Année Universitaire2017/2018

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET DES SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE

Laboratoire des Produits Naturels

Thèse de Doctorat en Biologie

Option: Microbiologie et sécurité sanitaire des aliments

Présentée par:

GHOUTI Dalila

Profil chimique et activités biologiques des huiles essentielles et des extraits de deux plantes (Juniperus phoenicea L. & Cotula cinerea (Del)). du sud-ouest algérien.

Devant la commission d’examen composée de:

Mr. CHABANE Sari D Président Pr. Université de Tlemcen Mr. LAZOUNI H. Abderrahman Directeur de Thèse Pr Université de Tlemcen Mr. MOUSSAOUI Abdallah Co-Directeur de Thèse Pr. Université de Béchar Mm. BEKHECHI Chahrazed Examinateur Pr. Université de Tlemcen Mr MAMI Anes Examinateur MCA. Université d'Oran Mr MAKHLOUFI Ahmed Examinateur MCA. Université de Béchar

Année Universitaire2017/2018

REMERCIMENTS

En rendant cette dissertation publique, je ressens le devoir et le besoin d'exprimer ma profonde gratitude à tous ceux qui ont contribué à la réalisation de cette travail qui en quelque sorte mon aidé à surmonter les difficultés que je ressentais pendant cette période de ma formation et de ma vie. Il est sensible que je reconnais:

Monsieur LAZOUNI Hamadi Abderrahmane, professeur au département de l’Ecologie et

Environnement, Faculté SNV-STU, Université de Tlemcen. J’adresse le plus spécial des remerciements. Pour leur orientation de cette thèse, son motivation et les conseils fournis au cours de ces années. Parce qu'il croyait que je pouvais arriver ici, parce qu'il me l'a fait croire, et surtout parce qu'il l'a rendu possible. Pour la grande autonomie qu’il m’a accordée, Pour son disponibilité rapide en toutes occasions. Mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup.

Monsieur MOUSSAUI Abdallah co-directeur de cette thèse, professeur au département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université de Béchar, car il était fondamental à un certain moment de ma carrière académique. J'exprime mon appréciation et mon admiration pour les précieux enseignements scientifiques transmis. Mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup.

Je suis très sensible à l’honneur que me fait Madame Isabel C.F.R. Ferreira, professeur au

Centre de recherche sur la montagne (CIMO), Institut polytechnique de Bragance, Portugal. , qui m’a accueilli au sein de son laboratoire, qui m’a soutenu dans la réalisation de ce travail et qui a toujours fait preuve d’une grande disponibilité et d’une gentillesse à tout moment. Mes profondes gratitudes et mes sincères reconnaissances. Merci beaucoup.

Mes remerciements vont également à Monsieur CHAABANE SARI Daoudi, Professeur au département de Biologie, faculté SNV-STU à l’université de Tlemcen, pour m’avoir apporté un appui au cours de ce travail. Je le remercie pour ses qualités humaines et de me faire l’honneur de présider ce jury. Mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup. Je suis également très redevable à Madame BEKHECHI Chahrazed, Professeur au département de Biologie, faculté SNV-STU à l’université de Tlemcen, qui m’a fait l’honneur d’examiner ce travail. Je suis très heureuse de bénéficier de vos observations et je tiens à vous exprimer mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup.

Un grand merci à monsieur MAMI Anes, Maitre de conférences "MCA", Université d'Oran, d’avoir accepté d’être examinateur de ce travail, et je tiens à vous exprimer mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup.

De même, je remercie très sincèrement Monsieur MAKHLOUFI Ahmed, Maitre de conférences "MCA", Université de Béchar, pour avoir accepté d’être examinateur de ce travail.

Je tiens à vous exprimer ma sincère reconnaissance et de mon plus profond respect. Merci beaucoup.

Je remercie mon cher époux, Monsieur BOUKHARI Abderrahmen qui m’a soutenue au quotidien pendent ces années de thèse. Je le remercie pour son aide et encouragement à aller plus loin. Mes plus sincères remerciements. Merci beaucoup.

Je ne pouvais finir sans remercier très fortement ma mère pour leur soutien et encouragement, pour l’inquiétude quant a l’avancée de mes travaux. Merci a mes frères, ma sœur, mes enfants. Merci beaucoup.

Table des Matières:

Remerciement Résumé Abstract ْ ُم َل َخ صْ Liste des Photos Liste des figures Liste des tableaux Liste des Abréviations

Introduction générale……………………………………………………………………. 1

1ère Partie: Synthèse bibliographique Chapitre I:

Les Plantes Aromatiques Médicinales

I.1.Introduction ………………………………………………………… ……… …. .. 4 I.2.Présentation des plantes étudiées …………………...... 4 I.2.1. .Juniperus phoenicea L……………………………………………………… ….. 4 I.2.1. 1.Classification Systématique……………………… ………………… ….. . 5 I.2.1. 2.Description botanique ……………………………………… ……… 6 I.2.1.3.Composition chimique, activités biologiques et utilisation . 6 I.2.2.Cotula cinerea (Del)……………………………………………………………... 8 I.2.2.1.Classification systématique …… ……………………...... 9 I.2.2.2.Description botanique …………………...... 9 I.2.2.3. Composition chimique, activités biologiques et utilisation médicinales ……... 10 Chapitre II: Composés phénoliques et huiles essentielles II.1.Introduction ……………………………………………………………… …... 12 II.2.Composés phénoliques ……………………………………...... 12 II.2.1.Phénols, acides phénols et phénylpropanoїdes … ………………………… 14 II.2.2.Les flavonoïdes ……… …………………………………………… …. 15 II.2.3.Les Stilbènes ………………………………………………………………… 18 II.2.4.Xanthones ………………………………………………………………………. 19 II.2.5.Quinones et émodols ………………………………………………………… 19 II.2.6.Tannins ………………………………………………………………………… 19 II.3.Les huiles essentielles …………………………………... 20 II.4.Caractérisation et identification des composés phénoliques et des huiles essentielles……………………………………………………………………………… 2 3 II.4.1.Chromatographie liquide haute performance ……………………... ……….. 2 4 II.4.2.Résonance magnétique nucléaire……………………... ……….. …………… 2 5 II.4.3.La chromatographie phase gazeuse ……………………... ……….. ………… 2 5 Chapitre III Activités biologiques des composés phénoliques et huiles essentielles III.1.Introduction ………………………………………………………………. .. 27 III.2.Activités antioxydantes ………………………………… ………………. . 28 III.2.1.Le stress oxydant ………………………………… …………… …… 28 III.2.2.Oxydants et antioxydant………………………………………… ………… .. 29 III .2 .2.1. Les antioxydants enzymatiques………………………………………………. 30 III .2 .2.2. Les antioxydants non enzymatiques………………………………………… 30 III .2 .3.Mode d’action des antioxydants……………………………………………….. 31 III .2 .3.1. Inhibition enzymatique………………………………………………………. 31 III .2 .3.2. Chélation des ions métalliques……………………………………………….. 32 III .2 .3.3. Piégeage des radicaux libres…………………………………………………. 32 III .2 .4. Les Maladies humaines liée au stresse oxydant……………………………….. 33 III .2 .5.Evaluation in vitro de l’activité antioxydante …………………………………. 3 5 III .2 .5.1.Le test de piégeage de radical DPPH• ………………………………… 3 5 III .2 .5.2. Le test de la réduction de fer (FRAP) ………………………………… 3 5 III .2 .5.3.Le test d’inhibition de blanchiment du β-caroténe ……...... 36 III .2 .5.4.Le test à l'acide thiobarbiturique (TBA)…………………………………… .. 36 III .2 .6. L’activité antioxydante des composés phénoliques et huiles essentielles……… 36 III.3. Activité antibactériennes…………………………………………………………... 37 III.3. 1. Les plantes, source naturelle d’antimicrobiens …………...... 37 III.3. 2. Spectre d’action des antibactériens naturelles…………………………………... 38 III .3 .3. L’activité antimicrobienne des composés phénoliques et huiles essentielles…. 39

2éme Partie Matériel et Méthodes Introduction ……………………………………………………………………………... 41 IV-1- Matériel végétale …………………………………………………………………. 41 IV.2. Screening phytochimique …………………………...... 42 IV.3. Les procédures d’extraction ……………………………………………………. 42 IV.3. 1. Extraction des huiles essentielles………………...... 42 IV. 3. 2. Préparation des extraits ……………………………………………………… 43 IV.4. Caractérisation des huiles essentielles et des composés phénoliques……………. 44 IV.4. 1. Analyse des huiles essentielles par CPG/SM………………………………….. 44 IV.4. 2. Caractérisation et quantification des composés phénoliques………………… 45 IV.5. Estimation des activités biologiques……………………………………………… 46 IV.5. 1.Les activités antioxydantes ………………………………………………… 46 IV.5. 1.1. Activité de piégeage des radicaux libres DPPH ……………………………. 46 IV.5. 1.2. Réduction de fer FRAP………………………………………………… 48 IV.5. 1. 3. Inhibition de blanchissement de β carotène………………………………... 49 IV.5. 1. 4. Test d’inhibition des substances réactives à l’acide thiobarbiturique TBARS 50 IV.5. 2. L’activité anti-inflammatoire………………………...... 51 IV.5. 2. 1. Culture de cellules(Macrophage)…………………………………………….. 52 IV.5. 2. 2. Détermination de l’oxyde nitrique………………………………………….. 52 IV.5. 3. Activité anti-tumorale……………...... 53 IV.5. 3. 1. Dans les lignées cellulaires tumorales humaines……… …………………… 53 IV.5. 3. 2. Cytotoxcicité des extraits dans les cellules non tumorales…………………... 54 IV.5. 4. Activité antimicrobienne ……………………………………...... 55 IV.5. 4.1. Activité antimicrobienne des extraits……………………………………. 55 IV.5. 4.1.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice(CMI)…………….. 55 IV.5. 4.1.2. Détermination de la concentration minimale bactéricide(CMB) …………... 56 IV.5. 4.2. Activité antibactérienne des huiles essentielles……………………………… 56 IV.5. 4.2. 1. Détermination de l’activité antibactérienne par la méthode de disque de difusion ………………………………………………………………………………….. 56 IV.5. 4.2. 2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice(CMI)……………. 57 IV.6.Analyses statistiques ………………………………...... 58

éme 3 Partie Résultats et Discussion

V.1. Profil chimique, Activités biologiques in vitro des huiles essentielles…………….. 59 V.1. 1.Rendement des huiles essentielles …………………………………………...... 59 V.1. 2.Caractérisation chimique des huiles essentielles par GPC/SM…………………... 60 V.1. 3.Activités antioxydantes des huiles essentielles ……………………………...... 66 V.1. 4. Activités antimicrobiennes des huiles essentielles …………………………….. 68 V.2.Screening phytochimique, profil phénolique et potentiel bioactif in vitro des plantes sahariennes J. phoenicea. L et C. cinerea (Del)………………….……………. 73 V.2.1. Screening phytochimiques ………………………………………………………. 73 V.2.2. Rendement des extraits …………………………………………………………... 74 V.2.3.Caractérisation des composés phénoliques……………………………………….. 76 V.2.4.Activités antioxydantes des extraits ……………………………………………... 87 V.2.5. Activités anti-inflammatoire.…………………………………………………….. 94 V.2.6. Effets Cytotoxiques ……………………………………………………………. 96 V.2.7. Activité antimicrobienne des extraits ……………………………………………. 98 Conclusion générales et perspectives……………………………………………………. 103 Références bibliographiques…………………………………………………………….. 108

Annexes 128

Liste des tableaux :

Tableau 1 : Principales classes des composés phénoliques………………………………. 13 Tableau 2 : Principales sous-groupe des Flavonoïdes au sens strict……………………… 17 Tableau 3 : Principales sous-groupe des Flavonoïdes au sens large……………………… 18 Tableau 4: Principales substances antioxydantes 31 Tableau 5 : Composition Chimique des huiles essentielles de J phoenicea L et de Cotula cinerea (Del).……………………………………………………………………………. 61 Tableau 6 : Variations de la teneur (en %) de l’α-pinène et du total identifié de l’H.E de J.phoenicea de différents pays……………………………………………………………. 65 Tableau 7 : Activités antibactériennes (DD (mm) et CMI (mg / mL)) des huiles essentielles de J. Phoenicea et C. cinerea…………………………………………………….. 69 Tableau 8 : Caractéristiques phytochimiques des plantes……………………………… 73 Tableau 9 : Temps de rétention (Rt), longueurs d'onde d'absorption maximale dans le visible (max), données de spectre de masse, identification et quantification des composés phénoliques dans Juniperus phoenicae L.( moyenne ± SD)…………………. 80 Tableau 10 : Temps de rétention (Rt), longueurs d'onde d'absorption maximale dans le visible (max), données de spectre de masse, identification et quantification des composés phénoliques dans Cotula cinerea (Del.) (moyenne ± SD)…………………….. 81 Tableau 11 : Activité antioxydante de J. Phoenica et de C. ceneiria (moyenne ± écart- type)……………………………………………………………………………………… 88 Tableau 12 : Capacité d'inhibition de la formation de NO de J. Phoenicea et de C. ceneirea (moyenne ± écart-type)………………………………………………………… 94 Tableau 13 : Propriétés cytotoxiques des extraits de J.phoenicea et de C. ceneirea dans des lignées cellulaires tumorales humaines et des cellules primaires hépatiques non tumorales (moyenne ± écart-type)……………………………………………………….. 97 Tableau 14 : Activités antibactérienne et antifongique de J. phoenicea et C. cinerea (valeurs MIC, MBC et MFC, mg/ml)…………………………………………………….. 99 Liste des figures :

Figure 1 : Quelques exemples de phénols…………………...……………………… 14 Figure 2 : Pricipaux acides hydroxybenzoiques et hydroxycinnamiques………….. 15 Figure 3 : Structure de base des Phénylpropanoïdes………………………………. 15 Figure 4 : Structure de base des flavonoïdes……………………………………….. 16 Figure 5: Structure des sous-classes de flavonoïdes principales……………………. 16 Figure 6 : Structure de trans-resveratol……………………………………………... 18 Figure 7: Structure de base des xanthones………………………………………….. 19 Figure 8 : Structures de base d’emodols et d’anthraquinones……………………… 19 Figure 9 : Structure d’un tannin hydrolysable et des tannins condensés…………… 20 Figure 10: Structure d’Isopréne…………………………………………………….. 21 Figure 11: Représentation schématique du principe de quelque procédé d’extractions………………………………………………………………………… 21 Figure 12 : Les classes des constituants des huiles essentielles…………………….. 22 Figure 13 : Effets bénéfiques des polyphénols végétaux sur la santé………………. 27 Figure 14 : La balance d’équilibre entre les systèmes pro et antioxydants…………. 30 Figure 15 : Conséquences pathogènes du stress oxydant…………………………… 34 Figure 16’ : les zones de récolte de plantes étudiée…………………………………… 42 Figure 16 : Forme réduite du radical DPPH………………………………………… 47 Figure 17: Structure du β-carotène………………………………………………….. 49 Figure 18: Rendement en huiles essentielles des deux plantes étudiées……………. 60 Figure 19: Chromatogramme de l’analyse par CPG/SM de l’huile essentiel de J.phoenicea L………………………………………………………………………... 63 Figure 20 : Chromatogramme de l’analyse par CPG/SM de l’huile essentiel de C.cinerea (Del)……………………………………………………………………… 63 Figure 21 : Pourcentage des différentes classes chimiques de l’huile essentielle de C.cinerea…………………………………………………………………………….. 64 Figure 22 : Pourcentage des différentes classes chimiques de l’huile essentielle de J.phoenicea…………………………………………………………………………………… 64 Figure 23: Valeurs des IC50 du test de piégeage des radicaux libres DPPH des deux huiles essentielles…………………………………………………………………. 67 Figure 24: Rendements des extraits (infusion, hydroéthanolique) des deux plantes étudiées………………………………………………………………………………. 75 Figure 25: Quantification des composées phénoliques dosées par HPLC/SM dans l’extrait hydroéthanolique et l’infusion des deux plantes étudiées………………….. 77 Figure 26 : Profil phénolique de l'extrait hydroéthanolique de C. cinerea enregistré à 370 nm……………………………………………………………………………... 82 Figure 27: Profil phénolique de l’infusion de C. cinerea enregistré à 370 nm……… 83

Figure 28 : Profil phénolique de l'extrait hydroéthanolique de J. phoenicea enregistré à 370 nm………………………………………………………………….. 84 Figure 29 : Valeurs de EC50 des extraits (hydroethanoliques, Infusions) et du Trolox par la méthode de piégeage des radicaux libres DPPH des plantes étudiées... 89 Figure 30 : Valeurs de l’activité antiradicalaire (1/EC50) des extraits (hydroéthanoliques, Infusions) des plantes étudiées et du standard (Trolox)……….. 89

Figure 31 : Valeurs de EC50 des extraits hydroethanoliques et Infusions et du Trolox par la méthode de réduction de fer FRAP des plantes étudiées…………….. 91 Figure 32 : Valeurs d’EC50 des extraits hydroethanolique, d’infusions et du Trolox par la méthode de β caroténe des plantes étudiées…………………………………... 92 Figure 33 : Valeurs d’EC50 des extraits hydroéthanolique, de l’infusion et du Trolox par la méthode TBARS des plantes étudiées………………………………... 93 Figure 34 : Pourcentages d’inhibition du radicale libre DPPH pour l’huile essentielle de Juniperus phoenicea L………………………………………………... 132 Figure 35: Pourcentages d’inhibition du radicale libre DPPH pour l’huile essentielle de Cotula cinerea (Del)………………………………………………….. 133

Listes des photos

Photo1: Juniperus phoenicea L……………………………………………………..……..5. Photo 2: Rameaux de Juniperus phoenicea L…………………………………..……...... 6. Photo3: Cotula cinerea(Del)………………………………………………………....….....9. Photo 4: les zones de récolte de plantes étudiée (à gauche Arbaouat: El Bayedh, à droite Abadla: Béchar)……………………………………………………………………….…..42. Photo 5 : (a) Extraction des huiles essentielles par hydro-distillation. (b) Les huiles obtenues ………………………………………………………………………………….43. Photo 6: Préparation des extraits à partir des plantes étudiés…………………………....44. Photo 7: Réduction du radical DPPH (de coleur violette) au diphényl picryl-hydrazine de couleur jaune)……………………………………………………………………….…46. Photo 8: Réduction du fer ferrique en fer ferreux………………………………….……..48. Photo 9: La réaction de malondialdéhyde (MDA) avec l'acide thiobarbiturique. (Coloration rose)…………………………………………………………………………50.

Liste des Abréviations :

AAR: L'activité antiradicalaire.

AFNOR: Association française de normalisation

AH: substrat.

AMP cyclique : Adénosine monophosphate cyclique.

ANOVA: Analyse de variance à un facteur.

ATP : Adénosine triphosphate.

BHA: Butylhydroxyanisole.

BHT: Butylhydroxytoluène.

CAT : Catalase.

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute.

CMB: Concentration bactéricide minimale.

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.

CO₂: Dioxyde de carbone.

CPG/SM: Chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse.

DAD : Détecteur a barrette de diodes.

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium.

DSMZ : Collection allemande de micro-organismes et Cultures cellulaires.

EAA : Equivalent d’acide ascorbique.

EC50 (IC50) : concentration inhibitrice à 50 %.

ERO : Espèces réactives de l’oxygène.

ESI: Electrospray.

FBS: sérum bovins fœtaux.

GPx : la glutathion peroxydase.

HE: Huile essentielle.

HeLa : Carcinome Cervical. HepG2 : Carcinome hépatocellulaire.

HPLC-DAD-ESI/MS: chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la détection par réseau de diodes et au spectromètre de masse à ionisation par électrospray.

FRAP : Le pouvoir réducteur de fer.

NT: chlorure de p-iodonitrotetrazolium.

LPS : les lipopolysaccharides.

MCF-7 : cellule d’adénocarcinome du sein.

MDA: le malondialdéhyde.

MRSA : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline.

MSSA : Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline.

NADH : Le nicotinamide adénine dinucléotid .

NADPH: Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate.

NCI-H460 : cellule de cancer du poumon non à petites cellules.

NED: sulphanilamide, N-(1-naphtyl) éthylènediamine chlorhydrate.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

PLP2: cellules de foie de porc.

RMN: La résonnance magnétique nucléaire.

RSA: Activité de piégeage des radicaux.

RPMI-1640: Le Roswell Park Memorial Institute medium.

SD: valeurs moyennes ± écarts types.

SOD: Superoxyde Dismutase.

SRB: Sulforhodamine B.

TBA: Acide ThioBarbiturique.

TBARS: les substances réactives à l'acide thiobarbiturique.

Tris: Trishydroxyméthylaminométhane.

Trolox: L'acide 3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-2H-1-benzopyran-2- carboxylique.

Résumé

Le présent travail est consacré d’une part, à l’étude de la composition chimique, des activités antimicrobienne et antioxydante des huiles essentielles de deux plantes sahariennes Juniperus phoenicea L. et Cotula cinerea (Del) de sud-ouest Algérien et, d’autre part à l'évaluation des propriétés bioactives à savoir les activités antioxydantes, anti-inflammatoires, cytotoxiques et antibactériennes ainsi que leur corrélation avec les composés phénoliques individuels identifiés dans les extrais (infusions, extraits hydroéthanoliques) des ces plantes. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) des huiles obtenues par hydrodistillation révèle la dominance de l'α-pinène (46,437%) pour J. phoenicea L et l'α-thujone (32,35%) pour C. cinerea (Del). L'activité antioxydante évaluée par le test DPPH a montré une capacité bonne à modérée (IC50 = 0,76 et 28 mg / ml) pour les huiles J phoenicea L. et C.cinerea (Del) respectivement. Par ailleurs, les résultats de l’activité antimicrobrienne suggèrent que les souches Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans avec une CMI allant de 0,04 à 0,63 mg / mL sont les souches les plus sensibles à l’huile de J phoenicea L, alors que la meilleure activité de l'huile de C. cinerea recensée était contre Bacillus subtilis avec une CMI égale à 0,303 mg/ mL. La chromatographie liquide à haute performance (HPLC-DAD-ESI / SM) a permis d’identifier un total de treize et neuf composés phénoliques individuels dans les extraits de J.phoenicea et C.cinerea respectivement. En effet, l'acide p-coumaroylquinique, la quercétine-O- pentoside et la myricétine-O-pentoside sont les principaux composés présents dans J .phoenicea et, C.cinerea a présenté comme molécules principales la lutéoline-7-O-glucoside, la lutéoline-O- malonylhexoside et l'acide 5-O-caffeoylquinique. En général, tous les échantillons ont présenté une activité antioxydante intéressante par rapport au Trolox, avec la capacité antioxydante la plus élevée observée chez J. Phoenicea. En outre, la cytotoxicité est évaluée en utilisant quatre lignées cellulaires tumorales humaines: HeLa (cancer du col utérin), NCI-H460 (carcinome pulmonaire non petit), MCF-7 (adénocarcinome du sein), HepG2 (carcinome hépatocellulaire) et montre une activité marquée pour tous les échantillons et sans toxicité pour les cellules hépatiques, notamment pour les extraits de J phoenicea L (IG50 allant de 9 à 51 μg / mL). L’activité antimicrobrienne in vitro des extraits des deux plantes donne une activité modérée, avec une sensibilité totale aux souches gram positives par rapport au gram négatif, leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) se situaient entre 5 et 20 mg/mL. Les souches Gram négatif testée apparaissant une résistance vers l’extrait hydroethanolique de C. cinerea. Sa meilleure activité d'inhibition de la croissance est remarquée contre le SARM (Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline) et le SASM (Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline) avec des valeurs de MIC comprises entre 5 et 10 mg/mL. La présence contemporaine de bioactivités suggère que J. phoenicea L. et C cinerea (Del) peuvent être une source de tels nouveaux conservateurs dans les industries alimentaires et pharmaceutiques.

Mot-clés: J. phoenicea L, C cinerea (Del), activités biologiques, composés phénoliques, huiles essentielles, HPLC-DAD-ESI / MS, CPG/SM. الملخص:

كأرس هذا العمل من جهة لدراسة التركأيب الكيميائي ، النشاطات المضييادة للميكروبييات و المضيادة للكأسييدة للزيييتين العطريييين المستخلصين من النبتتين الصحراويتين Juniperus Phoenicea L و (Cotula Cinerea(Del للناحية الجنوبية الغربية للجزائر. و من جهة أخرى، تقدير الخصائص البيولوجية مثل : النشاط المضاد للكأسدة ،المضاد لللتهاب ، المضيياد للسييرطان و المضاد للبكتيريا ، فضل عن ارتباطهما مع المركأبات الفينولية الفردية المحددة في المستخلصات (المنقوع المائي ، مستخلص اليثانول المائي ) لهاتين النبتتين . كأشييف الفصييل الكروميياتوغرافي الغييازي و مطييياف الكتليية (GC/SM) للزيييتيين المقطرييين عيين هيمنيية (%46.437) Pinène – α في Juniperus Phoenicea L و (α Thujone - (32.35% بالنسبة ل Cotula Cinerea .أظهر

النشاط المضاد للكأسدة الذي تم اختباره بطريقة تثبيط الجدر الحر DPPH على القدرة الجيدة إلى معتدلة مع (IC50 = 0.76 و 0.28 ملغ/ملل ) لزيتي Juniperus Phoenica L و Cotula Cinerea على التوالي .من ناحية أخرى ، تشير نتائج النشيياط المضيياد للبكتيريييا إلييى أن سييللت البكتيريييا Bacillus Cereus ,Bacillus Subtilis , Pseudomonas Aeruginosa , Micrococcus Luteus و Candida Albicans مع MIC تتراوح م ن 0.04 إلييى 0.63 ملييغ/ملييل ،كأييانت الكأييثر حساسييية لزيييت Juniperus Phoenica L ، ف ي حي ن س جل أفض ل نش اط للزي ت المح دد Cotula Cinerea ضد Bacillus Subtilis مع MIC تساوي 0.303 ملغ/ملل. سييمح الفصييل الكروميياتوغرافي السييائل عييالي الداء (MS/HPLC-DAD-ESI) لتحديييد مييا مجمييوعه ثالثايية عشيير و تسييع مركأبات فينولية فردية في مستخلصات Juniperus Phoenica L و (Cotula Cinerea(Del على التوالي .ف ي الواق ع L’acide -P-Coumaroyliquinique ،0-Pentoside La Quercétine - هي المركأبات الرئيسية الموج ودة ف ي Juniperus Phoenicea L .في حين تقدم Cotula Cinerea: La Lutéoline7-0-Glucoide ، Lutéoline-0- Malonylhexoside ، L’acide 5-0-Caffeoyliquininque كأجزيئات رئيسية . بشكل عام أظهرت جميع العينات نشاط مضاد للكأسيدة ميثير للهتميام مقارنية ميع Trolox،م ع أعل ى ق درة مض ادة للكأس دة لوحظت عند Juniperus Phoenicea L بالضافة إلى ذلك ،يتم تقييم النشاط المضاد للسرطان ضد أربع أنواع م ن الخلي ا السرطانية البشرية HELA (سرطان عنق الرح م ) ، NCI-H460 (س رطان الرئ ة غي ر الص غير ) ، MCF-7 (س رطان الثدي ) ، (سرطان الكبد ) Hepg2 ، و الذي أظهر نشاط ملحوظ لجميع العينات دون سمية لخليا الكبد ، ول سيما لمستخلص ي

Juniperus Phoenicea L مع ( IG50 تتراوح بين 9 الى 51 ميكروغرام /ملل ) . أعطى النشاط المضاد للبكتيرييا فيي المختيبر لمستخلصيات النبتيتين ، نشياطا معتييدل ميع حساسيية تامية للسيللت ذات الجيرام الموجب مقارنة بالسالبة الجرام ، و كأانت تراكأيزها المثبطة الدنيا (CMI ) تقع بين 5 و 20 ملغ/ملل . أظهر المستخلص المائي الثاانولي لنبتة Cotula Cinerea المقاومة لجميع سللت الجرام السالبة التي تم اختبارها .وكأ ان أفض ل تث بيط للنم و ض د ( Staphylococcus Aureus المقاومة للميثيسيلين ) مع قيم MIC محصورة بين 5 الى 10 20 ملغ/ملل. يشير الوجود المتزامن لنشاطات حيوية بيولوجية إلى أن Juniperus Phoenicea L و Cotula Cinerea.Del) قد يكونان مصدرا لمواد حافظة جديدة تدخل في الصناعات الغذائية و الدوائية.

الكلمات المفتاحية : Cotula Cinerea(Del)، Juniperus Phoenicea L ، النشطة البيولوجية ، المركأبات الفينولية ، الزيوت العطرية CPG/SM ، HPLC-DAD-ESI /SM . Abstract

This work is devoted on one hand, the chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of essential oils from two saharan plants, Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del) from southwestern Algeria. On the other hand, evaluation of bioactive properties, such as antioxidant, anti-inflammatory, cytotoxic and antibacterial activities, and their correlation with the individual phenolic compounds identified in the extracts (infusions, hydroethanolics) of these plants. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) of hydrodistilled oils reveals the dominance of α-pinene (46.437%) for J. phoenicea L and α-thujone (32.35%) for C. cinerea (Del). While, the antioxidant activity evaluated by the DPPH test, showed a good to moderate capacity (IC50 = 0.76 and 28 mg / ml) for the oils J phoenicea L. and C cinerea (Del) respectively. The results of the antibacterial activity suggest that Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans strains with (MIC range from 0.04 to 0.63 mg / mL) were the most susceptible strains to. J.Phoenicea L. oil. while the best activity of the identified C. cinerea oil acts against Bacillus subtilis with (MIC = 0.303 mg/ m mL). High-performance liquid chromatography (HPLC-DAD-ESI/MS) identified a total of thirteen and nine individual phenolic compounds in J.phoenicea and C.cinerea respectively, being p-coumaroylquinic acid, quercetin-O-pentoside, myricetin-O-pentoside and myricetin-O- hexoside the major compounds present in J.phoenicea. On the other hand, C.cinerea presented luteolin-7-O-glucoside, luteolin-O-malonylhexoside and 5-O-caffeoylquinic acid as the main molecules. Generally, all samples exhibited interesting antioxidant when compared to the standard Trolox, whith the highest antioxidant capability observed in J.phoenicea .In addition, , the cytotoxicity was evaluated using four human tumor cell lines: HeLa (cervical carcinoma), NCI- H460 (non-small lung carcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma), HepG2 (hepatocellular carcinoma), showed good activity for all samples without toxicity for liver cells especially, for J phoenicea L extracts (GI50 values ranging from 9 to 51 µg/mL). In vitro antibacterial activity of the two plant extracts found to give moderated activity, with a total sensitivity towards gram positive strains than gram negative ,their minimal inhibitory concentrations (MICs) ranged from 5 and 20 mg/mL C. cinerea hydroethanol extract appearing resistance compared to all gram negative strains test. The best growth inhibition activity was against MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and MSSA (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus) with MICvalues ranging from 5 to 10 µg/mL. The contemporary presence of bioactivities suggests that J. phoenicea L.and C. cinerea (Del) may be a source for such new preservatives in food and pharmaceutical industries.

Keywords: J. phoenicea L, C.cinerea (Del), biological activities, phenolic compounds, essential oils, HPLC-DAD-ESI / MS, GC/MS.

es plantes sont depuis toujours une source essentielle de médicaments. A L travers les siècles, les traditions humaines ont su développer la connaissance et l'utilisation des plantes médicinales dans le but de vaincre la souffrance et d'améliorer la santé des humains. Ces plantes médicinales sont reconnues pour leurs effets thérapeutiques et leurs caractéristiques biologiques, sous leur forme originale ou semi-synthétique, en raison de leur capacité à produire un grand nombre de métabolites secondaires (Fraga, 2007); parmi eux les terpénoïdes et les composés phénoliques (Halliwel,

2006).

Ces dernières biomolécules sont largement exploitées dans les industries alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques (Taviano, 2013), surtout les flavonoïdes, les acides phénoliques, les lignanes, les tanins et les stilbènes (Bruneton, 1995; Merzouki et al.,

2000;Halliwell, 2000, 2009) qui sont répandus dans différentes parties de la plante comme les feuilles, les tiges et les fleurs (Pacifico et al., 2015).

De nos jours, l’utilisation des plantes médicinales riches en composés phénoliques surtout la famille des polyphénols, suscite de plus en plus d’intérêt causé par leurs propriétés biologiques telles que les activités antioxydante (Halliwell, 2008), anti-inflammatoire (Guo et al., 2014), antibactérienne (Cushnie et Lamb, 2011), antivirale (Ben Sassi et al.,2008), antifongique (Martins et al., 2015), cytotoxique (Soobrattee et al., 2013; Carocho et

Ferreira, 2013a), anti-allergique et antithrombotique. Leur efficacité dépend de leurs structures diverses (Huyan et al., 2016, Farhoosh et al., 2016) et, à cet effet, beaucoup d'attention a été accordée à l'extraction et à l'isolement des polyphénols à partir d’herbes afin de remplacer les conservateurs synthétiques des produits alimentaires et prévenir les systèmes vivants des pathologies issus de dommages peroxydatif (Carocho et al., 2015, Caleja et al.,

2016, Takwa et al., 2018). De même, les huiles essentielles représentent une grande source de divers produits chimiques et, de par leurs propriétés prometteuses antibactérienne

(Derwich et al., 2010; Gulluce et al.,2007), antifongique (Dambolena et al.,2007) ainsi que d’autres propriétés biologiques (Viuda-Martos et al.,2011), les rendent comme meilleure alternative fiable des conservateurs synthétiques. En outre, l'utilisation des huiles essentielles est moins dommageable pour la santé humaine (Lis-Balchin et Deans .1997).

Les composés phénoliques des plantes médicinales sont contribués aux mécanismes de défense anti-oxydative cellulaire (Carocho et Ferreira, 2013b). Ils sont donc des antioxydants puissants avec des propriétés réductrices de piégeage des radicaux libres, d’inhibition des systèmes enzymatiques responsables de la génération de radicaux libres , de chélation des métaux (Han et Baik , 2008; Martins et al., 2016), de la prévention d'oxydation des lipides (Salvador et al., 2011, Carocho et Ferreira, 2013b) et de l’

élimination d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) telles que le superoxyde, le peroxyde d'hydrogène et les radicaux hydroxyle (Kahkonen et al., 1999). Dans ce contexte, plusieurs

études ont associé la consommation de composés phénoliques et plus particulièrement les flavonoïdes, avec la diminution de plusieurs maladies liées au stress oxydatif qui peut être le facteur potentialisant l’apparition de plusieurs pathologies telles que le cancer (Nichenametla et al., 2006 ), le diabète, la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires (Christen Y., 2000; Aviram et al., 2000).

L'Algérie est considérée parmi les pays connus pour leur diversité taxonomique vu sa position biogéographique privilégiée et son étendu entre la mer Méditerranée et l'Afrique sub- saharienne. Le Sahara le plus vaste et le plus chaud des déserts du monde possède dans sa partie nord, le Sahara septentrional renfermant une flore spontanée potentiellement riche et dont beaucoup d'espèces endémiques sont présentes. De cette flore, nous avons choisi les deux plantes endémiques sahariennes Juniperus phoenicea L. et Cotula cinerea (Del), récoltées dans le sud-ouest de l'Algérie et connues pour avoir des propriétés biologiques.

C’est dans le cadre de la valorisation de notre patrimoine naturel que le présent travail

2 s’inscrit sur la caractérisation des composés phénoliques et des huiles essentielles des plantes choisies. Les activités biologiques, en l’occurrence l’activité antioxydante, cytotoxique, anti- inflammatoire et antibactérienne sont également étudiées.

Le plan de notre travail est structuré comme suit:

➢ Une introduction générale dans laquelle la problématique est posée.

➢ La première partie aborde une étude bibliographique concernant les plantes

médicinales en général et étudiées en particulier, les composés phénoliques et les

huiles essentielles ainsi que leurs activités biologiques (antioxydante, antitumorale,

anti-inflammatoire et antimicrobienne).

➢ La seconde partie est réservée à l’étude expérimentale où le matériel utilisé est cité et

les méthodes opératoires son décrites.

➢ Dans la troisième partie, tous les résultats expérimentaux obtenus sont présentés et

discutés.

Enfin, une conclusion générale vient achever ce travail renfermant également des perspectives dans le futur.

1ére partie Synthèse Bibliographique

Chapitre I. Les Plantes Aromatiques Médicinales

I.1.Introduction

L’histoire des plantes aromatiques médicinales est associée à l’évolution des civilisations.

Dans toutes les régions du monde, l’histoire des peuples montre que ces plantes ont toujours occupé une place importante en médecine .On appelle plante médicinale toute plante renfermant un ou plusieurs principes actifs capables de prévenir, soulager ou guérir des maladies

(Schauenberg et Paris, 2006).

Les plantes aromatiques sont utilisées comme tous les végétaux en médecine, en parfumerie, en cosmétique et pour l’aromatisation culinaire. Elles font partie de notre quotidien sans que nous ne le sachions. Il reste difficile de définir les molécules responsables de l’action, bien que certains effets pharmacologiques prouvés sur l'animal aient été attribués à des composés tels que les alcaloïdes des terpènes, stéroïdes et des composés polyphénoliques.

Aujourd’hui il a été estimé que les principes actifs provenant des végétaux représentent

25% des médicaments prescrits soit un total de 120 composés d’origine naturelle provenant de

90 plantes différentes (Potterat et Hostettmann, 1995).

I.2. Présentation des plantes étudiées

Le Sahara est un vaste écosystème, caractérisé par des conditions climatiques très rudes, peuplé par des animaux et des végétaux bien adaptés à ce contexte dans des différentes zones géomorphologiques. Les ressources végétales spontanées du Sahara constituent une flore plus ou moins faible, adaptées et utilisées par les populations locales pour différentes utilisations médicinales, écologiques, etc. (Slimani et al., 2015) De cette flore, nous avons étudié les deux plantes qui suivent.

I.2.1. Juniperus phoenicea L.

La famille des Cupressacées comprend 135 espèces appartenant à 29 genres, parmi lesquels le genre Juniperus avec environ 70 espèces et 37 variétés réparties en trois sections à savoir, Caryocedrus, Sabina et Juniperus (Akkol et al.,009). 4

1ére partie Synthèse Bibliographique

Le nom «Juniperus» provient du mot celtique «juneprus» qui signifie âpre à cause de la saveur des fruits (Garnier et al., 1961; Bonnier, 1990), ou encore dejunio et pario car l’arbre posséde à la fois des fruits jeunes et des fruits mûrs (près de tomber) (Garnier et al., 1961).

Juniperus phoenicea L. est un petit arbre qui pousse spontanément autour du bassin méditerranéen côté Portugal vers la Palestine, en Afrique du Nord (Algérie et Maroc) et dans les

îles Canaries et l'île de Madère (Quézel et Médail, 2003; Adams R P, 2001; Nakanishi et al.,

2004; Seca et Silva, 2006). Seul J. phoenicea var. turbinata, communément appelé arar, pousse spontanément en Algérie, près de la côte et dans les zones montagneuses (Adams et Pandey,

2003; Quézel et Médail, 2003) .

I.2.1. 1.Classification botanique

Embranchement: Spermaphytes

Sous- Embranchement: Gymnospermes

Classe: Conifères

Ordre: Coniférales

Famille : Cupressacées

Genre: Juniperus Photo1: Juniperus phoenicea L. (Mai 2015)

Espèce: Juniperusphoenicea L. (Quezel et Santa, 1962).

Noms vernaculaires:

. )العر عار األحمر( En Arabe : Arar

En Français: Genévrier rouge, Genévrier de Phénicie.

En Anglais: Phoenician Cedar, Berry Bearing Cedar.

En Allemand: CypressenWacholder, RotbeerigerWacholder, GrichiseherWacholder.

En Italien: Cedrolicio (Bonnier, 1990).

1ére partie Synthèse Bibliographique

I.2.1. 2.Description botanique

C'est un arbrisseau de 1 à 8 mètres de hauteur, ramifié dès la base, à houppier dense et allongé.

L'écorce est brun- rouge, fibreuse et assez épaisse. Les feuilles persistantes opposées (rarement verticillées par trois) sont de deux sortes:

➢ Des feuilles en aiguilles (10mm), piquantes avec deux lignes blanches dessus et dessous

et qui se trouvent uniquement sur les individus très jeunes.

