A. Resumen B. Introducción

INFORME DE FINAL

ESTUDIO DE DIVERSIDAD GENÉTICA DE Prosopis chilensis Y

Porlieria chilensis EN LA COMUNA DE COLINA, REGIÓN METROPOLITANA

INSTITUTO DE ECOLOGÍA Y BIODIVERSIDAD

UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN

A. Resumen

Este estudio se enmarca dentro de las Medidas de Compensación asociadas con el componente Flora y Vegetación por la ejecución del Proyecto Parque Solar Quilapilún. Aborda una parte de las Medidas Forestales comprometidas por Chungungo S.A. tanto en la Resolución de Calificación Ambiental (RCA) 276/2015 como en la Resolución Fundada (RF) N° 295/2015 de la Corporación Nacional Forestal y en específico el punto 3.1.3. El objetivo de esta medida de compensación es caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto. Se espera identificar la estructuración genética a escala fina dentro del área de estudio e identificar individuos con genotipos únicos. La idea es que estos genotipos únicos identificados sean prioritarios para la conservación de las especies y que se puedan implementar programas de propagación vegetativa o producción de plántulas obtenidas de sus semillas. El conocimiento genético puede prevenir la pérdida de alelos escasos o únicos que pudiesen cumplir un rol fundamental para la mantención del potencial evolutivo de los genotipos utilizados en las medidas de compensación.

B. Introducción

El objetivo de esta medida de compensación es caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto. Se espera identificar la estructuración genética a escala fina dentro del área de estudio e identificar individuos con genotipos únicos. La idea es que estos sean prioritarios para su conservación, ya sea mediante propagación vegetativa o plántulas obtenidas de sus semillas. El conocimiento genético puede prevenir la pérdida de alelos escasos o únicos que pudiesen cumplir un rol fundamental para la mantención del potencial evolutivo de los genotipos utilizados en las medidas de compensación.

La estructura genética a escala fina se refiere a cómo se organiza la variación genética en el espacio, la cual está determinada por las características ambientales y del paisaje, por la distribución de las individuos en relación con dicho paisaje y por los procesos microevolutivos asociados, tales como selección, recombinación, mutación y flujo génico. El primer paso para poder establecer la estructura genética es determinar la variación genética de los individuos de cada población. Para ello se utilizarán los estimadores de diversidad genética tradicionales de la genética de poblaciones. Para los propósitos de la genética del paisaje, la información sobre variación genética permitirá hacer una prospección de cómo se distribuye 1 dicha diversidad en el espacio, para lo cual se utilizarán análisis específicos, en particular las pruebas de asignación, que permiten determinar a qué población pertenece un individuo o conjunto de individuos y se dividen en 2 tipos de métodos: de clasificación y de asignación.

Los métodos de clasificación se caracterizan por asignar los individuos a categorías predefinidas y dentro de estos métodos incluiremos análisis de componentes principales y análisis de discriminantes. Con los métodos de asignación es posible determinar qué tan indicativo es el genotipo de un individuo de la población en la cual fue muestreado, es decir, permiten estimar la probabilidad de que un individuo pertenezca a un grupo o población, con base en su genotipo multilocus y dada la frecuencia alélica de los loci de todos los individuos en diferentes poblaciones.

Objetos de estudio

Prosopis chilensis

El género Prosopis es considerado como un grupo filogenéticamente antiguo dentro de la subfamilia Mimosoideae (Burkart, 1976), que se pone en evidencia con los muchos grupos diferenciados de especies que se han desarrollado y con la frecuente hibridación entre estos grupos, dando origen a varios linajes y una gran diversidad de formas con elevado grado de especialización (Folliott y Thames, 1983).

En Chile, el género Prosopis está principalmente representado por 6 especies (aunque se propone la presencia de otras 4 más en documentos no publicados en revistas científicas) que corresponden a: Prosopis alba Griseb., Prosopis burkartii Muñoz, Prosopis chilensis (Mol) Stuntz var. chilensis, Prosopis flexuosa DC., Prosopis strombulifera (Lam.) Benth., Prosopis tamarugo Phil., con una distribución latitudinal que va desde la primera región de Tarapacá hasta la VI Región de O’Higgins, abarcando aproximadamente 17º de latitud, con la distribución más septentrional representada por P. tamarugo y P. burkartii y la más meridional por P. chilensis. Esta última es la que tiene una distribución más amplia que va desde la III región a la región Metropolitana (Altamirano 2006). De las seis especies P. tamarugo, P. burkartii y P. chilensis var. chilensis son endémicas de Chile (Serra et al. 1988). P. chilensis es dentro del género , una de las especies que presenta mayor variabilidad en sus diferentes caracteres. Cabe destacar en que la zona de estudio no se encuentran ninguna de las otras cinco especies de Prosopis que se distribuyen en Chile.

Porlieria chilensis

El género Porlieria está representado por tres especies en Sudamérica, P. hygrometra R. et Pav., P.microphylla (Baill.) Descole, O’Don. y Lourt. y P.chilensis Johnst. qué es la única representante de este género en Chile. (Porter 1974). Tiene una distribución que va desde la Provincia del Elqui (IV Región) hasta la Provincia del Colchagua (VI Región). También se encuentra en la Región Metropolitana creciendo en forma achaparrada en los cerros de Renca, Colina, cerro San Cristóbal, quebrada de Peñalolén, Cajón del Maipo, entre otros (Navas 1976; Serra et al. 1986).

C. Objetivos

Objetivo general: Caracterizar la diversidad genética de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis dentro del área de emplazamiento del proyecto en la comuna de Colina, Región Metropolitana.

Objetivos específicos:

1) Identificar marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) para la especie Prosopis chilensis.

2) Operacionalizar nuSSR para Prosopis chilensis y Porlieria chilensis bajo las condiciones analíticas del LEV.

3) Analizar la diversidad genética de ambas especies en la zona de estudio a nivel poblacional e individual.

2 La programación de las actividades requeridas para dar cumplimiento a los objetivos específicos planteados es la siguiente:

17 17 16 17 17

17 17

Actividades Dic Jun Abr Feb Ene Nov Mar May

1) Identificar marcadores nuSSR para la especie Prosopis chilensis

1.1. Optimización del método de extracción de ADN para X X ambas especies.

1.2. Obtención de ADN de individuos representivos de la X especie en la zona de estudio

1.3. Desarrollo de nuSSR para Porlieria chilensis X X X

1.4. Selección de nuSSR polimórficos para Porlieria chilensis en X X la zona de estudio

Hito 1: muestreo de individuos representativos de Porlieria chilensis X Hito 2: optimización de la extracción de ADN para Prosopis X chilensis y Porlieria chilensis

Hito 3: primera fase del desarrollo de los nuSSRs para Porlieria X chilensis completada

2) Operacionalizar nuSSR para Prosopis chilensis y Porlieria chilensis bajo las condiciones analíticas del LEV

2.1. Optimización de condiciones de PCR para los nuSSR en el X X X X LEV para ambas especies

2.2. Optimización de reacciones multiplex de PCR y X X X X electroforesis capilar

HIto 4: nuSSRs de Prosopis chilensis optimizados bajo X condiciones analíticas del LEV

3) Analizar la diversidad genética de ambas especies en la zona de estudio a nivel poblacional e individual

3.1. Muestreo de ambas especies en la zona de estudio y áreas X X X aledañas más extracción de ADN

3.2. Genotipificación ambas especies con marcadores nuSSR X X X X

3.3. Aplicación de métodos analíticos de clasificación y X X X asignación para caracterizar la diversidad genética

3.4. Identificación de individuos prioritarios para la X X conservación

Hito 5: entrega del informe final X

3 D. Materiales y Métodos.

Las frecuencias alélicas fueron estimadas mediante seis marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) por especie. Fueron seleccionados nuSSR altamente polimórficos. En el caso de Prosopis chilensis se utilizaron nuSSR ya desarrollados por Mottura et al (2005) y Bessaga et al (2013), de los cuales fueron inicialmente seleccionados los siguientes:

Locus Secuencia partidores Marcaje Ta Motivo Rango Na Ho He PIC HWE test (NS p < 0.05) GL8 F CAGGTGGGCATGAAGTTTCC FAM 58 (AT)12 150–180 6 0.87 0.8 0.78 GL8 R CCAAGAACAACCTGCCGAAG Mo13 F TTGATTAGAGTTGCATGTGGATG FAM 58 (GT)10C 218‐246 6 0.9 0.68 0.66 0,046 T(GT)2 Mo13 R TGCAGTCCCAAGTGTCAGAG GL12 F GAGTGAAGGTCGGGAAGAGG FAM 58 (CT)5(AT 340–390 5 1 0.74 0.7 CT)3(CT) 5 GL12 R CCATTGGACCAAGGCAGAAC Mo16 F CATTGCCCCAATATCACTCC VIC 60 (CA)12 149‐163 5 0.82 0.73 0.7 NS Mo16 R GGGTCCATCCAGAGTAGTGG Mo08 F TATCCTAAACGCCGGGCTAC VIC 59 (AC)9 208‐222 6 0.5 0.5 0.48 NS Mo08 R TCCCATTCATGCATACTTAAACC GL24 F CCTTAATCTCCCTCTCGGCC VIC 58 (AC)11 260‐330 5 0.75 0.69 0.64 GL24 R AACCAGGCTCTGCAGAAATG

Con respecto a los marcadores moleculares nucleares del tipo microsatélite (nuSSR) para la especie Porlieria chilensis y dado que no existen desarrollados, específicamente para esta especie, se aplicó la metodología usada en Quillaja saponaria por Letelier et al (2015) para su busqueda. Se seleccionaron 5 individuos distribuidos homogeneamente en el área de estudio.

