Universidade Estadual De Campinas Faculdade De Ciências Médicas Carlos Vinícius Buarque De Gusmão Efeito Do Ultrassom, Ondas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CARLOS VINÍCIUS BUARQUE DE GUSMÃO

EFEITO DO ULTRASSOM, ONDAS DE CHOQUE E DE PRESSÃO RADIAL NO REPARO DE DEFEITOS ÓSSEOS NAS TÍBIAS DE RATOS AVALIADO PELA EXPRESSÃO E ATIVIDADE DE AKT, BMP-2, ERK-2, FAK E TGF-β1

EFFECT OF ULTRASOUND, EXTRACORPOREAL SHOCKWAVES AND RADIAL PRESSURE WAVES ON AKT, BMP-2, ERK-2, FAK AND TGF-β1 DURING BONE HEALING IN RAT TIBIAL DEFECTS

CAMPINAS 2018

CARLOS VINÍCIUS BUARQUE DE GUSMÃO

EFEITO DO ULTRASSOM, ONDAS DE CHOQUE E DE PRESSÃO RADIAL NO REPARO DE DEFEITOS ÓSSEOS NAS TÍBIAS DE RATOS AVALIADO PELA EXPRESSÃO E ATIVIDADE DE AKT, BMP-2, ERK-2, FAK E TGF-β1

EFFECT OF ULTRASOUND, EXTRACORPOREAL SHOCKWAVES AND RADIAL PRESSURE WAVES ON AKT, BMP-2, ERK-2, FAK AND TGF-β1 DURING BONE HEALING IN RAT TIBIAL DEFECTS

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.

Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of the State University of Campinas as part of the requirements to obtain the title of Doctor in Sciences.

ORIENTADOR: PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS VINÍCIUS BUARQUE DE GUSMÃO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO.

CAMPINAS 2018

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 02-P-3369/2017; FAPESP, 2014/26729-0

Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Gusmão, Carlos Vinícius Buarque de, 1986- G972e Efeito do ultrassom, ondas de choque e de pressão radial no reparo de defeitos ósseos nas tíbias de ratos avaliado pela expressão e atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-b1 / Carlos Vinícius Buarque de Gusmão. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.

Orientador: William Dias Belangero. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Osteogênese. 2. Ondas ultrassônicas. 3. Fraturas ósseas. 4. Mecanotransdução celular. 5. Ondas de choque. I. Belangero, William Dias, 1952-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Effect of ultrasound, extracorporeal shockwaves and radial pressure waves on Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-b1 during bone healing in rat tibial defects Palavras-chave em inglês: Osteogenesis Ultrasonic waves Mechanotransduction, Cellular Mechanotransduction Shock waves Área de concentração: Fisiopatologia Cirúrgica Titulação: Doutor em Ciências Banca examinadora: William Dias Belangero [Orientador] Fernando Baldy dos Reis José Marcos Alves Ana Amélia Rodrigues José Barreto Campello Carvalheira Data de defesa: 27-02-2018 Programa de Pós-Graduação: Ciências da Cirurgia

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO CARLOS VINÍCIUS BUARQUE DE GUSMÃO

ORIENTADOR: PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO

MEMBROS:

1. PROF. DR. WILLIAM DIAS BELANGERO

2. PROF. DR. FERNANDO BALDY DOS REIS

3. PROF. DR. JOSÉ MARCOS ALVES

4. PROFª. DRª. ANA AMÉLIA RODRIGUES

5. PROF. DR. JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Cirurgia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 27/02/2018

DEDICATÓRIA

Àqueles que buscam o conhecimento para aliviar as chagas do próximo;

Àqueles que trabalham e estudam para beneficiar a humanidade;

Àqueles que se felicitam pelo bem produzido;

E aos humildes de coração.

AGRADECIMENTOS

Deus, princípio de tudo e Quem nos permite existir e gozar da existência;

Carlos Alberto Buarque de Gusmão e Maria Angelica Barcellos de Gusmão, pai e mãe, genitores, educadores, trabalhadores, exemplos, motivadores...;

Prof. Dr. William Dias Belangero, meu orientador desde o 1º ano da graduação, que me ensinou os caminhos da ciência, e ensina ainda hoje;

Nilza Alzira Batista, amiga, conselheira, companheira, cuja presença foi fundamental para todo o desenrolar da tese;

Valéria Trombini Vidotto Lemes e Wilson Leite Maia Neto, amigos que auxiliaram valiosamente para a produção dos resultados;

Prof. Dr. José Marcos Alves, que auxiliou com equipamentos e literatura de precioso valor.

Prof. Dr Orlando Petrucci Junior, que cedeu gentilmente as dependências de seu laboratório para execução de parte dos experimentos.

Antonio Ramos Calixto, Cristina Tanikawa, Daniela Diogenes de Carvalho, Isabella Bonilha de Oliveira e José Ricardo Lenzi Mariolani sempre dispostos para auxiliar quanto às dúvidas e atividades experimentais.

Amigos muitos, nem sempre visíveis e próximos fisicamente, que me auxiliam desde há muito tempo.

A FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), processo n° 2014/26729-0 pelo financiamento desta pesquisa como parte do Auxílio Regular intitulado “Estudo Biomecânico e Biomolecular de Métodos Terapêuticos de Regeneração Óssea”.

A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) pela concessão de bolsa de doutorado (processo 02-P-3369/2017).

RESUMO Ondas acústicas, como ultrassom pulsado de baixa intensidade, ondas de choque e ondas de pressão radial interferem na osteogênese por meio da modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) e TGF- β1 (transforming growth factor-β1). Apesar do uso habitual na prática médica, não está claro se as terapias acústicas aceleram o reparo de fraturas agudas. Ademais, nenhum estudo comparou o efeito do ultrassom, ondas de choque e de pressão radial na modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1 durante o reparo ósseo. A presente tese foi desenvolvida para determinar se o ultrassom, as ondas de choque e as de pressão radial modulam a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1 durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos; e, caso afirmativo, se a modulação proteica difere entre as terapias acústicas. Para tanto, defeitos ósseos nas tíbias de ratos foram expostos a uma sessão de 500 pulsos e 0.12mJ/mm2 de ondas de choque, uma sessão de 500 pulsos e 2.0 bar de ondas de pressão radial, ou sessões diárias de 20 minutos de ultrassom pulsado a 30mW/cm2. Após seguimento de 1, 3 e 6 semanas, o tecido ósseo foi coletado para análise da expressão e perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1. Os animais expostos ao ultrassom foram acompanhados por até 3 semanas. Identificou-se que o ultrassom pulsado de baixa intensidade modulou a expressão de BMP-2 na terceira semana; as ondas de choque modularam, na primeira semana, a expressão de BMP-2 e TGF-β1, e o perfil de atividade de Akt e FAK; e as ondas de pressão radial modularam o perfil de atividade de FAK na terceira semana. Com base nesses achados, conclui-se que, durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos, o ultrassom pulsado de baixa intensidade, as ondas de choque e as de pressão radial modularam, de maneira distinta, a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, FAK e TGF-β1, mas não de ERK-2. Além disso, entre as terapias avaliadas, as ondas de choque exibiram o efeito mais expressivo na modulação proteica. Palavras-chave: Akt; Fator de crescimento transformador beta; Fraturas ósseas; Mecanotransdução; Ondas de choque; Ondas ultrassônicas; Osteogênese; Proteína morfogenética óssea; Quinase de adesão focal; Quinase 2 regulada por sinal extracelular; Tecido ósseo.

ABSTRACT Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), extracorporeal shockwaves (ESWT) and radial pressure waves (RPWT) influence osteogenesis via Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) and TGF-β1 (transforming growth factor-β1) modulation. In spite of that, it is not clear whether those acoustic waves are effective to accelerate fracture healing. Additionally, to our knowledge no study compared the effect of different acoustic therapies on Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-β1 during bone healing. An experimental study was conducted to determine whether LIPUS, ESWT and RPWT modulate Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-β1 during bone healing in rat tibial defects; and, if so, to compare the results between the different modalities of acoustic therapies. Rat tibial defects were exposed to 500 shots of ESWT delivered at 0.12mJ/mm2, 500 impulses of RPWT operated at 2.0 bar, or daily 20-minute 30mW/cm2 sonication. Following 1, 3 and 6 weeks, bones were harvested to determine the expression and activity of Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-β1. Animals exposed to ultrasound were followed up to 3 weeks. It was demonstrated that LIPUS modulates BMP-2 expression at three weeks; ESWT modulate Akt and FAK activity profiles, and the expression of BMP-2 and TGF- β1 at one week; and RPWT modulate FAK activity profile at 3 weeks. In conclusion, LIPUS, ESWT and RPWT exhibit distinct mechanisms to modulate Akt, BMP-2, FAK and TGF-β1, but not ERK-2 – which is not modulated –, during bone healing in rat tibial defects.

Keywords: Akt; Bone; Bone morphogenetic protein; Extracellular signal-regulated kinase; Focal adhesion kinase; Fractures; LIPUS; Mechanotransduction; Osteogenesis; Shockwave; Transforming growth factor beta.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ActR: Activin Receptor ATP: Adenosine Triphosphate BMP: Bone Morphogenetic Protein BMPR: BMP Receptor BSA: Bovine Serum Albumin cbfa1: core binding fator a1 DLX: Distal-Less Homeobox ERK: Extracellular signal-Regulated Kinase FAK: Focal Adhesion Kinase FGF: Fibroblast Growth Factor HRP: Horseradish Peroxidase IGF-I: Insulin-like Growth Factor-I IL: Interleucina

ISATA: Spatial Average Temporal Average Intensity JNK: c-jun N-terminal Kinase LAP: Latency Associated Peptide LRP: Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein LTBP: Latent TGF-β Binding Protein M-CSF: Macrophage Colony-Stimulating Fator MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MEC: Matriz Extracelular Msx: Msh homeobox NFκB: Nuclear Factor-κB NMDA: N-Metil-D-Aspartato OPG: Osteoprotegerina PBS: Phosphate Buffered Saline PDGF: Platelet-Derived Growth Factor PEM: Matriz Pericelular PI3K: Phosphatidylinositol 3-Kinase

PTH: Hormônio da Paratiróide PYK2: Proline-rich Tyrosine Kinase-2 RIPA: Radioimmunoprecipitation assay R-SMAD: Receptor-regulated SMAD RUNX: Runt-related transcription factor SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE: SDS-Polyacrilamide Gel SH2: Src Homology 2 SMAD: Mothers Against Decapentaplegic homolog SMBTOC: Sociedade Médica Brasileira de Tratamento por Ondas de Choque TBST: Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20 TGF-β: Transforming Growth Factor-β TIMP: Tissue Inhibitor of Metalloproteinase TNF-α: Tumor Necrosis Factor-α TRAP: Tartrate-resistant Acid Phosphatase Tris: Tris[hydroximetil]aminometano UMB: Unidades Multicelulares Básicas UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas USPBI: Ultrassom Pulsado de Baixa Intensidade VEGF: Vascular Endotelial Growth Factor

SUMÁRIO

Introdução...... 14 1. Revisão da literatura...... 14 1.1. Dispositivos acústicos...... 14 1.1.1. Ultrassom pulsado de baixa intensidade...... 15 1.1.2. Ondas de choque...... 15 1.1.2.1. Dispositivo eletro-hidráulico...... 16 1.1.2.2. Dispositivo eletromagnético...... 16 1.1.2.3. Dispositivo piezelétrico...... 17 1.1.3. Ondas de pressão radial...... 17 1.2. Fenômenos físicos desencadeados pelas ondas acústicas nos tecidos biológicos...... 19 1.2.1. Atenuação...... 19 1.2.2. Bolhas de cavitação...... 20 1.2.3. Pressão de radiação acústica...... 21 1.3. Mecanotransdução...... 22 1.3.1. Amplificação da deformação mecânica...... 22 1.3.2. Mecanorreceptores...... 25 1.4. Vias de sinalização celular...... 28 1.4.1. FAK...... 28 1.4.2. Superfamília das TGF-β1...... 30 1.4.2.1. TGF-β1...... 30 1.4.2.2. BMP...... 31 1.5. Biologia do reparo ósseo...... 30 1.5.1. Etapas do reparo ósseo...... 32 1.5.1.1. Resposta inflamatória aguda...... 32 1.5.1.2. Formação de calo cartilaginoso e ósseo...... 33 1.5.1.3. Angiogênese...... 33

1.5.1.4. Mineralização óssea...... 34 1.5.1.5. Remodelação óssea...... 34 1.6. Aplicação das ondas acústicas para estímulo da osteogênese...... 35 1.6.1. Osso intacto...... 36 1.6.2. Osso Fraturado...... 36 Justificativa...... 38 Objetivos...... 38 Hipóteses...... 38 Metodologia...... 39 1. Animais...... 39 2. Delineamento experimental...... 39 3. Procedimento cirúrgico...... 41 4. Tratamento por ondas radiais...... 42 5. Tratamento por ondas focais...... 43 6. Tratamento por USPBI...... 44 7. Coleta do material para análise proteica...... 44 8. Preparo das amostras...... 45 9. Reagentes e equipamentos...... 46 10. Immunoblotting de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1...... 47 11. Análise estatística...... 48 Resultados...... 50 1. Tratados em relação ao controle...... 50 1.1. Ondas focais...... 50 1.2. Ondas radiais...... 63 1.3. USPBI...... 64 2. Razão Trat/Contr para o mesmo equipamento ou para o mesmo tempo de seguimento...... 65 3. Complicações...... 73 Discussão...... 74

1. Modelo de estudo da fratura...... 74 2. Protocolo de estímulo com ondas acústicas...... 75 2.1. USPBI...... 75 2.2. Ondas focais e radiais...... 75 2.2.1. Quantidade e momento dos estímulos...... 76 2.2.2. Número de pulsos...... 77 2.2.3. Densidade de fluxo de energia por pulso (ondas focais)...... 78 2.2.4. Intensidade da pressão (ondas radiais)...... 79 3. Coleta do material para análise proteica...... 80 4. Modulação da osteogênese pelas terapias acústicas...... 80 4.1. Efeitos agudos e imediatos (0 a 7 dias)...... 80 4.1.1. Ondas radiais...... 80 4.1.2. Ondas focais...... 81 4.1.3. USPBI...... 82 4.2. Efeitos a médio prazo (3 semanas)...... 83 4.2.1. Ondas radiais...... 83 4.2.2. Ondas focais...... 83 4.2.3. USPBI...... 84 4.3. Efeitos a longo prazo (6 semanas)...... 85 4.3.1. Ondas radiais...... 85 4.3.2. Ondas focais...... 86 5. Limitações do estudo...... 86 6. Relevância clínica e perspectivas futuras...... 87 Conclusão...... 88 Referências...... 89 Apêndice...... 105 Anexos...... 147

INTRODUÇÃO

O tecido ósseo é singular por sua capacidade de se regenerar; i.e., reparar-se sem a formação de tecido fibroso cicatricial. Especula-se que esta habilidade decorre da semelhança dos eventos celulares deflagrados durante o processo de reparo com os observados durante o desenvolvimento embrionário. Por conta disso, ao término do processo de regeneração, este tecido recupera integralmente suas funções biológicas e biomecânicas1-3. O processo de reparo ósseo está sujeito a interferências mecânicas e biológicas, que podem tanto prejudicar quanto otimizar o processo. Diversas interferências mecânicas podem melhorar o processo, dentre as quais se destacam as terapias acústicas, como ultrassom pulsado de baixa intensidade, ondas de choque e ondas de pressão radial. As terapias acústicas compreendem uma modalidade de tratamento médico empregadas para otimizar a regeneração óssea, quando se pretende acelerar o processo biológico; ou para promover a regeneração óssea, quando se pretende tratar distúrbios da osteogênese (p. ex., não união e retardo de união)4,5. As ondas acústicas são decodificadas, pelas células ósseas, em linguagem biológica representada pela expressão e ativação de uma miríade de proteínas. Estas se relacionam dentro de uma rede intricada de vias de sinalização celular que determinam o destino celular6. O entendimento da linguagem celular vem se aperfeiçoando conforme se realizam investigações experimentais. Na mesma linha, esta tese explora um segmento da linguagem celular ainda pouco compreendido que são as vias de sinalização deflagradas pelas terapias acústicas.

1. Revisão da literatura

1.1. Dispositivos acústicos Som é uma forma de energia que provoca vibração das moléculas dentro de um meio compressível, como a água ou ar. A vibração, ou radiação, constitui o mecanismo por que a onda sonora (onda acústica) se propaga, pois implica em ciclos rápidos de compressão (aproximação) e rarefação (afastamento) das moléculas. Assim, na fase de compressão, a energia é transmitida, em sentido único, para a molécula adjacente, na forma de ondas mecânicas; i.e., ondas que produzem movimento. Por este motivo, o som somente se propaga em meios compressíveis7- 10.

1.1.1. Ultrassom pulsado de baixa intensidade Quando a frequência da onda acústica é maior que 20kHz, i.e., superior à faixa audível para o ser humano, chama-se ultrassom. O ultrassom terapêutico pode ser operado de 45kHz a 3MHz, mas geralmente se utiliza a 1.5MHz ou 3MHz, de forma contínua ou em pulsos (disparos). Quando pulsado, opera conforme determinada frequência de pulso e ciclo de trabalho (do inglês, duty cycle), que varia de 10% a 50%7,11,12. O ciclo de trabalho corresponde à proporção do tempo do ciclo, determinado pela frequência de pulso, em que o equipamento realmente emite as ondas ultrassônicas. Por exemplo, para um ciclo de trabalho de 20% em equipamento operado com frequência de pulso de 1kHz, as ondas ultrassônicas são disparadas durante 200μs a cada segundo do ciclo. Este parâmetro independe da frequência da onda, mas determina a intensidade média temporal e média espacial (Isata) da energia transmitida7,11,12. Para fins terapêuticos, intensidade variando de 5-1000mW/cm2 é segura e aprovada pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e FDA (Food and Drug Administration), desde que seja respeitado o limite de tempo de exposição de 1 a 20 minutos, duração que varia conforme intensidade de energia e modo de operação (contínuo ou pulsado) utilizados. Não há, entretanto, valor estabelecido para ISATA que define o ultrassom de baixa intensidade. A despeito disso, arbitrou-se denominar ultrassom de baixa intensidade ondas com Isata menor ou igual a 150mW/cm2, visto que para esta faixa de intensidade não há efeito térmico, nem cavitações, fenômenos estes que podem provocar lesão tecidual (descritos adiante)7,11,12. Em 1983, Duarte LR publicou o resultado de seus trabalhos envolvendo o uso do USPBI (1.5MHz, ciclo de trabalho de 20%, frequência de pulso de 1kHz e Isata de 30mW/cm2) para acelerar a consolidação de fratura em animais. O equipamento desenvolvido pelo autor emitia ondas ultrassônicas desfocadas produzidas por um transdutor de cristal piezelétrico circular. A área efetiva irradiada por transdutores utilizados em equipamento clínico comercial (Exogen, Bioventus, EUA) possui 3.88cm2, comprimento focal de ~130mm e pico de pressão de rarefação de 0.076MPa7,8,13,14.

1.1.2. Ondas de choque Diferente das ondas sonoras convencionais, as ondas de choque, que também são ondas acústicas, trafegam em velocidade superior à do som. Sua fase compressiva ocorre de maneira abrupta, atingindo pico de pressão positiva de até 120MPa em menos de 10ns. Por conta disso, o formato do perfil de distribuição de pressão das ondas de choque se assemelha a um dente de serra, diferente do formato, sinusoidal, do perfil de distribuição de pressão das ondas ultrassônicas. Igualmente, a fase compressiva dá lugar à de rarefação rapidamente (pressão negativa de até 10MPa), determinando menor duração da onda (~1μs)9,15-18. 16

Porquanto são ondas de alta velocidade e pressão, as ondas de choque podem ser focadas tridimensionalmente numa região de interesse, onde descarregará a energia máxima. Por isso, nesta tese as ondas de choque serão denominadas, doravante, ondas focais; evitando, assim, qualquer confusão de terminologia quando comparadas às ondas de pressão radial9,15,16,19,20. Há, atualmente, diversos equipamentos disponíveis comercialmente que podem ser agrupados de acordo com a forma de geração da onda: eletro-hidráulico, eletromagnético e piezelétrico. Apesar de diferirem quanto à forma de geração, frequência, frequência de pulso, densidade de fluxo de energia, largura focal e capacidade de penetração; não há evidências científicas suficientes para discriminar a superioridade de um tipo de gerador de ondas focais sobre o outro18,21-23.

1.1.2.1. Dispositivo eletro-hidráulico Corresponde à primeira geração de equipamentos geradores de ondas focais. A onda é gerada a partir de uma descarga elétrica de alta voltagem aplicada em eletrodos imersos em fluido aquoso dentro de um refletor semielipsoide. A faísca resultante aquece e vaporiza o fluido, produzindo uma bolha que expande e produz uma onda de choque. Por conseguinte, a onda, ao atingir a superfície metálica do refletor semielipsoide, é refletida e, assim, focada para uma determinada zona terapêutica9,16,28. As especificações técnicas variam conforme fabricante e nem todos fornecem informação precisa. Os seguintes parâmetros foram obtidos da literatura e manuais disponíveis18-27: • Frequência da onda: 100kHz a 1MHz, podendo atingir 20MHz; • Frequência de pulso: 0.5-6Hz; • Densidade de fluxo de energia por pulso: 0.01-1.8mJ/mm2; • Largura focal: até 95mm; • Profundidade focal: até 100mm.

1.1.2.2. Dispositivo eletromagnético Dentro desses equipamentos, existe uma bobina eletromagnética adjacente a uma membrana metálica, ambas embebidas em fluido aquoso. Sob descarga de alta corrente, a bobina magnetiza e repele rapidamente a membrana metálica, que empurra o fluido aquoso e produz ondas de choque. Neste caso, as ondas atravessam uma lente acústica convergente que foca as ondas para a zona terapêutica. Existem alguns modelos que, à semelhança dos geradores eletro- hidráulicos, utilizam refletores parabólicos ao invés das lentes acústicas convergentes9,16,28. 17

As especificações técnicas variam conforme fabricante e nem todos fornecem informação precisa. Os seguintes parâmetros foram obtidos da literatura e manuais disponíveis18,21,23,29,30: • Frequência da onda: 100kHz a 1MHz, podendo atingir 20MHz; • Frequência de pulso: 1-8Hz; • Densidade de fluxo de energia por pulso: 0.01-1.0mJ/mm2; • Largura focal: até 65mm; • Profundidade focal: até 80mm.

1.1.2.3. Dispositivo piezelétrico O gerador piezelétrico é comercializado por somente um fabricante. Possui cerca de mil cristais piezelétricos dispostos em superfície esférica preenchida por fluido aquoso. Quando expostos à descarga elétrica de alta voltagem, os cristais contraem e expandem imediatamente gerando ondas de choque. Pela disposição geométrica dos cristais, as ondas são focadas na zona terapêutica que, neste caso, é menor em relação aos demais geradores. Por outro lado, a pressão das ondas sobre a pele do indivíduo é menor; por isso, exposição a ondas focais produzidas por gerador piezelétrico é praticamente indolor9,16,28. As especificações técnicas variam conforme fabricante e nem todos fornecem informação precisa. Os seguintes parâmetros foram obtidos da literatura e manuais disponíveis31-33: • Frequência da onda: informação indisponível; • Frequência de pulso: 1-8Hz; • Densidade de fluxo de energia por pulso: 0.03-0.4mJ/mm2; • Largura focal: até 4.8mm; • Profundidade focal: até 40mm.

1.1.3. Ondas de pressão radial Historicamente, as ondas de pressão radial têm sido denominadas erroneamente como ondas de choque radiais, ou ondas de choque desfocadas. Entretanto, as ondas de pressão radial possuem características físicas distintas das ondas focais, conforme apresentado a seguir15,17,34-37: • Tempo para atingir pico de pressão positiva: 600-1000ns; • Pressão positiva máxima: 0.1-19.9MPa; • Duração do pulso: 1-5ms. 18

Contrariamente, as ondas de choque apresentam as seguintes características físicas: • Tempo para atingir pico de pressão positiva: 5-10 ns; • Pressão positiva máxima: 11.5-120 MPa; • Duração do pulso: ~10 μs.

