UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sanja N. Nikolić
“ Uticaj citokinina na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana L. (Benth.) in vitro ”
Master rad
Niš, 2014.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
“ Uticaj citokinina na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana L. (Benth.) in vitro ”
Master rad
Kandidat: Mentor:
Sanja N. Nikolić Dr Dragana D. Stojiĉić
Br. indeksa 45 vanredni profesor
Niš, 2014.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
“ Cytokinin-mediated axillary bud induction on Micromeria juliana L. (Benth.) in vitro ”
Master thesis
Candidate: Mentor:
Sanja N. Nikolić Dr Dragana D. Stojiĉić
No. of index: 45 Associate professor
Niš, 2014.
Zahvaljujem se svom mentoru profesorki dr Dragani Stojičić na stručnoj pomoći, kao i asistentkinji Svetlani Tošić na savetima i pomoći prilikom izvođenja eksperimentalnog dela ovog master rada koji je rađen u okviru njene doktorske disertacije… Posebnu zahvalnost dugujem i celokupnom kolektivu sa Departmana za biologiju i ekologiju na prenešenom znanju...
SAŽETAK
U ovom radu je ispitivana mogućnost regeneracije Micromeria juliana indukcijom aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima uz pomoć citokinina. TakoĊe je ispitivan uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka. Mikropropagacija se pokazala uspešnom. UtvrĊeno je da se najveći broj pupoljaka razvio kod eksplantata gajenih na podlozi MS sa 0,1 µM BA, a najmanji na hranljivoj podlozi sa 10 µM BA. Na podlozi MS sa 10 µM BA proseĉna dužina pupoljaka bila je најmanja, a najveća na kontrolnoj podlozi. Najveću proseĉnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na podlogama sa 0,1 i 1 µM BA, a najmanju na podlozi sa 10 µM BA. Najviše vrednosti proseĉne suve mase izmerene su kod eksplantata gajenih na podlogama sa 0,1, 0,3 i 1 µM BA, a najniže na podlozi sa 10 µM BA.
Kljuĉne reĉi: Micromeria juliana, mikropropagacija, aksilarni pupoljci.
ABSTRACT
The possibility of regeneration Micromeria juliana through induction of axillary buds on the nodal explants, with the assistence of cytokinin, was tested in this work. It was also investigated the effect of different treatments on the weight of plants. Micropropagation was successful. It was found that the greatest number of buds was developed on explants that were cultured on MS medium with 0,1 µM BA, while the smallest number of buds was developed on nutrient medium with10 µM BA. On MS medium with 10 μM BA the average length of buds was the lowest, the highest was on medium whitout hormones. The highest average fresh weight had explants that were cultured on medium with 0.1 and 1 μM BA, while the lowest had explants on medium with 10 μM BA. The highest values of the average dry weight were measured in explants that were cultured on medium with 0.1, 0.3 and 1 μM BA, while the lowest were on the medium with 10 μM BA.
Key words: Micromeria juliana, micropropagation, axillary buds.
SADRŽAJ:
1. UVOD 1
1.1. Fam. Lamiaceae 2
1.2. Micromeria juliana 3
1.3. Mikropropagacija- vegetativno razmnožavanje in vitro 5
2. CILJ RADA 10
3. MATERIJAL I METODE 12
3.1. Biljni materijal 13
3.2. Sterilizacija biljnog materijala 13
3.3. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora 14
3.4. Hranljiva podloga 14
3.5. Hranljive podloge korišćene za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana 16
3.6. Merenje sveže i suve mase biljaka 16
3.7. Statistiĉka analiza 17
4. REZULTATI 18
4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana 19
4.2. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana 27
5. DISKUSIJA 28
6. ZAKLJUĈAK 31
7. LITERATURA 33
SKRAĆENICE
BA- 6- benzil- aminopurin
1. UVOD
1.1. Fam. Lamiaceae
Vrsta Micromeria juliana pripada veoma brojnoj i važnoj familiji usnatica, Lamiaceae, koja obuhvata oko 3500 vrsta. U našoj zemlji živi 147 vrsta, i oko 30 rodova. To su jednogodišnje i višegodišnje zeljaste biljke, polužbunovi ili žbunovi (retko drveće). Imaju stablo ĉetvorougaonog oblika sa prostim, naspramnim listovima bez zalistaka.
Cvetovi su izrazito zigomorfne simetrije. Ĉašica je od pet sraslih listića, cevasta, sa pet zubaca a kod nekih predstavnika ĉak i dvousnata. Krunica je sastavljena od pet listića koji su u donjem delu srasli u cev, a u gornjem delu su razdvojeni na dva dela: gornju usnu obrazovanu od dva listića i donju usnu koju izgraĊuju tri kruniĉna listića. Prašnika je ĉetiri, koji su nejednake dužine, dva duža i dva kraća. Tuĉak je izgraĊen od dve karpele. Plodnik je u poĉetku dvook, kasnije se dvema pregradama deli na ĉetiri okca, a u svakom od njih se nalazi po jedan anatropni semeni zametak. Oprašivanje je entomofilno. Cvetovi su proterandriĉni. Obiĉno su sakupljeni u manje cimozne cvasti u pazuhu listova na gornjem delu stable. Plod je merikarpijum.
MeĊu brojnim predstavnicima ove familije nalazi se dosta aromatiĉnih biljaka, koje se koriste u parfimeriji i farmaciji, zatim medonosnih biljaka, a priliĉan je broj i korovskih vrsta (Tatić B., Bleĉić V., 2002).
Od svih familija viših biljaka Lamiaceae su na drugom mestu po broju vrsta u ovom delu Evrope. Od navedenog broja vrsta iz familije Lamiaceae 84 su balkanski endemiti. Vrste roda Micromeria grupisane su u tri grupe (Boisser 1879): Pseudomelisa (M. thymifolia, M. albanica, M. dalmatica i M. pulegium), Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora) i Cymularia.
Nedavne molekularne analize pokazale su da je rod Micromeria polifilan, te da su ĉlanovi sekcije Pseudomelissa blisko srodni rodu Clinopodium. Zbog toga su 2006. godine vrste roda Micromeria sekcije Pseudomelissa prebaĉeni u rod Clinopodium, gde i spadaju zbog morfoloških karakteristika (Arabaci et al., 2010).