El muestreo consistió en la colecta de material vegetal (hojas) de individuos de Prosopis chilensis y Porlieria chilensis, tanto dentro del área del proyecto como en áreas colindantes que se encuentren fuera de esta área. Idealmente se propuso tomar 150 muestras de cada especie dentro del área de estudio y otras 30 fuera de dicha áreas en caso de ser posible; de lo contrario se colectarán muestras del número de individuos presentes en el área de estudio y un número proporcional fuera (aproximadamente 5:1).

El material fue colectado, georeferenciado, almacenado en bolsas plásticas herméticas y mantenido a 4‐10°C hasta ser trasladado al Laboratorio de Epigenética Vegetal, Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Concepción. La extracción del ADN total se realizó mediante el protocolo de rutina empleado en el LEV, el cual está basado en el kit DNeasy Plant Mini (©QIAGEN). En caso de no obtenerse resultados satisfactorios en una o ambas especies, se realizaron ajustes metodológicos para obtener ADN íntegro y con concentraciones > 5 ng/uL.

Se ajustaron las condiciones de PCR para los nuSSR con el objetivo de realizar análisis multiples de los seis nuSSR por especie. Los protocolos de PCR utilizados son estándares para este tipo de marcadores moleculares en el LEV. Se probaron distintos factores que podrían afectar el proceso de genotipificación, los cuales se enumeran a continuación:

‐ Concentración de ADN (dilución 1:5 y 1:10) ‐ Temperatura de alineamiento (58, 60 y 62°C)

4 ‐ Análisis de fragmentos en condiciones de i) 1 solo producto de PCR, ii) 3 productos mezclados y iii) mulpliplex PCR con 3 productos.

La exploración de los datos genéticos es un paso fundamental para cualquier análisis de diversidad genética. Para ello se utilizó el programa GenAlEx (Peakall y Smouse 2006, 2012) que ofrecen potentes herramientas para la exploración de datos genéticos. El cálculo de las frecuencias alélicas y varias estadísticas de resumen, como el número de alelos diferentes, alelos privados y alelos localmente comunes entre otras, representan estadísticos de referencia críticos. Se descartaron alelos falsos debidos a errores de genotipificación usando 16 individuos replicados para Algarrobo y 12 para Guayacan. Las desviaciones del equilibrio de Hardy‐ Weinberg se evaluaron mediante el método exacto implementado en el programa GENEPOP (Rousset 2008). Con el mismo software, se estimaron las frecuencias de alelos nulos por marcador, implementando el algoritmo EM (Esperanza y Maximización) para encontrar la estimación de máxima verosimilitud de frecuencia de alelos nulos.

La diversidad genética intraespecífica y poblacional se analizó con los métodos de clasificación y asignación, utilizando para ellos las herramientas informáticas GenAlEx y STRUCTURE (Pritchard et al. 2000). En términos generales, la diversidad genética interpoblacional se analizó en función de dos parámetros: frecuencia y distancia genética. Para el análisis basado en frecuencia, la estimación de las frecuencias de los alelos es la base para otros análisis como estadísticos F, procedimientos de asignación a poblaciones, entre otros. A diferencia de los análisis basados en frecuencia, aquellos basados en distancia genética son relativamente nuevos. Para estos análisis, el punto de partida será la conversión de los datos genéticos en una matriz de distancia genética por parejas de individuos. Con la matriz de distancia genética, se puede realizar varios análisis como: Análisis de varianza molecular (AMOVA), Análisis de Componentes Principales (PCA, por su sigla en inglés) y Análisis de autocorrelación espacial. Con estas aproximaciones se generó información clave para tomar mejores decisiones de conservación y manejo de las especies Prosopis chilensis y Porlieria chilensis en el área de estudio.

5 E. Resultados

Actividad 1.1. Optimización del método de extracción de ADN para ambas especies. Avance: 100%‐ actividad completa.

Se probaron distintos métodos de extracción de ADN para las especies Porlieria chilensis (guayacán) y Prosopis chilensis (algarrobo) partiendo de hojas. Los protocolos de uso frecuente en el LEV funcionaron sin problemas para guayacán con rendimientos levemente superiores en concentración con el uso de ambas columnas, ya sea Qiagen o EconoSpin (Fig. 1.1, 1.2, 1.3 y 1.4). Se decidió para esta especie realizar las extracciónes de ADN con el método basado en columna lila más blanca Qiagen y el buffer LEV1 (Fig. 1.1).

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Figura 1. Imagen representativa de la concentración e integridad del ADN extraído usando diversos métodos a partir de hojas de Porlieria chilensis (guayacán) y Prosopis chilensis (algarrobo).

C: ADN control comercial de concentración (60 ng totales) e integridad conocida; 1: guayacán‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer LEV1; 2: guayacán‐columna blanca Qiagen‐buffer LEV1; 3: guayacán‐columna blanca más celeste EconoSpin‐buffer LEV1; 4: guayacán‐columna celeste EconoSpin‐buffer LEV1; 5: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer DNeasy; 6: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer SDS1; 7: algarrobo‐ columna lila más blanca Qiagen‐buffer LEV2; 8: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer LEV3; 9: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer SDS1‐30 mg inicial; 10: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer SDS1‐60 mg inicial; 11: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer SDS2‐30 mg inicial; 12: algarrobo‐columna lila más blanca Qiagen‐buffer SDS2‐60 mg inicial; 13: algarrobo‐ columna blanca más celeste EconoSpin‐buffer SDS1;

Con respecto a algarrobo el resultado con los protocolos de uso frecuente en el LEV el resultado obtenido fue inesperado, dado que no se obtuvo ADN. Solo se obtuvo ADN usando el kit original de Qiagen (Fig.1 , lo que implicó el diseño de una estrategia de ajuste metodológico que permitiera la obtención de ADN. Para ello se prepararon exclusivamente para este proyecto los buffer LEV2, SDS1 y SDS2 (composición reservada), obteniendose resultados relativamente satisfactorios con dos de ellos, los cuales fueron SDS1 (Fig. 1.6, 1.9, 1.10 y 1.13) y LEV3 (Fig. 1.8). El uso del buffer LEV2 rinde ADN con cierto grado de degración y el buffer SDS2 rinde ADN completamente degrado (Fig. 1.11 y 1.12). Por rendimiento e integridad del ADN extraido, se seleccionó como método de extracción de ADN para algarrobo el protocolo basado en columna blanca más celeste EconoSpin y buffer SDS1.

6 Actividad 1.2. Obtención de ADN de individuos representivos de la especie en la zona de estudio. Avance 100%‐actividad completa.

En el caso de guayacán se tomaron 5 invidiuos representativos de la variación de la especie en el sitio de estudio (Fig. 2). A partir de estos individuos y de otros 7 más colectados en Pinpinela (2 individuos) y el Cajón del Maipo (5 individuos) , se tomó una muestra de hojas de cada uno y se extrajo ADN (Fig. 3). Estos ADNs fueron enviados a Inglaterra para el desarrollo de nuSSR para la especie.

Figura 2. Distribución en la zona de estudio de los cinco individuos seleccionados para el desarrollo de nuSSR en Porlieria chilensis.

Figura 3. Imagen representativa de la concentración y integridad del ADN extraido de Porlieria chilensis para el desarrollo y validación de nuSSR.

1: Ex 1 ‐ Colina 5: AIG 27 ‐ Colina 9: Ex 2.2 ‐ Cajón del Maipo 2: Ex 2 ‐ Colina 6: ID 1 ‐ Pimpinela 10: Ex 2.3 ‐ Cajón del Maipo 3: Ex 3 ‐ Colina 7: ID 2 ‐ Pimpinela 11: Ex 2.4 ‐ Cajón del Maipo 4: AIG 9 – Colina 8: Ex 2.1 ‐ Cajón del Maipo 12: Ex 2.5 ‐ Cajón del Maipo

Actividad 1.3. Desarrollo de nuSSR para Porlieria chilensis. Avance 100%‐actividad completa.

