MORPHOLOGICAL VARIATION IN THREE PARTIALLY SYMPATRIC OF THE GENUS (RODENTIA, )

Renan Maestri¹; Rodrigo Fornel²; Jorge Reppold Marinho²; Thales Renato Ochotorena de Freitas¹

1Laboratório de Citogenética e Evolução, UFRGS. 2Departamento de Ecologia, URI-Erechim.

Conference abstract. SAUMA-Regional conference, Erechim, Brazil. 2016.

Abstract The genus Akodon is well studied at the genetic level, and the relationships among some of the species are well understood. In this study, we assessed the morphological variation in the size and shape of and mandible of three species of the genus (A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii). Our objectives were to explore the variation in the size and shape of the skull and mandible, and test the existence of congruence between morphological distance and molecular distance among the species. We discovered that morphological distance does not recover the phylogeny based on molecular data. The two species less related phylogenetically, (A. simulator e A. spegazzinii) are morphologically closer regarding the shape of the skull and mandible. This similarity may result from the sharing of similar habitats by the two species, indicating that ecological differences may have been important in the morphological evolution of the genus.

Introduction A seleção natural pode agir sobre fenótipos independentemente de sua base genética, e em curto prazo produzir uma variedade de fenótipos com um único genótipo, fenômeno conhecido como plasticidade fenotípica (Lande & Arnold, 1983; Travis, 1994; Maestri et al. 2015a). Por outro lado, em respostas evolutivas em longo prazo, a variação fenotípica depende em maior grau do componente genético (Lande & Arnold, 1983; Maestri et al. 2016a). Neste caso, em um quadro simples, podemos resumir as possíveis diferenças morfológicas entre espécies como sendo o resultado de: restrições filogenéticas, onde espécies mais estritamente aparentadas possuem maior similaridade morfológica; divergências morfológicas devido à estrutura geográfica de distribuição das espécies, somada à deriva genética; ou diferenças entre habitats, que impõe pressões de seleção diferente em ambientes distintos (Maestri et al. 2016a). A variação fenotípica não é, portanto, apenas uma tradução do genótipo, já que depende da interação entre genes e ambiente, o que torna as diferenças fenotípicas também dependentes da ecologia das espécies (Wainwright 1994; Fornel 2010; Maestri et al. 2016b). O problema em definir de maneira simples e direta qual a origem da variação fenotípica, é que em um único organismo, diferentes características evoluem a diferentes taxas, e dependem de correlação com outros caracteres. Desta forma, diferentes caracteres podem estar simultaneamente sobre o efeito de diferentes forças (e.g. deriva genética e seleção natural) (Lande & Arnold, 1983). Isto adiciona complexidade a variação fenotípica, e torna necessários estudos específicos em diferentes espécies e estruturas, como tentativa de elucidação dos diferentes mecanismos de variação fenotípica (Maestri et al. 2016c). Entre os roedores neotropicais, o gênero Akodon (Rodentia, Sigmodontinae), é um dos melhores estudados quanto à variação e parentesco genético. Recentemente, as relações filogenéticas de quase todas as espécies do gênero (~45 sp) foram elucidadas com base em genes nucleares e do citocromo b (Coyner, 2013). Análises morfológicas também são comuns

dentro do gênero, e historicamente ajudaram a esclarecer problemas taxonômicos entre as espécies (Myers and Patton, 1989; Hershkovitz, 1990; Hershkovitz, 1998; Christoff et al., 2000; Pardiñas et al., 2005). Em comum, a maioria dos estudos morfológicos utilizaram a morfometria linear como forma de obtenção de dados, enquanto poucos estudos analisaram a variação craniana através de morfometria gemométrica (ver Wong, 2012 – A. mollis). Neste estudo, as análises fenotípicas, acessadas através de morfometria geométrica, provêm da variação na forma e tamanho do crânio e mandíbula, estruturas escolhidas porque abrigam o aparato trófico, o cérebro e órgãos sensoriais em mamíferos (Reis et al., 2002). Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar a existência de congruência entre a distância morfológica e a distância molecular (dados de literatura) para três espécies parcialmente simpátricas do gênero Akodon: A. albiventer, A. simulator e A. spegazzinii.

