Lepidoptera: Tischerioidea) Ir Elachistidae (Lepidoptera: Gelechioidea) Drugių Biocheminėje Sistematikoje
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS Brigita Paulavičiūtė MOLEKULINIŲ ŽYMENŲ PANAUDOJIMAS TISCHERIIDAE (LEPIDOPTERA: TISCHERIOIDEA) IR ELACHISTIDAE (LEPIDOPTERA: GELECHIOIDEA) DRUGIŲ BIOCHEMINĖJE SISTEMATIKOJE DAKTARO DISERTACIJA FIZINIAI MOKSLAI, BIOCHEMIJA (04P) Kaunas, 2010 Disertacija rengta 2006-2009 m. Vytauto Didžiojo universitete Mokslinis vadovas: Prof. dr. Algimantas Paulauskas (Vytauto Didžiojo universitetas, fiziniai mokslai, biochemija − 04P) Konsultantas: Prof. dr. Virginijus Sruoga (Vilniaus pedagoginis universitetas, biomedicinos mokslai, zoologija − 05B) 2 TURINYS ĮVADAS 5 1 LITERATŪROS APŽVALGA 9 1.1 Tischeriidae ir Elachistidae – taksonominės entobiontinių vabzdžių grupės, turinčios ypatingą teorinę ir praktinę reikšmę 9 1.1.1 Ontogenetinių vystymosi stadijų ypatumai 9 1.1.2 Tischeriidae šeimos drugių tyrimai 21 1.1.3 Elachistidae šeimos drugių tyrimai 22 1.2 Molekulinių tyrimo metodų taikymas entomologijoje 23 1.2.1 Fluorescencinis in situ hibridizacijos metodas (FISH) 24 1.2.3 Allozimų ir izoenzimų elektroforezės metodas 24 1.2.4 Pirštų antspaudų metodas (DNR fingerprinting) 25 1.2.5 Restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (RFLP) metodas 25 1.2.6 Atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcijos (RT- PCR) metodas 25 1.2.7 Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmo metodas (AFLP) 26 1.2.8 Atsitiktinai amplifikuotos polimorfinės DNR metodas (AAPD) 26 1.2.9 Mikrosatelitų tyrimo metodas 26 1.2.10 Ribosominės DNR tyrimo metodas 27 1.2.11 Branduolio DNR tyrimai 27 1.2.12 Mitochondrinės DNR tyrimai 28 2. MEDŽIAGA IR METODIKA 30 2.1 Tyrimų medžiaga 30 2.1.1 Medžiagos rinkimo vietovės 30 2.1.2 Medžiagos rinkimo metodai 36 2.1.3 Drugių identifikavimas 37 2.1.4 Reagentai 39 2.2 Molekuliniai tyrimo metodai 40 2.2.1 DNR išskyrimas 40 2.2.2 Elachistidae drugių AAPD tyrimai 43 2.2.2.1 APPD tyrimams naudoti žymenys 43 2.2.2.2 APPD molekulinių žymenų polimerazės grandininė reakcija (PGR) 44 2.2.2.3 DNR elektroforezė agarozės gelyje 45 3 2.2.3 Specifinių molekulinių žymenų polimerazės grandininė reakcija (PGR) 46 2.2.4 PGR fragmento kirpimas ir valymas 47 2.2.5 Sekvenavimas 50 2.2.5.1 Fragmentų gausinimas su ABI PRISM BigDye reakcijos mišiniu 51 2.2.5.2 ABI PRISM BigDye produkto išvalymas 51 2.2.5.3 Kapiliarų elektroforezė ABI PRISM 310 sekvenatoriuje 51 2.2.5.4 Statistinė ir duomenų analizė 52 3. REZULTATAI JŲ APTARIMAS 54 3.1 DNR išskyrimo problematiškumas 54 3.2 Mitochondrinės DNR COI geno sekų analizė 55 3.2.1 Tischeriidae šeimos drugių COI geno sekos 55 3.2.2 Tischeriidae rūšių polimorfizmas 68 3.2.3 Elachistidae šeimos drugių sekos 76 3.2.4. Elachistidae rūšių grupių polimorfizmas 93 3.3 Elachistidae šeimos populiaciniai tyrimai APPD metodu 105 IŠVADOS 110 AUTORĖS PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS 112 PADĖKA 114 LITERATŪROS SĄRAŠAS 115 4 ĮVADAS Tyrimų objektas – filogenetiškai vieni primityviausių (ir teoriniu požiūriu vieni svarbiausių bei įdomiausių) drugių būrio atstovai, jungiantys giminiškas šeimas: Tischeriidae ir Elachistidae. Šios šeimos plačiai paplitusios tiek Baltijos regione, tiek visame pasaulyje, joms