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Predicción de la actividad antihelmíntica empleando el método TOMOCOMD- CARDD

Autora: Yusleidy Ramírez Mederos

Tutores: Dr. Yovani Marrero Ponce MSc. Luis A. Torres Gómez Lic. Juan A. Castillo Garit

Santa Clara, 2007

“A veces se trabaja toda una vida para avanzar apenas un metro, pero así crecieron las grandes montañas, avanzando siglo a siglo, metro a metro“

A los que han caminado conmigo alguna hora, algún minuto, a lo largo de este camino, a los que me han ayudado a caminar: Desde mi corazón…GRACIAS!!! RESUMEN

El objetivo fundamental de este estudio fue desarrollar relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR) para la clasificación y la predicción de la actividad antihelmíntica, de manera que permitiera el desarrollo de procesos de tamizaje (screening) virtual. Para desarrollar las funciones discriminantes se empleó una data de 547 compuestos dividida en serie de entrenamiento (SE) y serie de predicción (SP) una familia de descriptores moleculares (DMs) TOMOCOMD-CARDD. Se empleó un análisis de “pasos-hacia-delante” como método de selección de variables y el análisis discriminante lineal (ADL) fue usado para obtener modelos que discriminan entre compuestos activos e inactivos. Los modelos obtenidos usando los índices bilineales no estocásticos y estocásticos clasifican correctamente 86.36% y del 87.50%, de los compuestos en las SE, respectivamente. Para corroborar la robustez y el poder predictivo de los modelos encontrados, se empleó una serie de validación externa obteniéndose una buena clasificación global de 84.24% (no estocástico) y 80.00% (estocástico). Para obtener conclusiones preliminares acerca del posible modo de acción de los compuestos antihelmínticos otros dos modelos fueron desarrollados. Estos modelos permiten la correcta clasificación del 92.11% y 94.74% de los compuestos incluidos en la SE, para los modelos no estocástico y estocástico, respectivamente; alcanzando un 84.21% de buena clasificación global en la SP externa para ambos casos. Los parámetros obtenidos para los dos modelos son similares a los obtenidos con otras familias de DMs del mismo programa. Estas aproximaciones permiten obtener una adecuada explicación de la actividad antihelmíntica basado en rasgos estructurales evidenciando el rol preponderante de los enlaces de hidrógenos, la presencia de heteroátomos y de las propiedades relacionadas con el tamaño molecular en las interacciones con los sitios dianas antihelmínticos. Finalmente, los modelos desarrollados fueron usados en ensayos virtuales de grandes bases de datos de compuestos químicos identificándose como antihelmínticos a varios de ellos. Estos resultados muestran que los índices bilineales pueden predecir satisfactoriamente la actividad antihelmíntica y sugiere que el método propuesto es una buena herramienta para el estudio de las propiedades biológicas de candidatos a fármacos durante el proceso de descubrimiento de los mismos.

ÍNDICE

I INTRODUCCIÓN 1

II REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1 Helmintos, su clasificación. 5

2.2 Modo de Acción de Drogas Antihelmínticas 9

2.2.1 Receptores Acetilcolina Nicotínico 9

2.2.2 Inhibidores Colinesterásicos:Organofosforados 12

2.2.3 Agonista GABA (Piperazina) 12

2.2.4 Potenciadores del Receptor de Glutamato 13

2.2.5 Permeabilidad del Calcio Aumentada 13

2.2.6 Protón Ionóforo: Salicylanilidas, Bisfenoles y Fenoles Sustituidos 15

2.2.7 La Inhibición de Formación del Microtúbulo, Unión a b-Tubulina 16

2.2.8 Inhibición del Metabolismo del Malato (Diamfenetida) 18

2.2.9 Inhibición de la Quinasa y Mutasa del 1,3-Difosfoglicerato 18

2.2.10 Dietilcarbamazina 19

III MATERIALES Y MÉTODOS 21

3.1 Generalidades 21

3.2 Base de Datos de los Compuestos Usados en la Obtención de los Modelos QSAR. 21 3.3 Cálculos de Parámetros o Índices Moleculares. TOMOCOMD Software. 23

3.4 Análisis Estadístico de los Datos. Desarrollo de Funciones Discriminantes usando ADL 26

IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29

4.1 Desarrollo de Modelos Usando ADL. 29 Desarrollo de Funciones Discriminantes para la Actividad 4.1.1 Antihelmíntica. 29 Índice

4.1.2 Desarrollo de Funciones Discriminantes para la Predicción del Posible Modo de Acción Antihelmíntico. 38

4.2 Interpretación en Términos Estructurales de los Modelos Obtenidos. 41 4.2.1 Análisis de la Naturaleza de las Variables Incluidas. 41

4.3 Virtual screening: Una Promisoria Alternativa para la Selección y el Diseño Racional de Fármacos Antihelmínticos. 42

V CONCLUSIONES 49

VI RECOMENDACIONES 50

VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 51

ANEXOS

I- INTRODUCCIÓN

La búsqueda de compuestos antihelmínticos vuelve a estar en el ‘desktop’ de la química médica debido a dos causas fundamentales: 1) El surgimiento y el incremento en frecuencia de la resistencia a los fármacos antihelmínticos [1] y 2) El alto número de países, y personas afectadas por alguna de las enfermedades “tropicales” causadas por alguna de las especie de helmintos patógenos que afectan al hombre y a los animales domésticos [2]. En este sentido, aunque la resistencia a determinados compuestos antihelmínticos ha ocurrido, todavía esta situación no es considerada como un problema clínico-terapéutico. No obstante, es alarmante el hecho de que desde hace más de 20 años no se comercializan productos nuevos; así por ejemplo desde el 1980 no se ha comercializado ningún fármaco fasciolicida y no existen tampoco compuestos nuevos bajo estudio [3]. En adición, las infecciones helmínticas siguen siendo un problema médico y de salud pública a gran escala en humanos y animales domésticos que pueden causar grandes pérdidas económicas en zonas donde existen áreas extensas para el pastoreo de animales [4]. En la Tabla 1.1 se muestran algunos ejemplos de resistencia a fármacos antihelmínticos. Además, más de la mitad de la población está en riesgo de adquirir alguna enfermedad tropical, fundamentalmente malaria, lepra, schistosomiasis, filariasis linfática, onchocerciasis, enfermedad de Chagas, Tripasonomiasis africana y lesmaniasis, y mas de 500 millones de personas están infestadas con al menos una de estas enfermedades. En la Tabla 1.2 se muestra el estimado global de la población en riesgo e infestada con enfermedades tropicales [2]. Como se puede observar, tres de las enfermedades que más azota al hombre son causadas por especies helmínticas (Schistosomiasis, Filariasis linfática y Onchocerciasis). En la actualidad, las pérdidas económicas en la producción de animales y las enfermedades humanas provocadas por estos parásitos aportan un ímpetu adicional para la búsqueda de nuevos agentes antihelmínticos. El indiscriminado e intensivo uso de estas drogas para el control de los parásitos helmintos ha propiciado y propiciará el desarrollo de resistencia.

1 Introducción

Tabla 1.1 Resistencia a Fármacos Antihelmínticos Huésped Parásito Fármaco Huésped Parásito Fármaco Humanos Schistosoma Oxamniquine Ovejas y Trichostron- Benzimidazoles [5, 6] Praziquantel Cabras gylids [7, 8] Levamisol Tetrahidropyri- midinas Lactonas macrocíclicas Hookworms Tetrahidropyrimidinas Fasciola [7, Benzimidazoles [9, 10] 11, 12] Triclabendazol Closantel Ganado Trichostron- Benzimidazoles Caballo Small Benzimidazoles gylids [7, 8] Lactonas macrociclicas Strongyles [7, Tetrahidropyri- 8] midinas Piperazina Cerdos Oesophagosto Benzimidazoles mum [7, 8] Lactonas macrocíclicas Tetrahidropyrimidinas

Nuevas entidades químicas con actividad antihelmínticas serán necesarias en el futuro pero el alto costo de desarrollo de un nuevo producto farmacéutico y el reducido mercado de este tipo de fármacos provoca que el desarrollo de estas sea lento. Dos soluciones son posibles y necesarias: 1) El uso del diseño de fármacos asistido por computadoras como alternativa ‘racional’ en la búsqueda de nuevos antihelmínticos y 2) El conocimiento de la bioquímica y fisiología del parásito para lograr encontrar o diseñar nuevos cabezas de serie que actúen de forma selectiva sobre dianas farmacológicas del parásito, aumentando el índice terapéutico y la probabilidad de que llegue a ser utilizado en la terapéutica. Lajines [13] y Estrada y col. [14] han reportado la alta incidencia en el uso de nuevos descriptores moleculares para el desarrollo de modelos QSAR (Acrónimo de Quantitative Structure-Activity Relationship) para el ‘screening’ ‘in silico’ de fármacos. En este sentido la definición de nuevos índices moleculares (ver Todeschini y Consonni para una exhaustiva compilación [15]) es un promisorio campo en la química médica y las ciencias veterinarias lo que permitiría el ahorro de tiempo y recursos para el descubrimiento de nuevos antihelmínticos En la pasada década, la industria farmacéutica reorientó sus estrategias de investigación en orden de dar más atención a los métodos que permiten la selección ‘racional’ o diseño de nuevos compuestos con propiedades deseadas [16-18]. Varios enfoques para el diseño de fármacos asistido por computadoras han sido introducidos en

2 Introducción

Tabla 1.2. Estimado Global de la Población en Riesgo e Infestada con Enfermedades Tropicales. Enfermedades Países afectados Población en riesgo Población infestada Tropicales Malaria 103 2 100 000 000 267 000 000 Leismaniasis 80 350 000 000 12 000 000 Tripanosomiasis 36 50 000 000 >100 000 Africana Enfermedad de Chagas 21 90 000 000 17 000 000 Schistosomiasis 74 600 000 000 200 000 000 Filariasis linfática 76 905 000 000 78 600 000 Onchocerciasis 34 90 000 000 17 600 000 Lepra 121 1 600 000 000 100 000 000 la literatura [19-22]. Todos estos enfoques están basados en la relación existente entre la estructura química y las propiedades moleculares (físicas, físico-químicas y biológicas). La exactitud y el alcance de estos métodos dependen de los descriptores moleculares que hayan sido seleccionados para caracterizar la estructura química y del uso apropiado de las técnicas estadísticas. Una de las mayores “metas” del diseño de fármacos asistido por computadoras y de las estrategias de descubrimiento es la identificación de pequeños subsistemas de un gran conjunto de compuestos químicos. Un subsistema es un número de compuestos formado por una variación significativa de una estructura original, la cual es referida como cabeza de serie (Lead compound). Estos subsistemas pueden ser obtenidos a través del procedimiento de ‘screening’ virtual [23] de grandes bases de datos o librerías de compuestos candidatos. En este sentido, el ‘screening’ virtual es reconocido como un filtro de una base de datos a través del uso de un enfoque computacional basado en la obtención de una o varias funciones discriminantes que permitan la selección de una serie de compuestos para ser evaluados experimentalmente [24].

Por todo lo anterior se plantea el siguiente problema científico: Existen en la literatura reportes concluyentes sobre la afectación cada vez más creciente que existe en el mundo subdesarrollado por los helmintos, por lo que cada vez se hace mas necesario encontrar nuevas moléculas capaces de combatirlas de manera más eficaz y menos costosa.

3 Introducción

Como vía para solucionar el problema científico se formula la siguiente hipótesis: El uso combinado del enfoque TOMOCOMD-CARD y técnicas de informática química permiten el desarrollo de modelos de clasificación lo suficientemente robustos y con un poder predictivo tal que permiten la identificación y selección de nuevos compuestos químicos con actividad antihelmíntica.

Para cumplimentar la anterior hipótesis y dar respuesta a la problemática científica planteada, se proponen los siguientes objetivos: 9 Conformar una base de datos de compuestos químicos a los cuales se les haya reportado actividad contra cualquier tipo de clase o género de helminto y clasificarlos según su modo de acción. 9 Obtener y validar funciones discriminantes que permitan predecir la actividad antihelmíntica y estimar el modo de acción de nuevas entidades químicas potencialmente bioactivas empleando una nueva familia de descriptores moleculares TOMOCOMD-CARDD. 9 Interpretar en términos estructurales los modelos encontrados. 9 Desarrollar un ‘screening’ virtual usando los modelos encontrados para identificar nuevos subsistemas moleculares.

4 II- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

FÁRMACOS ANTHELMÍNTICOS Y MODO DE ACCIÓN. 2.1 Helmintos, su clasificación. La helmintiasis o infestación por gusanos, es una de las enfermedades más predominantes en el mundo. Las infecciones causadas por estos vermes parásitos, tienen distribución cosmopolita y en el planeta afectan a más de 2000 millones de personas. La situación parece empeorar en cuanto al número de personas afectadas y a las áreas del mundo invadidas [2]. En las regiones tropicales, en las que es máxima su prevalencia, es frecuente la infestación simultánea con varios tipos de helmintos. Aún más, mediante los viajes y la migración humana los vermes se diseminan a sitios geográficos donde no se conocía al organismo en particular. Varios gusanos parasitan en el hombre, que puede sufrir una infestación toda su vida. Los vermes patógenos en seres humanos son los metazoos clasificados por costumbre en vermes redondos (nemátodos) y dos tipos de vermes planos: Duelas (tremátodos) y tenias (céstodes). En la Tabla 2.1 se muestra la clasificación actual de los parásitos helmintos. Estos macroparásitos, biológicamente heterogéneos, muestran variación en sus ciclos vitales, estructura corporal, desarrollo fisiológico, localización en el huésped y sensibilidad a quimioterápicos. Las formas inmaduras invaden al organismo de seres humanos por piel o vías gastrointestinales y evolucionan hasta transformarse en vermes adultos perfectamente diferenciados que poseen distribuciones tisulares características. Con unas cuantas excepciones, como Estrongiloides y Equinococcus, los organismos en cuestión no completan su ciclo vital, es decir, muestran réplicas por si mismos, dentro el huésped humano. Por tal motivo, la magnitud de la exposición a dichos parásitos es el elemento que rige la intensidad de la infección y la disminución del número de organismos adultos por medio de quimioterapia, es un hecho sostenido salvo que halla reinfeccción. En la Figura 2.1 se muestra a modo de ejemplo el ciclo biológico de la fasciola hepática (Duela o Fluke). La prevalencia de helmintos parásitos muestra de

5 Revisión Bibliográfica

Tabla 2.1 Clasificación de los Parásitos Helmintos. Superfamilia Familia Géneros Phylum Nemathelmintes Clase Nematoda (Roundworms) Ascaridoidea Anisakidae Toxocara Ascaridae Ascaris, Toxocaris, Parascaris Ascaridiidae Ascaridia Oxyuroidea (Pinworms) Oxyuridae Oxyuris, Enterobius, Skrjabinema, Passalurus, Dermatoxys Cosmocercidae Probsmayria Heterakidae Heterakis Subuluridae Subulura Metastrongyloidea (Lungworms) Metastrongylidae Metastrongylus Protostrongylidae Muellerius, Protostrongylus, Cystocaulus, Odocoileostrongylus Crenosomatidae Crenosoma Filaroididae Aleurostrongylus, Filaroides Spiruroidea Spiruridae Habronema, Draschia, Physocephalus, Ascarops, Gongylonema, Tetramer (Tropisurus) Thelaziidae Thelazia, Oxispirura Acuariidae Physaloptera, Dispharnyx, Cheilospirura (Acuaria), Spirocerca, Gnathostoma Trichostrongyloidea (Hair-likeworms) Trichostrongylidae Trichostrongylus, Haemonchus, Ostertagia, Cooperia, Marshallagia, Pseudostertagia, Teladorsagia, Nematodirus, Hyostrongylus, Obeliscoides, Graphydium, Mecistecirrus, Ornithostrongylus Heligmonsomatidae Nematospiroides Amidostomatidae Amidostomum Ollulanidae Ollulanus Dictyocaulidae Dictyocaulus Rhabditoidea Strongiloididae Strongiloides Strongiloidea Strongilidae Strongylus, Alfortia, Delafondia, Triodontophorus, Oesophagodontus, Cyatostomum Trichonematidae Oesophagostomum Ancylostomatidae Ancylostoma, Uncinaria, Necator, Bunostomum. Stephanuridae Stephanurus Syngamidae Syngamus (Mammonogamus) Chaberiinae Chabertia Filaroidea Filariidae Parafilaria Setariidae Setaria, Stephanofilaria Onchocercidae Onchocerca, Dipetalonema, Elaeophora, Wuchereria, Mansonella, Loa, Brugia, Dirofilaria Dracunculoidea Dracunculidae Dracunculus Trichuroidea Trichuridae Trichuris Capillaridae Capillaria Trichinellidae Trichinella Dioctophymoidea Dioctophymatidae Dioctophyma

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Tabla 2.1. Cont. Superfamilia Familia Géneros Phylum Plathelminthes (Tapeworms) Clase Cestoda Pseudophyllidea Diphyllobothriidae Diphyllobothrium, Spirometra Cyclophyllidea Davaineidae Davainea, Raillietina Anoplocephalidae Anoplocephala, Paranoplocephala, Moniezia, Thysanosoma, Avitellina, Stilesia, Thysaniezia, Bertiella, Aporina Mesocestoidae Mesocestoides Dilepididae Dipylidium, Choanotaenia, Metroliasthes, Amoebotaenia Hymenolepididae Hymenolepis Taeniidae Echinococcus, Taenia Clase Trematoda (Flukes) Digenea Fasciolidae Fasciola, Fascioliodes, Fasciolopsis Paramphistomatidae Paramphistomum Dicroeliidae Dicrocoelium, Eurytrema, Platynosomum Opistorchiidae Opistorchis, Amphimerus, Metorchis, Parametorchis Echinostomatidae Echinostoma, Echinoparyphium, Artyfechinostomum, Echinochasmus Schistosomatidae Schistosoma, Austrobilharzia, Heterobilharzia, Ornitobilharzia, Gigantobilharzia, Trichobilharzia Strigeidae Apatemon, Cotylurus Plagiorchiidae Prosthogonimus Troglotrematidae Collyriclum, Nanophyetus, Paragonimus Heterophyidae Heterophyes, Metagonimus, Cryptocotile, Phagicola Diplostomatidae Alaria Brachilaimidae Brachilaime Notocotylidae Notocotylus, Catatropis .

