UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

EVALUACIÓN DE PROCEDIMIENTOS EN LA CONSERVACIÓN Y GERMINACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE LA ORQUÍDEA Epidendrum nocturnum (Jacq).

TRABAJO EXPERIMENTAL

Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de INGENIERO AGRÓNOMO

AUTOR APOLO MORENO KELLY VERÓNICA

TUTOR PhD. MANCERO CASTILLO DANIEL

GUAYAQUIL – ECUADOR

2021

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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, DR. MANCERO CASTILLO DANIEL, docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi calidad de Tutor, certifico que el presente trabajo de titulación: EVALUACIÓN DE PROCEDIMIENTOS EN LA CONSERVACIÓN Y GERMINACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE LA ORQUÍDEA Epidendrum nocturnum (Jacq)., realizado por la estudiante APOLO MORENO KELLY VERÓNICA con cédula de identidad N° 095231399-7 de la carrera de INGENIERÍA AGRONÓMICA, Unidad Académica Guayaquil, ha sido orientado y revisado durante su ejecución; y cumple con los requisitos técnicos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador; por lo tanto, se aprueba la presentación del mismo.

Atentamente,

DR. MANCERO CASTILLO DANIEL TUTOR

Guayaquil, 26 de febrero del 2021

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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÒN

Los abajo firmantes, docentes designados por el H. Consejo Directivo como miembros del Tribunal de Sustentación, aprobamos la defensa del trabajo de titulación: EVALUACIÓN DE PROCEDIMIENTOS EN LA CONSERVACIÓN Y GERMINACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE LA ORQUÍDEA Epidendrum nocturnum (Jacq)., realizado por la estudiante APOLO MORENO KELLY VERÓNICA el mismo que cumple con los requisitos exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador.

Atentamente,

Ing.Yoansy García Ortega PRESIDENTE

Ing. Freddy Veliz Piguave Ing. Antonio Álava Murillo EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL

Guayaquil, 26 de febrero del 2021

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Dedicatoria

Esto es dedicado a mi Dios que siempre estuvo y está conmigo en los peores momentos de mi vida cuando pensé rendirme. Él me dio la fuerza en cada semestre, a pesar de las dificultades que se presentaron, en el camino, nunca me dejo y a mis padres que sin ellos no hubiera podido realizar este sueño, además sin ellos no sabría cómo seguir y a mi hermana por apoyarme emocionalmente en los momentos que pensé que cambiaría mi vida, en este duro camino que no fue fácil pero ya fue posible.

También va especialmente dedicado a esos seres queridos que anhelaron, verme llegar en esta etapa como lo son mi abuela Esperanza y mi bisabuelo

Humberto.

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Agradecimiento

Agradezco a Dios por regalarme los días para cumplir este sueño y a mi mamá Carmen Moreno por tantas madrugadas, por apoyarme en todo y darme sus consejos y a mi papá Rogelio Apolo, por ayudarme a cumplir mis objetivos también, la Dra. Ariadne Vega que despertó en mí, el interés en los cultivos in vitro y por su apoyo, finalmente a mis tíos Carmen Apolo y

David Apolo que siempre estuvieron prestos a ayudarme, en conseguir la orquídea y semillas para este estudio de importancia para mi tema de tesis.

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Autorización de Autoría Intelectual

Yo, APOLO MORENO KELLY VERÓNICA, en calidad de autor del proyecto realizado, sobre EVALUACIÓN DE PROCEDIMIENTOS EN LA CONSERVACIÓN

Y GERMINACIÓN IN VITRO DE SEMILLAS DE LA ORQUÍDEA Epidendrum nocturnum (Jacq).; para optar el título de INGENIERO AGRÓNOMO, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me correspondan, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

Guayaquil, 25 de febrero del 2021

APOLO MORENO KELLY VERÓNICA C.I. 095231399-7

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Índice general

PORTADA ...... 1

APROBACIÓN DEL TUTOR ...... 2

APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN ...... 3

Dedicatoria ...... 4

Agradecimiento ...... 5

Autorización de Autoría Intelectual ...... 6

Índice general ...... 7

Índice de tablas ...... 10

Índice de figuras ...... 11

Resumen ...... 13

Abstract ...... 14

1. Introducción ...... 16

1.1 Antecedentes del problema...... 16

1.2 Planteamiento y formulación del problema ...... 16

1.2.1 Planteamiento del problema ...... 18

1.2.2 Formulación del problema ...... 18

1.3 Justificación de la investigación...... 19

1.4 Delimitación de la investigación ...... 20

1.5 Objetivo general ...... 20

1.6 Objetivos específicos ...... 20

1.7 Hipótesis ...... 21

2. Marco teórico ...... 22

2.1 Estado del arte ...... 22

2.2 Bases teóricas ...... 26

2.2.1 Origen de orquídea Epidendrum nocturnum a nivel mundial ...... 26 8

2.2.2 Clasificación taxonómica ...... 26

2.2.2.1. Raíz ...... 27

2.2.2.2. Tallo ...... 27

2.2.2.3. Hojas ...... 27

2.2.2.4. Flores ...... 28

2.2.2.5. Fruto ...... 28

2.2.2.6. Semilla ...... 28

2.2.3 Distribución geográfica en Ecuador ...... 28

2.2.4 Hábitat ...... 29

2.2.5 Variedades de especies del género Epidendrum nocturnum ...... 29

2.2.6 Formas de propagación...... 29

2.2.6.1. Propagación sexual ...... 29

2.2.6.2. Propagación asexual ...... 30

2.2.7 Obtención de plantas enteras de manera asexual in vitro ...... 30

2.2.8 Propagación de las especies en peligro de vulnerabilidad ...... 31

2.2.9 Métodos de conservación y germinación de las semillas in vitro ..... 31

2.2.9.1. Conservación de semillas ...... 31

2.2.9.2. Germinación natural ...... 31

2.2.9.3. Germinación In vitro ...... 31

2.2.10 Medio Murashige & Skoog ...... 32

2.2.11 Giberelinas (GA3) ...... 32

2.2.12 Citocininas (BAP) ...... 32

2.2.13 Agua de coco (AC) ...... 33

2.2.14 Carbón activado (CA) ...... 33

2.3 Marco legal ...... 33 9

3. Materiales y métodos ...... 36

3.1 Enfoque de la investigación ...... 36

3.1.1 Tipo de investigación ...... 36

3.1.2 Diseño de investigación ...... 36

3.2 Metodología ...... 36

3.2.1 Variables ...... 37

3.2.1.1. Variables independiente ...... 37

3.2.1.2. Variables dependientes ...... 37

3.2.2 Tratamientos ...... 38

3.2.3 Diseño experimental ...... 42

3.2.3.1.Esquema del analisis de varianza ...... 42

3.2.3.2. Delmitación exprimental ...... 43

3.2.4 Recolección de datos ...... 43

3.2.4.1. Recursos...... 43

3.2.4.2. Metodos y tecnicas ...... 43

3.2.5 Análisis estadístico ...... 45

3.2.5.1. Análisis funcional ...... 45

3.2.5.2. Hipotesis estadistica ...... 45

4. Resultados ...... 46

4.1 Determinación del porcentaje de germinación de las semillas ...... 46

4.1.1 Porcentaje de germinación a los 15 días, primera siembra (%) ...... 46

4.1.2 Porcentaje de germinación a los 20 días, segunda siembra (%) ...... 47

4.1.3 Conservación de las semillas según tasa de germinación……….….47

4.2 Combinaciones entre los medios de cultivos y temperaturas………...….48

10

4.3 Análisis del porcentaje de contaminación presente en los tratamientos

en estudio…………………………………………………….……………..………....48

4.3.1 Porcentaje contaminación a los 15 días, primera siembra (%).….….48

4.3.2 Porcentaje de contaminación a los 20 días, segunda siembra (%) .. 50

5. Discusión ...... 52

6. Conclusiones ...... 57

7. Recomendaciones ...... 58

8. Bibliografía ...... 60

9. Anexos ...... 69

11

Índice de tablas

Tabla 1. Descripción de los tratamientos ...... 39

Tabla 2. Esquema del análisis factorial ...... 42

Tabla 3. Diseño experimental ...... 43

Tabla 4. Recursos económicos ...... 44

Tabla 5. Porcentaje de germinación a los 15 días (%) ...... 47

Tabla 6. Porcentaje de contaminación a los 15 días (%) ...... 49

Tabla 7. Porcentaje de contaminación a los 20 días (%) ...... 51

Tabla 8. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+AC ...... 76

Tabla 9. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+GA3 ...... 77

Tabla 10. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+BAP……..77

12

Índice de figuras

Figura 1. Andeva de la germinación a los 15 días, primera siembra ...... 69

Figura 2. Medias para los tratamientos en germinación a los 15 días ...... 69

Figura 3. Varible germinación factor A (Temperatura) ...... 70

Figura 4. Varible germinación factor B (Medios de cultivos) ...... 70

Figura 5. Interacción AXB en porcentaje de germinación ...... 71

Figura 6. Andeva de contaminación a los 15 días, primera siembra ...... 71

Figura 7. Medias para medios de cultivos en contaminación a los 15 días ..... 71

Figura 8. Variable contaminación factor A (Temperatura) ...... 72

Figura 9. Variable contaminación factor B (Medio de cultivo) ………….………73

Figura 10. Interacción de temperatura por medios de cultivo AxB...... 73

Figura 11. Andeva de contaminación a los 20 días, segunda siembra ...... 74

Figura 12. Medias estadísticas para variable contaminación a los 20 días ... 74

Figura 13.Variable contaminación factor A (Temperatura) ...... 73

Figura 14. Variable contaminación factor B (Medio de cultivo) ...... 73

Figura 15. Interacción de contaminación (AxB) ...... 73

Figura 16. Mapa de ubicación de la investigación ...... 78

Figura 17. Diferencia en color de cápsulas de Epidendrum nocturnum...... 78

Figura 18. Recolección de semillas de Epidendrum nocturnum...... 79

Figura 19. Medio de cultivo de giberelinas contaminado……………...…………79

Figura 20. Observación de semilla Epidendrum nocturnum germinada ……...80

Figura 21. Conteo de semillas antes de la siembra...... 80

Figura 22. Muestras sin germinar segunda siembra ...... 81

Figura 23. Medio de cultivo de agua de coco ...... 81

Figura 24. Flor de la Orquídea Epidendrum nocturnum Jacq ...... 82 13

Figura 25. Siembra de semillas Epidendrum nocturnum Jacq ...... 82

Figura 26. Medios de cultivos en cajas Petri ...... 83

Figura 27. Protocolo de desinfección para siembra ...... 83

Figura 28. Germinación en (T2) agua de coco de temperatura ambiente...... 84

Figura 29. Observación de semillas germinadas de E.nocturnum ...... 84

Figura 30. Siembra de semillas E. nocturnum ...... 85

Figura 31. Protocolo de desinfección segunda siembra ...... 85

Figura 32.Capsula cerrada cortada para conservación segunda siembra ...... 86

Figura 33 . Semillas germinadas en medio AC temperatura 4°C ...... 86

Figura 34. Contaminación en medio de cultivo de BAP ...... 87

Figura 35. Revisión a los 20 días de semillas sin germinar ...... 87

Figura 36. Contaminación en medio BAP siembra a los 20 días ...... 88

Figura 37. Contaminación de hongo en BAP en siembra a los 20 días ...... 88

Figura 38. Observación de semillas con el microscopio segunda siembra ...... 89

Figura 39. Ilustración de E.nocturnum Jacq...... 89

Figura 40. Utilización de giberelina para preparación en medios de cultivos….90

Figura 41. Preparación de los medios de cultivo AC,BAP,GA3…………………90

Figura 42. Contaminación primera siembra en medio agua de coco……………91

14

Resumen

Epidendrum nocturnum es una orquídea en lista de vulnerabilidad a la extinción en

