"Indukcija Aksilarnih Pupoljaka Na Nodalnim

UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Marija J. Jovanović

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana L. (Benth.)

MASTER RAD

Niš, 2014.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana L. (Benth.)

Master rad

Kandidat: Mentor:

Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, vanredni profesor

Br. indeksa: 56

Niš, 2014. UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Axillary bud induction on nodal explants Micromeria juliana L. (Benth.)

Master thesis

Candidate: Mentor:

Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, associate professor

No. of index: 56

Niš, 2014.

Zahvaljujem se svojoj mentorki prof. dr Dragani Stojičić na izboru teme, ukazanoj pomoći, savetima, podršci i strpljenju pri izradi ovog master rada. Takođe se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći pri izradi eksperimentalnog dela ovog rada. Ovaj master rad je rađen u okviru doktorske disertacije asistenta Svetlane Tošić i sadrži još uvek nepublikovane rezultate.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, Nikoli i svojim prijateljima na podršci, pomoći, ljubavi i razumevanju.

Hvala Vam što ste uvek uz mene!

SADRŢAJ: SAŽETAK ………...…………………………………………………………………………….. 1

1. UVOD ………………………………………………………………………………………… 3

1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae …………….………………………….……… 4 1.1.1. Rod Micromeria …………………………………….…………………………….. 5 1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. …….……………………………...……. 6 1.2. Kultura in vitro ……....……………………….………………………….....…………... 8 1.2.1. Mikropropagacija ……………………………………………….…………..….… 10 2. CILJ RADA ……………………………………………………………………………….… 13

3. MATERIJAL I METODE …………………………………….....………………………… 15

3.1. Biljni materijal …….……...…………………………………………………………… 16 3.2. Hranljiva podloga MS …….………………………………………………….……….. 16 3.2.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana ………….…….. 18 3.3. Metode sterilizacije ………………………….……………………………………...…. 19 3.3.1. Sterilizacija biljnog materijala ………………………………………………….... 20 3.3.2. Sterilizacija hranljivih podloga …………………………………………………... 21 3.3.3. Sterilizacija instrumenata i prostora ……………………………………………... 22 3.4. Merenje sveţe i suve mase biljaka ………………………………………………..….. 22 3.5. Statistiĉka analiza ………………………….……………………………………...... … 22 4. REZULTATI …………………………………………………………………………...... …. 23

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana ...... 24 4.2. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka M. juliana ...... 34 5. DISKUSIJA ...... 35 6. ZAKLJUČAK ...... 38 7. LITERATURA ...... 40

8. BIOGRAFIJA KANDIDATA ...... 44

SKRAĆENICE:

BA – 6 – benzil – aminopurin

IAA – indol – 3 – sirćetna kiselina

SAŽETAK

Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. je aromatiĉna biljka koja pripada porodici Lamiaceae. Veoma je efikasna u leĉenju mnogih bolesti i tegoba. U ovom radu su definisani uslovi pri kojima dolazi do indukcije pupoljaka M. juliana, njihovog izduţivanja, kao i uticaj razliĉitih tretmana na produkciju biomase. Korišćene su razliĉite kombinacije regulatora rastenja, citokinina (BA) i auksina (IAA) na MS hranljivoj podlozi. Najveći broj pupoljaka formirao se na eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM IAA. Na istoj podlozi je zabeleţena i najveća sveţa masa biljaka M. juliana. Najveću duţinu imali su pupoljci na eksplantatima gajenim na podlozi sa 0,57 µM IAA, dok su najveću suvu masu imali eksplantati gajeni na podlozi sa 10 µM BA i 0,57 µM IAA.

Ključne reči: Micromeria juliana, aksilarni pupoljci, benzil – aminopurin, indol – sirćetna kiselina

ABSTRAKT

Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. is an aromatic plant that belongs to the family Lamiaceae. It is very effective in treating many diseases and ailments. This work defines the conditions which cause the induction of buds M. juliana, their elongation, and the influence of different treatments on biomass production. Different combinations of plant growth regulators, cytokinins (BA) and auxin (IAA) were used on MS medium. The highest number of buds was formed on the explants that were cultured on medium with 3 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest fresh weight of plants M. juliana was registered on the same medium. A maximum length had buds on explants that were grown on medium with 0,57 μM IAA, while the highest dry weight had explants on medium containing 10 μM BA and 0,57 μM IAA.

Keywords: Micromeria juliana, axillary buds, benzyl - aminopurine, indole - acetic acid

1. UVOD

1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae

Familija usnatica (Lamiaceae) obuhvata veoma vaţnu i brojnu grupu biljaka. Predstavljena je sa 200 rodova i oko 3500 vrsta. Najveće bogatstvo rodova i vrsta je u Mediteranu, Maloj i centralnoj Aziji. U flori Balkanskog poluostrva familija je predstavljena sa 371 vrstom, od ĉega su 84 vrste Balkanski endemiti. U Srbiji je zastupljena sa 147 vrsta u okviru 30 rodova. Od svih familija, Lamiaceae zauzimaju drugo mesto po broju vrsta u ovom delu Evrope. Predstavnici familije Lamiaceae su kosmopolitske vrste koje naseljavaju suva i dobro osunĉana mesta – livade, pašnjake, kamenjare. Poznate su i korovske kao i rudimentarne vrste.

Biljke familije Lamiaceae su jednogodišnje i višegodišnje zeljaste biljke, poluţbunovi ili ţbunovi, retko drveće. Stablo im je ĉetvorougaonog oblika, listovi su prosti, naspramnog rasporeda, bez zalistaka. Cvetovi imaju karakteristiĉnu graĊu i zigomorfne su simetrije. Ĉašica se sastoji od pet sraslih listića, cevasta je, kod nekih predstavnika ĉak dvousnata. Krunica je sastavljena od pet listića, koji su u donjem delu srasli u cev, dok je gornji deo razdvojen na dva dela: gornju usnu, koju ĉine dva kruniĉna listića i donju usnu, sastavljenu od tri kruniĉna listića. Andreceum se sastoji od 4 prašnika, od kojih su dva duţa a dva kraća, dok se kod nekih rodova nalaze samo dva prašnika (Salvia, Rosmarinus). Tuĉak je izgraĊen od dve karpele. Plodnik je nadcvetan, dvook, sa po jednim semenim zametkom u svakom okcu. Cvetovi su sakupljeni u manje cimozne cvasti. Plod je merikarpijum koji se raspada na ĉetiri jednosemena plodića (Tatić B., Bleĉić V. 2002).