Além disso, pelas características físicas acima relatadas, o foco teórico das ondas de pressão radial é estimado em 80km de distância da fonte geradora; i.e., não é possível focar as ondas de pressão radial. Por isso, a propagação dessas ondas, ao contrário das focais, é divergente. Pelo mesmo motivo, nesta tese as ondas de pressão radial serão denominadas, doravante, ondas radiais17. As ondas radiais são produzidas pneumaticamente, de forma balística. Um projétil metálico é acelerado por meio de ar comprimido, ou por campo eletromagnético, dentro de um pistão cilíndrico (tubo-guia), e se choca contra um aplicador metálico posicionado sobre o tecido a ser tratado. O impacto do projétil contra o aplicador produz ondas de pressão que se expandem radialmente em direção ao tecido15,35. Consoante a isso, observa-se, em adição à discussão dos parágrafos acima, que a forma de geração das ondas radiais impossibilita a produção de ondas focais, pois a velocidade do projétil metálico dentro do pistão cilíndrico varia de 2-20m/s, ao passo que é necessário velocidade maior ou igual à do som para que sejam produzidas ondas de choque17,17,35-37. As especificações técnicas variam conforme fabricante e nem todos fornecem informação precisa. Os seguintes parâmetros foram obtidos da literatura e manuais disponíveis17,35,36,38-40: • Frequência da onda: 10kHz a 1MHz; • Frequência de pulso: 1-22 Hz; • Fluxo de densidade de energia: 0.08-0.55 mJ/mm2; • Pressão de pulso: 1.0-5.0 bar; • Capacidade de penetração: até 60 mm.

1.2. Fenômenos físicos desencadeados pelas ondas acústicas nos tecidos biológicos

1.2.1. Atenuação Quando a onda acústica entra em contato com a superfície do tecido biológico, uma fração da energia é refletida, outra fração é atenuada e o restante sofre refração e continua a propagar. Da porção que sofre atenuação, a maior parte é absorvida e convertida, irreversivelmente, em energia térmica (calor), devido, principalmente, à fricção de moléculas do meio41-43. A energia acústica também pode ser convertida em calor por dispersão energética pela falta de homogeneidade do meio (no caso, o tecido biológico), que redireciona a energia acústica para regiões fora do trajeto original da onda. Se a inomogeneidade for elevada, podem ocorrer múltiplas dispersões. Desse modo, a energia acústica pode se dispersar diversas vezes até ser completamente absorvida pelo tecido e convertida, irreversivelmente, em calor41-43. Dentre os tecidos biológicos, o osso possui um dos maiores coeficientes de atenuação acústica. Por isso, ondas acústicas tendem a produzir calor preferencialmente em ossos e articulações, podendo resultar em dano tecidual e dor dependendo das características da onda, como energia, frequência, modo de operação (contínuo ou pulsátil) e duração de exposição. Cumpre informar ainda que, quanto maior a frequência da onda, maior a atenuação; por isso, o aumento da frequência de onda diminui sua penetração nos tecidos7,41,42,44-46. Nesse diapasão, é conhecido que exposição por 5 minutos ao ultrassom desfocado operado em modo contínuo, a 1MHz e intensidade de 4000-5000mW/cm2 aumenta a temperatura óssea em 1.8-4.3°C (quando a 1-3cm de distância da fonte). Somando-se a isso, exposições a intensidades igualmente elevadas de ultrassom (5000-25000mW/cm2) provocam necrose e retardo na consolidação de fraturas. Apesar disso, foi observado que ultrassom na faixa de 200-3000mW/cm2 mantém seu potencial osteogênico. Em contrapartida, USPBI na faixa de 20-50mW/cm2 produz variação insignificante da temperatura (0.01±0.005°C) e acelera a consolidação de fraturas7,41,42,44-46. Não há dados na literatura quanto aos efeitos térmicos das ondas focais e radiais; porém, a observação de que cultura de células expostas a tais ondas provoca, nas primeiras 24-72h, diminuição da viabilidade celular, sugere lesão por impacto direto, cavitações, ou aumento da temperatura47-52.

1.2.2. Bolhas de cavitação A fração da onda acústica que sofre refração, quando trafega próximo a bolhas, pode gerar bolhas de cavitação em locais denominados sítios de nucleação. Cavitação é um conjunto de fenômenos complexos que envolve a criação, crescimento, oscilação e colapso de bolhas dentro de um meio líquido. O fenômeno já foi comprovado em modelos in vivo, de maneira indireta; e in vitro, por documentação fotográfica21,23,42,45,53,54. Os seguintes elementos determinam o comportamento e a ocorrência da cavitação: • Pressão acústica; • Existência de micro-heterogeneidades no meio líquido, como gás livre, partículas sólidas, ou combinação de ambos; • Se o campo acústico é focado ou desfocado, pulsado ou contínuo; • Natureza e estado do material e de suas margens.

O USPBI não provoca cavitação, pois esta não é gerada por ondas ultrassônicas com intensidade menor que 500mW/cm2. Além de não apresentar efeito térmico, esse constitui o segundo motivo porque o USPBI não provoca lesão celular. Esses fatos atestam sua segurança independente do tempo de exposição7,12,42,55,56. Por outro lado, as ondas ultrassônicas emitidas pelos equipamentos geradores de ondas radiais e pela maioria dos geradores de ondas focais produzem cavitações, visto que a intensidade da onda supera 500mW/cm2. Ademais, a literatura dispõe de estudos experimentais que comprovam a formação de bolhas de cavitação decorrentes da exposição de meios líquidos às ondas radiais e focais23,35,46,56-58. As bolhas de cavitação se formam na fase de rarefação (pressão negativa) da onda acústica, quando a força de tensão produzida pela onda excede a resistência de tração do meio líquido. As bolhas são esferas preenchidas por gás, imersas em líquido e sob constante pressão hidrostática. Em resposta a um campo acústico com variação sinusoidal da pressão em função do tempo, o raio da bolha oscila (expande e contrai) em velocidade e deslocamento que também variam de forma sinusoidal em função do tempo e na mesma frequência da onda9,56. A cavitação pode ser dita estável, quando a pressão da onda acústica é baixa e em sincronia com o movimento da bolha. Neste caso, o líquido circunjacente também se move harmonicamente, “para frente e para trás”, resultando em fluxo do fluido estável denominado microcorrente. Esse tipo de cavitação ocorre próximo da transição entre o meio líquido e sólido, como o osso, e cria estresse de cisalhamento que pode estimular mecanicamente as células9,56. Outro tipo de cavitação é denominado inercial, decorrente do acúmulo excessivo de energia dentro da bolha após sucessivos pulsos sônicos, ou mesmo após o 21

primeiro pulso se a energia for excessivamente elevada. Nessa situação, a bolha sofre contração extremamente rápida e colapsa, produzindo 5 outros fenômenos9,35,41,42,46,56,59,60: • Liberação da energia na forma de alta temperatura, produzindo radicais livres que podem danificar as células; • Ondas de choque secundárias que produzem efeito direto no tecido. Aqui, fala-se ondas de choque pois os trabalhos foram realizados com ondas focais. Portanto, não se sabe se as ondas radiais produziriam ondas radiais (ultrassônicas) secundárias; • Agregação da bolha com bolhas circunjacentes; • Fragmentação da bolha em bolhas menores, podendo repetir o ciclo de crescimento e colapso diversas vezes; • Um pulso ultrassônico sequencial, durante sua fase positiva, pode empurrar o líquido do meio contra uma das paredes da bolha, que se deforma progressivamente até atingir a parede oposta e, por fim, colapsa. Após o colapso, forma-se um microjato (com o líquido que empurrou a parede da bolha) que recebeu a energia armazenada na bolha, e este se choca contra a superfície do tecido com velocidade superior à inicial. Geralmente, esse fenômeno ocorre na vizinhança de áreas limítrofes entre materiais de densidade diferente, como o osso e a cartilagem.

1.2.3. Pressão de radiação acústica Este é o único fenômeno biofísico desencadeado pelo USPBI, e deve responder também pelos efeitos anabólicos das ondas focais e radiais nos tecidos vivos. Ao contrário da cavitação, que é gerada pelas forças tensionais da fase de rarefação da onda acústica, a pressão de radiação acústica é produzida durante a fase compressiva da onda, por deformação mecânica direta ou indireta16,41,45,46. A deformação direta ocorre na direção e sentido da propagação da onda, e tem seu efeito biológico a partir da deformação da membrana celular. A deformação indireta, por sua vez, resulta das correntes acústicas formadas pelo gradiente de pressão entre a fonte geradora da onda e a transição entre o meio líquido e o tecido “sólido”, fenômeno este que será descrito a seguir7,10,41,56. A intensidade da pressão de radiação acústica diminui conforme aumenta a distância da fonte geradora, resultando em um gradiente pressórico, que é máximo entre a fonte geradora e a região situada na divisória (limite) entre o meio líquido e o tecido sólido. Porquanto a tendência do fluido é de se deslocar do local de maior pressão para o local de menor pressão, forma-se um fluxo do fluido denominado corrente acústica. Esta difere das microcorrentes, mencionadas previamente, pois não se relacionam com as oscilações harmônicas das cavitações estáveis; mas ambas, microcorrentes e correntes acústicas, deformam as membranas celulares12,45,56,61. 22

Quando o fluido atinge a transição entre o meio líquido e o tecido, a pressão nas proximidades do tecido aumenta. Além disso, parte da onda que atinge o tecido sofre refração perpendicular, denominada conversão modal. Com isso, a trajetória do fluido acumulado nas vizinhanças entre a transição do meio líquido e o tecido, é desviada perpendicularmente (paralela à margem da transição). Na sequência, como a pressão na região da “nova trajetória” do fluido se torna maior do que a das proximidades da fonte geradora, o fluido retorna à fonte geradora (ao transdutor), formando redemoinhos de recirculação (assim como ocorre nas ondas do mar)9,12,42,44,45,56,61.

1.3. Mecanotransdução Denomina-se mecanotransdução o conjunto de fenômenos biofísicos desencadeados pela exposição do tecido biológico a forças mecânicas, resultando em reações biológicas; ou, de forma ainda mais simplificada, a conversão de forças mecânicas em reações biológicas. No tecido ósseo, inicialmente, as forças mecânicas são amplificadas; em seguida, “sentidas” pelos mecanorreceptores da membrana plasmática; e, finalmente, ativam vias de sinalização celular que incitam determinada resposta celular, como proliferação, diferenciação, migração, apoptose, etc.

1.3.1. Amplificação da deformação mecânica Strain é uma medida geométrica, adimensional, de deformação que representa o deslocamento relativo das partículas de um corpo submetido à força mecânica. Por exemplo, um corpo com 1000mm de largura que, ao ser submetido à força compressiva, sofre deformação de 1mm de sua largura (i.e., 0.1% da largura), foi submetido à deformação relativa correspondente a 1000μstrain. A deformação relativa teórica de 1 strain corresponde a 100% de deformação. Este valor é teórico pois significaria a destruição do material53. Os vários tipos celulares que povoam o tecido ósseo – osteoblastos, osteócitos, células periosteais e células tronco mesenquimais – são responsivos à estimulação mecânica. O osso é um material rígido que pode suportar até ~2% de deformação relativa (i.e., 20000μstrain) sem fraturar. Entretanto, a deformação relativa necessária para estimular células ósseas é ~10000-100000μstrain, que corresponde de 10 a 100 vezes a deformação relativa sofrida pelo tecido ósseo durante a locomoção habitual de um indivíduo (400-3000μstrain, mas raramente excede 1000μstrain), podendo superar a resistência óssea e produzir fratura. Com base nessa discrepância de grandezas de deformação relativa, alguns autores, propuseram um modelo matemático baseado na existência de um sistema de amplificação, em nível celular, das forças deformantes a que o tecido é exposto49,51-53,62-71. Microscopicamente, o osso possui arquitetura peculiar estruturada num sistema canalicular. Este sistema é constituído por canais Haversianos dispostos longitudinalmente, canais de Volkmann dispostos transversalmente para prover comunicação entre os canais Haversianos, e lamelas dispostas radialmente a partir 23 dos canais Haversianos para aumentar a resistência mecânica do tecido. As lamelas e a parede dos canais Haversianos e de Volkmann são formadas pela MEC óssea, composta principalmente por hidroxiapatita e colágeno tipo I. A MEC óssea é produzida e mantida pelos osteócitos localizados dentro de lacunas produzidas pelo próprio osteócito residente. Além disso, os osteócitos possuem prolongamentos do seu citoplasma, denominados dendritos ou processos citoplasmáticos (semelhantes aos processos citoplasmáticos dos neurônios), que possuem suas próprias lacunas denominadas canalículos (figura 1)53,71-76.

Figura 1. Microanatomia do tecido ósseo estruturada no sistema canalicular composto por canais Haversianos, canais de Volkmann e canalículos. As lamelas e lacunas são formadas por elementos da MEC óssea e formam as paredes do sistema canalicular.

Entre a parede do canalículo e o processo citoplasmático, existe o espaço pericelular que contém fluido com albumina e uma PEM com proteoglicanos e fibrilas transversas, as quais centralizam e ancoram o processo citoplasmático ao seu canalículo. O citoesqueleto do processo citoplasmático é composto por fibras de actina dispostas longitudinalmente no mesmo eixo do processo citoplasmático. Os filamentos de actina estão separados entre si por fimbrinas, proteínas rígidas de ligação cruzada dispostas axialmente no mesmo eixo das fibrilas. As fimbrinas, que também compõem o citoesqueleto do processo citoplasmático, separam os filamentos de actina por cerca de 25 nm de distância (figuras 2 e 3). Quanto maior a distância entre os filamentos de actina, maior a amplificação da deformação no nível dos processos citoplasmáticos. Por outro lado, a variação do diâmetro do espaço pericelular na faixa de 14 nm a 100 nm altera menos de 40% a amplificação do estímulo53,71-76. No modelo matemático desenvolvido, demonstrou-se que a disposição espacial das estruturas contidas no canalículo permite amplificação da deformação inicial sofrida pelo tecido ósseo, em nível celular, da seguinte forma: a deformação relativa sofrida pelo osso gera fluxo do fluido canalicular, produzindo, ao contato com albumina e outros solutos, uma força de arrasto que, em contato com as estruturas do citoesqueleto do canalículo, gera deformações circulares (do inglês, hoop strain) na ordem de 20 a 100 vezes maiores do que a deformação sofrida inicialmente pelo osso53,71-76.

Figura 2. Relação espacial entre as estruturas do canalículo: o espaço pericelular se situa entre o canalículo e o processo citoplasmático, e contém um fluido com albumina e PEM. Na PEM, há proteoglicanos e fibrilas transversas. Estas centralizam e ancoram o processo citoplasmático ao seu canalículo. O esqueleto do processo citoplasmático é composto por fibras de actina, dispostas longitudinalmente, separadas por cerca de 25 nm pelas fimbrinas, dispostas transversalmente.

Somado à força de arrasto, o fluxo do fluido produz estresse de cisalhamento entre o corpo celular e o processo citoplasmático do osteócito, que também estimula mecanicamente a célula óssea; mas, deve-se esclarecer que o estresse de cisalhamento não amplifica a deformação mecânica (figura 3)77,78.

1.3.2. Mecanorreceptores Diversas estruturas na membrana celular atuam como mecanorreceptores, como integrinas, canais iônicos, receptores de ATP, receptores de fatores de crescimento, proteínas G, proteínas frizzled, receptores de lipoproteína de baixa densidade e conexinas. Assim como ocorre em reações químicas (entre compostos moleculares), a força mecânica deformante altera a conformação estrutural dos receptores, ativando-os e deflagrando cascatas de reações biológicas22,62,64,69,79-85. Dentre os mecanorreceptores, especula-se que as integrinas sejam as mais importantes; pois evidências sugerem que sejam necessárias para a ativação dos demais mecanorreceptores, estão intimamente relacionadas com a matriz extracelular e o citoesqueleto, e são necessárias para a ativação de diversas vias de sinalização induzidas por estímulos mecânicos22,45,51,53,62,69,74,86-90.

Figura 3. Modelo de amplificação do estímulo mecânico: a força deformante produz fluxo do fluido canalicular, produzindo uma força de arrasto, que, em contato com as estruturas do canalículo, gera deformações circulares, que são de 20 a 100 26

vezes maiores do que a força deformante inicial. Além disso, o fluxo do fluido canalicular, em contato direto com a membrana plasmática, do corpo celular ou do processo citoplasmático, produz estresse de cisalhamento o que também estimula a célula óssea.

As integrinas são glicoproteínas transmembrana heterodiméricas (contêm 1 unidade α e 1 unidade β) e receberam essa denominação devido sua função de integrar o meio extracelular com o meio intracelular. As subunidades α2, α5, β1, β3 e β5, e os heterodímeros α5β1 e αvβ3 são responsivos a estímulos mecânicos, que podem ser provenientes do USPBI e das ondas focais. Não há estudos envolvendo o uso de ondas radiais e a atividade das integrinas22,90-92. No meio extracelular, as integrinas se conectam às proteínas da MEC ou da PEM; na membrana citoplasmática, conectam-se com Lrp5, proteínas frizzled, proteína G, adenilato ciclase, canais iônicos (sódio, potássio, cálcio, NMDA); e, no meio intracelular, conectam-se com a FAK e componentes do citoesqueleto (talina, paxilina, vinculina) (figura 4). Postula-se que, através dessas conexões as integrinas sejam o pilar de um sistema denominado MEC/PEM-integrinas-citoesqueleto-núcleo, que funciona como alavancas ao transmitir a força deformante proveniente da superfície celular até o núcleo celular22,45,51,53,62,67,69,74,86-90. Após a deformação celular, as integrinas também são deformadas, resultando em aglomeração de integrinas em sítios específicos da célula denominados adesões focais. Esses locais se tornam favoráveis a reações celulares pois atraem proteínas citoplasmáticas adaptadoras, como a FAK e Src, também ativadas mecanicamente pela deformação estrutural produzida pelas integrinas. Com isso, deflagram-se cascatas de reações celulares relacionadas com migração, diferenciação, proliferação e inibição da apoptose (figuras 4, 5 e 6)3,10,39,45,52,55,57,62,69-73.

Figura 4. As integrinas (representadas por α e β) conectam os componentes da MEC (representados por fibronectina e colágeno I) e a PEM ao meio intracelular graças as suas conexões com componentes do citoesqueleto (representados por paxilina, talina, vinculina e actina) e proteínas citoplasmáticas (representadas pela FAK e Src). O estímulo mecânico deforma inicialmente os componentes da MEC e PEM, que transmitem a força deformante para as integrinas. Estas ativam outros receptores transmembrana e deflagram diversas cascatas de sinalização celular. Nesta imagem, destacam-se duas vias principais de sinalização orquestradas pela FAK, ambas relacionadas com migração, diferenciação, proliferação e inibição da apoptose. 28

Figura 5. Sistema de alavancas formado pela ligação dos componentes da MEC (representados por fibronectina e colágeno tipo I) com as integrinas, e destas com o citoesqueleto (representados pela paxilina e talina).

1.4. Vias de sinalização celular Existe uma miríade de vias de sinalização celular deflagradas por perturbações mecânicas, como as da FAK, superfamília dos TGF-β, proteínas Wnt, canais iônicos, IGF-I e estrógeno. Nesta tese, serão descritos somente as de interesse para o estudo realizado.

1.4.1. FAK A FAK é uma proteína adaptadora que interage com várias proteínas em diferentes sítios de sua estrutura, resultando em variados tipos de resposta celular aos estímulos. Somando-se a isso, a FAK pode interagir com mais de uma proteína ao mesmo tempo e ser fosforilada em mais de um sítio ao mesmo tempo. Com base nessas características, acredita-se que a FAK seja uma das proteínas principais na modulação da osteogênese induzida por estímulos mecânicos90,93-95. Dentre as possibilidades de sítios de ativação, o único sítio comprovadamente relacionado com estímulos mecânicos é o de tirosina 397. Após deformação celular, a FAK é autofosforilada no resíduo de tirosina 397, ativando-a através da criação de sítios de alta afinidade para proteínas contendo o domínio SH2, como Src e a subunidade p85 da PI3K. Através da interação com Src, ocorre ativação da via FAK/Src/Grb2/Sos/Ras/ Raf/MEK/ERK-1/2; e, interagindo com a PI3K, ativa-se a via FAK/PI3K/Akt/NFκB. Ambas as vias sinalizam migração, proliferação e diferenciação celular, e inibição da apoptose. A intensidade da ativação dessas vias pode ser regulada pela 29

concentração de proteínas no citoplasma; dupla fosforilação da FAK, ERK-1/2 e Akt; e migração da FAK, ERK-1/2 e Akt para o núcleo celular (figura 4)22,96-100.

Figura 6. O estímulo mecânico é propagado para dentro da célula através do sistema de alavancas (PEM/MEC-integrinas-citoesqueleto-núcleo). As forças deformantes (F1, F2, F3, F4) são distribuídas por vários pontos de apoio do sistema de alavancas.

Outra possibilidade de regulação da atividade das vias sinalizadas pela FAK é através da fosforilação da PYK2 no resíduo de Tyr-402 de modo dependente de cálcio. O estímulo mecânico provoca influxo de cálcio na célula através de canais de cálcio, ativando a PYK2, que se acopla a FAK via SH2, resultando em transfosforilação da FAK em Tyr-397, Tyr-576 ou Tyr-925. Especula-se que a transfosforilação da FAK pela PYK2 aumente a atividade quinase de tirosina da FAK, porque foi demonstrado que a fosforilação da ERK-2 em Tyr-187 aumenta quando a FAK se acopla a PYK295. Questiona-se se a ativação da p38 – uma MAPK como a ERK – pelo estímulo mecânico esteja relacionada com a interação da FAK com a PYK2, porque a FAK sinaliza a via FAK-Src/Grb2/Sos/Ras/PAK/MKK3/6; e a ativação máxima da p38 depende de cálcio, que é necessário para a atividade da PYK2101. Entretanto, não foram encontrados estudos investigando a relação da p38 com FAK e PYK2. Curiosamente, o estímulo mecânico induz a ligação da FAK com canais de potássio dependentes de cálcio sem que a FAK esteja fosforilada em tyr-397. No 30

entanto, é desconhecido se a interação da FAK com tais canais aumenta – ou prolonga – a atividade do canal de potássio, aumenta a sensibilidade da célula ao estímulo mecânico, facilita a comunicação intercelular, ou outra função102.

1.4.2. Superfamília das TGF-β As proteínas TGF-β são uma superfamília de genes compostas por, pelo menos, 5 moléculas intimamente relacionadas; e por outras moléculas mais distantes, mas altamente homólogas, “primas”, que incluem as BMPs, inibinas e activina. As proteínas dessa família são ubiquamente expressas apesar dos 2 maiores reservatórios serem o osso e as plaquetas. Sugere-se que todas estão relacionadas com proliferação e diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário e reparo de lesão em humanos e inúmeras espécies animais. Todas são produzidas como uma grande pré-pró-proteína, consistindo em um peptídeo sinalizador, um pró- domínio (também chamado de LAP) grande com mais de 200 aminoácidos, e uma região madura com 100-150 aminoácidos103-105. Há evidências de que o USPBI e as ondas focais aumentam a expressão das TGF-βs, particularmente TGF-β1 e BMP-2, em células ósseas em modelos experimentais in vitro e in vivo, mas não há nenhuma investigação com o uso das ondas de pressão radial48, 106-111.

1.4.2.1. TGF-β O grupo dos TGF-β são altamente homólogos estruturalmente. Geralmente suas isoformas são homodiméricas, compreendendo os subtipos TGF-β1, TGF-β2 e TGF- β3. Até o momento, não foi identificado diferença funcional entre as isoformas de TGF-β. Há apenas diferença na capacidade de ligação e potência funcional. O TGF- β1 é geralmente expresso em áreas de osteogênese, enquanto que TGF-β2 e -β3 expressos em locais onde há condrogênese103. Quando secretados, os TGF-β se associam a proteoglicanos e glicoproteínas da matriz extracelular que os protegem da degradação precoce. Ademais, são secretados como precursores latentes (inativos) que requerem clivagem proteolítica de seu resíduo terminal de amina para se tornarem ativos. Em especial, a estrutura molecular do pró-domínio do TGF-β1 apresenta conformação semelhante a uma “camisa de força” localizada em torno do domínio maduro C-terminal do TGF-β1, bloqueando fisicamente a ligação de sua porção madura com o receptor desse fator, presente na célula-alvo; e, portanto, o pró-domínio do TGF-β1 o mantém inativo103,105. Ambientes ácidos como os das lacunas de Howship (espaço, resultante da degradação osteoclástica, entre as bordas pregueadas dos osteoclastos e a MEC), e do microambiente isquêmico da fratura ou da osteotomia, também contribuem para a conversão TGF-β1 na sua forma ativa. Por isso, os osteoclastos são cruciais para o reparo da fratura. Somando-se a isso, na molécula do TGF-β1, há locais de ligação a integrinas, permitindo que o TGF-β1 se torne ativo por deformação mecânica. Especula-se que a integrina engata no LTBP-1, -3, ou -4, ligado ao pró-domínio do 31

TGF-β1, e rompe a ligação na vigência de perturbações mecânicas103,105. Os TGF-β se ligam à porção extracelular dos receptores tipos I (TβRI, também denominado Alk1) e II (TβRII), formando um complexo heteromérico que induz aproximação dos domínios citoplasmáticos desses receptores (contendo quinase de serina/treonina), que promove a transfosforilação do receptor tipo II para o receptor tipo I. Este, após ativação (fosforilação), fosforila proteínas R-Smad (Smad2 e Smad3), que formam um hetero-oligômero com a Smad4, e, sequencialmente, translocam ao núcleo celular, onde atuam como fatores de transcrição105. Funções do TGF-β1103,110-112: • Estimula migração, proliferação e diferenciação osteoblástica de células osteoprogenitoras; • No início do reparo ósseo, inibe diferenciação, proliferação e ativação dos osteoclastos; mas, posteriormente, promove diferenciação e ativação osteoclásticas. Nota-se que a própria ativação dos osteoclastos, induzida por TGF-β, ativará TGF-β latentes que desempenharão papel importante na remodelação óssea; • Incita produção de colágeno, fosfatase alcalina, osteonectina e osteopontina, importantes para a mineralização óssea; • Diminui expressão de osteocalcina, que inibe mineralização óssea; • Inibe a produção de metaloproteinases matriciais e aumenta a síntese de inibidores de metaloproteinases matriciais (p. ex., TIMP-1), retardando a degradação da MEC; • Estimula síntese de VEGF.