Ecuador, se realizó una evaluación de procedimientos con esta especie, para una conservación y germinación in vitro, analizando la viabilidad en semillas conservadas en temperatura ambiente y bajo refrigeración, para su germinación en medios de cultivos que generen mayor obtención de propágulos. Las semillas se almacenaron durante 5 meses, se preparó medios de cultivos con formulación

Murashige & Skoog (MS) con carbón activado (0,5%), para 3 medios de cultivos suplementados cada uno con: BAP (1,5mg l–1), AC (20%), GA3 (3 mg l–1), dividiéndose para temperaturas: 25°C y 4°C, conformando así 6 tratamientos, con

5 repeticiones correspondiendo un diseño DCA, con arreglo factorial efectuando protocolos de desinfección en siembras. Mediante la evaluación, se determinó germinación a los 15 días, en el tratamiento 2 medio de cultivo agua de coco, en

25°C con obtención del 2,64%, siendo el más eficiente entre todos los tratamientos, concluyendo que la temperatura ambiente y medio de cultivo es favorable para esta especie. No existió combinaciones significativas entre los factores, habiendo menor contaminación a los 15 días, con 65,00% por hongos de manera interna para el medio de cultivo agua de coco en 25°C. No se observó germinación en la segunda siembra, teniendo una reducción en contaminación externa a los 20 días, por hongos con el 46,00% y como rango más alto de 58,60%, concluyendo que esta disminución en contaminación fue debido al cambio de protocolo de desinfección en cápsula y semillas.

Palabras Claves: Agua de coco, Epidendrum nocturrnum, Conservación, In vitro,

Germinación.

15

Abstract

Epidendrum nocturnum is an orchid in list of vulnerability kind to extinction in

Ecuador, an evaluation of procedures was made with this species, for a conservation and germination in vitro, analyzing viability in seeds conserved at room temperature and under refrigeration, for germination in crop media that generated greater production of propagules. The seeds were stored for 5 months, culture media with Murashige & Skoog (MS) formulation with activated carbon (0.5%) was prepared, for 3 crop media supplemented each with: Bap (1,5mg l–1), Ac (20%), Ga3

(3 mg l–1), Dividing for temperatures: 25 °C and 4 °C, thus conforming 6 treatments, with 5 repetitions corresponding to a DCA design, with factorial arrangement performing disinfection protocols in seedlings. Germination was determined at 15 days, in the treatment 2 culture medium coconut water, in 25 ° C obtained 2.64%, being the most efficient among all treatments, concluding that the ambient temperature and culture medium is favorable for this species. There were no significant combinations between the factors, having less contamination at 15 days, with 65.00% by fungi internally for the coconut water culture medium at 25 °C. No germination occured in the second sowing, having a reduction in external contamination at 20 days, by fungi with 46.00% and as the highest rank of 58.60%, concluding that this decrease in contamination was due to the change in the disinfection protocol in capsule and seeds.

Keywords: Coconut Water, Epidendrum nocturnum, Conservation, In vitro,

Germination

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1. Introducción

1.1 Antecedentes del problema

Las orquídeas son las flores más raras, singulares y exuberantes del mundo llamativas por sus peculiares formas de flores con sus colores y aromas estas especies todas de genética: Epifitas, vasculares, monocotiledóneas, fanerógamas y angiospermas pertenecientes a varios climas de las regiones tropicales o templado-cálidas, según los estudiosos, esconden en su reproducción y crecimiento un tesoro de la naturaleza, son el termómetro de la conservación de ecosistemas vírgenes (Johannessen, 2017).

Existen un total de plantas vasculares en el ecuador 17.934 y cerca de 5.507 son especies nativas endémicas de Ecuador; esta última cifra varía cada momento. El estado de conservación de la flora en el Ecuador continúa, siendo un desafío el total de especies nativas enfrentan algún grado de amenaza (Neill, 2018).

Teniendo valores en porcentajes indicando que, 353 especies de orquídeas (8%) estas se ven en peligro crítico de extinción (CR), 1.071 (24%) están en Peligro (EN) y 2.080 (46%) se consideran Vulnerables (VU), en ella se encierra la especie

Epidendrum nocturnum (León et al.,2011).

La principal amenaza que enfrentan las plantas endémicas en el país es la pérdida de su hábitat, ocasionada por actividades humanas, el mayor impacto proviene de la deforestación a pequeña gran escala, el cambio de uso del suelo para agricultura, ganadería, urbanización o minería (Wraith y Pickering, 2018).

La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación

(FAO, 2018) indica que “la tasa de perdía de la superficie forestal en el Ecuador es del 1,7 % anual, afectando de forma significativa también a las especies que habitan en estas áreas boscosas” (p.4). 17

La conservación de semillas se ha promovido desde el 2008, en cual atreves de los años las formas de conservación han ido, mejorando años tras años para perdurar la genética de las especies. La germinación natural de las orquídeas suele ser dificultosa debido a que las semillas carecen de endospermo, por ello la germinación in vitro en medios Murashige & skoog hechos por el hombre

(científicos) es la manera más adecuada de propagarlas (Cerna, Cárdenas, Cruz y

Jácome , 2014).

El término “cultivo in vitro de tejidos” significa cultivar algunas partes de las plantas también llamados “explantes”, como segmentos de hoja, tallo y raíces, además de otros tejidos u órganos vegetales, dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial, en los que deben de controlarse luminosidad, el crecimiento y el desarrollo de tejidos u semillas controlar la contaminación de microorganismos como bacterias, hongos y los tejidos o plantas deben de mostrar un óptimo desarrollo (Chávez, Mosquera y Otero, 2014).

En el caso en el cultivo in vitro de orquídeas, se cultivan las semillas su germinación de manera asimbiótica. Las cuales para su siembra se rigen por protocolos especializados para orquídeas teniendo la debida asepsia, se cultivan en soluciones nutritivas especiales, con frecuencia en medios solidificados con agar, a estos medios de cultivo, se les incorporan dosis adecuadas de inductores naturales (agua de coco) y fitoreguladores de crecimiento vegetal, como son citocinina (BAP) y giberelinas (Ga3). Entre los medios básicos utilizados en el cultivo in vitro en semillas de orquídeas se encuentran, el medio Murashige & Skoog

(1962), constituido por sales que contienen macronutrientes, micronutrientes, minerales y vitaminas con sus respectivos fitoreguladores de crecimiento los cuales son necesarios para su germinación (Cerna et al.,2014). 18

1.2 Planteamiento y formulación del problema

1.2.1 Planteamiento del problema

Las amenazas antrópicas a las que están expuestos las orquídeas y diversos hábitats, han promovido iniciativas para su conservación y preservación de las especies epifitas endémicas. Una de ellas, es el almacenamiento de semillas de orquídea, con el objetivo de conservar orquídeas tanto, como su germoplasma y fomentar la germinación de manera in vitro, cabe resaltar que estas especies monocotiledóneas en su gran mayoría. Todas ellas carecen endospermo es lo que las caracteriza de las demás semillas y en el momento de su germinación de manera natural, depende de varios factores (las condiciones climáticas dependiendo la especie, necesitan obligatoriamente un hongo simbionte y componentes rico en azucares, nutrientes y minerales), para poder germinar sin el hongo no germinará las semillas de orquídea. Es por ello que la germinación in vitro es una opción más apta, para las especies epifitas pertenecientes al territorio ecuatoriano con dificultad reproductiva para preservarse más tiempo alargando la descendencia del género de la especie cuando se preserva la semilla que se encuentran, en peligro de extinción o vulnerabilidad como es el caso de la orquídea

E. nocturnum.

El desarrollo de metodologías que estimulen conservación de orquídeas in vitro de especies locales, ayudará a las orquídeas vulnerables, preservarse más alargando la descendencia del género de la especie cuando se preserva la semilla y se hacen germinación in vitro y se realiza todas sus fases (Amaral, 2019).

Varias especies están en vulnerabilidad en ciertas zonas del Ecuador la cual es el caso Epidendrum nocturnum (Jacq), que obtiene el (46%) de vulnerabilidad, se necesitan de tres a cinco años para aumentar la población, de esta y cualquier 19 especie de orquídeas que requiera, una repoblación nueva de la especie en vulnerabilidad, las posibles causas de la pérdida paulatina de estas especies vasculares es la deforestación, quemas de bosques y la extracción de las mismas por habitantes de las zonas ya que son exótica, se comercializan dentro y fuera del país de manera legal o ilegal. Las contaminaciones ambientales han conllevado, a que algunas especies se encuentren en peligro de extinción a una considerable escala (Castañeda y Pérez, 2016).

1.2.2 Formulación del problema

¿Es posible la conservación y posterior germinación de las semillas perteneciente a la especie de orquídea Epidendrum nocturnum cultivadas in vitro a temperatura ambiente y refrigeración en diferentes medios de cultivo?

1.3 Justificación de la investigación

Según el Ministerio de Turismo, el Ecuador fue declarado el primer país de las orquídeas, obtenido por méritos realizados en el país, en promover la importancia sobre el valor de la biodiversidad de especies nativas. Es el país con mayor cantidad de especies descubiertas y tiene alrededor de 5.507 especies, de las cuales gran cantidad especies están en peligro de extinción y otras en listas de vulnerabilidad. Hay que tener en cuenta este tipo de advertencias en estas especies, ya que representan el termómetro ecológico, de las zonas donde son endémicas y en todo el país.

La orquídea Epidendrum nocturnum se encuentra en la lista de vulnerabilidad, por varios factores: Principalmente por la deforestación, la quema indiscriminada de bosques, por proyectos extractivos en zonas vírgenes y por parte de los pobladores que extraen estas especies y las trasladan a diferente hábitat sin ningún permiso. Algunas personas se dedican a la venta comercial indiscriminada e ilegal 20 de esta y muchas otras especies a nivel nacional e internacional. Por estas razones, se crea, la posibilidad de utilizar metodologías de conservación de semillas de orquídeas para posterior a una germinación de esta especie, mediante la evaluación de procedimiento en conservación y germinación in vitro de semillas endémicas y vulnerables, como es el caso de la orquídea Epidendrum nocturnum será de sumo beneficio, para contribuir a mantener y proteger este germoplasma, debido a las bajas poblaciones de Epidendrum nocturnum, que existen en ciertas partes del Ecuador. De esta manera se pretende ayudar a que permanezca fuera del listado de vulnerabilidad de plantas en peligro.

1.4 Delimitación de la investigación

 Espacio: Este análisis se realizó en el laboratorio de biotecnología de la

Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Agraria del Ecuador - Sede

Guayaquil.

 Tiempo: La tesis se realizó en un periodo de 10 meses, comprendido el

periodo de enero del 2020 a octubre del 2020.

 Población: Este ensayo fue dirigido a cultivadores de orquídeas in vitro que

preservan las especies en peligro de extinción a los taxónomos en orquídeas,

orquideólogos del Ecuador y organizaciones que preservan especies

vulnerables.

