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TESE DE DOUTORADO REGULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DA PAREDE CELULAR DURANTE A FORMAÇÃO DO AERÊNQUIMA EM RAÍZES DE CANA-DE-AÇÚCAR MSc. Eveline Queiroz de Pinho Tavares Orientador: Dr. Marcos S. Buckeridge São Paulo, maio de 2015 TESE DE DOUTORADO REGULAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DA PAREDE CELULAR DURANTE A FORMAÇÃO DO AERÊNQUIMA EM RAÍZES DE CANA-DE-AÇÚCAR Regulation of cell wall degradation during aerenchyma development in roots of sugarcane MSc. Eveline Queiroz de Pinho Tavares Orientador: Dr. Marcos S. Buckeridge Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Biologia de Sistemas São Paulo, maio de 2015 FICHA CATALOGRÁFICA TAVARES, Eveline Queiroz de Pinho Regulação da degradação da parede celular durante a formação do aerênquima em raízes de cana-de-açúcar Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Botânica. 1. Aerênquima 2. Cana-de-açúcar 3. Parede celular 4. Regulação transcricional 5. Etanol 2G. I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Botânica. Maio de 2015. Comissão julgadora: _______________________________ _______________________________ Prof(a) Dr(a): Prof(a) Dr(a): _______________________________ _______________________________ Prof(a) Dr(a): Prof(a) Dr(a): _______________________________ Prof. Dr. Marcos Silveira Buckeridge Orientador É sempre difícil a gente falar das qualidades da gente, mas acho que uma qualidade que a gente deve cultivar, não é que eu a tenha, mas que eu almejo tê-la, é saber-me frágil, saber-me incompleta, saber-me faltosa, dependente desse outro que me sustenta, que me completa, que me acalma e que me inquieta. Marina Silva AGRADECIMENTOS Agradeço ao Prof. Dr. Marcos Buckeridge, orientador desta tese e grande mentor da idéia por trás deste trabalho; Agradeço à FAPESP pela bolsa concedida e aos membros da banca pelo tempo dedicado a leitura desta tese e aprimoramento deste documento; Preciso agradecer também aos inúmeros co-orientadores oficiais ou não, temporários ou não, dos quais precisei ao longo da execução do meu trabalho: Amanda Pereira de Souza, que encontrou tempo em sua rotina corrida e leu todas as linhas que escrevi em todos relatórios, manuscritos, resumos de congresso e também nesta tese – mesmo depois de já ter deixado nosso grupo. Você foi uma grande amiga e inspiração desde que cheguei aqui e te desejo toda sorte nos próximos capítulos da sua vida. Marie-Anne van Sluys, que abriu as portas de seu laboratório e me deu acesso a tudo que eu precisasse como se de seu grupo eu também fosse. Sua equipe é feita de pessoas tão competentes quanto prestativas e simpáticas, e em algum momento do doutorado tive o imenso prazer de poder contar com cada um deles: Jonas, Tati, Paula, Andréia, Érika Jesus, Andrés, Guilherme. Jacqueline Grimma-Pettenati, une personne de routine lourde mais avec l’âme légère. J’espère encore que j’aurai une deuxième fois la chance de travailler dans ton groupe. Isabelle Truchet, la co- superviseur três bordelique sur la paillasse mais qui souriait avec les yeux. Vous deux, il faut que vous sachez que j’ai eu en France des jours magiques, presque insolites. Quand je pense au stage, je me rapelle des matins jaunes à Castanet, en faisant du vélo pour arriver au labo, le vent frais contre le visage.... et bien sur les PCR que ne marchait jamais. Anna, Chien, Marçal, Hong, Nathalie, Fabien, Annabelle, Audrey, Chantal, Christiane, Hua, Bruno, Raphael, gros bisous et un très grand merci! Nathália de Setta e seu eterno sorriso no rosto, que me ajudou muito na reta final, sempre se prontificando a discutir, corrigir e me conduzir nas análises de sequências de uma plantinha tão complicada.... Foi diante dos seus olhos que um TE se inseriu em minha tese. Eduardo Purgatto, uma enciclopédia ambulante de literatura de regulação hormonal. Obrigada por me ceder espaço na sua agenda e em seu laboratório. Sua contribuição e fé no meu trabalho me traz um imenso sentimento de dívida. Que venham publicações em retribuição! Gláucia Mendes Souza, por ceder os iniciadores constitutivos e espaço em seu laboratório. Em especial agradeço à Carolina Lembke pelo microarranjo, parte fundamental desta tese. Aos amigos que conheci no LAFIECO, que atormento diariamente: Eagle, Menina Greuce, Débora, Dri, Amanda Rusiska, Vivi, Vinícius, Luís, Giovanna, Ivan. Com a companhia de vocês era sempre mais fácil ver o lado bom de tudo (até das infindáveis coletas de raiz). Minhas raízes, eu balanço, eu balanço... Por mais importante que seja essa etapa em minha vida acadêmica, agradeço acima de tudo aqueles que me fizeram pensar em outra coisa que não BACs, pectina ou sinalização por etileno. Gente que perto ou longe ajuda a lapidar a pessoa por trás da pesquisadora. Gente