Rod Micromeria je u flori Srbije i Crne Gore predstavljen sa 10 vrsta, od ĉega je 7 endemskih (Šilić, 1979).
Neki autori (Chater i Guinea, 1972.) su objavili da rod obuhvata od 70 – 90 vrsta rasprostranjenih u umerenom pojasu. Rasprostire se od makaronezijsko – mediteranske regije sve do južne Afrike, Indije i Kine (Bräuchler et al., 2008).
Razliĉite Lamiaceae imaju važnu primenu u narodnoj medicini jer sadrže veliki broj aktivnih sastojaka. Najvažnije je to što sadrže etarska ulja (Slavkovska et al. 2005). U narodu su poznati sledeći predstavnici: lavanda, žalfija, bosiljak, majĉina dušica, nana, mrtva kopriva, origano…
1.2. Micromeria juliana
Regnum: Plantae
Phylum: Magnoliophyta
Classis: Magnoliopsida
Ordo: Lamiales
Famillia: Lamiaceae
Genus: Micromeria
Micromeria juliana (L.) Bentham ex Reichenb.
Slika 1. Micromeria juliana (L.) Bentham ex Reichenb. ( Izvor: http://www.biolib.cz/ )
Micromeria juliana (sinonimi: Satureja juliana L., Satureja canescens Guss. Var. glacilis Guss., Sabbatia corymbosa Moench.) je višegodišnja biljka (Slika 1). Koren i izdanci pri dnu su odrvenjeni. Stabljike su brojne, tanke, uspravne, proste ili granate, na popreĉnom preseku tupo ĉetvorougaone, maljave (Palić I., 2009).
M. juliana je niski zeleni polugrm visine 10 do 40 cm. Listovi su dužine 3 do 8 cm, a široki 1 do 2,5 mm, donji su ovalni, srednji lancetasti, a gornji usko lancetasti, paralelnih rubova. Mali ljubiĉasti cvetovi smešteni su u zbijenim raĉvicama i ĉine isprekidan grozd. Ĉašica je usko zvonasta, sivo zelena, 2,5 do 3,5 mm duga, spolja dlakava (Chater i Guinea, 1972). Cveta od maja do jula meseca.
M. juliana naseljava kamenjare i pukotine kreĉnjaĉkih stena mediteranskog i submediteranskog pojasa. Dolinom reka prodire dosta duboko u unutrašnjost. Javlja se u rasponu od 0 do oko 800 (1.000) m nadmorske visine. Rasprostranjena je u jugoistoĉnoj Francuskoj, Portugaliji, Italiji, Albaniji, Grĉkoj, Bugarskoj, Turskoj i eks-Jugoslaviji. U eks- Jugoslaviji: u Hrvatskoj, Hercegovini, Crnoj Gori, Kosmetu i Makedoniji (Palić I., 2009).
1.3. Mikropropagacija - vegetativno razmnožavanje in vitro
Kultura biljnih ćelija, tkiva i organa in vitro predstavlja gajenje razliĉitih biljnih delova (eksplantata) odvojenih od matiĉne biljke, na hranljivoj podlozi (medijumu), u sterilnim, kontrolisanim laboratorijskim uslovima. Eksplantati su izuzetno malih dimenzija zbog toga se razmnožavanje biljaka kulturom in vitro naziva i mikropropagacija (Pierik, 1987, Hartmann et al., 1990, Grbić, 2004). Rast i razvoj tkiva može se usmeriti u odreĊenom pravcu manipulacijom hemijskog sastava podloge i drugih parametara životne sredine (Bonga, 1982).
Pojedini autori (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996, Nešković et al., 2003) razmnožavanje biljaka kulturom in vitro definišu kao mikropropagaciju u širem smislu, dok sam termin mikropropagacija koriste za kulturu pupoljaka (apikalnih ili aksilarnih). Naziv kultura in vitro oznaĉava gajenje kultura u staklu ili prozirnim posudama, tj. in vitro propagacija (lat. in vitro – u staklu; biljke se uzgajaju u prozirnim posudama). Ovaj naĉin razmnožavanja biljaka ĉesto se naziva mikrorazmnožavanje (mikropropagacija), jer su biljni organi ili cele biljke, u odnosu na generativnu proizvodnju, u minijaturnim dimenzijama. Sam postupak osigurava vrlo brz proces dobijanja velikog broja serija biljaka, koje su istovetne po razvoju, rastu i genetiĉkom potencijalu vrste. Bez sumnje, to je proces kloniranja, jer sve proizvedene biljke predstavljaju matiĉne kopije razmnoženog majĉinskog uzorka.
Postupci kulture in vitro mogu biti primenjeni u raznim biotehnološkim i genetiĉko- inženjerskim istraživanjima u cilju oĉuvanja i zaštite genofonda neke zaštićene vrste, razmnožavanja genetiĉki superiornijih stabala, žalosnih formi drveća i grmlja, oblika otpornih na hemijski stres, zagaĊenost atmosfere, otpornost prema odreĊenim pesticidima, herbicidima itd. Kultura in vitro predstavlja najmoćnije oruĊe moderne genetike i molekularne biologije u cilju istraživanja rasta i razvoja biljaka, te njihove biohemije i fiziologije sekundarnih metabolita (MeĊedović, 2003).
Mikropropagacija i regeneracija izdanaka su osnov za istraživanje i uspešnu primenu genetskog inženjeringa kod biljaka. Tri hronološki najstarije in vitro tehnike kod biljaka su: kultura tkiva (ćelija), kultura embriona i kultura korenova.
Mikropropagacija sažeto ima sledeće primene:
brzo razmnožavanje novih genotipova ĉuvanje (održavanje) interesantnih genotipova ubrzavanje, skraćivanje ili dovršavanje postupka selekcije i oplemenjivanja regeneracija izdanaka i celih biljaka u genetskom inženjerstvu.