1.5 Objetivo general

Analizar la viabilidad de semillas de Epidendrum nocturnum conservadas a temperatura ambiente y bajo refrigeración para germinación de propágulos in vitro en medios de cultivos.

1.6 Objetivos específicos

 Determinar el medio de cultivo y temperatura con mayor porcentaje de 21

germinación de las semillas de la orquídea Epidendrum nocturnum (Jacq).

 Establecer la interacción entre tipos de medio de cultivo y temperaturas para

el cultivo in vitro de la orquídea Epidendrum nocturnum (Jacq).

 Evaluar el porcentaje de contaminación en el cultivo in vitro a la tercera

semana para semillas conservadas a temperatura ambiente y en refrigeración.

1.7 Hipótesis

Al menos una de las temperaturas y medios de cultivos favorecerán en la conservación y germinación in vitro para las semillas de orquídea Epidendrum nocturnum (Jacq).

22

2. Marco teórico

2.1 Estado del arte

Para la germinación de semillas de orquídea Sievekingia marsupialis se han utilizado medios de cultivo a los cuales, se ha adicionado carbón activado en porcentajes del 1,0% obteniendo altas tasas de germinación. Estos resultados coinciden con lo que propuso Margara (Citado por cerna et al.,2014). Por otra parte,

Borges (Citado por Cerna et al., 2014) menciona, que el ambiente de oscuridad que genera el carbón activado simula condiciones naturales, para la germinación de la semilla ya que ayuda a la formación de la clorofila, además que absorbe los compuestos tóxicos y consiguieron un promedio de 85% de viabilidad de las semillas después de ser almacenadas por 3 meses, en tubos de ensayo al vacío

(vacutainers) a 18º C, con 6-10 % de humedad relativa (HR) y en condiciones de oscuridad.

Según Victoriano, Velásquez, Ávila y Rodríguez (2016) al comparar el porcentaje de germinación y desarrollo de protocormos en semillas de orquídeas, luego de 5 meses, se observó que medios artificiales de cultivo Murashige & Skoog complementado con sacarosa al 3 % (medio base), no se observó germinación por lo que administro, fitorreguladores como BAP (Citocina). Al comparar el porcentaje de germinación obtenido, con medios MS con BAP al 2 mg. L-1, se verificó que

únicamente las especies Catasetum integerrium y Brassabola nodos, con porcentajes de germinación del 70 %. Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos por Vejsadova y García, citado por Victoriano et al., (2016). Este último autor afirma que la propagación in vitro, es una alternativa viable para especies de orquídeas terrestres y epifitas.

La germinación de la orquídea Cattleya máxima in vitro, se indica que en 23 porcentajes de carbón activado para su germinación fueron de 3 dosis de carbón activado 1 g/l, 1,5 g/l 2 g/l, en las cuales la dosis de 1,5 g/l resulto un porcentaje del

100 % de sobrevivencia a continuación. Se obtuvo en el tratamiento compuesto por carbón activado de 1 g/l con el 98 %, seguido de carbón activado con dosis de 2 g/l que presentaron con 89% de viabilidad, carbón activado (antioxidantes) este con luyo un papel muy importante en la germinación del embrión, debido a que este antioxidante en dosis de 35 y 40 mg/l, evitó la aparición de fenoles en el medio de cultivo. La semilla tardo en germinar 40 días después de la siembra manteniéndose, el color verde pálido durante todo el ensayo; y el protocormo un volumen reducido en comparación a las dosis de carbón activado y agua de coco. Cabe recalcar que el porcentaje de sobrevivencia, fue adjudicado en un 100% para la concentración de carbón activado de 1,5 g/l pues en este tratamiento no existió contaminación

(Castillo y Serrano, 2011).

La conservación de germoplasma de semillas de orquídeas de la especie

Epidendrum schistochilum, Oncidium cultratum, las semillas fueron transferidas a tubos de ensayo (de 10 x 1,5 cm); considerando, que las semillas de cada cápsula madura se depositan en tubos individuales, sin tapar solo en marcados con nombre de la especie posteriormente se realizó. En el proceso de secado de las semillas, se utilizó sílica gel previamente calentada, en la estufa a 70°C por treinta minutos en desecadores de vidrio; luego, las semillas fueron colocadas en dichos desecadores y al mismo tiempo, se implementó un medidor de temperatura (20 °C) y humedad relativa en cada desecador, esto se realizó para que mantengan humedad (Paredes, 2012). Se evaluaron en germinación 15 especies de orquídeas en las cuales dos eran del género Epidendrum, (Epidendrum nocturnum y

Epidendrum secundum) y se utilizó en cuatro tipos de diferentes medios de cultivos 24 constituido, por las sales inorgánicas Knudson (1946), Vacin y Went (1949),

Murashige y Skoog (1962) al 50% o Morel (1965) con agua de coco (10%), sacarosa

(2.0%), carbón activado (0.0 y 0.15%) y se solidificaron con agar técnico de tercer grado con concentración de 0.7%,como resultado se consiguió que ambas especies del género Epidendrum, tuvieran más germinación con carbón y menos germinación sin carbón, de manera que las demás especies resultaron al momento de la germinación fueron favorecidas solo 9 especies (60%) de las 15 en estudio, las demás especies se fenolizarón (Bletia patula, Encyclia gravida, Epidendrum wrightii) y en 3 especies no se observó germinación (Physinga polygonatum,

Polystachia concreta, Prosthechea fragans), se concluyó que el carbón activado es un componente especializado como medio in vitro, para orquídeas con resultados que influyó positivamente al aumentar de la germinación (Adhikari y Pant, 2019).

La adición al medio de cultivo de carbón activado es un método que ha sido empleado por una gran cantidad de autores (Thompson, 1980; Singh, 1993;

George, 1996; Pérez, 1998; Tisserat y Jones, 1999; Yang et al., 1999; McKendrick,

2000) y se ha demostrado que el carbón activado, contribuye positivamente en germinación y el desarrollo en sus fases de formación, de las orquídeas sobre todo de aquellas que son propensas a la fenolización (Rodríguez, González, Alvarado y

Telles, 2007).

Cerna et al., (2014) en su investigación consiguieron un promedio de 85% de viabilidad de las semillas después, de ser almacenadas por 3 meses en tubos de ensayo al vacío (vacutainers) a 18 ºC, con 6-10 % de humedad relativa (HR) y en condiciones de oscuridad.

En la germinación in vitro, de las orquídeas nativas de pamplona de cápsulas maduras de orquídeas P. Vespa y S. Klotzscheana, como resultados obtuvo el 25 porcentaje de germinación en formación de propágulos, fue más alto en el medio

MS+AC (agua de coco) en su fase 0 : Semillas con embrión no germinado con el

13,3% , en la fase 1 : Expansión del embrión con un 38,7%, en fase 2: Aparición del protocormo y rizoide obtuvo, un 15,3%, en fase 3 : Emergencia y primera hoja

17,3 % en su fase 4: Aparición de hoja y de raíces 15,3% en fase 5 :Dos o más hojas (plántula totalmente formada) obtuvo 0%, cabe indicar que existieron 2 tratamientos más basados en MS+ JP (jugo de piña), las cuales fueron insignificantes al medio AC (Salazar y Cancino, 2012).

Bertolini, Damon y Rojas (2014), la siembra de semillas de orquídeas a los 30 y

60 días, en el medio DR sugerido por (micronutrimentos de Dalla Rosa y Laneri)

KO7 (estabilizador de oxígeno), en medio MS adicionando 2,5g l-1 de carbón activado), más agua de coco se produjó mayormente número de protocormos con aparición de rizoides y primordios foliares.

Montoya et al., (2014) señala que de acuerdo con la determinación de los métodos para el establecimiento in vitro, de orquídeas en el proceso de germinación por parte de los estudiantes del técnico rural de Marinilla, se utilizaron 4 medios de cultivo de los cuales en todos existió contaminación, pero esto no impidió la germinación de las semillas en los medios de cultivos: 1) MS+ agar + sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de plátano se logró, un porcentaje de germinación del 25 % en orquídeas, con una contaminación del 0%. 2) MS + agar+ sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de tomate, tuvo un 0% de germinación con una contaminación del 100% de contaminación la cual inhibió en su totalidad la contaminación.3) MS+ agar + sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de plátano, zumo de tomate + zumo de zanahoria, poseyó una germinación del 25%, hubo un 60 % de contaminación.4) MS+ agar + sacarosa + tiamina +agua destilada 26

+ V8 (jugo de vegetales) hubo una germinación del 50 % y obtuvo un 20% de contaminación en el medio de cultivo.

(Soria, Juárez y Torres, 2015) indica que al momento de la desinfección para las semillas de orquídeas o de cualquier especie debe realizarse correctamente para evitar en lo posible la presencia de hongos o bacterias, donde se debe utilizar dosis de cloro comercial al 0.5% al 0,75% y se adhiere una gota de Tween 20.

Rodríguez, Vargas, Villegas y López. (2015) indica en su estudio que el uso de semilla madura de Brassolaeliocattle, conservada por dos meses con temperatura de 20 °C, tuvo mejores resultados en cuanto aparición de brotes y desarrollo vegetal.

2.2 Bases teóricas

2.2.1 Origen de orquídea Epidendrum nocturnum a nivel mundial

El nombre del género Epidendrum deriva de las palabras griegas epi- (sobre), y dendron (árbol); “que crece sobre los árboles”, aludiendo a su hábito epífito. La orquídea se descubrió al principio por el padre de la taxonomía Carl Linnaeus, en

1745 en una constancia de diferenciar el grupo de las orquídeas epifitas y en el año

1763, Nikolaus Joseph von Jacquin, descubrió su distribución geografía mundial de esta especie, por ello la terminación científica de la esta especie en (Jacq), actualmente se encuentra en Ecuador, Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica,

Estados Unidos y Venezuela (García, Sofrony, González y Samper, 2013).

2.2.2 Clasificación taxonómica

Dominio: Biota

Reino: Plantae

Filo: Tracheophyta

División: Magnoliophyta 27

Clase: Liliopsida

Subclase: Liliidae

Orden: Asparagales

Familia: Orchidaceae

Género: Epidendrum (Jacq, 1760)

Especie: nocturnum (Hoff, Cremers, Feuilet y Granville, 2018).

2.2.2.1. Raíz

Las raíces de las orquídeas son basales carnosas filiformes, que están forradas por unas fundas de células esponjosas llamadas velamen. Poseen clorofila bajo esa cubierta, lo que les permite realizar la fotosíntesis y facilita la absorción de agua y minerales, ya que estas plantas dependen para su nutrición de las lluvias periódicas, neblinas y ramas húmedas; pueden crecer en todas direcciones y sirven para la sujeción, ya que abrazan al tronco o ramas de los árboles (Menchaca, 2011).

2.2.2.2. Tallo

“Son tallos erectos medianamente largos por los generales dependiendo su variedad a medida que crece 7-10 entrenudos” (Cortés, Castro, y Cepeda, 2016, p.

25).

2.2.2.3. Hojas

Las hojas son medianamente gruesas simples lanceoladas, algo caedizas en su

ápice obtuso y base cuneada envainadoras, son alternar en los entrenudos en su tallo son totalmente verdes, con el nervio principal muy conspicuo con ápice ligeramente invaginado por la región del nervio central (Llamacho y Larramendi,

2005).

