UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES
THESE
pour l’obtention du diplôme de Doctorat en Sciences de la vie
Spécialité : Physiologie végétale
Biologie et diversité génétique de Centella asiatica (L.) Urban de Madagascar
Présentée par RAKOTONDRALAMBO RAOSETA Soaharin’ny Ony
Soutenu e publiquement le 27 Septembre 2013
devant le jury composé de :
Président : Pr. Bakolimalala RAKOUTH Directeur de thèse : Pr. RAMAVOVOLOLONA Co-directeur s de thèse : Dr. Eliane RALAMBOFETRA : Dr. Franc-Christophe BAURENS Rapporteur interne : Pr. Alice ANDRIANJAKA Rapporteur externe : Pr Samuel RAZANAKA Examinateur : Pr. Doll Danielle A. RAKOTO Membre invité : Dr. Pascal DANTHU
Remerciements
Cette thèse a été réalisée dans le cadre du projet URP (Unité de Recherche en Partenariat) « Forêts et Biodiversité » qui associe l’Université d’Antananarivo, le CIRAD et le FOFIFA. Sa concrétisation a été possible grâce : - aux bourses d’étude octroyées par le CIRAD et le Gouvernement Français; - à l’appui financier du Ministère Français des Affaires Etrangères (FSP/FORMA, PARRUR), de l’Union Européenne (FOREAIM) et du groupe Yves Rocher, - à l’accueil du Grand Plateau Technique Régional de Montpellier-Languedoc Roussillon pour la réalisation du génotypage des microsatellites. Que tous en soient ici très sincèrement remerciés.
Mes vifs remerciements vont : - au Professeur Rakouth Bakolimalala qui nous a fait honneur de diriger et de présider cette thèse malgré ses obligations. Vous avez également accordez un temps précieux dans la lecture et la correction de ce manuscrit. Merci Madame Rakouth ! - au Professeur Ramavovololona, mon directeur de thèse, qui a accepté d’apporter son aide plus que précieuse et sa bienveillance dans l’élaboration de cette thèse. Vous avez toujours su faire preuve de disponibilité à mon égard et m’avez toujours encouragé. Merci Madame Ramavovololona ! - au Docteur Eliane Ralambofetra qui a bien voulu assurer mon encadrement et qui s’est dévouée pour l’amélioration de la forme et du contenu de ce manuscrit. Je tiens à vous témoigner ici ma grande reconnaissance pour votre rigueur, votre disponibilité, vos conseils, votre patience et vos encouragements. Merci Madame Ralambofetra ! - au Professeur Andrianjaka Alice et au Professeur Razanaka Samuel, mes rapporteurs, qui ont accepté d’apporter leurs critiques et leurs appréciations pour la validation de cette thèse et ceci malgré leurs lourdes responsabilités. Madame Alice et Monsieur Razanaka, je vous suis très reconnaissante ! - au Professeur Rakoto Doll, mon examinateur, qui a accepté de faire partie de ce jury et m’a fait l’honneur de prendre en considération mon travail, de le corriger et d’en juger la qualité. Merci Madame Doll ! - au Docteur Franc-Christophe Baurens pour son encadrement effectué de main de maître, pour son attention, pour sa patience et pour sa spontanéité. Ton enseignement et tes conseils m’ont aidés, m’aident et m’aideront toujours à aller de l’avant et à atteindre mes objectifs. Merci Coach !
I
- au Docteur Pascal Danthu qui a bien voulu m’accueillir au CIRAD et qui a intégré cette thèse dans les objectifs de l’URP. Je vous adresse également un grand merci pour toutes les aides financières et matérielles. Merci Monsieur Danthu ! - au Docteur Jean Louis Noyer, l’initiateur de cette thèse. Malgré ses lourdes charges professionnelles, il n’a jamais cessé de montrer son attention et d’apporter son soutien pour la bonne réalisation et la finalisation de ce travail. Merci JL ! - au Docteur Maguy Rodier-Goud qui a accepté de m’encadrer pour les études cytogénétiques. Ta gentillesse, ta simplicité et ton humour m’ont donnés non seulement du punch pour l’accomplissement de mon travail mais m’ont également encouragés à supporter ces longs mois loin de ma famille. Thank you Maguy ! - au Docteur Jean Michel Leong Pock Tsy, responsable du Laboratoire de Biologie Moléculaire à Ambatobe, pour sa disponibilité, ses recommandations, ses conseils et son appui qui m’ont accompagnés depuis le début de ma thèse. JM ! reçois ici toutes mes reconnaissances ! - au Docteur Noronirina Rakotoarisoa, qui s’est occupée des modalités administratives indispensables pour mener à terme la soutenance de cette thèse. Merci Madame Noro ! Je tiens à adresser également mes remerciements à Indena S.A. Italy et à Dulieu du Zimbabwe qui nous ont fourni les échantillons de Centella asiatica provenant de l’Asie et de l’Afrique. Un grand merci aussi à : - toute l’équipe du CIRAD Forêt Antananarivo, en particulier : *Voninavoko Rahajaniriana, mon extraordinaire binôme et Miarantsoa Rakotobe Raoelina, ma charmante copine. Misaotra Voni sy Mi a ! *Wilfred Ramahafaly, Emilson Rakotoarisoa et Lucien Rasoanaivo, les chasseurs de Centella. Misaotra an’i Wil, Son sy Lulu an ! *Ghislain Vieilledent pour m’avoir dirigé dans mes analyses statistiques. Merci Ghislain ! - tous les membres de l’équipe et tous les thésards de l’UMR DAP (Développement et Amélioration des Plantes) du CIRAD Montpellier que j’ai sollicité à un moment ou a un autre au cours de ce travail et parmi eux Gerald Oliver, Ronan Rivallan, Alexandra Lusssert, Fabien De Bellis, Jean François Rami, Claire Billot, Xavier Perrier, Ange Marie Risterrucci, Mouna Jridi et Khin Myo Mint.
II
- Aina et Rina Rakotondralambo pour leur amitié et leur aide plus que précieuse. Mankasitraka e ! Je remercie de tout cœur toutes les familles et les personnes qui m’ont offert leur amitiés et leurs soutiens et avec qui j’ai passé des moments inoubliables : Les Baurens, Les Plumain, Les Spiral, Les Andriamaneho, Les Razanamazava de Lyon, Les Rabenirina, Jacques Etienne, Nathalie Razafimahandry et Ignace Rakotoarivony. Je tiens également à exprimer ma gratitude envers trois grandes familles : Les Rakotondralambo, Les Razafimahandry et Les Razanamazava. Leur confiance et leur soutien m’ont été d’un énorme encouragement. Merci particulièrement à Rakotondralambo Solofoniaina et Vololomanitra, à Rakotondralambo Andriatahiana et Voahangy, à Rakotondralambo Andrianaina et Lala, à Rakotofiringa Sylvère et Chantal les personnes que j’admire. Je voudrais également, par cette thèse, rendre hommage à feue Rasoanjanahary Christiane Colombe , ma confidente qui avait toujours cru en moi et m’avait toujours poussé à aller loin dans mes études. Merci Tati Co ! Je n’oublierai pas de remercier Tahiana, Mamin’ny Aina, Antso, Merindahy, Koto, Fanihy et Mirana, mes frères et sœurs qui ont embelli ces années de thèse par leurs amours, leurs humours et leurs emmerdements. Misaotra zalahy ô ! Je remercie spécialement Monique Razanamazava pour son amour, sa grande confiance et son aide illimitée. Merci Bébé Mo !
Rakoto Andry ! Merci du fond du cœur d’avoir eu confiance en ma capacité, d’avoir été patient et d’avoir été toujours là, même dans les pires moments. Merci Koutou ! Rakoto Ralambo Andrian’ny Soa ! Je tiens à te présenter ici mes sincères excuses pour mes absences perpétuelles. Je tiens à te remercier énormément pour ton courage, pour ta patience et pour la force que tu me procures chaque jour. Merci Loulou !
« Ny fianarana no lova tsara indrindra apetrakay ho anao » disaient-ils. Ainsi, avec tout mon amour et ma gratitude, je dédie ce mémoire à Rakotondralambo Mamy et Razafimahandry Mamiharinoro, mes racines, mes modèles, …, mes parents .
Misaotra Dada sy Mama !
III
LISTE DES ABREVIATIONS
ACP : Analyse en Composantes Principales ADN : Acide desoxyribonucléique ADNr : Acide désoxyribonucléique ribosomal AFTD : Analyse Factorielle sur Tableau de Distance ANOVA : Analyse Of Variance BSA : Bovine Serum Albumin (albumine sérique bovine) BET : Bromure d'Ethydium CIRAD : Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement CTAB : Cetyl Trimethylammonium Bromide DAPI : Diamidino-2-Phényl-Indole dNTP : Désoxyribonucléotide Triphosphate EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique EMBL : The European Molecular Biology Laboratory FISH : Fluorescence In Situ Hybridization FOFIFA : FOibe FIkarohana ampiharina amin'ny Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra ou Centre National de la Recherche Appliquée au Développement Rural IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées Kb : Kilobase min : Minute pb : Paire de bases PCR : Polymerase Chain Reaction PEG : Polyethylene Glycol RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SDS : Sodium dodecyl sulfate Sec : Seconde SSC : Sodium citrate, sodium chloride SSPE : Sodium chloride, sodium phosphate monobasic, EDTA SSR : Simple Sequence Repeat
IV
TBE : Tris Base, Acide Borique, Acide Ethylene Diaminetetracetique TE : 10mM Tris, 1mM EDTA UMR DAP : Unité Mixte de Recherche - Développement et Amélioration des Plantes URP : Unité de Recherche en Partenariat WGD : Whole Genome Duplication
V
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Liste des couples d’amorces chloroplastiques avec leurs séquences et leurs températures d’hybridation (Th) ...... 39 Tableau 2 : Listes des enzymes de restrictions avec leurs caractéristiques ...... 39 Tableau 3 : Calendrier de suivi du développement des individus de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et de Morondava (MORO) ...... 52 Tableau 4 : Taux de germination des plantes de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et de Morondava (MORO) après 4 mois de semis ...... 53 Tableau 5 : Nombres de chromosomes des individus de Centella asiatica ...... 55 Tableau 6 : Nombre de chromosomes et nombre de sites ADNr 45S et ADNr 5S sur les chromosomes de Centella asiatica suite à une hybridation in-situ en fluorescence ...... 56 Tableau 7 : Densités et tailles des stomates des feuilles des individus de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et d’Ambohitromby I (AMBR_I) ...... 59 Tableau 8 : Tableau de variance de la densité de stomates des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I (AMBR I) et de Vohimana (VOHI_réf) ...... 59 Tableau 9 : Tableau de variance de la taille de stomates des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I (AMBR I) et de Vohimana (VOHI_réf) ...... 59 Tableau 10 : Coefficients de corrélation des huit paramètres étudiés sur la feuille de Centella asiatica ...... 60 Tableau 11 : Tableau de variance de la taille des feuilles des individus de Centella asiatica 63 Tableau 12 : Tableau de variance de la forme des feuilles des individus de Centella asiatica ...... 64 Tableau 13 : Les mutations au niveau des longueurs de fragments de restriction des individus de Centella asiatica, en utilisant comme référence l’haplotype du clone de référence VOHI_réf...... 66 Tableau 14 : Caractérisations des 20 marqueurs microsatellites de Centella asiatica ...... 69 Tableau 15 : Caractéristiques des 20 marqueurs microsatellites de Centella asiatica ...... 72 Tableau 16 : Pourcentage des allèles communs et des allèles spécifiques des individus de Centella asiatica sur les 20 marqueurs microsatellites ...... 74
Tableau 17 : Hétérozygoties observées (Ho) et hétérozygoties calculées ( He) des individus de Centella asiatica à deux allèles ...... 75
VI
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Carte de répartition mondiale de Centella asiatica d’après Encyclopedia of life ..... 7 Figure 2 : Structure chimique des principes actifs majeurs de Centella asiatica ...... 11 Figure 3 : Répartition géographique des sites de récolte de Centella asiatica à Madagascar. Chaque site de collecte est associé à un numéro dont les correspondances et les caractéristiques sont détaillées en annexe 1...... 21 Figure 4 : Répartition géographique des sites de récolte étrangers, sur la carte de répartition mondiale de Centella asiatica selon Encyclopedia of life. Ethiopie (A), Congo (B), Tanzanie (C), Zimbabwe (D), Afrique du Sud (E), Mayotte (F), La Réunion (G), Chine (H), Inde (I), Vientiane (J) , Binh Chanh (K), Cambodge (L), Malaisie (M) ...... 22 Figure 5 : Mesures réalisées sur la feuille de Centella asiatica ...... 33 Figure 6 : Dessin de fleur de Centella asiatica ...... 50 Figure 7 : Dessin d’une coupe longitudinale d’ovaire de Centella asiatica ...... 51 Figure 8 : Dessin de chromosomes avec les sites ADNr 5S (en vert) et les sites ADNr 45S (en rouge)...... 57 Figure 9 : Dessin de stomates des épidermes inférieurs des feuilles de Centella asiatica ...... 58 Figure 10 : Cercle de corrélation des huit paramètres mesurés sur la feuille de Centella asiatica , dans le plan 1-2 ...... 61 Figure 11 : Répartition des individus de Centella asiatica à feuilles réniformes (Groupe A) et à feuilles orbiculaires (Groupe B) et des individus de Centella uniflora sur le plan 1-2, suivant leurs barycentres ...... 62 Figure 12 : Type de distribution par taille d’allèles présents dans l’ensemble des échantillons de Centella asiatica . mCaCIR002 : type multimodal, mCaCIR022 : type bimodal, mCaCIR007 : type non défini ...... 71 Figure 13 : Analyse factorielle des correspondances de l’ensemble des individus de Centella asiatica et de Centella uniflora à partir de 20 marqueurs microsatellites. Projection des individus sur le premier plan (1, 2)...... 77 Figure 14 : Analyse factorielle des correspondances des individus de Centella asiatica présentant, plus de deux allèles, à partir de 20 marqueurs microsatellites. Projection des individus sur le premier plan (1, 2) mettant en évidence la différenciation des individus des régions d’Alaotra Mangoro et d’Analamanga dans le sous-groupe 1 et le reste des individus dans le sous-groupe 2...... 79
VII
Figure 15 : Analyse factorielle des correspondances de l’ensemble des individus de Centella asiatica et de Centella uniflora à partir de 20 marqueurs microsatellites. Projection des individus sur le premier plan (1, 3). Groupe A : individus tétraploïdes. Groupe B: individus diploïdes. Groupe C : individus provenant de la Montagne d’Ambre, de Tanzanie et de Zimbabwe. Groupe D : individus provenant d’Antalaha et d’Ambanja groupés avec les individus de La Réunion et des sites asiatiques...... 80 Figure 16 : Arbre de consensus obtenu de l’ensemble des individus de Centella asiatica et de Centella uniflora à l’aide du logiciel DARwin à partir de l’estimateur de distance génétique de Dice. Groupe A : individus tétraploïdes. Groupe B: individus diploïdes. ... 82 Figure 17 : Arbre de consensus obtenu des individus diploïdes de Centella asiatica et des individus étrangers, à l’aide du logiciel DARwin à partir de l’estimateur de distance génétique de Dice ...... 83 Figure 18 : Arbre de consensus obtenu des individus tétraploïdes de Centella asiatica à l’aide du logiciel DARwin à partir de l’estimateur de distance génétique de Dice ...... 84 Figure 19 : Répartition du complexe polyploïde de Centella asiatica à Madagascar, représentée sur la carte phytogéographique établie par Humbert (1955) ...... 99 Figure 20 : Localisation des zones de collecte potentielles de Centella asiatica par rapport à la région de collecte actuelle. Correspondances des points sur la carte : 8 : Marotandrano, 17 : Ampatakamaroreny, 42 : Hazomay, 51 : Analavory, 60 : Antsirabe, 63 : Marolambo, 69 : Maroharatra, 72 : Fianarantsoa...... 105
VIII
LISTE DES PHOTOS Photo 1 : Centella asiatica ...... 8 Photo 2 : Groupe d’inflorescence sur un individu de Centella asiatica ...... 9 Photo 3 : Fleur de Centella asiatica ...... 9 Photo 4 : Deux fruits de Centella asiatica ...... 9 Photo 5 : Clone de Centella asiatica issus d’une multiplication végétative par stolons ...... 10 Photo 6 : Plantules de Centella asiatica obtenues à partir de la germination de graines ...... 10 Photo 7 : Teinture mère cicatrisante (HOMEOPHARMA) ...... 14 Photo 8 : Infusette pour les maux d’estomac et de foie (HOMEOPHARMA) ...... 14 Photo 9 : Boisson fortifiante et stimulante (HOMEOPHARMA) ...... 14 Photo 10 : Poudre à préparer en décoction pour les ulcères d’estomac et les ...... 14 Photo 11 : Pommade cicatrisante (MASY) ...... 14 Photo 12 : Solution hydratante (YVES ROCHER) ...... 14 Photo 13 : Madécassol : Crème pour le traitement local d'appoint des ulcérations ...... 14 Photo 14 : Baume expert fermeté pour raffermir la peau (YVES ROCHER) ...... 14 Photo 15 : Capsules tonifiantes (FITOTABLET - ELADIET) ...... 14 Photo 16 : Centella uniflora provenant de Krisiasy ...... 32 Photo 17 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant d'Ambohitromby I ...…...….50 Photo 18 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant de Mahajanga ..………...... 50 Photo 19 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant de Morondava .…………....50 Photo 20 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant de Sahoany ..…………...... 50 Photo 21 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant d'Ambohitromby II ..…...... 50 Photo 22 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant du Cap Saint André .…...... 50 Photo 23 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant de Vangaindrano .……...... 50 Photo 24 : Fleurs des individus de Centella asiatica provenant de Vohimana …...…...….....50 Photo 25 : Coupe longitudinale de Centella asiatica provenant du Cap Saint André ...…….51 Photo 26 : Coupe longitudinale de Centella asiatica provenant de Morondava .……...…….51 Photo 27 : Coupe longitudinale de Centella asiatica provenant de Vohimana…………...….51 Photo 28 : Coupe longitudinale de Centella asiatica provenant de Mahajanga .………...... 51 Photo 29 : Semis de Centella asiatica provenant de Vohimana (clone de référence) 5 mois après les semailles…………………………….………………………………………...... ….54
IX
Photo 30 : Semis de Centella asiatica provenant de Morondava 5 mois après les semailles …...………………..…………………………………………………………………….….…54 Photo 31 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant d'Ambohitromby I………………………………………………………....………57 Photo 32 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant de Mahajanga……………………………………….…………………...………...57 Photo 33 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant de Sahoany…………………………………………………………………...……57 Photo 34 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant d'Ambohitromby II…………………………………………………..……………57 Photo 35 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant du Cap Saint André…..……………………………………………………………57 Photo 36 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant de Vangaindrano……..……………………………………………………………57 Photo 37 : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica provenant de Vohimana……..…..……………………………………………………………57 Photo 38 : Stomates des épidermes inférieurs des feuilles de Centella asiatica provenant de Vohimana …………….……..…..……………………………………………………………58 Photo 39 : Stomates des épidermes inférieurs des feuilles de Centella asiatica provenant d'Ambohitromby I…….……..…..……………………………………………………………58 Photo 40 : Feuilles orbiculaires de Centella asiatica d’Ambohitromby I …….……..………64 Photo 41 : Feuilles orbiculaires de Centella asiatica de Mahajanga …………...………...…64 Photo 42 : Feuilles orbiculaires de Centella asiatica de Morondava …….……...………..…64 Photo 43 : Feuilles réniformes de Centella asiatica du Cap Saint André …….……..………64 Photo 44 : Feuilles réniformes de Centella asiatica de Toamasina …….……...………....…64 Photo 45 : Feuilles réniformes de Centella asiatica de Sambava …….……...…………...…64 Photo 46 : Feuilles réniformes de Centella asiatica de Vohimana …….……...………….…64 Photo 47 : Feuilles de Centella uniflora …….……...…………………………………..……64
X
LISTE DES PLANCHES Planche I : Groupe d’inflorescence sur un individu de Centella asiatica .Fleur de Centella asiatica. Deux fruits de Centella asiatica ...... 9 Planche II : Clone de Centella asiatica issus d’une multiplication végétative par stolons et plantules de Centella asiatica obtenues à partir de la germination des graines ...... 10 Planche III : Quelques produits pharmaceutiques, dermatologiques et cosmétiques à base de Centella asiatica vue sur le marché international ...... 14 Planche IV : Photos des fleurs des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I, de Mahajanga, de Morondava, de Sahoany, d’Ambohitromby II, du Cap Saint André de Vangaindrano et de Vohimana (clone de référence) ...... 50 Planche V : Coupes longitudinales d’ovaires des fleurs de Centella asiatica provenant du Cap Saint André, de Morondava, de Vohimana (clone de référence) et de Mahajanga ...... 51 Planche VI : Semis de Centella asiatica provenant de Vohimana (clone de référence) et de Morondava, 5 mois après les semailles...... 54 Planche VII : Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica colorés au DAPI (bleu) après une hybridation in-situ en fluorescence des sites ADNr 5S (en vert) et des sites ADNr 45S (en rouge). Cellules des accessions à 2n=18 chromosomes provenant d’Ambohitromby I ou AMBR I, de Mahajanga ou MAJG, de Sahoany ou SAHO. Cellules des accessions à 2n=36 chromosomes provenant d’Ambohitromby II, du Cap Saint André ou CAPA, de Vangaindrano et de Vohimana, le clone de référence ou VOHI_réf ...... 57 Planche VIII : Stomates des épidermes inférieures des feuilles de Centella asiatica provenant de Vohimana ou VOHI_réf et d’Ambohitromby I ou AMBR I ...... 58 Planche IX : Différentes formes de feuilles de Centella présentes à Madagascar. Feuilles de Centella asiatica orbiculaires d’Ambohitromby I, de Mahajanga et de Morondava. Feuilles de Centella asiatica réniformes du Cap Saint André, de Toamasina, de Sambava et de Vohimana. Feuille de Centella uniflora ...... 64
XI
LISTE DES ANNEXES
Annexe 1 : Liste des sites d’échantillonnage de Centella asiatica à Madagascar, associés à leurs codes respectifs, à leurs régions et à leurs provinces d’appartenance, à leurs coordonnées géographiques, à leurs numéros de correspondance sur la carte de répartition et aux numéros de leurs extraits d’ADN ...... i Annexe 2 : Liste des sites d’échantillonnage de Centella asiatica en Afrique, aux Comores, à La Réunion et en Asie, associés à leurs codes respectifs, à leurs numéros de correspondance sur la carte de répartition et aux numéros de leurs extraits d’ADN ...... vi Annexe 3 : Principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction) (Tagu, 1999) ...... vii Annexe 4 : Principe de la RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Tagu, 1999) ...... viii Annexe 5 : Construction d’une banque génomique (Tagu, 1999) ...... ix Annexe 6 : Principe du clonage moléculaire (Tagu, 1999) ...... x Annexe 7 : Mécanisme fonctionnel d’un génotypage ...... xi Annexe 8 : Exemple de chromatogrammes révélé par GeneMapper suite à un génotypage. Chaque couleur représente le chromatogramme d’un individu pour un marqueur microsatellite ...... xii Annexe 9 : Profils de restriction ou haplotypes du génome chloroplastique des individus de Centella asiatica diploïdes et tétraploïde soumis à la combinaison amorce-enzyme de restriction FV/TaqI ...... xiii
XII
GLOSSAIRE
ADN : une hélice en double brin constituée de nucléotides (base azotée, sucre = désoxyribose et phosphate) liés les uns aux autres par des liaisons phosphodiester. Les deux chaînes nucléotidiques sont maintenues ensemble par des liaisons faibles entre les bases, appelées liaisons hydrogènes. C’est la substance fondamentale dont sont composés les gènes.
Allèle : l’une des différentes formes d’un gène qui peuvent exister au niveau d’un même locus entre les chromosomes homologues
Allogamie : croisement entre deux gamètes issus de deux individus différents
Autogamie : croisement entre deux gamètes issus du même individu.
Chromosomes : structure cellulaire retrouvé dans le noyau et représentant le support physique des gènes et de l’information génétique. Ils sont constitués d’ADN
Diploïde : un organisme possédant deux jeux de chromosomes dans chacune de ses cellules.
Fragment de restriction : polynucléotide produit à partir de la digestion d'un ADN par une enzyme de restriction.
Gène : unité fonctionnelle et physique élémentaire de l’hérédité. C’est un segment d'ADN (ou d'ARN chez virus), situé à un locus précis sur un chromosome, qui comprend la séquence codant pour une protéine, et les séquences qui en permettent et régulent l'expression.
Génome chloroplastique : ensemble du matériel génétique extranucléaire retrouvé dans les chloroplastes.
Génome chloroplastique : ensemble du matériel génétique présent dans le noyau d'une cellule
Génotypage : discipline qui vise à déterminer l’origine d’une variation génétique, à une position spécifique sur le génome pour un individu ou un groupe d’individus donnés.
Génotype : ensemble des caractères génétiques d'un individu.
Haplotype : allèle localisé à un locus d’ADN haploïde comme l’ADN chloroplastique
Hétérozygote : individu diploïde qui possède deux versions ou allèles différents pour le même gène
Locus : endroit spécifique d’un chromosome au niveau duquel est situé un gène.
Marqueur génétique : facteur génétique pouvant être identifié et servir à reconnaître des gènes ou des caractères localisés mais difficilement identifiables.
XIII
Métaphase : étape de la mitose durant laquelle les deux chromatides symétrique du chromosome sont enroulés l'une autour de l'autre. A cette étape, les chromosomes sont bien éparpillés sur les fibres chromatiques et sont bien visibles au microscope
Microsatellite : séquence d’ADN répétée en tandem dont l’unité de répétition est comprise entre 1 à 6 pb
PCR : réaction de polymérisation en chaîne. Technique d'amplification enzymatique (utilisant la Taq polymérase) in vitro d'un fragment d'ADN à partir d'amorces nucléotidiques spécifiques, permettant d'obtenir un très grand nombre de copies de ce fragment.
PCR-RFLP : technique de marquage moléculaire utilisant les enzymes de restriction pour hydrolyser un fragment d'ADN amplifié afin de révéler un polymorphisme de séquence.
Phénotype : tous caractères visibles d'un individu
Protoplaste : cellule végétale dépourvue de sa paroi pecto-cellulosique
Random priming : hybridation au hasard
Télomère : extrémité d’un chromosome.
Tétraploïde : un organisme possédant quatre jeux de chromosomes dans chacune de ses cellules.
XIV
TABLE DES MATIERES
REMERCIEMENTS …………………………………………………………………..……..I
LISTE DES ABBREVIATIONS ……………………………………………….………....IV
LISTE DES TABLEAUX ………………………………………..………………………...VI
LISTE DES FIGURES …………………………...…………………………...…………..VII
LISTE DES PHOTOS ……………………..………………...…………………...………..IX
LISTE DES PLANCHES ……………...…..……………………...……………...………..XI
LISTE DES ANNEXES ……………………..…….………………..………...…………..XII
GLOSSAIRE …………………………………………………...…...……………….…...XIII
TABLE DES MATIERES……..………………….…………………………………...... XV
INTRODUCTION ...... 1
GENERALITES ...... 5
I. TAXONOMIE ...... 6
II. ORIGINE ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE ...... 6
III. MORPHOLOGIE ...... 8 III.1. Appareil végétatif ...... 8 III.2. Appareil reproducteur ...... 9
IV. MODE DE REPRODUCTION ...... 9
V. CYTOLOGIE ...... 10
VI. PHYTOCHIMIE ...... 10 VI.1. Substances actives de Centella asiatica ...... 10 VI.2. Variation de la teneur en principes actifs de Centella asiatica ...... 11
VII. UTILISATIONS ...... 12 VII.1. Utilisations traditionnelles ...... 12
VII.2. Utilisations industrielles ...... 13
XV
VIII. POSITION ECONOMIQUE A MADAGASCAR ...... 15 VIII.1. Zones et périodes de récoltes de feuilles ...... 15 VIII.2. Taux et prix d’exportation ...... 15
IX. DIVERSITE GENETIQUE ...... 16 IX.1. Rappel sur la diversité génétique des plantes ...... 16 IX.1.1. Génomes des végétaux ...... 16 IX.1.1.1. Génome chloroplastique ...... 16 IX.1.1.2. Génome nucléaire ...... 16 IX.1.2. Techniques de marquage moléculaire utilisées pour une étude de diversité génétique de plantes ...... 17 IX.1.2.1. Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction (RFLP-PCR)...... 17 IX.1.2.2. Simple Sequence Repeat (SSR) ...... 17 IX.2. Diversité génétique de Centella asiatica à Madagascar ...... 18
MATERIELS ET METHODES ...... 19
I. MATERIEL VEGETAL ...... 20 I.1. Materiel végétal provenant de Madagascar ...... 20 I.2. Matériel végétal provenant d’autres pays ...... 20 I.3. Mise en place d’une collection d’herbiers ...... 22
II. METHODES ...... 23 II.1. Caractérisation de la biologie de Centella asiatica de Madagascar ...... 23 II.1.1. Etude morphologique des fleurs ...... 24 II.1.2. Etude de la reproduction sexuée ...... 24 II.1.2.1. Test de fécondation ...... 24 II.1.2.2. Germination des graines ...... 25 II.1.3. Etude chromosomique ...... 25 II.1.3.1. Etalement des chromosomes ...... 25 a. Prélèvements racinaires ...... 26 b. Traitement des racines ...... 26 c. Digestion des pointes racinaires ...... 26 d. Etalement des chromosomes ...... 27 II.1.3.2. Comptage chromosomique ...... 27
XVI
II.1.3.3. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) ...... 28 a. Prétraitement des préparations chromosomiques ...... 28 b. Dénaturation de l’ADN chromosomique ...... 29 c. Préparation et dénaturation des sondes ...... 29 c.1. Préparation des sondes ...... 29 c.2. Préparation de la solution d’hybridation ...... 29 c.3. Dénaturation des sondes ...... 30 d. Hybridation ...... 30 e. Lavages ...... 30 f. Contre-coloration ...... 30 g. Observations...... 30 II.1.4. Etude des stomates ...... 31 II.2. Diversité de Centella asiatica de Madagascar ...... 31 II.2.1. Etude de la diversité morphologique ...... 32 II.2.1.1. L’Analyse en Composantes Principales (ACP) ...... 33 a. Présentation de la technique ...... 33 b. Analyse et interprétation des résultats ...... 33 b.1. Inertie des axes ...... 34 b.2. Corrélation entre les axes et les variables...... 34 b.3. Corrélation entre les individus ...... 34 II.2.1.2. Analyse de variance (ANOVA) ...... 34 a. Présentation de la technique ...... 34 b. Analyse et interprétation des résultats ...... 35 II.2.2. Etude de la diversité génétique ...... 35 II.2.2.1. Extraction d’ADN ...... 36 II.2.2.2. Etude du génome chloroplastique ...... 36 a. Principe de la technique RFLP-PCR ...... 36 b. Etapes de la manipulation ...... 37 b.1. Amplification ...... 37 b.2. Restriction enzymatique ...... 37 b.3. Séparation des fragments et révélation sur gel acrylamide ...... 38 c. Analyse de la diversité du génome chloroplastique ...... 38
XVII
II.2.2.3. Etude du génome nucléaire ...... 40 a. Principe de la technique SSR ...... 40 b. Etapes de la manipulation ...... 40 b.1. Construction et caractérisation de banque microsatellite ...... 40 b.1.1. Extraction d’ADN ...... 41 b.1.2. Digestion enzymatique ...... 41 b.1.3. Ligation et amplification par PCR ...... 41 b.1.4. Capture des fragments contenant un microsatellite ...... 42 b.1.5. Amplification des fragments capturés ...... 42 b.1.6. Clonage ...... 42 b.1.7. Hybridation ...... 43 b.1.8. Autoradiographie ...... 43 b.1.9. Repérage des clones positifs ...... 43 b.2. Séquençage ...... 44 b.3. Synthèse des amorces ...... 44 b.4. Génotypage ...... 44 c. Analyse de la structure du génome nucléaire ...... 46 c.1. Caractérisation des marqueurs microsatellites ...... 46 c.2. Caractérisation des allèles produits ...... 46 c.3. Indices de génétique des populations ...... 46 d. Analyse de la diversité du génome nucléaire ...... 47
RESULTATS ...... 48
I. CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES DE CENTELLA ASIATICA DE MADAGASCAR ...... 49 I.1. Morphologie des fleurs ...... 49 I.2. Reproduction sexuée ...... 49 I.2.1. Développement des plantes ...... 52 I.2.2. Fertilité des graines ...... 52 I.3. Cytogénétique ...... 54 I.3.1. Nombre de chromosomes ...... 54 I.3.2. Localisation et nombre de sites ADNr ...... 55 I.4. Densité et taille des stomates ...... 58
XVIII
II. DIVERSITE DE CENTELLA ASIATICA DE MADAGASCAR ...... 60 II.1. Diversité morphologique des feuilles ...... 60 II.2. Diversité génétique ...... 65 II.2.1. Extrait d’ADN ...... 65 II.2.2. Génome chloroplastique ...... 65 II.2.2.1. Structure du génome chloroplastique ...... 65 II.2.2.2. Diversité au niveau du génome chloroplastique ...... 66 II.2.3. Génome nucléaire ...... 67 II.2.3.1. Microsatellites de Centella asiatica ...... 67 a. Banque enrichie en locus microsatellites ...... 67 b. Séquences microsatellites ...... 67 c. Les marqueurs microsatellites ...... 68 II.2.3.1. Structure du génome nucléaire ...... 70 a. Caractéristiques des marqueurs microsatellites ...... 70 b. Caractéristiques des allèles produits ...... 72 c. Indices de génétique des populations ...... 75 II.2.3.2. Diversité au niveau du génome nucléaire ...... 76 a. Représentation graphique de la diversité génétique ...... 76 b. Représentation arborée de Neighbor-Joining ...... 81
DISCUSSIONS ...... 85
I. DIVERSITE DE CENTELLA ASIATICA A MADAGASCAR ...... 86 I.1. Diversité génétique ...... 86 I.1.1. Variations au niveau du génome chloroplastique ...... 86 I.1.2. Variation au niveau du génome nucléaire ...... 88 I.1.2.1. Nombre de chromosomes différents ...... 88 I.1.2.2. Niveau de ploïdie différent ...... 88 I.1.2.3. Variations microsatellites ...... 90 a. Diversité des populations diploïdes ...... 91 b. Diversité des populations tétraploïdes ...... 92 I.2. Diversité phénotypique ...... 94
XIX
I.3. Centella asiatica, complexe polyploïde à Madagascar ...... 95 I.3.1. Croisement entre populations ...... 95 I.3.2. Polyploïdisation de Centella asiatica ...... 95
II. CENTELLA ASIATICA DE LA REGION D ’A LAOTRA MANGORO ...... 100 II.1. Caractérisation des accessions d’Alaotra-Mangoro ...... 100 II.2. Probleme d’instabilité de la teneur en principes actifs ...... 100 II.3. Solutions proposées face à l’instabilité de la teneur en principes actifs ...... 101 II.3.1. Conservation des génotypes élites de Centella asiatica ...... 101 II.3.2. Extension de la zone de collecte de Centella asiatica ...... 103 II.3.3. Culture de Centella asiatica ...... 103
CONCLUSIONS ...... 106
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 110
ANNEXES ...... 133
PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES ...... 14
XX
INTRODUCTION
Introduction
Centella asiatica est une plante appartenant à la famille des APIACEAE, elle est originaire de l’Asie mais est très répandue dans toutes les régions tropicales et subtropicales du monde (Mathur et al. , 2003). Ses feuilles sont riches en asiaticoside et en madécassoside, deux triterpènes dotés de propriétés qui lui confèrent des vertus cicatrisantes et regénérantes de tissus (Hashim et al. , 2011). Ces vertus sont reconnues, d’une part dans la pharmacopée traditionnelle, avec de nombreuses applications internes et externes (Singh et al. , 2010); et d’autre part, dans la médecine moderne, qui utilise aujourd’hui les deux triterpènes de C. asiatica dans les préparations pharmaceutiques industrielles dont le Madécassol® et le Blastoestimulina® (Zheng et al. , 2007; Randriamampionona, 2010). C. asiatica est une plante médicinale très recherchée et très demandée par les pays du Nord et fait ainsi l’objet d’un commerce international important. Sur ce marché, Madagascar est le producteur le plus sollicité en raison de la richesse en principes actifs des accessions de C. asiatica malgaches. De ce fait, cette plante constitue, pour l’île, le deuxième produit d’exportation en tonnage brut de plante médicinale (Péchard et al. , 2005) après la pervenche de Madagascar, Catharanthus roseus . Bien que C. asiatica pousse dans toutes les régions de Madagascar, excepté dans la région semi-aride du Sud, les collectes destinées à l’exportation sont principalement effectuées dans la région d’Alaotra-Mangoro (Randriamampionona et al. , 2007). Du point de vue écologique, pédologique et climatique, cette région est propice au développement de C. asiatica que l’espèce y est très abondante et accessible ; et en plus d’après nos enquêtes, les accessions de cette région sont préférées du fait de leur teneur en principes actifs supposée élevée et satisfaisante. D’une part, Randriamampionona et al. (2007) ont montré que le taux de principes actifs des accessions des régions orientales est élevé par rapport à celui des accessions des Hauts-plateaux. D’autre part, Rahajanirina et al (2012) ont montré que la teneur en principes actifs des accessions orientales est plus élevée par rapport à celle des accessions occidentales. Néanmoins aucune information scientifiquement vérifiable n’est disponible auprès des importateurs pour confirmer la présomption que les accessions de la région d’Alaotra Mangoro sont les meilleures dans toute l’île. Toutefois, les importateurs de C. asiatica se plaignent récemment d’une instabilité et d’une diminution de la teneur en principes actifs des produits d’exportation et cherchent à trouver des solutions pour y remédier. Face à cette situation, nous avons soulevé l’hypothèse qu’il existe une certaine diversité génétique au sein des populations de C. asiatica malgaches et que la présence de cette diversité pourrait, au moins en partie, expliquer la richesse en principes actifs des
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Introduction accessions de la région d’Alaotra-Mangoro par la présence de génotypes particuliers. A partir de cette première hypothèse, nous supposons que l’instabilité de la teneur en principes actifs de ces accessions pourrait être une conséquence de la disparition de ces génotypes en question. Par conséquent, cette thèse vise à évaluer la diversité de C. asiatica à Madagascar, dans le but de distinguer les accessions contenant une teneur élevée en principes actifs. Pour pouvoir apprécier la diversité d’une espèce, une bonne connaissance de sa biologie est primordiale. C. asiatica a fait l’objet de plusieurs études biologiques, cependant les données sur la reproduction (Wankhar et al. , 1990a; Lopes-Consolaro et al. , 1996 ; Mathur et al. , 2003 ; Devkota et al. , 2010c) et les données cytogénétiques (Anuradha-Hore, 1976; Prasad et al. , 1985; Booncong et al. , 1995; Lopes-Consolaro et al. , 1996 ; Aziz et al. , 2007) restent parcellaires et confuses. Afin de mener à bien l’étude de diversité, ces deux éléments biologiques et tous ceux qui s’y rapportent ont été revus pour les accessions malgaches. Ainsi, nous nous sommes concentrés en premier lieu sur la caractérisation biologique de C. asiatica qui porte sur : - une description de la partie florale pour comprendre ce que peut être son fonctionnement en reproduction sexuée, - une étude de la reproduction basée sur des tests de croisements contrôlés et des tests de germination pour définir le mode de reproduction, - une étude chromosomique basée sur les techniques de cytologies classiques et sur la technique d’hybridation in-situ en fluorescence (FISH) qui ont permis respectivement de déterminer le nombre de chromosome et d’évaluer la ploïdie (D'Hont et al. , 1998; Li et al. , 2002), - une étude des stomates basée sur des comptages et des mesures des stomates des feuilles pour l’évaluation du niveau de la ploïdie (Marciniuk et al. , 2010), en complément à l’étude chromosomique Une fois que ces données biologiques ont été acquises, la diversité morphologique et génétique de C. asiatica à Madagascar ont été évaluées. Une diversité au niveau de la morphologie des feuilles et un polymorphisme au niveau du génome chloroplastique ont été détectées antérieurement lors de nos études préliminaires, mais au niveau d’un échantillonnage assez restreint (Rakotondralambo, 2006). Dans cette thèse, ces études ont été plus approfondies et ont été reproduites sur une zone d’échantillonnage plus large, représentative de toute l’île. Une étude de la morphologie des feuilles basée sur des mesures morphométriques a été effectuée en premier lieu. Ensuite, des études moléculaires du génome chloroplastique et du génome nucléaire ont été menées. Ces dernières ont été basées
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Introduction respectivement sur des techniques de marquage moléculaire par RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction) et par SSR (Simple Sequence Repeat). Au final, l’ensemble des données acquises ont servi à caractériser les accessions de la région d’Alaotra-Mangoro et des accessions produisant une teneur élevée en principes actifs. Des explications relatives à l’instabilité de la teneur en principes actifs de C. asiatica ont pu être déduites et des solutions à ce problème ont été avancées en vue d’une conservation et d’une gestion durable de l’espèce. Ce manuscrit est alors subdivisé en quatre grandes parties: la première synthétise les généralités sur C. asiatica , la deuxième décrit le matériel végétal, les outils et les méthodes utilisés, la troisième rapporte les résultats obtenus qui sont ensuite discutés dans la quatrième partie.