Metodologia Exploramos a variação morfológica das espécies , A. simulator e A. spegazzinii. As três possuem uma região de sobreposição na distribuição geográfica na região noroeste da (Figura 1). A maior área de sobreposição geográfica ocorre para A. spegazzinii, que possui sua distribuição quase totalmente sobreposta com A. simulator. Análises moleculares recentementes propostas por Coyner et al., (2013) com base em genes nucleares e do citocromo b, aproximam as espécies A. albiventer e A. simulator, ambas incluídas no grupo de espécies A. aerosus, com anscestral comum datado de aproximadamente 2,2 milhões de anos. As mesmas análises distanciam essas espécies de A. spegazzinii, incluída no grupo A. boliviensis, e colocam o anscestral comum das três espécies em cerca de 3,36 milhões de anos. O método empregado pra explorar a variação na forma e tamanho do crânio e mandíbula nas espécies foi o de morfometria geométrica. Como passo inicial, foram coletas imagens em duas dimensões das vistas dorsal, ventral e lateral do crânio e da mandíbula esquerda das três espécies: A. albiventer (16 espécimes), A. simulator (15 espécimes) e A. spegazzinii (27 espécimes). As imagens foram capturadas com uma câmera fotográfica, 13.1 (3648x2736) megapixels de resolução, a uma distância padrão de 65 mm da lente da câmera até a base (ver Maestri et al. 2015b). Todas as imagens foram obtidas na coleção de mamíferos do Museu Argentino de Ciências Naturais “Bernardinho Rivadávia” (MACN), Buenos Aires, Argentina. Após foram digitalizados os marcos anatômicos (Figura 2) em todos os espécimes, com o auxílio do programa TPSDig 2 (Rohlf, 2010), a descrição de cada marco anatômico encontra-se no Apêndice. As coordenadas cartesianas geradas a partir dos marcos anatômicos, para cada vista do crânio mais a mandíbula, foram então sobrepostas com uma GPA (Análise Generalizada de Procrustes), que remove os efeitos de tamanho, posição e orientação (Adams et al., 2004; Rohlf and Marcus, 1993). Para análises do tamanho do crânio e mandíbula foi utilizado o tamanho do centroide – a raiz quadrada da soma dos quadrados das distâncias de cada ponto de referência a partir do centroide (média de todas as coordenadas) da configuração (Bookstein, 1991). As análises estatísticas foram efetuadas em duas etapas. Primeiro foi testada a presença de diferença no tamanho do crânio e mandíbula entre as três espécies. Para isso foram realizadas análises de variância (ANOVA), para cada vista do crânio mais a mandíbula, seguida de comparações entre os pares com um Teste de Tukey. A segunda etapa foi testar diferenças na forma do crânio e mandíbula entre as espécies. Para isso foram realizadas análises multivariadas de variância (MANOVA) sobre os resíduos de forma, para cada vista do crânio mais mandíbula, seguida de testes par a par para comparações múltiplas, e aplicando a correção de Bonferroni quando necessário. Árvores de distância morfológica foram calculadas, usando distância de Mahalanobis com agrupamento de Neighbor-Joining, também para cada vista do crânio mais mandíbula. Para o cálculo das mesmas, foram previamente calculados coeficientes em uma análise discriminante (LDA – análise linear discriminante) utilizando os 10 primeiros eixos da análise de componentes principais (PCA) para todas as vistas do crânio e mandíbula (que totalizaram sempre mais de 80% da variação na forma). As diferenças na forma entre as espécies foram exploradas com CVA’s (análise de variáveis canônicas). Todos os procedimentos morfométricos, gráficos e análises estatísticas foram efetuados no software R (R Development Core Team, 2013), com as bibliotecas Rmorph (Baylac, 2008), MASS (Venables & Ripley, 2002), ape (Paradis et al., 2004), stats e ade4 (Dray & Dufour, 2007).