2.2.2.3. Flores

Las flores son medianas y despojan un aroma exquisito en horas de la noche; 28 tiene inflorescencias terminales que se componen de 1-3, tiene pétalos descendentes lineares a (filiformes) y sépalos laterales (lanceolados) y muy finos en medidas unos +/-8 cm de largo y son de color amarillo verdoso, esta variedad tiene un perianto blanco, tépalos verdes amarillento. Posee un labelo tubulado muy pequeño con antera dorsales (Tropical, 2016).

2.2.2.4. Fruto

“Los frutos son nombrados botánicamente como cápsulas de forma elipsoide de color verde” (Ayuso, 2017, p.3).

2.2.2.5. Semilla

Las semillas miden de (1-2 mm) de largo y (0,05-1) mm de ancho. Su peso varía de (0,31- 24 μg). En la parte interior de los frutos podemos encontrar miles de semillas. Su forma general varía desde forma de hilo (filiforme) o cilíndrica con punta (fusiforme) y en ocasiones parecen alas o protuberancia, viéndose desprovista de endospermo (sirve para alimentar al embrión mientras salen sus hojas). La testa o cáscara está formada por células muertas y el embrión por un rango de entre ocho y 200 células. Su dispersión se hace, generalmente con ayuda del viento (Menchaca, 2011).

2.2.3 Distribución geográfica en Ecuador

La orquídea Epidendrum nocturnum en Ecuador es una especie nativa fue encontrada por primera vez el 5 de agosto 1982, en Esmeraldas y el 9 de noviembre del mismo año en Napo se encuentran en elevaciones 0–500 su actual distribución, es en la provincia del Oro, Cuenca, Riobamba, Pichincha y Esmeraldas (Dodson y

De Dodson, 1999).

2.2.4 Hábitat

La orquídea Epidendrum Nocturnum, se encuentra en bosques muy húmedos y 29

en manglares en parte tropicales en América, incluyendo las Antillas y climas de temperatura fría o semi fría, florece en primavera y verano (Llamacho y Larramendi,

2005).

2.2.5 Variedades de especies del género Epidendrum nocturnum

Existen 2 variedades de esta orquídea:

Epidendrum nocturnum (var minor), pertenece a la variedad Epidendrum, pero teniendo un distintivo, por ser pequeña de tamaño en sus hojas y flores (flor pequeña de 2 cm) (Portilla y Acaro, 2020).

Epidendrum noctrunum (Jacq) Variedad de tamaño normal, con flor grande con 7 a 10 entrenudos. (Wunderlin, Hansen y Franck , 2020).

2.2.6 Formas de propagación

Las orquídeas tienen dos maneras de propagarse: sexual y asexual.

2.2.6.1. Propagación sexual

La propagación sexual consiste básicamente en que las flores de orquídeas contienen polen (células germinales sexuales masculinas), estas se trasladan por insectos, se instalan en el ovario y óvulos (células germinales femeninas), este proceso se llama polinización, en la cual días después la flor se seca, pero sin decaer de la planta formando una cápsula, que es el fruto de la orquídea en este caso llamado cápsulas. Que se alcanzan por medio de una fecundación entre plantas de la misma especie, lo que genera una mayor diversidad de caracterización en descendencia genética. La propagación de orquídeas es muy poca (alrededor del 4%) (Tremblay, Dackermand, Zimmerman y Calvo 2005). La propagación sexual suele ser baja, debido que la mayoría de semillas se mueren y no germinan solo se llega a un 1% de germinación entre todas, llega a ser colonizada por un hongo simbionte el cual, tiene la faculta de tener los nutrientes 30 necesarios de manera, que pueda llegar a la germinación y producir una planta nueva. Las semillas de orquídeas son capaces de establecerse, si encuentran su hábitat natural cuando, encuentran estos hongos más un microclima natural de bosque lluvioso o las condiciones morfogenética de la especie, su germinación natural es ideal (Prasad, Fischer y Siegfried, 2016).

2.2.6.2. Propagación asexual

La germinación asexual de las orquídeas, se inicia por diferentes tipos de explantes de la orquídea (meristemo apical, meristemo lateral, yema en latencia, nudo de tallo, yema floral, tallo floral joven, sección de hoja nueva, sección de raíz), cabe acotar que todas estas extracciones provienen del mismo meristema

son llamadas clones de la planta de origen (Placencia, 2010).

2.2.7 Obtención de plantas enteras de manera asexual in vitro

La obtención cabe acotar de las mismas plantas de cualquier edad, aunque de preferencia es mejor que sean plantas jóvenes, se extraen de brotes y embriones pre-existentes, se puede esperar a su crecimiento con la madre y cuando formen raíz se puede hacer una aclimatación en sustrato o si necesita ver su crecimiento, in vitro es ideal extraer sus pequeños brotes pre-existentes para ver sus fases de crecimiento (Rojas, 2014).

2.2.8 Propagación de las especies en peligro de vulnerabilidad

La propagación de la orquídea Epidendrum nocturnum es importante, debido a la vulnerabilidad que existe en las zonas donde habita. Por lo anterior se considera la germinación in vitro de los embriones, para garantizar la propagación de la especie. El crecimiento de las orquídeas durante la germinación no ocurre como en el resto de las demás angiospermas (radícula-tallo-hoja), sino que pasan por una serie de estadios llamados protocormos (Ortega, Martínez y Chávez, 2009). 31

2.2.9 Métodos de conservación y germinación de las semillas in vitro

2.2.9.1. Conservación de semillas

En la conservación de semillas se puede realizar para mantener meses y años de acuerdo al método de conservación, para realizar óptimas conservaciones se suele controlar la temperatura, oxígeno y humedad, sobre todo el estado de las semillas que puedan tener la capacidad y viabilidad de sobrevivencia, se conservan en tubos de ensayo al vacío, plásticos o en fundas ziploc, es necesario en pruebas de conservación anteriores se afirmó, que la silica gel daña la viabilidad de conservación de semillas (Magrini, De vitis, Torelli, santi y Zucconi, 2018).

2.2.9.2. Germinación natural

Las orquídeas solamente pueden germinar de manera natural, cuando están colonizadas por un hongo simbionte llamado micorrizas este hongo se encuentran las raíces de las orquídeas y se alimenta, obteniendo azucares y aminoácidos tanto las orquídeas terrestres como epifitas pueden ser micorrizadas, entre los hongos más importantes están los del género Rhizoctonia (Sardi y Guzmán, 2007, p.9).

2.2.9.3. Germinación In vitro

Las semillas de orquídeas pueden germinar in vitro cuando son colocadas, en un medio de cultivo aséptico, en mezclas especiales, que contienen: Leche de coco o agua de coco, azúcar y otros micro y macro elementos como los utilizados en los medios Murashige Skoog y fitohormonas (Sardi y Guzmán, 2007 p.10).

En la germinación in vitro, el embrión absorbe los nutrientes por medio de la cubierta seminal por parte del embrión y en la testa, que forma parte del epispermo.

Luego se inicia la división celular habiendo un rompimiento del embrión en su cubierta seminal y continuación se forma, un tipo de protocormo. Puede demorar varios meses para que llegue a esta fase (Pita y Pérez, 1998). 32

2.2.10. Medio Murashige & Skoog

Según Productos y Equipos Biotecnológicos (Probiotek,2017) “indica qué”.Murashige & Skoog, se basa en la formulación de macronutrientes (N, P, K,

S. Ca y Mg) y micronutriente (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co), (Vitaminas x 100). Es rico en carbono (sacarosa) y nitrógeno esencialmente la sacarosa que ayuda grandemente en los medios in vitro en orquídeas se ha convertido en el medio más popular y usado en el cultivo in vitro de tejidos vegetales.

2.2.11 Giberelinas (GA3)

Las giberelinas ayudan a la germinación a través de la formación de hidrolasas que provocan la ruptura de la testa, crecimiento y expansión foliar tanto in vitro como ex situ estas influyen positivamente al desarrollo de plantas completas para después una aclimatación. Todas las giberelinas se derivan del esqueleto ent- giberelano, son acidas tienen 20 átomos de carbono, y agrupados en cuatro o máximo cinco anillos. Producen el desarrollo muy temprano de los embriones, así como las expansiones de sus hojas (Cardoso, Ono, y Rodriguéz, 2012).

2.2.12 Citocininas (BAP)

Según George y colaboradores, citado por Aucapiña y López (2016), la cinetina fue una de las primeras citocininas (bencilaminopurina), en descubrirse, aislada en el laboratorio por el científico Skoog en 1976. Esta hormona ayuda a regular diversas respuestas en semillas, da la iniciación y crecimiento de yemas, el desarrollo de brotes de la dominancia apical, ampliación de hojas y cotiledones y también en su desarrollo reproductivo, fotosíntesis y la senescencia.

2.2.13 Agua de coco (AC)

Es un medio muy completo para medios de cultivos básicos in vitro. Contiene una amplia gama de componentes orgánicos e Inorgánicos. Sus componentes 33 orgánicos son los aminoácidos, compuestos nitrogenados, ácidos orgánicos y azúcares que brindan la alimentación necesaria para que las semillas germinen.

Los componentes inorgánicos son sus sales (Krikorian, 1991).

2.2.14 Carbón activado (CA)

El carbón activado es un compuesto antioxidante ya que contribuye a absorber esos compuestos fenólicos cuando están presentes. Se utiliza a razón de 0,2 - 3% peso/ volumen (Fernández, 2011).

2.3 Marco legal

Constitución política de la república del ecuador Disposiciones generales Cultivo in vitro. - Cultivo de órganos de la planta o plantas enteras utilizando un medio artificial de nutrientes almacenados en recipientes de vidrio o de plásticos. El cultivo in vitro de propagación vegetativa incluye varias opciones, como la micropropagación, eliminación de virus mediante el cultivo de meristemas y el almacenamiento de crecimiento lento. El cultivo in vitro se utiliza también como fase preparatoria para la criopreservación (Asamblea Nacional, 2017, p.15).

Constitución política de la República del Ecuador Código Orgánico del Ambiente Capítulo I: De la conservación ex situ Artículo 65. Especies objeto de conservación ex situ Entre las especies de vida silvestre susceptibles de una conservación ex situ se incluyen: 1. Las que se encuentren reducidas en su tamaño poblacional o de distribución restringida, las amenazadas de extinción, las amenazadas por erosión del patrimonio genético nacional o por cualquier otra causa, y las que no puedan ser conservadas in situ. 2. Las que posean particular importancia científica, económica, alimentaria o medicinal, actual o potencial. 3. Las que sean aptas para la crianza, cultivo o mejoramiento genético de sus parientes. 4. Las que hayan sido objeto de mejoramiento, selección, cultivo y domesticación o que se encuentren en colecciones y bancos de germoplasma. 5. Las que cumplan una función clave en las cadenas tróficas. 6. Las que no pueden ser reintroducidas a su medio natural de conformidad con criterios técnicos. 7. Las que sean de utilidad para el control biológico. 8. Las demás que determine la Autoridad Ambiental Nacional (Codigo Organico del Ambiente, 2018, p. 28;29).

