T.C. ERC İYES ÜN İVERS İTES İ FEN BİLİMLER İ ENST İTÜSÜ BİYOLOJ İ ANAB İLİM DALI

ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTK İSİNİN KÖKÜNDEN ELDE ED İLEN EKSTRAKTLARIN ANT İMİKROB İYAL VE ANT İKANSEROJEN ETK İSİNİN İNCELENMES İ

Hazırlayan Dilek DABANLI

Danı şman Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN Öğr. Gör. Dr. Gökçen D İNÇ

Yüksek Lisans Tezi

Aralık 2011 KAYSER İ

T.C. ERC İYES ÜN İVERS İTES İ FEN BİLİMLER İ ENST İTÜSÜ BİYOLOJ İ ANAB İLİM DALI

ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTK İSİNİN KÖKÜNDEN ELDE ED İLEN EKSTRAKTLARIN ANT İMİKROB İYAL VE ANT İKANSEROJEN ETK İSİNİN İNCELENMES İ (Yüksek Lisans Tezi)

Hazırlayan Dilek DABANLI

Danı şman Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN Öğr. Gör. Dr. Gökçen D İNÇ

Bu çalı şma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Ara ştırma Projeleri Birimi tarafından FBY-11-3486 kodlu proje ile desteklenmi ştir.

Aralık 2011 KAYSER İ

TE ŞEKKÜR

Çalı şmalarım boyunca bilimsel duru şuyla beni aydınlatan, zamanını, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen de ğerli hocam sayın Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN’ a te şekkürü bir borç bilirim.

Çalı şmamın ortaya çıkması sırasında ve sonraki a şamalarda göstermi ş oldu ğu yardım ve yönlendirmelerden dolayı sayın hocam Ö ğr. Gör. Dr. Gökçen D İNÇ’ e sonsuz te şekkür ederim. Beni laboratuvarlarında misafir edip, çalı şmalarıma verdikleri destek için GATA ekibi sayın Prof. Dr. Ali U ğur URAL, Doç. Dr. Ferit AVCU, Uzman Biyolog M. Pınar ELÇ İ ve Uzman Biyolog Meral SARPER’ e çok te şekkür ederim. İhtiyaç duydu ğum her an yardımlarını benden esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. Co şkun TEZ, Doç. Dr. Cem Vural, Yrd. Doç Dr Ebru SAATÇ İ ve Güler TOPRAK’ a te şekkürlerimi sunarım.

Çalı şmalarım sırasında beni yalnız bırakmayıp, yardımlarını esirgemeyen çalı şma arkada şlarım Dilek CEYLAN, Tu ğba D İŞ YAPAR, Ebru KARADA Ş, Fatih Serdar ŞAH İN, Sevgi BAKIR, Murat TELC İOĞLU, Metin KILIÇ, Handan ŞAPÇI, Ömer ERG İN ve Osman İBİŞ ’ e çok te şekkür ederim.

En derinden te şekkürlerim beni hiç yalnız bırakmayan, en vazgeçti ğim zamanlarda bile her şeyi anlamlı kılan ailem Seher DABANLI, Torun DABANLI, Ahmet ÇET İNOK, Mü şerref ÇET İNOK, Nevzat ÇET İNOK, Şengül ÖZP İŞ KİN KEBAPÇI ve Mehmet Ali BAHAR’ a.

Bu tez çalı şmasına maddi destek veren Erciyes Üniversitesi Bilimsel Ara ştırma Projeleri Birimi’ne ( Proje No: FBY-11-3486) te şekkür ederim.

Dilek DABANLI

Kayseri, Aralık 2011

ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. B İTK İSİNİN KÖKÜNDEN ELDE ED İLEN EKSTRAKTLARIN ANT İMİKROB İYAL VE ANT İKANSEROJEN ETK İSİNİN İNCELENMES İ Dilek DABANLI Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Aralık 2011 Danı şman: Yrd. Doç. Dr. Servet ÖZCAN Öğr. Gör. Dr. Gökçen D İNÇ

KISA ÖZET

Bu çalı şmada Echinops orientalis Trautv. türüne ait örneklerin kök kısımlarının metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal ve antikanserojenik özellikleri ara ştırılmı ştır. Metanol, kloroform ve hekzan ekstaraktları 14 standart bakteri ve bir fungus türü ile, üç hücre hattı üzerinde uygulanmı ştır. Antimikrobiyal etki disk difüzyon ve M İK deneyleri yapılarak, antikanserojenik aktivite ise MTT yöntemi uygulanarak ara ştırılmı ştır. Sonuçlar ekstraktların antimikrobiyal özelli ği bulunmadı ğını; hücre tipi, zaman ve konsantrasyona ba ğlı olarak da sitotoksik etkisi oldu ğunu göstermi ştir. Kloroform ve hekzan ekstraktlarının hücreler üzerinde metanol ekstraktından daha etkili oldu ğu görülmü ştür. Elde edilen sonuçlar E. orientalis’ in kanser tedavisinde kemoterapötik bir bitki olarak dikkate alınması gerekti ğini göstermi ştir.

Anahtar Kelimeler: Echinops orientalis, Antimikrobiyal, Antikanserojen, Hücre Kültürü, MTT

SCREENING OF ANTIMICROBIAL AND ANTICARSINOJENIC EFFECTS OF ECHINOPS ORIENTALIS ROOT EXTRACTS

Dilek DABANLI Erciyes University, Graduate School of Natural and Applied Sciences M.Sc. Thesis, December 2011 Supervisor: Asist. Prof. Servet ÖZCAN University Lecturer Dr. Gökçen D İNÇ

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate antimicrobial and anticarcinogenic effects of Echinops orientalis root extract. Methanolic, chloroformic and hexanoic extracts Echinops orientalis was evaluated on 14 bacteria and one fungi and in vitro on two human cell lines (MCF-7, PC3 and fibroblast cells as control group). Antimicrobial effects of extracts were determined by disc-difusion and MIC and anticarcinogenic effects of the extracts were determined by MTT assay. Results showed that there were not antimicrobiological effect of the extracts Depending on cell type and concentration used extracts had different effect. Chloroformic and hexanoic extracts had more strong effect than methanolic extract effect. Echinops orientalis could be considered as a chemotherapeutic plant in cancer treatment in future.

Keywords: Echinops orientalis, Antimicrobial, Anticarcinogenic, Cell Culture, MTT

İÇİNDEK İLER

ECHINOPS ORIENTALIS TRAUTV. BİTK İSİNİN KÖKÜNDEN ELDE ED İLEN EKSTRAKTLARIN ANT İMİKROB İYAL VE ANT İKANSEROJEN ETK İSİNİN İNCELENMES İ

Sayfa BİLİMSEL ET İĞ E UYGUNLUK SAYFASI ...... ii YÖNERGEYE UYGUNLUK SAYFASI ...... iii KABUL VE ONAY SAYFASI ...... iv ÖNSÖZ ...... v ÖZET...... vi ABSTRACT ...... vii İÇİNDEK İLER ...... viii KISALTMALAR L İSTES İ ...... xi SEMBOLLER L İSTES İ ...... xii TABLOLAR L İSTES İ ...... xiv ŞEK İLLER L İSTES İ ...... xv

GİRİŞ ...... 1

1. BÖLÜM

GENEL B İLG İLER

1.1. Tıbbi Bitkiler ve Kullanım Alanları…………………………………….…..3 2.1. Antimikrobiyal Aktivite…………………………………………………...... 4 2.2. Kullanılan Su şlar ve Özellikleri…………………………………………….4 3. Hücre Kültürü………………………………………………………………....6 3.1. Tarihçe…………………………………………………………………….…7 3.2. Kültür Hücrelerinin Biyolojisi ……………………………………………...8 3.4. Hücre Döngüsü……………………………………………………………....9

3.5. Laboratuvar Düzeni ve Ekipmanları……………………………………..10 3.6. Hücre Kültür Mediumları………………………………………………....11 3.6.1.Fizikokimyasal Özellikleri…………………………………….....11 3.6.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Solüsyonu)………………....12 3.6.3. Medium ve İçerikleri ………………………………………….…12 3.7. Hücre Kültür Modelleri………………………………………………..….14 3.8. Sitotoksisite………………………………………………………….……...15 3.8.1. MTT Testi………………………………………………………....15 3.9. Deneylerde Kullanılan Hücre Hatlarının Genel Özellikleri……….…....16 4. Echinops orientalis Bitkisinin Sınıflandırılması…………………………....17 4.1. Asteraceae Familyasının Genel Özellikleri………………………….…...17 4.2. Echinops Cinsinin Genel Özellikleri……………………………………….17 4.3. Echinops orientalis’ in Genel Özellikleri…………………………………...18 4.4. Echinops Cinsine Ait Çalı şmalar ve Kullanımı……………………….….19

2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Bitkisel Materyal………………………………………………………….22 2.2. Bitkilerin Toplanması………………………………………………….....22 2.3. Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması…………………………………….22 2.4. Antimikrobiyal Testlerde Kullanılan Mikroorganizmalar…………...23 2.5. Antimikrobiyal Aktivite Testleri………………………………………..24 2.5.1. Disk Difüzyon Metodu………………………………………….24 2.5.2. Mikrodilusyon Metodu…………………………………………26 2.6. Hücre Kültürü…………………………………………………………….26 2.6.1 Hücrelerin Temini……………………………………………….26 2.6.2. Hücrelerin Büyütülece ği Mediumun Hazırlanması…………..27 2.6.3. Hücrelerin Kültür Basamakları………………………….……27 2.6.4. Hücrelerin Sayımı………………………………………………27 2.6.5. Hücrelerin ELISA Pleytlerindeki Optimizasyonu…………....28 2.6.6. Hücreler Üzerindeki Etkisi İncelenecek Ekstraktların Optimizasyonu…………..………………………..…...28 2.6.7. MTT Test Metodu…………………………………………...….29

3. BÖLÜM BULGULAR

3.1. Ekstraksiyon Verimi…………………………………………………..…..30 3.2. Bitki Ekstraktlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri …………………...... 30 3.3. Mikrodilüsyon Sonuçları………………………………………………….30 3.4. Bitki Ekstraktlarının Kültür Hücreleri Üzerine Etkileri………………35 3.4.1. Bitki Ekstraktlarının MCF-7 Hücre Hattı Üzerine Etkisi…....35 3.4.2. Bitki Ekstraktlarının PC-3 Hücre Hattı Üzerine Etkisi …...... 37 3.4.3. Bitki Ekstraktlarının Fibroblast Hücreleri Üzerine Etkisi...... 40

4. BÖLÜM TARTI ŞMA-SONUÇ ve ÖNER İLER

4.1. Ekstraksiyon Verimi……………………………………………………44 4.2. Antimikrobiyal Aktivite………………………………………………..45 4.3. Kültür Hücreleri Üzerine Etkisi……………………………………….46

KAYNAKLAR………………………………………………..………………49 ÖZGEÇM İŞ …………………………………………………………………..55

KISALTMA L İSTES İ

WHO World Health Organization

CAMs Kalsiyuma ba ğlı olmayan adezyon mokelülleri

HEPES N-2-hidroksi etilpiperazin N-2 etansulfonik asit

PBS Fosfatla Tamponlanmı ş Tuz Solüsyonu

MTT 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid

MİK Minimum İnhibitör Konsantrasyonu

ATCC American Type Culture Collection

TSA Triptik Soy Agar

YPDA Yeast Pepton Dekstroz Agar

TSB Triptik Soy Broth

YPDB Yeast Pepton Dekstroz Broth

CFU Colony forming unit

MHA Müller hinton Agar

DMSO Dimetil Sülfoksit

DMEM Dulbecco’s Modify Eagle Medium

FBS Fetal Bovine Serum

NYS Nistatin

MYC Mikanozol

SİMGE LİSTES İ

µl Mikrolitre mm Milimetre

µg Mikrogram mg Miligram ml Mililitre gr Gram

ºC Santigrat derece atm Atmosfer

TABLOLAR L İSTES İ

Tablo 2.1. Kullanılan organizmalar ve kültür koleksiyon merkezi (ATCC) kodları.23

Tablo 2.2. Mikroorganizmalar ve seyreltme katsayıları……………………………25

Tablo 3.1. Ekstraktların verimlilik sonuçları……………………………………….30

Tablo 3.2. Standart antibiyotiklerin olu şturdu ğu zonlar…………………………...31

Tablo 3.3. Ampisilin M İK sonuçları………………………………………………...32

Tablo 3.4. Tetrasiklin M İK sonuçları……………………………………………….33

Tablo 3.5. Trimetoprim M İK sonuçları…………………………………………..…34

Tablo 3.6. Nistatin ve mikanazol M İK sonuçları………………………………...... 34

Tablo 3.7. Ekstraktların MCF-7 hücreleri üzerindeki etkisi…………………….....36

Tablo 3.8. Ekstraktların PC-3 hücreleri üzerine etkisi………………………….….38

Tablo 3.9. Ekstraktların Fibroblast hücreleri üzerine etkisi…………………...... …..40

ŞEK İLLER L İSTES İ

Şekil 1.1. Hücre kültürü uygulamaları…………………………………………………7

Şekil 1.2. Hücre adezyonu……………………………………………………………..8

Şekil 1.3. Hücre döngüsünün ana safhaları……………………………………….…...9

Şekil. 1.4 MTT’ nin formazan kristallerine dönü şmesi……………………………....16

Şekil 1.5. Echinops orientalis …………………………………………………..…….18 Şekil 2.1. Soksolet cihazı……………………………………………………….…….23

Şekil 3.1. MCF-7 hücreleri 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a.

MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……...... 36

Şekil 3.2. 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……………………………………………...... 37

Şekil 3.3. 600 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………………………………………………...... 37

Şekil 3.4. MCF-7 hücrelerinin Tukey testi sonuçları………………………………37

Şekil 3.5. PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a.

MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……….…39

Şekil 3.6. 900 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan PC-3hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………………………………………………....40

Şekil 3.7. 300 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)…………………………………………..….40

Şekil 3.8. PC-3 hücrelerinin Tukey testi sonuçları…………………..…………40

Şekil 3.9. Fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a.

MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……....42

Şekil 3.10. 800 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin

24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)……………………………………………....42

Şekil 3.11. 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin

24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)………………………………………..……..43

Şekil 3.12. Fibroblast hücrelerinin Tukey testi sonuçları……………………...43

GİRİŞ

Enfeksiyon ve kanser hastalıkları Dünya’da birçok insanın hayatını etkileyen sa ğlık sorunlarıdır. Dünya Sa ğlık Örgütü’nün raporlarına göre, yalnızca kanserden Amerika’ da 2010 yılında 550.000 civarında ki şi hayatını kaybetmi ştir [1].

Dünya Sa ğlık Örgütü’ nün raporlarına göre kanser kaynaklı ölümlerde ilk sırada akci ğer kanseri yer almaktadır. Kadınlarda meme kanseri, erkeklerde ise prostat kanseri ikinci sırayla en çok ölüme neden olan kanser çe şitleridir [1]. Enfeksiyon hastalıklarında ise adından en çok bahsettiren hastalıklar AIDS, grip ve hastane enfeksiyonlarıdır.

Türkiye’ de ise dünyadakine benzer bir şekilde, kanser ve enfeksiyona ba ğlı hastalıklardan kaynaklanan ölüm oranı, hastalıkların çe şitlenmesi ve tedavi edilememesi sebebiyle gün geçtikçe artmaktadır. Türkiye’ de 0-6 ya ş arası çocuklarda en yaygın hastalık solunum yolu enfeksiyonları iken [2]; akciğer ve bron ş kanserleri en çok görülen kanser hastalıklarıdır [3].