➢ Des feuilles en écailles, petites (1mm), ovales et bombées sur le dos, étroitement

appliquées sur les rameaux et bordées d'une marge d'aspect cartilagineux.

Les fruits (automne de la deuxième année) sont globuleux, assez gros (8 à 10 mm), noirâtres quand ils sont jeunes, puis verts et enfin rouges sombres et luisants à maturité; ils renferment 7 à

9 graines (Becker et al., 1982) (Photo 2).

Photo 2: Rameaux de Juniperus phoenicea L.

I.2.1.3. Composition, activités biologiques et utilisations médicinales

J.phoenicea L. est considérée comme une plante médicinale importante utilisée dans la médecine populaire dans le monde entier et l’Algérie en particulier en tant que diurétique, tonique stimulant et stomachique (Agnese et al., 2001; Tikkanen et al., 1998). La décoction de

1ére partie Synthèse Bibliographique ses feuilles est utilisée pour traiter la diarrhée, les rhumatismes, les troubles bronchiques, le diabéte et l'obésité (Allali et al., 2008, Keskes et al., 2014). Il est également préconisé dans le traitement de l'hépatotoxicité et de la néphrotoxicité (Ali, 2010). Le mélange des feuilles et des cônes est utilisé comme hypoglycémiant oral (Bellakhder, 1997), alors que les fruits sont connus pour guérir les ulcérations de la peau et les abcès (Le FIoc’h E, 1983).

De nombreuses études ont mis en évidence les bioactivités des extraits hydroalcooliques d'espèces de juniperus en particulier antioxydante (Chaouche et al., 2015; El Jemli et al.,

2016), anti-inflammatoire (Lesjak et al., 2014), anticancéreuse (Darvishi et al., 2016; Huyan et al., 2016), antiseptique (Taviano et al., 2013), antivirale (Sassi et al., 2008; Hammami et al.,

2009) antimicrobienne (Alzanda et al., 2014; Soltani et Hosseyni Moghaddam, 2015), analgésique (Akkol et al., 2009) et antidiabétique (Orhan et al., 2012).

Des études phytochimiques ont révélé que J. phoenicea renferme une grande variété de composés, principalement diterpénoïdes (Barrero et al., 2004), biflavonoïdes (Lamer

Zarawska, 1975; Fatma w et al., 1979), lignanes (San Feliciano et al, 1992; Hussein, Merfor et Nawwar, 2003), phényl-propanoïdes glucosides (Hussein et al., 2003), glucosides de furanone, des dérivés de bis-furanone (Comte, G.et al., 1996a.; Comte et al., 1996b) ainsi que des glucosides de monorterpène et de sesquiterpène (Champavier et al., 1999).

Les extraits bruts des feuilles de J phoenicea L. de l’Egypte (extrait de pétrole, chloroforme, acétate d'éthyle et méthanol) ont montré une activité antiproliférative efficace contre les carcinomes pulmonaires (H460), tumoraux hépatiques (HEPG2) et carcinomes mammaires (MCF7) (Maamoun et al., 2016). Selon Laouar et al.(2017), les extraits aqueux et méthanolique de J. phoenicea de l’Algérie possède une activité hépatoprotectrice contre les lésions hépatiques induites par CCL4 chez le rat.

Les composés phénoliques sont les principaux composés décrits des Juniperus. En effet,

(Innocenti, et al., 2007; Loizzo et al., 2007; Miceli et al., 2009; Orav, Kailas et Müürisepp,

2010; Miceli et al., 2011; Taviano et al., 2013). Boulanouar et al. (2013) ont signalé la 7

1ére partie Synthèse Bibliographique présence d'acides phénoliques et des flavonoïdes dans les extraits hydroalcooliques de la partie aérienne de J. phoenicea L. et, la biflavone et l'agathisflavone sont isolées à partir des feuilles d’extraits hydroalcooliques de J.phoenicea.L croissant en Egypte (Maamoun et al., 2016). Par ailleurs, Alqasoumi et al., (2013) ont isolé quatre dérivés de flavonoïdes (la cupressuflavone, l'hinokiflavone, l'hypolaétine-7-O-β-xylopyranoside et la catéchine) à partir d’extrait d'éthanol et de ses fractions: éther de pétrole, chloroforme et méthanol des parties aériennes de J. phoenicea.L provenant de l’Arabie Saoudite.

La composition de l'huile des feuilles et des baies de J. phoenicea a été largement étudiée sur des plantes cultivées dans le bassin méditerranéen septentrional (Adams et al., 1996;

Cavaleiro et al., 2001). Au Maroc (Barrero et al., 2004; Derwich, Benziane et Boukir, 2010;

Mansouri et al., 2011; Ait-Ouazzou et al., 2012; Achak et al., 2009), en Egypte (El-Sawi,

Motawae et Ali, 2007), en Tunisie (Ennajar et al., 2009), en Libye (Alfitori, Lamlom et Aly,

2014) et en Algérie (Ramdani et al., 2013; Mazari et al., 2010; Bekhechi et al., 2012) tous les

échantillons d'huile des feuilles étudiées ont été caractérisés par l'apparition de monoterpènes en tant que composants majeurs ; l'α-pinène étant dans presque tous les cas signalés comme composant majeure, bien que son contenu varie considérablement d'un échantillon à l'autre.

Les huiles essentielles des feuilles et des baies des espèces de Juniperus sont utilisées en cosmétique et également à des fins médicinales pendant plusieurs siècles. Ces huiles sont appliquées pour le traitement de nombreuses maladies telles que, la lèpre et la typhoïde.

I.2.2.Cotula cinerea (Del)

Cotula cinerea (Del) [Syn. Brocchia cinerea (Del)] appartenant à la famille Asteraceae, est une plante xérophyte largement répandue dans les sols sablonneux et désertiques (Markouk et al., 1999a). Elle représente une des trois espèces du genre Cotula en Algérie (Maiza et al.,1993; Dendougui et al., 2012). C'est une plante spontanée qui pousse dans les régions sahariennes notamment à Béchar et Oued Souf (Ozenda, 1977; Quézel et Santa, 1963). Elle est connue localement sous le nom de Gartoufa, Shiha, Shihia, Shih el Ibel (Halis, 2007). Le nom 8

1ére partie Synthèse Bibliographique

Cotula provient du grecque kotule « petite tasse », se référant à la zone creuse à la base des feuilles et cinerea qui signifie cendres colorées.

I.2.2.1.Classification botanique: (Quezel et Santa, 1963; Dupont et Guignard, 2007):

Embranchement : Phanérogames ou

Spermaphytes.

Sous-embranchement : Angiospermes.

Classe : Eudicots

Sous classe : Astéridées.

Ordre : Astérales. Photo3: Cotula cinerea(Del) (Mai 2015)

Famille : Astéracées ou Composées.

Genre: Cotula.

Espèce : Cotula cinerea (Del), syn. Brocchia cinerea. Del Vis.

Noms vernaculaires :

(gartoufa, robita, chiriya, chouihiya.(Quezel et Santa 1963القرطوفة () :En Arabe

En Turque: takkélt

En Anglais: Saharancamomile

En Français : camomille du Sahara.

I.2.2.2.Description botanique

C’est une petite plante annuelle herbacée (Bensizerara et al., 2012) d’aspect laineux de 5

à 15 cm entièrement tomenteuse. Les tiges sont couchées puis dressées ou diffusées et nombreuses sont en touffes. Les feuilles et les tiges vert-blanchâtres sont recouvertes de petits poils denses qui forment comme un manteau de velours. Les feuilles petites, entières, épaisses et veloutées sont découpées en trois à sept dents ou 'doigts' qui se présentent comme une main légèrement refermée. Les fleurs de petits demi-pompons jaune or en tubes; à chaine surmontée d’une écaille membraneuse et longue est rejetée sur un côté ayant l’aspect d’une ligule. C’est une

1ére partie Synthèse Bibliographique espèce saharo-arabique commune dans tout le Sahara et les lieux sablonneux désertiques

(Quezel et Santa 1963).

I.2.2.3. Composition, activités biologiques et utilisations médicinales

Cotula cinerea est parmi les plantes médicinales les plus utilisées par la population locale en raison de ses propriétés thérapeutiques. En effet, elle est couramment utilisée dans la médecine populaire algérienne ainsi que dans le reste du Maghreb, comme décoction pour traiter les troubles digestifs, la polyarthrite rhumatoïde, les infections urinaires et pulmonaires, la fièvre, les maux de tête, les migraines, l'inflammation de la toux et des articulations (El Rhaffari et

Zaid, 2002 ; Abdoun et al., 2002). Elle est très appréciée dans le thé vert ou mélangée avec de la nourriture pour en améliorer la saveur (Maiza et al., 1993; Markouk et al., 1999a, 1999b;

Larhsini et al., 2002; Hammiche et Maiza, 2006). Cette espèce a été décrite comme ayant des propriétés antioxydante, anti-inflammatoire, analgésique, antipyrétique et antimicrobiennes

(Markouk et al., 1999a et 1999b ; Bensizerara et al., 2013 ; Belyagoubi-Benhammou et al.,

2014).

La plante Cotula cinerea contient de nombreux composés actifs tels que les flavonoïdes

(Dendougui et al., 2012), les huiles essentielles et les terpènes qui lui donnent une odeur puissante et spécifique (Markouk et al., 1999a ; 1999b). Aussi, des sesquiterpènes lactones, des coumarines sesquiterpéniques, des tanins et des flavonoïdes ont été isolés de C. cinerea (Ahmed et al., 1987; Markouk et al., 1999). Les extraits des feuilles de la Cotula cinerea (Del) sont efficaces contre les champignons microscopiques pathogènes et possèdent également une activité insecticide sur les larves d'insectes (Bouziane, 2002).

Divers composés isolés à partir des extraits de méthanols de C cinerea d’Egypte et du

Maroc, renferment des acides phénoliques (acide néochlorogénique, acide chlorogénique, acide cryptochlorogénique, acide 3,4-dicaféoylquinique) et des flavonoïdes (lutéoline-4'-O-glucoside, lutéoline-7-O-β-D-glucoside, lutéoline- 6-hydroxy-7-O-β-D-glucoside, apigénine-7-O-α- rhamnoside, apigénine-6-C-arabinosyl-8-C-glucoside, isoschaftoside, quercétine-3-O-β-D- 10

1ére partie Synthèse Bibliographique glucoside et 5,3 ', 4'-trihydroxy 3,6,7-triméthoxyflavone) (Ahmed AA, 1987.)(Ahmed, 1987 ;

Khallouki et al., 2015).

L’huile essentielle de la C.cinerea (Del) est décrite dans la littérature en raison de ses propriétés biologiques intéressantes. Son étude menée par Bouzidi et al (2011), Kasrati et al

(2015) ont montré la présence de la trans-thujone, de l'acétate de cis-verbényle, du 1,8-cinéole et du camphre comme les principaux constituants des plantes recueillies au Maroc. Tandis que l’analyse de l’huile essentielle de la C.cinerea d’Algérie a révélé la présence du 3-carène, de la thujone, du camphre, du (E)-citral, du limonène, de l’époxyde cis, de l’éther méthylique, du thymol, du carvacrol et du trans-carvéol comme les principaux composés (Atef at al., 2015;

Djellouli et al., 2015) .

1ére partie Synthèse Bibliographique

Chapitre II. Composés phénoliques et huiles essentielles

II.1.Introduction

Aujourd’hui comme jadis, la médecine moderne dépend beaucoup des plantes. Ces derniers sont le siège d’une intense activité métabolique aboutissant à la synthèse des métabolites secondaires particulier qui constitué une source majeur de principes actifs les plus divers

(Kansole, 2009). Les métabolites secondaires sont des molécules organiques très hétérogènes complexes, synthétisées et accumulées en petites quantités par les plantes autotrophes(Lutge,

Kluge et Bauer, 2002; Abderrazak et Joël, 2007). Ils sont distribués différemment dans toutes les parties de plantes selon leurs rôles. Cette distribution varie d’une plante à l’autre. Ils contribuent efficacement dans la défense de plante face à de multiples agressions de l’environnement dans lequel elle vit : prédateurs, microorganismes pathogènes, d’une part, et Ils pourraient jouer un rôle dans les relations entre les plantes et leur environnement d’autre part, d’ou plusieurs composés phénoliques peuvent agissent comme agents protecteurs de la phytoalexine contre la lumière UV et jouent un rôle important dans la croissance et la reproduction des plantes(Ignat et al., 2011). L'intérêt pour les composés phénoliques a augmenté au cours de la dernière décennie en raison de leur activité structurelle et protectrice dans les plantes, mais aussi en raison des effets anti-allergéniques, anti-athérogènes, anti-inflammatoires, antimicrobiens, anti-thrombotiques, cardioprotecteurs et vasodilatateurs qu’ils présentent chez les animaux(Balasundram et al., 2006). L’objectif est de les utiliser dans les aliments et préparations pharmaceutiques pour remplacer des antioxydants synthétiques (BHA, BHT, etc.).

II.2.Composés phénoliques

Avec plus de 8000 structures phénoliques connues, les composés phénoliques constituent l’une des grandes familles de molécules largement répandues dans le règne végétal(Beta et al.,

2005). Ils regroupent un vaste ensemble de substances chimiques caractérisés par la présence d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec un glucide.

Cette désignation concerne a la fois les mono, les di et les polyphénols dont les molécules 12

1ére partie Synthèse Bibliographique contiennent une, deux ou plusieurs fonctions phénoliques respectivement (Macheix, et al.,

2005). Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieurs (racines, tiges, feuilles, fleurs, pollens, fruits, graines et bois) et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme la croissance cellulaire, la rhizogenèse, la germination des graines ou la maturation des fruits (Boizot et Charpentier, 2006).

Ils peuvent être regroupes en plusieurs classes dont la plupart ont des représentants chez de nombreux végétaux (Tableau 1).

Tableau 1 : Principales classes des composés phénoliques (Bruneton, 1999).

Squelette Classe Exemples carboné C6 Phénols simples Cathécol, hydroquinone C6-C1 Acides phénols Ac. gallique, Ac. salysalique, vanilline Benzoiques C6-C2 Acétophénones 3-acétyl6-méthoxybenzaldehyde C6-C3 Acides phénols Ac. coumarique, Ac.caféique Cinnamiques C6-C4 Naphtoquinones Shikonine C6-C1-C6 Xanthones Bellidifoline, mangoctine C6-C2-C6 Stiblènes Hydrangénol,,Pinosylvine

C6-C3-C6 Flavonoïdes Quercétine, Roténoide Isoflavonoïdes

(C6-C3)2 Lignanes Matairésinol (C6-C3-C6)2 Bi flavonoïdes Amentoflavone, Hinokiflavone

(C6-C3-C6)n Tanins condensés Aesculitanins (proanthocyanidols

Les premiers critères de distinction entre ces classes concernent le nombre d'atomes de carbone constitutifs, la structure de base du squelette carboné élaboré par la voie shikimate, le degré de modification de ce squeltte et la possibilité de se lieé avec d’autres molécules de

1ére partie Synthèse Bibliographique métabolites primaires et secondaires. Il existe de nombreuses classes de ces composés : acides phénols, flavonoïdes, coumarines et tanins. Ces structures peuvent également peuvent diversement substituées ( glycosylées, estérifiées, acylées…), ce qui donne une grande variété de structures (Harbone, 1998).

D’un point de vue biosynthèse, les composés phénoliques peuvent être engendrés par deux voies métaboliques : la voie du shikimate, la plus courante, qui conduit entre autre à la formation des acides phénoliques, des flavonoïdes et des lignanes; et la voie des polyacétates qui est à l’origine de composés polycycliques tels que les coumarines, les xanthones et les quinones

(Bruneton, 2009).

II.2.1.Phénols, acides phénols et phénylpropanoїdes

Les phénols sont des molécules aromatiques, possédant un groupe hydroxyle OH fixé sur un carbone d'un cycle benzénique avec une formule générale (Ar-OH).il est rare de trouver les phénols libres ( vanilline, catéchol, pyrogallol, orcinol, phloroglucinol) dans les plantes (figure

1) (Harbone, 1998).

Pyrocatéchol ou catéchol Phloroglucinol Vanillal ou (Vanilline)

Pyrogallol (colorant du brou de noix) Tymol Résorcinol

Figure1. Quelques exemples de phénols.

Les acides phénoliques sont universellement rencontrés chez les plantes surtout alimentaire, ils sont divisés en deux classes : les dérivés de l'acide benzoïque (C6-C1) et les dérivés de l'acide cinnamique (C6-C3) (figure 2) (Bruneton, 2009).

1ére partie Synthèse Bibliographique

Les acides hydroxycinnamiques sont plus fréquents que les acides hydroxybenzoïques et comprennent essentiellement l’acide p-coumarique, caféique, férulique et sinapique (Pandey et Rizvi, 2009).

Les acides hydroxybenzoiques Les acides hydroxycinnamiques R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 Ac.benzoïque H H H H Ac.cinnamique H H H H Ac salcylique OH H H H Ac.o- OH H H H coumarique Ac.p-hydroxy- H H OH H Ac.m- H OH H H benzoïque coumarique Ac.gallique H OH OH OH Ac.p- H H OH H coumarique Ac.syringiquee H OCH3 OH OCH3 Ac. Férulique H H OH OCH3 Ac.gentisique OH H H OH Ac.sinapique H OCH3 OH OCH3 Ac.protocatéchique H OH OH H Ac.caféïque H OH OH H Figure 2. Principaux acides hydroxybenzoiques et hydroxycinnamiques.

Les Phénylpropanoïdes dérivent de l’acide aminé phénylalanine et peuvent contenir un ou plusieurs résidus en C6-C3. Parmi les phénylpropanoides, on trouve (figure 3) : les dérivés directs (phénylpropénes), dérivés par cyclisation (coumarines), les lignanes ((C6-C3)2) et les lignines ((C6-C3)n) (figure 3) (Cseke et al., 2006; Bruneton, 2009).

Coumarine Lignane (imatairesinol)

Figure 3.Structure de base des Phénylpropanoïdes.

II.2.2.Les Flavonoïdes

Les flavonoïdes sont un groupe de dérivés de benzo-g-pyrone. Ils se présentent sous la forme d'aglycones, de glycosides et de dérivés méthylés et sont largement distribués dans le 15

1ére partie Synthèse Bibliographique règne végétal (Škerget et al., 2005). Ils apparaissent généralement sous forme glycosylée se qui les rend moins réactifs et plus solubles dans l’eau. Le glucose est le sucre le plus fréquemment rencontré (Macheix et al., 2005; Bruneton, 2009). Leur structure de base est celle d’un diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C6-C3 -C6), constitué de deux noyaux aromatiques

(ou anneaux) que désignent les lettres A et B, reliés par un hétérocycle oxygénés, qui désigne la lettre C (figure 4) (Dacosta Y, 2003). Dans la plante, ils sont très souvent liés aux sucres, on parle alors d’hétérosides constitués d’une partie phénolique aglycone ou génine associée à un sucre (Macheix et al., 2005; Bruneton J, 2009).

Figure 4. Structure de base des flavonoïdes (Girotti–Chanu, 2006). Les génines sont divisés en trois classe, 2-phénylchromanes (flavan-3-ols, flavan-4-ols, flavane-3,4-diols), les 2-phénylchromones (flavones, flavinols, flavonones et flavononols) et les flavyliums (anthocyanidines, chalcones et aurones) (De Rijke et al., 2006).La présence ou l'absence de substituant sur l'argénine, le degré de polymérisation, le nombre et la position des groupes hydroxyles sont les critères qui diffèrent entre les différentes classes de flavonoïdes

(figure 5) (De Rijke et al., 2006).

Figure 5. Structures des sous-classes de flavonoïdes principales.

1ére partie Synthèse Bibliographique

Les flavonoides au sens strict, sontreprésentées dans le tableau 2, leur structure porte le noyeau aromatique B en position 2 et la distinctions des sous classe se fait suivant la conformation de la structure centrale C (pyrone). Au sens large, il faut inclure aussi les flavanols

(flavan-3-ols), les flavanediols (flavane-3,4-diols ou leucoanthocyanidines) et les anthocyanidols(anthocyanidines) (tableau 3).

Tableau 2 : Principales sous-groupe des Flavonoïdes au sens strict. Les sous-groupe des Flavonoides Les flavonoïdes représentatifs Apigénine Lutéoline Flavones Tricine

Hesperitine Naringenine Flavanones Malvidin

Quercétine Myrcétine Flavonols Morine Kaempférol Isorhamnétine

Butéine Okanine ChaLcones

Sulphorétine Aureusidine Aurones Leptosidine

Hesperitine Naringenine Flavanones

Taxifoline

Flavanonols

1ére partie Synthèse Bibliographique

Tableau 3 : Principales sous-groupe des Flavonoïdes au sens large. Les sous-groupe des Flavonoides Les flavonoïdes représentatifs Epigallocatéchine Catéchine Epicatéchine

Flavanols Pélargonidine la cyanidine

Anthocyanidine Genistein Daidzein

Isoflavonoides

Aujourd’hui plus de 9000 flavonoïdes ont été répertoriés et il en reste des milliers d'autres

à découvrir puisque le squelette des f1avonoïdes peut être substitué par différents groupements comme des groupements hydroxy, méthoxy, méthyl, benzyl et isoprényl (Beecher, 2003;

(Williams et Grayer R.J, 2004; Kueny-Stotz, 2008).

II.2.3.Stilbénes

Les stilbènes contiennent deux groupements phényle reliés par un pont méthylène à deux atomes de carbone avec une structure de base C6-C2-C6. La présence de stilbènes dans l'alimentation humaine est assez faible. La plupart des stilbènes dans les plantes agissent comme phytoalexines antifongiques, composés synthétisés uniquement en réponse à une infection ou une blessure. L'un des polyphénols stilbènes les mieux étudiés est le resvératrol (3,4 ', 5- trihydroxystilbène) (figure 6), que l'on trouve principalement dans le raisin(Pandey et Rizvi,

2009).

Figure 6: Structure de trans-resveratol

1ére partie Synthèse Bibliographique

II.2.4.Xanthones

Les xanthones ont une structure de base C6-C1-C6 (figure 7). Ils sont isolés généralement a partir des plantes supérieures. Parmi les composés représentatifs de cette classe : le gaboxanthove, le xanthéne-9-one et le globuliférine (Bruneton J, 2009).

Figure7: Structure de base des xanthones.

II.2.5.Quinones et Emodols

Les quinones sont des noyaux aromatiques avec deux substitutions cétones. Ce sont des substances colorées et brillantes, en général rouges, jaunes ou oranges et possédant deux fonctions cétones. Elles sont responsables de la réaction de brunissement dans les fruits et végétaux coupés ou lésés. En plus de fournir une source de radicaux libres stables, les quinones sont connues pour se complexer de manière irréversible avec les nucléophiles des acides aminés dans les protéines. Par conséquent, les quinones inactivent les protéines et altèrent leur fonction

(Arif et al., 2009).les emodols sont des dérivés hydroxyanthracéniques (figure 8).

Figure 8: Structure de base d’emodols et d’anthraquinones.

II.2.6.Tanins

Les tanins sont des substances végétales de la famille des polyphénols, le plus souvent hydrosolubles, de structure variées, de saveur astringente et de haut poids moléculaire (Macheix et al., 2005). Ils possèdent la capacité de précipiter les protéines, alcaloïdes et polysaccharides, à partir de leur solution aqueuse (Bruneton , 2009; Ozcan et al., 2014).

1ére partie Synthèse Bibliographique

Ils sont classés en deux groupes selon leur structure chimique (figure 9):

Tanins condensés (proanthocyanidines) : ce sont des polymères de flavanols. Ils sont

constitués d'unités de flavan-3-ols liées entre elles par des liaisons carbone-carbone de

type C4-C8 ou C6-C8, on les appelle également proanthocyanidines, largement présents

dans le règne végétal, et que l’on rencontre dans de nombreux produits alimentaires

(prunes, fraises et pommes ou des boissons ….) (Sarni-Manchado et Cheynier, 2006).

Ils sont non hydrolysables mais qui peuvent être dépolymérisés en anthocyanidols

lorsqu’ils sont traités à chaud par un acide. Ils sont habituellement dénommés d’après

l'anthocyanidol ainsi libéré (Harbone, 1998).

Tanins hydrolysables : Ce sont des polyesters de glucides et d’acides phénols, ils sont

facilement hydrolysables par les acides et les enzymes (tannase) en ose (généralement le

glucose) et en acides phénols. Selon la nature de l’acide phénol qui est soit l’acide

gallique dans le cas des tanins galliques, soit l’acide hexahydroxy di-phénique et ses

dérivés dans le cas des tanins éllagiques (Bruneton, 1999).

Terchebuline R = H: Procyanidine R = OH: Prodelphinidine

Figure 9: Structure d’un tannin hydrolysable et des tannins condensés.

III. Les huiles essentielles

Une huile essentielle peut être un ensemble de molécules pour un chimiste, un arôme pour un parfumeur ou encore la quintessence ou l’esprit d’un végétal pour un l’alchimiste (Moro

Buronzo.A, 2008). En réalité, les huiles essentielles sont l’ensemble de tout cela, car il s’agit d’un mélange complexe pouvant contenir plus de 300 composés des substances huileuses, volatiles et

1ére partie Synthèse Bibliographique odorantes, appartenant à la classe des Isoprénoides (figure 10). Elles sont sécrétées par des plantes aromatiques que l'on extrait par divers procédés dont l’entraînement à la vapeur d’eau et l’hydrodistillation, expression de l’écorce des fruits, extraction par enfleurage, extraction par CO2 liquide ou par extraction avec des solvants (figure 11)(Iserin et al, 2007).

Figure 10: Structure d’Isopréne

l’hydrodistillation Extraction par entrainement à vapeur

Extraction par le CO2 supercritique Extraction par micro-ondes sans solvant

Figure 11: Représentation schématique du principe de quelque procédé d’extractions.

Elles sont produites dans le cytoplasme des cellules sécrétrices et s’accumulent en général dans des cellules glandulaires spécialisées, souvent situées sur ou à proximité de la surface des tissus de plantes et recouvertes d’une cuticule. Ensuite, elles sont stockées dans des cellules dites cellules à huiles essentielles (poils sécréteurs, cellules sécrétrices, poches sécrétrices ou canaux sécréteurs) suivant les familles botaniques (Bruneton, 1999). 21

1ére partie Synthèse Bibliographique

Les constituants des huiles essentielles peuvent être répartis en deux classes en fonction de leur voie de biosynthèse : les terpénoïdes et les phénylpropanoïdes (Buchanan et al., 2000). La classe des terpénoïdes est la plus variée au niveau structural. Les terpénoïdes, dont 25 000 sont connus comme métabolites secondaires, dérivent du précurseur isoprénique à cinq carbones, l’isopenténylpyrophosphate. Les plus petits terpénoïdes sont les hémiterpénoïdes (C5), qui sont formés d’une seule unité isoprénique. Les autres molécules, appartenant à cette classe, résultent de la condensation de plusieurs isoprènes. Ainsi, les monoterpénoïdes (C10) sont constitués de deux unités isoprèniques alors que les sesqui-terpénoïdes (C15) sont formés par l’association de trois isoprènes. Les mono et les sesquiterpénoïdes sont les plus représentés dans les huiles essentielles et rarement les di-terpénoïdes(C20). Les phénylpropanoïdes, ou composés phénoliques, sont biosynthétisés à partir des acides aminés aromatiques que sont la phénylalanine et la tyrosine. Ils sont généralement caractérisés par la présence d’un groupement hydroxyle fixé à un cycle phényle

(figure 12).

Figure 12: Les classes des constituants des huiles essentielles (Lamarti et al., 1994)

1ére partie Synthèse Bibliographique

Les huiles essentielles possèdent en commun un certain nombre de propriétés physiques : elles sont habituellement liquides à température ambiante et volatiles, ce qui les différencie des huiles fixes, odorantes, plus ou moins colorées, leur densité inférieure à celle de l’eau, leur indice de réfraction élevé et la plupart dévient la lumière polarisée, liposolubles et solubles dans les solvants organiques usuels, entraînables à la vapeur d’eau, très peu solubles dans l’eau, composées de molécules à squelette carboné, le nombre d’atomes de carbone étant compris entre

5 et 22 (le plus souvent 10 ou 15) (Afssaps, 2008).

La composition chimique des huiles essentielles confère à ces extraits un rôle écologique lors des interactions végétales et des interactions végétales-animal. Elles interviennent également, par leurs odeurs caractéristiques, dans l’attraction de pollinisateurs , ainsi, la conservation de l’humidité pour les plantes désertiques (Belaiche, 1979).

Les huiles essentielles des plantes ont trouvé leur place en aromathérapie, en pharmacie, en parfumerie, en cosmétique et dans la conservation des aliments. Leur utilisation est liée à leurs larges spectres d’activités biologiques reconnues (Amarti et al., 2010).

II.4. Caractérisation et identification des composés phénoliques et des huiles essentielles

Les produits naturels issus de la biomasse végétale (huiles essentielles, composés phénoliques, extraits, etc.) se présentent généralement sous forme d’un mélange complexe constitué de plusieurs dizaines, voire de plus d’une centaine de composés en proportions variables. Par exemple, les huiles essentielles, obtenues par entraînement à la vapeur d’eau par hydrodistillation renferment des mono-, sesqui- et parfois diterpènes ainsi que des phénylpropanoïdes de structures et de fonctions chimiques très variées.

La caractérisation qualitative et /ou quantitative de ces produits nécessite l’utilisation de plusieurs techniques complémentaires avec un dispositif d’outils analytiques rapides et fiables.

La résonnance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide haute performance

(CLHP) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG), sont celles qui sont les plus utilisées.

1ére partie Synthèse Bibliographique

Le couplage multiple a néanmoins démontré son efficacité. L’isolement et la préparation de nouveau composé avant leur analyse est nécessaire, cela est réaliser par les diverses techniques de séparation (partition acido-basique, distillation fractionnée, cristallisation, extraction sélective par des solvants, chromatographie sur couche mince CCM, CLHP ou CPG préparatrices (Bruneton, 1999).

II.4.1.Chromatographie liquide haute performance

Cette méthode est une forme de chromatographie à colonne qui pompe un mélange d’échantillons ou un analyte peu ou pas volatile, thermolabiles ou polaire dans un solvant (aussi appelé phase mobile) à une pression élevée à travers une colonne avec une garniture chromatographique (phase stationnaire). La HPLC a la possibilité de séparer et d’identifier les composés qui sont présents dans tout échantillon qui peuvent être dissous dans un liquide en concentrations infimes de l’ordre de parties par millier. Cette versatilité permet d’utiliser la

CLHP dans une variété d’applications industrielles et scientifiques comme les produits de la pharmaceutique, l’environnement, la médecine légale et les produits chimiques. Elle demeure la technique la plus souvent utilisée car elle présente de nombreux avantages telles que sa simplicité de mise en œuvre, sa reproductibilité. Le temps de rétention d’échantillon varie selon l’interaction entre la phase stationnaire, les molécules étant analysées et le ou les solvants utilisés. À mesure que l’échantillon passe à travers la colonne, il interagit entre les deux phases à des vitesses différentes, principalement à cause des polarités différentes des analytes. Ceux qui ont le moins d’interactions avec la phase stationnaire ou le plus d’interaction avec la phase mobile sortiront de la colonne plus rapidement.

Un détecteur est nécessaire pour voir les bandes de composé séparées à mesure qu’elles sont éluées de la colonne haute pression. L’information est envoyée du détecteur à un ordinateur qui génère le chromatogramme. La phase mobile sort du détecteur et est envoyée aux déchets ou recueillie, au choix. Les systèmes de détection les plus communément utilisés sont les détections par absorption dans l’ultraviolet visible (UV-Vis), fluorescence, diffusion de lumière (DEDL), 24

1ére partie Synthèse Bibliographique

électrochimie, spectrométrie de masse (MS) et résonnance magnétique nucléaire. Avec le développement des sources d’ionisation à pression atmosphérique, eletrospray (ESI) et l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), la technique la plus efficace et la plus utilisée pour l’analyse des composés phénolique, notamment les flavonoïdes est le couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse (CL-S M) qui conduit à l’identification des constituants par comparaison de leurs données spectrales avec celles de produits de référence contenues dans une bibliothèque de spectres (Cuyckens et Claeys, 2004).

II.4.2.Résonance magnétique nucléaire

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est fondée sur la mesure de l'absorption de la radiation de radiofréquence (RF) par un noyau atomique dans un champ magnétique fort.

L'absorption de la radiation pousse le spin nucléaire à se réaligner ou à retourner dans la direction de la plus haute énergie. Après avoir absorbé l'énergie, les noyaux atomiques réémettront une radiation RF et retourneront à leur état initial de moindre niveau d'énergie.

La résonance magnétique nucléaire du carbone-13(RMN13C) est la technique la plus utilisé dans le domaine analytique, elle permet l’identification des constituants d’un mélange complexe, à savoir les huiles essentielles et la plupart des molécules organiques, même dans les cas des molécules ayant des structures très proches (Tomi et al., 1995).

II.4.3.La chromatographie en phase gazeuse

C’est est une technique parfaitement adaptée à l’analyse des huiles essentielles au vu de leur composition chimique, caractérisée principalement par la présence de molécules volatiles.

Les analyses peuvent être réalisées sur colonnes remplies(AFNOR NF T75-400, 1985) ou sur colonnes capillaires (AFNOR NF T75-401, 1985) de polarités diverses. Les détecteurs utilisés sont généralement des détecteurs à ionisation de flamme (FID) ou à conductivité thermique

(TCD) et ne fournissent pas d’informations structurales. L’attribution des pics s’effectue alors grâce au système d’indices de rétention. Il se base sur le fait que la position de chaque pic 25

1ére partie Synthèse Bibliographique d’analyte est encadrée par le temps de rétention de deux alcanes linéaires (n-alcanes) aux nombres de carbones successifs.

Le profil chromatographique d’une huile essentielle correspond à la liste de ses constituants sélectionnés parmi ceux qui sont représentatifs et caractéristiques. Cette liste est accompagnée des limites de concentration des constituants et éventuellement des rapports entre leurs concentrations. La qualité de l’identification peut être améliorée considérablement par l’apport d’un couplage de la chromatographie gazeuse avec la spectrométrie de masse. La combinaison de ces deux techniques permet la séparation et l’identification de molécules dans des mélanges complexes (Fillatre, 2011).

1ére partie Synthèse Bibliographique

Chapitre III : Activités biologiques des composés phénoliques et huiles essentiels

III .1 .Introduction

Les composés phénoliques font l'objet d'un intérêt scientifique croissant en raison de leurs effets bénéfiques possibles sur la santé humaine. Ils sont reconnus pour leurs activités biologiques nombreuses à savoir : activité antibactérienne, anticancéreuse, antifongique, analgésique et diurétique(Dorman et Deans, 2000). Comme Ils possèdent une activité antioxydante, anti-inflammatoire et anti-âge(Benavente-García et Castillo, 2008).

Vers la fin du XXe siècle, des études épidémiologiques et des méta-analyses associées suggèrent fortement que la consommation de composés phénoliques, et plus spécifiquement de flavonoïdes, offre une certaine protection contre le développement de cancers(Nichenametla et al., 2006), de maladies cardiovasculaires(Kris-Etherton et al., 2002), de diabète, d'ostéoporose et de maladies neurodégénératives (Graf et al., 2005; Arts et Hollman, 2005). Ces vertus thérapeutiques sont due à leurs propriétés antioxydantes (Fleuriet et al.,, 2005). (figure 13)

Figure13 : Effets bénéfiques des polyphénols végétaux sur la santé(Pandey et Rizvi,

2009).

Les flavonoïdes et les acides phénoliques ont un rôle protecteur dans la cancérogenèse, l'inflammation, l'athérosclérose, la thrombose et ont une capacité antioxydante élevée. De plus, 27

1ére partie Synthèse Bibliographique des flavonoïdes ont été rapportés comme inhibiteurs de l'aldose réductase bloquant la voie du sorbitol qui est liée à de nombreux problèmes associés au diabète (Tapiero et al., 2002; Bonita et al., 2007).

Les acides pphénoliques ont des propriétés antimicrobiennes, antioxydantes, antiinflammatoires et chélatrices, surtout, l’acide cafeїque (Psotová et al., 2003).

Les composants phénoliques présents dans les huiles essentielles sont connus pour posséder une activité antimicrobienne et certains sont classés comme des substances reconnues comme généralement sûres (GRAS) et pourraient donc être utilisés pour prévenir la croissance post-récolte des bactéries natives et contaminantes (Singh et al., 2001). les huiles essentielles possédent aussi des propriétés antitoxique, antivenimeuse, antiviral, antiparasitaire et antioxydante (Valnet, 2005).

III .2 .Activités antioxydantes

III .2 .1. Le stress Oxydant

Le stress oxydant apparait dans une cellule quand un déséquilibre entre les processus biochimiques de production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) et ceux qui sont responsables de leur contrôle et élimination est rompu (Browne et al., 2008; Powers et., 2010).

Ce déséquilibre peut se produire quand le système de défense antioxydant est surmené par l’augmentation des oxydants ou lorsque les défenses sont affaiblies par une carence d’apport et/ou de production d’antioxydants(Kirschvink et al., 2008). L’équilibre ou homéostasie redox est perturbé et les cellules deviennent vulnérables aux attaques par les ERO(Mac Laren D,

2007). L’excès de radicaux libres non neutralisés par les moyens de défense est très dommageable pour les macrobiomolécules essentielles, entraînant anomalies d’expression des gènes et des récepteurs membranaires, prolifération ou mort cellulaire, troubles immunitaires, mutagenèse, dépôts de protéines ou de lipofuschine dans les tissus ( Favier, 2003).

1ére partie Synthèse Bibliographique

III .2 .2.Oxydant et antioxydants

Tous les organismes aérobies sont strictement dépendants de l’oxydation phosphorylante mitochondriale pour la production d’adénosine triphosphate (ATP) et l’homéostasie énergétique.

L’oxygène est ainsi strictement indispensable du fait de son potentiel oxydant très élevé, ce qui le rend parallèlement très dangereux pour toutes les molécules organiques (Leverve, 2009).

Les phénomènes radicalaires de base sont utiles au bon fonctionnement de l’organisme.

L’altération des composants cellulaires et des structures tissulaires intervient lorsque l’intensité de ces phénomènes augmente anormalement et dépasse la quantité d’antioxydants disponibles.

La conséquence de ce déséquilibre va entraîner une agression appelée « stress oxydatif » (figure

14). Tous les tissus et tous leurs composants peuvent être touchés : lipides, protéines, glucides et

ADN (Aurousseau, 2002; Valko et al, 2006). Toutes ces altérations augmentent le risque de plusieurs processus de différentes maladies dont le cancer (Kinnula et Crapo, 2004), les maladies cardiovasculaires (Singh et Jialal, 2006), les troubles neuraux (Sas et al., 2007), la maladie d'Alzheimer (Smith et al., 2000), la déficience cognitive légère (Guidi et al., 2006), la maladie de Parkinson (Bolton et al., 2000), l'hépatopathie alcoolique (Arteel, 2003), la colite ulcéreuse (Ramakrishna et al., 1997) et le vieillissement (Hyun et al., 2006).

Les défenses antioxydantes sont de nature diverse et agissent en synergie soit en se sacrifiant pour piéger l’électron célibataire d’un radical libre et le neutraliser en le délocalisant soit en réduisant enzymatiquement les espèces réactives de l’oxygène. Il existe des antioxydants non enzymatiques piégeurs proviennent de l’alimentation (éxogénes), comme les vitamines E

(tocophérol), C (ascorbate), Q (ubiquinone), les caroténoïdes ou les polyphénols. Il existe aussi des piégeurs endogènes synthétisés par les cellules et jouant le même rôle : le plus important d’entre eux est le glutathion réduit qui protège non seulement contre les radicaux oxygénés, mais aussi contre les peroxydes ou le NO (monoxyde d’azote) (Favier A, 2006).

Les antioxydants enzymatiques possédant une action direct sur les ERO et sont considérés comme la premiére ligne de défense de notre organisme .les trois enzymes 29

1ére partie Synthèse Bibliographique antioxydants majeurs sont la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), et la glutathion peroxydase (GPx)(De Moffarts et al., 2005).