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Figura 2.1 Ciclo biológico de la Fasciola Hepática.

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de manera característica una distribución binomial negativa en la población infestada, de modo que un número relativamente pequeño de personas portan cantidades importantes de parásitos. Sin tratamiento, los sujetos en cuestión probablemente mostrarán signos de enfermedad y perpetuarán la infección a su comodidad. Los antihelmínticos son fármacos que actúan en forma local para expulsar los vermes del tubo digestivo o, a nivel sistémico, para erradicar los helmintos adultos o las formas intermedias (de desarrrollo) que invaden órganos y tejidos. Seguidamente haremos una descripción de los principales mecanismos propuestos para la actividad antihelmíntica de los principales compuestos químicos utilizados en terapéutica. 2.2 Modo de Acción de Drogas Antihelmínticas Existen dos modos de acción fundamentales de los compuestos con actividad antihelmíntica. Hay fármacos que actúan en canales de iones en la membrana del parásito los cuales tienen un rápido efecto terapéutico; el otro grupo actúa lentamente en un rango de sitios dianas ‘bioquímicos’ encontrados en los parásitos helmintos. La Tabla 2.2 sumariza los sitios ‘target’ de los antihelmínticos que actúan en los canales de iones de membrana. Estos ‘target’ de canales de iones incluyen: El receptor –excitatorio- nicotínico de acetilcolina en el músculo de los nemátodos; el receptor del ácido γ- aminobutírico (GABA) también presente en el músculo de los nematodos; y canales de cloro estimulados por el glutamato. En la Tabla 2.2 también se resume el modo de acción de los antihelmínticos que actúan en la mayoría de los sitios dianas ‘bioquímicos’. A continuación se describe el modo de acción de las principales drogas utilizadas en clínica. 2.2.1 Receptores Acetilcolina Nicotínico En la Figura 2.2 se muestran la estructura química de los fármacos antihelmínticos nicotínicos. Estos son imidazotiazoles (levamisol y butamisol); tetrahidropirimidinas (pirantel, morantel y oxantel); sales de amonio cuaternario (befenium y tenium) y pirimidinas (metiridina). Estos compuestos actúan selectivamente como agonistas de los receptores acetilcolina nicotínicos sinápticos y extrasinápticos en células del músculo de nemátodos y produce contracción y parálisis espástica. El efecto electrofisiológico del levamisol, pirantel, morantel y oxantel se ha estudiado en gran detalle.

9 Revisión Bibliográfica

Tabla 2.2. Principales Sitios ‘Target’ de Fármacos Antihelmínticos. Sitio ‘Target’ (y grupo de parásito) Nombre genérico del fármaco Sitios dianas constituidos por canales de iones Receptor de acetilcolina (en nemátodos) Levamisol, Butamisol, Pyrantel, Morantel, Befenium, Tenium, Metyridina. Receptores GABA (en los intestinos de nemátodos) Piperazina Receptores Glutamato-Cl- (en nemátodos y Ivermectin, Abamectin, Doramectin, Moxidectin parásitos insectos) Permeabilidad de la membrana al calcio (en Praziquantel céstodes y tremátodos) Sitios dianas que no estan constituidos por canales de iones β-Tubulina (en nemátodos) Tiabendazol, Cambendazol, Oxibendazol, Albendazol, Albendazol sulfoxido. β-Tubulina (en nemátodos, céstodes y tremátodos) [ Febendazol, Oxfendazol, Mebendazol, Flubendazol, Febantel, Netobimin, Tiofanate, Triclabendazol Protón ionóforo (efectivo contra Flukes, Closantel, Rafoxanide, Oxiclozanida, Brotianida, Haemonchus contortus, Oestrus ovis) nitroxynil, niclofolan, Hexaclorofeno, Dibromosalan, Niclosamida. Metabolismo del malato (en fasciola inmadura) Diamfenetide Fosfoglicerato kinasa y mutasa Clorsulon Metabolismo del ácido araquidónico y inmunidad Diethylcarbamazina innata del huésped (efectivo contra filaria)

‰ Efecto electrofisiológico de antihelmínticos nicotínicos en nemátodos Mediciones intracelulares hechas con micropipetas en los músculos del cuerpo del Ascaris suum han mostrado que la aplicación de un baño de tetramisol, o de mezcla racémica D/L del levamisol, produce despolarización de la membrana, un aumento en la frecuencia y contracción del músculo [25]. El pirantel y sus análogos también producen despolarización, aumenta la actividad y contracción cuando se aplica al músculo del Ascaris, que sugiere que estos compuestos tienen un común modo de acción [26]. Se han usado microelectrodos para examinar los cambios en la conductancia de la membrana del músculo en Ascaris producido por acetilcolina, levamisol, pirantel y morantel [27]. Estos antihelmínticos han sido muestra para aumentar la conductancia de la membrana y despolarizar la misma abriendo de forma no-selectiva los canales iónicos que son permeables al Na+ y al K+.+. La aplicación simultánea de acetilcolina y pirantel mostró que ambos agonistas actuaron en los mismos receptores nicotínicos, y la potencia relativa del antihelmíntico en experimentos de aplicación de baño era: morantel = pirantel > levamisol > acetilcolina

10 Revisión Bibliográfica

Butamisol Levamisol

O N HN N S N

N S

Pirantel Morantel Oxantel

CH3 CH CH3 3 N N N HO

N H3C N S S H3C N Tenium

CH3 Metiridine O S N N O CH3 CH3

Befenium

CH3 O N

CH3 Figura 2.2.Estructura Química de Antihelmínticos Nicotínicos.

Además de los efectos del antihelmíntico en la conductancia de la membrana del músculo, Harrow y Gration [27] describieron la curva dosis-respuesta de la conductancia para el pirantel y morantel conocida como "campana invertida". El efecto de esta relación de concentración-efecto es el aumento de la conductancia-respuesta disminuyendo después la concentración de la elevación de antihelmíntico (dosis óptima). Una explicación para este fenómeno es el bloqueo de los canales abiertos por el antihelmíntico. El levamisol, pirantel, morantel y oxantel son cationes orgánicos grandes y podrían entrar en el canal iónico nicotínico del exterior y al tratar de atravesar los canales como Na+ o iones K+ producen el bloqueo en la región estrecha del canal, el filtro de selectividad. Este bloqueo sería sensible al voltaje y aumentaría con hiperpolarización de la membrana y concentración del antihelmíntico [28].

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2.2.2 Inhibidores Colinesterásicos: Organofosforados Los compuestos como el diclorvos y haloxon son anticolinesterásicos organofosforados selectivos (Figura 2.3) y tienen una acción antihelmíntica, así como insecticida. El modo de acción de estos compuestos es bloquear la acción de la enzima del parásito, acetilcolinesterasa, elevando excesivamente la concentración del neurotransmisor acetilcolina. Este modo de acción también predispone la toxicidad en el animal hospedero donde las enzimas acetilcolinesterasa también están presentes. En este sentido, como combinaciones selectivas de los agentes antihelmínticos + insecticidas (avermectins y milbemycin) están disponibles, en la actualidad los compuestos organofosforados se usan en menor frecuencia. Aunque la acetilcolinesterasa es responsable de la ruptura de acetilcolina y está involucrada en el motor de acción de los nemátodos [29], esta también se secreta en el ambiente externo en grandes cantidades por Ascaris suum y otros nemátodos parasitarios. La función de la acetilcolinesterasa secretada reduce los efectos de acetilcolina del hospedero en el intestino, con el objetivo de disminuir la secreción glandular mucosal del hospedero. La identificación de la función de colinesterasa secretada por nemátodos parasitarios, y la habilidad para antagonizar esta enzima, puede llevar al uso aumentado de los anticolinesterásico en el futuro, facilitando la eliminación de nemátodos en el intestino. Diclorvos Haloxon

H3CO O O P O ClCH CH O Cl 2 2 P O O H3CO Cl ClCH2CH2O Cl

CH3 Figura 2.3. Estructura Química del Diclorvos y Haloxon. 2.2.3 Agonista GABA (Piperazina) La piperazina tiene un anillo heterocíclico sin un grupo carboxílico (Figura 2.4). A pesar de esto, actúa sobre el mismo receptor que el ácido γ-aminobutírico, el cual esta ligado a canales de Cloro encontrados en la membrana simpática y extrasimpática del músculo de nemátodos [30, 31]. La aplicación de GABA o piperazina abre el canal de Cl-

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GABA Piperazina H N HOOC NH2 N H Figura 2.4. Estructura Química de GABA y Piperazina

, hiperpolariza el potencial de membrana, incrementa la conductancia de la misma y produce una relajación del músculo del cuerpo y parálisis flácida (reducción en la excitabilidad). La piperazina es eficaz contra los nemátodos intestinales grandes, en presencia de un alto porcentaje de CO2. Las moléculas de CO2 pueden interactuar con el anillo heterocíclico de la piperazina y pueden sustituirse por el grupo carboxílico del GABA [32]. 2.2.4 Potenciadores del Receptor de Glutamato El ivermectin, al igual que otros antibióticos lactónicos macrocíclicos (Figura 2.5), son compuestos de amplio espectro usados en el control de los parásitos nemátodos en animales y humanos [33]. Estas entidades químicas son utilizadas para el control de onchocerciasis (river blindness) en humanos y animales domésticos. El modo de acción del ivermectin es provocar una parálisis selectiva del parásito por incremento de la permeabilidad a iones cloro en el músculo. No obstante, la diana farmacológica de estos compuestos todavía es un tema muy controvertido [34]. El efecto de esos fármacos a bajas concentraciones es potenciar el efecto del glutamato y a altas concentraciones abrir los canales de cloro asociados con el receptor de glutamato directamente. El efecto terapéutico selectivo del avermectin y sus análogos podría ser explicado por acción en estos receptores, los cuales no están presentes en los hospederos. 2.2.5 Permeabilidad del Calcio Aumentada En la Figura 2.6 se muestra la estructura química del praziquantel y del epsiprantel. El efecto tóxico del praziquantel en Schistosomas parásitos han sido estudiados extensivamente [35, 36]. Muchas acciones de estos compuestos pueden ser explicadas por la permeabilidad del Ca2+ aumentada en el músculo del parásito y / o membranas tegumentales.

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Ivermectin Milbemycin D

OCH3 H3CO O O O O O O HO H C O 3 R CH3 O O O O O HO HO O O OH OH Doramectin Moxidectin

OCH3 H3CO O O O O HO O O H3C O CH3 O O O O O HO HO O O OH OH Figura 2.5. Estructura química de ivermectin y otros compuestos relacionados.

2+ ‰ Efecto en la permeabilidad del Ca El praziquantel se conoce por aumentar la entrada de Ca2+ por el tegumento de Schistosoma y causar la contracción rápida del músculo del parásito. El efecto del mismo sobre la entrada de Ca2+ sugiere que los sitios de acción son los canales iónicos permeables al Ca2+ en la membrana del tegumento y célula del músculo. La contracción del Schistosoma se invierte si el praziquantel es removido. Puede concluirse que este fármaco aumenta la permeabilidad del Ca2+ por las membranas del parásito por vía de canales que no son activados por despolarización. Estos canales son farmacológicamente diferentes que los presentes en el animal hospedero [37].

14 Revisión Bibliográfica

Praziquantel Epsiprantel

O O

N N

N O N O

Figura 2.6. Estructura Química del Praziquantel y el Epsiprantel.

2.2.6 Protón Ionóforo: Salicylanilidas, Bisfenoles y Fenoles Sustituidos Las estructuras químicas de salicilamidas, bisfenoles y fenoles sustituidos muestran que cada uno de los compuestos antihelmínticos poseen un protón detectable (Figura 2.7). Estas moléculas son muy lipofílicas y tienen protones que se dirigen a las membranas, particularmente a la membrana.mitocondrial interna. La fosforilación oxidativa es el mecanismo por el cual la disminución de energía libre que acompaña a la transferencia de electrones NADH o FADH a lo largo de la cadena respiratoria, se acopla a la formación de los grupos fosfato de contenido energético elevado de ATP, en la membrana mitocondrial interna [38]. Este proceso lleva a los protones fuera de la matriz mitocondrial que produce una fuerza motriz del protón, debido al gradiente del pH y al potencial eléctrico trasmembrana. El ATP se sintetiza a partir de ADP cuando los protones fluyen a través de la matriz mitocondrial por un complejo enzimático. Este proceso de fosforilación oxidativa tiene lugar en el animal hospedero, así como en el helminto parasitario. Sustancias solubles lipídicas pueden llevar protones lanzándolos por la membrana interna de la mitocondria, desacoplando el flujo del protón y la fosforilación oxidativa para que la oxidación de NADH y FADH ya no se una a la producción de ATP y no puede continuar su producción. El nitroxinil, oxiclosanida y hexaclorofeno son algunos de los compuestos lipofílicos que son capaces de llevar protones por las membranas, y por consiguiente, desacoplar la fosforilación oxidativa. Se asume, que el mecanismo de acción del protón ionóforo es desacoplar selectivamente la fosforilación oxidativa en la mitocondria del parásito. Se ha observado, que la aplicación del closantel en F. hepática produce una reducción en el pH tegumental

15 Revisión Bibliográfica

Oxiclozanide Rafoxanida Cl Cl HO O OH O OH O Cl I N Cl N Cl Cl H H Cl OH Cl I Nitroxynil Disofenol

I CN I NO2 H H O O NO2 I

Niclofolan Hexaclorofeno Cl H O NO H H 2 O O Cl Cl

Cl O2N O H Cl Cl Cl Cl Figura 2.7 Estructura Química de H-ionóforos (También conocidos como desacopladores de la fosforilación oxidativa). Los protones disociables estan representados en rojo.

(6.8-6.5) cuando se midió con un electrodo intracelular [39]. Los intra-tegumental reducen el pH asociado con una reducción en la motilidad del parásito y podría explicar la acción anti-parasitaria de closantel [32, 37]. 2.2.7 La Inhibición de Formación del Microtúbulo, Unión a β-Tubulina La Figura 2.8 ilustra la estructura química de algunos ejemplos de benzoimidazoles y profármacos antihelmínticos. Este grupo antihelmíntico incluye: oxibendazol, albendazol, oxfendazol, flubendazol, triclabendazol, tiabendazol, mebendazol y fenbendazol. Estos tres últimos son de amplio espectro, teniendo una actividad contra los nemátodos gastrointestinales y en algunos casos a concentraciones más elevadas la acción es contra los tremátodos. Netobimin, febantel y tiofanate, son profármacos que se convierten en benzoimidazoles activos por procesos metabólicos en el animal hospedero para que sea el metabolito activo el responsable de la acción antihelmíntica. Es aceptado que el triclabendazol, uno de los mejores fármacos flukicidas,

16 Revisión Bibliográfica

Tiabendazol Triclabendazol H H Cl Cl N N N S S N S N

Febantel Albendazol

NHCO2CH3 H N N NHCO2CH3 NHCO2CH3 N NHCOCH2OCH3 H3CH2CH2CS

Figura 2.8. Estructura química de benzoimidazoles y profármacos antihelmínticos.

actúa por el mismo mecanismo de acción de los otros benzoimidazoles pero la explicación de la acción potente contra flukes es desconocida [40], pero puede estar relacionado con sus altos niveles de unión a proteínas plasmáticas. El mebendazol [41, 42] y flubendazol [42] inducen la pérdida de microtúbulos del citoplasma de los tegumentos y células intestinales de céstodos y nemátodos, y esto es seguido por una pérdida del transporte de las vesículas secretadas, una captación de glucosa disminuida y una utilización aumentada de glucógeno acumulado. En Ascaris, el mebendazol es captado por células faríngeas e intestinales el cual se encuentra en la fracción del citoplasma unido con proteínas que representan monómeros y dímeros de tubulina. La acción comienza cuando el deterioro de los microtúbulos de las células intestinales de Áscaris producía inhabilidad para recaptar la glucosa [43]. En adición, se a detectado que los benzoimidazoles antihelmínticos compiten con los sitios de unión de la [H3] colchicina en la β-tubulina, y la potencia de los benzoimidazoles correlaciona con la constante de disociación para la unión a la β-tubulina de nemátodos [44,45]. Los microtúbulos son organelos que realizan una gran variedad de funciones las cuales incluyen el movimiento de cromosomas durante la división celular, proveen el esqueleto estructural de la célula, movimiento de partículas celulares incluyendo metabolitos energéticos y exocitocis. Estos son encontrados en animales, hongos y bacterias [38].