El ADN fue enviado a Inglaterra al servicio de desarrollo de nuSSR dentro del plazo previsto. Las muestras llegaron sin problemas a destino y el prestador del servicio validó su calidad para llevar a cabo el proceso de generación de librerias de ADN genómico enriquecidas con nuSSR para Porlieria chilensis. Para el descubrimiento de los nuSSR se usaron cinco muestras tomadas en la zona de estudio (1 a la 5 Fig. 3). Para la validación y selección de los mejores nuSSR se usaron 7 muestras considerando 3 en la zona de estudio (1, 3 y 5 Fig. 3) y 4 fuera de la zona de estudio (6, 7, 9 y 11 Fig. 3). Se desarrollaron 12 nuSSR para la especie contando con la información de la secuencia nucleotída da cada locus, detalles de los partidores desarrollados y evaluados mostrando sus perfiles polimórficos (Fig. 4; Ver Anexo 3).

PRIMER PICKING RESULTS FOR pch2 F/R

LEFT PRIMER 5 20 60.16 55.00 3.00 2.00 ACGAAGGACTCGGTTGTGTC RIGHT PRIMER 194 21 59.73 38.10 6.00 2.00 AAAGCCTCAAATATTGCACGA SEQUENCE SIZE: 227 INCLUDED REGION SIZE: 227

PRODUCT SIZE: 190, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 2.00 TARGETS (start, len)*: 64,36

1 acTTACGAAGGACTCGGTTGTGTCGATTTCCAAGATGTCTATATCGTCACAATGATAAAT >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

61 CTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTAGTTTAACTGTTTTCTCTATT **********************************

121 TATCAACCTTATAATTTGTTATGAGACTTTAGTTTTCGTTTTGCATTTAAAAATCGTGCA <<<<<<<

181 ATATTTGAGGCTTTGATTTTTGTTCATTTTCTTTTGGAAAAAATTgt <<<<<<<<<<<<<<

Figura 4. Información representativa de un locus nuSSR (pch2) desarrolado para Guayacán (Porlieria chilensis). Leyendas >>>: posición relativa de cada partidor en el locus pch2, ****: locus nuSSR.

A partir de la información entregada sobre los polimorfismos de los 12 nuSSR desarrollados para Guayacán en siete individuos representativos de la variabilidad de la especie en el área de estudio, se seleccionaron los seis más polimórficos. Con estos seis partidores se diseñaron dos PCR multiplex con 3 locus cada una

Tabla 1. Diseño de dos PCR multiplex para Guayacán con tres nuSSR por cada una.

Multiplex 1 Multiplex 2 pch1 144bp NED pch19 120bp PET pch7 pch2...190bp VIC 187bp FAM pch16 pch3 214bp FAM 206bp VIC

8 Actividad 2.1. Optimización de condiciones de PCR para los nuSSR en el LEV para ambas especies. Avance 100%‐actividad completa.

Los seis nuSSR seleccionados para Prosopis chilensis presentan amplificación positiva en geles de agarosa (Fig. 4). Se observó que la concentración de ADN en el rango de dilución 1:5 a 1:10 y la temperatura de alineamiento entre 58 y 62°C no tuvieron efectos en la amplificación de los seis loci.

Figura 4. Proceso de optimización de las condiciones de PCR para los nuSSR de Prosopis chilensis.

El mismo protocolo de PCR optimizado para los nuSSR de Prosopis chilensis fue probado con los nuSSR desarollados para Porlieria chilensis observándose buenos resultados (Fig. 5). Se aprecian variación (polimorfismos) en cada loci nuSSR lo que ratifica los resultados previos de en la etapa de desarrollo de los marcadores. Por otra parte, los resultados obtenidos con el protocolo optimizado, muestra un mejor desempeño con respecto al protocolo sugerido por el proveedor del servicio de desarrollo de los microsatélites en Inglaterra (Fig. 6) ya que se observa menos amplificación inespecífica, amplicones para las cinco muestras utilizadas y en los seis loci nuSSR analizados.

Figura 5. Perfíl de amplificación de los seis nuSSR desarrollados para Guayacan (Porlieria chilensis) en cinco individuos utilizadon el protocolo de PCR optimizado para Algarrobo (Prosopis chilensis). Los amplicones fueron analizados en geles de agarosa al 1,4%.

Figura 6. Perfíl de amplificación de los seis nuSSR desarrollados para Guayacan (Porlieria chilensis) en cinco individuos utilizando el protocolo de PCR entregado por el desarrollador en Inglaterra. Los amplicones fueron analizados en geles de agarosa al 1,4%.

Actividad 2.2. Optimización de reacciones multiplex de PCR y electroforesis capilar. Avance 100%‐ actividad completa.

Se observa que la visualización de los alelos cambia levemente si se utiliza una u otra alternativa de análisis de fragmentos (Fig. 7). Se puede apreciar al menos la presencia de 2 alelos en 2 individuos seleccionados al azar en la zona de estudio: en el caso de AIA8 presenta claramente 2 alelos (individuos heterocigoto) y AIA15 muestra 1 solo alelo por lo cual es un homocigoto.

i) AIA8

i) AIA15

ii) AIA8

ii) AIA15

iii) AIA8

iii) AIA15

Figura 7. Resultados del análisis de fragmentos para nuSSR Mo13 en Prosopis chilensis usando dos muestras (AIA8 y AIA15) bajo condiciones de i) 1 solo producto de PCR, ii) 3 productos mezclados y iii) mulpliplex PCR con 3 productos.

10 En el caso de Guayacán se aplicó el mismo protocolo de PCR multiplex optimizado y usado para Algarrobo y los resultados los esperados al ser chequeados en geles de agarosa (Fig. 8) y posteriormente en el secuenciador capilar flourescente (Fig. 9).

PCR multiplex 1 PCR multiplex 2 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Figura 8. Perfíl de amplificación de los seis nuSSR desarrollados para Guayacan (Porlieria chilensis) en cinco individuos utilizando utilizando PCR multiplex. Los amplicones fueron analizados en geles de agarosa al 1,4%.

Figura 9. Perfil representativo de la genotipificación de cuatro muestras con sus réplicas biológicas para el locus nuSSR pch1 desarrollado para Guayacán (Porlieria chilensis).

11 Actividad 3.1. Muestreo de ambas especies en la zona de estudio y áreas aledañas más extracción de ADN. Avance 100%‐actividad finalizada.

El muestreo fue responsabilidad de la consultora ECORES y se completó dentro del plazo previsto (mayores detalles revisar el informe adjunto en Anexo 1).

Para el caso de Porlieria chilensis fueron muestreados 101 individuos de los cuales 71 corresponden al área de estudio y 30 fuera de ella. Esta cantidad fue la máxima encontrada dentro y fuera del proyecto. Con respecto a Prosopis chilensis se colectaron 184 individuos de los cuales 154 son del área de estudio y 30 fuera de esta. Las muestras llegaron al LEV sin problemas aparentes, fueron almacenadas hasta ser procesadas para la extracción de ADN. Se logró extraer ADN de casi todas las muestras de hoja de ambas especies (Fig. 10 y 11). Se puede verificar que el ADN extraído se muestra íntegro y con una concentración suficiente para la amplfiicación de nuSSR para ambas especies. Se observan algunas muestras en las que falla la extracción (ej. AIG44) y luego de varios intentos y modificaciones del protocolo de extracción, no se obtienen resultados positivos, lo cual se asocia a un estado degradado de la muestra. El total de estos casos considerando ambas especies es diez (1 de Guayacán y 9 de Algarrobo), muestras que quedaron fuera del estudio.

Figura 10. Evaluación mediante electroforesis en geles de agarosa de la concentración e integridad del ADN extraído desde muestras de hojas de Guayacán (Porlieria chilensis).

Figura 11. Evaluación mediante electroforesis en geles de agarosa de la concentración e integridad del ADN extraído desde muestras de hojas de Algarrobo (Prosopis chilensis).

12 3.2. Genotipificación ambas especies con marcadores nuSSR. Avance 100%‐actividad finalizada.

Las diferencias en las frecuencias alélicas entre las poblaciones son consecuencia de las acción de las fuerzas evolutivas a lo largo del tiempo, y por eso funcionan como un archivo de la historia evolutiva. Es por ello que el primer paso fue realizar la genotipificación de ambas especies con marcadores microsatélites nucleares (nuSSR) y a partir de dichos resultados estimar las frecuencias alélicas y genotípicas.

3.2.1. Diversidad alélica y genotípica en Prosopis chilensis (Algarrobo).

Se completó la genotipificación de las 173 muestras de Algarrobo, provenientes de individuos muestreados dentro (N=146) y fuera del área de estudio (N=27). Para los 6 loci nuSSR se detectó un total de 73 alelos distribuidos según la información que aparece en la Tabla 2 (ver Anexo 4), detectándose en promedio 12,2 alelos por locus.