1.4.2.2. BMP Os BMP são considerados os fatores de crescimento mais osteoindutivos que se conhece. Dos 30 tipos de BMP identificados, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 e BMP-9 são os mais osteogênicos; capazes de induzir diferenciação osteoblástica em vários tipos celulares, como células tronco mesenquimais e fibroblastos. Quando em baixa concentração, promovem quimiotaxia e proliferação celular; quando em alta concentração, favorecem diferenciação celular e osteogênese103. BMP-2/4 se ligam à porção extracelular dos receptores tipo I (BMPRIa ou BMPRIb) e II (BMPRII, também denominado ActRIIA; ou ActRIIB) e formam um complexo heteromérico que ativa, assim como descrito para os TGF-β, R-Smads. Neste caso, as R-Smad envolvidas são as Smad1, Smad5, e Smad8. O complexo formado entre os receptores tipo I e II e as R-Smad se liga a Smad4, e o hetero- oligômero resultante transloca ao núcleo celular, onde atua como fator de transcrição sobre os genes RUNX2 (também conhecido como cbfa1), DLX5 e osterix, que regulam a síntese de matriz extracelular óssea e diferenciação osteogênica97,105,113,114. 32

A via de sinalização descrita acima corresponde à via canônica das BMP. Estas proteínas possuem também uma via de sinalização não canônica que envolve a ativação das MAPK (p38, JNK e ERK). Alternativamente, as BMP podem se ligar ao receptor tipo IV, ao invés dos receptores I e II, estimulando expressão direta do RUNX2103,114. Cabe notar que os osteoclastos, apesar de serem células de linhagem hematogênica, também possuem receptores para as BMP. Estes, quando ativados, potencializam os efeitos do M-CSF e RANKL sobre a proliferação e diferenciação osteoclástica113,115-117.

1.5. Biologia do reparo ósseo O reparo da fratura é um fenômeno biológico que coordena vários processos celulares, que podem resultar na consolidação óssea direta ou indireta. A primeira é menos comum, pois exige redução anatômica, estabilidade absoluta e ausência de contato entre os fragmentos de, no máximo, 0.8-1.0mm. Neste caso, há ossificação denominada intramembranosa, consistindo em formação direta de tecido ósseo lamelar, que, por sua vez, sofre remodelação até recuperar suas propriedades biomecânicas2. A consolidação indireta, ou secundária, é mais comum pois não exige condições de estabilidade absoluta, nem redução anatômica dos fragmentos. Ao contrário, é estimulada por micromovimento e descarga de peso. Por outro lado, como o tecido ósseo lamelar não suporta deformações relativas maiores que ~2%, o reparo ocorre, principalmente, por meio de ossificação endocondral, e, minoritariamente, por ossificação intramembranosa2. A ossificação endocondral produz, inicialmente, tecido cartilaginoso, capaz de suportar maior deformação relativa. O tecido neoformado, denominado calo ósseo, estabiliza a fratura, permitindo, posteriormente, a migração de células osteoprogenitoras capazes de produzir osso lamelar1-3.

1.5.1. Etapas do reparo ósseo Pode-se identificar 4 a 5 etapas principais no processo de regeneração tecidual. As etapas do reparo ósseo ocorrem em momentos oportunos, sobrepondo-se umas as outras de maneira coordenada para permitir o sucesso da regeneração tecidual. Portanto, é indispensável compreender que a divisão do processo em etapas tem finalidade exclusivamente didática e para nortear linhas de pesquisa.

1.5.1.1. Resposta inflamatória aguda Imediatamente após a lesão tecidual, forma-se um hematoma composto por células do sangue periférico e intramedular (medula óssea). A resposta inflamatória que se sucede atinge pico dentro de 24 horas e se completa após 7 dias. Apesar 33

disso, as moléculas pró-inflamatórias também atuam tardiamente na regeneração tecidual2,118,119. Inicialmente, há liberação de BMP, FGF-2, IL (-1, -6, -11, -18), M-CSF, PDGF, TGF-β, TNF-α e VEGF; que recrutam células inflamatórias (principalmente, linfócitos T e macrófagos), estimulam proliferação de células tronco mesenquimais e sua diferenciação osteogênica, incitam a diferenciação de osteoclastos, e promovem angiogênese2,118,119.

1.5.1.2. Formação de calo cartilaginoso e ósseo O hematoma da fratura coagula no interior da fratura e em suas bordas, servindo de molde para a formação do tecido de granulação rico em fibrina, dentro do qual ocorre a ossificação endocondral. Esta origina o calo cartilaginoso (ou mole) entre as extremidades da fratura e sobre o periósteo adjacente2. Sob influência de BMP-2 e TGF-β, majoritariamente as células periosteais (fornecem mais de 50% da massa celular para o tecido ósseo neoformado) são incitadas a promover condrogênese para formação do calo cartilaginoso, que atinge pico de crescimento entre 7-9 dias após lesão. Células provenientes de partes moles (p ex., mioblastos), medula óssea e circulação sistêmica também participam, mas contribuem menos para a população de células que se comprometem com a diferenciação osteogênica. Estas células assumem papel mais relevante nos casos em que há perda de periósteo, como nas fraturas expostas produzidas por alta energia cinética1,2,118,119. Concomitantemente, também sob a influência de BMP-2, células periosteais, e células tronco mesenquimais situadas no espaço medular, diferenciam-se em osteoblastos para promover a ossificação intramembranosa subperiostealmente e adjacente às extremidades da fratura; ou finalizar a ossificação endocontral por meio da substituição do tecido cartilaginoso por ósseo primário. Destarte, o calo, inicialmente cartilaginoso e mole, torna-se – entre 10-21 dias após a lesão – ósseo e rígido, conferindo maior estabilidade à fratura1-3. Cumpre, aqui, destacar que tanto a ossificação endocondral que ocorre no reparo tecidual, quanto a que ocorre no desenvolvimento embrionário é orquestrada diretamente pelas BMP, FGF-2, proteínas “ouriço” (hedgehog), PTH, proteína relacionada ao PTH, TGF-β, fatores morfogenéticos “sem asas” (wingless morphogenetic factors), proteínas Wnt e antagonistas das Wnt1.

1.5.1.3. Angiogênese Aporte sanguíneo é imprescindível para o sucesso da osteogênese. A despeito do calo cartilaginoso ser avascular, as vias que sinalizam a angiogênese são deflagradas durante a ossificação endocondral. Quando se trata da consolidação direta, por ossificação intramembranosa, a angiogênese ocorre na traseira dos cones 34

cortantes (cutting cones), acompanhando a remodelação dos canais de Havers e de Volkmann1-3. A angiogênese é regulada, principalmente, pelo VEGF; mas também pela angiopoietina. Esta pertence a uma família de proteínas vasculares morfogenéticas e é induzida na fase final da cascata de regeneração tecidual. A angiopoietina promove o crescimento vascular a partir de vasos remanescentes do periósteo2. O VEGF, por sua vez, regulador chave da angiogênese, é expresso por condrócitos hipertrofiados do calo cartilaginoso e por osteoblastos. Promove a invasão vascular no calo cartilaginoso tanto a partir de vasos pré-existentes (angiogênese), quanto a migração e diferenciação de células tronco mesenquimais endoteliais para a formação de plexos vasculares (vasculogênese)2. Além do VEGF e da angiopoietina, as BMP e os TGF-β também incitam a angiogênese, provavelmente pela modulação dos processos envolvidos na expressão e secreção de VEGF2,3.

1.5.1.4. Mineralização óssea À medida que os condrócitos hipertrofiam, sua matriz extracelular calcifica. Consoante a isso, sob influência de TNF-α, M-CSF, RANKL, e OPG, ocorre diferenciação de osteoclastos e osteoblastos para, respectivamente, reabsorver a matriz cartilaginosa calcificada e substituí-la por tecido ósseo primário (woven bone, também traduzido como osso imaturo, ou fibroso), que é inicialmente o calo ósseo rígido, cujo pico de formação ocorre após 14 dias da lesão em modelos experimentais animais2. Essa etapa é um marco que indica a diferenciação osteoblástica; i.e., a osteogênese propriamente dita. Nesse diapasão, há aumento da expressão de marcadores da osteoblastogênese, inicialmente o colágeno tipo I, seguido por fosfatase alcalina, osteocalcina e osteonectina2,100.

1.5.1.5. Remodelação óssea O calo rígido é uma estrutura rígida com certa estabilidade biomecânica. Todavia, seu tecido ósseo, ainda imaturo, não restaura completamente as propriedades mecânicas do osso maduro (lamelar). Para que isso ocorra, a partir da 3ª-4ª semana após o trauma, é deflagrada uma 2ª fase reabsortiva para remodelar o calo rígido e transformá-lo em osso lamelar1,2. Esta fase é orquestrada por IL-1 e TNF-α, cuja expressão se eleva. Contrariamente, a expressão da maioria dos membros da superfamília do TGF-β diminui, exceto a BMP-2, cuja expressão se mantém elevada semelhante a outras isoformas das BMP2. O remodelamento ósseo exige o balanço fino entre a reabsorção de calo rígido, efetuada pelos osteoclastos; e deposição de osso lamelar, executada pelos 35

osteoblastos. Para tanto, formam-se UMBs, compostas por osteoclastos na dianteira do cone cortante, e osteoblastos na porção traseira do cone (denominada cone de fechamento, closing cone) acompanhados por vasos sanguíneos e inervação periférica que invadem o sistema de canais Haversianos2,120. A disposição histológica das células nas UMBs reflete a sequência de eventos exigida para o reparo ósseo bem-sucedido. Nesse contexto, inicialmente, a atividade dos osteoblastos deve ser suprimida para que o osso danificado, imaturo, ou senil, seja completamente removido pelos osteoclastos. Estes, desse modo, expressam Semaforina 4D, que inibe a osteogênese por meio da inativação da via de sinalização do IGF-I. Posteriormente, os osteoblastos ativos expressam Semaforina 3A, que inibe a osteoclastogênese120. Os fatores de crescimento que participam da regulação da remodelação óssea são praticamente os mesmos de todo o processo (BMP, FGF, IGF, PDGF e TGF-β) com destaque para as BMP e TGF-β, que participam tanto da osteoblastogênese quanto da osteoclastogênese3,120.

1.6. Aplicação das ondas acústicas para estímulo da osteogênese A capacidade do USPBI e das ondas focais de induzir osteogênese em vários tipos de cultura celular (osteoblastos, osteócitos, células periosteais, células da medula óssea, células do ligamento periodontal e células derivadas de hematoma) é inquestionável. O potencial osteogênico dessas modalidades de terapia acústica se deve à modulação da expressão de Akt, BMP-2, ERK, FAK e TGF-β122,47- 49,51,52,66,75,85,90,96,111,121-134. Inclusive macrófagos exibem aumento de proliferação e da atividade fagocítica quando submetidos às ondas focais e ao USPBI, respectivamente; e observa-se aumento da diferenciação osteoclástica em escamas de peixe-zebra expostas ao USPBI via ativação da ERK. Apesar de não estarem diretamente relacionadas com a síntese de tecido ósseo, os macrófagos e osteoclastos são fundamentais no reparo ósseo. O mecanismo de atuação das ondas nesses tipos celulares, entretanto, requer mais investigações para ser esclarecido135-138. Embora inquestionável em modelos in vitro, os resultados clínicos das ondas focais e USPBI são variáveis conforme as condições em que são empregadas (osso íntegro e sadio, osteoporose senil ou hormonal, retardo de união, não união e fratura), provavelmente pelo índice elevado de heterogeneidade do próprio desenho de estudo, fato este demonstrado por metanálises com objetivo de determinar a eficácia das terapias139-141. As ondas radiais são amplamente utilizadas no manejo de diversas patologias musculoesqueléticas, como fasciopatia plantar, tendinite calcária e tendinopatia patelar. Entretanto, embora a experiência clínica – com evidência nível 5 (i.e., opinião de especialista) – demonstre resultados favoráveis da utilização da terapia por ondas de pressão radial para estimular osteogênese em indivíduos apresentando distúrbios da consolidação óssea, há poucas publicações nessa seara37,142-144: 36

• 1 ensaio clínico demonstrando o potencial osteogênico da terapia em distúrbios de união (nível de evidência 4); • 1 estudo experimental in vitro, com resultados pouco elucidativos; • 1 estudo experimental in vivo, demonstrando estímulo da osteogênese em osso intacto; • 1 estudo experimental in vivo, demonstrando otimização da osteogênese em tíbias perfuradas.

1.6.1. Osso intacto No osso íntegro e sadio, as 3 modalidades de terapias acústicas induzem osteogênese, o que suscitou a investigação – somente para o USPBI e ondas focais – do seu uso para a prevenção e tratamento de osteoporose de etiologias diversas. Em modelos experimentais de osteoporose induzida por hipoestrogenismo, ambos demonstraram reversão ou prevenção da doença; porém, o USPBI não foi eficaz no tratamento e prevenção de osteoporose por hipoestrogenismo ou trauma raquimedular nos estudos clínicos. Não há estudos clínicos com desenhos semelhantes para as ondas focais111,143,145-152. O mecanismo de ação das ondas acústicas foi pouco estudado no osso íntegro. No osso saudável estimulado por USPBI, identificou-se modulação da atividade e expressão da ERK-2, FAK e IRS-1; enquanto que no estimulado por ondas focais, identificou-se modulação de Akt, ERK-2 e TGF-β1. Não foram realizadas investigações com o emprego de ondas radiais, nem em ossos osteoporóticos111,122,150,153.

1.6.2. Osso fraturado Não há evidência clínica suficiente para indicar o uso das ondas acústicas para acelerar a osteogênese em fraturas, e osteotomias (alongamento ósseo e correção de distúrbio angular). Todos os estudos experimentais que avaliaram as terapias acústicas aceleraram a osteogênese ou melhoraram as características biomecânicas do osso neoformado. Por outro lado, não há estudos clínicos com o uso das ondas focais e radiais; e os estudos clínicos com USPBI, não atingem, nas metanálises, significado suficiente devido à heterogeneidade dos desenhos dos estudos108,140,154- 179. Quanto ao mecanismo de ação das ondas acústicas, há somente 4 estudos atestando o efeito modulador das ondas focais sobre a expressão de BMP-2, e 1 trabalho atestando a modulação da expressão de TGF-β1 por essas ondas. Não há relatos dos efeitos sobre nenhuma proteína investigada nesta tese para as ondas radiais e USPBI no tecido ósseo fraturado154,166,177,179,180. Nos casos complicados com distúrbios da osteogênese (retardo de união e não união [atrófica ou hipertrófica]), o emprego das terapias acústicas é mais consistente. 37

A taxa de cura varia de 69% a 90.9%, conforme tipo de não união (atrófica ou hipertrófica), início de tratamento, osso avaliado, etc. Apesar da variação relativamente grande, sempre que comparado ao tratamento cirúrgico, reconhecido como padrão-ouro, os resultados são semelhantes. Somando-se a isso, cumpre informar que o único trabalho disponível para as ondas radiais, embora apresente resultados positivos, trata-se de estudo prospectivo não controlado (série de casos) classificado, portanto, como nível 4 de evidência109,139,141,181-192. O mecanismo de ação das terapias acústicas nos ossos fraturados que apresentaram distúrbio de osteogênese recebeu ainda menos atenção. Para as ondas focais, 2 estudos demonstraram modulação da expressão de BMP-2 e TGF- β1; enquanto que para o USPBI, há somente 1 estudo demonstrando a modulação da expressão de TGF-β1. Não há investigações relacionadas aos efeitos moleculares das ondas radiais em ossos apresentando distúrbios da osteogênese, nem estudos para esclarecer a influência das terapias acústicas nas demais proteínas mecanossensíveis descritas nesta tese109,188.

JUSTIFICATIVA As terapias acústicas (USPBI, ondas focais e ondas radiais) incitam a atividade osteogênica de células ósseas por meio da modulação da expressão e atividade da Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1. Estas proteínas orquestram o processo de reparo da fratura. Porém, há evidências frágeis para suportar o uso das terapias acústicas para acelerar a osteogênese no processo de consolidação da fratura não complicada. Além disso, poucos estudos compararam os efeitos das diferentes modalidades de terapias acústicas nas mesmas condições experimentais; e não há nenhum trabalho comparando, ao mesmo tempo, USPBI, ondas focais e ondas radiais.

OBJETIVOS Com base nas alegações acima, os objetivos desta tese foram: • Determinar se USPBI, ondas focais e ondas radiais modulam a atividade e a expressão de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1 no reparo de uma lesão experimental em tíbias de ratos; • Estabelecer se a modulação exercida por USPBI, ondas focais e ondas radiais difere entre as ondas; • Definir o padrão de expressão e atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF- β1 em tíbias com lesão experimental e tratadas com USPBI, ondas focais ou ondas radiais.

HIPÓTESES

H0: hipótese nula, em que nenhuma das terapias acústicas modula ao menos 1 das proteínas estudadas;

H1: primeira hipótese alternativa, em que o USPBI modula ao menos 1 das proteínas estudadas;

H2: segunda hipótese alternativa, em que as ondas focais modulam ao menos 1 das proteínas estudadas;

H3: terceira hipótese alternativa, em que as ondas radiais modulam ao menos 1 das proteínas estudadas;

H4: quarta hipótese alternativa, em que existe diferença no perfil de modulação entre as diferentes modalidades de terapias acústicas.

METODOLOGIA 1. Animais Sessenta e cinco ratos (Rattus novergicus) machos da linhagem HanUnib: WH com 12 semanas de idade (no início do experimento), pesando 460.22 ± 56.23g foram fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica da UNICAMP. Os animais foram mantidos livres em gaiolas apropriadas no biotério de experimentação animal do Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental da UNICAMP, agrupados em 5 animais por gaiola, em estante ventilada, com temperatura controlada a 25oC, sem perturbações sonoras, com ciclos de 12 horas de luz artificial e 12 horas no escuro, ração padrão e água potável ad libitum. Os procedimentos experimentais, sob protocolos n° 873-1 e 2497-1, foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP, e de acordo com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo US National Institutes of Health (National Institutes of Health, publicação no 85-23 revisado em 1996).

2. Delineamento experimental Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 13 grupos de 5 animais cada. No primeiro agrupamento (figura 7), 30 animais com 12 semanas de vida foram submetidos à cirurgia de lesão experimental das tíbias bilateralmente. Ao término do procedimento cirúrgico, os grupos R1, R3 e R6 (n=5) foram tratados com uma sessão de ondas radiais para cada pata posterior; e seus controles, C1, C3 e C6 (n=5), foram submetidos a um tratamento falso para cada uma das patas posteriores. Com uma, três e seis semanas, realizou-se coleta de material (remoção de ambas as tíbias e fíbulas) dos animais dos grupos R1 e C1, R3 e C3, e R6 e C6, respectivamente. No segundo agrupamento (figura 8), 30 animais com 12 semanas de vida foram submetidos à cirurgia de lesão experimental das tíbias bilateralmente. Ao término do procedimento cirúrgico, os grupos F1, F3 e F6 (n=5) foram tratados com uma sessão de tratamento com ondas focais para cada pata posterior; e seus controles C1, C3 e C6 (n=5), foram os mesmos controles utilizados no primeiro agrupamento. Com uma, três e seis semanas, realizou-se coleta de material (remoção de ambas as tíbias e fíbulas) dos animais dos grupos F1 e C1, F3 e C3, e F6 e C6, respectivamente. No terceiro agrupamento (figura 9), 20 animais com 12 semanas de vida foram submetidos à cirurgia de lesão experimental das tíbias bilateralmente. Vinte e quatro horas após o procedimento cirúrgico, 10 animais foram submetidos ao tratamento diário com USPBI (grupos U1 e U3, n=5) em ambas as patas posteriores; e 10 animais, ao tratamento diário falso (grupos P1 e P3, n=5) com o mesmo equipamento de USPBI, em ambas as patas posteriores. Após uma e três semanas, realizou-se coleta de material (remoção de ambas as tíbias e fíbulas) dos animais dos grupos U1 e P1, e U3 e P3, respectivamente. Não foi realizado seguimento de 6 semanas por problemas técnicos com os equipamentos que não puderam ser resolvidos devido à 40

mudança do fabricante. O novo fabricante do produto (Bioventus) não apresenta representação nacional, e as tentativas de contato foram infrutíferas.

Figura 7. Distribuição dos animais, por grupos, submetidos às ondas radiais e sequência dos procedimentos.

Figura 8. Distribuição dos animais, por grupos, submetidos às ondas focais e sequência dos procedimentos.

Figura 9. Distribuição dos animais, por grupos, submetidos ao USPBI e sequência dos procedimentos.

3. Procedimento cirúrgico Os animais foram alocados nas dependências do laboratório, mantendo-se as mesmas condições de temperatura ambiente e aguardadas 2 horas para o início dos procedimentos. Em seguida, foram submetidos à punção venosa caudal para anestesia com Quetamina (40-100mg/kg) e Xylazina (10mg/kg). Anestesiados, os animais foram submetidos à tricotomia e assepsia bilateral dos membros posteriores, e posicionados em mesa cirúrgica em decúbito dorsal horizontal. Sequencialmente, realizou-se, em ambas as patas posteriores, incisão longitudinal mediana no nível da tuberosidade anterior da tíbia, dissecção por planos até expor a face medial da metáfise proximal da tíbia logo acima da inserção dos tendões isquiotibiais mediais (figura 10A-B). Com broca de 3.2 mm e guia limitador para 1.2 mm de profundidade, realizou- se perfuração na face medial da metáfise proximal da tíbia, obtendo-se uma lesão monocortical com 3.2 mm de diâmetro e 1.2mm de profundidade. A ferida operatória foi lavada com soro fisiológico e a pele foi suturada com fio nylon 3.0 (figura 10C-D). Este procedimento foi realizado nas duas tíbias de todos os animais, uma por vez. Todos os procedimentos cirúrgicos e laboratoriais foram realizados pelo mesmo pesquisador (autor desta tese).

A B

C D Figura 10. (A) Animal anestesiado e posicionado para ato cirúrgico. (B) Local da incisão. (C) Posicionamento para perfuração óssea. (D) Aspecto final do furo na tíbia.

4. Tratamento por ondas radiais Ao término do procedimento cirúrgico, mantidos sob efeito anestésico, 15 animais foram submetidos a uma única sessão de tratamento com ondas radiais e 15 animais foram submetidos a uma única sessão de tratamento falso. Com gel condutor de ultrassom, o transdutor do aparelho, previamente submetido à assepsia com álcool 70%, foi posicionado adjacente à ferida operatória, mas não sobre a mesma para evitar deiscência da sutura. Estimulou-se uma pata posterior por vez. O tratamento por ondas radiais foi realizado com equipamento MP 100® (Storz Medical, Suíca), e consistiu em 500 pulsos fornecidos a 10 Hz (frequência de pulso) e 2.0 bar. Utilizou-se aplicador DI (Deep Impact, produzido em titânio) com diâmetro de 15mm. Esses parâmetros equivalem à densidade de fluxo de energia de 0.4mJ/mm2 (valor correspondente ao total de energia, não somente ao componente ultrassônico, conforme comunicação direta com fabricante). O mesmo aparelho foi utilizado para todos os animais. O tratamento falso foi realizado com o mesmo equipamento e aplicador emissor de ondas radiais, operado sem gel condutor, a 10 Hz, 1.0 bar e anteparo de gaze com 50mm de espessura para anular a transmissão da onda até o tecido do animal. 43

Ao término dos procedimentos, os animais foram realocados em caixas novas, sob aquecimento até recuperação anestésica, e paracetamol 1mg/ml por 24 horas (na água de consumo). Os animais eram observados diariamente para identificação de evento adverso até a data pré-estabelecida para retirada bilateral das tíbias e fíbulas.