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Los microtúbulos están compuestos por 2 proteínas de 450 aminoácidos cada una conocidas como α-y β-tubulina. La formación de microtúbulos es un proceso dinámico y implica la polimerización de la tubulina en el polo positivo y la despolarización en el otro polo (el polo negativo). Los microtúbulos entonces están formados por anillos de 13 moléculas de tubulina (6 α- y 7 β-alternando con anillos de 7α- y 6 β-tubulinas). El proceso de formación de microtúbulos puede ser inhibido por sustancias que se unen en el borde del polo positivo por donde ocurre la polimerización. Este proceso de inhibición es conocido como “camping”, y la colchicina, vimblastina, vincristina, los inhibidores mitóticos y los benzoimidazoles pueden unirse a este sitio inhibiendo la formación del microtúbulo. 2.2.8 Inhibición del Metabolismo del Malato (Diamfenetida) La diamfenetida (Figura 2.9) es más activa contra F. hepática inmadura en el hígado que contra Fasciola adulta en los conductos biliares [46]. La diamfenetida es un profármaco que es desacetilado en el hígado del hospedero a una forma activa que es el metabolito monoamino y el diamino [47]. Coles [47] y Edwards [48] describieron como el aminodiamfenetida produce una elevación de concentración del malato, un producto intermediario del metabolismo de la glucosa. Ellos no pudieron identificar una acción de la diamfenetida en una enzima particular en el camino de la glicólisis pero en un segundo artículo [49] sugirieron que era probable que el efecto en el malato fuera un efecto primario porque ocurrió temprano y antes del deterioro del parásito entero. La acción de la diamfenetida no fue esclarecida; pero el estudio de Edwards[49,50] mostró que su efecto bioquímico contrastó con el protón ionóforo (oxiclosanida) y parece involucrar efectos en el metabolismo del malato en Fasciola. 2.2.9 Inhibición de la Quinasa y Mutasa del 1,3-Difosfoglicerato El clorsulon es el 4-amino-6-tricloroetenyl-1,3-benzenedisulphonamida (Figura 2.9). Estructuralmente, este compuesto es similar a 1,3-difosfoglicerato [52-53] y por consiguiente, inhibe las enzimas fosfoglicerato quinasa y fosfoglicero mutasa de Fasciola inhibiendo consecuentemente la vía de Emden-Meyerhoff. Como resultado hay una inhibición selectiva de utilización de glucosa, acetato y formación del propionato. La inhibición de quinasa fosfoglicerato en Fasciola es competitiva con una Ki de 0.29 mm: el clorsulon inhibe competitivamente la unión del ATP y del 3-fosfoglicerato a la

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Dianfenetida

H3COCHN OCH2CH2OCH2CH2O NHCOCH3

Clorsulon Dietilcarbamazina Cl Cl C H NH2 2 5 H CN NCON Cl 3 C2H5 H2NO2S SONH2

Figura 2.9. Estructura Química de la Dianfenetida, el Clorsulon y la Dietilcarbamazina. fosfoglicerato quinasa. Schulman y col. [52] sugirieron que el grupo voluminoso en la posición 6 de clorsulon impide los cambios conformacionales en la enzima quinasa requeridos para la actividad. Existe también una buena correlación entre los valores de Ki para el antagonismo de fosfoglicerato quinasa de Fasciola para un rango de compuestos relacionados con el clorsulon y la potencia de estos compuestos como agentes fasciolicidas. Esta evidencia apoya el modo de acción sugerido. [32]. La inhibición de fosfogliceromutasa de Fasciola por el clorsulon fue estudiada por Schulman y Valentino [53]. Estos investigadores apuntaron que esta enzima requiere de 2,3-difosfoglicerato para la activación y la similitud del clorsulon con el difosfoglicerato podría explicar la inhibición de la enzima mutasa. Estos autores purificaron la enzima y compararon algunas de sus propiedades con la fosfogliceromutasa de los mamíferos que no fue inhibida por el clorsulon. 2.2.10 Dietilcarbamazina La estructura química de la dietilcarbamazina, un derivado de piperazina, es mostrado en la Figura 2.9. Experimentos fisiológicos han mostrado que su modo de acción no es el mismo que el de la piperazina [54]. La dietilcarbamazina es un fármaco antifilárico (es un buen microfilaricida); pero presenta efectos macrofilaricidas limitados. La acción limitada de la dietilcarbamazina sobre determinados helmintos adultos requiere 10 veces la dosis de la dosis profiláctica y puede entonces implicar otro mecanismo de acción. La mayoría de los estudios sugieren que la dietilcarbamazina no tiene efecto directo sobre los parásitos filáricos y han mostrado, aunque no del todo convincente, la

19 Revisión Bibliográfica

implicación de la inmunidad innata es su acción [55]. La dietilcarbamazina también antagoniza las enzimas que metabolizan al ácido araquidónico, un producto de la acción de la fosfolipasa A2 en las membranas celulares. La 5-lypoxigenasa también ha sido citada como diana inhibida en la acción de la

dietilcarbamazina. En adición, la conversión de 5-HPETE a leucotrieno (LT)A4 por la LTA sintetasa fue bloqueada por dietilcarbamazina [56, 57]. El fármaco también parece inhibir la producción endotelial de prostangladinas (PGI2 y PGE2) por la cicloxigenasa pero no afecta la producción de tromboxano por esta enzima [58]. De forma interesante, la microfilaria también produce las prostangladinas antes citadas y esta producción en el parásito también es bloqueada por dietilcarbamazina [58]. Finalmente, una posible explicación del modo de acción de la dietilcarbamazina es el hecho de que este compuesto altera el metabolismo del ácido araquidónico en las células endoteliales del huesped y también en los parásitos microfilariae que son suceptibles al fármaco. Esto provoca entonces vasoconstricción, amplificación de la adhesión endotelial de la microfilariae y actividad citotóxica de los granulositos. En este sentido, la dietilcarbamazina activa más rápidamente la inmunidad innata que la adaptativa. [58]. Este modo de acción explica por que la dietilcarbamazina no tiene acción in vitro contra microfilariae y es inactiva en animales huespedes que no presentan sistema inmune.

20 III- MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Generalidades Todos los cálculos fueron efectuados en un ordenador personal PC Pentium-D 3.0 GHz. El módulo CARDD implementado en el programa TOMOCOMD [59] fue usado para el cálculo de los descriptores moleculares. El análisis estadístico se efectuó empleando el paquete de procesamiento STATISTICA 6.0 para Windows (StatSoft Inc., 2001). Los datos fueron almacenados y procesados utilizando el programa de Microsoft Excel (2003). 3.2 Base de Datos de los Compuestos Usados en la Obtención de los Modelos QSAR. La aplicabilidad y la representatividad del presente método dependen de forma crítica de la selección de los compuestos utilizados como serie de entrenamiento para la construcción del modelo de clasificación. Un aspecto muy importante en el diseño de la serie de entrenamiento es garantizar una gran diversidad molecular. Con el objetivo de asegurar esta diversidad molecular se seleccionó una base de datos compuesta por una gran cantidad de entidades moleculares; un grupo de compuestos reportados como antihelmínticos y el resto con otros usos farmacológicos. La data de compuestos activos fue seleccionada teniendo en cuenta los diferentes núcleos estructurales (cabeza de serie) y los mecanismos de acción antihelmínticos. En este sentido fueron incluidos compuestos con los siguientes modos de acción: 1) Agonistas colinérgicos del tipo imidazotiazoles (levamizol y butamizol ), tetrahidropiridinas (pirantel, morantel y oxantel), sales de amonio cuaternarios (befenio y tenium), y pirimidinas (metiridina); 2) Inhibidores acetilcolinesterásicos (haloxon y diclorvos); 3) Agonistas GABA como la piperazina; 4) Potenciadores del receptor del glutamato asociado a los canales de cloro (ivermectin, abarmectin y doramectin); 5) Agentes que provocan aumento de la permeabilidad del calcio (praziquantel); 6) Inhibidores de la formación de microtúbulos por unión a la β- tubulina (benzoimidazoles y profármacos como: albendazol y netobimin, respectivamente); 7) Desaclopadores de fosforilación oxidativa, conocidos también como protones ionóforos, grupo flukicida que incluyen a los fenoles sustituidos y aminas aromáticas como nitroxynil y rafoxanida, respectivamente; 8) Inhibidores del metabolismo del malato (dianfenetida); 9) Inhibidores de la fosfoglicerato quinasa y mutasa (clorsulon); 10) Inhibidores del metabolismo del ácido araquidónico y que

21 Materiales y Métodos provocan estimulación de la inmunidad innata (dietilcarbamazina). Otros compuestos que no se le han encontrado o definido un mecanismo de acción específico; pero que se les reporta actividad antihelmíntica también fueron incluidos, ejemplo de ellos los nitroimidazoles y los derivados de la hicantona, entre otros. El conjunto de compuestos inactivos fue construido de la siguiente forma: Los compuestos fueron seleccionados aleatoriamente de una gran base de datos de fármacos con diferentes usos farmacológicos. Estos fármacos incluyen antibióticos, antifúngicos, antivirales, antibacterianos, antihipertensivos, vasodilatadores, antineoplásicos, cardiotónicos, antihistamínicos, sedativos, antidepresivos, hipoglucemiantes, diuréticos, anticoagulantes etc. Está claro que la declaración de estos compuestos como ‘inactivos’ (sin actividad antihelmíntica) no garantiza que alguno de estos compuestos no presente alguna actividad antihelmíntica aún no detectada. Este problema puede verse reflejado en los resultados de la clasificación de la serie de compuestos inactivos. Sin embargo, alguno de estos compuestos puede ser detectado (clasificado) por la función de clasificación como antihelmíntico. En este sentido aunque estas moléculas serían erróneamente clasificadas como inactivas en un principio, pudieran ser escogidas para ser evaluadas experimentalmente. Los compuestos de la base de datos fueron divididos aleatoriamente en dos subconjuntos. Uno de estos conjuntos es usado como serie de entrenamiento (SE) para el desarrollo de la función de clasificación y el otro es usado como serie de predicción (SP) externa. Los compuestos incluidos en la serie de predicción externa nunca fueron usados en el desarrollo de los modelos cuantitativos. Todos los compuestos fueron tomados de la literatura, fundamentalmente del Handbook Martin Negwer [60] y del CD Merk Index [61], donde los nombres, sinónimos y fórmulas estructurales para los compuestos pueden ser encontrados. En la Figura 3.1 se ofrece un resumen de la composición de los datos en cada serie.

22 Materiales y Métodos

Compuestos seleccionados citados en la literatura (517)

Antihelmínticos Otras acciones (212) farmacológicas (305)

138 74 214 91

Serie de Serie de entrenamiento predicción

Figura 3.1 Distribución de compuestos extraídos de la literatura para el estudio de predicción.

3.3 Cálculos de Parámetros o Índices Moleculares. TOMOCOMD Software. TOMOCOMD [62] es un programa interactivo para el diseño molecular e investigaciones bioinformáticas. El programa está compuesto por cuatro módulos o subprogramas. Cada uno de estos módulos consta de una interfaz gráfica que facilita al investigador la representación de las moléculas (drawing mode) y el cálculo de varias familias de descriptores moleculares (calculation mode) (Figura3.2). Los módulos han sido denominados con las siguiente siglas acrónimas: CARDD (Computed-Aided ‘Rational’ Drug Design), CAMPS (Computed-Aided Modeling in Protein Science), CANAR (Computed-Aided Nucleic Acid Research) y CABPD (Computed-Aided Bio- Polymers Docking). En este trabajo, se solo se describen los rasgos sobresalientes de uno de estos subprogramas: CARDD. Este modulo fue desarrollado basado en una filosofía amigable para el usuario, el cual no tiene que tener a priori ningún conocimiento de programación. Los principales pasos para desarrollar un estudio QSPR/QSAR utilizando el enfoque topológico molecular TOMOCOMD-CARDD, son resumidos a continuación:

23 Materiales y Métodos

1. Representar el seudografo molecular de cada una de las moléculas de la base de datos a analizar, usando el módulo de dibujo del software seleccionando el átomo deseado perteneciente a diferentes grupos de la tabla periódica en el momento de representar las moléculas, 2. Usar un ‘peso’ apropiado (etiqueta) de átomo, en orden de diferenciar cada tipo de átomo en la molécula. En este estudio hemos utilizado un esquema de ponderaciones constituido por 4 propiedades atómicas, masa atómica (M), polarizabilidad atómica (P), volumen de van der Waals (V) y electronegatividad de Mullinken (E) en todas sus posibles combinaciones (ver Figura 3.3). Los valores de estas propiedades se muestran en la Tabla 3.1 [63]. 3. Computar los índices seleccionados. Este proceder es llevado a cabo en el módulo de cálculo del programa, el cual permite seleccionar la propiedad atómica y la familia que se desea calcular. Este programa genera una tabla en la cual las filas corresponden a los compuestos (casos) y las columnas a los índices moleculares calculados (variables). 4. Encontrar una o varias ecuaciones QSPR/QSAR usando técnicas estadísticas o de inteligencia artificial adecuadas, tales como Regresión Lineal Múltiple (RLM), Análisis Discriminante Lineal (ADL), Redes Neuronales (RN), entre otras. Es decir, se encontró una relación cuantitativa entre una propiedad P y la estructura química codificada con los descriptores calculados. Así por ejemplo, la ecuación obtenida con los índices bilineales totales tomaría la siguiente apariencia:

P = a0b0(x) + a1b1(x) + a2b2(x) +….+ akbk(x) + c (3.1) th donde P es la medida de la propiedad (o actividad), bk(x) [o bkL(x)] es el k índice

correspondiente, y los términos ak’s son los coeficientes obtenidos por el análisis estadístico multivariable. 5. Probar la robustez y demostrar el poder predictivo de las ecuaciones QSPR/QSAR obtenidas usando procedimientos de validación interna y externa. 6. Desarrollar una interpretación estructural de los modelos QSAR/QSPR obtenidos, que permita interpretar la propiedad P estudiada.

24 Materiales y Métodos

A

B Figura 3.2. TOMOCOMD-CARDD Software: A, Ventana para seleccionar el modulo de trabajo. B, Interfaz gráfica del subprograma de diseño de fármacos.

25 Materiales y Métodos

Los índices calculados en cada caso fueron los siguientes:

Indices biliniales basados en átomos

Estocástico No estocástico

Totales Locales

Con hidrógeno Heteroátomo con hidrógeno Sin hidrógeno Heteroátomo sin hidrógeno

Hidrógeno unido a heteroátomo

Figura 3.3 Diagrama de los cálculos realizados utilizando el programa TOMOCOMD-CARDD.

3.4 Análisis Estadístico de los Datos. Desarrollo de Funciones Discriminantes usando ADL A pesar de que existen varias técnicas quimiométricas para generar funciones discriminantes (FD), tales como SIMCA o redes neuronales (RNs), nosotros hemos seleccionado el Análisis Discriminante Lineal (ADL) en orden de obtener funciones de clasificación sobre la base de la simplicidad del método [64]. El ADL ha sido utilizado extensivamente en el diseño de fármacos por nuestro grupo de investigación [65-68], [69], [70], [71]. El grupo de valencia, también ha identificado nuevos compuestos líderes utilizando el mismo proceder [72-74].

26 Materiales y Métodos

Tabla 3.1. Valores de las propiedades atómicas usadas como pesos para el cálculo de los descriptores TOMOCOMD-CARDD. ID Masa Atómica Volumen de Electronegatividad Polarizabilidad VdW de Mulliken H 1.01 6.709 2.592 0.667 B 10.81 17.875 2.275 3.030 C 12.01 22.449 2.746 1.760 N 14.01 15.599 3.194 1.100 O 16.00 11.494 3.654 0.802 F 19.00 9.203 4.000 0.557 Al 26.98 36.511 1.714 6.800 Si 28.09 31.976 2.138 5.380 P 30.97 26.522 2.515 3.630 S 32.07 24.429 2.957 2.900 Cl 35.45 23.228 3.475 2.180 Fe 55.85 41.052 2.000 8.400 Co 58.93 35.041 2.000 7.500 Ni 58.69 17.157 2.000 6.800 Cu 63.55 11.494 2.033 6.100 Zn 65.39 38.351 2.223 7.100 Br 79.90 31.059 3.219 3.050 Sn 118.71 45.830 2.298 7.700 I 126.90 38.792 2.778 5.350

La función discriminante se obtuvo a través de un ADL utilizando el programa STATISTICA 6.0. Las variables incluidas en la ecuación del modelo fueron seleccionadas a través de un procedimiento de “paso hacia adelante” (‘Forward Stepwise’). En todos los casos la F y la tolerancia fueron estadísticos usados para el control del proceder de selección. Siempre se utilizó, por defecto, como mínimo aceptable de tolerancia el valor de 0.0001. La colinealidad entre variables fue examinada utilizando las matrices de correlaciones entre las variables incluidas en el modelo. La calidad estadística del modelo se determinó por el análisis de la lambda de Wilks (λ), que permite evaluar la hipótesis de que dos o más grupos provienen de poblaciones con las mismas medias para un conjunto de variables [75], [64]. La λ de Wilks toma valores en el rango de 0 (discriminación perfecta) a 1(no discrimina). También se calculó el cuadrado de la distancia de Mahalanobis (D2) como criterio para

determinar la existencia de dos poblaciones, la razón de Fisher (Fexp > Ftab, α = 0.05) y el número de variables en la ecuación. Otro factor que se tuvo en consideración para evaluar la habilidad (poder discriminante) de la FD obtenida, fueron los porcentajes de buena clasificación en cada uno de los grupos y del modelo en general en la serie de entrenamiento (SE) [64].