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GENERALITES
Généralités
La famille des APIACEAE, appelée aussi OMBELLIFERES, est une famille caractérisée notamment par son inflorescence typique, une ombelle. Elle regroupe près de 300 à 455 genres et 3000 à 3750 espèces (Pimenov and Leonov, 1993) dont Centella asiatica .
I. TAXONOMIE (D OWNIE ET AL ., 1998) Règne : VEGETALE Sous-règne : EUCARYOTES Embranchement : MAGNOLIOPHYTA Classe : MAGNOLIOPSIDA Ordre : APIALES Famille : APIACEAE Genre : Centella Espèce : asiatica - (L.) Urban Synonymes : Hydrocotyle asiatica (L.) Noms vernaculaires : − à Madagascar : Talapetraka, Korokorona, Anampetraka, Tamotamovotry, Railesoka, Ilabola, Tokatsofina − à l’étranger : Gotu kola, Cochleard du pays, Cotyliole asiatique, Bevilaque, Herbe de boileau, Herbe du tigre, Pegaga, Vilakwa bevilaqua
II. ORIGINE ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE Centella asiatica est une plante originaire de l’Asie (Bontems, 1942; Mathur et al. , 2003). Cependant, elle a une large répartition géographique qui reste actuellement vague due à la non actualisation de ses zones de présence. D’après Boiteau (1943), C. asiatica serait répartie de l’Asie méridionale à Madagascar et dans toute l’Afrique équatoriale et tropicale. Selon le même auteur, C. asiatica est également présente en Tasmanie, en Nouvelle Zélande, en Nouvelle Calédonie, en Uruguay, au Paraguay, au Brésil, à Porto Rico, en Martinique, au Guadeloupe, au Guatemala, au Mexique et aux Etats-Unis. Une carte de répartition mondiale de C. asiatica a été élaborée par Encyclopedia of life (http://eol.org ) (Figure 1) en fonction des données non exhaustives qui ont été recueillies.
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Généralités
d’après Encyclopedia life of d’après
Centella asiatica
deCarte répartition mondiale de
1 : Figure
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Généralités
III. MORPHOLOGIE C. asiatica est une plante sauvage vivace, herbacée, rampante et stolonifère (Boiteau, 1943; Mathur et al. , 2003; Aziz et al. , 2007) (Photo 1).
Photo 1 : Centella asiatica
III.1. APPAREIL VEGETATIF La tige de C. asiatica est rampante, fine, et de forme cylindrique. Au niveau des nœuds se développent d’une part des racines adventives fines et très nombreuses et d’autre part des feuilles insérées en rosette. Les feuilles sont constituées par un pétiole plus ou moins court et un limbe à forme très variée. Plusieurs formes de feuilles de C. asiatica ont été décrites dans les études antérieures, cependant la dénomination de ces formes est très confuse car les termes de désignation utilisés sont subjectifs. Aziz et al. (2007) ont décrit deux formes de feuilles en Malaisie : des feuilles crénelées et des feuilles dentées. En Afrique du Sud, James et ses collaborateurs (2008) ont travaillé sur deux phénotypes de C. asiatica qui se distinguent par la forme de leurs feuilles : une décrite comme étant réniforme avec un bord de limbe crénelé et une autre dite cordiforme avec un bord de limbe sinué. Au Sri Lanka, Peiris et Kays (1996) ont également distingués des populations de C. asiatica à petites feuilles et d’autres à grandes feuilles. En Inde, une étude morphologique d’individus de C. asiatica collectés dans 16 zones géographiquement différents, menée par Mathur et al. (2003), ont montré que la forme des feuilles varie du réniforme à cordiforme. Trois morphotypes ont été distingués : des plantes courtes avec des petites feuilles à pétiole court, des plantes longues ayant des feuilles larges à pétiole long et des plantes intermédiaires des deux premiers morphotypes.
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Généralités
A Madagascar, nos études préliminaires ont montré l’existence de C. asiatica à feuilles orbiculaires et à feuilles réniformes (Rakotondralambo et al., 2007) .
III.2. APPAREIL REPRODUCTEUR Les fleurs de C. asiatica sont organisées en inflorescence qui est une ombelle simple (Planche I -Photo 2), elles sont hermaphrodites et de petites tailles de moins de 3mm (Planche I -Photo 3). Le fruit est un diakène indéhiscent, glabre et de forme orbiculaire qui renferme deux graines de forme ovale (Planche I -Photo 4).
Planche I
Photo 2 : Groupe d’inflorescence sur un individu de Centella asiatica Photo 3 : Fleur de Centella asiatica Photo 4 : Deux fruits de Centella asiatica
IV. MODE DE REPRODUCTION C. asiatica peut avoir une reproduction végétative à partir de stolons (Planche II – Photo 5), et une reproduction sexuée à partir de graines (Wankhar et al. , 1990a; Devkota et al. , 2010c) (Planche II– Photo 6). Contrairement à la reproduction végétative qui produit des clones génétiquement identiques, la reproduction sexuée conduit à une diversité génétique (Devkota et al. , 2010c). Selon Mathur et al . (2003), la reproduction sexuée de C. asiatica semble très rare car la production et la fertilité des graines exigent des conditions environnementales très strictes. Lopes-Consolaro et al . (1996) ont montré, de leur coté, que C. asiatica a un taux de stérilité de pollens élevé, et un faible taux de production de graines.
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Généralités
Planche II
Photo 5 : Clone de Centella asiatica issus d’une multiplication végétative par stolons Photo 6 : Plantules de Centella asiatica obtenues à partir de la germination de graines
V. CYTOLOGIE Le nombre de chromosomes de C. asiatica révélé par les études cytologiques antérieures est très varié. Dans une large proportion, cette plante est déterminée comme étant un diploïde possédant 2n = 2x = 18 chromosomes, avec un nombre chromosomique de base fixé à n = 9 (Anuradha-Hore, 1976; Prasad et al. , 1985; Booncong et al. , 1995; Aziz et al. , 2007). Par ailleurs, des auteurs ont observé un nombre chromosomique variant de 17 chromosomes à 36 chromosomes (Mitsukuri et al ., 1959 ; Anuradha-Hore, 1976, Das et al ., 1991 ; Kokubugata et al. , 1998). Prasad et Ammal (1985) ont conclu que les variations du nombre chromosomique de l’espèce pourraient s’expliquer par des phénomènes d’aneuploïdie et de polyploïdie. Lopes-Consolaro et al . (1996), quant à eux, ont remarqué, au niveau des populations de C. asiatica du Sud du Brésil, des ségrégations chromosomiques irrégulières et des fuseaux achromatiques anormaux dus au nombre élevé de chromosomes. Selon eux, C. asiatica serait un hexaploïde.
VI. PHYTOCHIMIE
VI.1. SUBSTANCES ACTIVES DE CENTELLA ASIATICA Diverses substances actives ont été isolées de C. asiatica , à savoir : des triterpènes, des alcaloïdes, des glycosides, des flavonoïdes et des stéroïdes (Subban, 2008). Les substances actives les plus utilisées et les plus exploitées sont les deux triterpènes qui sont l’asiaticoside et le madécassoside, avec leurs dérivés respectifs qui sont l’acide asiatique et l’acide madécassique (Figure 2) (Inamdar et al. , 1996; Rouillard-Guellec et al. ,
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Généralités
1997; Brinkhaus et al. , 2000; Randriamampionona et al. , 2007) . Ils confèrent à la plante de nombreuses vertus thérapeutiques dont la cicatris ation et la régénération des tissus.
Figure 2 : Structure chimique des principes actifs majeurs de Centella asiatica
VI.2. VARIATION DE LA TENEU R EN PRINCIPES ACTIFS DE CENTELLA ASIATICA La concentration en principe s actifs des feuilles de C. asiatica varie significativement en fonction de l’origine écologique et/ou géographique de la plante (Das et al. , 1991; Aziz et al. , 2007; Randriamampionona et al. , 2007; Munduvelil et al. , 2010). Selon Das et Mallick (1991), il existe une corrélation entre l’origine de C. asiatica , sa prod uction de principes actifs et son nombre de chromosomes. Les plantes à taux de principes actifs élevés seraient celles qui présentent des chromosomes surnuméraires dans leurs cellules. Des études ont également montré que la teneur en principes actifs de C. asiatica varie également en fonction de la forme de s feuilles. Aziz et ses collaborateurs (2007) ont confirmé ce fait en comparant la production en asiaticoside et en madé cassoside de deux phénotypes différents de C. asiatica retrouvés en Malaisie. Les mêmes observations ont été également rapportées entre les différents écotypes de l’Inde (Mathur et al. , 2003) et entre les deux phénotypes retrouvés en Afrique du Sud (James et al. , 2008). Rouillard-Guellec et ses collaborateurs (1997) ont rapporté que les plantes mal gaches recèlent une teneur très importante en principes actifs de 3 à 7 fois plus élevé e que celles de l’Inde.
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Généralités
A Madagascar, Randriamampionona et ses collaborateurs (2007) ont mis en évidence des différences de taux de principes actifs entre les plantes collectées dans des régions des Haut-plateaux et les régions orientales. La concentration moyenne d’asiaticoside varie de 2,67 à 6,42% du poids de la matière sèche, celle du madécassoside de 2,38 à 5,89%, le taux moyen d’acide asiatique varie de 0,09 à 0,64% et celui de l’acide madécassique de 0,11 à 0,59%. Par ailleurs, Rahajanirina et al . (2012) ont pu mettre en évidence une variation de la teneur en principes actifs entre deux morphotypes identifiés à Madagascar. La teneur en principes actifs des individus de l’Est à feuilles réniformes représente 7,7% de la matière sèche, tandis que celle des individus de l’Ouest à feuilles orbiculaires est de 4,7%. Bien que les feuilles du morphotype de l’Est soient petites, elle est plus productive en biomasse foliaire et en principes actifs par rapport au morphotype de l’Ouest qui présentent de grandes feuilles. Selon les mêmes auteurs, la teneur en principes actifs de C. asiatica à Madagascar est plus élevée pendant la saison de pluies, du mois de Décembre au mois de Mars avec une valeur maximale au mois de Février.
VII. UTILISATIONS
VII.1. UTILISATIONS TRADITIONNELLES C. asiatica est révérée par les asiatiques car elle fait partie des plantes miracles à usages multiples (Sushma et al ., 2010). C’est une plante médicinale pantropicale utilisée depuis plus des milliers d’années ; les manuscrits sanscrits, la médecine ayurvédique et la médecine traditionnelle chinoise en témoignent (Mathur et al ., 2003). Elle est généralement utilisée pour soigner une multitude de maladies infectieuses (Peiris et al ., 1996 ; Brinkhaus et al ., 2000). La médecine chinoise considère C. asiatica comme une plante maîtresse pour la longévité (Sushma et al ., 2010). Son usage est décrit par LiChing Yun, un guérisseur légendaire qui aurait vécu 256 ans grâce à la consommation de thé de C. asiatica . Un proverbe sri lankais affirme même que « Deux feuilles de C. asiatica par jour font fuir la vieillesse » parce que la plante est particulièrement appréciée par les éléphants qui vivent généralement très vieux (Jayasinha et al ., 1999). A Madagascar, C. asiatica est localement connue sous le nom de Talapetraka. Elle est utilisée directement sous forme de feuilles fraiches ou de feuilles sèches pour le traitement de nombreuses infections internes et externes. Elle est classée dans le groupe des plantes à substances curatives et toniques appelé « tambavy ».
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Généralités
Outre les usages médicinaux de C. asiatica , cette plante est également utilisée en alimentation. Les Malagasy l’utilisent dans leur fameux plat de riz mélangé aux brèdes appelé « vary amin’anana », ou dans le « romazava » qui est une sorte de bouillon aux brèdes. Les Vietnamiens consomment également C. asiatica selon ces mêmes préparations mais en l’associant parfois avec du soja. C. asiatica possède une valeur nutritionnelle non négligeable. Les feuilles fraiches sont d’excellentes sources de vitamine C (7mg/100g) et de vitamine A (738UI). Elles sont également riches en minéraux comme le calcium (171mg/100g), le phosphore (32mg/100g) et le fer (5.6mg/100g) (Peiris et al. , 1996). Ainsi, au Sri Lanka, cette plante est préparée sous forme de porridge et est ensuite donnée aux enfants en préscolaire afin de lutter contre les carences alimentaires (Cox et al. , 1993; Singh et al. , 2010).
VII.2. UTILISATIONS INDUSTRIELLES Diverses études scientifiques ont montré que les substances actives de C. asiatica , à savoir l’asiaticoside et le madécassoside, favorisent la prolifération des fibroblastes et la synthèse du collagène (Maquart et al. , 1999 ; Sushma et al ., 2010) et possèdent une activité antiulcéreuse (Cheng et al. , 2004; Abdulla et al. , 2010), antioxydante (Zaunol et al. , 2003), antibactérienne (Zaidan et al. , 2005), anti-inflammatoire (Guo et al. , 2004) et même anticancéreuse (Park et al. , 2005). Ces valeurs médicinales rapportées ont conduit les industries pharmaceutiques à l’utiliser dans la composition de nombreuses préparations pharmaceutiques (Raghu et al. , 2007) dont les plus connues sont le Madécassol® et le Blastoestimulina® (Randriamampionona et al. , 2007). C. asiatica apparaît également dans la formulation de nombreuses préparations dermatologiques et cosmétiques, comme les anti- vergetures et les antirides. En pharmacie, C. asiatica peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, de poudre, de boisson, de teinture mère ou de crème selon le traitement (Planche III).
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Généralités
Planche III
Quelques produits pharmaceutiques, dermatologiques et cosmétiques à base de Centella asiatica vue sur le marché international
Photo 7 : Teinture mère cicatrisante (HOMEOPHARMA) Photo 8 : Infusette pour les maux d’estomac et de foie (HOMEOPHARMA) Photo 9 : Boisson fortifiante et stimulante (HOMEOPHARMA) Photo 10 : Poudre à préparer en décoction pour les ulcères d’estomac et les maladies intestinales (MASY) Photo 11 : Pommade cicatrisante (MASY) Photo 12 : Solution hydratante (YVES ROCHER) Photo 13 : Madécassol : Crème pour le traitement local d'appoint des ulcérations cutanées (BAYER) Photo 14 : Baume expert fermeté pour raffermir la peau (YVES ROCHER) Photo 15 : Capsules tonifiantes (FITOTABLET - ELADIET)
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Généralités
VIII. POSITION ECONOMIQUE A MADAGASCAR C. asiatica constitue la deuxième plante médicinale exportée de Madagascar (Péchard et al. , 2005). Les sociétés exportatrices potentielles sont BIONEXX, SOTRAMEX et CAER. Les deux premières sont basées à Antananarivo et la dernière à Ford-Dauphin. Les pays importateurs sont généralement l’Allemagne, la Belgique, la Corée du Sud, l’Espagne, les Etats-Unis, la France, l’Italie et la Suisse.
VIII.1. ZONES ET PERIODES DE RECOLTES DE FEUILLES
Les collectes destinées à l’exportation sont localisées dans la région d’Alaotra- Mangoro. Jusqu’à ce jour, C. asiatica a toujours été récoltée à l’état sauvage. Les feuilles sont récoltées à la main. La vente des feuilles séchées constitue une source de revenus pour les paysans collecteurs pendant la période de soudure (Chupin, 2010). La haute saison de récolte a lieu en saison de pluie durant laquelle la production en biomasse est très importante et la teneur en principes actifs est très élevée (Rahajanirina et al. , 2011).
VIII.2. TAUX ET PRIX D ’EXPORTATION Selon l’abondance de C. asiatica sur la zone de collecte, une personne peut prélever entre 500g et 1kg de feuilles séchées par jour, soit 2,5 à 5kg de feuilles fraiches. Les sociétés exportatrices achètent les feuilles séchées à 3000Ar le kilo (soit environ 1€), cela correspond à une source de revenus non négligeable pour les paysans collecteurs même si les revenus générés restent faibles. Dans les années 1970, la collecte annuelle représentait environ 30 tonnes de matières sèches. Actuellement, la quantité de feuilles collectées, atteint environ 600 tonnes par an (Ministère de l’Environnement et des Eaux et Forêts de Madagascar, 2010). La demande du marché international est en augmentation constante. Les sociétés exportent les feuilles séchées de C. asiatica à des prix de l’ordre de 9 000 000 à 12 000 000 Ar /tonne, soit 3000 à 4000 € (Ministère de l’Environnement et des Eaux et Forêts de Madagascar, 2010). Le commerce de C. asiatica représente des flux financiers importants et favorise une entrée de devises importantes pour Madagascar.
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Généralités
IX. DIVERSITE GENETIQUE
IX.1. RAPPEL SUR LA DIVERSITE GENETIQUE DES PLANTES La diversité génétique des plantes a été et est encore aujourd’hui largement étudiée. L’étude de cette diversité consiste à une analyse du génome de la plante par l’intermédiaire de nombreuses techniques dont la plus utilisée actuellement est le marquage moléculaire.
IX.1.1. Génomes des végétaux Le génome des plantes est distribué dans trois compartiments cellulaires : les mitochondries, les chloroplastes et le noyau. Seuls, le génome chloroplastique et le génome nucléaire, les plus utilisés dans les études de diversité des plantes, sont développés ici.
IX.1.1.1. Génome chloroplastique Le génome chloroplastique est un ADN circulaire à double brin. Il est de petite taille d’environ 35 à 217 kilobases (1 kilobase = 1kb = 103 paires de bases). Sa taille et son abondance ont fait de lui le génome le mieux caractérisé (Grivet, 2002). Ce génome est généralement hérité par voie maternelle (Curtis et al. , 1984; Yukawa et al. , 2006). Chez les plantes terrestres, l'organisation de ce génome est remarquablement conservée et son taux d'évolution est assez lent (Cui et al. , 2006). De ces faits, le séquençage de certaines portions de l’ADN chloroplastique ont permis de retracer l’évolution des grandes familles des plantes à partir de reconstruction phylogénétique (Ravi et al. , 2008). L’hérédité maternelle et l’absence de recombinaison de l’ADN cytoplasmique au moment du brassage génétique lors de la fécondation facilitent la reconstruction de la généalogie des différentes variantes génétiques (Grivet, 2002). Le génome chloroplastique est également très utilisé pour les études de diversité (Demesure et al. , 1995; Horning et al. , 2006; Dubé, 2009).
IX.1.1.2. Génome nucléaire Le génome nucléaire est le plus important dans la cellule végétale. Il peut être distingué des autres génomes par sa localisation, sa taille et sa complexité. Il peut représenter jusqu’à environ 30.000 fois la taille d’un génome chloroplastique. Une partie de l'ADN nucléaire ne code pas directement pour des protéines et sa fonction précise est encore actuellement non déterminée. Cette partie non codante comprend des séquences intergéniques assez peu connues, des séquences répétées et des répétitions en tandem d'unités de base composées de deux ou plusieurs nucléotides qui sont :
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Généralités
- les mini-satellites (Variable Numbers of Tandem Repeats) qui correspondent à des motifs répétés en tandem de 15 à 40 paires de bases. - les microsatellites ou SSR (Simple Sequence Repeat) qui sont des unités répétitives dont le motif est très court, d’une à six paires de bases, et répété de deux à 30 fois ou même plus. Ces microsatellites sont utilisés principalement dans des études de diversité génétique (Cubry et al. , 2008), des études de paternité, de flux de gènes, de dissémination du pollen et/ou des graines (Dow et al. , 1998; Austerlitz et al. , 1999) et des études de structuration des populations (Taquet, 2007).
IX.1.2. Techniques de marquage moléculaire utilisées pour une étude
de diversité génétique de plantes Plusieurs techniques de marquage moléculaire peuvent être employées pour réaliser une étude de diversité génétique de plantes. Les plus utilisées sont les RAPD (Random Amplified Polymorphic) (Murat et al. , 2003), les AFLP (Amplified Fragment Length) (Duval et al. , 2006), les RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction) (Lepais et al. , 2006), les ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) (Pissard et al. , 2006) et les SSR (Simple Sequence Repeat) (Moretzsohn et al. , 2004; Ouédraogo et al. , 2005; Lacape et al. , 2007; Barry et al. , 2008; Cubry et al. , 2008). Dans ce travail, nous nous sommes focalisés sur les RFLP-PCR et les SSR.
IX.1.2.1. Restriction Fragment Length Polymorphism -
Polymerase Chain Reaction (RFLP-PCR) La technique RFLP-PCR repose sur l’amplification in vitro d’une région connue et spécifique d’un ADN, suivie d’une digestion enzymatique spécifique (Szalanski et al, 2003). Elle consiste à digérer le fragment amplifié avec une ou plusieurs enzymes de restriction et à révéler le polymorphisme des sites de restriction par électrophorèse en gel d’agarose ou d’acrylamide (Grivet et al, 1999).
IX.1.2.2. Simple Sequence Repeat (SSR) La technique SSR consiste à travailler sur les microsatellites. En effet, les microsatellites peuvent être utilisés comme des marqueurs moléculaires, du fait qu’ils sont multialléliques et codominants, c’est-à-dire qu’ils possèdent plusieurs allèles sur un même locus et ils permettent de distinguer les hétérozygotes des homozygotes (Ellegren, 2004;
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Généralités
Vienne et al. ). Ils sont idéals pour évaluer la diversité génétique au sein d’une espèce car ils sont caractérisés par un polymorphisme extrêmement élevé (Belahbib et al. , 2005).
IX.2. DIVERSITE GENETIQUE DE CENTELLA ASIATICA A MADAGASCAR Une étude préliminaire sur la diversité génétique de C. asiatica au niveau du génome chloroplastique a été menée par nous même (Rakotondralambo, 2006). A l’issue de cette étude, nous avions pu montrer l’existence d’une diversité génétique au sein des populations de C. asiatica à Madagascar. L’étude a été basée sur l’application de la technique RFLP-PCR sur le génome chloroplastique des individus provenant de 10 sites. Par la combinaison amorces/ enzyme de restriction trnF-trnV/TaqI, deux profils identifiant d’une part les individus de l'Ouest et d’autre part les individus de l'Est ont été mis en évidence. Cette diversité génétique est corrélée à une diversité morphologique bien distincte. Ainsi deux groupes de C. asiatica ont été identifiés: un groupe de l’Ouest (Antsohihy, Bongolava, Maevatanana, Maintirano et Morondava) à feuille orbiculaire; et un groupe de l’Est (Ampasimadinika, Ford-Dauphin, Sambava, Soanierana Ivongo, Vangaindrano) à feuille réniforme. En se référant aux variétés décrites par Boiteau (1943), il a été supposé que les individus de l’Ouest pourraient appartenir à la variété abyssinica et les individus de l’Est appartiendraient à la variété typica . Pour expliquer cette diversité, deux hypothèses ont été émises. La première porte sur l’origine ancestrale des clones : la variété abyssinica proviendrait de l’Afrique et la variété typica proviendrait de l’Asie. La seconde suppose une adaptation des clones aux conditions climatiques : la variété abyssinica serait adaptée au climat sec et semi-aride de l’Ouest et la variété typica au climat humide de l’Est.
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MATERIELS ET METHODES
Matériels et méthodes
I. MATERIEL VEGETAL Le matériel végétal utilisé dans cette étude a été constitué d’individus de Centella asiatica provenant essentiellement de Madagascar et d’individus provenant d’autres pays.
I.1. MATERIEL VEGETAL PROVENANT DE MADAGASCAR Le matériel végétal malgache a été composé de populations de C. asiatica provenant de 90 localités réparties dans les 6 provinces de Madagascar (Annexe 1). Ces sites d’échantillonnage ont été choisis pour représenter au mieux les zones de distribution de C. asiatica dans toute l’île (Figure 3). Pour chaque site de collecte, 5 individus, distants d’au moins 2m, ont été prélevés ; ce qui fait un total de 450 individus. Trois types de traitement ont été effectués sur chaque individu : - une conservation des feuilles dans du silicagel pour l’étude génétique, - une collection de feuilles étalées entre deux papiers cartonnés pour l’étude de la morphologie foliaire, - une transplantation du clone en pépinière, au centre de recherche du CIRAD/FOFIFA à Antananarivo, pour une conservation in vivo Vu le grand nombre d’échantillons, un clone de référence a été nécessaire afin de faciliter le travail et pour servir de témoin pour d’éventuelles comparaisons. Parmi tous les échantillons malgaches, un clone provenant de Vohimana a été choisi pour représenter ce clone de référence. Le choix du site de Vohimana a été basé sur le fait que d’abord ce site fait partie des zones d’exploitation de la région d’Alaotra Mangoro, et que c’est un site où C. asiatica présente une teneur importante en principes actifs (Rahajanirina et al. , 2011). Ce clone de référence représente ainsi le profil de C. asiatica idéal pour l’exportation. Il a été codé VOHI_réf pour désigner Vohimana référence et son herbier a été déposé à l’herbarium de Tsimbazaza à Antananarivo.
I.2. MATERIEL VEGETAL PROVENANT D ’AUTRES PAYS Pour mieux comprendre la diversité de C. asiatica à Madagascar, la comparaison avec d’autres accessions provenant d’autres pays s’avérait indispensable. Des contacts, en Asie, en Afrique et dans les îles voisines, ont été ainsi établis avec des chercheurs pour avoir un maximum d’échantillons. En tout, 25 échantillons provenant de 13 sites étrangers nous sont parvenus, dont 6 sites de l'Asie, 5 sites de l’Afrique, un site de Mayotte et un site de l’île de La Réunion (Annexe 2) (Figure 4). Les collecteurs ont fait parvenir soit des feuilles fraichement collectées et conservées dans du silicagel, soit des feuilles séchées.
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Matériels et méthodes
Figure 3 : Répartition géographique des sites de récolte de Centella asiatica à Madagascar. Chaque site de collecte est associé à un numéro dont les correspondances et les caractéristiques sont détaillées en annexe 1.
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Matériels et méthodes
Figure 4 : Répartition géographique des sites de récolte étrangers, sur la carte de répartition mondiale de Centella asiatica selon Encyclopedia of life. Ethiopie (A), Congo (B), Tanzanie (C), Zimbabwe (D), Afrique du Sud (E), Mayotte (F), La Réunion (G), Chine (H), Inde (I), Vientiane (J) , Binh Chanh (K), Cambodge (L), Malaisie (M)
Tous les individus malgaches et étrangers ont été codés par 4 lettres en majuscules correspondant à leurs sites d’origine, suivies d’un numéro du clone qui va de 01 à 05, lorsqu’il y a plus d’un individu. Exemple : TOAM 03 pour le troisième individu collecté à Toamasina TANZ pour l’individu provenant de la Tanzanie
I.3. MISE EN PLACE D ’UNE COLLECTION D ’HERBIERS Pour chaque site de collecte à Madagascar, un clone fertile, avec des fleurs ou des fruits, a été monté en herbier. Cette collection est actuellement disponible à l’herbarium national TAN du Parc Zoologique de Tsimbazaza à Antananarivo.
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Matériels et méthodes
II. METHODES Compte tenu des objectifs, nous avions effectué en premier lieu la caractérisation biologique de C. asiatica et ensuite l’étude de diversité morphologique et génétique de l’espèce.
II.1. CARACTERISATION DE LA BIOLOGIE DE CENTELLA ASIATICA DE
MADAGASCAR Dans ce travail, la caractérisation biologique de C. asiatica a été particulièrement axée sur la morphologie des fleurs, le mode de reproduction et le niveau de ploïdie. Outre le clone de référence, sept localités sur les 90 sites d’études ont été choisies pour réaliser cette étude biologique. La forme des feuilles et la provenance ont été les critères considérés dans ce choix : - le clone de référence provenant de Vohimana (VOHI_réf), à feuilles réniformes, - 15 individus à feuilles réniformes dont 5 provenant d’Ambohitromby II (AMBR II), 5 du Cap Saint André (CAPA), et 5 de Vangaindrano I (VANG I), - 20 individus à feuilles orbiculaires provenant d’Ambohitromby I (AMBR I), de Mahajanga (MAJG), de Morondava (MORO) et de Sahoany (SAHO) Le site d’Ambohitromby (AMBR) a été particulièrement choisi du fait que des individus à feuilles réniformes et à feuilles orbiculaires y coexistent. Pour chaque paramètre biologique étudié, ces 36 individus n’ont pas toujours été utilisés en totalité mais les deux critères cités ci-dessus ont été toujours considérés. Dans certains cas, le matériel végétal a été constitué du clone de référence et d’individus à feuilles orbiculaires d’un site sélectionné au hasard. Dans le cadre de cette caractérisation, plusieurs approches ont été développées :
- une étude de la morphologie florale basée sur des observations macroscopiques - une étude de la reproduction sexuée basée sur des tests de croisements contrôlés et des tests de germination - une étude chromosomique basée sur les techniques de cytologies classiques et sur la technique d’hybridation in-situ en fluorescence (FISH) - une étude des stomates basée sur un comptage et une mesure des dimensions des stomates
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Matériels et méthodes
II.1.1. Etude morphologique des fleurs L’objectif de l’étude de la morphologie florale a été de confirmer les caractéristiques des fleurs de C. asiatica et de les comparer. Les paramètres observés pour chaque fleur ont été : - le nombre et la couleur des sépales - le nombre et la couleur des pétales - le nombre et la disposition des étamines - la forme et l’ouverture des sacs polliniques - la forme du pistil - la forme de l’ovaire Les observations ont été réalisées sur les 36 échantillons. Cinq fleurs par échantillon ont été étudiées. Les fleurs de C. asiatica étant de petites tailles, les observations ont été réalisées sous une loupe binoculaire Optikam Pro 3.
II.1.2. Etude de la reproduction sexuée Cette étude consistait en premier lieu à déterminer le type de reproduction sexuée existant chez C. asiatica , pour définir si l’espèce présente une fécondation libre ou une autofécondation ; et en second lieu à vérifier la fertilité des graines. Pour répondre à ces objectifs, un test de fécondation et un test de germination ont été menés, d’une part sur le clone de référence (VOHI_réf), à feuilles réniformes, et d’autre part sur un individu de Morondava (MORO), à feuilles orbiculaires.
II.1.2.1. Test de fécondation Deux tests ont été réalisés : un test d’autofécondation et un test de fécondation libre. Chaque localité, Vohimana et Morondava, a été représentée par 6 plantules issues d’un même clone, soit 3 plantules pour chacun des tests prévus. Pour que tous les individus soient au même niveau de départ, il a fallu que chaque plantule ait 3 jeunes feuilles. Chacune d’elles a été ensuite plantée dans un vase de végétation, sur un substrat composé d’argile et de compost (volume/volume) provenant d’Andralanitra. Afin de tester la capacité de C. asiatica à l’autofécondation, chaque plantule a été isolée à l’intérieur d’une mini-serre de 1,60m x 1,20m x 1m. Les 6 mini-serres ont été placées dans des endroits à conditions environnementales identiques. Dans ces conditions, les fleurs ne peuvent être pollinisées que par les pollens des fleurs du même individu.
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Matériels et méthodes
Pour la fécondation libre, les vases de végétation ont été placés au milieu de la pépinière de C. asiatica du CIRAD à Antananarivo, à des endroits qui présentent des conditions environnementales identiques à celles où les mini-serres ont été placées. Les stigmates des fleurs de ces individus sont donc exposés à des pollens de n’importe quels individus. Des suivis hebdomadaires du développement de ces plantes ont été effectués après l’apparition des fleurs pour voir si des fruits se forment à partir des fleurs et si ces fruits atteignent la maturité. Les éléments considérés durant ce suivi ont été la date de plantation, la période de floraison, de fructification et de maturation des fruits.
II.1.2.2. Germination des graines Pour l’étude de germination, les fruits matures issus des tests de fécondation ont été semés sur un substrat composé d’argile et de compost (volume/volume) provenant d’Andralanitra. Des suivis hebdomadaires du nombre de graines germées ont été ensuite effectués durant 4 mois pour évaluer la capacité de germination de ces graines.
II.1.3. Etude chromosomique Cette étude chromosomique a été menée dans le but de déterminer le nombre de chromosomes et le niveau de ploïdie de C. asiatica à partir, respectivement, d’un comptage chromosomique classique et de la réalisation de la technique FISH. Elle a été effectuée au sein du laboratoire de cytogénétique de l’UMR AGAP_ Departement BIOS du CIRAD Lavalette à Montpellier. Etant donné que sa réalisation requiert du matériel frais, le clone de référence et trois individus provenant de chacun des sept sites sélectionnés pour la caractérisation biologique ont été transplantés à la serre du CIRAD à Montpellier. Cette collection de travail, constituée de 22 échantillons, a été seulement mise en place pour la durée de la thèse. L’étude des chromosomes s’est faite en trois grandes étapes : - l’étalement des chromosomes - le comptage des chromosomes - la détermination du niveau de ploïdie par la technique FISH
II.1.3.1. Etalement des chromosomes L’étalement des chromosomes consistait à libérer les chromosomes des cellules de la plante grâce à une digestion enzymatique des parois cellulaires et à les étaler sur une lame d’observation. L’étude chromosomique peut être réalisée à partir de tous tissus présentant un
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Matériels et méthodes bon index mitotique et/ou méiotique, tels que les méristèmes racinaires, les carpelles, les méristèmes apicaux, les boutons floraux ou les anthères. Pour C. asiatica , elle a été réalisée à partir des méristèmes racinaires des plantes cultivées en serre au CIRAD à Montpellier et suivant le protocole modifié de D’hont (1996) qui s’effectue en quatre étapes : - les prélèvements racinaires, - le traitement des racines, - la digestion des pointes racinaires, - l’étalement des chromosomes
a. Prélèvements racinaires Des pointes racinaires de 0,5cm de longueur ont été prélevées sur chaque individu. Suite à des essais de prélèvement de racines de C. asiatica à différentes heures, les prélèvements définitifs ont été effectués 3 heures après le lever du soleil, période où les cellules racinaires de C. asiatica sont en métaphase, étape durant laquelle les chromosomes sont bien éparpillés sur les fibres chromatiques et donc bien visibles au microscope (Genevès, 1996).
b. Traitement des racines Les racines fraîchement prélevées ont été lavées dans un tampon phosphate contenant 0,5% de sulfite de sodium. Après le lavage, elles ont été immergées dans une solution d’Hydroxyquinoléine (0,04%) et mises à l’obscurité pendant 4h à température ambiante. Cette incubation inhibe la formation des fibres chromatiques et bloque ainsi les chromosomes à la métaphase. Les racines ont été ensuite fixées pendant 72h dans une solution d’éthanol-acide acétique en proportion 3:1, tout d’abord 24h à température ambiante puis 24h à 4°C. Les racines ainsi traitées ont été gardées dans une solution d’éthanol à 70% à 4°C. Elles peuvent être utilisées directement pour la suite des opérations ou être conservées dans cet état pendant plusieurs mois pour des utilisations ultérieures.
c. Digestion des pointes racinaires La digestion enzymatique libère les chromosomes en détruisant les parois cellulaires. Les racines gardées dans l’éthanol 70% ont été rincées à l’eau distillée pendant 20min (2 x 10min) puis hydrolysées dans un bain d’acide chlorhydrique 0,25N pendant 10min pour ramollir les parois cellulaires. Elles ont été ensuite rincées à l’eau distillée pendant 10min (2 x 5min). Afin de favoriser l’activité des enzymes, les racines ont été plongées dans un tampon
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Matériels et méthodes citrate (0,01M tri-sodium citrate di-hydrate, 0,5M acide citrique monohydrate, pH 4,5). L’apex racinaire a été ensuite coupé et incubé dans une solution enzymatique (1% cellulase Onozuka R-10, 1% pectolyase Y-23, 1% cytohelicase dans le tampon citrate) à 37°C. Le temps de digestion est variable selon les genres, les espèces et la taille des racines. Pour C. asiatica le temps d’obtention de protoplastes est de 20min pour les racines de petites tailles et 55min pour les plus grosses. Après la digestion, les racines ont été rincées et puis immergées dans de l’eau distillée pour la réhydratation. Le méristème racinaire et la coiffe des racines ont été dissociés grâce à un mouvement délicat et répété d’aspiration et de refoulement à l’aide de micropipettes pasteurs. Le méristème racinaire était ainsi prêt pour l’étalement.
d. Etalement des chromosomes Le méristème racinaire, débarrassé de sa coiffe, a été placé sur une lame, l’excès d’eau a été épongé à l’aide d’un papier absorbant. Une goutte de fixateur éthanol-acide acétique en proportion 3:1 lui a été ajoutée afin d’éclater les protoplastes. Les tissus ont été ensuite dissociés et étalés sur la lame à l’aide d’une pince très fine, sous une loupe binoculaire. Puis la lame a été séchée à l’air libre. Après vérification sous microscope à contraste de phase, les lames présentant les meilleures plaques métaphasiques ont été mises à l’étuve à 37°C pendant une nuit puis conservées à 4°C afin d’être colorées pour le comptage chromosomique ou pour l’hybridation.
II.1.3.2. Comptage chromosomique Les chromosomes étalés sur la lame ont été colorés à l’aide d’une goutte de 4’,6- Diamidino-2-phényl-indole (DAPI, Sigma) à 1,5µg/ml, montés dans de l’anti-fade (Abcys vector), l’anti-fade ayant la propriété de maintenir la coloration des chromosomes. Après la coloration, une lamelle de verre a été colmatée avec du vernis à ongle ordinaire sur la lame. Cette dernière a été ensuite observée au microscope à fluorescence Leica DMRAX2 (Heidelberg Allemagne). Les images des chromosomes ont été capturées avec une caméra digitale «ORCA-ER C4742-80 » Hamamatsu, visionnées et photographiées à l’aide du logiciel Volocity (Perkin Elmer). Les chromosomes ont été enfin comptabilisés à l’aide du logiciel Image J. Pour éviter les erreurs et les ambigüités, tout comptage a été vérifié par deux personnes différentes.
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Matériels et méthodes
II.1.3.3. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) La FISH de C. asiatica a été réalisée suivant le protocole modifié de D’Hont (1996). Cette technique consiste à détecter une séquence spécifique du génome en y hybridant une portion d’ADN connue marquée avec des éléments radioactifs. Cette portion d’ADN est appelée sonde. Dans cette étude, l’objectif a été de déterminer le nombre et la position des sites ou locus d’ADN ribosomaux (ADNr) 45S et 5S sur les chromosomes de C. asiatica, afin d’en tirer le nombre de chromosomes de base et le niveau de ploïdie de l’espèce. Le nombre de chromosomes de base d’une espèce peut-être déterminé en divisant le nombre total de chromosomes par le nombre de sites ADNr détecté pour chaque locus (D'Hont et al. , 1998) et le nombre de sites ADNr révélé par la technique FISH permet de déterminer le niveau de ploïdie des plantes (D'Hont et al. , 1998; Li et al. , 2002). Une espèce diploïde devrait présenter deux sites ADNr 5S et deux sites ADNr 45S, une espèce triploïde aurait 3 sites de chaque, une espèce tétraploïde devrait en posséder 4 de chaque, et ainsi de suite. La technique FISH a été appliquée directement sur les chromosomes étalés sur les lames. Elle s’est déroulée en six étapes : - le prétraitement des préparations chromosomiques - la dénaturation de l’ADN chromosomique - la préparation et la dénaturation des sondes - l’hybridation des sondes - le lavage - la contre-coloration Mais avant la réalisation des différentes étapes de l’hybridation, les zones présentant des métaphases, sur chaque lame, ont été sélectionnées au microscope en contraste de phase. La localisation des chromosomes a été enregistrée par le logiciel Volocity.
a. Prétraitement des préparations chromosomiques Les lames ont été incubées dans 150µl d’une solution de RNase (1µg/ml dans 2X de SSC ou Sodium Citrate, Sodium Chloride) pendant 45min à 37°C, dans une chambre d’hybridation humidifiée avec du 2X SSC. Elles ont été ensuite rincées 2 fois dans une solution tampon 2X SSC pendant 10min à température ambiante et séchées à l’air. Ce traitement par la ribonucléase élimine les ARN endogènes et réduit l’hybridation non- spécifique qui est une source de bruit de fond.