34

Ley orgánica de Agrobiodiversidad, semillas y fomento de la agricultura sustentable, en la cual se expresa lo siguiente: Art 7.- De los beneficios e incentivos. A fin de estimular la conservación y uso de la agrobiodiversidad, la semilla nativa y tradicional, así como la producción de semilla certificada de forma sostenible, orientada a garantizar la soberanía alimentaria, el Estado en sus diferentes niveles de gobierno, realizará las siguientes acciones:  Establecer programas de transferencia e innovación tecnológica participativa para la conservación de las zonas de alta de agrobiodiversidad, Fitomejoramiento de semilla, producción y se comercialización con énfasis en el desarrollo de proyectos para los pequeños y medianos productores de semillas; b) Promover la generación de productos financieros, líneas de crédito y tasas de interés preferencial, para estimular la producción y comercialización de semilla.

 Impulsar la formación de organizaciones de productores de semillas y de empresas semilleristas públicas, privadas y comunitarias; generar programas de provisión de capital de riesgo, servicios financieros de apoyo, infraestructura, equipamiento, tecnificación, seguro agrícola y garantía crediticia (Asamblea, 2017,p.4).

Art 22.-De la investigación e innovación de los recursos fitogenéticos. La Autoridad Agraria Nacional en coordinación con la institución rectora de la educación superior, ciencia, tecnología e innovación, centros de educación superior y entidades privadas establecerá planes, programas y proyectos para fomentar la investigación, el desarrollo y la innovación tecnológica en materia de los recursos fitogenéticos y semillas. Además, fortalecerá y se promoverá la generación de capacidades del talento humano. (Asamblea, 2017,p.8) Art 28.- Semilla nativa. Para efectos de esta ley, la semilla nativa es todo material reproductivo sexual y asexual vegetal que mantiene su capacidad de reproducción, originario o autóctono, que ha sido domesticado, conservado, criado, cuidado, utilizado e intercambiado por productores, comunas, comunidades, pueblos y nacionalidades de acuerdo a sus diversos saberes y culturas, cuyo uso, conservación, calificación, intercambio, promoción y protección corresponde a las personas, y colectividades con el apoyo del Estado. La semilla nativa patrimonio de pueblos y nacionalidades, es parte de los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura, cuyo competente genético no es susceptible apropiación (Asamblea, 2017,p.9). La Agencia Nacional de Investigación sobre la Biodiversidad del Instituto Nacional de Biodiversidad (NABIO). Objetivo 1.4: Crear y administrar el Banco Nacional de Recursos Genéticos. • Creación y gestión de la Red Nacional de Bancos de Germoplasma bajo un modelo de gestión que consolide la administración del Estado sobre el patrimonio genético. • Establecimiento de protocolos para la transferencia, manipulación, movilización y utilización de organismos conservados para unificar y almacenar la colección de tejido de todos los grupos taxonómicos en un repositorio de material genético (banco de genes), germoplasma y material vivo (microrganismos, algas). 35

• Creación de una base de datos que albergue los organismos que se encuentren en el Banco Nacional de Recursos Genéticos, convirtiéndose en el principal referente de datos sobre la biodiversidad del Ecuador. • Custodio del Banco Nacional de Recursos Genéticos para la conservación, manipulación y utilización sostenible de la diversidad biológica almacenada. • Evaluación del potencial biotecnológico de los organismos y del material genético del Banco Nacional de Recursos Genéticos, a través de la investigación con las diversas instituciones públicas y privadas del país (NABIO, 2007, p.7)

36

3. Materiales y métodos

3.1 Enfoque de la investigación

La evaluación del proyecto en estudio se efectuó conservaciones de las semillas de la especie epifita E. nocturnum, durante 5 meses, para analizar su viabilidad mediante la germinación se analizó si los factores de conservación como la temperatura y medios de cultivo donde estimulan el proceso de germinación, además este estudio es una investigación de tipo experimental.

3.1.1 Tipo de investigación

Este trabajo investigativo fue de carácter inductivo con características aplicadas y las variables a experimentar, implementando los métodos como: Experimental, descriptivo, narrativo, cualitativo y cuantitativo.

3.1.2 Diseño de investigación

Investigación experimental: Permitió manipular las variables y medir su efecto y comparación sobre las variedades.

Investigación descriptiva: Reconoció recolectar los datos sobre la base de la hipótesis, exponiendo y resumiendo la información para analizar minuciosamente los resultados a fin de extraer generalizaciones, significativas que contribuyen en la relación que existen entre dos o más variables.

Investigación explicativa: Accedió explicar y construir la discusión con las perspectivas de la investigación, el porqué de un cierto fenómeno o hecho determinado.

3.2 Metodología

El fin de la investigación presentada fue evaluar la conservación y germinación in vitro de las semillas E. nocturnum, mediante las 2 temperaturas (4°C) y (25°C), para su germinación se seleccionó, 3 medios de cultivo artificiales: en base en la 37 formulación Murashige Skoog: 1) MS+BAP (1,5 mg L–1) +CA Murashige

Skoog+Citocinina + Carbón Activado; 2) MS+AC (20 % L–1) +CA Murashige

Skoog+Agua de coco + Carbón Activado; 3) MS+GA3 L–1) +CA Murashige

Skoog+Giberelina + Carbón Activado.

3.2.1 Variables

3.2.1.1. Variables independientes

Los tratamientos que se realizaron con el objetivo de logra la conservación y germinación, con los respectivos medios de cultivos y temperaturas utilizados.

3.2.1.2. Variables dependientes

 Determinar el porcentaje de germinación de las semillas de orquídea.

 Porcentaje de germinación a los 15 días, primera siembra (%)

Una vez efectuada la primera siembra de Epidendrum nocturnum, se tomó datos después de 15 días, utilizando la fórmula de porcentaje de germinación.

n. de semillas emergidas en el ultimo conteo % 푔푒푟푚푖푛푎푐푖ó푛 = × 100  Porcentaje de germinaciónn total. de semillasa los 20 sembradas días, segunda en cada siem cajabra petri (%)

Una vez efectuada la segunda siembra de Epidendrum nocturnum, se revisaron medios de cultivo a los 20 días.

 Establecer la mejor temperatura para la conservación de semillas en

base al porcentaje de germinación.

 Conservación de las semillas según tasa de germinación

Una vez efectuado el análisis de los resultados para el porcentaje de germinación de las semillas de Epidendrum nocturnum, se estableció la mejor temperatura de conservación según los promedios obtenidos. 38

 Analizar el porcentaje de contaminación presente en los tratamientos en

estudio.

 Porcentaje de contaminación a los 15 días, primera siembra (%)

Una vez efectuada la primera siembra de Epidendrum nocturnum, se tomó datos después de 15 días, de las cajas Petri que presentaban contaminación, y se utilizó la siguiente fórmula:

n. de cajas contaminados % 푐표푛푡푎푚푖푛푎푐푖ó푛 = × 100  Porcentaje de contaminación a losn. de 20 cajas días, totales segunda siembra (%)

Una vez efectuada la segunda siembra de Epidendrum nocturnum, se tomó datos después de 20 días, de las cajas Petri que presentaban contaminación.

n. de cajas contaminados % 푐표푛푡푎푚푖푛푎푐푖ó푛 = × 100 3.2.2 Tratamientos n. de cajas totales

Se efectuaron los seis tratamientos como se describe en la tabla 1. Tomando en cuenta los medios MS y suplementados con carbón activado el 0,5%, cada medio diferenciado por BAP (1,5mg L–1), (citocinina), Giberelina GA3 (3 mg L–1) y un suplemento rico en nutrientes como es agua de coco AC (20% L–1).

39

Tabla 1. Descripción de los tratamientos

No. Tratamiento Temperaturas Dosis y Descripción

T1 T25 C°Temperatura Ambiente MS+BAP (1,5 mg L-1)+CA Murashige Skoog+Citocinina+Carbón Activado

T2 T25 C°Temperatura Ambiente MS+AC (20%L -1) +CA Murashige Skoog+Agua de coco +Carbón Activado

T3 T25 C° Temperatura Ambiente MS+GA3 (3mg L-1) +CA Murashige Skoog+Giberelina Carbón Activado

T4 T 4 C° Temperatura Bajo MS+BAP (1,5 mg L-1) +CA Refrigeración Murashige Skoog+Citocinina+Carbón Activado

T5 T 4 C° Temperatura Bajo MS+AC (20%L -1) +CA Refrigeración Murashige Skoog+Agua de coco +Carbón Activado

T6 T 4 C° Temperatura Bajo MS+GA3 (3mg L-1) +CA Refrigeración Murashige Skoog+Giberelina Carbón Activado.

Apolo, 2021

 Manejo del ensayo

Se preparó los medios de cultivos de murashige y skoog para un volumen de

500 ml en las siguientes dosis:

 De la solución madre de macronutrientes se tomó 100 ml con a una probeta,

en la cual se la coloco en un vaso de precipitación.

 De la solución madre de micronutrientes se tomó 100 ml en un vaso de

precipitación.

 Se adhirió agar 7,00 g esta cantidad es ideal para la preparación de medios

de cultivos.

 Se tomó ,1 ml de solución de hierro y se agregó en la solución. 40

 1ml de Cloruro de calcio.

 Se preparó vitamina (MS Vitamina 1000x) pesando 10.4 g en la balanza

analítica, se colocó en un vaso de precipitación en la cual, se vertió el polvo y

se puso 100 ml de agua destilada y se colocó en una botella de vidrio,

guardándose al refrigerador, para dosis de preparación del medio de 500 ml

se tomó con una micropipeta 1ml.

 Para cada medio suplementado de carbón activado se adiciono 2,5 g.

 Se adiciono sacarosa 15 mg para cada medio de cultivo.

 Se agregó dosis 0,75ml en volumen de 500 ml, para preparación del medio

de cultivo (BAP) citocinina.

 Para el tratamiento que contiene agua de coco se adiciono los (AC) 100 ml,

para el volumen de 500 ml.

 Se adicionó giberelina (GA3) como fitorregulador de crecimientos agrego los

1,5 ml para una cantidad de volumen de 500 ml.

 En los medios de cultivo se ajustó el pH entre 5.77 con KOH y NaOH 0.1 N,

antes de poner el carbón activado.

 Se enrasó con agua destilada en un vaso de precipitación, toda la mezcla

hasta llegar a 500 ml y se lo lleva a al calentador magnético a 175 °C durante

35 Minutos.

 Posteriormente una vez listo se puso en un vaso de precipitación y se cubrió

con papel aluminio y se los ingreso a la autoclave, junto con los demás

utensilios se esterilizaron en 121°C de temperatura y 15 libras/pulgadas de

presión, durante 30 min y una semana después procedió a la siembra in vitro.

 Las muestras fueron llevadas al laboratorio se hizo la respectiva asepsia de

la plántula y capsula de orquídeas de la especie E.nocturnum, el proceso de 41

siembra se llevó a cabo en la cámara de flujo laminar, previamente se

desinfecto durante 30 minutos, es recomendable usarla y esperar un tiempo

para que se libere cualquier espora de hongo.

 Protocolo de desinfección semillas primera siembra

Para ello se implementó el siguiente procedimiento: se efectuó la desinfección sobres de papel filtro 2x2 cm, y en cada sobre puso aproximadamente 0.0283 g.

E. nocturnum asegurando los sobres, fueron almacenados dentro de una funda

Ziploc , las semillas se desinfectaron en los sobres con una solución de etanol al

70% durante 1 minuto, después se transfirió a una solución de hipoclorito de sodio al 0,5 % durante 7 minutos y por último se enjuagaron, con agua destilada estéril haciendo 4 pases de enjuagado por 5 minutos.

