A. Resumen B. Introducción
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INFORME DE FINAL ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA DE Prosopis chilensis Y Porlieria chilensis EN LA COMUNA DE COLINA, REGIÓN METROPOLITANA INSTITUTO DE ECOLOGÍA Y BIODIVERSIDAD Y UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN A. Resumen Este estudio se enmarca dentro de las Medidas de Compensación asociadas con el componente Flora y Vegetación por la ejecución del Proyecto Parque Solar Quilapilún. Aborda una parte de las Medidas Forestales comprometidas por Chungungo S.A. tanto en la Resolución de Calificación Ambiental (RCA) 276/2015 como en la Resolución Fundada (RF) N° 295/2015 de la Corporación Nacional Forestal y en específico el punto 3.1.3. El objetivo de esta medida de compensación es caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto. Se espera identificar la estructuración genética a escala fina dentro del área de estudio e identificar individuos con genotipos únicos. La idea es que estos genotipos únicos identificados sean prioritarios para la conservación de las especies y que se puedan implementar programas de propagación vegetativa o producción de plántulas obtenidas de sus semillas. El conocimiento genético puede prevenir la pérdida de alelos escasos o únicos que pudiesen cumplir un rol fundamental para la mantención del potencial evolutivo de los genotipos utilizados en las medidas de compensación. B. Introducción El objetivo de esta medida de compensación es caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto. Se espera identificar la estructuración genética a escala fina dentro del área de estudio e identificar individuos con genotipos únicos. La idea es que estos sean prioritarios para su conservación, ya sea mediante propagación vegetativa o plántulas obtenidas de sus semillas. El conocimiento genético puede prevenir la pérdida de alelos escasos o únicos que pudiesen cumplir un rol fundamental para la mantención del potencial evolutivo de los genotipos utilizados en las medidas de compensación. La estructura genética a escala fina se refiere a cómo se organiza la variación genética en el espacio, la cual está determinada por las características ambientales y del paisaje, por la distribución de las individuos en relación con dicho paisaje y por los procesos microevolutivos asociados, tales como selección, recombinación, mutación y flujo génico. El primer paso para poder establecer la estructura genética es determinar la variación genética de los individuos de cada población. Para ello se utilizarán los estimadores de diversidad genética tradicionales de la genética de poblaciones. Para los propósitos de la genética del paisaje, la información sobre variación genética permitirá hacer una prospección de cómo se distribuye 1 dicha diversidad en el espacio, para lo cual se utilizarán análisis específicos, en particular las pruebas de asignación, que permiten determinar a qué población pertenece un individuo o conjunto de individuos y se dividen en 2 tipos de métodos: de clasificación y de asignación. Los métodos de clasificación se caracterizan por asignar los individuos a categorías predefinidas y dentro de estos métodos incluiremos análisis de componentes principales y análisis de discriminantes. Con los métodos de asignación es posible determinar qué tan indicativo es el genotipo de un individuo de la población en la cual fue muestreado, es decir, permiten estimar la probabilidad de que un individuo pertenezca a un grupo o población, con base en su genotipo multilocus y dada la frecuencia alélica de los loci de todos los individuos en diferentes poblaciones. Objetos de estudio Prosopis chilensis El género Prosopis es considerado como un grupo filogenéticamente antiguo dentro de la subfamilia Mimosoideae (Burkart, 1976), que se pone en evidencia con los muchos grupos diferenciados de especies que se han desarrollado y con la frecuente hibridación entre estos grupos, dando origen a varios linajes y una gran diversidad de formas con elevado grado de especialización (Folliott y Thames, 1983). En Chile, el género Prosopis está principalmente representado por 6 especies (aunque se propone la presencia de otras 4 más en documentos no publicados en revistas científicas) que corresponden a: Prosopis alba Griseb., Prosopis burkartii Muñoz, Prosopis chilensis (Mol) Stuntz var. chilensis, Prosopis flexuosa DC., Prosopis strombulifera (Lam.) Benth., Prosopis tamarugo Phil., con una distribución latitudinal que va desde la primera región de Tarapacá hasta la VI Región de O’Higgins, abarcando aproximadamente 17º de latitud, con la distribución más septentrional representada por P. tamarugo y P. burkartii y la más meridional por P. chilensis. Esta última es la que tiene una distribución más amplia que va desde la III región a la región Metropolitana (Altamirano 2006). De las seis especies P. tamarugo, P. burkartii y P. chilensis var. chilensis son endémicas de Chile (Serra et al. 1988). P. chilensis es dentro del género , una de las especies que presenta mayor variabilidad en sus diferentes