27 Materiales y Métodos

La clasificación de los casos es desarrollada por medio de la probabilidad posterior de clasificación. Usando la D2 para la clasificación, se pueden obtener probabilidades. La probabilidad de que un caso pertenezca a un grupo particular es básicamente ‘proporcional’ a la D2 del caso al centroide del grupo. En resumen, la probabilidad posterior es la probabilidad, basada en el conocimiento de los valores de otras variables, que el respectivo caso pertenece a un grupo en particular. Los resultados de las probabilidades de clasificación para cada compuesto son dados utilizando el siguiente parámetro: ΔP% = [P (actv)-P (inactv)] x100, donde P (actv) es la probabilidad con que la ecuación clasifica un compuesto como activo. Contrariamente, P (inactv) es la probabilidad con que el modelo clasifica un compuesto como inactivo. Para acceder al poder predictivo del modelo QSAR-ADL obtenido, se desarrollaron procedimientos de validación externa [76], [64]. Es un hecho reconocido que la única condición necesaria y suficiente para probar el poder predictivo de un modelo es a través de una serie de predicción. En este sentido, fueron calculados los parámetros estadísticos recomendados en la literatura médico-estadística [69]. La calidad de los modelos obtenidos fue igualmente expresada a través del coeficiente de correlación de Mattews (C), la sensibilidad, la especificidad y la relación de falsos positivos “false alarm rate (FAR)” [76]:

Q = 100 * (VP + VN) / (VP + FP + VN + FN) (3.2)

C = 100 * (VP * VN – FP * FN) / √ (VN + FN)*(VN + FP) * (VP + FP) * (VP + FN) (3.3)

Sensibilidad = 100 * VP / (VP + FN) (3.4)

Es pecificidad = 100 * VP / (VP + FP) (3.5) donde VP y VN son los verdaderos positivos y negativos; y FP y FN son los falsos positivos y negativos, respectivamente.

28 IV-RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Desarrollo de Modelos Usando ADL. 4.1.1 Desarrollo de Funciones Discriminantes para la Actividad Antihelmíntica. Los modelos de clasificación obtenidos utilizando los índices bilineales totales y locales, junto con sus parámetros ADL-estadísticos, son dados a continuación:

PK H PK WK E Class = -2.30213 -0.03742 b5L ( x E-H) -0.00013 b7L ( x E) +0.001 b6L ( x E-H) WK WK H WK H +0.0053 b2L( x E)-0.0206 b1L ( x E) +0.0126 b0 ( x ) WP MK H MW H +0.00103 b 4L ( x E) +0.01389 b0L ( x E) -0.00132 b0L ( x E) (4.1) N= 352 λ= 0.466 D2= 4.781 F(9.342)= 43.548 Q=86.36% p<0,0001

MKs WPs Class= -2.43036+0.40314 b12 ( x ) -0.04108 b11 ( x ) WPs WPs H WKs +0.04739 b6 ( x )-1.13446 b 5L ( x E-H)+0.01463 b 9L ( x E) MKs MWs H MWs -0.45133 b14 ( x )+0.01084 b 1L ( x E)-0.01474 b 1L ( x E) MKs WPs H PKs H +0.04431 b0 ( x )+1.70095 b 13L ( x E-H)-2.54912 b 4L ( x E-H) WPs H +0.03567 b 0L ( x E) (4.2) N= 352 λ= 0.457 D2= 4.956 F (12.339)= 33.563 Q= 87.50% p < 0,0001

donde N es el número de compuestos, λ es el estadístico de Wilks, D2 es el cuadrado de la distancia de Mahalanobis y F es el estadístico de Fischer. En ambos estudios fueron utilizados los índices bilineales no estocásticos y estocásticos respectivamente. En los dos casos la data de 547 compuestos, fue dividida aleatoreamente en dos subgrupos, uno conteniendo 138 compuestos activos (antihelmínticos) y 214 compuestos inactivos como serie de entrenamiento y el otro conteniendo 74 compuestos activos y 91 inactivos que fueron usados como serie de predicción. Los modelos cuantitativos obtenidos con los índices bilineales clasifican correctamente el 85.50% y el 88.40% de los compuestos activos, respectivamente; y el

29 Resultados y Discusión

86.91% de los compuestos inactivos en ambos casos, para la serie de entrenamiento. Las Ec. 4.1 y 4.2 tuvieron un apropiado poder de discriminación en esta serie, con un porcentaje de buena clasificación global del 86.36% y del 87.50%, respectivamente. Los porcentajes de falsos activos e inactivos para la serie de entrenamiento usada en el ajuste del primer modelo (Ec. 4.1) fueron de 7.95% y de 5.68% ,respectivamente. Un comportamiento similar fue obtenido en la confección del segundo modelo (Ec. 4.2), obteniéndose un porcentaje de falsos activos de 7.95% y de falsos inactivos de 4.55% Los falsos activos son compuestos inactivos que el modelo los clasifica como antihelmínticos y los falsos inactivos son los compuestos activos clasificados como inactivos por el modelo. Una de las aplicaciones más importantes de un modelo QSAR es su uso en la predicción de la actividad de nuevas entidades químicas, que incluso no tienen que tener existencia física aún. En este sentido, uno de los criterios para la aceptación o no de un modelo QSAR como los que se han desarrollado en este trabajo, están basados en los estadísticos de la serie de predicción externa. En esta serie las Ecuaciones 4.1 y 4.2 clasificaron correctamente el 81.80% y el 78.37% de los compuestos como activos y el 86.81% y el 81.31% de los compuestos inactivos en la serie de predicción, respectivamente.Como puede observarse, en esta serie el modelo ajustado usando los índices no-estocásticos describió más adecuadamente la actividad biológica de estos compuestos. El porcentaje de buena clasificación global de los dos modelos fue del 84.24% y del 80.00%, respectivamente. Los porcentajes de falsos activos y falsos inactivos son de 7.27% y 8.48% para la Ec. 4.1 y de 9.69% y 9.69% para la Ec 4.2. Los resultados de la clasificación para la SE y SP empleando las Ec. 4.1 y 4.2 pueden ser vistos en las Tablas 4.1-4.3. En la figura 4.1 se muestra gráficamente la separacion entre los grupos, en la misma podemos apreciar que existe una adecuada diferenciación entre los grupos 1,2,3 y 5, sin embargo; se observa una superposición de los compuestos que integran el grupo 4 con los demás, si consideramos que los grupos han sido conformados siguiendo el criterio de mecanismo de acción surge la posibilidad de que los compuestos que conforman el grupo 4 puedan actuar por más de un mecanismo.

30 Resultados y Discusión

Tabla 4.1 Clasificación de compuestos activos dada por (Eq. 4.1) and (Eq.4.2) .

Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Serie de entrenamiento Tetrachloromethane 98.43 53.69 Ontianil potasium 98.70 90.76 Hexachloroethane 99.93 99.60 Atractyl -38.88 0.95 Antimony sodium thioglycollate 98.20 90.81 Amidantel hydrochloride -57.85 -46.63 Dichlorvos 85.82 99.86 Mirasan -25.18 52.78 1-Chlorobutane -62.13 -43.44 Triclabendazole 99.58 99.31 Dimetrizadole -29.01 -56.68 Nocodazole 73.00 98.24 Disoferol 53.00 62.04 Styrylpyridiniumchloride 40.94 16.04 Lindane 98.20 99.70 Haloxon 89.33 99.99 Mindazole 62.25 33.40 Coumafos 99.72 97.93 Fospirate 96.83 99.87 Coralop 79.79 97.09 Oltipraz -61.40 96.35 Evultin 8.93 17.50 Certuna 22.17 -77.35 Oxamniquine 14.99 31.84 Butonate 99.61 88.26 Brotianide 99.97 99.72 Antienite 96.30 86.88 Afesal 98.22 98.56 Sodium antimony 82.55 99.39 Furodazole 91.02 71.08 dimethylcysteine tartrate Wormin 87.19 37.87 Oxfendazole 95.46 97.75 Nitrodam 99.76 97.67 Dribendazole 91.36 99.16 Lobendazole 48.34 83.71 Butamisole hydrochloride 76.91 94.88 Bromothymol 56.34 52.11 Spirazine 93.37 91.47 Iodothymol 27.18 74.82 Lubisan -24.47 -4.92 Famophos 94.18 81.62 S72014 72.66 96.04 Thiacetaisamide 92.56 96.24 Flubendazole 69.06 93.45 Antazonite 98.38 87.46 Mebendazole 46.96 90.87 Vincofos 95.78 98.95 Egresin -48.69 -91.38 Niclofolan 94.02 98.35 Benacyl 39.14 85.63 Bromofenofos 99.28 95.89 Imcarbofos 96.59 99.31 Sinid 99.56 99.64 Etibendazole 65.36 94.41 Phenotiazine 92.14 70.88 Fluranteel 99.10 97.88 Nitazoxanide 95.56 80.39 Dibutyltin dilaraute 97.18 99.60 Bendamizole 95.38 87.62 Pararosaniline embonate -33.48 -68.35 Tioxidazole 64.60 88.95 Difesyl -0.98 4.19 Phoxim 98.00 92.73 Uredofos 94.26 93.13 Albendazole 76.75 98.63 Diuredosan 89.05 90.98 Anthiolimine 99.93 99.88 Salantel 99.73 99.98 Carbantel 62.87 92.97 Trichlorophen 99.43 99.57 Cetovex 99.87 68.26 Miracil 15.94 77.40 4-Hexylresorcinol -11.14 -27.06 Lucanthone hydrochloride 53.12 85.15 Crufomate 24.27 80.39 Hycanthone 19.36 89.68 Butynorate -36.47 -90.70 Dimantine hydrochloride -66.61 -45.91 Hexachlorophenimonophosphate 99.91 99.78 Alazanine triclofenate 99.32 97.18 Niclosamide 96.88 97.59 Closantel 99.82 99.99 Nitroscanate 98.11 87.51 Diospyrol 82.86 48.92 G-572 88.04 85.02 Dithiazanine iodide 99.70 97.89 Resurantel 89.55 71.44 Desaspidin 79.03 64.97 Phenzidole 56.15 36.61 Methylrosanilidium chloride -90.30 -95.83

31 Resultados y Discusión

Tabla 1 Continuación.

Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Dicroden 80.47 73.35 Hectolin 96.27 99.06 Bidimazium oidide 50.76 14.55 Dichlorophenersine 95.03 99.18 agrimophol 90.30 80.04 Urea stibamine -67.88 80.37 Zilantel 100.00 99.77 beta-Kosin 57.91 66.25 Bisbendazole 100.00 99.96 Mibbemycin Oxime A4 90.68 79.01 Teroxalene hydrochloride 60.33 75.64 Mibbemycin Oxime A3 88.95 65.89 Stilbaziumiodide 55.09 44.63 Moxidentin 95.05 62.23 Coib -25.23 -37.82 Naftalofos 24.84 97.52 Dryocrassin 99.98 99.79 Netobimin 37.68 -62.65 Luxabendazole 60.14 87.28 Nitrodan 99.76 97.67 Phenithionate 97.88 89.63 Nitroxymil -13.39 38.14 Abamectin A 93.85 81.02 Albendazole sulphoxide 87.79 97.17 Abamectin B 92.99 85.35 Rafoxanide 99.77 99.96 Amorcazine 99.93 99.94 alfa-Santonin 10.59 39.33 Antimony potasium tartrate 99.96 99.05 Tenium Closylate 52.20 38.67 Arsenamide 92.56 96.24 Quinacrine 57.24 83.59 Aspidinol 1.34 -8.97 Suramin 90.95 98.56 Benomyl -31.88 90.60 Dibromomsalan 97.57 96.22 Bethionol 99.97 99.94 Tetrachloro- 99.32 88.96 difluoroethane Carbacol -37.07 -41.45 Ivermectin 94.00 92.79 Embelin 40.84 -33.81 Milbemycin D 87.41 72.79 Acid filix (b) 99.63 96.51 Tribromsalam 99.65 99.07 Acid filix (c) 99.57 97.26 Bromoxanide 98.98 98.56 Glycarsamide -47.27 99.97 Tetrachloroethane 71.18 89.30 serie de prediccion Tetrachloroethylene 98.53 94.95 Sodium stibocaptate 100.00 100.00 Metrifonate 96.88 89.49 Oxibendazole 32.72 88.97 Stibomen 86.74 48.21 Morantel tartrate 36.27 31.20 26354R-P 95.35 71.31 Oxyclozanide 99.96 99.98 VUFB-7904 57.84 51.71 Nitroclofene 95.28 96.82 Bitoscanate 99.89 93.32 Amoscanate 80.10 83.27 SQ18506 -50.39 -65.25 Dichlorophen 91.04 91.89 Carbendazim 18.03 78.86 Ciclobendazole 49.32 90.84 Tiabendazole 86.29 81.52 Parbendazole 38.25 91.98 F30066 -48.17 -45.39 SRC-4402 99.31 96.76 Ascaridole -5.77 -28.35 Cambendazole 93.40 97.85 Eucalyptol -3.15 -70.80 Thiophanate 65.04 98.95 R8231 95.16 87.97 Clioxanide 98.56 99.67 Nitramisole hidrochloride 81.00 79.43 Fenbendazole 95.09 98.78 Levamisole hydrochloride 32.34 39.55 Santolactone 10.59 39.33 Pyrantel tartrate 33.45 31.49 Ticarbodine 97.90 94.81 Clorsulon 90.55 93.34 Meclorazepan 88.77 92.27 Feniodiumchloride 99.99 99.88 RP12869 18.69 66.51 Stibofen 27.47 -79.50 Artemethei 12.31 2.34

32 Resultados y Discusión

Tabla 1 Comtinuación.

Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Santoperonin 87.50 92.95 Alantolactone -14.15 -9.28 Agrimonolide 12.14 -13.61 Aspidin 86.58 64.28 Dibutyltin dilarate 97.18 99.60 1,4- 99.97 99.97 Bistrichloromethylbencene Praziquantel 15.86 56.22 Triclabendazole sulphoxide 99.80 99.34 153C51 -15.04 -13.05 Epripantel 23.60 61.37 Febantel 63.29 99.86 Acid filix (a) 99.68 95.56 Miracil A -52.90 21.98 Oentian violet -98.08 -97.50 Diamphenetide 54.09 29.52 Hidroxyquinoline -22.63 -46.21 Becantone 42.05 88.18 alfa-Kosin 62.37 74.52 Bunamide hydrochloride 48.97 92.76 Mandelic acid isoamyl ester -33.43 -15.40 Pyruinium chloride 42.81 -44.57 Moxidectin 94.01 72.64 Desoine -49.27 -20.89 Naphthalene -58.87 -54.23 thymoloverm 66.31 60.71 Paraherquanude 92.10 69.65 Pretamazium iodide 89.93 92.97 Trichlorfan 96.88 89.49 Chuanliansu 80.40 20.12 Arsamilate -26.00 99.61 Hedaquinium chloride 69.76 67.99 Hexachlorophene 99.98 99.99 Netobimin 69.66 -39.48 Doramectin 92.87 85.03 Artesunate 73.89 14.01 Dymanthine -66.61 -45.91 a ;b se corresponden con las ecuaciones 4.1 y 4.2 respectivamente.

