Tesis Maestríax

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA DE POST-GRADO

“Susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencialPOSGRADO de Copaifera officinalis (copaiba) en comparación con hipoclorito de sodio al 2.5%” DE

TESIS

PARA OPTAR EL GRADO DE: MAESTRIADIGITAL EN ESTOMATOLOGÍA

AUTOR

Br. ROCÍO DEL PILAR BOCANEGRA ARISTA

ASESOR

BIBLIOTECA Dr. MARCO ANTONIO REÁTEGUI NAVARRO

TRUJILLO 2009

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

A nuestro Padre Celestial que

siempre está conmigo

iluminándome y guiándome

por el sendero del bien.

A mis dos amores, mis padres

Santiago y Marisa, por su

apoyo incondicional y consejos POSGRADO que me guían hacia el camino DEdel éxito y superación.

DIGITAL

A mi hermana Carol, por

brindarme su inmenso amor y

paciencia; y

BIBLIOTECAA mi hermanito Néstor, que

desde el cielo me protege y

bendice.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Marco Antonio Reátegui Navarro, por su asesoramiento y grandes aportes en el

desarrollo de esta investigación.

A la Dra. Elva Mejía Delgado por su importante aporte en la ejecución de este trabajo.

Al Dr. Jorge Neciosup Obando por su valiosa colaboración en la elaboración de este

trabajo.

POSGRADO A todas las personas que me acompañaron en esta importante etapa de mi vida brindándome su generosa amistad y apoyo. DE

DIGITAL

BIBLIOTECA

RESUMEN

El presente estudio de investigación de tipo experimental comparativo tuvo como

objetivo conocer la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente a

diferentes concentraciones de aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) en

comparación con hipoclorito de sodio al 2.5%.

La muestra estuvo constituida por 90 repeticiones realizadas (con aceite esencial de

copaiba a diferentes concentraciones o con hipoclorito de sodio al 2.5%) en cada placa

petri con la cepa de Enterococcus faecalis. Se encontró que la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente al aceitePOSGRADO esencial de Copaifera officinalis (copaiba) al 100%, 75% y 50% fue mayor en comparación con hipoclorito

de sodio al 2.5%. DE

Palabras claves: Susceptibilidad bacteriana, Enterococcus faecalis, Aceite de Copaifera

officinalis (copaiba). DIGITAL

BIBLIOTECA

ABSTRACT

The present study of experimental type had as objective to know the bacterial

susceptibility in vitro of Enterococcus faecalis to the Copaifera officinalis (copaiba)

essential oil at different concentrations in comparison with the sodium hypochlorite to

2.5%.

The sample was made up of 90 repetitions performed (with Copaiba essential oil at

different concentrations or with sodium hypochlorite to 2.5%) in each petri plates of

strains of Enterococcus faecalis. We found the bacterial susceptibility in vitro of Enterococcus faecalis to the Copaifera officinalis (copaiba)POSGRADO essential oil to 100%, 75% and 50% was higher than the sodium hypochlorite to 2.5%.

Key words: Bacterial susceptibility, Enterococcus faecalis, Copaifera officinalis

(copaiba) oil.

DIGITAL

BIBLIOTECA

ÍNDICE

DEDICATORIA

AGRADECIMIENTOS

RESUMEN

ABSTRACT POSGRADO

I. INTRODUCCIÓN ………………………………………………DE 01

II. MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………… 16

III. RESULTADOS …………………………………………………. 25

IV. DISCUSIÓN …………………………………………………….. 29 DIGITAL V. CONCLUSIONES ……………………………………………… 32

VI. RECOMENDACIONES ……………………………………….. 33

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………... 34

ANEXOS

BIBLIOTECA

I. INTRODUCCIÓN

1. Antecedentes y justificación del problema

El sistema estomatognático es la unidad morfofuncional ubicada en la región

cráneo-facial que comprende las estructuras combinadas de la boca y maxilares.

Mantiene con el organismo una interrelación recíproca y constante en estado de

salud y enfermedad. Está constituido por un conjunto heterogéneo de tejidos y

órganos que comprenden estructuras óseas, dientes, músculos, articulaciones,

glándulas y componentes vasculares, linfáticos y nerviosos asociados.1

POSGRADO Dentro de este sistema, los dientes son muy importantes en la ingestión y masticación de alimentos, fonación y estéticaDE de la persona. La profesión odontológica ha ido descubriendo que los dientes naturales funcionan mejor que

cualquier sustituto, y ha comprendido que merece la pena esforzarse un poco

más para tratar de conservar los dientes con problemas pulpares; así el tratamiento endodóntico haDIGITAL ampliado enormemente su campo de acción dentro de la práctica odontológica en estos últimos años.2