Mikroorganizmalar, gün geçtikçe antibiyotiklere karşı daha dirençli hale gelmektedir. Benzer şekilde kanser hücrelerinin kanser ilaçlarına kar şı geli ştirdi ği direnç de artmaktadır. Kansere kar şı, geli ştirilen ilaçların toksik etki göstermesiyle de daha çok insanın hayatı tehdit altına girmektedir. Bu durum, hastalıkların tedavisi için yeni yöntemler geli ştirmeyi gerekli kılmaktadır. Yeni tedavi yöntemlerinin aranmasıyla aktif bir ara ştırma alanı do ğmu ş olup bu çalı şmalarda tıbbi bitkilerden yaygın bir şekilde yararlanıldı ğı görülmektedir [4-6].

Hastalıkların çe şitlenmesi, tedavi için do ğada var olan potansiyelin kullanılması gereklili ği gibi nedenler, ara ştırmacıları kansere kar şı bitkilerden yararlanma yoluna yöneltmi ştir. Di ğer yandan tıbbi bitkilerin yüzyıllardır çe şitli hastalıkların tedavisinde geleneksel olarak kullanıldı ğı bilinmekte birlikte özelikle tıbbi bitkilerin kullanımı, Afrika, Asya ve Çin’de çok fazla ra ğbet gören bir tedavi yöntemidir.

Tıbbi bitkilerin ekstraktlarının enfeksiyon ve kanser hastalıklarına olan etkilerini ara ştırmak amacıyla pek çok çalı şma yapılmı ştır [7-9].

Tıbbi bitkilerin içeri ğinde bulunan birçok bile şik, in vivo ve in vitro çalı şmalarda kullanılmı ştır. Bu çalı şmalardan en yaygın olanları canlılık, antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisite testleridir.

Ülkemizin bitkisel zenginli ği üç fitoco ğrafik bölgenin kesi şti ği bölgede bulunması, Güney Avrupa ile Güneybatı Asya floraları arasında köprü olması ve pek çok cins ve seksiyonun orjin ve farklıla şım merkezlerinin Anadolu olu şu, ekoloji ve fitoco ğrafik farklıla şma ile ilgili olarak tür endemizminin yüksek olu şunu açıklamaktadır [10].

Bu çalı şmada Türkiye’de geni ş bir yayılı ş alanı olan Echinops orientalis bitkisinden elde edilen methanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal aktiviteleri test edilmesi ve antikanserojen etkilerinin ara ştırılması amaçlanmı ştır.

1. BÖLÜM

Genel Bilgiler

1. 1. Tıbbi Bitkiler ve Kullanım Alanları

Bitkiler, antik ça ğlardan itibaren tıbbın kullanım alanındadır. Dünya’da 250.000 ile 500.000 bitki türü bulundu ğu tahmin edilmektedir. Bunlardan %10’ u insanlar ve hayvanlar için besin kayna ğını olu ştururken bir kısım bitki tıbbi amaçlar için kullanılmaktadır [11,12]. Hipokrat M.Ö. 50. yüzyılın sonlarında, 300 - 400 kadar tıbbi bitki oldu ğunu söylemi ştir. İsveçli botanikçi hekim Carolus Linnaeus (1707-1778) ise ilk kez binnomial sınıflandırma ile bitkileri sınıflandırmı ş ve Species Platarum ve Systema Naturae çalı şmalarıyla tıbbi bitkilerin kulanımının geli şimine katkıda bulunmu ştur. Kutsal kitaplarda da şifalı bitkilerden bahsedilmesi insanların tıbbi bitkilere olan ilgisini arttırmı ştır. Bu nedenle Orta Ça ğ boyunca Arap dünyası bu konuda çalı şmalar yapmı ştır. Günümüzde ise Asya’ dan Afrika’ ya kadar her kıtada bu konuyla ilgili birçok bilimsel ara ştırma yapılmı ştır. Örne ğin Çin, tıbbi bitkilerin kullanımıyla ilgili yaptı ğı çalı şmalarla adını sıkça duyuran ülkeler arasındadır [12]. Tıbbi bitkilerin bu kadar yaygın olarak kullanılmasının nedeni olarak yeterli kimya endüstrisine sahip olmayan ülkelerde bitkilerden yararlanmanın daha ucuz ve kolay olması [13], sentetik bile şiklere göre daha ucuz olması, birden çok olumlu etkilerinin olması, yan etkilerinin sentetik bile şiklere oranla daha az olması ve kültürel inanı şlar sayılabilir [14-16].

Tıp alanında bitkilere yönelinmesi AIDS ya da kanser gibi tedavisi pek de mümkün olmayan çe şitli hastalıkların ma ğdurlarına bir umut kayna ğı olmaktadır [17, 18]. Bu amaçla da birçok çalı şma yapılmı ş ve bitkiler ilaçlar için hammadde olarak kullanılmı ştır. Bu çalı şmalara ba ğlı olarak Amerika’ da Eczacılar Birli ği tarafından üretilen bütün yeni bile şiklerin %25’ nin bitkilerden elde edildi ği kaydedilmi ştir [13]. Yurdumuzda 9000’ e yakın farklı do ğal bitki türü bulunmaktadır [19]. Bütün dünya ile birlikte ülkemizde de bitkilerden elde dilen birçok sayıda baharat ve çay tedavi amaçlı olarak yıllardır kullanılmaktadır [20].

2.1. Antimikrobiyal Aktivite

Bitkilerin tedavi amaçlı kullanılmasıyla birlikte etnobotanik geli şmi ştir. Bitkilerin mikroorganizmaları öldürücü etkileri ba şta olmak üzere insan sa ğlı ğı için önemli olan özellikleri uzun yıllardır ara ştırılmaktadır (21, 22). Tedavi amaçlı kullanılan bitkilerin sayısı Dünya Sa ğlık Örgütü’nün (WHO) ara ştırmalarına göre 20.000 civarındadır (23). Do ğadaki bazı bitki ekstraktlarının ve uçucu ya ğların bakterilere oldu ğu kadar, mantarlara kar şı da antimikrobiyal aktivite gösterdi ği yapılan çalı şmalarda tespit edilmi ştir.

Antimikrobiyal bile şiklerin, mikroorganizmalar üzerindeki etkileri, etki derecelerine göre iki grupta incelenir: 1. Bakteriyostatikler: Bakterilerin geli şmesini ve üremesini engellerler, bakterileri do ğrudan öldürmezler. 2. Bakteriyositler: Bakterileri direk yok ederler [24].

Antimikrobiyal aktivite testleri mikrobiyal üremeleri inhibe eden maddelerin test edilmesini amaçlayan testlerdir.

2.2. Kullanılan Su şlar ve Özellikleri

1. Staphylococcus aureus: Besin zehirlenmelerine yol açan bir bakteri olarak bilinir. Gram pozitif, kok şeklinde, tekli, üçlü veya dörtlü zincirler şeklinde ya da üzüm benzeri bir yapıdadır. Hareketsizdir, spor olu şturmaz ve genellikle kapsülsüzdür veya sınırlı bir kapsül yapısına sahiptir. Fakültatif anaeroptur. Optimum üreme 37 °C’ de gözlenir [25].

2. Staphylococcus epidermidis: İnsan derisinde yaygın olarak bulunur. Son yıllarda yapılan çalı şmalarda nosokomiyal enfeksiyon nedeni olarak sıkça adından söz ettirir. Gram pozitif, kok şeklinde bakteridir. Anaerobik geli şim gösterir [25].

3. Escherichia coli: Orijinal adı Bacterium coli olan E. coli’ nin habitatı , insan ve hayvan gastrointestinal sistemidir. E. coli Gram negatif, anaerop, 0,5 - 3,0 µm uzunlukta çomak şeklinde bir bakteridir [25].

4. Klebsiella pneumoniae: Kapsüllü, hareketsiz çomak şeklinde bakteridir. 30-35 °C’ de optimumüreme gösterir. Gram negatiftir. Memelilerde geni ş bir yelpazede yayılı ş gösterir. Nosokomiyal patojenler arasında önemli bir yeri vardır. Ba şta hastanelerde yatan hastalarda olmak üzere solunum yolu enfeksiyonlarına yol açar [25].

5. Bacillus cereus: Besin zehirlenmesine neden olur. Düz, veya çok az kıvrılmı ş, 3-12 µm uzunlu ğundadır. Gram pozitif, endospor olu şturan, anaerop bir bakteridir. 30-40 °C’ de geli şim gösterir [25].

6. Bacillus subtilis: Gram pozitif, kolonileri düz, mat ve geni ş bir yayılı ş gösterir. Oval endospor olu şturur. Besin zehirlenmelerine, göz ve dokularda enfeksiyona yol açar [25].

7. Listeria monocytogenes: İnsan patojenidir. Gram pozitif çomak şeklinde bir yapılanma gösterir. Dü şük sıcaklık ve yüksek tuz oranı gibi uç noktalara kar şı dirençlidir, de ğişen çevre ko şullarına kar şı çok iyi bir adaptasyon yetene ğine sahiptir. Gastroenteritis, menenjitis, ensefalitis gibi enfeksiyonlara neden olur. Küçük, Gram pozitif, sporsuz, kapsülsüz bir bakteridir. 20 °C’ de hareketli, 37 °C’ de hareketsizdir [25].

8. Corynebacterium renale : Genel olarak toprak ve hayvanlarda bulunur. İnsan ve hayvanlarda patojen olan bu bakteri deride ve mukoz membranlarda görülür. Gram pozitif ve çomak yapıdadır. Anaerob veya aeroptur [25].

9. Proteus mirabilis: İnsan, ku ş ve sürüngenlerin ba ğırsak sisteminde görülen bir bakteri türüdür. İnsanlarda özellikle üriner sistemde de rastlanır. Optimum üreme sıcaklı ğı 37 °C’ dir. Gram negatif, çomak yapıdadır. Çok sayıda ve uzun kirpiklerle hareketlilik kazanır [25].

10. Micrococcus luteus: Gram pozitif, küre şeklinde, hareketsiz ve spor olu şturmayan bir bakteridir. Genellikle memeli deri yüzeyinde bulunur. Aerobiktir. İnsanlarda özellikle üriner sistemde görülür [25].

11. 12. Pseudomonas aeruginosa ve P. fluorescens: Gram negatif, çomak şeklinde bakterilerdir. 42 °C’ ye kadar ya şayabilirler. Koloni morfolojisi, hareketlilik ve pigmentasyon de ğişiklik gösterir. Genel olarak su ve toprakta ya şarlar, bitkilerde patojendirler. İdrar yolları, solunum sistemi ve gastrointestinal sistemde enfeksiyonlara yol açar [25].

13. Enterococcus faecalis: İnsanlarda ba ğırsak enfeksiyonuna neden olan, nosokomiyal bir bakteridir. Gram pozitif, fakültatif anaerobik ve küre şeklinde bir bakteridir. İnsanlarda genellikle üriner sistem enfeksiyonlarına neden olur [25].

14. Enterobacter aerogenes: Hareketli, Gram negatif, fakültatif anaerob bir bakteridir. Yanıkları, solunum yollarını ve idrar yollarını enfekte eder [25].

15. Candida albicans: Ökaryotiktir. Saprofit veya parazit özellik gösterir. Deri, a ğız, vajina ve ba ğırsakların normal florasında bulunur. Aynı ortamdaki flora, antibiyotik kullanımı ile uzakla ştırıldı ğında maya üremesine olanak sa ğlanır ve enfeksiyon meydana gelir [26].

3. Hücre Kültürü

“Hücre kültürü” terimi, orijinal bir dokudan, primer kültürden, hücre hattından enzimatik, mekanik veya kimyasal ayırma yöntemleri ile hücrelerin elde edilerek kültürünün yapılması anlamında kullanılır [27].

Hücre kültürlerinde, kültüre edilen hücreler elde edildikleri dokuların genel özelliklerini ve normal fonksiyonlarını gösterir. Bu nedenledir ki dokunun in vivo bütünlü ğü ve özellikleri hücre kültürlerinde in vitro olarak da gözlenebilir. Böylelikle gerek çe şitli hastalıkların tedavisine yönelik ara ştırmalar, gerekse ilaç etkinlik deneyleri gibi deneysel çalı şmalar hücre kültürünün önemini ortaya koyar [28]. Hücre kültürü üzerinde yapılabilecek çalı şmalar Şekil 1.1’ deki gibi özetlenebilir.

Şekil 1. 1. Hücre kültürü uygulamaları [27]

3. 1. Tarihçe

Hücre kültürü deneyleri bugün bütün dünyada yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Hücrenin vücut dı şında büyüyebilmesini gerektiren tekniklerin geli şmesi 20. yüzyılda ortaya çıkmıştır. İlk hücre kültürü çalı şması Wilhelm Roux tarafından 1885’ te gerçekle ştirmi ştir. Bu çalı şmada tavuk embriyoları tuzlu suda bekletilmi ş ve birkaç gün boyunca canlılıklarını koruyabildi ği gözlenmi ştir. Daha sonra Loeb tarafından 1897 yılında yapılan bir çalı şma ile kan yapan hücreler ve ba ğlayıcı dokular uzun süre ya şatılmı ştır [29]. 1898 yılında ise Ljunggren, bir asit sıvısı içinde insanlara ait deri parçalarını haftalarca canlı olarak muhafaza edebilmi ştir [30-32, 28]. Bu çalı şmalardan sonra ise 1907 yılındaki ba şarısıyla adını “doku kültürünün babası” olarak kabul ettiren Ross Harrison’ un çalı şması gelmektedir. Ross Harrison, muhtemelen so ğukkanlı bir hayvan olup inkübasyon gerektirmedi ğinden seçti ği, kurba ğa embriyosundan aldı ğı doku parçalarını kültüre etmi ş ve sadece doku parçalarını de ğil sinir fibrillerini de ya şatmayı ba şarmı ştır. Bu çalı şmalardan sonra ise hücre kültürü çalı şmalarını bugünkü haline getiren pek çok ara ştırma yapılmı ştır [27].

3.2. Kültür Hücrelerinin Biyolojisi

Kültür hücrelerinin ya şadıkları mikroçevre kendi içinde her zaman de ğişkenlik gösterir. Hücre-hücre ve hücre–matriks etkile şimleri, in vivo ortamdaki üç-boyutlu yapılarına göre hormonlar ve besin uyarıcıları yüzünden de ğişkenlik gösterir (indirgenir). Ortamdaki bu de ğişiklik ise hücrelerin yayılmasını, göç etmelerini ve ço ğalmalarını etkiler. Hücrelerin ortama tutunması, hücreler arası ili şki, mediumun fizikokimyası, gaz fazın yapısı ve inkübasyon sıcaklı ğı hücre ortamlarının en önemli özelliklerini olu şturur.

Bir yüzeye tutunarak ço ğalan hücrelerin, ço ğalabilmesi için dokudan ayrıldıktan veya ikinci kültürlerinin (subkültür) yapılmasından sonra bir yüzeye tutunması ve yayılması gereklidir. Hücreler polistirol (polystyrene) gibi plastik bir yüzeye veya güçlü bir asitle ve yüksek enerjili iyon radyasyonuyla i şlenmi ş bir plastik yüzeye ya da yine i şlenmi ş bir cam yüzeye tutunabilirler [27]. Hücrelerin adezyonu Şekil 1. 2.’ de gösterilmi ştir.