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Matériels et méthodes
b. Dénaturation de l’ADN chromosomique L’ADN chromosomique a été dénaturé pour que l’ADN des sondes puisse s’hybrider. Le traitement dénaturant utilisé est une solution de formamide à 70%. Les lames ont été incubées dans une solution tampon 2X SSC contenant 70% de formamide pendant 3min à 80°C sur une plaque chauffante. Elles ont été ensuite placées pendant 3min dans un bain de 2X SSC préalablement refroidi dans la glace pour diminuer en température sans risque de renaturation. Les lames ont été enfin déshydratées dans trois bains successifs d’alcool à 70%, 90%, 100% à -20°C (5min chacun) et séchées à température ambiante.
c. Préparation et dénaturation des sondes c.1. Préparation des sondes La réalisation du FISH nécessite l’utilisation de sondes. Les sondes utilisées dans le cadre de ce travail ont été des sondes de blé contenant des gènes codant pour les ADNr. Ces gènes sont répétés et suffisamment conservés entre différentes espèces pour permettre la révélation des locus des ADNr chez les plantes de différentes familles (Devi et al. , 2005). La sonde pTA71 a été utilisée pour révéler les gènes codants pour les sous unités 45S (Gerlach et al. , 1979). Elle a été marquée à la biotine 14 dUTP (Fisher Bioblock Scientific) par « random priming » ou hybridation au hasard. La biotine est révélée en utilisant son affinité pour l’avidine qui est elle même couplée au fluorochrome « Texas Red ». Ce dernier apparaît en rouge en microscopie à fluorescence. La sonde pour les gènes ADNr 5S a été celle du blé cloné (Gerlach et al. , 1980). Elle a été marquée à la digoxygenine 11 dUTP (Fisher Bioblock Scientific) par « random priming ». Le fluorochrome fluorescéine isothiocyanate (FITC) couplé à un anticorps anti-dig a été employé pour révéler la sonde marquée à la digoxygénine. Il émet dans le vert en microscopie à fluorescence.
c.2. Préparation de la solution d’hybridation Pour assurer la spécificité de l’hybridation au niveau des sites ADNr, les sondes ont été associées avec d’autres réactifs. Ce mélange réactionnel est appelé solution d’hybridation. Par lame, cette solution d’hybridation a été constituée de : - 40µl de mélange d’hybridation composé de 50% de formamide, de 10% de dextran sulfate, de 2X de SSC 20X, de 0,66% de SDS 20% (Sodium Dodecyl Sulfate) et de 0,5µg/µl d’ADN de sperme de saumon 10mg/ml comme bloquant. - 100ng sondes marquées pour l’ADNr 5S - 100ng sondes marquées pour l’ADNr 45S
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Matériels et méthodes
c.3. Dénaturation des sondes Pour pouvoir s’hybrider sur leurs séquences cibles, les sondes marquées doivent être dénaturées. La solution d’hybridation a été alors dénaturée dans un bain-marie bouillant pendant 10min. La solution a été ensuite transférée dans la glace pendant 15min, avant d’être déposée sur les lames.
d. Hybridation 50µl de la solution d’hybridation ont été déposés sur l’étalement chromosomique qui a été ensuite recouvert d’une lamelle en plastique. Les lames ont été placées dans une chambre humide et incubées à 37°C pendant la nuit pour l’hybridation.
e. Lavages Après hybridation, les lamelles ont été retirées et les lames ont été lavées dans quatre bains successifs de solution 2X SSC ; 0,5 X SSC ; 0,1X SSC pendant 10min à 42°C puis de solution 2X SSC pendant 10min à température ambiante. Afin d’éliminer les signaux aspécifiques, les zones d’hybridation ont été traitées avec 150µl de BSA 5% (Albumine Sérique Bovine), les lames ont été de nouveau recouvertes d’une lamelle en plastique et incubées 10min à 37°C dans une chambre humide.
f. Contre-coloration Après le lavage, les chromosomes ont été contre-colorés avec une solution de DAPI (20 µl/lame) et recouverts d’une lamelle de verre colmatée avec du vernis à ongle ordinaire. Les lames ont été stockées à l’obscurité.
g. Observations Les préparations chromosomiques hybridées ont été enfin observées au microscope à fluorescence (Leica DMRXA2, Heidelberg Allemagne) équipé d’un objectif à immersion à huile (100X) assurant l’excitation et l’observation de la fluorescence verte émise par la fluorescéine, la fluorescence rouge émise par le texas red et la fluorescence bleue émise par le DAPI. Ainsi, les signaux d’hybridation et les chromosomes peuvent être observés et les segments d’ADN hybridés seront localisés précisément sur les chromosomes. Les images ont été ensuite capturées sur une caméra digital « «ORCA-ER C4742-80 » Hamamatsu. La position et le nombre de sites ADNr ont été enfin visualisés avec les logiciels Volocity (Perkin Elmer) et Image J.
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Matériels et méthodes
II.1.4. Etude des stomates Cette étude consiste à déterminer la taille et la densité des stomates des feuilles de C. asiatica à partir d’observations microscopiques. En complément à l’étude chromosomique, elle a pour objectif d’évaluer le niveau de ploïdie de l’espèce. En effet, la densité et la longueur des stomates sont corrélées avec le niveau de ploïdie chez un grand nombre d’espèces végétales (Mishra, 1997; Joachimiak et al. , 2000b). La taille des stomates augmente avec la ploïdie en même temps que la densité diminue (Vandenhout et al. , 1995; Mishra, 1997). L’étude des stomates de C. asiatica a été réalisée sur le clone de référence, à feuilles réniformes, et sur les individus AMBR I, à feuilles orbiculaires. Les stomates ont été observés sur la face inférieure des feuilles. Cette face a été d’abord nettoyée avec une bande adhésive pour éliminer les poussières et les débris qui pourraient interférer avec les observations microscopiques. Une mince couche de vernis transparent y a été ensuite étalée pour récupérer les empreintes des stomates. Lorsque la couche de vernis est bien sèche, elle a été recouverte d’une bande adhésive. Cette dernière a été retirée délicatement et collée directement sur une lame d’observation. Pour chaque échantillon, 3 feuilles différentes ont été utilisées. Pour chaque feuille, 15 observations réparties sur toute la surface ont été réalisées. Au grossissement 200X, le nombre et la taille de tous les stomates entiers ont été déterminés. Le comptage s’est fait manuellement sur les images capturées, tandis que la taille des stomates a été déterminée grâce au logiciel Volocity (Perkin Elmer). La densité en stomates, exprimée en nombre de stomates par mm 2, a été déterminée comme étant le nombre de stomates entiers comptés par champ de microscope mesurant 1,42 mm² au grossissement 200X. La taille des stomates correspond à la longueur maximale de leurs cellules de garde. Afin de valider et de comparer les données obtenues pour chaque individu, un test ANOVA a été réalisé.
II.2. DIVERSITE DE CENTELLA ASIATICA DE MADAGASCAR Pour pouvoir répondre aux problématiques de cette étude, la diversité morphologique et la diversité génétique des 450 individus de C. asiatica provenant de Madagascar ont été évaluées. Centella uniflora (Photo 16), provenant de Krisiasy dans la région d’Amoron’ny Mania, a été également incluse dans les échantillons, pour pouvoir faire des comparaisons et des rapprochements entre les deux espèces. Elle a été représentée par cinq individus codés KRIS.
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Matériels et méthodes
Photo 16 : Centella uniflora provenant de Krisiasy
II.2.1. Etude de la diversité morphologique L’étude de la diversité morphologique de C. asiatica a été effectuée dans le but d’identifier les différents phénotypes existant à Madagascar. Elle a été concentrée sur des mesures morphométriques des feuilles. Les six dimensions suivantes ont été considérées (Figure 5) : - surface foliaire (S) - grande longueur (GL) : longueur maximale de la feuille - longueur (L) : longueur à partir du sommet de la feuille jusqu’au point d’insertion du pétiole. - largeur (l) : largeur maximale de la feuille - poids de la matière sèche (P) - longueur du pétiole (LP) Le choix de ces dimensions a été basé sur l’étude de la diversité morphologique effectuée par Rakotondralambo (2006) et sur l’étude de Devkota et al . (2009; 2010b). La taille des feuilles est définie par les dimensions ci-dessus tandis que les rapports entre la grande longueur et la largeur (GL/l) et entre la grande longueur et la longueur (GL/L) mettent en évidence la forme des feuilles. Les données obtenues ont été ensuite soumises à l'Analyse en Composantes Principales (ACP) à partir du logiciel XLSTAT. Ce module statistique permet de constituer des groupes d’individus similaires sur la base d’un ensemble de variables quantitatives. Les résultats issus
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Matériels et méthodes de l’ACP ont été ensuite vérifiés statistiquement avec l’analyse de variance ANOVA à un facteur.
Figure 5 : Mesures réalisées sur la feuille de Centella asiatica 1 : Longueur (L) - 2 : Largeur (l) - 3 : Grande longueur(GL) - 4 : Longueur du pétiole (LP)
II.2.1.1. L’Analyse en Composantes Principales (ACP)
a. Présentation de la technique L’Analyse en Composantes Principales fait partie du groupe des méthodes descriptives multidimensionnelles appelées méthodes factorielles. C’est une méthode descriptive, sans test statistique, qui s’appuie sur un modèle géométrique pour l’analyse des données (Escofier et al. , 1998). L’ACP a été adoptée afin d’évaluer la ressemblance entre les individus par rapport aux variables, qui sont les paramètres morphologiques, et afin d’évaluer la liaison entre ces variables. La position géographique des sites a été utilisée comme des variables supplémentaires dans le but de déterminer si la morphologie des feuilles a une quelconque relation avec la position géographique des sites. La division territoriale phytogéographique de Madagascar établie par Humbert (1955), délimitant la région orientale, la région occidentale et les domaines de chaque région de l’île, a été considérée.
b. Analyse et interprétation des résultats Les résultats issus de l’ACP ont été interprétés à partir de trois données qui sont l’inertie des axes, la corrélation entre les axes et les variables, et la corrélation entre les individus.
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Matériels et méthodes
b.1. Inertie des axes Les résultats sont représentés sur des graphes à 2 axes factoriels orthonormés. La quantité d'informations recueillie par un axe est évaluée à partir du pourcentage d'inertie. En additionnant les pourcentages d’inertie de 2 axes du plan, la qualité de la représentation des données dans ce plan factoriel est évaluée. Ces données sont représentées dans le tableau des valeurs propres (Escofier et al. , 1998).
b.2. Corrélation entre les axes et les variables La corrélation entre les axes et les variables est expliquée par le coefficient de corrélation r et représenté géométriquement par le cercle de corrélation. Plus r est proche de 1 (en valeur absolue), plus la variable est liée à l’axe. Plus r est proche de 0, moins la variable est liée à l’axe (Escofier et al. , 1998). Dans le cercle de corrélation, plus une variable est projetée vers le bord du cercle de rayon 1, mieux elle est représentée. Par ailleurs, deux variables bien représentées et proches l’une de l’autre sont corrélées positivement tandis que deux variables qui s’opposent sont corrélées négativement. Une orthogonalité entre deux variables traduit l’absence de corrélation linéaire.
b.3. Corrélation entre les individus Les individus sont représentés en deux dimensions sur un graphique. Sur cette représentation, une proximité de deux points individus s’interprète comme un comportement analogue de ces individus considérés envers les variables. Une proximité entre un point variable et un point individu signifie que la variable est caractéristique de l’individu considéré (Escofier et al. , 1998). Les individus sont représentés sous-forme de nuage de points. Les barycentres représentent les centres de gravité de ces nuages de points. Lorsque les individus sont trop nombreux, l’observation du barycentre est plus représentative.
II.2.1.2. Analyse de variance (ANOVA)
a. Présentation de la technique Le test ANOVA (ANalyse Of VAriance) est une technique permettant de savoir si une ou plusieurs variables dépendantes ou variables réponses sont en relation avec une ou plusieurs variables dites indépendantes ou variables explicatives. Il est basé sur le modèle suivant :
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Matériels et méthodes
= + Y représente la variable réponse représente la variable explicative
ε représente les résidus ou erreurs i représente le nombre d’observations
Dans cette étude, l’ANOVA a été réalisée afin de vérifier si les déductions graphiques issues de l’ACP sont statistiquement significatives. Les hypothèses à vérifier dans cette analyse seront donc l’effet de la position géographique sur la détermination de la taille des feuilles d’une part et sur la détermination de la forme des feuilles d’autre part. Les modèles correspondant sont les suivants :
= ∝ é +
= ∝ é +
i représente le nombre d’individus : 1< i < 455 k représente la position géographique : région orientale ou région occidentale α représente le coefficient de régression
ε représente les résidus ou erreurs
b. Analyse et interprétation des résultats Pour l’analyse des résultats, trois paramètres principaux ont été observés : le P value, l’écart-type et la valeur. Si le P value entre les régions est inférieur à 0,0001 et que les écart- types sont inférieurs ou égaux à leurs paramètres valeurs, les variables en question sont significativement différents de 0 et sont donc différents entre eux.
II.2.2. Etude de la diversité génétique Les analyses ont été effectuées en même temps sur le génome chloroplastique et le génome nucléaire. Sachant que le génome chloroplastique a une transmission maternelle et présente une évolution lente, l’étude de sa diversité a été réalisée dans le but de clarifier les relations phylogénétiques entre les individus étudiés et afin de retracer leur évolution.
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Matériels et méthodes
Le génome nucléaire est, quant-à lui, d’origine biparentale et présente par ce fait un taux de polymorphisme élevé. L’exploration de ce génome est ainsi idéale pour l’évaluation de la diversité de C. asiatica .
II.2.2.1. Extraction d’ADN L’ADN de chaque individu de C. asiatica a été extrait au laboratoire de Biologie Moléculaire du Dispositif en Partenariat « Forêts – Biodiversités » à Ambatobe Antananarivo. Les ADN totaux de C. asiatica ont été extraits selon le protocole modifié de Doyle and Doyle (1987), à partir des feuilles. Sept cent milligrammes de feuilles ont été broyés avec de l’azote liquide. La poudre obtenue a été transférée dans un tube Treff de 2ml. Le broyat a été incubé pendant 1h à 64°C dans 1ml de tampon d’extraction composé de 2% CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide), 1,4M de NaCl, 20mM d’EDTA (Ethylène diamine tétra acétique), 100mM de Tris HCl (pH 7,5), 1% de PEG 6000 (Polyethylene glycol) et 0,4% de Sulfite de sodium. A ce mélange ont été ajoutés 800µl d’une solution de chloroforme/ alcool iso-amylique (24/1). L’ensemble a été ensuite mélangé et centrifugé à 6000tr/min pendant 15min à température ambiante. Le surnageant a été récupéré dans un autre tube Treff de 2ml et a été précipité par un ajout d’isopropanol (volume/volume). Le tout a été centrifugé à 6000tr/min pendant 20min à température ambiante. Le surnageant a été éliminé et le culot contenant l’ADN a été séché à température ambiante pendant 2h. Après le séchage, le culot a été repris dans 200 µl de TE (10mM Tris, 1mM EDTA) à +4°C pendant une nuit. L’extrait d’ADN est ainsi prêt pour tout utilisation, sinon il est conservé à -20°C.
II.2.2.2. Etude du génome chloroplastique Le génome chloroplastique de C. asiatica a été analysé grâce à la technique RFLP-PCR, une technique adéquate et idéale pour des génomes stables tels que l’ADN chloroplastique.
a. Principe de la technique RFLP-PCR La technique RFLP-PCR consiste à une amplification in-vitro par PCR suivi d’une restriction enzymatique (Annexe 4). L’extrait d’ADN d’un individu est donc soumis à une combinaison amorces/ enzyme de restriction. La séquence d’ADN est amplifiée avec une amorce, puis coupée en plusieurs fragments de restriction par une enzyme au niveau de régions spécifiques appelées sites de restriction. Les fragments de restriction produits auront des tailles variées en fonction de l’emplacement des sites de restriction sur la séquence génomique. L’ensemble des fragments de restriction d’un extrait d’ADN, révélé par
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Matériels et méthodes
électrophorèse verticale sur gel polyacrylamide, représente le profil de restriction de l’individu ou encore l’haplotype. La structure et la diversité du génome étudié sont respectivement caractérisées et évaluées à partir de ce profil de restriction.
b. Etapes de la manipulation Le travail s’est déroulé en trois étapes :
- l’amplification - la restriction enzymatique - la séparation des fragments et la révélation sur gel polyacrylamide
b.1. Amplification L’amplification a été réalisée à partir de la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) (Annexe 3). Elle consiste à augmenter de manière considérable le nombre des séquences d’ADN encadrées par des amorces nucléotidiques spécifiques. Les extraits d’ADN de C. asiatica ont été amplifiés avec 5 amorces chloroplastiques universelles disponibles sur le marché, à savoir FV (trn F-trn V) (Dumolin-Lapègue et al. , 1997), SR (trn S-trn R) (Grivet, 2002), HK (trn H-trn K), AS (psa A-trn S) (Demesure et al. , 1995), K5-K6 (Mat K5-Mat K6) (Grivet et al. , 2002). Leurs caractéristiques sont représentées dans le Tableau 1. Chaque amplification a été réalisée dans 20 µl de solution réactionnelle, contenant 20ng d’extrait d’ADN, 10mM de Tris-HCl, 2,5mM de MgCl 2, 100µM de chaque désoxyribonucléotide, 0,2µM de chaque amorce, 0,1mg/ml de BSA, 1 unité de Taq ADN polymérase (Goldstar DNA Polymerase, Eurogentec). Elle a été mise en réaction dans un thermocycler Peltier Thermal Cycler – 200, à des températures d’hybridation différentes en fonction de chaque couple d’amorces (Tableau 1).
b.2. Restriction enzymatique Après la PCR, les amplifiats obtenus ont été soumis à une restriction enzymatique. Cette dernière consiste à fragmenter les produits de la PCR par l’intermédiaire des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction employées ont été EcoRI, RsaI, TaqI et TasI (GibcoBRL/Eurogentec France). Leurs caractéristiques sont présentées dans Tableau 2. Les restrictions ont été effectuées dans un volume final de 10 µl de solution contenant le tampon recommandé par le fournisseur, 10U d’enzyme de restriction et 5 µl du produit d’amplification PCR.
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Matériels et méthodes
b.3. Séparation des fragments et révélation sur gel acrylamide L’action de l’enzyme de restriction sur les séquences d’ADN génère des fragments de restriction. Ces fragments peuvent être séparés sur un gel acrylamide en fonction de leurs tailles par électrophorèse verticale. Plus le fragment est de grande taille, moins la migration électrophorétique sera importante. Dans cette étude, les fragments obtenus ont été séparés sur un gel de 18 cm x 28 cm à 8% de polyacrylamide dans du tampon TBE (Tris Base, Acide Borique, Acide Ethylene Diaminetetracetique) par électrophorèse verticale. La migration a été effectuée à 200V pendant 4h. Après la migration, le gel a été immergé dans un bain de BET 0.1% (Bromure d'Ethydium) pendant 5min. La révélation des profils de restriction a été ensuite effectuée sur un transilluminateur à 312nm. Les photos des gels ont été capturées avec une caméra PULNIX TM – 6EX et récupérées avec le logiciel GelSmart.
c. Analyse de la diversité du génome chloroplastique La technique RFLP-PCR appliquée au génome chloroplastique de C. asiatica met en évidence la variabilité de la séquence nucléotidique par l’analyse des haplotypes (Horning et al. , 2006). Les fragments d’ADN de tailles variables générés par cette restriction enzymatique permettent de détecter les mutations. La variation nucléotidique est due à des changements qui se produisent au niveau des sites de restriction, ainsi qu’à des mutations de longueurs du type insertion/délétion, et plus rarement à des inversions (Dubé, 2009). Chaque mutation a été décrite en fonction de sa nature, elle peut être une mutation de site de restriction ou une mutation de longueur de restriction. Lorsque la taille d’un fragment spécifique à un individu 1 correspond au total à la taille de deux ou plusieurs fragments spécifiques à un individu 2, ceci indique qu’une mutation de site de restriction s’est produite. Dans le cas où les individus 1 et 2 présentent chacun un fragment spécifique qui diffèrent juste par leur taille, c’est une mutation de longueur de restriction (Leong Pock Tsy et al. , 2009). Les mutations ont été numérotées une par une avec des lettres.
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Matériels et méthodes
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62 57 59,5 59,5 61,5 Th (°C) Th
on (Th) 3’- 5’ 3’- 5’ …CTTAA_G... …CTTAA_G... …CA_TG… …AGC_T… …TT_AA… Séquences Coupures Coupures 5’- 3’ 5’- 3’ CCGAGAAGGTCTACGGTTCG CCGAGAAGGTCTACGGTTCG ATTGCGTCCAATAGGATTTGAA CCGACTAGTTCCGGGTTCGA AACCACTCGGCCATCTCTCCTA GGATTTCTAACCATCTTGTT …G_AATTC… …G_AATTC… …GT_AC… …T_CGA… …AA_TT… trnS trnS trnR trnR trnV trnV trnK 5 h 12 h 12 h 12 h 16 h MatK6 MatK6
(5' - 3') -(5' 3') reverse reverse Amorces Amorces Durées Durées Incubation Incubation c leurs températuresc leurs et séquences d’hybridati 37°C 37°C 37°C 62°C 65°C Températures Températures
Séquences Vn 4–211 Vn restrictions leurs avec caractéristiques CTCGTGTCACCAGTTCAAAT CTCGTGTCACCAGTTCAAAT CGCCGCTTTAGTCCAACTCA ACGGGAATTGAACCCGCGCA ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA AAAGGAAATATTGAATGAAT Origines Origines coli RY13 Escherichia shaeroides Rhodobacter Thermus aquaticus Thermus aquaticus trnF trnF trnS trnH trnH psaA psaA MatK5 MatK5 (5' - 3') -(5' 3') forward forward Amorces Amorces Listes des enzymes de de Listes enzymes des : :
2 : Liste des couples des chloroplastiques d’amorces : Liste ave Amorces Amorces Enzymes Enzymes R1 Eco I Rsa I Taq Tas I FV FV SR HK AS K6 K5 - Tableau Tableau 1
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Matériels et méthodes
II.2.2.3. Etude du génome nucléaire La technique de marquage moléculaire utilisée pour l’étude du génome nucléaire de C. asiatica a été la technique SSR, une technique basée sur la détermination du nombre de répétitions des motifs microsatellites. L’intérêt de cette technique est le polymorphisme extrêmement élevé des microsatellites.
a. Principe de la technique SSR Cette technique consiste à cribler une banque génomique avec une sonde microsatellite, à séquencer les clones positifs, à synthétiser les amorces oligonucléotidiques, et à tester ces amorces par PCR sur quelques individus afin de vérifier celles qui sont utilisables. Les échantillons étudiés sont ensuite amplifiés grâces aux amorces sélectionnées. Etant donné que les microsatellites sont constitués de motifs répétés, les locus microsatellites n’ont pas besoin d’être séquencés mais génotypés. Le génotypage consiste à déterminer la longueur des allèles d’un même locus microsatellite d’un individu. La différence de taille entre deux allèles représente l’indice de la différence du nombre de répétitions de motifs qui n’est autre que la distance génétique entre les deux allèles (Taquet, 2007).
b. Etapes de la manipulation L’étude microsatellite de C. asiatica a été réalisée en 4 grandes étapes : - 1ère étape : la construction et la caractérisation d’une banque microsatellite - 2ème étape : le séquençage des fragments d’ADN contenant les microsatellites - 3ème étape : la synthèse des amorces microsatellites - 4ème étape : le génotypage
b.1. Construction et caractérisation de banque microsatellite A notre connaissance, aucune étude microsatellite de C. asiatica n’a été encore mentionnée dans la littérature, ainsi une banque enrichie en locus microsatellites spécifique à l’espèce a été conçue. Cette banque est constituée d’un ensemble de vecteurs recombinants contenant chacun un morceau de séquences microsatellites du génome nucléaire de C. asiatica (Tagu, 1999). La construction d’une banque microsatellite consiste à isoler l’ADN génomique de l’espèce, à digérer cet ADN par une enzyme de restriction pour avoir des fragments de petites tailles faciles à manipuler, à capturer les fragments contenant des séquences microsatellites, à cloner ces fragments dans un vecteur de clonage et à intégrer ces vecteurs dans un micro-
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Matériels et méthodes organisme afin de les multiplier. La banque est ainsi constituée de millions de clones recombinants (Annexe 5) (Tagu, 1999). La banque enrichie en locus microsatellites de C. asiatica est réalisée à partir de l’ADN du clone de référence VOHI_réf à feuilles réniformes. Elle est construite suivant le protocole établi par Billotte et al. (1999) qui comprend neuf étapes : - Extraction d’ADN - Digestion enzymatique - Ligation et amplification PCR - Capture des fragments contenant un microsatellite - Amplification des fragments capturés - Clonage - Hybridation - Autoradiographie - Repérage des clones positifs
b.1.1. Extraction d’ADN L’ADN de VOHI_réf est extraite suivant le protocole d’extraction de Doyle and Doyle (1987), décrit plus haut.
b.1.2. Digestion enzymatique 10µg de l’ADN génomique de VOHI_réf ont été soumis à une restriction par une enzyme appelée RsaI à 37°C. L’enzyme va cliver l’ADN au niveau des sites de restriction GTAC pour donner une multitude de fragments d’ADN double brin. Ces fragments de petites tailles (en général quelques centaines de paires de base) sont facilement manipulables.
b.1.3. Ligation et amplification par PCR Des adaptateurs RSA21(*) et RSA25 (*) ont été ensuite ligués à chaque extrémité des fragments d’ADN grâce à une enzyme T4 DNA ligase. Une PCR avec l’amorce RSA21 a été ensuite réalisée sur 10ng du produit de ligation, afin d’amplifier les fragments obtenus. L’amplifiat a été ensuite purifié avec le kit de purification QIAquick PCR Purification de QIAGEN. * RSA21 : 5’ CTCTTGCTTACGCGTGGACTA 3’ * RSA25 : 5’ TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA 3’
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Matériels et méthodes
b.1.4. Capture des fragments contenant un microsatellite Après la purification, le produit d’amplification a été dénaturé à 95°C pendant 15min. Des oligonucléotides de synthèse biotinylés en 5’ ou sondes biotinylées y ont été ajoutés. Ces sondes, présentant un motif de type microsatellite I 5(GA) 8 ou I 5(GT) 8, vont se fixer par complémentarité sur les fragments contenant les microsatellites correspondants. Des billes magnétiques associées avec de la streptavidine ont été ajoutées à ce produit d’hybridation. L’interaction protéique forte entre la biotine et la streptavidine permet aux billes magnétiques de s’associer avec les sondes biotinylées. Ainsi, tous les fragments contenant des microsatellites ont été magnétisés et ont été maintenus sur la paroi du tube utilisé grâce à un aimant placé à l’extérieur de celui-ci. Toutes les séquences d’ADN non-magnétisées ont été éliminées grâce à plusieurs lavages successifs avec du SSC 0.1X (0.3M NaCl, 0.03M citrate de sodium (pH 7)).
b.1.5. Amplification des fragments capturés A l’issue de la phase de capture, les fragments génomiques sont constitués d’ADN simple brin. Afin de reconstituer le second brin du fragment d'ADN, et augmenter la quantité de fragments obtenue, 20 cycles de PCR additionnels ont été réalisés en utilisant l’amorce RSA21.
b.1.6. Clonage Le principe du clonage est fourni en annexe 6. Brièvement, chaque fragment d’ADN, a été introduit dans le vecteur de clonage plasmidique pGEM-T Easy vector (Promega) grâce à une ligation par l’enzyme ligase. Les plasmides ont été ensuite transformés dans une souche bactérienne d’ Escherichia coli DH10BT1 R (Invitrogen) par électroporation. Les bactéries ainsi transformées ont été cultivées sur milieu 2YT solide complémenté avec de l’ampicilline et du Xg al. Après une nuit de culture à 37°C, chaque colonie bactérienne blanche a été repiquée sur un milieu liquide 2YT et a été amplifié par PCR avec RSA21. Les produits d’amplification ont été séparés sur un gel d’agarose puis transférés sur une membrane Hybond-N+ (GE Healthcare) afin d’être hybridés. Une manipulation à l’aide du robot GENETIX QPIX II XT a été également réalisée en parallèle. Les bactéries cultivées sur le milieu solide ont été repiquées à l’aide du robot dans des plaques PCR sur du milieu liquide. Après une nuit de culture à 37°C, les bactéries ont été directement transférées sur des membranes posées sur du milieu de culture gélosé et remise en
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Matériels et méthodes culture à 37°C. Le lendemain, les colonies bactériennes ont été dénaturées directement sur les membranes pour fixer l’ADN. Chaque membrane existe en double pour avoir 2 lots identiques : l’un pour pouvoir hybrider plus tard l’oligonucléotide GA et l’autre pour l’hybridation de l’oligonucléotide GT.
b.1.7. Hybridation L’étape d’hybridation est également appelée enrichissement. Elle consiste à hybrider des sondes constituées oligonucléotides GA et GT, marqués en position gamma avec l’élément radioactif 32 P, aux fragments clonés présent sur les membranes. L’hybridation de la sonde ne peut avoir lieu que sur les fragments contenant un microsatellite correspondant à la sonde. Chaque lot de membrane a été enroulé et inséré dans deux tubes d’hybridation séparés, contenant respectivement les sondes marquées correspondant aux oligonucléotides GA et GT et 10ml de solution d’hybridation contenant 50% de formamide désionisée, 10% de dextran sulfate, 2xSSC, 1% de SDS. Les deux tubes ont été ensuite déposés dans un four à hybridation rotatif à une température de 55°C pendant 4h pour l’hybridation. Après cette étape, les membranes ont été rincées deux fois avec une solution de 5 SSPE (Sodium chloride, sodium phosphate monobasic, EDTA) à 55°C et une fois avec une solution de 0,1 SSPE et de 0,1 SDS à 40°C afin d’éliminer les molécules d’oligonucléotides marquées qui n’étaient pas hybridées. Les membranes ont été ensuite séchées.
b.1.8. Autoradiographie Les signaux radioactifs présents sur la membrane ont été révélés par autoradiographie. Pour cela, les membranes ont été mises en contact avec un film Fuji Rx et ont été exposées pendant 1h en cassette. Chaque signal obtenu sur le film correspond à l’hybridation de la sonde sur un fragment contenant un microsatellite.
b.1.9. Repérage des clones positifs Après les résultats de l’autoradiographie, les clones bactériens contenant des fragments microsatellites ont été repérés, sélectionnés et cultivés sur un milieu liquide pour constituer la banque enrichie en locus microsatellites de C. asiatica . Une fois que la banque microsatellite est construite, l’ADN plasmidique dans chaque bactérie a été séquencé.
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Matériels et méthodes
b.2. Séquençage Le séquençage est une étape qui consiste à déterminer l’enchainement des nucléotides dans chacun des fragments d’ADN. Le séquençage des fragments d’ADN contenant des microsatellites de C. asiatica a été réalisé par la société GATC Biotech basée en Allemagne. Les séquences ont été ensuite analysées avec SAT (http://sat.cirad.fr/sat) (Dereeper et al. , 2007), un pipeline électronique hébergé sur la plateforme bioinformatique Southgreen (http://southgreen.cirad.fr /), conçu spécifiquement pour l’analyse des séquences obtenues à partir d'une banque enrichie en locus microsatellites.
b.3. Synthèse des amorces Le pipeline SAT, après avoir analysé les séquences, propose une sélection d’amorces capables d’amplifier chaque séquence microsatellite détectée. Les amorces ou marqueurs microsatellites sélectionnés ont été envoyés à la société Sigma-Aldrich France pour être synthétisés.
b.4. Génotypage Le génotypage se fait de manière automatisée via un séquenceur. Dans cette étude, il a pour objectif de faire une analyse fine de la structure génétique de tous les individus étudiés par la détermination de la longueur des allèles de chaque locus. Le génotypage de C. asiatica a été réalisé au sein de la plateforme de génotypage Languedoc-Roussillon France sur un séquenceur automatique à 24 capillaires de dernière génération de type ABI 3500 XL. Avant de procéder au génotypage proprement dit, une amplification par PCR de ces marqueurs microsatellites sur tous les individus étudiés a été effectuée. Les marqueurs microsatellites ont été amplifiés à partir des extraits d’ADN suivant le protocole d’amplification d’Oblessuc et al. (2009) qui consiste à utiliser des amorces marquées par fluorescence et le kit d’amplification Ampli Taq Gold Kit (Applied BiosystemTM). Chaque marqueur a été donc marqué par un fluorochrome, une substance chimique qui après excitation par une longueur d’onde particulière émet une fluorescence à une longueur d’onde spécifique. Quatre fluorochromes différents ont été utilisés, à savoir le Fam, le Vic, le Ned et le Pet (Applied BiosystemTM). Ils correspondent respectivement à la couleur bleue, verte, noire et rouge assignée par le logiciel d’analyse. Chaque marqueur microsatellite a été ainsi associé à un fluorochrome. Une PCR normale a été effectuée pour chaque marqueur. La réaction PCR a été effectuée dans 10µl de solution réactionnelle contenant 25ng d’ADN, 1X de tampon PCR, 0,5mM de MgCl 2, 200µM de dNTP, 0,1µM de chaque amorce et 0,1U/µl
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Matériels et méthodes
Taq DNA polymérase, dans les conditions suivantes : 2min de dénaturation initiale à 94°C, 35 cycles composés d’une étape de dénaturation de 30sec à 94°C, d’une étape d’hybridation de 45sec à une température d’hybridation spécifique à chaque marqueur, et d’une étape d’élongation de 1min 30sec à 72°C, suivie de 8min d’élongation finale à 72°C. L’utilisation de quatre fluorochromes différents permet le multiplexage, c’est-à-dire, qu’après la PCR et pour chaque individu, les produits d’amplification de quatre marqueurs différents associés chacun à un fluorochrome différent ont été mélangés dans un seul tube. Le séquenceur détecte séparément les quatre fluorochromes qui correspondent respectivement aux quatre marqueurs. La possibilité d’utiliser plusieurs fluorochromes est un gain d’informations et de temps car au lieu d’effectuer une seule analyse, quatre ont été réalisées en un seul passage dans le séquenceur. Après le multiplexage, à 2µl de chaque produit d’amplification ont été ajoutés 10µl d’un mélange de formamide et du marqueur de taille LIZ600. Ce marqueur de taille contient également un fluorochrome différent des quatre autres. Le séquenceur l’utilise comme référence pour déterminer la taille des différents allèles des microsatellites. Par ailleurs, avant le génotypage, l’ADN a été dénaturé à 95°C pendant 5min dans un thermocycleur PCR. Grâce à la formamide qui empêche les liaisons hydrogènes de se reformer au-delà de 42°C, l’ADN va rester sous sa forme dénaturée. Ainsi, lors de la migration dans le séquenceur, l’ADN est donc en configuration monobrin. Les deux brins d’ADNs complémentaires migrent côte à côte. Ce procédé est plus rapide que si le génotypage se passait en conditions non dénaturantes, de plus cela évite un écrasement du polymère et assure une séparation maximum, jusqu'à la base près. Le produit final a été ensuite passé au séquenceur ABI3500 XL Applied Biosystem. Le génotypage a été effectué à partir de plaques Elisa 96 (plaques de 96 puits) et à partir de plaques Elisa 384 (plaques de 384 puits). Le séquenceur, possédant 24 capillaires, traite 24 échantillons à la fois, cela correspond à un run. Chaque run dure environ une demi-heure. Le génotypage d’une plaque 96 a duré ainsi 2h20 et celui d’une plaque 384 a duré 9h. Ce processus est résumé en annexe 7. Les résultats ont été ensuite visualisés sous forme de chromatogrammes sur le logiciel GeneMapper (Annexe 8). Chaque pic du chromatogramme représente un allèle qui est automatiquement assigné à sa taille en nucléotide par le logiciel.
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Matériels et méthodes
c. Analyse de la structure du génome nucléaire Afin de définir la structure du génome nucléaire, les données obtenues du génotypage ont été soumises à des analyses de statistiques descriptives, à savoir la caractérisation des marqueurs microsatellites, la caractérisation des allèles produits et le calcul de quelques indices de génétique des populations.
c.1. Caractérisation des marqueurs microsatellites La comparaison entre les marqueurs microsatellites a été réalisée à l’aide d’indices de diversités simples que sont : - le nombre de marqueurs polymorphes, un marqueur est polymorphe dans un ensemble d’échantillons lorsqu’il présente plus de 2 allèles différents (Tani et al. , 2009) -.la richesse allélique ou nombre d’allèles, - la distribution par taille des allèles pour une classification des marqueurs en fonction de la répartition des allèles en groupe ou mode et en fonction de leurs allèles majoritaires, c’est-à- dire les allèles les plus rencontrés dans chaque locus, - la valeur PIC (Polymorphism Information Content) calculée suivant la formule de Botstein et al. (1980) pour cibler les marqueurs informatifs : un marqueur est reconnu informatif lorsque son PIC est supérieur à 0,5.
c.2. Caractérisation des allèles produits Le nombre d’allèles par individu a été compté afin de confirmer le niveau de ploïdie des individus étudiés. Le taux d’allèles communs et spécifiques ont été relevés afin d’évaluer l’homogénéité des individus au sein d’une population.
c.3. Indices de génétique des populations Deux indices de génétiques de population ont été déterminés :
- les hétérozygoties calculés (H e) et les hétérozygoties observés (H o) calculées suivant les formules développées par Nei (1973.) et Nei et Roychoudhury (1974) en utilisant le logiciel Powermarker 3.25 (Liu et al. , 2005): si Ho
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Matériels et méthodes conduit à la déviation de cet équilibre de Hardy–Weinberg, causée par une déficience d’hétérozygotie (Sun et al. , 2003).
d. Analyse de la diversité du génome nucléaire Les microsatellites sont répartis sur l’ensemble du génome d’une espèce et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce polymorphisme repose sur la variation du nombre d’unités de répétition constituant le microsatellite. L’analyse de ce polymorphisme conduit à l’évaluation de la diversité génétique au niveau du génome nucléaire des individus. Les résultats obtenus par GeneMapper ont été analysés avec le logiciel DARwin 5 software package Version 5.0.158 (Perrier et al. , 2003). Une représentation graphique de la diversité génétique existante au niveau de la population de C. asiatica de Madagascar a été édifiée à partir d’une Analyse Factorielle sur Tableau de Distance (AFTD). L’AFTD est un procédé d’analyses multidimensionnelles analogues à l’Analyse en Composantes Principales, mais adaptée à l’étude des liaisons entre deux ou plusieurs variables qualitatives. Le principal intérêt de la méthode est de représenter les individus par un système de points situés dans un espace euclidien, ce qui permet la visualisation des regroupements des individus. Par ailleurs, un arbre de diversité globale a été construit en utilisant la méthode de Neighbor-Joining (Saitou et al. , 1987) afin d’analyser la relation entre les individus. Cette méthode de Neighbor-Joining permet d’élaborer des arbres phylogénétiques sans racines à partir de distances génétiques ou de dissimilarités.
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RESULTATS
Résultats
I. CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES DE CENTELLA ASIATICA DE
MADAGASCAR La caractérisation biologique de C. asiatica rassemble les informations sur la morphologie florale, la reproduction, la cytogénétique et les caractéristiques des stomates de l’espèce.
I.1. MORPHOLOGIE DES FLEURS L’étude morphologique des fleurs de C. asiatica , basée sur des observations macroscopiques, a été réalisée sur le clone de référence et sur les individus provenant d’Ambohitromby I, Ambohitromby II, Cap Saint André, Mahajanga, Morondava, Sahoany et Vangaindrano I. Les observations ont montré que ces individus ont des fleurs hermaphrodites composées de (Figure 6, Planche IV): - un calice tronqué avec des sépales verts très courts - une corolle à 5 pétales libres de couleurs variant de rose à rose violacée - un androcée formé de 5 étamines alternipétales, à filet court, avec des anthères introrses dithèques. - un gynécée muni d’un ovaire infère à deux carpelles, surmonté d’un style court terminé par des stigmates ovoïdes transparents (Figure 7, Planche V). Aucune différence morphologique n’a été observée entre les fleurs des individus des différents sites d’études. Les fleurs des individus à feuilles réniformes et celles des individus à feuilles orbiculaires sont identiques.
I.2. REPRODUCTION SEXUEE L’étude de la reproduction sexuée de C. asiatica a été réalisée sur le clone de référence VOHI_réf à feuilles réniformes et sur un individu MORO provenant de Morondava à feuilles orbiculaires. Elle a consisté à déterminer le mode de fécondation de C. asiatica à partir d’un test d’autofécondation et d’un test de fécondation libre, associés d’un suivi du développement des plantes et d’une vérification de la fertilité des graines produites.
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Résultats
Figure 6 : Dessin de fleur de Centella asiatica
Planche IV
Photos des fleurs des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I (Photo 17), de Mahajanga (Photo 18), de Morondava (Photo 19), de Sahoany (Photo 20), d’Ambohitromby II (Photo 21), du Cap Saint André (Photo 22), de Vangaindrano (Photo 23) et de Vohimana (clone de référence) (Photo 24) Photos 17 à 20 : fleurs d’individus à feuilles orbiculaires Photos 21 à 24 : fleurs d’individus à feuilles réniformes 50
Résultats
Figure 7 : Dessin d’une coupe longitudinale d’ovaire de Centella asiatica
Planche V
Coupes longitudinales d’ovaires des fleurs de Centella asiatica provenant du Cap Saint André (Photo 25),de Morondava (Photo 26), de Vohimana (clone de référence) (Photo 27) et de Mahajanga (Photo 28) Photos 25 et 27 : ovaires d’individus à feuilles réniformes ; Photos 26 et 28 : ovaires d’individus à feuilles orbiculaires
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Résultats
I.2.1. Développement des plantes Pour déterminer le mode de fécondation de C. asiatica un suivi du développement des individus VOHI_réf à feuilles réniformes et des individus MORO à feuilles orbiculaires, en conditions libre et isolée, a été réalisé. Les données recueillies sont résumées dans le Tableau 3.