Tabla 4.2 Clasificación de compuestos inactivos dada por (Eq. 4.1) and (Eq.4.2) . Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Serie de entrenamiento Radicinin -25.03 -61.93 Carbazochrome sodium -78.88 -99.79 sulfonate Mizoribine -93.92 -97.02 Styptol -93.49 -81.95 2- chloroNpcA 5.69 -10.26 Policresulen -52.05 -84.68 BL-1743 -66.00 -50.56 Furosemide beta- 0.48 17.95 diethylaminoethyl ester IMPY -68.23 -77.34 Glycerol -98.49 -99.17 BVDU -31.08 -10.91 Pamabron -98.89 -90.82 TSKI- VI -99.41 -99.14 Chloraminophenamidum -52.28 -67.24 Alcabrol -18.85 -44.76 Ambuside -30.71 -36.49 Cetohexazine -15.57 -40.28 Bromothiazide -46.38 -27.15 Hedonal -87.92 -98.56 Theobromine -76.67 -76.92 Aminoglutethimide -8.55 -12.47 Teclothiazide -39.50 -55.05 SOG-18 -91.04 -28.42 Quimbosan 15.38 -73.59 Phenacemide -85.25 -97.35 Beroxan -54.57 -37.08 Norantoin -52.12 -16.19 Geroquinol 2.65 -24.43 Pheneturide -79.65 -94.83 Glibutimine 22.07 -49.37 Primidone -75.00 -70.86 Gliamilide 21.29 -80.66 Ferroglycine sulfate -97.94 -98.87 CGP 11112 30.81 -36.18 Orotonsan Fe -39.93 -58.46 Etoformin hydrochloride -89.74 -97.18 Ferrocal -66.78 -95.09 Phenbutamide -59.87 -57.17 Polyferose -99.27 -99.91 Enalaprilat -24.88 -23.95 Ferrotrenine -75.98 -89.75 Guancidine -24.95 -88.47 Picosulfate -69.95 -99.67 Dihydralazine -98.71 -98.95

33 Resultados y Discusión

Tabla 4.2 Continuación . Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Oxdralazine -98.81 -99.33 Dioxoprometazine -84.92 -78.36 dihydrochloride hydrocloride Guanoclor sulfate -87.34 -96.32 Cycliramine maleate -54.22 -20.53 Guanoctine hydrochloride -91.11 -90.44 meflopenhidramine -63.36 -69.27 hydrocloride BAEA -89.44 -89.56 Histamithizine 15.67 53.00 Benzochinoniumchlorid -60.26 -43.47 Bamipine -61.34 -41.09 Agentit -99.86 -92.11 Trastomin -59.50 -58.07 Tetramethoquine -93.00 -80.73 Hiproheptine hydrocloride -83.99 -75.18 methiodide Temechin -2.06 -71.07 Trazitiline -62.89 -56.19 Cyclocholine tosilate -97.83 -96.72 Quifenadine hydrocloride -31.48 2.29 Fluroxene 0.76 -62.08 Colestipol -99.99 -99.58 Vinamar -74.70 -84.29 Xantifibrate -98.85 -91.38 Anaesthaminol -43.72 -58.41 Fluperlapine 14.99 12.35 Naretin -53.85 -55.00 Metoxepin -76.41 -75.23 Mercaptothiazoline -82.74 -73.26 Azabuperone -29.53 -34.45 Thiamazol methyl iodide -74.49 -87.05 Perhidro,1,2,4,tiadiazine -93.34 -99.80 1,1dioxide Alloxanthine -0.81 -58.27 4- nitrofenol -37.71 -52.43 Mecytosine -8.56 -64.57 Carbamimidotioic acid -93.53 -10.23 FBF -94.98 23.57 5-sulfonalicylic acid -63.38 -82.15 N.H.C 5.65 38.08 Acetanilide -28.52 -49.46 Khelloside -92.27 -89.85 8-hidroxy-7-quinoline -54.44 -75.61 sulfonic acid Nitrous ether -83.78 -77.87 N-metil acetanilide -39.66 -64.24 Amyl nitrite -76.75 -84.75 4,5,6,7-tetrahidro-2-metil- -51.97 -82.80 3-(metilamino)-2H-indazole Isosorbide mononitrate -70.92 -91.87 Hadacidin -94.40 -96.90 Ampecyclal -97.35 -97.10 Dinitolmide -49.68 1.88 Molsidomine -71.11 -17.90 Azapicyl -59.85 -35.86 Berbamine -39.15 -54.29 Imidazol mustan -70.31 86.68 Cloguanamil -38.95 -96.08 Ida -74.97 -38.85 B arteether 13.39 2.34 Novembitol -82.92 -49.61 Dibenzepine Hidrochloride -77.54 -78.42 Razoxan 10.24 -68.41 Bifemelane Hidrochloride -96.03 -98.16 Suosan -42.42 -67.51 Cimoxatone -70.25 -6.20 Aspartame -85.97 -72.20 Pridefine hidrochloride -62.26 -42.42 Neohesperidin -55.78 -91.70 dihydrochlalcone Amedalin hidrochloride -18.34 13.10 Dienestrol 4.31 -19.03 Prasterone -10.03 -9.98 Pipadrol hydrochloride -53.67 -38.16 Danitracen -67.06 -37.01 Estrone 28.30 27.91 Dimetridazole -92.14 -90.21 Hydroxyestrone 5.91 11.32 Ipronidazole -27.29 -16.83 Drupanol -3.85 -17.84 Tinidazole -99.45 31.89 Tuaminoheptane -96.09 -90.71 Nitrofural -85.03 -91.89 ASL-7003 -81.28 -90.12 Narceina -92.73 -78.41 Methophedrinum -88.79 -95.80 Remifentanilo 29.08 57.67 Phedrazine -81.61 -90.00 Naltrexona 22.58 3.22 Tefazoline nitrate -49.17 -43.30 ketobemidone -50.77 -52.97 Domazoline fumarate -64.81 -68.03

34 Resultados y Discusión

Tabla 4.2 Continuacion .

Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Felypressin -98.85 -75.23 Belarizine -49.36 -27.85 Angiotensinamide -35.23 70.89 Carvedilol -49.07 -79.38 Orphenadrine hydrochloride -84.62 -74.22 PHQA 33 -82.84 -76.02 Zoxazolamine 18.75 62.03 Ericolol -23.40 -23.72 Emylcamate -79.64 -92.95 Betaxolol -92.68 -77.59 Cresotamide -61.05 -41.41 Bisoprolol fumarate -93.42 -72.66 Meprobamate -97.62 -99.81 Bornaprolol hydrochloride -87.86 -71.36 Mephenesin -90.49 -96.19 Bevantolol hydrochloride -93.43 -96.28 Methocarbamol -95.41 -99.18 Sulfinalol hydrochloride -22.59 -78.06 Strychnocarpine -5.59 -3.13 Celiprolol -59.59 4.33 Fenyripol hydrochloride -30.14 -49.03 Solypertine -31.92 0.95 Carisoprodol -93.33 -98.44 Butopamine -68.38 -78.89 Quiloflex -92.54 -68.62 Dobutamine hydrochloride -45.70 -74.73 Acetylcholine -94.10 -99.22 Bufogenin 25.56 -16.51 Pilokarpin -50.77 -47.05 Cassaidine -72.91 -89.69 Eseridine -91.17 -92.02 Ramnodigin 41.51 8.60 Alifedrine hydrochloride -58.95 -57.97 Locundieside -35.59 -81.93 Doxaminol -71.64 -48.67 Proscillaridin -8.08 -30.10 MK-801 2.51 -14.95 Erysimoside -47.18 -94.80 SY 28 -65.97 11.15 Piperonyl Butoxide -76.86 -24.30 Bamethan sulfate -89.77 -70.55 Tetramethrin 4.67 35.03 Varon -97.71 -98.77 Ovalicin 23.32 -61.26 Isofenefrine -88.42 -80.36 Ethydine 14.72 -59.41 Mephentermine -88.20 -94.48 Homocysteine thiolactone -64.48 -43.09 Dioxethedrin -83.66 -83.64 Acidum metioformicum -29.04 -41.75 Protokylol hydrochloride -72.76 -81.15 Silicristin 37.10 -5.19 Norepinephrine -94.53 -96.31 Apoatropine -28.64 -19.91 Octodrine -95.60 -90.24 Caroverine -0.38 15.79 Hydroxyamfetamine -92.94 -95.04 Diisopromine -7.71 -4.88 Phenylephrine -95.11 -97.19 Etomiololine -7.97 51.70 Deoxyadrenaline -90.68 -96.26 Fenpiverinium Bromide -80.51 -4.39 Homorenon -75.76 -85.63 Flavoxate -40.47 41.28 Metamfetamine -92.57 -95.93 Phenamacide hydrochloride -59.44 -45.36 Oxyephedrine -92.25 -95.37 Mefuralazine -51.22 -27.76 Metanephrine -96.06 -97.92 Cycloserine -97.94 -96.40 Amezinium metilsulfate -28.00 -72.87 Enheptin-P -35.98 -67.97 AMT -80.93 -67.96 Selectan 10.82 52.51 Dilevalol hydrochloride -80.34 -62.39 Nibroxane 37.95 -8.68 Papaverine -58.23 -64.58 Selectan-neutral -18.49 79.42 Chinotoxin -66.60 -55.74 Zinc sulfanilate -73.22 -95.36 Tipropidil hydrochloride -29.79 -18.01 Furaguanidine -86.70 -97.87 Diniprofylline -7.29 75.12 Sulfanilamide -63.40 -96.30

35 Resultados y Discusión

Tabla 4.2 Continuación . Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Serie de predicción Thiacetazone -94.22 -82.86 Azanidazole 26.06 -12.57 5'-nor ARI -77.15 -92.98 Puromycin -99.07 -94.09 ZDPFA -30.91 -69.34 Levacetilmetadol -55.17 -58.57 Pirazolopirimidine 36.55 -70.09 Desomorphine -41.53 -43.40 Citenazone -80.14 60.51 Bromazine -20.40 -25.18 AIDU -78.93 -57.09 Tolpropamine hydrocloride -80.62 -78.85 Indinavir -0.64 32.70 Azatidine maleate -60.50 -45.22 Calcii bromoaminoacetas -97.68 -78.67 Choline glycerophosphate -99.43 -99.89 Aleudrin''Beckmann'' -80.83 15.90 Nicoclonate 63.82 76.40 Methylpentynol -68.52 -82.89 LM 08050 -80.80 -38.39 Carbromide -2.39 12.61 Dimetilsulfoxide -79.81 -99.47 Nevanide -65.59 -57.96 2propyl-5-tiazolecarboxylic acid 82.46 53.55 Carbavin -85.97 -91.49 Etyl-p-amino benzoate -60.95 -58.95 Chlorphenacemide -58.72 -85.63 Etretin -13.70 -1.51 MECap -47.31 -51.89 DMDAI 5.51 -99.97 Phensuximide -33.29 -24.58 Douxan -32.08 -34.64 Cinromide 6.69 -6.09 Vinconate -20.76 11.01 Mesuximide -34.71 -15.17 Epiestriol -45.66 -60.06 Fertaron -89.23 -98.86 Formetamate -95.17 -91.38 Iron aspartate -95.20 -98.25 Oxymetazoline hydrochloride -10.39 -6.10 Sodium dipantoylferrate -88.78 -96.28 Cypentil -95.23 -87.68 Ferromaltose -99.57 -99.92 Metaxalone -67.69 -52.23 Bibrofenum 98.23 90.83 Carmecolina cloruro -98.96 -99.90 Oxamarin -59.71 -31.74 Oxyphenudrine -58.68 -80.81 Polyurene -53.58 60.79 Dimetofrine hydrochloride -96.92 -98.38 Chlormetaminofenamide -55.69 -34.53 Octopamine -96.18 -96.26 Hydracarbazine -95.08 -97.99 Oxidopamine -88.76 -92.58 Iodothiazide -77.44 -11.89 Ephinephrine -93.32 -97.19 Oradon -29.97 -11.31 Methyladrenaline -87.67 -90.09 Meglitinide 12.01 72.18 Benfurodil hemisuccinate 37.56 49.55 Guanoxabenz hydrochloride -30.47 -45.32 Pipratecol -60.37 -72.38 Guanfacine hydrochloride 33.22 -77.74 Vincamine 8.37 59.16 Vincamine methyl chloride -5.45 16.32 Prenylamine -59.95 -53.86 Plegarol -96.51 -90.02 K 4423 -89.60 -71.58 Hexamethonium -99.54 -93.33 Nafetolol -73.90 -67.23 Ethyl chloride -71.02 -59.61 Spirendolol -75.90 -64.77 Metacaine -58.73 -54.23 Neo-Coronaril -48.62 -9.30 Bathyran -25.21 -80.43 Oleandrin 68.01 13.07 Allantovanamide -66.02 -71.82 Hydramitrazine -83.85 -99.94 W 3580 B -67.19 -85.85 Noxytiolin -90.27 -73.96 Cinepazic acid -83.30 -90.61 Bi-Domus -76.06 -12.26 Nicorandil -56.96 -8.56 Azanidazole -34.57 42.89 Malagoshine -21.10 17.07 Puromycin -82.97 -76.11 Dabhekhin -49.63 18.23 Levacetilmetadol -99.15 -29.50 Fluperlapine -47.24 -32.21 Desomorphine -55.78 -42.33 Noxiptiline hidrochloride -77.16 -34.80

a; b se corresponden con las ecuaciones 4.1 y 4.2 respectivamente

36 Resultados y Discusión

Root 1 v s. Root 3 4

3

2

1

0

Root 3 -1

-2

-3

-4 G_1:1 G_2:2 G_3:4 -5 G_4:6 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 G_5:7 Root 1

Figura 4.1. Representación gráfica de los resultados del análisis canónico del primer modelo. Los grupos se corresponden con los siguientes mecanismos de accion: G-1Nicotinic acetylcholine agonist (NAA);G-2 Acetylcholinesterase inhibitors (AChI); G-3 GluCl receptor (GR); G-4 b-Tubulin binding (t);G-5 Proton ionophores (H)

Tabla 4.3. Resultados globales de la clasificación de los compuestos en la serie de entrenamiento y prediccion. Coeficiente de Exactitud Sensibilidad Especificidad Falsos positivos Corr. de ‘QTotal ‘ (%) (%) (%) Matthews (C) Descriptores no estocásticos [Eq. (4.1)]

SE 0.72 86..36 85..51 80..82 13..08 SP 0.68 84..24 81.08 83..33 13..19 Descriptores estocásticos [Eq. (4.2)] SE 0.74 87.50 88.41 81..33 13..08 SP 0,79 80..00 78..38 78..38 17.58

En los resultados mostrados en la tabla 4.4 se puede apreciar la similitud de los modelos obtenidos con los índices biliniales basados en átomos con los reportados empleando índices lineales y cuadráticos basados en átomos, lo cual demuestra la calidad de los modelos obtenidos pudiendo usarse en conjunción con los reportados para la busqueda de nuevas moléculas potencialmente activas.

37 Resultados y Discusión

Tabla 4.4. Comparación entre los Modelos Desarrollados en este Estudio y otros reportados Rasgos de los Modelos de clasificación de lo actividad modelos objeto de antihelmíntica comparación Indices Indices Indices bilineles basados cuadráticos lineales en átomo basados en basados átomo en átomo Eq 4.1 Eq 4.2 Eq 10 Eq 12 N total 517 517 441 418 No de Compuestos 212 212 214 213 Wilks’λ 0.47 0.46 0.46 0.48 F 43.55 33.56 38.52 33.54 D2 4.78 4.95 4.68 4.30 p-level < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 Variables incluidas en 9 12 8 9 el modelo Serie de entrenamiento N total 352 352 273 291 No de Compuestos 138 138 144 148 Coeficiente de Corr. 0.72 0.74 0.80 0.21 de Matthews (C) Exactitud ‘QTotal ‘ 86.36 87.50 90.11 90.38 Especificidad (%) 80.82 81.33 93.97 30.87 Sensibilidad (%) 85.51 88.41 87.26 95.95 Serie de predicción N total 165 165 168 127 No de Compuestos 74 74 73 65 Coeficiente de Corr. 0.68 0.79 0.77 0.76 de Matthews (C) Exactitud ‘QTotal ‘ 84.24 80.00 88.56 88.19 Especificidad (%) 83.33 78.33 92.22 87.88 Sensibilidad (%) 81.08 78.38 84.21 89.23 aEcuaciones (4.1-4.2) son reportadas en este trabajo, modelos 10 y 12 fue reportado por Yovani Marrero- Ponce, Bioorganic & Medicinal Chemistry 13 (2005) 1005–1020 y Yovani Marrero-Ponce Journal of Computer-Aided Molecular Design 18: 615–634, 2004

4.1.2 Desarrollo de Funciones Discriminantes para la Predicción del Posible Modo de Acción Antihelmíntico. Con el propósito de desarrollar modelos capaces de estimar el posible mecanismo de acción anthielmíntica a nuevos compuestos seleccionados por el modelos de actividad, se desarrolló un segundo estudio donde se tuvieron en cuenta los 5 modos de acción más representativos y estudiados de los fármacos antihelmínticos. Las dianas escogidas para la modelación incluyen 3 blancos farmacológicos ‘acoplados’ a canales de iones y otros 2 sitios de acción no relacionados (al menos directamente) con canales de

38 Resultados y Discusión

iones. Las funciones de clasificación para el modo de acción de los fármacos antihelmínticos obtenidas utilizando el ADL de los índices bilineales, junto con sus parámetros estadísticos son dados a continuación:

No estocástico MW H Nicotine AcetylChol: Agonist (NAA) = -5.51220-0.00027 b0L ( x E) WK H MW H -0.00005 b6L ( x E-H)+0.00344 b0L ( x E) WK H WK H -0.00108 b1L ( x E)+0.00604 b0 ( x ) (4.3 )

MW H WK H AcetylCholinest: Inh: (AChI)= 14.5030+0.0007 b0L ( x E)-0.0001 b6L ( x E-H) MW H WK H -0.0088 b0L ( x E)+0.0174 b1L ( x E) WK H +0.0018 b0 ( x ) (4.4 )