Şekil 1.2. Hücre adezyonu [27]

Yüzey dı şında hücrelerin tutunmasını etkileyen bir di ğer faktör ise hücre adezyon molekülleridir. Hücre-hücre ve hücre-yüzey adezyonunda dört büyük transmembran proteininin rol oynadı ğı belirlenmi ştir. Bu moleküller şu şekilde sıralanabilir:

1. Ca 2+ ba ğlı kaderinler 2. Ca 2+ ba ğlı olmayan hücre-hücre adezyon molekülleri (CAMs) 3. Fibronektin, entaktin, laminin ve kollajen gibi moleküllerle etkile şime giren integrinler 4. Transmembran proteoglikanları 5. Klaudinler ve okludenler [27]

3.4. Hücre Döngüsü

Yeni bir hücre olu şturmak için var olan tek yol halihazırda var olan hücrenin dublike olmasıdır. Bu temel olay 19. yüzyılın ortalarında ilk kez ortaya çıkmı ştır. Hücre döngüsü bakterilerden memelilere kadar tüm canlılarda esastır. Hücrede var olan genetik materyalin ve hücre içeri ğinin iki katına ula şıp ikiye ayrılması olayına hücre döngüsü denir. Hücre döngüsü bütün canlıların yeniden üremesi için zorunludur. Hücre döngüsünün kontrol sistemi genelde protein kinaz ailesinin üyelerinden olan siklin-ba ğlı kinazlar (Cdks). tarafından kontrol edilir [32]. Hücre döngüsünün fazları Şekil 1.3.’ te verilmi ştir.

Şekil 1.3. Hücre döngüsünün ana safhaları [33]

a) G0: Dinlenme fazıdır. Hücreler i şlevi görmek üzere programlanırlar. b) G1 (interfaz): Hücre fonksiyonları için gereken proteinler ve RNA sentezlenir. Ayrıca, DNA sentezi için gereken enzimler üretilir. c) S: Hücredeki DNA ve proteinlerin sayısı ikiye katlanır. d) G2 fazı: Mitoz ba şlar ve karde ş kromatidler ayrılana dek bu süreç devam eder. Mitoz genel olarak profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz olmak üzere be ş basamakta gerçekle şir. e) M (mitoz): En kısa süren safhadır. Genetik materyal olu şan iki yeni hücreye da ğılır. Protein ve RNA sentez hızı aniden yava şlar. Mitozu takiben olu şan yeni hücreler ya G0 ya da G1 fazına girerler [34].

Ço ğalma kapasitesine sahip hücreler normal olarak belirli kontrol noktalarında dururlar. İlk kontrol noktası G1 fazında gerçekle şir. E ğer G1 fazından önce bir anormallik saptanırsa, hasar onarılır veya apoptoza giderek öldürülür. İkinci kontrol ise hücreler M (mitozis) fazına girmeden önce yapılır. Sonuç olarak hücre, döngü boyunca ilerlerken iki noktada kontrol edilmi ş olur [35-37].

3.5. Laboratuvar Düzeni ve Ekipmanları

Hücre kültürlerinin yapıldı ğı laboratuarlar di ğer deneylerin gerçekle ştirildi ği laboratuvarlara göre bazı de ğişiklikler gösterir. Bu laboratuvarlar için tercih edilen kültür yapılan ortamın, preparasyon alanlardan ayrı tutulmasıdır. Çalı şmaların sa ğlıklı bir şekilde yürütülebilmesi için laboratuarı kullanan kişi sayısı, laboratuar alanı, hazırlık alanlarının yerle şimi, malzemelerin depolanması gibi özellikler oldukça önem ta şır.

Laminar kabin, invert mikroskop, inkübatör, CO 2 inkübatörü, azot tankı, santrifüj ve flasklar hücre kültürü laboratuarlarının en temel donanımlarıdır. Laminar kabinler kontrol edilebilir bir şekilde, çalı şma alanında steril bir hava akımı olmasını sa ğlayarak çalı şmalarda kontaminasyonun önlenmesi açısından büyük önem ta şırlar. İnvert mikroskoplar flaskın alt yüzeyine tutunmu ş hücrelerin düzenli olarak gözlenebilmesi için çok önemlidir. Hücrelerin ya şayıp ço ğalabilmeleri için gerekli atmosfer, nem ve sıcaklı ğın kontrolü CO 2 inkübatörleri ile sa ğlanır. Bir anlamda hücrelerin elde edildi ği organizmanı in vivo ko şullarını taklit eden CO 2 inkübatörlerinde hücreler genellikle, 37 °C sıcaklık, %5 CO 2 ve sabit nemli bir ortam ile kültüre edilirler. Azot tankları ise dondurulan hücrelerin bozulmadan saklanabilece ği (kritik sıcaklık seviyesi -135 °C’ altında) -196 °C’ lik ortamı sa ğlamada hücre kültür laboratuvarlarının en önemli donanımlarından biridir. Hücrelerin dondurulmasında dimetilsülfoksit (DMSO) ve gliserol kullanımı, hücrelerin zarar görmeden dondurulmasına yardımcı olur. Kademeli olarak so ğutma sa ğlayan özel dondurma kapları da yine hücrelerin zarar görmeden dondurulmasında etkilidir.

3.6. Hücre Kültür Mediumları

3.6.1. Fizikokimyasal Özellikleri

Hidrojen İyonu (pH): Hücrelerin kültür ortamında ya şatılabilmesi için hidrojen iyonu konsantrasyonu oldukça önemlidir. Hücrelerin birço ğu pH 7.4’ te iyi bir şekilde büyürler. Bununla beraber hücre hattına göre çe şitli pH de ğerlerinden de söz edilebilir. Mediumların birço ğunun içinde pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur. Medium rengi kırmızı iken pH 7.4 tür. Mediumun turuncuya dönü şmesi pH’ ın 7.0, sarıya dönü şmesi ise pH’ ın 6.5 civarlarında oldu ğunu gösterir. pH 7.6 gibi yüksek pH’ a sahip mediumlarda ise mediumun rengi koyu kırmızı-pembe bir renk alır [27].

- Karbondioksit ve Bikarbonat: Karbondioksit HCO 3 iyonlarıyla dengeyi kurmak için, gaz fazında iken medium içinde çözünür ve laktik asitin de artmasıyla mediumun pH’ ı - dü şer. Çözünmü ş CO 2, HCO 3 ve pH birbiriyle ili şkili oldu ğu için CO 2’ in direk etkisini kontrol etmek zordur. Ortamın pH’ ının sabit kalabilmesi için CO 2 ve H 2CO 3 tampon sistemleri kullanılır. Karbondioksitin H 2CO 3 olu şturdu ğu denklem şu şekilde gösterilebilir:

+ − H2O + CO 2 ↔H2CO 3 ↔H + HCO 3

Mediumlara bu dengeyi korumak için CO 2, NaHCO 3 veya HEPES ilave edilir. Bikarbonat tamponlarıyla kar şıla ştırıldı ğında daha ucuz ve daha az toksik oldu ğundan son yıllarda tamponların en iyilerinden birisi olarak kabul edilen HEPES‘ in kullanımı oldukça yaygındır [27].

Oksijen: Di ğer bir önemli bile şen ise gaz formundaki oksijendir. Oksijen oranının artması hücrelerde toksik etki olu şturmasının yanısıra %95 oksijene ihtiyaç duyan hücreler oldu ğu gibi; %5’e kadar inen dü şük oksijen seviyelerinde ya şayan insan mezenkimal kök hücreleri ve insan embriyonik akci ğer fibroblastları gibi hücreler de mevcuttur [27].

Osmolarite: Birçok hücre osmotik basınca oldukça dayanıklıdır. İnsan plasması yakla şık olarak 290 mOsm/kg’dır. Osmolaritedeki ± 10 mOsm/kg’lık bir de ğişim tolere edilebilir. Mediumun hazırlanmasında osmolarite oldukça önemlidir ve ölçümü için osmometre kullanılır [27].

Sıcaklık: Hücre kültürleri için sıcaklık hücrelerin elde edildi ği organizmanın sıcaklı ğına ba ğlıdır. Bu yüzden sıcakkanlı hayvanlardan elde edilen hücrelerde optimum sıcaklık 37 °C’ dir. Memeli hücrelerinin kültürlerinde hücreler 4 °C’ de birkaç gün ya şayabilir ve kademeli olarak so ğutulduklarında -196 °C’ de dondurulabilirler. Ku şlar gibi daha yüksek sıcaklı ğa sahip hayvanların hücreleri 38,5 °C’ de canlılıklarını sürdürürler. So ğukkanlı hayvanların kültüre edilen hücreleri ise 15 -26 °C’ de ya şayabilirler [27].

Vizkozite: Vizkozite hücre kültürlerinde, hücrelerin çalkalanması veya hücrelerin tripsinizasyon sonrası ayrılmasında önemi bir rol oynar. Mediumlardaki vizkozite daha çok serum ile sa ğlanır [27].

3.6.2. PBS ( Fosfatla Tamponlanmı ş Tuz Solüsyonu )

İnorganik tuzlardan olu şan PBS, sodyum bikarbonat veya glukoz içerebilir. Genellikle tripsinizasyon öncesinde mediumun tripsin aktivitesini dü şürmesini engellemek için hücreleri yıkamada kullanılır. İzotonik bir solüsyon oldu ğundan hücrelere zarar vermez.

3.6.3. Medium ve İçerikleri

Kültüre edilen hücreler besin ihtiyaçlarını mediumdan sa ğlarlar. Mediumlar hücre hatları için çe şitlilik gösterdi ğinden mediumlara eklenen destekleyici içerikler de de ğişiklik gösterir. Bu yüzden mediumlar basal mediumlar ve tamamlanmı ş mediumlar olarak ikiye ayrılırlar. Bazal mediumlarda hücrelerin ya şaması için gerekli bütünleyici içerikler olmadı ğından tek ba şına hücrelerin ya şatılabilmesi için uygun de ğildirler. Tamamlanmı ş mediumlar ise hücre hattına göre de ğişen gerekli bütünleyici içerikleri ile hücrelerin ya şatılmasına yardımcı olurlar. Bütünleyici içerikler şu şekilde sıralanabilir:

Aminoasitler: Aminoasit konsantrasyonu hücrelerin ya şaması ve büyümesinde önemlidir. Hücre tipine göre de ğişse de genel olarak kullanılan zorunlu amino asitler sistein, arjinin, glutamin ve tirozindir. Hücre için en çok kulanılan amino asit ise glutamindir. Ancak glutaminin yarılanma ömrü kısadır ve üretti ği amonyak sebebiyle toksik bir etkiye neden olabilir. Çe şitli firmalarca glutamin yerine kullanılabilecek daha stabil bir yapıya sahip olan bile şikler de vardır [27].

Vitaminler: B grubu vitaminler, folik asit, inositol, biotin, nicotinamit, A, D, E, K vitaminleri ve kolin gibi çe şitli mediumlarda bulunan çe şitli vitaminler hücre canlılı ğının devamı için önemlidir [27].

+ + 2+ 2+ - 2 3 3- Tuzlar: Na , K , Mg , Ca , Cl , SO 4 -, PO 4 -, HCO tuzları mediumun osmolaritesine katkıda bulunan tuzlardır. Özellikle Ca + sinyal iletiminde rol alıp, hücrelerin büyümesi ve ço ğalmasında etkili oldu ğu için oldukça önemli bir tuzdur. Birçok medium orijinal olarak kendi tuz konsantrasyonuna sahiptir [27].

Glukoz: Enerji kayna ğı olarak kullanılan glukoz, birçok mediumda kendiliğinden bulunur. Glikolizle laktata dönü şen pirüvat olu şumunu metabolize edebilir, sitrik asit döngüsüne katılarak CO 2 ve su okside edebilir [27].

Organik Bile şenler: Hücre mediumunda bulunan di ğer bile şenler ise protein, peptit, nükleosit, piruvat ve lipitlerdir. İçeri ği indirgenmi ş serumlarda bu organik bile şenler hücre devamlılı ğı açısından önem ta şır [27].

Hormonlar ve Büyüme Faktörleri: Hormonlar ve büyüme faktörleri her medium için gerekli de ğildir, daha çok serum içermeyen mediumlarda kullanılır.

Antibiyotikler: Hücre kültürlerinde aseptik ko şullar oldukça önemlidir. Kullanılan malzemeler ile ortamın sterilitesi ve çalı şanların temizli ği hücrelerin sa ğlıklı bir şekilde ya şamaları için elzemdir. Bu nedenle mediumların içerisine mikroorganizmaların üremesini engellemek için çe şitli antibiyotikler eklenir. Hücre kültür laboratuarlarında en çok görülen kontaminasyon sebebi bakterilerin özellikle de mikoplazmaların yol açtı ğı kontaminasyonlardır. Bunlar için de genelde streptomisin, penisilin ve gentamisin gibi antibiyotikler kullanılır.

Serum: Büyüme faktörleri içeren serumlar, hücre bölünmesinin indüklenmesini ve antitripsin özelli ği ile de hücrelerin adezyonunu sa ğlarlar. Aynı zamanda birçok hormonun, lipitin ve mineralin kayna ğıdır. Mediumlarda daha çok büyükba ş hayvanlardan elde edilen serumların kullanılmasının yanısıra atlardan ve nadiren insanlardan elde edilen serumlar da kullanılabilir. Ancak kullanılmadan önce bu serumların HIV ve Hepatit B gibi virüsler açısından kontrol edilmi ş olması gereklidir. Ayrıca bazı serumlar yine kullanımdan önce ısı ile inaktive edilerek mikoplazmalara kar şı önlem alınmalıdır. Serumsuz olarak kullanılan mediumlar da vardır.

3.7. Hücre Kültür Modelleri

Bir doku veya organdan alınan hücreler, i şlenmi ş özel yüzeylere sahip ortamlarda belirli mediumlarda ve gereken besin miktarıyla tam olarak doku veya organ özelli ği göstermeseler dahi ya şayarak ço ğalabilirler. Hücrelerin ilk subkültürden önce, hücre hattı olu şturmadı ğı ve elde edildi ği dokudan izole edildikten sonraki kültürlerine primer hücre kültürü denir. Primer hücre kültürleri yapabilmek için hücreler ait oldukları dokulardan eksplant yöntemiyle, mekanik ayrı ştrmayla veya kollejenaz gibi enzimlerin kullanılmasıyla izole edilebilirler. İzole edilmi ş hücreler dokudaki gibi genetik özelliklerini korurlar. Primer hücre kültürleri, kullanılan dokuyu olu şturan hücrelerin varlı ğıyla heterojen bir yapılanma gösterirler. Bu yapılanmadan kaynaklanan tek tip hücrenin elde edilmesi zor olması ve kontaminasyona daha açık bir i şlem geçirmesi sebebiyle primer hücre kültürlerinin dezavantajları vardır.

Primer hücre kültürlerini olu şturan hücreler, mitoz bölünmeyle ço ğalarak ve seçici bir mediumun kullanılması ile subkültüre edilerek daha homojen bir hale gelirler. Kanser ve kök hücrelerin aksine di ğer hücre tipleri telomeraz aktivitesinden yoksun olup senesense uğradıkları için ancak 20-100 kere subkültürleri yapılabilir. Bazı virüslerin kullanılmasıyla ise hücreler ölümsüz (immortal) hale getirilerek sonsuz sayıda subkültürlerinin yapılabilmesine olanak sa ğlanır [27]. Bu şekilde indüklenerek veya do ğal olarak telomeraz aktivitesine sahip oldu ğu için sonsuz bölünme yetene ğine sahip hücrelerin kültürleri ise devamlı hücre kültürü olarak adlandırılır.