5. Tratamento por ondas focais Ao término do procedimento cirúrgico, mantidos sob efeito anestésico, 15 animais foram submetidos a uma única sessão de tratamento com ondas focais e 15 animais foram submetidos a uma única sessão de tratamento falso. Com gel condutor de ultrassom, o transdutor do aparelho, previamente submetido à assepsia com álcool 70%, foi posicionado adjacente à ferida operatória, mas não sobre a mesma para evitar deiscência da sutura. Estimulou-se uma pata posterior por vez (figura 11).

Figura 11. Posicionamento da probe do equipamento de ondas focais.

O tratamento por ondas focais foi realizado com equipamento Evotron (Switech Medical AG, Suíca), e consistiu em 500 pulsos fornecidos a 4 Hz (frequência de pulso) e 0.12mJ/mm2, utilizando-se probe cujo foco se situa a 5mm de profundidade (figura 11). O mesmo aparelho foi utilizado em todos os animais. O tratamento falso foi realizado com o mesmo equipamento e aplicador emissor de ondas radiais, operado sem gel condutor, a 10 Hz, 1.0 bar e anteparo de gaze com 50mm de espessura para anular a transmissão da onda até o tecido do animal. Ao término dos procedimentos, os animais foram realocados em caixas novas, sob aquecimento até recuperação anestésica, e paracetamol 1mg/ml por 24 horas (na água de consumo). Os animais eram observados diariamente para identificação de evento adverso até a data pré-estabelecida para retirada bilateral das tíbias e fíbulas. 44

6. Tratamento por USPBI Vinte e quatro horas após a cirurgia, 10 animais foram submetidos a tratamento diário com USPBI, e 10 animais foram submetidos a tratamento diário falso com o mesmo equipamento. Durante as sessões de estímulo, sem necessidade de sedação, os animais foram mantidos em tubo de PVC fechado na extremidade cranial, permitindo a exposição das patas posteriores (figura 12A). Com gel condutor de ultrassom, o transdutor do aparelho, previamente submetido à assepsia com álcool 70%, foi posicionado sobre a face anterolateral das patas posteriores dos animais, que foram estimuladas simultaneamente, utilizando-se um equipamento para cada pata (figura 12A-B). O tratamento por ondas USPBI foi realizado com equipamento Exogen 2000+® (Smith & Nephew Inc, Estados Unidos da América), e consistiu em sessões diárias de 20 minutos, gerando ondas pulsáteis de 1.5MHz, ciclo de trabalho de 20%, frequência de pulso de 1KHz e intensidade de 30mW/cm2. Os mesmos aparelhos foram utilizados para todos os animais. O tratamento falso foi realizado da mesma maneira, com gel de ultrassom, mas o equipamento permaneceu desligado durante os 20 minutos. As sessões de estímulo foram realizadas diariamente pelo período estipulado, e a última sessão ocorreu 15 horas antes da coleta do material para análise proteica.

7. Coleta do material para análise proteica Para a retirada dos ossos, os animais foram submetidos aos mesmos procedimentos anestésicos previamente descritos. Em seguida, realizou-se incisão anterior longitudinal ampla sobre a tíbia e a fíbula, que foram retiradas, bilateralmente, sem a cartilagem articular. Ao término, os animais foram submetidos a eutanásia por overdose de anestésico. Após remoção, as tíbias e fíbulas foram embebidas em meio contendo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM); na sequência, lavadas com PBS 1X (preparado com água destilada ultrapura); colocadas em eppendorfs® e, imediatamente, expostas a nitrogênio líquido por 2 minutos; e, finalmente, estocadas em refrigerador (biofreezer) a -80o C até o momento de seu processamento.

Figura 12. (A) Animal mantido no tubo de PVC durante as sessões de estímulo. (B) Posicionamento do transdutor na pata posterior do animal.

8. Preparo das amostras As amostras foram retiradas do biofreezer e, imediatamente, acondicionadas dentro de sacolas de plástico individuais (figura 13A) para serem maceradas com martelo de 5kg para fragmentação inicial (figura 13B-D); e, depois, com martelo padrão, de ~2kg (figura 13E-F). Os fragmentos resultantes foram imersos em nitrogênio líquido contido dentro de um cadinho, onde a maceração foi finalizada com auxílio de soquete (figura 13G). Na sequência, o macerado, sob a forma de pó, foi transferido para um tubo de ensaio contendo tampão de lise RIPA (150 mM NaCl, 1.0% IGEPAL® CA-630, 0.5% desoxicolato de sódio, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0; R0278 – Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA), mantido sob banho de gelo, e homogeneizado (Homogeneizador Turratec® TE-102, Tecnal Equipamentos para Laboratório LTDA, Piracicaba, Brasil) por 5 segundos, duas vezes, com intervalo de 30 segundos (figura 13H). Subsequentemente, adicionou-se Triton X-100 10%; quarenta minutos depois, o material insolúvel foi removido por centrifugação a 11000 46

rpm por 30 minutos a 4° C; e, por fim, o sobrenadante foi transferido para tubos eppendorf®. Parte da amostra sobrenadante foi utilizada para determinação da concentração de proteínas por método fluorométrico quantitativo conforme instruções do fabricante (Thermo Scientific™ Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Pierce Biotechnology, Rockford, EUA), e a parte restante foi utilizada para o immunoblotting (descrito a seguir).

9. Reagentes e Equipamentos Reagentes e equipamentos para eletroforese foram obtidos da Bio-Rad Laboratories Inc (Richmond, CAN): 10% Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (15-well, 15 µl, #4561036); Tris; Glicina; SDS; 10% Tween 20; 2x Laemmli Sample Buffer (#1610737); Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards (#1610375); Trans-Blot® Turbo™ Transfer System; e Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (#1704158). Anticorpos primários foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc (Dallas, EUA): actina (100 µg/ml, IgG policlonal de cabra, SC-1616), Akt-1/2 (200 µg/ml, IgG policlonal de cabra, SC-1619), BMP-2 (100 µg/ml, IgG policlonal de cabra, SC-6895), ERK-2 (200 µg/ml, IgG policlonal de cabra, SC-154-G), FAK (200 µg/ml, IgG policlonal de coelho, SC-557), p-Akt-1/2/3 Ser 473 (100 µg/ml, IgG policlonal de coelho, SC- 33437), p-ERK-1/2 Thr 202/Tyr 204 (200 µg/ml, IgG policlonal de cabra, sc-16982), p- FAK Tyr 397 (200 µg/ml, IgG policlonal de coelho, sc-11765-R), TGF-β1 (200 µg/ml, IgG policlonal de cabra, SC-146-G). Anticorpos secundários foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc (Dallas, EUA): IgG policlonal de burro anti-cabra conjugado a HRP (200 µg/0.5 ml, SC-2020), IgG de cabra anti-coelho conjugado a HRP (200 µg/0.5 ml, SC-2004). Reagentes para detecção de quimiluminescência foram obtidos da Bio-Rad Laboratories Inc (Richmond, CAN): Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (#1705061).

Figura 13. Sequência de maceração das amostras. (A) Os ossos foram introduzidos em sacolas de plástico individuais e (B e C) macerados com martelo de ~5kg. (D) Aspecto final após 1ª maceração. (E) Utilizou-se, na sequência, martelo de ~2kg para segunda maceração, obtendo-se (F) fragmentos ósseos menores, que (G) foram finalmente macerados, com soquete dentro de cadinho contendo nitrogênio líquido. O pó resultante foi (H) introduzido em tubo de ensaio com tampão de lise RIPA, e homogeneizado na sequência.

10. Immunoblotting de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1 Alíquotas com 50 µg de proteína de cada grupo foram posicionadas em SDS- PAGE para corrida eletroforética, com tampão para eletroforese (Tris 25 mM; glicina 192 mM; SDS 0,1%); depois, transferidas para membranas de nitrocelulose; bloqueadas com BSA 5% em solução basal (Tris 25mM, NaCl 125 mM, HCl 29mM, Tween 20 0,05%) sob temperatura ambiente por 2 horas, seguido de 3 lavagens com 48

solução basal por 10 minutos cada, e depois incubadas overnight a 4° C – sob agitação contínua – com anticorpos específicos para Akt-1/2 (1:300), Akt-Ser(P)-473 (1:150), BMP-2 (1:350), ERK-2 (1:500), ERK-1/2-Thr/Tyr(P)-202/204 (1:150), FAK (1:100), FAK-Tyr(P)-397 (1:200) e TGF-β1 (1:350). Após incubação, as membranas foram lavadas 3 vezes com solução basal por 10 minutos cada, e incubadas com seus respectivos anticorpos secundários (1:4000) por 2 horas em temperatura ambiente. Sequencialmente, foram lavadas 3 vezes com solução basal por 10 minutos cada, e expostas aos reagentes para detecção por reação de quimiluminescência para identificar as bandas imunorreativas. Estas foram visualizadas com o equipamento ImageQuant™ LAS 500 (GE Healthcare UK Limited, Amersham Place, UK). A quantificação de pixels, em escala de cinza, foi realizada pelo programa UN-SCAN-IT gel™ (Silk Scientific Corporation, Orem, EUA). Para efeito de normalização, as mesmas membranas foram submetidas a stripping com solução branda (glicina 200mM, SDS 0.1%, Tween 20 1%, ajustado para pH 2.2) em 2 exposições, sob agitação contínua, por 10 minutos cada; seguida de 2 sessões de lavagem com PBS por 10 minutos cada, e 2 sessões de lavagem com TBST (Tris 20mM, NaCl 151mM, ajustado para pH 7.6) por 5 minutos cada. Subsequentemente, as membranas foram novamente bloqueadas com solução contendo BSA 5%, e todo processo descrito previamente foi repetido, utilizando-se anticorpo primário para actina (1:500).

11. Análise estatística Trata-se de um estudo de intervenção aberto, com dois braços paralelos e grupo controle (placebo). Para expressar a intensidade das bandas correspondentes à expressão, ou atividade, de cada uma das proteínas avaliadas, utilizou-se a média (mp) de 3 medidas consecutivas (obtidas pelo software UN-SCAN-IT gel™) que foi normalizada pela média (ma) – de 3 medidas consecutivas – da intensidade das bandas de actina (da amostra correspondente). A normalização implica na padronização dos resultados tendo como referência uma proteína constitutiva (do inglês, housekeeping protein), no caso a actina. A normalização foi realizada pela fórmula:

= , em que M é o resultado da medida para uma determinada amostra 𝑚𝑚𝑝𝑝 normalizada𝑀𝑀 𝑚𝑚𝑎𝑎 (i.e., tendo como referência) para actina.

A normalidade da distribuição das variáveis foi determinada pelos testes de Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov, e a homogeneidade de variância das amostras foi determinada pelo teste de Levene. Por se tratarem de variáveis quantitativas, independentes, sem distribuição normal – ou sem homogeneidade de variância –, optou-se pela utilização do teste não paramétrico de Mann-Whitney.

Para testar as hipóteses H1, H2 e H3, foram comparados os grupos: • R1, R3 e R6, com C1, C3 e C6, respectivamente; • F1, F3 e F6, com C1, C3 e C6, respectivamente; • U1 e U3, com P1 e P3, respectivamente.

Para testar a hipótese H4, comparou-se a razão Trat/Contr (o quanto cada terapia acústica modificou a expressão, ou atividade, das proteínas Akt, BMP-2, ERK- 2, FAK e TGF-β1 em relação ao respectivo controle) entre os grupos, dada divisão entre o resultado obtido no grupo tratado e o obtido no respectivo controle: • R1/C1 com F1/C1; • R1/C1 com U1/P1; • R1/C1 com R3/C3; • R1/C1 com R6/C6; • F1/C1 com U1/P1; • F1/C1 com F3/C3; • F1/C1 com F6/C6; • R3/C3 com F3/C3; • R3/C3 com U3/P3; • R3/C3 com R6/C6; • F3/C3 com U3/P3; • F3/C3 com F6/C6; • R6/C6 com F6/C6; • U1/P1 com U3/P3.

Os testes estatísticos foram realizados com auxílio do programa IBM SPSS Statistics 25 (International Business Machines Corp, Nova Iorque, EUA), considerando-se α = 0.05.

RESULTADOS

1. Tratados em relação ao respectivo controle Os resultados sem relevância para a discussão da tese encontram-se no Apêndice e não serão descritos na seção de Resultados.

1.1. Ondas focais A expressão e a atividade de Akt foram identificadas em todos os grupos (figuras 14 e 15). A expressão de Akt em F6 foi 54% (p = 0.142) a expressão de seu controle (figura 16). A atividade de Akt em F1 foi 2.63 (p = 0.034) e 2.11 (p = 0.043) vezes maior que R1 e C1, respectivamente; e em F3 foi 2.55 (p = 0.149) e 2.34 (p = 0.386) vezes maior que C3 e R3, respectivamente (figura 17).

Figura 14. Bandas representativas da expressão de Akt identificada por immunoblotting (IB) e a correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Figura 15. Bandas representativas da atividade de Akt (pAkt) identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

AKT 0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 Expressão de Akt (relativa à actina) (relativa Akt de Expressão 0

GRUPO Figura 16. Expressão de Akt normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão de Akt dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

pAKT 0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 Atividade de Akt (relativo à actina) (relativo Akt de Atividade 0

GRUPO Figura 17. Atividade de Akt (pAKT) normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar pAkt dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Foram identificadas as expressões das formas madura e precursora de BMP-2 (figura 18). A expressão da forma precursora de BMP-2 não foi diferente em nenhum dos grupos tratados em relação aos respectivos controles (figura 19).

Figura 18. Bandas representativas da expressão das formas precursora e madura de BMP-2 identificadas por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Forma precursora de BMP-2 0,7

0,6

0,5

0,4 2 (relativa à actina) 2 (relativa - 0,3

0,2

0,1

Expressão BMP de Expressão 0

GRUPO Figura 19. Expressão da forma precursora de BMP-2 normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão da forma precursora de BMP-2 dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

A expressão e a atividade de ERK-2 foram identificadas em todos os grupos (figuras 20 e 21). A diferença da atividade de ERK-2 dos grupos tratados em relação aos respectivos controles não atingiu relevância estatística (figura 22).

Figura 20. Bandas representativas da expressão de ERK-2 identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Figura 21. Bandas representativas da atividade de ERK (pERK) identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

pERK 4

3,5

2,5

1,5

0,5 Atividade de ERK (relativo à actina) (relativo ERK de Atividade 0

GRUPO Figura 22. Atividade de ERK (pERK), normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar pERK dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

A expressão e atividade de FAK foram identificadas em todos os grupos (figuras 23 e 24). Não houve diferença significativa na expressão de FAK dos grupos tratados comparados aos respectivos controles (figura 25). A atividade de FAK (pFAK) do grupo F3 foi 2.16 (p = 0.047) vezes maior que seu respectivo controle; e F6 correspondeu a 43.2% a atividade de seu controle (p = 0.347), e a 40.8% de R6 (p = 0.047) (figura 26).

Figura 23. Bandas representativas da expressão de FAK identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Figura 24. Bandas representativas da atividade de FAK (pFAK) identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 59

representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

FAK 1,8

1,6

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2 Expressão de FAK (relativo à actina) (relativo FAK de Expressão 0

GRUPO Figura 25. Expressão de FAK, normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão de FAK dos grupos tratados com os respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

pFAK 0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 Atividade de FAK (relativo à actina) (relativo FAK de Atividade 0

GRUPO Figura 26. Atividade de FAK (pFAK), normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a atividade de FAK dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Não foi identificada a forma madura de TGF-β1; somente identificou-se a forma precursora (figura 27). A expressão da forma precursora de TGF-β1 do grupo F1 foi 9.11 (p = 0.016), e 6.4 (p = 0.047) vezes maior que o controle C1 e o tratado R1, respectivamente; F3 foi 3.75 (p = 0.076) e 2.69 (p = 0.117) vezes maior que C3 e R3, respectivamente; F6 foi 1.6 (p = 0.221) e 1.85 (p = 0.175) vezes maior que C6 e R6 (figura 28).

Figura 27. Bandas representativas da expressão da forma precursora de TGF- β1 identificada por immunoblotting (IB) e sua correspondente expressão de actina. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle para os grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Forma precursora de TGF-β1 2

1,8

1,6

1,4

1,2

1 (relativo à actina) (relativo 1 1 β - 0,8

0,6

0,4

0,2

Expressão TGF de Expressão 0

GRUPO

Figura 28. Expressão da forma precursora de TGF-β1, normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão de TGF-β1 dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

1.2. Ondas radiais A expressão de Akt em R1 e R6 foi 65% (p = 0.347) e 52% (p = 0.05) do resultado obtido para a expressão de seus controles, respectivamente (figura 16). A expressão de ERK-2 no grupo R1 foi 2.4 vezes maior que seu controle (p = 0.347); R3 foi 3.02 (p = 0.076) e 2.97 (p = 0.076) vezes maior que seu controle e F3, respectivamente (figura 29).

ERK-2 6

3 2 (relativo à actina) 2 (relativo -

0 Expressão ERK de Expressão

GRUPO

Figura 29. Expressão de ERK-2, normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão de ERK dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

A atividade de FAK (pFAK) do grupo R3 foi 2.6 (p = 0.028) vezes maior que seu respectivo controle (figura 26).

1.3. USPBI A expressão da forma madura de BMP-2 em U3 foi 1.91 vezes maior que P3 (p = 0.117) (figura 30). A expressão da forma precursora de TGF-β1 do grupo U1 foi 67.9% a expressão do seu controle (p = 0.347); e U3 foi 1.67 (p = 0.117) vezes maior que o respectivo controle (figura 28).

Forma madura de BMP-2 1,8

1,6

1,4

1,2

2 (relativo à actina) 2 (relativo 0,8 -

0,6

0,4

0,2

0 Expressão BMP de Expressão GRUPO

Figura 30. Expressão da forma madura de BMP-2 normalizada por actina (valores relativos à expressão de actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para comparar a expressão da forma madura de BMP-2 dos grupos tratados com seus controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. C1, C3 e C6 representam os grupos falsamente tratados com ondas radiais (mesmo controle dos grupos F1, F3 e F6, respectivamente) e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. P1 e P3 representam os grupos falsamente tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico. 65

2. Razão Trat/Contr para o mesmo equipamento ou para o mesmo tempo de seguimento Para a expressão de Akt, observou-se que U1/P1 foi 2.13 (p = 0.047), 1.28 (p = 0.465) e 1.76 (p = 0.117) vezes maior que F1/C1, U3/P3 e R1/C1, respectivamente; R6/C6 foi 67.8% a razão R1/C1 (p = 0.327); e F6/C6 foi 78.97% (p = 0.462) e 42.8% (p = 0.327) as razões F1/C1 e F3/C3, respectivamente (figura 31).

AKT 7

Expressão de Akt (relativo ao controle) (relativo Akt de Expressão 0

GRUPO Figura 31. Expressão de Akt, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann- Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença, entre os grupos tratados, na alteração da expressão da proteína em relação aos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Quanto à atividade de Akt, F1/C1 foi 2.84 (p = 0.157) e 2.65 (p = 0.083) vezes maior que R1/C1 e U1/P1, respectivamente; F3/C3 foi 2.66 (p = 0.355), 1.94 (p = 0.149), 1.66 (p = 0.248) vezes maior que F6/C6, R3/C3 e U3/P3, respectivamente; e U3/P3 foi 1.79 (p = 0.149) vezes maior que U1/P1 (figura 32).

pAKT 6

1 Atividade de Akt (relativo ao ao controle) de Akt (relativo Atividade 0

GRUPO Figura 32. Atividade de Akt (pAKT), normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann- Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões dos grupos tratados pelos seus respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Para a expressão da forma precursora de BMP-2, observou-se que F1/C1 foi 4.64 (p = 0.05), 2.18 (p = 0.251), 2.65 (p = 0.175) vezes maior que F6/C6, R1/C1 e U1/P1, respectivamente; F6/C6 foi 19.5% (p = 0.327) e 10.8% (p = 0.386) F3/C3 e R6/C6, respectivamente; e U3/P3 foi 1.87 (p = 0.047), 1.72 (p = 0.117) e 1.56 (p = 0.117) vezes maior que U1/P1, R3/C3 e F3/C3, respectivamente (figura 33).

Forma precursora de BMP-2 20

10 2 (relativa ao controle) 2 (relativa - 8

Expressão BMP de Expressão 0

GRUPO Figura 33. Expressão da forma precursora de BMP-2, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença na alteração da expressão do fator de crescimento entre os grupos tratados em relação aos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Com relação à expressão da forma madura de BMP-2, observou-se que F1/C1 foi 2.04 vezes maior que F3/C3 (p = 0.047); e U3/P3 foi 1.78 (p = 0.175), 1.77 (p = 0.347) e 1.72 (p = 0.251) vezes maior que U1/P1, R3/C3 e F3/C3, respectivamente (figura 34).

Forma madura de BMP-2 8

4 2 (relativo ao controle) 2 (relativo - 3

0 Expressão BMP de Expressão

GRUPO Figura 34. Expressão da forma madura de BMP-2, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões dos grupos tratados pelos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

No tocante às razões Trat/Contr para a expressão de ERK-2, R3/C3 foi 3.23 (p = 0.05), 2.49 (p = 0.117) e 3 (p = 0.175) vezes maior que R6/C6, F3/C3 e U3/P3, respectivamente (figura 35).

ERK-2 16

8 2 (relativo ao controle) 2 (relativo - 6

0 Expressão ERK de Expressão

GRUPO Figura 35. Expressão de ERK-2, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann- Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões dos grupos tratados pelos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Na comparação das razões Trat/Contr para pERK, F3/C3 foi 1.46 (p = 0.465), 3.31 (p = 0.221), 1.66 (p = 0.221), 1.95 (p = 0.117) vezes maior que F1/C1, F6/C6, R3/C3, U3/P3, respectivamente (figura 36).

pERK 4

3,5

2,5

1,5

0,5

0 Atividade de ERK (relativa ao ao controle) de ERK (relativa Atividade

GRUPO Figura 36. Atividade de ERK (pERK), normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões de pERK dos grupos tratados pelos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Para a expressão de FAK, observou-se que F1/C1 foi 1.71 (p = 0.127) e 1.72 (p = 0.127) vezes maior que R1/C1 e U1/P1, respectivamente; R3/C3 foi 1.37 (p = 0.275 e 0.05, respectivamente) vezes maior que R1/C1 e U3/P3; e R6/C6 foi 1.39 (p = 0.248) vezes maior que R1/C1 (figura 37).

FAK 2,5

1,5

0,5

Expressão de FAK (relativo ao controle) (relativo Expressão de FAK 0

GRUPO Figura 37. Expressão de FAK, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann- Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões da expressão de FAK dos grupos tratados pelos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Quanto a pFAK, identificou-se que R3/C3 foi 2.85 (p = 0.076), 1.54 (p = 0.251) e 3.41 (p = 0.028) vezes maior que R1/C1, R6/C6 e U3/P3, respectivamente (figura 38).

pFAK 18

0 Atividade de FAK (relativo ao controle) ao (relativo FAK de Atividade GRUPO

Figura 38. Atividade da FAK (pFAK), normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença entre as razões de pFAK dos grupos tratados pelos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

Comparando as razões Trat/Contr da forma precursora de TGF-β1, identificou- se que F1/C1 foi 2.42 (p = 0.047), 4.81 (p = 0.05), 6.1 (p = 0.016) e 5.15 (p = 0.016) vezes maior que F3/C3, F6/C6, R1/C1 e U1/P1, respectivamente; e U3/P3 foi 1.2 vezes maior que U1/P1 (p = 0.117) (figura 39).

Forma precursora de TGF-β1 16

8 1 (relativo ao controle) (relativo 1 β - 6

0 Expressão TGF de Expressão

GRUPO Figura 39. Expressão da forma precursora de TGF-β1, normalizada por actina (valores relativos ao controle normalizado por actina), apresentada em box plot. Realizado teste de Mann-Whitney considerando p<0.05 para determinar a diferença das razões da expressão do fator de crescimento dos grupos tratados pelos respectivos controles. F1, F3 e F6 representam os grupos tratados com ondas focais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. R1, R3 e R6 representam os grupos tratados com ondas radiais e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente, 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico. U1 e U3 representam os grupos tratados com USPBI e cujo material proteico foi analisado após, respectivamente 1 e 3 semanas do procedimento cirúrgico.