Cvetna formula: K(5) [ C(5) A(4,2) ] G(2)

Lamiaceae imaju karakteristiĉan miris jer sadrţe etarska ulja (aromatiĉni alkoholi, fenoli, terpeni, ketoni, aldehidi itd.). Etarska ulja su smeštena u ţlezdanim dlakama na površini lista i drugih organa. Etarska ulja se koriste u medicini, farmaciji, kozmetiĉkoj industriji a neke vrste se koriste i kao zaĉinske biljke. Najpoznatiji predstavnici familije su: majĉina dušica, nana, ruzmarin, ţalfija, lavanda, origano, matiĉnjak, mrtva kopriva, bosiljak, rtanjski ĉaj, srdaĉica, trava iva i mnogi drugi.

1.1.1. Rod Micromeria

U starijoj literaturi postojale su brojne nedoumice u pogledu taksonomije i nomenklature Micromeria vrsta, što potvrĊuje i postojanje velikog broja sinonima za pojedine vrste. Neke su svrstane u rod Thymus, Satureja, Calamintha, Melissa idr. (Kalogjera i Vladimir, 1992).

Prvi put rod Micromeria opisuje Bentham 1829. godine. Rod sadrţi 130 vrsta koje su najvećim delom rasprostranjene u mediteranskoj i makaronezijskoj regiji (Morales, 1991). Prema Brӓuchler et al. (2008), rod Micromeria se prostire od mediteransko – makaronezijske regije, sve do juţne Afrike, Indije i Kine (Slika 1.). U flori Srbije i Crne Gore rod je predstavljen sa 10 vrsta, od kojih su 7 endemiĉne (Šilić, 1979).

Slika 1. Rasprostranjenost roda Micromeria u svetu (Brӓuchler, 2008)

Boissier (1879) deli rod Micromeria u tri sekcije:

 Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. pulegium, M. dalmatica)  Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora)  Cymularia

Nedavne molekularne analize su pokazale da je rod Micromeria polifilan, tako da su ĉlanovi sekcije Pseudomelisa blisko srodni rodu Clinopodium, pa su vrste iz ove sekcije prebaĉene u rod Clinopodium, gde i spadaju zbog morfoloških karakteristika (Arabaci et al., 2010). Micromeria juliana, koja je korišćena u ovom radu pripada sekciji Eumicromeria.

1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb.

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Klasa: Magnoliopsida

Red: Lamiales

Familija: Lamiaceae (Labiatae)

Rod: Micromeria

Slika 2: Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb.

Morfologija i biologija: Micromeria juliana (Sinonimi: Clinopodium julianum, Micromeria minoa, Sabbatia corymbosa, Satureja juliana, Satureja spicata) je višegodišnja zeljasta biljka (Slika 2). Ima formu listopadnog ţbuna visine 10 – 40 cm, ĉesto manji, dlakavi, sa mnogo stabljika. Listovi su usko ovalnog oblika, naspramnog rasporeda. Cvetovi su ljubiĉaste boje udruţeni u cvasti. Koren i izdanci pri dnu su odrvenjeni. Cveta od maja do jula.

Stanište: Ovoj vrsti odgovaraju suva, svetla (pešĉana) zemljišta. Naseljava i kamenjare i pukotine kreĉnjaĉkih stena mediteranskog i submediteranskog pojasa. Javlja se u rasponu od 0 do oko 800 (1000) m nadmorske visine. Raste na kiselim, neutralnim i baznim zemljištima. Moţe da raste na nutritivno siromašnom zemljištu. Ne moţe da raste u senci. Populacije su sa malim brojem jedinki.

Distribucija: Rasprostranjena je u Hrvatskoj, Hercegovini, Crnoj Gori, Kosmetu, Makedoniji, jugoistoĉnoj Francuskoj, Portugaliji, Italiji, Albaniji, Grĉkoj, Bugarskoj, Turskoj (Palić, 2009) kao i u severozapadnoj Africi, u zapadnom delu Male Azije i na Kritu.

Terapeutska upotreba: Micromeria juliana je veoma korisna biljka u leĉenju mnogih bolesti i tegoba. Nadzemni deo biljke ima diuretiĉka svojstva. Veoma je efikasna u leĉenju kamena u bubregu i bešici, kao deo biljnih mešavina ili samostalno. Ekstrakt biljke se koristi kod upale ţeluca, peptiĉkog ulkusa, prehlade i muĉnine prilikom putovanja. TakoĊe pomaţe u varenju neutrališući gasove, pojaĉava znojenje i dobar je ekspektorans. Koncentrovani ekstrakt biljke se koristi kao laksativ. Moţe da se koristi i kao zaĉin.

Micromeria juliana spade u ugroţene biljne vrste. Pored ograniĉene distribucije i malog broja jedinki ugroţavaju je i ispaše i gaţenje ţivotinja pored urbanih mesta, kao i poţari, nastali prirodnim putem ili antropogeno.

1.2. Kultura in vitro

Kultura biljnog tkiva predstavlja dobijanje novih individua u laboratorijskim uslovima in vitro. Iz vegetativnih delova biljaka uzetih iz spoljašnje sredine, u sterilnim uslovima, na hranljivim podlogama u laboratoriji, mogu se proizvesti nove jedinke, i one se kasnije mogu vratiti na prirodna staništa. Deo biljke koji se uvodi u kulturu, bez obzira od kojeg se tkiva sastoji, naziva se eksplantat. Kultura in vitro je od velikog znaĉaja jer proizvodnjom velikog broja biljaka i njihovim vraćanjem u prirodna staništa moţe da se spreĉi potpuno išĉezavanje ugroţenih i retkih biljaka, zaštitom i obnavljanjem njihovog genofonda. TakoĊe, kultura in vitro daje znatan doprinos farmaciji, šumarstvu i hortikulturi, gde je mnogo manji pritisak na biljke u prirodi koje se koriste u ovim oblastima.

Dve osobine biljnih ćelija su kljuĉne za in vitro umnoţavanje biljaka:

 totipotentnost – sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu pojedine organe, pa ĉak i celu biljku i  plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rastenja, metabolizma i razvića u zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.