Les antioxydants peuvent être très utiles pour améliorer la qualité de vie en prévenant ou en retardant l'apparition de maladies dégénératives. De plus, ils ont le potentiel de réaliser des

économies substantielles sur le coût de la prestation des soins de santé et al., 2013).

Figure 14. La balance d’équilibre entre les systèmes pro et antioxydants (Favier A,

2006).

III .2 .2.1. Les antioxydants enzymatiques :

La cellule est pourvue d’enzymes antioxydantes qui possède une action directe sur les ERO et sont considérés comme la première ligne de défense de notre organisme.les trois enzymes majeurs sont la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GPx) et la catalase

(CAT) (De Moffarts et al., 2005).

III .2 .2.2. Les antioxydants non enzymatiques :

Les substances non enzymatiques sont considérées comme une deuxième ligne de défense complémentaire, consiste en un ensemble de composés susceptibles de ralentir considérablement les effets des radicaux libres qui n’ont pas été piégés par les systèmes de défense précédents. Ce sont des molécules exogènes, c’est à dire qu’on ne les trouve pas spontanément dans l’organisme, mais qu’elles sont apportées par l’alimentation comme par

1ére partie Synthèse Bibliographique exemple les vitamines, les minéraux et les polyphénols. les principales substances utilisées pour lutter contre toute forme d’oxydation sont récapitulé dans le tableau (4) ci-dessous (Pokorny et al., 2001; Le Cren, 2004).

Tableau 4: Principales substances antioxydantes (Pokorny et al., 2001; Le Cren, 2004).

Antioxydants Antioxydants secondaires naturelles Antioxydants de primaires synthèse Enzymes Vitamines Minéraux Phytochimiques Cytosoliques GPX (Glutathion Vitamine C Sélénium Terpènes BHT (3,5ditertobutyl- Peroxydase) 4hydroxytoluène GRD (Glutathion Vitamine E Zinc BHA (3-tertiobutyl4- réductase) (Tocophérols) hydroxyanisole) GRT (Glutathion Vitamine Q Manganèse TBHQ ransférase) (Ubiquinone) (tertiobutylhydro- xyquinone) SOD (Superoxyde Vitamine A Cuivre Polyphénols Trolox (acide-6- Dismutase) (Rétinol) hydroxy-2,5,7,8- tetraméthylchroman-2- carboxylique) Catalase Vitamine B5 (A. Anhydride Gallate de propyle pantothénique) sulfureux (SO2) (E310) Gallate d’octyle (E311) Gallate de dodécyle (E312)

III .2 .3.Mode d’action des antioxydants

Les antioxydants peuvent agir selon divers mécanismes d’activité d’oxydation et avec plus d’un mécanisme ce qui ne facilite pas leur classification (Frankel et Meyer, 2000).

III .2 .3.1. Inhibition enzymatique

Les flavonoïdes sont capables d’inhiber plusieurs enzymes génératrices du O2 et d’autres

ERO, comme la xanthine oxydase (formation de complexes enzyme-inhibiteur), la proteprotéine kinase C, la cyclooxygenase, la lipooxygenase, la monooxygenase microsomal et la glutation S-

Transferase. Les flavonoïdes présentant un cycle B de type catéchol (ortho-diphénol ou 1,2- dihydroxybenzène) inhibent la succinoxidase mitochondriale et la NADH oxydase(Pietta, 2000).

1ére partie Synthèse Bibliographique

III .2 .3.2. Chélation des ions métalliques

Les flavonoïdes (tels la quercétine) peuvent chélater les ions fer et cuivre qui sont essentiels pour de nombreuses fonctions physiologiques(Cuyckens et Claeys, 2004). Ils entrent notamment dans la composition des hémoprotéines et de cofacteurs d’enzymes du système de défense antioxydant. Ainsi, les ions fer sont nécessaires pour la biosynthèse de la catalase, et ceux cuivrique pour la formation du superoxyde dismutase. Les sites de liaison proposés pour chélater les traces de métaux par les flavonoïdes sont la fraction catéchol dans le cycle B, le 3- hydroxyl, les groupes 4-oxo dans le noyau hétérocyclique, et les 4-oxo, les groupes 5-hydroxy entre l’hétérocycle et le cycle A.

III .2 .3.3. Piégeage des radicaux libres

Le piégeage des radicaux libres par des antioxydants est lié a deux types de mécanismes : la libération de l’atome d’hydrogène du groupement hydroxyle (cinétique rapide de certaines acides et dérivés phénoliques) et d’un électron (cinétique lente des dérivés glycosylés et des anthocyanes). Les antioxydants rentrent en compétition avec des radicaux déjà existant et contribuent à bloquer la phase de propagation. Plusieurs travaux ont établi des relations entre la structure chimique des polyphénols, notamment les flavonoïdes et leur capacité à piéger les radicaux libres. Les critères sont les suivants : (i) la structure ortho-dihydroxy sur le cycle B

(groupement catéchol), (ii) la double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo, (iii) la présence du groupe 3-OH en combinaison avec la double liaison C2-C3, (iv) un troisième OH sur le cycle renforce également le caractère antioxydant (ex: acide gallique), (v) l’effet de la glycosylation diminue l’activité des flavones et flavanones.

Le mécanisme d’action principale des composés phénoliques est le piégeage des radicaux libres par le transfert de l’atome d’hydrogène. A cause de leur faible potentiel redox, ils sont capables de réduire les radicaux libres oxydants(R•) comme le superoxyde, le radical peroxyde, le radical alkoxyle et OH• par transfert d’hydrogène. Le radical aroxyle résultant peut réagir avec un autre radical libre pour former une structure quinone stable.les flavonoïdes sont aussi des 32

1ére partie Synthèse Bibliographique principaux donneurs d’électrons. Cette capacité est appelée pouvoir réducteur(Huang, et al.,

2005).

III .2 .4. Les Maladies humaines liées au stress oxydant

Le stress oxydant est un phénomène impliqué dans plusieurs maladies (Figure 15). Par la création de molécules biologiques chimiquement et irréversiblement anormales et la surexpression de certains gènes, le stress oxydant sera la cause initiale essentielle de plusieurs maladies : l’inflammation, cancer, cataracte, sclérose latérale amyotrophique, syndrome de détresse pulmonaire aigu, œdème pulmonaire, vieillissement accéléré (Favier A, 2006).

En particulier, l'activité antioxydante des polyphénols, principalement flavonoïdes, est liée à la capacité de piégeage des radicaux libres, à la liaison forte aux ions ferreux libres et à l'effet antimutagène par une forte inhibition des dommages de l'ADN oxydatif (Lodovici et al.,

2001; Wu, et al., 2007).

Ainsi, les relations entre stress oxydant et cancer s’avèrent très étroites ; les radicaux libres intervenant dans l’activation des pro-carcinogènes en carcinogènes, créant les lésions de l’ADN, amplifiant les signaux de prolifération et inhibant les antioncogènes comme la protéine p53(Pryor, 1987). Par contre, à un stade plus avancé d’évolution de la carcinogenèse, les radicaux libres serviront inversement pour les NK (Natural Killer) lymphocytes à tuer les cellules tumorales. Le stress oxydant sera aussi un des facteurs potentialisant la genèse de maladies plurifactorielles telles que le diabète, la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires.

Par conséquent, la capacité anti tumorale de polyphénoles Par conséquent est liée à l'induction de l'apoptose, à la suppression de l'activité de la protéine tyrosine kinase, à l'antiprolifération, à l'antimetastasis et aux effets anti-angiogenèse. De plus, les flavonoïdes sont capables d'inhiber le processus d'inflammation in vivo et in vitro et possèdent également des activités antibactériennes et antifongiques. (Barros et al., 2010; Carocho et Ferreira, 2013).

1ére partie Synthèse Bibliographique

Dans certaines maladies la cause initiale ne met pas en jeu un processus radicalaire, mais la survenue secondaire du stress vient aggraver le processus initial. Un exemple caractéristique de cette situation est celui du sida. La responsabilité la plus nette des radicaux libres est mise en

évidence dans les maladies génétiques qui sont directement induites par des anomalies héréditaires d’un gène antioxydant (Favier A, 2006).

Figure 15. Conséquences pathogènes du stress oxydant (Favier A, 2006).

1ére partie Synthèse Bibliographique

III .2 .5.Evaluation in vitro de l’activité antioxydante

Diverses méthodes sont utilisées pour étudier les propriétés antioxydantes des

échantillons (extraits de plantes, antioxydants commerciaux…etc.). L'activité antioxydante ne devrait pas être conclue sur la base d'un seul modèle d'essai antioxydant. Et en pratique, plusieurs procédures de test in vitro sont effectuées pour évaluer les activités antioxydantes avec les échantillons d'intérêt. Ces analyses diffèrent entre eux en terme de mécanismes de réaction, oxydants et espèces cibles (les sondes), états des réactions et la forme dont sont exprimés les résultats. En plus, même lorsque seulement une de ces analyses est envisagée, ça engendre d’autres paramètres à prendre en considération tels que : le solvant, le temps de réaction et le pH

(Magalhães et al., 2008).

Par conséquent, il est difficile de comparer complètement une méthode à l'autre (Alam et al., 2013).On va citre quelque testes :

III .2 .5.1.Le test de piégeage de radical DPPH•

La molécule 1, 1-diphényl-2-picrylhydrazyl est caractérisée comme un radical libre stable en raison de la délocalisation de l'électron de rechange sur la molécule dans son ensemble, de sorte que la molécule ne se dimérise pas, comme ce serait le cas avec la plupart des autres radicaux libres.

La délocalisation de l'électron donne également naissance à la couleur violette profonde, caractérisée par une bande d'absorption dans une solution d'éthanol ou méthanol se situe vers

515-517 nm. Lorsqu'une solution de DPPH est mélangée à celle d'un substrat (AH) qui peut donner un atome d'hydrogène, alors cela donne la forme réduite avec la perte de cette couleur violette(Gouveia et Castilho, 2012).

III .2 .5.2. Le test de la réduction de fer (FRAP)

Cette méthode mesure la capacité des antioxydants à réduire le fer ferrique. Il est basé sur la réduction du complexe ferrique de la tripyridyl-s-triazine 2.4.6 [Fe (III) - (TPTZ) 2]3+ au

1ére partie Synthèse Bibliographique complexe ferreux coloré par le bleu [Fe (II) - (TPTZ) 2]2+ à faible pH(Alam et al., 2013). Cette réduction est suivie en mesurant le changement d'absorption à 700 nm(Oyaizu, 1986).

III .2 .5.3.Le test d’inhibition de blanchiment du β-caroténe

C'est l'une des méthodes rapides de criblage des antioxydants, basée principalement sur le principe que l'acide linoléique, qui est un acide gras insaturé, est oxydé par les «espèces réactives de l'oxygène» (ROS) produites par l'eau oxygénée. Les produits formés initieront l'oxydation du

β-carotène, ce qui conduira à une décoloration. Les antioxydants diminuent l'ampleur de la décoloration, qui est mesurée à 434 nm(Alam et al., 2013).

III .2 .5.4.Le test à l'acide thiobarbiturique (TBA)

La méthode TBA décrite par Ottolenghi (1959) est la suivante: La concentration finale de l'échantillon de 0,02% m/v a été utilisée dans cette méthode. Deux mL d'acide trichloroacétique à 20% et 2 mL de 0,67% d'acide thiobarbiturique ont été ajoutés à 1 mL de solution échantillon. Le mélange a été placé dans un bain d'eau bouillante pendant 10 minutes, puis centrifugé après refroidissement à 3000 tr/min pendant 20 minutes. L'activité d'absorbance du surnageant a été mesurée à 552 nm et enregistré après avoir atteint son maximum.

III .2 .6. L’activité antioxydante des composés phénoliques et huiles essentielles

Les polyphénols constituent une importante famille d’antioxydants dans les plantes, les fruits et les légumes puisqu’elles comprennent plus de 6000 molécules. ils n’ont aucun effet nuisible sur la santé humaine, contrairement aux antioxydants synthétiques comme le butylhydroxyanisole (BHA) et le butylhydroxytoluène (BHT) (Bounatirou et al., 2007). Les acides phenoliques, les flavonoides sont les composés phénoliques de plantes qui possèdent des capacités de piégeage des radicaux libres, inhiber l’oxydation lipidique et prévenir les dommage oxidatifs de l’ADN( Yu-Ling Lee et al., 2008).

Les propriétés antioxydantes des huiles essentielles sont depuis peu massivement

étudiées. Les huiles essentielles de cannelle, de muscade, de clou de girofle, d’origan et de thym possèdent de puissants composés antioxydants (Edris, 2007). L’efficacité antioxydante des 36

1ére partie Synthèse Bibliographique huiles essentielles peuvent être liée à l’activité de certain type de composés tels que les monoterpènes oxygénés, en particulier les alcools et les phénols(Bourgou et al., 2008). De même, le terpinéne-4-ol, géraniol, eugénol et thymol semblent avoir une activité antiradicalaire intéressante(Dorman et Deans, 2000).

L’activité antioxydante des huiles essentielles est également attribuée à certains alcools,

éthers, cétones et aldéhydes monoterpéniques : le linalool, le 1,8-cinéole, le géranial/néral, le citronellal, et quelques monoterpènes : γ-terpinène et l’α-terpinolène (Edris, 2007).

III .3 .Activités antibactériennes

III .3 .1.les plantes, source naturelle d’antimicrobiens

Les taux alarmants de menaces microbiennes émergentes et ré-émergentes, associés à la résistance antimicrobienne croissante aux antibiotiques actuels sont des préoccupations majeures pour la santé publique et les communautés scientifiques du monde entier (Butler et Cooper,

2011; He et al., 2010). Ces tendances ont souligné le besoin urgent de concevoir et de développer de nouvelles classes d'agents antimicrobiens avec des structures chimiques et des mécanismes d'action différents de ceux des médicaments traditionnels, afin d'améliorer leurs activités tout en conservant de bons profils de biodisponibilité et de sécurité (Ziemska, et al.,

2013).

Les plantes synthétisent plus de 100 000 petites molécules dotées pour la plupart d’une activité antibiotique. En général, cette activité est inferieure à celle exercée par les antibiotiques d’origine microbienne(Tegos et al., 2002; Lewis et Ausubel, 2006). Les concentrations requises pour exercer une activité antimicrobienne sont donc plus élevées pour les molécules isolées de plantes que pour celles issues de bactéries et de champignons. En effet, une molécule phytochimique est considérée comme « antimicrobienne », si elle inhibe la croissance des microorganismes pour des concentrations minimales inhibitrices (CMIs) compris entre 100

μg /ml et 1000 μg /ml, pour les antibiotiques d’origine microbienne, des CMIs varient de 0.01

μg /ml, suffisent à générer une activité inhibitrice(Tegos et al., 2002). 37

1ére partie Synthèse Bibliographique

Les nouveaux antibactériens devraient pouvoir induire la mort cellulaire en agissant simultanément sur plusieurs cibles bactériennes ou en développant des mécanismes d’action originaux et les nouveaux agents antifongiques doivent avoir un large spectre d’action fongicide, des nouveaux modes d’actions et moins d’effet secondaires (Dannaoui, 2013).

III .3 .2.spectre d’action des antibactériens naturels

La thérapeutique des infections bactériennes se base principalement sur l’usage des antibiotiques. La prescription à grande échelle et parfois inappropriée de ces agents peut entraîner la sélection de souches multi-résistantes d’où l’importance d’orienter les recherches vers la découverte de nouvelles voies qui constituent une source d’inspiration de nouveaux médicaments à base des plantes (Billing et Sherman, 1998).les antibactériens produit par les plantes est plus restreint que celui généré par les antibiotiques conventionnels.

Les mécanismes d'action des huiles essentielles et leur sélectivité envers certaines bactéries restent jusqu'à présent mal élucidés. Elle est variable d’une huile à l’autre et d’une souche bactérienne à l’autre (Dorman et Deans, 2000; Bagamboula et al., 2004).Selon ces auteurs, cette sélectivité est le résultat de la composition variée des fractions actives des huiles, qui présentent souvent des actions synergiques. Il semble que le mécanisme d'action de ces huiles est lié essentiellement à la structure de la paroi et à la perméabilité membranaire des bactéries à Gram+ et Gram-.

Rhayour, et al (2003) a examiné le mécanisme d'action des huiles essentielles des

Clous de girofle et d'origan (Origanum vulgare) simultanément avec ceux de deux de leurs composants, le thymol et l'eugénol, sur des bactéries: E. coli et Bacillus subtilis et qui ont été utilisées respectivement comme modèles de bactérie Gram+ et Gram-. Les deux H.E. tout comme leurs deux composants ont été capables d'induire une lyse cellulaire.

Une huile essentielle active exercera son pouvoir antimicrobien par son interférence avec la bicouche lipidique de la cellule cible grâce à sa propriété hydrophobe, ce qui entraîne une perturbation de la perméabilité et perte des constituants de la cellule (Burt, 2004). En plus, cette 38

1ére partie Synthèse Bibliographique réaction varie en fonction de la nature de la bicouche lipidique, ce qui explique la résistance des bactéries Gram- . En outre, Dabbah et al (1970) ont mis en évidence la grande sensibilité des bactéries Gram+ par rapport aux Gram- et aux champignons. Dans la même démarche d'étude, plusieurs auteurs on suggéré différents mécanismes d’action des huiles essentielles savoir : la destruction de certains systèmes enzymatiques incluant ceux qui participent dans la production d'énergie cellulaire et la production des composés structuraux (Gordon, 1973) , l'inactivation et destruction du matériel génétique (Guesmi et A.Boudabous, 2006),et l’empêchement de la multiplication des bactéries, leur sporulation et la synthèse de leurs toxines (Caillet et al., 2007).

Les herbes estragon et le thym contiennent de l'acide caféique, qui est efficace contre les virus , les bactéries et les champignons(Cowan, 1999).

Le catéchol et le pyrogallol sont tous les deux des phénols hydroxylés, qui se sont révélés toxiques pour les microorganismes. Le catéchol a deux groupes OH, et le pyrogallol en a trois. le site et le nombre de groupes hydroxyles sur le groupe phénol sont liés à leur toxicité relative vis-à-vis des micro-organismes, avec une évidence qu'une hydroxylation accrue entraîne une toxicité accrue. Les mécanismes supposés responsables de la toxicité phénolique pour les micro-organismes comprennent l'inhibition de l'enzyme par les composés oxydés, possiblement par réaction avec des groupes sulfhydryle ou par des interactions plus spécifiques avec les protéines (Cowan, 1999).

L’activité des flavonoïdes est probablement due à leur capacité de se complexer aux protéines extracellulaires et solubles. De même, les flavonoïdes à caractère lipophile peuvent détruire les membranes microbiennes en augmentant la fluidité des lipides membranaires(Daglia,

2012) .

III .3 .3. L’activité antimicrobienne des composés phénoliques et huiles essentielles

Les plantes synthétisent une multitude de molécules antimicrobiennes, pour se protéger contre les bactéries et les champignons. Ces ressources naturelles, délaissées ai profil des molécules de synthèses, sont à nouveau exploitées pour mener les recherches sur les 39

1ére partie Synthèse Bibliographique antimicrobiens. Les huiles essentielle connue de façon empirique depuis des siècles, semble être les meilleures alternatives fiable à l’usage comme antibiotiques. Leur efficacité anti-infectieuse a

été scientifiquement prouvée in vitro et in vivo. (Dorman et Deans, 2000)

L’activité antimicrobienne des polyphénols a été largement étudiée contre un large

éventail de micro-organismes. Parmi lesquels, les flavan-3-ols, les flavonols et les tanins en reçu le plus d’attention en raison de leur large spectre d’action antimicrobienne. Les propriétés antimicrobiennes de certaines classes de polyphénols ont été proposées soit pour développer de nouveaux conservateurs alimentaires (Rodríguez Vaquero et al., 2010), ou pour le traitement des infections microbienne divers.

2éme partie Matériel et Méthodes

IV.MATERIEL ET METHODES

Introduction

L’Algérie, par sa situation géographique, est dotée d’un Sahara très vaste disposant d’une grande diversité floristique à laquelle s’ajoute une tradition d’utilisation des plantes. La recherche d’agents bioactifs de ces derniers doit être entreprise au sein de cette biodiversité végétale se servant de nouveaux remèdes thérapeutiques. Ces principes actifs sont déterminés par une étude phytochimique qui consiste à les détecter et doser, pour une éventuelle utilisation à résoudre le problème croissant de la résistance bactérienne et la cancérogénicité des additifs alimentaires synthétiques actuellement très répandus dans le commerce.

A cet effet, on s’est intéressé à étudier les composés phénoliques individuels et les huiles essentielles de deux plantes sahariennes Juniperus phoenica L. et Cotula cinerea (Del) ainsi que l’évaluation de leurs activités biologiques (antioxydant, anti-inflammatoire, cytotoxique et antibactérienne).

IV.1. Matériel végétal

Pour les deux échantillons, les parties aériennes de Juniperus phoenica L. (feuilles) et

Cotula cinerea (Del) (feuilles, tige, fleures) ont été récoltées au sud-ouest de l'Algérie à El

Bayadh (Arbaouat 33 ° 05 '18 "Nord; 0 ° 34' 52" Est) et Béchar (Abadllah 31 ° 01 '00 "Nord 2 °

44' 00" Ouest) respectivement, pendant la période de floraison (mai 2015). Les plantes ont été identifiées par Pr. Okacha Hasnaoui du Laboratoire d'écologie et gestion des écosystèmes

Naturels à l'Université. Abou Bakr Belkaid Tlemcen (Algérie). Le matériel végétal a été étalé sur le sol et laissé sécher à température ambiante et à l'abri de la lumière directe du soleil. Une fois séchée, une partie a été broyée en une poudre fine, pour être soumise à des tests phytochimiques et également à différentes extractions.

41 2éme partie Matériel et Méthodes

Figure 16’: les zones de récolte de plantes étudiée (à gauche Arbaouat: El Bayedh, à droite Abadla: Béchar). IV.2. Screening photochimique

Pour connaître la composition chimique du matériel végétal, nous avons fait un dépistage phytochimique. Celui-ci est basé sur des essais de solubilité, sur des réactions de coloration et de précipitation ainsi que sur des examens en lumière ultra violette. La coloration observée est généralement due à la formation d'une conjugaison ou d'une instauration dans une molécule. Dans de tels tests de caractérisation, nous provoquons cette insaturation en utilisant un réactif approprié.

Nous avons caractérisé les différents groupes chimiques (tanins, flavonoïdes, anthocyanes, coumarines, composés réducteurs, amidon stérols et stéroïdes, alcaloïdes et saponines) en faisant référence aux techniques décrites par (Paris et al., 1969, Trease et Evans,

1996) avec quelques modifications.

IV.3. Les procédures d’extraction

IV. 3.1. Extraction des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont extraites par hydrodistillation en utilisant un appareil de type

Clevenger selon les méthodes décrites par (Browning et al., 1967). Des quantités (100 g) de chaque matière végétale séchée sont mises dans 1 litre d’eau distillée puis chauffées pendant 4 heures. Les vapeurs refroidies sont ensuite récupérées. Les huiles obtenues sont séchées à l’aide 42 2éme partie Matériel et Méthodes

de sulfate de sodium anhydre et conservées dans des flacons de verre scellées à 4 ° C pour être

ensuite analysées.

Le rendement en huile essentiel obtenue est déterminé comme suit:

Huile %(v /p) = poids d'huile extraite en (g) / poids de l'échantillon traitée en (g) x 100

(a) (b) Photo 5 : (a) Extraction des huiles essentielles par hydro-distillation. (b) Les huiles obtenues

IV.3.2. Préparation des extraits

Des extraits aqueux obtenus par infusions et des extraits hydroéthanoliques sont préparés

à partir de la partie aérienne de J. phenica L et C. ceneria (Del). Pour les extraits aqueux, 2 g de

matière végétale sont infusés avec de l'eau distillée bouillante (200 ml) pendant 15 minutes puis

filtrés.

Quant à l'extraction hydroéthanolique, 1 g de chaque échantillon est macéré avec 30 ml d'éthanol

(80%) sous agitation (150 tr/min) à 25 °C pendant 1 heure, puis filtré. Le résidu est ré-extrait une

43 2éme partie Matériel et Méthodes fois de plus (30 ml éthanol). Les extraits combinés de chaque plante sont évaporés afin d'éliminer l'éthanol, sous pression réduite (évaporateur rotatif Büchi R-210, Flawil, Suisse).

Les deux extraits (aqueux et éthanolique), préalablement congelés pour la lyophilisation

(FreeZone 4.5, Labconco, Kansas City, MO, USA), sont dissouts dans un mélange éthanol / eau

(80:20, v / v) et de l'eau respectivement pour l’obtention d’une solution mère. Une concentration de 10 mg/ml servira pour les tests de l’activité antioxydante; 5 mg/ml pour la caractérisation des composés phénoliques, 20 mg /ml pour l’activité antibactérienne et enfin 8 mg /ml dans l'eau pour des tests anti-inflammatoires et de cytotoxicité. Concernant les tests d'évaluation de la bioactivité, les solutions mères ont été davantage diluées et testées.

Photo 6: Préparation des extraits à partir des plantes étudiés

IV.4. Caractérisation des huiles essentielles et des composés phénoliques

IV.4.1.Analyse des huiles essentielles par CPG/SM

L'analyse des huiles essentielles est réalisée par la chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CPG/SM) (Hewlette Packard Agilent 6890) équipé d'une colonne capillaire HP-5MS (30 m 0,25 mm, épaisseur de film 0,25 mm) dont les températures d'injecteur et de détecteur sont maintenues à 250 °C. La température du four est programmée à

60 °C pendant 8 minutes, pour être élevée jusqu’à 250 °C à une vitesse de 2 °C / min et

44 2éme partie Matériel et Méthodes isotherme à 250 °C pendant 10 minutes. L'hélium est le gaz porteur, dont le débit à 0,5 ml / min.

Un échantillon de 0,2 μL d'huile essentielle est injecté manuellement (en mode divisé 50: 1) et un détecteur sélectif de masse Hewlett Packard Agilent 5973 sert à la séparation. Le détecteur sélectif de masse fonctionne en mode d'ionisation par impact électronique (EI) avec une gamme de balayage de masse de 30 à 550 m / z à 70 éV. Les indices de rétention sont calculés pour tous les constituants volatils en utilisant une série homologue de n-alcanes C8 - C22. Les constituants de l'huile essentielle sont identifiés en comparant leurs indices de rétention GC avec les données des spectres de masse de bibliothèque GPC-SM de composant d’huiles essentielles, Wiley,Mass-

Finder et Adams (Adams, 2001). Les composants d'huile essentielle sont fournis en pourcentage relatif de l'huile totale par zone de pics.

IV.4.2.Caractérisation et quantification des composés phénoliques

Le profil phénolique quantitatif et qualitatif a été déterminé par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse(SM) LC-DAD-

ESI / MSn (Dionex Ultimate 3000 UPLC, Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), comme décrit précédemment par Bessada et al. (2015) LC-DAD-ESI / MSn (Dionex Ultimate 3000 UPLC,

Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), comme décrit précédemment par Bessada et al. (2015), systéme munie d’une pompe de distribution de solvant binaire. Pour la détection en double ligne, nous avons utilisé 280 et 370 nm comme longueurs d'onde pour le détecteur a barrette de diodes

(DAD) dans un spectromètre de masse (MS). La détection MS est réalisée en mode négatif en utilisant un spectromètre de masse Linear Ion Trap LTQ XL (ThermoFinnigan, San Jose, CA,

USA) équipé d'une source électrospray (ESI). L'identification des composés phénoliques est réalisée en utilisant des composés standards lorsqu'ils sont disponibles, en comparant leurs temps de rétention, leurs spectres UV-Vis et de masse et également, en comparant les informations obtenues avec les données disponibles rapportées dans la littérature donnant une identification provisoire. Pour l'analyse quantitative, une courbe d'étalonnage pour chaque étalon phénolique disponible est réalisée sur la base du signal UV. Les composés phénoliques identifiés et pour 45 2éme partie Matériel et Méthodes lesquels un étalon commercial n'était pas disponible, la quantification est effectuée à l'aide de la courbe d'étalonnage de l'étalon le plus proche disponible. Les résultats sont exprimés en mg /g d'extrait.

IV.5.Estimation des activités biologiques in vitro

IV.5 .1. Les activités antioxydantes

L'activité antioxydante est évaluée en utilisant quatre méthodes différentes à savoir le piégeage des radicaux libres DPPH, le pouvoir réducteur du fer, l'inhibition du blanchiment du β- carotène et les tests d'inhibition des substances réactives à l'acide thiobarbiturique TBARS pour les extrais aqueux et éthanoliques (Barros et al., 2013). Pour les huiles essentielles nous n’avons utilisé que le piégeage des radicaux libres DPPH. Les résultats sont exprimés en valeurs CE50 qui représente la concentration de l'échantillon fournissant 50% de l’activité antioxydante ou 0,5 de l'absorbance dans le test du pouvoir réducteur de fer. Le trolox, l’acide ascorbique et le

(BHA) sont utilisés comme standards.

II.5.1.1. Activité de piégeage des radicaux libres DPPH

Le DPPH (2,2 diphényl-1-picrylhydrasyl) est généralement le substrat le plus utilisé pour l’évaluation rapide et directe de l’activité antioxydante en raison de sa stabilité en forme de radical libre et de la simplicité de l’analyse. Il absorbe dans le visible à la longueur d’onde de

515 à 520 nm (Bozin et al., 2008). Cette méthodologie est réalisée en utilisant un lecteur de microplaque

Photo 7: Réduction du radical DPPH (de coleur violette) au diphényl picryl-hydrazine (de couleur jaune).

46 2éme partie Matériel et Méthodes

Figure 16 : Forme réduite du radical DPPH˙

 Mise en œuvre pratique

On prépare des dilutions à différentes concentrations à partir d’une concentration de solution mère à 5mg/ml des extraits aqueux et éthanoliques (les dilutions se font dans l’eau distillée déionisée des extraits aqueux et les autres par de l’éthanol.

Dans une microplaque (96puits) on dépose 30 µL des extraits a différentes concentrations et on ajoute 270 µL de la solution méthanolique de DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ; pm=394.32 g/mol; 6 10-5). Ensuite, Le mélange réactionnel a été incubé à température ambiante pendant une heure dans l'obscurité, et l'absorbance a été mesurée à 515 nm avec trois répétitions et trois lectures. Pour le blanc, le méthanol est le contrôle négatif (en remplaçant l’extrait par l’eau ou le méthanol).Le Trolox et l’acide ascorbique, hydroxyanisole butylé (BHA) sont utilisé comme un contrôle positif pour les extraits et les huiles essentielles respectivement.

L'activité de piégeage des radicaux (RSA) est calculée en pourcentage de décoloration de DPPH en utilisant l'équation:

RSA% = [(ADPPH-AS) / ADPPH] ×100, où

AS est l'absorbance de la solution contenant l'échantillon

ADPPH est l'absorbance de la solution de DPPH.

47 2éme partie Matériel et Méthodes

La concentration inhibitrice de 50 % (appelée aussi EC₅₀ «Efficient Concentration 50») est la dose d’extrait nécessaire pour provoquer une diminution de 50% de l'absorbance à 515 nm.

Elle est calculée graphiquement par les régressions linéaires des graphes tracés (pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des extraits testés) (Bertoncelj et al.,

2007 ; Marxen et al., 2007 ; Scherer et al., 2009 ; Fabri et al., 2009).

L'activité antiradicalaire est exprimée en IC₅₀ (µg mL-1) en calculant l’inverse des valeurs des IC₅₀ trouvées (Maisuthisakul et al, 2007).3

AAR=1/IC50

IV.5.1.2. Réduction du Fer: FRAP (Ferric reducing antioxydant power)

L’activité réductrice du fer de nos extraits est déterminée selon la méthode décrite par

(Pan et al., 2008), basée sur la réaction chimique de réduction du Fe3+ présent dans le complexe

2+ K3Fe(CN)6 en Fe . La réaction est révélée par le virement de couleur jaune du fer ferrique (Fe³⁺ ) en couleur bleu vert du fer ferreux (Fe²⁺ ). Cette capacité réductrice peut servir comme un indicateur significatif de l’activité antioxydante potentielle d’un composé. L’absorbance du milieu réactionnel est déterminée à 690 nm.

Photo 8: Réduction du fer ferrique en fer ferreux.

48 2éme partie Matériel et Méthodes

 Mise en œuvre pratique

Les solutions d'extrait à différentes concentrations (500 µl) sont mélangées avec 500 µl d’une solution tampon de phosphate de sodium (200 µmol/l, pH=6,6) et 500 µl de ferricyanure de potassium (1% poids/volume). Le mélange est incubé à 50 °C pendant 20 min avec 500µL d’acide trichloroacétique (10% p / v, H₂0). Un volume de 800 µl est transfé dans des microplaques de (48puits, 2mL), additionné à de l'eau déionisé (800 µl) et du chlorure ferrique

(0,1% poids / volume, 160 µl). L'absorbance est mesurée à 690 nm par un lecteur de

Microplaque ELX800 (Bio-Tek Instruments, Inc ; Winooski, États-Unis) avec trois lectures et deux essais.

IV.5.1.3. Inhibition de blanchissement de β-carotène

Dans ce test la capacité antioxydant des extraits est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydative du β-carotène (figure17) par les produits d’oxydation de l’acide linoléique selon la méthode décrite par Koleva (2002).

Figure 17 : Structure du β-carotène

 Mise en œuvre pratique

Une solution de β-carotène est préparée en dissolvant 2 mg de ce dernier dans 10 ml de chloroforme. Deux millilitres de cette solution sont prélevés et mis dans un ballon de 100ml.

Après élimination du chloroforme à 40 °C sous vide, 40 mg d'acide linoléique, 400 mg de

Tween 80 et 100 ml d’eau distillée sont ajoutés au ballon avec une agitation vigoureuse pour la préparation d’une émulsion. Des aliquotes (4,8 ml) de cette émulsion sont transférées dans des tubes à essai contenant différentes concentrations (200 µl) d’extrait (0,039-2,5mg/ml). La lecture

49 2éme partie Matériel et Méthodes est effectuée directement à 470 nm représentant l’absorbance initiale (T0). Après incubation du mélange dans un bain marie pendant 2h et à 50°C avec agitation on fait une deuxième lecture de l’absorbance (T2).

Le contrôle négatif: l’émulation est mélangée avec de l’eau et du méthanol pour le test des extraits aqueux et éthanolique successivement. Le pourcentage d'inhibition du blanchiment β carotène est calculé en utilisant l'équation suivante:

Pourcentage d’inhibition = (Absorbance à (T2)/ absorbance (T0)) × 100. Avec

T2: Absorbance après 2 h de dosage, T0: Absorbance initiale.

IV.5.1.4. Test d’inhibition des substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS)

Les substances réactives à l'acide thiobarbiturique TBARS sont formées comme sous- produits de la peroxydation des lipides (c'est-à-dire comme produits de dégradation des graisses) qui peuvent être détectés par le test TBARS. Dans cet essai, le malondialdéhyde (MDA) réagi avec le TBA pour former un complexe MDA-TBA de couleur rose qui est mesuré par spectrophotométrie à 530-535 nm (Trevisan et al., 2001) (Shahidi et al.,2005). L'oxydation des peroxydes lipidiques conduit à la formation d'alcoxy et radicaux peroxy comme produits d'oxydation primaires, qui à leur tour, produisent de nombreux produits secondaires tel que le malondialdéhyde (MDA) qui se forme à la suite de la dégradation des acides gras polyinsaturés.

Le MDA pourrait produire des dommages à l'ADN et est jugé comme une importante cause de plusieurs maladies de vieillissement comme le cancer (Liao et al, 2014).

Photo9: La réaction de malondialdéhyde (MDA) avec l'acide thiobarbiturique. (Coloration rose). 50 2éme partie Matériel et Méthodes

 Mise en œuvre pratique

Les cerveaux porcins (Sus scrofa) sont obtenus à partir d'animaux fraîchement abattus, disséqués et homogénéisés avec Polytron dans un tampon Tris-HCl glacé (20 mM, pH7.4) pour produire un homogénat de tissu cérébral de 1: 2 P / v qui est centrifugé à 3000 t /mn pendant 10 min. Une aliquote (100 µl) du surnageant est incubée avec (200µl) de l’extrait à différentes concentrations (0,00488- 0,3125mg/ml) en présence de FeSO4 (10 mM, 100 µ) et d'acide ascorbique (0,1 mM, 100 µl) à 37.5°C pendant 1 heure. La réaction est arrêtée après addition de

500µl d'acide trichloroacétique (28%, H20), suivi de 380µl d’acide thiobarbiturique (TBA 2%,

H20). Le mélange est ensuite chauffé à 80 °C pendant 20 min. Après centrifugation à 3000 t/mn pendant 5 min pour éliminer le précipité protéine, l’absorbance à 532 nm de l'intensité de la couleur du complexe malondialdéhyde (MDA) –TBA du surnageant est mesurée.

Le premier témoin négatif est constitué de réactifs avec de l’eau ou du méthanol à la place de l’extrait pour le test d’activité antioxydant des extraits aqueux ou éthanolique successivement.

Le deuxième témoin négatif est un mélange des réactifs avec la solution tampon Tris HCl qui remplace l’extrait dans la même proportion.

Le taux d'inhibition (%) est calculé en utilisant la formule suivante:

Taux d'inhibition (%) = [(A-B) /A] ×100%

où A et B représentent respectivement l'absorbance du témoin et de la solution de l'échantillon.

IV.5.2. L’Activité anti-inflammatoires

L'évaluation des propriétés anti-inflammatoires est réalisée par la détermination de l'oxyde nitrique (NO) produit suite à une agression des Macrophage de souris RAW 264.7 par des lipopolysaccharides (LPS) (d’Escherichia coli). La concentration du nitrite est mesurée comme indicateur de la production de NO à 540 nm dans un lecteur de microplaque ELX800

51 2éme partie Matériel et Méthodes

(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) et est comparé à la courbe d'étalonnage standard (Sobral et al., 2016).

IV.5.2.1. Culture de cellules (Macrophages)

La lignée cellulaire de type macrophage de souris RAW 264.7 (DSMZ-Collection allemande de micro-organismes et Cultures cellulaires, Braunschweig, Allemagne) est cultivée dans du milieu DMEM, supplémenté de 10% de sérum bovins fœtaux (FBS) inactivés par la chaleur, de glutamine et d’antibiotiques à 37 °C sous 5% de CO₂, dans de l'air humidifié. Pour chaque test, les cellules sont détachées avec un grattoir cellulaire. Dans l'expérience, la densité cellulaire des macrophages utilisée est de 5×105 cellules par ml et la proportion de cellules mortes est inférieure à 5% selon le test d'exclusion du colorant bleu trypan. Les cellules sont ensemencées dans des plaques de 96 puits avec une concentration cellulaire de à 150 000 cellules par puits et laissées attachées à la plaque pendant la nuit. Par la suite, les cellules sont traitées avec les différentes concentrations de chaque échantillon pendant 1 h puis vient l’étape de la stimulation des macrophages attachés avec lipopolysacharides (LPS 1 µg ml-1) pendant 18 h. Le dosage de l’oxyde nitrique produit suit a l’ajout des échantillons testés dans l'absence de LPS et s’elle produit après l’ajout des LPS son évalué, afin d'observer si nos extraits induisent un changement dans les niveaux initiaux d'oxyde nitrique (NO) produit par les macrophages.

En contrôle négatif; aucun LPS n'a été ajouté aux macrophages traités par nos extraits.

En contrôle positif: l’inhibiteur synthétique de la production de NO à savoir le déxaméthasone

(50 mM) a été utilisé. Les quatre extraits et LPS ont été dissous en milieu DMEM.2.

IV.5.2.2. Détermination de l'oxyde nitrique

Pour la détermination de l'oxyde nitrique, un kit de système de réactif de Griess est utilisé qui contient du sulphanilamide, N-(1-naphtyl) éthylènediamine chlorhydrate (NED) et des solutions de nitrite. Une courbe d'étalonnage est réalisée avec du nitrite de sodium (100 µM à 1.6

µM; y=0,0063x + 0,1318; R2 = 0,9999) dans une plaque à 96 puits. La culture cellulaire surnageant (100 ml) est transférée dans la plaque et mélangée avec des solutions de 52 2éme partie Matériel et Méthodes sulfanilamide et de NED pendant 5-10 minutes chacune, à température ambiante. L'oxyde nitrique produit est déterminé en mesurant l'absorbance à 540 nm (lecteur de microplaques

ELX800 Biotek) qui est comparée avec celles de la courbe l'étalonnage. Les résultats sont exprimés en valeurs EC50 (mg ml-1) qui correspondent à la concentration de l'échantillon fournissant 50% d'inhibition de la production d'oxyde nitrique (NO).