que inclusive sequer sabe o que são BACs, pectina ou sinalização por etileno, aliás. Prefiro que minha mãe continue sabendo é que o frango com quiabo que ela faz é minha comida preferida, que meu pai saiba que gostaria de dividir uma cerveja com ele mais vezes e que a Karla saiba que pode fazer mais pulseirinhas para mim que vou usar! Que a Keila saiba que o jeito que a cabeça dela funciona me fascina, então nem faz mal que ela não saiba o que é um fator de transcrição. E à Carla, cujos cafunés nunca são suficientes... te devo mais do que poderia retribuir a alguém, sobretudo pelo suporte emocional, pela torcida e por ainda insistir em valorizar meu trabalho quando eu mesma não o faço. Por fim, agradeço ao Floriano por pular no meu colo e pelo teclado do computador nos momentos em que a inspiração fugia e o cansaço chegava... A essas pessoas (de duas ou quatro patinhas), preciso dizer que é um prazer enorme ser neste momento motivo de orgulho de vocês. ÍNDICE RESUMO 1 ABSTRACT 2 INTRODUÇÃO 3 1. Uso de biomassa vegetal para bioenergia 3 2. Parede celular: composição e degradação endógena 4 3. Aerênquima 5 3.1 Formações induzida e constitutiva 6 3.1.1 Hipóxia 7 3.1.2 Estresse nutricional 9 4. Cascatas de sinalização e fatores de resposta ao etileno 10 4.1 Efeito do etileno na formação do aerênquima 14 5. Morte celular programada 16 6. Degradação da parede celular na formação do aerênquima 17 7. Viabilizando o pré-tratamento biológico em cana-de-açúcar 20 OBJETIVOS GERAL E ESPECÍFICOS 22 DESENHO EXPERIMENTAL 23 METODOLOGIA 24 Cultivo de cana-de-açúcar e coleta de raiz 24 PARTES A & B: Cultivo de cana-de-açúcar em estresse nutricional e na presença de 1-MCP 25 1. Cultivo de cana-de-açúcar irrigada com distintas soluções de nutrientes 25 2. Cultivo de cana-de-açúcar em 1-metilciclopropeno 26 3. Preparação das amostras para microscopia de luz e cálculo da área do aerênquima 27 4. Dosagem de AIA livre 28 5. Dosagem de etileno 28 6. Escolha de sequências-alvo e desenho de oligonucleotídeos específicos 29 7. Extração de RNA de raízes de cana-de-açúcar e síntese de cdna para qPCR e 31 microarranjo 8. Análise dos padrões de expressão gênica por pcr em tempo real 32 9. Hibridização em oligoarray e processamento da imagem 32 PARTE C: Seleção e sequenciamento de genes alvo 33 1. Triagem das sequências alvo na biblioteca de BACs de Saccharum hybrid (SHCRBa) da 33 linhagem R570 2. Extração de DNA plasmidial em média escala 35 3. Preparo da biblioteca, sequenciamento na plataforma 454/Roche e predição de genes 35 4. Avaliação da predição automática e caracterização gênomica das sequências candidatas 35 PARTE D: Análise de sintenia, filogenia e estrutura dos genes alvo sequenciados 36 ÍNDICE 1. Avaliação da colinearidade e sintenia dos BACs de cana-de-açúcar em relação a S. 37 bicolor 2. Análise da estrutura dos genes alvo 37 PARTE E: Seleção da sequência para clonagem e análise in silico dentre as versões do gene 37 alvo 1. Mapeamento dos reads do RNAseq/aerênquima nas sequências codificantes dos genes 37 alvo 2. Análise in silico das proteínas preditas a partir da versão mais expressa dos genes alvo 38 PARTE F: Avaliação da interação dos fatores de transcrição RAV e ERF com os promotores 39 das glicosil hidrolases 1. Identificação in silico de elementos em cis nos promotores de ScEPG1a e ScARA1a 39 2. Método de choque térmico para obtenção de células competentes de Escherichia coli e 39 transformação 3. Agrobacterium tumefaciens eletrocompetentes e transformação 39 4. Síntese de oligonucleotídeos para vetores para transformação de A. tumefaciens 40 5. Amplificação das sequências alvo 40 6. Construção de vetores intermediários e finais 41 7. Sequenciamento 42 8. Infiltração de folhas de Nicotiana benthamiana 42 9. Extração de proteínas de discos foliares de N. benthamiana e ensaio de β-glucuronidase 43 ANÁLISE ESTATÍSTICA 43 RESULTADOS 44 PARTES A & B: Cultivo de cana-de-açúcar em estresse nutricional e na presença de 1-MCP 44 1. Área ocupada pelo aerênquima no córtex da raiz 44 2. Perfil transcricional dirante de distintas disponibilidades de nutrientes 46 3. Formação do aerênquima e dosagem hormonal diante da aplicação de 1-MCP 50 4. Expressão diferencial de genes avaliada por microarranjo após tratamento com 1-MCP 52 5. Validação do microarranjo por qPCR 54 PARTE C: Seleção e sequenciamento de genes alvo 56 1. Características gerais dos BACs sequenciados 56 PARTE D: Análise de sintenia, filogenia e estrutura dos genes alvo sequenciados 36 1. Análises de colinearidade e sintenia dos BACs homeólogos de cana-de-açúcar em 58 relação a S. bicolor 2. Caracterização da estrutura gênica dos genes alvo homeólogos em relação a S. bicolor 69 PARTE E: Seleção da sequência para clonagem e análise in silico dentre as versões do gene 73 alvo ÍNDICE 1.