 Protocolo de desinfección cápsulas cerrada segunda siembra

Para la desinfección de capsula de orquídeas de E. nocturnum se utilizó un fungicida: CAPTAN 80 WG de acción de contacto, con buena fitocompatibilidad y es utilizado para desinfección y eliminación de hongos en cultivos in vitro, se pesó

0,10 g de Captan y se lo diluyó en 100 ml de agua destilada, en la misma mezcla se adhirió 0.100 g de tetraciclina y se agregó 1000 ml de agua destilada a la misma mezcla.

 Protocolo de desinfección semillas segunda siembra

Para ello se implementó el siguiente procedimiento: se efectuó la desinfección sobres de papel filtro de café 2x2 cm, y en cada sobre puso aproximadamente

0.0283 g. E. nocturnum asegurando los sobres, fueron almacenados dentro de una funda ziploc las semillas se desinfectaron en sobres, con una solución de etanol al

70% durante 1 minuto, después se transfirió a una solución de hipoclorito de sodio 42 al 1 % durante 10 minutos, por último se enjuagaron con agua destilada estéril, haciendo 4 pases de enjuagado por 5 minutos.

3.2.3 Diseño experimental

3.2.3.1. Esquema del análisis de varianza

Tabla 2. Esquema del análisis factorial

Factor A Factor B

A1: Temperatura 25 °C B1: Medio de cultivo + Citoquinina

A2: Temperatura 4 °C B2: Medio de cultivo + Giberelina

B3: Medio de cultivo + Agua de coco Fuente de Variación Fórmula Desarrollo GL

Factor A (Temperaturas) A -1 2 -1 1

Factor B (Medios de cultivo) B -1 3 -1 2

Interacción (A -1) (B -1) (2 -1) (3 -1) 2

Error (N -1)- (A -1)- (B -1)- (30 -1)- (2 -1)- (3 -1)- 24

((A -1)(B -1)) -(r - 1) (2 -1)(3 -1)-(5 - 1)

Total N -1 30 -1 29

Apolo, 2021

43

3.2.3.2. Delimitación experimental

Tabla 3. Diseño experimental Variable Descripción

Tipo de siembra In vitro

Números de tratamientos 6

Número de repeticiones 5

Número de unidades experimentales 30

Apolo, 2021

3.2.4 Recolección de datos

3.2.4.1. Recursos

Materiales y herramientas: Libreta de apuntes, agua, cinta, papel aluminio, insumos, cámara, fotográfica, microscopio y esferos.

Material experimental: Murashige & skoog, reguladores de crecimiento, vidriería y materiales de laboratorio. Semillas de orquídeas de Epidendrum nocturnum, obtenidas de la empresa Ecuadorquideas ubicado, en la provincia de

El Oro del cantón Santa Rosa, parroquia Torata.

Recursos humanos: Tesista, tutor.

Recursos bibliográficos: Los recursos que se utilizaron de consulta son: Tesis de grados de varias universidades, biblioteca de la Universidad Agraria del

Ecuador, revistas agrícolas, informe técnico, boletines de instituciones de investigación, artículos científicos.

Recursos económicos: El presente trabajo de investigación fue financiado en su totalidad por recursos propios del tesista. Los recursos económicos que se requirieron para el desarrollo del estudio son los siguientes:

44

Tabla 4. Recursos económicos

Gastos Detalle Cantidad Valor / Valor total unidad ($) ($) Cajas Petri plástica 60 1,00 60,00 Transporte 33 3.50 115,50 MS 1 30,00 30,00 GA3(Giberelina Fitorregulador) 1 80,00 80,00 BAP (Citocina Fitorregulador) 1 50,00 50,00 Agua de coco 3 1.50 4,50 Papel aluminio 5 2,50 12.50 Hipoclorito de sodio 500 ml 7,00 7,00 Etanol 50 ml 0,50 0,50 Agua Destilada 1 4,00 4,00 Funda Ziploc 3 2,50 7,50 Marcadores permanentes 2 2.00 4,00 Alcohol al 97% 1 galón 15,00 15,00 Carbón activado 1 40,00 40,00 Materiales varios 10 40,00 30,00 Total $ 470,50 Apolo, 2021

3.2.4.2. Métodos y técnicas

Método inductivo: Este método permite observar los resultados obtenidos de la investigación con la finalidad de cumplir los objetivos e hipótesis que están planteadas.

Método deductivo: Permite observar casos particulares de la investigación a través de principios, teorías y leyes.

Método sintético: Permite establecer y relacionar los resultados para construir la discusión, conclusiones relacionadas bajo la perspectiva de totalidad de la investigación. 45

3.2.5 Análisis estadístico

3.2.5.1. Análisis funcional

El diseño que se utilizó fue (DCA) diseño completamente al azar con arreglo factorial, compuesto de 6 tratamientos y 5 repeticiones, como factor A: las temperaturas; como factor B: los medios de cultivo. Se analizó mediante la prueba de Tukey al 5% de error.

3.2.5.2. Hipótesis estadística

3.2.5.2.1. Hipótesis estadística para el factor A

Ha: Al menos una de las dos temperaturas tendrá respuestas en obtención de propágulos en la conservación y germinación de semillas en orquídea E. nocturnum.

Ho: Ninguna temperatura tendrá respuestas en obtención de propágulos conservación y germinación de semillas en orquídea E. nocturnum.

3.2.5.2.2. Hipótesis estadística para el factor B

Ha: Al menos uno de los medios de cultivos propuestos como tratamiento tendrá respuestas en obtención de propágulos en base la conservación y germinación de las semillas en orquídea E. nocturnum.

Ho: Ningún de los medios de cultivos propuestos como tratamiento tendrá respuestas en obtención de propágulos en base la conservación y germinación de las semillas en orquídea E. nocturnum.

3.2.5.2.3. Hipótesis estadística para la combinación AxB

Ha: Existe combinaciones entre los factores.

Ho: No existe ninguna combinación entre los factores.

46

4. Resultados

4.1 Determinación del porcentaje de germinación para semillas de orquídea.

4.1.1 Porcentaje de germinación a los 15 días, primera siembra (%)

En la tabla 5 se indican todos los promedios obtenidos, al evaluar el porcentaje de germinación a los 15 días en la primera siembra dando como resultado; un coeficiente de variación de 17,79%. De acuerdo con el análisis de varianza se originó significancia estadística en el (factor A) temperatura, con un p-valor

0,0247<0,05 y en el (factor B) medios de cultivos con un p-valor 0,0010<0,05, demostrando que estos valores son significativos por ser menores a 0,05 por lo cual esto, conllevo al rechazo de la hipótesis nula formulada para cada factor, determinando que ambos factores intervinieron en el proceso germinativo.

Las semillas de orquídea E. nocturnum; consiguieron un resultado destacado para el estímulo morfogenético por parte del tratamiento 2 (medio de cultivo agua de coco), indicando a su vez que la conservación fue favorable en temperatura ambiente (25°C), para la obtención de propágulos con el 2,64%, durante el conteo se pudo observar con el microscopio óptico una expansión de embriones con coloraciones verdes, seguido del tratamiento 5 (medio de cultivo agua de coco), en conservaciones bajo refrigeración (4°C), ocasionó la obtención de propágulos del

1,97%. El tratamiento 1 (medio de cultivo con citocinina), con temperatura de conservación en (25°C), contribuyo a la germinación con 1,88%. Se observó germinación del 1,71% en el tratamiento 4 (medio de cultivo citocinina) en conservación de semillas en temperatura en (4°C).

En el tratamiento 3 (medio de cultivo giberelina) con conservaciones en temperatura (25°C), tuvo un porcentaje de 1,71% en germinación siendo igual al tratamiento 4. Finalmente, el porcentaje con menos desarrollo de propágulos fue el 47 tratamiento 6 (medio de cultivo giberelina) en conservación para semillas en temperatura (4°C) con 1,65% de germinación.

Tabla 5. Porcentaje de germinación a los 15 días (%)

N° Tratamiento Temperatura Germinación Factor B Factor A % T2 Agua de coco 25°C 2,64 A T5 Agua de coco 4°C 1,97 A B T1 Citocinina 25°C 1,88 B T4 Citocinina 4°C 1,71 B T3 Giberelina 25°C 1,71 B T6 Giberelina 4°C 1,65 B CV: 17,79% Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05). Apolo,2021

4.1.2 Porcentaje de germinación a los 20 días, segunda siembra (%)

Se realizó revisiones en 20 días posteriores a la segunda siembra mediante el microscopio, en las que no se observó germinación en los medios de cultivo. Debido a esto no se describen resultados de porcentajes germinativos. Se afirma que al momento del corte de la semilla se produjó una exudación, entre la plántula y la cápsula esto conllevo a una coloración más oscura a causa del corte y ocasiono que desarrollen compuestos fenólicos, provocando la oxidación esto sucede cuando la cápsula no ha madurado por completo. (ver figura 11 en anexos).

4.1.3 Conservación de las semillas según tasa de germinación

Los resultados obtenidos en el análisis de varianza (factor A) temperatura, del porcentaje de la variable germinación, determinó que la temperatura ambiente

(25°C), fue idónea durante la conservación de las semillas E. nocturnum, siendo contribuyente para la germinación.

48

4.2 Combinaciones entre los medios de cultivos y temperaturas

Las combinaciones o (interacciones) entre temperaturas (factor A) y medios de cultivos (factor B) en la variable germinación a los 15 días, no presentó significancia estadística indicando que p-valor de 0,1278>0,05 fue mayor a 0,05 por lo tanto, se acepta la hipótesis nula, debido que no existió combinación entre los factores en esta variable. Por otra parte, en la variable contaminación a los 15 días se determinó que no existió interacciones significativas (A x B), consiguiendo un p-valor de

0,1462 >0,05 por ello se acepta la hipótesis nula.

No se estableció combinaciones significativas en la variable contaminación a los

20 días resultando con un p-valor de 0,6705 > 0,05; por lo tanto, se acepta la hipótesis nula, es decir, no existió combinaciones entre los factores evaluados.

4.3 Análisis del porcentaje de contaminación presente en los tratamientos en estudio.

4.3.1 Porcentaje de contaminación a los 15 días, primera siembra (%)

En la tabla 6 se indican, todos los porcentajes de contaminación del menor al mayor; dando un coeficiente de variación de 11,98%. De acuerdo con el análisis de varianza resultó que el (factor A) temperaturas produjó un p-valor 0,2103 > 0,05, y en el (factor B) medios de cultivo, conllevo a la obtención de p-valor 0,0196 <0,05 determinado que en los factores no hubo significancia estadística, en la contaminación, por ello se acepta la hipótesis nula.