priklauso vieni mažiausių Žemėje mikro drugiai, kurie išsiskiria ne tik archaiška sandara, bet ir labai didele specializacija. Dėl stenofagijos tendencijų, sėslaus gyvenimo būdo ir endemizmo šie smulkūs vabzdžiai yra vieni iš objektų, charakterizuojančių tiriamo biomo biologinės įvairovės turtingumą, gamtinius ryšius, kilmę ir filogeografijos ypatumus. Tačiau šių, praktinę ir teorinę reikšmę turinčių, vabzdžių tyrimų duomenų (tiek Baltijos regiono, tiek kitų pasaulio regionų) nepakanka (Puplesis, Diškus, 2003; Lees, Stonis, 2007; Stonis, Diškus, 2007, 2008). Minuojantis gyvenimo būdas – svarbi primityvių Microlepidoptera biologinė adaptacija, suteikusi šiems vabzdžiams daug privalumų. Tai ir maitinimasis labai koncentruotu maistu, temperatūros režimo optimizacija, geresnė apsauga nuo natūralių priešų, mechaninio aplinkos poveikio ir kt. Tačiau perėjus prie entobiontinio gyvenimo būdo, sumažėjo ekologinis plastiškumas. Minuojantys drugiai yra labai „patogus“ objektas bendriems biogeografiniams tyrimams. Jie paplitę beveik visose svarbiausiose sausumos ekosistemose, yra labai įvairūs, gana sėslūs ir palyginti lengvai pastebimi ir tyrinėjami (Puplesis, Diškus, 2003). Iki šiol molekulinių tyrimų su šiais drugiais atlikta ypač mažai, todėl visi publikuoti apžvalginiai darbai (tiek Lietuvos autorių, tiek užsienio mokslininkų), iki šiol nesiremia molekulinių tyrimų duomenimis. Tischeriidae ir Elachistidae tai gana smulkių drugių šeimos. Daugelio jų išskleistų sparnų ilgis siekia iki 6–13 mm. Šie drugiai paplitę visame pasaulyje, tačiau dauguma rūšių žinomos Borealiniame, Palearkties ir Neotropiniame regionuose. Daugelis Tischeriidae ir Elachistidae rūšių išoriškai yra panašios ir sunkiai atskiriamos, todėl pagrindinis dėmesys apibūdinant rūšį skiriamas patinų genitalijų struktūrai. Šių šeimų vikšrų gyvenimo būdas augalų audinių viduje vadinamas minavimu, o augalų asimiliaciniuose audiniuose padaryti pažeidimai − minomis. Trofiškai Tischeriidae yra susiję su augalais, priklausančiais Fagaceae, Rosaceae, Rhamnaceae, Tiliaceae, Malvaceae ir Asteraceae šeimoms. Tik pavienės rūšys registruotos kaip Combretaceae, Sterculiaceae, Euphorbiaceae, Ericaceae, Anacardiaceae, Theaceae, Hypericaceae ir Apocynaceae šeimų augalų minuotojos. Vidutinėse platumose vyrauja rūšys, trofiškai susijusios su augalais, priklausančiais Rosaceae, Fagaceae ir Asteraceae šeimoms (Puplesis, Diškus, 2003). Elachistidae šeimai būdinga siaura trofinė specializacija. Dauguma rūšių minuoja 3 šeimų augalus: Poaceae, Cyperaceae ir Junaceae. Tačiau kai kurios rūšys minuoja Caprifolaceae ir Boraginaceae šeimų augalų lapus (Sruoga, Ivinskis, 2005). Nors Tischeriidae ir Elachistidae nėra laikomi kultūrinių augalų kenkėjais, tačiau 12 rūšių buvo 5 įtrauktos į Rusijos ir aplinkinių kraštų kultūrinių augalų kenkėjų sąvadą (Kuznetzov, 1994) kaip potencialūs kenkėjai. Mokslinėje literatūroje iki šiol yra mažai skelbtų darbų, nagrinėjančių Tischeriidae šeimą. Šiek tiek duomenų apie Tischeriidae šeimą galima rasti bendrosiose Lepidoptera faunos apžvalgose, taksonominiuose sąrašuose ir pavieniuose Tischeriidae drugių rūšių aprašuose. Iš visų publikacijų išsiskiria veikalas, revizuojantis Šiaurės Amerikos fauną bei pateikiantis daug apibendrintų duomenų apie morfologiją