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REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA MELYSSA LIMA DE MEDEIROS AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE DO ÓLEO DE COPAÍBA VEICULADO EM SISTEMAS SNEDDS E PROCESSOS TERAPÊUTICOS EM MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO DE LESÕES CUTÂNEAS NATAL/RN 2019 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA MELYSSA LIMA DE MEDEIROS AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE DO ÓLEO DE COPAÍBA VEICULADO EM SISTEMAS SNEDDS E PROCESSOS TERAPÊUTICOS EM MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO DE LESÕES CUTÂNEAS Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia, RENORBIO, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Áreas de Concentração: Biotecnologia em Saúde Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Medeiros Maciel NATAL/RN 2019 MELYSSA LIMA DE MEDEIROS AVALIAÇÃO DO EFEITO CICATRIZANTE DO ÓLEO DE COPAÍBA VEICULADO EM SISTEMAS SNEDDS E PROCESSOS TERAPÊUTICOS EM MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO DE LESÕES CUTÂNEAS Tese apresentada ao programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia, RENORBIO, como requisito para obtenção da aprovação do Exame de Qualificação da referida candidata, no Programa de Biotecnologia da Rede Renorbio. Aprovada em 29 de julho de 2019, por: _____________________________________________________ Profa. Dra. Maria Aparecida Medeiros Maciel Examinador Interno e Presidente _____________________________________________________ Prof. Dr. Valdir Florêncio da Veiga Júnior Examinador Externo ____________________________________________________ Prof. Dr. José Heriberto Oliveira do Nascimento Examinador Externo _____________________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Júnior Examinador Interno _____________________________________________________ Prof. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros Examinador Interno DEDICATÓRIA A Deus, pelo dom da vida e bênçãos em minha caminhada. Aos meus pais, Danny Moura e Terezinha Lima, pelo incentivo, confiança e incontestável exemplo de sabedoria. A meu esposo e grande amor, Jung Dantas, por dividir comigo o nosso bem mais precioso, a família. Aos meus filhos, Fabrício, Enzo, Benício e Maria Luiza, a razão para todo esse esforço e minha fonte de inspiração. As minhas irmãs e familiares, o alicerce para concretização desse sonho. AGRADECIMENTOS A Profa. Dra. Maria Aparecida Medeiros Maciel, pela oportunidade de trilhar um caminho em busca de aprimoramento intelectual e também, pela contribuição na concretização deste sonho. Agradeço o incentivo e suporte em todos os momentos que pensei em desistir, ficando ao meu lado e acompanhando cada passo do meu desenvolvimento. Sem dúvida é minha “mãe científica”, que na maioria das vezes acreditou mais em mim do que eu mesma. Uma das pessoas mais incríveis que tenho ao meu lado! Ao Prof. Dr. Irami Araújo Filho, um honrado pesquisador e um “grande ser humano”, comprometido com sua profissão e que vivencia os princípios do método científico de uma forma encantadora. Muito obrigada pela colaboração nos estudos em animais e pelos conhecimentos compartilhados durante as discussões técnico-científicas. À Profa. Dra. Amália Cinthia Meneses do Rêgo, pela parceria, cordialidade e contribuições nos estudos em animais. Agradeço, especialmente, a Profa. Dra. Maria das Dores Melo, por compartilhar comigo parte de seu imenso saber no campo da elaboração dos projetos de uso em animais, e pelo cordial acolhimento, apoio e amizade ao longo do tempo. Ao Prof. Dr. Valdir Florêncio da Veiga Júnior , pela atenção e colaboração na parte das caracterizações químicas da amostra de óleo de copaíba. Ao Prof. Magnaldo Tavares, doutorando do PPGB-Renorbio, pelo apoio, confiança, suporte e troca de conhecimentos, em algumas das disciplinas cursadas na etapa final do meu doutorado, bem como em alguns dos experimentos realizados com animais. À Profa. Dra. Rejane Carvalho e, especialmente, ao Dr. Ciro Soares, pela inestimável colaboração e oportunas contribuições com as análises histopatológicas e estatísticas. Aos parceiros de pesquisa Profa. Dra. Denise Porfirio Emerenciano, bem como ao doutorando da Rede Renorbio, Joherbson Deivid dos Santos Pereira e ao aluno de IC, Bernardo Bruno Dias Baracho pela parceria na pesquisa dos bioformulados, desenvolvidos a base de óleo de copaíba. Aos meus queridos alunos de iniciação científica, Everardo Lucena e Alana Guiotto que são exemplos de dedicação e comprometimento com o desenvolvimento da ciência. Gratidão pelo cuidado e empenho em algumas etapas desta pesquisa. Aos professores do Programa do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Renorbio, pelo comprometimento com a ciência. Deixo meu agradecimento especial às professoras Dra. Lucymara F. Agnez Lima, Dra. Silvia Batistuzzo e Dra. Katia Scortecci, pelo apoio e oportunidades de desenvolvimento. Aos professores Dra. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros, Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha e José Heriberto Oliveira do Nascimento, pela participação no meu Exame de Qualificação desta tese, e contribuições. A Rede RENORBIO, em especial a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, por possibilitarem juntamente com s instituição parceira UnP, a realização do presente estudo. Aos meus colegas de doutorado pelos vários momentos compartilhados, convívio e cumplicidade. Aos meus colegas de trabalho da Rede Laureate e da Universidade Potiguar (UnP), que me apoiaram e contribuíram para a conclusão de mais uma etapa da minha trajetória acadêmica. Especialmente à Profa. Patrícia Klahr pelo apoio, incentivo e parceria, que foram indispensáveis para o fechamento desta etapa profissional que parecia uma missão impossível. Conciliar o meu trabalho na Rede Laureate e na UnP, e ainda me dedicar ao doutorado, foram, de fato, experiências fantásticas que exigem comprometimento e dedicação exaustivos. Portanto, sem o seu apoio eu não teria conseguido gerenciar a questão tempo. Muito obrigada! Finalmente, aos meus pais e minha família pelo companheirismo e compreensão nas minhas ausências em várias ocasiões. “Ninguém vence sozinho, Nem no campo, Nem na vida”. Papa Francisco RESUMO O manejo da ferida crônica compreende um importante aspecto da prática médica e requer tratamento específico para que o tratamento terapêutico seja eficaz. Registros históricos mostram que o óleo de copaíba é utilizado preferencialmente para promover a cicatrização de feridas e tratar doenças inflamatórias e infecciosas. No entanto, sua baixa solubilidade em água limita seu uso farmacológico. Neste sentido, na presente pesquisa, sistemas nanoemulsionados do tipo SNEDDS desenvolvidos à base de óleo de copaíba (OC) em baixa concentração (0,5%), foram preparados na presença de Tween® 80 e meio aquoso (neutro ou salino). O encapsulamento deste óleo bioativo em sistema de liberação de fármacos SNEDDS (self-nanoemulsion drug delivery system) possibilita sua liberação lenta e prolongada com aplicação tópica em procedimento experimental de cicatrização de feridas diabéticas e não diabéticas. Análises físico-químicas foram realizadas para caracterizar o OC nas formas in natura e encapsulado em sistemas SNEDDS. As bionanoformulações de OC foram preparadas sem o uso de co-surfactante o que justifica sua maior importância nas aplicações farmacológicas, em função da redução de ingredientes carreadores que possam causar reações adversas. Especificamente, os sistemas SNEDDS possuem OC e óleo de girassol em mistura (1:1), percentuais variáveis de surfactante (da classe dos Tweens) e água (pH neutro ou salino). Os sistemas SNEDDS-OC foram avaliados em procedimentos terapêuticos de cicatrização. Os ensaios in vivo para cicatrização de feridas (não infectada e infectada) foram realizados com ratos Wistar ( Rattus novergicus albinus ). Os animais foram divididos em grupos de 5 animais (n = 5), submetidos a cirurgia para retirada de retalho cutâneo na região dorsal e receberam tratamento tópico diário, com os sistemas SNEDDS-OC, durante o período pós-operatório. Análises histopatológicas e imunohistoquímicas foram realizadas após 7 e 14 dias de tratamento para ambos os grupos. Análises histomorfométricas revelaram um menor número de neutrófilos e linfócitos nos grupos tratados (7 dias), bem como aumento da colagênese, proliferação de fibroblastos e maior espessamento epitelial, que por comparação, foram mais evidentes nos grupos tratados (14 dias). Nos grupos controle, o atraso no reparo tecidual foi relacionado à presença de queratinócitos em função do aumento da imunorreatividade para IL-1β. O maior número de células imunocoradas com FGF-2 foi associado à melhora da colagênese e do processo de reparo tecidual cutâneo. Além disso, foi realizada uma abordagem comparativa in vivo dos processos terapêuticos, em modelo experimental de lesões cutâneas, na qual foi avaliado o efeito da terapia com laser de baixa intensidade (LLLT) na angiogênese e imunoexpressão da metaloproteinase-2 de matriz, na ausência e/ou presença dos sistemas SNEDDS-OC. Palavras-Chave: Óleo de copaíba; Sistemas carreadores SNEDDS; Lesões cutâneas; Processos terapêuticos de cicatrização; Análises histológicas. ABSTRACT Chronic wound management comprises an important aspect of medical practice and requires specific treatment for effective therapeutic treatment. Historical records show that copaiba oil is used preferentially to promote wound healing and treat inflammatory and infectious diseases. However, its low solubility in water limits its pharmacological use.