Figure 1. Geographic distribution (approximate; from IUCN red list) of three species of the genus Akodon: Akodon albiventer (dotted polygon), Akodon simulator (dashed polygon) and (solid polygon).

Figure 2. Locations of landmarks on skull of Akodon for dorsal, ventral and lateral views of the skull, and lateral view of the mandible.

Resultados Encontramos diferença significativa no tamanho do crânio e mandíbula entre as espécies em todas as vistas (Table 1), sendo A. simulator maior que as outras duas (Figure 3).

Table 1. Results of ANOVA for skull and mandible centroid size in Akodon species: A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii.

Skull Views Sum of squares d.f F P Dorsal 569285 2,55 75.78 < 2×10-16 Ventral 529952 2,55 62.73 6.44×10-15 Lateral 599741 2,55 60.83 1.16×10-14 Mandible 152198 2,55 39.42 2.4×10-11

Figure 3. Skull and mandible centroid size variability among Akodon species. In A) dorsal view, B) ventral view, C) lateral view and D) mandible view. Small letters indicate differences in P values obtained from the Tukey test.

Table 2. Results of MANOVA for skull and mandible centroid size in Akodon species: A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii.

Skull Views λWilks d.f F P Dorsal (3 species) 0.0373 2,55 19.21 < 2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.1875 1,29 8.66 2.55×10-5 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0670 1,41 44.54 6.19×10-16 A. simulator x A. spegazzinii 0.1879 1,40 13.39 1.11×10-8 Ventral (3 species) 0.0374 2,55 19.17 <2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.0420 1,29 45.61 1.46×10-11 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0926 1,41 31.32 9.96×10-14 A. simulator x A. spegazzinii 0.2735 1,40 8.23 2.49×10-6 Lateral (3 species) 0.0309 2,55 21.54 <2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.0776 1,29 23.75 5.94×10-9 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0899 1,41 32.39 6.20×10-14 A. simulator x A. spegazzinii 0.1336 1,40 20.09 7.17×10-11 Mandíbula (3 species) 0.1426 2,55 7.57 3.56×10-12 A. albiventer x A. simulator 0.2322 1,29 6.61 0.00017 A. albiventer x A. spegazzinii 0.2145 1,41 11.71 3.95×10-8 A. simulator x A. spegazzinii 0.3774 1,40 5.11 0.00021

Também encontramos diferença na forma do crânio e mandíbula entre as três espécies (Table 2). As análises de variáveis canônicas (CVA’s) revelam três grupos nítidos para todas as vistas do crânio e mandíbula (Figures 4,5,6,7), onde A. simulator geralmente apresenta a posição mais intermediária ao longo do eixo um (que separa as espécies A. spegazzinii e A. albiventer), e se separa das demais ao longo do eixo dois. As árvores de distância morfológica confirmam a posição intermediária de A. simulator com relação a forma, e na maioria das vistas do crânio e mandíbula, aproxima esta de A. spegazzinii.

Figure 4. A) Scatter plot of first versus second canonical variate axis (CV1 and CV2) for dorsal view of the skull in three species of Akodon: A. albiventer (filled triangles), A. simulator (empty circles), e A. spegazzinii (crosses); B) The shape change for second axis is given, dark lines indicate positive scores and gray lines negative ones; C) The shape change for first axis; D) Neighbor-joining tree of Mahalanobis distance among Akodon species for dorsal view of the skull.

Figure 5. A) Scatter plot of first versus second canonical variate axis (CV1 and CV2) for ventral view of the skull in three species of Akodon: A. albiventer (filled triangles), A. simulator (empty circles), e A. spegazzinii (crosses); B) The shape change for second axis is given, dark lines indicate positive scores and gray lines negative ones; C) The shape change for first axis; D) Neighbor-joining tree of Mahalanobis distance among Akodon species for ventral view of the skull.