Postoje razliĉiti pristupi u klasifikaciji tehnika kulture biljaka in vitro (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996, Nešković et al. 2003). One se mogu podeliti prema:

1. tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije, organa, tkiva)

a) kultura kalusa – agregati ćelija nastali kao posledica neorganizovanog rastenja biljnih organa ili kultivisanih ćelija

b) kultura ćelija u suspenziji – populacija ćelija i malih ćelijskih agregata u teĉnoj podlozi

c) kultura pojedinačnih ćelija – postiţe se izolacijom ćelija iz kalusa ili kulture ćelija u suspenziji, enzimskim ili mehaniĉkim izdvajanjem

d) kultura protoplasta – kultura ćelija kojima je enzimskim putem odstranjen ćelijski zid, a protoplasti su ostali oĉuvani i ţivi

e) kultura semena – iz semena se dobijaju zdravi klijanci; koristi se za povećanje efikasnosti klijanja kod vrsta koje teško klijaju

f) kultura embriona – zigotskih i somatskih, omogućava prevazilaţenje dormancije i skraćivanje ciklusa gajenja biljaka

g) kultura meristema – koriste se meristemi sa vrha korena i stabla, pogodna su za gajenje in vitro jer su bez virusnih infekcija

h) kultura korena

2. prema nameni:

a) mikropropagacija – umnoţavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih pupoljaka, koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih primordija (mikropropagacija u uţem smislu),

b) organogeneza – obrazovanje pupoljaka i korenova de novo

c) kultura haploida – haploidne ćelije muškog (androgeneza) i ţenskog gametofita (ginogeneza) mogu da se u odreĊenim uslovima razviju u biljni organizam bez oploĊenja,

d) somatka embriogeneza – tehnika u kojoj embrioni nastaju od somatskih ćelija

e) somaklonalno variranje – nastanak nove nasledne varijabilnosti pod dejstvom faktora kulture in vitro

f) genetička manipulacija – molekularno – genetiĉki metod kojim se genetiĉki materijal prenosi iz ćelija ili protoplasta na ćeliju ili protoplast in vitro, bez generativne faze i polnog ciklusa (somatska hibrdizacija, citoplazmatska hibridizacija, genetiĉka transformacija).

Navedene metode razmnoţavanja se ĉesto mogu kombinovati, što znaĉi da kulture dobijene jednom metodom mogu kasnije da se gaje primenom neke druge.

1.2.1. Mikropropagacija

Već je pomenuto da neki autori (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996, Nešković et al. 2003) termin mikropropagacija u “uţem smislu” ili samo mikropropagacija koriste za kulturu aksilarnih i apikalnih pupoljaka, dok pod terminom mikropropagacija u “širem smislu” podrazumevaju bilo koji postupak metode kulture in vitro koji obezbeĊuje klonsko razmnoţavanje biljaka.

Mikropropagacija je od velike vaţnosti jer se koristi za razmnoţavanje endemiĉnih i retkih biljaka spreĉavajući da potpuno išĉeznu, zatim za razmnoţavanje ugroţenih i ukrasnih biljaka, lekovitih biljaka, radi obezbeĊivanja sirovina za industrijsku proizvodnju. Veliki znaĉaj mikropropagacija ima i u suzbijanju i eliminaciji biljnih virusa meĊu biljkama, koristeći meristeme kao eksplantate u kojima se ne nalaze virusi. TakoĊe daje rezultate koji su od velikog znaĉaja za poljoprivredu, hortikulturu i šumarstvo.

Tokom razvoja kulture in vitro postojale su razliĉite podele procesa mikropropagacije. MeĊutim, podela koja je najprihvatljivija, i koja se danas najviše koristi jeste podela koju su dali Debergh i Maene (1981). U ovoj podeli mikropropagacija se deli na 4 faze koje su obeleţene brojevima od 0 do 4.

Faza 0 je dobila naziv “nulta” po tome što u stvari ne predstavlja fazu samog razmnoţavanja, već se u ovoj fazi vrši izbor majke biljke i njena priprema, odnosno obuhvata sve postupke pre uvoĊenja biljke u kulturu in vitro.

Faza 1 predstavlja prvu fazu klonskog razmnoţavanja. Obuhvata uspostavljanje aseptiĉne kulture, što se odnosi na sterilnu izolaciju eksplantata, sterilizaciju prostora, pribora i posuĊa, kao i pripremanje i sterilizaciju hranljivih podloga.

Faza 2 je faza u kojoj se umnoţavaju klonirane biljke, koje bi kada se odvoje od kulture bile sposobne da nastave svoj rast i daju kompletnu biljku. Uovoj fazi se obavezno koriste biljni regulatori rastenja (citokinini, auksini, giberelini…).

Faza 3 podrazumeva obavljanje neophodnih koraka za osposobljavanje biljaka za individualni rast, fotosintezu i preţivljavanje bez dodataka ugljenih hidrata – priprema za rast u prirodnom okruţenju. To podrazumeva indukciju korenova in vitro pre prebacivanja u zemlju.

Faza 4 predstavlja pripremu i prenos biljaka iz in vitro u uslove spoljašnje sredine (ex vitro). Ova faza je veoma znaĉajna zato što prenos biljaka u spoljašnju sredinu predstavlja fiziološki stres, koji neke biljke ne mogu da pravaziĊu, jer su u in vitro uslovima imale sve potrebne hranljive materije, optimalnu temperaturu, visoku vlaţnost i zaštitu od mikroorganizama u sterilnim uslovima.

Prednosti vegetativnog razmnoţavanja u uslovima in vitro:

- In vitro razmnoţavanje moţe biti mnogo brţe od in vivo razmnoţavanja;

- Moguće je razmnoţavanje biljaka ĉije umnoţavanje nije moguće u in vivo uslovima;

- Mikroklonirane biljke ĉesto rastu bolje i brţe od biljaka koje rastu u in vivo uslovima jer su osloboĊene od patogena i infekcija bakterijama i gljivama;

- U kulturi in vitro se razmnoţavaju samo zdrave biljke;

- Vegetativno razmnoţavanje u uslovima in vitro moţe poĉeti sa vrlo malo biljnog materijala kao poĉetnog eksplantata;

- Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je vremenski predvideti proizvodnju odreĊenih kultura;

- Veliki znaĉaj ovaj vid razmnoţavanja našao je u ex situ zaštiti ugroţenih i retkih biljnih vrsta.

Nedostaci vegetativnog razmnoţavanja u uslovima in vitro:

- U nekim kulturama koje se razmnoţavaju na ovaj naĉin genetiĉka stabilnost je niska;

- Kod drvenastih vrsta teško je indukovati formiranje korenovog sistema in vitro;

- Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako teţak i mukotrpan posao;

- Regenerativna sposobnost se moţe izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;

- U nekim sluĉajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teška.

2. CILJ RADA

Cilj ovog rada:

 Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana i ispitivanje uticaja razliĉitih kombinacija regulatora rastenja na rastenje i izduţivanje aksilarnih pupoljaka

 Ispitivanje uticaja nutritivnih podloga na produkciju biomase eksplantata M. juliana

 Statistiĉka obrada dobijenih rezultata

 IzvoĊenje zakljuĉaka i tumaĉenje rezultata u skladu sa postojećim podacima iz literature

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal

Postoje dve vrste biljnog materijala koje mogu da se koriste za in vitro izolaciju: biljke koje se gaje u kontrolisanim uslovima (u staklari) i biljni materijal sakupljen u prirodi. Ako se eksplantat izoluje iz biljke koja je rasla u prirodi postoji veća verovatnoća da će doći do infekcije pa je neophodna ozbiljnija sterilizacija tkiva. Izuzetak ĉine tkiva koja se izoluju iz unutrašnjosti biljnih organa, kao na primer iz kambijalne zone nekog ţbuna ili drveta, ili iz organa rezervoara hrane kao što su pupoljci, krtole idr. (Marić, 1995).