MW H 3 WK H GluCl Receptor (GluClR) = -42.4569-0.0036 b0L ( x E)-0.4x10- b6L ( x E-H) MW H WK H +0.046 b0L ( x E)-0.0217 b1L ( x E) WK H +0.0209 b0 ( x ) (4.5 )

MW H WK H β-Tubulin (t) = - 7.61617-0.00052 b0L ( x E)+0.00016 b6L ( x E-H) MW H WK H WK H +0.00663 b0L ( x E)+0.00229 b1L ( x E)+0.0038 b0 ( x ) (4.6 )

MW H WK H H-Ionophores (H) = -14.6341-0.0026 b0L ( x E)+0.0003 b6L ( x E-H) MW H WK H WK H +0.0525 b0L ( x E)-0.0185 b1L ( x E)+0.0061 b0 ( x ) (4.7 )

N=76 λ=0.017 F(20.223)=27.041 p<0.0001 Estocástico PKs H Nicotine AcetylChol: Agonist (NAA)= -0.06808-0.39664 b4L ( x E-H) WKs +0.00512 b9L ( x E) WPs H WPs -0.00869 b13L ( x E-H)+0.00660 b6 ( x ) MKs MWs H +0.00835 b0 ( x ) -0.00245 b1L ( x E) (4.8 )

PKs H WKs AcetylCholinest: Inh: (AChI)=-17.6048+4.8073 b4L ( x E-H) +0.0450 b9L ( x E) WPs H WPs -1.2020 b13L ( x E-H)+ 0.0349 b6 ( x ) MKs MWs H -0.0373 b0 ( x )+0.0056 b1L ( x E) (4.9 )

PKs H WKs GluCl Receptor (GluClR) =-38.4157+3.5404 b4L ( x E-H) +0.0080 b9L ( x E) WPs H WPs MKs -0.8747 b13L ( x E-H)-0.0056 b6 ( x )+0.0538 b0 ( x ) MWs H -0.0128 b1L ( x E) (4.10 )

PKs H WKs β-Tubulin (t) =-7.56287-0.93767 b4L ( x E-H) +0.01844 b9L ( x E) WPs H WPs MKs +0.33573 b13L ( x E-H)+0.00450 b6 ( x )+0.00497 b0 ( x ) MWs H -0.00201 b1L ( x E) (4.11 )

39 Resultados y Discusión

PKs H WKs H-Ionophores (H) =-13.9159-12.1941 b4L ( x E-H) -0.0187 b9L ( x E) WPs H WPs MKs +2.9014 b13L ( x E-H) -0.0187 b6 ( x )+0.0368 b0 ( x ) MWs H -0.0018 b1L ( x E) (4.12 )

N= 76 λ= 0.157 F(24.231)= 22.056 p<0,0001

En ambos casos, se han utilizado la misma serie de entrenamiento y predicción para la obtención y validación del poder predictivo de los modelos obtenidos con los dos descriptores TOMOCOMD-CARDD calculados. En este sentido, se extrajeron de la literatura [32, 37] los principales modos de acción de los antihelmínticos. Solo se encontraron una gran representatividad de los 5 mecanismos que fueron utilizados en el análisis y la data de 98 compuestos fue dividida aleatoriamente en dos subconjuntos, un grupo mayor de 79 compuestos como serie de entrenamiento para el desarrollo de la función de discriminante y el otro grupo menor de 19 compuestos como serie de predicción, utilizada para acceder al poder predictivo de las funciones encontradas. El primer modelo clasifica correctamente el 92.11% de los compuestos incluidos en la serie de entrenamiento; 6 compuestos mal clasificados de un total de 79 y el 84.21% de los compuestos en la serie de predicción; 3 compuestos mal clasificados de un total en la serie de 19. El segundo modelo tuvo un comportamiento similar en cuanto a los porcentajes de buena clasificación obteniéndose un 94.74% con 4 compuestos mal clasificados y un 84.21% con 3 compuestos mal clasificados en la serie de entrenamiento y predicción, respectivamente. En las Tablas 4.5 y 4.6 se muestran los cuadrados de la distancia de Malahanobis entre cada uno de los grupos (mecanismos) y la matriz de clasificación de las series de entrenamiento para los dos modelos obtenidos. En adición, en las Tablas 4.7 y 4.8 se muestran los resultados obtenidos con las dos funciones discriminantes para estas 2 series.

Tabla 4.5. Cuadrados de la distancia de Mahalanobis (D2) entre grupos (modos de acción) y porcentajes de buena clasificación (%) para la serie de entrenamiento usando el modelo 4.1 (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) % (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) (NAA) 0.00 13.28 40.40 5.05 16.28 (NAA) 94.12 16 0 0 0 1 (AchI) 0.00 60.99 8.46 29.84 (AchI) 81.82 2 9 0 0 0 (GR) 0.00 47.45 39.08 (GR) 100.00 0 0 8 0 0 (t) 0.00 14.11 (t) 90.91 0 2 0 20 0 (H) 0.00 (H) 94.44 1 0 0 0 17 Total 92.11 19 11 8 20 18

40 Resultados y Discusión

Tabla 4.6. Cuadrados de la distancia de Mahalanobis (D2) entre grupos (modos de acción) y porcentajes de buena clasificación (%) para la serie de entrenamiento usando el modelo 4.2 (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) % (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) (NAA) 0 13.28 40.4 5.05 16.28 (NAA) 88.24 15 0 0 2 0 (Achl) 0 60.99 8.46 29.84 (AchI) 100 0 11 0 0 0 (GR) 0 47.45 39.08 (GR) 100 0 0 8 0 0 (t) 0 14.11 (t) 100 0 0 0 22 0 (H) 0 (H) 88.89 0 0 0 2 16 Total 94.74 15 11 8 26 16

4.2 Interpretación en Términos Estructurales de los Modelos Obtenidos. 4.2.1 Análisis de la Naturaleza de las Variables Incluidas. Una inspección directa del modelo QSAR reportado anteriormente muestra la importancia de la presencia de heteroátomos y de hidrogenos ‘disociables’ unidos a heteroátomos. En este sentido los índices locales fueron seleccionados como mejores combinaciones de variables para describir la actividad antihelmíntica de los compuestos incluidos en la serie de entrenamiento. En ambos, al menos 1 variable total fue incluida en las funciones de clasificación de la actividad, estas variables totales incluyen índices

bilineales (b0(x)) de orden cero con contribuciones positivas a la actividad indicando la importancia de la talla y composición en átomos de las moléculas para su actividad. La alta contribución de variables locales puede ser función de que todos los modos de acción de los fármacos antihelmínticos son directos y especificos, actuando sobre receptores, en donde las interacciones no covalentes débiles propiciadas por la distribución electrónica creada por los heteroátomos son de gran importancia. No obstante, en ambas ecuaciones estan incluidas variables locales de ordenes superiores, demostrando que aunque se tenga una composición adecuada se necesita también un ambiente molecular adecuado para facilitar la interacción con los ‘target’ bioquímicos. Así por ejemplo, los antihelmínticos H-ionóforos, β-tubulínicos y acetilcolinesterásicos requieren grupos electroaceptores que faciliten la disociación de los grupos ácidos (tales como fenoles o aminas) o la activación de centros electrófilos en la molécula [77-32]. Los modelos ADL para los modos de acción antihelmínticos también validan esta explicación, pues en ambos casos se utilizan 1 parámetro total de orden cero y varios locales de heteroátomos para discriminar entre los diferentes modo de acción.

41 Resultados y Discusión

4.3 Virtual screening: Una Promisoria Alternativa para la Selección y el Diseño Racional de Fármacos Antihelmínticos. El screening virtual ha emergido como una interesante alternativa para el screening masivo de fármacos [23, 24]. Este proceso consiste en utilizar los modelos obtenidos en el ‘screening’ de grandes bases de datos con el objetivo de encontrar nuevos compuestos con la actividad biológica deseada. Otras técnicas computacionales como uso de la investigación de clusters y similaridad/disimilaridad y/o técnicas de modelación molecular tales como docking y superposición molecular, son también usados para el descubrimiento de fármacoforos y para optimizar el descubrimiento de los mismos. En el presente trabajo se realizo una búsqueda virtual de nuevos fármacos antihelmínticos utilizando las funciones obtenidas con los descriptores TOMOCOMD-CARDD calculados. Varios enfoques fueron utilizados en la manipulación del ‘screening’; todos con un objetivo en específico, pero con un objetivo general que los agrupa: encontrar en el menor tiempo y con el menor gasto de recursos posible un nuevo candidato a fármaco con actividad antihelmíntica, que presente grandes probabilidades de llegar a ser utilizado en terapéutica. Fueron manipuladas dos bases de datos para ser evaluadas en los modelos obtenidos: 1. Fármacos utilizados en la práctica clínica con gran variabilidad de rasgos estructurales y actividad farmacológicas; pero que no han sido reportadas en la literatura como antihelmínticos, 2. Compuestos sintetizados y caracterizados estructuralmente utilizando técnicas espectroscópicas en diversos Centros de Investigación extranjeros.

De lo expresado hasta este punto podemos plantear que existen 2 enfoques diferentes para encontrar un nuevo compuesto antihelmíntico: 1) diseño de nuevos compuestos para ser sintetizados en un laboratorio químico y posteriormente evaluados experimentalmente o 2) encontrar compuestos conocidos, con otras actividades o usos, en bases de datos químicas y probar su actividad antihelmíntica experimentalmente. Ambos enfoques son importantes y muy utilizados en la práctica farmacéutica, el primero permite el diseño de nuevos cabezas de serie con la actividad deseada, pero ellos

42 Resultados y Discusión

necesitan ser primeramente sintetizados, evaluados farmacológicamente y finalmente tienen que pasar a través de rigurosos test toxicológicos y farmacodinámicos. Sin embargo, los compuestos seleccionados con el segundo enfoque ya tienen métodos de síntesis bien establacidos y en muchos casos su comportamiento toxicológico y farmacodinámico es bien conocido, sobre todo para el caso de compuestos comercializados como fármacos. No obstante, en este trabajo ambos enfoques fueron utilizados con el proposito de encontrar nuevos compuestos antihelmínticos. Se desarrolló una exhaustiva búsqueda en el Merk Index [61], Negwer handbook [60], Goodman & Gilman [78], buscando compuestos para ser evaluados en los modelos. Un reducido grupo fue identificado por las funciones discriminantes como posibles antihelmínticos, entre estos, nosotros podemos encontrar conocidos fármacos con otras propiedades farmacológicas y con diversos usos. En la tabla 4.9 se muestran los compuestos seleccionados como antihelmínticos (predichos con una probabilidad posterior >0) por las Ec. 4.1 y Ec. 4.2, respectivamente. Existe gran variabilidad en las funciones farmacológicas y en las estructuras de estas moléculas. Estos compuestos identificados como activos, pero que no han sido reportados en la literatura como antihelmínticos están ahora en análisis con el objetivo de demostrar experimentalmente su actividad farmacológica. Estos resultados son unos de los más importantes criterios de validación de los modelos desarrollados en este trabajo pues son capaces de detectar una serie de compuestos como activos a partir de miles de compuestos incluidos en las bases de datos Como se planteó anteriormente en este trabajo considerar un compuesto como inactivo no significa afirmar que lo sea, sino que, es seguir el criterio de no reporte de la actividad objeto de estudio, en la tabla 4.9 se reportan 13 compuestos incluidos inicialmente en la data de los inactivos clasificados por lo modelos con actividad antihelmíntica, debido a

43 Resultados y Discusión

Tabla 4.7.Resultados de la clasificación de compuestos antihelmínticos para las series de entrenamiento y predicción (no estocástico). Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Nicotinic acetylcholine agonist (NAA)

Metyridine 0.94 0.00 0.00 0.06 0.00 Styrylpyridiniumchloride 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00 Antienite 0.82 0.04 0.00 0.14 0.00 Butamisole hydrochloride 0.57 0.01 0.00 0.42 0.00 R8231 0.89 0.00 0.00 0.10 0.00 Bephenium hydroxynaphaoate 0.98 0.00 0.00 0.02 0.00 Antafenite 0.73 0.00 0.00 0.27 0.00 Amphotalide 0.62 0.00 0.00 0.38 0.00 Nitramisole hidrochloride 0.62 0.19 0.00 0.19 0.00 Bemosat 0.98 0.00 0.00 0.02 0.00 Tetramisole hydrochloride 0.76 0.00 0.00 0.24 0.00 Difesyl 0.89 0.00 0.00 0.10 0.01 Levamisole hydrochloride 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 Stilbaziumiodide 0.99 0.00 0.01 0.00 0.00 Pyrantel tartrate 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 Antimony potasium tartrate 0.01 0.00 0.00 0.02 0.97 Morantel tartrate 0.94 0.00 0.00 0.05 0.00 Arecoline 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 Oxantel embonate 0.87 0.00 0.00 0.13 0.00 Tenium Closylate 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00

Acetylcholinesterase inhibitors (AChI)

Dichlorvos 0.15 0.64 0.00 0.21 0.00 Coumafos 0.21 0.69 0.00 0.10 0.00 Metrifonate 0.15 0.30 0.00 0.51 0.05 Coralop 0.29 0.57 0.00 0.14 0.00 Fospirate 0.03 0.91 0.00 0.06 0.00 Imcarbofos 0.00 0.99 0.00 0.01 0.00 Butonate 0.14 0.66 0.00 0.18 0.02 Uredofos 0.00 0.85 0.00 0.15 0.00 Famophos 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Diuredosan 0.00 0.80 0.00 0.20 0.00 Vincofos 0.64 0.16 0.00 0.20 0.00 Zilantel 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Crufomate 0.47 0.10 0.00 0.43 0.00 Naftalofos 0.10 0.85 0.00 0.05 0.00 Haloxon 0.17 0.66 0.00 0.14 0.03 Trichlorfan 0.15 0.30 0.00 0.51 0.05

GluCl receptor (GR)

Abamectin A 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Moxidectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Abamectin B 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Ivermectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Mibbemycin Oxime A4 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Doramectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Mibbemycin Oxime A3 0.01 0.00 0.98 0.00 0.00 Milbemycin D 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00

44 Resultados y Discusión

Tabla 4.7 Continuación Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b-Tubulin binding (t)

Carbendazim 0.05 0.00 0.00 0.95 0.00 Fenbendazole 0.08 0.00 0.00 0.91 0.00 Tiabendazole 0.26 0.00 0.00 0.74 0.00 Oxfendazole 0.04 0.03 0.00 0.94 0.00 Lobendazole 0.05 0.00 0.00 0.94 0.00 Dribendazole 0.10 0.00 0.00 0.89 0.00 Bendamizole 0.16 0.02 0.00 0.82 0.00 Flubendazole 0.07 0.00 0.00 0.92 0.01 Tioxidazole 0.46 0.02 0.00 0.52 0.00 Mebendazole 0.09 0.00 0.00 0.90 0.00 Albendazole 0.06 0.00 0.00 0.94 0.00 Benacyl 0.45 0.04 0.00 0.50 0.00 Oxibendazole 0.06 0.00 0.00 0.94 0.00 Etibendazole 0.07 0.00 0.00 0.92 0.02 Ciclobendazole 0.06 0.00 0.00 0.93 0.00 Febantel 0.00 0.00 0.00 0.99 0.01 Parbendazole 0.11 0.00 0.00 0.89 0.00 Bisbendazole 0.07 0.50 0.00 0.43 0.00 Triclabendazole 0.08 0.00 0.00 0.17 0.75 Luxabendazole 0.00 0.57 0.00 0.43 0.00 Nocodazole 0.05 0.00 0.00 0.94 0.00 Benomyl 0.14 0.03 0.00 0.83 0.00 Cambendazole 0.02 0.00 0.00 0.98 0.00 Triclabendazole sulphoxide 0.11 0.02 0.00 0.67 0.20 Thiophanate 0.00 0.00 0.00 0.99 0.00 Albendazole sulphoxide 0.03 0.04 0.00 0.94 0.00 Furodazole 0.11 0.00 0.00 0.89 0.00

Proton ionophores (H)

Niclofolan 0.01 0.00 0.00 0.13 0.86 Fluranteel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Bromofenofos 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Salantel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Sinid 0.15 0.06 0.00 0.13 0.66 Trichlorophen 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Oxyclozanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Closantel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Hexachlorophenimonophosphate 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Desaspidin 0.01 0.00 0.00 0.04 0.95 Niclosamide 0.02 0.00 0.00 0.23 0.75 Bethionol 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Nitroclofene 0.01 0.00 0.00 0.11 0.87 Rafoxanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Resurantel 0.00 0.00 0.00 0.04 0.95 Hexachlorophene 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Dichlorophen 0.06 0.00 0.00 0.04 0.91 Dibromomsalan 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Brotianide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Tribromsalam 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Afesal 0.10 0.00 0.00 0.39 0.51 Bromoxanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Ticarbodine 0.41 0.00 0.00 0.31 0.28