El tratamiento endodóntico abarca muchos aspectos cuando se trata de la

endodoncia práctica; el desbridamiento total del espacio pulpar, la creación de

un sellado apical y la obturación completa del sistema de conductos radiculares

BIBLIOTECAconstituyen los objetivos principales.3

La cámara pulpar y los conductos radiculares de dientes no tratados

desvitalizados están lleno de una masa gelatinosa de restos pulpares necróticos y

líquidos hísticos, porciones de tejido momificado y tejido viviente que se

encuentra algunas veces en la porción apical del conducto radicular. Por lo

general también hay bacterias. Un instrumento proyectado hacia dicho conducto

puede hacer salir este material nocivo a través del agujero apical, y producir

infecciones periapicales. Por esta razón, antes de la instrumentación y a

intervalos frecuentes durante ella, los conductos deberán irrigarse con una

solución que permita desinfectar y disolver el material orgánico.3

La irrigación del sistema de conductos es, quizás, uno de los procedimientos más importantes durante la terapia endodóntica;4 POSGRADOfacilita la instrumentación, debido a que lubrica las paredes de los conductos y suspende el polvo de

dentina. Para el éxito a corto y largo plazo, DEel desbridamiento minucioso de la

cámara pulpar y los conductos constituye un aspecto fundamental del

tratamiento endodóntico.3

DIGITAL Sin embargo sabemos que la eliminación total de los microorganismos del

interior del conducto es un objetivo difícil de lograr. Investigaciones realizadas

han demostrado que con las técnicas convencionales se consigue eliminar

mecánicamente un 90% de la población bacteriana6. Dejándonos todavía un 10%

de microorganismos remanente dentro del sistema de conductos radicular, el

cual puede potencialmente proliferar entre citas.6 Por este motivo, es importante BIBLIOTECA tener en cuenta que la preparación biomecánica y la irrigación con antisépticos

debe ser realizada lo más completa y meticulosamente posible.5

La patología pulpar y perirradicular son enfermedades inflamatorias de etiología

microbiana. Los microorganismos y sus productos desempeñan un papel

esencial en la inducción, progresión y perpetuación de tales enfermedades; más

de 150 especies microbianas se han aislado de los canales infectados de la raíz,

generalmente las infecciones son mixtas que comprenden de cuatro a siete

diversas especies y con predominio de bacterias anaerobias estrictas.4

En un primer momento existe predominancia de microorganismos aeróbicos,

pero a medida que las bacterias migran hacia la región apical aparecen anaerobios facultativos y estrictos. Este cambio enPOSGRADO la ecología del sistema de conductos radiculares infectados se debe a que los nutrientes inicialmente

obtenidos a partir de la fermentación de carbohidratosDE o aportados por la saliva

son sustituidos por el tejido pulpar desintegrado y los líquidos hísticos que

favorecen la fermentación de aminoácidos y péptidos. A esto, súmase la

creciente ausencia del oxígeno en los canales radiculares, que determinan el DIGITAL desarrollo de anaerobios facultativos, los cuales cederán su lugar a las bacterias

anaerobias estrictas a medida que avanza el proceso desvitalizante de la pulpa.

La ausencia de tejidos con vitalidad y la presión ejercida por la presencia de

lesiones en los tejidos del periápice aumentarán las condiciones de anaerobiosis

y por consiguiente la proliferación de anaerobios estrictos.4

BIBLIOTECA La flora bacteriana de los dientes con conductos radiculares con tratamiento

endodóncico depende de la calidad del tratamiento y la obturación de los

conductos. Las bacterias halladas en estos casos son predominantemente cocos

grampositivos, bacilos y filamentos. De acuerdo a técnicas microbiológicas, las

especies pertenecientes a los géneros Enterococcus, Actinomyces y

Propionibacterium, son los microorganismos aislados y caracterizados con más

frecuencia en tales conductos.4,5

Se ha demostrado que debido a la contaminación con saliva del conducto

radicular, por una mala técnica aséptica o por dejar el conducto abierto a la

cavidad oral, son cada vez mas frecuentes los casos en que están presentes los

Actinomyces y Enterococcus faecalis en conductos radiculares y lesiones periapicales.7 POSGRADO