Tabla 2. Detalle del número de alelos por locus nuSSR detectados fuera y dentro del área de estudio en Colina para Algarrobo (Prosopis chilensis).

Alelos GL24 Mo08 Mo16 Gl12 Gl08 Mo13 Nro. Total de alelos 21 9 12 10 15 6

Para poder estudiar con más detalle la diversidad genética dentro y fuera del área de estudio, se definieron 5 zonas; AC1, AC2 y AC3 que corresponden a los individuos ubicados en el área colindante al área de estudio, AE_S1 y AE_S2 donde se ubican los individuos colectados dentro del área de estudio, diferenciando el sector 1 y sector 2 durante el muestreo. La diferencia entre ambos es el nivel de intervención siendo AE_S1 menos intervenido y sin presencia de paneles solares. En cambio AE_S2 está casi complemente intevenido previo al inicio de este estudio, con presencia remanente al algunos individuos en zonas libres de paneles solares (Fig. 12).

Figura 12. Zona de estudio correspondiente a 390 ha con presencia de Algarrobo (Prosopis chilensis). Foto obtenida mediante Google Earth el 10 de noviembre de 2016.

13 El detalle de la distribución de los alelos en cada zona se muestra en la Fig. 13, donde se observa preliminarmente variabilidad en sus frecuencias para cada locus.

0.800

0.700

0.600

0.500 AC1 0.400 AC2 Frecuencia 0.300 AC3

AE_S1 0.200 AE_S2 0.100

0.000 292 294 298 305 307 309 310 311 313 315 317 319 321 323 325 327 329 331 333 335 336 206 209 212 214 216 218 220 222 224 142 144 147 149 153 155 157 159 162 165 167 171 335 337 353 355 358 361 363 367 369 390 166 168 170 174 176 178 180 182 186 192 194 197 199 201 203 228 233 235 237 239

GL24 Mo08 Mo16 Gl12 Gl08 Mo13 Locus Figura 13. Frecuencias alélicas en función del locus nuSSR y zona de muestreo para Algarrobo (Prosopis chilensis).

La ley de Hardy‐Weinberg afirma que, bajo ciertas condiciones, tras una generación de apareamiento al azar, las frecuencias de los genotipos de un locus individual se fijarán en un valor de equilibrio particular. El test exacto de Fisher se puede aplicar para comprobar si existen proporciones de Hardy‐Weinberg. Como el test está condicionado por las frecuencias alélicas, p y q, el problema se puede entender como la comprobación del número adecuado de heterocigotos. De esta forma, la hipótesis de las proporciones de Hardy‐Weinberg queda violada si el número de heterocigotos es muy grande o muy pequeño. En el caso de Algarrobo se observa que no hay desviación del equilibrio de Hardy‐Weinberg (p < 0.05) en toda el área de estudio ni en las distintas zonas (Tabla 3).

Tabla 3. Resultado del test exacto de Fisher para evaluar equilibrio de Hardy‐Weinberg en las distintas zonas en estudio y total para Algarrobo (Prosopis chilensis). Zonas AC1 AC2 AC3 AE_S1 AE_S2 Total Chi2 16.5370 17.4443 > 13.6275 > 18.1478 > 17.7407 > 33.9813 Df 12 12 12 12 12 50 Prob 0.1679 0.1336 < 0.3251 < 0.1113 < 0.1238 < 0.9596

3.2.2. Diversidad alélica y genotípica en Porlieria chilensis (Guayacán).

Se completó la genotipificación de las 87 muestras de Guayacán, provenientes de individuos muestreados dentro (N=71) y fuera del área de estudio (N=16). Para los 6 loci nuSSR se detectó un total de 73 alelos distribuidos según la información que aparece en la tabla 4 (ver Anexo 5) , detectándose en promedio 11,5 alelos por locus cifra levemente inferior a la detectada para Algarrobo en la zona de estudio.

Tabla 4. Detalle del número de alelos por locus nuSSR detectados fuera y dentro del área de estudio en Colina para Guayacán (Porlieria chilensis). Alelos pch1 pch16 pch2 pch19 pch3 pch7 Nro. Total de alelos 9 12 11 13 16 8

Con el objetivo de estudiar con más detalle la diversidad genética dentro y fuera del área de estudio, se consideraron 5 zonas; AC1 y AC2 que corresponden a los individuos ubicados en dos áreas colindante al área de estudio, AE_S1 y AE_S2 donde se ubican los individuos colectados dentro del área de estudio en dos sectores y CM los cuales son individuos colectados en el Cajón del Maipo con el objetivo primario del desarrollo de los nuSSR para la especie Guayacán. El detalle de la distribución de los alelos en cada zona se muestra en la Fig. 14, donde se observa preliminarmente variabilidad en sus frecuencias para cada locus y alelos que no se encuentran en todas las zonas.

14 0.900

0.800

0.700

0.600

0.500 AC1 AC2 0.400

Frecuencia CM 0.300 AE_S1 0.200 AE_S2 0.100

0.000 123 127 129 139 143 148 152 154 156 200 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 164 166 180 186 188 190 194 196 198 200 203 104 108 116 118 120 122 124 126 128 130 132 134 136 187 192 199 201 203 207 209 212 214 216 218 221 223 226 228 235 172 174 176 178 186 188 190 pch1 pch16 pch2 pch19 pch3 pch7 Locus

Figura 14. Frecuencias alélicas en función del locus nuSSR y zona de muestreo para Guayacán (Porlieria chilensis).

Se observa desvíos de Hardy‐Weimberg (valor p < 0.05) al considerar el total de las muestras y la zona AE_S2 (Tabla 5). Estos resultados podrían estár explicados por presencia de alelos nulos y subestructuración, aspectos que fueron estudiados. Por otra parte se refuerza el desequilibrio de Hardy Weinberg al observar valores p significativos para la hipótesis del déficit de heterocigotos en el total de las muestras y en la zona AE_S1.

Tabla 5. Resultado del test exacto de Fisher para evaluar equilibrio de Hardy‐Weinberg en las distintas zonas en estudio y total para Guayacán (Porlieria chilensis). Zonas AC1 AC2 CM AE_S1 AE_S2 Total Chi2 8.9215 12.3721 19.3148 13.0486 29.6946 83.3516 Df 12 12 12 12 12 60 Valor 0.7096 0.4163 0.0812 0.3655 0.0031 0.0248

Valor p (H1 = déficit de 0.0865 0.1117 0.0011 0.0065 0.0661 0.0001 heterocigotos)

Para comprobar si el desequilibrio de Hardy‐Weinberg observado en Guayacán tiene su origen en la presencia de alelos nulos, estos fueron estimados usando GENEPOP. En la tabla 6 se observa la frecuencia de alelos nulos detectados mediante el algoritmo EM (Dempster et al., 1997) para los 6 nuSSRs en las cinco zonas estudiadas. Se ha determinado que cuando la frecuencia de un alelo nulo es > 0,2 significa que la probabilidad de exclusión puede ser mucho más alta que si solo se analizara sin la presencia de alelos nulos, en ese sentido el marcador debería ser descartado del análisis genético. En el presente estudio la presencia de alelos nulos a través de los 6 SSRs estuvo en un rango de 0 a 0.2903 (pch7 en AC1). De acuerdo con el algoritmo EM, ningún marcador presentó valores de frecuencia superiores a 0,2 en las zonas AE_S1 o AE_S2, (zonas de mayor interés para este estudio) por lo cual no debería ser eliminado ningún marcador para los próximo análisis, confirmándose que existe un desequilibrio de Hardy Weimber en AE. El siguiente paso fue estudiar la hipótesis de la estructuración.

Tabla 6. Frecuencia estimada de alelos nulos por cada locus nuSSR analizado en las distintas zonas para Guayacán (Porlieria chilensis). AC1 AC2 CM AE_S1 AE_S2 pch1 0 0 0 0 0 pch16 0 0.0313 0.1317 0.1028 0.0795 pch2 0.2783 0.191 0.3 0.1209 0.1516 pch19 0 0.0237 0 0.0847 0.1306 pch3 0 0 0.2363 0.0445 0.0612 pch7 0.2903 0 0 0.0151 0.092

15 3.3. Aplicación de métodos analíticos de clasificación y asignación para caracterizar la diversidad genética. Avance 100%‐actividad terminada.