Se evidencio contaminación a los 15 días en los medios de cultivos, el menor porcentaje fue de contaminación externa por hongos de coloración blanco y negro con el 65,00%, en el tratamiento 2 (medio de cultivo agua de coco), en temperatura ambiente (25°C). Mientras que se presentó un aumentó de 2,60% en el tratamiento

5, (medio de cultivo agua de coco) en temperatura (4°C) bajo refrigeración, 49 obteniendo contaminación interna y externa; proveniente de las semillas en la siembra con un total de 67,60% en hongos con coloración blanca. El tratamiento 4

(medio de cultivo de citocinina), en temperatura (4°C), se observó la aparición de bacterias con coloración amarilla, semitransparente y hongos de color negro correspondiente a una contaminación interna, debido a una inadecuada asepsia en las semillas, a su vez existió contaminación externa en los medios de cultivo dando un 70,80%. Seguido del tratamiento 3 (medio de cultivo giberelina) con temperatura de conservación de (25°C), presentó contaminación externa por hongos con el

71,80%. Se presenció en el tratamiento1 (medio de cultivo giberelina) en conservación de semillas a (25°C), una contaminación interna de hongos (asepsia de semillas) con coloración blanca y externa con hongos de color negro, emergido desde los medios de cultivo con promedio de 73,80%. Finalmente, el tratamiento 6

(medio de cultivo giberelina), en temperatura (4°C), se vio mayormente afectado, por la contaminación interna y externa por hongos de color negros, blancos, verdes oscuros y bacterias amarillas semitransparentes, con un porcentaje promedio de

84,40%.

Tabla 6. Porcentaje de contaminación a los 15 días (%)

N° Tratamiento Temperatura Organismos Contaminación Factor B Factor A Unicelulares ……. % T2 Agua de coco 25°C Hongos 65,00 B T5 Agua de coco 4°C Hongos 67,60 A B T4 Citocinina 4°C Hongos y Bacterias 70,80 A B T3 Giberelina 25°C Hongos 71,80 A B T1 Citocinina 25°C Hongos 73,80 A B T6 Giberelina 4°C Hongos y Bacterias 84,40 A CV: 11,98%. Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05) Apolo, 2021

50

4.3.2 Porcentaje de contaminación a los 20 días, segunda siembra (%)

En la tabla 7 se indican los porcentajes de contaminación del menor al mayor; dando un coeficiente de variación de 21,87%. Acorde con el análisis de varianza, se alcanzó que el (factor A) temperaturas tenga un p-valor 0,8920>0,05 y en el

(factor B) medios de cultivo, conllevo un resultado de p-valor 0,0196<0,05 determinado que en los dos factores no hubo significancia estadística, en el momento de la contaminación, por ello se conllevo a aceptar la hipótesis nula.

A los 20 días se evaluó la contaminación para segunda siembra, produciendo una menor contaminación externa, con presencia de hongos de coloración amarilla y verde oscuro con un 46,00%, en el tratamiento 6 (medio de cultivo giberelina) en temperatura bajo refrigeración (4°C). Seguido del tratamiento 3 (medio de cultivo giberelina), en conservaciones de temperatura ambiente (25°C), con contaminación externa del 47,83% en los medios de cultivos presentó hongos de coloración verde oscuro y negro. El tratamiento 2 (medio de cultivo agua de coco), en temperatura ambiente (25°C), obteniendo contaminación externa con hongos blancos y bacterias semitransparentes con el 52,02%. Se observó que el tratamiento 4 (medio de cultivo citocinina), en temperatura de conservación de (4°C), produjó contaminación externa con bacterias semitransparente del 56,20%. Se tomó datos para el tratamiento 5 (medio de cultivo agua coco) con temperatura de conservación de (4°C), mostró contaminación externa por bacterias de coloración blanca con el

58,00%. Se evidenció en el tratamiento 1 (medio de cultivo citocinina), en conservación de semillas a (25°C), dándose contaminación externa por bacterias blancas y hongos de coloración gris con un 58,60% el tratamiento fue el más afectado en esta segunda siembra, pero se diferenció por obtener menores porcentajes de contaminación en relación a la primera siembra. 51

Tabla 7. Porcentaje de contaminación a los 20 días (%)

N° Tratamiento Temperatura Organismo Contaminación Factor B Factor A Unicelulares ……. % T6 Giberelina 4°C Hongos 46,00 A T3 Giberelina 25°C Hongos 47,83 A T2 Agua de coco 25°C Bacterias y Hongos 52,02 A T4 Citocinina 4°C Bacterias 56,20 A T5 Agua de coco 4°C Bacterias 58,00 A T1 Citocinina 25°C Bacterias y Hongos 58,60 A CV: 21,87% Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05) Apolo, 2021

52

5. Discusión

Tomando en cuenta los resultados, después de haber llevado a cabo la evaluación e interpretación de datos en la conservación y germinación de las semillas de orquídea Epidendrum nocturnum, Se determinó que tratamiento 2

(medio de agua de coco), fue el más adecuado en la germinación in vitro para estas semillas de E. nocturnum, obteniendo una tasa germinativa del 2,64%, este valor contribuyo también en la temperatura de conservación en (25°C), en esta variable.

El resultado originado en germinación se asocia con lo que dice, Salazar y Cancino

(2012) en la germinación in vitro, de las orquídeas nativas de pamplona de cápsulas maduras de orquídeas P. Vespa y S. Klotzscheana, como resultados obtuvo el porcentaje de germinación en formación de propágulos, fue más alto en el medio

MS+AC (agua de coco) en su fase 0 : Semillas con embrión no germinado con el

13,3% , en la fase 1: Expansión del embrión con un 38,7%, en fase 2: Aparición del protocormo y rizoide obtuvo, un 15,3%, en fase 3 : Emergencia y primera hoja 17,3

% en su fase 4: Aparición de hoja y de raíces 15,3% en fase 5 : Dos o más hojas

(plántula totalmente formada) obtuvo 0%, cabe indicar que existieron 2 tratamientos más basados en MS+ JP (jugo de piña), las cuales fueron insignificantes al medio AC. Por lo tanto, tienen en común, lo dicho por Bertolini et al., (2014), la siembra de semillas de orquídeas a los 30 y 60 días, en el medio DR sugerido por (micronutrimentos de Dalla Rosa y Laneri) KO7 (estabilizador de oxígeno), en medio MS adicionando 2,5g l-1 de carbón activado), más agua de coco se produjó mayormente número de protocormos con aparición de rizoides y primordios foliares.

Los resultados obtenidos en la investigación y su respectiva tabulación estadística en lo que concierne a conservación de las semillas, se pudo observar 53 que el promedio más alto en porcentaje de germinación fue la temperatura de

(25°C); datos similares obtuvo Cerna et al., (2014) en su investigación consiguieron un promedio de 85% de viabilidad de las semillas después de ser almacenadas por

3 meses, en tubos de ensayo al vacío (vacutainers) a 18°C, con 6-10 % de humedad relativa (HR) y en condiciones de oscuridad; y acorde con Rodríguez et al., (2015) indica en su estudio que el uso de semilla madura de Brassolaeliocattle, conservada por dos meses con temperatura de 20 °C, tuvo mejores resultados en cuanto aparición de brotes y desarrollo vegetal.

Referente a los resultados de combinaciones (temperaturas) A x B (medios de cultivos), no existió combinaciones entre ambos factores a su vez en las variables germinación a los 15 días y contaminación a los 15 y 20 días. Se verificó las respuestas obtenidas que tampoco se encontró interacciones significativas entre ambos factores de ninguna variable evaluada, no existe autores que corroboren esta información referente a combinaciones de temperatura y medios de cultivo in vitro en orquídea E. nocturnum.

De acuerdo con los porcentajes de la variable contaminación a los 15 días en primera siembra. Se ocasiono menor contaminación externa en el tratamiento 2 en el (medio agua de coco) en conservación de semillas (25 °C), con aparición de hongos con coloraciones blancos y negros del 65,00%, este medio de cultivo tuvo una contaminación menos agresiva, por ello tuvo más germinación.

Se comprobó una gran diferencia numérica entre los porcentajes del tratamiento

6 (medio de cultivo giberelina) en temperatura a (4°C) con una contaminación interna y externa por bacterias amarillas semitransparentes y hongos de coloraciones blancos, negros y verde oscuro tomando el porcentaje más alto, con

84,40% Esto se relaciona con lo que los resultados obtenidos, por Montoya et al., 54

(2014) señala que de acuerdo con la determinación de los métodos para el establecimiento in vitro, de orquídeas en el proceso de germinación por parte de los estudiante del técnico rural de Marinilla, se utilizaron 4 medios de cultivo de los cuales existió en todos contaminación, pero esto no impidió la germinación de las semillas en los medios de cultivos: 1) MS+ agar + sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de plátano se logró, un porcentaje de germinación del 25 % en orquídeas, con una contaminación del 0%, 2) MS + agar+ sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de tomate, tuvo un 0% de germinación con una contaminación del 100% de contaminación la cual inhibió en su totalidad la contaminación, 3) MS+ agar + sacarosa + tiamina + agua destilada + zumo de plátano, zumo tomate + zumo de zanahoria, poseyó una germinación del 25%, hubo un 60 % de contaminación, 4) MS+ agar + sacarosa + tiamina +agua destilada +

V8 (jugo de vegetales), hubo una germinación del 50%, obtuvo un 20% de contaminación.

En la toma de datos de la variable contaminación a los 20 días, en la segunda siembra, no se observó contaminación interna en ningún medio de cultivo , solo externa por hongos de coloraciones amarillas y verde oscuro, por parte del tratamiento 6 (medio de cultivo de giberelina), en conservación bajo refrigeración

(4°C), con el 46%.Como valor más elevado en la evaluación fue el tratamiento 1 en (medio de cultivo de citocinina) con temperatura (25°C),teniendo contaminación externa, de bacterias con coloraciones blancas y hongos de color plomo obteniendo el 58,60%, la reducción de contaminación en segunda siembra fue de manera solamente interna, esto fue atribuido a una mejor asepsia en la preparación en los medios de cultivos y un cambio de protocolo de desinfección de cápsulas y semillas. Esto se enlaza con Soria et al., (2015) la desinfección para las semillas 55 de orquídeas o de cualquier especie debe realizarse correctamente para evitar en lo posible la presencia de hongos o bacterias, donde se debe utilizar dosis de cloro comercial al 0.5% al 0,75% y se adhiere una gota de Tween 20. Se rechazó la hipótesis nula formulada para los factores, debido a que al menos, una de las temperaturas y medios de cultivos favoreció en la conservación y germinación in vitro para las semillas de orquídea E. nocturnum, demostrando una significancia estadística de p-valor menores a 0,05.

56

6. Conclusiones

Finalizando el análisis se concluye según los resultados:

Se puede afirmar que al momento de la evaluación se analizó la viabilidad en las semillas E. nocturnum, mediante la germinación in vitro, tuvo un mejor desempeño del 2.64% en el tratamiento 2, MS enriquecido con agua de coco más carbón activado (MS+CA+AC),induciendo al rompimiento de la testa durante los 15 días, produciendo expansión en los embriones, teniendo en su formación una coloraciòn verde clara.Se logró conservaciones óptimas en temperatura ambiente (25°C), para las semillas E. nocturnum, durante el tiempo de almacenamiento fue exitoso para las semillas de orquídea, cabe indicar que las dos temperaturas propuestas en la investigación, influyeron en el proceso germinativo para la obtención de propágulos.

No se estableció interacciones significativas, para las combinaciones de (factor

A) temperatura y (factor B) medio de cultivo, las cuales no intervinieron significativamente durante el proceso de germinación en primera siembra, de la misma forma no existió interacción en la variable contaminación a los 15 y 20 días, obteniéndose un p-valor mayores a 0,05 como indico el análisis de varianza.