Es necesario resaltar que en dientes previamenteDE tratados endodónticamente, con

evidencias de fracaso encontramos un alto porcentaje de microorganismos

altamente resistentes como Enterococcus faecalis.6

DIGITAL Las bacterias pueden utilizar diversas vías de entrada hacia la cavidad pulpar,

entre ellas están: Túbulos dentinarios, conductos radiculares laterales por la

continuidad entre el tejido pulpar con el tejido conjuntivo periodontal;

estableciéndose una infección de origen perio-endo, o bien endo-perio en el caso

en que una afección pulpar se extienda y afecte el tejido periodontal.7

BIBLIOTECA Microorganismos facultativos como Enterococcus faecalis, Staphylococcus

aureus y Candida albicans han sido considerados las especies más resistentes en

la cavidad oral y posible causa del fracaso del tratamiento de conductos.8

Los nuevos conceptos de resistencia bacteriana en endodoncia están mostrando

el papel importante del Enterococcus faecalis y Cándida albicans. Cuando

analizada la microbiota de canales radiculares con infecciones persistentes, los

Enterococcus fueron encontrados con mayor frecuencia.9,10

Enterococcus faecalis es una especie del género Enterococcus que según la

clasificación de Lancefield forma parte de los estreptococos del grupo D.11,12

Los enterococos son cocos grampositivos, catalasa negativa, inmóviles,

anaerobios facultativos y no forman endosporas ni cápsulas. Entre las características fisiológicas que distinguen al género EnterococcusPOSGRADO se encuentra la habilidad para crecer en presencia de 6,5 % de cloruro de sodio; entre 10º C y

45º C; y pH 9,6.13 Se puede cultivar en agarDE sangre 11,12,14,15 y en agar soya-

tripticasa12 y se transmite de persona a persona o a través del consumo de agua o

alimentos contaminados.11,14

Hasta la fecha, se han descritoDIGITAL 12 especies patógenas de enterococos para los

seres humanos, dentro de los cuales los más comúnmente aislados han sido E.

faecalis y E. Faecium. Los enterococos causan entre un 5% y un 15% de los

casos de endocarditis bacteriana. Así mismo, pueden causar infecciones de la

zona urinaria, intraabdominal, pélvica, e infecciones de heridas.16

BIBLIOTECA Enterococcus faecalis es un comensal normal adaptado ecológicamente a los

ambientes complejos de la cavidad oral, y los tractos gastrointestinales y

vaginales. Esta especie bacteriana esta envuelta a menudo en infecciones

endodónticas persistentes, y es una de las especies más resistentes encontradas

en la cavidad oral, teniendo la capacidad de sobrevivir bajo tensiones

medioambientales extremas.6

Desde el punto de vista odontológico, el E. faecalis comenzó a interesar en

procedimientos endodóncicos, debido a que esta bacteria es difícil de controlar

con los medicamentos que se utilizan dentro del conducto actualmente. La

instrumentación mecánica, sola o en combinación con agentes de irrigación

antimicrobianos, ha mostrado ser insuficientes para la completa eliminación de microorganismos.16 POSGRADO

Enteroccoccus. faecalis se encuentra como parteDE integrante de la microbiota de

dientes con pulpa necrótica sin tratar en proporciones muy bajas, por lo que

algunos investigadores sugieren que su alta incidencia en casos de repeticiones

de tratamiento se debe a entrada de microorganismos durante la terapia DIGITAL endodóntica, por una técnica de asepsia inadecuada, o entre citas, debido a un

sellado coronario inadecuado.16

El Enterococcus tiene la capacidad de colonizar las irregularidades anatómicas

del cemento radicular a nivel apical, formando parte de una placa bacteriana en

irregularidades, como superficies entre fibras colágenas, entre células, en BIBLIOTECA orificios y criptas.10

Muchas soluciones han sido consideradas como irrigantes endodónticos, cada

una con sus ventajas y desventajas; entre ellas tenemos: Hipoclorito de sodio

(0.5% a 5.25%), gluconato de clorhexidina, solución saturada de hidróxido de

calcio, agentes quelantes (EDTA, EDTAC), solución salina, soluciones

anestésicas, peróxido de hidrógeno (en solución al 3%), peroxido de urea, ácidos

fosfórico, láctico, cítrico, entre otros.3,17

Actualmente el irrigador de primera elección ante la presencia de un conducto

necrótico infectado es el hipoclorito de sodio por su capacidad para disolver tejido y por su amplio espectro antimicrobiano, ya quePOSGRADO este elimina rápidamente formas vegetativas de bacterias, esporas, hongos y virus.4,17,18 Sin embargo es

altamente citotóxico, inestable a corto tiempo,DE de sabor y olor desagradable, y

además es agresivo al instrumental.4

El hipoclorito de sodio ha sido descrito por la Asociación Americana de DIGITAL Endodoncistas como un líquido claro, pálido, verde-amarillento,