3.8. Sitotoksisite

Sitotoksisite terimi hücreleri zehirleyici olmak anlamında kullanılır. İn vivo olarak sitotoksisite hücrelere direk olarak zarar verip i şlevlerini yapmasına engel olan fizyolojik bir durumdur. İn vitro olarak ise sitotoksisiteyi sistemik ve fizyolojik bir şekilde gözlemlemek zordur. Sitotoksisitenin de ğişkenli ği çalı şmaya ba ğlı olarak hücrenin ölmesi veya fenotipik olarak de ğişmesi gibi çe şitli şekillerde olabilir. Buna ek olarak hücreler nekrozis, apoptozis, otofaji ve sitostazis gibi şekillerde ölebilirler. Yeni ilaçlar, kozmetik ürünler, gıdalardaki katkı maddeleri üretilmeden önce sitotoksisite testlerinden geçerler. Bu toksisite testlerinden en yaygın olanı MTT, XTT ve MTS testleridir. Bu testlerde direk olarak hücre sayısını ölçme yerine, artan DNA, protein miktarı, devam eden metabolik aktivite, tetrazolium tuzunun formazan kristallerine dönü şmesi ya da proteinin veya DNA’ nın toplam miktarı ölçülür [27].

3.8.1. MTT Testi

MTT testi dolaylı olarak hücre sayısının artmasını veya hücre ölümünü de ğerlendirmeyi amaçlayan bir testdir. Hızlı kolorometrik bir yöntem olarak MTT testinde yalnızca canlı hücreler çok kuyucuklu bir spektrofotmetrede taranırlar. Çok yönlü, sayısal de ğerler veren, hassas ve tekrarlanabilir, kolay, hızlı ve daha ekonomik olmasıyla bu test di ğer geleneksel yöntemlere göre daha avantajlıdır. İlk olarak Mosmann tarafından tanımlanan, 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromid (MTT) yöntemi hücre canlılı ğının belirlenmesi için çok sık kullanılan pratik bir yöntemdir [38]. Wilson ve arkada şları, MTT'den olu şan formazonun yo ğunlu ğunun direkt olarak ya şayan hücrelerin sayısıyla ba ğlantılı oldu ğunu ileri sürmü şlerdir. Bu yöntemi, kanserli hastaların tedavisinde kullanılan ilaçlar üzerinde denemi şler ve elde ettikleri klinik sonuçların, MTT sonuçlarıyla paralel oldu ğunu rapor etmi şlerdir [39, 28]. Bu test sa ğlam hücrelerde mitokondirinin MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır. Bu reaksiyon kırılgan bir mitokondriyal enzim olan süksinatdehidrogenaz enziminin aktivitesine ba ğımlıdır. MTT, hücrelere aktif olarak absorbe olan ve mitokondriye ba ğlı bir reaksiyon ile renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenen bir maddedir [40, 28]. Tetrazolium halkasının parçalanması sonucu soluk sarı renkli MTT boyası koyu mavi-mor formazan ürününe dönü şmektedir. Hücrelerin MTT indirgeme özelli ği hücre canlılı ğının ölçütü olarak alınır ve MTT analizi sonucunda elde edilen boya yoğunlu ğu canlı hücre sayısı ile korrelasyon gösterir [41, 28]. Sonuç olarak canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamı ş hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonksiyonu bozulmu ş hücreler ise boyanmamaktadırlar. MTT’ nin formazan kristallerine dönü şmesi Şekil 1.4. ‘te verilmi ştir.

Şekil. 1.4 MTT’ nin formazan kristallerine dönü şmesi [42]

3.9. Deneylerde Kullanılan Hücre Hatlarının Genel Özellikleri

MCF-7, meme epitelinden şekillenen bir adenokarsinoma hücresidir. Meme dokusunun birkaç ideal karakteristik özelli ğini gösterdi ği için kanser çalı şmalarında sıkça kullanılmaktadır. Östrojen reseptör pozitif bir hücre hattıdır. İlk kez 1970’ te Kafkas ırkından 69 ya şında bir kadından izole edilmi ştir. Tavsiye edilen subkültür oranı 1:3 veya 1:6’ dır. Optimum ya şama ko şulları 37 °C’ de %5 CO 2’li ortamdır.

PC-3 prostat epitelinden elde edilen bir adenokarsinoma hücresidir. İlk kez yine Kafkas ırkından 62 ya şındaki bir erkekten izole edilmi ştir. Dü şük asit-fosfat ve testosteron-5- alfa redüktaz aktivitesi gösterir. Optimum ya şam ortamı 37 °C’ sıcaklık ve %5 CO 2’ li ortamdır. Yine tavsiye edilen subkültür oranı 1:3 veya 1:6’ dır.

Fibroblast hücresi ba ğ dokunun ana hücreleridir. Deriden izole edilmi şlerdir. Optimum ya şama ortamı 37 °C’ sıcaklık ve %5 CO 2’ li ortamdır. Tavsiye edilen subkültür oranı 1:2 veya 1:9 dur [43].

4. Echinops orientalis Bitkisinin Sınıflandırılması

Alem : Plantae (Bitkiler) Şube : Magnoliophyta (Kapalı tohumlular, Angiosperms) Sınıf : Magnoliopsida ( İki çenekliler, Dikotiledonlar) Takım : Asterales Familya : Asteraceae (papatyagiller, Compositae) Tribus : Cardueae Subtribus : Echinopsidinae Cins : Echinops Tür : Echinops orientalis Trautv [44]

4.1. Asteraceae Familyasının Genel Özellikleri

“Asteraceae” ya da di ğer adıyla “Compositae” çiçekli bitkilerin en büyük familyasıdır. 1100 genus ve 25000 civarında türe sahiptir. Papatyagiller familyasına ait taksonlar Dünyanın ekvatoral ya ğmur ormanları hariç, tamamına yakın kısmında görülebilirler. Asterace familyasının ço ğu üyesi rizomlu çok yıllık otsular, herdem ye şil çalılar ya da yarıçalılardır. Bunların yanında kazık köklü ya da tuberli çok yıllık, iki yıllık ya da bir yıllık otsulara da sıkça rastlanır. Epifitler, sucul a ğaçsılar ve büyük a ğaçlar nadirdir. Bazıları gerçek tırmanıcı, sarılıcı ya da sukkulenttir [44].

4.2. Echinops Cinsinin Genel Özellikleri

Echinops L. cinsi Türkiye Florası’nın 5. cildinde Hedge tarafından yazılmı ştır. 11. ciltte (ek cilt 2) bir tür daha ilave edilmi ştir. Gövde dik, ço ğunlukla sadece en uç kısımlarda seyrek dallı, tüylü, nadiren tüysüzdür. Yapraklar alternat, pinnat parçalı şekilde bölünmü ş, ço ğunlukla dikenli, ço ğunlukla üzeri yumu şak tüylü, hatta bazen salgı tüylü, nadiren neredeyse tüysüzdür. Kapitulumlar tek çiçeklidir. Korolla, beyaz ya da açık maviden maviye kadar renklerdedir. Be ş lopludur. Stigma 2 parçalı, stillusun üst kısımlarında tüysü yapılar ta şıyan bir şişkinlik bulunur. Akenler i ğ şekilli, zayıf boyuna, yüzey üzerine paralel olarak yatık yo ğun uzun tüylerle çevrili, papus kısa fırça şeklinde serrat tüylerden olu şmu ş bir halkasal yapıdadır. Çok yıllık, çok nadiren iki yıllık ve çok ender olarak da tek yıllık otsulardır, step ve yarı-çöl bölgelerde da ğılmı ş ve özellikle de da ğların yarı-çöl ve step bölgelerinde ya şar, 125-130 civarında türe sahiptir [44].

4.3. Echinops orientalis’ in Genel Özellikleri

Endemik de ğildir. Kromozom sayısı 2n=28’dir. Çiçeklenmesi 6.-8. aylarda gerçekle şir. Ya şama ortamları step alanları kayalık ve ta şlık yamaçlar, tarla kenarları, Quercus ormanları, yol kenarlarıdır. Genel olarak Kafkasya, kuzey-batı, kuzey İran ve Türkiye’ de yayılı ş gösterir. İran-Turan elementidir. Türkiye’ de ise Anadolu da 32. boylamın do ğusunda kalan alanlarda yayılı ş gösterir. IUCN Tehlike Kategorisine göre tehlike altında de ğildir.

Gövde çok sayıda, kahverengimsi, fazlaca dallanır, 40–120 cm , 6 -20 mm çaplarına kadar geni şlemektedir. Taban yaprakları 28 – 39 cm arasında ortalama 34,87 ± 3,96 cm boyundadır. Çok sayıda de ğişik boylarda batıcı dikenler mevcut. Çiçekler küçük basit yapraklara sahip. Korolla koyu mavi, mavi ya da soluk mavidir [44].

Şekil 1.5. Echinops orientalis 4.4.Echinops Cinsine Ait Çalı şmalar ve Kullanımı

Echinops cinsine ait türler hakkında çok geni ş çapta bir çalı şma yoktur. Bitkinin çok dikenli olup kolaylıkla toplanamaması, hakkında çok ara ştırma yapılamamasına neden olmu ştur. Kuete ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmaya göre E. giganteus var. leyli türünün antimikrobiyal etkisi oldu ğu, kalp ve mide hastalıklarına kar şı geleneksel olarak kullanıldı ğı belirtilmi ştir [45].

Jaisval ve arkada şlarının E. humilis türü üzerinde yaptıkları bir çalı şmada UV’ ye kar şı korumada etkili oldu ğu ve herbivorlar ile patojenleri bitkilerden uzak tutmaya yaradı ğı tahmin edilen hydroksicinnamat isimli ikincil metabolitler elde edilmi ş ve profili çıkarılmı ştır [46].

Yine Özüdo ğru ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmada E. ritro türüne ait yaprakların gıda maddesi olarak tüketildi ği ortaya çıkarılmı ştır [47].

E. sphaerocephalus hakkında Iglinski ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şma ise bu türün bal üretimini arttırmak için kullanıldı ğını kaydetmi şlerdir [48].

Lamorde ve arkada şları yaptıkları çalı şmada E. amplexicaulis türünün Uganda’ da geleneksel olarak HIV’ e kar şı kullanıldı ğını [17]; Wondimu ve arkada şları E. hoehnelii türünün yılan sokması ve Malarya’ya kar şı kullanıldı ğını belirtmi şlerdir [49].

Lamberth tarafından yapılan bir çalı şmada E. sphaerocephalus türünden elde edilen bithienil maddesinin mantarlara kar şı etkili oldu ğu ortaya çıkarılmı ştır [50].

Erdo ğan ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmada [15] Echinops cinsi bitki türlerinin ekstraktlarının antimikrobiyal etkisi oldu ğu bulunmu ştur.

Jin ve arkada şlarının E. grijiisi türüyle yaptıkları çalı şmada kök kısmından elde edilen etanol ekstraktalarından izole ettikleri tiofeninin HepG2, K562, HL60 ve MCF-7 insan kanserli hücre hatlarına kar şı sitotoksik özelli ği oldu ğunu bulmu şlardır [51].

Singh ve arkada şları ise E. echinatus türünün etanol ekstraktlarının Hindistan’ da iltihaplanmalara kar şı kullanılan bir bitki türü oldu ğunu kaydetmi şlerdir [52].

Teklehaymanot ve arkada şları E. kebericho türünün Etiyopya’ da öksürük ve ba ş ağrısına kar şı kullanıldı ğını göstermi şlerdir [53].

Mhaske ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmada E. echinatus türünden uyu şturucu, sakinle ştirici, a ğrı kesici, anti-konvülzan, antibakterial, antidiabetik, iltihap giderici, öksürük giderici ve anti tümör özellikleriyle bilinen kuinazolinonların alkaloidlerinden olan ekhinozolleri elde etmi şlerdir [54]. Ayrıca kuinazolinonların E. ritro ve E. shaerocephalus türlerinden elde edildi ğini belirten çalı şmalar da vardır [55- 58].

Hymete ve arkada şları tarafından E. ellenbeckii ve E. longisetus üzerinde yapılan çalı şmada, örneklerin metanol ekstratlarının bazı mikroorganizmalar üzerinde etkili olduklarını bulmu şlardır [58].

Barbour ve arkada şları tarafından E. gaiilardoti türü üzerinde yapılan bir çalı şmada bitkinin çiçeklerinin Escherichia coli , Proteu s sp., Pseudomonas aeruginosa , Shigella dysenteriae , Salmonella enteritidis , Salmonella typhi , Staphylococcus aureus , Streptococcus faecalis , ve Canadida albicans organizmalarına kar şı etkili oldu ğu bulunmu ştur [59].

Sharma ve arkada şlarının yaptı ğı çalı şmada, Hindistan’ da fitoterapide geleneksel olarak kullanılan E. niveus türüne ait kök kısmının öksürük ve astıma kar şı kullanıldı ğı belirtilmi ştir [60].

Unny ve arkada şları tarafından yapılan çalı şmada E. echinatus türüne ait kök kısmının %50 alkollü ekstraktının sperm hareketsizli ğine yol açtı ğını belirtilmi ştir [61].

Aburjai ve arkada şları E. polyceras türünden elde ettikleri metanol ekstraktlarının P. aeruginos a’ ya ait iki su ş üzerindeki dirençlili ğini ara ştırmı şlardır [62].

Graham ve arkada şlarının yapmı ş oldukları çalı şmada E. grijisii türüne ait köklerin hepatomada, kanser tedavisinde ve kemik tümörlerinde; E. latifolius türüne ait kök örneklerinin ise kanser ve tümörü iyile ştirmede kullanıldı ğını rapor etmi şlerdir [63].

Merzouki ve arkada şları Fas’ ta E. spinosus türünün hipoglisemiye kar şı geleneksel olarak kullanıldı ğını kaydetmi şlerdir [64].

Sharma ve Sharma tarafından yapılan bir çalı şmada ise E. echinatus’ un geleneksel tıpta Plasmodium falciparum’ a kar şı kullanıldı ğını belirtilmi ştir [65].

Nyman ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmada ise E. echinatus ’ a ait kök kısımlarının yılan sokmasına kar şı kullanıldı ğı bildirilmi ştir [66].

Sing ve arkada şları tarafından yapılan bir çalı şmada Echinops cinsi türlerinin flavanoid ve antihelmintik (ba ğırsak solucanı dü şürücü) aktiviteye sahip olan tiyofen asetilen bile şenlerini içerdi ği saptanmı ştır [67, 68, 58].

Dawit ve Ahadu tarafından yapılan çalı şmada Echinops cinsinin bazı türlerinin Etiyopya geleneksel tıbbında, migren, diare, kalp ağrısı, enfeksiyonların farklı formları, ba ğırsak kurdu istilası, hemoroid ve di ğer bazı hastalıkların tedavisinde kullanıldı ğı ifade edilmi ştir [69, 58].

Günümüze kadar yapılan çalı şmalar incelendi ğinde E. orientalis türüne ait bir çalı şmaya rastlanmamı ştır. Bu nedenle bu çalı şmada, E. orientalis türüne ait örneklerin kök kısımlarının metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının antimikrobiyal ve in vitro MCF-7, PC-3 ve fibroblast hücre kültürlerindeki sitotoksik etkilerinin ara ştırılması amaçlanmı ştır. Bu amaçla çalı şmamızda, antimikrobiyal aktivitenin incelenmesi için disk difüzyon ve M İK testleri ile sitotoksisite ara ştırması için günümüzde en çok kullanılan MTT testi gerçekle ştirilmi ştir.

2. BÖLÜM

GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Bitkisel Materyal

Bu çalı şmada Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısımları kullanıldı.

2.2. Bitkilerin Toplanması

Çalı şmada kullanılan bitkiler Kayseri Tavlusun Köyü yakınındaki habitatlarından toplandı (CV4806 numaralı kayıtlı örnek). Bitkiler Erciyes Üniversitesi Biyoloji Bölümü Ö ğretim Üyesi Doç. Dr. Cem VURAL tarafından te şhis edildi.