IV.5.3. Activité Antitumorale

L’activité antiproliférative de nos extraits est évaluée par le test calorimétrique sulforhodamine B (SRB) qui est utilisé pour la détermination de la densité des cellules tumorale en se basant sur la mesure de leur teneur en protéines. La méthode que l’on décrit est optimisée pour la toxicité des composés vis-à-vis des cellules adhérentes aux microplates 96 puits. L'essai de sulforhodamine B (SRB), qui a été développé en 1990, reste l'une des méthodes les plus utilisées pour le criblage in vitro de cytotoxicité (skchan et al., 1990). L'essai repose sur l'aptitude de SRB à se lier aux composants protéiques de culture cellulaire fixée par l’acide trichloroacétique (TCA).SRB qui est un colorant aminoxanhène rose vif avec deux groupes sulfoniques qui se lient aux résidus d'acides aminés basiques dans des conditions acides douces et se dissocient dans des conditions basiques (Lilie, 1997). Comme la liaison de SRB est stœchiométrique, la quantité de colorant extraite des cellules colorées est directement proportionnelle à la masse cellulaire.

IV.5.3.1 Dans les lignées cellulaires tumorales humaines

Quatre types de cellules tumorales humaines (DSMZ, Braunschweig, Allemagne) sont utilisées: MCF-7(adénocarcinome du sein), NCI-H460 (carcinome pulmonaire non a petite cellules), HeLa (carcinome cervical) et HepG2 (carcinome hépatocellulaire). Les cellules sont systématiquement maintenues en tant que cultures de cellules adhérentes dans le milieu RPMI-

1640 contenant 10% de sérum bovins fœtaux (FBS) inactivés par la chaleur et du glutamine 2

µM (MCF-7, NCI-H460, Cellules HepG2 et HeLa) à 37 °C dans un incubateur à air humidifié contenant 5% de CO₂. Un volume de 190 µl de chaque culture cellulaire est plaqué avec une 53 2éme partie Matériel et Méthodes densité appropriée (7,5 à 103 cellules par puits pour MCF-7 et NCI-H460 à raison de 1,0×104 cellules par puits pour HeLa et HepG2) dans des plaques à 96 puits. Ces cellules sont laissées s’attacher à la paroie des puits pendant 24 h Une quantité de 10 µl d’extraits à différentes concentrations (de 0,12 à 8 mg/ml) est ajoutée puis incubée pendant 48 h. Les cellules adhérentes sont ensuite fixées en ajoutant 100 μL d’acide trichloroacétique à 10% et incubées pendant 60 min à 4 ºC. Les plaques sont ensuite lavées avec de l'eau désionisée et séchées. Le sulforhodamine B, solution (0,1% dans de l'acide acétique à 1%, 100 µl) est ensuite ajoutée à chaque plaque et incubée pendant 30 min à température ambiante. Le SRB non lié est ensuite retiré après lavage avec de l'acide acétique à 1%. Les plaques sont séchées à l'air et le SRB lié est solubilisé avec 200 μL de la solution Tris (10 mM) et l'absorbance mesurée à 540 nm dans le lecteur de microplaquementionné ci-dessus (Barros et al., 2013; Guimarães et al., 2013;

Gomes-Corrêa et al., 2015). L’ellipticine est utilisée comme témoin positif et les résultats sont exprimés en GI50 (concentration de l'échantillon qui inhibe 50% de la croissance des cellules tumorales en mg par ml).

IV.5.3.2 Cytotoxicité des extraits dans les cellules non tumorales

Pour l'évaluation de la cytotoxicité de nos extraits dans les cellules non tumorales, une culture cellulaire (attribuée en tant que PLP2) a été préparée à partir d'un foie de porc fraîchement prélevé provenant d'un abattoir local, selon une procédure établie par les auteurs

(Abreu et al., 2011). Brièvement, les tissus du foie sont rincés dans une solution saline

équilibrée de Hank contenant 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine et divisée en 1×1 mm3 d'explants. Certains de ces explants sont placés dans des flacons qui contiennent 25 cm2 de tissu dans un milieu DMEM additionné de 10% sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM d'acides aminés non essentiels, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine. Le tout est incubé à 37 °C avec une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂. Le milieu est changé tout les deux jours. La culture des cellules est poursuivie avec une surveillance directe tous les deux à trois jours en utilisant une phase microscope de contraste. Avant que la confluence ne soit 54 2éme partie Matériel et Méthodes atteinte, les cellules étaient cultivées en milieu DMEM avec 10% de FBS et mises dans des plaques de 96 puits à une densité de 1.0× 104 cellules par puits, 100 U/ml de pénicilline et 100

µg/ ml de streptomycine. L’ellipticine a été utilisé comme témoin positif.

IV.5.4 Activité antimicrobienne

IV.5.4.1. Activité antimicrobienne des extraits

L'activité antimicrobienne des échantillons est testée contre l'ensemble des souches de différentes espèces bactériennes, dont quatre sont des bactéries Gram-positives (MRSA-

Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, MSSA-Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline, Listeria monocytogenes et Enterococcus faecalis) et cinq, des bactéries à Gram négatif (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Morganella morganii et

Pseudomonas aeruginosa) et une levure (Candida albicans). Les micro-organismes ont été fournis par des patients hospitalisés dans divers services de l'Unité Sanitaire Locale de Bragança et Centre Hospitalier de Trás-os-Montes et Alto-Douro Vila Real, au Nord-Est du Portugal.

IV.5.4.1.1 Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)

Les concentrations inhibitrices minimales CMI sont réalisées par la méthode de microdilution en série utilisant le dosage colorimétrique du chlorure de p-iodonitrotetrazolium

(INT) selon la méthode d’écrite par (Fernandes et al., 2016). Les espèces bactériennes sont cultivées pendant une nuit à 37 °C dans un milieu de bouillon de Luria. Les cellules bactériennes sont ajustées avec une solution saline stérile à une concentration d'environ 1,0× 106 dans un volume final de 100 µl par puits. Les inoculums sont conservés à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Les dilutions des inoculums sont cultivées sur gélose Müller-Hinton pour les bactéries et gélose de malt pour la levure afin de vérifier l'absence de contamination et vérifier également la validité de l'inoculum. Les extraits étudiés sont ensuite dissous dans 5% de diméthylsulfoxyde

(DMSO) et ajoutés dans un milieu Müller-Hinton bouillon (bactéries) / milieu malt bouillon

(Ccandidat albicans) avec inoculums. Les microplaques sont incubées pendant 48 h à 37 °C pour les bactéries ou 48 h à 28 °C pour la levure (Candidat albicans). Après l’incubation, 30 µl d’une 55 2éme partie Matériel et Méthodes solution d’INT (p-iodonitrotétrazolium violet) avec une concentration de 0,2 mg/ml est ajoutée et les plaques sont retournées à l'incubateur pendant au moins une demi-heure pour assurer une réaction de couleur adéquate. L'inhibition de la croissance est indiquée par une solution claire ou une diminution nette de la réaction de couleur. les plus faibles concentrations sans croissance visible (au niveau microscope binoculaire) sont définies comme des CMI (CLSI, 2009;

Tsukatani et al., 2012).

IV.5.4.1.2. Détermination de la concentration bactéricide minimale (CMB)

Les concentrations bactéricides minimales (CMB) sont calculées en ajoutant 10 μl de la

CMI à des concentrations plus élevées au milieu de culture frais pour voir si les bactéries sont capables de croître et ce, après 24 heures d'incubation à 37 °C. La plus faible concentration sans croissance visible est définie comme CMB indiquant 99,5% de la mort de l'inoculum original. Le

DMSO à (5%) est utilisé comme contrôle négatif.

IV.5.4.2.Activité antimicrobienne des huiles essentiel

L'activité antimicrobienne des huiles essentielles est testée contre l'ensemble des souches de différentes espèces bactériennes dont cinq bactéries à Gram positif: Bacillus cereus

(ATCC25921), Bacillus subtilis (ATCC6633), Micrococcus luteus (ATCC9341), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Listeria monocytogenése (ATCC 19111) et trois bactéries à Gram négatif

Escherichia coli (ATCC 8739), Klebsiella pneumoniae (IBMC Strasbourg), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) et une levure Candida albicans (ATCC 10231). Les références de micro-organismes sont ATCC, American Type Culture Collection; IBMC, Institut de biologie moléculaire et cellulaire ; ils ont été fournis par le Laboratoire de substances naturelles

(Université de Tlemcen).

IV.5.4.2.1.Détermination de l'activité antimicrobienne par la méthode de disque de diffusion

La méthode de diffusion du disque est utilisée pour le test de sensibilité antimicrobienne des huiles essentielles contre les souches précédemment citées. Selon Pfaller et 56 2éme partie Matériel et Méthodes al. (1998), une quantité de 0,1 ml d’une suspension bactérienne ajustée à (107 CFU / ml pour S. aureus et 106 UFC / ml pour les autres souches et levures) est étalée en surface d’une boîte de

Pétri contenant de l'agar Mueller-Hinton pour les bactéries, de l'agar Mueller Hinton supplémenté avec 2% de glucose (pour soutenir la croissance) et 0,5 μg / ml de bleu de méthylène (pour améliorer la définition du bord de la zone) pour la levure (Testore et al., 2004).

Les disques de papier filtre (6 mm de diamètre) sont imprégnés individuellement avec 10 μl des huiles puis placés sur le milieu gélose déjà inoculé avec les microorganismes testés. Les boîtes de Pétri sont stockées à 4 °C pendant 2 h puis incubées à 37 °C / 24h pour les bactéries, à 30 °C /

48 h pour C. albicans. Les diamètres des zones d'inhibition (mm) sont mesurés y compris le diamètre des disques. Les antibiotiques amoxicilline (30μg), ampicilline (10μg) et gentamycine

(30μg) sont utilisés comme témoins positifs pour les bactéries, tandis que la nystatine (30μg) est utilisée pour la levure quant au solvant DMSO (5%), il est utilisé comme témoin négatif.

IV.5.4.2.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont déterminées à l'aide des plaques de microdilution stérilisées selon Okusa et al (2007) avec modifications mineures. Les essais sont réalisés dans le Muller Hinton bouillon pour les bactéries ou Sabouraud Dextrose bouillon pour C.albicans. Les huiles essentielles étudiées sont d’abord dissoutes dans 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) et des séries de dilutions sont préparées dans des microplaques à 96 puits (200 µl /puits). Ensuite, les souches sont ajustées à 0.5 Mc Farland (107 cellules / ml pour les bactéries et 106 cellules / ml pour les levures), diluées à 1/100 pour atteindre (106 et 104 cellules / ml pour les bactéries et C. albicans, respectivement) et rajoutées à chaque puits (100 ul / puits). Enfin, les souches et C. albicans sont incubées pendant 24 heures à 37 °C et 30 °C respectivement. La MIC est défini comme la concentration la plus faible des échantillons pour laquelle les micro-organismes ne démontrent pas de croissance visible à l'œil nu comme indiquée par la turbidité.

57 2éme partie Matériel et Méthodes

Le DMSO est le contrôle négatif et le contrôle de la stérilité est préparé en utilisant le bouillon Muller Hinton seul.

IV.6. Analyses statistiques

Les dosages des quatre extraits (éthanol et infusions) sont effectués en trois essais. Les résultats sont exprimés en valeurs moyennes ± écarts types (SD). Les valeurs obtenues sont analysées à l'aide d’un logiciel de l'analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivi du test HSD de Tukey avec α = 0,05. Dans le cas de la composition phénolique, un test t de Student est

également utilisé pour déterminer la différence significative parmi deux échantillons différents, avec α = 0,05. Ce traitement est réalisé en utilisant le programme SPSS v. 23.0 (IBM Corp.,

Armonk, New York, USA).

3éme partie Résultats et Discussions V. Résultats et Discussion

V.1. Profil chimique - Activités biologiques in vitro des huiles essentielles de Juniperus phoenicea L. et Cotula cinerea (Del):

Les huiles essentielles commencent à avoir beaucoup d'intérêt notamment comme source potentielle de molécules naturelles bioactives. En effet, avec les progrès des moyens d’analyses actuelles, de nouveaux principes actifs et de nouvelles propriétés pharmacologiques ont permis de faire des huiles essentielles d’authentiques médicaments.

V.1.1 Rendements des huiles essentielles

L’hydrodistillation des parties aériennes de J phoenicea L.et de C. cinerea (Del) a donné respectivement une huile volatile jaune pâle caractérisée par une forte odeur de genevrier avec un rendement moyen de 0,99% pour la première et, une huile visqueuse verte jaunâtre avec un rendement moyenne de 0,72% pour la deuxième (Figure18). Des rendements de 0,52% et 0,82% sont obtenus à partir de J phoenicea L. de l'ouest et de l'est de l'Algérie respectivement (Mazari et al., 2010; Ramdani et al., 2013). Le rendement de J phoenicea L. trouvé dans notre étude est plus élevé que ceux rapportés dans les études relatives au nord du bassin méditerranéen, du

Portugal (0,41%), de l'Espagne (0,66%) et de la Grèce (0,58%) (Adams, et al., 1996).

Cependant, dans la partie sud du bassin méditerranéen (Egypte et Maroc), les auteurs ont noté des rendements relativement élevés que le notre respectivement de 1,96% et 1,62% (El-Sawi,

Motawae et Ali, 2007; Derwich et al., 2010).

Le rendement en huile essentielle de la Cotula cinerea (Del) est plus important voire voisin de ceux obtenus dans d’autres travaux notamment en Algérie (0.28%, 0.39%) (Djellouli et al.,

2015; Atef et al., 2015), au Maroc (0.78%) (Bouzidi et al., 2011) et en Égypte (0.3%)

(Fournier et al., 1989). Ces variations ont une corrélation significative avec certains facteurs

édaphiques (pH, teneur en K2O, texture du sol) (Aboukhalid et al., 2017).

La concentration en huile essentielle des plantes aromatiques et médicinales varie significativement avec le mode et la durée de séchage. La durée optimale de séchage est

3éme partie Résultats et Discussions d’environ 10 jours et à l’ombre (Bourkhiss et al., 2009). Il est actuellement admis que si les conditions de séchage ne sont pas respectées, la plante risque de se dégrader ce qui engendre quelquefois la perte de la totalité de ses huiles essentielles (Aghfir et al., 2007).

L’augmentation de la teneur en huile essentielle avec le séchage suggère la continuité et l’accélération de la biosynthèse des huiles essentielles après la récolte du matériel végétal

(Bourkhiss et al., 2009 ).

0,99% 1 0,72% 0.8

Juniperus phoenicae(L) 0.6 Cotula cinerea(Del) 0.4

0.2 Rendement en % en Rendement

Figure 18: Rendements en huiles essentielles des deux plantes étudiées

V.1.2.Caractérisation chimique des huiles essentielles par CPG / SM

La séparation et l’identification des constituants volatils d’un extrait présente bien moins d’alternatives que sa préparation. En effet, la chromatographie en phase gazeuse (CPG) est la méthode de référence dans l’analyse des huiles essentielles. Dans ce travail, la caractérisation chimique des huiles volatiles est déterminée par la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM) et les résultats (temps de rétention, indices de rétention et composants chimiques en %) sont présentés dans le Tableau5. Au total, 45 et 25 composants sont révélés représentant 100% des compositions respectives des huiles de J. phoenicea L et C. cinerea (Del) (figure19 et 20). Les monoterpènes hydrogénés et oxygénés sont les composés prédominants (59,98% -72,21%) voir figure 21 et 22. L'α-pinène et l'α-thujone, avec des proportions respectives de 46,43% et 32,35%, sont les constituants principaux des huiles 60

3éme partie Résultats et Discussions essentielles de J phoenicea L. et de C. cinerea (Del) suivis du linalol (5,98%), du δ-3carène

(5,82%), du δ-cadinène (5,14%) et du caryophyllène trans (3,08%) pour la première et, du camphor (20,16%), du santolinatriene (12,73%) et de l’eucalyptol (11,57%) pour la deuxième.

Table 5. Composition Chimique des huiles essentielles de J phoenicea L et de Cotula cinerea

(Del).

Composants TR lR J phoenicea L C. cinerea (min) (%) (Del) (%) Santolinatriene 6,818 852 - 12,734 Tricylene 7,353 861 - 0,126 α-thujene 7,613 865 - 1,572 α-pinène 7,960 871 46,437 3,024 Camphene 8,830 885 0,917 3,105 Verbenene 9,110 890 0,456 - Sabinene 10,120 918 - 0,805 β-pinène 10,264 925 1,25 0,805 β-Myrcene 11,307 972 1,302 0,471 δ3carene 12,498 1015 5,82 - α-Terpinène 12,790 1022 - 0,771 0rtho cymene 13,385 1037 0,879 - P cymene 13,435 1039 - 2,51 Limonene 13,621 1043 0,972 - Eucalyptol 13,864 1050 - 11,575 γ-Terpinene 15,652 1095 0,221 1,073 Linalool oxide cis 16,667 1108 0,468 - α- Terpinolene 17,645 1118 0,668 0,771 Linalool 19,129 1133 5,978 - Rose oxide trans 19,447 1136 0,366 - α- Thujone 20,264 1144 - 32,355 α- Campholene aldehyde 20,397 1145 1,02 - Camphor 21,568 1157 0,996 20,162 Trans pinocarveol 21,944 1161 1,535 - Borneol 23,397 1175 - 1,361 Phellandren-8-ol 23,616 1177 1,273 - 4 –Terpineol 24,084 1184 0,574 3,318 P cymen-8-ol 24,807 1189 0,324 - α- Terpineol 25,315 1194 - 1,771 Myrtenol 25,549 1196 0,342 - Verbanone 25,881 1200 0,045 - Trans carveol 27,250 1223 0,483 - Citronellol B 28,156 1239 2,061 - Cuminic aldehyde 28,395 1243 - 0,08 Isopulegol acetate 30,870 1287 0,632 - Endo Bornyl acetate 31,475 1297 - 1,17 Carvacrol 33,682 1327 - 0,178

3éme partie Résultats et Discussions Δ- Elemene 34,754 1341 0,44 - α- cubebene 35,520 1350 0,276 - α-Terpinyl acetate 35,757 1354 1,415 - Neryl acetate 36,795 1367 - 0,076 α- Copaene 37,164 1372 0,522 - β- Bourbonene 37,694 1379 0,279 - Geranyl acetate 38,058 1383 - 0,165 β- Elemene 38,340 1387 0,978 - Isolongifolene 38,812 1393 0,34 - Cis jasmone 38,868 1394 - 0,255 Caryophyllene trans 39,969 1406 3,084 - γ- Elemen 40,904 1414 0,779 - α- H umulene 42,056 1425 1,331 - B Farnesene 42,487 1429 - 0,119 Germacerene D 43,815 1441 1,793 Epi- 1447 1,976 - bicyclosesquiphellamdrene 44,436 α- Selinene 44,624 1449 1,297 - α- Muurolene 45,029 1453 0,985 - Δ- Cadinene 46,533 1467 5,139 - Cadina1, 4diene 46,938 1470 0,468 - Germacerene B 48,682 1487 0,114 - Nerolidol 49,020 1490 0,308 - Caryophyllene oxide 49,548 1495 - 0,439 β- Guailene 49,815 1497 2,013 - Geranyl isovalenate 51,545 1603 0,481 - 1,7,7Trimethyl-2-vinyl 1618 0,963 - bicyclo(2,2,1)het-2-ene 52,673 Total identifié (%) 100% 100% Monoterpènes 59,885 26,976 hydrogénés Monoterpènes oxygénés 17,512 72,211 Sesquiterpènes 21,814 0,558 hydrogénés Sesquiterpènes oxygénés 0,789 0 Composés non 0 0,255 terpéniques TR: Temps de rétention; IR: Indice de rétention

3éme partie Résultats et Discussions

A b u n d a n c e

T IC : P s-he-j.d\data.m s 6000000

5500000

5000000

4500000

4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0 1 0 . 0 0 2 0 . 0 0 3 0 . 0 0 4 0 . 0 0 5 0 . 0 0 6 0 . 0 0 7 0 . 0 0 8 0 . 0 0 9 0 . 0 0 1 0 0 . 0 0 1 1 0 . 0 0 T i m e - - >

Figure19: Chromatogramme de l’analyse par CPG/SM de l’huile essentiel de J.phoenicea L.

A b u n d a n c e

T IC: Ps-he-c.d\data.ms 4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0 1 0 . 0 0 2 0 . 0 0 3 0 . 0 0 4 0 . 0 0 5 0 . 0 0 6 0 . 0 0 7 0 . 0 0 8 0 . 0 0 9 0 . 0 0 1 0 0 . 0 01 1 0 . 0 0 T im e - - >

Figure 20: Chromatogramme de l’analyse par CPG/SM de l’huile essentiel de C.cinerea (Del).

3éme partie Résultats et Discussions

Composés non Sesquiterpènes terpéniques hydrogénés 0,255% 0,558% Monoterpènes hydrogénés 26,976%

Monoterpènes oxygénés 72,211%

Figure 21 : Pourcentage des différentes classes chimiques de l’huile essentielle de C.cinerea.

Sesquiterpènes oxygénés 0,789% Sesquiterpènes hydrogénés 21,814%

Monoterpènes Monoterpènes hydrogénés oxygénés 59,885% 17,512%

Figure 22 : Pourcentage des différentes classes chimiques de l’huile essentielle de J.phoenicea.

3éme partie Résultats et Discussions Les valeurs que nous avons obtenues montrent que l’α-pinène (46,437%) est le composant majoritaire de l’huile essentielle de J. phoenicea. Ce résultat est en accord avec ceux des différents travaux réalisés sur la composition chimique de l’H.E des feuilles et des baies de cette même plante, provenant de différentes localités géographiques: nord du bassin méditerranéen

(Adames et al., 1996; Rezzi et al., 2001), Maroc (Barrero et al., 2006; Derwich et al., 2010;

Mansouri et al., 2011a; Ait-Ouazzou et al., 2012; Achak et al., 2009), Egypte (El-Sawi,

Motawae et Ali, 2007), Tunisie (Ennajar et al., 2009), Libye (Alfitori et al., 2014) et Algérie

(Ramdani et al., 2013; Mazari et al., 2010; Bekhechi et al., 2012). Cependant, les autres composés dominants sont différents dans la nature et les proportions.

Tableau 6: Variations de la teneur (en %) de l’α-pinène et du total identifié de l’H.E de J.phoenicea de différents pays.

Localités et Références (%) α-pinène (%) Total identifié

Portugal (Adams et al., 1996) 34.1 98.3

Espagne (Adams et al., 1996) 53.5 99

Grèce (Adams et al., 1996) 41.8 88

Corse (Rezzi et al., 2001) 31.1-59.5 -

Egypte (Elsawi et al., 2007) 38.22 99.16

Maroc (Derwich et al., 2010) 49.15 81.87

Maroc (Mansouri et al., 2011 34.23-74.03 99.56-99.98

Maroc (Achak et al., 2008) 35.46 72

Libye (Alfitori et al.,2014) 20.85 88.29

Tunisie (Achak et al., 2008) 38.20 99

Ouest de l'Algérie (Mazari et al., 2010) 34.5 96.9

Est de l'Algérie (Messaoud et al., 2010) 36.3-55.9 85-91.4

Sud-est de l'Algérie (notre étude) 46.43 100

3éme partie Résultats et Discussions L’H.E de C. cereiria (Del) est citée dans de nombreuses études de la littérature et ce, en raison de ses propriétés biologiques intéressantes et de ses composés bioactifs variables. Dans leurs

études, Bouzidi et al. (2011) et Kasrati et al (2015) obtiennent le trans-thujone (41,4%), l'acétate de cis-verbényle (24,7%), le 1,8-cinéole (8,2%) et le camphre (5,5%) comme les principaux composants des plantes du Maroc. Tandis que dans la composition obtenue par Atef et al (2015), le 3-carène (30,99%), le thujone (21,73%), le santolinatriène (18,58%) et le camphre (6,21%) représentent les composants majoritaires de l'huile d'un échantillon de la région de Oued-Souf (sud-est de l'Algérie). Aussi, les H.E de Cotula cinera provenant de Zagora du

Maroc renferment les constituants principaux similaires à savoir le camphre (5,5%), le santolinatriène (7,2%) et le thujone (41,4%) (Tadrent et al., 2014). Par ailleurs, Djellouli et al

(2015) dans leurs travaux, ont trouvé des compositions très différentes de l’H.E de Cotula cinera. émanant de la même région que celle de notre plante (Béchar) avec le (E) - citral

(24,01%), le limonène époxyde cis- (18,26%), l’éther méthylique du thymol (15,04%), le carvacrol (15,03%), le transcarvéol (13,79%), le carvone (3,06%) et le trans-pipéritol (2,54%) comme les principaux composés. Ces différences qualitatives et quantitatives dans la composition chimique des huiles essentielles de nos deux plantes pourraient être attribuées à plusieurs facteurs tels que la situation géographique, les effets climatiques, la saison des récoltes, la nature du sol, l'âge des parties végétales (jeunes ou adultes), les matières végétales (séchées ou fraîches), la partie de la plante utilisée, le moment de la collecte et le chémotype (Ben Marzoug et al., 2011; El-Akhal et al., 2014). De plus, Aboukhalid et al (2017) ont déterminé la relation significative entre les composants des huiles essentielles et certains facteurs environnementaux

(température, précipitations)

V.1.3.Activités antioxydantes des huiles essentielles

L’activité antioxydante de l'huile essentielle de J phoenicea L et de C.cinerea (Del) est évaluée en utilisant le test de piégeage des radicaux libres DPPH. Les résultats sont donnés en valeur IC50

3éme partie Résultats et Discussions représente essentiellement la concentration requise pour qu'un antioxydant atteigne 50% du piégeage des radicaux DPPH(figure 23).

BHA 1.61

Acide ascorbic 1.12

C.cinerea 28.42

J.phoenicae 0.76

0 5 10 15 20 25 30 IC50/ piégeage des radicaux libres DPPH (mg/ml)

Figure 23: Valeurs des IC50 du test de piégeage des radicaux libres DPPH des deux huiles essentielles

L'huile essentielle de J phoenicea a montré une activité antioxydante élevée avec un IC50 = 0.76

± 0.0163 mg / ml par rapport à celles des standards, le butyle hydroxyl anisole (BHA) et l’acide ascorbique avec respectivement IC50 = 1, 61 et 1, 12 mg / ml ce qui montre que l’essence de cette plante est dotée d’une importante efficacité réductrice du radical DPPH. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans les études menées par Bouzouita et al (2008) et Emami et al

(2007) sur l'activité antioxydante des huiles essentielles tunisiennes et iraniennes de J. Phoenicea respectivement qui ont montré une bonne capacité antioxydante par rapport à celles citées dans les normes habituelles relatives au tocophérol et à l’hydroxytoluène butyle (BHT). Cependant, l’activité obtenue par Ennajar et al (2009) et Boulanouar et al (2013) est plus faible que la notre et également des standards. Aussi, l’activité antioxydante de l’ H.E de J. phoenicea est liée

à sa composition chimique et, la présence des monoterpènes (limonène, p-cymène et γ-terpinène) l’améliorent en tant que donneurs d'hydrogène. Il est difficile d’attribuer cette activité à un seul

3éme partie Résultats et Discussions composé puisque un effet de synergie entre les différents composés peut avoir lieu. Quant à l'huile essentielle de C.cinerea, elle montre un potentiel de piégeage des radicaux DPPH modéré avec une valeur de CI50 égale à 28,42 mg / ml ce qui la rend moins active que les standards à savoir l’acide ascorbique (CI50 = 1,12 mg / ml) et le BHA (CI50 = 1,61 mg / ml). Cette activité est relativement liée à la richesse de son huile par la présence de monoterpènes (l'α-thujone, le camphre et l'eucalyptol). Kasrati et al (2015) et Fathy et al (2017) ont étudié le potentiel antioxydant de l'huile essentielle de C.cinerea provenant du sud du Maroc et du désert égyptien occidental en utilisant un dosage de l'activité de piégeage des radicaux libres DPPH qui montre une capacité antioxydante modérée. Ce résultat classe notre échantillon à un rang similaire que ceux du Maroc et de l’Egypte.

Le pouvoir antioxydant des huiles essentielles est surtout lié aux phénols et polyphénols présents dans sa composition (Afssaps, 2008; Burt, 2004; Lahlou, 2004). Dans cette optique, plusieurs

études menées dans le Laboratoire de Recherche en Sciences Appliquées à l’Alimentation montrent que l’incorporation des huiles essentielles directement dans les aliments (viandes hachées, légumes hachés, purées de fruit, yaourts…) ou que son application par vaporisation en surface de l’aliment (viande, poulet, fruits, légumes entiers…) contribuent à préserver l’aliment des phénomènes d’oxydation (Caillet et Lacroix, 2007). Aussi, la « US. Food and Drug

Administration » reconnait aux H.E ces mêmes effets (Nerio et al., 2010).

V.1.4.Activité antimicrobienne

L’activité antibactérienne des H.E obtenues à partir de J phoenicea L et de C.cinerea (Del) sont quantifiées et qualifiées par les méthodes de diffusion sur disque et de dilution liquide contre un panel de microorganismes pathogènes associé aux intoxications alimentaires. L'objectif est d'évaluer leurs propriétés antibactériennes par la présence ou l'absence de zones d'inhibition et de diamètre de zone, ainsi que par les concentrations minimales inhibitrices (MIC) des souches les plus sensibles. Les résultats sont résumés dans le tableau 7

3éme partie Résultats et Discussions

Table 7. Activités antibactériennes (DD (mm) et CMI (mg / mL)) des huiles essentielles de J. Phoenicea et C. cinerea

Activité antibactérienne Bacteries Gram- positive Bacteries Gram- negative Levure Bacillus Bacillus Micrococcus Staphylococcus Listeria Escherichia Klebsiella Pseudomonas Candida cereus subtilis luteus aureus monocytogenes Coli pneumonia aeruginosa albicans DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI DD CMI J.poenicae 21 0.04 20 0.04 22 0.08 08 - 11 - 07- 27 0.04 16 0.31 21 0.063 C. cinerea 12 - 15 0.303 12 - 08 - 07 - 8 - 12 - 13 - 12 - cephalexin (30 μg/disk) 06 - - - - - 28 - - - 40 - - - 06 - - - Ampicilin(10µg/disk) 07 - 14 - - - 08 - - - 17 - - - 19 - 08 - Gentamycin(30µg/disk) 18 - 18 - - - 17 - - - 19 - 16 - 16 - - - Nystatin(30µg/disk) ------21 - Control Négatif (DMSO) 06 - 06 - 06 - 06 - 06 - 06 - 06 - 06 - 06 - DD: diamètre de la zone d'inhibition (mm) y compris le diamètre du disque de 6 mm, -: non testé. CMI: concentration inhibitrice minimale (mg / ml).

3éme partie Résultats et Discussions Ces résultats indiquent que l'huile de J. phoenicea présente une activité antibactérienne significative à modérée sur toutes les souches testées avec un diamètre d'inhibition compris entre

7 et 27 mm. Les souches les plus sensibles sont Bacillus cereus, Bacillus subtilis et Micrococcus luteus avec des CMI de l’ordre de 0,04 , 0,04 et 0,08 mg / mL. Une activité relativement significative est remarquée vis-à-vis des bactéries gram-négatives Kleibseilla pnemonia,

Pseudomonas aeruginosa avec des valeurs de CMI égales à 0,04, 0,31 mg / mL contre Candida albicans qui présente une CMI égale à 0,063 mg / mL. L'activité la plus faible est notée contre les souches Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Listeria monocytogénes avec un diamètre de zone d'inhibition compris entre 7 et 11mm.

Ainsi, les bactéries Gram-positives sont plus sensibles que les Gram-négatives. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Bouzouita et al., 2008 et Ait Ouazzou et al., 2012. De même,

Angioni et al.(2003) dans leur étude, ont signalé que les HE des feuilles de J. phoenicea présentaient une faible activité contre Staphylococcus aureus par contre, aucune contre

Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Contrairement, Derwich et al. (2010) ont trouvé que Escherichia coli était la souche la plus sensible de l'H.E de J. phoenicea avec la zone d'inhibition la plus forte (34 mm), tandis que des zones d'inhibition de 24 mm ont été mesurées pour S. aureus. Les valeurs des CMI ont également confirmé ces résultats. L'activité antibactérienne de l'huile de Juniperus phoenicea est fortement liée à la concentration de α- pinène (Dorman et Deans, 2000). D’autre part, l’essence de J. phoenicea a réussi à inhiber non seulement P. aeruginosa mais aussi Kleibseilla pnemonia ce qui est en accord avec les travaux de Derwich et al. (2010) qui ont signalé une activité moyenne de l’huile de J. phoenicea de

Tunisie contre P.aeruginosa avec une zone d'inhibition de 10 mm et une CMI de 0,22 mg / mL.

Ceci est important puisque cette bactérie à Gram négatif est dotée d'une barrière externe très restrictive et est connue pour avoir un haut niveau de résistance aux H.E et aux composants bioactifs d'origine végétale (Burt, 2004; Skočibušić et al., 2006). Derwich et al. (2010) ont supposé que l'activité antibactérienne présentée pour l’H.E de J. phoenicea pourrait être

3éme partie Résultats et Discussions expliquée par son profil chimique riche en hydrocarbures terpéniques, notamment l'α-pinène et aux constituants chimiques globaux de cette H.E. L'α-pinène s'est avéré être un composé efficace contre certains pathogènes d'origine alimentaire (Cha et al., 2007; Hajlaoui et al., 2009) et présente également d’autres activités biologiques: anti-inflammatoire, antivirale, expectorant, sédative, herbicide et insectifuge (Duke, 1998; Ghanmi et al., 2007).

L’activité antibactérienne peut être aussi attribuée au terpinène-4-ol et aux autres monoterpènes de cette huile essentielle qui agissent comme des antiseptiques, anti-inflammatoires et antimicrobiens (Nazik et al., 2011). En effet, le cadinène est un antiseptique aigue et possède des propriétés anti-inflammatoire et antibactérienne (Nazik et al., 2011). Ce qui leur confère d’être les éléments déterminants de l’activité observée contre les microorganismes testés dans cette

étude. Cependant, tout cela n’empêche qu’un effet synergique entre les constituants majoritaires et minoritaires de l’huile essentielle de cette espèce peut aussi être pris en compte dans cette activité.

Concernant l'huile essentielle de C. cinerea (Del), elle a montré une sensibilité modérée à faible aux souches testées avec différents degrés d'inhibition de la croissance (7-15 mm). Sa meilleure activité est contre Bacillus subtilis (CMI = 0.303mg / ml) et Bacillus cereus, Micrococcus luteus,

Kleibseilla pneumonie, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans avec un diamètre de zone d'inibition compris entre 12 et13mm. L’activité antibactérienne de l’H.E de C.cinerea peut être expliquée par la présence des composés oxygénés qui possèdent une activité antimicrobienne plus élevée que celles des composés hydrocarbonées (Bencheqroun et al., 2012; Pierozan et al., 2009). A titre d’exemple les composés carbonylés tels que la thujone, le camphor et l’eucalyptol sont décrits comme très actifs vis-à-vis d’un large spectre de microorganismes

(Bencheqroun et al., 2012; Pierozan et al., 2009). L’activité de ces molécules est liée à la fois au caractère lipophile de leur squelette hydrocarboné et au caractère hydrophile de leurs groupements fonctionnels. La teneur importante des monoterpènes oxygénés (72.21%) dans cette

H.E peut être aussi responsable de son activité prononcée contre Staphylococcus aureus et sa

3éme partie Résultats et Discussions haute activité contre Bacillus subtilis. En effet, il a été démontré que le Staphylococcus aureus est le plus affecté par les monoterpènes cétones comme la thujone (Dorman et Deans, 2000;

Oussalah et al., 2007). À l'inverse, une armoise A.campestris qui est composée essentiellement de monoterpènes hydrocarbonés, a révélé une activité antimicrobienne faible contre les germes pathogènes comme E. coli et S. aureus (Akrout et al., 2010). Ce qui indique que la présence d'une fonction oxygène dans la structure, augmente les propriétés bactériostatique et fongistatique des terpénoïdes.

L’α-thujone, qui est le composé majoritaire (32,35%) de l’huile de C. cinerea, lui confère une forte propriété antiseptique et de plus d’autres caractéristiques physiologiques; elle est abortive, antibactérienne, emménagogue, insecticide et larvicide (Duke, 1998). En complément à cela, d’autres composés de cette huile ont des activités biologiques intéressantes. Le camphor, par exemple, présente une activité antibactérienne, antidysentérique et aussi fongicide (Tantaoui-

Elaraki, et al., 1993). Le pourcentage du camphre de 20,16%, pourrait être potentiellement une raison de la sensibilité microbienne et antifongique (vis C. albicans) envers l’essence de cette plante (Tabanca et al., 2001).

Selon plusieurs auteurs, P. aeruginosa est apparu être moins sensible à l'action de nombreuses huiles essentielles (Dorman et Deans, 2000; Senatore et al., 2000; Pintore et al., 2002;

Wilkinson et al., 2003). Dans notre étude, nos deux échantillons testés ont montré une efficacité contre cette bactérie Gram négative.

Les huiles essentielles possèdent une panoplie d'activités antibactériennes dues à leurs richesses en composés terpéniques portant divers groupes fonctionnels (alcools, carbonyles,...) et à leurs effets synergiques. La bibliographie, selon certains auteurs, indique qu’il y a une relation entre les structures chimiques des composés les plus abondants dans l’huile testée, leurs proportions, les interactions présentes entre eux et l’activité antimicrobienne (Dorman et Deans, 2000). Cette dernière pourrait être expliquée par l’intéraction moléculaire des groupements fonctionnels des composants des H.E avec la paroi des bactéries provoquant de profondes lésions. On peut

3éme partie Résultats et Discussions conclure donc que cette activité peut être le résultat d’un effet synergique entre plusieurs composés de ces H.E (Senatore et al, 2000).

V.2. Screening phytochimique, profil phénolique et potentiel bioactif in vitro des plantes saharienne J. Phoenica L. & C.cinerea (Del)

V.2.1 Screening phytochimique

Les plantes médicinales sont considérées comme une riche source d'ingrédients qui peuvent être utilisés dans le développement et la synthèse de médicaments. En outre, ces plantes jouent un rôle essentiel dans le développement des cultures humaines dans le monde entier (Singh, 2015).

Les analyses phytochimiques sur les extraits des végétaux est une étape préliminaire et d’une grande importance puisqu’elle révèle la présence des constituants connus par leur activités physiologiques et possédant des vertus médicinales (Sofowra, 1993).

Les tests phytochimiques des parties aériennes de nos deux plantes saharienne Juniperus phoenicea L et Cotula cinerea (Del) sont réalisés sur différents extraits préparés par des solvants de polarités différentes. La détection de ces composés chimiques est basée sur des essais de solubilité des constituants, des réactions de précipitation et de turbidité, un changement de couleur spécifique ou un examen sous la lumière ultraviolette. Les résultats relatifs au screening phytochimique sont regroupés dans le Tableau 8

Tableau 8: Caractéristiques phytochimiques des plantes

Plantes étudiées Cotula cinerea Juniperus phoenicea L (Del) Amidon - + Saponosides ++ - Tanin - - Flavonoides ++ +++ Composés réducteurs - +++ Alcaloides - - Coumaarines - - Anthocyane - - Stérols et stéroides +++ +++ Hétérosides stérodique +++ +++ Hétéroside triterpéniques +++ +++

(+): Présence faible; (+++): Présence forte; (++): Présence moyenne; (-): Absence. 73

3éme partie Résultats et Discussions

Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence la présence de métabolites secondaires au niveau des tissus végétaux de nos plantes, à savoir les flavonoïdes, les stérols et les hétérosides stérodiques et triterpéniques avec des intensités variables dans les deux plantes.