extremadamente alcalino y con fuerte olor clorino, que presenta una acción

disolvente sobre el tejido necrótico y restos orgánicos y además es un potente

agente antimicrobiano.4,18

Químicamente, el hipoclorito de sodio (NaOCl), es una sal formada de la unión BIBLIOTECA de dos compuestos químicos, el ácido hipocloroso y el hidróxido de sodio, que

presenta como características principales sus propiedades oxidantes. La formula

química de este compuesto es la siguiente: NaOH + HOCl = NaOCl 4

El hipoclorito de sodio (NaOCl) ha sido usado en tratamiento endodóntico desde

1920 como un irrigante auxiliar a la preparación mecanica19. La solución es

utilizada durante y después de la preparación mecánica en varias

concentraciones de 0,5% a 5,25%. El NaOCl en tratamiento endodóntico tiene

dos características fundamentales: acción solvente de tejidos blandos como

resultado de la oxidación, efecto antiséptico por liberar Cl y la reducción del

NaOCl a productos no tóxicos (Na+, Cl-), cuando entra en contacto con materia

orgánica. El cloro liberado constituye un bactericida notable, promoviendo la

desodorización y el clareamiento de la dentina.10 POSGRADO Una característica del NaOCl es que tiene un pH de aproximadamente 10-12,

por su pH alcalino neutraliza la acidez DE del medio evitando el desarrollo

bacteriano. 19

El NaOCl ejerce su acción antibacteriana por medio del contacto directo con el DIGITAL microorganismo o por vaporización. No se ha demostrado experimentalmente

como destruye exactamente el microorganismo, pero la eficacia en la

desinfección depende de la concentración del ácido hipocloroso (HClO) no

disociado en solución. El HClO ejerce su efecto germicida por medio de una

acción oxidativa en el grupo sulfidril de las enzimas de las bacterias, estas

enzimas esenciales son inhibidas y posteriormente se va a presentar un BIBLIOTECA rompimiento de las reacciones metabólicas, dando como resultado la muerte

celular de las bacterias; el cloro también puede combinarse con componentes

citoplasmáticos de las bacterias formando complejos tóxicos que destruyen al

microorganismo.17

El NaOCl también presenta propiedades negativas como la corrosión del

instrumental endodóntico, inefectividad para algunos microorganismos cuando

es utilizado a bajas concentraciones, por sí solo no remueve el barro dentinario

ya que sólo actúa sobre la materia orgánica de la pulpa y la predentina; además

presenta el riesgo de sobrepaso de NaOCl a los tejidos periapicales y es

potencialmente alergeno y citotóxico.19 El sabor es inaceptable por los pacientes.17,20 POSGRADO

El efecto antibacteriano del NaOCl contraDE el Enterococcus faecalis ha sido

evaluado a diferentes concentraciones. Siqueira y col. no encontraron diferencias

significativas entre las tres concentraciones de NaOCl al 1%, 2.5% y 5.25%21.

Sin embargo. Berber y col. encontraron que el NaOCl al 5.25% tiene mayor DIGITAL efecto antibacteriano dentro de los túbulos dentinarios.22 Otros autores

concluyeron que el NaOCl al 5.25% elimina todas las muestras de Enterococcus

faecalis estudiadas.23,24,25 Georgopoulou y col. evidenciaron que el NaOCl a

2,5% fue efectivo contra Enterococcus faecalis.4 Estrela y col. encontraron una

media de 10 mm de halo de inhibición del Enterococcus faecalis frente al NaOCl

al 2%.26 Estrela y col. encontraron para el NaOCl una concentración mínima BIBLIOTECA inhibitoria de 0.1% contra el E. faecalis.27

Un irrigante ideal sería aquel que tenga efectos bactericidas máximos y

toxicidad mínima. El hipoclorito de sodio no reúne estas condiciones; así una

solución al 5% es fuertemente bactericida, pero altamente tóxica y una solución

al 0.5%, aunque menos irritante, sus efectos antimicrobianos están disminuidos.4

En la actualidad se está investigando el uso de alternativas terapéuticas, las que

incluyen sustancias químicas sintetizadas en laboratorios y productos que

provienen de la naturaleza. Es así que etno-farmacólogos, botánicos,

microbiólogos, y bioquímicos, están trabajando en la investigación de sustancias fitoquímicas para desarrollar tratamientos contraPOSGRADO enfermedades infecciosas basados en productos naturales..28