3. Complicações Ocorreram 9 óbitos durante o procedimento anestésico para realização do defeito ósseo monocortical, e os animais foram substituídos imediatamente. Não houve complicações pós-operatórias em nenhum dos animais. 74

DISCUSSÃO

1. Modelo de estudo de fratura Para investigar os efeitos biológicos do USPBI, ondas focais e ondas radiais na osteogênese, adotou-se um modelo animal in vivo de perfuração óssea monocortical na metáfise proximal de ambas as tíbias de ratos HanUnib:WH. Desde o início do milênio, o modelo de perfuração óssea tem sido utilizado, com êxito, para simular o reparo ósseo de fraturas. O referido modelo apresenta algumas vantagens que merecem destaque193-197: • Menor dor pós-operatória para o animal; • Permite descarga de peso imediata no membro fraturado. Com isso, evita- se prejuízos nutricionais, pela dificuldade para o animal alimentar-se, com consequente perda de massa muscular; e mantém-se estímulo mecânico fisiológico, proveniente da marcha do animal, para o tecido ósseo em reparo; • Elimina a necessidade de utilizar implantes para estabilizar a fratura, pois a lesão experimental produzida não modifica a anatomia, nem induz instabilidade mecânica. Consequentemente, anula-se a chance de eventos adversos relacionados ao implante (infecção, soltura do implante, exteriorização do implante, etc), bem como a necessidade de retirada do material de síntese para a análise proteica; • Produz sempre o mesmo padrão de fratura, proporcionando resultados mais homogêneos; • Tempo cirúrgico reduzido e procedimento minimamente invasivo; • Curva de aprendizado mais curta e menor custo com materiais.

Além disso, o modelo utilizado neste estudo está amplamente consolidado para a análises histomorfométricas, radiológicas, biomecânicas e moleculares142,193-199. Em contrapartida, podem-se elencar limitações para o modelo de perfuração monocortical: • Há predomínio da ossificação intramembranosa sobre a endocondral. Portanto, o modelo não é recomendado para estudos cujo objetivo é investigar eventos específicos da ossificação endocondral; • Não pode ser utilizado para investigações envolvendo implantes, pois elimina o estresse mecânico que o implante absorveria (devido à instabilidade da fratura), e que, progressivamente, é devolvido ao tecido ósseo à medida que a fratura consolida;

• Devido à estabilidade e redução anatômica intrínsecas, não permite a investigação de distúrbios da osteogênese, como retardo de união e não união.

2. Protocolo de estímulo com ondas acústicas

2.1. USPBI Utilizou-se protocolo de estímulos diferente do inicialmente proposto por seu autor, Duarte LR, que consistia em estímulos diários de 15 minutos. Embora, à semelhança do trabalho pioneiro, o tratamento tenha sido iniciado 24h após a cirurgia, optou-se pela duração 20 minutos por sessão, pois é o tempo padronizado na maioria dos estudos experimentais e clínicos, o trabalho prévio realizado pelo autor desta tese expôs os animais por 20 minutos diários, e o temporizador do equipamento oferece 20 minutos como tempo padrão. A partir desse parágrafo, o termo estudo experimental será utilizado como referência exclusiva a estudos realizados com animais7,75,108,127,153,170,175,190,192. Em virtude do instinto do animal em buscar “buracos” e locais escuros para autoproteção contra predadores, percebeu-se que os ratos permanecem dentro de tubos – como o demonstrado na figura 12 – calmos durante os 20 minutos necessários para estímulo. Por conta disso, não foi necessário sedar os animais, ao contrário de estudos diversos. Além disso, a maioria dos estudos experimentais (com animais) interrompe o tratamento aos finais de semana; provavelmente, por questões logísticas. Entretanto, preferiu-se estimular os animais de forma ininterrupta para reproduzir os tratamentos clínicos e os experimentais que optam pelo tratamento sem pausas55,153,157,161,165,170,175.

2.2. Ondas focais e radiais A literatura carece de orientações e protocolos acerca do emprego de ondas focais e radiais para patologias ortopédicas, tanto de partes moles (tendões, músculos, ligamentos), quanto para partes ósseas. Observa-se vasta diversidade dos parâmetros físicos utilizados para os tratamentos das diversas patologias da área, sem um consenso142-145,150,171,180,183,184,191,200-205. Os seguintes parâmetros requerem padronização: • Número de pulsos por ponto de aplicação; • Número de pontos de aplicação; • Intensidade da pressão, ou da densidade de fluxo de energia por pulso; • Frequência de pulso; • Intervalo entre sessões; • Quantidade de sessões.

Para o manejo de distúrbios da osteogênese, o tratamento por ondas de pressão radial não constitui, ainda, indicação formal. Por conta das poucas evidências de benefícios da referida modalidade de terapia acústica para o manejo de patologias ósseas, a SMBTOC e sua respectiva entidade internacional – The International Society for Medical Shockwave Treatment (ISMST) –, em seus consensos, não indicam formalmente o uso da terapia. Por outro lado, sabe-se do uso clínico informal da terapia por ondas radiais no manejo de distúrbios da união, obtendo-se resultados animadores com uma publicação em periódico, e algumas publicações em congressos144,206,207. Por conta disso, para estabelecer o protocolo de estímulo com ondas focais e radiais foram levados em consideração diferentes aspectos conforme será discutido nas seções que seguem.

2.2.1. Quantidade e momento dos estímulos A cronologia dos eventos biológicos desencadeados pelas perturbações mecânicas produzidas pelas ondas focais e radiais é desconhecida. Para controlar melhor a duração da ação biológica das terapias supramencionadas, optou-se por expor os animais a uma única sessão de estímulo. Em adição, não está determinado, na literatura, o melhor momento para se introduzir a terapia mecânica no tecido fraturado; i.e, se antes, logo após, ou mais de 24 horas após o procedimento cirúrgico. Planejou-se estimular os animais logo após a cirurgia por que: • Realiza-se somente um procedimento anestésico, evitando eventuais complicações anestésicas e necessidade de puncionar veia caudal repetidas vezes (nem sempre acessível após múltiplas punções); • Tanto ondas focais e ondas radiais, devido ao impacto direto sobre os tecidos, podem produzir lesão vascular, resultando em hemorragia e hematoma. A realização do estímulo mecânico previamente ao ato cirúrgico poderia dificultar a visualização do local da perfuração óssea por sangramento local, aumentar perda sanguínea do animal e interferir em sua recuperação pós-operatória142,171; • Os autores do presente estudo acreditam que, para obter a melhor resposta osteogênica, o 1º estímulo deve ser suficiente para incitar o máximo de atividade celular. Postulou-se que, em se tratando de sessão única de estímulos, o máximo de atividade celular não seria obtido pela perfuração óssea, ou pela terapia acústica, isoladamente. Além disso, estímulos submáximos fornecidos em tempos diferentes podem não produzir resposta máxima após o último estímulo. Como é desconhecido o potencial osteogênico da associação da fratura com a terapia mecânica, optou-se pelo maior estímulo que poderia ser oferecido pelas intervenções experimentais num mesmo procedimento.

2.2.2. Número de pulsos A quantidade de pulsos por sessão de ondas focais para estimular a osteogênese varia, nos trabalhos, de 250 a 10000 pulsos. Consoante a isso, estudos que avaliaram ondas radiais para induzir a osteogênese se mantiveram dentro da mesma faixa, variando de 2000 a 4000 pulsos. Apesar de não se obter nenhuma conclusão quanto à quantidade ideal de número de pulsos por sessão de estímulos, observou-se que a maioria dos autores optaram, empiricamente, por maior quantidade de pulsos conforme o tamanho do osso e porte do animal142-144,150,171,178-180,183-185,187,191,208-213. Embora empírico (nível de evidência 5), é consensual entre os membros da SMBTOC que o tratamento por ondas focais e radiais deve ser distribuído por pontos de aplicação dentro da região tratada. Recomenda-se que sejam aplicados 250-500 pulsos por ponto em cada região. Com base na experiência pessoal e publicações em modelos experimentais e in vitro, acredita-se que menos de 250 pulsos não promove efeito biológico suficiente; ao passo que mais de 500 pulsos aumenta a chance de lesão celular com menor capacidade de supercompensação pelo tecido. Somando-se a isso, a maioria dos estudos in vitro demonstra que 500 pulsos é a quantidade ideal para estimular osteogênese, e há estudos experimentais que demonstram efeito osteogênico das ondas focais administradas na dose de 500 pulsos em seção única, tanto para o reparo de defeito segmentar ósseo, quanto em ossos íntegros22,48,49,52,111,122,129,150,154,166,215,216. Por fim, os autores deste trabalho acreditam que os tratamentos são normalmente realizados com dose superior à necessária para induzir osteogênese. Como contrapartida, os resultados positivos podem ser mais demorados, pois necessitam antes suplantar os efeitos nocivos; e o paciente pode experimentar maior dor pós-operatória e há maior riscos de efeitos adversos. Pode-se citar, como exemplo, estudo realizado em defeito segmentar ósseo em coelhos, em que foram aplicados 6000 pulsos a 0.47mJ/mm2, resultando em óbito do animal 3 dias após o tratamento. Por outro lado, tem-se observado, na prática clínica do autor deste estudo – e comunicação direta com outros especialistas – o benefício de doses mais baixas das usualmente utilizadas no emprego das terapias acústicas (menos dor, menos complicações, resultados mais precoces)171. Pelos motivos acima expostos, e seguindo o mesmo protocolo de trabalho publicado pelo grupo de pesquisa do qual o autor participa, optou-se por expor os animais do estudo a um protocolo com 500 pulsos de ondas radiais e focais em sessão única122.

2.2.3. Densidade de fluxo de energia por pulso (ondas focais) Os aparelhos geradores de ondas focais podem emitir ondas com pulsos de 0.01mJ/mm2 até 1.80mJ/mm2, mas valores iguais de densidade de fluxo de energia para aparelhos diferentes não correspondem a perturbações mecânicas

78 semelhantes, provavelmente pelas características distintas do foco de cada aparelho. Igualmente, não se pode equiparar densidades de fluxo de energia iguais para ondas diferentes. Como exemplo de equipamentos com tecnologia distinta de geração de ondas focais, mas densidade de fluxo de energia por pulso iguais, pode-se citar o estudo comparativo entre os aparelhos eletro-hidraúlico e eletromagnético, fornecendo 500 pulsos com 0.4mJ/mm2 em cultura de osteoblastos. A viabilidade celular imediatamente após a exposição foi de 73% para o primeiro aparelho, e 32% para o segundo48. Não há exemplos de densidades de fluxo de energia iguais para ondas diferentes, mas cabe citar o estudo comparativo entre USPBI (30mW/cm2, 20 min/dia) e ondas focais (gerador eletromagnético, 1250 pulsos com 0.12mJ/mm2, sessão única) fornecidos a células periosteais. Cada pulso de USPBI dura 200μs 2 -5 2 e possui ISATA de 30mW/cm , o que equivale a 6x10 mJ/mm . Ainda assim, no 6º dia após exposição às ondas focais, e de tratamento diário com USPBI, houve maior proliferação das células expostas a este último; enquanto que no 18º dia, houve maior proliferação nas células expostas às ondas focais (não houve cessação do estímulo diário com USPBI). Aprofundando-se as comparações, cada sessão de 20 minutos de USPBI (frequência de pulso de 1kHz e 20% de ciclo de trabalho) fornece 2.4x108 pulsos, cada um com 6x10-5mJ/mm2, fornecendo, ao todo, 14400mJ/mm2. Considerando 6 e 18 dias de tratamento, a cultura de células periosteais recebeu, ao todo 86400mJ/mm2 e 259200mJ/mm2, respectivamente; ao passo que a cultura exposta às ondas focais recebeu somente 150mJ/mm2 50. O exemplo acima sugere que as características da perturbação da onda (fases de compressão e rarefação, frequência e formato da onda) também devem ser levadas em consideração para determinar a resposta celular. Fortalecendo esta hipótese, foi observado que, para o mesmo aparelho, eletromagnético gerador de ondas focais, células periosteais exibiram resposta diferente para fluxo de energia total igual fornecido de maneira distinta. Nesse estudo, quando comparado células expostas a 1250 pulsos a 0.12mJ/mm2 com células expostas a 300 pulsos a 0.5mJ/mm2, observou-se menor viabilidade celular e mineralização óssea para a segunda exposição embora a energia total tenha sido 150mJ/mm2 para ambas as culturas. Portanto, acredita-se que os protocolos de estímulos devem ser desenvolvidos respeitando as peculiaridades de cada tipo de aparelho e da onda produzida49. A faixa de densidade de fluxo de energia utilizada nos estudos é muito ampla, variando de 0.12mJ/mm2 a 1.2mJ/mm2. Optou-se por utilizar a densidade de fluxo de energia de 0.12mJ/mm2, porque estudo prévio do grupo de pesquisa do qual o autor dessa tese participa utilizou a dose referida (com resultados satisfatórios), e a literatura demonstra resultados melhores para energias menores ou iguais a 0.18mJ/mm2 48,66,122,129,145,149,150,166,173,178-180,187,191,201.

2.2.4. Intensidade da pressão (ondas radiais) O único estudo in vitro encontrado utilizou intensidade de 0.05mJ/mm2 para investigar os efeitos osteogênicos das ondas de pressão radial em osteoblastos, investigações estas que restaram frustras; provavelmente, pelo tempo escolhido pelos autores (24-48h) para analisar os efeitos da mecanoterapia. Conforme estudo de Császár NB et al (2015), a intensidade utilizada naquele estudo in vitro equivale a disparos efetuados com pressão menor que 2.0 bar. Não é possível precisar a pressão exata, pois os fabricantes dos aparelhos, ou não sabem informar a densidade de energia equivalente a cada nível pressórico do compressor pneumático, ou informam valores divergentes que não são reprodutíveis do ponto de vista científico5,35. A maioria dos especialistas na área – e os poucos estudos encontrados – utilizam, para estimular osteogênese in vivo, a intensidade máxima de pressão que seus respectivos aparelhos produzem, o que corresponde a 4.0-5.0 bar. Caso o mesmo raciocínio fosse utilizado para ondas focai, certamente os efeitos seriam devastadores, visto que há aparelhos que emitem até 1.80mJ/mm2. A justificativa dos especialistas para utilizar a energia máxima é decorrente da incapacidade das ondas de pressão radial atingir o tecido ósseo com a mesma energia de saída, ao contrário das ondas focais que concentram a energia máxima de saída exatamente na região a ser tratada5. Entretanto, a justificativa utilizada não pode prosperar e não apresenta embasamento biofísico. Primeiro porque o USPBI emite ondas desfocadas com ISATA inferior às ondas radiais e focais, cuja capacidade de penetração tecidual estimada é de 3-5cm, e, ainda assim, é indicado para tratamento de distúrbios da osteogênese e acelerar a consolidação da fratura. Segundo, porque, no presente estudo, a distância entre a cabeça do aplicador das ondas radiais e o tecido-alvo do animal tratado é de ~2mm; e o diâmetro do aplicador é de 15mm, cerca da metade do tamanho da tíbia do animal, e quase 5 vezes maior que a lesão experimental. Terceiro, porque a capacidade de penetração da onda independe da energia de saída, ou da pressão do aplicador sobre a pele do animal, mas sim da frequência da onda e da impedância dos tecidos. Nesse diapasão, aumentar a intensidade de saída da energia significa expor os tecidos moles a energia que pode produzir lesão e atrapalhar a consolidação óssea, visto que as partes moles são fonte importante de células tronco mesenquimais e aporte sanguíneo para a fratura1,3-5,7,120,217. Pela ausência de referências reprodutíveis para correlacionar a intensidade de pressão emitida pelo equipamento utilizado no presente estudo com a densidade de fluxo de energia, e por considerar que pressão superior a 3.0 bar é muito elevada (dado considerado por meio da experiência clínica do autor), optou-se por operar o equipamento a 2.0 bar com aplicador DI que fornece, conforme comunicação direta com o fabricante, densidade de fluxo de energia de 0.4mJ/mm2.

3. Coleta do material para análise proteica Geralmente, os estudos experimentais utilizam o membro contralateral como controle. Entretanto, os estudos pilotos que precederam a publicação do material publicado em 2010 pelo autor dessa tese, demonstraram concentração proteica relativamente baixa em amostras unilaterais das tíbias, que exigiria volume excessivo de amostra para obter a quantidade de proteína necessária para o immunoblotting. Por conta disso, foi optado por utilizar ambas as tíbias e fíbulas do mesmo animal para o mesmo grupo138. Somando-se a isso, a fíbula foi incorporada na análise pois, no rato, a fíbula é contígua à tíbia. A coleta de material do tecido ósseo, conforme descrito nas seções anteriores, é muito agressiva se comparada a de partes moles. Portanto, requer-se que a coleta seja rápida o suficiente para minimizar a chance de desnaturação proteica com perda de material biológico. Como a coleta exclusiva da tíbia exigiria ostectomia da fíbula, prolongando o tempo do procedimento – pela necessidade de regularizar perfeitamente a junção tibiofibular para garantir a homogeneidade das amostras –, optou-se por incluir a fíbula no material analisado.

4. Modulação da osteogênese pelas terapias acústicas

4.1. Efeitos agudos e imediatos (0 a 7 dias) Nos primeiros 3 dias após perfuração óssea, observa-se, normalmente, infiltrado hemorrágico e inflamatório, e presença de células tronco mesenquimais comprometidas na diferenciação osteogênica. Isso permite denominá-las células osteoprogenitoras, pois já expressam genes específicos da linhagem osteogênica, como a fosfatase alcalina. Ao completar ~1 semana sucedendo a perfuração óssea, normalmente são identificados osteoblastos diferenciados, ossificação intramembranosa na cavidade medular, e ossificação endocondral na região cortical. Ademais, observa-se pico de expressão da maioria dos fatores reguladores da osteogênese, como BMP-2, TGF-β, OPG, RANKL e TRAP. Seus transcritos e demais fatores de transcrição (cbfa1, colágeno tipo I, Dlx5, osteocalcina, osterix, Msx, RUNX2), notadamente, aumentam no mesmo período193,194,196,198,199.

4.1.1. Ondas radiais Em cultura de osteoblastos submetidos a ondas de pressão radial, o mesmo cenário de lesão tecidual e morte celular é representado pela diminuição na expressão de osteocalcina nas primeiras 24-72h. Os achados se confirmam quando animais com perfuração óssea são expostos às ondas radiais. Nessa situação, observa-se um realce da resposta inflamatória e do infiltrado hemorrágico, mas sem complicações e prejuízo à osteogênese. Sugere-se,

81 portanto, que as ondas de pressão radial não aumentam a lesão tecidual que ocorre “normalmente” quando o osso sofre fratura. Em adição, a perturbação mecânica promovida pelas ondas radiais aumenta a concentração de células no local da fratura, ampliando o potencial osteogênico para reparo do tecido. Desse modo, acredita-se que há menor possibilidade de distúrbios da osteogênese e de infecção, e maior velocidade do reparo da fratura37,142. A partir desse parágrafo, o termo “tendência” será utilizado para se referir aos achados que não atingiram p<0.05 nas análises estatísticas, mas que merecem atenção do leitor. No presente estudo, apesar dos achados não terem atingido significado estatístico, identificou-se tendência de aumento da expressão de ERK-2 e diminuição da expressão de Akt em relação ao controle dos animais submetidos às ondas radiais. No contexto do reparo da fratura, ERK-2 é necessária para a diferenciação celular osteogênica induzida por BMP-2, pois permite a atividade de transcrição da Smad197,99,100,218-221. A Akt é igualmente necessária para diferenciação celular induzida por BMP- 2, e está relacionada com a inibição da apoptose. Como as ondas radiais, em cultura celular, exibem inicialmente um efeito nocivo, é possível que a tendência de diminuição da expressão de Akt guarde relação com aumento de apoptose. Entretanto, deve-se lembrar que nem sempre a inibição de Akt indica apoptose, fato este que merece melhor investigação222-224.

4.1.2. Ondas focais Apesar de apresentar, em culturas de células, efeitos deletérios iniciais (24h-72h), com diminuição da viabilidade celular e indução da apoptose, o emprego das ondas focais em fraturas não complicadas exibem efeito positivo, representado por pico de expressão de BMP-2, aumento da expressão de TGF- β1, agregação de células tronco mesenquimais, produção de MEC óssea, e ossificações intramembranosa e endocondral. A despeito disso, a densidade mineral óssea nos animais submetidos às ondas focais se torna superior à dos não tratados somente após 12 semanas51,154,178,179. Observou-se maior atividade da Akt e maior expressão de TGF-β1 nos animais estimulados com ondas focais em relação ao respectivo controle (C1) e aos estimulados com ondas radiais (R1). Somando-se a isso, o aumento da expressão de TGF-β1, em relação ao controle (F1/C1), foi maior do que nos tratados com USPBI (U1) e ondas radiais (R1/C1), e ao aumento observado na 3ª e 6ª semanas (F3/C3 e F6/C6, respectivamente). Adicionalmente, as ondas focais produziram aumento da expressão da forma madura de BMP-2, em relação ao respectivo controle (F1/C1), superior ao da terceira semana (F3/C3). Similarmente, a expressão da forma precursora de BMP-2 exibiu maior aumento, em relação ao respectivo controle (F1/C1), superior ao da sexta semana (F6/C6).

Quanto às tendências, identificou-se maior aumento da expressão da FAK, em relação ao respectivo controle (F1/C1), do que nos grupos expostos às ondas radiais (R1/C1) e de USPBI (U1/P1). A tendência de aumento da FAK associado à maior atividade de Akt e expressão de BMP-2 e TGF-β1, sugerem modulação da diferenciação osteogênica, compatível com o esperado para o tratamento. Consistente com a literatura, os resultados aqui obtidos demonstram que as ondas focais modularam as proteínas, principalmente de forma aguda; i.e, na primeira semana após a cirurgia.

4.1.3. USPBI Diferente das demais ondas acústicas, o USPBI não produz cavitações, nem efeitos térmicos; consequentemente, não diminui a viabilidade celular nas primeiras 24h-72h após o estímulo. Comparado com as ondas focais, o USPBI induz, in vitro, proliferação precoce (dentro de 6 dias) de células periosteais. Além disso, é a terapia acústica que apresenta maior acervo literário relativo a investigações experimentais e clínicas (em humanos). Todavia, as referências no âmbito da modulação proteica in vivo induzida pelo USPBI são escassas. Do conhecimento do autor dessa tese, há somente um experimento que investigou proteínas osteogênicas moduladas pelo USPBI em tíbias submetidas à lesão experimental. Nesse experimento, foi demonstrado aumento da expressão de BMP-4 e RUNX2 após 7 dias da cirurgia. Ambos, BMP-4 e RUNX2 estão relacionados à diferenciação osteogênica. No mesmo trabalho, e outro estudo relacionado ao estímulo do USPBI em fraturas, identificou-se maior agregado de células tronco mesenquimais e formação de tecido ósseo primário do que animais não tratados50,108,158,162,169,170,175. No presente estudo, a expressão de Akt aumentou, em relação ao controle, nos animais submetidos ao UPSBI (U1/P1) mais do que nos expostos às ondas focais (F1/C1). Ademais, constatou-se tendência de aumento da expressão dessa proteína (U1/P1) superior ao obtido na 3ª semana (U3/P3) e em animais expostos às ondas radiais (R1/C1). Sabendo-se que a Akt participa das vias que sinalizam diferenciação celular e inibem apoptose, os resultados deste estudo são compatíveis com o aumento de BMP-4 e RUNX2 observados por demais pesquisadores223,224. Curiosamente, a expressão de TGF-β1 exibiu tendência a ser menor que o respectivo controle (C1). Este resultado não pode ser entendido como modulação negativa da osteogênese sem investigação adequada, pois o TGF- β1 apresenta funções dependentes da sua concentração, podendo estimular, ou inibir, ora a diferenciação osteoblástica, ora a diferenciação osteoclástica. Como ilustração, pode-se citar a diminuição da concentração sérica de TGF-β1 na primeira semana após início da terapia com USPBI em indivíduos que obtiveram êxito na resolução da não união de fraturas de ossos longos3, 100,103,188,225,226.

4.2. Efeitos a médio-prazo (3 semanas) Ao vigésimo primeiro dia que sucede a perfuração óssea, observa-se surgimento de neocórtex formando uma ponte entre as margens superficiais do defeito ósseo, e substituição de osso imaturo da cavidade medular. Do ponto de vista molecular, a expressão de BMP-2 e de osterix se mantém máxima; enquanto que a de cbfa1, colágeno tipo I, OPG, osteocalcina (achados divergentes entre os estudos quanto ao pico de expressão), RANKL e TRAP diminui, mas se mantém maior que os níveis basais. Os demais fatores de transcrição e de crescimento diminuem e retomam seus níveis basais193,196,198.

