UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Marija J. Jovanović Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana L. (Benth.) MASTER RAD Niš, 2014. UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana L. (Benth.) Master rad Kandidat: Mentor: Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, vanredni profesor Br. indeksa: 56 Niš, 2014. UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY Axillary bud induction on nodal explants Micromeria juliana L. (Benth.) Master thesis Candidate: Mentor: Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, associate professor No. of index: 56 Niš, 2014. Zahvaljujem se svojoj mentorki prof. dr Dragani Stojičić na izboru teme, ukazanoj pomoći, savetima, podršci i strpljenju pri izradi ovog master rada. Takođe se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći pri izradi eksperimentalnog dela ovog rada. Ovaj master rad je rađen u okviru doktorske disertacije asistenta Svetlane Tošić i sadrži još uvek nepublikovane rezultate. Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, Nikoli i svojim prijateljima na podršci, pomoći, ljubavi i razumevanju. Hvala Vam što ste uvek uz mene! SADRŢAJ: SAŽETAK ………...…………………………………………………………………………….. 1 1. UVOD ………………………………………………………………………………………… 3 1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae …………….………………………….……… 4 1.1.1. Rod Micromeria …………………………………….…………………………….. 5 1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. …….……………………………...……. 6 1.2. Kultura in vitro ……....……………………….………………………….....…………... 8 1.2.1. Mikropropagacija ……………………………………………….…………..….… 10 2. CILJ RADA ……………………………………………………………………………….… 13 3. MATERIJAL I METODE …………………………………….....………………………… 15 3.1. Biljni materijal …….……...…………………………………………………………… 16 3.2. Hranljiva podloga MS …….………………………………………………….……….. 16 3.2.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana ………….…….. 18 3.3. Metode sterilizacije ………………………….……………………………………...…. 19 3.3.1. Sterilizacija biljnog materijala ………………………………………………….... 20 3.3.2. Sterilizacija hranljivih podloga …………………………………………………... 21 3.3.3. Sterilizacija instrumenata i prostora ……………………………………………... 22 3.4. Merenje sveţe i suve mase biljaka ………………………………………………..….. 22 3.5. Statistiĉka analiza ………………………….……………………………………......… 22 4. REZULTATI …………………………………………………………………………......…. 23 4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana .......................... 24 4.2. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka M. juliana .................................................... 34 5. DISKUSIJA ............................................................................................................................. 35 6. ZAKLJUČAK ......................................................................................................................... 38 7. LITERATURA ........................................................................................................................ 40 8. BIOGRAFIJA KANDIDATA ............................................................................................... 44 SKRAĆENICE: BA – 6 – benzil – aminopurin IAA – indol – 3 – sirćetna kiselina SAŽETAK Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. je aromatiĉna biljka koja pripada porodici Lamiaceae. Veoma je efikasna u leĉenju mnogih bolesti i tegoba. U ovom radu su definisani uslovi pri kojima dolazi do indukcije pupoljaka M. juliana, njihovog izduţivanja, kao i uticaj razliĉitih tretmana na produkciju biomase. Korišćene su razliĉite kombinacije regulatora rastenja, citokinina (BA) i auksina (IAA) na MS hranljivoj podlozi. Najveći broj pupoljaka formirao se na eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM IAA. Na istoj podlozi je zabeleţena i najveća sveţa masa biljaka M. juliana. Najveću duţinu imali su pupoljci na eksplantatima gajenim na podlozi sa 0,57 µM IAA, dok su najveću suvu masu imali eksplantati gajeni na podlozi sa 10 µM BA i 0,57 µM IAA. Ključne reči: Micromeria juliana, aksilarni pupoljci, benzil – aminopurin, indol – sirćetna kiselina 1 ABSTRAKT Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. is an aromatic plant that belongs to the family Lamiaceae. It is very effective in treating many diseases and ailments. This work defines the conditions which cause the induction of buds M. juliana, their elongation, and the influence of different treatments on biomass production. Different combinations of plant growth regulators, cytokinins (BA) and auxin (IAA) were used on MS medium. The highest number of buds was formed on the explants that were cultured on medium with 3 μM BA and 0,57 μM IAA. The highest fresh weight of plants M. juliana was registered on the same medium. A maximum length had buds on explants that