De acuerdo con los porcentajes de contaminación a los 15 días, para primera siembra, se observó que existió menor afectación en contaminación externa por hongos con el 65%, por parte del tratamiento 2 (medio de cultivo agua coco) en conservación (25 °C), concluyendo que produjò menos contaminación, debido a esto se presenció un incremento de germinación en este tratamiento. Para la contaminación los 20 días en segunda siembra, se adquirió una reducción del 46% en el tratamiento 6 (medio de cultivo giberelina), en conservación de semillas de

(4°C), concluyendo que los porcentajes de contaminación externa disminuyeron, 57 debido al cambio de protocolo de desinfección y almacenamiento de medios de cultivos se consiguió resultados menores de 58,00% en los tratamientos evaluados, presentando bacterias y hongos fitopatógenos.

.

58

7. Recomendaciones

Se debe realizar conservaciones en semillas de orquídea para especies, que se encuentren en listado de vulnerabilidad o peligro de extinción. Al momento de la conservación es preferible no adherir silica gel al material genético. Se recomienda hacer pruebas germinativas previas al almacenamiento, es aconsejable hacer conservaciones en rangos de temperatura ambiente, para posteriormente analizar su viabilidad mediante la germinación in vitro.

En el momento de analizar su germinación vitro en las semillas E. nocturnum, es aconsejable utilizar, la preparación en base a la formulación: MS + carbón activado

+ agua de coco, debido que en la primera etapa de germinación necesita alcanzar el rompimiento de la testa y expansión del embrión por ello, el agua de coco le es eficiente, ya que, contiene fuentes naturales de sacarosa, minerales y vitaminas, justificando con la investigación realizada, esto aporta al estímulo morfogenético en las semillas, más la aplicación del carbón activado, el cual es inhibidor y catalizador de toxinas tóxicas que pueden surgir durante el proceso de germinación.

Realizar estudios en conservación para semillas ortodoxas (orquídeas) utilizando diferentes metodologías de almacenamiento, en varias temperaturas para luego preparar un estudio de germinación in vitro, utilizando distintos tratamientos con fitoreguladores que induzcan, al rompimiento de semilla.

Se sugiere tener en cuenta una concentración optima, de hipoclorito de sodio para la desinfección de semillas y el tiempo adecuado de aplicación del mismo, para no repercutir en la parte morfogenética de las semillas, en el momento de la germinación, realizar una adecuada esterilización para la utilización del agua de 59 coco y medios de cultivos, esto podría generar una menor afectación de contaminación al momento de las siembras in vitro.

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69

9. Anexos

Análisis de la varianza

Variable N R² R² Aj CV Germinación % 30 0,55 0,45 17,79

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 3,41 5 0,68 5,80 0,0012 Factor A 0,68 1 0,68 5,74 0,0247 Factor B 2,21 2 1,10 9,39 0,0010 Factor A*Factor B 0,53 2 0,26 2,24 0,1278 Error 2,82 24 0,12 Total 6,23 29

Test: Tukey Alfa=0,05 DMS=0,25834 Error: 0,1175 gl: 24 Factor A Medias n E.E. 25°C 2,08 15 0,09 A 4°C 1,78 15 0,09 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 1. Andeva de la germinación a los 15 días, primera siembra. Apolo, 2021

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=0,38284 Error: 0,1175 gl: 24 Factor B Medias n E.E. Agua de coco 2,31 10 0,11 A Citocinina 1,80 10 0,11 B Giberalina 1,68 10 0,11 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=0,67033 Error: 0,1175 gl: 24 Factor A Factor B Medias n E.E. 25°C Agua de coco 2,64 5 0,15 A 4°C Agua de coco 1,97 5 0,15 A B 25°C Citocinina 1,88 5 0,15 B 4°C Citocinina 1,71 5 0,15 B 25°C Giberalina 1,71 5 0,15 B 4°C Giberalina 1,65 5 0,15 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 2. Medias para los tratamientos en germinación a los 15 días. Apolo, 2021 70

Figura 3. Variable germinación factor A (Temperatura). Apolo, 2021

Figura 4. Variable germinación factor B (Medios de cultivos). Apolo, 2021 71

Figura 5. Interacción AXB en porcentaje de germinación. Apolo, 2021

Análisis de la varianza

Variable N R² R² Aj CV Contaminación 30 0,39 0,26 11,98

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 1132,57 5 226,51 3,03 0,0295 Factor A 124,03 1 124,03 1,66 0,2103 Factor B 696,27 2 348,13 4,65 0,0196 Factor A*Factor B 312,27 2 156,13 2,09 0,1462 Error 1796,80 24 74,87 Total 2929,37 29

Test: Tukey Alfa=0,05 DMS=6,52082 Error: 74,8667 gl: 24 Factor A Medias n E.E. 4°C 74,27 15 2,23 A 25°C 70,20 15 2,23 A Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 6. Andeva de contaminación a los 15 días, primera siembra. Apolo, 2021 72

Test: Tukey Alfa=0,05 DMS=9,66335 Error: 74,8667 gl: 24 Factor B Medias n E.E. Giberalina 78,10 10 2,74 A Citocinina 72,30 10 2,74 A B Agua de coco 66,30 10 2,74 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Test: Tukey Alfa=0,05 DMS=16,92014 Error: 74,8667 gl: 24 Factor A Factor B Medias n E.E. 4°C Giberelina 84,40 5 3,87 A 25°C Citocinina 73,80 5 3,87 A B 25°C Giberelina 71,80 5 3,87 A B 4°C Citocinina 70,80 5 3,87 A B 4°C Agua de coco 67,60 5 3,87 A B 25°C Agua de coco 65,00 5 3,87 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 7. Medias para medios de cultivos en contaminación a los 15 días Apolo, 2021

Figura 8. Variable contaminación factor A (Temperatura). Apolo, 2021 73

Figura 9. Variable contaminación factor B (Medio de cultivo) . Apolo, 2021

Figura 10. Interacción de temperatura por medios de cultivo AxB. Apolo, 2021 74

Análisis de la varianza

Variable N R² R² Aj CV Contaminación 30 0,18 0,01 21,87

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor Modelo 715,88 5 143,18 1,06 0,4059 Factor A Temp. 2,54 1 2,54 0,02 0,8920 Factor B Medios 603,67 2 301,84 2,24 0,1285 Factor A Temp.*Factor B M.. 109,67 2 54,83 0,41 0,6705 Error 3237,68 24 134,90 Total 3953,56 29

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=8,75324 Error: 134,9032 gl: 24 Factor A Temp. Medias n E.E. 4°C 53,40 15 3,00 A 25°C 52,82 15 3,00 A Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 11. Andeva de contaminación a los 20 día, segunda siembra. Apolo, 2021

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=12,97163 Error: 134,9032 gl: 24 Factor B Medios Medias n E.E. Citocinina 57,40 10 3,67 A Agua de coco 55,01 10 3,67 A Giberalina 46,92 10 3,67 A Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=22,71281 Error: 134,9032 gl: 24 Factor A Temp. Factor B Medios Medias n E.E. 25°C Citocinina 58,60 5 5,19 A 4°C Agua de coco 58,00 5 5,19 A 4°C Citocinina 56,20 5 5,19 A 25°C Agua de coco 52,02 5 5,19 A 25°C Giberalina 47,83 5 5,19 A 4°C Giberalina 46,00 5 5,19 A Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Figura 12. Medias estadísticas para variable contaminación a los 20 días. Apolo, 2021 75

Figura 13. Variable contaminación factor A (Temperatura). Apolo, 2021

Figura 14. Variable contaminación Factor B (Medios de cultivo). Apolo, 2021 76

Figura 15. Interacción de contaminación (AxB). Apolo, 2021

Tabla 8. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+AC

Solución (g/LT) MS(mg.ML 500 )

Macronutrientes 100 ml Micronutrientes 100 ml Vitaminas (Ms1000 x) 1ml Cloruro de calcio 1ml Solución de hierro 1ml Na2EDTA (FeSO4, 7H2O ) Agua de Coco 100 ml Sacarosa 15 mg Agar 7,00 g Agua destilada 250 ml Apolo, 2021 77

Tabla 9. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+GA3

Solución (g/LT) MS(mg.ML 500 ) Macronutrientes 100 ml Micronutrientes 100 ml Vitaminas (Ms1000 x) 1ml Cloruro de calcio 1ml Solución de hierro 1ml Na2EDTA (FeSO4, 7H2O )

Carbón Activado 2,5 g GA3 1,5 mg Sacarosa 15 mg Agar 7,00 g Agua destilada para el medio GA3 250 ml Apolo ,2021

Tabla 10. Componentes del medio Murashige y Skoog (MS) +CA+BAP

Solución (g/LT) MS(mg.ML 500 ) Macronutrientes 100 ml Micronutrientes 100 ml Vitaminas (Ms1000 x) 1ml Cloruro de calcio 1ml Solución de hierro 1ml Na2EDTA (FeSO4, 7H2O )

Carbón Activado 2,5 g BAP 0,75 mg Sacarosa 15 mg Agar 7,00 g Agua destilada para el medio BAP 250 ml Apolo ,2021 78

Figura 16. Mapa de ubicación de la investigación. Google mapas, 2021

Figura 17. Diferencia en color de cápsulas de Epidendrum nocturnum. Apolo, 2021 79

Figura 18. Recolección de semillas de Epidendrum nocturnum. Apolo, 2021

Figura 19. Medio de cultivo de giberelinas contaminado. Apolo, 2021 80

Figura 20. Observación de semilla Epidendrum nocturnum germinada. Apolo, 2021

Figura 21. Conteo de semillas antes de la siembra. Apolo, 2021 81

Figura 22. Muestras sin germinar segunda siembra. Apolo, 2021

Figura 23. Medio de cultivo de agua de coco. Apolo, 2021 82

Figura 24. Flor de la Orquídea Epidendrum nocturnum Jacq. Apolo, 2021

Figura 25. Siembra de semillas Epidendrum nocturnum Jacq. Apolo, 2021 83

Figura 26. Medios de cultivos en cajas Petri. Apolo, 2021

Figura 27. Protocolo de desinfección para siembra. Apolo, 2021 84

Figura 28. Germinación en (T2) agua de coco de temperatura ambiente. Apolo, 2021

Figura 29. Observación de semillas germinadas de E.nocturnum. Apolo, 2021 85

Figura 30. Siembra de semillas E. nocturnum. Apolo, 2021

Figura 31. Protocolo de desinfección segunda siembra. Apolo, 2021 86

Figura 32. Cápsula cerrada cortada para conservación segunda siembra. Apolo, 2021

Figura 33. Semillas germinadas en medio AC temperatura 4°C. Apolo, 2021 87

Figura 34. Contaminación en medio de cultivo de BAP. Apolo, 2021

Figura 35. Revisión a los 20 días de semillas sin germinar. Apolo, 2021 88

Figura 36. Contaminación en medio BAP siembra a los 20 días. Apolo, 2021

Figura 37. Contaminación de hongo en BAP en siembra a los 20 días. Apolo, 2021 89

Figura 38. Observación de semillas con el microscopio segunda siembra. Apolo, 2021

Figura 39. Ilustración de E.nocturnum Jacq. Apolo, 2021 90

Figura 40. Utilización de giberelina para preparación en medios de cultivos. Apolo, 2021

Figura 41. Preparación de los medios de cultivo de AC, BAP, GA3. Apolo, 2021 91

Figura 42. Contaminación primera siembra en medio agua de coco. Apolo, 2021