Tableau 3 : Calendrier de suivi du développement des individus de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et de Morondava (MORO)
VOHI_réf MORO Formes des feuilles Feuilles réniformes Feuilles orbiculaires Tests de fécondation Isolés Libre Isolés Libre Plantation Février 2010 Février 2010 Février 2010 Février 2010 Floraison Mai 2010 Mai 2010 Avril 2010 Avril 2010 Fructification Juin à Aout 2010 Mai 2010 Maturation des fruits Janvier 2011 Avril 2011 Octobre 2010 Octobre 2010
Le développement des individus VOHI_réf et MORO diffère par le temps mis pour atteindre la maturité c’est-à-dire la floraison. Après la plantation, isolés ou libre, MORO met 2 mois pour fleurir tandis que VOHI_réf prend 3 mois. La fructification a été considérée à partir de la chute définitive du calice, de la corolle et de l’androcée. Dans les deux conditions, les fleurs de MORO se sont transformées en fruits en une période de 20 à 30 jours après la floraison, tandis que la fructification de VOHI_réf ne s’est effectuée qu’à partir de 30 à 90 jours après la floraison. Les fleurs de MORO se sont fructifiées en une période plus courte par rapport à celles de VOHI_réf. Concernant la maturation des fruits, elle a été notée à partir du moment où les fruits tombent au sol. Ce phénomène est plus rapide chez MORO que chez VOHI_réf. Les fruits de MORO, atteignent la maturité 5 mois après la fructification quelque soit les conditions. Quant-à VOHI_réf, les fruits des clones isolés sont matures 6 à 7 mois après la fructification, ceux des clones en condition libre ne le sont que 9 à 10 mois après.
I.2.2. Fertilité des graines Le contrôle de la fertilité des graines produites par les plantes cultivées en condition libre et en condition isolée permet de définir le mode de fécondation adopté par ces plantes. Pour cela, un essai de germination a été réalisé afin de déterminer la durée et
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Résultats le taux de germination des graines. Les fruits issus des essais précédents ont été récoltés un mois après leur maturation pour le test de germination. Les individus VOHI_réf, qu’ils soient isolés ou libres, ont produit en moyenne une même quantité de graines. Un même nombre de graines a pu alors servir au test de germination, soit 270 graines. Chez MORO, l’autofécondation a produit deux fois plus de graines que la fécondation libre. Ainsi 330 graines issues de l’autofécondation et 170 graines issues de la fécondation libre ont été utilisées pour le test de germination. Une grande différence de durée de germination a été observée d’une part entre MORO et VOHI_réf et d’autre part par rapport aux conditions de culture de chaque clone. La germination de VOHI_réf a été plus lente que celle de MORO. Pour MORO, les premières germinations issues de l’autofécondation ont été observées 17 jours après le semis, tandis que celles issues de la fécondation libre apparaissent 26 jours après. Quant- aux individus VOHI_réf, les premières germinations des graines issues des deux tests de fécondation ont été observées 4 mois après le semis. Si l’expérimentation a été prévue sur 4 mois, elle a été prolongée de 4 mois pour VOHI_réf afin de pouvoir suivre le devenir des graines germées. Concernant le taux de germination, des valeurs assez variées ont été relevées (Tableau 4). Chez MORO, les graines issues de la fécondation libre ont présenté un taux de germination très élevé de 87,06% par rapport à celui des graines issues de l’autofécondation (43,33%). Pour VOHI_réf, bien que la maturation des fruits des individus en condition libre ait été très retardée, leur taux de germination s’élève à 55,55% alors que les individus isolés n’ont présenté que 1,85% de germination. Ces données, obtenues 4 mois après l’apparition des premières plantules, sont présentées dans le Tableau 4 et la Planche VI.
Tableau 4 : Taux de germination des plantes de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et de Morondava (MORO) après 4 mois de semis
VOHI_réf MORO Formes des feuilles Feuilles réniformes Feuilles orbiculaires Types de fécondation Autofécondation Fécondation libre Autofécondation Fécondation libre Graines semées 270 270 330 170 Graines germées 5 150 143 148 Taux de germination 1,85 55,55 43,33 87,06 (%)
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Résultats
En considérant la forme des feuilles, ces résultats montrent que la reproduction sexuée des individus de C. asiatica à feuilles réniformes et à feuilles orbiculaires est plus efficace lorsqu’ils vivent en association avec d’autres individus que lorsqu’ils sont isolés.
Planche VI
Semis de Centella asiatica provenant de Vohimana (clone de référence) ( Photo 29 ) et de Morondava ( Photo 30), 5 mois après les semailles.
I.3. CYTOGENETIQUE Sur les huit populations transplantées à Montpellier, sept ont pu servir pour l’étude cytogénétique de C. asiatica . Les individus de Morondava ont mis du temps à s’acclimater à tel point que la qualité des pointes racinaires était inappropriée pour l’étalement chromosomique. Cette étude chromosomique a été basée sur un comptage chromosomique classique suivi d’une localisation et d’un comptage des sites ADNr au niveau des chromosomes, afin de déterminer respectivement le nombre de chromosomes et le niveau de ploïdie de C. asiatica .
I.3.1. Nombre de chromosomes Le comptage chromosomique a été effectué au total sur 84 cellules dont en moyenne 16 cellules par sites, sauf pour les individus de Vangaindrano (VANG) et Sahoany (SAHO) (Tableau 5). Seulement 6 cellules ont été exploitables pour VANG, car les cellules étaient très sensibles à la digestion enzymatique tellement les méristèmes racinaires étaient petits. Quant-à SAHO, seulement 4 cellules ont été observées car beaucoup ont été détériorées du fait du mauvais état de la plante.
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Résultats
Le nombre de chromosomes a été fonction du site, cependant ce nombre a été constant pour les individus d’un même site. Les individus d’Ambohitromby I (AMBR I), de Mahajanga (MAJG) et de Sahoany (SAHO) ont 18 chromosomes (Tableau 5, Planche VII, Photos 31 – 32 - 33). Les individus d’Ambohitromby II (AMBR II), du Cap Saint André (CAPA), de Vangaindrano (VANG) et le clone de référence ont 36 chromosomes (Tableau 5, Planche VII, Photos 34 – 35 – 36 - 37). Néanmoins, tous ces individus possédaient deux chromosomes associés à des chromosomes satellites qui sont de petites masses de chromatine situées à l'extrémité du bras court de chaque chromatide d'un chromosome acrocentrique. Ces observations ont montré que les plantes ayant la même forme de feuilles présentent le même nombre de chromosomes. Les individus à feuilles réniformes possèdent deux fois plus de chromosomes que ceux à feuilles orbiculaires.
Tableau 5 : Nombres de chromosomes des individus de Centella asiatica
Formes des Sites de Nombre de Nombre de Populations Accessions feuilles collectes cellules chromosomes Vohimana VOHI réf VOHI réf 10 36 CAPA 1 12 36±1 Cap Saint André CAPA CAPA 2 5 36 Feuilles VANG 2 3 36±2 réniformes Vangaindrano VANG VANG 3 3 36 AMBRII 1 10 36±2 Ambohitromby AMBRII AMBRII 2 5 36 Ambohitromby AMBRI AMBRI 1 16 18 Feuilles Sahoany SAHO SAHO 1 4 18 orbiculaires Mahajanga MAJG MAJG 1 16 18
I.3.2. Localisation et nombre de sites ADNr La localisation et le comptage des sites ADNr ont été effectués d’une part pour pouvoir calculer le nombre de chromosomes de base de C. asiatica et d’autre part pour déterminer le niveau de ploïdie de l’espèce. Ceux-ci ont été réalisés grâce à la technique FISH. Les sites ADNr 45S et ADNr 5S, révélés respectivement au Texas Red et au FITC, ont été observés simultanément sur les chromosomes de chaque cellule de C. asiatica (Figure 8).
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Résultats
Tous les individus de C. asiatica analysés ont affiché deux sites ADNr 5S (Tableau 6). Les signaux d'hybridation ont été localisés dans les régions télomériques des chromosomes, c’est-à dire à l’extrémité des bras des chromosomes, pour AMBR I, SAHO, VANG et le clone de référence (Planche VII , Photos 31 – 33 – 36 - 37). Par contre, ils ont été localisés dans les régions du centromère des chromosomes pour MAJG, AMBR II et CAPA (Planche VII, Photos 32 – 34 - 35). Aucune différence d’intensité des signaux n’a été observée entre les deux sites d’ADNr 5S. Deux sites ADNr 45S ont été détectés pour AMBR I, MAJG, SAHO, CAPA, VANG et le clone de référence (Tableau 6, Planche VII, Photo 31 – 32 – 33 – 35 – 36 - 37). Ces deux sites ont été dans tous les cas retrouvés sur des chromosomes satellites avec des signaux d'hybridation de même intensité (Planche VII). Ces chromosomes satellites ont été identifiés grâce à la fluorescence du Texas Red sur leur liaison avec leurs chromosomes respectifs. Ceci a permis de ne pas les confondre avec un chromosome supplémentaire. Les accessions de AMBR II ont affiché, par ailleurs, 4 sites ADNr bien distincts: deux sites correspondant à des signaux d'hybridation très intenses au niveau des chromosomes satellites et deux sites à signaux moins intenses, localisés dans les régions télomériques des chromosomes (Planche VII , Photo 34).
Tableau 6 : Nombre de chromosomes et nombre de sites ADNr 45S et ADNr 5S sur les chromosomes de Centella asiatica suite à une hybridation in-situ en fluorescence
Formes Nombre de Nombre de sites Sites de collecte Populations des feuilles chromosomes ADNr 5S ADNr 45S
Vohimana VOHI_réf 36 2 2
Cap Saint André CAPA 36 2 2 Feuilles réniformes Vangaindrano VANG 36 2 2
Ambohitromby AMBR II 36 2 4
Ambohitromby AMBR I 18 2 2
Feuilles Sahoany SAHO 18 2 2 orbiculaires Mahajanga MAJG 18 2 2
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Résultats
Figure 8 : Dessin de chromosomes avec les sites ADNr 5S (en vert) et les sites ADNr 45S (en rouge).
Planche VII
Chromosomes des cellules méristématiques des racines de Centella asiatica colorés au DAPI (en bleu) après une hybridation in-situ en fluorescence des sites ADNr 5S (en vert) et des sites ADNr 45S (en rouge). Cellules des accessions à 2n=18 chromosomes provenant d’Ambohitromby I ou AMBR I ( Photo 31 ), de Mahajanga ou MAJG ( Photo 32 ), de Sahoany ou SAHO ( Photo 33 ). Cellules des accessions à 2n=36 chromosomes provenant d’Ambohitromby II ( Photo 34 ), du Cap Saint André ou CAPA ( Photo 35 ), deVangaindrano ( Photo 36 ) et deVohimana ou VOHI_réf ( Photo 37 ) 57
Résultats
I.4. DENSITE ET TAILLE DES STOMATES L’étude des stomates a été réalisée en appui à l’étude cytogénétique dans le but d’évaluer le niveau de ploïdie de C. asiatica . Elle consistait à déterminer la taille et la densité des stomates des feuilles à partir d’observations microscopiques (Figure 9). Les caractéristiques des stomates des individus d’Ambohitromby I (AMBR I) à feuilles orbiculaires, et du clone de référence (VOHI_réf) à feuilles réniformes, sont présentées dans le Tableau 7 et leurs photos sont présentées sur la Planche VIII (Photos 38 et 39). Les tailles des stomates de VOHI_réf et d’AMBR I ont été presque identiques, par contre les stomates d’AMBR I ont été deux fois plus denses que ceux de VOHI_réf.
Figure 9 : Dessin de stomates des épidermes inférieurs des feuilles de Centella asiatica
Planche VIII
Stomates des épidermes inférieurs des feuilles de Centella asiatica provenant de Vohimana ou VOHI_réf ( Photo 38 ) et d’Ambohitromby I ou AMBR I ( Photo 39 )
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Résultats
Tableau 7 : Densités et tailles des stomates des feuilles des individus de Centella asiatica provenant de Vohimana (VOHI_réf) et d’Ambohitromby I (AMBR_I)
Densités Tailles Stomates (nombre stomate/mm²) (µm) Individus VOHI_réf AMBR I VOHI_réf AMBR I Forme des Feuilles Feuilles Feuilles Feuilles feuilles réniformes orbiculaires réniformes orbiculaires Moyennes 13.93 29.3 24.69 23.99
Ces observations ont été confirmées statistiquement par le test ANOVA. En comparant la densité stomatale de VOHI_réf et AMBR I, un P value < 0,0001 et un écart-type inférieur au paramètre valeur ont été démontrés (Tableau 8). Les densités des stomates de VOHI_réf et AMBR I sont donc significativement différentes.
Tableau 8 : Tableau de variance de la densité de stomates des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I (AMBR I) et de Vohimana (VOHI_réf)
Provenances Formes des feuilles Valeurs Ecart-types P values AMBR I Feuilles orbiculaires 0,942 0,070 < 0,0001 VOHI_réf Feuilles réniformes 0,000 0,000
Contrairement à la densité, le test ANOVA effectué sur la taille des stomates de VOHI_réf et AMBR I affiche un P value > 0,0001 et un écart-type largement supérieur au paramètre valeur (Tableau 9). Les tailles des stomates ne sont donc pas significativement différentes pour VOHI_réf et AMBR I.
Tableau 9 : Tableau de variance de la taille de stomates des individus de Centella asiatica provenant d’Ambohitromby I (AMBR I) et de Vohimana (VOHI_réf)
Provenances Formes des feuilles Valeurs Ecart-types P values AMBR I Feuilles orbiculaires -0,120 0,067 0,074 VOHI_réf Feuilles réniformes 0,000 0,000
Bien qu’aucune différence n’ait été observée au niveau de la taille des stomates des individus, leurs densités sont significativement différentes. Les individus à feuilles orbiculaires présentent des stomates deux fois plus nombreux que les individus à feuilles réniformes.
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Résultats
II. DIVERSITE DE CENTELLA ASIATICA DE MADAGASCAR L’étude de la diversité de C. asiatica a été focalisée sur la morphologie des feuilles et sur la structure du génome chloroplastique et du génome nucléaire.
II.1. DIVERSITE MORPHOLOGIQUE DES FEUILLES Afin de mettre en évidence les différences morphologiques des feuilles, une mesure de différentes dimensions de cet organe a été réalisée. Les huit paramètres étudiés sont: la surface foliaire (S), la grande longueur (GL), la longueur (L), la largeur (l), le poids de la matière sèche (P), la longueur du pétiole (LP), le rapport entre la grande longueur et la largeur (GL/l), et le rapport entre la grande longueur et la longueur (GL/L). L’Analyse en Composantes Principales (ACP) a abouti à une représentation de la répartition des individus de C. asiatica dans un plan (Figure 11). Le plan considéré dans cette analyse est celui formé par les axes F1 et F2 qui contribuent respectivement à 49,63% et à 24,17% de la répartition des individus, soit un total de 73,80%. Les paramètres les mieux représentés dans ce plan sont la surface, la longueur, la grande longueur, le poids de la matière sèche et le rapport entre la grande longueur et la largeur du limbe avec un coefficient de corrélations r proche de 1 (Tableau 10) et les extrémités de leurs vecteurs sont proches du cercle de corrélation (Figure 10). La surface, la longueur, la grande longueur et le poids de la matière sèche, définissant la taille des feuilles, sont liés à l’axe F1. Cet axe traduit ainsi la taille des feuilles. Le rapport entre la grande longueur et la largeur du limbe, qui représente un des variables définissant la forme des feuilles, est quant-à lui lié à l’axe F2.
Tableau 10 : Coefficients de corrélation des huit paramètres étudiés sur la feuille de Centella asiatica
Paramètres Codes F1 F2 Longueur du pétiole LP 0,086 0,037 Surface S 0,946 0,004 Largeur l 0,507 0,436 Longueur L 0,721 0,237 Grande longueur GL 0,788 0,006 Poids de la matière sèche P 0,869 0,000 Grande longueur / Largeur GL-l 0,002 0,689 Grande longueur / Longueur GL-L 0,052 0,525 En gras, les valeurs à repérer
60
Résultats
Variables (axes F1 et F2 : 73,80 %)
1 GL-l 0.75
0.5 L
0.25 GL 0 P
S
F2 (24,17 (24,17 F2 %) LP -0.25
-0.5 l
-0.75 GL-L
-1 -1 -0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 F1 (49,63 %)
Figure 10 : Cercle de corrélation des huit paramètres mesurés sur la feuille de Centella asiatica , dans le plan 1-2
Etant donné que les individus sont extrêmement nombreux, les barycentres respectifs des groupes de points ont été considérés pour l’interprétation de leur répartition (Figure 11). Dans le plan, les barycentres des individus de la région orientale et de la région occidentale se sont bien différenciés suivant l’axe F1. Le barycentre des individus de la région orientale ayant des feuilles réniformes (groupe A) se trouve dans la partie négative de l’axe F1 tandis que celui des individus de la région occidentale à feuilles orbiculaires (groupe B) se trouve dans la partie positive. Suivant la traduction de l’axe F1, cette observation signifie que les feuilles du groupe A sont petites par rapport à celles du groupe B. Une relation région - taille de feuilles est ainsi mise en évidence. Toutefois, il est noté que les individus du Cap Saint André (CAPA) sont retrouvés dans le groupe A et présentent des feuilles réniformes, alors que ce site est situé à l’Ouest de Madagascar. Même situation pour les individus d’Antalaha (ANTA), ils ont des feuilles orbiculaires et sont classés dans le groupe B alors qu’Antalaha est une région de l’Est de l’île. Ces deux constats laissent penser que ces populations ont été ramenées dans ces régions et y ont été plantées. Les enquêtes auprès des populations locales ont confirmé cette hypothèse.
61
Résultats
iculaires (Groupe iculaires B)
à feuilles réniformes feuilles à à et (Groupe A) feuilles orb suivant barycentres leurs
, 2 - Centella asiatica sur le plan 1 plan le sur
uniflora
Centella
Répartition individus des de : Figure 11 Figure individus des et de
62
Résultats
La position des barycentres par rapport à l’axe F2 n’est pas significative. Les paramètres définissant la forme de la feuille choisis dans cette étude n’ont pas permis de distinguer significativement la distribution des individus. Néanmoins, en observant la répartition globale des individus, il est remarqué que les individus du groupe A sont éparpillés sur tout le plan (F1, F2) par rapport à ceux du groupe B. Cette distribution montre l’existence d’une variabilité de l’aspect réniforme des feuilles à l’intérieur du groupe A. La Figure 11 montre également que le barycentre de C. uniflora est lié à l’axe F1 et est placé encore plus à gauche de celui de C. asiatica de la région orientale. C. uniflora possède donc des feuilles encore plus petites que les individus de C. asiatica de l’Est. Cette ACP a ainsi montré que les individus de C. asiatica étudiés se répartissent significativement en fonction de la taille des feuilles et suivant les régions. Les individus de la région orientale ayant des feuilles réniformes ont de petites feuilles, tandis que les individus de la région occidentale à feuilles orbiculaires ont des grandes feuilles. Les plus grandes feuilles sont retrouvées dans les sites d’Andranomena, Kandreho, Ambatomainty, Tambohorano et Antsohihy et les plus petites sont localisées à Vohémar. Il est montré que la position géographique a un effet positif sur la détermination de la taille des feuilles et un effet négatif sur la détermination de la forme des feuilles. Ces affirmations ont été vérifiées par le test ANOVA. La taille et la forme de la feuille ont été analysées séparément. Par rapport à la taille des feuilles, les régions de l’Est et de l’Ouest présentent un Pvalue < 0,0001 et des écart-types inférieurs aux paramètres valeurs (Tableau 11). Les individus de ces deux régions présentent donc des tailles de feuilles significativement différentes.
Tableau 11 : Tableau de variance de la taille des feuilles des individus de Centella asiatica
Provenances Valeurs Ecart-types P values Constantes -3,405 0,729 < 0,0001 Régions orientales 2,788 0,734 0,000 Régions occidentales 5,297 0,744 < 0,0001
Par contre, par rapport à la forme de la feuille, le P value est largement supérieur à 0,0001 et les écart-types sont supérieurs aux paramètres valeurs (Tableau 12). La forme des feuilles n’est donc pas significativement différente entre les individus des régions de l’Est et de l’Ouest.
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Résultats
Tableau 12 : Tableau de variance de la forme des feuilles des individus de Centella asiatica
Provenances Valeurs Ecart-types P values Constantes -1,394 0,617 0,024 Régions orientales 1,498 0,622 0,016 Régions occidentales 1,162 0,630 0,066
Ainsi, les individus de C. asiatica sont répartis en fonction de la taille de leurs feuilles qui varie en fonction des régions. Le groupe A constitue un ensemble d’individus provenant de la région orientale de Madagascar, tandis que le groupe B est formé par des individus provenant de la région occidentale de l’île. Bien que, les paramètres utilisés dans cette étude n’aient pas permis d’identifier la dissemblance de la forme des feuilles entre les groupes, cette différence est observée de visu (Planche IX) et semble bel et bien corrélée avec la position géographique des sites. D’autres paramètres morphologiques traduisant au mieux cette forme devraient alors être recherchés et étudiés. Planche IX
Différentes formes de feuilles de Centella présentes à Madagascar. Feuilles de Centella asiatica orbiculaires d’Ambohitromby I ( Photo 40 ), de Mahajanga ( Photo 41 ) et de Morondava ( Photo 42 ). Feuilles de Centella asiatica réniformes du Cap Saint André (Photo 43 ), de Toamasina ( Photo 44 ), de Sambava ( Photo 45 ) et de Vohimana ( Photo 46 ). Feuille de Centella uniflora (Photo 47 ) 64
Résultats
II.2. DIVERSITE GENETIQUE La diversité génétique de C. asiatica a été explorée au niveau du génome chloroplastique et du génome nucléaire grâce respectivement aux techniques de marquage moléculaire par RFLP-PCR et par SSR. La réalisation de ces techniques a nécessité en tout premier lieu l’extraction de l’ADN total des individus étudiés.
II.2.1. Extrait d’ADN Les échantillons de C. asiatica malgaches sont de bonnes qualités et aucune difficulté n’a été rencontrée lors de l’extraction de leurs ADN. Quant-aux échantillons étrangers, les extraits d’ADN sont de qualités moindres car ces échantillons étaient en mauvais état à la réception. Les extraits étrangers utilisables ont été ceux de la Tanzanie, du Zimbabwe, de l’Afrique du Sud, de Mayotte, de La Réunion, de l’Inde, du Vientiane, du Binh Chanh, du Cambodge et de la Malaisie. Les numéros des extraits d’ADN des échantillons malgaches sont présentés en annexe 1 et ceux des échantillons étrangers en annexe 2.
II.2.2. Génome chloroplastique La diversité du génome chloroplastique de C. asiatica a été évaluée à partir de la caractérisation et de l’analyse de la structure de l’ADN chloroplastique des individus.
II.2.2.1. Structure du génome chloroplastique Sachant que le génome chloroplastique représente une partie infime du génome total de la plante, des extraits de bonnes qualités ont été nécessaires. En conséquence, les échantillons provenant des pays autres que Madagascar n’ont pas donné de résultats satisfaisants en RFLP-PCR. Les cinq amorces chloroplastiques utilisées ont très bien amplifié tous les échantillons. Pour une amorce donnée, tous les échantillons ont présenté un produit d’amplification de taille identique. Par ailleurs, cette taille est différente en fonction de l’amorce soit 1 kb pour FV; 2,75 kb pour SR; 3 kb pour HK; 1kb pour AS et 1.25kb pour K5-K6. Suite à la restriction enzymatique, les cinq combinaisons amorces/enzyme de restriction FV/TaqI, FV/TasI; SR/TaqI, SR/RsaI et HK/TaqI ont révélé un polymorphisme au niveau du génome chloroplastique. Pour chacune des cinq combinaisons, deux profils de restriction ont été obtenus : un profil correspondant au clone de référence et aux individus à feuilles réniformes et un profil correspondant aux individus à feuilles orbiculaires.
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Résultats
Dans l’ensemble, des fragments de restriction identiques et spécifiques aux deux profils ont été observés. Les autres combinaisons amorces/enzyme de restriction ont révélé soit un seul profil de restriction pour tous les individus, soit aucune coupure des produits d’amplification par l’enzyme. Un exemple de photo de profils de restriction est présenté en annexe 9.
II.2.2.2. Diversité au niveau du génome chloroplastique A partir des cinq combinaisons amorces/enzyme de restriction (FV/TaqI, FV/TasI, SR/TaqI, SR/RsaI et HK/TaqI) ayant révélé un polymorphisme au niveau du génome chloroplastique de C. asiatica , des mutations distinguant les individus à feuilles réniformes de ceux à feuilles orbiculaires ont été relevées. Au total, 10 mutations ont été détectées dont 2 mutations de site, numérotées B et C, et 8 mutations de longueur notées A, D, E, F, G, H, I et J (Tableau 13).
Tableau 13 : Les mutations au niveau des longueurs de fragments de restriction des individus de Centella asiatica, en utilisant comme référence l’haplotype du clone de référence VOHI_réf.
Longueur des fragments de Amorces Enzymes de N° restriction (pb) chloroplastiques restriction mutations Références ‰ Mutations trnF - trn V TaqI A 917 ‰ 934 B 231+275 ‰ 506 TasI C 100+58 ‰ 158 trn S - trn R TaqI D 649 ‰ 661 E 257 ‰ 273 RsaI F 1690 ‰ 1856 G 380 ‰ 393 trn H - trn K TaqI H 944 ‰ 1007 I 538 ‰ 555 J 172 ‰ 177 Haplotypes H1 H2
66
Résultats
Deux haplotypes bien distincts H1 et H2, correspondant aux deux profils structuraux observés, sont identifiés. La distance entre les deux haplotypes est bien caractérisée par les 10 mutations.
II.2.3. Génome nucléaire La diversité du génome nucléaire de C. asiatica a été évaluée à partir de la caractérisation et de l’analyse de la structure du génome nucléaire des individus.
II.2.3.1. Microsatellites de Centella asiatica
a. Banque enrichie en locus microsatellites Une banque enrichie en locus microsatellites constituée de 768 clones a été construite pour C. asiatica . Parmi ceux-ci, 560 clones possèdent des microsatellites, soit un taux d’enrichissement de 73%. Les bactéries transférées directement sur des membranes à l’aide d’un robot ont donné un rendement d’enrichissement de 67,85%, tandis que celui des inserts amplifiés est de 54,15%.
b. Séquences microsatellites Sur les 560 clones positifs, les 96 clones qui ont révélé les meilleures intensités de présence de microsatellites en autoradiographie sont sélectionnés pour être séquencés. Quatre vingt séquences ont été jugées de bonnes qualités et exploitables : - 76 sont des singletons, c'est-à-dire des séquences qui sont retrouvées chacune une seule fois dans un seul clone bactérien, - 4 sont des clusters, c’est-à-dire des séquences qui sont retrouvées dans au moins 2 clones bactériens différents. En classifiant les microsatellites suivant la pureté du motif répété (Weber, 1990), ces 80 séquences comprennent : - 37 motifs composés, c’est-à-dire des séquences constituées d’une combinaison continue de motifs répétés de dinucléotides, - 32 motifs purs, c’est-à-dire des séquences constituées d’une répétition continue d’un seul dinucléotide, - 11 motifs composites, c’est-à-dire des séquences constituées de combinaisons mélangées de motifs répétés de di, tri, tétra et/ou de pentanucléotides.
67
Résultats
c. Les marqueurs microsatellites L’analyse des 80 séquences microsatellites sélectionnées avec le pipeline SAT a mis en exergue des marqueurs microsatellites pour 65% des séquences. Trente marqueurs microsatellites ont été alors sélectionnés, dont : - 04 marqueurs microsatellites encadrant des motifs composés, - 14 marqueurs microsatellites encadrant des motifs purs, - 12 marqueurs microsatellites encadrant des composites. Ces 30 marqueurs ont été ensuite synthétisés par la société Sigma-Aldrich ; et la qualité et la quantité des produits d’amplification obtenus, suite à un test PCR sur le clone de référence, ont montrées que ces marqueurs ont été tous synthétisés convenablement. Après une analyse préliminaire sur quelques échantillons de C. asiatica pris au hasard, seuls les 20 marqueurs microsatellites présentant une bonne spécificité et une facilité de lecture ont été retenus pour le génotypage de tous les individus de C. asiatica (Tableau 14). Ces 20 marqueurs microsatellites ont été soumis à la base de données EMBL Nucleotide Sequence Database (The European Molecular Biology Laboratory) et leurs séquences y sont actuellement accessibles.
68
Résultats
Tableau 14 : Caractérisations des 20 marqueurs microsatellites de Centella asiatica
Taille des Th EMBL Locus SSR Séquences (5' to 3') Motifs allèles (°C) N°accessions
mCaCIR002 F: CCACAGGTAACACCGAAT (ct)30 145 - 267 55 FR838931 R: GCACTTGCACTATCTGGAA
mCaCIR004 F: GGGTGGTCTGCCTAAAGA (ct)17 189 - 256 56 FR838932 R: TGGAGATCAAGTTTCATGC
mCaCIR005 F: GGCCTTCAATGTATGCTG (ga)16 167 - 203 57 HE605293 R: TTTGATTTGTTGGGTCTTG
mCaCIR006 F: ACGGGCATTTATTCCATT (ct)15 195 - 269 55 FR838933 R: GCAAACCACCACAACTTC
mCaCIR007 F: TGGAGGTGGTGTAACTGG (tg)12 225 - 255 55 FR838934 R: AGGGGATCAAACCTCATC
mCaCIR009 F: TGCCTATCCTTTGAATGC (tc)11 266 - 335 55 FR838935 R: CAAACATGACATTCTTAAAACA
mCaCIR010 F: AATGTAAAATTCCCGGTGT (tg)10 229 - 261 54 FR838936 R: TAAACAGGCGTTCCAAGT
mCaCIR011 F: TTCATAAAAGTCCTTCCACA (ca)10 209 - 239 53 FR838937 R: TAGGTTGATGTGGCCTCT
mCaCIR012 F: CACGAAAATTGGAAACAA (ac)10 205 - 231 53 FR838938 R: CATGTGAGTTTATGAGTTTCTATG
mCaCIR013 F: CAAGTTCCTCCCACGAAT (ac)9 201 - 242 50 HE605294 R: GCCGAAATAATCGAAATATAAG
mCaCIR018 F: TTGAGTTTAAGAAGTCCCAAAT (tc)23 (ta)7 170 - 343 55 FR838939 R: AATCCTTCACACTCCTAAAGC
mCaCIR019 F: TTTCTTGTTAAATGCGATGA (ga)15 (gtgc)3 206 - 233 54 FR838940 R: AATGACATCACTGCTATGGA
mCaCIR020 F: TTTAGGAAGTTGGATTTTGC (ac)7 (ac)5 165 - 198 55 FR838941 R: GGTTTAATTCAGGACGCTTA
mCaCIR021 F: TGCCTAGATTTTGGGTTTT (ct)24 (att)4 209 - 235 55 HE605295 R: TCTTACAATGCAATCAACCT
mCaCIR022 F: AGGAGTATTGACAAGAGGTGA (ct)6(ct)11(ca)9 219 - 321 54 FR838942 R: GGATGGCAGTCCATTTTA
mCaCIR024 F: TCTTTCGTTGATACATGCAC (atta)3 233 - 279 55 FR838943 R: AAAACTTAAAGAAGATACAAACTCC
mCaCIR027 F: ACCCCAAGACCTTCAGTT (ca)6 (ag)10 220 - 261 54 FR838944 R: CCTTCTGCTTTCCCTTTT
mCaCIR028 F: CAGAGTTTGGGCAGAAAA (ag)5 (ag)8 197 - 241 55 FR838945 R: GACGAGTGGAGGATAAGAAA
mCaCIR029 F: GGTCTGAGGTCTGTTGAGG (ca)8 (at)5 (ct)5 276 - 375 55 FR838946 R: CGCATTGACAGAACAAAA
mCaCIR030 F: GGCAAATCGAGAGCAATA (tg)5 (ta)5 (ga)20 232 - 297 55 FR838947 R: ACGGAAAAGCCTAACAGC
(Nom du locus, séquence du locus, motifs, taille des allèles, température d’hybridation (Th) et numéro d’accessions EMBL) 69
Résultats
II.2.3.2. Structure du génome nucléaire La structure du génome nucléaire des individus de C. asiatica a été définie à partir de trois analyses statistiques descriptives des données de génotypage, à savoir la caractérisation de marqueurs microsatellites, la caractérisation des allèles produits et le calcul de quelques indices de génétique des populations.
a. Caractéristiques des marqueurs microsatellites Pour l’ensemble des échantillons, chaque marqueur affiche plus de 4 allèles, ils sont donc tous polymorphes. Aucune différence n’est repérée au niveau du polymorphisme des marqueurs issus des motifs purs, composés et composites. Un total de 531 allèles sont produits pour les 20 marqueurs microsatellites. Dans l’ensemble, le nombre d’allèles par marqueurs varie de 5 à 79 allèles. La distribution par taille de ces allèles au sein de l’ensemble des individus est représentée par des histogrammes (Figure 12). Pour les locus mCaCIR002, mCaCIR027, mCaCIR029 et mCaCIR030, la distribution des allèles est de type multimodal (Figure 12 A) . Plusieurs groupes d’allèles ont été observés. Ces groupes ont été centrés ou non sur des allèles majoritaires. Pour mCaCIR004, mCaCIR009, mCaCIR018 et mCaCIR022, la distribution des allèles est globalement de type bimodal (Figure 12 B). Les allèles de chacun de ces locus sont répartis en 2 groupes. Ces derniers sont centrés chacun autour d‘un allèle majoritaire mais qui ne sont pas d‘une importance égale. Les 14 locus restant, à savoir mCaCIR005, mCaCIR006, mCaCIR006, mCaCIR010, mCaCIR011, mCaCIR012, mCaCIR013, mCaCIR020, mCaCIR019, mCaCIR021, mCaCIR024 et mCaCIR028, ont chacun un ou plusieurs allèles nettement majoritaires sans mode bien défini (Figure 12 C). La majorité des marqueurs ont un PIC (Polymorphism Information Content) supérieur à 0,5, ce qui signifie qu’ils sont fortement informatifs (Tableau 15). Les PIC maximaux correspondent aux marqueurs mCaCIR002, mCaCIR022 et mCaCIR018 qui sont respectivement 0,939, 0,908 et 0,882. Néanmoins, les marqueurs mCaCIR013, mCaCIR019, mCaCIR021, mCaCIR024 sont moyennement informatifs avec un PIC inférieure à 0,5.
70
Résultats
mCaCIR002 A 60 50 40 30 20 Nombre d'individus Nombre 10 0 145 147 149 151 153 155 157 159 161 163 165 167 169 171 173 175 177 179 181 183 185 187 189 191 193 195 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 245 247 249 251 253 255 257 259 261 263 265 267
Taille des allèles (pb)
mCaCIR022 B 100
80
60
40 Nombre d'individus Nombre 20 0 219 222 225 228 231 234 237 240 243 246 249 252 255 258 261 264 267 270 273 276 279 282 285 288 291 294 297 300 303 306 310 314 318 321
Taille des allèles (pb)
mCaCIR007 C 200
150
100
Nombre d'individus Nombre 50
0 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 Taille des allèles (pb)
Figure 12 : Type de distribution par taille d’allèles présents dans l’ensemble des échantillons de Centella asiatica . mCaCIR002 : type multimodal, mCaCIR022 : type bimodal, mCaCIR007 : type non défini
71
Résultats
Tableau 15 : Caractéristiques des 20 marqueurs microsatellites de Centella asiatica
Locus SSR Na PIC
mCaCIR002 53 0.939 mCaCIR004 31 0.738 mCaCIR005 18 0.571 mCaCIR006 26 0.622 mCaCIR007 16 0.701 mCaCIR009 25 0.779 mCaCIR010 15 0.595 mCaCIR011 10 0.695 mCaCIR012 15 0.688 mCaCIR013 14 0.348 mCaCIR018 79 0.882 mCaCIR019 13 0.288 mCaCIR020 10 0.527 mCaCIR021 5 0.194 mCaCIR022 57 0.908 mCaCIR024 8 0.351 mCaCIR027 36 0.742 mCaCIR028 20 0.742 mCaCIR029 46 0.757 mCaCIR030 34 0.749 Moyennes 26.550 0.641 (Nombre des allèles (Na), Polymorphism Information Content (PIC))
b. Caractéristiques des allèles produits Le nombre total d’allèles par individu varie de 2 à 5. La présence d’individus à plus de 2 allèles signifie l’existence probable d’individus polyploïdes. Ce cas a été retrouvé chez le clone de référence et chez les individus à feuilles réniformes. Au vue des comptages chromosomiques et des résultats cytogénétiques, les individus à 2 allèles seraient des diploïdes et les individus à plus de 2 allèles sont probablement des tétraploïdes et devraient donc présenter 4 allèles. Etant donné que seulement 5 individus sur 450 présentent un cinquième allèle, cet allèle a été interprété comme étant une contamination des extraits.
72
Résultats
Etant donné que ces observations coïncident avec les résultats de l’étude chromosomique, 3 groupes d’individus ont été séparés afin de distinguer les allèles communs des allèles spécifiques (Tableau 16). - un groupe, nommé A, constitué par les individus ayant des feuilles réniformes identiques à celle du clone de référence et qui ont plus de deux allèles - un groupe, nommé B, constitué par les individus ayant des feuilles orbiculaires et qui ne possèdent pas plus de deux allèles - un groupe, nommé C, constitué par les individus étrangers provenant de l’Asie, de l’Afrique et des îles voisines. Ces trois groupes affichent au total 13,6% d’allèles communs. Entre eux, le groupe A et C ont été les groupes qui ont présentés le maximum d’allèles communs avec un pourcentage de 7,64%. Ce sont les groupes d’individus les plus proches. Le pourcentage d’allèles communs entre le groupe A et B est de 4,83% et de 1,47% entre le groupe B et C. Les individus malgaches du groupe A sont donc plus proches des individus étrangers. Cependant, les individus malgaches du groupe B sont plutôt proches du groupe A que des individus étrangers. Le groupe A affiche 66,55% d’allèles spécifiques, alors que le groupe B et C présentent très peu d’allèles spécifiques, respectivement, 3,25% et 2,66%. En effet, le groupe B ne présente au total que 91 allèles sur les 531 allèles produits. Cette forte proportion d’allèles spécifiques du groupe A peut être expliquée par le fait que ces individus présentent plus de deux allèles par locus. Par ailleurs, elle signifie un degré de polymorphisme élevé au sein du groupe et également une particularité de ces individus par rapport à ceux des autres groupes. Les caractéristiques microsatellites de C. uniflora ont révélé au total 43 allèles pour 17 marqueurs microsatellites, sachant que les données étaient manquantes pour 3 marqueurs : mCaCIR007, mCaCIR012 et mCaCIR022. Ces 43 allèles comprennent 29 allèles communs à C. asiatica et 14 allèles spécifiques à l’espèce , soient respectivement 67,5% et 32,5% des allèles produits. Les allèles communs à C. asiatica se répartissent comme suit : 6 allèles communs aux groupes A, B et aux individus étrangers, 16 allèles communs au groupe A, 6 allèles communs au groupe A et aux individus étrangers et un allèle commun avec groupe A et B. La présence de ces allèles confirme l’existence d’un lien de parenté entre ces deux espèces de Centella . Leur différenciation est, par ailleurs, expliquée par ce taux d’allèles spécifiques à C. uniflora , une valeur qui est assez élevée par rapport à celle qui a été observée au sein des populations de C. asiatica . 73
Résultats
------26.7 7.14 1.75 12.5 2.17 2.94 2.66 Groupe C
------10 10 25 6.25 7.14 6.52 3.25 sur sur les 20 marqueurs Groupe B Allèles spécifiques (%)
69.81 77.42 94.44 80.77 37.50 76.00 20.00 50.00 66.67 64.29 84.62 76.92 60.00 80.00 77.19 25.00 86.11 70.00 69.57 64.71 66.55 dividus à feuilles orbiculaires feuilles orbiculaires à dividus Groupe A Centella asiatica - - - - - 6.45 7.69 4.35 7.64 6.67 7.14 5.13 7.69 7.02 2.78 16.98 25.00 12.00 13.33 10.00 20.59 Groupe A et C , de l’Afrique et des îles voisines et des l’Afrique de , ------6.25 3.51 5.00 2.17 1.47 12.50 Groupes etB C ifiques ifiques des individus de
------9.43 9.68 3.85 6.25 4.00 7.69 7.69 8.77 2.78 6.52 4.83 10.00 10.00 10.00 Allèles communs (%) Groupes A et B ques à celles du clone de référence référence declone du à celles ques in : B *groupe 3.77 6.45 5.56 7.69 8.00 2.56 7.69 1.75 8.33 5.00 8.70 18.75 40.00 30.00 26.67 14.29 20.00 20.00 25.00 11.76 13.60 *groupe C : individus étrangers provenant de l’Asie de provenant étrangers individus : C *groupe Groupes A*, B* et C* Locus Locus SSR mCaCIR002 mCaCIR004 mCaCIR005 mCaCIR006 mCaCIR007 mCaCIR009 mCaCIR010 mCaCIR011 mCaCIR012 mCaCIR013 mCaCIR018 mCaCIR019 mCaCIR020 mCaCIR021 mCaCIR022 mCaCIR024 mCaCIR027 mCaCIR028 mCaCIR029 mCaCIR030 Moyennes (%) Pourcentage Pourcentage des allèles communs et des allèles spéc
identi réniformes, feuilles à individus : A *groupe Tableau 16 : microsatellites
74
Résultats
c. Indices de génétique des populations L’hétérozygotie a été calculée sur les marqueurs polymorphes et sur les génotypes
à 2 allèles. En conséquence, l‘hétérozygotie observée (H o) et l’hétérozygotie calculée (He) sont calculés seulement sur le groupe B qui sont des génotypes à 2 allèles et seulement à partir de 18 marqueurs microsatellites car mCaCIR005 et mCaCIR021 sont monomorphes pour ce groupe (Erreur ! Référence non valide pour un signet. ). L‘hétérozygotie moyenne observée dans l‘ensemble des échantillons étudiés pour les 20 locus est de 0,092, variant de 0 à 0,277, tandis que l’hétérozygotie moyenne calculée est de 0,354, variant de 0,020 à 0,677 (Erreur ! Référence non valide pour un signet. ). Ho est donc inférieure à H e.