Biljke Micromeria juliana iz prirodnog staništa iz kanjona Moraĉe (Crna Gora) donete su i sa njih su prikupljena semena. Semena su in vitro isklijala, biljke dobijene na ovaj naĉin bile su upotrebljene za uspostavljanje kulture aksilarnih pupoljaka (nepublikovani materijal, D. Stojiĉić, S. Tošić). Biljke dobijene na ovaj naĉin su izdeljene na nodalne eksplantate. Vršni pupoljak nije korišćen kao eksplantat. Nodalni eksplantati su postavljani na hranljivu podlogu MS (Murashige i Skoog, 1962) sa razliĉitim kombinacijama regulatora rastenja – citokinina (BA) i auksina (IAA).

3.2. Hranljiva podloga MS

Hranljiva podloga (medijum) predstavlja smešu agara, šećera, mineralnih soli, vitamina, inozitola, aminokiselina, kofaktora i hormona. Priprema se kuvanjem i steriliše autoklaviranjem pre ili posle razlivanja u posude za kultivaciju in vitro. Hranljive podloge mogu biti teĉne i ĉvrste. Teĉne sadrţe sve navedene komponente osim agara (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996).

Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu je MS podloga. Doterivanje pH podloge je uraĊeno sa 1N NaOH, i podešena vrednost treba da iznosi 5,8. Treba imati u vidu da tokom autoklaviranja pH podloge opadne za oko 0,5 pH jedinica, pa ako se spusti ispod vrednosti 5,0 postoji mogućnost da se podloga nakon autoklaviranja ne stegne. Kasnije, pH podloge menja i sama biljka koja raste na njoj. pH vrednost podloge se najĉešće proverava indikator papirom (Merck pH 5,4 – 7,0), mada je pravilnije da se odreĊuje pH – metrom.

Sastav MS podloge prikazuje Tabela 1. Sve prikazane teţine koriste se za pripremanje jednog litra hranljive podloge.

Makro mineralne soli MS (mg/l)

KNO3 1900 NH4NO3 1650 CaCl2 x 2H2O 440 MgSO4 x 7H2O 370 KH2PO4 170 Mikro mineralne soli MS (mg/l)

MnSO4 x 4H2O 22.3 ZnSO4 x 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KJ 0.83 NaMoO4 x 2H2O 0.25 CuSO4 x 5H2O 0.025 CoCl2 x 6H2O 0.025 FeSO4 x 7H2O 27.8 Na2EDTA 37.2 Organski dodaci MS (mg/l)

vitamin B1 0.4 vitamin B6 0.5 nikotinska kiselina 0.5 glicin 2.0 (g/l) mioinozitol 0.1 saharoza 30.0 agar 7.0

Tabela 1. Sastav MS hranljive podloge

3.2.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana

Za indukciju aksilarnih pupoljaka na eksplantatima M. juliana korišćena je MS podloga sa razliĉitim kombinacijama regulatora rastenja. MS podloga bez regulatora rastenja je sluţila kao kontrola. TakoĊe, korišćena je i MS podloga sa indol – sirćetnom kiselinom kao kontrola 2. Citokinin BA je korišćen u koncentracijama 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 i 30 µM, a auksin indol – sirćetna kiselina u koncentraciji 0.57 µM. Korišćene kombinacije regulatora rastenja prikazane su u Tabeli 2.

Podloga BA (µM) IAA (µM) 1 0 0 2 0 0.57 3 0.1 0.57 4 0.3 0.57 5 1.0 0.57 6 3.0 0.57 7 10.0 0.57 8 30.0 0.57

Tabela 2. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana

Nakon pripreme, hranljive podloge su razlivene u staklene teglice, po tri teglice za svaku kombinaciju biljnih hormona, kao i za kontrole. U svakoj teglici postavljeno je po 10 nodalnih eksplantata, ukupno 30 za svaku kombinaciju. Eksplantati su bili pribliţno iste veliĉine. Postavljeni su uspravno, donjim delom uronjeni u podlogu. Eksplantati su gajeni u kulturi 28 dana, na temperaturi od 21 ± 2 °C i fotoperiodu od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Nakon 28 dana utvrĊen je broj pupoljaka, njihova duţina, izmerena je sveţa masa biljaka, a nakon sušenja (nekoliko dana na sobnoj temperaturi) i njihova suva masa. Dobijeni podaci su obraĊeni statistiĉki.

3.3. Metode sterilizacije

Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju ili uništavaju svi oblici mikroorganizama. Metode sterilizacije se dele na fiziĉke i hemijske.

Fizičke metode sterilizacije obuhvataju sterilizaciju toplotom, zraĉenjem i mehaniĉku sterilizaciju (filtriranje). Sterilizacija toplotom moţe biti:

 Sterilizacija suvom toplotom:

Opaljivanje na plamenu – koristi se za sterilizaciju metalnog i staklenog pribora. Na ovaj naĉin sterilišu se pincete, špatule, makaze, otvori epruveta, itd.

Toplim vazduhom – ovaj vid sterilizacije vrši se upotrebom suvog sterilizatora (princip metode će biti opisan u odeljku 3.3.3. sterilizacija instrumenata).

 Sterilizacija vlaţnom toplotom:

Kuvanjem – Ovaj vid sterilizacije danas je u velikoj meri prevaziĊen, ali se moţe upotrebljavati za sterilizaciju gumenih creva i sliĉnog pribora. Sterilizacija se vrši na 100 °C tokom 15 minuta.

Vodenom parom pod pritiskom – Sterilizacija vlaţnom toplotom pod pritiskom podrazumeva upotrebu autoklava (detaljnije u odeljku 3.3.2.).

Vodenom parom bez pritiska – Sterilizacija vlaţnom toplotom bez pritiska podrazumeva upotrebu Kohovog lonca i vodenog kupatila, a sama sterilizacija oznaĉena je kao tindalizacija ili frakciona sterilizacija.

 Radijacija (zraĉenje)

Ultravioletnim (UV) zracima – Ovaj vid sterilizacije podrazumeva upotrebu svetlosti malih talasnih duţina (250-300 nm), što se ostvaruje upotrebom UV lampi. Na ovaj naĉin sterilišu se radne površine i vazduh u laboratorijama.

Jonizujuće zračenje (X zraci,  zraci) – Dejstvom zraĉenja vrši se jonizacija, stvaraju se peroksidi i na taj naĉin uništavaju mikroorganizmi.

 Mehaniĉke metode – filtracija

Metodom filtracije se odstranjuju bakterije iz teĉnosti uz pomoć filtera na kojima se nalaze pore veliĉine od jednog do nekoliko mikrona. Filtracija se obavlja primenom pozitivnog pritiska iznad teĉnosti ili negativnog (upotrebom vakuuma). Postoji više vrsta filtera: Seitz-ov filter, Chamberland-ov filter, Berkefeld-ov filter i membranski filteri.