El Perú es uno de los países con mayor diversidad biológica de la Tierra, tanto

por el número de especies y de recursos genéticos como por la variedad de

ecosistemas. Se calcula que posee unas 25,000 especies de plantas conocidas, de DIGITAL las cuales 5,000 son utilizadas para 49 diferentes usos, principalmente

alimenticios (728 especies), medicinales (1,400 especies), ornamentales (1,608

especies), y utilitarios (618 especies). Las plantas peruanas han sido utilizadas

desde tiempos inmemoriales por las antiguas culturas de los andes y de la

amazonía, y se han difundido, en los últimos siglos, entre todos los países del

planeta para beneficio de toda la humanidad.28 BIBLIOTECA

Se han realizado numerosos estudios con plantas nativas demostrándose sus

propiedades, como es el caso de la "uña de gato" o Uncaria tomentosa que

presenta un efecto antiinflamatorio y favorece la cicatrización. La "sangre de

grado" o Croton lechleri ha demostrado tener propiedades astringentes y

hemostáticas siendo de gran utilidad en casos de osteomielitis y osteítis. El

"bálsamo del Perú" Myroxylon balsamun ha demostrado sus propiedades

regeneradoras de tejidos en casos de alveolitis seca y al asociarse con eugenol

elimina el dolor y mal olor presentes en esta patología. El Aloe vera o "sábila"

disminuye la cantidad de placa, y la inflamación gingival y de garganta.29

Dentro del amplio espectro de productos forestales no maderables que rutinariamente son recolectados en la región del POSGRADO Amazonas se encuentra la Copaifera officinalis. Medicinalmente se utiliza la oleoresina que fluye en los

pequeños vasos y a veces se acumula en grandesDE cavidades en el medio de este

gran árbol de la selva tropical.30

Los principios activos del aceite de copaiba son: Esteroides y/o triterpenos, DIGITAL esteres, aldehídos y cetonas, peróxidos. Su división es: Magnoliophyta; clase:

Magnoliopsida; subclase: Rosidae; orden: Fabales; familia: FABACEAE =

Leguminosae; género: Copaifera y especie: Copaifera officinalis.30,31,32

El aceite de copaiba es un líquido espeso y claro, cuyo color cambia de amarillo

pálido a un marrón dorado claro. Presenta un olor característico y aromático; su BIBLIOTECA sabor es amargo y desagradable. Tiene un pH entre 5.4 y 5.5, y es soluble en

compuestos orgánicos como: Alcohol, bencina, éter y cloroformo.30,33

El aceite de copaiba contiene alrededor de 24 hidrocarburos sesquiterpénicos y

varios diterpenos, ácidos resínicos como el elácico y copaíbico; aceites

esenciales, trementina, ácido copaífero, B-eariofileno, E-cubeno, a-cubebeno, a-

humuleno, E-humuleno y D-candieno, ácido resinólico.30

El método más común de recolección de oleorresina consiste en perforar un

orificio hacia el centro del árbol y luego utilizar un contenedor para recolectar la

resina que fluye hacia fuera.30

En la medicina tradicional es utilizado para: CicatrizantePOSGRADO de heridas y úlceras cutáneas, amigdalitis, cáncer, herpes, inflamaciones, cistitis, micosis dérmica,

sarna, tos, bronquitis crónica, asma, úlcerasDE estomacales, dolor de oído,

psoriasis, hemorroides, artritis, dolores musculares, próstata, sífilis, sinusitis,

tétano, picaduras de insectos, golpes, hinchazones, abscesos, incontinencia de la

orina; y como antiséptico, astringente, antirreumático.30,31 Se ha demostrado en DIGITAL estudios experimentales que el aceite de copaiba tiene una marcada actividad

antibacteriana, antiinflamatoria y cicatrizante que validan sus usos

tradicionales.32

Oliveira et al.34 (Rio de Janeiro, 2008) investigaron sobre la actividad

antimicrobiana del aceite de copaiba obtenida de diferentes especies de BIBLIOTECA Copaifera; encontrando que el aceite de Copaifera officinalis tiene efecto

antibacteriano contra el Enterococcus faecalis con una concentración mínima

inhibitoria de 31.3-62.5 µg/ml.

Gálvez 35 (Lima, 2004) investigó la actividad antimicrobiana del aceite esencial

de Copaifera officinalis (copaiba) sobre el Streptococcus mutans - in vitro;

concluyendo que el aceite de copaiba afecta el crecimiento de Streptococcus

mutans y la sensibilidad del Streptococcus mutans frente al aceite de copaiba es

semejante a la manifestada en relación con la eritromicina.

Sousa y col.36 (Brasil, 2005) en el estudio sobre la acción antimicrobiana de

malva, aceite de copaiba y propóleo sobre cepas de Streptococcus mutans,

encontraron para el grupo del aceite de copaiba una media de 5 mm de halo de inhibición y una desviación estándar de 0.62. POSGRADO

De Melo y col.37 (Brasil, 2002) en el estudioDE sobre plantas medicinales en la

cicatrización de alveolitis secas en ratas: análisis microbiológico y

microscópico; encontraron que Copaifera officinalis tuvo efecto contra el S.