2.3. Bitki Ekstraktlarının Hazırlanması

Toplanan örneklere ait kök kısımları temizlenerek üzerinden toprak vb. maddelerin uzakla ştırılması sa ğlandı. Bahçe makasıyla küçük parçalara ayrılan kökler mutfak robotu yardımıyla toz haline getirildi. Toz halindeki bu örneklerden 10-12 gr tartılarak 250 ml metanol, kloroform ve hekzanın kullanıldı ğı üç çözücü ile ekstrakte edildi. Çözücü olarak metanol, kloroform ve hekzan (Merck) kullanıldı. Soksolet cihazı ( Şekil 2.1.) yardımıyla en az 6 saat (ekstrakt sabit bir renk alana kadar) ekstraksiyon yapıldı. Bu ekstrakttan evoporasyon cihazı (Heidolph, laborota 4000) yardımıyla çözücülerin uçması sa ğlanarak sadece bitki materyaline ait ekstrak edildi ve sonraki uygulamalar için +4 °C’ de muhafaza edildi.

Şekil 2. 1. Soksolet cihazı

2.4. Antimikrobiyal Testlerde Kullanılan Mikroorganizmalar

Antimikrobiyal testlerde 14 bakteri türü ve 1 fungus türü olmak üzere toplam 15 standart organizma ile çalı şıldı. Kullanılan su şlara ait kod numaraları Tablo 2.1.’ de sunuldu ğu gibidir.

Tablo 2.1. Kullanılan organizmalar ve kültür koleksiyon merkezi (ATCC) kodları

MİKROORGAN İZMA ORGAN İZMA KODU 1 Bacillus cereus ATCC 11778 2 Bacillus subtilis ATCC 6633 3 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 4 Enterococcus faecalis ATCC 29212 5 Escherichia coli ATCC 25922 6 Klebsiella pneumonia ATCC 13883 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 8 Staphylococcus aureus ATCC 25923 9 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 10 Listeria monocytogenes ATCC 19115 11 Micrococcus luteus ATCC 10240 12 Pseudomonas fluorescens ATCC 49838

13 Corynebacterium renale ATCC 19412 14 Proteus mirabilis ATCC 25933 15 Candida albicans ATCC 90028

2.5. Antimikrobiyal Aktivite Testleri

Ekstratların antimikrobiyal aktiviteleri disk difüzyon testi ve mikrodilüsyon yöntemi (M İK) kullanılarak de ğerlendirildi.

2.5.1. Disk Difüzyon Metodu

Mikroorganizmaların ilk inkübasyonu, -80 °C’ de muhafaza edilen stok su şlardan tek koloni olu şturulacak şekilde petrilere ekilmesiyle yapıldı. Organizmalar 37 °C’ de 24 saat inkübe edilerek üretildi. Su şların üretiminde için bakterilerde Triptik Soy Agar (TSA-Acumedia) maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Agar (YPDA-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Katı besiyerinde inkübe edilen organizmalardan tek koloni alınarak sıvı besiyerine ekim yapıldı. Bakteriler için Triptik Soy Broth (TSB- Acumedia), maya için ise Yeast Pepton Dekstroz Broth (YPDB-Acumedia) besiyerleri kullanıldı. Çalkalayıcıda (GFL 3031) 16-20 saat süren inkübasyonun ardından 200 µl alınarak tekrar aynı sıvı besiyerlerinde 4-5 saat süren bir inkübasyon daha yapıldı. Bunun amacı disk difüzyon ve M İK testlerinde kullanılacak mikroorganizmaların mümkün oldu ğunca genç bireylerden olu şmasını ve spektrofotometre ile yapılan ölçümlerde ölü organizma sayısının en aza dü şürülmesini sa ğlamaktır.

Ekstraktların antimikrobiyal aktiviteleri National Commitee for Clinical Laboratory Standarts tarafından önerilen yönteme göre disk difüzyon tekni ği ile yapılmı ştır.

Organizmaların petrilere e şit sayıda dü şmesini sa ğlamak için laboratuvarımızda yapılan mikroorganizma çalı şmaları için daha önceden belirlenen bakteri seyreltme katsayıları kullanıldı. Bu i şlem için CFU (colony forming unit/ml) testi yapıldı. CFU testinde sıvı besiyerinde ikinci inkübasyondan sonra mikroorganizmaların optik dansiteleri 0,1’e (Hitachi U-1800) ayarlandı. Sonuçlar de ğerlendirilerek her bir mikroorganizma için optimum seyreltme katsayıları belirlendi ve sonraki denemelerde bu seyreltmeler

kullanılarak ekimler yapıldı [15]. Belirlenen seyreltme katsayıları Tablo 2.2.’ de görüldü ğü gibidir.

Sıvı besiyerinde üretilip seyreltmeleri yapılan mikroorganizmalar bakteriler için hazırlanan Müller Hinton Agar (MHA- Acumedia) ve maya için hazırlanan YPDA besiyerlerine ekildi. Ekim i şlemi yapılırken mikroorganizmalar petri üzerine pipetlenip steril eküvyon çubu ğu ile e şit miktarda yayılıp 10–15 dakika laboratuvar ko şullarında bekletildi. Tablo 2.2. Mikroorganizmalar ve seyreltme katsayıları

MİKROORGAN İZMA SEYRELTME

KATSAYISI

1 Bacillus cereus 1/8

2 Bacillus subtilis 1/16

3 Enterobacter aerogenes 1/16

4 Enterococcus faecalis 1/16

5 Escherichia coli 1/16

6 Klebsiella pneumonia 1/8

7 Pseudomonas aeruginosa 1/16

8 Staphylococcus aureus 1/8

9 Staphylococcus epidermidis 1/8

10 Listeria monocytogenes 1/16

11 Micrococcus luteus 1/8

12 Pseudomonas fluorescens 1/8

13 Corynebacterium renale 1/8

14 Proteus mirabilis 1/16 15 Candida albicans 1/2

Her bir diske emdirilecek bitki ekstraktları ise DMSO’ da (Merck) çözdürülerek hazırlandı. Metanol esktraktı 24 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları ise 12 mg/ml olacak şekilde hazırlanarak disklere 30 µl emdirildi. Disklerin ekstraktları tamamen

emmesi beklendikten sonra ekim yapılan petrilere aseptik olarak yerle ştirilerek 37 °C’ de 24 saat inkübe edildi. Antimikrobiyal aktivite; bakteri ya da maya üremesinin az oldu ğu daha şeffaf olan zon çapı kumpas yardımıyla ölçülerek kaydedildi. Her bir örnek için, iki ayrı ba ğımsız set düzenlendi. Negatif kontrol olarak sadece örneklerin çözeltilerinin hazırlandı ğı çözücü (DMSO) kullanıldı. Ayrıca pozitif kontrol olarak laboratuvarımızda daha önce yapılan standart pozitif kontrol testleri tekrarlandı. Bunun için 50 µg /disk ampisilin, 30 µg /disk tetrasiklin, 30 µg /disk trimetoprim, 30 µg /disk nistatin, ve 40 µg /disk mikanozol (Sigma), kullanıldı. Nistatin ve mikanozol uygulaması yalnızca maya için kullanıldı. Antibiyotik denemeleri tek set olarak gerçekle ştirildi.

2.5.2. Mikrodilüsyon Metodu

Ekstraksiyonu yapılan bitkilerin Minumum İnhibisyon Konsantrasyonu (M İK) mikro dilüsyon yöntemiyle çalı şıldı. Ekstraktlar DMSO’da çözülerek metanol esktraktı için 8 mg/ml, kloroform ve hekzan esktraktları için ise 4 mg/ml’ lik ara stoklar hazırlandı. 96 kuyucuk içeren U tabanlı ELISA kaplarının ilk kuyucuklarına belirlenen ekstraktlardan 200 µl, geri kalan bütün kuyucuklara ise 100 µl besiyeri eklendi. Ardından stok konsatrasyonlarının eklendi ği ilk kuyucuktan 100 µl alınarak ikinci kuyucu ğa eklendi ve bu i şlemler son kuyucu ğa gelene kadar bu şekilde devam ettirilerek her kuyucuktaki konsantrasyonun bir öncekinin yarısı olacak şekilde seyreltilmesi sa ğlandı. Böylece metanol ekstraktı için kullanılan konsantrasyonlar 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ve 0,062 mg/ml olurken; kloroform ve hekzan için kullanılan konsantrasyonlar 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,062 mg/ml, 0,031 mg/ml oldu. Bu i şlemin ardından her kuyucu ğa 90 µl besiyeri eklendi ve son olarak da her kuyucu ğa 10 µl organizma (optik densiteleri ayarlanmı ş ve seyreltmeleri yapılmı ş) pipetlenerek 24 saat 37 °C’ lik inkübasyonun ardından de ğerlendirmeler yapıldı. Aynı ELISA pleytinde pozitif ve negatif kontroller de denendi. Ayrıca ampisilin, tetrasiklin ve trimetaprim antibiyotikleri bakteriler üzerinde, nistatin ve mikanozol ise maya üzerinde denenerek MİK de ğerleri belirlendi ve kar şıla ştırmaları yapıldı.

2.6. Hücre Kültürü

2.6.1 Hücrelerin Temini

Çalı şmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 hücreleri Gülhane Askeri Tıp Akademisi Sa ğlık Bilimleri Enstitüsü Ara ştırma Geli ştirme Merkezi, Kanser ve Tıbbi Laboratuar Ara ştırma Kısmı’ ndan, fibroblast hücreleri ise Erciyes Üniversitesi, Hücre Kültür Bankasından temin edildi.

2.6.2. Hücrelerin Büyütülece ği Mediumun Hazırlanması

Çalı şmada kullanılan MCF-7 ve PC-3 kanserli hücre hatları için RPMI-1640 (Biological Industries), sa ğlıklı fibroblast hücre hattı içinse %1 glukoz içeren DMEM (Biological Industries) mediumu kullanıldı. Bazal mediumlara %10 FBS (Biological Industries), %1 L-glutamin (Biological Industries) ve %1 penisilin-streptomisin (Invitrogen) antibiyotik karı şımı eklenerek tamamlanmı ş medium elde edildi.

2.6.3. Hücrelerin Kültür Basamakları

Sıvı azot tankından çıkarılan kryo tüp içerisinde donmu ş haldeki hücreler su banyosunda hafifçe sallanarak çözüldü. Hücrelerin DMSO’nun (Sigma) zararlı etkisinden kurtulması için steril bir santrifüj tüpüne alınıp üzerine medium eklenerek 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası tüpün içindeki süpernatant atılıp pellet üzerine 5 ml medium eklenerek pellet süspanse hale getirildi ve büyümesi için

T25 flaska ekilerek 37 °C’, %5 CO 2’li inkübatöre (Sanyo) kaldırıldı. Hücreler her gün düzenli olarak kontrol edilerek büyümeleri gözlendi. Hücre yo ğunlu ğunun %80 konflüense ula şmasını takiben flask yüzeyi PBS (Biological Industries) ile yıkanarak hücreler 5 dakika boyunca tripsine (Biological Industries) maruz bırakıldı. Tripsinizasyon sonrası flask yüzeyinden ayrılan hücreler üzerlerine medium eklenerek santrifüj tüpüne alındı ve yine 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edildikten sonra pellet süspanse edilerek hücrelerin ço ğalması için daha büyük bir alana sahip ba şka bir flaska ekildi. Devam edecek i şlemler için gerekecek hücreler ise kryo tüpe alınarak azot tankında saklandı. Bu i şlem için tripsinizasyon sonrası hücreler her kryo tüpte

1.000.000 hücre olacak şekilde ayarlandı ve santrifüj edildi. Pellet üzerine %90 FBS ve %10 DMSO içeren dondurma mediumu eklenerek hücreler süspanse edildi ve kryo tüpe alındı. Kryo tüpler ise dondurma kabına (Nalgene-Mr. Frosty) yerle ştirilerek -80 °C’ ye kaldırıldı. 24 saat sonra -80 °C’ de bekletilen hücreler azot tankına yerle ştirildi.

2.6.4. Hücrelerin Sayımı

Çalı şmada kullanılacak hücrelerin sayımı “Thoma lamı” adı verilen, üzerinde mikroskobik enine ve boyuna çizgilerin bulundu ğu özel bir lam kullanılarak yapıldı. Bunun için bir ependorf tüpün içine 0,9 ml santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler ve 0,1 ml tripan mavisi (Sigma) eklenerek oda sıcaklı ğında 5 dakika bekletildi. Ardından üzerine lamel kapatılan Thoma lamına ependorf tüp içindeki karı şımdan 10 µl alınırak sayım yapıldı. Hücrelerin mililitredeki sayısı;

“Hücre sayısı/ml= (Sayılan hücre miktarı X Dilüsyon oranı X 10 4)/9” formülü kullanılarak hesaplandı.

2.6.5. Hücrelerin ELISA Pleytlerindeki Optimizasyonu

Çalı şmada kullanılan hücrelerin morfolojileri, hücre- hücre etkile şimi ve dolayısıyla ELISA pleytlerindeki herbir kuyucukta kapladıkları alan sayısı çalı şmanın sa ğlıklı olarak de ğerlendirilmesinde çok büyük bir önem ta şır. Bu yüzden santrifüj sonrası süspanse edilen hücreler sayılarak belirli oranlarda seyreltilip ELISA pleytlerinin her bir kuyucu ğuna ekildi. Hücrelerin ilaç etkile şimi ve normal büyüme hızları göz önüne alınarak MCF-7 için 10.000, PC-3 için 6.000 ve fibroblast için 8.000 hücre sayısı hücrelerin her bir kuyucukta büyüyebilece ği optimum sayılar olarak belirlendi.

2.6.6. Hücreler Üzerindeki Etkisi İncelenecek Ekstraktların Optimizasyonu

Hücrelere etkisinin ara ştırılaca ğı bitki ekstraktlarının optimizasyonu yapılırken benzer çalı şmalarda kullanılan dozlar denendi. Bunun için bitki ekstraktları DMSO’ da çözülerek 20 µg/ml, 200 µg/ml ve 1000 µg/ml olacak şekilde ara stoklar hazırlanarak 24, 48 ve 72 saatlik MTT deneyi yapıldı. Bu deney sonucunda elde edilen sonuçlara göre 20 µg/ml’lik ara stok konsantrasyonunun hücreler üzerinde bir etkisi olmadı ğı

görüldü ğünden metanol ekstraktından 2000 µg/ml, 1800 µg/ml, 1600 µg/ml, 1400 µg/ml ve 1200 µg/ml’lik; kloroform ve hekzan ekstraktlarından ise 1400 µg/ml, 1200 µg/ml, 1000 µg/ml, 800 µg/ml ve 600 µg/ml’lik ara stoklar hazırlandı. Bu ara stoklar hücrelere verilmeden önce 0,22 µm‘ lik filtrelerden geçirilerek steril edildi.