45 Resultados y Discusión

Tabla 4.8 Resultados de la clasificación de compuestos antihelmínticos para las series de entrenamiento y predicción ( estocástico). Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Nicotinic acetylcholine agonist (NAA)

Metyridine 0.88 0.00 0.00 0.12 0.00 Styrylpyridiniumchloride 0.96 0.00 0.00 0.04 0.00 Antienite 0.67 0.02 0.00 0.31 0.00 Butamisole hydrochloride 0.40 0.00 0.00 0.60 0.00 R8231 0.82 0.00 0.00 0.17 0.01 Bephenium hydroxynaphaoate 0.98 0.00 0.00 0.02 0.00 Antafenite 0.66 0.00 0.00 0.34 0.00 Amphotalide 0.52 0.00 0.00 0.48 0.00 Nitramisole hidrochloride 0.64 0.01 0.00 0.35 0.00 Bemosat 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00 Tetramisole hydrochloride 0.67 0.00 0.00 0.33 0.00 Difesyl 0.67 0.00 0.00 0.18 0.15 Levamisole hydrochloride 0.85 0.00 0.00 0.15 0.00 Stilbaziumiodide 0.85 0.00 0.14 0.00 0.00 Pyrantel tartrate 0.82 0.00 0.00 0.18 0.00 Antimony potasium tartrate 0.16 0.00 0.00 0.51 0.33 Morantel tartrate 0.85 0.00 0.00 0.15 0.00 Arecoline 0.77 0.00 0.00 0.23 0.00 Oxantel embonate 0.72 0.00 0.00 0.28 0.00 Tenium Closylate 0.94 0.00 0.00 0.06 0.00

Acetylcholinesterase inhibitors (AChI)

Dichlorvos 0.00 0.99 0.00 0.01 0.00 Coumafos 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Metrifonate 0.01 0.45 0.00 0.53 0.01 Coralop 0.26 0.43 0.00 0.31 0.00 Fospirate 0.00 0.99 0.00 0.01 0.00 Imcarbofos 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Butonate 0.00 0.99 0.00 0.01 0.00 Uredofos 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Famophos 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Diuredosan 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Vincofos 0.00 0.99 0.00 0.01 0.00 Zilantel 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Crufomate 0.03 0.93 0.00 0.04 0.00 Naftalofos 0.17 0.63 0.00 0.20 0.00 Haloxon 0.00 0.98 0.00 0.02 0.00 Trichlorfan 0.01 0.45 0.00 0.53 0.01

GluCl receptor (GR)

Abamectin A 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Moxidectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Abamectin B 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Ivermectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Mibbemycin Oxime A4 0.01 0.00 0.99 0.00 0.00 Doramectin 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 Mibbemycin Oxime A3 0.02 0.00 0.97 0.01 0.00 Milbemycin D 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00

46 Resultados y Discusión

Tabla 4.8 Continuación . Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Compuesto (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) β-Tubulin binding (t)

Carbendazim 0.10 0.00 0.00 0.90 0.00 Fenbendazole 0.17 0.00 0.00 0.83 0.00 Tiabendazole 0.36 0.00 0.00 0.64 0.00 Oxfendazole 0.10 0.00 0.00 0.90 0.00 Lobendazole 0.12 0.00 0.00 0.88 0.00 Dribendazole 0.14 0.00 0.00 0.86 0.00 Bendamizole 0.22 0.00 0.00 0.78 0.00 Flubendazole 0.21 0.00 0.00 0.78 0.01 Tioxidazole 0.32 0.00 0.00 0.67 0.00 Mebendazole 0.24 0.00 0.00 0.76 0.00 Albendazole 0.08 0.00 0.00 0.91 0.00 Benacyl 0.49 0.00 0.00 0.51 0.00 Oxibendazole 0.10 0.00 0.00 0.90 0.00 Etibendazole 0.22 0.00 0.00 0.76 0.02 Ciclobendazole 0.13 0.00 0.00 0.87 0.00 Febantel 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 Parbendazole 0.17 0.00 0.00 0.83 0.00 Bisbendazole 0.06 0.45 0.00 0.49 0.00 Triclabendazole 0.25 0.00 0.00 0.48 0.27 Luxabendazole 0.02 0.12 0.00 0.86 0.00 Nocodazole 0.10 0.00 0.00 0.90 0.00 Benomyl 0.08 0.00 0.00 0.92 0.00 Cambendazole 0.08 0.00 0.00 0.90 0.01 Triclabendazole sulphoxide 0.14 0.00 0.00 0.55 0.30 Thiophanate 0.00 0.00 0.00 0.78 0.22 Albendazole sulphoxide 0.05 0.01 0.00 0.95 0.00 Furodazole 0.24 0.00 0.00 0.71 0.05

Proton ionophores (H)

Niclofolan 0.00 0.00 0.00 0.04 0.96 Fluranteel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Bromofenofos 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Salantel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Sinid 0.37 0.04 0.00 0.51 0.09 Trichlorophen 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Oxyclozanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Closantel 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Hexachlorophenimonophosphate 0.02 0.17 0.00 0.76 0.04 Desaspidin 0.00 0.00 0.00 0.02 0.98 Niclosamide 0.06 0.00 0.00 0.42 0.53 Bethionol 0.00 0.00 0.00 0.02 0.98 Nitroclofene 0.02 0.00 0.00 0.18 0.80 Rafoxanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Resurantel 0.00 0.00 0.00 0.02 0.98 Hexachlorophene 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Dichlorophen 0.09 0.00 0.00 0.09 0.82 Dibromomsalan 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Brotianide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Tribromsalam 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Afesal 0.24 0.00 0.00 0.46 0.31 Bromoxanide 0.00 0.00 0.00 0.00 1.00 Ticarbodine 0.33 0.00 0.00 0.26 0.41

47 Resultados y Discusión

Tabla 4.9 Compuestos clasificados como antihelmínticos por los modelos 4.1 y 4.2 a partir de una base de datos de compuestos con otras actividades farmacológicas reportadas. Nombre ∆P%a ∆P%b Nombre ∆P%a ∆P%b Furosemide beta-diethylaminoethyl 0.48 17.95 Estrone 28.30 27.91 ester N.H.C 5.65 38.08 Hydroxyestrone 5.91 11.32 B arteether 13.39 2.34 Zoxazolamine 18.75 62.03 Remifentanilo 29.08 57.67 Ramnodigin 41.51 8.60 Naltrexona 22.58 3.22 Tetramethrin 4.67 35.03 Histamithizine 15.67 53.00 Selectan 10.82 52.51 Fluperlapine 14.99 12.35 a; b se corresponden con las ecuaciones 4.1 y 4.2 respectivamente que en realidad pudieran poseer dicha actividad existe la posibilidad de que se conviertan en nuevas cabezas de serie a las que ya se les conoce un gran número de parámetros por constituir fármacos en uso. Utilizando el mismo proceder que para los fármacos convencionales, se seleccionaron compuestos sintetizados y caracterizados estructuralmente utilizando técnicas espectroscópicas en diversos Centros de Investigación extranjeros. En este caso hemos utilizado los modelos para tamizar (como filtro) y descartar una gran parte de compuestos para pruebas experimentales, con el consiguiente ahorro de recursos, tiempo y animales de laboratorio. Los resultados del screening virtual de esta base de datos se muestran en la tabla 1 de los anexos. Los compuestos 94, 109d, 110, 141, 151, fueron clasificados como activos con una probabilidad de clasificacion superiror a 0.97, sus posibles mecanismos de acción se corresponden con (t),(NAA),(GR), (NAA), (NAA) respectivamente, lo cual está en correspondencia con sus características estructurales. Varios de estos compuestos están siendo evaluados experimentalmente con vistas a corroborar la predicción.

48 V-CONCLUSIONES

Las conclusiones generales de nuestro trabajo, muy relacionadas con los objetivos propuestos para el mismo, son expuestas a continuación: 9 Se conformó una base de datos de compuestos químicos a los que se les han reportado actividad contra cualquier tipo de clase o género de helminto y se clasificaron según su modo de acción. 9 Se desarrollaron funciones discriminantes que permiten predecir la actividad antihelmíntica y estimar el modo de acción de nuevas entidades químicas potencialmente bioactivas utilizando los descriptores TOMOCOMD-CARDD computados. 9 Se interpretaron en términos estructurales los modelos encontrados, lo que nos permite explicar desde el punto de vista químico-físico la acción antihelmíntica de varios compuestos cabezas de series. 9 Se desarrolló un ‘screening’ virtual masivo de grandes bases de datos de compuestos químicos, identificándose nuevos subsistemas moleculares como posibles bioactivos.

49 VI-RECOMENDACIONES

• Corroborar las predicciones realizadas en estudios experimentales. • Realizar la modelación de la actividad antihelmíntica ‘personalizando’ los modelos para cada tipo de los helmintos parásitos en específico. • Obtener valores cuantitativos de la actividad antihelmíntica que permitan obtener modelos QSAR utilizando técnicas de correlaciones tales como la RLM, que posibiliten predecir la actividad cuantitativa de nuevos compuestos antihelmínticos que hayan sido seleccionados por los modelos obtenidos con el ADL. • Extender estos resultados a la aplicación de otros descriptores moleculares nuevos que han sido implementados en el software TOMO-COMD.

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54 59. Marrero-Ponce, Y.; Romero, V. TOMOCOMD software. Central University of Las Villas. 2002. TOMOCOMD (TOpological MOlecular COMputer Design) for Windows, version 1.0 is a preliminary experimental version; in future a professional version will be obtained upon request to Y. Marrero: [email protected] or [email protected] 60. Marting Negwer. Organic-chemical Drugs and their synonyms. Ed. Akademie-verlag. 1987. 61. Chapman & Hall. The Merk Index. Twelfth Edition.1996. 62. Marrero-Ponce, Y.; Romero, V. TOMOCOMD software. Central University of Las Villas. 2002. TOMOCOMD 63. Kier L. B; Hall, L. H. Molecular Connectivity in Structure–Activity Analysis, Research Studies Press: Letchworth, U.K, 1986. 64. van de Waterbeemd, H. Discriminant Analysis for Activity Prediction. In: Manhnhold, R., Krogsgaard-Larsen, L., Timmerman, H. (Eds.), Methods and Principles in Medicinal Chemistry. Chemometric Methods in Molecular design, Van Waterbeemd, H. (Ed.), VCH, Weinhiem.1995, 2, 265-288.

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56 ANEXOS

Tabla 1. Clasificación de compuestos sintetizados en Centros de Investigación extranjeros. Compuesto a∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) Serie1 Va1-13 0.10 0.45 0.02 0.00 0.53 0.00 0.73 0.27 0.00 0.00 0.72 0.01 Va1-15 0.25 0.51 0.01 0.00 0.47 0.01 0.67 0.57 0.00 0.00 0.42 0.01 Va1-31 0.19 0.81 0.05 0.00 0.14 0.00 0.32 0.71 0.00 0.00 0.29 0.00 Va2-10 0.27 0.50 0.03 0.00 0.47 0.00 0.85 0.30 0.00 0.00 0.69 0.02 Va2-17 0.40 0.64 0.01 0.00 0.34 0.00 0.80 0.58 0.00 0.00 0.39 0.02 Va2-38 0.22 0.66 0.01 0.00 0.32 0.00 0.39 0.49 0.00 0.00 0.51 0.00 Va3-1f 0.28 0.88 0.01 0.00 0.12 0.00 0.45 0.77 0.00 0.00 0.23 0.00 Va4-6b 0.24 0.52 0.01 0.00 0.46 0.01 0.63 0.58 0.00 0.00 0.41 0.00 Va4-10 0.79 0.03 0.47 0.00 0.51 0.00 0.84 0.15 0.01 0.00 0.84 0.00 Va5-5b 0.45 0.58 0.02 0.00 0.41 0.00 0.58 0.54 0.00 0.00 0.44 0.02 Va5-6 0.47 0.42 0.16 0.00 0.42 0.00 0.55 0.39 0.00 0.00 0.61 0.00 Va5-10 0.29 0.23 0.06 0.00 0.71 0.00 0.28 0.35 0.00 0.00 0.64 0.00 Va5-14g 0.18 0.95 0.01 0.00 0.05 0.00 0.62 0.94 0.00 0.00 0.06 0.00 Va5-14j 0.09 0.80 0.04 0.00 0.16 0.00 0.36 0.81 0.00 0.00 0.19 0.00 Va5-15c 0.73 0.30 0.01 0.00 0.69 0.01 0.82 0.46 0.00 0.00 0.52 0.02 Va6-6b 0.44 0.77 0.07 0.00 0.16 0.00 0.33 0.74 0.00 0.00 0.26 0.00 Va6-17b 0.16 0.44 0.09 0.03 0.43 0.00 0.80 0.03 0.00 0.96 0.01 0.00 Vax-2 0.45 0.34 0.01 0.00 0.64 0.01 0.71 0.31 0.00 0.00 0.69 0.00 Vax-6 0.58 0.35 0.01 0.00 0.64 0.01 0.78 0.26 0.00 0.00 0.74 0.01 Vax-7 0.19 0.35 0.01 0.00 0.64 0.00 0.32 0.30 0.00 0.00 0.70 0.01 Vax-12 0.00 0.33 0.02 0.00 0.65 0.00 0.23 0.38 0.00 0.00 0.62 0.00 Vax-16 0.44 0.38 0.01 0.00 0.60 0.01 0.74 0.39 0.00 0.00 0.60 0.02 Vax-18 0.04 0.81 0.05 0.00 0.14 0.00 0.51 0.72 0.00 0.00 0.28 0.00 Vax-20 0.36 0.27 0.01 0.00 0.72 0.00 0.39 0.33 0.00 0.00 0.66 0.00 Vax-21 0.41 0.32 0.01 0.00 0.67 0.00 0.53 0.34 0.00 0.00 0.65 0.01 Vax-22 0.48 0.44 0.00 0.00 0.55 0.00 0.44 0.65 0.00 0.00 0.35 0.00 VAM1 0.50 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.90 0.65 0.03 0.00 0.31 0.00 VA-M2* 0.83 0.30 0.66 0.02 0.02 0.00 0.98 0.02 0.00 0.98 0.00 0.00 VAM4 0.37 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.86 0.65 0.04 0.00 0.31 0.00 VA-M5* 0.83 0.30 0.66 0.02 0.02 0.00 0.98 0.02 0.00 0.98 0.00 0.00 VAM6* 0.83 0.03 0.81 0.00 0.16 0.00 0.95 0.14 0.00 0.00 0.83 0.03 VAM7 0.38 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.86 0.65 0.04 0.00 0.31 0.00 VA-M8* 0.84 0.30 0.66 0.02 0.02 0.00 0.98 0.02 0.00 0.98 0.00 0.00 VAM9* 0.90 0.03 0.63 0.00 0.34 0.00 0.96 0.11 0.00 0.00 0.84 0.05 VAM10 0.54 0.06 0.92 0.00 0.01 0.00 0.94 0.78 0.00 0.10 0.11 0.00 VA-M11* 0.89 0.02 0.01 0.98 0.00 0.00 0.99 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 VAM12* 0.89 0.13 0.59 0.00 0.28 0.00 0.98 0.34 0.00 0.02 0.59 0.05 VAM13 0.69 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.91 0.32 0.31 0.00 0.37 0.00 VA-M14* 0.97 0.01 0.99 0.00 0.00 0.00 0.99 0.26 0.01 0.68 0.05 0.00 VAM15* 0.93 0.00 0.97 0.00 0.02 0.00 0.97 0.06 0.01 0.00 0.92 0.01 VAM16 0.32 0.00 0.99 0.00 0.00 0.00 0.79 0.36 0.15 0.00 0.48 0.00 VAM17* 0.81 0.01 0.88 0.00 0.11 0.00 0.94 0.05 0.00 0.00 0.93 0.02 VAM18 0.37 0.01 0.99 0.00 0.00 0.00 0.82 0.38 0.14 0.00 0.47 0.00 VAM19* 0.83 0.02 0.86 0.00 0.13 0.00 0.95 0.06 0.00 0.00 0.92 0.02 VAM20 0.42 0.01 0.99 0.00 0.00 0.00 0.85 0.41 0.13 0.00 0.46 0.00