Existen varios métodos para estimar la diferenciación y estructura genética poblacional, pero es importante recalcar que las diferentes medidas de estructura genética están relacionadas entre si, y simplemente se basan en analizar las diferencias en las frecuencias alélicas. Así, los métodos más sencillos simplemente comparan estadísticamente las diferencias frecuencias alélicas. Otros métodos se basan en estimar la proporción de variación genética que se encuentran dentro y entre las poblaciones, usualmente empleando el estadístico Fst de Wright o sus análogos, que permiten comparar de manera clara y cuantitativa las diferentes especies.

3.3.1. Caracterización de la variabilidad genética de Prosopis chilensis (Algarrobo).

En la Fig. 15 y la tabla 7 se presentan los valores asociados con riqueza alélica. El Indice de Información de Shannon que permite establecer la relación entre la frecuencia de un determinado alelo y el número de individuos en cada población en términos de riqueza y uniformidad de su distribución, osciló en un rango entre 1.32 y 1.85, siendo más alto en los individuos muestreados dentro del área de estudio (AE_S1 y AE_S2). En cuanto al índice F, este alcanza el valor de 0 si las poblaciones se encuentran en las proporciones esperadas si los apareamientos fueran estrictamente al azar (Hardy‐Weinberg), y puede llegar hasta 1 si sólo se encuentran individuos homócigos o déficit total de heterocigotos en la población (lo cual generalmente es una consecuencia de la endogamia extrema). Si F es negativo, quiere decir que se tiene un exceso de heterócigos. En el caso de Algarrobo en el AE_S1 y AE_S2 se observa un promedio de F = 0.15 y 0.25, respectivamente, lo que estaría indicando cierto déficit de heterocigotos.

16 0.9

14 0.8

Nro. alelos (Na) 12 0.7 0.6 Na Freq. >= 5% Número io 10 0.5 efeczvo de alelos 8 igocidad 0.4 Indice de Información de Shannon 6 Promed 0.3 Nro. alelos únicos 4 0.2 Heteroc Nro. alelos poco comunes (<=25%) 2 0.1 Nro. alelos poco comunes (<=50%) 0 0.0 AC1 AC2 AC3 AE_S1 AE_S2 uHe Zona

Figura 15. Patrones alélicos estimados a partir de 6 nuSSR para Algarrobo (Prosopis chilensis) en las distintas zonas dentro y fuera el área de estudio.

16 Tabla 7. Parámetros generales (promedios y desviación estándar) de diversidad genética intraespecíficas estimados a partir de 6 nuSSR para Algarrobo (Prosopis chilensis) en las distintas zonas dentro y fuera el área de estudio. Zona N Na Ne I Ho He uHe F AC1 Promedio 7.8 5.0 3.3 1.32 0.63 0.67 0.72 0.04

DE 0.17 0.6 0.4 0.11 0.11 0.04 0.04 0.18

AC2 Promedio 9.0 5.2 3.5 1.39 0.76 0.70 0.74 ‐0.09 DE 0.0 0.5 0.4 0.10 0.11 0.04 0.04 0.14

AC3 Promedio 10.0 5.5 3.7 1.43 0.58 0.71 0.75 0.19 DE 0.0 0.7 0.5 0.13 0.11 0.04 0.05 0.13

AE_S1 Promedio 119. 7 11. 7 5.1 1.85 0.67 0.79 0.79 0.15 DE 0.2 2.1 0.6 0.13 0.04 0.03 0.03 0.04

AE_S2 Promedio 26.0 7.8 4.6 1.68 0.58 0.76 0.77 0.25

DE 0.0 0.7 0.7 0.12 0.10 0.04 0.04 0.12 Total Promedio 34.5 7.0 4.1 1.54 0.64 0.73 0.75 0.11 DE 8.0 0.7 0.3 0.062 0.042 0.02 0.02 0.06 N: Número promedio de individuos, Na: Número promedio de alelos diferentes, Ne: Número de alelos efectivos, I: Indice de información de Shannon, He: Indice promedio de diversidad genética de Nei, uHe: Indice promedio de diversidad genética de Nei insesgado, F: Indice de fijación de alelos.

Con el AMOVA calculado para las cinco zonas (fuera y dentro del área de estudio) se realizaron las pruebas de diferenciación para los diferentes niveles jerárquicos, todos los cuales fueron significativos (p < 0.05) (tabla 8). La mayor parte de la varianza estimada para las cinco zonas mostró diferencias altamente significativas (p < 0.01) entre individuos dentro de las zonas (Fis) y en menor medida entre individuos dentro de las zonas (Fit). El valor de positivo de Fis de 0.177 estaría confirmando el déficit de heterocigotos dentro de las zonas. En cuanto al valor de Fst a pesar de ser significativo, este no difiere mayormente de 0, lo que estaría indicando una reducida diferenciación entre las zonas.

Tabla 8. Análisis jerárquico de varianza molecular (AMOVA), indices de diversidad F y estimación del número de migrantes (Nm) estimados a partir de 6 nuSSR y 999 permutaciones para Algarrobo (Prosopis chilensis) dentro y fuera de la zona de estudio.

Fuente de variación Aporte a la variabilidad Estadístico F Valor Valor p Entre zonas 1% Fst 0.010 0.016 Entre individuos 17% Fit 0.177 0.001 dentro de las zonas Dentro de inviduos 82% Fis 0.169 0.001

Nm 25.6

El cálculo del Fst tiene la ventaja adicional de que permite generar un estimador conjunto de la importancia de la deriva génica y el flujo génica, la Nm. Según lo demostrado por Sewall Wright (1957) este estimador nos indica si la deriva génica es importante (si Nm es muy pequeño, usualmente menor de 1) o si el flujo génico es el proceso evolutivo determinante (i.e., si Nm es “grande”, usualmente mayor de 4). En este estudio, la nula diferenciación genética entre zonas estaría explicada por el flujo génico histórico, el cual se ve reflejado en un alto número de migrantes (Nm) valor que alcanza un valor de 25.6 (tabla 5).

Otro método para estimar Nm es el de alelos privados (Slatkin 1981, 1985), en el que se muestrean distintas localidades y se obtienen la frecuencia promedio de alelos que sólo están en una de ellas. Este parámetro

17 está linealmente relacionado con log10(Nm). Usando los módulos de cálculo implementados en GENEPOP se determinó que la frecuencia de alelos privados para Algarrobo es 1,2% y el Nm 19.7 (valor similar al obtenido con el método del Fst.

Para confirmar la homogeneidad genética entre las zonas se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA), con la finalidad de observar la distribución y ordenación de los individuos de Algarrobo sobre un sistema de ejes multidimensional. No se observa tendencia de divergencia entre las zonas pero si entre los individuos muestreados (Fig. 16).

) AC1 %

(7 AC2

AC3

Coord. AE_S1

AE_S2

Coord. 1 (9,1%)

Figura 16. Ordenación de un conjunto de 173 individuos definida por las dos primeras componentes del Análisis de Coordenadas Principales realizado sobre las frecuencias alélicas de Algarrobo (Prosopis chilensis) en la zona de estudio.

Se utilizó el método de autocorrelación espacial de Smouse y Peakall (1999) implementado en GENALEX 6.4 (Peakall & Smouse, 2006) para generar los autocorrelogramas. Se probó la significancia de los coeficientes de correlación sobre la hipótesis nula de una estructura al azar utilizando 1000 permutaciones, 1000 repeticiones y un intervalo de confianza del 95%. El correlograma de la Fig. 17 muestra la existencia de una importante correlación positiva entre las distancias genéticas y geográficas de los individuos analizados para la primera clase de distancia (0 – 30 m). Para el resto de las clases los valores no se alejaron significativamente de la distribución aleatoria esperada para los genotipos en cada grupo. El intercepto con el eje de las abscisas fue de aproximadamente 20 m; este valor pueden interpretarse como la delimitación espacial en la cual los individuos de Algarrobo mantienen una relación genética.

0.150

0.100

r 0.050 r

0.000 U L ‐0.050 0 30 60 111 199 267 287 306 363 Clases de distancia

18 Figura 17. Correlograma discretos entre la distancias geográficas (m) y las distancias genéticas obtenidos mediante la caracterización de 173 individuos de Algarrobo (Prosopis chilensis) en la zona de estudio. Se realizaron 999 permutaciones obteniéndose un correlograma significativo (p < 0.001).

19 3.3.2. Caracterización de la variabilidad genética de Porlieria chilensis (Guayacán).

En la Fig. 18 y la tabla 9 se presentan los valores asociados con riqueza alélica para Guayacán. El Indice de Información de Shannon osciló en un rango entre 1.26 y 1.79, siendo más alto en los individuos muestreados dentro del área de estudio (AE_S1 y AE_S2) al igual que lo ocurre con Algarrobo, pero con valores absolutos menores. En cuanto al índice F, este alcanza valores positivos en todas las zonas, y con valores menores a los detectados en Algarrobo.