4.2.1. Ondas radiais A partir da terceira semana, foram identificados os efeitos mais significativos das ondas radiais, quando o aumento da atividade da FAK, em relação ao controle (R3/C3), superou o induzido pelo USPBI (U3/P3); e apresentou tendência a ser superior às razões da primeira e sexta semanas (R1/C1 e R6/C6). Igualmente, encontrou-se tendência de maior atividade da FAK em relação ao controle (C1). Como achados adicionais, constatou-se tendência de modulação das ondas radiais sobre a expressão de ERK-2 e FAK. Quanto a ERK-2, o aumento proporcionado pelas ondas radiais, em relação ao controle (R3/C3), foi maior do que na sexta semana (R6/C6), e do que o obtido pela exposição às ondas focais (F3/C3) e de USPBI (U3/P3). Além disso, comparado com o controle a expressão de ERK-2 foi maior nos animais tratados (R3). Com relação a FAK, sua expressão aumentou mais na terceira semana, em relação ao controle (R3/C3), do que na primeira semana (R1/C1) e do que o USPBI (U3/P3). Não há trabalhos demonstrando os efeitos a médio prazo das ondas radiais. De qualquer modo, a modulação de ERK-2 e FAK, aqui demonstradas, sugere aceleração da diferenciação celular; i.e., na substituição do tecido ósseo primário para o tecido ósseo maduro. Deve-se notar que a superioridade das ondas radiais em aumentar a expressão e o perfil de atividade de ERK-2 e FAK em relação às ondas focais e de USPBI, não se traduz necessariamente em superioridade nos resultados histológicos, mecânicos e funcionais; pois as 3 terapias modulam proteínas relacionadas com a osteogênese em momentos diferentes e de formas diferentes. O entendimento do mecanismo de ação particular de cada uma das terapias acústicas poderá ser útil para tratamentos específicos de distúrbios da osteogênese99,100,218,224,227-229.

4.2.2. Ondas focais A literatura aponta que tíbias perfuradas submetidas às ondas focais exibem maior expressão de BMP-2 e TGF-β1 na 3ª semana, comparado aos controles [177, 152]. Similarmente, encontrou-se, aqui, tendência para maior

84 expressão de TGF-β1 em relação ao controle (C3) e às ondas radiais (R3). Por outro lado, não houve modulação de BMP-2. A modulação produzida pelas ondas focais na 3ª semana não é expressiva como o observado na 1ª semana, mas se mantém presente e é representado principalmente pela maior atividade da FAK em relação ao controle (C3). Além disso, a atividade de Akt apresentou tendência de ser maior do que o controle; e a atividade de Akt e de ERK apresentou tendência de aumento mais expressivo na terceira semana, em relação ao controle (F3/C3), do que na sexta semana (F6/C6), e do que nos animais expostos às ondas radiais (R3/C3) e de USPBI (U3/P3). A modulação da Akt, ERK-2, FAK e TGF-β1 encontradas são semelhantes aos achados das ondas radiais e sugerem influência das ondas focais na diferenciação celular. Considerando-se a terceira semana de reparo, provavelmente a diferenciação celular guarda relação com a substituição do osso primário por osso maduro. Em adição os achados obtidos para as ondas focais (F3) reforçam a discussão de que não se pode concluir superioridade de uma modalidade terapêutica sobre a outra somente com base na modulação proteica. Existe uma miríade de proteínas envolvidas com a osteogênese e a regulação do processo é bastante complexo. Portanto, é necessário ampliar as investigações para análises histomorfométricas, biomecânicas e clínicas.

4.2.3. USPBI Nos trabalhos levantados, observou-se aumento de BMP-4, RUNX2 e fosfatase alcalina na 3ª semana de tratamento diário com USPBI em tíbias com lesão experimental. O perfil proteico acima descrito indica maior mineralização óssea e aceleração do reparo em relação ao controle158,165. No presente estudo, investigou-se a BMP-2, cuja forma precursora exibiu aumento, em relação ao controle (U3/P3), superior ao obtido na primeira semana (U1/P1). Igualmente, o aumento relatado (U3/P3) foi superior ao proporcionado pelas ondas radiais (R3/P3) e focais (F3/P3). Consoante a isso, a expressão da forma madura de BMP-2 apresentou tendência de ser superior à expressão do controle (P3), aumento este superior ao proporcionado pelas ondas radiais (R3/C3) e focais (F3/C3), e na 1ª semana de exposição ao USPBI (U1/P1). A forma madura de BMP-2, assim como a de TGF-β1, é reconhecida como a forma funcionalmente ativa, pois está desassociada da LTBP, que impede a atividade desses fatores no meio extracelular. As investigações relacionadas com a função da BMP-2 não estão adiantadas como estão para o TGF-β1; por isso, será exposto o que se conhece a respeito do último. A meia-vida plasmática da forma precursora do TGF-β1 é maior que 108 minutos, ao passo que a da forma madura é de 2.2 minutos. Além disso, a forma precursora desse fator mais abundante nos tecidos e é biologicamente ativa (com menor potência). A secreção da forma precursora do TGF-β1 não ocorre se não houver ligação com a LTBP. Com base nesses dados, entende-se que acumular forma precursora

85 de TGF-β1 faz parte do mecanismo regulatório da atividade desse fator. O mesmo deve ocorrer para BMP-2, que possui funções semelhantes às do TGF- β1103,230-233. Acrescentando aos achados supra, observou-se tendência para maior expressão de TGF-β1 em relação ao controle; maior aumento de TGF-β1 e atividade de Akt (U3/P3) do que na 1ª semana (U1/P1). As tendências observadas sugerem modulação dos processos anti-apoptóticos e de diferenciação celular regulados pela Akt e TGF-β1, compatíveis com remodelação óssea esperada para este período2,120,223,234. Porquanto o USPBI, na 3ª semana, modulou BMP-2 e apresentou tendência a modular também Akt e TGF-β1, infere-se que os efeitos do USPBI são mais exuberantes na 3ª semana, assim como para as ondas radiais. Provavelmente, se o tratamento com USPBI fosse postergado até a 6ª semana, a modulação positiva seria mantida assim como para as ondas radiais. De qualquer modo, acredita-se que os resultados poderiam ser mais significativos com a modificação do protocolo de estímulos; por exemplo, aumentando-se a quantidade de sessões diárias e a ISATA.

4.3. Efeitos a longo prazo (6 semanas) Na 6ª semana de seguimento, animais submetidos à perfuração óssea monocortical exibem remodelamento ósseo quase completo; o defeito ósseo, está completamente fechado; e o canal medular é indistinguível do osso intacto. Para animais submetidos à perfuração óssea bicortical, há ainda irregularidades na região do defeito ósseo, mas também a osteogênese está finalizando142,196. Em nível molecular, a maioria dos estudos é interrompida na 4ª semana. Um único estudo incluiu a 6ª semana no tempo de seguimento. Nele, observou- se manutenção de níveis elevados de marcadores de atividade osteoclástica e de reabsorção da MEC óssea, e queda de marcadores da osteogênese, diferenciação osteoblástica e de produção de matriz extracelular196.

4.3.1. Ondas radiais Os animais tratados com ondas radiais exibiram menor expressão de Akt em relação ao controle (C3), sugerindo menor estímulo para diferenciação celular. Esse achado é compatível com reparo ósseo adiantado conforme exposto no parágrafo acima142. A hipótese acima aventada não é incompatível com a tendência observada de maior aumento na expressão de FAK (R6/C6) em relação à primeira semana (R1/C1); nem do maior aumento na expressão e atividade da FAK, e expressão da forma precursora de BMP-2 em relação aos animais expostos às ondas focais (F6/C6). A tendência de aumento em relação à primeira semana se deve ao fato de que as ondas radiais iniciaram seu efeito mais exuberante a partir da 3ª

86 semana. E a tendência de aumento em relação às ondas focais é decorrente da diminuição do efeito modulador das próprias ondas focais; i.e., não é um mérito das ondas radiais. Portanto, conclui-se que as ondas radiais não exibiram efeito modulador na 6ª semana. Correlacionando os resultados da primeira à sexta semana, observou-se que os efeitos mais significativos das ondas radiais foram encontrados na terceira semana. Esses dados sugerem que o protocolo de exposição às ondas radiais utilizados produziu efeito subótimo. Assim, acredita-se que investigações futuras devem ser realizadas com protocolos diferentes (modificando quantidade de sessões e de pulsos, e intensidade de pressão), a fim de produzir resultados mais substantivos que possam ser beneficiais do ponto de vista clínico.

4.3.2. Ondas focais A atividade da FAK foi menor do que nos animais expostos às ondas radiais, e apresentou tendência em ser menor do que o controle (assim como expressão de Akt). Além disso, observou-se tendência de diminuição, em relação ao controle (F6/C6), de Akt e BMP-2 (forma precursora) e pERK quando comparado aos resultados da 1ª e 3ª semanas (F1/C1 e F3/C3, respectivamente). Todos esses achados são compatíveis com a queda de BMP- 2 demonstrada em estudo de outros autores, e sugerem que o processo de remodelação óssea deixou de ser modulado pelas ondas focais na 6ª semana, provavelmente porque o reparo foi completado179. Correlacionando os resultados da primeira à sexta semana, observou-se que os efeitos mais significativos das ondas focais foram encontrados na primeira semana. Esses dados sugerem levantam questionamentos se a quantidade de sessões aplicadas poderia ser maior para produzir efeitos ainda mais exuberantes. Desse modo, acredita-se que investigações futuras devem ser realizadas com protocolos diferentes (modificando quantidade de sessões e de pulsos, e intensidade de densidade de fluxo de energia), a fim de otimizar a resposta celular e os resultados clínicos.

5. Limitações do estudo Parte do avanço realizado nas ciências se deve ao reconhecimento das limitações dos estudos. Nesse sentido, serão apontadas as limitações aqui encontradas. Primeiro, a quantidade de animais por grupo influenciou a falta de significado estatístico observada para alguns resultados. Cumpre informar que a utilização de 5 animais por grupo não foi determinada por planejamento inadequado, mas pela dificuldade na aquisição de animais devido às novas políticas de uso e manuseio de animais para experimentação estabelecidas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da instituição.

Segundo, apesar de terem sido avaliados importantes fatores osteoindutores (BMP-2 e TGF-β1), bem como importantes proteínas reguladoras da vitalidade, diferenciação e proliferação celular (Akt, ERK-2 e FAK), não é possível atestar que as ondas acústicas estudadas aceleram o reparo da fratura. A análise molecular representa a decodificação celular, em linguagem biológica, dos estímulos mecânicos. Para elucidar o significado da decodificação celular, são necessárias investigações biomecânicas, histológicas e radiográficas. Por fim, em virtude da inexistência de protocolos sobre o uso das ondas focais e radiais para acelerar a consolidação de fraturas, os parâmetros utilizados nesse estudo podem ter sido subótimos. Desse modo, os resultados apresentados não podem ser avaliados isoladamente para atestar a eficácia das terapias acústicas para o reparo ósseo.

6. Relevância clínica e perspectivas futuras Compreender as minúcias sobre os mecanismos que norteiam o funcionamento das terapias acústicas é tão importante quanto o conhecimento da fisiopatologia das moléstias, pois contribuem para a otimização da terapêutica e desenvolvimento de novas tecnologias. Nesse diapasão, o presente estudo contribui na demonstração de que as ondas de USPBI, focais e radiais atuam, de maneira distinta, na expressão e perfil de atividade da Akt, BMP-2, FAK e TGF-β1, no reparo de uma lesão experimental nas tíbias de ratos. Outrossim, o presente estudo, ao expor a complexidade e a heterogeneidade do mecanismo de ação das diferentes modalidades de terapias acústicas, levanta a necessidade de continuar as investigações e experimentar novos protocolos de tratamento, tanto para otimizar a resposta celular e produzir resultados mais substantivos do ponto de vista clínico, quanto para determinar o limite entre o nocivo e o benéfico para o tecido. Sugestões para estudos futuros: • Definir o melhor protocolo de tratamento para cada terapia acústica, por meio da definição da quantidade ideal de pulsos, intensidade de energia, frequência de pulso, quantidade de sessões de estímulo, e intervalo entre as sessões de estímulo e início das sessões de estímulo (em relação ao evento traumático); • Visando otimizar os resultados obtidos para o USPBI, modificar o protocolo de estímulo, inicialmente variando a intensidade da energia aplicada, e, posteriormente, variando a frequência de pulso e duração de cada sessão; • Comparar os melhores protocolos de cada terapia acústica entre si;

• Extrapolar os resultados para o reparo de fraturas complicadas (p. ex., não união e retardo de união; e para as não complicadas, mas submetidas à osteossíntese; • Definir as indicações e os limites de segurança terapêutica para grupos específicos de pacientes, como indivíduos com osteoporose senil, osteoporose por deficiência estrogênica, população pediátrica, etc.

CONCLUSÃO

Foi comparado o perfil de atividade e expressão de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-β1 em ratos submetidos à lesão experimental, em ambas as tíbias, tratados com USPBI, ondas focais e ondas radiais. Com base nos resultados obtidos após 1, 3 e 6 semanas do procedimento cirúrgico, pode-se concluir que: • USPBI, ondas focais e ondas radiais modulam o perfil de atividade e de expressão de Akt, BMP-2, FAK e TGF-β1, mas não de ERK-2, no reparo de uma lesão experimental bilateral em tíbias de ratos; • USPBI, ondas focais e ondas radiais exibem formas distintas de modulação do perfil de atividade e expressão de Akt, BMP-2, FAK e TGF-β1 em tíbias submetidas a uma lesão experimental bilateral nas tíbias de ratos; • O USPBI modulou, a médio prazo (terceira semana após a cirurgia), a expressão de BMP-2; • As ondas focais modularam, agudamente (primeira semana após a cirurgia), BMP-2, pAkt, pFAK e TGF-β1; • A ondas radiais modularam, a médio prazo (terceira semana após cirurgia), pFAK.

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APÊNDICE

Tabela 1. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para Akt. AKT/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de Akt pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra.

Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1 15017,75 3588,5 29778 100012,6667 105623,6667 98104 13899 30209 21471 87419,66667 35234 31076,66667 48589 2 58106,66667 32579,33333 66966 61667 19431,66667 37214,33333 49027,33333 72030,66667 14013 42766,66667 42183 45803,33333 92456 3 6656 16259,66667 11806,33333 31972,66667 9763 8625 21269 26038,33333 27611 50638,66667 60720,66667 40189,33333 35860,66667 4 9824 11501 9646,666667 16930,33333 14695 52034,33333 20631 8950,666667 16347 34273,66667 27038,66667 24786,66667 51905,33333

5 51297,33333 47599 35121 78029,33333 18717 29239 14778 39577,66667 67042,33333 71689,33333 84459,33333 75662,33333 Actina 1 125628,6667 107038 149810,3333 248503 258045 172579 123323,3333 175536,3333 179826 187077,6667 100489,6667 118802 149948,6667 2 167820,3333 124452,6667 168531,3333 165281,3333 250047,3333 112919,3333 184607,3333 144412,3333 45568,66667 52277 63934,33333 118893,3333 217209,3333 3 85836,66667 139304,6667 123098 175980,6667 51678,66667 31621,33333 105431,3333 127318 145382 190730 198661 160784 155812 4 160688,3333 159464,6667 180940,6667 187036 121455,3333 144158 186127,3333 151291,6667 152145,6667 203245,3333 201121 193423,6667 220843,3333 5 146586,3333 119307,3333 120802,6667 206217,3333 62487 0 125710 93431 144076,3333 210584,6667 190150,3333 170222 178433,6667

AKT/ACT 1 0,11954079 0,033525477 0,198771335 0,402460601 0,409322663 0,568458503 0,112703733 0,172095426 0,119398752 0,467290769 0,350623115 0,261583699 0,32403756 2 0,346243304 0,261780918 0,397350443 0,373103234 0,077711953 0,329565649 0,265576304 0,49878473 0,307513935 0,818078059 0,659786343 0,38524728 0,425653901 3 0,07754262 0,116720186 0,095910034 0,181682836 0,188917413 0,272758897 0,201733198 0,204514156 0,189920348 0,265499222 0,305649658 0,249958537 0,230153433 4 0,061136984 0,07212256 0,053313978 0,090519116 0,120990982 0,360953491 0,110843473 0,059161663 0,107443086 0,168631998 0,134439798 0,128147021 0,235032376

5 0,349946221 0,398961226 0,290730337 0,37838397 0,299534303 0,232590884 0,1581702 0,274699291 0,318362844 0,377013977 0,496171666 0,424036196 Média 0,190881983 0,176622074 0,207215225 0,285229951 0,219295463 0,382934135 0,184689518 0,218545235 0,199795083 0,407572578 0,365502578 0,304221641 0,327782693 Desvio padrão 0,145092827 0,151386713 0,140776342 0,140335958 0,135260023 0,128956347 0,070290276 0,165783668 0,089866517 0,253632031 0,189690027 0,140690011 0,096166041 máximo 0,349946221 0,398961226 0,397350443 0,402460601 0,409322663 0,568458503 0,265576304 0,49878473 0,307513935 0,818078059 0,659786343 0,496171666 0,425653901 3º quartil 0,346243304 0,261780918 0,290730337 0,37838397 0,299534303 0,412829744 0,232590884 0,204514156 0,274699291 0,467290769 0,377013977 0,38524728 0,424036196 mediana 0,11954079 0,116720186 0,198771335 0,373103234 0,188917413 0,34525957 0,201733198 0,172095426 0,189920348 0,318362844 0,350623115 0,261583699 0,32403756

106

1º quartil 0,07754262 0,07212256 0,095910034 0,181682836 0,120990982 0,315363961 0,112703733 0,1581702 0,119398752 0,265499222 0,305649658 0,249958537 0,235032376 mínimo 0,061136984 0,033525477 0,053313978 0,090519116 0,077711953 0,272758897 0,110843473 0,059161663 0,107443086 0,168631998 0,134439798 0,128147021 0,230153433

Tabela 2. Análise estatística referente à expressão de Akt (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 5 0.117 0,669221386 F1 x R1 12 0.917 1,033529056 F3 x C3 8 0.347 0,805406876 F3 x R3 10 0.602 0,808171697 F6 x C6 4 0.142 0,541124978 F6 x R6 12 0.917 1,037138766 R1 x C1 8 0.347 0,647510955 R3 x C3 12 0.917 0,996578918 R6 x C6 2 0.05 0,521747905 U1 x P1 9 0.465 1,339722504 U3 x P3 12 0.917 1,11507589

107

Tabela 3. Valores das razões das expressões de Akt dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3

1 0,297024825 0,081904766 0,349667274 0,280036686 0,420439524 0,210039522 1,786391008 1,082044674

2 0,928009388 3,368605565 1,205679187 0,711803812 6,418378503 0,933088555 2,123514169 1,550053558

3 0,42680212 0,6178371 0,35162935 1,110359138 1,082558528 0,696293869 1,062173055 1,328025631

4 0,675404119 0,596098644 0,147703178 1,224531104 0,488975812 0,297664627 1,315926011 0,572005443

5 0,924844201 1,331938352 0,614695394 0,528053711 0,6416385 0,889108005

Média 0,65041693 1,199276886 0,513669747 0,788285227 1,787681215 0,534271643 1,385928549 1,084247462

Desvio padrão 0,28630483 1,291704557 0,471155493 0,383517107 2,602076209 0,339811457 0,584826551 0,379762841

máximo 0,928009388 3,368605565 1,205679187 1,224531104 6,418378503 0,933088555 2,123514169 1,550053558

3º quartil 0,924844201 1,331938352 0,565141809 1,110359138 1,082558528 0,755492541 1,786391008 1,328025631

mediana 0,675404119 0,6178371 0,350648312 0,711803812 0,528053711 0,496979248 1,315926011 1,082044674

1º quartil 0,42680212 0,596098644 0,29917625 0,614695394 0,488975812 0,275758351 1,062173055 0,889108005

mínimo 0,297024825 0,081904766 0,147703178 0,280036686 0,420439524 0,210039522 0,6416385 0,572005443

108

Tabela 4. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão de Akt. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 11 0.754 0,542340921 F1/C1 x F6/C6 7 0.462 1,266216151 F1/C1 x R1/C1 10 0.602 0,825103539 F1/C1 x U1/P1 3 0.047 0,469300478 F3/C3 x F6/C6 6 0.327 2,334723607 F3/C3 x R3/C3 11 0.754 0,670856121 F3/C3 x U3/P3 11 0.754 1,106091485 F6/C6 x R6/C6 8 1 0,961439286 R1/C1 x R3/C3 11 0.754 0,440954025 R1/C1 x R6/C6 6 0.327 1,475439014 R1/C1 x U1/P1 5 0.117 0,568777682 R3/C3 x R6/C6 6 0.327 3,346015528 R3/C3 x U3/P3 8 0.347 1,64877602 U1/P1 x U3/P3 9 0.465 1,278240067

109

Tabela 5. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para pAkt. pAKT/ACT indica a razão do resultado obtido para a atividade de Akt pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1 15242,67 5056 19460,33 28631,33 26693 22489,33 7076,333 21261,33 19547,33 34167 21589,33 25253 14165

2 28771,67 34874,67 25952 20551,33 9780 25100 18719 20116,33 22254 22987 21281,67 18724 26299,67

3 53213,33 38324,33 55508,67 9630,333 16978,67 0 30216 61472 69266,67 61643,33 27355 4 13232 12602,33 8298,667 10076,67 2982,333 9585,667 11105,33 11106,67 9763 12558,67 8203,667 5282,333

ACTINA 1 69551,67 73107 84215,33 183043,3 210856 89758,33 79663,33 118814,7 156428,7 209723 147317 124481 157127,3

2 157770,3 220432,7 169424,7 150919,7 200126 205603 282818,3 266329 119660,3 232093,3 205035 190253,3 199102,3

3 162378,3 80087 72832 148927 147218,3 92164,33 37633,67 204211 184331,7 140434,3 146650,3

4 92937,67 104888,7 88808 182342 91040,33 103001,3 112400,7 94184,67 152442,7 171061,3 181703,3 185404,7 pAKT/ACT

1 0,219156 0,069159 0,231078 0,156418 0,126594 0,250554 0,088828 0,178945 0,12496 0,162915 0,14655 0,202866 0,09015

2 0,182364 0,15821 0,153177 0,136174 0,048869 0,12208 0,066187 0,075532 0,185976 0,099042 0,103795 0,098416 0,132091

3 0,327712 0,478534 0,762147 0,064665 0,11533 0 0,802898 0,301022 0,375772 0,438948 0,186532

4 0,142375 0,12015 0,093445 0,055262 0,032758 0,093064 0,098801 0,117924 0,064044 0,073416 0,045149 0,028491

média 0,217902 0,206513 0,309962 0,10313 0,080888 0,186317 0,082693 0,08832 0,30794 0,156756 0,174883 0,196345 0,109316

110

desvio padrão 0,079639 0,18498 0,306678 0,05067 0,046964 0,090845 0,01445 0,073681 0,331384 0,104526 0,137244 0,174498 0,066786 máximo 0,327712 0,478534 0,762147 0,156418 0,126594 0,250554 0,093064 0,178945 0,802898 0,301022 0,375772 0,438948 0,186532

3º quartil 0,246295 0,238291 0,363845 0,141235 0,118146 0,218436 0,090946 0,118837 0,340207 0,197442 0,203856 0,261887 0,145701 mediana 0,20076 0,13918 0,192128 0,100419 0,0821 0,186317 0,088828 0,087167 0,155468 0,130978 0,125173 0,150641 0,111121

Tabela 6. Análise estatística (teste de Mann-Whitney) referente à atividade de Akt (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 1 0.043 2,112887 F1 x R1 0 0.034 2,635071 F3 x C3 3 0.149 2,553083 F3 x R3 5 0.386 2,338246 F6 x C6 4 1 1,663625 F6 x R6 8 1 1,006566 R1 x C1 6 1 0,801833 R3 x C3 8 1 1,091879 R6 x C6 4 1 1,652772 U1 x P1 8 1 0,79837 U3 x P3 6 0.564 1,599797

111

Tabela 7. Valores das razões da atividade de Akt dos grupos tratados pelo respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 1,401089 0,546307 0,922268 0,567887 1,413543 0,498734 0,803065 1,625629 2 1,3392 3,237418 1,254729 0,48605 1,545593 1,523399 1,00636 0,785785

3 5,067859 4,149262 0 0,685781 2,014516 4 2,576342 3,667753 1,684028 3,016063 1,418508 2,576835

média 2,596123 2,900185 1,088499 0,912655 1,4938 1,011067 0,978428 1,750691

desvio padrão 1,743352 1,612847 0,235085 0,669281 1,232592 0,724547 0,321893 0,752507

máximo 5,067859 4,149262 1,254729 1,684028 3,016063 1,523399 1,418508 2,576835 3º quartil 3,199221 3,78813 1,171614 1,125958 1,91321 1,267233 1,109397 2,155095

mediana 1,988716 3,452585 1,088499 0,567887 1,479568 1,011067 0,904713 1,820073

112

Tabela 8. Análise estatística das razões Trat/Contr para a atividade de Akt. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 7 0.773 0,895158 F1/C1 x F6/C6 0 0.064 2,385049 F1/C1 x R1/C1 2 0.157 2,844582 F1/C1 x U1/P1 2 0.083 2,65336 F3/C3 x F6/C6 2 0.355 2,66439 F3/C3 x R3/C3 3 0.149 1,941482 F3/C3 x U3/P3 4 0.248 1,656594 F6/C6 x R6/C6 2 1 1,076585 R1/C1 x R3/C3 5 0.724 0,610962 R1/C1 x R6/C6 3 1 0,902666 R1/C1 x U1/P1 4 0.48 0,932777 R3/C3 x R6/C6 3 0.643 1,477449 R3/C3 x U3/P3 6 0.564 0,853263 U1/P1 x U3/P3 3 0.149 0,558881

113

Tabela 9. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para forma precursora de BMP-2. BMP/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de BMP-2 pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Os subitens indicam duplicata.

Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1 15709,33 2641 4230,333 4722,333 7134,333 9303 0 3545,333 5862,333 8888,333 7287,667 4350,667 5925,667

2.1 35618 28113,33 21213,33 30345 65078,67 64167,67 25183,67 34291,33 6499 9226,333 21360,33 1963,333 2.2 30065,33 31020,33 30598 47812,67 49512,67 38932,67 48429,33 33656 19935,67 26940,67 10658 27142

2 35618 29089,33 26116,83 30471,5 56445,67 49512,67 51550,17 36806,5 33973,67 13217,33 18083,5 16009,17 14552,67 3 2695,333 1223,333 2847,333 1687,667 317,6667 2333,333 1768 3410,333 11639,67 4902 9605,333 8063 8231,333

4 4562 6767,333 5335,333 15980,67 16417,67 14132,67 2768 13961,67 9070 11823,67 12545,33 7140,333 6314,333

5.1 12949 20119,67 20679,33 19348,33 0 15885,67 20803,33 15749 18057,67 12551,67 17433,67 8987,333 5.2 46962,67 46862,67 33794 39085 38024,67 0 30885,67 40078,33 34752 34149,67 25251,67 33379 23254

5 29955,83 33491,17 27236,67 29216,67 38024,67 0 23385,67 30440,83 25250,5 26103,67 18901,67 25406,33 16120,67

ACTINA

1 125628,7 107038 149810,3 248503 258045 172579 123323,3 175536,3 179826 187077,7 100489,7 118802 149948,7

2.1 99427 116872,3 190873,7 194365,3 216103,7 92985,67 216694,3 218182,3 72396,67 212840 155671 216481,7 279229

2.2 105909,3 123485,3 125098,3 113111 114880,7 115342 125635,3 149033,7 88998,67 182354 137080 149178,7 181441

2 102668,2 120178,8 157986 153738,2 165492,2 104163,8 171164,8 183608 80697,67 197597 146375,5 182830,2 230335 3 92228 59499,33 112493 158791,7 182751,3 109313 68636,33 148517,3 28836 161980,7 187894,7 162006,7 178378,3

4 47703 36564,67 70781,67 82602 38955 32125,67 20690,67 47049,33 77252 61067 37027 53480,33 53458,67

114

5.1 196911 136369 129368,3 255701,7 66693,67 127844,3 178725 84566,33 155536 203014 134189 89238,67 162177,7

5.2 171403,7 141105,3 133841,7 229291 60118,67 122850,7 131028 133650,7 203438,7 183000 207902,7 205578,3 5 184157,3 138737,2 131605 242496,3 63406,17 127844,3 150787,8 107797,2 144593,3 203226,3 158594,5 148570,7 183878

BMP/ACT 1 0,125046 0,024673 0,028238 0,019003 0,027648 0,053906 0 0,020197 0,0326 0,047511 0,072522 0,036621 0,039518

2 0,346924 0,24205 0,165311 0,198204 0,341078 0,475335 0,301173 0,200462 0,420999 0,06689 0,123542 0,087563 0,06318 3 0,029225 0,02056 0,025311 0,010628 0,001738 0,021345 0,025759 0,022963 0,403651 0,030263 0,051121 0,04977 0,046145

4 0,095633 0,185078 0,075377 0,193466 0,421452 0,439918 0,13378 0,296745 0,117408 0,193618 0,338816 0,133513 0,118116

5 0,162664 0,2414 0,206958 0,120483 0,5997 0 0,15509 0,28239 0,174631 0,128446 0,119182 0,171005 0,08767 média 0,151898 0,142753 0,100239 0,108357 0,278323 0,198101 0,12316 0,164551 0,229858 0,093346 0,141036 0,095694 0,070926

desvio padrão 0,119464 0,11209 0,082219 0,090827 0,258382 0,238019 0,119871 0,135588 0,174173 0,067206 0,11476 0,056495 0,032279 máximo 0,346924 0,24205 0,206958 0,198204 0,5997 0,475335 0,301173 0,296745 0,420999 0,193618 0,338816 0,171005 0,118116

3º quartil 0,162664 0,2414 0,165311 0,193466 0,421452 0,439918 0,15509 0,28239 0,403651 0,128446 0,123542 0,133513 0,08767 mediana 0,125046 0,185078 0,075377 0,120483 0,341078 0,053906 0,13378 0,200462 0,174631 0,06689 0,119182 0,087563 0,06318

1º quartil 0,095633 0,024673 0,028238 0,019003 0,027648 0,021345 0,025759 0,022963 0,117408 0,047511 0,072522 0,04977 0,046145

mínimo 0,029225 0,02056 0,025311 0,010628 0,001738 0 0 0,020197 0,0326 0,030263 0,051121 0,036621 0,039518

115

Tabela 10. Análise estatística referente à expressão da forma precursora de BMP-2 (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 10 0.602 1,401835 F1 x R1 10 0.602 1,233338 F3 x C3 8 0.347 0,512902 F3 x R3 11 0.754 0,867526 F6 x C6 12 0.917 0,506 F6 x R6 6 0.175 0,436092 R1 x C1 12 0.917 1,136618 R3 x C3 8 0.347 0,591225 R6 x C6 11 0.754 1,160307 U1 x P1 11 0.754 0,975457 U3 x P3 5 0.117 1,9885

116

Tabela 11. Valores das razões das expressões da forma precursora de BMP-2 dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 6,580274 0,892427 0,523839 0 0,73052 0,60476 1,297377 1,835154 2 1,750337 0,709664 0,347778 1,519509 0,587733 0,885691 0,763911 1,955381 3 2,749734 11,82828 1,18579 2,423646 13,21018 18,91039 0,60806 1,107822

4 0,494317 0,439145 0,171344 0,691492 0,704102 0,266886 1,450178 2,868496

5 1,350103 0,402535 1,287235 0,470885 0,751126 1,359436

Média 2,584953 2,85441 0,557188 1,184377 3,140683 5,166932 0,97413 1,825258 Desvio padrão 2,376023 5,020579 0,443088 0,908896 5,629962 9,165799 0,373845 0,677695

máximo 6,580274 11,82828 1,18579 2,423646 13,21018 18,91039 1,450178 2,868496

3º quartil 2,749734 0,892427 0,689327 1,519509 0,73052 5,391866 1,297377 1,955381 mediana 1,750337 0,709664 0,435809 1,287235 0,704102 0,745225 0,763911 1,835154 1º quartil 1,350103 0,439145 0,30367 0,691492 0,587733 0,520291 0,751126 1,359436 mínimo 0,494317 0,402535 0,171344 0 0,470885 0,266886 0,60806 1,107822

117

Tabela 12. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão da forma precursora de BMP-2. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 7 0.251 0,9056 F1/C1 x F6/C6 2 0.05 4,639285 F1/C1 x R1/C1 7 0.251 2,182543 F1/C1 x U1/P1 6 0.175 2,653601 F3/C3 x F6/C6 6 0.327 5,122887 F3/C3 x R3/C3 11 0.754 0,90885 F3/C3 x U3/P3 5 0.117 1,563839 F6/C6 x R6/C6 5 0.386 0,107837 R1/C1 x R3/C3 11 0.754 0,377108 R1/C1 x R6/C6 9 0.806 0,229222 R1/C1 x U1/P1 11 0.754 1,21583 R3/C3 x R6/C6 9 0.806 0,607843 R3/C3 x U3/P3 5 0.117 1,720679 U1/P1 x U3/P3 3 0.047 0,533695

118

Tabela 13. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para forma madura de BMP-2. BMP/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de BMP-2 pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Os subitens indicam duplicata.

Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1 21758,33 5582,667 6923,333 7469,667 6608,667 0 0 11570,33 1354,667 7819,333 8593,333 5775,333 12599,67

2.1 50221 24801,67 22280,67 39413,67 37320,67 28153,67 16732 14657,33 10009 5666,667 2.2 23729 16151,33 37903,67 30008,67 20098 23547,33 33338,33 37735,33 23221,33 8803 5896,333 11472,67 25192,67

2 36975 20476,5 30092,17 34711,17 28709,33 23547,33 33338,33 37735,33 25687,5 12767,5 10276,83 10740,83 15429,67 3 23036,33 6786,667 27248 16475,67 13186 9331,667 1485,333 17396 17076,67 20619,33 23781,67 7958,333 4585,333

4 40840 47281 39958,67 39947,67 36589 40359,67 31940 24747,33 6885 8767,667 14076,33 10559 9110,333

5.1 12496,33 11760 15087,33 12621,33 17397,67 0 16470,67 10028,33 20673,67 17900 13037,33 9424,333 2457

5.2 31992,67 25930 28125 21749 0 16963 18310,33 14288,67 17877,33 14061,33

5 22244,5 18845 21606,17 17185,17 17397,67 0 16470,67 10028,33 18818,33 18105,17 13663 13650,83 8259,167

ACTINA

1 125628,7 107038 149810,3 248503 258045 172579 123323,3 175536,3 179826 187077,7 100489,7 118802 149948,7

2.1 99427 116872,3 190873,7 194365,3 216103,7 92985,67 216694,3 218182,3 72396,67 212840 155671 216481,7 279229

2.2 105909,3 123485,3 125098,3 113111 114880,7 115342 125635,3 149033,7 88998,67 182354 137080 149178,7 181441

4 47703 36564,67 70781,67 82602 38955 32125,67 20690,67 47049,33 77252 61067 37027 53480,33 53458,67

119

5.1 196911 136369 129368,3 255701,7 66693,67 127844,3 178725 84566,33 155536 203014 134189 89238,67 162177,7

BMP/ACT 1 0,173196 0,052156 0,046214 0,030059 0,025611 0 0 0,065914 0,007533 0,041797 0,085515 0,048613 0,084027

2 0,360141 0,170384 0,190474 0,225781 0,173479 0,226061 0,194773 0,205521 0,318318 0,064614 0,070209 0,058748 0,066988 3 0,249776 0,114063 0,24222 0,103756 0,072153 0,085366 0,021641 0,117131 0,5922 0,127295 0,126569 0,049123 0,025706

4 0,856131 1,293079 0,564534 0,483616 0,939263 1,256306 1,543691 0,525987 0,089124 0,143575 0,380164 0,197437 0,170418

5 0,120791 0,135832 0,164174 0,070868 0,274384 0 0,109231 0,09303 0,130147 0,089089 0,086151 0,091881 0,044917 média 0,352007 0,353103 0,241523 0,182816 0,296978 0,313547 0,373867 0,201517 0,227464 0,093274 0,149721 0,08916 0,078411

desvio padrão 0,295843 0,527223 0,194339 0,183333 0,371645 0,535056 0,65849 0,188796 0,233594 0,042357 0,130505 0,063054 0,055962 máximo 0,856131 1,293079 0,564534 0,483616 0,939263 1,256306 1,543691 0,525987 0,5922 0,143575 0,380164 0,197437 0,170418

3º quartil 0,360141 0,170384 0,24222 0,225781 0,274384 0,226061 0,194773 0,205521 0,318318 0,127295 0,126569 0,091881 0,084027 mediana 0,249776 0,135832 0,190474 0,103756 0,173479 0,085366 0,109231 0,117131 0,130147 0,089089 0,086151 0,058748 0,066988

1º quartil 0,173196 0,114063 0,164174 0,070868 0,072153 0 0,021641 0,09303 0,089124 0,064614 0,085515 0,049123 0,044917

mínimo 0,120791 0,052156 0,046214 0,030059 0,025611 0 0 0,065914 0,007533 0,041797 0,070209 0,048613 0,025706

120

Tabela 14. Análise estatística referente à expressão da forma madura de BMP-2 (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 6 0.175 1,92547 F1 x R1 7 0.251 0,941529 F3 x C3 12 0.917 1,188987 F3 x R3 12 0.917 1,752227 F6 x C6 9 0.463 0,770294 F6 x R6 11 0.754 1,061807 R1 x C1 11 0.754 2,045046 R3 x C3 12 0.917 0,678558 R6 x C6 9 0.463 0,725456 U1 x P1 11 0.754 1,046135 U3 x P3 5 0.117 1,909444

121

Tabela 15. Valores das razões das expressões da forma madura de BMP-2 dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 5,761921 2,036504 0 2,573715 0,859794 1,017709 2 1,595089 0,98216 0,842578 0,862664 1,184707 1,408108 1,099855 1,04808 3 2,407328 1,580855 2,837408 0,208571 1,623378 6,937144 2,591327 4,923784

4 1,770269 1,376695 0,44936 3,191976 0,559999 0,070941 0,727191 2,23077

5 1,704453 0,495044 1,541332 0,339049 0,969609 1,918013

Média 2,647812 1,294251 1,376449 1,160909 1,25617 2,805398 1,249555 2,227671 Desvio padrão 1,769445 0,586518 1,280412 1,285842 0,894656 3,640123 0,762547 1,598465

máximo 5,761921 2,036504 2,837408 3,191976 2,573715 6,937144 2,591327 4,923784

3º quartil 2,407328 1,580855 1,839993 1,541332 1,623378 4,172626 1,099855 2,23077 mediana 1,770269 1,376695 0,842578 0,862664 1,184707 1,408108 0,969609 1,918013 1º quartil 1,704453 0,98216 0,645969 0,208571 0,559999 0,739525 0,859794 1,04808 mínimo 1,595089 0,495044 0,44936 0 0,339049 0,070941 0,727191 1,017709

122

Tabela 16. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão da forma madura de BMP-2. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 3 0.047 2,045825 F1/C1 x F6/C6 4 0.297 1,923655 F1/C1 x R1/C1 4 0.076 2,28081 F1/C1 x U1/P1 4 0.076 2,119004 F3/C3 x F6/C6 3 0.655 0,940283 F3/C3 x R3/C3 12 0.917 1,030316 F3/C3 x U3/P3 7 0.251 0,580989 F6/C6 x R6/C6 4 0.827 0,490643 R1/C1 x R3/C3 10 0.602 0,924166 R1/C1 x R6/C6 6 0.655 0,413813 R1/C1 x U1/P1 11 0.754 0,929058 R3/C3 x R6/C6 7 0.881 0,447769 R3/C3 x U3/P3 8 0.347 0,563894 U1/P1 x U3/P3 6 0.175 0,560924

123

Tabela 17. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para ERK-2. ERK/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de ERK-2 pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 7133,667 4044 8248,667 35250,33 76154,67 16472,33 31411,33 22879,33 41321 43656,67 26684 19189,33 25409 1 38670,67 40280 142666,3 144276,3 41670,67 54813 103621 145045,3 14973,67 58815,33 11298,33 79838,67 196949,3 2 70111 67214,67 85367 27789 15823 101582,3 88580 165293 45941 155477,3 228240,7 183744,3 187289,7 3 94309,33 76221,67 89738,33 30718 13233 94135,33 64519,67 170651 83235,67 148631,3 220667,3 161317 181468,7 4 59918 35461 85486,33 171229 35514 35172 62427 90598,67 122145 101951 133640,3 152933,7 5

Actina 66257,67 50779,67 95922 150885 187436,3 87574 108456,7 73939,67 115893,7 156261 104129,7 139206,3 166195,3 1 82340 82736 136513,3 158677 153946,7 105914 163157,3 162212 38740,33 164635 76951,33 100043 166089,7 2 101641,7 93375,33 90049,33 119651,3 51221 120058,7 164028,7 204581 91287 183729,3 177455,7 188897 202010,7 3 126936,3 108804 134650,7 133184,7 22718,33 17825,67 18451 40508 30120,67 75035,33 180655,7 190473 192980,7 4 91863,33 75476,33 94823 229686,7 41795,67 52175,33 58403,33 85411 133893,7 136758,3 126447,3 116837 5

ERK/ACT 0,107666 0,079638 0,085993 0,233624 0,406296 0,188096 0,289621 0,309432 0,356542 0,279383 0,256257 0,137848 0,152886 1 0,469646 0,48685 1,045073 0,909245 0,270682 0,517524 0,635099 0,894171 0,386514 0,357247 0,146824 0,798044 1,185801 2 0,689786 0,719833 0,948003 0,23225 0,308916 0,846106 0,540028 0,807959 0,503259 0,84623 1,286184 0,972722 0,927128 3 0,742966 0,700541 0,666453 0,230642 0,582481 5,280887 3,496811 4,212773 2,763407 1,980818 1,22148 0,846928 0,940346 4

124

0,652252 0,469829 0,901536 0,74549 0,849705 0,674112 1,068894 1,060738 0,912254 0,745483 1,056885 1,308949 5 0,532463 0,491338 0,729411 0,47025 0,483616 1,708153 1,127134 1,458646 1,014092 0,875186 0,731246 0,762486 0,903022 Média Desvio 0,258752 0,257854 0,385682 0,331105 0,237505 2,396923 1,333119 1,565235 1,018511 0,679683 0,528122 0,363812 0,449838 padrão 0,742966 0,719833 1,045073 0,909245 0,849705 5,280887 3,496811 4,212773 2,763407 1,980818 1,286184 1,056885 1,308949 máximo 0,689786 0,700541 0,948003 0,74549 0,582481 1,954801 0,674112 1,068894 1,060738 0,912254 1,22148 0,972722 1,185801 3º quartil 0,652252 0,48685 0,901536 0,233624 0,406296 0,681815 0,635099 0,894171 0,503259 0,84623 0,745483 0,846928 0,940346 mediana 0,469646 0,469829 0,666453 0,23225 0,308916 0,435167 0,540028 0,807959 0,386514 0,357247 0,256257 0,798044 0,927128 1º quartil 0,107666 0,079638 0,085993 0,230642 0,270682 0,188096 0,289621 0,309432 0,356542 0,279383 0,146824 0,137848 0,152886 mínimo

125

Tabela 18. Análise estatística referente à expressão de ERK-2 (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 12 0.917 1,132297 F1 x R1 12 0.917 0,472404 F3 x C3 11 0.754 1,015967 F3 x R3 4 0.076 0,336845 F6 x C6 9 0.806 0,427018 F6 x R6 12 0.917 0,719275 R1 x C1 8 0.347 2,396882 R3 x C3 4 0.076 3,016123 R6 x C6 9 0.806 0,593677 U1 x P1 12 0.917 1,147807 U3 x P3 10 0.602 0,809776

126

Tabela 19. Valores das razões das expressões de ERK-2 dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 0,46085 0,19601 0,457178 1,23969 0,761593 1,895532 2,026745 1,67613 2 0,516523 1,798601 2,019372 0,69849 3,303396 0,746852 0,447653 0,123819

3 2,970017 2,330189 1,12043 2,325201 2,615462 0,594794 0,869961 1,387278

4 3,221291 1,202685 0,126201 15,1612 7,232463 0,523285 2,338826 1,298968

5 0,874931 0,552932 0,904254 1,257959 0,863153 0,569528

Média 1,608722 1,216083 0,930795 4,065766 3,034175 0,940116 1,309268 1,011145 Desvio padrão 1,369531 0,874794 0,835194 6,234151 2,558954 0,64373 0,822975 0,642047

máximo 3,221291 2,330189 2,019372 15,1612 7,232463 1,895532 2,338826 1,67613 3º quartil 2,970017 1,798601 1,345166 2,325201 3,303396 1,034022 2,026745 1,387278 mediana 0,874931 1,202685 0,788804 1,23969 2,615462 0,670823 0,869961 1,298968 1º quartil 0,516523 0,552932 0,374434 0,904254 1,257959 0,576917 0,863153 0,569528 mínimo 0,46085 0,19601 0,126201 0,69849 0,761593 0,523285 0,447653 0,123819

127

Tabela 20. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão de ERK-2. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 11 0.754 1,322872 F1/C1 x F6/C6 6 0.327 1,728331 F1/C1 x R1/C1 9 0.465 0,395675 F1/C1 x U1/P1 10 0.602 1,228719 F3/C3 x F6/C6 7 0.462 1,306499 F3/C3 x R3/C3 5 0.117 0,400795 F3/C3 x U3/P3 11 0.754 1,20268 F6/C6 x R6/C6 7 0.773 0,990086 R1/C1 x R3/C3 9 0.465 1,339991 R1/C1 x R6/C6 4 0.142 4,32475 R1/C1 x U1/P1 9 0.465 3,105375 R3/C3 x R6/C6 2 0.05 3,227447 R3/C3 x U3/P3 6 0.175 3,000732 U1/P1 x U3/P3 10 0.602 1,294837

128

Tabela 21. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para pERK. pERK/ACT indica a razão do resultado obtido para a atividade de ERK pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Os subitens indicam duplicata.

Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1 76309,33 74980,67 69400 82875,33 79474,67 39365,67 51427 56040,67 78017 94832 88728,33 82487,33 102683

2.1 3736,333 2010 5263,667 5318,667 540 1727 4250,333 13125 29013,67 32830,67 27900,33 34590,67 35360,33 2.2 32673 37509 42848,33 40880,67 32958,67 39101,67 19525,67 6838,333 4377 3423,333 13752,33 24618,33 26665

2 18204,67 19759,5 24056 23099,67 16749,33 20414,33 11888 9981,667 16695,33 18127 20826,33 29604,5 31012,67 3 111168,7 125349,3 120719,7 138086,3 119129,7 138871,3 143314,7 165947,3 96284 126482 155860,3 148162,7 127950

4 22995,67 21466,67 19584,67 19739,67 9356,333 11878,67 9657,333 23895,67 4346 16280,33 15286,67 13193,33 15227,67 5.1 9044 17283 13529,67 15686,67 8257,667 15924 6827,667 12290,67 12552,67 8245 14952,33 16080,33

5.2 90629,33 77376,33 95570,33 265182,7 105090 0 197968,3 73539,33 105277,3 156124,3 145082,3 144925,7 198663,3

5 49836,67 47329,67 54550 140434,7 56673,83 0 106946,2 40183,5 58784 84338,5 76663,67 79939 107371,8

ACTINA

1 37936 38671 61239 84214,33 108332 31129,67 51158,33 35948,33 105022,7 208151,7 141862,7 154008 186597

2.1 75775,67 59365,33 162071,3 139631,3 85502 68735,67 146934,7 190879 27511,33 160308,7 124479,7 162214,3 160979,3

2.2 118095,3 152115,3 196887 188161,3 146299,3 189775,7 78506,67 34054,67 11392,67 21225 69158,33 135961,3 158745,3

2 96935,5 105740,3 179479,2 163896,3 115900,7 129255,7 112720,7 112466,8 19452 90766,83 96819 149087,8 159862,3 3 92228 59499,33 112493 158791,7 182751,3 109313 68636,33 148517,3 28836 161980,7 187894,7 162006,7 178378,3

4 126519,3 102089 121723,3 138957,7 85101,67 125842,3 183967 265775 159409 204730 153574,7 122158,7 124077,7

129

5.1 146586,3 119307,3 120802,7 206217,3 62487 125710 93431 144076,3 210584,7 190150,3 170222 178433,7

5.2 195811,3 128568 171288,7 261801,3 65708,67 145651 110548,3 170474,7 200325,7 202768 200894 187545,3 5 171198,8 123937,7 146045,7 234009,3 64097,83 135680,5 101989,7 157275,5 205455,2 196459,2 185558 182989,5 pERK/ACT 1 2,011528 1,938938 1,133265 0,9841 0,733621 1,264571 1,005252 1,558923 0,742859 0,455591 0,625452 0,535604 0,550293

2 0,187802 0,186868 0,134032 0,140941 0,144515 0,157938 0,105464 0,088752 0,858284 0,19971 0,215106 0,198571 0,193996 3 1,205368 2,106735 1,07313 0,869607 0,651868 1,270401 2,088029 1,11736 3,339021 0,780846 0,829509 0,914547 0,717296

4 0,181756 0,210274 0,160895 0,142055 0,109943 0,094393 0,052495 0,089909 0,027263 0,079521 0,099539 0,108002 0,122727

5 0,291104 0,381883 0,373513 0,600124 0,884177 0,788221 0,393996 0,373765 0,410496 0,390227 0,430803 0,586765 média 0,775512 0,96494 0,574967 0,547365 0,504825 0,696826 0,807892 0,649788 1,068238 0,385233 0,431967 0,437505 0,434215

desvio padrão 0,81319 0,970469 0,491509 0,395859 0,354835 0,659456 0,827967 0,659319 1,310756 0,269248 0,297807 0,317372 0,260581 máximo 2,011528 2,106735 1,133265 0,9841 0,884177 1,270401 2,088029 1,558923 3,339021 0,780846 0,829509 0,914547 0,717296

3º quartil 1,205368 1,938938 1,07313 0,869607 0,733621 1,266028 1,005252 1,11736 0,858284 0,455591 0,625452 0,535604 0,586765

mediana 0,291104 0,381883 0,373513 0,600124 0,651868 0,711254 0,788221 0,393996 0,742859 0,410496 0,390227 0,430803 0,550293

1º quartil 0,187802 0,210274 0,160895 0,142055 0,144515 0,142052 0,105464 0,089909 0,373765 0,19971 0,215106 0,198571 0,193996

mínimo 0,181756 0,186868 0,134032 0,140941 0,109943 0,094393 0,052495 0,088752 0,027263 0,079521 0,099539 0,108002 0,122727

130

Tabela 22. Análise estatística referente à atividade de ERK (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 9 0.465 1,416808 F1 x R1 11 0.754 0,95992 F3 x C3 9 0.465 1,911435 F3 x R3 9 0.465 1,485007 F6 x C6 9 0.806 0,825123 F6 x R6 11 0.754 0,538239 R1 x C1 12 0.917 1,475965 R3 x C3 12 0.917 1,287156 R6 x C6 10 1 1,533006 U1 x P1 11 0.754 0,880521 U3 x P3 12 0.917 0,994821

131

Tabela 23. Valores das razões da atividade de ERK dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 2,044028 2,642968 0,896166 1,021493 2,124969 0,587439 0,850611 1,136581 2 1,332488 1,293075 0,848641 0,748288 0,614139 5,43432 1,005734 1,108815

3 1,386107 3,231845 0,844718 2,401118 1,714091 2,62832 0,853807 1,15644

4 1,279475 1,912573 1,704517 0,369539 0,817782 0,288826 0,736294 0,811061

5 0,485073 0,431908 1,313429 0,445607 0,952861 0,665048

Média 1,305434 1,902474 0,574967 1,170774 1,143318 1,068238 0,879862 0,975589 Desvio padrão 0,553721 1,10109 0,491509 0,770853 0,735225 1,310756 0,104066 0,22354

máximo 2,044028 3,231845 1,133265 2,401118 2,124969 3,339021 1,005734 1,15644 3º quartil 1,386107 2,642968 1,07313 1,313429 1,714091 0,858284 0,952861 1,136581 mediana 1,332488 1,912573 0,373513 1,021493 0,817782 0,742859 0,853807 1,108815 1º quartil 1,279475 1,293075 0,160895 0,748288 0,614139 0,373765 0,850611 0,811061 mínimo 0,485073 0,431908 0,134032 0,369539 0,445607 0,027263 0,736294 0,665048

132

Tabela 24. Análise estatística das razões Trat/Contr para pERK. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 9 0.465 0,686177 F1/C1 x F6/C6 7 0.462 2,27045 F1/C1 x R1/C1 9 0.465 1,115019 F1/C1 x U1/P1 5 0.117 1,483681 F3/C3 x F6/C6 5 0.221 3,308839 F3/C3 x R3/C3 8 0.347 1,663994 F3/C3 x U3/P3 5 0.117 1,950077 F6/C6 x R6/C6 8 1 0,538239 R1/C1 x R3/C3 12 0.917 1,024014 R1/C1 x R6/C6 9 0.806 1,095985 R1/C1 x U1/P1 9 0.465 1,330634 R3/C3 x R6/C6 9 0.806 1,070283 R3/C3 x U3/P3 12 0.917 1,171926 U1/P1 x U3/P3 9 0.465 0,901877

133

Tabela 25. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para FAK. FAK/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de FAK pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 59008,67 32705,33 27015,67 56043,67 143140 18131,67 13938,67 106711,7 12416,67 60461 112163,7 93391,33 102234,7 1 54157,33 39510,67 45792 44522,33 98497 36556,67 11991,67 98070,67 39966,67 66390 76180 110834,7 89638 2 34670 29591,67 47764 51642 21511,67 0 25778,67 26860 25709,67 62286,67 50765 63823,67 50777 3

Actina 89126,33 64901 50934,67 112272,7 115827,3 40687,33 32751 82491 28465 75137 98708 72055,67 62504,67 1 114799 124079,7 160900 175835,7 185102 118527,7 99027,33 196975,3 102270 166966,7 179996 196882,3 180649,7 2 101962,7 94490,33 105917,3 144054,2 150464,7 79607,5 65889,17 139733,2 65367,5 121051,8 139352 134469 121577,2 3

FAK/ACT 0,662079 0,503926 0,530398 0,499175 1,235805 0,445634 0,425595 1,293616 0,436208 0,804677 1,136318 1,2961 1,635633 1 0,471758 0,31843 0,284599 0,253204 0,532123 0,308423 0,121095 0,497883 0,390796 0,397624 0,423232 0,562949 0,496198 2 0,340026 0,313171 0,450955 0,35849 0,142968 0 0,391243 0,192224 0,39331 0,514545 0,364293 0,474635 0,417652 3 0,491288 0,378509 0,421984 0,37029 0,636965 0,251352 0,312644 0,661241 0,406771 0,572282 0,641281 0,777894 0,849828 Média Desvio 0,161912 0,108646 0,125435 0,123409 0,553911 0,228233 0,166774 0,568578 0,025524 0,209578 0,429726 0,450946 0,681659 padrão 0,662079 0,503926 0,530398 0,499175 1,235805 0,445634 0,425595 1,293616 0,436208 0,804677 1,136318 1,2961 1,635633 máximo 0,566918 0,411178 0,490677 0,428832 0,883964 0,377029 0,408419 0,895749 0,414759 0,659611 0,779775 0,929524 1,065915 3º quartil 0,471758 0,31843 0,450955 0,35849 0,532123 0,308423 0,391243 0,497883 0,39331 0,514545 0,423232 0,562949 0,496198 mediana

134

0,405892 0,315801 0,367777 0,305847 0,337546 0,154212 0,256169 0,345053 0,392053 0,456085 0,393762 0,518792 0,456925 1º quartil 0,340026 0,313171 0,284599 0,253204 0,142968 0 0,121095 0,192224 0,390796 0,397624 0,364293 0,474635 0,417652 mínimo

Tabela 26. Análise estatística referente à expressão de FAK (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 3 0.513 1,326766 F1 x R1 2 0.275 1,571396 F3 x C3 3 0.513 0,594238 F3 x R3 4 0.827 0,572423 F6 x C6 2 0.275 1,678855 F6 x R6 3 0.513 1,0374 R1 x C1 4 0.827 0,844323 R3 x C3 4 0.827 1,038111 R6 x C6 3 0.513 1,61833 U1 x P1 3 0.513 0,735681 U3 x P3 3 0.513 0,754601

135

Tabela 27. Valores das razões das expressões de FAK dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 1,326347 0,407772 1,19021 0,852598 1,04678 0,978848 0,620845 0,694727 2 1,863152 0,598414 0,922756 0,478248 0,935654 1,267076 0,706324 0,852949

3 0,948496 2,190496 1,091363 1,344519 1,084087 0,87224

Média 1,379332 1,065561 1,056483 0,807403 1,108984 1,122962 0,803752 0,806639 Desvio padrão 0,459624 0,978875 0,189119 0,309046 0,211411 0,203808 0,246511 0,097397

máximo 1,863152 2,190496 1,19021 1,091363 1,344519 1,267076 1,084087 0,87224

3º quartil 1,59475 1,394455 1,123347 0,97198 1,19565 1,195019 0,895206 0,862595

mediana 1,326347 0,598414 1,056483 0,852598 1,04678 1,122962 0,706324 0,852949 1º quartil 1,137422 0,503093 0,989619 0,665423 0,991217 1,050905 0,663584 0,773838 mínimo 0,948496 0,407772 0,922756 0,478248 0,935654 0,978848 0,620845 0,694727

136

Tabela 28. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão de FAK. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 3 0.513 1,294465 F1/C1 x F6/C6 1 0.248 1,305588 F1/C1 x R1/C1 1 0.127 1,708356 F1/C1 x U1/P1 1 0.127 1,716116 F3/C3 x F6/C6 2 0.564 1,008592 F3/C3 x R3/C3 3 0.513 0,960844 F3/C3 x U3/P3 3 0.513 1,320989 F6/C6 x R6/C6 1 0.439 0,9408 R1/C1 x R3/C3 2 0.275 0,728056 R1/C1 x R6/C6 1 0.248 0,718994 R1/C1 x U1/P1 4 0.827 1,004543 R3/C3 x R6/C6 3 1 0,987553 R3/C3 x U3/P3 0 0.05 1,374822 U1/P1 x U3/P3 4 0.827 0,996421

137

Tabela 29. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para pFAK. pFAK/ACT indica a razão do resultado obtido para a atividade de FAK pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 8650,667 13775 6769 24443,67 31246,67 30006 12081,33 19568 8577,333 28602,33 28086 31441,33 20710,67 1 18309 11415,67 25918,33 31001,67 13273 27154,33 31073 34665 26545,33 52764,33 24598,67 35747,33 58031,33 2 13365,67 16050,33 13575,33 6747,667 10090,33 26697,33 18543,33 29552,67 16604 55553,33 31863,67 36679 47770 3 13761,67 16530 3894 3192 2433,667 7126,667 2718,667 18870 27555,67 76160,67 47880,33 42326,67 50013,67 4 19017,67 17787,33 15216,33 16960,67 8101,333 2846,667 25375,67 26784,67 28556,67 44065,33 20109,67 63203 40129 5

Actina 66257,67 50779,67 95922 150885 187436,3 87574 108456,7 73939,67 115893,7 156261 104129,7 139206,3 166195,3 1 99427 116872,3 190873,7 194365,3 216103,7 92985,67 216694,3 218182,3 72396,67 212840 155671 216481,7 279229 2 82842,33 83826 143397,8 172625,2 201770 90279,83 162575,5 146061 94145,17 184550,5 129900,3 177844 222712,2 3 82842,33 83826 143397,8 172625,2 201770 90279,83 162575,5 146061 94145,17 184550,5 129900,3 177844 222712,2 4 196911 136369 129368,3 255701,7 66693,67 127844,3 178725 84566,33 155536 203014 134189 89238,67 162177,7 5 pFAK/ACT 0,130561 0,27127 0,070568 0,162002 0,166705 0,342636 0,111393 0,264648 0,07401 0,183042 0,269721 0,225861 0,124616 1 0,184145 0,097676 0,135788 0,159502 0,06142 0,292027 0,143396 0,158881 0,366665 0,247906 0,158017 0,165129 0,207827 2 0,161339 0,191472 0,094669 0,039089 0,050009 0,295718 0,11406 0,202331 0,176366 0,30102 0,245293 0,206243 0,214492 3 0,166119 0,197194 0,027155 0,018491 0,012062 0,07894 0,016722 0,129193 0,292693 0,412682 0,368593 0,237999 0,224566 4

138

0,09658 0,130435 0,11762 0,06633 0,121471 0,022267 0,141982 0,31673 0,183602 0,217056 0,149861 0,708247 0,247439 5 0,147749 0,17761 0,08916 0,089083 0,082333 0,206317 0,105511 0,214356 0,218667 0,272341 0,238297 0,308696 0,203788 Média Desvio 0,034498 0,067013 0,04244 0,067595 0,061382 0,144932 0,051857 0,076623 0,113278 0,089646 0,089832 0,22506 0,046734 padrão 0,184145 0,27127 0,135788 0,162002 0,166705 0,342636 0,143396 0,31673 0,366665 0,412682 0,368593 0,708247 0,247439 máximo 0,166119 0,197194 0,11762 0,159502 0,121471 0,295718 0,141982 0,264648 0,292693 0,30102 0,269721 0,237999 0,224566 3º quartil 0,161339 0,191472 0,094669 0,06633 0,06142 0,292027 0,11406 0,202331 0,183602 0,247906 0,245293 0,225861 0,214492 mediana 0,130561 0,130435 0,070568 0,039089 0,050009 0,07894 0,111393 0,158881 0,176366 0,217056 0,158017 0,206243 0,207827 1º quartil 0,09658 0,097676 0,027155 0,018491 0,012062 0,022267 0,016722 0,129193 0,07401 0,183042 0,149861 0,165129 0,124616 mínimo

139

Tabela 30. Análise estatística referente à atividade da FAK (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 5 0.117 1,658557 F1 x R1 6 0.175 1,400322 F3 x C3 3 0.047 2,157202 F3 x R3 9 0.465 0,828571 F6 x C6 8 0.347 0,43215 F6 x R6 3 0.047 0,407743 R1 x C1 12 0.917 1,184411 R3 x C3 2 0.028 2,60352 R6 x C6 12 0.917 1,059859 U1 x P1 10 0.602 0,882232 U3 x P3 9 0.465 1,169337

140

Tabela 31. Valores das razões da atividade de FAK dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 0,805922 1,627241 0,205955 0,687604 1,587519 0,216003 0,810418 2,164413 2 1,1545 1,590313 0,464984 0,89902 2,586811 1,255586 1,50129 0,760329

3 4,127516 3,828745 0,320133 2,917986 4,045885 0,5964 1,459542 1,1436

4 8,983797 16,34894 0,343999 0,904362 10,71108 3,707808 1,733966 1,641354

5 1,456055 1,0738 5,282347 2,140537 2,607455 8,245585 0,306469 0,605649

Média 3,305558 4,893808 1,323484 1,509902 4,307749 2,804276 1,162337 1,263069 Desvio padrão 3,435619 6,490963 2,214982 0,974222 3,685222 3,331536 0,588714 0,643184

máximo 8,983797 16,34894 5,282347 2,917986 10,71108 8,245585 1,733966 2,164413 3º quartil 4,127516 3,828745 0,464984 2,140537 4,045885 3,707808 1,50129 1,641354 mediana 1,456055 1,627241 0,343999 0,904362 2,607455 1,255586 1,459542 1,1436 1º quartil 1,1545 1,590313 0,320133 0,89902 2,586811 0,5964 0,810418 0,760329 mínimo 0,805922 1,0738 0,205955 0,687604 1,587519 0,216003 0,306469 0,605649

141

Tabela 32. Análise estatística das razões Trat/Contr para a atividade de FAK. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 10 0.602 0,675457 F1/C1 x F6/C6 4 0.076 2,497619 F1/C1 x R1/C1 8 0.347 2,189254 F1/C1 x U1/P1 10 0.602 2,84389 F3/C3 x F6/C6 4 0.076 3,697671 F3/C3 x R3/C3 10 0.602 1,136047 F3/C3 x U3/P3 7 0.251 3,874537 F6/C6 x R6/C6 7 0.251 0,471952 R1/C1 x R3/C3 4 0.076 0,350508 R1/C1 x R6/C6 12 0.917 0,538428 R1/C1 x U1/P1 10 0.602 1,299022 R3/C3 x R6/C6 7 0.251 1,536136 R3/C3 x U3/P3 2 0.028 3,410542 U1/P1 x U3/P3 12 0.917 0,920248

142

Tabela 33. Valores brutos obtidos para a leitura de pixels, em escala de cinza, para forma precursora de TGF-β1. TGF/ACT indica a razão do resultado obtido para a expressão de TGF-β1 pelo resultado da expressão de actina para a mesma amostra. Os subitens indicam duplicata.

Amostra F1 F3 F6 C1 C3 C6 R1 R3 R6 U1 U3 P1 P3 1.1 60994,67 24451,33 78082,67 19589,67 53420,33 57079 23398,33 37725,33 0 51149,33 112888 50542,33 40549,67

1.2 79959 37269,67 51901,33 18374,67 58382,67 14820 3519,333 8194,667 3672,667 53169 178416,7 60368,33 67034,67

1 70476,83 30860,5 64992 18982,17 55901,5 35949,5 13458,83 22960 3672,667 52159,17 145652,3 55455,33 53792,17

2 12806,67 8824 19411,67 8605,333 4403,333 7628,667 2078 11883 4692,333 10344 20564,67 11307,67 13864

3.1 56961,33 45449,67 62451,67 4955,667 11371,67 21498,33 68845,33 94990 82468,33 40050,33

3.2 137391,3 80419,33 43160,33 10745 14498,67 87240,33 29540 38006,67 28726,33 181905,7 174117,7 155928,3 187044,3

3 97176,33 62934,5 52806 7850,333 12935,17 87240,33 29540 38006,67 25112,33 125375,5 134553,8 119198,3 113547,3

4.1 85059 71447,67 84215,33 15164,33 27002,33 20814 1709 84059,33 49261,33 59256 114596,3 132132,3 64592,67

4.2 102381 65711,67 84931,67 30558 34485,67 85812 39174,67 73919,67 138978,7 165514,3 133633,3 130831,7 131741

4 93720 68579,67 84573,5 22861,17 30744 53313 20441,83 78989,5 94120 112385,2 124114,8 131482 98166,83

5 122678 134426 100730,3 22540 37737 31171 10224,33 19584 99290 126177,3 205583,3 118485,7

ACTINA

1.1 79541,33 56037,67 76654,33 142540 166011,3 128269,3 140357,3 84197 173135,7 192331,3 100951,7 113287 98607,67

1.2 71827,33 69018,67 66093,33 224308,7 208941 84879,67 134023 102559,3 122119,3 137492,3 83092,67 85123,67 89247

1 75684,33 62528,17 71373,83 183424,3 187476,2 106574,5 137190,2 93378,17 147627,5 164911,8 92022,17 99205,33 93927,33

143

2 118095,3 152115,3 196887 188161,3 146299,3 189775,7 78506,67 34054,67 11392,67 21225 69158,33 135961,3 158745,3

3.1 162378,3 80087 72832 148927 147218,3 92164,33 37633,67 204211 184331,7 140434,3 146650,3

3.2 89739,67 76208 83346 68079,33 29866,33 102936,3 162459,7 167473,7 71858 226863 204252,3 196630,7 222844,7

3 126059 78147,5 78089 108503,2 88542,33 102936,3 162459,7 129819 54745,83 215537 194292 168532,5 184747,5

4.1 114799 124079,7 160900 175835,7 185102 118527,7 99027,33 196975,3 102270 166966,7 179996 196882,3 180649,7

4.2 77917,67 52768,33 124728,7 185484,3 110643,7 100304,7 165695 197989,3 151475,7 167303,3 101203,3 97720,67 124089

4 96358,33 88424 142814,3 180660 147872,8 109416,2 132361,2 197482,3 126872,8 167135 140599,7 147301,5 152369,3

5 100998 76939,33 88277,33 248884,3 107129 190713,7 65528,33 94142,33 142244 111895 113161,3 143780

TGF/ACT

1 0,931194 0,493546 0,910586 0,103488 0,298179 0,337318 0,098103 0,245882 0,024878 0,316285 1,582796 0,558995 0,5727

2 0,108443 0,058009 0,098593 0,045734 0,030098 0,040198 0,026469 0,348939 0,411873 0,48735 0,297356 0,083168 0,087335

3 0,77088 0,80533 0,676228 0,072351 0,14609 0,847517 0,18183 0,292767 0,458708 0,581689 0,692534 0,707272 0,614608

4 0,97262 0,775578 0,592192 0,126542 0,207908 0,48725 0,15444 0,399983 0,741845 0,672421 0,882753 0,892605 0,644269

5 1,214658 1,747169 1,141067 0,090564 0,352258 0,163444 0,156029 0,208025 0,698026 1,12764 1,816728 0,824076

média 0,799559 0,775926 0,683733 0,087736 0,206907 0,428071 0,124857 0,28872 0,369066 0,551154 0,916616 0,811754 0,548598

desvio padrão 0,417746 0,620347 0,390974 0,030671 0,126904 0,335717 0,063257 0,094159 0,270754 0,155277 0,480408 0,636818 0,27511

máximo 1,214658 1,747169 1,141067 0,126542 0,352258 0,847517 0,18183 0,399983 0,741845 0,698026 1,582796 1,816728 0,824076

144

3º quartil 0,97262 0,80533 0,910586 0,103488 0,298179 0,577317 0,163444 0,348939 0,458708 0,672421 1,12764 0,892605 0,644269 mediana 0,931194 0,775578 0,676228 0,090564 0,207908 0,412284 0,15444 0,292767 0,411873 0,581689 0,882753 0,707272 0,614608

1º quartil 0,77088 0,493546 0,592192 0,072351 0,14609 0,263038 0,098103 0,245882 0,208025 0,48735 0,692534 0,558995 0,5727

mínimo 0,108443 0,058009 0,098593 0,045734 0,030098 0,040198 0,026469 0,156029 0,024878 0,316285 0,297356 0,083168 0,087335

Tabela 34. Análise estatística referente à expressão da forma precursora de TGF-β1 (normalizado por actina). Na razão A/B, o numerador se refere ao primeiro grupo indicado na coluna do teste, e o denominador se refere ao segundo grupo da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk >.05. Teste de homogeneidade de Levene >.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1 x C1 1 0.016 9,113251 F1 x R1 3 0.047 6,403787 F3 x C3 4 0.076 3,750125 F3 x R3 5 0.117 2,68747 F6 x C6 5 0.221 1,597243 F6 x R6 6 0.175 1,852605 R1 x C1 7 0.251 1,423103 R3 x C3 8 0.347 1,395411 R6 x C6 8 0.624 0,862161 U1 x P1 8 0.347 0,678967 U3 x P3 7 0.117 1,670835

145

Tabela 35. Valores das razões das expressões da forma precursora de TGF-β1 dos grupos tratados com os respectivos controles (Trat/Contr).

Trat/Contr F1 F3 F6 R1 R3 R6 U1 U3 1 8,998115 1,655198 2,699488 0,947972 0,824611 0,073752 0,56581 2,763745 2 2,371188 1,927318 2,452662 0,578764 11,59338 10,24602 5,859806 3,404784 3 10,65469 5,512551 0,797893 2,513155 2,004013 0,541237 0,82244 1,126789

4 7,68611 3,730381 1,215377 1,220458 1,923841 1,522515 0,753325 1,370163

5 13,41212 4,959918 1,804731 0,442941 0,384222 1,368369

Média 8,624446 3,557073 1,791355 1,413016 3,357758 3,095882 1,677121 2,00677 Desvio padrão 4,097777 1,738903 0,927496 0,760438 4,653689 4,804841 2,344426 1,014229

máximo 13,41212 5,512551 2,699488 2,513155 11,59338 10,24602 5,859806 3,404784

3º quartil 10,65469 4,959918 2,514368 1,804731 2,004013 3,703392 0,82244 2,763745 mediana 8,998115 3,730381 1,834019 1,220458 1,923841 1,031876 0,753325 1,370163 1º quartil 7,68611 1,927318 1,111006 0,947972 0,824611 0,424366 0,56581 1,368369 mínimo 2,371188 1,655198 0,797893 0,578764 0,442941 0,073752 0,384222 1,126789

146

Tabela 36. Análise estatística das razões Trat/Contr para a expressão da forma precursora de TGF-β1. Na razão A/B, o numerador se refere à primeira razão indicada na coluna do teste de Mann-Whitney, e o denominador se refere à segunda razão da mesma coluna. Testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk <.05.

Teste de Mann-Whitney Valor de U Valor de p A/B F1/C1 x F3/C3 3 0.047 2,424591 F1/C1 x F6/C6 2 0.05 4,814482 F1/C1 x R1/C1 1 0.016 6,103572 F1/C1 x U1/P1 1 0.016 5,142413 F3/C3 x F6/C6 4 0.142 1,985689 F3/C3 x R3/C3 8 0.347 1,05936 F3/C3 x U3/P3 4 0.076 1,772536 F6/C6 x R6/C6 6 0.564 0,578625 R1/C1 x R3/C3 11 0.754 0,420821 R1/C1 x R6/C6 8 0.624 0,456418 R1/C1 x U1/P1 7 0.251 0,842525 R3/C3 x R6/C6 7 0.462 1,084588 R3/C3 x U3/P3 11 0.754 1,673215 U1/P1 x U3/P3 5 0.117 0,835731

147

ANEXOS

148