Tableau 17 : Hétérozygoties observées (Ho) et hétérozygoties calculées (He) des individus de Centella asiatica à deux allèles
Hétérozygoties Hétérozygoties Locus SSR observées (Ho) calculées (He) mCaCIR002 0.143 0.660 mCaCIR004 0.050 0.204 mCaCIR005* - - mCaCIR006 0.008 0.142 mCaCIR007 0.033 0.257 mCaCIR009 0.059 0.391 mCaCIR010 0.277 0.375 mCaCIR011 0.123 0.211 mCaCIR012 0.000 0.173 mCaCIR013 0.032 0.304 mCaCIR018 0.010 0.619 mCaCIR019 0.021 0.020 mCaCIR020 0.073 0.245 mCaCIR021* - - mCaCIR022 0.089 0.611 mCaCIR024 0.253 0.364 mCaCIR027 0.156 0.538 mCaCIR028 0.008 0.153 mCaCIR029 0.234 0.677 mCaCIR030 0.092 0.424 Moyennes 0.092 0.354 *amorces monomorphes pour les génotypes à deux allèles
75
Résultats
II.2.3.3. Diversité au niveau du génome nucléaire Etant donné que les individus présentent un nombre d’allèles différents, les analyses AFTD et Neighbor-Joining ont du être faites séparément en fonction des groupes retrouvés. Cependant, pour avoir une image de la structuration générale de l’ensemble de tous les individus étudiés, ces derniers ont été analysés d’un trait en effectuant un calcul de distances génétiques en terme de présence – absence d’allèles et non en terme d’allèles. L’indice de dissimilarité adéquate pour ce genre d’analyse a été celui de Dice car c’est un indice qui donne un même poids à la présence ou à l'absence d'un allèle. Il est calculé automatiquement par le logiciel DARwin 5 pour servir à la construction de l’arbre de diversité. Après cette analyse globale, que ce soit pour l’AFTD ou pour l’élaboration de la représentation arborée de Neighbor Joining, une analyse séparée des groupes d’individus a été effectuée et toujours avec les individus étrangers et ceux de Centella uniflora .
a. Représentation graphique de la diversité génétique La représentation graphique de la diversité génétique existante au niveau de la population de C. asiatica de Madagascar est le résultat de l’AFTD (Figure 13). Un regroupement séparé des individus diploïdes et tétraploïdes a été observé. Le premier axe, qui rend compte de 17,98% de l’inertie, oppose les individus tétraploïdes à feuilles réniformes qui présentent plus de deux allèles et les individus diploïdes à feuilles orbiculaires, soit respectivement les groupes A et B qui ont été déjà définis dans l’étude de la structure du génome nucléaire. Les individus zimbabwéens et tanzaniens sont regroupés avec le groupe B. Les autres individus étrangers sont proches les uns des autres et semblent former un seul groupe avec le groupe A. Les individus d’Antalaha et d’Ambanja, qui présentent des feuilles orbiculaires, se sont regroupés avec ces individus étrangers et font un tout avec le groupe A. Entre ces deux grands groupes A et B se sont isolés les individus de Montagne d’Ambre (MOTA) qui constituent le groupe C (Figure 13).
76
Résultats
à partir de 20
BGroupe
sites asiatiques.
Centella uniflora
et de
d’Ambre (MOTA) Montagne la la
Centella asiatica
Groupe C
: individus de provenant
le le des individus de
Groupe C ovenant d’Antalaha, d’Ambanja, de d’Ambanja, d’Antalaha, La ovenant Réunion des et
Axes 1/2
sur le premier plan plan premier (1, le sur 2).
Analyse Analyse factorielle des correspondances de l’ensemb : individus diploïdes : individus tétraploïdes associés associés : individus individusaux pr tétraploïdes
Groupe AGroupe
marqueurs microsatellites.marqueurs individus Projection des Groupe A Figure Figure 13 : Groupe B
77
Résultats
Les individus du groupe A sont répartis suivant le deuxième axe mais une partie des individus semble très proche. Pour vérifier cela, une AFTD a été effectuée en considérant juste le groupe A (Figure 14). Un amas d’individus constitué à 95% des individus provenant des régions d’Alaotra Mangoro et d’Analamanga a été identifié. Cet amas a été nommé sous-groupe 1. Le reste des individus du groupe A exclus de ce sous-groupe 1 constitue le sous-groupe 2. A part les deux grands groupes A et B observés, le troisième axe, qui rend compte 3,3% de l’inertie, a permis de différencier (Figure 15) : - un groupe rassemblant les individus de la Montagne d’Ambre, de la Tanzanie et un individu du Zimbabwe. - un groupe bien distinct constitué par les individus d’Antalaha, d’Ambanja, de l’île de la Réunion et des sites asiatiques, nommé groupe D. L’AFTD effectuée montre une claire différentiation selon le niveau de ploïdie. En termes de présence et d’absence d’allèles, ces deux groupes individus sont très distants. Ils ont très peu d’allèles communs. Le groupe A est constitué d’individus très éparpillés par rapport au groupe B. En effet, les individus constituant le groupe A possèdent un grand nombre variés d’allèles spécifiques, soit 66,55% contre 3,5% pour ceux du groupe B. Les individus de la Montagne d’Ambre se sont isolés entre les groupes A et B. En effet, la grande majorité des allèles de ces individus font partie des 4,83% d’allèles communs à ces 2 groupes. Parmi les sites malgaches, les individus d’Antalaha et d’Ambanja sont les plus proches des individus de l’île de la Réunion et des sites asiatiques car ils présentent un plus grand nombre d’allèles communs. Les individus de C. uniflora , se trouvent rattachés avec le groupe A (Figure 13 et Figure 15). Leurs caractéristiques microsatellites en témoignent car 55,17% des allèles de C. uniflora , qui sont identiques à l’espèce C. asiatica, sont communs aux individus tétraploïdes.
78
Résultats
2.
différenciation des individus des régions SOUS-GROUPE2
présentant plus de deux allèles à partir de 20
Centella asiatica Axes 1/2 us de pe 1 et le le 1 et despe reste individus sous-groupe le dans sur le premier plan (1, 2) mettant en évidence la
GROUPE1 - Analyse Analyse factorielle des correspondances des individ
: SOUS marqueurs marqueurs microsatellites. Projection des individus Mangoro dans d’Analamanga et sous-groud’Alaotra le Figure Figure 14
79
Résultats
: individus
à partir de 20 Groupe B Groupe
Groupe B
Centella uniflora
: individus provenant d’Antalaha
et de
Groupe D
: individus tétraploïdes.
Centella asiatica Groupe A Groupe C
anzanie et de et anzanie Zimbabwe. le le des individus de
Axes 1/3 on et des sites des on asiatiques. et sur le premier plan (1, 3). Groupe DGroupe : individus de provenant la d’Ambre, deMontagne T
Analyse Analyse factorielle des correspondances de l’ensemb Groupe C Groupe A Groupe Figure Figure 15 : groupés individus les avec d’Ambanja Réuniet La de diploïdes. marqueurs marqueurs microsatellites. Projection des individus
80
Résultats
b. Représentation arborée de Neighbor-Joining La représentation arborée de Neighbor-Joining est un arbre de diversité qui permet de mettre en évidence les relations génétiques entre les individus étudiés. La Figure 16 représente l’arbre obtenu à partir du polymorphisme des 20 microsatellites en utilisant la distance de Dice. Cet arbre montre une forte opposition entre les espèces Centella asiatica et Centella uniflora et une séparation très marquée des individus de C. asiatica diploïdes et tétraploïdes, soient le groupe A et B. La diversité génétique des individus de C. asiatica au sein du groupe A est largement plus importante par rapport à ceux au sein du groupe B. Malgré la large distribution géographique des individus qui composent le groupe B, ces individus sont très peu diversifiés génétiquement (Figure 17). Des profils alléliques similaires sont observés entre les individus d’un même site et même entre les individus provenant de sites différents (exemple : AMBR I, BERB, KDRE et BELB). Les individus des régions de Sava et de Diana forment une population bien distincte avec les individus asiatiques et réunionnais (Figure 17) et sont plus proches génétiquement du groupe A que du groupe B (Figure 16) alors qu’ils présentent bien des feuilles orbiculaires. Ces individus présentent un profil génétique particulier qui mérite une étude approfondie. Les individus de Mayotte, Zimbabwe et Tanzanie sont retrouvés proches des individus provenant d’Antsohihy (ANTS), de Mandritsara (MDTR) et de Soalala (SOAL). Le groupe A présente une grande diversité génétique (Figure 18). Il est subdivisé en 2 sous-groupes bien distincts, semblables à ce qui a été révélé par l’AFTD : - le sous-groupe 1, constitué principalement par les populations des régions d’Alaotra-Mangoro et d’Analamanga - le sous-groupe 2, constitué par les populations des autres régions Malgré la diversité génétique observée au niveau du sous-groupe 1, ces individus présentent des génotypes bien particuliers par rapport aux autres individus (Figure 16 et Figure 18). Les individus de la Montagne d’Ambre (MOTA) se sont retrouvés hors des deux sous-groupes et se sont rattachés aux individus africains, aux individus asiatiques et ceux de la Mayotte (Figure 18). Ce qui confirme leur position dans l’AFTD. Dans l’ensemble, la diversité du génome nucléaire met ainsi clairement en évidence la distribution des individus en fonction de leurs nombres d’allèles qui est en relation étroite avec la forme de leurs feuilles. 81
Résultats
KRIS KRIS
KRIS KRIS KRIS CAP AFRS CAP CAP CAP
CAP APTK
BESA_II TANZ BESA_II BESA_II ANDP BESA_II ANDP MOTA MOTA MOTA MOTA ZIMB MOTA MAJG MAJG MAJG MAJG TMDR TMDR TMDR MAHA MAHA TMDR MAHA SOAL TMDR SOAL SOAL SOAL SOAL ZIMB BFND
ZIMB
MDTR MAYO MAYO MAYO à l’aide du logiciel MAYO MDTR BFND ANTSO BFND ANTSO BFND
ANTSO BFND ANTSO
MDTR ANTSO MDTR MAYO Centella uniflora ANTV TSIA BESA_I TSIA MORO MORO MOROr TSIA MORO SAHO MORO
ANTV ANTV SAHO SAHO SAHO SAHO ANTV ANTV MDTO BLBK BLBK KDRE pe B:pe individus diploïdes. KDRE AMTY AMTY AMTY Groupe B Groupe AMTY
AMTY MDTO KDRE BESA_I MDVZ TSIR MDTO TSIR MRTO TSIR MRTO Centellaasiatica ANAL_II MRTO MDVZ MDVZ Centella uniflora MRTO MDVZ ANAL_II ANDR ANDR BESA_I TAMB TAMB ANDR KDRE BLBK MDTO BLBK ANAL_II ANAL_II MRTO BERB ANAL_II BLBK BERB et de AMBR_I KDRE AMBR_I BERB AMBR_I BERB AMBR_I MDVZ TAMB VOHM VOHM VOHM VOHM VOHM AMBL AMBL AMBL AMBL AMBL RAHN RAHN RAHN BETK BETK BETK BETK BETK RAHN ANKI RAHN ANKI ANKI ANKI ANKI MIDO MIDO MIDO MIDO BEFO
BEFO BEFO BEFO BEFO 2 IAKO IAKO VANG_II VANG_II RNTS VANG_II LAVA LAVA LAVA LAVA VANG_I MANK VANG_III VANG_I RNTS Centella asiatica RNTS RNTS VANG_II VOND VANG_I VOND VOND AMBS groupe groupe AMBS AMBS - AMBS AMBS SOAN SOAN SOAN SOAN IAKO SOAN IAKO ISOA ISOA ISOA ISOA us de ISOA MANK Sous MANP MANP FARF FARF FARF FORD FORD FORD FORD FORD SAMB SAMB SAMB TOAM TOAM TOAM MARI TOAM MARI MARI MARI MARI MNOR MNOR MNOR MNOR MNOR VOHP MANK VANG_II MANK MANP FARF FARF NOSV NOSV NOSV NOSV NOSV IRON IRON IRON IRON
VOHP VOHP VOHP ue de Dice. de Groupe : A ue individus Grou tétraploïdes. VANG_III VANG_III MABE VANG_III MABE BESA_II VANG_III MABE MABE MABE MANP IKEL MANP IKEL IKEL AMBZ AMBZ ANDO ANDL ANDL ANDO ANDO ANDO ANDO ANDL ANDL Groupe A Groupe APTK APTK APTK MRTD MRTD MRTD ARIO MRTD MRTD ANAL_I HAZY ANAL_I HAZY ANAL_I HAZY ANOS ANDV ANDV ANDV ANDV ANDV RANE RANE RANE RANE TSARA
TSARA TSARA TSARA TSARA AMBR_II AMBR_II AMBR_II AMBR_II AMBR_II AMBR_III TANA AMBR_III AMBY AMBR_III MAHI AMBR_III AMBN MAHI AMBR_III MAHI MAHI MAHI ARIO ARIO ATBE ARIO FIAN MARO FIAN FIAN FIAN groupe 1 groupe FIAN - AMBN AMBN TANA AMBN TANA TANA TANA ANDL AMBZ ANJI AMBZ ANJI AMBZ Sous MANDp MARL MANDp MARL MANDp MARL MARL MARL HAZY ANAL_I MANJ HAZY MANJ MARH MARH MARH MARH MARH ANOS ANOS MORA MORA MORA MORA MORA MARO MARO MARO VOHI BEFR VOHI VOHI VOHI VOHI Arbre de consensus obtenu de l’ensemble des individ MARO MANDs MANDs MANDs MANJ MANDp MANJ MANDp MANJ BEFR BEFR BEFR VOHId VOHId VOHId VOHId VOHId VOHId VOHId VOHIr VIET BINH VOHId INDE ANTA REUN REUN REUN ANTA ANTA ANTA ABJA ABJA ABJA ABJA MALS DARwin à partir de l’estimateur de distance de de génétiqpartir l’estimateur DARwin à Figure Figure 16 :
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Résultats
ARwin AFRS BINH MALS VIET INDE ABJA ABJA ABJA ABJA ANTA ANTA ANTA de Sava, de de La Sava, ANTA REUN REUN REUN Réunionl’Asie de et ZIMB Populations de Diana, MAJG MAJG MAJG MAJG TMDR TMDR TMDR MAHA MAHA TMDR MAHA TMDR SOAL SOAL SOAL SOAL SOAL TANZ BFND ZIMB ZIMB MDTR MAYO MAYO MAYO MAYO MDTR et des et étrangers, individus à l’aide du logiciel D ANTSO ANTSO ANTSO ANTSO BFND BFND BFND BFND ANTSO MDTR MDTR MAYO BESA_I ANTV MORO TSIA TSIA Centella Centella asiatica MOROr e e MORO MORO MORO SAHO TSIA ANTV ANTV SAHO SAHO SAHO SAHO ANTV ANTV
MDTO BLBK BLBK ice KDRE KDRE AMTY AMTY AMTY AMTY AMTY MDTO BESA_I KDRE MDVZ MDTO MRTO TSIR TSIR TSIR MRTO MDVZ ANAL_II MDVZ MRTO ANAL_II MRTO MDVZ ANDR BESA_I ANDR TAMB TAMB ANDR KDRE AMBR_I BLBK KDRE AMBR_I ANAL_II MRTO Arbre de Arbre consensus obtenu des individus diploïdes d ANAL_II BLBK BLBK MDTO AMBR_I BERB ANAL_II AMBR_I BERB BERB BERB MDVZ TAMB Figure Figure 17 : l’estimateur de de génétiquepartir à de distance D
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Résultats
KRIS KRIS KRIS ur ur de KRIS KRIS
AFRS MABE ANAL_I ANAL_I ANAL_I BESA_II
MABE MABE MABE
BESA_II BESA_II BESA_II BESA_II
ZIMB MALS BINH VIET MOTA REUN INDE REUN MOTA MOTA MOTA TANZ ZIMB MAYO MAYO MAYO MAYO 0.5 à l’aide du logiciel DARwin à partir de l’estimate ANDP ANOS ANDP IAKO VOHM VOHM IAKO VOHM SAMB SAMB TOAM TOAM MARI MARI MARI TOAM FARF FARF MARI Centella Centella asiatica VOHP NOSV VANG_II NOSV SOAN MNOR MNOR MNOR NOSV MNOR NOSV SOAN SOAN VANG_III VANG_III VANG_III s de FARF FARF VOHP MANP FORD VOHP FARF MANK VOHP FORD VANG_III MANP MANK FORD FORD ISOA ISOA MANP AMBL ISOA AMBL MANK AMBL ISOA AMBL BETK BETK BETK AMBL BETK RAHN ANKI BETK ANKI ANKI RAHN LAVA ANKI RAHN RAHN VOND LAVA VOND RNTS LAVA VANG_I VANG_I LAVA RNTS IKEL MANK VOND VANG_I IKEL IRON IRON IRON SOAN IRON IAKO IKEL MANP RNTS RNTS VANG_II VANG_II MIDO VANG_II MIDO MANP ANDV AMBS BEFO AMBS VANG_II BEFO IAKO AMBS BEFO AMBS ANDV BEFO ANDV MIDO ANDV AMBS CAP ANDV MIDO CAP TSARA TSARA CAP CAP CAP TSARA TSARA RANE RANE RANE RANE ANDO TANA MANJ AMBN ANJI ANDO TANA MAHI AMBR_II TANA ANDL BEFR VOHI AMBR_III ARIO MAHI VOHId ANDL ANDO APTK ANDO AMBR_II AMBZ AMBN AMBZ MANJ MORA MANDp MARL MARL MARL AMBR_II ANOS TANA MAHI ANDO AMBZ AMBN MARO VOHIr ATBE MARO BEFR ARIO FIAN MORA MARH MARH VOHI AMBZ MANJ MARH MARO AMBR_III FIAN 0 ANOS ANDL MAHI FIAN VOHI ANDL APTK ANJI VOHId MANDp AMBR_II ARIO FIAN VOHI APTK VOHId APTK VOHId MARH BEFR AMBR_III AMBR_III HAZY ARIO MARO MANDp VOHI AMBY MANJ VOHId MANDs MARL VOHId MANJ MRTD HAZY MRTD MRTD MANDp FIAN MAHI MORA MANDp MANDs MARL VOHId AMBZ TANA ANAL_I VOHId MARO HAZY AMBR_II HAZY
Arbre Arbre de consensus obtenu des individus tétraploïde Populations et d’Analamanga d’Alaotra-Mangoro Figure Figure 18 : distance génétique de génétique Dicedistance
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DISCUSSIONS
Discussions
L’objectif de cette thèse a été d’évaluer la diversité de Centella asiatica à Madagascar afin de caractériser les accessions produisant une teneur élevée en principes actifs. Pour atteindre ces objectifs, une caractérisation biologique et une étude de diversité ont été menées. Dans ce volet discussion, les résultats obtenus seront discutés afin d’apprécier la diversité de C. asiatica présente à Madagascar. Ils seront ensuite exploités pour décrire les meilleures accessions et pour apporter des explications et des solutions à l’instabilité de la teneur en principes actifs des accessions malgaches.
I. DIVERSITE DE CENTELLA ASIATICA A MADAGASCAR Depuis longtemps, les espèces vivantes n’ont cessé de coloniser des milieux variés, bien au-delà de leurs centres d’origine. Elles ont évolué et se sont adaptées progressivement à des environnements divers. Cette évolution a pu se mettre en place grâce à l’expression d’une importante diversité au sein des espèces (Charte Nationale pour la gestion des ressources génétiques). Cette diversité est due en partie à des facteurs environnementaux et en partie à des différences entre les génotypes individuels, transmissibles à la descendance (Benlaghlid et al. , 1990; Grivet, 2002). Toutefois, il est difficile de mesurer leur part relative dans la variation phénotypique globale car ces deux facteurs interagissent fortement, c’est l’interaction génotype-environnement (Grivet, 2002). Dans cette étude, nous nous sommes axés sur la diversité du génome des accessions de C. asiatica malgaches, principalement au niveau chloroplastique et nucléaire.
I.1. DIVERSITE GENETIQUE
I.1.1. Variations au niveau du génome chloroplastique Le génome chloroplastique des plantes est contenu dans les chloroplastes, sièges de la photosynthèse. Il est généralement constitué de quelques dizaines de molécules d’ADN de forme circulaire qui porte une centaine de gènes (Ravi et al. , 2008). L’étude du génome chloroplastique de C. asiatica par la technique RFLP-PCR a révélée deux haplotypes différents, H1 et H2. Ces haplotypes présentent entre eux des fragments de restriction similaires et des fragments spécifiques. La présence de fragments de restriction communs au niveau des haplotypes des populations signifie l’existence d’un lien de parenté entre eux (Yukawa et al. , 2006). Il en découle alors que les individus de C. asiatica à haplotype H1 et ceux à haplotype H2 sont apparentés.
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Discussions
Ces deux haplotypes se distinguent cependant par des fragments spécifiques à chacun d’eux. Des auteurs ont mentionné qu’au cours du temps le génome chloroplastique des plantes peut être sujet à des mutations telles que des insertions, des délétions et des réarrangements (Bowman et al. , 1983; Curtis et al. , 1984) et que la stabilité de ces modifications à travers des générations représente une forme évolutive de la plante (Cui et al. , 2006). Dans notre étude, dix mutations ont été constatées entre les haplotypes H1 et H2. Ces modifications paraissent constantes au niveau de notre échantillonnage et pourraient ainsi signifier une évolution temporelle d’un groupe d’individus. Nos résultats ne nous permettent pas de déterminer quel haplotype a évolué, mais nous pouvons émettre l’hypothèse que toutes les populations avaient, à l’origine, le même haplotype puis au cours du temps, une partie aurait évolué en subissant des mutations au niveau du génome chloroplastique. De tels phénomènes ont été également démontrés par Mohanty et ses collaborateurs (2001) au sein des populations de Prunus avium de l’Europe. Une variation au niveau du génome chloroplastique des populations a été démontrée et les relations identifiées entre les haplotypes ont conduit à l’hypothèse qu’un lien de parenté existe entre ces populations de Prunus avium . Une grande fraction du génome chloroplastique est dévolue aux gènes impliqués dans la photosynthèse (Grivet, 2002; Ravi et al. , 2008; Dubé, 2009) et les plantes réalisent et contrôlent la photosynthèse grâce aux stomates (Hetherington et al. , 2003; Hodgson et al. , 2010). Nos résultats ont montré que les stomates des individus de C. asiatica à haplotype H2 sont plus denses par rapport à ceux des individus à haplotype H1. Cette différence de densité stomatique semblerait avoir une corrélation avec la variation du génome chloroplastique. Notons, par ailleurs, qu’outre les fonctions photosynthétiques des stomates, leur taille et leur densité sont également utilisées comme des marqueurs morphologiques pour l’identification du niveau de ploïdie chez de nombreuses espèces telles que Gossypium et Dactylis (Mishra, 1997). En général, lorsque le niveau de ploïdie augmente, la densité des stomates diminue mais leur taille croit (Vandenhout et al. , 1995; Mishra, 1997). Bien que la différence de taille des stomates n’ait pas été significative chez les individus de C. asiatica , la variation de leur densité permet d’émettre l’hypothèse que les individus à haplotype H1 présentent un niveau de ploïdie élevé par rapport aux individus à haplotype H2. Ce polymorphisme détecté au niveau du génome chloroplastique des individus de C. asiatica pourrait donc être issue d’une évolution liée à une polyploïdisation de l’espèce.
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Discussions
I.1.2. Variation au niveau du génome nucléaire Le génome nucléaire est organisé en chromosomes, il est composé d’autant de molécules linéaires qu’il y a de chromosomes et peut porter entre 20000 à 50000 gènes (Hamon et al. , 1999). Dans ce travail, la diversité au niveau du génome nucléaire de C. asiatica a été évaluée à partir des études effectuées au niveau des chromosomes ainsi qu’à partir des analyses microsatellites.
I.1.2.1. Nombre de chromosomes différents Une variation du nombre de chromosomes a été constatée au sein des individus de C. asiatica étudiés. Deux groupes d’individus ont été distingués : un groupe A constitué d’individus possédant 2n=36 chromosomes et un groupe B formé d’individus ayant 2n=18 chromosomes. Nos résultats se rapprochent de ceux obtenus par Kokubugata et ses collaborateurs (1998) qui ont observé deux types de populations : une population à 2n=18 chromosomes fixée diploïde et une population à 2n=36 chromosomes considérée tétraploïde. Kaensaksiri et ses collaborateurs (2011) ont, quant-à eux, rapporté l’existence de plantes tétraploïdes viables de C. asiatica grâce à l’utilisation in-vitro de la colchicine. Dans l’objectif de sélectionner des plants qui produisent le maximum de principes actifs, ces auteurs ont décidé d’induire la polyploïdie chez cette espèce. Les témoins diploïdes à 2n=2x=18 chromosomes traités à la colchicine ont ainsi produit des tétraploïdes qui présentaient 2n=4x=36 chromosomes. Ces études antérieures associées à nos résultats permettent ainsi de supposer que le groupe A est constitué d’individus tétraploïdes tandis que le groupe B comprend des individus diploïdes. Toutefois, comme le nombre de chromosome ne suffit pas pour affirmer avec certitude le niveau de ploïdie d’une espèce (Negron-Ortiz, 2007), cette assertion est étayée à partir de l’analyse des résultats cytogénétiques.
I.1.2.2. Niveau de ploïdie différent Le niveau de ploïdie des plantes peut être déterminé à partir d’un comptage du nombre de sites ADNr sur les chromosomes (D'Hont et al. , 1998; Li et al. , 2002). Comme les individus à 18 chromosomes présentaient deux signaux de sites ADNr 5S et 45S, ces résultats confirment qu’ils sont diploïdes. Dans ce cas, avec un nombre de chromosomes doublé, les individus à 36 chromosomes auraient dû révéler quatre signaux de sites ADNr. Ceci n’a cependant pas été le cas car ces individus n’ont affiché que deux signaux, excepté les individus d’Ambohitromby II (AMBRII) qui ont présenté quatre sites d’ADNr 45S. Ces
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Discussions résultats jettent ainsi le doute concernant le niveau de ploïdie de ces individus à 36 chromosomes. A cet effet, deux hypothèses peuvent être avancées : ces individus à 36 chromosomes seraient soit des diploïdes, soit des polyploïdes. S’ils sont diploïdes, ils auraient donc un chromosome de base de n=18 et seraient ainsi une autre espèce de Centella . Les populations étudiées appartiendraient alors à deux espèces différentes qui sont des diploïdes à 2n=2x=18 chromosomes et des diploïdes à 2n=2x=36 chromosomes. Si c’est le cas, la présence des quatre sites ADNr 45S chez AMBR II impliquerait que deux sites surnuméraires sont apparus dans un seul caryotype, ce qui est pourtant improbable. L’hypothèse de diploïdie est ainsi rejetée et suppose que ces individus seraient plutôt des polyploïdes. Il existe deux grandes classes de polyploïdes : - les autopolyploïdes : polyploïdes issus d’un doublement du stock chromosomique d’une espèce, due à une méiose anormale (Soltis et al. , 2003), - les allopolyploïdes : polyploïdes issus d’un croisement de deux espèces différentes dont les chromosomes ne peuvent s’apparier, entrainant ainsi une non réduction du stock chromosomique de chaque espèce lors de la méiose (Bennett, 2004). Dans le cas d’autopolyploïde, la position des sites ADNr sont similaires à celle de leurs origines diploïdes (D'Hont et al. , 1998). Dans notre étude, la position des sites est très variée et laisse supposer, par contradiction, que les individus de C. asiatica à 36 chromosomes seraient des allopolyploïdes. Une allopolyploïdisation devrait être associée à une multiplication du nombre de sites ADNr, toutefois des études ont montré qu’une variation du nombre de sites peut apparaitre au cours de l’évolution de nombreuses plantes polyploïdes (Nicolas et al. , 2007; Kovarik et al. , 2008; Lim et al. , 2008). Ceci pourrait expliquer la réduction du nombre de site ADNr chez les individus de C. asiatica à 36 chromosomes. Yoon Lim et al . (2008) ont émis l’hypothèse que cette réduction est due à une ségrégation inégale des chromosomes homologues qui provoque des anomalies méiotiques et conduit à une hérédité non mendélienne. Pagliarini (2000) a effectivement noté l’existence de telles irrégularités de ségrégation chromosomiques chez C. asiatica , néanmoins, ces anomalies méiotiques ne sont pas des phénomènes permanents pour que tous les individus en soient affectés. Une autre explication devrait alors être apportée. Chez Brassica napus , une espèce allopolyploïde, la réduction de sites ADNr a été expliquée par le nombre élevé de réarrangements chromosomiques qui s’effectuent de génération en génération durant la méiose (Nicolas et al. , 2007). Les auteurs ont supposé que la moitié de ces réarrangements sont des recombinaisons homologues des chromosomes. Ces 89
Discussions recombinaisons correspondent à un échange génétique entre de grandes régions d’ADN localisées sur un même chromosome ou sur deux chromosomes différents. Elles conduisent à la disparition de certains locus chez certains descendants. La réduction du nombre de sites ADNr chez les individus de C. asiatica à 36 chromosomes serait plutôt expliquée pareillement à celle de Brassica napus . Au début de leur polyploïdisation, ces individus auraient présenté quatre sites ADNr 5S et quatre sites ADNr 45S. Au fil des générations, et suite à de nombreuses recombinaisons homologues, certains sites auraient disparu chez certaines populations. Le nombre des sites ADNr 45S d’AMBRII constituerait ainsi un indice indiquant que les individus de C. asiatica à 36 chromosomes auraient eu à l’origine quatre sites ADNr et en auraient perdus deux au cours du temps. En associant toutes ces informations, les individus de C. asiatica du groupe A seraient des allopolyploïdes qui ont éliminé des sites ADNr au cours de leur évolution, tandis que ceux du groupe B sont des diploïdes.
I.1.2.3. Variations microsatellites Une variation du nombre de chromosomes, associée à une variation du niveau de ploïdie, a été identifiée au sein des populations de C. asiatica de Madagascar. Sachant que les chromosomes sont constitués d’ADN nucléaire, des variations devraient donc se présenter au niveau même du génome nucléaire de ces individus. Une variation du nombre d’allèles microsatellites a été constatée. Les individus du groupe A à 36 chromosomes ont affiché plus de deux allèles par locus par individu, tandis que ceux du groupe B à 18 chromosomes ont présenté deux allèles par locus par individu. Etant donné que le nombre d’allèles révélés au niveau des locus permet également de déterminer le niveau de ploïdie d’un individu (Besnard et al. , 2008), ces résultats confirmeraient que le groupe B est véritablement constitué d’individus diploïdes. Par contre, le nombre d’allèles des individus du groupe A devrait être encore analysé avant de pouvoir affirmer leur niveau de ploïdie. La présence de plus de deux allèles chez le groupe A peut être expliquée soit par des duplications segmentales du génome, soit par une duplication globale ou Whole Genome Duplication (WGD). Les duplications segmentales consistent à une duplication de plusieurs segments d’ADN du génome, d’une longueur de 1 à 400 kb (Sharp et al. , 2005). Ces duplications jouent un rôle important dans l’évolution du génome des organismes (Zhang et al. , 2005). Si ce phénomène s’est produit chez C. asiatica les allèles surnuméraires seraient retrouvés
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Discussions seulement au niveau d’un ou quelques locus, là où les duplications segmentales ont eu lieu. Ce n’est cependant pas les résultats obtenus de ce travail. Le WGD est une duplication entière du génome qui se produit au cours de l’évolution (Blanc et al. , 2000). Ce phénomène augmente la diversité fonctionnelle des gènes et permet aux plantes de survivre à un environnement climatique en constant changement (Delseny, 2009). La mise en évidence des WGD au cours de l’évolution a été reportée chez de nombreuses plantes tels que le bananier, le riz, le maïs, le sorgho et le blé (Salse et al. , 2004; Yu et al. , 2005; Baurens et al. , 2010). Dans notre cas, 20 locus microsatellites ont été analysés et chez les individus de C. asiatica , tous ces locus présentent plus de deux allèles pour les individus du groupe A. Ces résultats montrent que la duplication se serait produite au niveau de l’ensemble du génome de C. asiatica et non pas seulement sur quelques segments. La présence de plus de deux allèles chez C. asiatica serait donc due à une WGD qui n’est autre qu’une polyploïdisation. Ces individus à 36 chromosomes seraient ainsi des polyploïdes et plus précisément des tétraploïdes car ces individus possédaient 4 allèles par locus. En outre, l’identification de plus de deux allèles différents par individu dans ce groupe confirme l’allopolyploïdie, car dans le cas d’une autopolyploïdie, où le stock chromosomique est doublé, les deux allèles parentaux seraient juste représentés deux fois et pas plus de deux allèles différents ne seraient révélés. D’après ces analyses, nous pouvons tirer que les individus de C. asiatica malgaches sont constitués de populations diploïdes à 18 chromosomes et de populations allotétraploïdes à 36 chromosomes. Au sein de chacun de ces populations existe encore une variation du génome nucléaire.
a. Diversité des populations diploïdes Les populations diploïdes sont peu diversifiées génétiquement. Les variations génétiques sont faibles ou inexistantes au sein des populations provenant d’un même site ou même provenant des sites rapprochés. L’étude de l’hétérozygotie a effectivement montré que ces populations présentent un déficit en hétérozygotie et un écart à l’équilibre de Hardy-
Weinberg car l’hétérozygotie observée Ho a été inférieure à l’hétérozygotie calculée He. Sachant que C. asiatica se reproduit végétativement et sexuellement, cette déviation de l’équilibre de Hardy-Weinberg pourrait s’expliquer par un taux élevés en autofécondation et/ou une dominance de la multiplication végétative.
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Discussions
b. Diversité des populations tétraploïdes Les populations tétraploïdes de C. asiatica sont constituées d’individus très polymorphes. Une large diversité génétique a été démontrée au sein de ces populations. Cette diversité génétique pourrait s’expliquer par le mode de reproduction adopté par ces populations. Vu le taux de germination et la viabilité des graines produites observés lors de l’étude de reproduction, les tétraploïdes semblent opter pour la fécondation croisée que pour l’autofécondation. En effet, la réalisation de l’autofécondation reste douteuse car le taux de germination des graines issues de ce type de reproduction ne s’élève qu’à 1,85% contre 55,55% pour la fécondation libre. Ce fait peut-être dû soit à des anomalies cellulaires, ou à une dormance des graines, ou à une auto-incompatibilité, ou à une mortalité pollinique. La difficulté de germination des graines et la stérilité des pollens de C. asiatica ont été antérieurement exposées par Mathur et al. (2003) et Lopes-Consolari (1996). De son côté, Pagliarini (2000) a mentionné que les anomalies observées au niveau de la fertilité des pollens et de la production de graines de C. asiatica seraient d’une part une conséquence de la ségrégation des chromosomes qui se fait de façon irrégulière à cause de l’ascension précoce ou tardive des chromosomes ; et seraient d’autre part une conséquence de la présence de chromosomes « collants » qui est due à des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. Si ces anomalies existent vraiment chez C. asiatica , un faible taux de germination aurait dû être également noté chez les individus du groupe A en fécondation libre. Etant donné que ceci n’a pas été le cas, cette hypothèse est donc à écarter. Devkota et ses collaborateurs (2010c) ont étudié l’effet de plusieurs facteurs environnementaux sur la germination des graines de C. asiatica récoltées au Nép al. Ils ont démontré que les graines fraichement récoltées ne germent pas immédiatement, elles restent en dormance durant deux à trois mois. Dans notre étude, les premières plantules sont apparues quatre mois après le semis et les germinations des restes des graines ont été attendues 4 mois en plus. Au total, huit mois après le semis, les graines n’ont toujours pas germées. La dormance des graines n’est donc pas l’explication à ce faible taux de germination des tétraploïdes en autofécondation. En plus, dans le cas d’un phénomène de dormance des graines, les mêmes résultats auraient du être obtenus chez les graines issues de la fécondation libre. Ces constats nous amènent à l’hypothèse d’un phénomène d’auto-incompatibilité. L’auto-incompatibilité est un mécanisme qui s’oppose à l’autofécondation. D’après Lundquist en 1964, c’est l’inaptitude d’une plante hermaphrodite fertile à produire un zygote après autofécondation (Borgel, 1980). Ce système est déterminé par les allèles présents dans
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Discussions un locus appelé locus S. Dans le locus S réside 2 gènes complètement liés qui sont les gènes exprimés respectivement dans le pollen et le pistil. Ces derniers codent pour la production des protéines de reconnaissance à leur surface. Lorsque ces protéines se reconnaissent, le pollen ne peut polliniser un ovule présent dans le pistil. Les systèmes d’auto-incompatibilité sont très répandus chez un grand nombre de plantes à fleurs et les individus de C. asiatica compris dans le groupe A pourraient en faire partie. Le très faible taux de germination en autofécondation chez les individus tétraploïdes de C. asiatica pourrait s’expliquer par ce système d’auto-incompatibilité. Toutefois, étant donné que quelques graines ont quand même germé, cette auto-incompatibilité serait donc préférentielle. Quoi qu’il en soit, une vérification de l’état pollinique et une étude de ségrégation allélique des descendances consistant à vérifier la présence des allèles parentaux au niveau des descendants seraient indispensables pour confirmer cette déduction. A l’issu d’une étude de pollinisation et de fécondation, Le Bellec (2004) a démontré cette auto-incompatibilité chez deux espèces de Hylocereu s. Elles fleurissent et ne produisent que rarement des fruits qui renferment des graines dont le pouvoir germinatif est incertain. Les observations ont montrées que cette absence de productivité était en effet due à une auto-incompatibilité non lié à une stérilité du pollen. Chez le melon africain (Cucumis melo L. var . agrestis ), Djé et ses collaborateurs (2006) ont observé également un très faible taux de germination des graines issus des fleurs hermaphrodites. L’hypothèse d’une mortalité pollinique a été envisagée. Cependant, l’observation des grains de pollens de ces fleurs a montré que ceux-ci sont viables et fonctionnels. Ils en ont déduit que les grains de pollens de la fleur hermaphrodite de Cucumis melo sont viables, mais l’espèce présente une auto-incompatibilité qu’elle est prédisposée à l’allogamie. Suite à cette auto-incompatibilité, la grande diversité génétique observée au sein des populations tétraploïdes de C. asiatica pourrait ainsi se justifier par leur propension à l’allogamie, et ceci en dépit de leurs propagations végétatives. Elias et ses collaborateurs (2001) ont effectivement rapporté que chez les plantes à multiplication végétative, un faible taux de reproduction sexuée peut déjà conduire une diversité génétique élevée. En bref, une diversité au niveau du génome nucléaire est révélée au sein des populations de C. asiatica malgaches, une distinction de populations diploïdes et tétraploïdes a été démontrée. En établissant un lien entre la diversité observée au niveau du génome chloroplastique et celle révélée au niveau du génome nucléaire, il est remarqué que le groupe d’individus à haplotype H1 correspondent aux individus tétraploïdes à 36 chromosomes tandis que le groupe d’individus à haplotype H2 correspondent aux individus diploïdes à 18 chromosomes. Ainsi,
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Discussions l’exploration du génome chloroplastique et nucléaire de C. asiatica a démontré qu’une diversité génétique bien nette se présente au sein des populations de C. asiatica malgaches.