14 0.9

12 0.8 0.7 Nro. alelos (Na)

10 0.6 Na Freq. >= 5% Número io 8 0.5 efeczvo de alelos igocidad 6 0.4 Indice de Información de Shannon

Promed 0.3 4 Nro. alelos únicos 0.2 Heteroc Nro. alelos poco comunes (<=25%) 2 0.1 Nro. alelos poco comunes (<=50%) 0 0.0 AC1 AC2 CM AE_S1 AE_S2 uHe Zona

Figura 18. Patrones alélicos estimados a partir de 6 nuSSR para Guayacán (Porlieria chilensis) en las distintas zonas dentro y fuera el área de estudio.

Tabla 9. Parámetros generales (promedios y desviación estándar) de diversidad genética intraespecíficas estimados a partir de 6 nuSSR para Guayacán (Porlieria chilensis) en las distintas zonas dentro y fuera el área de estudio. Zona N Na Ne I Ho He uHe F AC1 Promedio 4.0 3.8 3.2 1.19 0.63 0.65 0.74 0.09 DE 0.0 0.5 0.5 0.16 0.14 0.06 0.07 0.21

AC2 Promedio 8.0 6.0 4.6 1.49 0.67 0.69 0.74 0.03 DE 0.0 1.1 1.0 0.25 0.08 0.09 0.09 0.03

CM Promedio 4.0 4.2 3.3 1.26 0.54 0.67 0.76 0.15 DE 0.0 0.3 0.4 0.12 0.12 0.06 0.06 0.19

AE_S1 Promedio 45.0 10.5 5.5 1.79 0.70 0.73 0.74 0.02 DE 0.0 1.3 1.5 0.24 0.05 0.07 0.07 0.06

AE_S2 Promedio 26.0 8.2 4.3 1.53 0.60 0.65 0.66 0.07 DE 0.0 1.3 1.0 0.28 0.11 0.11 0.11 0.04

Total Promedio 17.4 6.5 4.2 1.45 0.63 0.68 0.73 0.07 DE 3.0 0.6 0.4 0.10 0.04 0.03 0.04 0.05

20 de las zonas (Fit). El valor de positivo de Fis de 0.108 estaría confirmando un cierto déficit de heterocigotos dentro de las zonas pero menor al observado para Algarrobo. Es posible que la frecuencia promedio de alelos nulos encontrada en las distintas zonas para Guayacán (Tabla 6), a pesar de no ser tan alta (< a 0.2 en casi todos los casos), explique en cierta proporción la deficiencia de heterocigotos observada. En cuanto al valor de Fst a pesar de ser significativo, este no difiere mayormente de 0, lo que estaría indicando una reducida diferenciación entre las zonas.

Tabla 10. Estadísticos F y estimación del número de migrantes (Nm) estimados a partir de 6 nuSSR y 999 permutaciones para Guayacán (Porlieria chilensis) en la zona de estudio.

Fuente de variación Aporte a la variabilidad Estadístico F Valor Valor p Entre zonas 2% Fst 0.023 0.026 Entre individuos 8% Fit 0.108 0.001 dentro de las zonas Dentro de inviduos 89% Fis 0.087 0.001

Nm 10.7

El valor de Fst para Guayacán más alto que el observado para Algarrobo se traduce en un menor número de migrantes estimados (10.7). Esta estimación se confirma al aplicar el método de estimación de Nm basado en alelos privados. En el caso de Guayacán se obtiene una proporción mayor de alelos privados (3,6%) y un menor número de migrantes Nm (5.78) que Algarrobo.

Para confirmar la homogeneidad genética entre las zonas se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA), con la finalidad de observar la distribución y ordenación de los individuos de Guayacán sobre un sistema de ejes multidimensional. No se observa tendencia de divergencia entre las zonas (Fig. 19).

AC1

1%) . AC2 (8

d CM r oo

C AE_S1

AE_S2

Coord. 1 (11.3%)

Figura 19. Ordenación de un conjunto de 87 individuos definida por las dos primeras componentes del Análisis de Coordenadas Principales realizado sobre las frecuencias alélicas de Guayacán (Porlieria chilensis) en la zona de estudio.

21 El correlograma de la Fig. 20 muestra la existencia de una importante correlación positiva entre las distancias genéticas y geográficas de los individuos analizados para la primera clase de distancia (0 – 30 m). Para el resto de las clases los valores no se alejaron significativamente de la distribución aleatoria esperada para los genotipos en cada grupo. El intercepto con el eje de las abscisas fue de aproximadamente 30 m; este valor pueden interpretarse como la delimitación espacial en la cual los individuos de Guayacán mantienen una relación genética.

0.150 0.100

0.050

r r 0.000 U ‐0.050 L ‐0.100 0 30 60 111 199 267 287 306 363 Clases de distancia

Figura 20. Correlograma discretos entre la distancias geográficas (m) y las distancias genéticas obtenidos mediante la caracterización de 87 individuos de Guayacán (Porlieria chilensis) en la zona de estudio. Se realizaron 999 permutaciones obteniéndose un correlograma significativo (p < 0.002).

22 3.4. Identificación de individuos prioritarios para la conservación. Avance 100%‐actividad terminada.

Con el objetivo de no poder alelos únicos en la zona de estudio, las zonas fueron reducidas a solo dos: i) dentro del área de intervención del proyecto y ii) fuera del área de intervención. Se procedió a la búsqueda de alelos únicos y el resultado se resume en las tablas 11 y 13 para Algarrobo y 12 y 14 para Guayacán. Así por ejemplo el alelo 307 del locus GL24 fue detectado 3 veces como se puede apreciar en la tabla 11, el cual se encuentra duplicado en el individuo AIA63 y la otra copia en el individuo AIA 84 como se observa en la tabla 13. Es necesario diferenciar entre aquellos alelos privados comunes (que se encuentra en mayor frecuencia) y aquellos raros (detectados en menor frecuencia).

Tabla 11. Listado de alelos únicos por locus indicando su frecuencia y número de detecciones en el área de intervención del proyecto para Algarrabo (Prosopis chilensis).

Locus Alelo Frecuencia Detecciones GL24 298 0.003 1 GL24 305 0.003 1 GL24 307 0.010 3 GL24 310 0.007 2 GL24 311 0.003 1 GL24 315 0.003 1 GL24 317 0.017 5 GL24 319 0.007 2 GL24 321 0.007 2 GL24 325 0.045 13 GL24 329 0.048 14 GL24 336 0.014 4 Mo08 206 0.021 6 Mo08 209 0.007 2 Mo08 224 0.007 2 Mo16 167 0.007 2 Mo16 171 0.003 1 Gl12 353 0.031 9 Gl08 166 0.007 2 Gl08 168 0.003 1 Gl08 192 0.003 1 Gl08 194 0.007 2 Gl08 197 0.010 3 Gl08 201 0.007 2 Gl08 203 0.003 1 Mo13 233 0.017 5 Mo13 241 0.038 11

23 Tabla 12. Listado de alelos únicos por locus indicando su frecuencia y número de detecciones en el área de intervención del proyecto para Algarrabo (Prosopis chilensis).

Locus Alelo Frecuencia Detecciones pch1 143 0.014 2 pch1 152 0.007 1 pch1 154 0.007 1 pch1 156 0.014 2 pch16 200 0.063 9 pch16 201 0.007 1 pch16 215 0.007 1 pch16 217 0.049 7 pch16 221 0.007 1 pch19 104 0.014 2 pch19 126 0.014 2 pch19 136 0.106 15 pch3 192 0.007 1 pch3 214 0.007 1 pch3 223 0.035 5 pch3 235 0.028 4 pch7 174 0.021 3 pch7 178 0.007 1 pch7 192 0.056 8

24 Tabla 14. Listado de individuos con uno o más alelos únicos en función de la zona de estudio de Algarrobo (Prosopis chilensis) en la comuna de Colina, Región Metropolitana.