caracteres. Cabe destacar en que la zona de estudio no se encuentran ninguna de las otras cinco especies de Prosopis que se distribuyen en Chile. Porlieria chilensis El género Porlieria está representado por tres especies en Sudamérica, P. hygrometra R. et Pav., P.microphylla (Baill.) Descole, O’Don. y Lourt. y P.chilensis Johnst. qué es la única representante de este género en Chile. (Porter 1974). Tiene una distribución que va desde la Provincia del Elqui (IV Región) hasta la Provincia del Colchagua (VI Región). También se encuentra en la Región Metropolitana creciendo en forma achaparrada en los cerros de Renca, Colina, cerro San Cristóbal, quebrada de Peñalolén, Cajón del Maipo, entre otros (Navas 1976; Serra et al. 1986). C. Objetivos Objetivo general: Caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto en la comuna de Colina, Región Metropolitana. Objetivos específicos: 1) Identificar marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) para la especie Prosopis chilensis. 2) Operacionalizar nuSSR para Prosopis chilensis y Porlieria chilensis bajo las condiciones analíticas del LEV. 3) Analizar la diversidad genética de ambas especies en la zona de estudio a nivel poblacional e individual. 2 La programación de las actividades requeridas para dar cumplimiento a los objetivos específicos planteados es la siguiente: 17 17 16 17 17 17 17 16 Actividades Dic Jun Abr Feb Ene Nov Mar May 1) Identificar marcadores nuSSR para la especie Prosopis chilensis 1.1. Optimización del método de extracción de ADN para X X ambas especies. 1.2. Obtención de ADN de individuos representivos de la X especie en la zona de estudio 1.3. Desarrollo de nuSSR para Porlieria chilensis X X X 1.4. Selección de nuSSR polimórficos para Porlieria chilensis en X X la zona de estudio Hito 1: muestreo de individuos representativos de Porlieria chilensis X Hito 2: optimización de la extracción de ADN para Prosopis X chilensis y Porlieria chilensis Hito 3: primera fase del desarrollo de los nuSSRs para Porlieria X chilensis completada 2) Operacionalizar nuSSR para Prosopis chilensis y Porlieria chilensis bajo las condiciones analíticas del LEV 2.1. Optimización de condiciones de PCR para los nuSSR en el X X X X LEV para ambas especies 2.2. Optimización de reacciones multiplex de PCR y X X X X electroforesis capilar HIto 4: nuSSRs de Prosopis chilensis optimizados bajo X condiciones analíticas del LEV 3) Analizar la diversidad genética de ambas especies en la zona de estudio a nivel poblacional e individual 3.1. Muestreo de ambas especies en la zona de estudio y áreas X X X aledañas más extracción de ADN 3.2. Genotipificación ambas especies con marcadores nuSSR X X X X 3.3. Aplicación de métodos analíticos de clasificación y X X X asignación para caracterizar la diversidad genética 3.4. Identificación de individuos prioritarios para la X X conservación Hito 5: entrega del informe final X 3 D. Materiales y Métodos. Las frecuencias alélicas fueron estimadas mediante seis marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) por especie. Fueron seleccionados nuSSR altamente polimórficos. En el caso de Prosopis chilensis se utilizaron nuSSR ya desarrollados por Mottura et al (2005) y Bessaga et al (2013), de los cuales fueron inicialmente seleccionados los siguientes: Locus Secuencia partidores Marcaje Ta Motivo Rango Na Ho He PIC HWE test (NS p < 0.05) GL8 F CAGGTGGGCATGAAGTTTCC FAM 58 (AT)12 150–180 6 0.87 0.8 0.78 GL8 R CCAAGAACAACCTGCCGAAG Mo13 F TTGATTAGAGTTGCATGTGGATG FAM 58 (GT)10C 218‐246 6 0.9 0.68 0.66 0,046 T(GT)2 Mo13 R TGCAGTCCCAAGTGTCAGAG GL12 F GAGTGAAGGTCGGGAAGAGG FAM 58 (CT)5(AT 340–390 5 1 0.74 0.7 CT)3(CT) 5 GL12 R CCATTGGACCAAGGCAGAAC Mo16 F CATTGCCCCAATATCACTCC VIC 60 (CA)12 149‐163 5 0.82 0.73 0.7 NS Mo16 R GGGTCCATCCAGAGTAGTGG Mo08 F TATCCTAAACGCCGGGCTAC VIC 59 (AC)9 208‐222 6 0.5 0.5 0.48 NS Mo08 R TCCCATTCATGCATACTTAAACC GL24 F CCTTAATCTCCCTCTCGGCC VIC 58 (AC)11 260‐330 5 0.75 0.69 0.64 GL24 R AACCAGGCTCTGCAGAAATG Con respecto a los marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) para la especie Porlieria chilensis y dado que no existen desarrollados, específicamente para esta especie, se aplicó la metodología usada en Quillaja saponaria por Letelier et al (2015) para su busqueda. Se seleccionaron 5 individuos distribuidos homogeneamente en el área de estudio. El muestreo consistió en la colecta de material vegetal (hojas) de individuos de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis, tanto dentro del área del proyecto como en áreas colindantes que se encuentren fuera de esta área. Idealmente se propuso tomar 150 muestras de cada especie dentro del área de estudio y otras 30 fuera de dicha áreas en caso de ser posible; de lo contrario se colectarán muestras del número de individuos presentes en el área de estudio y un número proporcional fuera (aproximadamente 5:1). El material fue colectado, georeferenciado, almacenado en bolsas plásticas herméticas y mantenido a 4‐10°C hasta ser trasladado al Laboratorio de Epigenética Vegetal, Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Concepción.