I.2. DIVERSITE PHENOTYPIQUE Etant donné que les caractéristiques biologiques d’une espèce sont les résultats de l’expression de ses propres gènes (Benlaghlid et al. , 1990), il a été remarqué dans notre étude que ces variations génétiques observées au sein des populations malgaches de C. asiatica semblent s’exprimer au niveau phénotypique. Effectivement, une diversité morphologique des feuilles de C. asiatica a été mise en évidence. Notre échantillonnage est constitué de populations à feuilles réniformes et de populations à feuilles orbiculaires. Sachant que la variabilité phénotypique des végétaux repose non seulement sur la diversité génétique mais également sur la variabilité des facteurs environnementaux, notre étude confirme que l’aspect morphologique des feuilles de C. asiatica est un résultat d’une expression génétique car ce caractère est hérité de tous les descendants de chaque population. En effet, tous les échantillons de C. asiatica , provenant des différents sites, transplantés à la pépinière à Antananarivo ont gardé la forme originelle de leurs feuilles malgré le changement des conditions environnementales auquel ils ont été soumis. En associant les données génétiques aux données morphologiques, il est constaté que les deux formes de feuilles de C. asiatica correspondent respectivement aux deux groupes génétiques qui ont été identifiés. Les populations tétraploïdes ont des feuilles réniformes tandis que les populations diploïdes présentent des feuilles orbiculaires. De telles relations génotype-phénotype ont été également identifiées chez Solanum melonga L. (Prohens et al. , 2005). En mesurant 35 traits morphologiques d’individus de Solanum melonga et en analysant leurs ADNs par la technique AFLP, Prohens et al. (2005) ont démontré, chez cette espèce, une diversité morphologique positivement corrélée avec une variation génétique. Il est ainsi démontré que la diversité génétique au sein des populations malgaches de C. asiatica s’est nettement exprimée au niveau de la morphologie des feuilles. En visualisant, la distribution de ces populations, il a été remarqué que les populations diploïdes à feuilles orbiculaires sont retrouvées dans la région occidentale de l’île tandis que les populations tétraploïdes à feuilles réniformes sont localisées dans la région orientale. Une diversité de C. asiatica est alors identifiée à Madagascar et cette diversité est en relation étroite avec la répartition géographique des individus. En comparant C. asiatica avec l’espèce C. uniflora , les études morphologiques et les analyses du génome nucléaire ont montré qu’un lien de parenté assez éloigné se présente entre
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Discussions ces deux espèces de Centella , toutefois C. uniflora est plus proche des populations tétraploïdes que des diploïdes.
I.3. CENTELLA ASIATICA , COMPLEXE POLYPLOÏDE A MADAGASCAR Il est défini que deux plantes appartiennent au même complexe si dans les conditions naturelles elles peuvent, avec une probabilité non nulle, échanger des gènes par hybridation, soit directement, soit par le relais de plantes intermédiaires (Pernes, 1984). Si les populations diploïdes et les populations tétraploïdes malgaches de C. asiatica sont apparentées, cette espèce pourrait alors constituer un complexe polyploïde à Madagascar. Une hypothèse sur l’existence de ce lien de parenté a déjà pu être avancée à partir de l’étude du génome chloroplastique mais une étude de l’inter-fertilité entre les deux types de populations et une analyse de l’origine de la polyploïdie de l’espèce permettront de conforter cette hypothèse.
I.3.1. Croisement entre populations Concernant l’inter-fertilité entre les individus diploïdes et tétraploïdes de C. asiatica , notre étude a montré que malgré la ressemblance de leurs fleurs, les floraisons de ces individus se produisent à des périodes différentes, au mois d’Avril pour les diploïdes et au mois de Mai pour les tétraploïdes. La possibilité de croisement entre ces deux types de populations semble ainsi improbable. Cependant une floraison tardive des diploïdes ou une floraison précoce des tétraploïdes sont envisageables, ces cas pourraient favoriser un croisement entre eux. La cohabitation d’individus à feuilles réniformes et à feuilles orbiculaires a été observée dans les sites d’Analavory et d’Ambohitromby. Ces deux formes d’individus peuvent donc vivre dans un même endroit, cependant aucun individu intermédiaire n’a été identifié dans nos analyses. L’inter-fertilité entre ces individus devrait faire l’objet d’une étude minutieuse afin de savoir s’ils vivent en sympatrie ou s’ils s’hybrident pour former des individus intermédiaires. Les informations découlant de ce genre d’étude pourraient amener à tracer et à comprendre l’évolution de C. asiatica . Si l’inter-fertilité des individus diploïdes et tétraploïdes de C. asiatica n’a pas pu être vérifiée à partir de ce travail afin de contrôler leur lien de parenté, voyons si des informations concernant l’origine de la polyploïdie de cette espèce peuvent être recueillies.
I.3.2. Polyploïdisation de Centella asiatica Plus de 70% des plantes à fleurs évoluent vers la polyploïdisation (Meyers et al. , 2006), c’est un phénomène très répandu chez les angiospermes (Szadkowski et al. , 2011). Il a
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été démontré précédemment qu’une polyploïdisation s’est également produite au sein de l’espèce C. asiatica . Les caractéristiques des stomates, les mutations au niveau du génome chloroplastique, le nombre de chromosomes, le nombre de sites ADNr, et la structure du génome nucléaire en témoignent. La question est alors de savoir d’où dérivent ces populations de C. asiatica malgaches supposées tétraploïdes. Une analyse plus approfondie du génome chloroplastique permettrait de répondre en partie à cette question. Le génome chloroplastique est généralement transmis maternellement (Yukawa et al. , 2006). De ce fait, l’haplotype des populations diploïdes originelles devraient alors être logiquement retrouvé dans celui des tétraploïdes. Nos résultats ont montré que les haplotypes de ces deux types de populations de C. asiatica sont différents. Trois hypothèses peuvent être avancées : soit ces tétraploïdes sont issus de populations diploïdes qui proviennent d’autres pays, ou ils dérivent de diploïdes malgaches, ou ils proviennent du croisement des deux. D’une part, en se référant aux études antérieures, les polyploïdes peuvent présenter des niveaux variés de polymorphisme puisqu’ils ont été formés plusieurs fois indépendamment à partir des mêmes espèces apparentées (Grivet, 2002). Ils ne résultent donc pas nécessairement d’une population liée à une origine unique mais à une origine multiple (Soltis et al. , 1993; Grivet, 2002). Ceci conduit à l’hypothèse que les populations supposées tétraploïdes retrouvées à Madagascar pourraient dériver de populations diploïdes d’un autre pays. Des résultats similaires aux nôtres ont été retrouvés chez les populations polyploïdes et les populations diploïdes du lierre, Hedera (Vargas et al. , 1999). Si ces populations ont été supposées apparentées, une différence au niveau des haplotypes a été détectée par les séquences chloroplastiques du locus trnL-trnT. L’analyse effectuée par les auteurs ont permis de confirmer que les populations polyploïdes ( Hedera hibernica ) dérivent bien des populations diploïdes ( Hedera helix ssp. helix et Hedera maroccana ) mais qu’elles avaient une origine maternelle multiple. D’autre part, il a été démontré de nos analyses précédentes que la différence au niveau du génome chloroplastique des populations étudiées est le résultat d’une évolution dans le temps et que ces populations sont apparentées. Deux cas peuvent alors être possibles : soit ces populations tétraploïdes malgaches sont issues du croisement de populations diploïdes malgaches différentes, soit elles dérivent de l’union de populations malgaches avec d’autres populations provenant d’autre pays. Nos analyses suggèrent ainsi qu’un lien de parenté existe entre les populations tétraploïdes malgaches et les populations diploïdes malgaches. Quoi qu’il en soit, l’hypothèse stipulant que des tétraploïdes peuvent provenir de diploïdes d’autres pays n’est pas à omettre car il est fortement probable que des populations diploïdes étrangers
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Discussions soient elles-mêmes apparentées aux diploïdes malgaches et présentent un haplotype similaire. D’autant plus que les analyses microsatellites ont révélés que des individus étrangers se rapprochent de certaines populations malgaches. En effet, il a été remarqué que d’une part les populations de l’île de La Réunion et des sites asiatiques se rapprochent des populations d’Antalaha et d’Ambanja, et d’autre part la population de la Tanzanie et de Zimbabwe se regroupe avec celles de la Montagne d’ Ambre. Ce rapprochement peut révéler deux cas possibles : ces individus étrangers pourraient provenir originalement de ces individus malgaches et ont ensuite subit des modifications au niveau de leur génome pour pouvoir s’adapter à leur environnement ou à l’inverse, ce sont les individus malgaches qui sont originaires de ces autres pays. Une étude phylogéographique qui consistera à examiner les liens de parenté entre les populations de C. asiatica permettra d’éclaircir cette confusion sur l’origine de C. asiatica malgache. Dans la nature, les complexes polyploïdes sont très fréquents chez les plantes. De tels complexes d’espèces sont observés chez de nombreuses espèces. En Algérie, Amirouche et Misset (2009) ont identifié chez les orges ( Hordeum murinum ) des populations diploïdes (2n=2x=14) et des populations tétraploïdes (2n=4x=28). Ces deux populations sont caractérisées par une grande diversité génétique et une distribution géographique en corrélation avec le gradient bioclimatique Nord-Sud de l’Algérie. Elles ont été érigées en deux taxons différents, H. murinum ssp. glaucum et H. murinum ssp. Leporinum , qui forment un complexe diploïde et tétraploïde. La distribution géographique de ce complexe a été expliquée par l’adaptation et l’évolution au sein des populations diploïdes qui est un taxon endémique des zones arides et semi-arides. Nous pouvons ainsi conclure que C. asiatica constitue à Madagascar un complexe polyploïde. Ce complexe comprend des populations diploïdes à 2n=2x=18 chromosomes et des populations tétraploïdes à 2n=4x=36 chromosomes. Il est caractérisé par une variabilité morphologique bien nette en relation avec une importante variabilité génétique et une tendance forte à une structuration des populations corrélée à la division territoriale phytogéographiques de Madagascar (Humbert, 1955) (Figure 19). L’existence du phénomène de polyploïdisation chez l’espèce C. asiatica a été déjà antérieurement évoquée. Kokubugata et ses collaborateurs (1998), après avoir identifiés des populations de C. asiatica diploïdes à 18 chromosomes et tétraploïdes à 36 chromosomes dans les zones pacifiques, ont déduit que les tétraploïdes sont des autotétraploïdes originaires des populations diploïdes. Ils ont émis l’hypothèse que cette tétraploïdisation pourrait être une forme d’adaptation des plantes des régions tropicales et subtropicales vers les régions
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Discussions tempérées. A Madagascar, la distribution spatiale de C. asiatica semble être en relation avec le climat. D’une part, les populations diploïdes à feuilles orbiculaires habitent la région occidentale à climat aride et semi-aride. D’autre part, les populations tétraploïdes à feuilles réniformes se sont répandues dans toute la région Est de l’île qui présente un climat humide. Ainsi, le complexe polyploïde de C. asiatica retrouvé à Madagascar peut être expliqué par une adaptation et une évolution de la population originelle d’un climat aride et semi-aride vers un climat humide.
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Discussions
Figure 19 : Répartition du complexe polyploïde de Centella asiatica à Madagascar, représentée sur la carte phytogéographique établie par Humbert (1955)
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II. CENTELLA ASIATICA DE LA REGION D ’A LAOTRA MANGORO Les résultats issus de cette thèse constituent des informations importantes et intéressantes pour la filière C. asiatica à Madagascar. Ils ont conduit à la caractérisation des populations de la région d’Alaotra-Mangoro, et à apporter des explications et des solutions aux problèmes d’instabilité de la productivité de C. asiatica dans cette région.
II.1. CARACTERISATION DES ACCESSIONS D ’A LAOTRA -MANGORO Dans l’île, les collectes sont principalement effectuées dans la région d’Alaotra- Mangoro, que ce soit en vue d’une exportation ou en vue d’une utilisation locale. Ce choix ne s’est pas fait au hasard. Il a été effectivement publié que les accessions récoltées dans cette région font partie, des accessions qui produisent un taux élevé en principes actifs à Madagascar (Rahajanirina et al. , 2011) et même par rapport aux autres pays fournisseurs (Rouillard-Guellec et al. , 1997) ; raison pour laquelle elles sont très demandées sur le marché international des produits naturels (Péchard et al. , 2005). Notre étude a montré que ces plantes récoltées sont des accessions de C. asiatica à feuilles réniformes, tétraploïdes à génotypes particuliers. Il est ainsi déduit que la richesse en principes actifs de ces accessions pourrait être liée à la spécificité de leur génotype.
II.2. PROBLEME D ’INSTABILITE DE LA TENEUR EN PRINCIPES ACTIFS D’après nos enquêtes, la teneur en principes actifs de ces accessions d’Alaotra Mangoro est devenue très instable voir même en baisse depuis quelques années, bien qu’aucun problème d’épuisement des ressources n’est détecté. Cette situation inquiète les exportateurs et les incite actuellement à trouver des explications et des solutions car l’offre risque de ne plus satisfaire la demande. Des éléments de réponse à ce problème ont été tirés de nos résultats. L’étude de diversité génétique de C. asiatica a montré que les populations tétraploïdes sont très variées génétiquement. Cette diversité est due certainement au régime de reproduction de ces populations qui tend préférentiellement vers l’allogamie et qui conduit ainsi à un échange de gènes entre les individus. Sachant que les accessions de la région d’Alaotra-Mangoro sont des tétraploïdes, ce régime de reproduction allogame les concerne également. Ainsi, en considérant les brassages génétiques induits par cette allogamie et en impliquant la corrélation de la richesse en principes actifs avec la structure génétique, le maintien des gènes productifs chez les descendants de ces accessions collectées n’est alors pas constant. A cet effet, le taux de principes actifs pourrait varier de façon importante de
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Discussions génération en génération, ce qui pourrait expliquer l’instabilité et la régression de la quantité des principes actifs des accessions de C. asiatica. Par conséquent, si tel est notre cas, les génotypes producteurs de C. asiatica de Madagascar risquent de disparaitre au fil des années alors que cette espèce constitue une richesse patrimoniale, une source de revenu pour les populations locales et une source de devise importante pour l’économie malgache. Telles sont les explications avancées du point de vue génétique, mais d’autres facteurs comme la fréquence des collectes, l’épuisement du sol, le changement climatique, et bien d’autres sont aussi à considérer concernant ce problème d’instabilité.
II.3. SOLUTIONS PROPOSEES FACE A L ’INSTABILITE DE LA TENEUR EN PRINCIPES
ACTIFS Face à ce problème d’instabilité de la teneur en principes actifs de C. asiatica , des mesures devraient être prises. Pour y remédier, il serait intéressant de détecter et de sélectionner les génotypes élites, c’est-à-dire les génotypes qui présentent un taux de principes actifs intéressant. En tenant compte des données génétiques et chimiques, cette sélection serait un moyen efficace pour régler les problèmes de productivité de l’espèce dans des buts de conservation, d’extension de la zone de collecte et de valorisation agronomique, Afin d’identifier les génotypes élites, il serait donc intéressant, à moyen terme, de procéder à des échantillonnages rigoureux et précis dans la région d’Alaotra-Mangoro. Les échantillons collectés seront ensuite soumis à des tests chimiques pour déterminer leurs teneurs en principes actifs, à des tests génétiques afin de révéler leurs génotypes et à des tests de reproduction afin de confirmer leur mode de reproduction. Une fois que les génotypes élites seront détectés, ces ressources génétiques seront en priorité conservées, puis elles serviront à définir la possibilité d’extension des zones de collectes et enfin elles feront l’objet d’une culture.
II.3.1. Conservation des génotypes élites de Centella asiatica Afin de prévenir leurs disparitions, les génotypes élites de C. asiatica doivent être conservés. Le mode de conservation adopté doit tenir compte du fait que le risque d’extinction des génotypes élites de C. asiatica serait surtout les croisements naturels non sélectionnés qui se produisent entre les individus. Cette conservation pourrait être in-situ ou ex-situ.
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La conservation in-situ consiste à conserver les ressources dans son écosystème et dans son milieu naturel. La conservation in-situ de C. asiatica aurait pu être la création d’aires protégées mais vue la large distribution de cette plante, la superficie de ces aires seraient énorme que la gestion et l’entretien des génotypes dans son milieu naturel seraient complexes et même non envisageables. La conservation à la ferme est aussi un mode de conservation in- situ très utilisé. Elle consiste à cultiver les génotypes dans des jardins privés de la population locale. Cette forme de conservation pourrait aussi être appliquée sur C. asiatica , cependant cela nécessite des données sur les flux de pollen de C. asiatica afin d’éviter tout croisements avec les autres génotypes non élites. La méthode de conservation la plus adéquate pour ces génotypes élites serait alors un mode de conservation isolé et contrôlé en dehors de son habitat naturel c’est-à-dire en conservation ex-situ. Cette dernière permet non seulement de conserver les génotypes mais permet également de fournir du matériel végétal pour la multiplication, pour la réintroduction des espèces, pour la recherche et l’enseignement (Randriamampionona, 2010). Deux modes de conservation ex-situ peut être proposés pour les génotypes élites de C. asiatica : la conservation dans un jardin botanique et la culture in-vitro. L’introduction des génotypes élites de C. asiatica dans un jardin botanique est une forme de conservation adéquate dans la mesure où la plantation se fasse dans un milieu clos et isolé. Ceci permettra de maintenir ces génotypes et de les conserver. Sachant que C.asiatica se reproduit végétativement et que le patrimoine génétique est hérité de génération en génération, il serait intéressant de faire des essais d’ablation des appareils reproducteurs pour ne laisser fonctionner que le système de reproduction végétatif et ensuite de doser leurs principes actifs. Si la productivité des génotypes élites est maintenue, une grande population pourrait être ainsi générée et conservée ex-situ. Une culture in-vitro des génotypes élites de C. asiatica peut également être envisagée à des fins de conservation. La culture in-vitro de C. asiatica a déjà été adoptée par l’Institut Malgache de Recherches Appliquées grâce aux études menées par Randriamampionona (2010). Ce dernier a travaillé sur des accessions de C. asiatica récoltées dans 7 localités sélectionnées parmi les sites les plus exploités pour la récolte de l’espèce. Il a pu démontrer que le taux de principes actifs des accessions in vitro est en moyenne 4 fois moins important que celui des accessions in vivo (Randriamampionona, 2010). Avec une amélioration des techniques et des processus de culture, ce mode de procédé serait une option pour la conservation des génotypes élites de C. asiatica de Madagascar.
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II.3.2. Extension de la zone de collecte de Centella asiatica En plus d’être conservés, les génotypes élites pourraient servir pour l’extension de la zone de collecte de C. asiatica. La stratégie est de cibler d’autres zones de collecte potentielles en identifiant les génotypes élites dans des régions autres qu’Alaotra-Mangoro. Cette extension augmenterait le taux d’accessions productifs dans les collectes et conduirait ainsi à un maintien de la teneur en principes actifs à des niveaux appréciables. Quelques possibilités d’extension ont été déduites de nos résultats microsatellites. En effet ces derniers ont révélé que des populations tétraploïdes présentent des génotypes très proches des génotypes élites de la région d’Alaotra Mangoro, à savoir toutes les populations de la région d’Analamanga, les populations de Marolambo, de Maroharatra, de Hazomay, d’Analavory, de Fianarantsoa, d’Antsirabe, d’Ampatakamaroreny et de Marotandrano (Figure 20). Bien qu’aucun dosage de principes actifs n’ait été effectué, les analyses microsatellites montrent qu’il est fortement probable que ces populations présentent un taux de principes actifs exploitable égalant celui des populations d’Alaotra-Mangoro. Si tel est réellement le cas, ces localités pourraient représenter de nouvelles zones de collectes de C. asiatica. Toutefois comme l’espèce est présente en faible abondance dans ces zones, les collectes y afférentes serviront à compléter la production de la région d’Alaotra-Mangoro car elles ne sauraient couvrir à elles seules la demande pour le marché international. La potentialité de la région d’Analamanga à représenter une nouvelle région de collecte de C. asiatica peut déjà être confirmée car il a été mentionné par Randriamampionona (2010) et Rahajanirina et al. (2012) que des collectes de C. asiatica à des fins d’exportation se font déjà aux alentours d’Antananarivo. Elargir les zones de collecte est une solution d’importance non négligeable face à l’instabilité de la quantité des principes actifs de C. asiatica . Par ailleurs, une valorisation agronomique pourrait être également une solution adéquate.
II.3.3. Culture de Centella asiatica Vue que C. asiatica est jusqu’à aujourd’hui récoltée à l’état sauvage et n’a jamais fait l’objet de culture, excepté les petites plantations destinées à la recherche, un essai de valorisation agronomique consistant à cultiver de façon intensive les génotypes élites de C. asiatica pourrait être conduit. Cette culture devra être réalisée dans des endroits isolés de tout contact avec d’autres génotypes de C. asiatica pour éviter le risque de brassage génétique avec des plantes à faible productivité. Cette perspective de domestication assurera la stabilité et la normalisation de la quantité et la qualité des produits d’exportation car la culture ne sera
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Discussions constituée que de plantes produisant des principes actifs d’une qualité et d’une quantité appréciables. Une fois que C. asiatica est domestiquée, un programme d’amélioration variétale peut-être envisagée pour l’amélioration de la quantité et de la qualité des principes actifs des populations tétraploïdes et diploïdes de C. asiatica malgaches. Par ailleurs, sachant que la collecte de C. asiatica constitue une source de revenus pour les paysans pendant la période de soudure (Chupin, 2010), l’impact social de ce programme de domestication doit être considérée sérieusement. Une stratégie concevable serait également de réintroduire une population de génotypes élites dans les zones de collectes sauvages de C. asiatica . Pour ce faire, une production massive de génotypes élites devrait être effectuée. Ils seront ensuite introduits dans le milieu naturel de l’espèce afin de reconstituer une dominance de populations de génotypes élites à l’état sauvage. Cette stratégie serait une option intéressante pour la filière C. asiatica malgache et satisfaisante pour les paysans.
Telles sont les solutions que nous suggérons pour résoudre les problèmes actuels des exportateurs de C. asiatica . La réalisation de ces projets de sélection, de conservation, d’extension des zones de collecte et d’essai de valorisations agronomiques nécessite un maximum de données génétiques et chimiques. Une exploration plus détaillée et plus approfondie de la génétique et de la teneur en principes actifs de C. asiatica de Madagascar devrait donc être effectuée en priorité afin de faire correspondre chaque génotype aux caractéristiques de ses principes actifs.
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Figure 20 : Localisation des zones de collecte potentielles de Centella asiatica par rapport à la région de collecte actuelle. Correspondances des points sur la carte : 8 : Marotandrano, 17 : Ampatakamaroreny, 42 : Hazomay, 51 : Analavory, 60 : Antsirabe, 63 : Marolambo, 69 : Maroharatra, 72 : Fianarantsoa.
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CONCLUSIONS
Conclusions
Centella asiatica est une plante médicinale de grand intérêt pour Madagascar car elle est mondialement réputée pour sa richesse en principes actifs et est ainsi très demandée des pays du Nord. Bien que cette plante soit retrouvée du Nord au Sud et de l’Est à l’Ouest de l’île, les exportateurs effectuent principalement les collectes dans la région d’Alaotra- Mangoro. De ce fait, une hypothèse sur l’existence d’une diversité de C. asiatica à Madagascar a été avancée et a conduit à notre étude dont l’objectif principal a été d’évaluer cette diversité et d’en tirer les caractéristiques des accessions produisant une teneur élevée en principes actifs. En outre, ce travail cherchait également à trouver, à partir des données collectées, des éléments de réponse biologiques aux questionnements évoqués actuellement par les exportateurs, concernant les problèmes d’instabilité de la productivité des produits d’exportation. Pour atteindre ces objectifs, deux points essentiels ont été abordés, notamment la biologie et la diversité de l’espèce. La caractérisation biologique de C. asiatica a permis de mieux comprendre le fonctionnement de l’espèce par des recueils de données sur le mode de reproduction, sur le nombre de chromosomes et sur le niveau de ploïdie. L’étude de diversité, quant à elle, a permis de démontrer qu’à Madagascar C. asiatica présente une diversité génétique chloroplastique et nucléaire qui s’exprime au niveau de la morphologie des feuilles. Deux types de populations bien distincts ont été identifiés : des populations diploïdes et des populations tétraploïdes. Les populations diploïdes présentent 2n=2x=18 chromosomes et leurs feuilles sont orbiculaires, tandis que les populations tétraploïdes possèdent 2n=4x=36 chromosomes et leurs feuilles sont réniformes. Génétiquement, les populations diploïdes présentent peu de variations dues à leur mode de reproduction tendant vers la multiplication végétative et/ou l’autofécondation. Les populations tétraploïdes sont, par contre, très diversifiées génétiquement du fait qu’en plus de la reproduction végétative, elles optent préférentiellement pour l’allogamie car leur autofécondation semble être limitée par un système d’auto-incompatibilité préférentielle qui conduisent à des graines non fertiles. La distribution géographique de ces deux types de populations est corrélée avec la division territoriale phytogéographique de Madagascar. Les populations diploïdes sont retrouvées dans la région occidentale de Madagascar où elles ont adopté un climat aride et semi-aride, tandis que les populations tétraploïdes sont réparties dans toute la région orientale de l’île où le climat est humide. Il a découlé de nos analyses que ces deux types de populations sont apparentés. Les populations tétraploïdes sont très probablement issues d’une allotétraploïdisation de diploïdes. De plus, la coexistence de ces populations dans certains sites laisse supposer l’existence de
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Conclusions populations intermédiaires car des échanges polliniques pourraient être possibles étant donné que la morphologie de leurs fleurs est similaire. Ce lien nous permet de déduire que C. asiatica constitue à Madagascar un complexe polyploïde composé de populations diploïdes et de populations tétraploïdes. Par ailleurs, une étude d’inter-fertilité ne serait pas incongrue, car dans le cas où des populations intermédiaires existeraient, il serait intéressant de savoir, comment elles se présenteraient du point de vue morphologique, chromosomique et génétique ? Seront-elles fertiles ? Leur teneur en principes actifs seraient-elles meilleures ? Et en conséquence, ces questionnements permettront de comprendre l’évolution de C. asiatica . A l’issu de cette étude de diversité, il a été identifié que les populations de C. asiatica de la région d’Alaotra-Mangoro sont des populations tétraploïdes à 36 chromosomes, à feuilles réniformes et présentent des génotypes spécifiques. Cette particularité est certainement corrélée avec une teneur élevée en principes actifs, ce qui expliquerait pourquoi la collecte se focalise dans cette zone là. Il a été déduit de notre recherche que, génétiquement, les problèmes d’instabilité et de diminution de productivités des accessions dans cette région pourraient s’expliquer par un brassage génétique marqué entre les génotypes élites producteurs et d’autres génotypes moins intéressants. Suite à ce brassage, le caractère de génotypes élites n’est plus maintenu constant chez les descendances, et de génération en génération ce caractère serait de moins en moins exprimé et entrainerait ainsi une variation non maitrisable de la teneur en principes actifs au sein de ces populations exploitées. Pour remédier à ces problèmes auxquels font actuellement face la filière C. asiatica à Madagascar, nous proposons de procéder à une caractérisation génétique et chimique détaillées des populations de C. asiatica malgaches dans le but de sélectionner tous les génotypes élites existants. Cette sélection permettra, en premier lieu d’assurer la pérennité de ces génotypes élites par une conservation en milieu isolé dans un jardin botanique et/ou une conservation in-vitro. En second lieu, elle permettra d’orienter des pistes vers d’autres zones d’exploitation et de mettre en œuvre un essai de valorisation agronomique et d’amélioration variétale. Compte tenu de l’importance de la collecte sauvage de C. asiatica sur les revenus des paysans en période de soudure, nous proposons également une réintroduction massive de génotypes élites dans leur milieu naturel. En plus d’avoir satisfaits les objectifs visés, cette étude a fourni de nouvelles données sur C. asiatica . Une banque enrichie en locus microsatellites de l’espèce a été construite. C’est une première pour la plante C. asiatica car elle n’a jamais fait l’objet d’études microsatellites auparavant. A partir de cette banque, vingt marqueurs microsatellites spécifiques à C. asiatica ont été synthétisés. Ces marqueurs sont d’ores et déjà enregistrés
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Conclusions dans la base de données internationale EMBL. Cette banque enrichie en locus microsatellites et ces marqueurs microsatellites constituent une source de données nationales et internationales et un outil important à portée de mains pour les études ultérieures. Plusieurs recherches plus approfondies sur C. asiatica peuvent actuellement être menées, à savoir l’élaboration d’une carte génétique, des études phylogéographiques, des études de populations et même une clarification de la classification taxonomique du genre Centella . Ce travail nous a permis de développer considérablement les connaissances sur la biologie et la diversité de C. asiatica à Madagascar , bien que divers points soient encore à préciser. Il ouvre une voie à d’autres perspectives de recherches, en plus de celles proposées précédemment. De quel croisement les tétraploïdes dérivent-ils réellement ? Existe-t-il un flux de gènes entre les populations diploïdes et tétraploïdes ? Des populations triploïdes existeraient-elles dans les zones de contacts ? Une étude de populations de plus grande taille dans les zones de contacts des deux types de populations permettra de répondre à ces questions. Quels allèles spécifient les génotypes élites des autres ? Ces données sont d’une grande importance et d’une grande utilité pour la filière C. asiatica car ceci permettra d’identifier et de sélectionner correctement les génotypes élites. Une caractérisation allélique de l’espèce serait ainsi nécessaire. Ces génotypes élites produisent-ils vraiment un taux en principes actifs élevés ? Quelle sont les corrélations entre génotype et productivité chimique chez C. asiatica ? Une étude de la variation de la teneur en principes actifs chez C. asiatica mérite ainsi d’être mis en œuvre et d’être associée aux résultats de notre travail. Une étude de diversité à l’échelle mondiale devrait être également envisagée afin de se rendre compte de la réelle distribution de C. asiatica , de pouvoir replacer la diversité malgache par rapport à la diversité mondiale et de comparer les populations exploitées de Madagascar aux autres populations étrangères. Une prospection et un échantillonnage strict dans toute la zone de distribution mondiale de C. asiatica devraient alors être effectués. Les résultats de cette recherche ont fait l’objet, jusqu’à aujourd’hui, de deux publications scientifiques dans des revues internationales citées ci-après. Le premier article porte sur la construction de la banque enrichie en locus microsatellites de C. asiatica (Article 1), et le deuxième concerne le complexe polyploïde que forme C. asiatica à Madagascar (Article 2).
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Références bibliographiques
Abdulla, M. A., Al-Bayaty, F. H., Younis L. T. and Hassan, M. I. A. 2010. Anti-ulcer activity of Centella asiatica leaf extract against ethanol-induced gastric mucosal injury in rats. Journal of Medicinal Plants Research . 4(13): 1253-1259. Acharya, K. P. and Acharya, M. 2010. Traditional knowledge on medicinal plants used for the treatment of livestock diseases in Sardikhola VDC, Kaski, Nepal. Journal of Medicinal Plants Research . 4(2): 235-239. Adjanohoun, E. E. 1995. La biodiversité tropicale face au développement des industries pharmaceutiques. Medical & Pharmaceutical Trade South Africa. 3-18. Albertini, E., Porceddu, A., Marconi, G., Barcaccia, G., Pallottini, L. and Falcinelli, M. 2003. Microsatellite-AFLP for genetic mapping of complex polyploids. Genome . 46 : 824- 832. Amann, R. I., Binder, B. J., Olson, R. J., Chisholm, S. W., Devereux R. and Stahl D. A. 1990. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology . 56 (6): 1919-1925. Amirouche, R. and Misset, M. T. 2009. Flore spontanée d’Algérie : différenciation écogéographique des espèces et polyploïdie. Les Cahiers Agricultures . 18 (6): 474- 480. Amsellem, L. 2000. Comparaison entre aires d'origine et d'introduction de quelques traits biologiques chez Rubus alceifolius Poir. (Rosaceae), plante envahissante dans les îles de l'Océan Indien. Thèse de doctorat. Ecole doctorale Biologie intégrativité , Formation Biologie de l'Evolution et Ecologie . Université de Montpelllier II Sciences et Techniques du Languedoc. 239 p. Anathbandhu, D. and Mallick, R. 1991. Correlation between genomic diversity and asiaticoside content in Centella asiatica (L.) Urban. Botanical Bulletin - Academia Sinica Taipei . 32 : 1-8. Andriantsiferana, R. 2009. Travelling Through Time - Voyage dans le Temps. Madagascar Conservation & Development . 4: 67-68. Anuradha-Hore. 1976. Chromosome study affinities of some species of Hydrocotyloideae. Science and Culture . 42 (5): 266-268. Arias, R. S., Ballard, L. L. and Scheffler B. E. 2009. UPIC: Perl scripts to determine the number of SSR markers to run. Bioinformation . 3(8): 352-360. Armstrong, E., Postiglioni, A., Martínez, A., Rincón, G. and Vega-Pla, J. L. 2006. Microsatellite analysis of a sample of Uruguayan Creole bulls ( Bos taurus ). Genetics and Molecular Biology . 29 (2): 267-272. Asadian, G. and Pieber, K. 2005. Morphological variations in Walnut varieties of the mediterranean regions. International Journal Of Agriculture & Biology 7(1): 71-73. Aubourg, S., Delseny, M. and Lecharny, A. 2006. L’organisation des génomes végétaux révélée par leur annotation. Biofutur . 265 : 33-37. Austerlitz, F., Brachet, S., Couvet, D., Frascaria-Lacoste, N., Jung-Muller, B., Kremer, A. and Streiff, R. 1999. Flux géniques chez les arbres forestiers. Synthèse bibliographique . Ayala, F. J. 1992. Evolution at the molecular level. Journal of Molecular Evolution . 35 : 90-92
111
Références bibliographiques
Aziz, Z. A., Davey, M. R., Power, J. B., Anthony, P., Smith, R. M. and Lowe, K. C. 2007. Production of asiaticoside and madecassoside in Centella asiatica in vitro and in vivo. Biologia Plantarum . 51 (1): 34-42. Balfourier, F., Ravel, C., Bochard, A.-M., Exbrayat-Vinson, F., Boutet, G., Sourdille, P., Dufour, P. and Charmet, G. 2006. Développement, utilisation et comparaison de différents types de marqueurs pour étudier la diversité parmi une collection de blé tendre. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 6: 129-144. Barcelos, E. 1998. Etude de la diversité génétique du genre Elaeis (E. oleifera (Kunth) Cortés et E. guineensis Jacq.) par marqueurs moléculaires (RFLP et AFLP). Thèse de doctorat. Ecole doctorale Biologie des systèmes intégrés, Spécialité Sciences Agronomiques . Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier. 150 p. Barry, M. B., Diagne, A., Pham, J.-L. and Ahmadi, N. 2008. Évolution récente de la diversité génétique des riz cultivés ( Oryza sativa et O. glaberrima ) en Guinée. Cahiers Agricultures . 17 (2): 122-127. Baurens, F.-C., Bocs, S., Rouard, M., Matsumoto, T., Miller, R. N., Rodier-Goud, M., MBéguié-A-MBéguié, D. and Yahiaoui, N. 2010. Mechanisms of haplotype divergence at the RGA08 nucleotide-binding leucine-rich repeat gene locus in wild banana ( Musa balbisiana ). Biomedcentral Plant Biology . 10 : 149-165. Beaulieu, J. M., Leitch, I. J., Patel, S., Pendharkar, A. and Knight, C. A. 2008. Genome size is a strong predictor of cell size and stomatal density in angiosperms. New Phytologist . 179 : 975-986. Belahbib, N., Ouassou, A., Dahmani, J. and Douira, A. 2005. Contribution à l’étude de l’introgression génétique entre Quercus suber L et Q. rotundifolia (Lamk.) Trabut au Maroc par l'utilisation des marqueurs microsatellites. Bulletin de l'Institut Scientifique, Rabat, Section Sciences de la Vie . 26-27 : 31-34. Benlaghlid, M., Bouattoura, N., Monneveux, P. and Borries, C. (1990). Les blés des oasis : Etude de la diversité génétique et de la physiologie de l’adaptation au milieu. Options Méditerranéennes - Les systèmes agricoles oasiens . 11: 171-194. Bennett, M. D. 2004. Perspectives on polyploidy in plants – ancient and neo. Biological Journal of the Linnean Society . 82 : 411-423. Besnard, G., Garcia-Verdugo, C., Rubiodecasas, R., Treier, U. A., Galland, N. and Vargas, P. 2008. Polyploidy in the olive complex ( Olea europaea ): Evidence from flow cytometry and nuclear microsatellite analyses. Annals of Botany . 101 : 25-30. Bhattarai, S., Chaudhary, R. P. and Taylor, R. S. 2009. Ethno-medicinal plants used by the people of Nawalparasi District, Central Nepal. Our Nature . 7: 82-89. Billotte, N., Lagoda, P. J. L., Risterucci, A.-M. and Baurens, F.-C. 1999. Microsatellite- enriched libraries: applied methodology for the development of SSR markers in tropical crops. Fruits . 54 (4): 277-287. Blanc, G., Barakat, A., Guyot, R., Cooke, R. and Delseny, M. 2000. Extensive duplication and reshuffling in the Arabidopsis genome. Plant Cell . 12 : 1093-1101. Blanc, G., Hokamp, K. and Wolfe, K. H. 2003. A recent poly-ploidy superimposed on older large scaleduplication in the Arabidopsis genome. Genome Research . 13 : 137-144. Boiteau, P. 1943. Travaux sur l'asiaticoside. Rapport annuel de la co-société des amis du parc botanique et zoologique de Tananarive . 9: 71-75.
112
Références bibliographiques
Boiteau, P., Buzas, A., Lederer, E., Polonsky, J., Bhattacharyya, S. C., Lythgoe, B. and Trippett, S. 1949. Derivatives of Centella asiatica used against leprosy. Nature . 163 : 258-260. Boluarte-Medina, T. and Veilleux, R. E. 2002. Phenotypic characterization and bulk segregant analysis of anther culture response in two backcross families of diploid potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 68 : 277-286. Bontems, M. 1942. L'asiaticoside isolée à partir de l’ Hydrocotyle asiatica . Gazette Médicale de Madagascar . 15 : 29-33. Booncong, P., Eshbaugh, W. H. and D. O. C. 1995. Centella asiatica (L.) (Apiaceae): Morphological and cytological characterization. Abstract of Lectures and Poster Presentations in the 43rd Annual Congress on Medicinal Plant Research . 92-93. Borchert, R., Rivera, G. and Hagnauer, W. 2002. Modification of vegetative phenology in a tropical semi-deciduous forest by abnormal drought and rain. Biotropica . 34 (1): 27- 39. Borgel, A. 1980. L'autoincompatibilité chez les graminées : application à l'étude de l'espèce Oryza longistaminata . Office de la recherche scientifique et technique outre-mer – Laboratoire de Génétique - Centre d’Adiopodoume Abidjan. Borie, C., Raphaël, M., Hamelin, R. and Duval, A. (2004). Instabilité des microsatellites : un nouveau mécanisme de carcinogenèse associé à l’immunodépression dans les lymphomes non hodgkiniens chez l’homme. Nouvelle Magasine . 20: 641-642. Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M. and Davis, R. W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using Restriction Fragment Length Polymorphisms. American Journal of Human Genetics . 32 : 314-331. Bowman, C. M., Bonnard, G. and Dyer, T. A. 1983. Chloroplast DNA variation between species of Triticum and Aegilops. Location of the variation of the chloroplast genome and its relevance to the inheritance and classification of the cytoplasm. Theoret. Appl. Genet. 65 : 247-262. Bréda, N. 1999. L’indice foliaire des couverts forestiers :mesure, variabilité et rôle fonctionnel. Revue Forestière Française LI . 2: 135-150. Brezinová, B., Macák, M. and Eftimová, J. 2009. The morphological diversity of selected traits of world collection of poppy genotypes ( Genus papaver ). Journal of Central European Agiculture . 10 (2): 183-190. Brinkhaus, B., Lindner, M., Schuppan, D. and Hahn, E. G. 2000. Chemical, pharmalogical and clinical profile of the East Asian medical plant Centella asiatica . Phytomedicine . 7(5): 427-448. Brochmann, C., Brysting, A. K., Alsos, I. G., Borgen, L., Grundt, H. H., Scheen, A.-C. and Elven, R. 2004. Polyploidy in arctic plants. Biological Journal of the Linnean Society . 82 : 521-536. Caldas, E. D. and Machado, L. L. 2004. Cadmium, mercury and lead in medicinal herbs in Brazil. Food and Chemical Toxicology . 42 (4): 599-603. Camposeo, S. 2011. Effect of increasing climatic water deficit on some leaf and stomatal parameters of wild and cultivated almonds under Mediterranean conditions. Scientia horticulturae . 127 (3): 234.