Pour le J.phoenicea, il y a absence des saponosides, des tanins, des alcaloides et des anthocyanes. Ces données sont comparables à celles obtenues à partir de J.phoenica du

Kurdistan Irak (Alzand et al., 2014). Le dosage des composés phénoliques par HPLC-DAD-

ESI/MS confirment nos résultats puisqu’il révèle la présence des flavonoïdes et des acides phenoliques et l’abscence des tanins. Du point de vue biologique, ces groupes constituent des principes potentiellement actifs rencontrés dans toute ou une partie de la plante. Ce sont des précurseurs de drogues très utiles en thérapie clinique (Sofowora, 1993).

Le screening phytochimique de la C.cinerea a révélé sa richesse en flavonoïdes, saponosides, stérols, hétérosides stérodiques et hétérosides triterpéniques et l’absence des autres groupes testés (tanins, alcaloïdes et anthocyanes). Ces résultats sont en accord avec ceux de plusieurs

études qui montrent la richesse en flavonoides de cette plante (Khallouki et al., 2015;

Dendougui.et al., 2012; Ahmed, 1987). L’analyse par HPLC-DAD-ESI/MS confirme les résultats qui dérivent de ces tests.

V.2.2.Rendement des extraits

L’extraction des principes actifs, à partir de la matière végétale, suscitent actuellement beaucoup d’intérêt en raison de leurs pouvoirs biologiques. Les rendements massiques de nos extraits sont représentés dans la figure 24.

3éme partie Résultats et Discussions

43.73% 45.00%

40.00% 34.56% 32.27% 35.00% 30.00% 25.00% 20.94% J.phoenicea 20.00% C.cinerea 15.00%

Rendement % Rendement 10.00% 5.00% 0.00% Infusion extrait ethanolique

Figure24: Rendements des extraits (infusion, hydroéthanolique) des deux plantes étudiées

Peu de travaux relatifs à la détermination des rendements en extraits hydroalcooliques des deux plantes étudiées sont cités dans la littérature. Les auteurs (Benhammou, et al., 2014) ont trouvé un rendement de 15.79% d’extrait méthanolique pour la C.cinerea qui est bien en-deçà de ceux que nous avons déterminés dans notre étude et pour la même plante à savoir 32.27% et 20.94% pour l’infusion et l’extrait hydroéthanolique respectivement. Concernant la plante J.phoenicea, les résultats montrent des rendements plus élevés de 43,73% et 34,56% pour l’infusion et l’extrait hydroéthanolique respectivement. La différence entre ces valeurs peut être liée à la méthode d’extraction et au solvant utilisé. En effet, l’extraction des polyphénols se fait à l’aide de plusieurs solvants ou par des mélanges solvant/eau. Le mélange éthanol/eau à 80/20 (v/v) est considéré comme un mélange de polarité élevée et le solvant apolaire eau (infusion) est très utilisé en thérapie traditionnelle; ces deux solvants sont choisis pour la réalisation des extractions. Plusieurs travaux antérieurs montrent que le rendement d'extraction augmente de manière significative avec l'utilisation d'éthanol aqueux ou de méthanol aqueux par rapport à des extractions aux solvants organiques purs (Vázquez et al., 2008; Mussatto et al., 2011).

Trabelsi et al.(2010) ont noté que l’ajout de 20% d'eau aux solvants polaires améliore 75

3éme partie Résultats et Discussions l'extraction des composés phénoliques en particulier à l'éthanol, au méthanol ou à l'acétone.

Aussi, la présence de l’eau déstabilise les parois cellulaires et, par conséquent en pénétrant plus profondément dans la matrice végétale, le solvant peut entrer en contact avec une quantité plus grande du soluté favorisant ainsi l’extraction. (Mussatto et al., 2011).

Toutefois, il est difficile de comparer nos résultats avec ceux de la bibliographie, car le rendement n’est que relatif et semble être lié à de nombreux paramètres parmi lesquels les propriétés génétiques des plantes et leur origine géographique, les conditions et la durée du stockage, la période de la récolte, les méthodes d’extraction appliquées, le rapport poids de la plante /volume du solvant et les conditions dans lesquelles l’extraction réalisée.

V.2.3.Caractérisation des composés phénoliques

Les composés phénoliques sont des composés phytochimiques bien connus présents dans toutes les plantes. Des développements importants dans la recherche axée sur l'extraction, l'identification et la quantification de composés phénoliques en tant que molécules médicinales et

/ ou diététiques ont eu lieu au cours des 25 dernières années. L'extraction par solvant organique est la principale méthode utilisée pour extraire les composés phénoliques. Des techniques spectrophotométriques et chromatographiques sont utilisées pour identifier et quantifier ces composés phénoliques individuels. L'infusion de plantes aromatiques est l'une des boissons les plus consommées au monde et est riche en composés polyphénoliques connus sous le nom de flavonoïdes du thé (Langley-Evans, 2000).Dans cette partie de notre travail, nous avons accédé

à la révélation du profil phénolique (qualitatif et quantitatif) des extraits (infusion, hydroéthanol) des deux plantes étudier J.phoenicae et C.cinerea par HPLC-DAD-ESI/MS. Pour la première fois la quantification des composés phénoliques individuels de nos deux plantes se fait par cette méthode et les résultats obtenus sont représentés par la figure 25.

3éme partie Résultats et Discussions

20.1 Infusion 8.12

flavonoides totale C cinerea C 51 extrait éthanolique 14.1

Acides 3.2 phenoliques Infusion Totale

3.1 Quantification (mg/g d'extrait)

J phoeniceaJ 5.5 extrait éthanolique 4.1

0 20 40 60

Figure 25: Quantification des composées phénoliques dosées par HPLC/SM dans l’extrait hydroéthanolique et l’infusion des deux plantes étudiées

Les teneurs totales en composés phénoliques obtenues sont respectivement 9,6 ± 0.1 et 6,3± 0.1 mg/g (d’extrait) pour l’extrait hydroéthanolique et l’infusion de J.phoenicae. Ces teneurs en flavonoides totaux sont plus ou moins élevées par rapport à celles relatives aux acides phénoliques dans les deux extraits. Ces valeurs restent faibles devant celles déterminées par

Boulanouar et al.(2013) qui on quantifié les phénols totaux des feuilles et fruits de J.phoenicea de la zone steppique de l'Algérie nommée région du Djebel Amour. Deux méthodes sont utilisées en tenant compte du groupe des phénols. La première est la méthode spectrométrique directe et la deuxième est celle de Folin-Ciocalteau. Des teneurs de 70.31 mg/g d’extrait sec à 

= 280 nm en polyphénols totale, 9.61 mg/g d’extrait sec en flavonols à  = 360 nm sont enregistrées par la méthode directe, alors que la deuxième a donné 46.61 mg/g d’extrait sec en polyphénols totaux et 7.80 mg/g d’extrait sec en flavonols et flavones.

Concernant la C.cinerea, un total de composés phénoliques (65 ± 1 et 29 ± 1 mg/g d’extrait) pour l’extrait hydroéthanolique et l’infusion respectivement est déterminé. Le groupe dominant

3éme partie Résultats et Discussions des polyphénols est celui des flavonoïdes totaux (51 ± 2 et 20 ± 1 mg/g d’extrait) suivi par celui des acides phénoliques (14.1 ± 0.1 et 8.12 ± 0.04 mg/g d’extrait) pour respectivement, l’extrait hydroéthanolique et l’infusion. Ce que l’on remarque d’important, c’est que le taux en polyphénols pour l’extrait méthanolique déterminé par Benhammou et al (2014) est de 22.22 mg GAE/g d’extrait sec en utilisant le réactif Folin Ciocalteu et, une teneur totale en flavonoïdes de 3.93mg CE/g d’extrait sec. Aussi, il apparait que le solvant hydroéthanolique est le meilleur extracteur des composés phénoliques pour les deux plantes.

La variation des composés phénoliques peut être liée aux méthodes de dosage et d’extraction des plantes séchées et du solvant utilisé. Dans le présent travail, la quantification des composés phénoliques est effectuée par la spectrométrie de masse (SM) qui est une technique physique d'analyse sensible, sélective et rapide. Elle permet de détecter et d'identifier des composés phénoliques par mesure de leur masse et de caractériser leurs structures chimiques.

Boulanouar et al (2013) ont signalé dans leur étude que la méthode directe ou l'analyse spectrale fournit des niveaux plus élevés de phénols pour le J.phoenicea que les notres et pour ceux mesurés par la méthode de Folin-ciocalteau. Les phénols simples ont une absorption maximale entre 220 et 280 nm. Néanmoins il existe une possibilité d'interférence par des substances absorbant les UV telles que les protéines, les acides nucléiques et les acides aminés; ce qui peut donner une surestimation des composés phénoliques. Ces biomolécules des extraits peuvent être responsables de la teneur en phénol la plus élevée trouvée par Boulanouar et al

(2013) dans les extraits. Cependant, la quantification des phénols mesurée par le Folin-

Ciocalteau n'est pas non plus absente des interférences avec l’ascorbate, les sucres et les acides aminés aromatiques (Waterhouse, 2003; Vinson, 2001).

Comme le montrent les tableaux 9 et 10 et, les figures 26, 27 et 28, treize et neuf composés phénoliques individuels sont respectivement identifiés pour J.phoenicea et C.cinerea. En effet, neuf flavonols, un biflavone, le flavan-3-ol, le flavone et l'acide phénolique sont identifiés chez

J.phoenicea avec comme principaux composés phénoliques: l'acide 3-p-coumaroylquinique et la

3éme partie Résultats et Discussions quercétine-O-pentoside, la myricétine-O-pentoside, la myricétine-O-hexoside. D'autre part, quatre flavones, deux flavonols et trois acides phénoliques sont recencés chez C.inerea avec la lutéoline-7-O-glucoside, la lutéoline-O-malonylhexoside et l'acide 5-O-caféoylquinique comme molécules principales.

En ce qui concerne J.phoenicea, les pics 2JP, 6JP et 9JP sont positivement identifiés en fonction de leur temps de rétention, de leur masse et de leurs caractéristiques UV-vis par comparaison avec les standards commerciaux. Les composés restants sont identifiés en fonction de leurs ions pseudomoléculaires et de leur profil de fragmentation. Les flavonols sont les flavonoïdes les plus abondants dans cette espèce avec une proportion de 51 à 57% de la composition phénolique, représentés par les pics 3JP, 4JP, 5JP, 7JP et 8JP et identifiés comme myricétin glycosides sur la

2 base de leurs spectres UV (λmax autour de 356 nm) et de la production d'un ion fragment MS à

JP JP JP m/z 317. De même, les pics 9 , 10 et 11 sont identifiés comme glycosides de quercétine (λmax

2 JP autour de 353 nm, fragment MS à m / z 301) et, le pic 13 comme isorhamnétine (λmax autour de 350 nm, fragment MS2 à m/z 315) glycoside. Le pic 3JP ([MH] - à m/z 611) est identifié comme myricetin-O-pentosyl-O-hexoside et dans lequel les fragments MS2 révèlent la perte alternative de pentosyl (m/z à 479; -132 u) et hexosyl (m/z à 317; -162 u) indiquant ainsi la localisation de chaque résidu sur différentes positions de l'aglycone. Le reste des composés présente des fragments MS2 correspondant à des pertes distinctes de fragments de dihexosyle (-

324 mu), d'hexosyle (-162 mu), de rhamnosyle (-146 mu) et de pentosyle (-132 mu) et, un ordre d'élution cohérent avec le type de sucres substituants en fonction de leur polarité attendue, bien que la position et la nature des fragments de sucre ne soient pas identifiées; leurs temps de rétention ne correspondant à aucun des étalons disponibles.

3éme partie Résultats et Discussions

Table 9. Temps de rétention (Rt), longueurs d'onde d'absorption maximale dans le visible (max), données de spectre de masse, identification et quantification des composés phénoliques dans Juniperus phoenicae L.( moyenne ± SD).

Quantification (mg/g extract) Rt max [M-H]- MS2 Tentative Peak Hydroethanol Infusion Student´s t- (min) (nm) (m/z) (m/z) Identification extract extract test 1JP 6.2 310 337 191(),173(),163(),155(),137(),119() Acide 3-p-Coumaroylquinique 1 4.1± 0.1 3.09± 0.03 <0.001 2JP 7.7 278 289 245(100),231(22),205(13),179(20),137(10) Catéchine2 0.230± 0.001 0.230± 0.001 <0.001

3JP 13.3 356 611 479(100),317(66) Myricetin-O-pentoside-O-hexoside3 0.514± 0.005 0.305± 0.003 <0.001

JP 3 4 14.1 354 641 479(100),317(28) Myricetin-O-dihexoside 0.50± 0.01 0.230± 0.001 <0.001 5JP 14.5 356 479 317(100) Myricetin-O-hexoside3 0.40± 0.01 0.337± 0.001 <0.001 6JP 16.5 346 431 341(20),311(100) Apigénine -6-C-glucoside4 0.023± 0.001 tr - 7JP 17.6 357 463 317(100) Myricetin-O-deoxyhexoside3 0.337± 0.001 0.27± 0.01 <0.001

JP 3 8 18.0 356 449 317(100) Myricetin-O-pentoside 1.00± 0.02 0.33± 0.01 <0.001 9JP 18.8 350 463 301(100) Quercétine-3-O-glucoside3 0.38± 0.01 0.230± 0.01 <0.001 10JP 20.5 354 463 301(100) Quercétine -O-hexoside3 0.362± 0.001 0.29± 0.01 <0.001 11JP 22.4 355 433 301(100) Quercétine-O-pentoside3 1.033± 0.003 0.48± 0.01 <0.001

12JP 23.4 270,330 551 537(100) Methyl-biflavone5 0.31± 0.01 0.243 ± 0.004 <0.001

13JP 26.9 350 447 315(100) Isorhamnetin-O-pentoside3 0.42± 0.01 0.29± 0.01 <0.001 Acides phenoliques totaux 4.1± 0.1 3.1± 0.03 <0.001 Flavonoïdes totaux 5.50± 0.03 3.2± 0.04 <0.001

Composés phénoliques totaux 9.6± 0.1 6.3± 0.1 <0.001 tr- traces. Courbes d'étalonnage standard: (1) acid p-coumaric (y = 301950x + 6966.7; R2=0.999); (2) catechin (y = 84950x – 23200; R2=0.999); (3) quercetin-3-O- glucoside (y = 34843x – 160173; R2=0.999) ; (4) apigenin-6-C-glucoside (y = 107025x + 61531; R2=0.999); (5) apigenin-7-O-glucoside (y = 10683x – 45794; R2=0.996). Lorsque seulement deux échantillons étaient présents, le test Student´s t- a été utilisé pour déterminer la différence significative entre deux échantillons différents, avec α = 0.05.

3éme partie Résultats et Discussions

Table 10. Temps de rétention (Rt), longueurs d'onde d'absorption maximale dans le visible (max), données de spectre de masse, identification et quantification des composés phénoliques dans Cotula cinerea (Del) (moyenne ± SD). Quantification (mg/g extract) Rt max [M-H]- MS2 Identification Pic Extrait Infusion Student´s (min) (nm) (m/z) (m/z) Provisoire ETOH t-test 1CC 7.2 324 353 191(100),179(10),161(5),135(3) Acide 5-O-Caffeoylquinic 1 5.9 ± 0.1 5.9 ± 0.1 0.999 2CC 15.5 342 609 447(20),285(100) Lutéoline-dihexoside2 2.38 ± 0.05 3.1 ± 0.1 <0.001 3CC 15.9 352 463 301(100) Quercetin-O-hexoside3 1.70 ± 0.04 1.17 ± 0.04 <0.001

CC 2 4 17.9 343 579 285(100) Luteoline-O-pentosyl-hexoside 3.3 ± 0.1 1.9 ± 0.1 <0.001 5CC 18.9 345 447 285(100) Luteoline-7-O-glucoside2 36 ± 1 5.8 ± 0.1 <0.001 6CC 20.4 325 515 353(80),191(100),179(47),173(5),135(7) Acide3,5-O-Dicaffeoylquinic 1 4.0 ± 0.1 1.27 ± 0.03 <0.001 7CC 22.4 350 549 505(80),463(5),301(100) Quercetine-O-malonylhexoside3 1.39 ± 0.02 1.66 ± 0.03 <0.001

8CC 22.9 327 515 353(78),191(28),179(65),173(100),135(5) Acide4,5-O-Dicaffeoylquinic 1 4.1 ± 0.2 0.915 ± 0.005 <0.001

9CC 23.8 345 533 489(80),447(10),285(100) Luteoline-O-malonylhexoside2 6.6 ± 0.3 6.9 ± 0.2 0.168 Acides phenoliques totaux 14.1 ± 0.1 8.12 ± 0.04 <0.001 Flavonoïdes totaux 51 ± 2 20 ± 1 <0.001

Composés phénoliques totaux 65 ± 1 29 ± 1 <0.001

Courbes d'étalonnage standard: (1) acide chlorogenique (y = 168823x – 161172; R2=0.999); (2) apigenine-7-O-glucoside (y = 10683x – 45794; R2=0.996); (3) quercetine-3-O- glucoside (y = 34843x – 160173; R2=0.999). Lorsque seulement deux échantillons étaient présents, un test t de Student a été utilisé pour déterminer la différence significative entre d

3éme partie Résultats et Discussions deux échantillons différents, avec α = 0,05. F:\Xcalibur\...\Dalila\CotulEtOH_1 21-09-2017 07:44:16

RT: 0.00 - 60.00 3.32 NL: 1200000 1.23E6 UV_VIS_1 1100000 UV CotulEtOH_ 1000000 1 900000

800000

700000 18.91

600000 mAU

500000

400000

300000 3.20 200000 39.07 2.84 23.77 7.16 15.85 22.96 100000 3.72 15.47 9.84 11.17 25.43 27.14 29.14 32.55 1.72 33.93 36.94 42.04 43.35 47.22 52.40 54.29 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min)

RT: 0.00 - 60.00 18.92 NL: 6.90E5 650000 UV_VIS_3 600000 UV 3 CotulEtOH_ 550000 1

500000

450000

400000

350000 mAU 300000

250000 3.32 200000 39.07 150000 23.77 100000 15.85 15.46 50000 20.15 2.83 7.15 9.78 25.42 25.84 0.05 3.72 13.28 29.12 31.03 33.97 36.94 41.90 44.76 49.00 49.95 51.88 53.83 55.80 58.38 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min) Figure 26: Profil phénolique de l'extrait hydroéthanolique de C. cinerea enregistré à 370 nm.

3éme partie Résultats et Discussions

F:\Xcalibur\...\Dalila\CotulInf_1 21-09-2017 09:48:31

RT: 0.00 - 60.00 4.46 NL: 4.00 260000 2.63E5

240000 UV_VIS_1 UV 220000 CotulInf_1 7.08 200000

180000

160000

140000

mAU 19.16 23.77 120000

2.86 2.79 100000 6.57 15.52 80000 11.36 16.76 9.92 15.01 20.44 60000 22.43

27.11 28.13 40000 30.75 31.65 33.62 35.48 37.60 41.66 43.33 20000 2.01 52.85 55.05 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min)

RT: 0.00 - 60.00 23.77 NL: 120000 1.22E5 UV_VIS_3 110000 UV 3 100000 CotulInf_1

90000

80000 19.14 70000

60000 mAU 22.42 50000 15.49 7.07 40000 4.47 17.55 30000 4.28 9.87 20.18 11.21 13.53 20000 2.79 25.87 6.53 7.84 28.14 29.09 30.24 32.46 34.18 36.90 39.04 10000 40.20 43.19 2.02 48.43 50.10 51.74 53.64 55.71 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Time (min) Figure27: Profil phénolique de l’infusion de C. cinerea enregistré à 370 nm.

3éme partie Résultats et Discussions

Figure28: Profil phénolique de l'extrait hydroéthanolique de J. phoenicea enregistré à 370 nm.

3éme partie Résultats et Discussions

Le pic 7JP est identifié comme le myricétine-3-O-rhamnoside précédemment reconnu dans les baies et les feuilles de J. phoenicea par Ali et al (2010). Le pic 12JP ([M-H]- a m/z 551) est identifié comme étant un méthyl-biflavonoïde tenant compte de la découverte d’Innocenti et al

(2007) et Miceli et al. (2009) qui l’ont identifié dans les fruits de Juniperus communis. Le pic 1JP

([M-H]- à m/z 337) est reconnu comme étant l'acide 3-p-coumaroylquinique si on tient compte des clés hiérarchiques précédemment développées par Cliffor et al (2003). Quant aux acides phénoliques, ils représentent 43% à 49% de la composition totale des constituants phénoliques.

Les résultats que nous avons obtenus sont différents de ceux rapportés pour les baies et les feuilles de J.phoenicea égyptiennes qui ont révélé la présence de deux composés biflavonoïdes majeurs (la cupressuflavone et l'amentoflavone) dans la fraction acétate d'éthyle, quatre flavonoïdes (myricitrine, quercétine, cosmosine, quercitrine) et deux acides phénoliques (acide p-coumarique et acide caféique) dans la fraction méthanol (Ali et al., 2010). Le seul composé similaire à celui identifié dans notre étude est la myricitrine (pic 7JP). De plus, Alqasoumi et al.,

(2013) ont étudié des fractions d'éther de pétrole, de chloroforme et de méthanol de J. phoenicea de l’ Arabie Saoudite et ont confirmé la présence de cinq diterpénoïdes connus à savoir les acides 13-épiclupressique, imbricatolique, 7-α-hydroxysandaracopimarique, 3-β- hydroxysandaracopimarique et isopimarique ainsi que quatre dérivés flavonoïdes: le cupressuflavone, le hinokiflavone, l’hypolaetin-7-O-β-xylopyranoside et la (+) catéchine. De leur côté, Maamoun et al (2016) ont identifié 4 flavonoïdes (isoétin-7-O-β-glucoside, isoscutellare, amentoflavone et agathisflavone) à partir des extraits d'éthanol, d’éther de pétrole, de chloroforme, d'acétate d'éthyle et de méthanol de J. phoenicea d’Egypte. Ces différences peuvent être attribuées à plusieurs facteurs tels que la localisation géographique, la partie de la plante utilisée et surtout l'utilisation des différents solvants d'extraction (Çelik et al., 2010).

Chez C.cinerea, les acides phénoliques constituent également les composés mineurs (22 à 28%) alors que les flavonoïdes présentent 72 à 78% de la composition. Les pics 1cc, 6cc et 8cc sont 85

3éme partie Résultats et Discussions identifiés respectivement en tant qu'acide 5-O-cafféoylquinique, acide 3,5-O-dicaféoylquinique et acide 4,5-O-caffeoylquinique selon les clés hiérarchiques précédemment développées par

Clifford et al. (2003). Ces composés sont également présents dans les parties aériennes des extraits methanoliques de Cotula cinerea provenat du Maroc (Khalloukhi et al., 2015)

Les composés restants correspondent aux flavonoïdes, principalement la lutéoline (λmax autour de

2 2 345 nm, MS fragment à m/z285) et la quercétine (λmax autour de 350 nm, MS fragment à m/z

301) glycoside. Les pics 2cc ([M-H]- à m/z609), 3cc ([M-H]- à m/z463), 4cc ([M-H]- à m/z 579), et

5cc ([M-H]- à m/z 447) sont identifiés à l’aide d’un raisonnement similaire à celui des composés décrits dans J. phoenicea. En outre, les pics 7cc et 9cc représentent respectivement un ion pseudomoléculaire ([M-H]- à m/z 549 et 533) libérant un fragment MS2 à m/z 301 et 285 ([MH-

162-86] - perte d'un fragment malonylhexoside) et qui sont affectés à la quercétine et à la lutéoline O-malonylhexoside, respectivement.

Dendougui et al (2012) ont étudié l'extrait éthanolique de C.cinerea d'Algérie révélant la présence de germacranolide, de tatridine A et de dix-sept flavonoïdes tels que les dérivés de la lutéoline, de l'apigénine et de la quécretine.

D’autre part, Khalloukhi et al (2015) ont étudié les extraits de méthanol de Cotula cinerea du

Maroc et ont révélé la présence d'acides phénoliques (acides chlorogéniques et dérivés de l'acide dicaféoylquinique) et d'un flavonoïde (lutéoline-4'-O-glucoside). En comparaison avec nos résultats relatifs au profil phénolique, les acides phénoliques sont très similaires à ceux présentés dans cette étude, montrant ainsi seulement un dérivé flavonoïde. Ahmed (1987) décrit différents flavonoïdes de cette espèce à savoir: le 7-O-β-D-diglucoside et le 7-O-β-D-glucoside de la lutéoline et la lutéoline elle-même ainsi que l’apigénine-7-O-α -L-rhamnoside. Tous ces profils montrent certaines similitudes avec ceux présentés dans notre étude. Ainsi, ces différences sont probablement dues à la variation de la localisation géographique, à la partie de la plante utilisée,

à la variation de la polarité des solvants d'extraction (Çelik et al., 2010), aux facteurs génotypiques (El-Waziry, 2007), aux conditions abiotiques (facteurs édaphiques) (Ksouri et al., 86

3éme partie Résultats et Discussions

2008), à la nature du sol, au type du microclimat (Atmani et al., 2009) ainsi qu’aux étages bioclimatiques où poussent ces plantes.

V.2.4. Activités antioxydantes des extraits

Le stress oxydatif est impliqué dans plusieurs maladies y compris le diabète, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies cardiovasculaires, l'athérosclérose, les maladies neurodégénératives

(Parkinson, Alzheimer et Huntington), le cancer et le vieillissement (Hybertson et al., 2011; El

Jemli et al., 2016) . Les antioxydants naturels tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes, composés de plantes, peuvent offrir une résistance contre le stress oxydatif en piégeant les radicaux libres, en inhibant les lipides de peroxydation et par d'autres mécanismes (Dai et

Mumper, 2010). Sur la base des réactions chimiques impliquées, les dosages de capacité antioxydante majeure peuvent être grossièrement divisés en deux catégories: des essais basés sur la réaction de transfert d'atome d'hydrogène (HAT) et des essais basés sur la réaction de transfert d'électron unique(ET). Les dosages à base d'ET impliquent une réaction d'oxydoréduction avec l'oxydant en tant qu'indicateur du point final de la réaction. La plupart des tests basés sur HAT contrôlent la cinétique de la réaction compétitive et, la quantification est dérivée des courbes cinétiques. Les méthodes à base de HAT sont généralement composées d'un générateur de radicaux libres synthétiques, d'une sonde moléculaire oxydable et d'un antioxydant. (Huang et al., 2005) Cette étude a été entreprise dans le but de montrer les potentiels antioxydants des deux plantes saharienne J.phoenicae et C.cinerea.

Les résultats de cette activité à la fois d’extraits hydroéthanoliques et infusion des plantes

étudiées sont présentés dans le (tableau 11). Pour une évaluation plus large et authentique de la capacité antioxydante, quatre méthodologies sont réalisées: l'activité de piégeage des radicaux libres DPPH, le pouvoir réducteur de fer (FRAP), l'inhibition du blanchiment du β-carotène et l'inhibition de la peroxydation des lipides à travers le test TBARS. Les résultats sont comparés au contrôle positif Trolox et exprimés en valeurs EC50. Ces dosages peuvent être classés globalement comme dosages se basant sur le transfert d’électrons (ET) (pouvoir réducteur de fer 87

3éme partie Résultats et Discussions

(FRAP), sur les essais de 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ou sur le transfert d'atomes d'hydrogène (HAT) (essais de TBARS et d'inhibition du blanchiment du β carotène) (Huang et al., 2005).

Tableau 11. Activité antioxydante de J. Phoenica et de C. cinerea (moyenne ± écart-type).

J.phoenicea C.cinerea extrait Infusion extrait Infusion Contrôle Hydroéthanolique Hydroéthanolique Positive* Activité antioxydante (EC50en µg/mL) Activité de piégeage de 12±1d 22.4±0.6c 26.0±0.1a 24.8±0.2b 42±1 DPPH FRAP 12.0±0.4d 18.2±0.3c 31.9±0.2b 38±1a 41±1 inhibition du blanchiment du 11.57±0.08c 20±1a 14.7±0.2b 20.2±0.8a 18±1 β-carotène inhibition 7.6±0.3a 6.7±0.2b 7.4±0.3a 7.5±0.2a 23±1 TBARS

Trolox Contrôle Positif*. L'activité antioxydant est exprimée en valeurs CE50 (moyenne ± écart-type), ce qui signifie que des valeurs plus élevées correspondent à un pouvoir réducteur ou antioxydant plus faible. EC50: concentration d'extrait correspondant à 50% de l'activité antioxydante ou à 0,5 de l'absorbance dans le dosage de pouvoir réducteur de fer. Dans chaque rangée, différentes lettres signifient des différences significatives entre les extraits (p <0,05).

L'activité de piégeage est évaluée par le test DPPH est comparée à l’antioxydant standard Trolox.

Pour le test DPPH, la valeur EC50 représente essentiellement la concentration requise pour qu'un antioxydant atteigne 50% du piégeage des radicaux DPPH (Chen et al., 2013). Les valeurs inférieures de la EC50 sont liées à une plus grande activité de piégeage des radicaux libres d'un antioxydant ou d’une grande activité antiradicalaire (figure 29 et 30) (Osman, 2011).

3éme partie Résultats et Discussions

45 42 40 35

30 26 a 24.8 b 22.4 c 25 20 15 12 d 10 5 0 ETOH ETOH extrait Infusion extrait Infusion Trolox J.phoenicea C.cinerea

Figure29: Valeurs de EC50 des extraits (hydroethanoliques, Infusions) et du Trolox par la méthode de piégeage des radicaux libres DPPH des plantes étudiées.

0.16 0,044 0,038 0.14 0,083 0,040 0.12 0.1 0.08 0.06 0,023 0.04 0.02 0 J.phoenicae (extrait J.phoenicae C.cinerea(extrait C.cinerea( Infusion) Trolox ethanolique) (Infusion) ethanolique) 1/EC50 (µg/ml-1)

Figure30: Valeurs de l’activité antiradicalaire (1/EC50) des extraits (hydroéthanoliques, Infusions) des plantes étudiées et du standard (Trolox)

Ces résultats montrent que J.phoenicea présente des valeurs EC50 très faibles pour les extraits d'éthanol et d’infusion (12 ± 1 et 22,4 ± 0,6 µg / ml, respectivement), indiquant une grande capacité de l'extrait correspondant à donner de l'hydrogène et piéger le radical DPPH libre, ce qui pourrait être dû à sa composition phénolique (Ennajar et al., 2009). Les résultats obtenus dans notre travail sont plus élevés que ceux rapportés par El Jemli et al.(2016) et Keskes et al (2014) 89

3éme partie Résultats et Discussions qui évaluent l'aptitude à piéger les radicaux libres DPPH de l'extrait aqueux de J. phoenicea du

Maroc à EC50 = 30,74 ± 0,11 µg / ml et de l'extrait d'acétate d'éthyle de J. phoenicea Tunisienne avec EC50 =220 µg / ml .Néanmoins, l'extrait de méthanol semble avoir une plus grande capacité

à piéger le radical DPPH avec une valeur EC50 de 2 µg / ml. Taviano et al (2011) ont étudié les extraits de méthanol et aqueux de cinq espèces différentes de Juniperus de la Turquie qui présentaient une faible activité antioxydante par rapport à nos extraits. Aussi, l'extrait d'infusion de C.cinerea montre une plus forte activité de piégeage de DPPH (EC50 24,8 ± 0,2μg / ml) par rapport à son extrait hydroéthanolique. Néanmoins, l'activité de tous les échantillons reste supérieure au standard commerciale Trolox (EC50 = 42 ± 1μg / ml).

Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Khaloukhi et al (2015) qui ont montré de fortes capacités antioxydantes d'extrait méthanolique de la plante C.cinerea du Marroc (mesuré par les tests DPPH et FRAP), et ont lié cette activité à une teneur significative en échinoïdes et en flavonoïdes de cette plante. Krishnaiah et al (2011) on attribué l’activité antioxydante des plantes aux métabolites végétaux tels que les flavonoïdes et autres composés phénoliques.

L’activité de réduction de fer (FRAP) qui mesure la capacité des extraits à donner des électrons au Fe (III) est généralement associée à leurs propriétés antioxydantes (Siddhuraju et al., 2002) .

En fait, la capacité antioxydante des différents extraits est exprimée par la détermination de la concentration efficace (EC50) qui correspond à une absorbance égale à 0.5. D’après ces résultats, on déduit que les extraits à partir des deux espèces de plantes étudiées ont révélé un bon pouvoir réducteur qui augmente avec les concentrations de ces extraits, allant de 12.04 à 38,1 µg / ml, ce qui donne des valeurs de EC50 plus élevées que celle du Trolox (41 ± 1 µg / ml) (figure31).

3éme partie Résultats et Discussions

45 41 38.1 a 40 31.9 b 35 30 25 18.2 c 20 12.08 d 15 10 5 0 ETOH ETOH extrait Infusion extrait Infusion Trolox J.phoenicea C.cinerea

Figure 31: Valeurs de EC50 des extraits hydroethanoliques et Infusions et du Trolox par la méthode de réduction de fer FRAP des plantes étudiées.

Une fois de plus, l’extrait hydroéthanolique et l’infusion de J.phoenicea présentent la meilleure

3+ 2+ capacité à réduire le Fe en complexe Fe (valeurs de EC50 de 12,04 et 18,2 µg / ml, respectivement), suivie par l'extrait hydroéthanolique et l'extrait aqueux du C. cinerea (valeurs de EC50 de 12,04 et 18,2 µg / ml, respectivement). On peut donc classer la puissance de la réduction du fer par les différents extraits comme suit: J.phoenicae (infusion)> C.cinerea (extrait hydethanolique) > C.cinerea(infusion) > J.phoenicae (extrait hydethanolique)> Trolox.

Les métaux de transition peuvent générer des radicaux hydroxyls et superoxydes et conduire à la peroxydation des lipides, la modification de la protéine et aux lésions de l’ADN. Les agents chélateurs peuvent inactiver ces ions métalliques et potentiellement inhiber ces processus.

La sensibilité d'un antioxydant à neutraliser les radicaux libres et à inhiber la peroxydation des lipides peut être évaluée par l'essai d'inhibition de blanchiment au β-carotène (Kato et al., 2009).

Le test de blanchiment de β carotène / acide linoléique est basé sur la capacité de l'antioxydant à réduire l'oxydation de l'acide linoléique et à inhiber les radicaux libres générés par le système d'émulsion comme les hydroperoxydes de diènes conjugués provenant de l'oxydation de l'acide linoléique (Koleva et al., 2002). Dans ce test, les extraits hydroéthanoliques de J.phoenicea et de 91

3éme partie Résultats et Discussions

C. cinerea ont montré les meilleures activités (valeurs EC50 de 11,57 et 14,7 µg / ml, respectivement) et plus élevées que celle du Trolox (valeurs de EC50 de 18,0 µg / ml); tandis que l'infusion pour les deux plantes étudiées montre une activité plus faible voire proche en comparaison avec celle du Trolox (figure 32).

25 20 a 20.2 a 18 20 14.7 b 15 11.57 c

carotène(EC50 en en µg/ml) en en carotène(EC50 0 -

β ETOH ETOH extrait Infusion extrait Infusion Trolox J.phoenicea C.cinerea

Figure32: Valeurs d’EC50 des extraits hydroethanolique, d’infusions et du Trolox par la méthode de β caroténe des plantes étudiées

L'efficacité de l'extrait hydroéthanolique peut être expliquée par sa concentration plus élevée en composés phénoliques en particulier celle du flavonol et des acides phenoliques; ce qui pourrait influencer leur capacité à piéger les radicaux libres et de prévenir la peroxydation des lipides

(Yanishlieva-Maslarova, 2001; Gardi et al., 2015). En fait, de nombreux rapports indiquent l'effet antioxydant des composants polyphénoliques y compris celui de la myricétine, la quercétine, la catéchine et de leurs dérivés (Materska et Perucka, 2005; Wang et al., 2006).

De même, la relation entre l'activité antioxydante et la teneur en composés phénoliques de J. phoenicea et de C. cinerea pourrait également être établie dans cette étude.

Le test antioxydant TBARS qui permet d’évaluer l'inhibition de la formation de substances réactives à l'acide thiobarbiturique (ATB) utilisant le cerveau de porc comme tissu animal réal, est habituellement utilisée comme indicateur du processus d'oxydation des lipides. Sur la base

3éme partie Résultats et Discussions des résultats obtenus, les extraits de J.phoenicea et C.cinerea ont montré des propriétés antioxydantes intéressantes, en particulier pour les essais TBARS (figure 33).

23 25

15 7.6 a 6.7 b 7.4 a 7.5 a 10

ETOH ETOH TBARS (EC50 (EC50 µg/ml) en en TBARS extrait Infusion extrait Infusion Trolox J.phoenicea C.cinerea

Figure 33: Valeurs d’EC50 des extraits hydroéthanolique, de l’infusion et du Trolox par la méthode TBARS des plantes étudiées.

Les valeurs EC50 de tous les échantillons montrent qu'ils sont deux à trois fois plus efficaces que le standard Trolox avec EC50 de 7,6 ± 0,3 et 7,4 ± 0,3 µg / ml pour les extraits hydroéthanoliques et EC50 de 6,7 ± 0,2 et 7,5 ± 0,2 µg / ml pour l’infusion de J.phoenicea et C. cinerea, respectivement. L'inactivation des composants cellulaires et l'endommagement des biomolécules, y compris l'ADN, sont les principaux effets indésirables de la peroxydation lipidique. Ces extraits pourrait posséder une propriété de peroxydation lipidique, ayant un grand intérêt pour la santé et la conservation des aliments (Rathee et al., 2006).

Les végétaux présentent une grande diversité des composés phénoliques à activités antioxydantes. En effet, chez les plantes, les teneurs en composés phénoliques et leurs natures sont fortement modifiées sous l’action, d’une part, des facteurs externes ou exogènes qu’ils soient de natures biotiques ou abiotiques et d’autre part, des facteurs internes ou endogènes tels les facteurs génétiques conduisant à des différences importantes entre les espèces du même genre

(Ksouri et al., 2010).

3éme partie Résultats et Discussions

Globalement, l'activité antioxydante mise en évidence peut être liée au contenu phénolique des extraits de nos plantes étudiées. Comme déjà connu, les composés phénoliques agissent avec plusieurs mécanismes d'action, tels que les réactions donneuses d'hydrogène, la chélation des métaux et la régulation positive ou la protection des défenses antioxydantes (par exemple les niveaux de glutathion intracellulaire) (Pereira et al., 2013). L'efficacité des composés phénoliques en tant qu'anti-radicaux et antioxydants dépend de nombreux facteurs, tels le nombre de groupes hydroxyls liés au cycle aromatique, le site de liaison et la position mutuelle des hydroxyls dans le cycle aromatique (Sroka et Cisowski, 2003). Par conséquent, leur effet antioxydant est capable d'atténuer l'effet du stress oxydatif (Mejía et al., 2010; Pereira et al.,

2013).

V.2.5.Activité anti-inflammatoire

L'inflammation est un ensemble de réactions générées par le corps en réponse à une agression induite par une infection ou une blessure. Cela peut favoriser l'apparition de maladies humaines aiguës et chroniques. Dans la présente étude, l'effet anti-inflammatoire est évalué à l'aide de cellules RAW 264.7 de type macrophage murin et, la quantification de la production d'oxyde nitrique (NO) est résumée dans le tableau 12 ci-aprés.

Tableau 12. Capacité d'inhibition de la formation de NO de J. Phoenicea et de C. cinerea (moyenne ± écart-type). J.phoenicea C.cinerea Extrait Infusion Extrait Infusion Positive Hydroethanolic extract Hydroethanolic extract control* Activité anti-inflammatoire (EC50 valeurs en µg/mL) production d’oxide Nitrique (NO) 51±4d 70±5c 105±9b 122±6a 16±1 *Dexamethasone Control Positive*. Les résultats de l'activité anti-inflammatoire sont exprimés en valeurs CE50: concentration de l'échantillon fournissant 50% d'inhibition de la production d'oxyde nitrique (NO). Dans chaque rangée, différentes lettres signifient des différences significatives entre les extraits (p <0,05).