MeĊu hemijskim sredstavima koja se primenjuju za sterilizaciju treba spomenuti etilen – oksid, koji se koristi samo u te svrhe, dok se ostala hemijska sredstva primenjuju prvenstveno za dezinfekciju.

U kulturi in vitro postoje 4 izvora infekcija: biljka, hranljiva podloga (nedovoljno sterilisana), vazduh i istraţivaĉ (neprecizan rad) (Marić,1995).

3.3.1. Sterilizacija biljnog materijala

Procedura sterilizacije eksplantata, kao prva faza mikropropagacije je veoma vaţna za uspešnost organogeneze, posebno ako se poĉetni eksplantati uzimaju iz prirode. Biljni materijal treba da bude dobro sterilisan pre njegove izolacije in vitro, jer je upravo biljni materijal najĉešće glavni uzrok infekcije u kulturi.

Sterilizacija semena je spoljašnja, zapoĉinje potapanjem semena u 70% alkohol u trajanju od nekoliko sekundi (96% alkohol je jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju). Zatim se semena prenose u 25% - ni rastvor varikine (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g aktivnog hlora/l) u trajanju od 25 minuta. Nakon toga se semena isperu tri puta sterilnom destilovanom vodom, i u sterilnim uslovima se prenose na hranljive podloge uz pomoć sterilnih instrumenata. Iz sterilnih semena razvijaju se sterilne biljke sa kojih se uzimaju nodalni eksplantati.

Ukoliko se i nakon primenjene sterilizacije biljnog materijala, kasnije javi infekcija neki od uzroka su:

- tzv. unutrašnje infekcije ĉiji su uzroĉnici mikroorganizmi u samoj biljci i ne mogu se ukloniti spoljašnjom sterilizacijom. Rešenje u ovakvim sluĉajevima je kultura meristema, jer većina mikroorganizama ne naseljava meristeme, kao i dodavanje antibiotika hranljivoj podlozi

- neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana površina stola, nesterilni instrumenti …)

- alkohol u koji se uranjaju instrumenti pred opaljivanje je zagaĊen

- hranljive podloge se ne ĉuvaju u sterilnim uslovima

- nije sterilna prostorija u kojoj je laminarna komora

- suviše ljudi ulazi u inokulacionu prostoriju, i na taj naĉin inficiraju pod i vazduh.

3.3.2. Sterilizacija hranljivih podloga

Sterilizacija hranljivih podloga vrši se vodenom parom pod pritiskom, odnosno u autoklavu. Za hranljive podloge autoklaviranje poĉinje kada pritisak dostigne vrednost 0,67 bara (odnosno 0,067 MPa, što priblizno iznosi 0,8 atm) i temperaturu od 114 – 115 °C. Na ovoj temperaturi hranljive podloge se sterilišu 20 do 25 minuta. Ukoliko se autoklaviraju na temperaturi od 121°C, vreme sterilizacije se skraćuje i iznosi 15 do 20 minuta (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996).

Podloge za potrebe ovog eksperimenta sterilisane su na temperatri od 120 °C u trajanju od 30 minuta. Po završetku sterilizacije, efikasnost autoklaviranja se proverava specijalnom trakom osetljivom na temperaturu. Ukoliko posude sa podlogom sadrţe više od 50 ml podloge, vreme autoklaviranja bi trebalo malo produţiti.

3.3.3. Sterilizacija instrumenata i prostora

Instrumenti (pincete, skalpeli...) se sterilišu iskuvavanjem u destilovanoj vodi 30 minuta. Nakon iskuvavanja prebacuju se u alkohol, a neposredno pre upotrebe se sterilišu i opaljivanjem na plamenu špiritusne lampe. Instrumenti se mogu sterilisati i u suvom sterilizatoru na temperaturi od 160 do 180°C, u trajanju od 1 do 2 sata. U suvom sterilizatoru se mogu sterilisati i predmeti od stakla i porculana. Pre sterilizacije u suvom sterilizatoru objekti moraju biti stavljeni u metalne kutije ili zavijeni u hartiju, kako nakon sterilizacije ne bi došlo do kontaminacije.

Radna prostorija i površine se sterilišu UV lampama, najmanje dva sata pre poĉetka rada. Radne površine se takoĊe dezinfikuju alkoholom.

3.4. Merenje sveže i suve mase biljaka

Sveţa masa biljaka merena je odmah nakon utvrĊivanja broja pupoljaka i njihove duţine. Suva masa je merena nakon nekoliko dana sušenja biljnog materijala. Sva merenja su obavljena na automatskoj analitiĉkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg. Dobijeni podaci su nakon toga statistiĉki obraĊeni.

3.5. Statistička analiza

Obrada podataka je uraĊena statistiĉko – grafiĉkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA i test LCD na nivou znaĉajnosti p<0,05. Statistiĉka analiza je uraĊena za svaki parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistiĉki znaĉajne razlike predstavljene su razliĉitim slovima, ista slova oznaĉavaju da tih razlika nije bilo.

4. REZULTATI

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana

Nodalni eksplantati Micromeria juliana postavljeni su na MS hranljivu podlogu: a) bez regulatora rastenja (kontrola), b) sa auksinom IAA (0,57 µM), i c) sa kombinacijom auksina IAA (0,57 µM) i razliĉitih koncentracija citokinina BA (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 i 30 µM ). Na induktivnoj podlozi eksplantati su gajeni 4 nedelje i za to vreme došlo je do formiranja aksilarnih pupoljaka na svim eksplantatima bez obzira na kojoj podlozi su gajeni. Na svim eksplantatima došlo je do promene boje listova koji su bili u dodiru sa hranljivom podlogom. Najviše odstranjenih eksplantata zbog nekroze bilo je na MS podlozi sa 30 µM BA + 0,57 µM IAA, ukupno 11 eksplantata od 30 postavljenih. Infekcija se javila na podlozi MS 3 µM BA + 0,57 µM IAA, obuhvatajući samo jedan eksplantat. Na ostalim podlogama nije došlo do znaĉajnih promena u pogledu nekroze i infekcije.