Anexos

Tabla 1. Continuación Compuesto a∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) VAM21* 0.85 0.02 0.83 0.00 0.15 0.00 0.96 0.06 0.00 0.00 0.92 0.02 VAM22 0.25 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.72 0.68 0.03 0.00 0.29 0.00 VAM23* 0.82 0.30 0.66 0.02 0.02 0.00 0.98 0.02 0.00 0.98 0.00 0.00 VAM24 0.26 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.71 0.68 0.03 0.00 0.29 0.00 VAM25 0.27 0.01 0.98 0.00 0.00 0.00 0.71 0.68 0.03 0.00 0.29 0.00 VAM2-1 0.02 0.46 0.02 0.00 0.51 0.00 0.29 0.41 0.00 0.00 0.59 0.00 VAM2-2 0.08 0.52 0.02 0.00 0.46 0.00 0.39 0.44 0.00 0.00 0.56 0.00 VAM2-3 0.14 0.57 0.01 0.00 0.41 0.00 0.42 0.49 0.00 0.00 0.51 0.00 VAM2-4 0.20 0.66 0.01 0.00 0.34 0.00 0.47 0.74 0.00 0.00 0.26 0.00 VA7-34 0.34 0.29 0.01 0.00 0.70 0.01 0.76 0.30 0.00 0.00 0.68 0.02 VA7-35 0.39 0.34 0.01 0.00 0.65 0.01 0.80 0.35 0.00 0.00 0.64 0.02 VA7-37 0.53 0.47 0.00 0.00 0.52 0.01 0.71 0.64 0.00 0.00 0.34 0.02 VA7-38 0.22 0.54 0.01 0.00 0.45 0.00 0.23 0.72 0.00 0.00 0.27 0.01 VA7-37 0.10 0.84 0.03 0.00 0.12 0.00 0.40 0.75 0.00 0.00 0.25 0.00 VA7-71 0.22 0.89 0.02 0.00 0.09 0.00 0.53 0.88 0.00 0.00 0.11 0.00 VA5-5a 0.17 0.66 0.01 0.00 0.33 0.00 0.44 0.60 0.00 0.00 0.40 0.00 VA5-5c 0.76 0.59 0.02 0.00 0.39 0.00 0.87 0.51 0.00 0.00 0.47 0.02 VA5-5e 0.30 0.83 0.00 0.00 0.17 0.00 0.30 0.76 0.00 0.00 0.23 0.01 VA5-8pre 0.45 0.81 0.01 0.00 0.18 0.00 0.73 0.79 0.00 0.00 0.20 0.01 VA5-8 0.36 0.28 0.01 0.00 0.71 0.00 0.42 0.23 0.00 0.00 0.74 0.03 VA5-12b 0.09 0.60 0.04 0.00 0.37 0.00 0.31 0.56 0.00 0.00 0.43 0.01 G-1 0.97 0.05 0.00 0.00 0.02 0.93 0.74 0.04 0.00 0.00 0.02 0.94 AR 1 0.69 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 0.09 0.96 0.00 0.00 0.04 0.00 AR 2 0.59 0.92 0.00 0.00 0.07 0.00 0.03 0.96 0.00 0.00 0.03 0.00 AR 3 0.59 0.92 0.00 0.00 0.07 0.00 0.04 0.96 0.00 0.00 0.03 0.00 Serie 2 4 0.43 0.60 0.00 0.00 0.38 0.02 0.36 0.33 0.00 0.00 0.61 0.06 12 0.37 0.00 0.00 0.00 0.08 0.92 0.16 0.00 0.00 0.00 0.04 0.96 13 0.51 0.00 0.00 0.00 0.02 0.98 0.03 0.00 0.00 0.00 0.01 0.99 28 0.10 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 0.18 0.89 0.00 0.00 0.10 0.01 30 0.52 0.92 0.02 0.00 0.07 0.00 0.08 0.69 0.03 0.00 0.29 0.00 37 0.40 0.81 0.00 0.00 0.10 0.09 0.28 0.68 0.00 0.00 0.27 0.05 45 0.39 0.73 0.00 0.00 0.19 0.08 0.60 0.50 0.00 0.00 0.27 0.22 52 0.02 0.94 0.00 0.00 0.05 0.01 0.18 0.89 0.00 0.00 0.06 0.05 58 0.06 0.51 0.00 0.00 0.39 0.09 0.12 0.33 0.00 0.00 0.31 0.37 72 0.26 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 0.53 0.89 0.00 0.00 0.11 0.00 76* 0.93 0.49 0.01 0.00 0.50 0.00 0.82 0.61 0.00 0.00 0.39 0.00 77 0.65 0.95 0.00 0.00 0.05 0.00 0.59 0.92 0.00 0.00 0.08 0.00 0081a 0.79 0.63 0.00 0.00 0.37 0.00 0.61 0.77 0.00 0.00 0.22 0.01 0081d 0.35 0.45 0.00 0.00 0.55 0.00 0.06 0.56 0.00 0.00 0.43 0.02 0082a* 0.94 0.94 0.01 0.00 0.06 0.00 0.92 0.87 0.00 0.00 0.13 0.00 0082b 0.84 0.87 0.02 0.00 0.11 0.00 0.72 0.72 0.00 0.00 0.28 0.00 0082c 0.80 0.87 0.02 0.00 0.11 0.00 0.61 0.73 0.00 0.00 0.27 0.00 83 0.79 0.71 0.00 0.00 0.29 0.00 0.78 0.89 0.00 0.00 0.11 0.00 85* 0.99 0.05 0.00 0.00 0.93 0.02 0.81 0.90 0.00 0.00 0.10 0.00 0086a 0.36 0.99 0.00 0.00 0.01 0.00 0.86 0.81 0.00 0.19 0.01 0.00 0087a 0.75 0.96 0.01 0.00 0.03 0.00 0.95 0.94 0.00 0.02 0.04 0.00

Anexos

Tabla 1. Continuación Compuesto a∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) 0087b 0.32 0.90 0.05 0.00 0.05 0.00 0.77 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 0087c 0.32 0.90 0.05 0.00 0.05 0.00 0.77 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 88* 0.85 0.71 0.00 0.00 0.28 0.00 0.86 0.90 0.00 0.00 0.09 0.01 89 0.77 0.59 0.00 0.00 0.41 0.00 0.67 0.79 0.00 0.00 0.21 0.00 90* 0.99 0.02 0.00 0.00 0.98 0.00 0.91 0.53 0.00 0.00 0.47 0.00 91* 0.81 0.30 0.01 0.00 0.69 0.00 0.89 0.68 0.00 0.00 0.28 0.04 92* 0.81 0.67 0.00 0.00 0.33 0.00 0.91 0.89 0.00 0.00 0.10 0.01 94* 1.00 0.00 0.00 0.00 0.99 0.00 1.00 0.01 0.00 0.98 0.00 0.00 96 0.90 0.05 0.00 0.00 0.95 0.00 0.71 0.27 0.00 0.00 0.73 0.00 97 0.51 0.36 0.00 0.00 0.63 0.00 0.53 0.46 0.00 0.00 0.54 0.00 0097a 0.50 0.55 0.00 0.00 0.45 0.00 0.55 0.73 0.00 0.00 0.27 0.00 99 0.81 0.01 0.00 0.00 0.99 0.00 0.16 0.11 0.00 0.00 0.89 0.00 0099a 0.97 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.74 0.06 0.00 0.00 0.94 0.00 0099b 0.81 0.01 0.00 0.00 0.99 0.00 0.16 0.11 0.00 0.00 0.89 0.00 0099c 0.97 0.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.74 0.06 0.00 0.00 0.94 0.00 100 0.36 0.39 0.00 0.00 0.60 0.00 0.40 0.50 0.00 0.00 0.50 0.00 0100a 0.69 0.15 0.00 0.00 0.85 0.00 0.44 0.45 0.00 0.00 0.55 0.00 0100b 0.36 0.39 0.00 0.00 0.60 0.00 0.40 0.50 0.00 0.00 0.50 0.00 0100c 0.69 0.15 0.00 0.00 0.85 0.00 0.44 0.45 0.00 0.00 0.55 0.00 0101a 0.08 0.97 0.00 0.00 0.02 0.00 0.61 0.96 0.00 0.00 0.04 0.00 0101b 0.10 0.94 0.01 0.00 0.05 0.00 0.39 0.89 0.00 0.00 0.10 0.00 102 0.90 0.05 0.24 0.00 0.70 0.00 0.59 0.18 0.03 0.00 0.79 0.00 0102a* 0.95 0.14 0.03 0.00 0.83 0.00 0.96 0.52 0.00 0.00 0.48 0.00 0102b 0.86 0.12 0.13 0.00 0.75 0.00 0.71 0.36 0.02 0.00 0.62 0.00 0102c* 0.96 0.07 0.06 0.00 0.88 0.00 0.94 0.30 0.00 0.00 0.70 0.00 103 0.53 0.52 0.37 0.00 0.11 0.00 0.65 0.66 0.01 0.00 0.34 0.00 0103a 0.37 0.92 0.04 0.00 0.04 0.00 0.88 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 0103b 0.40 0.79 0.13 0.00 0.07 0.00 0.80 0.82 0.00 0.00 0.18 0.00 0103c 0.50 0.79 0.13 0.00 0.07 0.00 0.79 0.84 0.00 0.00 0.16 0.00 104 0.35 0.30 0.01 0.00 0.69 0.00 0.56 0.39 0.00 0.00 0.61 0.00 0104a 0.65 0.05 0.00 0.00 0.94 0.00 0.45 0.15 0.00 0.00 0.85 0.00 0104b 0.40 0.48 0.00 0.00 0.52 0.00 0.63 0.66 0.00 0.00 0.34 0.00 0104c 0.71 0.10 0.00 0.00 0.89 0.00 0.51 0.35 0.00 0.00 0.65 0.00 105* 0.89 0.85 0.00 0.00 0.15 0.00 0.92 0.77 0.00 0.00 0.23 0.00 0106a 0.67 0.12 0.00 0.00 0.88 0.00 0.21 0.41 0.00 0.00 0.58 0.01 107 0.52 0.92 0.02 0.00 0.07 0.00 0.08 0.69 0.03 0.00 0.29 0.00 109* 0.95 0.90 0.03 0.00 0.08 0.00 0.86 0.80 0.00 0.00 0.19 0.00 0109a* 0.95 0.95 0.01 0.00 0.04 0.00 0.90 0.93 0.00 0.00 0.07 0.00 0109b* 0.95 0.98 0.00 0.00 0.02 0.00 0.93 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00 0109c* 0.99 0.95 0.01 0.00 0.04 0.00 0.96 0.92 0.00 0.00 0.08 0.00 0109d* 0.99 0.98 0.00 0.00 0.02 0.00 0.97 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00 110* 0.98 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.99 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 112 0.45 0.94 0.00 0.00 0.06 0.00 0.46 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 113* 0.90 0.91 0.01 0.00 0.08 0.00 0.89 0.89 0.00 0.00 0.11 0.00 114* 0.94 0.28 0.00 0.00 0.71 0.01 0.94 0.87 0.00 0.00 0.09 0.04 134 0.49 0.95 0.00 0.00 0.04 0.01 0.49 0.92 0.00 0.00 0.07 0.00 137 0.21 0.89 0.00 0.00 0.05 0.06 0.39 0.85 0.00 0.00 0.08 0.07

Anexos

Tabla 1. Continuación Compuesto a∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) 141* 0.98 0.88 0.02 0.00 0.10 0.01 0.97 0.84 0.00 0.00 0.11 0.05 142 0.44 0.97 0.00 0.00 0.03 0.00 0.58 0.95 0.00 0.00 0.05 0.00 143 0.77 0.81 0.06 0.00 0.13 0.00 0.81 0.78 0.00 0.00 0.21 0.00 144* 0.81 0.86 0.02 0.00 0.11 0.00 0.87 0.80 0.00 0.00 0.20 0.00 145* 0.98 0.58 0.23 0.00 0.18 0.00 0.94 0.59 0.03 0.00 0.38 0.00 147 0.77 0.78 0.07 0.00 0.14 0.00 0.73 0.78 0.00 0.00 0.22 0.00 148* 0.80 0.85 0.03 0.00 0.13 0.00 0.82 0.79 0.00 0.00 0.21 0.00 149* 0.98 0.88 0.02 0.00 0.10 0.01 0.97 0.84 0.00 0.00 0.11 0.05 150* 0.93 0.95 0.00 0.00 0.04 0.00 0.94 0.95 0.00 0.00 0.05 0.00 151* 0.98 0.88 0.02 0.00 0.10 0.01 0.97 0.84 0.00 0.00 0.12 0.04 152* 0.99 0.76 0.11 0.00 0.14 0.00 0.97 0.78 0.01 0.00 0.22 0.00 153* 0.90 0.91 0.01 0.00 0.08 0.00 0.89 0.89 0.00 0.00 0.11 0.00 154 0.69 0.96 0.00 0.00 0.04 0.00 0.77 0.94 0.00 0.00 0.06 0.00 155* 0.90 0.93 0.01 0.00 0.06 0.00 0.91 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 156* 0.88 0.88 0.03 0.00 0.09 0.00 0.84 0.89 0.00 0.00 0.11 0.00 157* 0.85 0.88 0.03 0.00 0.09 0.00 0.84 0.88 0.00 0.00 0.12 0.00 158* 0.91 0.93 0.01 0.00 0.06 0.00 0.90 0.91 0.00 0.00 0.09 0.00 Serie 3 1b00 0.37 0.03 0.50 0.00 0.47 0.00 0.05 0.08 0.34 0.00 0.58 0.00 1b01 0.21 0.02 0.37 0.00 0.61 0.00 0.06 0.03 0.15 0.00 0.82 0.00 1b02 0.02 0.02 0.37 0.00 0.61 0.00 0.00 0.04 0.15 0.00 0.82 0.00 1b03 0.21 0.02 0.37 0.00 0.61 0.00 0.06 0.03 0.15 0.00 0.82 0.00 1b05 0.03 0.01 0.25 0.00 0.74 0.00 0.19 0.01 0.05 0.00 0.94 0.00 1b13 0.31 0.02 0.68 0.00 0.30 0.00 0.07 0.06 0.36 0.00 0.58 0.00 1b15 0.31 0.02 0.68 0.00 0.30 0.00 0.07 0.06 0.36 0.00 0.58 0.00 1d00 0.85 0.02 0.57 0.00 0.41 0.00 0.28 0.06 0.31 0.00 0.63 0.00 1d01 0.80 0.01 0.44 0.00 0.55 0.00 0.29 0.02 0.13 0.00 0.84 0.00 1d02 0.72 0.01 0.44 0.00 0.55 0.00 0.24 0.02 0.13 0.00 0.84 0.00 1d03 0.80 0.01 0.44 0.00 0.55 0.00 0.29 0.02 0.13 0.00 0.84 0.00 1d04 0.63 0.01 0.30 0.00 0.69 0.00 0.33 0.01 0.03 0.00 0.95 0.01 1d05 0.72 0.01 0.31 0.00 0.68 0.00 0.41 0.01 0.04 0.00 0.95 0.00 1d06 0.63 0.01 0.30 0.00 0.69 0.00 0.33 0.01 0.03 0.00 0.95 0.01 1d07 0.89 0.01 0.34 0.00 0.65 0.00 0.13 0.02 0.11 0.00 0.86 0.01 1d09 0.89 0.01 0.34 0.00 0.65 0.00 0.13 0.02 0.11 0.00 0.86 0.01 1d13 0.83 0.01 0.74 0.00 0.25 0.00 0.29 0.04 0.33 0.00 0.62 0.01 1d14 0.80 0.01 0.74 0.00 0.25 0.00 0.20 0.04 0.33 0.00 0.62 0.01 1d15 0.83 0.01 0.74 0.00 0.25 0.00 0.29 0.04 0.33 0.00 0.62 0.01 1e00 0.53 0.00 0.97 0.00 0.03 0.00 0.29 0.01 0.86 0.00 0.13 0.00 1e01 0.38 0.00 0.94 0.00 0.06 0.00 0.30 0.00 0.66 0.00 0.33 0.00 1e02 0.21 0.00 0.94 0.00 0.06 0.00 0.24 0.00 0.67 0.00 0.33 0.00 1e03 0.38 0.00 0.94 0.00 0.06 0.00 0.30 0.00 0.66 0.00 0.33 0.00 1e04 0.06 0.00 0.90 0.00 0.10 0.00 0.34 0.00 0.30 0.00 0.70 0.00 1e05 0.22 0.00 0.90 0.00 0.10 0.00 0.41 0.00 0.34 0.00 0.65 0.00 1e06 0.06 0.00 0.90 0.00 0.10 0.00 0.34 0.00 0.30 0.00 0.70 0.00 1e07 0.63 0.00 0.91 0.00 0.09 0.00 0.14 0.00 0.62 0.00 0.37 0.00 1e09 0.63 0.00 0.91 0.00 0.09 0.00 0.14 0.00 0.62 0.00 0.37 0.00 1e11 0.71 0.00 0.79 0.00 0.21 0.00 0.01 0.00 0.30 0.00 0.70 0.00

Anexos

Tabla 1. Continuación Compuesto a∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) b∆P (NAA) (AchI) (GR) (t) (H) 1e13 0.48 0.00 0.98 0.00 0.02 0.00 0.30 0.00 0.87 0.00 0.13 0.00 1e14 0.41 0.00 0.98 0.00 0.02 0.00 0.21 0.00 0.87 0.00 0.13 0.00 1e15 0.48 0.00 0.98 0.00 0.02 0.00 0.30 0.00 0.87 0.00 0.13 0.00 2b 0.64 0.78 0.00 0.00 0.21 0.01 0.52 0.67 0.00 0.00 0.31 0.02 2c 0.62 0.42 0.00 0.00 0.24 0.33 0.28 0.48 0.00 0.00 0.24 0.28 2d 0.30 0.92 0.00 0.00 0.08 0.00 0.61 0.88 0.00 0.00 0.12 0.00 a,b Se corresponden con las probabilidades de clasificación obtenidas con las ecuaciones 4.1 y 4.2 respectivamente. * Compuestos con probabilidade de clasificacion mayor que 0.80 .