Figure 6. A) Scatter plot of first versus second canonical variate axis (CV1 and CV2) for lateral view of the skull in three species of Akodon: A. albiventer (filled triangles), A. simulator (empty circles), e A. spegazzinii (crosses); B) The shape change for second axis is given, dark lines indicate positive scores and gray lines negative ones; C) The shape change for first axis; D) Neighbor-joining tree of Mahalanobis distance among Akodon species for lateral view of the skull.

Figure 7. A) Scatter plot of first versus second canonical variate axis (CV1 and CV2) for lateral view of the mandible in three species of Akodon: A. albiventer (filled triangles), A. simulator (empty circles), e A. spegazzinii (crosses); B) The shape change for second axis is given, dark lines indicate positive scores and gray lines negative ones; C) The shape change for first axis; D) Neighbor-joining tree of Mahalanobis distance among Akodon species for lateral view of the mandible.

Discussão A análise morfológica das três espécies revela que a variação fenotípica não é congruente com a filogenia. É claro, um estudo considerando todas as espécies do gênero é necessária para tomar qualquer conclusão mais geral. Nesse trabalho apenas com três espécies, a espécie A. simulator apresenta uma forma intermediária em comparação com as demais, e é menos próxima da espécie com a qual tem maior afinidade taxonômica (A. albiventer), do que da espécie menos relacionada filogeneticamente, porém com a qual compartilha a maior sobreposição na distribuição geográfica (A. spegazzinii). Existem poucas informações ecológicas a respeito destas espécies. Sabe-se que as três ocupam pradarias geralmente em altitudes elevadas (Dunnum et al., 2008; Jayat and Pardinas 2008a; Jayat and Pardinas 2008b), portanto compartilham habitats com características similares. A maior congruência na distribuição entre A. simulator e A. spegazzinii é provavelmente responsável pela maior similaridade na forma do crânio e mandíbula entre as duas, porém não sabemos quais fatores ambientais ou geográficos influenciam as características na forma do crânio. A mesma região geográfica abriga um hotspot de diversidade para sigmodontíneos (Maestri & Patterson 2016), e muitas possibilidades de contato com outras espécies. Até o momento, para o gênero, inúmeros trabalhos vêm utilizando características crâniométricas como auxilio na identificação das espécies e resolução de problemas taxonômicos (Pardiñas et al., 2003; Geise et al., 2005; Pardiñas et al., 2005), no entanto poucos têm enfoque ecológico. Um dos poucos estudos no gênero utilizando a técnica de morfometria geométrica, e ao mesmo tempo aplicado a questões ambientais, foi desenvolvido por Wong (2012). Neste estudo, a variação no crânio da espécie Akodon mollis foi correlacionada com diferenças altitudinais nos peruanos. Estudos genéticos e morfológicos são importantes ferramentas para a compreensão da evolução do grupo, porém informações ecológicas são de suma relevância quando se deseja contar de maneira precisa a história de adaptação das espécies aos seus ambientes atuais. Assim sendo, a obtenção de informação ecológica e de história de vida das espécies do gênero devem ser mais exploradas.

Referências Bibliográficas ADAMS, D. C.; ROHLF, F. J.; SLICE, D. E. Geometric morphometrics: ten years of progress following the “revolution”. Italian Journal of Zoology, 71: 5-16, 2004.

BAYLAC, M. Rmorph: a R geometric and multivariate morphometrics library. 2008.

BOOKSTEIN, F. L. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. Cambridge University Press, London, 1991.

COYNER, B. S.; BRAUN, J. K.; MARES, M. A.; BUSSCHE, R. A. V. D. Taxonomic validity of species groups in the genus Akodon (Rodentia, ). Zoologica Scripta, 42(4): 335-350, 2013.

DRAY, S.; DUFOUR, A. B. The ade4 package: implementing the duality diagram for ecologists. Journal of Statistical Software, 22(4): 1-20, 2007.