Sistem za mikropropagaciju koji je dao Murashige (1974) obuhvata sve sisteme u kojima se kao rezultat in vitro kultivisanja mogu dobiti izdanci. Istraživaĉkom radu su bliže razliĉite varijante šeme Murashige (1974) sa ožiljavanjem kao poslednjom, in vitro fazom razmnožavanja. Šema Debergh i Maene (1981) se smatra pogodnom za masovno komercijalno razmnožavanje (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Mikropropagacija ima sledeće faze: Faza 0- higijenski uzgoj biljaka sa kojih se uzimaju eksplantati Faza 1- uspostavljanje aseptiĉnih kultura Faza 2- indukcija meristemskih centara, njihov razvoj u izdanke i multiplikacija Faza 3a- uniformno izduživanje izdanaka Faza 3b- ex vitro- isecanje izduženih izdanaka a zatim ožljavanje i adaptacija takvih reznica na uslove spoljašnje sredine. Mikropropagacija ima poseban, vrlo veliki znaĉaj u borbi za suzbijanje i eliminaciju biljnih virusa. Pošto se virusi, po pravilu, ne nalaze u meristemskim ćelijama, razmnožavanjem zdravog materijala u kulturi, dobija se zdravo vegetativno potomstvo. Ako se iz obolele biljke izoluju meristemi, može se dobiti potomstvo osloboĊeno od virusa. Potrebno je samo da poĉetni eksplantat bude što manji, da se ne bi izolovale i trajne ćelije koje sadrže viruse. Najbolje bi bilo izolovati samo apikalni meristem, ali vegetaciona kupa bez lisnih primordija ne može da se razvija kao u stablu, već se formira kalus. Zato se na eksplantatu ostavljaju dve najmlaĊe primordije, ĉije je prisustvo dovoljno za normalno razviće (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996). Pupoljci su u kulturi sterilni, i biljke koje od njih nastaju su slobodne od virusa (“virus-free”).
In vitro tehnike poseduju sledeće prednosti u odnosu na tradicionalne metode razmnožavanja:
kultura se zapoĉinje sa vrlo malo poĉetnog materijala (eksplantata), a dobiju se mali izdanci ili embrioni (otuda termin mikropropagacija); potreban je vrlo mali prostor za održavanje biljaka, ĉime se može jako povećati njihov broj; propagacija se obavlja u aseptiĉnim uslovima (izbegavajući kontaminaciju). Jednom kada se zapoĉne kultura dobijene biljke su obiĉno osloboĊene od bakterija, gljivica i drugih mikroorganizama; metode su pogodne za dobijanje biljaka osloboĊenih od virusa. Terminologija kao što je virus-free ili bakteria-free biljke ne bi se trebao koristiti, jer je nemoguće dokazati da je biljka u potpunosti osloboĊena od svih vrsta virusa ili bakterija. Možemo reći samo da je osloboĊena od specifiĉnog kontaminanta na koji smo datu biljku testirali; u kulturi in vitro razmnožavaju se samo zdrave biljke. Stepen propagacije se može jako povećati, podešavanjem faktora koji pogoduju vegetativnoj regeneraciji, kao što su nutrijenti, regulatori rastenja, svetlost, temperatura itd. Na ovaj naĉin se u vrlo kratkom vremenu može dobiti veliki broj biljaka; moguće je razmnožavati biljke koje se sporo ili teško (ĉak nemoguće) vegetativno razmnožavaju, što je omogućeno rejuvenilizacijom koja se javlja u uslovima in vitro; in vitro razmnožavanjem je moguće dobiti biljke sa novim privremenim karakteristikama koje su vrlo poželjne, tako da oplemenjivaĉi mogu brže postići stabilne mutante (poticanjem adventivnih pupoljaka i izdanaka); produkcija se može obavljati tokom ĉitave godine i nezavisna je od sezonskih promena, ĉime se može precizno vremenski planirati proizvodnja sadnica; vegetativno reprodukovan materijal se može saĉuvati duži period; manje energije i prostora je potrebno za propagaciju i održavanje matiĉnih biljaka (stok biljaka); biljni materijal treba manje pažnje izmeĊu subkultura, jer ga ne treba zalivati niti prskati, a što je neophodno ukoliko se koriste druge metode vegetativnog razmnožavanja;
razmnožavanje in vitro mnogo je brže u odnosu na razmnožavanje in vivo, tako da se nove sorte mogu komercijalno brzo razmnožavati i tako ponuditi tržištu u mnogo kraćem vremenu; mikroklonirane biljke rastu mnogo brže u odnosu na biljke klonirane in vivo, što je povezano ili sa rejuvenilizacijom i/ili sa ĉinjenicom da su te biljke zdrave i osloboĊene patogenih klica; kultura in vitro je korisna za osnivanje banke gena koja ĉuva zdrav, od virusa osloboĊeni biljni materijal, na niskoj temperaturi i malom prostoru; neke biljke potrebno je razmnožavati vegetativno jer su polno sterilne; mikropropagacija je od najveće prednosti kada su manji troškovi u odnosu na tradicionalne metode multiplikacije. Ako to nije sluĉaj onda mora postojati neki drugi, važan razlog zbog koga se primenjuje ova tehnika. Pored prednosti, in vitro tehnike imaju i nedostatke, a kao osnovni se navodi to što je neophodno prethodno predznanje za uspešno izvoĊenje postupaka. Kao nedostaci kuture in vitro navode se i: specijalizovana i nekada skupa produkcija. U nekim sluĉajevima specifiĉne metode su neophodne za dobijanje optimalnih rezultata. Samim tim se povećava uloženi trud što na kraju povećava i troškove; biljke dobijene na ovakav naĉin su jako male i nekad mogu imati nepoželjne karakteristike; genetiĉka stabilnost je, u nekim sluĉajevima razmnožavanja in vitro, vrlo niska (razmnožavanje adventivnim izdancima i somatskom embriogenezom); kod drvenastih vrsta ĉesto je vrlo teško indukovati rizogenezu in vitro; adaptacija biljka na uslove spoljašnje sredine kod nekih vrsta je posebno težak i zahtevan postupak. Naime, biljke dobijene u uslovima kulture in vitro nakon prenosa u spoljašnju sredinu ne mogu same proizvoditi organsku materiju fotosintezom (jer nisu autotrofne), te se moraju ,,stimulisati” na fotosintezu. Pošto su rasle u uslovima velike relativne vlažnosti, u posudama za kulturu, u uslovima spoljašnje sredine se moraju navići da ekonomišu sa vodom, kao i da otvaraju i zatvaraju stome. Ove biljke u ex vitro uslovima ponekad mogu imati odreĊene loše osobine, npr. gromolik rast;
mikroklonirani genotip biljaka, koji će se, nakon uslova kulture uzgajati u polju na otvorenom, može biti osetljiv na bolesti i uništen od patogenog organizma koji ga je napao; regenerativna sposobnost kod biljke se može izgubiti nakon odreĊenog broja subkultura (Nešković et al., 2003).