113
Références bibliographiques
Cardoso, J. M. K., Oblessuc, P. R., Campos, T. d., Sforça, D. A., Carbonell, S. A. M., Chioratto, A. F., Formighieri, E. F., Souza, A. P. d. and Benchimol, L. L. 2008. New microsatellite markers developed from an enriched microsatellite common bean library. Pesquisa Agropecuária Brasileira . 43 (7): 929-936. Carpentier, F. G.. 2005. Analyse Factorielle des Correspondances. Introduction aux analyses multidimensionnelles . 25-35 Carvalho, A., Guedes-Pinto, H. and Lima-Brito, J. 2011. Physical localization of NORs and ITS length variants in old Portuguese durum wheat cultivars. Journal of Genetics . 90 (1): 95-101. Carvalho, C. R., Clarindo, W. R., Praça, M. M., Araujo, F. S. and Carels, N. 2008. Genome size, base composition and karyotype of Jatropha curcas L., an important biofuel plant. Plant Science . 174 : 613-617. Charcosset, A., Camus-Kulandaivelu, L., Tenaillon, M., Gouesnard, B., Tollon-Cordet, C., Madur, D., Combes, V., Brunel, D., Giancola, S., Cornouiller, J., Chastanet, M., Beigbeder, J. and Manicacci, D. 2006. Caractérisation à grande échelle du polymorphisme de gènes candidats en vue de la valorisation de ressources génétiques allogames – Étude prospective chez le maïs. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 6: 145-159. Cheng, C. L., Guo, J. S., Luk, J. and Koo, M. W. 2004. The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcer in rats. Life Science . 74 : 2237- 2249. Chulalaksananukul, W. and Chimnoi, W. 1999. Polyploid induction in Centella asiatica (L.) Urban by colchicine treatment. Journal of Science Research in Chulalongkorn University . 24 (2): 55-65. Chung, K.-S., Weber, J. A. and Hipp, A. L. 2011. Dynamics of chromosome number and genome size variation in a cytogenetically variable sedge ( Carex scoparia var. scoparia, Cyperaceae). American Journal of Botany . 98 (1): 122-129. Chupin, J. 2010. Comment l'exploitation durable d'une plante dans un territoire, affecte la sécurisation de l'approvisionnement dans la filière? Cas d'étude de Centella asiatica (L.) Urban, plante médicinale et à usage cosmétique, à Madagascar. Mémoire de Master II. Innovation et Développement des Territoires Ruraux . Ecole supérieure Agronomique Montpellier France. Commonwealth Forestry Association. 2005. Research confirms water sceptics’ worst fears. College of Fine Arts Newsletter . 30 Cornet, A. and Guillaumet, J.-L. 1976. Divisions floristiques et étages de végétation à Madagascar. Cahier ORSTOM, Biologie . 11 (1): 35-40. Cox, D. N., Rajasuriya, P. E., Gladwin, J. and Ashworth, A. 1993. Problems encountered in the community based production of leaf concentrate as a supplement for pre-school children in Sri Lanka. International Journal of Food Sciences and Nutrition . 44 : 123- 132. Cubry, P., Musoli, P., Legnaté, H., Pot, D., De Bellis, F., Poncet, V., Anthony, F., Dufour, M. and Leroy, T. 2008. Diversity in coffee assessed with SSR markers: structure of the genus Coffea and perspectives for breeding. Genome . 51 : 50-63.
114
Références bibliographiques
Cui, L., Leebens-Mack, J., Wang, L.-S., Tang, J., Rymarquis, L., Stern, D. B. and dePamphilis, C. W. 2006. Adaptive evolution of chloroplast genome structure inferred using a parametric bootstrap approach. BMC Evolutionary Biology . 1-12. Curtis, S. E. and Clegg, M. T. 1984. Molecular evolution of chloroplast DNA sequences. Molecular Biology and Evolution . 1(4): 291-301. D'Hont, A. 2005. Unraveling the genome structure of polyploids using FISH and GISH; examples of sugarcane and banana. Cytogenetic and Genome Research . 109 : 27-33. D'Hont, A., Grivet, L., Feldmann, P., Rao, S., Berding, N. and Glaszmann, J. C. 1996. Characterisation of the double genome structure of modern sugarcane cultivars (Saccharum spp .) by molecular cytogenetics. Molecular and General Genetics . 250 : 405-413. D'Hont, A., Ison, D., Alix, K., Roux, C. and Glaszmann, J. C. 1998. Determination of basic chromosome numbers in the genus Saccharum by physical mapping of ribosomal RNA genes. Genome . 41 : 221-225. D'Hont, A., Lu, Y.-H., Gonzales de Leon, D., Grivet, L., Feldmann, P., Lanaud, C. and Glaszmann, J. C. 1994. A molecular approach to unraveling the genetics of sugarcane, a complex polyploid of the Andropogoneae tribe. Genome . 37 : 222-230. D’Hont, A., Paget-Goy, A., Escoute, J. and Carreel, F. 2000. The interspecific genome structure of cultivated banana, Musa spp . revealed by genomic DNA in situ hybridization. Theor Appl Genet . 100 : 177-183. Danan, S. 2009. Diversité structurale des locus de résistance à Phytophthora infestans chez la pomme de terre et synténie chez les Solanacées. Thèse de doctorat. Ecole doctorale Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences, Environnement. Centre International D’etudes Superieures En Sciences Agronomiques Supagro Montpellier. 302 p. Das, A. and Mallick, R. 1991. Correlation between genomic diversity and asiaticoside content in Centella asiatica (L.) Urban. Botanical Bulletin- Academia Sinica Taipei . 32 : 1-8. Davies, G. P., Martin, I., Sturrock, S. S., Cronshaw, A., Murray, N. E. and Dryden, D. T. F. 1999. On the structure and operation of type I DNA restriction enzymes. The Journal of Molecular Biology. 290 : 565-579. Defani-Scoarize, M. A., Pagliarini, M. S. and Aguiar, C. G. 1996. Meiotic behavior of inbred lines of maize (Zea mays L.). Nucleus . 39 : 10-18. Deka, S. J., Ahmed, M. and Basumatary, S. K. 2005. Allelopathic effects of Hydrocotyle asiatica on Cicer arietinum seed germination and growth. Environment and Ecology . 23 : 111-113. Delseny, M. 2009. Le séquençage des génomes de plantes : les acquis. Les Cahiers Agricultures . 18 (6): 461-467. Demesure, B., Sodzi, N. and Petit, R. J. 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology . 4(1): 129-134. Dereeper, A., Argout, X., Billot, C., Rami, J. F. and Ruiz, M. 2007. SAT, a flexible and optimized web application for SSR marker development. BMC Bioinformatics . 8: 465. Devi, J., Ko, J. M. and Seo, B. B. 2005. FISH and GISH: Modern cytogenetic techniques. Indian Journal of Biotechnology . 4: 307-315.
115
Références bibliographiques
Devkota, A., Dall’Acqua, S., Comai, S., Innocenti, G. and Jha, P. K. 2010a. Centella asiatica (L.) urban from Nepal: Quali-quantitative analysis of samples from several sites, and selection of high terpene containing populations for cultivation. Biochemical Systematics and Ecology . 38 : 12-22. Devkota, A. and Jha, P. K. 2009. Variation in growth of Centella asiatica along different soil composition. Botany Research International. 2(1): 55-60. Devkota, A. and Jha, P. K. 2010b. Effects of different light levels on the growth traits and yield of Centella asiatica . Middle-East Journal of Scientific Research . 5(4): 226-230. Devkota, A. and Jha, P. K. 2010c. Seed Germination responses of the medicinal herb Centella asiatica . Brazilian Society of Plant Physiology . 22 (1): 143-150. Dibong, S. D., Mpondo Mpondo, E., Ngoye, A., Kwin, M. F. and Betti, J. L. 2011. Ethnobotanique et phytomédecine des plantes médicinales de Douala, Cameroun. Journal of Applied Biosciences . 37 : 2496-2507. Direction des Eaux et Forêts (1987). Plantes médicinales : Qu'avons nous exploité jusqu'à présent?. Guide du producteur - exportateur de plantes médicinales . Madagascar. Djè, Y., Kouonon, L. C., Bi, A. I. Z., Gnamien, G. Y. and Baudoin, J. 2006. Étude des caractéristiques botaniques, agronomiques et de la biologie florale du melon africain (Cucumis melo L. var. agrestis Naudin, Cucurbitaceae). Biotechnology, Agronomy, Society and Environment . 10 (2): 109-119. Djebrouni, M. 1992. Variabilité morphologique, caryologique et enzymatique chez quelques populations de Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud. Folia Geobotanica & Phytotaxonomica . 27 (1): 49-59. Dogan, B., Duran, A., Bagci, Y., Dinc, M., Martin, E., Cetin, O. and Ozturk, M. 2010. Phylogenetic relationships among the taxa of the genus J ohrenia dc . (Apiaceae) from turkey based on molecular method. Bangladesh Journal of Plant Taxonomy . 17 (2): 113-120. Dolezel, J. and Bartos, J. 2005. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Annals of Botany . 95 : 99-110. Dolezel, J., Lysák, M. A., Van den Houwe, I., Dolezelová, M. and Roux, N. (1998). Utilisation de la cytométrie en flux pour la détermination rapide du degré de ploïdie des espèces de Musa . INFOMUSA - La Revue Internationale sur Bananiers et Plantains . 6: 6-9. Dow, B. D. and Ashley, M. V. 1998. High levels of gene flow in bur oak revealed by paternity analysis using microsatellites. Heredity . 89 (1): 62-70. Downie, S. R. and Katz-Downie, D. S. 1996. A molecular phylogeny of Apiaceae subfamily Apioideae: Evidence from nuclear ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Sequences. American Journal of Botany . 83 (2): 234-251. Downie, S. R., Ramanath, S., Katz-Downie, D. S. and Llanas, E. 1998. Molecular systematics of Apiaceae subfamily Apioideae: phylogenetic analyses of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer and plastid rpoc1 intron sequences. American Journal of Botany. 85 (4): 563-591. Doyle, J. J. and Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin . 19 : 11-15.
116
Références bibliographiques
Dubé, M.-P. 2009. Étude de la diversité génétique au sein des génomes nucléaire et chloroplastique chez les cinq races connues du Striga gesnerioides , une plante parasite d’importance mondiale. Thèse pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor. Département de Phytologie . Université Laval Québec. 167 p. Dufresne, C. 2008. Plantes médicinales biologiques. Des développements prometteurs. Biobulle 82 : 3 p. Dumolin-Lapègue, S., Pemonge, M. H. and Petit, R. J. 1997. An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular Ecology . 6: 393–397. Durbin, O. 2006. Relations entre variables morphométriques foliaires et floraison chez l’orchis mâle Orchis mascula L. Problème pratique de statistique . 73. Duval, M.-F., Bory, S., Andrzejewski, S., Grisoni, M., Besse, P., Causse, S., Charon, C., Dron, M., Odoux, E. and Wong, M. 2006. Diversité génétique des vanilliers dans leurs zones de dispersion secondaire. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 6(181-196). Elias, M., Penet, L., Vindry, P., MicKey, D., Panaud, O. and Robert, T. 2001. Unmanaged sexual reproduction and the dynamics of genetic diversity of a vegetatively propagated crop plant, cassava ( Manihot esculenta Crantz), in a traditional farming system. Molecular Ecology . 10 (8): 1895-1907. Ellegren, H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Genetics . 5: 435-445. Escofier, B. and Pagès, J. 1998. Analyses factorielles simples et multiples – Objectifs, méthodes et interprétation. 3èmé édition, Paris, DUNOD. Fanciullino, A.-L., Dhuique-Mayer, C., Luro, F., Casanova, J., Morillon, R. and Ollitrault, P. 2006. Carotenoid diversity in cultivated citrus is highly influenced by genetic factors. Journal of Agricultural and Food Chemistry . 54 : 4397-4406. Federici, M. T., Shcherban, A. B., Capdevielle, F., Francis, M. and Vaughan, D. 2002. Analysis of genetic diversity in the Oryza officinalis complex. EJB Electronic Journal of Biotechnology . 5(2). Ferrante, S. P., Lucretti, S., Reale, S., Patrizio, A. D., Abbate, L., Tusa, N. and Scarano, M.-T. 2010. Assessment of the origin of new citrus tetraploid hybrids (2n = 4x) by means of SSR markers and PCR based dosage effects. Euphytica . 173 : 223-233. Friha, F. L.-B. 2008. Analyse de la diversité génétique et symbiotique des populations naturelles tunisiennes de Medicago truncatula et recherche de QTL liés au stress salin. Thèse de doctorat. Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies . l'Université Toulouse III - Paul Sabatier. Galland, N. and Favarger, C. 1988. Un complexe polyploïde méconnu : Thlaspi perfoliatum L. AGG. (Brassicaceae). Jaca y Huesca . 205-211. Garcia-Pichel, F., Lopez-Cortes, A. and Nubel, U. 2001. Phylogenetic and morphological diversity of cyanobacteria in soil desert crusts from the colorado plateau. Applied And Environmental Microbiology . 67 (4): 1902-1910. Genevès, L. 1996. Aide-mémoire de biologie moléculaire. Paris, DUNOD. Gerlach, W. L. and Bedbrook, J. R. 1979. Cloning and characterization of ribosomal RNA genes from wheat and barkley. Nucleic Acids Research . 7(7): 1865-1885.
117
Références bibliographiques
Gerlach, W. L. and Dyer, T. A. 1980. Sequence organization of the repeating units in the nucleus of wheat which contain 5S rRNA genes. Nucleic Acids Research . 8(21): 4851- 4865. Gömürgen, A. N. and Altinözlü, H. 2005. Chromosome number and karyotype analysis of Kalidiopsis wagenitzii aellen. Pakistan Journal of Botany . 37 (2): 307-311. Grivet, D. 2002. Phylogéographie et évolution moléculaire comparée d’arbres forestiers à l’aide des marqueurs chloroplastiques. Thèse de doctorat. Ecole doctorale Ingénieries des ressources, Procédés, Produits et Environnement. Mention Biologie Forestière . Université Henri Poincaré Nancy. 244 p. Grivet, D. and Petit, R. J. 2002. Phylogeography of the common ivy ( Hedera sp .) in Europe: genetic differentiation through space and time. Molecular Ecology . 11: 1351-1362. Guo, J. S., Cheng, C. L. and Koo, M. W. 2004. Inhibitory effects of Centella asiatica water extract and asiaticoside on inducible nitric oxide synthase during gastric ulcer healing in rats. Planta Medica . 70 : 1150-1154. Hamadi, H. and Safia, E. B. 2011. Study of some characteristics related to the sexual reproduction in autotetraploid vicia narbonensis. Journal of Agricultural Science 3(1): 153-162. Hamon, P., Seguin, M., Perrier, X. and Glaszmann, J. C. 1999. Diversité génétique des plantes tropicales cultivées. CIRAD. Hashim, P., Sidek, H., Helan, M. H. M., Sabery, A., Palanisamy, U. D. and Llham, M. 2011. Triterpene composition and bioactivities of Centella asiatica . Molecules . 16 : 1310- 1322. Heong, C. S., Kaur, Bhupinder, Huda, N., Karim, A. A. and Fazilah, A. 2011. Effect of fermentation on the composition of Centella asiatica teas. American Journal of Food Technology . 6(7): 581-593. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. and Parks, D. R. 2006. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immulogy . 7(7): 681-685. Hetherington, A. M. and Woodward, F. I. 2003. The role of stomata in sensing and driving environmental change. Nature . 424 : 901-908. Hodgson, J. G., Sharafi, M., Jalili, A., Dıaz, S., Montserrat-Mart, G., Palmer, C., Cerabolini, B., Pierce, S., Hamzehee, B., Asri, Y., Jamzad, Z., Wilson, P., Raven, J.A., Band, S. R., Basconcelo, S., Bogard, A., Carter, G., Charles, M., Castro-Diez, P., Cornelissen, J. H. C., Funes, G., Jones, G., Khoshnevis, M., Pérez-Harguindeguy, N., Pérez- Rontome, M.C., Shirvany, F. A., Vendramini, F., Yazdani, S., Abbas-Azimi, R., Boustani, S., Dehghan, M., Guerrero-Campo, J., Hynd, A., Kowsary, E., Kazemi- Saeed, F., Siavash, B., Villar-Salvador, P., Craigie, R., Naqinezhad, A., Romo-Diez, A., Espuny, L. d. T. and Simmons, E. 2010. Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog?. Annals of Botany . 105 : 573-584. Hoffmann, M. H., Schmuths, H., Koch, C., Meister, A. and Fritsch, R. M. 2010. Comparative analysis of growth, genome size, chromosome numbers and phylogeny of arabidopsis thaliana and three cooccurring species of the Brassicaceae from Uzbekistan. Journal of Botany . 2010 : 1-8.
118
Références bibliographiques
Hong, H.-T., Kim, H.-J., Lee ,.-K., Kim, D.-W., Kim, H.-M., Choo, Y.-K., Park, Y.-G., Lee, Y.-C. and Kim, C.-H. 2002. Inhibitory effect of a Korean traditional medicine, Honghwain–Jahage (water extracts of Carthamus tinctorius L. seed and Hominis placenta ) on interleukin-1-mediated bone resorption. Journal of Ethnopharmacology . 79 : 143-148. Horning, M. E. and Cronn, R. C. 2006. Length polymorphism scanning is an efficient approach for revealing chloroplast DNA variation. Genome . 49 : 134-142. Howe, C. J., Barbrook, A. C., Koumandou, V. L., Nisbet, R. E. R., Symington, H. A. and Wightman, F. T. 2002. Evolution of the chloroplast genome. Philosophical Transactions of the Royal Society London Biological Sciences . 358 : 99-107. Humagain, K. and Shrestha, K. K. 2009. Medicinal plants in Rasuwa district, central Nepal: trade and livelihood. Journal of Plant Science . 6: 39-46. Humbert, H. 1955. Flore de Madagascar et des Comores. 140è Famille . 12-19. Inamdar, E. K., Yeole, R. D., Ghogare, A. B. and de Souza, N. J. 1996. Determination of biologically active constituents in Centella asiatica . Journal of Chromatography . 742 : 127-130. INFOMUSA. 1997. The International Magazine on Banana and Plantain. Vol. 6. Itayguara, R. d. C. and Forni-Martins, E. R. 2006. Chromosome studies in Brazilian species of Campomanesia Ruiz & Pa ´von and Psidium L. (Myrtaceae Juss.). Caryologia . 59 (1): 7-13. Jain, P. K. and Agrawal, R. K. 2008. High Performance Liquid Chromatographic Analysis of Asiaticoside in Centella asiatica (L.) Urban. Chiang Mai Journal of Science . 35 (3): 521-525. Jakse, J. and Javornik, B. 2001. High throughput isolation of microsatellites in hop ( Humulus lupulus L.). Plant Molecular Biology Reporter . 19 : 217-226. James, J. T. and Dubery, I. A. 2009. Pentacyclic triterpenoids from the medicinal herb, Centella asiatica (L.) Urban. Molecules . 14 : 3922-3941. James, J. T., Meyer, R. and Dubery, I. A. 2008. Characterisation of two phenotypes of Centella asiatica in Southern Africa through the composition of four triterpenoids in callus, cell suspensions and leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 94 : 91-99. Jamil, S. S., Nizami, Q. and Salam, M. 2007. Centella asiatica (Linn.) Urban óA Review. Natural Product Radiance . 6(2): 158-170. Jaskani, M. J., Kwon, S. W. and Dae, H. K. 2005. Flow cytometry of DNA contents of colchicine treated watermelon as a ploidy screening method at M1 stage. Pakistan Journal of Botany . 37 (3): 685-696. Jayasinha, P. 1999. Centella asiatica, a litterature survey. Medicinal and Aromatic Plant Series. 1: 1-22. Jin, H.-X. and Sheng, T.-Z. 1994. Cytological study of six species in the carrot family (Umbelliferae) in Sichuan Province. Journal of Southwest Agricultural University . 16 (5): 488-491. Joachimiak, A. and Grabowska-Joachimiak, A. 2000a. Stomatal cell length and ploidy level in four taxa belonging to the Phleum sect. Phleum. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica . 42 : 103–107.
119
Références bibliographiques
Joachimiak, A. and Grabowska-Joachimiak, A. 2000b. Stomatal cell length and ploidy level in four taxa belonging to the Phleum sect. Phleum. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica . 42 : 103–107. Jombart, T., Moazami-Goudarzi, K., Dufour, A.-B. and Laloë, D. 2006. Fréquences alléliques et cohérence entre marqueurs moléculaires : des outils descriptifs. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 6: 25-39. Kaensaksiri, T., Soontornchainaksaeng, P. and Prathanturarug, S. 2011. In vitro induction of polyploidy in Centella asiatica (L.) Urban. Plant Cell, Tissue and Organ Culture . Kahn, C. L., Mozes, S. and Raphael, B. J. 2010. Efficient algorithms for analyzing segmental duplications with deletions and inversions in genomes. Algorithms for Molecular Biology . 5: 1-12. Karanja, J., Amugune, N. O., Ininda, J., Kimatu, J. N. and Danson, J. W. 2009. Microsatellite analysis of the correlation between molecular and morphological traits in assorted maize inbred lines. African Crop Science Journal. 17 (3): 133-144. Karki, D. 2009. Ecological and socio- economic impacts of Parthenium hysterophorus L. invasion in two urban areas in Nepal. Dissertation for Masters of Science in Botany . Central Department of Botany. Tribhuvan University Kathmandu Nepal. Kellogg, E. A. and Bennetzen, J. L. 2004. The evolution of nuclear genome structure in seed plants. American Journal of Botany . 91 (10): 1709-1725. Kim, O.-T., Bang, K.-H., Shin, Y.-S., Lee, M.-J., Jung, S.-J., Hyun, D.-Y., Kim, Y.-C., Seong, N.-S., Cha, S.-W. and Hwang, B. 2007. Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate. Plant Cell Repport . 26 : 1941-1949. Kim, O.-T., Kim, M.-Y., Huh, S.-M., Ahn, J.-C., Seong, N.-S. and Hwang, B. 2004. Effect of growth regulators on asiaticoside production in whole plant cultures of Centella asiatica (L.) Urban. Journal of Plant Biology . 47 (4): 361-365. Kim, O.-T., Seong, N.-S., Kim, M.-Y. and Hwang, B. 2005a. Isolation and characterization of squalene synthase cDNA from Centella asiatica (L.) Urban Journal of Plant Biology . 48 (3): 263-269. Kim, O. T., Ahn, J. C., Hwang, S. J. and Hwang, B. 2005b. Cloning and expression of a farnesyl diphosphate synthase in Centella asiatica (L.) Urban. Molecules and Cells . 19 (2): 294-299. Kim, O. T., Kim, M. Y., Huh, S. M., Bai, D. G., Ahn, J. C. and Hwang, B. 2005c. Cloning of a cDNA probably encoding oxidosqualene cyclase associated with asiaticoside biosynthesis from Centella asiatica (L.) Urban. Plant Cell Repport . 24 : 304-311. Knapp, E. E. and Rice, K. J. (1997). Ecotypes of native species: How local is local in restoration plantings?. California Exotic Pest Plant Council . Departement of agronomy and Center for population biology, University of California, Davis. Knapp, J. 2008. Caractérisation et validation du marqueur microsatellite multilocus répété en tandem EmsB pour la recherche de polymorphisme génétique chez Echinococcus multilocularis : Application à l’étude de la transmission du parasite en Europe. Thèse de doctorat. Ecole doctoral « Homme, Environnement, Santé ». Université de Franche-Comté. 210 p.
120
Références bibliographiques
Kokubugata, G., Kondo, K. and Randall, L. M. 1998. Intraspecific polyploidy in Centella asiatica their karyotypes in five populations in Australia and Japan. Chromosome Science . 2: 43-46. Kouadio, D., Echikh, N., Toussaint, A., Pasquet, R. S. and Baudoin, J.-P. 2007. Organisation du pool génique de Vigna unguiculata (L.) Walp. : croisements entre les formes sauvages et cultivées du niébé. Base . 11 (1): 47-57. Kouakou, C. K., Roy-Macauley, H., Gueye, M. C., Otto, M. C., Rami, J.-F., Cissé, N. and Pasquet, R. S. 2007. Diversité génétique des variétés traditionnelles de niébé [ Vigna unguiculata (L.) Walp.] au Sénégal : étude préliminaire. Plant Genetic Resources Newsletter . 152 : 33-44. Kovarik, A., Dadejova, M., Lim, Y. K., Chase, M. W., Clarkson, J. J., Knapp, S. and Leitch, A. R. 2008. Evolution of rDNA in Nicotiana allopolyploids: a potential link between rDNA homogenization and epigenetics. Annals of Botany . 101 : 815-823. Ková řová, P., Navrátilová, A., Macas, J. and Doležel, J. 2007. Chromosome analysis and sorting in Vicia sativa using flow cytometry. Biologia Plantarum . 51 (1): 43-48. Kumar, A., Prakash, A. and Dogra, S. 2011. Centella asiatica attenuates D-galactose-induced cognitive impairment, oxidative and mitochondrial dysfunction in mice. International Journal of Alzheimer’s Disease . 1-9. Lacape, J.-M., Dessauw, D., Rajab, M., Noyer, J.-L. and Hau, B. 2007. Microsatellite diversity in tetraploid Gossypium germplasm : assembling a highly informative genotyping set of cotton SSRs. Mol Breeding . 19 : 45-58. Lalanne, E., Honys, D., Johnson, A., Borner, H. H. G., Lilley, K. S., Dupree, P., Grossniklaus, U. and Twell, D. 2004. SETH1 and SETH2 , Two components of the glycosylphosphatidylinositol anchor biosynthetic pathway, are required for pollen germination and tube growth in Arabidopsis . The Plant Cell . 16 : 229-240. Le Bellec, F. 2004. Pollinisation et fécondation d’Hylocereus undatus et d’ H. costaricensis à l’île de la Réunion. Fruits . 59 : 1-12. Léger, A. 2008. Biodiversité des plantes médicinales québécoises et dispositifs de protection de la biodiversité et de l'environnement. Mémoire Master en Sciences de l’environnement . Université de Québec à Montre al. Leipzig,. 1995. Madagascar: Rapport de pays pour la conférence technique internationale de la FAO sur les Ressources phylogénétiques. Food and Agriculture Organization Leong Pock Tsy, J.-M., Lumaret, R., Mayne, D., Mohamed Vall, A. O., Abutaba, Y. I. M., Sagna, M., Rakotondralambo, R. S. O. and Danthu, P. 2009. Chloroplast DNA phylogeography suggests a West African centre of origin for the baobab, Adansonia digitata L. (Bombacoideae, Malvaceae). Molecular Ecology . 18 : 1707-1715. Leong Pock Tsy, J. M. 2007. Complexe Anopheles gambiae à Madagascar : caractérisation moléculaire et variabilité génétique. Thèse de Doctorat. Sciences de la Vie - Biologie, Ecologie et Conservation Animales . Biologie Animale. Université d'Antananarivo. 201 p. Lepais, O., Lavabre, J., Gonzalez, M., Willm, J., Cabanettes, A. and Gerber, S. 2006. Diversité et structuration génétique des chênes à l’échelle de deux paysages : impact de l’écologie, de l’histoire et de la gestion. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 6: 543-557.
121
Références bibliographiques
Levy, A. A. and Feldman, M. 2002. The impact of polyploidy on grass genome evolution. Plant Physiology . 130 : 1587-1593. Li, D. and Zhang, X. 2002. Physical localization of the 18S-5´8S-26S rDNA and sequence analysis of ITS regions in Thinopyrum ponticum (Poaceae: Triticeae): Implications for concerted evolution. Annals of Botany . 90 : 445-452. Lim, K. Y., Soltis, D. E., Soltis, P. S., Tate, J., Matyasek, R., Srubarova, H., Kovarik, A., Pires, J. C., Xiong, Z. and Leitch, A. R. 2008. Rapid chromosome evolution in recently formed polyploids in Tragopogon (Asteraceae). Public Library of Science One . 3(10): 1-13. Lingling, L., Sun, G., Xie, J., Zang, X., Hu, Y. and Duan, J. 2009. Determination of chromosomal ploidy in Agave ssp. African Journal of Biotechnology . 8(20): 5248- 5252. Liu, K. and Muse, S. V. 2005. PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics . 8 p. Lopes-Consolaro, M. E., Pagliarini, M. S. and Chaves, L. J. 1996. Meiotic behaviour, pollen fertility and seed production in Brazilian populations of Centella asiatica (L.) Urban (Umbelliferae). Cytologia . 61 (4): 375-381. Louarn, J. 1980. Hybrides interspécifiques entre Coffea canephora Pierre et C. Liberica bull. Ex Hiern. Resultats préliminaires sur les hybrides F1. Communication du Neuvième colloque International sur le Café . Londres. Lysak, M. A., Dolezelova, M., Horry, J. P., Swennen, R. and Dolezel, J. 1999. Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in Musa . Theoretical and Applied Genetics. 98 : 1344-1350. Mable, B. K. 2004. Why polyploidy is rarer in animals than in plants: myths and mechanisms. Biological Journal of the Linnean Society . 82 : 453-466. Maquart, F. X., Chastang, F., Simeon, A., Birembaut, P. and Gillery, P. Y. (1999). Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds. European Journal of Dermatology . 9: 289-296. Marciniuk, J., Rerak, J., Grabowska-Joachimiak, A., Jastrz ąb, I., Musiał, K. and Joachimiak, A. J. 2010. Chromosome numbers and stomatal cell length in Taraxacum sect. palustria from Poland. Acta Biologica Cracoviensia . 52 (1): 117-121. Marhold, K., Huthmann, M. and Hurka, H. 2002. Evolutionary history of the polyploid complex of Cardamine amara (Brassicaceae): isozyme evidence. Plant Systematics & Evolution . 233 : 15-28. Martins, G. A., Soares, A. M., Barbosa, J. P. R. A. D., Mello J. M. d., Castro E. M. d. and Ferraz A. C. J. 2011. Stomatal density distribution patterns in leaves of the Jatoba (Hymenaea courbaril L.). Trees . Mathur, S., Sharma, S. and Kumar, S. 2003. Description of variation in the Indian accessions of the medicinal plant Centella asiatica (L.) Urban. Plant Genetic Resources Newsletter Newsletter - FAO - Biodiversity . 135 : 47-52. Matsuda, H., Morikawa, T., Ueda, H. and Yoshikawa, M. 2001. Medicinal foodstuffs. XXVII. Saponin constituents of Gotu Kola (2): Structures of new ursane- and oleanane-type triterpene oligoglycosides, Centella saponins B, C, and D, from Centella asiatica cultivated in Sri Lanka. Chemical Pharmacology Bulletin . 49 (10): 1368-1371.
122
Références bibliographiques
Melo, S. C. O., Gaiotto, F. A., Cupertino, F. B., Correâ, R. X., Moreira Reis, A. M., Grattapaglia, D. and Brondani, R. P. V. 2007. Microsatellite markers for Caesalpinia echinata Lam.(Brazilwood), a tree that named a country. Conservation Genetics . 8: 1269–1271. Menglan, S., Fading, P., Zehui, P., Watson, M. F., Cannon, J. F. M., Holmes-Smith, I., Kljuykov, E. V., Phillippe, L. R. and Pimenov, M. G. 2005. Apiaceae (Umbelliferae). Flora China . 14 : 1-205. Meyers, L. A. and Levin, D. A. 2006. On the abundance of polyploids in flowering plants. Evolution . 60 (6): 1198-1206. Mishra, M. K. 1997. Stomatal characteristics at different ploidy levels in Coffea L. Annals of Botany . 80 : 689-692. Mitsukuri, Y. and Kurahori, Y. 1959. Cytological studies in Umbelliferae II. The chromosome numbers and karyotypes of some Japanese species. La Kromosomo. 40 : 1354-1361. Mizuta, S., Munakata, H., Aimaiti, A., Oya, I., Oosawa, K. and Shimizu, T. 2006. Analysis of tandem repeats found in 44 prokaryotic genomes. Silico Biology . 6. Moazami-Goudarzi, K., Belemsaga, D. M. A., Ceriotti, G., Laloë, D., Fagbohoun, F., Kouagou, N. T., Sidibé, I., Codjia, V., Crimella, M. C., Grosclaude, F. and Touré, S. M. 2001. Caractérisation de la race bovine Somba à l’aide de marqueurs moléculaires. Revue d'élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux . 54 (2): 129-138. Mohammadi, S. A. and Prasanna, B. M. 2003. Analysis of genetic diversity in crop plants— salient statistical tools and considerations. Crop Science . 43 : 1235-1243. Mohandas, K. G., Muddanna, S. and Gurumadhva, S. 2005. Centella asiatica (linn) induced behavioural changes during growth spurt period in neonatal rats. Neuroanatomy . 4: 18-23. Mohanty, A., Martin, J. P. and Aguinagalde, I. 2001. A population genetic analysis of chloroplast DNA in wild populations of Prunus avium L. in Europe. Heredity . 87 (4): 421-427. Mondini, L., Noorani, A. and Pagnotta, M. A. 2009. Assessing plant genetic diversity by molecular tools. Diversity . 1: 19-35. Moraes, I. C. R. D., Pinto-Malio, C. A. F. and Lombello, R. A. 2009. Reproductive biology and cytology of Hypericum brasiliense Choisy (Hypericaceae). Revista Brasileira de Botânica . 32 (3): 539-544. Moretzsohn, M. d. C., Hopkins, M. S., Mitchell, S. E., Kresovich, S., Valls, J. F. M. and Ferreira, M. E. 2004. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. Biomedcentral Plant Biology . 4(11): 1-10. Mouton, J.-A. (1968). Contribution de la morphologie foliaire à la phylogénie des angiospermes. Communication Congré national des sociétés savailtes , Tours. 93 . Mun, W. S. 2003. Molecular genetic characterization of different accessions of Centella asiatica . School of Graduate Studies. Universiti Putra. 103 p.
123
Références bibliographiques
Munduvelil, T. T., Rajani, K., Anil, J. J., Sreeja, P. C., Paravanparampil, J. M., Mathew, D. and Sabulal, B. 2010. Elite genotypes/chemotypes, with high contents of madecassoside and asiaticoside, from sixty accessions of Centella asiatica of south India and the Andaman Islands: For cultivation and utility in cosmetic and herbal drug applications. Industrial Crops and Products . 32 (3): 545–550 Murat, C., Luis, P., Diez, J., Delaruelle, C., Guillot, P., Dupré, C., Chevalier, G. and Martin, F. 2003. Diversité génétique des populations de Tuber melanosporum Vittad. Les Actes du Bureau des Ressources Génétiques . 4: 467-478. Naicy, T. and Anilkumar, K. 2008. Genetic characteristics of five microsatellite markers associated with milk production traits in crossbred dairy cattle of Kerala. Veterinary World . 1(8): 245-247. Najimi, B., Jaafari, S. E., Jlibène, M. and Jacquemin, J.-M. 2003. Applications des marqueurs moléculaires dans l’amélioration du blé tendre pour la résistance aux maladies et aux insectes. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment . 7(1): 17-35. Neale, D. B., Saghai-Maroof, M. A., Allard, R. W., Zhang, Q. and Jorgensen, R. A. 1986. Chloroplast DNA diversity in populations of wild and cultivated barley. Genetics . 120 : 1105-1110. Negron-Ortiz, V. 2007. Chromosome numbers, nuclear DNA content, and polyploidy in Consolea (Cactaceae), an endemic cactus of the Caribbean islands. American Journal of Botany . 94 (8): 1360-1370. Nei, M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A . 70 : 3321–3323. Nei, M. 1978a. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics . 89 : 583-590. Nei, M. 1978b. The theory of genetic distance and evolution of human races. Japanese Journal of Human Genetics. 23 : 341-369. Nei, M. and Roychoudhury, A. K. 1974. Sampling variances of heterozygosity and genetic distance. Genetics . 76 : 379-390. Nelson, M. N. and Lydiate, D. J. 2006. New evidence from Sinapis alba L. for ancestral triplication in a crucifer genome. Genome . 49 : 230-238. Nguyen, H. L. and Nguyen, T. T. A. 2010. Asiaticoside production from Centella (Centella asiatica L. Urban) cell culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering . 15 : 1065- 1070. Nicolas, S. D., Le Mignon, G., Eber, F., Coriton, O., Monod, H., Clouet, V., Huteau, V., Lostanlen, A., Delourme, R., Chalhoub, B., Ryder, C. D., Chèvre, A. M. and Jenczewski, E. 2007. Homeologous recombination plays a major role in chromosome rearrangements that occur during meiosis of Brassica napus haploids. Genetics . 175 : 487-503. Noirot, M. 1978. Polyploïdisation de caféiers par la colchicine. Adaptation de la technique sur bourgeons axillaires aux conditions de Madagascar. Mise en évidence de chimères Café Cacao Thé . 23 (3): 187-194.
124
Références bibliographiques
Noyer, J. L., Weber, A., Billot, C., Brottier, P., Quero-Garcia, J. and Lebot, V. 2004. Genetic diversity of Taro ( Colocasia esculenta (L.) Schott) assessed by SSR markers. Proceeding of the 3rt International Taro Symposium . Pacific Community Noumea : 174-180. Oblessuc, P. O., Campos, T., Cardoso, J. M. K., Sforça, D. A., Baroni, R. M., Souza, A. P. and Benchimol, L. L. 2009. Adaptation of fluorescent technique for genotyping with new microsatellite markers in common bean. Pesquisa Agropecuária Brasileira 44 : 638-644. Ochatt, S. J. 2006. Flow cytometry (ploidy determination, cell cycle analysis, DNA content per nucleus). Medicago truncatula handbook : 1-13. Oliva, M. G., Lugo, A., Alcocer, J. and Cantoral-Uriza, E. A. 2008. Morphological study of Cyclotella choctawhatcheeana Prasad (Stephanodiscaceae) from a saline Mexican lake. Saline Systems . 4(17): 1-9. Ollitrault, P., Dambier, D. and Froelicher, Y. 2000. Apport de l’hybridation somatique pour l’exploitation des ressources génétiques des agrumes. Cahiers Agricultures . 9: 223- 226. Omar, R., Abdullah, M. A., Hasan, M. A. and Marziah, M. 2004. Development of growth medium for Centella asiatica cell culture via response surface methodology. American Journal of Applied Sciences . 1(3): 215-219. Ouédraogo, M., Maquet, A. and Baudoin, J.-P. 2005. Étude comparative de la diversité et de la structure génétique de populations sauvages de Phaseolus lunatus L à l’aide des marqueurs enzymatiques et microsatellites. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment . 9(3): 195-205. Pagliarini, M. S. 2000. Meiotic behavior of economically important plant species: the relationship between fertility and male sterility. Genetics and Molecular Biology . 23 (4): 997-1002. Parducci, L. and Szmidt, A. E. 1999. PCR-RFLP analysis of cpDNA in the genus Abies . Theor Appl Genet . 98 : 802-808. Park, B. C., Bosire, K. O., Lee, E. S., Lee, Y. S. and Kim, J. A. 2005. Asiatic acid induces apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells. Cancer Letter . 218 : 81-90. Parkin, I. A. P., Sharpe, A. G. and Lydiate, D. J. 2003. Patterns of genome duplication within the Brassica napus genome. Genome . 46 : 291-303. Paterson, A. H. 2005. Polyploidy, evolutionary opportunity, and crop adaptation. Genetica . 123 : 191-196. Patra, A., B.Rai, Rout, G. R. and P.Das. 1998. Successful plant regeneration from callus cultures of Centella asiatica (Linn.) Urban. Plant Growth Regulation . 24 : 13-16. Péchard, G., Antona, M., Aubert, S. and Babin, D. 2005. Ressources phytogénétiques, contrats et application de la Convention biodiversité à Madagascar : une approche prospective. Bois et Forêts des Tropiques . 284 (2): 45-58. Peiris, K. H. S. and Kays, S. J. 1996. Asiatic Pennywort Centella asiatica (L.) Urb. : A Little- known Vegetable Crop. HortTechnology . 6(1): 13-18. Pimenov, M. G., Leonov, M. V., 1993. The genera of the Umbelliferea. Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, Surrey, UK
125
Références bibliographiques
Pernes, J. 1984. Gestion des ressources genetiques des plantes / Manuel. Tome 2. Perrier, X., Flori, A. and Bonnot, F. 2003. Genetic diversity of cultivated tropical plants. Methods of data analysis . CIRAD, Montpellier France. Pissard, A., Ghislain, M. and Bertin, P. 2006. Genetic diversity of the Andean tuber-bearing species, oca ( Oxalis tuberosa Mol.), investigated by inter-simple sequence repeats. Genome . 49 : 8-16. Pittella, F., Dutra, R. C., Junior, D. D., Lopes, M. T. P. and Barbosa, N. R. 2009. Antioxidant and cytotoxic activities of Centella asiatica (L) Urb. International Journal of Molécular Sciences . 10 : 3713-3721. Prabhakar, M. 2004. Structure, delimitation, nomenclature and classification of stomata. Acta Botanica Sinica . 46 (2): 242-252. Prasad, N. P. and Ammal J. E. K. 1985. Chromosome count of Centella asiatica (Linn) Urban. Current Science . 54 (14): 706-707. Prat, D., Rampant, P. F. and Prado, E. 2006. Analyse du génome et gestion des ressources génétiques forestières. Prieto, C., Jara, C., Mas, A. and Romero, J. 2007. Application of molecular methods for analysing the distribution and diversity of acetic acid bacteria in Chilean vineyards. International Journal of Food Microbiology . 115 : 348-355. Prohens, J., Blanca, J. M. and Nuez, F. 2005. Morphological and molecular variation in a collection of eggplants from a secondary center of diversity: implications for conservation and breeding. Journal of the American Society for Horticultural Science . 130 (1): 1-9. Queval, R., Moazami-Goudarzi, K., Laloë, D., Mériaux, J.-C. and Grosclaude, F. 1998. Relations génétiques entre populations de taurins ou zébus d’Afrique de l’Ouest et taurins européens. Genetics Selection Evolution 30 : 367-383. Quilichini, A. 1999. Biologie et Ecologie d’une espèce endémique corso-sarde rare et protégée: Anchusa crispa Viv. (Boraginaceae) - Implications pour sa conservation. Thèse de doctorat. Biologie des Populations et Ecologie . Université de Corse Pascal Paoli, Corte. 126 p. Rafamantanana, M. H., Rozetc, E., Raoelisona, G. E., Cheuka, K., Ratsimamanga, S. U., Hubertc, P. and Quetin-Leclercq, J. 2009. An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification of triterpenic glycosides and aglycones in leaves of Centella asiatica (L.) Urb (APIACEAE). Journal of Chromatography . 877 : 2396- 2402. Raghu, A. V., Martin, G., Priya, V., Geetha, S. P. and Balachandra, I. 2007. Low cost alternatives for the micropropagation of Centella . Journal of Plant Sciences . 2(6): 592-599. Rahajanirina, V., Rakotondralambo, R. S. O., Roger, E., Razafindrazaka, H., Pirotais, S., Boucher, M. and Danthu, P. 2012. The influence of certain taxonomic and environmental parameters on biomass production and triterpenoid content in the leaves of Centella asiatica (L.) Urb. from Madagascar. Chemistry and biodiversity . 9(2): 298-308.