Tous les échantillons ont révélé une inhibition de la production d'oxyde nitrique (NO) avec des valeurs de EC50 comprises entre 51 et 122 µg / ml. On peut remarquer que l'activité la plus

élevée est montrée par les deux extraits de J. phoenicea (extrait éthanolique et infusion, avec des valeurs de EC50 de 51 et 70 µg / ml, respectivement). Les résultats obtenus sont en accord avec 94

3éme partie Résultats et Discussions ceux rapportés par Jeong et al (2012) qui ont trouvé une puissante activité anti-inflammatoire de l'extrait méthanolique de Juniper rigide Coréen et de ses fractions (n-Hexane, CHCl3, EtOAc et n-BuOH). Cette capacité est attribuée à la composition phénolique présente dans l'extrait, en particulier la présence de phénylpropanoïdes glycosides avec des groupes p-hydroxy (2, 4), massoniaside A, (+)-catéchine et amentoflavone qui inhibent efficacement la production de NO induite par le LPS dans les cellules RAW264.7 (Jeong et al., 2012).

L’activité anti-inflammatoire des extraits de J.phoenicea peut aussi être attribuée à la présence des composés phénoliques telles que: Quercétine-3-O-glucoside, Quercétine -O-hexoside

Quercétine -O-pentoside3. Cela est confirmé par Gardi et al (2015) qui ont étudié les effets de l'administration orale de la quercétine dans un modèle d'arthrite adjuvante chez le rat. Les groupes expérimentaux ont été traités avec une dose orale quotidienne de 150 mg / kg de poids corporel de quercétine pendant 28 jours. Les résultats ont indiqué que la quercétine était capable d'améliorer tous les marqueurs de l'inflammation et du stress oxydatif mesurés. Le potentiel d'inhibition des NO des extraits de J.phoenicea pourrait être attribué à la présence des composés bioactifs comme les flavonols et les acides phénoliques, principales molécules présentes dans cette espèce et connues pour leur effet anti-inflammatoire in vivo et in vitro (Umesalma et

Sudhandiran, 2010; Piwowarski et al., 2014; Li et al., 2017). Les différences entre les

échantillons pourraient être attribuées à la distribution différente des biomolécules dans les fractions et l'extrait brut.

Selon l'auteur, il s'agit du premier travail rapportant l'activité anti-inflammatoire des feuilles de J. phoenicea et des parties aériennes de C. cinerea, considérant que C. cinerea éthanolique et les extraits d’infusion ont révélé une inhibition plus faible de la production de NO, avec des valeurs de EC50 de 105 et 122 µg / ml, respectivement. L'activité présente dans les deux extraits pourrait

être attribuée à la présence des composés phénoliques tels que la Lutéoline-7-O-glucoside, la

Lutéoline-O-malonylhexoside et l'acide 5-O-Caffeoylquinique.

3éme partie Résultats et Discussions

Les deux plantes sahariennes étudiées J.phoenicea et C.cinerea contiennent dans leur profil phénolique des composants actifs des végétaux, des voies inflammatoires et des maladies chroniques qui sont les dérivés de la quercétine. Les propriétés anti-cancéreuses, anti- inflammatoires et anti-oxydantes de ces flavonoïdes sont démontrées par de nombreuses études.

La quercétine est efficace contre diverses maladies chroniques dont l'arthrite, le cancer du sein, la dermatite, l'hépatite, le psoriasis, etc. et ce, raison de sa capacité à inhiber les voies inflammatoires déréglées impliquées dans ces maladies chroniques (Kunnumakkara et al.,

2018).

Ces résultats peuvent être associés à l'importance de l'utilisation de ces espèces végétales dans la médecine traditionnelle africaine (Dendougui et al., 2012; Khaloukhi et al., 2015). Les flavonoides qui représentent les composés majoritaires de nos deux plantes sont recherchés de part leur activité anti-inflammatoire dans les phases prolifératives et exsudatives de l'inflammation (Rathee et al., 2011).

V.2.6. Effets cytotoxiques

Les résultats concernant les effets antiprolifératifs des extraits éthanoliques et d’infusion de J. phoenicea et de C. cinerea contre les quatre lignées cellulaires tumorales humaines MCF-7,

NCI-H460, HeLa et HepG2) testées par le test SRB, sont résumés dans le tableau 13. Tous les

échantillons testés ont présenté des propriétés cytotoxiques significatives pour les quatre lignées cellulaires tumorales humaines avec des valeurs GI50 comprises entre 9 et 101 µg / ml. De plus, les échantillons présentaient également de légers effets cytotoxiques sur les cellules non tumorales (PLP2 -cellules primaires hépatiques porcines). Néanmoins, les valeurs de GI50 sont beaucoup plus élevées que celles nécessaires pour exercer une activité antiproliférative et,

également beaucoup plus élevées que celles présentées par l'ellipticine. L'extrait ethanolique et l’infusion de la plante saharienne J. phoenicea ont montré un potentiel plus élevé vers le carcinome cervical HeLa (9 et 17 µg / ml, respectivement), le carcinome du sein MCF-7 (11 et

19 µg / ml, respectivement) et le carcinome hépatocellulaire HepG2 (15 et 22 µg / ml, 96

3éme partie Résultats et Discussions respectivement) et les cellules du cancer du poumon non à petites cellules NCI-H460 (30 et 51

µg / ml, respectivement).

Tableau 13. Propriétés cytotoxiques des extraits de J.phoenicea et de C. cinerea dans des lignées cellulaires tumorales humaines et des cellules primaires hépatiques non tumorales (moyenne ± écart-type). J.phoenicea C.cinerea Extrait Infusion Extrait Infusion Ellipticine Hydroethanoliq Hydroethanoliq

ue ue Lignes de cellules tumorales humaines (GI50 valeurs en. µg/mL)

MCF-7 (carcinome du 11±1d 19±1c 53±4b 77±6a 0.91±0.04 sein) NCI-H460 (cancer du 101±10a 1.03±0.09 poumon non à petites 30±1c 51±3b 50±3b cellules) HeLa (carcinome 9±1d 17±2c 47±5b 51±4a 1.91±0.06 cervical) HepG2 (carcinome 15±1d 22.4±0.7c 31±2b 42±4a 1.1±0.2 hépatocellulaire) Cellules non tumorales (GI50 valeurs en. µg/mL) PLP2 (cellules primaires 88±8d 137±12b 120±8c 198±5a 3.2±0.7 de foie de porc) GI50 valeurs (moyenne ± écart-type) correspondent à la concentration de l'échantillon atteignant 50% d'inhibition de croissance dans les lignées cellulaires tumorales humaines ou dans la culture primaire hépatique PLP2. Dans chaque rangée, des lettres différentes signifient des différences significatives entre les extraits (p <0,05).

Les résultats obtenus sont en accord avec ceux rapportés par Maamoun et al (2016) qui ont trouvé une activité plus élevée en utilisant le test SRB contre des lignées cellulaires telles que le carcinome pulmonaire (H460), la tumeur du foie (HepG2) et le carcinome du sein (MCF7) en utilisant l’extrait brut des feuilles de J. phoenicea d'Egypt. Consécutivement, ces auteurs ont criblé le flavonoïde agathisflavone qui a enregistré une capacité antitumorale plus élevée sur le carcinome pulmonaire (H460) (Maamoun et al., 2016). De plus, un important effet hépatoprotecteur in vivo des extraits de feuilles et de baies de J. phoenicea a été testé contre les lésions hépatiques entraîné par le CCL4 (Ali et al., 2010; Laouar et al., 2017). En outre,

Tavares et al.(2012) ont également démontré le potentiel neuroprotecteur d'une fraction phénolique obtenue à partir du J. phoenicea de portugal et d'autres espèces de Juniperus, attribuant cette capacité aux biflavones telles que l'amentoflavone. De plus, il est admis que J. phoenicea renferme des lignans qui sont reconnues pour leurs activités antiproliférative et

3éme partie Résultats et Discussions antivirale intéressante (Comte et al., 1996). De nombreux rapports supposent que les espèces de

Juniperus pourraient être une source de composés bioactifs ayant des effets anticancéreux potentiels (Yaglioglu et Eser, 2017; Taviano et al., 2013; Shokrzadeh et Saravi, 2010;

Moujir et al., 2008; Van Slambrouck et al., 2007).

D'autre part, l'extrait hydroéthanolique et l’infusion de C. cinerea ont également présenté une activité antiproliférative plus active dans l'ordre suivant: HepG2 (31 et 42 μg / mL), HeLa (47 et

51 μg / mL), NCI-H460 (50 et 101 μg / mL) et MCF-7 (53 et 77 μg / mL). En fait, la cytotoxicité des extraits de C. cinerea est moins énergique que celle de l'extrait ethanolique et de l'infusion de

J. phoenicea. Ces différences peuvent être dues aux différents profils phénoliques individuels présents dans les deux extraits.

Il a déjà été souligné que certains composés phénoliques peuvent contribuer à la protection contre les maladies cancéreuses tels l'acide p-coumaroylquinique, la quercétine et les dérivés de myricétine, qui sont les principaux composés phénoliques de J. phoenica. Ces composés ont montré un rôle protecteur in vivo dans l'hépatotoxicité et la néphrotoxicité (Ali et al., 2010).

L'effet antimutagène de la catéchine est à nouveau démontré (Kuroda, 1996). Heim, et al.,

(2002) attribuent l’effet cardioprotecteur des flavonoides (composés majoritaires de nos plantes)

à leur capacité d'inhiber la peroxydation des lipides, de chélater les métaux actifs redox et d'atténuer d'autres processus impliquant des espèces réactives de l'oxygène.

V.2.7. Activité antimicrobienne des extraits

La résistance aux agents antimicrobiens est actuellement reconnue comme un problème majeur de santé publique mondiale. Les extraits de plantes antimicrobiennes sont considérés comme une source future de nouveaux corps antimicrobiens. Les composés phénoliques sont bien connus pour avoir une activité contre un grand nombre de microorganismes (Miceli et al., 2011).

Les résultats de l'activité antibactérienne des extraits de J.phoenicea et C.cinerea (éthanol, infusion, 20 mg / ml) testés contre dix souches pathogènes, et exprimés en concentration

3éme partie Résultats et Discussions minimale inhibitrice (CMI) et en concentration bactéricide minimale (MBC), sont regroupés dans le tableau 14.

Tableau 14. Activités antimicrobienne et antifongique de J. phoenicea et C. cinerea (valeurs MIC, MBC et MFC, mg/ml). Activité antibactérienne J phoenicea C cinerea Extrait Infusion Extrait Infusion éthanolique éthanolique Gram-negative CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB Escherichia coli 10 >20 10 >20 >20 >20 >20 >20 Klebsiella pneumoniae >20 >20 >20 >20 20 20 20 20 Proteus mirabilis >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 Morganella morganii 10 20 10 20 >20 >20 >20 >20 Pseudomonas >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 aeruginosa Gram-positive MRSA 5 >20 5 >20 10 >20 10 >20 MSSA 10 >20 10 >20 5 >20 5 20 Listeria monocytogenes 20 >20 20 >20 20 >20 20 >20 Enterococcus faecalis 10 >20 10 >20 20 >20 >20 >20 Levure CMI CMF CMI CMF CMI CMF CMI CMF Candida albicans >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 MRSA- Staphylococcus aureus résistante à la Methicillin; MSSA S.aureus sensible a la methicillin; CMI- concentration inhibitrice minimale; CMB- concentration minimale bactéricide ; CMF-concentration minimale Fongicide.

Globalement, les extraits obtenus des deux plantes étudiées ont montré une activité modérée à faible, avec une sensibilité plus élevée envers les souches de bactéries Gram-positives qu’envers celles à Gram négatif. Leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) se situent entre 5 et 20 mg / ml et, l'effet inhibiteur testé contre toutes les souches est plus bactériostatique que bactéricide.

Les souches MRSA et MSSA se sont révélées plus sensibles à la fois aux extraits de J. phoenicea (CMI = 5 et 10 mg / ml, respectivement) et de C.cinerea (CMI = 10 et 5 mg / ml, respectivement). D'autre part, les extraits de J. phoenicea ont également révélé une sensibilité à

Morganella morganii montrant des valeurs MIC et MBC de 10 et 20 mg / ml respectivement. En ce qui concerne les bactéries à Gram négatif, J. phoenicea et C.cinerea ne présentaient qu'une activité inhibitrice pour Escherichia coli (MIC = 20 mg / ml) et Klebsiella pneumonia (MIC et

3éme partie Résultats et Discussions

MBC = 20 mg / ml), respectivement. Il est important de souligner que les deux extraits de J. phoenicea ont le même comportement sur toutes les bactéries testées, tandis que C.cinerea présente une variation entre les extraits utilisés pour les souches E. faecalis et MSSA. En ce qui concerne la levure Candida albicans, les extraits testés n'expriment aucune sensibilité jusqu'à la concentration testée (20 mg / ml).

L'activité inhibitrice de l'extrait de J.phoenicea est confirmée par les études réalisées par

Hammami et al.(2009) qui ont démontré une activité antimicrobienne modérée à bonne de l'extrait aqueux ainsi ses fractions (méthanol, acétone) obtenues à partir de graines de

J.phoenicea provenant de Tunisie, notamment contre les bactéries à Gram-positives Listeria monocytogenes, Listeria innocua et Listeria ivanovii et les bactéries à Gram-négatives

Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Dans un ordre similaire, Alzanda et al (2014) ont montré une inhibition significative de la croissance d’Escherichia coli, Staphylococcus aureus et

Klebsiella pneumonia en utilisant l'extrait alcoolique des barks de J.phoenicea de l'Inde. Tandis que, Miceli et al (2009) ont montré une activité antibactérienne des extraits méthanoliques des différentes espèces de Juniperus Turc (Juniperus communis L. var. communis and Juniperus communis.L var. saxatilis. Pall) de capacité modérée seulement contre les bactéries à Gram- positives. Il convient également de souligner que la partie de la plante utilisée et la concentration en composés phénoliques auront une grande influence sur l'activité antibactérienne obtenue pour chaque extrait.

L'activité antimicrobienne relativement plus élevée des extraits de parties aériennes de

J.phoenicea pourrait être due à la présence de certains composés phénoliques tels que la catéchine et l'apigénine.(Ceylan & Alic, 2015). Aussi, elle peut être également liée à la présence de composés phénoliques tels que les dérivés de la quercétine, l'acide p-coumaroylquinique qui est un dérivé hydroxy de l'acide cinnamique largement présent dans les produits végétaux et qui est le principal métabolite des autres acides phénoliques biologiques (Li et al., 2016). Pragasam et al (2013) on rapporté que l'acide p-coumaroylquinique possédait une activité antibactérienne. 100

3éme partie Résultats et Discussions

Ajileye et al. (2015) ont rapporté le bon effet antibactérien de la quercétine-3-O-rhamnoside isolée de la fraction acétate d'éthyle des feuilles de l'Anacardium occidentale L. contre un large panel de bactéries (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescence, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia et Clostridium sporogenes).

Étant donné que les flavonoïdes représentant les composés majoritaires de nos extraits de

J.phoenicea sont synthétisés par les plantes suite à une infection microbienne, il n’est donc pas surprenant qu’ils possèdent des propriétés antimicrobiennes (Cowan, 1999). La catéchine par exemple, est douée de propriétés antibactériennes, antifongiques et antivirales (Friedman,

2007). En plus des activités directes et synergiques, les flavonoïdes inhibent un certain nombre de facteurs de virulence bactérienne, y compris les récepteurs du signal de détection du quorum, les enzymes et les toxines. La preuve de ces effets moléculaires au niveau cellulaire, on trouve l'inhibition in vitro de la formation de biofilm, l'inhibition de l'attachement bactérien aux ligands de l'hôte et la neutralisation de la toxicité vis-à-vis des cellules humaines cultivées. Les preuves in vivo d'une perturbation de la pathogenèse bactérienne comprennent l'efficacité démontrée contre l'infection par Helicobacter pylori et l'intoxication par S. aureus (Cushnie & Lamb,

2011). Daglia(2012) ont rapporté que les flavonoïdes à caractère lipophile peuvent détruire les membranes microbiennes en augmentant la fluidité des lipides membranaires.

Concernant l'activité antibactérienne de C.cinerea, elle est en accord avec les rapports de

Bensizerara et al (2013) qui ont évalué les propriétés antibactériennes des extraits obtenus à partir des parties aériennes de C.inerea en utilisant différents solvants de polarités différentes

(éthanol, nbutanol, acétate d'éthyle et éther de pétrole). Ces auteurs révélent une faible activité pour tous les extraits mentionnés avec comme fraction la plus active le n-butanol. De plus,

Markouk et al (1999) rapportent que l'extrait n-butanol de C.cinerea du Maroc est très efficace contre les germes à des concentrations allant de 12 à 200 μg / ml. Néanmoins, la capacité d'inhibition des bactéries montrées par C. cinerea peut être associée aux niveaux importants des flavonoïdes tels que la quercétine et la lutéoline Dendougui et al. (2012) et Ahmed (1987). 101

3éme partie Résultats et Discussions

Ainsi, les extraits de plantes riches en flavonoïdes ont déjà été décrits comme présentant une activité antibactérienne (Aladesanmi et al., 1986;Cushnie & Lamb, 2006 Torrenegra et al.,

1989, Tereschuk et al., 1996). Aussi, les acides phénoliques possèdent des activités antivirale, antibactérienne et antifongique (Daglia, 2012).

102

Conclusion générale et Perspectives

Le recours aux plantes à des fins thérapeutiques est connu depuis la nuit des temps. Par intuition et par expérimentation, l’homme a sélectionné les plantes alimentaires pour se nourrir et les plantes médicinales pour se soigner. A l’heure actuelle, les plantes demeurent indéniablement une source importante de médicaments grâce aux thérapeutiques qu’elles procurent. Ces derniers appartiennent à une gamme extraordinaire de molécules bioactives synthétisées par la plante possédant des propriétés biologiques: antioxydants, antimicrobiens, anti-inflammatoire et cytotoxique et, qui peuvent résoudre les problèmes de l’implication du stress oxydatif dans plusieurs pathologies telles que le cancer, le diabète, la maladie d’Alzheimer, les rhumatismes et les maladies cardiovasculaires.

A cet effet, ces molécules naturelles de nature phénolique sont très recherchées en phytothérapie vu les effets secondaires indésirables des molécules de synthèse.

L’objectif primordial assigné par cette étude englobe le même contexte afin d’évaluer les propriétés bioactives, telles que les activités antioxydantes, antibactériennes, anti-inflammatoires et cytotoxiques des huiles essentielles et des extraits de quelque plantes aromatiques originaires de sud-ouest algérien. Il s’agit de deux plantes endémiques sahariennes Juniperus phoenicea L. et Cotula cinerea (Del) qui poussent spontanément dans la région d’El Bayadh (Arbaouat) et de

Béchar (Abadlla) respectivement.

La première partie de notre travail est consacré à l’étude de la composition chimique et de celles des activités antioxydantes et antimicrobiennes des huiles essentielles de nos deux plantes.

L’hydrodistillation des parties aériennes de J phoenicea L.et de C. cinerea (Del) a donné respectivement une huile volatile jaune pâle caractérisée par une forte odeur de genévrier avec un rendement moyen de 0,99% pour la première et, une huile visqueuse verte jaunâtre avec un rendement moyenne de 0,72% pour la deuxième. La caractérisation de ces huiles est menée à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM).

Au total, 45 et 25 composants sont révélés représentant 100% des compositions respectives des huiles de J phoenicea L et C. cinerea (Del). Les monoterpènes hydrogénés et oxygénés sont les 103

Conclusion générale et Perspectives composés prédominants (59,98% -72,21%) avec l’α-pinène (46,43%) et l'α-thujone(32,35%) comme les principaux constituants des huiles essentielles de J phoenicea L. et de C. cinerea

(Del) respectivement. Le linalol (5,98%), le δ-3carène (5,82%), leδ-cadinène (5,14%) et le caryophyllène trans (3,08%) sont les deuxièmes constituants les plus importants pour l’huile de J phoenicea L., tandis que le camphor (20,16%), la santolinatriène (12,73%) et l’eucalyptol

(11,57%) sont les second plus importants constituants dans l'huile de C. cinerea (Del). L’activité antioxydante des l'huiles essentielles est évaluée en utilisant le test de piégeage des radicaux libres DPPH. L'huile essentielle de J phoenicea a montré une activité antioxydante élevée avec un IC50 = 0.76 ± 0.0163 mg / ml par rapport à celles des standards, le butyle hydroxyl anisole

(BHA) et l’acide ascorbique avec respectivement IC50 = 1, 61 et 1, 12 mg / ml. Quant à l'huile essentielle de C.cinerea (Del), elle montre un potentiel de piégeage des radicaux DPPH modéré avec une valeur de CI50 égale à 28,42 mg / ml ce qui la rend moins active que les standards.

L'activité antibactérienne in vitro des huiles essentielles est évaluée contre neuf bactéries pathogènes d'origine alimentaire et une levure Candida albicans en utilisant la méthode de diffusion sur disque puis, les valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) sont déterminées par micro dilution. Les résultats suggèrent que l'huile essentielle de J phoenicea.L a une activité antibactérienne significative à modérée sur toutes les souches testées. Les souches les plus sensibles sont Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans avec une CMI variant de 0,04 à 0,63 mg / mL. Alors que, l'huile de C. cinerea a montré une sensibilité modérée à faible aux souches testées. Sa meilleure activité est contre Bacillus subtilis avec une CMI = 0,303 mg / ml.

La deuxième partie de notre étude nous a permi de déterminer un screening phytochimique reflétant une caractérisation du profil phénolique individuel ainsi que l’évaluation des bioactivités (antioxydante, anti-inflammatoire, cytotoxique et antibactérienne) des extraits

(infusions, hydroéthanoliques) obtenus à partir du Juniperus phoenicea L. et de Cotula cinerea

(Del). L’analyse phytochimique nous a permis de mettre en évidence la présence de métabolites 104

Conclusion générale et Perspectives secondaires au niveau des tissus végétaux de nos plantes à savoir les flavonoïdes, les stérols et les hétérosides stérodiques et les triterpéniques avec des intensités variables dans les deux plantes. Le profil phénolique (qualitatif et quantitatif) est déterminé par chromatographie liquide

à haute performance couplée à la détection par réseau de diodes et au spectromètre de masse à ionisation par électrospray (HPLC-DAD-ESI / MS). Un total de 13 et 9 composés phénoliques individuels sont identifiés respectivement dans J.phoenicea.L et C.cinerea (Del). L'acide p- coumaroylquinique, la quercétine-O-pentoside, la myricétine-O-pentoside et la myricétine-O- hexoside sont les principaux composés présents dans J.phoenicea.L. et, pour C.cinerea(Del), les principales molécules sont la lutéoline-7-O-glucoside, la lutéoline-O-malonylhexoside et l'acide

5-O-caffeoylquinique. Les teneurs totales en composés phénoliques obtenues sont respectivement 9,6 ± 0.1 et 6,3± 0.1 mg/g (d’extrait) pour l’extrait hydroéthanolique et l’infusion de J.phoenicae.L. Concernant la C.cinerea (Del), elles sont de 65 ± 1 et 29 ± 1 mg/g d’extrait pour l’extrait hydroéthanolique et l’infusion. Le groupe dominant des polyphénols est celui des flavonoïdes totaux (51 ± 2 et 20 ± 1 mg/g d’extrait) suivi par celui des acides phénoliques (14.1

± 0.1 et 8.12 ± 0.04 mg/g d’extrait) pour respectivement l’extrait hydroéthanolique et l’infusion.

L’activité antioxydante des extraits de nos deux plantes est réalisée par quatre méthodologies: l'activité de piégeage des radicaux libres DPPH, le pouvoir réducteur de fer (FRAP), l'inhibition du blanchiment du β-carotène et l'inhibition de la peroxydation des lipides à travers le test

TBARS. Généralement, tous les échantillons présentent un potontiel antioxydant intéressant par rapport au standard commercial Trolox (EC50 = 42 ± 1μg / ml), avec la capacité antioxydante la plus élevée observée chez J.phoenicea.L qui présente des valeurs EC50 très faibles pour les extraits d'éthanol et d’infusion (12 ± 1 et 22,4 ± 0,6 µg / ml, respectivement). Aussi, l'extrait d'infusion de C.cinerea montre une plus forte activité de piégeage de DPPH (EC50 24,8 ± 0,2μg / ml) par rapport à son extrait hydroéthanolique. D’après les résultats du test FRAP, on déduit que les extraits à partir des deux espèces de plantes étudiées ont révélé un bon pouvoir réducteur qui augmente avec leurs concentrations allant de 12.04 à 38,1 µg / ml, ce qui fournit des valeurs de 105

Conclusion générale et Perspectives

EC50 moins élevées que celle du Trolox (41 ± 1 µg / ml). Dans le test de blanchiment de β carotène, les extraits hydroéthanoliques de J.phoenicea et de C. cinerea ont montré les meilleures activités avec comme valeurs respectives des EC50 11,57 et 14,7 µg / ml et plus

élevées que celle du Trolox ( EC50 de 18,0 µg / ml). Quant à l'infusion et pour les deux plantes, les activités révélées sont plus faibles comparativement à celle du Trolox. Le test antioxydant

TBARS a révélé que les valeurs EC50 de tous les extraits montrent qu'ils sont deux à trois fois plus efficaces que le standard Trolox avec EC50 de 7,6 ± 0,3 et 7,4 ± 0,3 µg / ml pour les extraits hydroéthanoliques et EC50 de 6,7 ± 0,2 et 7,5 ± 0,2 µg / ml pour l’infusion de J.phoenicea et C. cinerea respectivement. Concernant l’activité anti-inflammatoire, tous les échantillons ont révélé une inhibition de la production d'oxyde nitrique (NO) avec des valeurs de EC50 comprises entre

51 et 122 µg / ml. On peut remarquer également que l'activité la plus élevée est révélée par les deux extraits de J. phoenicea (extrait éthanolique et infusion) avec des valeurs de EC50 égales respectivement à 51 et 70 µg / ml. Tous les échantillons testés ont présenté des propriétés cytotoxiques significatives pour les quatre lignées cellulaires tumorales humaines HeLa

(carcinome cervical), NCI-H460 (carcinome pulmonaire non petite cellule), MCF-7

(adénocarcinome du sein), HepG2 (carcinome hépatocellulaire) avec des valeurs GI50 comprises entre 9 et 101 µg / ml. De plus, les échantillons présententt également de légers effets cytotoxiques sur les cellules non tumorales (PLP2 -cellules primaires hépatiques porcines).

Néanmoins, les valeurs de GI50 sont beaucoup plus élevées que celles nécessaires pour exercer une activité antiproliférative et, également beaucoup plus élevées que celles présentées par le standars (ellipticine). Globalement, l’activité antibactérienne des extraits obtenus des deux plantes étudiées montrent une activité modérée à faible, avec une sensibilité plus élevée envers les souches de bactéries Gram-positives qu’envers celles à Gram négatif. Leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) se situent entre 5 et 20 mg / ml et, l'effet inhibiteur testé contre toutes les souches est plus bactériostatique que bactéricide. Les souches MRSA et MSSA se sont

106

Conclusion générale et Perspectives révélées plus sensibles à la fois aux extraits de J. phoenicea (CMI = 5 et 10 mg / ml, respectivement) et de C.cinerea (CMI = 10 et 5 mg / ml, respectivement).

A la lumière de ces résultats, nous pouvons conclure que les deux plantes montrent des capacités antioxydantes, anti-inflammatoires, cytotoxiques et antibactériennes prometteuses qui pourraient également être liées à leur utilisation thérapeutique importante en Afrique. Aussi, et dans le souci de soutenir l'utilisation de ces plantes dans les domaines pharmaceutiques et/ou alimentaires, d'autres études seront nécessaires pour établir le mécanisme d'action, pour déterminer la toxicité des huiles essentielles et les problèmes associées au mauvais goût.

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ANNEXES

Tests phytochimiques

Triterpènes et stérols Saponosides Tanins Flavonoïdes

10 ml d’extrait aqueux 5 ml d’extrait aqueux, 1ml d’extrait Partie d’extrait aqueux étherique ou méthanolique aqueux, éthanolique ou étherique

Évaporation à sec 10ml d’eau distillée Filtration Agitation / 2 mn 10 ml d’eau distille 3 gouttes de FeCl3 1%

5ml d’NH3 dilué Solubilisation Coloration Anhydride acétique/chloroforme : H2SO4

0.5 / 0.5 ml + 2 ml H2SO4 Mousse Emulsions Bleu Brun persistante formées après noir verdâtre Coloration jaune après 15 addition de non permanente mn l’huile d’olive Formation d’un anneau

brunâtre- rouge ou Tanins hydrolysables Tanins condensés [Harborne, 1973] ; violet à la surface + [Sofowara, 1993] coloration verte violette

de la solution [Trease et Evans, 1987]

[Trease et Evans, 1987]

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ANNEXES

Alcaloïdes Coumarines Anthocyanes

0.2ml d’extrait aqueux, 1g poudre + Gouttes é thano lique / étherique d’eau 2 ml d’extrait aqueux

Mélanger 5ml de HCl Couverture par papier aqueux 1 % imbibé de NaOH dilué 2ml de HCl 2N Ebullition Agitation bain marie/15 mn

E xamen sous UV Filtration

L’apparition d’une coloration rose-rouge qui vire au bleu - violacé [ Paris et al., 1969] 1ml 1ml Fluorescence jaune 3gouttes de [Rizk, 1982] Gouttes de NaOH aqueux (1/10) Réactif de Mayer Réactif de Wagner

Une précipitation ou une turbidité

[Sofowara, 1993]

- 129 -

ANNEXES

L’amidon Les sucres réducteurs

5ml d’extrait aqueux 2ml des extrait aqueux et éthanolique

5ml de mélange de volume égal de la solution Quelques gouttes du réactif de Fehling A+B d’amidon

Ebullition / 2minutes

Virage au bleue violacé [Bruneton, 1999] Formation d’un précipité rouge brique [Trease et Evans, 1987]

- 130 -

Annexes

Annexe 01: Les réactifs utilisés lors des tests sont les suivants :

●Solution de Fehling (A): Dissoudre 5g de sulfate de cuivre CuSO4 dans 50ml d’eau instillée.

●Solution de Fehling (B): Dissoudre 6.5g de la soude + 17.3g de tartrate de sodium et potassium dans 35ml d’eau distillée puis compléter à 50ml d’eau distillée.

●Réactif de Wagner : Dissoudre 2g de KI et 1,27g d’I₂ dans 75 ml d’eau. Ajuster le volume total à 100ml d’eau.

●Réactif de Mayer : Dissoudre 1,358 g de HgCl2 dans 60ml d’eau et également 5 g de KI dans 10 ml d’eau. Mélanger les deux solutions puis ajuster le volume total à 100ml d’eau.

●Réactif d’amidon : Dissoudre 1,2 g d’iode dans 50 ml d’eau distillée contenant 2,5g d’iodure de potassium. Chauffer dans un bain marie 5 ml de la solution à tester avec 10 ml d’une solution de NaCl saturée jusqu’à ébullition.

●Réactif de Liebermann-Burchardt : Mélanger 5 ml de la solution à tester avec 5 ml d’anhydride acétique et quelques gouttes d’acide sulfurique concentré. Agiter le tout et laisser la solution reposer pendant 30 minutes à 21ºC.

Annexe 02: Activité antioxydante des huiles essentielles.

IC50=0.76±0.0163 mg/ml 100 90 y = 83.695x - 11.899 y = 74.669x - 8.5256 y = 78.169x - 10.082 80 R² = 0.9376 R² = 0.9804 R² = 0.9897 70 60 50 40 30

Inibition% 20 10 0 -10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 concentration en mg/ml

Figure 34 : Pourcentages d’inhibition du radicale libre DPPH pour l’huile essentielle de Juniperus phoenicea L.

131

Annexes

IC50=28.42±0.53369 mg/ml 40 y = 1.7813x - 0.6097 y = 1.6929x - 0.3822 y = 1.762x - 0.6326 R² = 0.9911 35 R² = 0.9913 R² = 0.9801 30 25 20 15

Inibition% 10 5 0 0 5 10 15 20 25 Concentration en mg/ml

Figure 35: Pourcentages d’inhibition du radicale libre DPPH pour l’huile essentielle de Cotula cinerea (Del).

Annexe 3: Valeurs du piégeage du radical DPPH exprimées en densités optique (D.O) pour l’acide ascorbique en fonction des centrations (mg/ml). Concentration 0,5 0,9 1 1,25 1,5 1,80 1,85 1,95 2 (mg/ml) DO (acide 0,499 0,488 0,396 0,351 0,271 0,196 0,173 0,170 0,153 ascorbique) ±0,000 ±0,007 ±0,005 ±0,003 ±0,002 ±0,024 ±0,034 ±0,013 ±0,068

Annexe 4 : Valeurs du piégeage du radical DPPH exprimées en densités optique (D.O) pour le BHA en fonction des centrations (mg/ml). Concentration 0,5 1 1,25 1,5 1,75 1,80 1,85 2 2,25 (mg/ml) DO (BHA) 0,495 0,478 0,438 0,391 0,355 0,341 0,317 0,278 0,209 ±0,004 ±0,004 ±0,008 ±0,012 ±0,043 ±0,004 ±0,003 ±0,016 ±0,002

132

Annexes

Annexe 05 : Valeurs du piégeage du radical DPPH exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de J.phoenicea L en fonction des concentrations (mg/ml). Concentration (mg /ml) 0,0078 0,0156 0,0312 0.0625 DO (extrait ETOH) 0,294 0,15 0,062 0,058 ±0,0013 ±0,0106 ±0,0118 ±0,0007 PI% 33.44 66.06 84.69 86.72 ±0,3098 ±2,4183 ±2,6770 ±0,1600

Concentration (mg /ml) 0,0078 0,0156 0,0312 0.0625 DO (infusion) 0,38 0,27 0,141 0,078 ±0,0097 ±0,0052 ±0,0057 ±0,0017 PI% 13.41 37.09 66.81 81.91 ±2,1918 ±1,1770 ±1,3077 ±0,3982 Annexe 06 : Valeurs du piégeage du radical DPPH exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de C. cinerea (Del) en fonction des concentrations (mg/ml).

Concentration (mg /ml) 0,0078 0,0156 0,0312 0.0625 0.125 DO (extrait ETOH) 0,371 0,30 0,176 0,086 0,071 ±0,0146 ±0,0033 ±0,0004 ±0,0090 ±0,0006 PI% 16,50 29,47 60,37 80,67 84,09 ±3,3010 ±0,7579 ±0,0973 ±2,0318 ±0,1498

Concentration (mg /ml) 0,0078 0,0156 0,0312 0.0625 0.125 DO (infusion) 0,35 0,315 0,183 0,086 0.087 ±0,0202 ±0,0021 ±0,0017 ±0,0010 ±0,0008 PI% 25,72 33,70 61,51 81,67 81,65 ±4,2449 ±0,4592 ±0,3562 ±0,2296 ±0,1819

133

Annexes

Annexe 07 : Valeurs du pouvoir réducteur exprimées en densités optique (DO) des extraits de J.phoenicea L.et C.cinerea (Del).

DO J.phoenicea L J.phoenicea C.cinerea (Del ) C.cinerea(Del) (Extrait L (Extrait (Infusion)

ETOH) (Infusion) ETOH)

Concentration

0,0088 0,340±0,0041 0,28±0,0137 0,130±0,0139 0,109±0,0066

0,0177 0,80±0,0454 0,492±0,0045 0,302±0,0057 0,247±0,0033

0,0355 1,37±0,0163 0,76±0,0144 0,797±0,0016 0,471±0,0142

0,0710 1,93±0,4502 1,05±0,0715 1,27±0,0217 0,869±0,0050

Annexe 8 : Valeurs de l’activité antioxydante de la décoloration de la β-carotène exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de J.phoenicea L en fonction des concentrations (mg/ml).

Concentration (mg /ml) 0,00313 0,00625 0,0125 0,025 0,05 DO (extrait ETOH) 0,21 0,182 0,283 0,303 0,335 ±0,04 ±0,0125 ±0,00165 ±0,0113 ±0,043 PI% 39,571 33,97 52,84 57.06 61,39 ±7, 4855 ±2,195 ±0,6033 ±2,3133 ±7,9796

Concentration (mg /ml) 0,00313 0,00625 0,0125 0,025 0,1 DO (infusion) 0,096 0,129 0,169 0,24 0,294 ±0,00513 ±0,01515 ±0,00139 ±0,01514 ±0,0053 PI% 23,070 29,60 37,38 58.07 66,96 ±1, 1988 ±3,6212 ±0,9565 ±2,9529 ±5,0739

134

Annexes

Annexe 9 : Valeurs de l’activité antioxydante de la décoloration de la β-carotène exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de C.cinerea (Del) en fonction des concentrations (mg/ml).

Concentration (mg /ml) 0,00313 0,00625 0,0125 0,025 0,05 DO (extrait ETOH) 0,14 0,16 0, 23 0,26 0,30 ±0,04 ±0,02 ±0 ±0,0126 ±0,0156 PI% 29,37 34,06 48,86 55,17 62,24 ±0, 3220 ±3,5043 ±0,4491 ±1,9677 ±3,6190

Concentration (mg /ml) 0,00313 0,00625 0,0125 0,025 0,05 DO (extrait infusion) 0,14 0,17 0,2 0,27 0,277 ±0,01 ±0,0734 ±0,0006 ±0,0096 ±0,0047 PI% 32,50 35,11 42,94 54,51 56,45 ±1,8462 ±14,4759 ±0,170 ±1,3177 ±2,9375

Annexe 10 : Valeurs de l’activité antioxydante par le teste TBARS exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de J.phoenicea L en fonction des concentrations (mg/ml).

Concentration (mg /ml) 0,0003 0,0007 0,0142 0,0027 0,0056 DO (extrait ETOH) 0,34 0,31 0,27 0,14 0,03 ±0,0131 ±0,01 ±0,0027 ±0,0044 ±0,0032 PI% 12,52 22,34 32,13 63,27 91,99 ±3,2918 ±2,1210 ±0,8601 ±1,1159 ±0,81

Concentration (mg /ml) 0,0142 0,0027 0,0056 0,0113 0,0226 DO (infusion) 0,25 0,12 0,046 0,059 0,038 ±0,0056 ±0,0009 ±0,0060 ±0,0164 ±0,0003 PI% 23,35 63,82 85,93 82,30 86,02 ±1,6839 ±0,2714 ±1,8071 ±4,9208 ±1,5803

135

Annexes

Annexe 11 : Valeurs de l’activité antioxydante par le teste TBARS exprimées en densités optique (DO) et pourcentage d’inhibition %(PI%) par les extraits de C.cinerea (Del) en fonction des concentrations (mg/ml).