2. CILJ RADA
Cilj rada bio je:
ispitivanje mogućnosti da se korišćenjem razliĉitih koncentracija benzilaminopurina (BA) indukuje razviće aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana u uslovima in vitro; ispitivanje uticaja hranljive podloge na masu dobijenih pupoljaka; statistiĉka obrada dobijenih podataka; tumaĉenje rezultata i izvoĊenje zakljuĉka.
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Biljni materijal
Biljni materijal Micromeria juliana sakupljen je na prirodnom staništu u kanjonu Moraĉe (Crna Gora). Sa donetih biljaka su prikupljena semena. Semena su klijala in vitro na hranljivoj podlozi a biljke dobijene na ovaj naĉin (u sterilnim uslovima) su bile upotrebljene za uspostavljanje kulture aksilarnih pupoljaka (nepublikovani materijal, D. Stojiĉić, S. Tošić). Biljke dobijene isklijavanjem semena bile su iskorišćene za dobijanje eksplantata - nodalnih segmenata približno iste veliĉine. Vršni pupoljci nisu korišćeni kao eksplantati. Na svaku hranljivu podlogu postavljano je po 30 eksplantata, 10 po teglici. Korišćena je hranljiva podloga Murashige i Skoog (1962) MS sa razliĉitim koncentracijama regulatora rastenja – citokinina (BA).
3.2. Sterilizacija biljnog materijala
Kako bi se spreĉila kontaminacija hranljivih podloga i uklonili mikroorganizmi sa spoljašnje površine eksplantata važno je izvršiti površinsku sterilizaciju. Za površinsku sterilizaciju se najĉešće koristi 10% varikina (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g aktivnog hlora/l) ili drugi komercijalni izbeljivaĉi koji sadrže 4-6% Na- hipohlorit. Smatra se da je površinska sterilizacija efikasnija kada se eksplantati prvo tretiraju etil alkoholom (70-96%), a nakon toga varikinom. Prilikom izvoĊenja ovog eksperimenta semena Micromeria juliana sterilisana su 25%-im rastvorom varikine u trajanju od 25 minuta nakon ĉega su tri puta isprana destilovanom vodom. Dobijene biljke isklijale iz semena nisu dodatno sterilisane, već su u sterilnim uslovima izdeljene na nodalne eksplantate i postavljene na induktivne podloge.
3.3. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora
Sterilizacija podrazumeva uništavanje mikroorganizama fiziĉkim ili hemijskim sredstvima, što zavisi od vrste materijala koji se steriliše. Hranljive podloge i rastvori sterilisani su u autoklavu na temperaturi od 120 °C, u trajanju od 25-30 minuta. Instrumenti su najpre sterilisani iskuvavanjem u destilovanoj vodi koje traje 10-30 minuta, nakon ĉega su na kratko prebaĉeni u 70-95% alkohol a potom opaljivani na plamenu. Petri kutije i ostatak posuĊa su sterilisane 2h u suvom sterilizatoru na temperaturi od 160-180 °C. Prostorija za rad sterilisana je UV lampom najmanje 2h, a radna površina prebrisana alkoholom pre i tokom rada.
3.4. Hranljiva podloga
Za gajenje eksplantata korišćena je MS podloga - Murashige, T. and Skoog, F. (1962) sa odreĊenim sastavom makro, mikro mineralnih soli i organskih dodataka što je i prikazano u tabelama. Sve prikazane težine koriste se za pripremanje jednog litra hranljive podloge. pH podloge je 5,8.
Tabela 1a. Sastav makro mineralnih soli MS hranljive podloge
Makro mineralne soli MS (mg/l) 1650 NH4NO3
KNO3 1900 440 CaCl2×2H2O 370 MgSO4×7H2O
KH2PO4 170
Tabela 1b. Sastav mikro mineralnih soli MS hranljive podloge
Mikro mineralne soli MS (mg/l)
MnSO4 ×4H2O 22,3 8,6 ZnSO4×7H2O 6,2 H3BO3 KJ 0,83 0,25 NaMoO4 ×2H2O 0,025 CuSO4 ×5 H2O
CoCl2 ×6 H2O 0,025 27,8 FeSO4 ×7H2O 37,3 Na2EDTA
Tabela 1c. Sastav organskih dodataka MS hranljive podloge
Organski dodaci MS (mg/l) vitamin B1 0,4 vitamin B6 0,5 nikotinska kiselina 0,5 glicin 2,0 g/l mioinozitol 0,1 saharoza 30,0 agar 0,7
3.5. Hranljive podloge korišćene za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana
Radi ispitivanja uticaja regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana u MS podlogu dodat je 6 - benzil aminopurin (BA) u rasponu koncentracija od 0,1-10,0 µM što je i prikazano u Tabeli 2.:
Tabela 2. Sadržaj hormona u hranljivim podlogama
Hranljiva podloga 1 2 3 4 5 6 BA (µM) 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10,0
U svaku teglicu razliveno je približno 30-35 ml hranljive podloge. Teglice su zatvorene metalnim zatvaraĉima sa otvorima na sredini kroz koje je provuĉena vata radi provetravanja. Svaki pojedinaĉni tretman obuhvatio je 3 teglice, u svakoj je postavljeno po 10 eksplantata, što znaĉi 30 eksplantata po tretmanu. Eksplantati su gajeni na hranljivim podlogama ĉetiri nedelje pri temperaturi od 21 ± 2 °C, sa fotoperiodom od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka, pri svetlosti fluorescentih belih cevi „Tesla” - Panĉevo i gustinom fotonskog fluksa od 50 μmol s-1m-2. Nakon ovog perioda evidentiran je broj pupoljaka po eksplantatu, a zatim i merenje njihove dužine, sveže i suve mase.