Viridans. DIGITAL

Paiva LA y col.38 (Brasil, 2002) investigaron la actividad cicatrizante de heridas

de la oleo-resina de Copaifera Langsdorffi en ratas, aplicándola directamente

sobre heridas abiertas; obteniendo resultados que indican los efectos benéficos

de la copaiba en el proceso de cicatrización.

BIBLIOTECA La irrigación es un paso en la terapia endodóntica tan importante como lo son la

correcta instrumentación y obturación. La sustancia irrigante escogida debe

permitir la neutralización e inactivación de toxinas bacterianas mediante un

completo desbridamiento y desinfección del espacio del conducto radicular lo

cual es fundamental para el éxito del tratamiento, al igual que una completa

obturación de este.

Considerando que aún no se ha encontrado un agente ideal que permita lograr

estos objetivos sin causar efectos secundarios, se mantiene una permanente

búsqueda de alternativas terapéuticas en la biodiversidad de plantas medicinales.

Una de ellas es el aceite de copaiba, que por poseer propiedades antibacterianas,

y no es citotóxico como el irrigante convencional; se realizó el presente estudio con el propósito de evaluar la susceptibilidadPOSGRADO bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencial de

Copaifera officinalis (copaiba) en comparaciónDE con hipoclorito de sodio al

2.5%.

2. Problema DIGITAL ¿Cuál es la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente a

diferentes concentraciones de aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba)

en comparación con hipoclorito de sodio al 2.5%?

3. Hipótesis

No existen diferencia en la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus BIBLIOTECA faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencial de Copaifera

officinalis (copaiba) en comparación con hipoclorito de sodio al 2.5%, y esta

susceptibilidad no varía de acuerdo a la concentración utilizada.

3.1. Objetivos

3.1.1. Objetivo General

- Determinar la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus

faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencial de

Copaifera officinalis (copaiba) en comparación con hipoclorito de

sodio al 2.5%.

3.1.2. Objetivos Específicos - Determinar la susceptibilidad bacterianaPOSGRADO in vitro del Enterococcus faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencial de

Copaifera officinalis (copaiba). DE

- Determinar la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus

faecalis frente al hipoclorito de sodio al 2.5%.

DIGITAL

BIBLIOTECA

II. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Material de estudio

4.1.1. Tipo y área de estudio

El presente trabajo siguió un diseño de investigación aplicada y

experimental comparativa, y se realizó en los ambientes de la

Sección de Microbiología de la Facultad de Medicina de la

Universidad Nacional de Trujillo. POSGRADO 4.1.2. Diseño estadístico

Definición de la población objetivoDE

La investigación tuvo como población objetivo al conjunto de

repeticiones de la cepa de Enterococcus faecalis en placas petri.

DIGITAL Unidad de Análisis

La unidad de análisis lo constituyó cada repetición realizada (con

diferentes concentraciones de aceite esencial de copaiba o

hipoclorito de sodio al 2.5%) en cada placa petri con la cepa de

Enterococcus faecalis.

BIBLIOTECA Unidad de Muestreo

La unidad de muestreo lo constituyó cada repetición realizada (con

diferentes concentraciones aceite esencial de copaiba o con

hipoclorito de sodio al 2.5%) en cada placa petri con la cepa de

Enterococcus faecalis.

Tamaño muestral

Para la determinación de la muestra del estudio se estableció los

siguientes criterios:

- Estimación previa del promedio del halo inhibitorio S  0.62.36

- Nivel de precisión 0.13 mm.

- Nivel de confiabilidad 95% (Z=1.96) POSGRADO En tales condiciones el tamaño de la muestra correspondió a: DE

n = Z2 S2 = (1.96)2 (0.62)2 = 88 d2 (0.13)2

No requiere corrección por finitud. DIGITAL

La muestra estuvo constituida por 90 repeticiones por ser múltiple de

5 que corresponde al número de grupos experimentales, los cuales se

distribuyeron en:

BIBLIOTECA. Grupo 1: 18 repeticiones en placas petri con siembra de Enterococcus faecalis, utilizando aceite esencial de Copaifera

officinalis al 100%.

. Grupo 2: 18 repeticiones en placas petri con siembra de

Enterococcus faecalis, utilizando aceite esencial de Copaifera

officinalis al 75%.

. Grupo 3: 18 repeticiones en placas petri con siembra de

Enterococcus faecalis, utilizando aceite esencial de Copaifera

officinalis al 50%.