were grown on medium with 0,57 μM IAA, while the highest dry weight had explants on medium containing 10 μM BA and 0,57 μM IAA. Keywords: Micromeria juliana, axillary buds, benzyl - aminopurine, indole - acetic acid 2 1. UVOD 3 1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae Familija usnatica (Lamiaceae) obuhvata veoma vaţnu i brojnu grupu biljaka. Predstavljena je sa 200 rodova i oko 3500 vrsta. Najveće bogatstvo rodova i vrsta je u Mediteranu, Maloj i centralnoj Aziji. U flori Balkanskog poluostrva familija je predstavljena sa 371 vrstom, od ĉega su 84 vrste Balkanski endemiti. U Srbiji je zastupljena sa 147 vrsta u okviru 30 rodova. Od svih familija, Lamiaceae zauzimaju drugo mesto po broju vrsta u ovom delu Evrope. Predstavnici familije Lamiaceae su kosmopolitske vrste koje naseljavaju suva i dobro osunĉana mesta – livade, pašnjake, kamenjare. Poznate su i korovske kao i rudimentarne vrste. Biljke familije Lamiaceae su jednogodišnje i višegodišnje zeljaste biljke, poluţbunovi ili ţbunovi, retko drveće. Stablo im je ĉetvorougaonog oblika, listovi su prosti, naspramnog rasporeda, bez zalistaka. Cvetovi imaju karakteristiĉnu graĊu i zigomorfne su simetrije. Ĉašica se sastoji od pet sraslih listića, cevasta je, kod nekih predstavnika ĉak dvousnata. Krunica je sastavljena od pet listića, koji su u donjem delu srasli u cev, dok je gornji deo razdvojen na dva dela: gornju usnu, koju ĉine dva kruniĉna listića i donju usnu, sastavljenu od tri kruniĉna listića. Andreceum se sastoji od 4 prašnika, od kojih su dva duţa a dva kraća, dok se kod nekih rodova nalaze samo dva prašnika (Salvia, Rosmarinus). Tuĉak je izgraĊen od dve karpele. Plodnik je nadcvetan, dvook, sa po jednim semenim zametkom u svakom okcu. Cvetovi su sakupljeni u manje cimozne cvasti. Plod je merikarpijum koji se raspada na ĉetiri jednosemena plodića (Tatić B., Bleĉić V. 2002). Cvetna formula: K(5) [ C(5) A(4,2) ] G(2) Lamiaceae imaju karakteristiĉan miris jer sadrţe etarska ulja (aromatiĉni alkoholi, fenoli, terpeni, ketoni, aldehidi itd.). Etarska ulja su smeštena u ţlezdanim dlakama na površini lista i drugih organa. Etarska ulja se koriste u medicini, farmaciji, kozmetiĉkoj industriji a neke vrste se koriste i kao zaĉinske biljke. Najpoznatiji predstavnici familije su: majĉina dušica, nana, ruzmarin, ţalfija, lavanda, origano, matiĉnjak, mrtva kopriva, bosiljak, rtanjski ĉaj, srdaĉica, trava iva i mnogi drugi. 4 1.1.1. Rod Micromeria U starijoj literaturi postojale su brojne nedoumice u pogledu taksonomije i nomenklature Micromeria vrsta, što potvrĊuje i postojanje velikog broja sinonima za pojedine vrste. Neke su svrstane u rod Thymus, Satureja, Calamintha, Melissa idr. (Kalogjera i Vladimir, 1992). Prvi put rod Micromeria opisuje Bentham 1829. godine. Rod sadrţi 130 vrsta koje su najvećim delom rasprostranjene u mediteranskoj i makaronezijskoj regiji (Morales, 1991). Prema Brӓuchler et al. (2008), rod Micromeria se prostire od mediteransko – makaronezijske regije, sve do juţne Afrike, Indije i Kine (Slika 1.). U flori Srbije i Crne Gore rod je predstavljen sa 10 vrsta, od kojih su 7 endemiĉne (Šilić, 1979). Slika 1. Rasprostranjenost roda Micromeria u svetu (Brӓuchler, 2008) 5 Boissier (1879) deli rod Micromeria u tri sekcije: Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. pulegium, M. dalmatica) Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora) Cymularia Nedavne molekularne analize su pokazale da je rod Micromeria polifilan, tako da su ĉlanovi sekcije Pseudomelisa blisko srodni rodu Clinopodium, pa su vrste iz ove sekcije prebaĉene u rod Clinopodium, gde i spadaju zbog morfoloških karakteristika (Arabaci et al., 2010). Micromeria juliana, koja je korišćena u ovom radu pripada sekciji Eumicromeria. 1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. Carstvo: Plantae Razdeo: Magnoliophyta Klasa: Magnoliopsida Red: Lamiales Familija: Lamiaceae (Labiatae) Rod: Micromeria Slika 2: Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. 6 Morfologija i biologija: Micromeria juliana (Sinonimi: Clinopodium julianum, Micromeria minoa, Sabbatia corymbosa, Satureja juliana, Satureja spicata) je višegodišnja zeljasta biljka (Slika 2). Ima formu listopadnog ţbuna visine 10 – 40 cm, ĉesto manji, dlakavi, sa mnogo stabljika. Listovi su usko ovalnog oblika, naspramnog rasporeda. Cvetovi su ljubiĉaste boje udruţeni u cvasti. Koren i izdanci pri dnu su odrvenjeni. Cveta od maja do jula. Stanište: Ovoj vrsti odgovaraju suva, svetla (pešĉana) zemljišta. Naseljava i kamenjare i pukotine kreĉnjaĉkih stena mediteranskog i submediteranskog pojasa. Javlja se u rasponu od 0 do oko 800 (1000) m nadmorske visine. Raste na kiselim, neutralnim i baznim zemljištima. Moţe da raste na nutritivno siromašnom