126
Références bibliographiques
Raharison Ramiaramanana, E. 1983. Contribution à l'étude de Centella asiatica "Talapetraka". Mémoire de fin d’étude. Agriculture , Etablissement d’enseignement supérieur des sciences agricultures. Université de Madagascar. Rakotondralambo, S. O. R. 2006. Diversités morphologique et génétique de Centella asiatica (L.) Urban à Madagascar. Mémoire de DEA. Physiologie végétale , Département de Biologie et Ecologie Végétales. Université d’Antananarivo. Rakotondralambo, S. O. R., Andrianjaka, A., Danthu, P. and Ratsimiala Ramonta, I. 2007. Diversités morphologique et génétique de Centella asiatica (L.) Urban à Madagascar. Tohiravina . 2 : 409 – 418. Rakotondralambo, S. O. R., Lussert, A., Rivallan, R., Danthu, P., Noyer, J.-L. and Baurens, F.-C. 2012. Microsatellite markers isolated from the wild medicinal plant Centella asiatica (Apiaceae) from an enriched genomic library. American Journal of Botany_Primer Notes & Protocols in the Plant Sciences . 99 (4): e176-e178. Rakotondralambo, S. O. R., Rodier-Goud, M., Rivallan, R., Lussert, A., Danthu, P., De Lamotte, F., Ralambofetra, E., Ramavovololona, P., Noyer, J.-L. and Baurens, F.-C. 2012. Insight into biology, genetics and evolution of the Centella asiatica polyploid complex in Madagascar. Industrial crops and products . 47 : 118-125 Rakotoniriana, E. F., Munaut, F., Decock, C., Randriamampionona, D., Andriambololoniaina, M., Rakotomalala, T., Rakotonirina, E. J., Rabemanantsoa, C., Cheuk, K., Ratsimamanga, S. U., Mahillon, J., El-Jaziri M., Quetin-Leclercq, J. and Corbisier, A. M. 2008. Endophytic fungi from leaves of Centella asiatica : occurrence and potential interactions within leaves. Antonie van Leeuwenhoek. 93 : 27-36. Ramamoorthi, J., Thilagam, K., Sivaselvam, S. N. and Karthickeyan, S. M. K. 2009. Genetic characterization of Barbari goats using microsatellite markers. Journal of Veterinary Science . 10 (1): 73-76. Randriamampionona, D. 2010. Conservation ex situ des ressources phytogénétiques, cas des plantes médicinales à Madagascar. Thèse de doctorat. Physiologie végétale , Département de Biologie et Ecologie Végétales. Université d'Antananarivo. Randriamampionona, D., Diallo, B., Rakotoniriana, F., Rabemanantsoa, C., Cheuk, K., Corbisier, A.-M., Mahillon, J., Ratsimamanga, S. and El Jaziri, M. 2007. Comparative analysis of active constituents in Centella asiatica samples from Madagascar: Application for ex situ conservation and clonal propagation. Fitoterapia. 78 : 482-489. Randrianarivelo, G. 2008. Transfert de gestion, traçabilité et contrôle forestier décentralisé dans le cadre du Schéma d’Aménagement Intercommunal Didy-Andaingo. Gestion communale, gestion communautaire et développement local : vers une co-gestion décentralisée des ressources forestières (Madagascar, Mali, Niger) . GESFORCOM. Ravi, V., Khurana, J. P., Tyagi, A. K. and Khurana, P. 2008. An update on chloroplast genomes. Plant Systematics and Evolution . 271 : 101-122. Razafindratsimandresy, H. 2007. Étude de l’activité psychostimulante de l’extrait de Centella asiatica (Apiaceae) chez la souris. Mémoire de DEA. Pharmacologie , Département Physiologie Animale et de Pharmacologie. Universite D’Antananarivo. Reyes, O. and Trabaud, L. 2009. Germination behaviour of 14 Mediterranean species in relation to fire factors: smoke and heat. Plant Ecology . 202 : 113-121.
127
Références bibliographiques
Ribeiro-Carvalho, C., Guedes-Pinto, H., Igrejas, G., Stephenson, P., Schwarzacher, T. and Heslop-Harrison, J. S. 2004. High levels of genetic diversity throughout the range of the portuguese wheat landrace ‘Barbela’. Annals of Botany . 94 : 699-705. Ronfort, J., Jenczewski, E., Bataillon, T. and Rousset, F. 1998. Analysis of population structure in autotetraploid species. Genetics . 150 : 921-930. Rouillard-Guellec, Robin F., Renaud J., Rakoto Ratsimamanga, A., Ratsimamanga, S. and Rasoanaivo, P. 1997. Etude comparative de Centella asiatica d'origine malgache et d'origine indienne. Acta Botanica Gallica 144 (4): 489-493. Ruget, F., Bonhomme, R. and Chartier, M. 1996. Estimation simple de la surface foliaire de plantes de maïs en croissance. Agronomie . 16 : 553-562. Rumalla, C. S., Ali, Z., Weerasooriya, A. D., Smillie, T. J. and Khan, A. I. 2010. A new triterpene glycoside from Centella erecta . Fitoterapia . 81 : 751-754. Sage, T. L. and Williams, E. G. 1995. Structure, ultrastructure, and histochemistry of the pollen tube pathway in the milkweed Asclepias exaltata L. Sex Plant Reproduction . 8: 257-265. Saitou, N. and Nei, M. 1987. Neighbor-joining Method. Molecular Biology and Evolution . 4: 406-425. Salse, J., Piegu, B., Cooke, R. and Delseny, M. 2004. New in silico insight into the synteny between rice ( Oryza sativa L) and maize ( Zea mays L.) high-lights reshuffling and identifies new duplications in the rice genome. Plant Journal. 38 : 396-409. Samigullin, T. K., Martin, W. F., Troitsky, A. V. and Antonov, A. S. 1999. Molecular data from the chloroplast rpoc1 gene suggest a deep and distinct dichotomy of contemporary spermatophytes into two Monophyla: Gymnosperms (Including Gnetales) and Angiosperms. Journal of Molecular Evolution . 49 : 310-315. Sandve, S. R., Rudi, H., Dørum, G., Berg, P. R. and Rognli, O. A. 2010. High-throughput genotyping of unknown genomic terrain in complex plant genomes: lessons from a case study. Molecular Breeding . 26 (4) : 711-718 Savidan, V. 1978. L’apomixie gamétophytique chez les Graminées et son utilisation en amelioration des plantes. Améliorations des Plantes et Biotechnologies Végétales . 28 (1): 1-9. Scrok, G. J. and Varassin, I. G. 2011. Reproductive biology and pollination of Aechmea distichantha Lem. (Bromeliaceae). Acta Botanica Brasilica . 25 (3): 571-576. Sharp, A. J., Locke, D. P., McGrath, S. D., Cheng, Z., Bailey, J. A., Vallente, R. U., Pertz, L. M., Clark, R. A., Schwartz, S., Segraves, R., Oseroff, V. V., Albertson, D. G., Pinkel, D. and Eichler, E. E. 2005. Segmental duplications and copy-number variation in the human genome. American Journal of Human Genetic . 77 : 78-88. Shen, Y., Liu, A., Ye, M., Wang, L., Chen, J., Wang, X. and Han, C. 2009. Analysis of biologically active constituents in Centella asiatica by microwave-assisted extraction combined with LC–MS. Chromatographia . 70 (3-4): 431-438. Shete, S., Tiwari, H. and Elston, R. C. 2000. On estimating the heterozygosity and polymorphism information content value. Theoretical Population Biology . 57 : 265- 271. Sushma, T., Sangeeta, G. and Gambhir, I. S. 2010. Centella asiatica : a concise drug review with probable clinical uses. Journal of Stress Physiology & Biochemistry . 7: 38-44
128
Références bibliographiques
Silva, M. B., Kanashiro, M., Ciampi, A. Y., Thompson, I. and Sebbenn, A. M. 2008. Genetic effects of selective logging and pollen gene flow in a low-density population of the dioecious tropical tree Bagassa guianensis in the Brazilian Amazon. Forest Ecology and Management. 255 : 1548-1558. Singh, S., Gautam, A., Sharma, A. and Batra, A. 2010. Centella asiatica (l.): a plant with immense medicinal potential but threatened. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 4(2): 9-17. Sinkovic, T., Batic, F., Javornik, B. and Guttenberger, H. 1996. Detection of interspecies hybrids in plants by fluorescence in situ hybridization, using total genomic DNA as a probe. Phyton . 36 (3): 155-158. Slama, A., Sale, M. B., Naceur, M. B. and Zid, E. 2005. Les céréales en Tunisie :production, effet de la sécheresse et mécanismes de résistance. Secheresse . 16 (3) : 225-229. Small, E. and Catling, P. M. 2000. Les cultures médicinales canadiennes. Communication Conseil national de recherches Canada . Sodhi, M., Mukesh, M., Prakash, B., Ahlawat, S. P. S. and Sobti, R. C. 2006. Microsatellite DNA typing for assessment of genetic variability in Tharparkar breed of Indian zebu (Bos indicus ) cattle, a major breed of Rajasthan. Journal of Genetics . 85 (3): 165-170. Soltis, D. E. and Soltis, P. S. 1993. Molecular data and the dynamic nature of polyploidy. Critical Reviews in Plant Sciences. 12 (3): 243-273. Soltis, D. E., Soltis, P. S. and Tate, J. A. 2003. Advances in the study of polyploidy since plant speciation. New Phytologist . 161 : 173-191. Soltis, D. E., Soltis, P. S., Thompson, J. N. and Pellmyr, O. 1992. Chloroplast DNA variation in Lithophragma (Saxifragaceae). Systematic Botany . 17 (4): 607-619. Soumyanath, A., Zhong, Y. P., Gold, S. A., Yu, X. L., Koop, D. R., Bourdette, D. and Gold, B. G. 2005. Centella asiatica accelerates nerve regeneration upon oral administration and contains multiple active fractions increasing neurite elongation in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology . 57 (9): 1221-1229. Souza, A. M. and Pagliarini, M. S. 1996. Spontaneous chromosome stickiness in canola. Nucleus . 9: 85-89. Souza, M. A., Pagliarini, M. S., Brandão Filho, J. U., Carraro, I. M. and Balbino, L. C. 1997. Evaluation of meiotic behavior in canola ( Brassica napus var. oleifera and Brassica campestris var. oleifera ) cultivars recently introduced in Brazil. Nucleus . 40 : 95-100. Spencer, H., Weiblen, G. and Flick, B. 1996. Phenology of Ficus variegata in a seasonal wet tropical forest at Cape Tribulation, Australia Journal of Biogeography . 23 : 467-475. Sripanidkulchai, K., Techataweewan, N., Tumsan, Y., Pannangrong, W. and Sripanidkulchai, B. 2007. Prevention of Indomethacin - Induced Gastric Ulcers in Rats by Extract from Leaves of Centella asiatica . Siriraj Medicine . 59 : 122-124. Srivastava, S. and Mishra, N. 2009. Genetic Markers - A cutting-edge technology in herbal drug research. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research . 1(1): 1-18. Stoeckel, S. 2006. Impact de la propagation asexuée et du système d’auto-incompatibilité gamétophytique sur la structuration et l’évolution de la diversité génétique d’une essence forestière entomophile et disséminée, Prunus avium L. Thèse de doctorat. Sciences Forestières . Ecole Nationale du Génie Rural, des Eaux et Forêts Paris. 251 p.
129
Références bibliographiques
Subban, R., Veerakumar, A., Manimaran, R., Hashim, K. M. and Balachandran, I. 2008. Two new flavonoids from Centella asiatica (Linn.). The Journal of Natural Medicines . 62 : 369-373. Suehs, C. M., Affre, L. and Médail, F. 2004. Invasion dynamics of two alien Carpobrotus (Aizoaceae) taxa on a Mediterranean island: II. Reproductive strategies. Heredity . 1-7. Sun, G. and Salomon, B. 2003. Microsatellite variability and heterozygote deficiency in the arctic–alpine Alaskan wheatgrass ( Elymus alaskanus ) complex. Genome . 46 : 729-737. Szadkowski, E., Eber, F., Huteau, V., ´ M. L., Coriton, O., Jenczewski, E. and Chèvre, A. M. 2011. Polyploid formation pathways have an impact on genetic rearrangements in resynthesized Brassica napus . New Phytologist . 191 : 884-894. Tagu, D. 1999. Principes des techniques de biologie moléculaire. Paris. Tandon, P., Kumaria, S. and Nongrum, L. 2009. Conservation and management of plant genetic resources of Northeast India. Indian Journal of Traditional Knowledge . 8(1): 29-34. Tani, N., Ohtani, M. and Yoshimaru, H. 2009. Development and diversity of microsatellite markers for endangered species Clinostigma savoryanum . Conservation Genetics . 10 : 1521-1523. Taquet, C. 2007. Diversité et différenciation génétiques des populations de tortues vertes (Chelonia mydas ) dans les sites de ponte et d'alimentation du sud-ouest de l'océan Indien : Application aux stratégies de conservation de l'espèce. Thèse de doctorat. Ecole Doctorale Interdisciplinaire . Université de La Réunion. 226 p. Thomas, M. T., Kurup, R., Johnson, A. J., Chandrika, S. P., Mathew, P. J., Dan, M. and Baby, S. 2010. Elite genotypes/chemotypes, with high contents of madecassoside and asiaticoside, from sixty accessions of Centella asiatica of south India and the Andaman Islands: For cultivation and utility in cosmetic and herbal drug applications. Industrial Crops and Products . 32 : 545-550. Thompson, J. N., Nuismer, S. L. and Merg, K. 2004. Plant polyploidy and the evolutionary ecology of plant/animal interactions. Biological Journal of the Linnean Society . 52 : 511-519. Tiwari, K. N., Sharma, N. C., Tiwari, V. and Singh, B. D. 2000. Micropropagation of Centella asiatica (L.), a valuable medicinal herb. Plant Cell, Tissue and Organ Culture . 63: 179-185. Traill, K. N., Bock, G., Winter, U., Hilchenbach, M., Jurgens, G. and Wick, G. 1986. Simple method for comparing large numbers of flow cytometry histograms exemplified by analysis of the CD4 (T4) antigen and LDL receptor on human peripheral blood lymphocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry . 34 (9): 1217-1221. UICN .2002. Stratégie mondiale pour la conservation des plantes. Communication Sixième réunion de la Conférence des Parties à la Convention sur la diversité biologique. La Haye, Pays-Bas . Ullah, M. O., Sultana, S., Haque, A. and Tasmin, S. 2009. Antimicrobial, cytotoxic and antioxidant activity of Centella asiatica . European Journal of Scientific Research . 30 (2): 260-264. Umehara, M., Eguchi, I., Kaneko, D., Ono, M. and Kamada, H. 2005. Evaluation of gene flow and its environmental effects in the field. Plant Biotechnology . 22 : 497-504.
130
Références bibliographiques
Vaissière, B. E., Freitas, B. M. and Gemmill-Herren, B. 2011. Protocol to detect and assess pollination deficits in crops: a handbook for its use. Food and Agriculture Organization of The United Nations . Valizadeh, M., Valdeyron, G., Kjellberg, F. and Ibrahim, M. 1987. Flux génique chez le figuier. Ficus carica : dispersion par le pollen dans un peuplement dense. Acta Oecologia . 8(22): 143-154. Van Laere, K., Hermans, D., Leus, L. and Van Huylenbroeck, J. 2011. Genetic relationships in European and Asiatic Buxus species based on AFLP markers, genome sizes and chromosome numbers. Plant Systematics & Evolution . 293 : 1-11. Vandenhout, H., Ortiz, R., Vuylesteke, D., Swennen, R. and Bai, K. V. 1995. Effect of ploidy on stomatal and other quantitative traits in plantain and banana hybrids. Euphytica . 83 : 117-122. Vargas, P., McAllister, H. A., Morton, C., Jury, S. L. and Wilkinson, M. J. 1999. Polyploid speciation in Hedera (Araliaceae): phylogenetic and biogeographic insights based on chromosome counts and ITS sequences. Plant Systematics & Evolution 219 (3-4): 165- 179. Vekemans, X., Hardy, O., Berken, B., Fofana, B. and Baudoin, J.-P. 1998. Use of PCR-RFLP on chloroplast DNA to investigate phylogenetic relationships in the genus Phaseolus . Biotechnology, Agronomy, Society and Environment . 2(2): 128-134. Vienne, D. d. 1998. Les marqueurs moléculaires en génétique et biotechnologies végétales. Institut National de la Recherche Agronomique, Paris. Collection Mieux comprendre. Vienne, D. d. and Santon, S. 2008. Les principales sources de marqueurs moléculaires. Les marqueurs moléculaires . Edition Quae Amazon France Vouillamoz, J. F. and Arnold, C. 2009. Etude historico-génétique de l’origine du ‘Chasselas’. Plant Survival. 1-10. Wankhar, B. and Tripathi, R. S. 1990a. Competitive fitness of Centella asiatica populations raised from stem cuttings and seedlings Proceedings of the Indian Academy of Science . 100 (4): 239-245. Wankhar, B. and Tripathi, R. S. 1990b. Growth and reproductive allocation pattern of Centella asiatica raised from stem cuttings of different sizes in relation to light regimes, soil texture and soil-moisture. Acta OecologicaInternational Journal of Ecology . 11 (5): 683-692. Wolfe, K. H. 2001. Yesterday's polyploids and the mystery of diploidization. Nature Reviews Genetics . 2: 333-341. Woodford, R. 2005. Dorrobbee Grass’: Relic of the past or icon of the future? Ecological Management & Restoration . 6(1): 68-79. Xingjin, H. E., Song, G. E., Jiemei, X. U. and Deyuan, H. 2000. Phylogeny of Chinese Allium (Liliaceae) using PCR-RFLP analysis. Science In China . 43 (5): 454-463. Xu, R. F., Li, K., Chen, G. H., Qiang, B. Y. Z., Mo, D. L., Fan, B., Li, C. C., Yu, M., Zhu, M. J., Xiong, T. A. and Liu, B. 2005. Investigation of PCR-RFLPs within major histocompatibility complex B-G genes using two restriction enzymes in eight breeds of chinese indigenous chickens. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences . 18 (7): 942-948.
131
Références bibliographiques
Yousofi, M. and Aryavand, A. 2004. Determination of ploidy levels of some populations of Agropyron cristatum (Poaceae) in iran by flow cytometry. Iranian Journal of Science & Technology . 28 (A1): 137-144. Yu, J., Wang, J. and Lin, W. 2005. The genomes of Oryza sativa : a history of duplications. Public Library of Science Biology . 3: 261-281. Yu, Q. L., Duan, H. Q., Gao, W. Y. and Takaishi, Y. 2007. A new triterpene and a saponin from Centella asiatica . Chinese Chemical Letters . 18 : 62-64. Yukawa, M., Tsudzuki, T. and Sugiura, M. 2006. The chloroplast genome of Nicotiana sylvestris and Nicotiana tomentosiformis : complete sequencing confirms that the Nicotiana sylvestris progenitor is the maternal genome donor of Nicotiana tabacum . Mol Gen Genomics . 275 : 367-373. Zaidan, M. R. S., Noor Rain, A., Badrul, A. R., Adlin, A., Norazah, A. and Zakiah, I. 2005. In vitro screening of five local medicinal plants for antibacterial activity using disc diffusion method. Tropical Biomedicine . 22 (2): 165-170. Zainol, M. K., Abd-Hamida, A., Yusof, S. and Muse, R. 2003. Antioxidative activity and total phenolic compounds of leaf, root and petiole of four accessions of Centella asiatica (L.) Urban. Food Chemistry . 81 : 575-581. Zainol, N. A., Voo, S. C., Sarmidi, M. R. and Aziz, R. A. 2008. Profiling of Centella asiatica (l.) Urban extract. The Malaysian Journal of Analytical Sciences . 12 (2): 322-327. Zardini, E. M., Gu, H. and Raven, P. H. 1991. On the separation of two species within the Ludwigia uruguayensis complex (Onagraceae). Systematic botany . 16 (2): 242-244. Zaunol, M. K., Abd-Hamid, A., Yusof, S. and Muse, R. 2003. Antioxidative activity and total phenolic compounds of leaf, root and petiole of four accessions of Centella asiatica L. Urban. Food Chemistry . 81 : 575-581. Zhang, F.-L., Ying-Jie Wei, Zhu1, J. and Gong, Z.-N. 2008. Simultaneous quantitation of three major triterpenoid glycosides in Centella asiatica extracts by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Biomedical Chromatography . 22 : 119-124. Zhang, L., Lu, H. H. S., Chung, W.-Y., Yang, J. and Li, W.-H. 2005. Patterns of segmental duplication in the human genome. Molecular Biology and Evolution . 22 (1): 135-141. Zhang, X., Friedl, M. A., Schaaf, C. B. and Strahler, A. H. 2004. Climate controls on vegetation phenological patterns in northern mid- and high latitudes inferred from MODIS data. Global Change Biology . 10 : 1133-1145. Zheng, C. and Qin, L. 2007. Chemical components of Centella asiatica and their bioactivities. Journal of Chinese Integrative Medicine . 5(3): 348-351. Zhou, J., Peng, H., Downie, S. R., Liu, Z.-W. and Gong, X. 2008. A molecular phylogeny of Chinese Apiaceae subfamily Apioideae inferred from nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences. Taxon . 57 (2): 402-406.
132
ANNEXES
Annexes
ANNEXE 1
Liste des sites d’échantillonnage de Centella asiatica à Madagascar, associés à leurs codes respectifs, à leurs régions et à leurs provinces d’appartenance, à leurs coordonnées géographiques, à leurs numéros de correspondance sur la carte de répartition et aux numéros de leurs extraits d’ADN
i
Annexes
N° extraits N° sites Sites Codes Régions Provinces Altitudes (m) Longitudes Latitudes d'ADN 1 Montagne d'Ambre MOTA Diana Diego 340 49° 11' -12° 30' 1 à 5 2 Vohémar VOHM Sava Diego 10 49° 58' -13° 24' 6 à 10 3 Ambanja ABJA Diana Diego 5 48° 25' -13° 43' 11 à 15 4 Sambava SAMB Sava Diego 113 50° 11' -14° 17' 16 à 20 5 Andapa ANDP Sava Diego 143 49° 39' -14° 38' 21 à 25 6 Antsohihy ANTS Sofia Mahajanga 21 48° 2' -14° 54' 31 à 35 7 Antalaha ANTA Sava Diego 1 50° 16' -14° 54' 26 à 30 8 Marotandrano MRTD Sofia Mahajanga 384 48° 49' -15° 10' 56 à 60 9 Befandriana Nord BFND Sofia Mahajanga 839 48° 32' -15° 14' 36 à 40 10 Mahajanga MAJG Boeny Mahajanga 2 46° 19' -15° 40' 41 à 45 11 Mandritsara MDTR Sofia Mahajanga 420 48° 43' -15° 49' 46 à 50 12 Soalala SOAL Boeny Mahajanga 837 45° 52' -16° 7' 51 à 55 13 Tsaramandroso TMDR Boeny Mahajanga 454 48° 25' -17° 49' 66 à 70 14 Cap Saint André CAPA Melaky Mahajanga 5 44° 28' -16° 22' 61 à 65 15 Besalampy II (Nord) BESA II Melaky Mahajanga 36 44° 16' -16° 36' 76 à 80 16 Besalampy I (ville) BESA I Melaky Mahajanga 39 44° 29' -16° 44' 71 à 75 17 Ampatakamaroreny APTK Sofia Mahajanga 710 48° 50' -16° 50' 81 à 85 18 Sainte Marie MARI Atsinanana Toamasina 2 49° 54' -16° 54' 136 à 140 19 Soanierana Ivongo SOAN Atsinanana Toamasina 11 49° 35' -16° 56' 131 à 135 20 Andilamena ANDL Aloatra - Mangoro Toamasina 965 48° 33' -17° 0' 141 à 145 21 Mahabe MABE Betsiboka Mahajanga 291 45° 9' -17° 5' 86 à 90 22 Ambatomainty AMTY Betsiboka Mahajanga 194 45° 59' -17° 25' 96 à 100 23 Kandreho KDRE Betsiboka Mahajanga 199 46° 5' -17° 29' 91 à 95 24 Tambohorano TAMB Melaky Mahajanga 14 44° 1' -17° 33' 101 à 105 25 Mahatsinjo MAHA Boeny Mahajanga 42 47° 0' -17° 44' 106 à 110 26 Ambatondrazaka AMBZ Aloatra - Mangoro Toamasina 959 48° 26' -17° 49' 146 à 150
ii
Annexes
N° extraits N° sites Sites Codes Régions Provinces Altitudes (m) Longitudes Latitudes d'ADN 27 Ambohitromby I AMBR I Analamanga Antananarivo 803 46° 16' -17° 59' 226 à 230 28 Ambohitromby II AMBR II Analamanga Antananarivo 800 46° 15' -17° 59' 231 à 235 29 Ambohitromby III AMBR III Analamanga Antananarivo 806 46° 15' -17° 59' 236 à 240 30 Maintirano MRTO Melaky Mahajanga 26 44° 1' -17° 59' 111 à 115 31 Andaingo ANDO Aloatra - Mangoro Toamasina 967 48° 15' -18° 12' 151 à 155 32 Toamasina TOAM Atsinanana Toamasina 22 49° 18' -18° 13' 156 à 160 33 Antsalova ANTV Melaky Mahajanga 117 44° 37' -18° 40' 121 à 125 34 Besara Sahoany SAHO Melaky Mahajanga 55 44° 17' -18° 41' 116 à 120 35 Mahitsy MAHI Analamanga Antananarivo 1342 47° 20' -18° 43' 241 à 245 36 Tsiandro TSIA Melaky Mahajanga 747 44° 53' -18° 43' 126 à 130 37 Tsiroanomandidy TSIR Bongolava Antananarivo 940 46° 3' -18° 45' 246 à 250 38 Ambanitsena AMBN Analamanga Antananarivo 1412 47° 41' -18° 52' 256 à 260 39 Anjiro ANJI Aloatra - Mangoro Toamasina 850 48° 1' -18° 53' 186 à 190 40 Mandraka parc MANDp Aloatra - Mangoro Toamasina 1092 47° 53' -18° 54' 196 à 200 41 Mandraka S MANDs Aloatra - Mangoro Toamasina 1116 47° 55' -18° 55' 201 à 205 42 Hazomay HAZM Bongolava Antananarivo 899 46° 24' -18° 55' 271 à 275 43 Arivonimamo ARVO Analamanga Antananarivo 1392 46° 9' -18° 55' 286 à 290 44 Manjakandriana MANJ Analamanga Antananarivo 1411 47° 49' -18° 55' 261 à 265 45 Marozevo MARO Aloatra - Mangoro Toamasina 935 47° 56' -18° 55' 191 à 195 46 Moramanga MORA Aloatra - Mangoro Toamasina 980 48° 13' -18° 55' 206 à 210 47 Tsaramarina TSARA Atsinanana Toamasina 20 48° 58' -18° 56' 171 à 175 48 Vohimana VOHI Aloatra - Mangoro Toamasina 963 48° 50' -18° 57' 166 à 170 49 Ranomafana Est RANE Atsinanana Toamasina 73 48° 50' -18° 57' 176 à 180 50 Andovoranto ANDV Atsinanana Toamasina 16 49° 6' -18° 57' 161 à 165 51 Analavory I ANAL I Bongolava Antananarivo 1199 46° 43' -18° 58' 276 à 280 52 Analavory II ANAL II Bongolava Antananarivo 1343 46° 43' -18° 58' 281 à 285 53 Beforona BEFR Aloatra - Mangoro Toamasina 674 48° 34' -18° 58' 181 à 185 54 Belobaka BLBK Bongolava Antananarivo 820 45° 41' -18° 59' 266 à 270 55 Antananarivo TANA Analamanga Antananarivo 1275 47° 11' -19° 1' 251 à 255 56 Ambatolampy AMBY Itasy Antananarivo 1446 47° 25' -19° 24' 296 à 300
iii
Annexes
N° extraits N° sites Sites Codes Régions Provinces Altitudes (m) Longitudes Latitudes d'ADN 57 Anosibe an'ala ANOS Aloatra - Mangoro Toamasina 691 48° 12' -19° 25' 211 à 215 58 Miandrivazo MDVZ Menabe Toliara 100 45° 27' -19° 31' 416 à 420 59 Mandoto MDTO Vakinakaratra Antananarivo 1475 46° 18' -19° 34' 291 à 295 60 Antsirabe ATBE Vakinakaratra Antananarivo 1500 47° 1' -19° 51' 301 à 305 61 Mahanoro MNOR Atsinanana Toamasina 640 48° 47' -19° 52' 216 à 220 62 Beroboka BERB Menabe Toliara 47 44° 36' -19° 58' 421 à 425 63 Marolambo MARL Atsinanana Toamasina 494 48° 9' -20° 3' 221 à 225 64 Andranomena ANDR Menabe Toliara 5 44° 25' -20° 10' 426 à 430 65 Morondava MORO Menabe Toliara 9 44° 18' -20° 19' 431 à 435 66 Ambositra AMBS Amoron'i Mania Fianarantsoa 1364 47° 15' -20° 31' 306 à 310 67 Nosivarika NOSV Vatovavy Fito Vinany Fianarantsoa 11 48° 31' -20° 35' 316 à 320 68 Maroharatra MARH Haute Mahatsiatra Fianarantsoa 535 47° 43' -20° 43' 321 à 325 69 Ikelilalina Ranomafana IKEL Vatovavy Fito Vinany Fianarantsoa 612 47° 31' -21° 16' 336 à 340 70 Irondro IRON Vatovavy Fito Vinany Fianarantsoa 84 47° 58' -21° 24' 326 à 330 71 Fianarantsoa FIAN Haute Mahatsiatra Fianarantsoa 1010 47° 9' -21° 25' 331 à 335 72 Manapatrana MANP Vatovavy Fito Vinany Fianarantsoa 620 47° 34' -21° 38' 341 à 345 73 Ambalavao AMBL Haute Mahatsiatra Fianarantsoa 1273 46° 57' -21° 50' 346 à 350 74 Manakara MANK Atsimo Atsinana Fianarantsoa 28 48° 0' -22° 7' 351 à 355 75 Ankilibory Ankazoabo ANKI Menabe Toliara 1135 44° 48' -22° 26' 436 à 440 76 Ranotsara Nord RNTS Horombe Fianarantsoa 641 46° 36' -22° 46' 366 à 370 77 Farafangana FARF Atsimo Atsinana Fianarantsoa 18 47° 49' -22° 48' 376 à 380 78 Vondrozo VOND Atsimo Atsinana Fianarantsoa 204 47° 19' -22° 48' 371 à 375 79 Iakora IAKO Horombe Fianarantsoa 567 46° 39' -23° 6' 381 à 385 80 Lavaraty LAVA Atsimo Atsinana Fianarantsoa 562 46° 59' -23° 15' 386 à 390 81 Ranohira RAHN Horombe Fianarantsoa 846 46° 5' -23° 16' 361 à 365 82 Betroka BETK Horombe Toliara 596 46° 5' -23° 16' 441à 445 83 Vangaindrano I VANG I Atsimo Atsinana Fianarantsoa 20 47° 35' -23° 21' 391 à 395 84 Vangaindrano II VANG II Atsimo Atsinana Fianarantsoa 12 47° 37' -23° 22' 396 à 400 85 Vangaindrano III VANG III Atsimo Atsinana Fianarantsoa 4 47° 48' -22° 48' 401 à 405 86 Midongy du Sud MIDO Atsimo Atsinana Fianarantsoa 741 47° 1' -23° 35' 406 à 410
iv
Annexes
N° extraits N° sites Sites Codes Régions Provinces Altitudes (m) Longitudes Latitudes d'ADN 87 Befotaka BEFO Atsimo Atsinana Fianarantsoa 748 46° 59' -23° 49' 411 à 415 88 Isoanala ISOA Horombe Toliara 688 45° 43' -23° 49' 446 à 450 89 Vohipeno VOHP Atsimo Atsinana Fianarantsoa 76 45° 10' -24° 7' 356 à 360 90 Ford Dauphin FORD Anosy Toliara 291 46° 52' -25° 3' 451 à 455
v
Annexes
ANNEXE 2
Liste des sites d’échantillonnage de Centella asiatica en Afrique, aux Comores, à La Réunion et en Asie, associés à leurs codes respectifs, à leurs numéros de correspondance sur la carte de répartition et aux numéros de leurs extraits d’ADN
N° sites Sites Codes Continents N° extraits d'ADN A Ethiopie ETHP Afrique 469 B Congo CONG Afrique 470 C Tanzanie TANZ Afrique 471 D Zimbabwe ZIMB Afrique 472 à 476 E Afrique du Sud SAFR Afrique 477 F Mayotte MAYO Iles 464 à 468 G La Réunion REUN Iles 459 à 463 H Chine CHIN Asie 456 I Inde INDE Asie 457 J Vietiane VIET Asie 479 K Binh Chanh BINH Asie 478 L Cambodge CABG Asie 480 M Malaisie MALS Asie 458
vi
Annexes
ANNEXE 3
Principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction) (Tagu, 1999)
vii
Annexes
ANNEXE 4
Principe de la RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Tagu, 1999)
Haplotype Haplotype de de l’individu A l’individu B
viii
Annexes
ANNEXE 5
Construction d’une banque génomique (Tagu, 1999)
ix
Annexes
ANNEXE 6
Principe du clonage moléculaire (Tagu, 1999)
x
Annexes
ANNEXE 7
Mécanisme fonctionnel d’un génotypage
xi
Annexes
ANNEXE 8
Exemple de chromatogrammes révélé par GeneMapper suite à un génotypage. Chaque couleur représente le chromatogramme d’un individu pour un marqueur microsatellite
al 180 al 2 25 al 234 al 2 89
Fluorochromes Vic (vert) Fluorochromes Pet (rouge)
Fluorochromes Fam (bleu) Fluorochromes Ned (noire)
xii
Annexes
ANNEXE 9
Profils de restriction ou haplotypes du génome chloroplastique des individus de Centella asiatica diploïdes et tétraploïde soumis à la combinaison amorce -enzyme de restriction FV/TaqI
Mutation A : Mutation de longueur
Mutation B : Mutation de sites
M : Marqueur de tailles Small Fragment
xiii
PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES
Publications scientifiques
ARTICLE 1
Soaharin’ny Ony Raoseta Rakotondralambo , Alexandra Lussert , Ronan Rivallan, Pascal Danthu , Jean-Louis Noyer , Franc-Christophe Baurens. 2012. Microsatellite markers isolated from wild medicinal plant Centella asiatica (Apiaceae) from an enriched genomic library. American Journal of Botany_Primer Notes & Protocols in the Plant Sciences . 99 (4): e176- e178 (Facteur d’impact : 3.052)
xv
Publications scientifiques
xvi
Publications scientifiques
xvii
Publications scientifiques
xviii
Publications scientifiques
ARTICLE 2
Soaharin’ny Ony Raoseta Rakotondralambo , Marguerite Rodier-Goud, Ronan Rivallan, Alexandra Lussert, Pascal Danthu, Frédéric de Lamotte, Eliane Ralambofetra, Perle Ramavovololona, Jean-Louis Noyer and Franc-Christophe Baurens. 2012. Insight into biology, genetics and evolution of the Centella asiatica polyploid complex in Madagascar . Industrial crops and products . 47 : 118-125 (Facteur d’impact : 2.507)
xix
Publications scientifiques
xx
Publications scientifiques
xxi
Publications scientifiques
xxii
Publications scientifiques
xxiii
Publications scientifiques
xxiv
Publications scientifiques
xxv
Publications scientifiques
xxvi
Publications scientifiques
xxvii
Abstract
Centella asiatica (F. APIACEAE) is an important medicinal herb used in both traditional pharmacopoeia and modern medicine. It is commercially used as wound-healing and tissue-reconstituting agent. Madagascar plays a major role in C. asiatica trade. It is the first producer worldwide, and because of higher principal compounds content in the leaves, Malagasy origin is appreciated by industry. In Madagascar, C. asiatica can be found almost throughout the island but the collection destined for exportation is principally focused in the region of Alaotra-Mangoro. So, we voiced hypothesis that genetic diversity of C. asiatica exist in Madagascar and Alaotra-Mangoro accessions could be particular. Consequently, we report in this work the biological and diversity studies of malagasy C. asiatica . The biological study was based on floral morphology, reproduction mode, chromosome number and ploidy level of the species. The diversity study concerned foliar morphology, chloroplast DNA and nuclear DNA. The variation of foliar morphology was highlighted by size measurement. Genetic diversity was evaluated with Restriction Fragment Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction for chloroplast DNA and through Simple Sequence Repeat analysis for nuclear DNA. As results, some populations of C. asiatica are diploids and the other tetraploids. Diploid populations display 2n=2x=18 chromosomes, have round leaves and present vegetative propagation by stolons or/and self-reproduction. Tetraploid populations display 2n=4x=36 chromosomes, have kidneyshaped leaves and opt for allogamy. Diploid populations grow frequently in the western part of Madagascar and tetraploid populations are generally located in the eastern part. Tetraploid populations are divided into two separated group, accessions of Alaotra-Mangoro and Analamanga form the first group and the others populations constitute the second group. The Alaotra-Mangoro accessions are tetraploids with specific genotypes. We supposed that their genetic peculiarity could be correlated with higher principal compounds content and that is why the collect is principally based in this region. This thesis gives details on C. asiatica biology and estimates its diversity in Madagascar. Propositions concerning species conservation and management are deduced from this study. Through this work, development and characterization of twenty microsatellite markers for C. asiatica was realized from the first microsatellite-enriched library of this species. These microsatellite markers were already submitted to The European Molecular Biology Laboratory database.
Keywords : Centella asiatica , Madagascar, Alaotra-Mangoro, ploidy, chloroplast DNA, microsatellites.
Résumé
Centella asiatica (F. APIACEAE) est classée parmi les plantes à valeurs médicinales. Elle est dotée de vertus cicatrisantes et regénérantes de tissus reconnues par la pharmacopée traditionnelle à travers nombreux pays et par la médecine moderne dans le monde. C. asiatica fait l’objet d’un commerce international et les accessions de Madagascar sont les plus sollicitées sur ce marché à cause de leur richesse en principes actifs. Cette espèce est présente dans presque toutes les régions de Madagascar, cependant la concentration des collectes dans la région d’Alaotra-Mangoro laisse supposer l’existence d’une variété spécifique. A cet effet, des recherches sur la biologie et sur la diversité de l’espèce ont été menées. Une étude de la morphologie florale, du mode de reproduction, du nombre de chromosomes et du niveau de ploïdie de l’espèce ont été réalisées. Une étude de la diversité portant sur les variations de la morphologie et sur le polymorphisme génétique de l’espèce a été effectuée. Il s’agit de l’analyse des dimensions des feuilles et les analyses de l’ADN chloroplastique et de l’ADN nucléaire, par les techniques Restriction Fragment Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction et Simple Sequence Repeat . Ces recherches ont conduit à l’identification de deux types de populations de C. asiatica : des populations diploïdes et des populations tétraploïdes. Les populations diploïdes, avec 2n=2x=18 chromosomes, ont des feuilles orbiculaires et favorisent la multiplication végétative et/ou l’autofécondation. Les populations tétraploïdes, avec 2n=4x=36 chromosomes, possèdent des feuilles réniformes et optent préférentiellement pour l’allogamie. La répartition géographique de ces deux populations est bien définie, les diploïdes sont fréquemment rencontrées à l’Ouest de Madagascar tandis que les tétraploïdes se répandent généralement dans toute la région orientale. Les populations tétraploïdes sont réparties en deux groupes, un premier groupe constitué par les populations d’Alaotra- Mangoro et d’Analamanga et un deuxième groupe qui rassemble le reste des populations. Les accessions d’Alaotra-Mangoro ont des génotypes assez particuliers qui semblent corrélés avec une teneur élevée en principes actifs. Cette spécificité génétique expliquerait pourquoi la collecte est principalement axée dans cette zone. Les données sur la biologie de C. asiatica , obtenues dans la présente thèse, permet d’apprécier sa diversité à Madagascar. De ces résultats découlent des propositions de modes de conservation et de gestion de l’espèce. Grâce à ce travail, la première banque enrichie en locus microsatellites de C. asiatica a pu être établie. Vingt marqueurs microsatellites spécifiques à l’espèce ont pu être synthétisés et sont actuellement disponibles dans la base de données internationale de « The European Molecular Biology Laboratory ».
Mots clés : Centella asiatica , Madagascar, Alaotra-Mangoro, ploïdie, ADN chloroplastique, microsatellites.