2.6.7. MTT Test Metodu

MTT (Serva) testinin yapılması için gereken toplam hücre sayısı belirlendi ve hücreler bu sayıya ula şana kadar flasklarda ço ğaltıldı. Hücrelerin istenilen toplam sayıya ula şmasından sonra tripsinizasyonla ekili oldukları flask yüzeyinden kaldırıldı ve santrifüjlendi. Santrifüj sonrası elde edilen pellet süspanse edilerek F tabanlı, ELISA pleytlerine ekim yapıldı. Hücre ve ilaç etkile şiminin sonuçlarını görmek için 24, 48 ve 72 saatlik düzenekler hazırlandı. 100 µl hücre her bir kuyucu ğa ekildikten 24 saat sonra bütün kuyucuklara, belirlenen konsantrasyondaki ekstraktlardan 100 µl eklendi. İlaçların eklenmesinden sonraki 24, 48 ve 72. saatlerde hücrelere herbir kuyucuktaki son konsantrasyon 0,5 mg/ml olacak şekilde ayarlanan 5 mg/ml konsantrasyonuna sahip MTT solüsyonu eklendi. Bu i şlemden sonra invert mikroskop altında incelenen hücrelerin formazan kristalleri olu şturdu ğu gözlendi. Bu formazan kristallerini de çözmek için 100 µl isopropil alkol (Merck) kullanıldı ve formazan kristallerinin çözülmesiyle olu şan mor rengin absorbansı 570 nm’ de ELISA okuyucuda (Mikroquant-Biotek) okundu. Her bir deney birbirinden ba ğımsız bir set olarak 3 tekrarlı yapıldı. Deney düzene ğinde negatif kontrol olarak, belirlenen bazı kuyucuklara bitki ekstraktı eklenmedi. Elde edilen absorbans sonuçları de ğerlendirilirken, ekstrakt eklenerek ekstrakt etkile şimine bakılan kuyucuklardan elde edilen absorbans de ğerinin, ekstrakt eklenmeyen hücrelerin ekili oldu ğu kuyucuklardan elde edilen absorbans de ğerine oranı alındı. İlaçla etkile şime girmeyen negatif kontrolde kullanılan hücrelerin absorbansı %100 canlılık de ğeri olarak kabul edilirken, di ğer kuyucuklardaki absorbansın bu absorbansa oranı o kuyucuktaki hücrelerin yüzde canlılı ğını verdi. Çalı şmalardan elde edilen veriler SPSS istatistik analiz programı kullanılarak standart hatalar belirlenmi ştir. Elde edilen verilerin anlamlılı ğını belirlemek için ANOVA ve Tukey testi kullanılmı ştır.

3. BÖLÜM

BULGULAR

3.1. Ekstraksiyon Verimi

Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısımlarının ekstraksiyonu için metanol, kloroform ve hekzan olmak üzere üç de ğişik çözücü kullanılmı ştır. Ekstraksiyon i şlemi Soksolet cihazı ile yakla şık 6 saat boyunca çözücünün rengi sabitlenene kadar gerçekle ştirilmi ştir. Kurutma i şlemi vakum altında yapılmı ştır. Metanol ekstraktından en yüksek miktarda kuru madde eldesi sa ğlanmı ştır. Elde edilen verimlilik sonuçları Tablo 3.1.’ de gösterilmi ştir.

Tablo 3.1. Ekstraktların verimlilik sonuçları

Kuru madde Elde edilen özüt Elde edilen özüt miktarı (gr) miktarı (gr) yüzdesi (%) Metanol 12 1,15 9,5 Kloroform 12 0,277 2,3 Hekzan 12 0,117 0,9

3.2. Bitki Ekstraktlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri

Echinops orientalis türüne ait metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının disk- difüzyon denemeleri sonucunda elde edilen veriler de ğerlendirildi ğinde bitki ekstraktlarının test edilen konsantrasyonlarda test edilen organizmaya kar şı etkili olmadıgı tespit edilmi ştir. Sadece S. epidermidis ve B. cereus bakterilerinde, ekstraktların emdirildi ği disklerin etrafında daha şeffaf bir bakteri zonu gözlenmi ştir. Negatif kontrol olarak ekstraktların çözüldü ğü dimetilsülfoksid emdirilen disklerin hiçbir organizma üzerinde inhibisyon zonu olu şturmadı ğı görülmü ştür. Standart antibiyotiklerin olu şturdu ğu zon çapları inhibisyon zon çapından disk çapı çkarılarak hesaplanmı ştır. Standart antibiyotiklerin olu şturdu ğu zonlar ise Tablo 3.2.’ de verilmi ştir.

Tablo 3.2. Standart antibiyotiklerin olu şturdu ğu zonlar

a: etki gözlenmemi ştir b: etki gözlenmi ştir

3.3. Mikrodilüsyon Sonuçları

Minimum inhibisyon konsantrasyonu denemelerinde organizmanın üremesini engelleyen konsantrasyon belirlenmeye çalı şılmı ştır. Negatif kontrol sütununa organizma eklenmemi ş; sadece ekstraktlarının seri dilüsyonları aktarılmı ştır. Bu sayede özütlerden kaynaklanabilecek bulanıklı ğın kontrolü sa ğlanmı ştır. H sütununa ise sadece besiyeri ve organizma ilave edilerek pozitif kontrol olarak de ğerlendirilmi ştir. Ancak, yapılan denemelerde mikrodilüsyon sonuçlarından da organizmaları öldürmeye yetecek bir konsantrasyon bulunamamı ştır. Standart antibiyotiklerin M İK sonuçları Tablo 3.3., 3.4., 3.5. ve 3.6.’ da verildi ği şekildedir.

Tablo 3.3. Ampisilin M İK sonuçları

a: etki gözlenmemi ştir b: etki gözlenmi ştir

Tablo 3.4. Tetrasiklin M İK sonuçları

a: etki gözlenmemi ştir b: etki gözlenmi ştir

Tablo 3.5. Trimetoprim M İK sonuçları

a: etki gözlenmemi ştir b: etki gözlenmi ştir

Tablo 3.6. Nistatin ve mikanazol M İK sonuçları

3.4. Bitki Ekstraktlarının Kültür Hücreleri Üzerine Etkileri

Bitkisel ekstraktların in vitro şartlarda meme kanseri hücre hattı MCF-7, prostat kanseri hücre hattı PC-3 ve kansersiz, sa ğlıklı hat olarak kullanılan fibroblast hücre hattına etkilerini ara ştırmak amacıyla yapılan bu çalı şmada kullanılan ekstraktlar ve konsatrasyonlarıyla ilgili sonuçlar şu şekilde bulunmu ştur.

3.4.1. Bitki Ekstraktlarının MCF-7 Hücre Hattı Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının meme kanseri hücresi MCF-7 üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmı ş ve hücreler her a şamada morfolojik olarak da de ğerlendirilmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3.7.’ de özetlenmi ştir.

Tablo 3.7.’ deki de ğerlere bakıldı ğında MCF-7 hücrelerinin %50’sini öldüren de ğerlerin 24 saatlik etkile şimle 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı (Şekil 3.2.) ve 600 µg/ml’ lik (Şekil 3.3.) kloroform ekstraktının oldu ğu gözlenmi ştir. Uygulanan dozlardan hiçbirisi MCF-7 hücrelerini tamamen öldürmeye yeterli olmamı ştır. Yapılan istatistiksel de ğerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmu ştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine göre ise ( Şekil 3.4.) metanolün 24 saatlik denemede 800 µg/ml ile 700µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 900 µg/ml, 800 µg/ml ile 700 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µg/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; hekzan ekstraktının ise 24 saatlik denemede 600µg/ml, 500 µg/ml, 400 µg/ml ile 300 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede bütün konsantrasyonlar arasında ve 72 saatlik denemede 600 µg/ml, 500 µg/ml, 400 µg/ml ve 300 µg/ml’lik konsantrasyonları arasında önemli bir fark olmadı ğı belirlenmi ştir.

Tablo 3.7. Ekstraktların MCF-7 hücreleri üzerindeki etkisi

Metanol Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 1000 µg/ml 900 µg/ml 800 µg/ml 700 µg/ml 600 µg/ml

24 saat 50 ±1,4 78 ±1,4 83 ±3,3 85 ±1,2 95 ±0,33

48 saat 6±0,5 26 ±2,6 52 ±1,2 60 ±1,2 60 ±1,4

72 saat 2±0 5±0,3 5±0,57 9±0 16 ±2,02 Kloroform Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 µg/ml 600 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml 300 µg/ml

24 saat 16 ±0,33 50 ±0,88 64 ±1,4 77 ±2,0 78 ±0,3

48 saat 5±2,0 7±0 14 ±2,6 56 ±2,9 76 ±1,2

72 saat 3±0,3 7±0,6 18 ±0 31 ±0,3 36 ±0,5 Hekzan Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 600 500 400 300

24 saat 2±1,0 8±0,3 9±1,2 9±0,6 11 ±0,6

48 saat 4±1,2 5±0,6 10 ±2,3 12 ±0,6 14 ±0,8

72 saat 1±1,0 3±0,3 4±1,0 4±0 5±0,8

Şekil. 3.1. MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.2. 1000 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.3. 600 µg/ml’lik kloroform ekstraktı uygulanan MCF-7 hücrelerinin sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.4. MCF-7 hücrelerinin Tukey testi sonuçları

3.4.2. Bitki Ekstraktlarının PC-3 Hücre Hattı Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktların prostat kanseri hücresi PC-3 üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmı ş ve hücreler her aşamada morfolojik olarak da de ğerlendirilmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3.8.’ de özetlenmi ştir.

Tablo 3.8. de ğerlere bakıldı ğında PC-3 hücrelerinin %50’sini öldüren dozların 24 saatlik etkile şimle 900 µg/ml’lik metanol (Şekil 3.4.) ve 300 µg/ml’ lik kloroform (Şekil 3.5.) ekstraktlarının oldu ğu söylenebilir. Hekzan ekstraktının ise 24 saatlik etkile şimle 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ve 400 µg/ml konsantrasyonlarının ve 48 saat etkile şimle 700 µg/ml, ve 600 µg/ml konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yeterli bulunmu ştur. Yapılan istatistiksel de ğerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmu ştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine (Şkeil 3.8.) göre ise metanolün 24 saatlik denemede 800 µg/ml, 700µg/ml ile 600 µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 900 µg/ml, 800 µg/ml, 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 1000 µg/ml, 900 µg/ml, 800 µg/ml ile 700 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 600 µg/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µg/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; hekzan ekstraktının ise 24 saatlik denemede 700µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 700 µg/ml, 600 µg/ml ile 500 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında ve 72 saatlik denemede 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ve 300 µg/ml’lik konsantrasyonları arasında önemli bir fark olmadı ğı belirlenmi ştir.

Tablo 3.8. Ekstraktların PC-3 hücreleri üzerine etkisi

Metanol Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 1000 µg/ml 900 µg/ml 800 µg/ml 700 µg/ml 600 µg/ml 24 saat 37 ±0,6 48 ±0,3 62 ±2,4 70 ±0,6 72 ±0,6

48 saat 9±0,88 10 ±1,2 12 ±1,5 14 ±2,0 16 ±0,8

72 saat 3±0 4±0,3 5±0,6 10 ±0,5 15 ±1,15 Kloroform Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 µg/ml 600 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml 300 µg/ml

24 saat 24 ±1,4 37 ±0,3 38 ±0,81 44 ±0,3 48 ±0,8

48 saat 1±0,57 15 ±0,8 16 ±0 17 ±0,6 34 ±0,3

72 saat 1±0 4±0,8 15 ±0,8 21 ±1,15 37 ±2,3 Hekzan Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 600 500 400 300

24 saat - - - - 17 ±0,3

48 saat - - 1±0,6 7±0,5 15 ±3,17

72 saat 1±0 3±1,0 3±0,6 10 ±0,3 16 ±1,0

Şekil 3.5. PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.6. 900 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan PC-3hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.7. 300 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan PC-3 hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.8. PC-3 Hücrelerinin Tukey testi sonuçları 3.4.3. Bitki Ekstraktlarının Fibroblast Hücreleri Üzerine Etkisi

Echinops orientalis bitkisinden elde edilen metanol, kloroform ve hekzan ekstraktlarının kansersiz hücre hattı olan fibroblast hücresi üzerindeki etkileri pozitif kontrol olarak 24, 48 ve 72 saatlik deney düzenekleri kurularak incelenmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisini sayısal olarak ölçmek için MTT testi yapılmı ş ve hücreler her a şamada morfolojik olarak da de ğerlendirilmi ştir. Ekstraktların hücreler üzerindeki etkisi Tablo 3. 9.’ da özetlenmi ştir.

Tablo 3. 9. Ekstraktların Fibroblast hücreleri üzerine etkisi

Metanol Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 1000 µg/ml 900 µg/ml 800 µg/ml 700 µg/ml 600 µg/ml

24 saat 39 ±0,6 39 ±0,3 49 ±0,8 59 ±0,3 60 ±1,3

48 saat 3±0,6 18 ±0,8 21 ±0,8 36 ±2,02 40 ±0,6

72 saat - - 5±0 11 ±0,3 15 ±0,8 Kloroform Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 µg/ml 600 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml 300 µg/ml

24 saat 47 ±0,3 56 ±1,85 64 ±0,8 89 ±1,0 92 ±0,3

48 saat 19 ±4,6 38 ±0,3 43 ±1,4 50 ±1,4 59 ±1,0

72 saat 29 ±1,2 34 ±0,6 38 ±0,3 44 ±0,8 60 ±0 Hekzan Ekstraktı Ya şama Uygulanan konsantrasyonlar yüzdeleri 700 µg/ml 600 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml 300 µg/ml

24 saat 21 ±0,5 31 ±0,5 61 ±2,02 67 ±0,8 85 ±0,3

48 saat 19 ±1,2 27 ±0,3 58 ±2,3 64 ±0 93 ±1,1

72 saat 21 ±0,3 36 ±2,0 41 ±0,6 83 ±0,6 98 ±0,67

Tablo 3.9.’ daki de ğerlere bakıldı ğında fibroblast hücrelerinin %50’ sini öldüren dozların 24 saatlik etkile şimle 800 µg/ml’ lik metanol (Şekil 5.6.) ve 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktlarının (Şekil 5.7.) oldu ğu gözlenmi ştir. Metanol ekstraktının ise 72 saatlik etkile şimle 1000 µg/ml ve 900 µg/ml’ lik konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yeterli bulunmu ştur. Yapılan istatistiksel de ğerlendirmeler sonucu 24, 48 ve 72 saatlik denemeler arasında önemli bir fark bulunmu ştur (p<0,05 ANOVA). Tukey testine ( Şekil 3.12.) göre ise metanolün 24 saatlik denemede 1000 µg/ml, ile 900 µg/ml’lik konsatrasyonları arasında, 48 saatlik denemede 900 µg/ml ile 800 µg/ml ve 700 µg/ml ile 600 µg/ml’ lik konsatrasyonları arasında ve 72 saatlik denemede 1000 µg/ml ile 900 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında; kloroform ekstraktının 24 saatlik denemede 400 µg/ml ile 300 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında, 48 saatlik denemede 600 µg/ml, 500 µg/ml ile 400 µg/ml’ lik konsatrasyonlar arasında önemli bir fark olmadı ğı belirlenmi ştir.

Şekil 3.9. Fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.10. 800 µg/ml’ lik metanol ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.11. 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktı uygulanan fibroblast hücrelerinin 24 saat sonraki mikroskobik görüntüsü a. MTT uygulamasından önce, b. MTT sonrası formazan kristalleri (x20)

Şekil 3.12. Fibroblast hücrelerinin Tukey testi sonuçları

Bütün tablolardaki de ğerler birlikte de ğerlendirildi ğinde metanol ekstrakt konsatrasyonunun, kloroform ve hekzan ekstrakt konsantrasyonlarından fazla olmasına ra ğmen MCF-7 ve PC-3 hücrelerinin ya şama yüzdesinin daha yüksek oldu ğu görülmektedir. Fibroblast hücrelerinde ise tam tersi bir durum söz konusudur. Metanol ekstraktı fibroblast hücrelerini di ğer hücreleri etkiledi ğinden daha fazla etkilemi ştir.

Kloroform ve hekzan ekstraktları kar şıla ştırıldı ğında ise hekzan ekstraktının çalı şılan üç hücre üzerinde de daha ölümcül bir etkiye sahip oldu ğu görülmektedir.

Ayrıca 24, 48 ve 72 saatlik sonuçlar kar şıla ştırıldı ğında hücrelerin ekstraktla etkile şim zamanının artmasıyla birlikte hücre ölümlerinin de arttı ğı söylenebilir.