DUNNUM, J.; VARGAS, J.; BERNAL, N.; ZEBALLOS, H.; VIVAR, E.; PATTERSON, B.; PARDINAS, U.; JAYAT, J. P. 2008. Akodon albiventer. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.1.

FORNEL, R. Evolução na forma e tamanho do crânio no gênero Ctenomys (Rodentia: Ctenomyidae). Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2010.

GEISE, L.; DE MORAES, D. A.; DA SILVA, H. S. Morphometric differentiation and distributional notes of three species of Akodon (Muridae, Sigmodontinae, ) in the Atlantic coastal area of Brasil. Arquivos do Museu Nacional, 63(1): 63-74, 2005.

JAYAT, J.; PARDINAS, U. 2008a. Akodon simulator. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.1.

JAYAT, J.; PARDINAS, U. 2008b. Akodon spegazzinii. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.1.

LANDE, R.; ARNOLD, S. J. The measurement of selection on correlated characters. Evolution, 37(6): 1210-1226, 1983.

MAESTRI, R.; FORNEL, R.; FREITAS, T.R.O.; MARINHO, J.R. Ontogenetic allometry in the foot size of flavescens (Waterhouse, 1837) (Rodentia, Sigmodontinae). Brazilian Journal of Biology, 75: 435-441.

MAESTRI, R.; FORNEL, R., GALIANO, D., FREITAS, T.R.O. Niche suitability affects development: Skull asymmetry increases in less suitable areas. Plos One, 10(4): e0122412, 2015b.

MAESTRI, R.; PATTERSON, B.D. Patterns of species richness and turnover for the South American fauna. Plos One, 11(3): e0151895, 2016.

MAESTRI, R.; FORNEL, R.; GONÇALVES, G.L.; GEISE, L.; FREITAS, T.R.O; CARNAVAL, A.C. Predictors of intraspecific morphological variability in a tropical hotspot: comparing the influence of random and non‐random factors. Journal of Biogeography, 43: 2160-2172, 2016a.

MAESTRI, R.; LUZA, A.L.; BARROS, L.D.; HARTZ, S.M.; FERRARI, A.; DUARTE, L.D.S. Geographical variation of body size in sigmodontine depends on both environment and phylogenetic composition of communities. Journal of Biogeography, 43: 1192-1202, 2016b.

MAESTRI, R.; PATTERSON, B.D.; FORNEL, R.; MONTEIRO, L.R.; FREITAS, T.R.O. Diet, bite force and skull morphology in the generalist rodent morphotype. Journal of Evolutionary Biology, 29: 2191-2204, 2016c.

PARADIS, E.; CLAUDE, J.; STRIMMER, K. APE: analyses of phylogenetics and evolution in R language. Bioinformatics, 20: 289-290, 2004.

PARDIÑAS, U. F. J.; D’ELÍA, G.; CIRIGNOLI, S. The genus Akodon (: Sigmodontinae) in Missiones, Argentina. Mammalian Biology, 68: 129-143, 2003.

PARDIÑAS, U. F. J.; D’ELÍA, G.; CIRIGNOLI, S.; SUAREZ, P. A new species of Akodon (Rodentia, Cricetidae) from the northern campos grasslands of Argentina. Journal of Mammalogy, 86(3): 462-574, 2005.

R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2013. URL: http://www.R- project.org/.

REIS, S. F.; DUARTE, L. C.; MONTEIRO, L. R.; ZUBEN, F. J. V. Geographic variation in cranial morphology in Thrichomys apereoides (Rodentia: Echimyidae). I. Geometric descriptors and patterns of variation in shape. Journal of Mammalogy, 83(2): 333-344, 2002.

ROHLF, F. J. TPSDig2, ver. 2.16, software by F. James Rohlf Dept. Ecology and Evolution, State University of New York Stony Brook. 2010. Disponível em: http://life.bio.sunysb.edu/morph/

ROHLF, F. J.; MARCUS, L. F. A revolution in morphometrics. Trends in Ecology and Evolution, 8(4): 129-132, 1993.