3.6. Merenje sveže i suve mase biljaka
Sveža masa biljaka merena je odmah nakon utvrĊivanja broja pupoljaka i njihove dužine. Ovako izmeren materijal je sušen na sobnoj temperaturi a zatim je merena njegova suva masa. Merenja su obavljena na automatskoj analitiĉkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg, a zatim su dobijeni podaci obraĊeni statistiĉki.
3.7. Statistiĉka analiza
Obrada podataka je uraĊena statistiĉko-grafiĉkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA i test LCD na nivou znaĉajnosti p<0,05. Statistiĉka analiza je uraĊena za svaki parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistiĉki znaĉajne razlike predstavljene su razliĉitim slovima, ista slova oznaĉavaju da tih razlika nije bilo.
4. REZULTATI
4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana
Kultura Micromeria juliana dobijena je isklijavanjem semena in vitro. Ovaj postupak obezbedio je dobijanje biljaka bez infekcije ali i genetiĉku heterogenost materijala. Sa dobijenih biljaka odstranjen je koren i vršni meristem, a preostali deo biljke je skalpelom iseĉen na nodalne eksplantate – deo stabla sa nodusom i parom listova u ĉijem pazuhu se nalaze aksilarni pupoljci. Nodalni eksplantati su bazalnim delom uronjeni u hranljivu podlogu. Eksplantati su gajeni na hranljivoj MS podlozi sa razliĉitim koncentracijama BA u rasponu od 0,1 – 10,0 μM. Nodalni eksplantati su bili postavljeni i na kontrolnu hranljivu podlogu - MS bez hormona.
Prve promene na eksplantatima su uoĉene u trećoj nedelji gajenja u kulturi in vitro. Aksilarni pupoljci su se izduživali na gotovo svim nodalnim eksplantatima bez obzira na koncentraciju korišćenog citokinina (BA).
U tabeli 3 prikazan je proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu kao i proseĉna dužina aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana. Iz tabele se vidi da je korišćenje MS hranljive podloge sa ili bez regulatora rastenja dovelo do formiranja aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana.
Tabela 3. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana
Tretman Proseĉan broj pupoljaka po Proseĉna dužina pupoljaka eksplantatu (mm) 1 Bez hormona 5,86 ± 0,40bc 3,95 ± 0,31b 2 0,1 μM BA 7,21 ± 0,43c 3,25 ± 0,27ab 3 0,3 μM BA 5,72 ± 0,38bc 3,18 ± 0,24ab 4 1 μM BA 3,95 ± 0,49a 3,19 ± 0,20ab 5 3 μM BA 4,97 ± 0,50abc 2,72 ± 0,19a 6 10 μM BA 4,68 ± 0,36ab 2,46 ± 0,23a Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05
Eksplantati M. juliana gajeni na MS podlozi, bez regulatora rastenja, bili su zelene boje sa pojavom nekroze na listovima koji su bili u direktnom kontaktu sa podlogom (Sl. 2, 3). Vidljiva je i razlika u dužini internodija kod razliĉitih eksplantata. Proseĉan broj pupoljaka koji je formiran po eksplantatu na ovoj podlozi iznosio je 5,86 a proseĉna dužina pupoljaka bila je 3,95 mm, što je najveća zabeležena vrednost u poreĊenju sa eksplantatima na ostalim podlogama (Tabela 3). Od ukupno 30 eksplantata postavljenih na ovu podlogu, kod 3 je došlo do spontanog razvića adventivnih korenova.
MS
Micromeria juliana
Slika 2. Biljke M. juliana na MS hranljivoj podlozi
MS
Micromeria juliana
Slika 3. Eksplantat M. juliana gajen na MS podlozi bez regulatora rastenja
Na MS podlozi sa 0,1 µM BA, od ukupno 30 postavljenih eksplantata M. juliana, uspešno se razvilo njih 29. Nije bilo bitnijih promena u pogledu morfoloških karakteristika (Sl. 4, 5), u poreĊenju sa predhodno komentarisanom podlogom. Proseĉan broj formiranih pupoljaka po eksplantatu iznosio je 7,21 što je najveća zabeležena vrednost (Tabela 3). Proseĉna dužina pupoljaka bila je 3,25 mm, što je znaĉajno manje u odnosu na kontrolne eksplantate.
MS + 0,1 µM BA
Micromeria juliana
Slika 4. Biljke M. juliana na MS podlozi sa 0,1 µM BA
MS + 0,1 µM BA
Micromeria juliana
Slika 5. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 0,1 µM BA
Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa dodatkom 0,3 µM BA, bili su svetlo zelene boje, sa pojavom i žbunastih formi (Sl. 6, 7). Na Sl. 5 prikazani su eksplantati u grupi. U odnosu na predhodnu koncentraciju (MS sa 0,1µM BA) broj formiranih pupoljaka po eksplantatu bio je manji, njihov proseĉan broj bio 5,72. Zabeležena je i niža vrednost proseĉne dužine pupoljaka koja je u ovom sluĉaju iznosila 3,18 mm (Tabela 3).
MS + 0,3 µM BA
Micromeria juliana
Slika 6. Biljke M. juliana na MS podlozi sa 0,3 µM BA
MS + 0,3 µM BA
Micromeria juliana
Slika 7. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 0,3 µM BA
Proseĉan broj razvijenih pupoljaka po eksplantatu na podlozi MS sa 1 µM BA, iznosio je 3,95 što je niža vrednost u odnosu na predhodnu podlogu (MS sa 0,3µM BA), ali i najniža zabeležena uopšte. Nije bilo bitnijih razlika u pogledu dužine pupoljaka koja je u ovom sluĉaju iznosila 3,19 mm (Tabela 3). Eksplantati su bili kratkih internodija, uglavnom žbunaste forme (Sl. 8, 9).
MS + 1 µM BA
Micromeria juliana
Slika 8. Biljke M. juliana na MS podlozi sa 1,0 µM BA
MS + 1 µM BA
Micromeria juliana
Slika 9. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 1,0 µM BA
Na listovima eksplantata M. juliana koji su gajeni na MS podlozi sa 3 µM BA (Sl. 10, 11) koji su dodirivali podlogu javila se nekroza tkiva. Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi iznosio je 4,97 (Tabela 3). Na ovoj podlozi došlo je do daljeg smanjenja proseĉne dužine pupoljaka i koja je iznosila 2,72 mm.