Hücrelerin MTT uygulaması öncesi ve sonrası, formazan kristallerinin olu ştu ğu zaman, yapılan mikroskopik incelemede ise, ekstrakt etkileşimine ba ğlı olarak hücrelerin morfolojilerinin de ğişti ği ve daha yuvarlak bir hal aldıkları görülmü ştür. Ayrıca metanol ekstraktının di ğer ekstraktlara oranla hücre şeklerinin bozulmasında daha az etkili oldu ğu saptanmı ştır.

4. BÖLÜM

TARTI ŞMA–SONUÇ VE ÖNER İLER

İnsanların yüzyıllardır kullandıkları ve faydalı oldu ğunu dü şündükleri bitkilerin gerçekten etkili olup olmadıklarını ara ştırmak, kullanılan sentetik ilaçların toksik etkisi, bakterilerin antibiyotik direnci geli ştirmesi ve kanser hücrelerinin ilaçlara dirençlilik gösterebilmesi tıbbi bitkilerin tedavi edici özellikleri üzerindeki ara ştırmalara yo ğunluk kazandırmı ştır [15]. Literatürde Echinops cinsi üyelerinin antimikrobiyal ve antikanserojen aktiviteleri üzerine yapılmı ş çalı şmalar sınırlı sayıdadır ve Echinops orientalis türü üzerine yapılmı ş bir çalı şmaya rastlanmamı ştır.

Yapılan bu çalı şmada, Türkiye’ nin karasal bölgelerinde daha genel yayılı şa sahip Echinops orientalis türüne ait örneklerin kök kısmından elde edilen ekstraktların, in vitro antimikrobiyal ve antikanserojen aktivitesi incelenmi ştir.

4.1. Ekstraksiyon Verimi

Echinops orientalis örnekleriyle yapılan üç çözücü ekstraksiyon verimi kar şıla ştırıldı ğında metanol ekstraksyonu veriminin di ğer organik çözücülerden en az 4- 10 kat daha fazla oldu ğu gözlenmi ştir. En dü şük verim yüzdesi ise % 0.9 ile hekzan ekstraksyonlarında oldu ğu gözlemlenmi ştir. Erdo ğan ve ark. yaptıkları çalı şmada da Echinops cinsi bitki türleri, aynı çözücülerle ekstrakte etmi ş ve en dü şük verim hekzanda, en yüksek verim ise metanolde bulmu şlardır. Metanol gibi alkol türevli bile şik, antosiyanin, terpenoid, saponin, tanin, ksantoksilin (xanthoxylline), totarol, kuassinoid, lacton, flavon, fenon ve polifenolleri; kloroform gibi klorlu bile şikler terpenoid ve flavonoidleri [12]; hekzan gibi alkanlar ise ya ğ asitlerini çözdü ğü için, çalı şmamızda çözücülerin uçurulması sonucu elde etti ğimiz ekstrakt verimleri literatürü desteklemektedir.

4.2. Antimikrobiyal Aktivite

Bitki örneklerinin antimikrobiyal etkisini incelemek için disk difüzyon ve minimum inhibitör konsantrasyon testi yapılmı ştır. Çalı şmalar 14 bakteri ve bir fungus türü üzerinde gerçekle şmi ştir. Disk difüzyon testi sonunda elde edilen sonuçlara göre uyglanan ekstraktlara kar şı en hassas organizmaların S. epidermidis ve B. cereus oldu ğu tespit edilmi ştir. Bakterilerin ekili oldu ğu petrilerde de ekstraktların bakterileri öldürdü ğünü gösterecek bir zon çapı olu şmamı ş sadece petri kabındaki di ğer bölgelere göre daha şeffaf bir zon çapı olu şmu ştur. Bu durum ekstraktların bakteriyositik de ğil, bakteriyostatik özellik gösterdi ği şeklinde yorumlanabilir. Ayrıca etki gözlenen iki bakteri türü de Gram pozitif özelliktedir. İki bakteri türünün de Gram pozitif olması ekstraktların Gram pozitif bakteriler üzerinde etkili oldu ğu şeklinde dü şünülebilir.

Erdo ğan ve ark. [15] E. viscosus ve E. mersinensis türleri üzerinde yaptı ğı çalı şmada örneklerin toprak üstü kısımlarını kullanarak Gram pozitif bakterilere kar şı antimikrobiyal bir etki gözlemlemi ştir. Hymete ve ark. [58], E. ellenbeckii ve E. longisetus üzerinde yaptıkları antimikrobiyal çalı şmada bitki türlerinin kök, gövde, yaprak, çiçek kısımlarının ayrı olarak metanol ekstrakyonunu yapmı şlar ve disk difüzyon denemeleri sonucunda E. ellenbeckii ’ nin yaprak E. longisetus ’ un ise yaprak ve gövde ekstraktlarının S. aureus ve C. albicans üzerinde etkili olduklarını tespit etmi şlerdir. Barbour ve arkada şları tarafından E. gaiilardoti türü üzerinde yapılan çalı şmada [59], bitkiye ait çiçekler kullanılarak Escherichia coli , Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa , Shigella dysenteriae , Salmonella enteritidis , Salmonella typhi , Staphylococcus aureus , Streptococcus faecalis , ve Canadida albicans organizmalarına kar şı etkili oldu ğu bulmu şlardır. Çalı şmalarda kullanılan ortak mikroorganizlara kar şı, bizim çalı şmamızda antimkrobiyal bir etki görmememiz bitkinin toprak altı kısımlarının de ğil, toprak üstü kısımlarının antimikrobiyal bir etki gösterdi ği şeklinde yorumlanabilir.

Çalı şmada bitkilerin antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla disk difüzyon yöntemine ek olarak minimum inhibitör konsantrasyon testinde bakterileri öldürmeye yetecek herhangi bir doz bulunamamı ştır. Daha önce yapılan çalı şmalarda [15] M İK testinde aynı konsantrasyonlarda bakterileri öldürücü bir doz bulundu ğu halde bizim çalı şmamızda bulunamamasının nedeni yine E. orientalis bitkisinin kök kısımlarının antimikrobiyal bir etkisinin olmadı ğı şeklinde yorumlanabilir.

4.3. Kültür Hücreleri Üzerine Etkisi

Echinops orientalis örneklerinin kök kısımlarının metanol, kloroform ve hekzan ekstraktları kanserli hücre hatları MCF-7 ve PC-3 ile kansersiz normal hücre hattı fibroblast üzerinde MTT yöntemi kullanılarak denenmi ştir. Hücreler üzerindeki metanol ekstraktı konsantrasyonları 1000 µg/ml, 900 µg/ml, 800 µg/ml, 700 µg/ml ve 600 µg/ml iken; kloroform ve hekzan ekstraktları konsantrasyonu 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml, 400 µg/ml ve 300 µg/ml olarak test edilmi ştir.

MCF-7 hücrelerinde en etkili ekstrakt hekzan ekstraktı olurken; en az etkili ekstrakt metanol ekstraktıdır. Hücrelerde dozun ve ekstrakt etkile şim süresinin artmasına ba ğlı olarak hücre ölümlerinin de arttığı görülmü ştür. De ğerler kar şıla ştırıldı ğında MCF-7 hücrelerinin %50’sini öldüren de ğerlerin 24 saatlik etkile şimle 1000µg/ml’ lik metanol ekstraktı ve 600 µg/ml’ lik kloroform ekstraktının oldu ğu söylenebilir. Uygulanan dozlardan hiçbirisi ise MCF-7 hücrelerini tamamen öldürmeye yetmemi ştir.

PC-3 hücrelerinde en etkili olan ekstrakt yine hekzan ekstraktı; en az etkili ise metanol ekstratıdır. Yine hücrelerde doz ve etkile şim süresinin artmasıyla hücre ölümleri de artmı ştır. De ğerler kar şıla ştırıldı ğında PC-3 hücrelerinin %50’sini öldüren dozların 24 saatlik etkile şimle 900 µg/ml’ lik metanol ve 300 µg/ml’ lik kloroform ekstraktlarının oldu ğu söylenebilir. Hekzan ekstraktının ise 24 saatlik etkile şimle 700 µg/ml, 600 µg/ml, 500 µg/ml ve 400 µg/ml konsantrasyonlarının ve 48 saat etkile şimle 700 µg/ml, ve 600 µg/ml konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yetmi ştir.

Fibroblast hücrelerinde ise en etkili olan ekstrakt yine hekzan ekstraktı iken; metanol ekstraktı en az etki gösteren ekstrakt olmu ştur. Fibroblast hücrelerinin %50’ sini öldüren dozların 24 saatlik etkile şimle 800 µg/ml’ lik metanol ve 700 µg/ml’ lik kloroform ekstraktlarının oldu ğu söylenebilir. Metanol ekstraktının ise 72 saatlik etkile şimle 1000 µg/ml, 900 µg/ml ve 800 µg/ml’ lik konsantrasyonları hücreleri tamamen öldürmeye yeterli olmu ştur. Kloroform ve hekzan ekstraktları kar şıla ştırıldı ğında hekzan ekstraktının çalı şılan üç hücre üzerinde de daha ölümcül bir etkiye sahip oldu ğu görülmektedir. Metanol ve kloroform ekstraktlarının hücrelerde doz ve etkile şim süresinin artmasıyla hücre ölümlerini de arttırdı ğı görülürken; hekzan ekstraktında doza ba ğlı artmalar hücre ölümlerini arttırmı ş ancak zamana ba ğlı artmalar di ğer hücrelerde oldu ğunun aksine canlılık oranının artmasına neden olmu ştur.

Bütün de ğerler kar şıla ştırıldı ğında ise metanol ekstraktında, kanserli hücre hatları olan MCF-7 ve PC-3 hücrelerinin canlılık yüzdesinin, kansersiz normal, hücreler olan fibroblast hücrelerinden daha yüksek oldu ğunun görülmesi metanol ekstraktının sitotoksik bir özelli ği olabilece ğini göstermektedir. Jin ve ark. [51] E. grijiisi türünün etanol ekstraktıyla yaptıkları çalı şmada, ekstraktın kanserli hücrelere kar şı sitotoksik etkisi oldu ğunu bulmaları, Hymete ve arkada şları tarafından E. ellenbeckii ve E.longisetus üzerinde yaptıkları çalı şmada [58] örneklerin metanol ekstratlarının molluscalar ve ba ğırsak kurtları üzerinde etkili olduklarını bulmaları ve Gao ve ark. [70], Scutellaria baicalensis etanol ekstraktıyla yaptıkları çalı şmada ekstraktı insan akci ğer kanseri hücrelerine kar şı sitotoksik bulmaları, alkollü ekstraktların sitotoksik özellik ta şıyabilmesine ba ğlı olarak çalı şmamızı desteklemektedir. Hekzan ve klorform ekstraktlarının ise MCF-7 ve PC-3 hücrelerini, fibroblast hücrelerinden daha fazla etkilemesi bu ekstraktların antikanserojen özelli ği olabilece ğini göstermektedir.

Hücrelerin MTT uygulaması öncesi ve sonrası, formazan kristallerinin olu ştu ğu zaman, yapılan mikroskopik incelemede, ekstrakt etkile şimine ba ğlı olarak hücrelerin morfolojilerinin de ğişti ği ve daha yuvarlak bir hal aldıkları, ayrıca metanol ekstraktının di ğer ekstraktlara oranla hücre morfojilerinin bozulmasında daha az etkili oldu ğu görülmesi metanol ekstraktının di ğer ekstraktlara göre daha farklı bir etkisi oldu ğunu desteklemektedir.

Gün geçtikçe tedavisinde kar şıla şılan problemlerden dolayı yeni ilaçlar bulma ve ara ştırma çabaları tıbbi bitkilerin ara ştırılmasına hız kazandırmı ştır. Literatürde, E. orientalis bitkisinden elde edilen ekstraktlarla ilgili olarak antimikrobiyal ve antikanserojen çalı şmalarına rastlanmamı ştır. Çalı şmamızda E. orientalis türüne ait örneklerin kök kısımlarından elde edilen ekstraktların muhtemelen bakteriyostatik, sitotoksik ve antikaserojenik özellikleri oldu ğu yapılan deneyler sonucu tespit edilmi ştir. Bu nedenle çalı şmamızın bulguları önem ta şımaktadır. Morfolojik bulgularımız MTT testi sonucu elde etti ğimiz bulguları desteklemektedir.

Çalı şmamız E. orientalis ekstraktlarının bakteriyostatik, sitotoksik ve antikanserojenik özelliklerini göstermesi açısından özgün bir çalı şmadır. Bu nedenle ülkemizde yeti şmekte olan E. orientalis bitkisinden elde edilen ekstraktların ileride meme ve prostat kanserine kar şı antikanserojen ilaç yapımında kullanılmasının uygun olaca ğını dü şünmekteyiz. Ancak ekstraktların içerdikleri maddelerin izolasyonu ve tanımının yapılıp, daha geni ş kapsamlı ve ayrıntılı çalı şmalarla klinik uygulamalar için umut do ğabilir. Bu konu ile ilgili ara ştırmalarımız devam etmektedir.

KAYNAKÇALAR

1. Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E., 2010, Cancer statistics 2010, CA Cancer Journal Clinicians, 60 :277–300 2. T.C. Ba şbakanlık Türkiye İstatistik Kurumu, 2008, Türkiye sa ğlık ara ştırması, www.tuik.gov.tr , Eri şim tarihi: Kasım 2011 3. Türk Kanser Ara ştırma ve Sava ş Kurumu Derne ği, www.turkkanser.org.tr , Eri şim tarihi: Kasım 2011 4. Jeong, C.-H., Bode, A., M., Pugliese, A., 2009, 6-Gingerol suppresses colon cancer growth by targeting leukotriene A 4 hydrolase, Cancer Research , 69 : (13) 5. Dhar, A., Mentha, S., Dhar, G., Dhar, K, Banerjee, S., Veldhuizen, P., V. Cambell, D., R., Banerjee, S., K., 2009, Crocetin inhibits pancreatic cancer cell proliferation and tumor progression in a xenograft mouse model, Molecular Cancer Therapeutics ; 8 (2) 6. Tavakkol-Afshari, J., Brook, A., Mousavi, S., H., 2008, Food and Chemical Toxicology , 46 : 3443–3447 7. Wang, Y., Zhao, X., Gao, X., Nie, X., Yang, Y., Fan, X., 2011, Development of fluorescence imaging-based assay for screening cardioprotective compounds from medicinal plants, Analytica Chimica Acta , 702 : 87-94 8. Hsueh, C.-C., Chen, B.-Y., Lo, D.-H., Wu, C.-C., Tzeng, Y.-J., 2010, Preliminary screening via dose–response analysis of the antibacterial activities of six Chinese medicinal plant extracts, Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers , 41 : 579-584 9. Yan, R., Yang, Y., Zeng, Y., Zou, G., 2009, Cytotoxicity and antibacterial activity of Lindera strychnifolia essential oils and extracts, Journal of Ethnopharmacology , 121 : 451–455 10. Tan, A. 1992. Türkiye’de bitkisel çe şitlilik ve bitki genetik kaynakları, Anadolu Journal. Of AARI, 2: 50-6 11. Moerman, D., E., 1996, An analysis of the food plants and drug plants of native North America, Journal of Ethnopharmacology , 52 : 1-22 12. Cowan, M., M., 1999, Plant products as antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews, p. 564–582 13. Toker, Z., 2002, Bazı Hypericum uçucu ya ğ bile şenleri ve bu ya ğların antimikrobiyal aktiviteleri, Dicle Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Diyarbakır, 97 s. 14. Baytop T. , 1999, Türkiye’de bitkiler ile tedavi s. 1-50, Nobel Yayın Evi, 1999 15. Erdo ğan, Ş., 2009, Echinops viscosus ve Echinops mersinensis türlerinin antioksidan ve antimikrobiyal aktivitelerinin ara ştırılması, Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, s. 58 16. Ncube, B., Finnie, J., F., Staden, J., V., 2011, Seasonal variation in antimicrobial and phytochemical properties of frequently used medicinal bulbous plants from South Africa, South African Journal of Botany, 77 : 387– 396 17. Lamorde, M., Tabuti, J., Obua, C., Kukunda-Byobona, C., 2010, Medicinal plants used by traditional medicine practitioners for the treatment of HIV/AIDS and related conditions in Uganda, Journal of Ethnopharmacology , 130 : 43–53 18. Malikova, J., Swaczynova, J., Kolar, Z., Strnad, M., 2008, Anticancer and antiproliferative activity of natural brassinosteroids, Phytochemistry, 69 : 418–426 19. İlçim, A., Dı ğrak, M., Ba ğcı, E. 1998. Bazı bitki ekstraktlarının antimikrobiyal etkilerinin ara ştırılması. Turkish Journal of Biology , 22 : 119-125 20. Toro ğlu, S., Çenet, M., 2006, Tedavi amaçlı kullanılan bazı bitkilerin kullanım alanları ve antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi için kullanılan metodlar, KSU. Journal of Science and Engineering, 9: 2 21. Vanderbank, H., 1949, Ergebisse der chemotheropie der tubercoluse, Pharmazaie , 4: 198-207 22. Dı ğrak, M., İlçim A., M., H., 1999, Antimicrobial activities of several parts of Pinus brutia, Juniperus oxycedrus, Abies cilicica, Cedrus libani and Pinus nigra. Phytother Research , 13 : 584-587 23. Kalaycıo ğlu, A., Öner, C. 1994. Bazı bitki ekstraktlarının antimutajenik etkilerinin Amest Salmonella test sistemi ile ara ştırılması, Turkish Journal of Botany , 18 : 117-122