Concentration (mg /ml) 0,0027 0,0056 0,011 0,022 0,045 DO (extrait ETOH) 0,30 0,21 0,07 0,03 0,01 ±0,0048 ±0,0102 ±0,0042 ±0,01 ±0,0011 PI% 11,88 37,08 78,25 88,12 93,99 ±1,4176 ±2,9929 ±0,1388 ±5,8620 ±1,9353

Concentration (mg /ml) 0,0027 0,0056 0,022 0,045 0,090 DO (infusion) 0,32 0,26 0,07 0,03 0,04 ±0,0152 ±0,0133 ±0,02 ±0,00 ±0,0054 PI% 15,54 30,18 85,11 89,75 90,03 ±4,0246 ±3,5225 ±7,9058 ±4,3197 ±1,5652

136

Phytothérapie DOI 10.3166/phyto-2018-0061

PHARMACOGNOSIE

Chemical Profile, in vitro Antibacterial and Antioxidant Activities of Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del.) Essential Oils from Southwestern Algeria Profil chimique, activités antibactériennes et antioxydantes in vitro des huiles essentielles de Juniperus phoenicea L. et de Cotula cinerea (Del.) du Sud-Ouest algérien

D. Ghouti · H.A. Lazouni · A. Moussaoui · D. Chabane Sari

Abstract This work aims to study the chemical composition, (Del.) [IC50 = 28. mg/ml] oils respectively. The promising antimicrobial and antioxidant activities of Juniperus phoeni- bioactivities of these plants suggest that they may be a new cea L. and Cotula cinerea (Del.) essential oils from south- source of preservative molecules. western Algeria. The hydrodistilled oils obtained were char- – – acterized by gas chromatography mass spectrometry (GC Keywords Juniperus phoenicea L. · Cotula cinerea (Del.) · MS). A total of 45 and 25 compounds were identified repre- Chemical compositions · Essential oil · Antibacterial senting 100% of Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea activity · Antioxidant activity (Del.) respectively. The dominant component was α-pinene (46.437%) for Juniperus phoenicea L. and α-thujone (32.35%) for Cotula cinerea (Del.). The in vitro antibacterial Résumé Ce travail est consacré à la composition chimique, activity of the essential oils was evaluated against nine food- aux activités antimicrobiennes et antioxydantes des huiles borne pathogenic bacteria and one yeast, Candida albicans, essentielles de Juniperus phoenicea L. et de Cotula cinerea using the disk diffusion method; the minimum inhibitory (Del.) du Sud-Ouest algérien. Les huiles hydrodistillées concentration (MIC) values were examined (micro dilution). obtenues ont été caractérisées par chromatographie en phase The results suggest that the essential oil of Juniperus phoeni- gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). Au total, respec- cea has a significant to moderate antibacterial activity on all tivement 45 et 25 composés ont été identifiés, représentant strains of bacteria. The most sensitive strains were Bacil- 100 % de Juniperus phoenicea L. et de Cotula cinerea lus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomo- (Del.). Le composant dominant était l’α-pinène (46,437 %) nas aeruginosa, and Candida albicans with (MIC = 0.04 to pour Juniperus phoenicea L. et l’α-thujone (32,35%) pour 0.63 mg/ml). Cotula cinerea oil showed moderate to low Cotula cinerea (Del.). L’activité antibactérienne in vitro des sensitivity to the test strains. Its best activity was against huiles essentielles a été évaluée contre neuf bactéries patho- Bacillus subtilis (MIC = 0.303 mg/ml). The DPPH test con- gènes d’origine alimentaire et une levure Candida albicans ducted to evaluate the antioxidant activity of both oils en utilisant la méthode de diffusion sur disque, puis les showed a good to moderate capacity for Juniperus phoenicea valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) ont été L. (concentration of an inhibitor when the response is déterminées (microdilution). Les résultats suggèrent que ’ reduced by half, IC50 = 0.76 mg/ml) and Cotula cinerea l huile essentielle de Juniperus phoenicea a une activité anti- bactérienne significative à modérée sur toutes les souches testées. Les souches les plus sensibles étaient Bacillus cereus, D. Ghouti (*) · H.A. Lazouni · A. Moussaoui Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aerugi- Laboratory of Natural Products, Department of Biology, nosa et Candida albicans (CMI va de 0,04 à 0,63 mg/ml). Faculty of Sciences of the Nature and the Life, L’huile de Cotula cinerea a montré une sensibilité modérée à University Abou-Bekr-Belkaid, PB 119 Tlemcen 13000, Algeria faible aux souches testées. Sa meilleure activité était contre e-mail : [email protected] Bacillus subtilis (CMI = 0,303 mg/ml). Concernant l’activité antioxydante évaluée par le test DPPH pour les deux huiles, D. Chabane Sari elle a montré une capacité bonne à modérée (IC = 0,76 et Laboratory of Plant Resource Development and 50 Food Security in Semi-Arid Areas, Department of Biology, 28 mg/ml) pour les huiles Juniperus phoenicea L. et University of Bechar, South West of Algeria, BP 417, Algeria Cotula cinerea (Del.) respectivement. Les bioactivités 2 Phytothérapie prometteuses de ces plantes suggèrent qu’elles pourraient It has interesting therapeutic effects and has been used in the être une source de nouvelles molécules conservatrices. traditional medicine of North Africa [17,18]. Some authors have reported the hypoglycemic effect of leaves and berries Mots clés Juniperus phoenicea L. · Cotula cinerea (Del.) · mixture from this plant. The leaves decoction is used to treat Compositions chimiques · Huile essentielle · Activité diarrhea, rheumatism, and diabetes; it is also used as a antibactérienne · Activité antioxydante diuretic [19–21]. In the north of the Mediterranean basin, the characterization of the essential oil of Juniperus phoenicea has been described by many researchers [22]. Derwich et al. noted that minor studies have proved their antimicro- Introduction bial activities in the southern part of this basin [5]. Cotula cinerea (Del.), locally named Gartoufa and In the 21st century, numerous bacterial infections are posing belonging to the Asteraseae family, is one of the most com- a real public health problem [1]. The discovery of multidrug mon medicinal plants used by the local population of North resistant strains in bacteria [2]; the emergence of new infec- Africa, due to their medicinal properties. Cotula genus, com- tious diseases; the proliferation of disorders such as cancer; prising 80 species, is widespread in the southern hemisphere and the hypersensitivity, immune suppression, and allergic and is represented by three species in Algeria, among which reaction caused by antibacterial agents [3] suggest an imper- is the plant under study, Cotula cinerea (Del.) with the syn- ative need of an alternative source of new natural drugs from onym Brocchia cinerea (Del.) [23,24].This species is used herbal plants [4]. against colic, coughs and bronchopulmonary cooling; it is The food industry at present is facing a tremendous pres- also used as a tea to aid digestion [25]. sure from consumers to use alternatives to chemical preser- The aim of the present study was to investigate the chem- vatives that prevent the growth of food-borne and spoiling ical characterization, antibacterial and antioxidant activities microbes. This situation has led scientists to search for new of the Saharan Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea sources of useful alternatives against diseases and to reduce (Del.) aerial parts essential oils, as well as to evaluate their or eliminate chemically synthesized additives from foods. potential to replace synthetic preservatives. Essential oils, as a large source of various chemicals and with their promising antibacterial [5,6], antifungal properties [6,7], and various other biological effects [8], are useful in many applications, including raw and processed food pres- Materials and methods ervation, pharmaceuticals, alternative medicine and natural therapies [9,10] These essential oils are also important as Plant material they are less damaging to the human health [11]. Juniperus phoenica L. (Cupressaceae) is an important The samples of Juniperus phoenica L. leaves and shrub from the western part of the Mediterranean [12–15], Cotula cinerea (Del.) aerial parts were collected from the largely growing in the Algerian mountains (Fig. 1) [16,12]. southwest region of Algeria El Bayadh (33° 05′ 18″ North;

Fig. 1 Juniperus phoenica L. and Cotula cinerea (Del.) [Gartoufa] Phytothérapie 3

0° 34′ 52″ East) and Bechar (31° 01′ 00″ North 2° 44′ 00″ (ATCC 6538), Listeria monocytogenese (ATCC 19111) – West), respectively, during the flowering period (May 2015). and three Gram-negative Escherichia coli (ATCC 8739), The plants were identified by Okacha Hasnaoui, Professor in Klebsiella pneumonia (IBMC Strasbourg), Pseudomo- the University of Tlemcen, Algeria. Plant material was dis- nas aeruginosa (ATCC 27853); and one yeast Candida albi- persed on the ground and allowed to dry at ambient temper- cans (ATCC 10231). The microorganisms references are ature and away from direct sunlight. obtained from the ATCC (American Type Culture Collec- tion) and the IBMC (Institute of Molecular and Cellular Extraction procedure of essential oils Biology); they were provided from the Natural Products Laboratory (University of Tlemcen). Volatile oils were isolated by hydro-distillation using a Cle- The disk diffusion method was used for antimicrobial sus- venger type apparatus according to methods previously uti- ceptibility testing of the essential oils against previously cited lized by Browning [26] and Dob et al. [27]. Portions (100 g) strains [29]. According to Pfaller et al. [30], 0.1 ml of bacterial of each dried plant material were hydro-distilled for 4 hours suspension adjusted to 107 CFU (colony forming unit)/ml for in the Clevenger type apparatus to extract the essential oils. Staphylococcus aureus and 106 CFU/ml for the others strains The obtained samples were concentrated with anhydrous and yeast was placed in Petri dishes containing Mueller- sodium sulfate and stored at 4 °C until analyzed. The yield Hinton agar for bacteria, and Mueller-Hinton agar supplemen- of the obtained oil was determined as follows: ted with 2% glucose (to support growth) and 0.5 μg/ml of Oil (% v/w) = Obtained volume of oil (ml)/Weight of methylene blue (to improve zone edge definition) for yeast sample (g) × 100 [31]. The filter paper disks (6 mm in diameter) were individ- ually impregnated with 10 μl of the samples and then placed on the agar medium already inoculated with the test microor- GC/MS analysis characterization ganisms. The petri dishes were stored at 4 °C for 2 h and then incubated at 37 °C/24 h for bacteria and at 30 °C/48 h for The analysis of the essential oil was performed using a Hew- Candida albicans. The diameters of the inhibition zones lett Packard Agilent 6890, equipped with an HP-5MS capil- (mm) are measured, including the diameter of the disks. The lary column (30 m × 0.25 mm; film thickness, 0.25 mm) antibiotics amoxycillin (30 μg), ampicillin (10 μg), and gen- whose injector and detector temperatures were maintained tamycin (30 μg) were used as positive controls for bacteria, at 250 °C. The oven temperature was programmed at 60 ° while nystatine (30 μg) was used for yeast. DMSO (dimethyl C for 8 min, raised to 250 °C at a rate of 2 °C/min, and kept sulfoxide) solvent was used as the negative control. isotherm at 250 °C for 10 min. Helium was the carrier gas, at The minimal inhibitory concentrations (MICs) were deter- a flow rate of 0.5 ml/min. A sample of 0.2 μl of essential oil mined using sterilized microdilution plates according to was injected manually (in split mode 50:1), and a Hewlett Okusa et al. [32] with minor modifications. All the tests Packard Agilent 5973 mass selective detector was used for were carried out in the Mueller-Hinton broth for bacteria or the separation. The mass selective detector was operated in Sabouraud dextrose broth for Candida albicans. First, the electron impact ionization (EI) mode with a mass scan Tic samples studied were dissolved in 5% DMSO and a serial range from 30 to 550 m/z, and intensity of the filamen 70 éV. of dilutions were prepared in a 96 wells plates (200 μl/well). The retention indices were calculated for all volatile consti- Then, strains adjusted to 0.5 McFarland (108 cells/ml for bac- 6 tuents using a homologous series of n-alkanes C8–C22. The teria and 10 cells/ml for yeasts), and diluted by 1/100 to essential oil constituents were identified by comparing their reach 106 and 104 cells/ml for bacteria and Candida albicans GC retention indices, mass spectra with published data [28] respectively were added to each well (100 μl/well). Finally, and the National Institute of Standards and Technology mass the strains and Candida albicans were incubated for 24 hours spectra library data provided by the software of the GC–MS at 37 °C and 30 °C respectively. MIC is defined as the lowest system. Essential oil components are reported as a relative concentration of the samples at which the microorganism percentage of the total oil by peak area. does not demonstrate visible growth with the unaided eye; it is indicated by turbidity. The negative control was a mixture of bacterial inoculums and DMSO. Sterility control was pre- Antimicrobial assay pared by using Mueller-Hinton broth alone.

The antimicrobial activity of the samples were tested against a range of strains from different bacterial species, five of In vitro antioxidant activity assay them Gram-positive bacteria — Bacillus cereus (ATCC 25921), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Micrococ- The antioxidant activity was evaluated by in vitro DPPH cus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus radical scavenging method. At different concentrations, a 4 Phytothérapie mixture of 50 μl of diluted samples in methanol and 1950 μl GC/MS characterization of a metabolic solution of DPPH (6.34 × 10–5 M) was prepared. In parallel, the investigated samples were tested with methanol as control negative, butylated hydroxyl anisole In this work, the chemical characterization of the volatile oils – (BHA) and ascorbic acid as positive control at the same conis determined by GC MS and the results are presented in centration used. After incubation of the solution mixtures in table 2. Totally, 45 and 25 components were found to reveal the dark for 30 min at room temperature, the reduction of 100% of the total oils of Juniperus phoenicea L. and DPPH is followed by the transition of the violet color to Cotula cinerea (Del.) respectively. Monoterpene hydrocar- the yellow color of the resulting solution [33]. Absorbance bons and oxygenated monoterpenes were the predomi- – α reading is performed at 515 nm using a spectrophotometer. nant compounds (59.9885 72.211%), with -pinene and α – The DPPH scavenging activity was expressed as a per cent -thujone (46.437 32.355%) as the major constituent of of inhibition (PI); the inhibition percentage of the oils was Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del.) essen- estimated to calculate the EC values, which refers to the tial oils respectively, followed by linalool (5.972%), 50 δ Δ concentration of the sample providing 50% of antioxidant -3-carene (5.82%), -cadinene (5.139%), caryophyllene activity. trans (3,084%), as the second most important constituents for Juniperus phoenicea oil, and camphor (20.16%), santolinatriene (12.73%) and eucalyptol (11.57%) for Cotula cinerea (Del.). Results and discussion Our results are consistent with those obtained by many papers’ report on the chemical composition of leaves and Essential oils yields berries essential oils of Juniperus phoenicea grown in different geographical localities, which identified α-pinene as the main components of the Juniperus phoenicea L. essen- The hydro-distillated pale yellow volatile oil of Juni- tial oil (Table 3). However, the other dominant compounds perus phoenicea L. aerial parts with a strong odor of juniper of this oil were different in proportions or relative composi- and the greenish yellow essential oil of Cotula cinerea (Del.) tions to the studies carried out for Juniperus phoenica L. have an average yield of 0.99% (w/w) and 0.72%(w/w) essential oil. Cotula cinerea (Del.) oil has been studied respectively, which is higher than those reported in the north and described in the literature because of its interesting bio- of the Mediterranean basin studies and less important in the logical properties and varying bioactive compounds. Studies southern part of this basin for Juniperus phoenicea L.; while, from El Bouzidi et al. and Kasrati et al [38,48] described the Algerian Cotula cinerea (Del.) had a yield higher or near trans-thujone (41.4%), cis-verbenyl acetate (24.7%), 1,8- to those obtained in the Middle East studies (Table 1).These cineole (8.2%), and camphor (5.5%) as the major compo- variations have significant correlation with some edaphic fac- nents of the plants collected in Morocco, while Atef et al. tors (pH, K2O content, soil texture) [43] [36] described 3-carene (30.99%), thujone (21.73%), santo- lina triene (18.58%), and camphor (6.21%) from the oil obtained from a specimen collected in the Oued Souf Sahara Table 1 The yields of Juniperus phoenicea L. and Cotula in southeast of Algeria. However, Djellouli et al. [35] have cinerea (Del.) from different countries very different compositions from the essential oil extracted from the aerial parts of Cotula cinerea (Del.) from the same Country Juniperus phoenicea L. Cotula cinerea region of our study, southwest of Algeria, with the major yield (Del.) yield compounds of (E)-citral (24.01%), limonene epoxide cis Algeria 0.99 0.72 (18.26%), thymol methyl ether (15.04%), carvacrol (our study) (15.03%), trans-carveol (13.79%), carvone (3.06%), and Algeria 0.52 [34] 0.282% [35], trans-piperitol (2.54%). These qualitative and quantitative 0.391% [36] differences in the chemical composition of essential oils Morocco 1.62 [5], 0.98 [37] 0.87 [38] could be attributed to several factors such as geographical Egypt 1.96 [39] 0.30 [40] location, climatic effects, harvest season, nature of the soil, Portugal 0.41 [41] – age of the plant parts (young or adult), the state of used plant Spain 0.66 [41] – materials (dried or fresh), the part of the plant used, time of Greece 0.58 [41] – collection and chemotype [49–50]. Furthermore, Aboukha- Corsica 0.4 [42] – lid et al. determined the significant relationship between oil components and some environmental factors (temperature, –: not mentioned rainfall) [43]. Phytothérapie 5

Table 2 Chemical composition of southwest Algerian Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del.) essential oil

Compounds lR Juniperus phoenicea L. (%) Cotula cinerea (Del.) (%) Santolinatriene 852 12.734 Tricylene 861 0.126 α-thujene 865 1.572 α-pinene 871 46.437 3.024 Camphene 885 0,917 3.105 Verbenene 890 0456 Sabinene 918 0.805 β-pinene 925 1.25 0.805 β-myrcene 972 1.302 0.471 Δ-3-carene 1,015 5.82 α-terpinene 1,022 0.771 Ortho-cymene 1,037 0.879 p-cymene 1,039 2.51 Limonene 1,043 0.972 Eucalyptol 1,050 11.575 γ-terpinene 1,095 0.221 1.073 Linalool oxide cis 1,108 0.468 α-terpinolene 1,118 0.668 0.771 Linalool 1,133 5.978 Rose oxide trans 1,136 0.366 α-thujone 1,144 32.355 α-campholene aldehyde 1,145 1.02 Camphor 1,157 0.996 20.162 Trans-pinocarveol 1,161 1.535 Borneol 1,175 1.361 Phellandren-8-ol 1,177 1.273 4-terpineol 1,184 0.574 3.318 p-cymen-8-ol 1,189 0.324 α-terpineol 1,194 1.771 Myrtenol 1,196 0.342 Verbanone 1,200 0.045 Trans-carveol 1,223 0.483 Citronellol B 1,239 2.061 Cuminic aldehyde 1,243 0.08 Isopulegol acetate 1,287 0.632 Endo-bornyl acetate 1,297 1.17 Carvacrol 1,327 0.178 Δ-elemene 1,341 0.44 α-cubebene 1,350 0.276 α-terpinyl acetate 1,354 1.415 Neryl acetate 1,367 0.076 α-copaene 1,372 0.522 β-bourbonene 1,379 0.279 Geranyl acetate 1,383 0.165 β-elemene 1,387 0.978 Isolongifolene 1393 0.34 Cis-jasmone 1,394 0.255 Caryophyllene trans 1,406 3.084 (Suite page suivante) 6 Phytothérapie

Table 2 (suite)

Compounds lR Juniperus phoenicea L. (%) Cotula cinerea (Del.) (%) γ-elemene 1,414 0.779 α-humulene 1,425 1.331 B farnesene 1,429 0.119 Germacrene D 1,441 1.793 Epi-bicyclosesquiphellamdrene 1,447 1.976 α-selinene 1,449 1.297 α-muurolene 1,453 0.985 Δ-cadinene 1,467 5.139 Cadina1,4-diene 1,470 0.468 Germacrene B 1,487 0.114 Nerolidol 1,490 0.308 Caryophyllene oxide 1,495 0.439 β-guailene 1,497 2.013 Geranyl isovalenate 1,603 0.481 1,7,7-trimethyl-2-vinyl bicycle[2,2,1]het-2-ene 1,618 0.963 Total identified (%) 100% 100% Monoterpene hydrocarbons 59.885 26.976 Oxygenated monoterpenes 17.512 72.211 Sesquiterpene hydrocarbons 21.814 0.558 Oxygenated sesquiterpenes 0.789 0 Non-terpenic compounds 0 0.255

RI: retention index

antibacterial activity on all test strains with a zone diameter α Table 3 -pinene % of Juniperus phoenicea L. essential oil of inhibition 7–27 mm). The most sensitive strains were from different geographical localities Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Micrococcus luteus Country α-pinene % of Juniperus phoenicea L with MIC of 0.04, 0.04, and 0.08 mg/ml). The oil also has a significant activity toward Gram-negative bacteria Kleib- Algeria 46.43 seilla pneumonie, Pseudomonas aeruginosa with MIC of (our study) 0.04, 0.31 mg/ml and against Candida albicans, with an Algeria 34.5 [34], 36.3–55.9 [44] MIC of 0.063 mg/ml. The lowest activity was noted against Morocco 45.5 [45], 58 [46], 49.15 [5], 34.23–74.03 strains Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Lis- [37] teria monocytogenes, with a diameter of inhibition zone Egypt 38.22 [39] between 7–11 mm. Thus, Gram-positive bacteria are more Libya 20.85 [47] sensitive than Gram-negative bacteria; this finding was sup- Portugal 34.1 [41] ported by many researchers [51–52]. The antibacterial activ- Spain 53.5 [41] ity of Juniperus phoenicea L. oil is strongly related to the Greece 41.8 [41] concentration of α-pinene [53]. On the other hand, Corsica 31.1–59.5 [42] Cotula cinerea (Del.) essential oil has shown moderate to low sensitivity to test strains with varying degrees of inhibi- Antibacterial activity tion of growth (7–15 mm). Its best activity was against Bacillus subtilis (MIC = 0.303 mg/ml) and Bacillus cereus, As can be seen in table 4, the in vitro antibacterial activity of Micrococcus luteus, Kleibseilla pneumonie, Pseudomo- essential oils of Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea nas aeruginosa, Candida albicans with a diameter of (Del.) have been quantified and qualified using disk diffu- zone of inhibition between 12–13 mm. This activity is the sion and liquid dilution methods against a panel of patho- result of the predominant compounds of the oil, which are genic microorganisms. The results showed that Juni- oxygenated monoterpenes that exhibit potential antimicro- perus phoenicea L. oil inhibited a significant to moderate bial activities [54]; camphor, eucalyptol, and thujone (active Phytothérapie

Table 4 Antibacterial (DD [mm] and MIC [mg/ml] values) of the essential oils of Juniperus phoenicea and Cotula cinerea

Antibacterial activity Gram-positive bacteria Gram-negative bacteria Yeast Bacillus cereus Bacillus subtilis Micrococ- Staphylococ- Listeriamonocy- Escherichia coli Klebsiella pneu- Pseudomo- Can- cus luteus cus aureus togenes monia nas aeruginosa dida albicans DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC DD MIC J. phoenicae 21 0.04 20 0.04 22 0.08 8 – 11 – 7 – 27 0.04 16 0.31 21 0.06- essential oil 3 C. cinerea 12 – 15 0.303 12 – 8 – 7 – 8 – 12 – 13 – 12 – essential oil Cephalexin 06 –––––28 –––40 ––– 06 ––– (30 μg/disk) Ampicilin 07 – 14 –––8 –––17 ––– 19 – 8 – (10 μg/disk) Gentamycin 18 – 18 –––17 –––19 – 16 – 16 ––– (30 μg/disk) Nystatin –– –– –– –– –– –– –– –– 21 – (30 μg/disk) Negative 06 – 06 – 06 – 06 – 06 – 6 – 6 – 6 – 06 – control (DMSO)

DD: diameter of inhibition zone (mm) including disk diameter of 6 mm; –: not active; MIC: minimal inhibitory concentration (mg/ml) 7 8 Phytothérapie ingredients widely used in therapies) also help [55]. Essen- weaker activity than the activity of our oil and also the stan- tial oils have a variety of antibacterial activities — a result of dard [59,60]. their richness in terpenic compounds carrying various func- The essential oil of Cotula cinerea showed a moderate tional groups (alcohols, carbonyls, etc.) and their synergistic DPPH radical scavenging potential with (MIC = effects with each other [56,57]. 28.42 mg/ml), which is of less potency than the reference

ascorbic acid (IC50 = 1.12 mg/ml) and BHA (IC50 = Antioxidant assay 1.61 mg/ml). This activity was explained partially by the wealth of this oil with monoterpenes α-thujone, camphor, and eucalyptol [48]. Kasrati et al. and Dekinash et al. Antioxidant capacity of Juniperus phoenicea L. and [48,61] investigated the antioxidant potential of the essen- Cotula cinerea (Del.) essential oil were evaluated using tial oil of Cotula cinerea collected from South Morocco DPPH free-radical scavenging assay, and the results are and the Western Egyptian desert respectivly, using the given as IC values (Table 5). The essential oil of Juni- 50 DPPH free radical scavenging activity assay, which perus phoenicea showed a higher antioxidant activity with showed a moderate antioxidant capacity. This entails that (IC = 0.76±0.0163 mg/ml) than the standards, butylated 50 the Algerian Cotula cinerea oil also has a low antioxidant hydroxyl anisole (BHA) and ascorbic acid with (IC = 50 capacity like its Moroccan and Egyptian counterpart. 1.61 and 1.12 mg/ml) respectively. The obtained results are supported by other studies carried out by Bouzouita et al (2008) and Emami et al. [51,58] on the antioxidant activity of Tunisian and Iranian essential oils of Juniperus phoenicea Conclusion that showed a good antioxidant capacity compared with usual standards, tocopherol and BHT respectively. However, The motivating results of this study suggest that Juni- the studies of Ennajar et al. and Boulanouara et al. showed perus phoenica L. essential oil is found to have very strong antimicrobial and antioxidant potential compared to Cotula cinerea (Del.) oil which has moderate biological Table 5 Antioxidant activity (DPPH scavenging activity) activities. This dual biological efficiency and the oil’s rich- of Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del.) essential ness in active terpene compounds, allowed us to realize in a oils subsequent study, a test of toxicity and new activities as well

Samples Concentra- Percentage IC50 as the identification of the active principles of these plants tion (mg/ml) activity (%) (mg/ml) that could be used as a source of bioactive compounds and preservatives. Juniperus phoeni- 0.25 9.47 0.76 ± This is true especially of Juniperus phoenicea L. oil that cea 0.375 16.93 0.0163 prevents microbial contamination and protects against 0.5 27.33 organoleptic deterioration caused by free radicals. It can 0.75 45.07 also exhibit antiseptic and disinfectant effects that can be Cotula cinerea 1.05 76 28.42 ± exploited by the pharmaceutical industry. New approaches 58.80.5337 of research are needed to disclose, even more, the secrets 7.5 12 of these traditional therapeutic and culinary plants that 10 18.93 have been used for a long time. Ascorbic acid 15 27.33 1,12 ± 20.2 34 0.02 0.5 34 Acknowledgments The authors are grateful to everyone 0.9 44 who helped in the realization of this work BHA 1 48 1.61 ± Conflict of interest: the authors declare they have no con- 1.25 54 0.09 flict of interest. 1.5 64 0.5 35 1.25 38 1.5 42 References 1.5 48 1.75 54 1. Morris AK, Masterton RG (2002) Antibiotic resistance surveillance: action for international studies. J Antimicrob Chemother DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; BHA: butylated 49:7–10 2. Levy SB, Marshall B (2004) Antibacterial resistance worldwide: hydroxyl anisole; IC50: inhibitory concentration 50% causes, challenges and responses. Nat Med 10:122–9 Phytothérapie 9

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This article can be cited before page numbers have been issued, to do this please use: D. Ghouti, W. Rached, M. Abdallah, T. Pires, R. C. Calhelha, M. J. Alves, L. H. Abderrahmane, L. Barros and I. C. F. R. Ferreira, Food Funct., 2018, DOI: 10.1039/C8FO01392F.

Volume 7 Number 1 January 2016 Pages 1–612 This is an Accepted Manuscript, which has been through the Food & Royal Society of Chemistry peer review process and has been Function accepted for publication. Linking the chemistry and physics of food with health and nutrition Accepted Manuscripts are published online shortly after www.rsc.org/foodfunction acceptance, before technical editing, formatting and proof reading. Using this free service, authors can make their results available to the community, in citable form, before we publish the edited article. We will replace this Accepted Manuscript with the edited and formatted Advance Article as soon as it is available.

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rsc.li/food-function Page 1 of 28 Food & Function View Article Online DOI: 10.1039/C8FO01392F

1 Phenolic profile, and in vitro bioactive potential of Saharan Juniperus

2 phoenicea L. and Cotula cinerea (Del) growing in Algeria

4 Dalila Ghoutia,b, Wahiba Racheda,c,d, Moussaoui Abdallahe, Tânia C.S.P. Piresa, Ricardo

5 C. Calhelhaa, Maria José Alvesa, Lazzouni Hamadi Abderrahmanef, Lillian Barrosa,*,

a,* 6 Isabel C.F.R. Ferreira

8 aCentro de Investigação de Montanha (CIMO), Instituto Politécnico de Bragança,

9 Campus de Santa Apolónia, 5300-253 Bragança, Portugal. Manuscript 10 bNatural Products Laboratory, Department of Biology, Faculty of Nature and Life

11 Sciences, University of Tlemcen, BP 119 Immama, Tlemcen, Algeria.

12 cLaboratory of Plant Biochemistry and Natural Products, Department of Biology,

13 Faculty of Nature and Life Sciences, University of Oran1, Ahmed Ben Bella,1524 EL M

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15 dDepartment of Biology, Faculty of Nature and Life Sciences, University of Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 16 Mostaganem, BP 188/227 Mostaganem 2700, Algeria.

17 eLaboratory of Plant Resource Development and Food Security in Semi Arid Areas,

18 Department of Biology, University of Bechar, South West of Algeria, BP 417, Algeria. Function & 19 fDepartment of Biology, Faculty of Nature and Life Sciences, University of Saida, BP

20 138 ENNASR 2000 Saida, Algeria.

21 Food

22 *Authors to whom correspondence should be addressed: email: [email protected]

23 telephone +351273303219; fax +351273325405; email: [email protected] telephone

24 +351273303285

Food & Function Page 2 of 28 View Article Online DOI: 10.1039/C8FO01392F

26 Abstract

27 The aim of this study was to characterize the individual phenolic profile, antioxidant,

28 antiinflammatory, cytotoxic, and antimicrobial activities of the hydroethanolic and

29 infusion extracts prepared from Algerian Sahara Juniperus phoenicea L. and Cotula

30 cinerea (Del). The phenolic profile was determined by liquid chromatography coupled

31 to a diode array detector and electrospray ionization mass spectrometer (LCDAD

32 ESI/MS). A total of thirteen and nine individual phenolic compounds were identified in

33 J. phoenicea and C. cinerea, respectively. 3pCoumaroylquinic acid, quercetin and

34 myricetin Opentoside were the major compounds present in J. phoenicea, on the other

35 hand, C. cinerea presented luteolin7Oglucoside, luteolinOmalonylhexoside, and 5 Manuscript

36 Ocaffeoylquinic acid as the main molecules. In general, all samples exhibited

37 interesting antioxidant activity when compared to the standard Trolox, but J. phoenicea

38 extracts presented the highest bioactivity. Likewise, all the samples exhibited anti

39 inflammatory activity, thus J. phoenicea hydroethanolic extract showed the highest Accepted

40 potential (88 ± 8 µg/mL). In addition, the cytotoxicity was evaluated towards a panel of

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 41 four selected cell lines (HeLa, NCIH460, MCF7 and HepG2), and all the extracts

42 showed cytotoxic effects, being J. phoenicea extracts the most effective. The in vitro

43 antimicrobial activity of the plant extracts was moderate, thus being Grampositive Function

44 bacteria more sensitive than the Gramnegative strains (MIC values between 5 and 20 &

45 mg/mL). The present work suggests J. phoenicea and C. cinerea as sources of bioactive

46 ingredients with potential use in the food and pharmaceutical industries. Food 47

48 Keywords: Juniperus phoenicea L.; Cotula cinerea (Del); Bioactivities; Phenolic

49 compounds; LC–DADESI/MS.

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50 1. Introduction

51 Medicinal plants are recognized for their therapeutic effects and biological

52 characteristics, due to the presence of several bioactive substances belonging to

53 different molecule classes, such as terpenoids, alkaloids, and phenolic compounds, like

54 flavonoids, tannins, coumarins and phenolic acids 1. These biomolecules are widespread

55 in different plant parts, such as fruits, leaves, and seeds 2. Nowadays, there is an

56 increasing interest in the consumption of phytochemicals, like phenolic compounds, due

57 to their important health effects which are caused by their preventive properties against

58 a diverse of pathologies mainly related with oxidative stress 3. Many authors have

59 reported the beneficial effects of polyphenols and mentioned that they present Manuscript

60 innumerous bioactive properties, such as antibacterial 4,5, antiviral, antifungal 6,

61 cytotoxic 7, and antiinflammatory 8,9 properties. These properties depend on their

10 62 specific chemical structures and much attention has been paid to the extraction and

63 isolation of polyphenols from herbs with the ability of preventing food and living Accepted

64 systems from peroxidative damages 11.

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 65 In order to search for effective natural bioactive compounds, the current study selected

66 two traditional medicinal plants based on their ethnopharmacological importance,

67 being applied as pharmaceutical and dietary supplements. Among the medicinal plants, Function

68 Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del) are Algerian Saharan herbs, harvested &

69 from southwest of Algeria and known for having biological properties. J. phoenicea

70 (Cupressaceae) is a small shrub of the Mediterranean basin, mostly distributed in its Food 71 western part, largely growing in the Algeria mountains 12. J. phoenicea is considered an

72 important medicinal plant used in folk medicine, where the decoctions and infusions of

73 its leaves are used to treat diarrhea, rheumatism, broncopulmonary, diuretic, diabetic

74 and obesity diseases 13,14; it is also used in the treatment of hepatotoxicity and

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75 nephrotoxicity 15. A recent study on J. phoenicea growing in Egypt reported that the

76 crude extracts (petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, and methanol) showed

77 antiproliferative activity against lung carcinoma (H460), liver tumor (HepG2), and

78 breast carcinoma (MCF7) cell lines 16. Moreover, the hydroethanolic extract prepared

79 from Algerian species demonstrated antioxidant activity 17. The main bioactive

80 compounds described in Juniperus species, are mostly phenolic compounds 18.

81 Boulanouar et al. 17 analyzed these molecules using spectrophotometric methods, and

82 concluded that hydroalcoholic extracts of the aerial parts of J. phoenicea mainly

83 presented phenolic acids and flavonoids. In addition, it was also reported the presence

84 of the biflavone, agathisflavone, isolated from the hydroalcoholic extracts of J. Manuscript

85 phoenicea leaves growing in Egypt 16. Whereas, four flavonoid derivatives

86 (cupressuflavone, hinokiflavone, hypolaetin7Oβxylopyranoside and catechin)

87 extracted from petroleum ether, chloroform, and methanol fractions obtained from the

88 crude ethanol extract of the aerial parts of J. phoenicea growing in Saudi Arabia were Accepted

89 isolated and detected by Alqasoumi et al. 19.

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 90 Cotula cinerea (Del) is a synonymy of Brocchia cinerea (Dil.) Vis. (Asteraceae), it has

91 been known as a xerophytic herb in Algeria by «Guertouffa» or Saharan camomile

12 92 (English), and is commonly found in the Algerian desert . It is traditionally used as a Function

93 infusions and decoction to treat digestive troubles, rheumatoid arthritis, urinary and &

94 pulmonary infections, fever, headaches, migraines, coughs, and joints inflammation 20.

95 This species has been described to have antioxidant, analgesic, antiseptic, and Food 96 antimicrobial properties 21–24. The main compounds have been isolated from the

97 methanol extracts of Egyptian and Moroccan C. cinerea, and identified as phenolic

98 acids (neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, and 3,4

99 dicaffeoylquinic acid) and flavonoids (luteolin4´Oglucoside, luteolin7OβD

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100 glucoside, luteolin6hydroxy7OβDglucoside, apigenin7Oαrhamnoside,

101 apigenin6Carabinosyl8Cglucoside, isoschaftoside, quercetin3OβDglucoside,

25,26 102 and 5,3',4'trihydroxy 3,6,7trimethoxyflavone) .

103 In this study, the most common form of consumption (infusion) of J. phoenicea and C.

104 cinerea (Del) collected in southwest of Algeria was compared with the crude

105 hydroethanolic extract. The extracts of both species were characterized in terms of

106 phenolic composition and bioactive properties, such as antioxidant, cytotoxic, anti

107 inflammatory, and antimicrobial activities.

108

109 2. Materials and Methods Manuscript

110 2.1. Plant material

111 The samples of Juniperus phoenicea L. leaves and Cotula cinerea (Del) aerial parts

112 were collected in southwest of Algeria EL Bayadh (33° 05′ 18″ Nord; 0° 34′ 52″ Est)

113 and Bechar (31° 01′ 00″ Nord 2° 44′ 00″ Oest), respectively, during the flowering Accepted

114 period (May 2015). The plants were identified by Okacha Hasnaoui, Professor in the

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 115 University of Tlemcen, Algeria. The samples were dried and ground to a fine powder (~

116 20 mesh) prior to analysis.

117 Function

118 2.2. Extraction procedure &

119 Hydroethanolic and infusion extracts were prepared from J. phenica leaves and C.

120 cinerea aerial parts. The hydroethanolic extraction (80% ethanol, 30 mL) was Food 121 performed by maceration (150 rpm), with 1 g of each sample at 25 °C during 1 h and

122 then filtered; the residue was reextracted, using the same methodology. Afterwards, the

123 extracts were evaporated in order to remove the ethanol, under reduced pressure (rotary

124 evaporator Büchi R210, Flawil, Switzerland). For aqueous extracts, 2 g of plant

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125 material was infused with boiling distilled water (200 mL) for 15 min and then filtered.

126 Both extracts were previously frozen before lyophilizing (FreeZone 4.5, Labconco,

127 Kansas City, MO, USA), in order to obtain a dry extract.

128 The lyophilized hydroethanolic and infusion extracts were dissolved in ethanol/water

129 (80:20, v/v) and water, respectively, to obtain a stock solution of 10 mg/mL for the

130 antioxidant activity assays; 5 mg/mL for the phenolic compounds characterization; 20

131 mg/mL in culture medium for the antimicrobial assays; and, finally, 8 mg/mL in water

132 for antiinflammatory and cytotoxicity tests. In the bioactivity evaluation assays, the

133 stock solutions were further diluted and tested.

134 Manuscript

135 2.3. Phenolic compounds characterization

136 LCDADESI/MSn (Dionex Ultimate 3000 UPLC, Thermo Scientific, San Jose, CA,

137 USA) was used for phenolic compounds characterization (identification and

138 quantification), as previously detailed by Bessada et al. 27. The detection was preformed Accepted

139 using a diode array detector (DAD, 280, 330, and 370 nm, as preference wavelengths)

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 140 and with a ESI mass spectrometer working in negative mode (Linear Ion Trap LTQ XL

141 mass spectrometer, Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA). Calibration curves were

142 prepared with different available standards and the results were expressed as mg/g of Function

143 extract. &

144

145 2.4. Antioxidant activity assays Food 146 Four different in vitro methods were used to evaluate the antioxidant activity, DPPH

147 radicalscavenging activity, reducing power, βcarotene bleaching inhibition assay and

148 lipid peroxidation inhibition by TBARS using a methodologies previously described by

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28 149 Sobral et al. . Results were expressed as EC50 value (g/mL) and Trolox was used as

150 positive control.

151

152 2.5. Anti-inflammatory activity assay

153 The LPSinduced NO (nitric oxide) production by Murine macrophage (RAW 264.7)

154 cell lines was determined as nitrite concentration in the culture medium according to the

28 155 method previously performing by Sobral et al. . Results were expressed in EC50 values

156 (µg/mL), and Dexamethasone was used as a positive control.

157

158 2.6. Cytotoxicity assays Manuscript

159 The cytotoxicity was evaluated against four human tumor cell lines, MCF7 (breast

160 carcinoma), NCIH460 (nonsmall cell lung cancer), HeLa (cervical carcinoma), HepG2

161 (hepatocellular carcinoma), and nontumor porcine liver cell line (PLP2), using the

162 Sulphorhodamine assay previously performed by Sobral et al. 28. Results were Accepted

163 expressed as GI50 (µg/mL) and Ellipticine was used as a positive control.

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 164

165 2.8. Antimicrobial activity assays

166 The antimicrobial activity of the samples was tested against a range of strains from Function

167 different microorganism: four Grampositive bacteria (MRSA methicillinresistant &

168 Staphylococcus aureus, MSSA methicillinsusceptible Staphylococcus aureus, Listeria

169 monocytogenes and Enterococcus faecalis) and five Gramnegative bacteria Food 170 (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Morganella morganii and

171 Pseudomonas aeruginosa) and one yeast (Candida albicans). The minimal inhibitory

172 concentrations (MIC) were performed by the microdilution method using the p

173 iodonitrotetrazolium chloride (INT) colorimetric assay according to Dias et al. 29. The

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174 Minimal bactericidal concentration (MBC) and minimal fungicidal concentration

175 (MFC) were calculated by adding 10 µL of the MIC value, to fresh culture medium to

176 see if the bacteria were able to grow. After 24h of incubation at 37 ºC, MBC and MFC

177 were registered. The antibiotic susceptibility profile of microorganisms was previously

178 described 29.

179

180 2.8. Statistical analysis

181 For each species, three samples were used and all the assays were carried out in

182 triplicate. Statistical comparisons were performed using an SPSS Statistics v. 23.0

183 program, and differences were significant at the level of α = 0.05, by using the oneway Manuscript

184 analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s HSD. When necessary, a Student´s

185 ttest was used, to determine the significant difference between less than three different

186 samples, with p = 0.05. All the data was expressed as means values with the standard

187 deviations (SD). Accepted

188

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 189 3. Results and discussion

190 3.1. Phenolic compounds characterization

191 As shown in Tables 1 and 2, a total of thirteen and nine individual phenolic compounds Function

192 were identified in J. phoenicea and C. cinerea, respectively. Nine flavonols, one &

193 biflavone, flavan3ol, flavone, and a phenolic acid were identified in J. phoenicea, on

194 the other hand, four flavones, two flavonols, and three phenolic acids were identified in Food 195 C. cinerea.