. Grupo 4: 18 repeticiones en placas petri con siembra de

Enterococcus faecalis, utilizando aceite esencial de Copaifera

officinalis al 25%.

. Grupo 5: 18 repeticiones en placasPOSGRADO petri con siembra de Enterococcus faecalis, utilizando Hipoclorito de sodio al 2.5%.

4.1.3. Criterios de Control y Balance

Fueron excluidos del estudio, aquellos cultivos en los que se observe

deficiencias en la manipulación. DIGITAL

4.2. Métodos y Técnicas

4.2.1. Ficha de recolección de datos

Los datos fueron registrados en la ficha elaborada por el autor de

acuerdo a los propósitos de la presente investigación (Anexo 01). BIBLIOTECA

4.2.2. Procedimiento

A) De la obtención del aceite esencial

El aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) fue obtenido

de la Empresa Santa Natura con certificación 100% natural.

- Diluciones del aceite esencial

Se prepararon 3 diluciones con etanol a partir del aceite esencial

de Copaifera officinalis (copaiba) al 100%: 75%, 50% y 25%.

Dichas diluciones se guardaron a 4° C para el estudio bacteriológico. POSGRADO

B) De la obtención del hipocloritoDE de sodio

El hipoclorito de sodio al 2.5% fue obtenido del hipoclorito de

sodio “Zonident” al 5% elaborado por la empresa Proquident S.A.

diluido con agua destilada. DIGITAL

C) De la obtención de la cepa bacteriana

La cepa de Enterococcus faecalis fue obtenida del cepario de la

Sección de Microbiología de la Facultad de Medicina de la

Universidad Nacional de Trujillo.

BIBLIOTECA D) De la preparación de la cepa bacteriana

Una vez obtenida la cepa, estas fueron cultivadas en frascos de

penicilina conteniendo el medio Agar Soya Tripticasa, incubándose

a 37º C para obtener colonias jóvenes. Luego de 24 horas de

cultivadas se les agregó solución salina estéril, de tal manera que se

obtuvo una turbidez semejante al tubo número 1 de la escala de

Mac Farland.

Los tubos conteniendo la bacteria estudiada, fueron girados entre

las manos durante 30 segundos, antes de proceder al sembrado,

para distribuir los microorganismos adecuadamente.

E) Del sembrado POSGRADO Con un hisopo estéril, el cual fue embebido en la solución

preparada de Enterococcus faecalisDE y a una distancia de 10 cm de

la llama del mechero, se hizo el sembrado en placas petri,

conteniendo Agar Müeller Hinton, hisopando uniformemente sobre

toda la superficie del agar y girando cada placa 30 grados por 10 DIGITAL veces aproximadamente.

F) De la prueba de susceptibilidad

Se prepararon discos de papel de filtro estériles, los cuales fueron

sumergidos dentro de cada concentración de aceite esencial de

Copaifera officinalis, y luego con una aguja estéril, fueron BIBLIOTECA colocados sobre el cultivo de Enterococcus faecalis. En las placas

destinadas al grupo control se utilizó hipoclorito de sodio al 2.5%,

las cuales fueron selladas herméticamente utilizando parafilm. Una

vez colocados los discos, las placas fueron colocadas en una jarra

Gaspak, con una vela encendida a fin de obtener una atmósfera de

5% de CO2.

La lectura se llevó a cabo a las 24 horas. Se midieron los halos de

inhibición de cada concentración de aceite esencial, incluyendo el

área del aceite esencial, con una regla milimetrada; y se procedió

de igual manera con el hipoclorito de sodio al 2.5%.

4.2.3. Variables y escalas de medición POSGRADO

Variables Independientes: DE

- Soluciones inhibidoras de Enterococcus faecalis.

o Aceite esencial de Copaifera officinalis.

o Hipoclorito de sodio. DIGITAL

Variable dependiente:

- Susceptibilidad bacteriana en cepas de Enterococcus faecalis.