24. Bilgin, Y., 2006, Escherichiae coli , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii ve Staphylococcus aureus Su şlarında Çesitli Aminoglikozidlerin Duyarlılıklarının Ara ştırılması, Haseki E ğitim Ve Ara ştırma Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları Ve Klinik Mikrobiyoloji Klini ği, Uzmanlık Tezi, 56s. 25. Dworkin M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E., 2006, The Prokaryotes 3rd Ed., Springer Press, 1182 s. 26. Naglik, J., R., Moyes, D., L., Wactler, B., Hube, B., 2011, Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity, Microbes and Infection , 13 : 963-976 27. Freshney, R., I., 2010, Culture of Animal Cells, 6th Ed., Wiley-Blackwell, 676 s. 28. Ersöz, M., 2007, İnsan Meme Kanseri (MCF 7) ve Fare Fibroblast (L-929) Hücre Kültürlerinde Poliakrilik Asidin Toksisitesinin İncelenmesi, Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 139 s. 29. Langdon, S., P., 2004, Basic Principles of Cancer Cell Culture, Cancer Cell Culture, Humana Press, 3-17 30. Gürtürk S., 1977, Virolji, Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, 64-73 31. Baker, F., J., Breach, M., R., 1980, Medical Microbiology Techniques, 259-62, 324-29 32. Alberts B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M,. Roberts, K. ve Watson, J.,D., 1994, The Cell Cycle, 1053-1114, In: Molecular Biology of The Cell, Garlan Publishing Inc, USA 33. Garret, M., D., 2001, Cell cycle control and cancer, Current Science , 81 : 5 34. Lewin, B., 2004, Cell Cycle and Growth Regulation, 849-894, In: Genes IIIV, Pearson Prentice Hall, USA, 35. Pecorıno, L., Molecular biology of cancer, Oxford University Press, 2005 36. Lowitz, B.B, Cascıato, D.A, Medical oncology & principles of cancer biology, Kanser biyolojisi ve onkogenler, Lippincott Williams & Wilkins pres, 2004 37. Karaca, T., D., 2008, İnsan meme kanseri hücre kültüründe Nerium oleander bitkisinden elde edilen ekstraktların antikanserojen etkisinin incelenmesi, Sakarya Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 111 s. 38. Mosmann, T., 1983, Rapid colorometric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods , 65 : 55-63 39. Wilson, J., K., Sargent, J., M., Elgie, A., W., Hill, J., G., Taylor, C., G., 1990, A feasibility study of The MTT assay for chemosensitivity testing in ovarian malignancy, British Journal of Cancer , 62 : 189-194. 40. Alley M.C., Scudiero D.A., Monks A., Hursey M.L., Czerwinski M.J., Fine D.L., Abbott B.J, Mayo J.G., Shoemaker R.H. ve Boyd M.R., 1988, feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay, Cancer Research , 48 : 589-601 41. Abe K. ve Matsuki N., 2000, Measurement of cellular 3-(4,5 Dimethylthiazol-2- Yl)-2,5- Diphenytetrazoliumbromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT, Neuroscience Research , 38 : 325-329 42. Roche Applied Science, Apoptosis, Cell Death and Cell Proliferation, 3rd Ed., http://www.roche-applied-science.com , Eri şim tarihi: Eylül 2011 43. American Type Culture Collection, LGC Standarts, http://www.lgcstandards- atcc.org/ , Eri şim Tarihi: Aralık 2011 44. Vural, C., Dadandı, M., Y., 2010, Türkiye Echinops L. (Asteraceae) türlerinin taksonomik revizyonu, Tubitak, Proje No: 106T526 45. Kuete, V., Krusche, B., Youns, M., Voukeng, I., 2011, Cytotoxicity of some Cameroonian spices and selected medicinal plant extracts, Journal of Ethnopharmacology , 134 : 803–812 46. Jaiswal, R., Kiprotich, J., Kuhnert, N., 2011, Determination of the hydroxycinnamate profile of 12 members of the Asteraceae family, Phytochemistry , 72 : 781–790 47. Özüdo ğru, B., Akaydın, G., Erik, S., Yesilada, E., Inferences from an ethnobotanical field expedition in the selected locations of Sivas and Yozgat provinces (Turkey), Journal of Ethnopharmacology , 137 : 85– 98 48. Iglinski, B., Iglinska, A., Kujawski, W., Buczkowski, R., 2011, Bioenergy in Poland, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 15 : 2999– 3007 49. Giday, M., Asfaw, Z., Woldu, Z., 2010, Ethnomedicinal study of plants used by Sheko ethnic group of Ethiopia, Journal of Ethnopharmacology, 132 : 75–85 50. Lamberth, C., 2009, Alkyne chemistry in crop protection, Bioorganic & Medicinal Chemistry , 17 : 4047–4063 51. Jin, W., Shi, Q., Hong, C., Cheng, Y., 2008, Cytotoxic properties of thiophenes from Echinops grijissi Hance, Phytomedicine , 15 : 768–774 52. Singh, A., Malhotra, S., Subban, R., 2008, Anti-inflammatory and Analgesic Agents from Indian Medical Plants, International, Journal of Integrative Biology , 3: 57-72 53. Teklehaymanot,T., Giday, M., Medhin, G., Mekonnen., Y., 2007, Knowledge and use of medicinal plants by people around Debre Libanos monastery in Ethiopia, Journal of Ethnopharmacology , 111 : 271–283 54. Mhaske, S., B., Argade., N., P., 2006, The chemistry of recently isolated naturally occurring quinazolinone alkaloids, Tetrahedron , 62 : 9787– 9826 55. Chaudhuri, P.K., 1992. 7-hydroxyechinozolinone, a new alkaloid from the flowers of Echinops echinatus , Journal of Natural. Products , 55 (2), 249–250 56. Dopke, W., Fritsch, G., 1969. Echinine a dihydroquinoline alkaloid from Echinops ritro seeds, Pharmazie , 24 (12), 782. 57. Schroeder, P., Luckner, M., 1968. Physiology of formation of the quinoline alkaloid echinorine in Echinops ritro , Planta Med . 16 (1), 99–108 58. Hymete, A., Iversen, T.-H., Rohloff, J., Erko, B., 2005, Screening of Echinops ellenbeckii and Echinops longisetus for biological activities and chemical constituents, Phytomedicine , 12 : 675–679 59. Barbour, E., K., Sharif, M., A., Sagherian, V., K., Habre, A., N., 2004, Screening of selected indigenous plants of Lebanon for antimicrobial

activity , Journal of Ethnopharmacology, 93 : 1–7 60. Sharma, P., K., Chauhan, N., S., Lal, B., 2004, Observations on the traditional phytotherapy among the inhabitants of Parvati valley in western Himalaya, India, Journal of Ethnopharmacology , 92 : 167–176

61. Unny, R., Chauhan, A., K., Joshi, Y., C., Dophal, M., P., 2003, A review on potentiality of medicinal plants as the source of new contraceptive principles, Phytomedicine , 10 : 233–260 62. Aburjai, T., Darwish, R., M., Al-Khalil, S., Mahafzah, A., 2001, Screening of antibiotic resistant inhibitors from local plant materials against two different strains of Pseudomonas aeruginos a, Journal of Ethnopharmacology , 76 : 39–44 63. Graham, J., G., Quinn, M., L., Fabricant, D., S., Farnsworth, N., R., 2000, Plants used against cancer – an extension of the work of Jonathan Hartwell, Journal of Ethnopharmacology, 73 : 347–377 64. Merzouki, A., Ed-derfoufi, F., Mesa, J., M., 2000, Contribution to the knowledge of Rifian traditional medicine. II: Folk medicine in Ksar Lakbir district NW Morocco, Fitoterapia , 71 : 278-307 65. Sharma, P., Sharma, J., D., 1999, Evaluation of in vitro schizontocidal activity of plant parts of Calotropis procera —an ethnobotanical approach, Journal of Ethnopharmacology , 68 : 83–95 66. Nyman, U., Joshi, P., Madsen, L., B., Pedersen, T., B., 1998, Ethnomedical information and in vitro screening for angiotensin-converting enzyme inhibition of plants utilized as traditional medicines in Gujarat, Rajasthan and Kerala (India), Journal of Ethnopharmacology , 60 : 247–263 67. Singh, R.P., Pandey, V.B., 1994. Further flavonoidsof Echinops niveus Fitoterapia 65 (4), 374 68. Hymete, A., Kidane, A., 1991. Screening for anthelmintic activity in two Echinops spp ., Ethiopian Pharmaceutical Journal, 9 (1), 67–71 69. Dawit, A., Ahadu, A., 1993. Medicinal plants and enigmatic health practices of Northern Ethiopia, Birhanena Selam, AddisAbaba, pp. 37–44 70. Gao, J., Morgan, A., W., Sanchez-Medina, A., Corcoran, O., 2011, The ethanol extract of Scutellaria baicalensis and the active compounds induce cell cycle arrest and apoptosis including upregulation of p53 and Bax in human lung cancer cells, Toxicology and Applied Pharmacology, 254 : 221–228

ÖZGEÇM İŞ

KİŞİ SEL B İLG İLER

Adı, Soyadı: Dilek DABANLI Uyru ğu: Türkiye (TC) Do ğum Tarihi ve Yeri: 15 Eylül 1986, Kayseri Medeni Durumu: Bekâr Tel: 0541 433 15 96 e-posta: [email protected] Yazı şma Adresi: Fatih Mah. Bozantı Cad. No:12/7 Kayseri

EĞİ TİM

Derece Kurum Mezuniyet Tarihi Yüksek Lisans ERÜ Fen Bilimleri Enstitüsü 2011 Lisans ERÜ Fen-Edb. Fak. Biyoloji Böl. 2009 Lise Melikgazi, M. Emino ğlu (YDA) 2004 Lisesi

YABANCI D İL

İngilizce

YAYINLAR

1. Toprak, G., Karada ş, E ., Di şyapar, T., Ceylan, D., Dabanlı, D., Özcan, S., Effects of

H2O2 Stresses on Antioxidant Enyzme Systems of Phanerochaete chrysosporium, International Conference on Enzyme Science and Technology, 31 October-04 November 2011, Ku şadası, Türkiye

2. Dabanlı, D ., Toprak G., Ceylan, D., Dinç, G., Özcan, S., Cytotoxicity Of Echinops Orientalis Extract On Prostate Adenocarcınoma Cell Line PC3 , 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

3. Özcan, S ., Dabanlı, D., Şahin, F., S., Toprak, G., Dinç, G., Akalın, H., Ural, A., U., Özkul, Y., Çetin, M., Nayernia, K., The Role Of Piwil2 In Reprogramming Of Human

Mesenchymal Stem Cells, 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

4. Dinç, G ., Özcan, S., Toprak, G., Dabanlı, D., Taheri, S., Akalın, H., Akbarova, Y., Özbilge, H., Özkul, Y., Çetin, M., Nayernia, K., Investigation Of The Role Of Piwil2 On Transition Of Tumorogenic Mammary Epithelial Cells (MCF7 Cell Line) To The Breast Cancer Stem Cells, , 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

5. Toprak, G ., Özcan, S., Gönen, Z., B., Dabanlı, D., Şahin, F., S., Rabbit Dental Pulp Stem Cell Cultivation, 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

6. Gönen, Z., B., Özcan, S., Toprak, G., Dabanlı, D., Şahin, F., Ş., Stem Cell Isolation From Human Exfoliated Deciduous Teeth (Shed), 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

7. Toprak, G., Ceylan, D., Dabanlı, D., Karada ş, E., Saatçi, E., Özcan, S., The Effect Of GFP Transfection On Gst Pi In Human Prostate Cancer Cell Line LNCap, 1st International Conference/Workshop on Stem Cell Research and Application, 7-9 October 2011, Kayseri, Türkiye

8. Ceylan, D ., Toprak, G., Dabanlı, D., Di şyapar, T., Özcan, S., The Effect Of Piwil2 Transfection On Gst Pi In Human Breast Cancer Cell Line MCF-7

9. Erciyes Da ğı “Master Planı” çerçevesinde endemik ve nadide bitkilerin korunması ve bu bitkilerin ex-situ koruması çalı şmasında gönüllü olarak görev alınmı ştır

10. Şapçı, H., Dabanlı, D., Vural, C., Özcan, S., Türkiye Echinops L. Taksonlarının Tohum Depo Proteinleri Polimorfizminin SDS-PAGE Yöntemi ile Ara ştırılması, 20. Ulusal Biyoloji Kongresi, 21-25 Haziran 2010, Denizli, Program ve Özet Kitabı s. 455

11. Dabanlı, D., Şapçı, H., A şık, E., Vural, C., Echinops phaeocephalus Hand.-Mazz, 20. Ulusal Biyoloji Kongresi, 21-25 Haziran 2010, Denizli, Program ve Özet Kitabı s. 444

12. Özcan, S., Dabanlı, D., Ekici, M., Şapçı, H., Vural, C., Aytaç, Z., Phylogenetic Relationships of Taxa Incani Dc. Section in Genus Astragalus L. Using Seed Storage Protein Polymorphism, XIII. Optima Meeting, March 22-26 2010, Antalya, Book of Abstracts, p. 166

13. Şapçı, H., Dabanlı D., Özcan, S., Ekici, M., Vural, C., Akan, H., Phylogenetic Relationships of Taxa Dissitiflori Dc. Section in Genus Astragalus L. Using Seed Storage Protein Polymorphism, XIII. Optima Meeting, March 22-26 2010, Antalya, Book of Abstracts, p. 117

14. Dabanlı, D., Şapçı, H., Ekici, M., Özcan, S., Vural, C., Akan, H., Phylogenetic Relationships of Taxa Hypoglottidei Dc. Section in Genus Astragalus L. Using Seed Storage Protein Polymorphism, XIII. Optima Meeting, March 22-26 2010, Antalya, Book of Abstracts, p. 88