Posle statistiĉke obrade podataka dobijeni su sledeći rezultati :

 Tabela 3. prikazuje proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu, kao i njihovu duţinu u milimetrima  U Tabeli 4. prikazan je uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Tabela 3. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduţivanje aksilarnih pupoljaka M. juliana

Tretman Proseĉan broj Proseĉna duţina pupoljaka po pupoljaka (mm) eksplantatu 1 Bez hormona 5,86 ± 0,40b 3,95 ± 0,31b 2 0,57 μM IAA 4,68 ± 0,33ab 6,47 ± 0,79c 3 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA 5,73 ± 0,42b 4,12 ± 0,37 b 4 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA 3,68 ± 0,49a 4,18 ± 0,42 b 5 1 μM BA + 0,57 μM IAA 4,52 ± 0,42ab 3,94 ± 0,36 b 6 3 μM BA + 0,57 μM IAA 9,39 ± 0,65c 3,84 ± 0,20 b 7 10 μM BA + 0,57 μM IAA 4,37 ± 0,38a 2,56 ± 0,18 a 8 30 μM BA + 0,57 μM IAA 4,00 ± 0,49a 1,75 ± 0,10 a Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05

Eksplantati su uspešno rasli i razvijali se na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja. MeĊutim, eksplantati su se vidljivo razlikovali u duţini internodija, pojedini eksplantati su imali izduţene a pojedini eksplantati skraćene internodije (Sl. 3). Na malom broju eksplantata došlo je do pojave adventivnih korenova (Sl. 4). Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 5,86. Proseĉna duţina pupoljaka bila je 3,95 mm (Tab. 3).

M. juliana

Slika 3. M. juliana na MS podlozi bez hormona

M. juliana

Slika 4. Eksplantati M. juliana na MS podlozi bez hormona

Eksplantati gajeni na podlozi MS sa 0,57 μM IAA (Sl. 5) takoĊe pokazuju razliku u duţini internodija (Sl. 6). Boja im je nešto svetlija, svetlo zelena do ţuta. Na skoro svim eksplantatima došlo je do razvića adventivnih korenova (Sl. 6), što potvrĊuje ulogu auksina u razviću adventivnih korenova. Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 4,68 što je znaĉajno manja vrednost u odnosu na kontrolu bez hormona (Tab. 3). Proseĉna duţina pupoljaka bila je 6,47 mm, i to je znaĉajno više nego na eksplantatima sa bilo koje druge podloge.

MS + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 5. M. juliana na podlozi MS + 0,57 μM IAA

MS + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 6. Esplantati M. juliana na podlozi MS + 0,57 μM IAA

Na MS podlozi sa 0,1 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 7) proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 5,73 što je pribliţno kao i na podlozi bez hormona, dok je proseĉna duţina pupoljaka bila 4,12 mm (Tab. 3). Sa sve većom koliĉinom BA u podlozi dolazi do smanjenja proseĉne duţine pupoljaka, sa izuzetkom kod koncentracije 0,3 BA, gde je proseĉan broj pupoljaka neznatno veći. Na svega nekoliko eksplantata su se razvili adventivni korenovi (Sl. 8). Eksplantati su bili pribliţno iste visine, sa ponekim izuzetkom (Sl. 7).

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 7. M. juliana na MS podlozi sa 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 8. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

Kod eksplantata gajenih na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 9) zabeleţen je najmanji proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu i iznosio je 3,68 (Tab. 3). Proseĉna duţina pupoljaka bila je 4,18 mm i od ove vrednosti sledi smanjenje proseĉnih duţina pupoljaka sa povećanjem koncentracije BA u podlozi. Samo na jednom eksplantatu je došlo do razvića adventivnih korenova (Sl. 10), jer je još uvek koncentracija auksina veća od koncentracije citokinina.

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 9. M. juliana na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 10. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA

Na podlozi MS sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 11) proseĉan broj pupoljaka je iznosio 4,52. Proseĉana duţina pupoljaka po eksplantatu, kao što je već napomenuto, se smanjuje i na ovoj podlozi je iznosila 3,94 mm (Tab. 3). Na ovoj podlozi primećuje se veći broj tamnijih listova na gajenim eksplantatima usled njihovog kontakta sa podlogom - polegla forma zbog jaĉeg razvijanja jedne grane (Sl. 12). Na ovoj i svim sledećim podlogama nije došlo do razvića adventivnih korenova.

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 10. M. juliana na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 12. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA

Eksplantati koji su gajeni na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 13), imali su kraće internodije i skoro ţbunastu formu, ali i veliki broj pupoljaka (Sl. 14). Na ovoj podlozi zabeleţen je najveći proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu koji je iznosio 9,39 (Tab. 3). Ovo je jedina podloga na kojoj je proseĉan broj pupoljaka veći od vrednosti na kontrolnoj MS podlozi bez hormona. S obzirom na već pomenutu formu koju imaju, proseĉna duţina pupoljaka je bila sve manja i iznosila je 3,84 mm.

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 13. M. juliana na MS podlozi sa 3 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 14. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 3 μM BA + 0,57 μM IAA

Na podlozi MS sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 15) gajeni eksplantati su bili razliĉitih morfoloških karakteristika. Neki su imali duţe, neki kraće internodije, a neki toliko kratke da su bili ţbunaste forme (Sl. 16). Proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi iznosio je 4,37 (Tab. 3). Njihova proseĉna duţina bila je 2,56 mm.

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 15. M. juliana na MS podlozi sa 10 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 16. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 10 μM BA + 0,57 μM IAA

Na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA svi eksplantati su bili ţbunaste forme, sa izuzetno kratkim internodijama (Sl. 17, 18). Od ukupno 30 postavljenih eksplantata, 19 se uspešno razvilo. Na ovoj podlozi je zabeleţena najmanja proseĉna duţina pupoljaka koja je iznosila 1,75 mm (Tab. 3). Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 4,00 što je druga po redu najmanja zabeleţena vrednost u ovom radu.

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 17. M. juliana na MS podlozi sa 30 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

Slika 18. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 30 μM BA + 0,57 μM IAA

Dobijeni rezultati se mogu prikazati i grafiĉki, histogramom. Na histogramu 1. uoĉava se da je samo kombinacija hormona 3 µM BA + 0,57 µM IAA na MS podlozi dovela do povećanja proseĉnog broja pupoljaka po eksplantatu u odnosu na kontrolu bez hormona, što ujedno predstavlja i najveću vrednost. Svi ostali tretmani hormonima ne dovode do povećanja broja pupoljaka. Najmanja vrednost proseĉnog broja pupoljaka je zabeleţena na podlozi MS sa 0,3 µM BA + 0,57 µM IAA. Najveća proseĉna duţina pupoljaka je postignuta na podlozi MS sa 0,57 µM IAA, dok su najmanju proseĉnu duţinu imali pupoljci na eksplantatima gajenim na MS podlozi sa 30 µM BA + 0,57 µM IAA.

10 Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu 9 Prosečna duzina pupoljaka 8

0 Bez hormona 0,57 μM IAA 0,1 μM BA + 0,3 μM BA + 1,0 μM BA + 3,0 μM BA + 10 μM BA + 30 μM BA + 0,57 μM IAA 0,57 μM IAA 0,57 μM IAA 0,57 μM IAA 0,57 μM IAA 0,57 μM IAA

Histogram 1. Uticaj regulatora rastenja na broj i duţinu aksilarnih pupoljaka M. juliana

4.2. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Sveţa masa biljaka merena je odmah nakon evidentiranja broja pupoljaka i njihove duţine, i to za svaki eksplantat posebno. Nakon nekoliko dana, kada se materijal dobro osuši, merena je suva masa eksplantata. Dobijeni podaci su obraĊeni statistiĉki. U Tabeli 4. prikazan je uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana.