TRAVIS, J. Evaluating the adaptive role of morphological plasticity. p. 99-122. In: WAINWRIGHT, P. C.; REILLY, S. eds. Ecological morphology: integrative organismal biology. The University of Chicago Press, 1994.

VENABLES, W. N.; RIPLEY, B. D. Modern Applied Statistics with S. Fourth Edition. Springer, New York, 2002.

WAINWRIGHT, P. C. Functional morphology as a tool in ecological research. p. 42-59. In: WAINWRIGHT, P. C.; REILLY, S. eds. Ecological morphology: integrative organismal biology. The University of Chicago Press, 1994.

WONG, L. A. L. Differentiation of the Akodon mollis species group (Rodentia: Cricetidae: Sigmodontinae) in the Andes of Peru. Ph. D. dissertation, The University of Michigan, 2012.

Apêndice. Localização dos marcos anatômicos. Dorsal: 1. Ponto mais anterior da sutura entre os nasais. 2. Sutura entre os frontais e os nasais. 3. Sutura entre os frontais e os parietais. 4. Sutura entre os parietais e o interparietal. 5. Ponto mais posterior do osso occipital. 6,7. Intercessão rostral entre os nasais e os premaxilares em uma projeção dorsal. 8,9. Extremidade rostral da placa zigomática. 10,11. Ponto mais anterior da órbita. 12,13. Ponto mais estreito da região interorbital. 14,15. Ponto mais rostral da sutura entre o parietal e o frontal. 16,17. Ponto mais posterior da orbita. 18,19. Ponto mais lateral do osso occipital. Ventral: 1,2. Ponto mais anterior do forame incisivo. 3,4. Ponto mais posterior do forame incisivo. 5,6. Extremidade rostral da placa zigomática. 7,8. Ponto mais anterior da órbita. 9,10. Ponto mais anterior da linha dos molares. 11,12. Ponto mais posterior da linha dos molares. 13. Ponto mais posterior da sutura entre os palatinos e a borda anterior da fossa mesopterygoid. 14,15. Ponto mais posterior da órbita. 16,17. Ponto mais anterior do tubo de eustachian. 18,19. Estremidade rostral do conduto auditivo. 20,21.Extremidade caudal do conduto auditivo. 22. Ponto mais anterior do forame magno. 23. Ponto mais posterior do forame magno. 24,25. Ponto mais lateral da abertura do forame magno (na parte mais anterior do) no côndilo occipital. Lateral: 1. Ponto mais posterior do alvéolo incisivo. 2. Ponto mais inferior do alvéolo incisivo. 3. Ponto mais anterior da sutura entre o nasal e a premaxila. 4. Ponta anterior do nasal. 5. Ponto mais superior da sutura entre o frontal e o parietal. 6. Ponto mais superior da sutura entre o parietal e o interparietal. 7. Curvatura no limite entre o côndilo occipital e o osso occipital. 8. Limite inferior da divisa entre o côndilo occipital e a bula timpânica. 9. Extremidade anterior e inferior da bula timpânica. 10. Ponto mais posterior da linha dos molares. 11. Ponto mais anterior da linha dos molares. 12. Ponto mais anterior da órbita. 13. Ponto mais posterior da órbita. 14. Sutura entre o frontal, o parietal e o squamosal(temporal). 15. Sutura entre o parietal, o interparietal e o squamosal. Mandíbula: 1. Borda anterior superior do alvéolo incisivo. 2. Borda da extremidade posterior do alvéolo incisivo. 3. Forame mental. 4. Borda anterior do alvéolo do pré-. 5. Intercessão entre o alvéolo molar e o processo coronóide. 6. Extremidade superior do processo coronóide. 7. Ponto de máxima curvatura entre os processos coronóide e condilar. 8. Extremidade superior do processo condilar. 9. Extremidade inferior do processo condilar. 10. Ponto de máxima curvatura entre os processos condilar e angular. 11. Ponta do processo angular.