MS + 3 µM BA
Micromeria juliana
Slika 10. Biljke M. juliana na MS podlozi sa 3,0 µM BA
MS + 3 µM BA
Micromeria juliana
Slika 11. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 3,0 µM BA
Na MS podlozi sa 10 µM BA proseĉan broj pupoljaka bio je najmanji u poreĊenju sa eksplantatima gajenim na ostalim hranljivim podlogama, i iznosio je 4,68. Proseĉna dužina pupoljaka je takoĊe bila najmanja samo 2,46 mm (Tabela 3). Eksplantati su bili žbunaste forme sa kraćim internodijama (Sl.12 i 13), u poreĊenju sa eksplantatima na ostalim podlogama.
MS + 10 µM BA
Micromeria juliana
Slika 12. Biljke M. juliana na MS podlozi sa 10,0 µM BA
MS + 10 µM BA
Micromeria juliana
Slika 13. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 10,0 µM BA
Rezultati istraživanja, zbog preglednosti prikazani su i grafiĉki (His. 1). Primećujemo da je samo najniža korišćena koncentracija BA (0,1 µM) dovela do formiranja većeg broja pupoljaka u odnosu na kontrolu (eksplantati gajeni na hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja). Ostale korišćene podloge dovele su do formiranja manjeg broja pupoljaka od kontrole. Proseĉna dužina pupoljaka bila je najveća kod eksplantata gajenih na kontrolnoj podlozi, dok su sve korišćene koncentracije BA vodile ka formiranju pupoljaka znaĉajno manjih proseĉnih dužina.
Histogram 1. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana
8
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu 7 Prosečna duzina pupoljaka
6
5
4
3
2
1
0 Bez hormona 0,1 μM BA 0,3 μM BA 1,0 μM BA 3,0 μM BA 10,0 μM BA
4.2. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana
Osim uticaja razliĉitih hormonskih tretmana na broj i dužinu pupoljaka analiziran je i uticaj na masu biljaka Micromeria juliana (Tabela 4). Nakon ĉetvoronedeljne indukcije merena je proseĉna sveža i proseĉna suva masa biljaka. Najveću proseĉnu svežu masu, izraženu u miligramima (mg) imali su eksplantati gajeni na podlogama sa 0,1 i 1 µM BA a najmanju eksplantati gajeni na podlozi sa 10 µM BA. Najviše vrednosti proseĉne suve mase izmerene su kod eksplantata gajenih na podlogama sa 0,1, 0,3 i 1 µM BA. Najniža vrednost proseĉne suve mase dobijena je kod eksplantata gajenih na podlozi sa 10 µM BA.
Tabela 4. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana
Tretman Proseĉna sveža masa Proseĉna suva masa (mg) (mg) 1 Bez hormona 0,017 ± 0,0019ab 0,0028 ± 0,00030ab 2 0,1 μM BA 0,022 ± 0,0016b 0,0031 ± 0,00019b 3 0,3 μM BA 0,021 ± 0,0013ab 0,0031 ± 0,00021b 4 1 μM BA 0,022 ± 0,0016b 0,0034 ± 0,00024b 5 3 μM BA 0,015 ± 0,0010a 0,0022 ± 0,00015a 6 10 μM BA 0,014 ± 0,0014a 0,0020 ± 0,00021a Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05
5. DISKUSIJA
Dosadašnja istraživanja vezana za vrstu Micromeria juliana odnose se na ispitivanje sastava i dejstva etarskih ulja. Glavni sastojci ulja M. juliana su verbenol (11,8%), timol (10,8%), kariofilen oksid (10,5%), borneol (9,3%) i mirtenal (7,1%) (Slavkovska et al., 2005). Ispitivana je antimikrobna aktivnost etanolskog rastvora etarskog ulja metodom difuzionog diska sa ampicilinom kao standardnim antibiotikom protiv šest mikroorganizama. Aktivnost ulja pri razblaženju 1:20 bila je umerena, dok je pri razblaženju 1:40 aktivnost bila slaba ili nikakva (Stojanović et al., 2006). M. juliana pokazala je antimikrobnu aktivnost protiv S. epidermidis (Sarac and Ugur, 2007).
U ovom radu ispitivan je uticaj regulatora rastenja, citokinina, na indukciju i izduživanje aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana, kao i na masu biljaka. Mikropropagacija je bila uspešna.
Na podlozi MS, bez regulatora rastenja, došlo je do razvića pupoljaka. Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 5,86. Na ovoj podlozi bila je najveća proseĉna dužina pupoljaka, i to 3,95 mm. Razvoj pupoljaka na podlozi bez hormona, meĊutim, nije zabeležen kod vrsta Salvia miltiorrhiza (Xu and Sun, 2008) i balkanske endemske vrste Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006). Kod Ocimum gratissimum L. takoĊe nije došlo do formiranja pupoljaka na kontrolnoj podlozi (Saha et al., 2012).
Kada je podloga sadržala citokinin, u koncentraciji 0,1 µM BA, na eksplantatima se razvio veći broj pupoljaka po eksplantatu u odnosu na kontrolu, ali i najveći broj pupoljaka uopšte. Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 7,21, dok je dužina pupoljaka bila manja u poreĊenju sa kontrolom. Regulator rastenja koncentracije 0,1 µM BA bio je efikasan u stimulisanju regeneracije pupoljaka vrste Ocimum gratissimum, mada je najveća brojnost pupoljaka primećena kod eksplantata gajenih na podlozi MS sa 1,0 µM BA (Xu and Sun, 2008).
Dalje povećanje koncentracije BA u hranljivoj podlozi bilo je inhibitorno, na eksplantatima gajenim na podlogama sa 0,3 – 10 µM BA formiran je manji proseĉni broj pupoljaka po eksplantatu a i njihova dužina je bila manja.
