MORPHOLOGICAL VARIATION IN THREE PARTIALLY SYMPATRIC SPECIES OF THE GENUS AKODON (RODENTIA, SIGMODONTINAE) Renan Maestri¹; Rodrigo Fornel²; Jorge Reppold Marinho²; Thales Renato Ochotorena de Freitas¹ 1Laboratório de Citogenética e Evolução, UFRGS. 2Departamento de Ecologia, URI-Erechim. Conference abstract. SAUMA-Regional conference, Erechim, Brazil. 2016. Abstract The genus Akodon is well studied at the genetic level, and the relationships among some of the species are well understood. In this study, we assessed the morphological variation in the size and shape of skull and mandible of three species of the genus (A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii). Our objectives were to explore the variation in the size and shape of the skull and mandible, and test the existence of congruence between morphological distance and molecular distance among the species. We discovered that morphological distance does not recover the phylogeny based on molecular data. The two species less related phylogenetically, (A. simulator e A. spegazzinii) are morphologically closer regarding the shape of the skull and mandible. This similarity may result from the sharing of similar habitats by the two species, indicating that ecological differences may have been important in the morphological evolution of the genus. Introduction A seleção natural pode agir sobre fenótipos independentemente de sua base genética, e em curto prazo produzir uma variedade de fenótipos com um único genótipo, fenômeno conhecido como plasticidade fenotípica (Lande & Arnold, 1983; Travis, 1994; Maestri et al. 2015a). Por outro lado, em respostas evolutivas em longo prazo, a variação fenotípica depende em maior grau do componente genético (Lande & Arnold, 1983; Maestri et al. 2016a). Neste caso, em um quadro simples, podemos resumir as possíveis diferenças morfológicas entre espécies como sendo o resultado de: restrições filogenéticas, onde espécies mais estritamente aparentadas possuem maior similaridade morfológica; divergências morfológicas devido à estrutura geográfica de distribuição das espécies, somada à deriva genética; ou diferenças entre habitats, que impõe pressões de seleção diferente em ambientes distintos (Maestri et al. 2016a). A variação fenotípica não é, portanto, apenas uma tradução do genótipo, já que depende da interação entre genes e ambiente, o que torna as diferenças fenotípicas também dependentes da ecologia das espécies (Wainwright 1994; Fornel 2010; Maestri et al. 2016b). O problema em definir de maneira simples e direta qual a origem da variação fenotípica, é que em um único organismo, diferentes características evoluem a diferentes taxas, e dependem de correlação com outros caracteres. Desta forma, diferentes caracteres podem estar simultaneamente sobre o efeito de diferentes forças (e.g. deriva genética e seleção natural) (Lande & Arnold, 1983). Isto adiciona complexidade a variação fenotípica, e torna necessários estudos específicos em diferentes espécies e estruturas, como tentativa de elucidação dos diferentes mecanismos de variação fenotípica (Maestri et al. 2016c). Entre os roedores neotropicais, o gênero Akodon (Rodentia, Sigmodontinae), é um dos melhores estudados quanto à variação e parentesco genético. Recentemente, as relações filogenéticas de quase todas as espécies do gênero (~45 sp) foram elucidadas com base em genes nucleares e do citocromo b (Coyner, 2013). Análises morfológicas também são comuns dentro do gênero, e historicamente ajudaram a esclarecer problemas taxonômicos entre as espécies (Myers and Patton, 1989; Hershkovitz, 1990; Hershkovitz, 1998; Christoff et al., 2000; Pardiñas et al., 2005). Em comum, a maioria dos estudos morfológicos utilizaram a morfometria linear como forma de obtenção de dados, enquanto poucos estudos analisaram a variação craniana através de morfometria gemométrica (ver Wong, 2012 – A. mollis). Neste estudo, as análises fenotípicas, acessadas através de morfometria geométrica, provêm da variação na forma e tamanho do crânio e mandíbula, estruturas escolhidas porque abrigam o aparato trófico, o cérebro e órgãos sensoriais em mamíferos (Reis et al., 2002). Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar a existência de congruência entre a distância morfológica e a distância molecular (dados de literatura) para três espécies parcialmente simpátricas do gênero Akodon: A. albiventer, A. simulator e A. spegazzinii. Metodologia Exploramos a variação morfológica das espécies Akodon albiventer, A. simulator e A. spegazzinii. As três possuem uma região de sobreposição na distribuição geográfica na região noroeste da Argentina (Figura 1). A maior área de sobreposição geográfica ocorre para A. spegazzinii, que possui sua distribuição quase totalmente sobreposta com A. simulator. Análises moleculares recentementes propostas por Coyner et al., (2013) com base em genes nucleares e do citocromo b, aproximam as espécies A. albiventer e A. simulator, ambas incluídas no grupo de espécies A. aerosus, com anscestral comum datado de aproximadamente 2,2 milhões de