Iz dobijenih rezultata vidi se da je najveća proseĉna sveţa masa zabeleţena kod eksplantata koji su rasli na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA, i iznosila je 0,061 mg. Na istoj podlozi razvio se i najveći broj pupoljaka. Najmanja proseĉna sveţa masa zabeleţena je kod eksplantata na podlozi MS sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0, 012 mg. Eksplantati koji su rasli na ovoj podlozi su bili veoma mali, ţbunaste forme, pa su dobijeni rezultati oĉekivani. Na istoj podlozi je zabeleţena i najmanja proseĉna vrednost suve mase, koja je iznosila 0,0020 mg. Najveću proseĉnu vrednost suve mase imali su eksplantati koji su rasli na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA, i ta vrednost je iznosila 0,0085 mg.

Tabela 4. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Tretman Proseĉna sveţa masa Proseĉna suva masa (mg) (mg) 1 Bez hormona 0,017 ± 0,0019a 0,0028 ± 0,00030a 2 0,57 μM IAA 0,046 ± 0,0079bcd 0,0056 ± 0,00066abc 3 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA 0,027 ± 0,0019ab 0,0043 ± 0,00027ab 4 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA 0,044 ± 0,0053bcd 0,0057 ± 0,00066bc 5 1 μM BA + 0,57 μM IAA 0,051 ± 0,0013cd 0,0060 ± 0,00057bc 6 3 μM BA + 0,57 μM IAA 0,061 ± 0,0042d 0,0070 ± 0,00041bc 7 10 μM BA + 0,57 μM IAA 0,038 ± 0,0034bc 0,0085 ± 0,00074c 8 30 μM BA + 0,57 μM IAA 0,012 ± 0,0010a 0,0020 ± 0,00022a Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05

5. DISKUSIJA

Micromeria juliana je uspešno gajena u kulturi. M. juliana je uvedena u kulturu in vitro od strane D. Stojiĉić i S. Tošić i njihovi neobjavljeni rezultati bili su nam dostupni na uvid. U toku je publikacija indukcije aksilarnih pupoljaka i analiza etarskih ulja ove vrste. Najveći broj radova u kojima je korišćena vrsta M. juliana odnosili su se na ispitivanje sastava esencijalnih ulja. Slavkovska et al. (2005) nalaze da u sastavu esencijalnih ulja preovlaĊuju terpenske komponente. Kasnije, Kostadinova et al. (2007) govore da su to seskviterpeni. Hemijski sastav esencijalnih ulja iz listova ĉine ugljovodonici (7%) i jedinjenja kiseonika (57%), gde je glavni sastojak karvakrol (Phokas et al. 1980), dok Kremer et al. (2014) govore da je glavna komponenta esencijalnog ulja kariofilin – oksid. Prema Stojanović et al. (2005) glavni sastojci esencijalnog ulja su verbenol, timol, kariofilin – oksid, borneol i mirtenol. Što se tiĉe broja hromozoma, Martin et al. (2011) potvrĊuju ranija istraţivanja da broj hromozoma kod M. juliana iznosi 30 (2n).

U ovom radu su definisani uslovi u kojima dolazi do indukcije pupoljaka M. juliana, zatim njihovog izduţivanja, kao i uticaj razliĉitih tretmana na produkciju biomase. Pupoljci su se razvijali na svim eksplantatima bez obzira na kojoj su podlozi gajeni. Najveći proseĉan broj pupoljaka je indukovan na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM IAA i iznosio je 9,39. Njihova proseĉna duţina iznosila je 3,84 mm. Ovu kombinaciju hormona koristili su mnogi autori, takoĊe u cilju indukcije pupoljaka. Tako je, kod biljke Agastache rugosa najveći broj i najbolji kvalitet pupoljaka postignut na MS podlozi sa upravo ovom kombinacijom hormona (Zielinska et al. 2011). BA i IAA su pozitivno delovali i na indukciju pupoljaka kod vrste Ocimum killimandscharicum L. (Sharma et al. 2013), Ocimum citriodorum Vis. (Janarthanam i Sumathi, 2012), kao i kod vrste Mentha viridis L. (Rahman et al. 2013), dok se kod vrste Ocimum basilicum L. najveći broj pupoljaka razvio na podlozi MS sa 11 µM BA bez auksina (Asghari et al. 2012). Kod vrste Mentha piperita L. u indukciji pupoljaka najbolje se pokazala kombinacija citokinina (BA) i kinetina (Sunandakumari et al. 2004) kao i kombinacija auksina (NAA) i kinetina (Venkatramalingam and Ebbie, 2011).

Proseĉna duţina pupoljaka bila je najveća na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi samo sa auksinom IAA (0,57µM), i iznosila je 6,47 mm. Drugaĉiji rezultati dobijeni su kod vrste Mentha piperita L. gde je najveća duţina pupoljaka postignuta na MS podlozi samo sa citokininom (BA) (Ghanti et al. 2004). Sa povećanjem koncentracije BA u podlozi, smanjivala se

36 proseĉna duţina pupoljaka na eksplantatima M. juliana. Iako citokinini pospešuju proliferaciju aksilarnih izdanaka, njihova inhibitorna uloga u elongaciji izdanka je takoĊe dobro poznata (Zuzarte et al. 2010).

U ovom radu najpovoljniji uticaj na produkciju sveţe mase eksplantata M. juliana imala je podloga na kojoj se razvio i najveći broj pupoljaka na eksplantatima (MS podloga sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA). Na toj podlozi proseĉna sveţa masa biljaka je bila najveća i iznosila je 0,061mg. Najveću proseĉnu suvu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA, i ta vrednost je iznosila 0,0085 mg.

6. ZAKLJUČAK

Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. je uspešno gajena u kulturi in vitro. Najveći broj aksilarnih pupoljaka indukovan je na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi sa 3 µM citokinina BA i 0,57 µM auksina IAA. Ovo je jedina podloga gde je zabeleţen veći broj pupoljaka u odnosu na kontrolnu MS podlogu bez hormona. Najveća proseĉna duţina pupoljaka je izmerena na eksplantatima koji su gajeni na podlozi MS samo sa auksinom IAA u koncentraciji 0,57 µM. Adventivni korenovi su se razvili samo na podlogama u kojima je koncentracija IAA bila veća od koncentracije BA. Sa povećanjem koncentracije BA smanjivao se broj eksplantata na kojima su se razvili adventivni korenovi.