No. locus Locus Individuo GL24 Mo08 Mo16 Gl12 Gl08 Mo13 con alelo con alelo único único AIA 106 327 327 216 220 157 157 355 355 182 197 237 237 1 Gl08 AIA 115 319 327 216 220 155 155 335 369 180 186 237 239 1 GL24 Mo08 AIA 123 323 333 206 216 155 155 355 355 170 182 241 241 2 Mo13 AIA 4 325 325 216 220 153 165 355 355 180 182 228 235 1 GL24 AIA 7 323 323 216 216 147 171 335 367 176 180 228 235 1 Mo16 AIA 13 323 333 206 216 144 155 355 367 178 180 228 235 1 Mo08 AIA 15 313 325 216 222 144 147 355 355 176 182 228 235 1 GL24 AIA 18 327 327 216 222 153 153 353 369 174 178 228 237 1 Gl12 AIA 19 323 323 216 220 153 157 355 355 180 182 228 233 1 Mo13 AIA 24 323 333 214 216 155 159 363 367 178 180 235 241 1 Mo13 AIA 28 325 329 214 216 144 155 355 363 180 182 228 228 1 GL24 GL24 Gl12 AIA 30 325 336 218 218 149 159 335 353 178 194 237 241 4 Gl08 Mo13 GL24 AIA 31 325 333 218 218 157 157 355 363 180 192 237 237 2 Gl08 AIA 32 329 333 218 218 155 155 355 355 178 182 237 237 1 GL24 AIA 33 329 329 218 218 153 155 355 367 180 186 0 0 1 GL24 GL24 AIA 34 329 335 216 224 153 155 355 363 178 182 228 228 2 Mo08 AIA 35 329 335 216 220 159 162 355 355 178 178 228 235 1 GL24 AIA 37 329 329 216 222 147 159 335 367 186 186 235 239 1 GL24 AIA 38 329 336 218 222 157 157 369 369 174 178 235 237 1 GL24 AIA 39 321 321 216 222 153 153 367 367 180 182 228 239 1 GL24 GL24 AIA 40 325 336 220 224 153 159 335 367 182 182 237 237 2 Mo08 AIA 41 329 329 218 218 159 159 355 367 176 180 235 239 1 GL24 AIA 42 315 336 216 220 153 153 355 367 174 182 235 235 1 GL24 AIA 43 325 335 218 222 142 157 355 367 174 180 228 239 1 GL24 GL24 AIA 44 325 329 218 220 162 162 355 390 178 182 233 233 2 Mo13 AIA 45 310 327 212 216 155 155 367 369 170 182 237 237 1 GL24 AIA 47 323 325 216 216 149 153 358 367 178 178 228 235 1 GL24 AIA 49 323 327 216 220 147 159 355 367 166 178 235 239 1 Gl08 AIA 50 327 333 216 220 155 155 353 355 180 182 235 239 1 Gl12 AIA 51 313 323 216 222 157 162 353 361 170 186 235 235 1 Gl12 AIA 52 327 327 220 220 157 157 355 355 182 194 228 228 1 Gl08 AIA 54 333 335 216 216 142 155 355 355 180 197 235 239 1 Gl08 AIA 56 317 335 216 216 159 159 355 355 174 178 237 239 1 GL24 AIA 59 294 323 218 222 162 162 367 367 178 197 228 228 1 Gl08 AIA 61 323 329 216 216 142 142 355 367 178 182 228 237 1 GL24

No. locus Locus Individuo GL24 Mo08 Mo16 Gl12 Gl08 Mo13 con alelo con alelo único único GL24 AIA 63 307 307 220 220 159 159 335 358 182 182 233 233 2 Mo13 GL24 AIA 69 298 333 214 220 153 162 355 367 180 199 237 241 2 Mo13 AIA 71 305 323 216 220 157 162 355 355 178 178 228 237 1 GL24 GL24 AIA 73 317 327 216 220 157 162 355 369 186 201 228 237 2 Gl08 AIA 74 323 325 216 216 142 155 337 355 180 180 228 235 1 GL24 AIA 75 335 335 216 216 142 142 353 367 170 186 239 239 1 Gl12 AIA 76 323 323 220 220 153 159 353 355 170 182 235 235 1 Gl12 AIA 81 327 327 216 218 142 147 390 390 170 178 237 241 1 Mo13 AIA 84 307 323 216 216 153 159 355 363 180 180 228 237 1 GL24 Mo08 AIA 86 323 323 206 216 155 159 355 355 170 170 237 241 2 Mo13 GL24 AIA 87 310 333 218 222 153 157 355 355 170 180 237 241 2 Mo13 AIA 88 309 333 209 216 159 159 335 390 178 180 237 237 1 Mo08 AIA 90 319 327 216 216 157 157 355 355 178 178 235 239 1 GL24 AIA 116 323 323 216 220 149 153 355 367 170 174 228 241 1 Mo13 AIA 120 313 335 216 220 147 162 353 355 178 178 239 239 1 Gl12 AIA 121 311 331 214 214 153 153 335 335 178 186 239 239 1 GL24 GL24 AIA 122 317 327 218 222 147 162 335 355 166 178 239 239 2 Gl08 AIA 124 325 333 216 216 155 155 335 355 178 178 237 237 1 GL24 AIA 1‐6 323 325 216 216 157 157 355 367 178 180 235 237 1 GL24 Mo08 AIA 1‐9 313 333 206 206 144 157 355 367 178 182 241 241 2 Mo13 AIA 1‐11 323 335 214 216 142 142 353 367 170 182 228 239 1 Gl12 AIA 1‐12 323 335 214 216 142 144 353 367 170 182 228 237 1 Gl12 Mo16 AIA 1‐16 292 294 216 216 167 167 355 363 168 178 237 237 2 Gl08 AIA 1‐17 294 317 216 220 157 157 355 369 180 186 228 235 1 GL24 AIA 1‐18 327 333 216 220 155 159 355 367 178 201 237 237 1 Gl08 GL24 AIA 1‐19 317 333 216 220 155 155 355 367 170 203 237 237 2 Gl08 AIA 1‐20 313 329 216 216 144 144 355 367 180 180 237 237 1 GL24 AIA 1‐21 323 327 206 216 159 159 355 367 178 182 228 228 1 Mo08 AIA 1‐30 335 335 209 218 155 155 363 369 170 182 235 237 1 Mo08

26 Tabla 15. Listado de individuos con uno o más alelos únicos en la zona Area de estudio (AE) de Guayacán (Porlieria chilensis) en la comuna de Colina, Región Metropolitana.

No. locus Locus Individuo pch1 pch16 pch2 pch19 pch3 pcph7 con alelo con alelo único único AIG_02 127 127 207 213 186 186 120 130 218 221 186 192 1 pch7 pch19 AIG_04 127 127 203 207 164 196 128 136 207 235 172 172 2 pch3 AIG_05 123 127 205 213 164 186 118 132 212 212 172 192 1 pch7 pch1 AIG_07 127 156 207 217 164 186 120 122 187 209 172 186 2 pch16 AIG_10 127 129 205 205 198 198 128 136 203 207 172 172 1 pch19 AIG_11 127 127 209 211 164 200 122 122 207 207 172 174 1 pch7 AIG_12 123 127 201 200 186 198 118 128 187 209 172 186 1 pch16 AIG_13 127 127 207 207 186 188 118 122 199 207 172 178 1 pch7 pch19 AIG_14 127 127 207 207 164 194 128 136 212 223 190 192 3 pch3 pch7 pch16 AIG_18 127 148 200 209 164 186 126 136 221 226 172 186 2 pch19 AIG_21 123 127 203 207 186 186 120 124 187 214 172 190 1 pch3 pch16 AIG_22 127 148 200 221 166 186 104 116 203 221 172 186 2 pch19 AIG_23 127 127 200 205 164 194 120 120 201 221 172 172 1 pch16 AIG_24 127 148 207 207 164 164 104 122 203 207 172 186 1 pch19 pch19 AIG_25 127 148 205 209 186 186 120 136 216 218 174 186 2 pch7 AIG_26 127 127 209 217 164 196 122 132 187 207 172 186 1 pch16 AIG_27 127 127 207 209 186 186 122 124 201 207 172 192 1 pch7 AIG_28 127 127 203 203 166 166 122 136 201 201 172 186 1 pch19 AIG_32 127 143 203 205 164 203 134 134 199 218 172 172 1 pch1 pch19 AIG_34 127 127 205 213 164 186 120 126 187 192 172 192 3 pch3 pch7 pch1 AIG_35 127 154 205 217 164 186 120 132 209 228 172 172 2 pch16 pch1 AIG_37 123 156 207 209 164 203 122 136 187 201 172 172 2 pch19 AIG_38 127 127 205 205 194 200 128 134 209 223 172 172 1 pch3 AIG_43 127 148 205 205 164 186 116 128 199 223 172 190 1 pch3 AIG_44 127 127 200 207 166 186 122 132 207 218 172 186 1 pch16 AIG_2‐11 143 148 209 213 203 203 120 128 207 212 172 172 1 pch1 AIG_2‐12 127 148 200 207 164 186 128 130 218 228 172 172 1 pch16 AIG_2‐14 127 127 203 209 194 198 120 122 218 235 172 172 1 pch3 pch16 AIG_2‐15 127 127 200 207 194 198 120 122 218 235 172 172 2 pch3 AIG_2‐17 127 127 203 205 190 194 130 136 209 218 172 172 1 pch19 AIG_2‐18 127 127 203 203 186 190 122 130 209 212 172 192 1 pch7 pch16 AIG_2‐19 123 127 215 217 203 203 130 132 199 209 174 192 2 pch7 AIG_2‐2 127 127 203 217 164 196 120 124 203 209 172 172 1 pch16 AIG_2‐21 127 127 205 205 164 196 122 136 199 221 172 186 1 pch19