anos. As mesmas análises distanciam essas espécies de A. spegazzinii, incluída no grupo A. boliviensis, e colocam o anscestral comum das três espécies em cerca de 3,36 milhões de anos. O método empregado pra explorar a variação na forma e tamanho do crânio e mandíbula nas espécies foi o de morfometria geométrica. Como passo inicial, foram coletas imagens em duas dimensões das vistas dorsal, ventral e lateral do crânio e da mandíbula esquerda das três espécies: A. albiventer (16 espécimes), A. simulator (15 espécimes) e A. spegazzinii (27 espécimes). As imagens foram capturadas com uma câmera fotográfica, 13.1 (3648x2736) megapixels de resolução, a uma distância padrão de 65 mm da lente da câmera até a base (ver Maestri et al. 2015b). Todas as imagens foram obtidas na coleção de mamíferos do Museu Argentino de Ciências Naturais “Bernardinho Rivadávia” (MACN), Buenos Aires, Argentina. Após foram digitalizados os marcos anatômicos (Figura 2) em todos os espécimes, com o auxílio do programa TPSDig 2 (Rohlf, 2010), a descrição de cada marco anatômico encontra-se no Apêndice. As coordenadas cartesianas geradas a partir dos marcos anatômicos, para cada vista do crânio mais a mandíbula, foram então sobrepostas com uma GPA (Análise Generalizada de Procrustes), que remove os efeitos de tamanho, posição e orientação (Adams et al., 2004; Rohlf and Marcus, 1993). Para análises do tamanho do crânio e mandíbula foi utilizado o tamanho do centroide – a raiz quadrada da soma dos quadrados das distâncias de cada ponto de referência a partir do centroide (média de todas as coordenadas) da configuração (Bookstein, 1991). As análises estatísticas foram efetuadas em duas etapas. Primeiro foi testada a presença de diferença no tamanho do crânio e mandíbula entre as três espécies. Para isso foram realizadas análises de variância (ANOVA), para cada vista do crânio mais a mandíbula, seguida de comparações entre os pares com um Teste de Tukey. A segunda etapa foi testar diferenças na forma do crânio e mandíbula entre as espécies. Para isso foram realizadas análises multivariadas de variância (MANOVA) sobre os resíduos de forma, para cada vista do crânio mais mandíbula, seguida de testes par a par para comparações múltiplas, e aplicando a correção de Bonferroni quando necessário. Árvores de distância morfológica foram calculadas, usando distância de Mahalanobis com agrupamento de Neighbor-Joining, também para cada vista do crânio mais mandíbula. Para o cálculo das mesmas, foram previamente calculados coeficientes em uma análise discriminante (LDA – análise linear discriminante) utilizando os 10 primeiros eixos da análise de componentes principais (PCA) para todas as vistas do crânio e mandíbula (que totalizaram sempre mais de 80% da variação na forma). As diferenças na forma entre as espécies foram exploradas com CVA’s (análise de variáveis canônicas). Todos os procedimentos morfométricos, gráficos e análises estatísticas foram efetuados no software R (R Development Core Team, 2013), com as bibliotecas Rmorph (Baylac, 2008), MASS (Venables & Ripley, 2002), ape (Paradis et al., 2004), stats e ade4 (Dray & Dufour, 2007). Figure 1. Geographic distribution (approximate; from IUCN red list) of three species of the genus Akodon: Akodon albiventer (dotted polygon), Akodon simulator (dashed polygon) and Akodon spegazzinii (solid polygon). Figure 2. Locations of landmarks on skull of Akodon for dorsal, ventral and lateral views of the skull, and lateral view of the mandible. Resultados Encontramos diferença significativa no tamanho do crânio e mandíbula entre as espécies em todas as vistas (Table 1), sendo A. simulator maior que as outras duas (Figure 3). Table 1. Results of ANOVA for skull and mandible centroid size in Akodon species: A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii. Skull Views Sum of squares d.f F P Dorsal 569285 2,55 75.78 < 2×10-16 Ventral 529952 2,55 62.73 6.44×10-15 Lateral 599741 2,55 60.83 1.16×10-14 Mandible 152198 2,55 39.42 2.4×10-11 Figure 3. Skull and mandible centroid size variability among Akodon species. In A) dorsal view, B) ventral view, C) lateral view and D) mandible view. Small letters indicate differences in P values obtained from the Tukey test. Table 2. Results of MANOVA for skull and mandible centroid size in Akodon species: A. albiventer, A. simulator and A. spegazzinii. Skull Views λWilks d.f F P Dorsal (3 species) 0.0373 2,55 19.21 < 2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.1875 1,29 8.66 2.55×10-5 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0670 1,41 44.54 6.19×10-16 A. simulator x A. spegazzinii 0.1879 1,40 13.39 1.11×10-8 Ventral (3 species) 0.0374 2,55 19.17 <2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.0420 1,29 45.61 1.46×10-11 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0926 1,41 31.32 9.96×10-14 A. simulator x A. spegazzinii 0.2735 1,40 8.23 2.49×10-6 Lateral (3 species) 0.0309 2,55 21.54 <2.2×10-16 A. albiventer x A. simulator 0.0776 1,29 23.75 5.94×10-9 A. albiventer x A. spegazzinii 0.0899 1,41 32.39 6.20×10-14 A. simulator x A.