Kod nekih vrsta iz roda Lamiaceae benziladenin je korišćen u kombinaciji sa drugim regulatorima rastenja i pokazao se efikasnim. Najefikasnija podloga za regeneraciju vrste Ocimum basilicum L. je podloga koja sadrži kombinaciju auksina i citokinina (Nirmal and
Sehgal, 2010). Kombinacija ovih hormona bila je efikasna i kod Salvia brachyodon (Mišić et al., 2006).
Za indukciju pupoljaka Mentha viridis kao eksplantati korišćeni su nodalni segmenti koji su gajeni na MS podlozi sa razliĉitim nivoima i kombinacijama regulatora rastenja. Najbolji odgovor dala je kombinacija citokinina i auksina (Rahman et al., 2013). Kod Mentha piperita najbolji odgovor je postignut kombinacijom Kn (kinetin) i BA (Mehta et al., 2012). BA se pokazao najefikasnijim citokininom u proliferaciji izdanaka po eksplantatu kod Mentha arvensis (Maity et al., 2011).
Kombinacija giberelina i citokinina pokazala se efikasnom kod indukcije pupoljaka vrsta Ocimum americanum L., Ocimum sanctum L. (Pattnaik and Chand, 1996).
Na eksplantatima Prunella vulgaris, gajenim na podlozi sa 15 µM BA razvio se najveći broj pupoljaka po eksplantatu, dok je kombinacija citokinina i auksina izazvala višestruku multiplikaciju izdanaka praćenu ožiljavanjem (Rasool et al., 2009).
Osim stimulativnog, citokinini mogu imati i inhibitorno dejstvo na indukciju i razvoj aksilarnih pupoljaka, što je bio sluĉaj kod Coleus barbatus (Gupta et al., 2010), i Mentha arvensis (Akram et al., 2007).
Analiziran je i uticaj razliĉitih tretmana na masu Micromeria juliana. Eksplantati gajeni na podlogama sa 0,1 i 1 µM BA imali su najveću proseĉnu svežu masu, dok su najmanju imali eksplantati gajeni na podlozi sa 10 µM BA. Najveća proseĉna suva masa bila je kod eksplantata na podlogama sa 0,1, 0,3 i 1 µM BA. Najmanja proseĉna suva masa, kao i sveža, zabeležena je kod eksplantata na MS podlozi sa 10 µM BA.
6. ZAKLJUĈAK
Metoda kulture in vitro vrste Micromeria juliana pokazala se uspešnom i može se koristiti za razmnožavanje ove vrste indukcijom aksilarnih pupoljaka što može imati znaĉaja u oĉuvanju vrste.
Kod nodalnih eksplantata, gajenih na hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja, došlo je do indukcije aksilarnih pupoljaka. Kao najefikasnija podloga, sa dodatkom citokinina, pokazala se hranljiva podloga sa 0,1 µM BA. Na eksplantatima gajenim na ovoj podlozi razvio se najveći broj pupoljaka, i to 7,21 po eksplantatu. Samo ova koncentracija citokinina dovela je do formiranja većeg broja pupoljaka u odnosu na kontrolu.
Dužina pupoljaka imala je najveću vrednost kod eksplantata koji su gajeni na kontrolnoj podlozi i iznosila je 3,95 mm. Sve koncentracije BA koje su korišćene, nisu izazvale povećanje dužine pupoljaka, naprotiv, formirani su pupoljci znaĉajno manjih dužina.
Do sada nisu zabeleženi rezultati o uticaju razliĉitih tretmana na masu biljaka. U ovom radu najveću proseĉnu svežu masu imali su eksplantati gajeni na hranljivim podlogama sa 0,1 i 1 µM BA. Najniže vrednosti su pak zabeležene kod eksplantata koji su rasli na podlozi sa 10 µM BA. Pri ovoj koncentraciji BA bila je najmanja i proseĉna suva masa eksplantata. Najveća vrednost je zabeležena kod eksplantata gajenih na podlogama sa 0,1, 0,3 i 1 µM BA.
7. LITERATURA
1. Akram, M., Afrasiab, H., Mahmood, S., Aftab, F. (2007): Monoterpene contents in in vitro cultures and field-grown plants of Japanese mint Mentha arvensis L. Pak. j. biochem. mol. biol., 40 (2): 74-79. 2. Arabaci, T., Dirmenci, T., Celep, F. (2010): Morphological character analysis in Turkish Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical taxonomic study. Turk J Bot 34, 379-389. 3. Boissier E. (1879): Flora Orientalis.vol. 4. Basel & Geneve, 568 – 575. 4. Bonga J.M. (1982): Tissue culture techniques. Chapter from book: Tissue culture in Forestry (4-36), edited by Bonga J.M. and Durzan D.J. 5. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria (Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia 38: 363-410. 6. Chater, A.O., Guinea, E. (1972): Micromeria bentham. u: Tutin T.G., Heywood V.H., Burges N.A, Moore D.M., Valentine D.H, Walters S.M, Webb D.A., Valentine D.H, Walters S. M, Webb D. A. (ur.). Flora Europaea, Cambridge: Cambridge University press, III: 167-170. 7. Debergh, P.C., Maene, L.J. (1981): A scheme for commercial propagation ofornamental plants by tissueculture. Sci. Hortic., 14, 335-345. 8. Gupta, A., Gupta, R.K., Dhingra, G.K., Kuriyal, S., Lal, S., Arya, R. (2010): Variations in growth of tubers of field grown Coleus barbatus as affected by different hormonal treatments. African Journal of Plant Science, Vol. 4(12), pp. 467-473. 9. Grbić, M. (2004): Vegetativno razmnožavanje ukrasnog drveća i žbunja - proizvodnja sadnog materijala. Beograd: Ne & Bo 10. Hartmann, H.D., Kester, D.E., Davies, F.T. (1990): Plant Propagation: Principles and Practices, Prentice Hall, Englwood Cliffs, NJ 11. Maity, S.K., Kundu, A.K., Tiwary, B.K. (2011): Rapid and large scale micropropagation of true to type clone of Mentha arvensis Linn. (Lamiaceae)- A valuable medicinal plante. Indian J. Applied & Pure Bio. Vol. 26(2), 193-198. 12. MeĊedović, S., Ferhatović Dž. (2003): Klonska proizvodnja sadnica drveća i grmlja. Bemust, Sarajevo 13. Mehta, J., Naruka, R., Sain, M., Dwivedi, A., Sharma, D., Mirza, J. (2012): An efficient protocol for clonal micropropagation of Mentha piperita L. (Pipperment). Asian Journal of Plant Science and Research, 2 (4):518-523. 14. Mišić, D., Grubišić, D., Konjević, R. (2006): Micropropagation of Salvia brachyodon through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476 (4)