No. locus Locus Individuo pch1 pch16 pch2 pch19 pch3 pcph7 con alelo con alelo único único pch16 AIG_2‐22 127 127 200 217 186 194 128 136 199 223 172 186 3 pch19 pch3 pch16 AIG_2‐23 123 127 207 217 186 198 120 134 216 235 172 186 2 pch3 pch1 AIG_2‐25 127 152 203 205 196 196 118 136 209 216 172 172 2 pch19 AIG_2‐26 127 127 203 203 164 186 130 136 209 209 172 172 1 pch19 AIG_2‐3 127 127 203 203 166 196 120 136 187 207 172 172 1 pch19 AIG_2‐4 127 127 203 203 194 196 120 136 209 221 172 172 1 pch19 AIG_2‐5 127 127 200 205 186 186 120 122 207 209 172 186 1 pch16 AIG_2‐6 127 127 205 207 186 186 130 130 209 218 172 192 1 pch7 pch19 AIG_2‐7 127 127 203 203 194 196 120 136 209 223 172 172 2 pch3

28 F. Discusión

Las especies en estudio Prosopis chilensis y Porlieria chilensis muestraron resultados diferenciales en el extracción de ADN con el método de uso rutinario en el LEV, lo que podría ser explicado por la composición química de sus hojas. Con respecto a Prosopis chilensis el resultado obtenido en las primeras pruebas mostró nulo rendimiento de ADN, lo cual podría esta explicado por un alto contenido de carbohidratos o compuestos fenólicos. Ambos se conocen como interferentes en la purificación de ácidos nucleicos (Sambrook y Russel, 2001). Esto se verifica al observar los resultados obtenidos con los buffer LEV2, LEV3 y SDS1 los cuales fueron especialmente diseñados en el LEV para muestras con altos contendios con carbohidratos. Es relevante destacar que las dificultades iniciales fueron superadas con el uso de estos buffer y en especial del buffer SDS1, el cual muestra un rendimiento similar al buffer original de QIAGEN. La ventaja de usar buffer propios hechos en nuestro laboratorio es que nos posibilita flexibilizar y optimizar el protocolo a todo tipo de material.

Porlieria chilensis muestra un comportamiento completamente opuesto a Prosopis chilensis con respecto a al protocolo de uso rutinario en el LEV, mostrando buenos resutados con los dos tipos de columnas de purificación disponibles en nuestro laboratorio. Este resultado respalda nuestra apreciación sobre las diferencias entre ambas especies en relación al contenido de compuestos foliares.

El desarrollo de nuSSR para Porlieria chilensis se logró en un tiempo muy acotado gracias a un servicio de desarrollo de microsatélites subcontratado en Inglaterra (Genetic Marker Services), quienes ya tienen experiencia en especies leñosas chilenas, específicamente Quillaja saponaria cuyos resultados que fueron recientemente publicados (Letelier et al., 2015). De los 12 nuSSR se seleccionaron solo 6 para este proyecto pero el resto queda a disposición de ser probados en futuros proyectos.

Los seis loci nuSSR analizados en este estudio muestran altos niveles de diversidad genética (Ho = 0.64 y He = 0.73) en comparación a los reportados en otros estudios en Algarrobo (Prosopis chilensis) (Bessega et al., 2013) o en el género Prosopis (Bessega 2000, 2015, 2016; Roser et al. 2017). Este resultado podría explicarse por procesos de hibridación con otra especie del género Prosopis, por ejemplo, con P. flexuosa especie con la cual se han registrado híbridos (Altamirano 2005), sin embargo, esta última especie crece solamente en la III región, por lo cual se descarta esa opción. Los resultados muestran que los individuos muestreados que se encuentran en la zona de intervención del proyecto, tienen un alto valor de conservación dada su alta diversidad genética, por lo que representan un reservorio de biodiversidad para esta especie actualmente en categoría Vulnerable (VU A2cd) según el Ministerio de Medio Ambiente de Chile. Además se detectaron una cantidad importante de alelos privados (1,1% de frecuencia) al comparar con individuos presentes en sitios colindantes, a pesar que no se observa diferenciación genética de los individuos que están fuera del área de intervención con respecto a los que están dentro, lo que le otorga un mayor valor de conservación. Para poder confirmar si efectivamente se trata de una localidad que contiene alta diversidad genética para este especie, se require de un estudio que abarque toda la distribución de la especie en Chile.

Las diferencias en las frecuencia alélicas entre las poblaciones (o localidades o zonas de estudio) constituyen la estructura genética. Cuando una especie posee alta estructuración genética, implica que se pueden detectar fuertes diferencias en las frecuencias alélicas entre las poblaciones. En contraste, en una especie con baja estructura genética, las poblaciones que la constituyen son casi idénticas, con nulas o muy pocas diferencias en las frecuencias alélicas. Este último caso es el que se detecta en este estudio con Algarrobo. La reducida distancia geográfica podría explicar estos resultados, pero también su biología reproductiva. Las especies del género Prosopis se clasifican como entomófilas protóginas. Las flores, aunque no muy vistosas, son nectaríferas y atraen gran número de abejas y otros himenópteros. Los frutos azucarados favorecen la propagación zoófila y endozoica. En efecto, la mayoría de las especies de Prosopis son propagadas por los animales que comen sus frutos y por enden favorecen el flujo génico por medio de la dispersión de semillas.

En siete especies del genéro Prosopis se analizó el sistema de apareamiento, a partir de datos provenientes de electroforesis de isoenzimas y sistema de apareamiento. Se demostró que aunque éstas son mayormente exógamas, pueden presentar hasta un 28% de autofecundación, con un promedio del 19%. La variabilidad genética las especies fue alta, pero tiende a ocurrir dentro de las poblaciones. Por esta razón con muestras

29 de pocas poblaciones se cubre la mayor parte de la variación genética detectada por isoenzimas y RAPD (Saidman et al. 2000). Estos antecedentes podrían explicar la falta de estructuración que detectamos en este estudio.

La variación genética detectada en Guayacan (Ho = 0.63 y He = 0.68) muestra valores similares a los observados para Algarrobo en el área de estudio. No obstante, no es posible comparar los resultados obtenidos en este estudio con otros estudios previos, ya que no se han reportado estudios genéticos en esta especie. Al analizar si Guayacan se encuentra en equilibrio de Hardy Weinberg se observa una desviación altamente significativa (p < 0.01), situación que no ocurre con Algarrobo. Esta desviación se explica principalmente por uno de los sectores dentro del área de estudio (AE_S2) y por un déficit significativo de heterocigotos (p < 0.01) en el otro sector (AE_S1). Por lo anterior, es clave rescatar genéticamente la mayor cantidad de individuos de Guayacan (siguiendo lo comprometido en la RCA 276/2015) que permitan reestabler en el mediano a largo plazo el equilibro de Hardy Weinberg.

En relación a los alelos privados comunes basta con iniciar estrategias de conservación in situ para asegurar su permanencia en el tiempo. En el caso de los alelos privados raros se requiere de estrategias de conservación complementarias a las in situ para asegurar su persistencia y permitir que en el futuro puedan aportar a mantener potencial evolutivo de estas especies, más aun considerando que ambas se encuentran en su límite sur de distribución, lo que hace más relevante cuidar y mantener la diversidad genética detectada.

G. Conclusiones

‐ La diversidad genética de los individuos de Guayacán y Algarrobo muestreados dentro del área de estudio y específicamente en el área de intervención del proyecto es alta. Cada individuo muestreado es genéticamente único, lo que justifica iniciar acciones de conservación comprometidas en la RCA 276/2015 para ambas especies.

‐ No hay señales significativas de divergencia genética entre las zonas en las que se dividió el área de estudio para Guayacán y Algarrobo lo que indica un estado optimo de conectividad vía flujo génico.

‐ La detección de alelos privados en ambas especies permitió identificar individuos prioritarios para la conservación y deberían formar parte de futuros esfuerzos de conservación de acuerdo a la RCA 276/2015.

30 H. Referencias

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32 I. Anexos

Anexo 1. Informe de Colecta Guayacán y Algarrobo. ECORES, Diciembre 2016. Anexo 2. Archivo Digital. Incluye KMZ y Base de Datos. Anexo 3. PCH SSR Report2.doc (informe sobre la validación de los nuSSR desarrollados para Porlieria chilensis. Anexo 4. Matriz básica de datos Algarrobo.xlsx Anexo 5. Matriz básica de datos Guayacán.xlsx

Foto Google Earth del 30 de octubre de 2014

Foto Google Earth del 23 de mayo de 2015

Foto Google Earth del 29 de enero de 2016

Foto Google Earth del 11 de febrero de 2017

Foto Google Earth del 11 de febrero de 2017 (acercamiento)