Najveću proseĉnu sveţu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM IAA, dok je najveća vrednost proseĉne suve mase zabeleţena na eksplantatima na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA.

Dobijeni rezultati su pokazali da se Micromeria juliana moţe uspešno gajiti i razmnoţavati u in vitro uslovima, i da se od veoma malo poĉetnog materijala moţe dobiti veliki broj biljaka koje se mogu reintrodukovati na svoja prirodna staništa. Na taj naĉin spreĉava se potpuno išĉezavanje ove biljke, i postiţe se znaĉajan napredak u farmaceutskoj, kozmetiĉkoj i prehrambenoj industriji gde je ova biljka našla svoju primenu.

7. LITERATURA

1. Arabaci, T., Dimenci, T., Celep, F., 2010: Morphological character analysis in Turkish Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical taxonomic study. Turkish Journal of Botany, 34: 379 – 389. 2. Asghari, F., Hossieni, B., Hassani, A., Shirzad, H., 2012: Effect of explants source and different hormonal combinations on direct regeneration of basil plants (Ocimum basilicum L.). AJAE, 3: 12 – 17. 3. Brӓuchler, C., Ryding, O., Heubl, G., 2008: The genus Micromeria (Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia, 38: 363 – 410. 4. Boissier, E., 1879: Flora orientalis. Basel & Geneve, 4: 568 – 575. 5. Debergh, P., Maene, L., 1981: A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture, Sci. Hort., 14: 335–345. 6. Ghanti, K., Kaviraj, C. P., Venugopal, R. B., Jabeen, F. T. Z., Rao, S., 2004: Rapid regeneration of Mentha piperita L. from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of Biotechnology, 3: 594 – 598. 7. Janarthanam, B., Sumathi, E., 2012: Plantlet regeneration from nodal explants of Ocimum citriodorum Vis. Bangladesh J. Sci. Ind. Res., 47: 433 – 436. 8. Kalogjera, Z., Vladimir, S., 1992: Micromeria vrste u flori Hrvatske. Farmaceutski glasnik, 48: 203 – 214. 9. Kostadinova, E., Alipieva, K., Stefova, M., Stafilov, T., Antonova, D., et al. 2007: Chemical composition of the essential oils of three Micromeria species growing in Macedonia and Bulgaria. Macedonian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 26: 3 – 7. 10. Kremer, D., Dunkić, V., Rušĉić, M., Matevski, V., Ballian, D., Bogunić, F., Eleftheriadou, E., Stešević, D., Kosalec, I., Bezić, N., Stabentheiner, E., 2014: Micromorphological traits and essential oil contents of Micromeria kerneri Murb. and M. juliana (L.) Benth. Phytochemistry, 98. 128 – 136. 11. Marić, M., 1995: Kultura biljnih tkiva. Draganić, Beograd. 12. Martin, E., Cetin, O., Dırmenci, T., Ay, H., 2011: Karyological studies of Clinopodium L. (Sect. Pseudomelissa) and Micromeria Benth. s. str. (Lamiaceae) from Turkey. Caryologia, 64: 398 – 404. 13. Morales, V., 1991: El genero Micromeria Bentham (Labiateae) en la Peninsula Iberica e Islas Baleares. Anales Jard. Bot. Madrid, 48: 131 – 156.

14. Murashige, T., Skoog, F., 1962: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497. 15. Nešković, M., Konjević, R., Ćulafić, Lj., 2003: Fiziologija biljaka. Biološki fakultet, Beograd. 16. Palić, I., 2009: Hemijska analiza i mikrobiološka aktivnost ekstrakata odabranih vrsta roda Micromeria Bentham, PhD Dissertation, Prirodno – matematiĉki fakultet, Univerzitet u Nišu. 17. Phokas, G., Patouha – Volioti, G., Katsiotis, S., 1980: Studies on the essential oils from Micromeria juliana leaves. Plantes Medicinales et Phytotherapie, 14: 159 – 163. 18. Rahman, M. M., Ankhi, U. R., Biswas, A., 2013: Micropropagation of Mentha viridis L.: An aromatic medicinal plant. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4: 2926 – 2930. 19. Sharma, N. K., Vandana, T., Kumar, M., Kumar, H., 2013: In vitro regeneration of Ocimum killimandscharicum L.: A camphor yielding medicinal plant. Journal of Cell and Tissue Research, 13: 3937 – 3942. 20. Slavkovska, V., Couladis, M., Bojović, S., Tzakou, O., Pavlović, M., Lakušić, B., Jancic, R., 2005: Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria Bentham from Serbia and Montenegro. Plant Systematics and Evolition, 255: 1 – 15. 21. Stojanović, G., Palić, I., Ursić – Janković, J., 2005: Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Micromeria cristata and Micromeria juliana. Flavour and Fragrance Journal, 21: 77 – 79. 22. Sunandakumari, C., Martin, K. P., Chithra, M., Sini, S., Madhusoodanan, P. V., 2004: Rapid axillary bud proliferation and ex vitro rooting of herbal spice, Mentha piperita L. Indian Journal of Biotehnology, 3: 108 – 112. 23. Šilić, Ĉ., 1979: Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej Bosne i Hercegovine, Sarajevo. 24. Tatić, B., Bleĉić, V., 2002: Sistematika i filogenija viših biljaka. Zavod za udţbenike i nastavna sredstva, Beograd.

25. Venkatramalingam, K., Ebbie, M.G., 2011: An Efficient in vitro Culture Method of Shoot Regeneration for a Medicinaly Important Plant Mentha Piperita. Journal of Plant Sciences, 6: 108-112. 26. Vinterhalter, D., Vinterhalter, B., 1996: Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka. Axial, Beograd. 27. Zielinska, S., Piatczak, E., Kalemba, D., Matkowski, A., 2011: Influence of plant growth regulators on volatiles produced by in vitro grown shoots of Agastache rugosa (Fischer & C.A.Meyer) O. Kuntze. Plant Cell Tiss Organ Cult, 107: 161 – 167. 28. Zuzarte, M., Dinis, A., Cavaleiro, C., Salgueiro, L., Canhoto, M., 2010: Trichomes, essential oils and in vitro propagation of Lavandula pedunculata (Lamiaceae). Industrial Crops and Products, 32: 580 – 587.

8. BIOGRAFIJA KANDIDATA

Marija J. Jovanović roĊena je 23. jula 1989. godine u Nišu. Završila je osnovnu školu „Bogdan Blagojević“ u Medoševcu, a nakon toga 2004. godine upisuje srednju medicinsku školu „Dr Milenko Hadţić“ u Nišu, smer pedijatrijska – sestra tehniĉar. Nakon završene srednje škole, školske 2008/2009. godine, zapoĉinje osnovne akademske studije, na Prirodno – matematiĉkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju, koje završava 2011. godine sa zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije, na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, na istom fakultetu, koje završava 2014. godine.