15. Murashige, T. (1974): Plant propagation through tissue cultures. Ann Rev. Plant Physiol., 25, 135-165. 16. Murashige, T. and Skoog, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant. 15: 473-497. 17. Nešković, M., Ćulafić, Lj., Konjević, R. 2003): Fiziologija biljaka. NNK- International. Beograd 18. Nirmal K.S., Sehgal C.B. (2010): Micropropagation of „Holy Basil‟ (Ocimum sanctum Linn.) from young inflorescences of mature plants. Plant Growth Regul. pp 1 19. Palić, I. (2009): Hemijska analiza i mikrobiološka aktivnost ekstrakata odabranih vrsta roda Micromeria Bentham. PhD Thesis, Prirodno- matematiĉki fakultet, Univerzitet u Nišu 20. Pattnaik, S.K., Chand, P.K. (1996): In vitro propagation of the medicinal herbs Ocimum americanum (L.) Sy. Ocimum canum Sim (Loary basil) and O. santum (Holly basil). Plant Cell Rep. 15: 846–850. 21. Pierik R.L.M., (1987): In vitro culture of higher plants as a tool in the propagation of horticultural crops. ISHS Acta Horticulturae 226: International Symposium on Propagation of Ornamental Plants 22. Rahman, M.M., Ankhi, U.R., Biswas, A., (2013): Micropropagation of Mentha viridis L.: An aromatic medicinal plant. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4: 2926-2930. 23. Rasool, R., Kamili, A.N., Ganai, B.A., Akbar, S. (2009): Effect of BAP and NAA on Shoot Regeneration in Prunella vulgaris. Journal of Natural Sciences and Mathematics, Qassim University, Vol. 3, No. 1, PP 21-26. 24. Saha, S., Kader, A., Sengupta, C. (2012): In vitro Propagation of Ocimum gratissimum L. (Lamiaceae) and Its Evaluation of Genetic Fidelity Using RAPD Marker. American Journal of Plant Sciences, 3, 64-67. 25. Sarac, N., Ugur, A. (2007): Antimicrobial activities and usage in folcloric medicine of some Lamiaceae species growing in Mugla, Turkey. EuroAsian Journal of BioScences, 4, 28-37. 26. Slavkovska, V., Couladis, M., Bojović, S., Tzakou, O., Pavlović, M., Lakušić, B., and Janĉić, R. (2005): Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255: 1–15.
27. Stojanović, G., Palić, I., Ursić-Janković, J. (2006): Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Micromeria cristata and Micromeria juliana. Elavour and Fragrance Journal, 21, 77-79. 28. Šilić, A., (1979): Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej BiH, Sarajevo. 172-262. 29. Tatić, B., Bleĉić, V. (2002): Sistematika i filogenija viših biljaka. Univerzitetski udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 347-348. 30. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka. Axial, P.O., Beograd (15-54). 31. Xu M.Y., Sun Q.Z. (2008): Buds Induction and High- frequency Plant Regeneration of Salvia miltiorrhiza. Journal of Agricultural science and Technology, 10 (1): 76-80.
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Sanja Nikolić roĊena je 11. 09. 1987 godine u Nišu, gde je stekla osnovno obrazovanje u školi ,,Bubanjski heroji“. Potom, 2002. godine, upisuje srednju medicinsku školu ,,Dr. Milenko Hadžić“ koju završava sa ostvarenim odliĉnim uspehom. Po završetku srednje škole, a nakon šestomeseĉnog volontiranja u Kliniĉkom centru i Domu zdravlja, u Nišu, kao i položenog struĉnog ispita, stiĉe zvanje ,,pedijatrijska sestra“. 2007. godine zapoĉinje osnovne akademske studije na Prirodno-matematiĉkom fakultetu u Nišu, na odseku za biologiju i ekologiju. Studije završava 2011. godine sa zvanjem ,,biolog“. Master akademske studije upisuje 2011.god., na odseku za ekologiju i zaštitu prirode koje završava 2014. godine.
Прилог 5/1 ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Caњa Николић Ментор, МН: Драгана Стојичић Наслов рада, НР: Утицај цитокинина на индукцију аксиларних пупољака Micromeria juliana L. (Benth.) in vitro Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 45 стр. ; 13 слика , 6 табела, 1 хистограм (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) Научна област, НО: биологија Научна дисциплина, НД: биологија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria juliana, микропропагација, аксиларни пупољци
УДК 577.175.1:582.929.4
Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У овом раду је испитивана могућност регенерације Micromeria juliana индукцијом аксиларних пупољака на нодалним експлантатима уз помоћ цитокинина. Такође је испитиван утицај различитих третмана на масу биљака. Микропропагација се показала успешном. Утврђено је да се највећи број пупољака развио на експлантатима гајеним на подлози MS са 0,1 µM BA. На подлози MS са 10 µM BA просечна дужина пупољака била је најмања, a највећа на контролној подлози. Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор: Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/2 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: Master thesis Author, AU: Sanja Nikolić Mentor, MN: Dragana Stojičić Title, TI: Cytokinin-mediated axillary bud induction on Micromeria juliana L. (Benth.) in vitro
Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 45 p. ; 13 figures, 6 tables, 1 histogram (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: biology Subject/Key words, S/KW: Micromeria juliana, micropropagation, axillary buds
UC 577.175.1:582.929.4
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: The possibility of regeneration Micromeria juliana through induction of axillary buds on the nodal explants, with the assistence of cytokinin, was tested in this work. It was also investigated the effect of different treatments on the weight of plants. Micropropagation was successful. It was found that the greatest number of buds was developed on explants that were cultured on MS medium with 0,1 µM BA. On MS medium with 10 μM BA the average length of buds was the lowest, the highest was on medium whitout hormones. Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: Образац Q4.09.13 - Издање 1