JP JP JP 196 Regarding J. phoenicea, peaks 2 , 6 and 9 were positively identified according to

197 their retention time, mass and UVvis characteristics by comparison with commercial

198 standards. The remaining compounds were tentatively identified based on their

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199 pseudomolecular ions and fragmentation pattern. Flavonols were the most abundant

200 flavonoids present in this species, representing 5157% of the phenolic composition,

JP JP JP JP JP 201 being peaks 3 , 4 , 5 , 7 , and 8 identified as myricetin glycosides based on their

2 202 UV spectra (λmax around 356 nm) and the production of a MS fragment ion at m/z 317.

JP JP JP 203 Similarly, peaks 9 , 10 and 11 were identified as quercetin (λmax around 353 nm,

2 204 MS fragment at m/z 301) glycosides, and peak 13 as isorhamnetin (λmax around 350 nm,

205 MS2 fragment at m/z 315) glycoside. Peak 3JP ([MH] at m/z 611) was identified as

2 206 myricetinOpentosylOhexoside, in which the MS fragments revealed the alternative

207 loss of pentosyl (m/z at 479; 132 u) and hexosyl (m/z at 317; 162 u) residues,

208 indicating location of each residue on different positions of the aglycone. The remaining Manuscript

209 compounds presented MS2 fragments corresponding to distinct losses of dihexosyl (324

210 mu), hexosyl (162 mu), rhamnosyl (146 mu), and pentosyl (132 mu) moieties. An

211 elution order coherent with the type of sugar substituents, and according to their

212 expected polarity was presented, although the position and nature of the sugar moieties Accepted

213 could not be identified, because their retention times did not correspond to any of the

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 214 standards available. Peak 7 was identified as myricetin3Orhamnoside, previously

215 identified in berries and leaves of J. phoenicea by Ali et al. 15. Peak 12 ([MH] at m/z

216 551) was identified as a methylbiflavonoid taking into account the findings of Function

30 31

217 Innocenti et al. and Miceli et al. , identifying this compound in fruits of Juniperus &

218 communis. Peak 1 ([MH] at m/z 337) was identified as 3pcoumaroylquinic acid

219 taking into account the hierarchical keys previously reported by Clifford et al. 32. This Food 220 was the only phenolic acid present, and accounted in 4349 % of the total phenolic

221 compounds.

222 In general, 3pcoumaroylquinic acid was the main phenolic compound present in J.

223 phoenicea, followed by quercetinOpentoside, and myricetinOpentoside. Moreover,

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224 the hydroethanolic extract presented a higher concentration in these then the infusion

225 extract.

226 The obtained individual profile was different from those reported for the Egyptian J.

227 phoenicea berries and leaves’ extracts, which revealed the presence of two major

228 biflavonoid compounds; cupressuflavone and amentoflavone in the ethyl acetate

229 fraction, four flavonoids (myricitrin, quercetin, cosmosin, quercitrin), and two phenolic

230 acids (pcoumaric acid and caffeic acid) in the methanol fraction 15. The only compound

231 that was similar to the one identified in the present work was myricitrin (peak 7).

232 Moreover, Alqasoumi et al. 19 studied J. phoenicea petroleum ether, chloroform, and

233 methanol fractions from Saudi Arabia, resulting in the identification of five known Manuscript

234 diterpenoids (13epicupressic acid, imbricatolic acid, 7αhydroxysandaracopimaric

235 acid, 3βhydroxysandaracopimaric acid and isopimaric acid) and four flavonoid

236 derivatives (cupressuflavone, hinokiflavone, hypolaetin7Oβxylopyranoside, and (+)

237 catechin). While, Maamoun et al. 16 identified 4 flavonoids (isoetin7Oβglucoside, Accepted

238 isoscutellarein, amentoflavone, and agathisflavone) from ethanol, petroleum ether,

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 239 chloroform, ethyl acetate, and methanol extracts of J. phoenicea growing in Egypt.

240 These differences could be attributed to several factors such as geographical location,

241 the part of the plant used and especially the use of different extraction methodologies Function

242 and solvents. &

243 Concerning C. cinerea, phenolic acids were the minor group of compounds present (22

244 28%), while flavonoids represented 7278% of the phenolic composition. Peaks 1cc, 6cc Food 245 and 8cc were identified as 5Ocaffeoylquinic acid, 3,5Odicaffeoylquinic acid, and 4,5

246 Ocaffeoylquinic acid respectively, according to the hierarchical keys previously

247 developed by Clifford et al. 32. These compounds were also found in the areal parts of

248 Morocco C. cinerea methanol extracts 25. The remaining compounds correspond to

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2 249 flavonoids derivatives, mainly luteolin (λmax around 345 nm, MS fragment at m/z 285)

2 cc 250 and quercetin (λmax around 350 nm, MS fragment at m/z 301) glycosides. Peaks 2 ([M

cc cc cc 251 H] at m/z 609), 3 ([MH] at m/z 463), 4 ([MH] at m/z 579), and 5 ([MH] at m/z

252 447), were identified as luteolindihexoside, quercetinOhexoside, luteolinOpentosyl

253 hexoside, and luteolin7Oglucoside (identified in comparison to a commercial

254 standard), using a similar reasoning as for the compounds described in J. phoenicea.

255 Furthermore, Peaks 7 ([MH] at m/z 549) and 9 ([MH] at m/z 533) released a MS2

256 fragment at m/z 301 and 285 ([MH16286] , loss of a malonylhexoside moiety), being

257 tentatively assigned as quercetin and luteolin Omalonylhexoside, respectively.

258 Overall, luteolin7Oglucoside, luteolinOmalonylhexoside, and 5Ocaffeoylquinic Manuscript

259 acid were the main molecules present in both infusion and hydroethanolic extracts

260 obtained from C. cinerea, thus the latter extracts revealed the highest concentration in

261 all the detected compounds.

262 Dendougui et al. 33 studied the ethanolic extract of C. cinerea from Algeria revealing Accepted

263 the presence of germacranolide, tatridin A, and, seventeen flavonoid derivatives, such as

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 264 luteolin, apigenin, and quercetin glycosides. Khallouki et al. 25 studied Morocco C.

265 cinerea methanol extracts, describing the presence of phenolic acids (chlorogenic acids

266 and dicaffeoylquinic acids derivatives) and one flavonoid (luteolin4´Oglucoside), Function

267 thus being very similar to the herein described phenolic acids composition. Ahmed et al. &

268 26 reported different flavonoids in this species, namely: 7OβDdiglucoside and 7Oβ

269 Dglucoside of luteolin, and luteolin itself, as well as apigenin7OαLrhamnoside. All Food 270 of these described profiles presented some similarities to the ones presented herein.

271 Thus, the variances in the chemical composition could also be due to the same factors

272 mentioned above for the precedent species, including different types of extraction

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273 methodologies, the nature of solvents used; the bioclimatic zone divergence and the

274 plant parts used to obtain the extracts.

275

276 3.2. Antioxidant activity

277 The results regarding the antioxidant activity of both J. phoenicea and C. cinerea

278 hydroethanolic and infusion extracts are shown in Table 3. For a broader evaluation of

279 the antioxidant capacity, four assays were carried out: DPPH radical scavenging

280 activity, reducing power, βcarotene bleaching inhibition and lipid peroxidation

281 inhibition in brain cell homogenates (TBARS). The results were compared with the

282 standard Trolox and expressed as EC50 values. Based on these results, J. phoenicea and Manuscript

283 C. cinerea extracts showed interesting antioxidant properties, particularly for the

284 TBARS assays, in which all samples demonstrated to be two to three times more

285 effective than Trolox, with EC50 values of 7.6 ± 0.3 and 7.4 ± 0.3 µg/mL for

286 hydroethanolic extracts and EC50 of 6.7 ± 0.2 and 7.5 ± 0.2 µg/mL for infusion extracts Accepted

287 of J. phoenicea and C. cinerea, respectively. These extracts showed antilipid

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 288 peroxidation proprieties, which has a great interest in food preservation 11. The

289 scavenging activity evaluated by the DPPH assay, showed that J. phoenicea presented

290 very low EC50 values for both extracts (12 ± 1 and 22.4 ± 0.6 µg/mL, for hydroethanolic Function

291 and infusion extracts, respectively), indicating a high ability to donate hydrogen and &

292 scavenge the free DPPH radical, probably due to its phenolic composition. The results

293 obtained were higher than the ones reported by El Jemli et al. 34 and Keskes et al. 14, Food 294 who evaluated the ability of Morrocan J. phoenicea water extract regarding the

295 scavenging activity of DPPH (EC50= 30.7 ± 0.1 µg/mL), as also Tunisien J. phoenicea

296 ethyl acetate extract (EC50= 220 µg/mL) and hexane extract, which did not show

297 activity using this method. Nevertheless, Keskes et al. 14, reported the methanol extract

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298 with a higher ability to scavenge DPPH radicals (EC50 value = 2 g/mL). Taviano et al.

299 35 studied the antioxidant activity of the methanol and water branches extracts of five

300 different Turkish Juniperus species, which showed a weaker activity in comparison to

301 the herein studied extracts. On the other hand, C. cinerea infusion extract demonstrated

302 a higher DPPH radical scavenging activity (EC50= 24.8 ± 0.2 µg/mL) in comparison to

303 its hydroethanolic extract (EC50= 26.0 ± 0.1 µg/mL), contrarily to what happened for all

304 the remaining methods for both species. Moreover, the activity of all the samples were

305 higher than the ones displayed by the commercial standard Trolox (EC50= 42 ± 1

306 µg/mL). This data is in accordance with the results obtained by Khallouki et al. 25,

307 which also reported a strong antioxidant capacity (DPPH and FRAP assays) of the Manuscript

308 methanol extract from Moroccan C. cinerea, and correlated this activity with its

309 significant content in echinoids and flavonoids. In fact, both extracts from the two plant

310 species revealed a relevant reducing power, which increased with the increase of the

311 extract concentration, ranging from 12.04 ± 0.4 to 38.1 ± 1 µg/mL, being more effective Accepted

312 than Trolox (41 ± 1 µg/mL). Once more, J. phoenicea hydroethanolic and infusion

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 313 extracts exhibited the best ability to reduce Fe3+ to Fe2+ (Table 3). The susceptibility of

314 an antioxidant capable to neutralize free radicals and inhibit the lipid peroxidation can

315 be evaluated through the βcarotene bleaching inhibition assay. For this methodology, Function

316 the hydroethanolic extracts of J. phoenicea and C. cinerea demonstrated the highest &

317 activity (EC50 values of 11.57 ± 0.08 and 14.7 ± 0.2 µg/mL, respectively), revealing a

318 higher activity than Trolox (EC50 values = 18.0 ± 1 µg/mL), while the infusion extract Food 319 of both plants showed lower or closer activity in comparison to the commercial

320 standard. The effectiveness of the hydroethanolic extracts can be explained by their

321 higher concentration in phenolic compounds, which could influence their capacity to

322 scavenge free radicals and prevent lipid peroxidation 36.

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323

324 3.3. Anti-inflammatory activity

325 The antiinflammatory effect was evaluated using Murine macrophagelike RAW 264.7

326 cells and quantified through the nitric oxide (NO) production, being the results

327 summarized in Table 3. All the samples revealed inhibition of NO production with

328 EC50 values ranging between 51 ± 4 and 122 ± 6 µg/mL. It can be noticed that the

329 highest activity was shown by both extracts of J. phoenicea (hydroethanolic and

330 infusion, with EC50 values = 51 ± 4 and 70 ± 5 µg/mL, respectively). This activity could

331 be attributed to the high content of 3pcoumaroylquinic acid and the flavonol

332 derivatives found in this species. The obtained results are also in agreement with those Manuscript

333 reported by Jeong et al. 37, that found a powerful antiinflammatory activity in Korean

334 Juniper rigida methanolic extract and its fractions (nhexane, chloroform, ethyl acetate

335 and nbutanol). This ability was attributed to the phenolic composition present in the

336 extract, especially the presence of phenylpropanoid glycosides, with phydroxy groups, Accepted

337 massoniaside A, (+)catechin, and amentoflavone, that effectively inhibited LPS

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 338 induced NO production in RAW264.7 cells 37. Otherwise, C. cinerea hydroethanolic

339 and infusion extracts revealed lower inhibition of the NO production, with EC50 values

340 of 105 ± 9 and 122 ± 6 µg/mL, respectively. The activity observed for both extracts of Function

341 C. cinerea could be attributed to the presence of phenolic compounds, such as luteolin &

342 7Oglucoside, luteolinOmalonylhexoside, and 5Ocaffeoylquinic acid. These

343 findings could be associated to the important usage of this species in traditional African Food 344 medicine 25,33. To the author´s best knowledge, this is the first report on the anti

345 inflammatory potential of J. phoenicea leaves and C. cinerea areal parts.

346

347 3.4. Cytotoxic effects

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348 The results regarding the antiproliferative effects of J. phoenicea and C. cinerea

349 hydroethanolic and infusion extracts are summarized in Table 4. All the tested samples

350 presented significant cytotoxic properties for the four human tumor cell lines tested

351 (MCF7, NCIH460, HeLa and HepG2), with GI50 values ranging from 9 ± 1 to 101 ±

352 10 µg/mL. Furthermore, the samples also presented cytotoxic effects against nontumor

353 cells (PLP2 porcine liver primary cells), thus the GI50 values were much higher than

354 those needed to exert antiproliferative activity in tumor cells, and also much higher than

355 those exhibited by the standard Ellipticine. J. phoenicea hydroethanolic and infusion

356 extracts demonstrated a higher cytotoxic potential in comparison with C. cinerea. The

16 357 obtained results are also in agreement with those reported by Maamoun et al. , which Manuscript

358 found higher activity against lung carcinoma (H460), liver tumor (HepG2), and breast

359 carcinoma (MCF7) cell lines with the crude extract of Egyptian J. phoenicea leaves.

360 Consecutively, these authors screened the flavonoid agathisflavone, which recorded

361 higher cytotoxicity in the lung carcinoma (H460) 16. Additionally, significant in vivo Accepted

362 hepatoprotective effect was reported for J. phoenicea leaves 15,38. Tavares et al. 39, also

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 363 proved the neuroprotective potential of the phenolic fractions obtained from Portuguese

364 J. phoenicea and other species of Juniperus, attributing this capacity to the biflavones

365 detected, especially to amentoflavone. Furthermore, J. phoenicea is well known for Function

366 containing lignans which are recognized by an interesting antiproliferative and antiviral &

367 activities 40. Many reports supposed that Juniperus species could be a source of

368 bioactive compounds with potential anticancer effects 41. Food 369 On the other hand, C. cinerea hydroethanolic and infusion extracts also presented

370 antiproliferative activity, being more active in the following order: HepG2 (31 ± 2 and

371 42 ± 4 µg/mL), HeLa (47 ± 5 and 51 ± 4 µg/mL), NCIH460 (50 ± 3 and 101 ± 10

372 µg/mL) and MCF7 (53 ± 4 and 77 ± 6 µg/mL). In fact, the cytotoxicity of C. cinerea

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373 extracts was lower than the one observed for J. phoenicea hydroethanolic and infusion

374 extracts; these differences could be due to the distinct individual phenolic profiles of

375 both extracts. It has been previously highlighted that some phenolic compounds can

376 contribute to the protection of cancer disease, such as pcoumaroylquinic acid,

377 quercetin, and myricetin derivatives, which were the major phenolic compounds found

378 in J. phoenica. These compounds have exhibited a protective role for in vivo

379 hepatotoxicity and nephrotoxicity 15. To the author’s best knowledge there are no

380 previous reports regarding the cytotoxic activity of C. cinerea.

381

382 3.5. Antimicrobial activity Manuscript

383 The antimicrobial activity results of both J. phoenicea and C. cinerea extracts

384 (hydroethanolic and infusion) tested against ten pathogenic strains, and expressed as the

385 minimal inhibitory concentrations (MIC), minimal bactericidal concentrations (MBC)

386 and minimal fungicidal concentrations (MFC), are presented in Table 5. Overall, the Accepted

387 extracts obtained from both species were found to have moderate to weak activity, with

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 388 a higher effectiveness towards Grampositive bacteria, in comparison with Gram

389 negative. MIC values ranged between 5 and 20 mg/mL, and the inhibitory effect tested

390 against all the bacterial strains were more bacteriostatic than bactericidal. The strains Function

391 MRSA and MSSA demonstrated to be more susceptible to both J. phoenicea (MIC= 5 &

392 and 10 mg/mL, respectively) and C. cinerea (MIC= 10 and 5 mg/mL, respectively)

393 extracts. On the other hand, Morganella morganii also showed susceptibility towards J. Food 394 phoenicea extracts reveling MICs and MBCs values of 10 and 20 mg/mL, respectively.

395 Regarding Gramnegative bacteria, J. phoenicea and C. cinerea only presented

396 inhibitory activity for Escherichia coli (MIC= 10 mg/mL) and Klebsiella pneumonia

397 (MIC and MBC = 20 mg/mL). It is important to highlight that both J. phoenicea

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398 extracts had the same behavior on all the bacteria tested, while C. cinerea presented

399 variation between the used extracts, especially for the strains E. faecalis and MSSA.

400 Regarding, the yeast Candida albicans, the extracts did not express any activity up to

401 the maximal tested concentration.

402 The antimicrobial activity of J. phoenicea extract is supported by the studies performed

403 by Hammami et al. 42 , that demonstrated moderate to good activity of Tunisian J.

404 phoenicea aqueous extract, obtained from seeds, and its fractions (methanol and

405 acetone), against Grampositive (Listeria monocytogenes, Listeria innocua, and Listeria

406 ivanovii) and Gramnegative (Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) bacteria.

43 407 In a similar order, Alzand et al. proved a significant growth inhibition of Escherichia Manuscript

408 coli, Staphylococcus aureus, and Klebsiella pneumonia using alcoholic extracts of J.

409 phoenicea barks from India. Whereas, Miceli et al. 31 described the antibacterial activity

410 of different species of Turkish Juniperus (J. communis L. var. communis and J.

411 communis L. var. saxatilis. Pall) methanol extract, which showed moderate capacity Accepted

412 only against Grampositive bacteria. It should also be highlighted that the part of the

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 413 plant used and the phenolic compounds concentration, will also have a great influence

414 on the antibacterial activity obtained for each extract. Thus, the antimicrobial activity

415 obtained for both extracts of J. phoenicea could also be related to the presence of Function

416 phenolic compounds, such as quercetin derivatives and pcoumaroylquinic acid, which &

417 have been recognized for their antimicrobial actions 4,44, supporting the antibacterial

418 effectiveness of the studied species. Food 419 Concerning C. cinerea antibacterial activity, it is in agreement with the results described

23 420 by Bensizerara et al. , which evaluated the antibacterial properties of the extracts

421 obtained from C. cinerea aerial parts using different polarity solvents (ethanol, n-

422 butanol, ethyl acetate and petroleum ether). These authors revealed weak activity for all

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423 the mention extracts, thus the most active fraction was nbutanol. Additionally,

424 Markouk et al. 22, reported that the nbutanol extract obtained from the Moroccan C.

425 cinerea was highly effective against germs in the tested concentrations (ranging from 12

426 to 200 µg/mL). Nevertheless, the inhibition ability of the bacterial growth showed by C.

427 cinerea could also be associated to the important levels of flavonoids, such as quercetin

428 and luteolin derivatives, as also reported by Dendougui et al. 33 and Ahmed et al. 26.

429

430 Overall, the wide range of bioactive properties (antioxidant, antiinflammatory,

431 cytotoxic and antibacterial) showed by the hydroethanolic and infusion extracts of the

432 studied Saharan plants, support their traditional use as a popular remedy in the treatment Manuscript

433 of cancer, infectious and inflammatory diseases. These properties may be related to the

434 presence of different phenolic compounds with variable contents. Thus, further studies

435 are needed to establish the mechanisms of action, supporting the use of these plants in

436 pharmaceutical and food fields. Accepted

437

Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. 438 Acknowledgements

439 The authors are grateful to the Foundation for Science and Technology (FCT, Portugal)

440 and FEDER under Program PT2020 for financial support to CIMO Function

441 (UID/AGR/00690/2013), L. Barros and R. Calhelha contracts. The authors are also &

442 grateful to FEDERInterreg EspañaPortugal programme for financial support through

443 the project 0377_Iberphenol_6_E. Food

444

445 References

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Table 1. Retention time (Rt), wavelengths of maximum absorption in the visible region (λmax), mass spectral data, identification and quantification of phenolic compounds in Juniperus phoenicae L. extracts (mean ± SD) Quantification (mg/g extract) Rt λλλmax [MH] MS2 Tentative Peak Hydroethanolic Infusion Student´s (min) (nm) (m/z) (m/z) identification extract extract ttest 1JP 6.2 310 337 191(100),173(15),163(22),155(7),137(5),119(3) 3pCoumaroylquinic acid1 4.1± 0.1 3.09± 0.03 <0.001 2JP 7.7 278 289 245(100),231(22),205(13),179(20),137(10) Catechin2 0.230± 0.001 0.230± 0.001 <0.001 3JP 13.3 356 611 479(100),317(66) MyricetinOpentosideOhexoside3 0.514± 0.005 0.305± 0.003 <0.001 JP 3

4 14.1 354 641 479(100),317(28) MyricetinOdihexoside 0.50± 0.01 0.230± 0.001 <0.001 Manuscript 5JP 14.5 356 479 317(100) MyricetinOhexoside3 0.40± 0.01 0.337± 0.001 <0.001 6JP 16.5 346 431 341(20),311(100) Apigenin6Cglucoside4 0.023± 0.001 tr

Published on 23 August 2018. Downloaded on 8/25/2018 1:47:39 AM. AM. 1:47:39 on 8/25/2018 2018. Downloaded 23 August on Published 7JP 17.6 357 463 317(100) Myricetin3Orhamnoside3 0.337± 0.001 0.27± 0.01 <0.001 8JP 18.0 356 449 317(100) MyricetinOpentoside3 1.00± 0.02 0.33± 0.01 <0.001 9JP 18.8 350 463 301(100) Quercetin3Oglucoside3 0.38± 0.01 0.230± 0.01 <0.001

10JP 20.5 354 463 301(100) QuercetinOhexoside3 0.362± 0.001 0.29± 0.01 <0.001 Accepted 11JP 22.4 355 433 301(100) QuercetinOpentoside3 1.033± 0.003 0.48± 0.01 <0.001 12JP 23.4 270,330 551 537(100) Methylbiflavone5 0.31± 0.01 0.243 ± 0.004 <0.001 13JP 26.9 350 447 315(100) IsorhamnetinOpentoside3 0.42± 0.01 0.29± 0.01 <0.001 Total phenolic acids 4.1± 0.1 3.1± 0.03 <0.001

Total flavonoids 5.50± 0.03 3.2± 0.04 <0.001 Function

Total phenolic compounds 9.6± 0.1 6.3± 0.1 <0.001 & tr traces. Standard calibration curves: (1) pcoumaric acid (y = 301950x + 6966.7; R2=0.999); (2) catechin (y = 84950x – 23200; R2=0.999); (3) quercetin3Oglucoside (y =34843x – 160173; R2=0.999) ; (4) apigenin6Cglucoside (y = 107025x + 61531; R2=0.999); (5) apigenin7Oglucoside (y = 10683x – 45794; R2=0.996). When only two samples were present aStudent´s ttest was used to determine the significant difference between two different samples, with α = 0.05.

Food

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Table 2. Retention time (Rt), wavelengths of maximum absorption in the visible region (λmax), mass spectral data, identification and quantification of phenolic compounds in Cotula cinerea (Del) extracts (mean ± SD). Quantification (mg/g extract) Rt λλλmax [MH] MS2 Tentative Peak Hydroethanolic Infusion Student´s (min) (nm) (m/z) (m/z) identification extract extract ttest 1CC 7.2 324 353 191(100),179(10),161(5),135(3) 5OCaffeoylquinic acid1 5.9 ± 0.1 5.9 ± 0.1 0.999 2CC 15.5 342 609 447(20),285(100) Luteolindihexoside2 2.38 ± 0.05 3.1 ± 0.1 <0.001 3CC 15.9 352 463 301(100) QuercetinOhexoside3 1.70 ± 0.04 1.17 ± 0.04 <0.001 CC 2

4 17.9 343 579 285(100) LuteolinOpentosylhexoside 3.3 ± 0.1 1.9 ± 0.1 <0.001 Manuscript 5CC 18.9 345 447 285(100) Luteolin7Oglucoside2 36 ± 1 5.8 ± 0.1 <0.001 6CC 20.4 325 515 353(80),191(100),179(47),173(5),135(7) 3,5ODicaffeoylquinic acid1 4.0 ± 0.1 1.27 ± 0.03 <0.001

Published on 23 August 2018. Downloaded on 8/25/2018 1:47:39 AM. AM. 1:47:39 on 8/25/2018 2018. Downloaded 23 August on Published 7CC 22.4 350 549 505(80),463(5),301(100) QuercetinOmalonylhexoside3 1.39 ± 0.02 1.66 ± 0.03 <0.001 CC 1 8 22.9 327 515 353(78),191(28),179(65),173(100),135(5) 4,5ODicaffeoylquinic acid 4.1 ± 0.2 0.915 ± 0.005 <0.001 9CC 23.8 345 533 489(80),447(10),285(100) LuteolinOmalonylhexoside2 6.6 ± 0.3 6.9 ± 0.2 0.168 Total phenolic acids 14.1 ± 0.1 8.12 ± 0.04 <0.001 Accepted Total flavonoids 51 ± 2 20 ± 1 <0.001 Total phenolic compounds 65 ± 1 29 ± 1 <0.001

Standard calibration curves: (1) chlorogenic acid (y = 168823x – 161172; R2= 0.999); (2) apigenin7Oglucoside (y = 10683x – 45794; R2=0.996); (3) quercetin3O glucoside (y = 34843x – 160173; R2= 0.999). When only two samples were present a Student´s ttest was used to determine the significant difference between two different

samples, with α = 0.05. Function

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Table 3. Antioxidant activity and NO production inhibition capacity of J. phoenicae and C. cinerea extracts (mean ± SD).

J. phoenicea C. cinerea Hydroethanolic Infusion Hydroethanolic Infusion Positive extract extract extract extract control*

Antioxidant activity (EC50values, µg/mL) DPPH scavenging activity 12± 1d 22.4± 0.6c 26.0± 0.1a 24.8± 0.2b 42 ± 1

Reducing power 12.0± 0.4d 18.2± 0.3c 31.9± 0.2b 38± 1a 41 ± 1 Manuscript βcarotene bleaching inhibition 11.57± 0.08c 20± 1a 14.7± 0.2b 20.2± 0.8a 18 ± 1

Published on 23 August 2018. Downloaded on 8/25/2018 1:47:39 AM. AM. 1:47:39 on 8/25/2018 2018. Downloaded 23 August on Published TBARS inhibition 7.6± 0.3a 6.7± 0.2b 7.4±0. 3a 7.5± 0.2a 23 ± 1

Antiinflammatory activity (EC50 values, µg/mL)

Nitric oxide (NO) production 51 ± 4d 70 ± 5c 105 ± 9b 122 ± 6a 16 ± 1 Accepted

*Trolox and dexamethasone for antioxidant and antiinflammatory activities, respectively. The antioxidant activity was expressed as EC 50 values (mean ± SD), what means that higher values correspond to lower reducing power or antioxidant potential. EC50: extract concentration corresponding to 50% of antioxidant activity or 0.5 of absorbance in reducing power assay. Results of antiinflammatory activity are expressed in EC50 values: sample concentration providing 50% of inhibition of nitric oxide (NO) production. In each row different letters mean significant differences between extract (p<0.05).

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Table 4. Cytotoxic properties of J. phoenicae and C. cinerea extracts in human tumor cell lines and nontumor liver primary cells (mean ± SD).

J. phoenicae C. cinerea Hydroethanolic Infusion Hydroethanolic Infusion Ellipticine extract extract extract extract

Human tumor cell lines (GI50 values, µg/mL) MCF7 (breast carcinoma) 11± 1d 19± 1c 53± 4b 77± 6a 0.91± 0.04

NCIH460 (nonsmall cell lung cancer) 30± 1c 51± 3b 50± 3b 101± 10a 1.03± 0.09 Manuscript HeLa (cervical carcinoma) 9± 1d 17± 2c 47± 5b 51± 4a 1.91± 0.06

Published on 23 August 2018. Downloaded on 8/25/2018 1:47:39 AM. AM. 1:47:39 on 8/25/2018 2018. Downloaded 23 August on Published HepG2 (hepatocellular carcinoma) 15± 1d 22.4± 0.7c 31± 2b 42± 4a 1.1± 0.2

Nontumor cells (GI50 values, µg/mL)

PLP2 (porcine liver primary cells) 88± 8d 137± 12b 120± 8c 198± 5a 3.2± 0.7 Accepted

GI50 values (mean ± SD) correspond to the sample concentration achieving 50% of growth inhibition in human tumor cell lines or in liver primary culture PLP2.In each row different letters mean significant differences between extract (p<0.05).

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Table 5. Antibacterial and antifungal activity of J. phoenicea and C. cinerea extracts (MIC, MBC and MFC values, mg/mL).

Antibacterial activity Gramnegative bacteria Grampositive bacteria Yeast Escherichia Pseudomonas Klebsiella Proteus Morganella Enterococcus Listeria Candidat MRSA MSSA coli aeruginosa pneumoniae mirabilis morganii faecalis monocytogenes albicans MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC J. phoenicea Hydroethanolic extract 10 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 10 20 10 >20 20 >20 5 >20 10 >20 >20 >20

Infusion extract 10 >20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 10 20 10 >20 20 >20 5 >20 10 >20 >20 >20 Manuscript C. cinerea Hydroethanolic extract >20 >20 >20 >20 20 20 >20 >20 >20 >20 20 >20 20 >20 10 >20 5 >20 >20 >20

Published on 23 August 2018. Downloaded on 8/25/2018 1:47:39 AM. AM. 1:47:39 on 8/25/2018 2018. Downloaded 23 August on Published Infusion extract >20 >20 >20 >20 20 20 >20 >20 >20 >20 >20 >20 20 >20 10 >20 5 20 >20 >20 MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus; MSSA methicillin susceptible S. aureus; MIC minimal inhibitory concentration; MBC minimal bactericidal concentration.

Accepted

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Phenolic profile, and in vitro bioactive potential of Saharan Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea (Del) growing in Algeria

Dalila Ghouti, Wahiba Rached, Moussaoui Abdallah, Tânia C.S.P. Pires, Ricardo C. Calhelha, Maria José Alves, Lazzouni Hamadi Abderrahmane, Lillian Barros, Isabel C.F.R. Ferreira

Manuscript

Accepted Published on 23 August 2018. Downloaded 8/25/2018 1:47:39 AM. Function & Food Résumé

Le présent travail est consacré d’une part, à l’étude de la composition chimique, des activités antimicrobienne et antioxydante des huiles essentielles de deux plantes sahariennes Juniperus phoenicea L. et Cotula cinerea (Del) de sud-ouest Algérien et, d’autre part à l'évaluation des propriétés bioactives à savoir les activités antioxydantes, anti-inflammatoires, cytotoxiques et antibactériennes ainsi que leur corrélation avec les composés phénoliques individuels identifiés dans les extrais (infusions, extraits hydroéthanoliques) des ces plantes. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) des huiles obtenues par hydrodistillation révèle la dominance de l'α-pinène (46,437%) pour J. phoenicea L et l'α-thujone (32,35%) pour C. cinerea (Del). L'activité antioxydante évaluée par le test DPPH a montré une capacité bonne à modérée (IC50 = 0,76 et 28 mg / ml) pour les huiles J phoenicea L. et C cinerea (Del) respectivement. Par ailleurs, les résultats de l’activité antibactérienne suggèrent que les souches Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans avec une CMI allant de 0,04 à 0,63 mg / mL sont les souches les plus sensibles à l’huile de J phoenicea L, alors que la meilleure activité de l'huile de C. cinerea recensée agit contre Bacillus subtilis avec une CMI égale à 0,303 mg/ mL.La chromatographie liquide à haute performance (HPLC- DAD-ESI / MS) a permis d’identifier un total de treize et neuf composés phénoliques individuels dans les extraits de J.phoenicea et C.cinerea respectivement. En effet, l'acide p-coumaroylquinique, la quercétine-O-pentoside et la myricétine-O-pentoside sont les principaux composés présents dans J .phoenicea et, C.cinerea a présenté comme molécules principales la lutéoline-7-O-glucoside, la lutéoline-O-malonylhexoside et l'acide 5-O-caffeoylquinique. En général, tous les échantillons ont présenté une activité antioxydante intéressante par rapport au Trolox, avec la capacité antioxydante la plus élevée observée chez J. Phoenicea. En outre, la cytotoxicité est évaluée en utilisant quatre lignées cellulaires tumorales humaines: HeLa (cancer du col utérin), NCI-H460 (carcinome pulmonaire non petit), MCF-7 (adénocarcinome du sein), HepG2 (carcinome hépatocellulaire) et montre une activité marquée pour tous les échantillons et sans toxicité pour les cellules hépatiques, notamment pour les extraits de J phoenicea L (IG50 allant de 9 à 51 μg / mL ). L’activité antimicrobienne in vitro des extraits des deux plantes donnent une activité modérée, avec une sensibilité totale aux souches gram positives par rapport au gram négatif, leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) se situaient entre 5 et 20 mg/mL. Les souches de Gram négatif testée apparaissant une résistance vers l’extrait hydroethanolique de C. cinerea. Sa meilleure activité d'inhibition de la croissance est remarquée contre le SARM (Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline) et le SASM (Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline) avec des valeurs de MIC comprises entre 5 et 10 mg/mL. La présence contemporaine de bioactivités suggère que J. phoenicea L. et C cinerea (Del) peuvent être une source de tels nouveaux conservateurs dans les industries alimentaires et pharmaceutiques.

Mot-clés: J. phoenicea L, C cinerea (Del), activités biologiques, composés phénoliques, huiles essentielles, HPLC-DAD-ESI / MS, CPG-SM.

الملخص: ك ه لعل من ج لس لتكيب لييئي ، لش ل ليب ل لأكس ليتين لعيين لستصين من لتتين لصحيتين Juniperus Cotula Cinerea.Del Phoenicea L لحي لبي لغبي لئ. من ج أخ، تقي لصئص ليلجي مثل : لش ل لأكس ،ل لالت ، ل لس ل لتيي ، فا عن ت مع لك لفيلي لفي لح في لستص )لق لئي ، مستص ايثن لئي ( لتين لتتين .كشف لفصل لمتغفي لغ ميف لت (GC/SM) ليتيين لقين عن هي Pinène – α (%46.437) في Thujone - α Juniperus Phoenicea L (32.35%) بلس Cotula Cinerea .أض لش ل لأكس ل تم خت بيق تثيط ل لح ع لق لي إل معتل مع )IC50 = 0.76 0.28 مغ/مل ( ليتي Cotula Cinerea Juniperus Phoenica L ع لتلي .من نحي أخ ، تشي نتئج لش ل لتيي إل أ ساا لتيي Bacillus Cereus ,Bacillus Candida Albicans Subtilis , Pseudomonas Aeruginosa , Micrococcus Luteus مع MIC تت من 0.04 إل 0.63 مغ/مل ،كنت أكث حسسي ليت Juniperus Phoenica L ، في حين سل أفل نش ليت لح Cotula Cinerea ض Bacillus Subtilis مع MIC تس 0.303 مغ/مل. سح لفصل لمتغفي لسئل عي أء (MS/HPLC-DAD-ESI) م معه ثاث عش تسع مك فيلي في في لستص Cotula Juniperus Phoenica L (Cinerea(Del ع لتلي .في لقع La Quercétine - 0-Pentoside ، L’acide -P-Coumaroyliquinique هي لك لئيسي لج في Juniperus Phoencea L .في حين تقL’acide 5-0-Caffeoyliquininque ، Lutéoline-0-Malonylhexoside ، La Lutéoline7-0-Glucoide : Cotula Cinerea كي ئيسي .بشل ع أ جيع لعي نش م لأكس مثي لاهت مقن مع Trolox ،مع أع ق م لأكس لحت ع Juniperus Phoenicea L بإضف إل لك ،يتم تقييم لش ل لس ض أبع أن من لاي لسني لشي HELA )س عق لحم ( ، NCI-H460 )س لئ غي لصغي ( ، MCF-7 )س لث ( ، )س ل ( Hepg2 ، ل أ نش مح ليع لعي سي لاي ل ، ا سي لستصي Juniperus Phoenicea L مع ) IG50 تت بين 9 ل 9 51 ميغ /مل ( .أع لش ل لتيي في لت لستص لتتين ، نش معتا مع حسس تم لساا ل لجب مقن بلسل ل ، كنت تكيه لث لني )CMI ( تقع بين 5 20 مغ/مل . أ لستص لئي إثنلي لت Cotula Cinerea لقم ليع ساا ل لسل لتي تم خته .ك أفل )Staphylococcus Aureus لقم ليثيسيين ( مع قيم MIC محص بين 5 ل 10 20 مغ/مل. يشي لج لتمن لش حيي بيلجي إل Juniperus Phoenicea Cotula Cinerea(Del) L ق ين مص ل حف جي أ تخل في لصع لغئي لئي .

ل لفتحي :(Juniperus Phoenicea L ، Cotula Cinerea(Del ، أنش ليلجي ، لك لفيلي ، لي لعي ، MS/HPLC-DAD-ESI ، CPG/SM .

Abstract

This work is devoted on one hand, the chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of essential oils from two saharan plants, Juniperus phoenicea L. and Cotula cinerea .Del from southwestern Algeria. On the other hand, evaluation of bioactive properties, such as antioxidant, anti-inflammatory, cytotoxic and antibacterial activities, and their correlation with the individual phenolic compounds identified in the extracts (infusions, hydroethanolics) of these plants.Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) of hydrodistilled oils reveals the dominance of α-pinene (46.437%) for J. phoenicea L and α-thujone (32.35%) for C. cinerea (Del). While, the antioxidant activity evaluated by the DPPH test, showed a good to moderate capacity (IC50 = 0.76 and 28 mg / ml) for the oils J phoenicea L. and C cinerea (Del) respectively. The results of the antibacterial activity suggest that Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans strains with (MIC range from 0.04 to 0.63 mg / mL) were the most susceptible strains to. J.Phoenicea L.oil. while the best activity of the identified C. cinerea oil acts against Bacillus subtilis with (MIC = 0.303 mg/ m mL).High-performance liquid chromatography (HPLC-DAD- ESI/MS) identified a total of thirteen and nine individual phenolic compounds in J.phoenicea and C.cinerea respectively, being p- coumaroylquinic acid, quercetin-O-pentoside, myricetin-O-pentoside and myricetin-O-hexoside the major compounds present in J.phoenicea. On the other hand, C.cinerea presented luteolin-7-O-glucoside, luteolin-O-malonylhexoside and 5-O-caffeoylquinic acid as the main molecules.Generally, all samples exhibited interesting antioxidant when compared to the standard Trolox, whith the highest antioxidant capability observed in J.phoenicea .In addition, , the cytotoxicity was evaluated using four human tumor cell lines: HeLa (cervical carcinoma), NCI-H460 (non-small lung carcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma), HepG2 (hepatocellular carcinoma), showed good activity for all samples without toxicity for liver cells especially, for J phoenicea L extracts (GI50 values ranging from 9 to 51 µg/mL). In vitro antibacterial activity of the two plant extracts found to give moderated activity, with a total sensitivity towards gram positive strains than gram negative ,their minimal inhibitory concentrations (MICs) ranged from 5 and 20 mg/mL C. cinerea hydroethanol extract appearing resistance compared to all gram negative strains test. The best growth inhibition activity was against MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) and MSSA (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus) with MICvalues ranging from 5 to 10 µg/mL. The contemporary presence of bioactivities suggests that J. phoenicea L.and C cinerea (Del) may be a source for such new preservatives in food and pharmaceutical industries.

Keywords: J. phoenicea L, C cinerea (Del), biological activities, phenolic compounds, essential oils, HPLC-DAD-ESI / MS, CPG-SM.