ir biologiją (Braun, 1972). D. R. Davis paskelbė Tischeriidae šeimos bendrąją charakteristiką (Davis, 1999). Remiantis Tischeriidae šeimos tyrimų duomenimis buvo parengta originali ir išsami šios šeimos charakteristika, pirmą kartą pateikta nagrinėjamo taksono kladistinė analizė ir filogenija bei žymiai pakeista iki šiol nusistovėjusi samprata apie Tischeriidae taksonominę struktūrą (Diškus, Puplesis, 2003). Elachistidae šeima tiriama apie 200 metų. Tačiau duomenys apie daugelį šios šeimos rūšių yra fragmentiniai ir negalutiniai. Daug likusių neaiškumų reikia atskleisti, tikslinti ar patvirtinti išsamesniais tyrimais. Europos Elachistidae drugių biologijos ypatumai tyrinėjami jau nuo XX a. antrosios pusės (Stainton, 1858, 1878; Warren, 1878; Fletcher, 1887) To laikmečio darbai daugiausiai skirti atskirų Elachistidae rūšių mitybiniams ryšiams apžvelgti, juose pateiktos ir fragmentinės pastabos apie jų biologiją. Didesnio dėmesio verti vėliau pasirodę E. M. Heringo darbai, tapę pagrindu tolimesniems minuojančių drugių tyrimams (Hering, 1925, 1927, 1935, 1951). Kai kurie faunistiniai duomenys apie šios šeimos drugius buvo apibendrinti keliose monografijose. 1977 metais išleista Traugott–Olsen ir Nielsen monografija apie mažųjų žolinukų šeimos drugius Šiaurinėje Europoje (Traugott-Olsen, Nielsen, 1977). Tai pirmasis veikalas Europoje, kuriame smulkiai aprašyta ši mikrodrugių šeima. Autoriai atskleidė jų morfologiją, biologiją, paplitimą šiaurės Europoje. Monografijoje pateikti Elachistidae šeimos drugių patinų ir patelių genitalijų piešiniai, kurie yra labai svarbūs rūšių diagnostikai. 2005 metais Lietuvos entomologai V. Sruoga ir P. Ivinskis išleido monografiją „Lietuvos elachistidai (Lepidoptera: Elachistidae)“ (Sruoga, Ivinskis, 2005). Knygoje autoriai pateikia drugių morfologijos ypatumus, patinų ir patelių genitalijų struktūrų piešinius, biologiją, informaciją apie minuojamus augalus ir paplitimą. Tischeriidae ir Elachistidae drugiai paplitę visame pasaulyje, iš viso yra žinoma 111 Tischeriidae šeimos rūšių ir 630 Elachistidae šeimos rūšių, tačiau jų ištyrimo lygis yra vis dar netolygus ir labai nepakankamas. Molekuliniai DNR tyrimo metodai šių šeimų (ir filogenetiškai artimų šeimų) rūšims anksčiau nebuvo taikomi. Tik 2006 m. pasirodė publikacija apie molekulinių metodų taikymą Elachistidae šeimoje, tyrinėjant Australijos fauną (Kaila, Ståhls, 2006), o 2010 m. Erik J. van 6 Nieukerken pateikė pirmąsias Tischeria ptarmica Meyrick, 1908 citochromo c oksidazės I geno (COI) sekas (Nieukerken, 2010). Darbo tikslas: ištirti ir pritaikyti molekulinius DNR žymenis Tischeriidae (Lepidoptera: Tischerioidea) ir Elachistidae (Lepidoptera: Gelechioidea) drugių biocheminėje sistematikoje. Darbo uždaviniai: 1. Tischeriidae ir Elachistidae šeimų drugiams pritaikyti molekulinius tyrimo metodus, jau anksčiau taikytus kitose sistematinėse grupėse; 2. Nustatyti kiekvienai tirtai rūšiai specifines citochromo c oksidazės geno (COI) sekas bei deponuoti gautas DNR sekas genų banke; 3. Atlikti naujai išaiškintų molekulinių Tischeriidae ir Elachistidae duomenų (NJ medžių) ir ankščiau publikuotų kladogramų, sudarytų remiantis vien tradiciniais, morfologiniais ir ekologiniais požymiais lyginamąją analizę; 4. Įvertinti Elachistidae