BIBLIOTECA

ESCALA DE VARIABLE CATEGORÍA INDICADOR TIPO MEDICION - 100% Aceite esencial de - 75% Soluciones inhibidoras de Copaifera officinalis - 50% Categórica Nominal Enterococcus faecalis - 25% Hipoclorito de sodio - 2.5% Susceptibilidad bacteriana Diámetro del en cepas de Enterococcus Numérica De razón halo en mm faecalis

POSGRADO 4.2.4. Definiciones operacionales DE Soluciones inhibidoras de Enterococcus faecalis

- Aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba)

Definición conceptual: Oleorresina extraída mediante la perforación delDIGITAL árbol Copaifera officinalis; cuyo color cambia de amarillo pálido a marrón dorado claro con propiedades

antibacterianas, antiinflamatorias y cicatrizantes.30

Definición operacional: Se realizaron 3 diluciones a partir del

100% de aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba):

o Dilución 1: 75%

BIBLIOTECAo Dilución 2: 50%

o Dilución 3: 25%

- Hipoclorito de sodio:

Definición conceptual: Líquido claro, pálido, verde-amarillento,

extremadamente alcalino y con fuerte olor clorino, que presenta

una acción disolvente sobre el tejido necrótico y restos orgánicos y

además es un potente agente antimicrobiano.4

Definición operacional: Se diluyó con agua destilada el

hipoclorito de sodio al 5% para obtener una concentración de 2.5%.

Susceptibilidad bacteriana en cepas de Enterococcus faecalis Definición conceptual: Sensibilidad o POSGRADO resistencia de la cepa de Enterococcus faecalis bajo la acción de las diferentes concentraciones

de aceite esencial de Copaifera officinalisDE .14

Definición operacional: Correspondió a la medida del diámetro del

halo de susceptibilidad en las placas petri con siembra de este

microorganismo medido a las 24 horas en milímetros. DIGITAL

4.2.5. Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico se empleó el test múltiple de comparación

de medias conocido como ANOVA, el cual asume el siguiente modelo

a efectos fijos:

BIBLIOTECAY ij = µ + i + eij Donde: Yij: corresponde a cada medición real

µ: media verdadera

i: efecto de la concentración experimental

eij: error aleatorio

La hipótesis nula plantea:

H0: i = 0

En el caso de rechazar la hipótesis nula se continuará con la aplicación

del test de Tuckey para la comparación 2 a 2.

La significación estadística será considerada a partir del nivel de 5% de probabilidad. POSGRADO

DIGITAL

BIBLIOTECA

III. RESULTADOS

En el presente estudio se ha evaluado la susceptibilidad in vitro del Enterococcus

faecalis frente a diferentes concentraciones de aceite esencial de Copaifera officinalis

(copaiba) en comparación con hipoclorito de sodio al 2.5%, a través de los halos de

susceptibilidad bacteriana.

En la Tabla Nº 1 se presentan los valores del promedio y desviación estándar del halo de

inhibición de susceptibilidad bacteriana del Enterococcus faecalis frente al aceite esencial de Copaifera Officinalis (copaiba) al 100%, 75%, POSGRADO50%, 25% e hipoclorito de sodio al 2.5%. Los resultados indican que el valor más alto del halo corresponde al

aceite esencial de Copaifera officinalis al 100%. DE

El Análisis de Varianza (ANOVA) indica que existen diferencias altamente

significativas (p<0.01) entre el aceite esencial de Copaifera Officinalis (copaiba) al DIGITAL 100%, 75%, 50%, 25% e hipoclorito de sodio al 2.5% (Tabla Nº 2).

La Tabla N° 3 indica que el aceite esencial de Copaifera officinalis al 100% difiere

significativamente de los demás grupos. En cambio no hay diferencia significativa entre

el aceite esencial de Copaifera officinalis al 75% y 50%; tampoco se encontró

diferencia significativa entre el aceite esencial de Copaifera officinalis al 25% y el BIBLIOTECA hipoclorito de sodio al 2.5%.

TABLA N° 1

MEDICIONES DEL HALO DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA IN VITRO

DEL ENTEROCOCCUS FAECALIS FRENTE A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ACEITE DE COPAIBA E HIPOCLORITO DE

SODIO AL 2.5%. TRUJILLO, 2009.

TRATAMIENTO

COPAIBA 100% COPAIBA 75% COPAIBA 50% COPAIBA 25% HIPOCLORITO DE SODIO

20 20 18 8 8

20 12 18 8 8 20 12 14 POSGRADO6 8 20 12 12 6 6 18 10 12 DE 6 6 18 10 12 6 6

16 10 8 5 4

16 10 8 4 4

14 DIGITAL10 8 4 4

14 8 6 4 4

14 8 4 2 4

14 6 4 2 4

12 6 4 2 4

12 4 2 2 2

10 4 2 2 2 BIBLIOTECA 8 2 1 2 1 PROMEDIO 15.44 9.11 8.28 4.28 4.61

DESV. ESTANDAR 3.55 4.01 5.18 2.05 2.03

TABLA N° 2

ANÁLISIS DE VARIANZA DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA DEL

ENTEROCOCCUS FAECALIS FRENTE A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ACEITE DE COPAIBA E HIPOCLORITO DE

SODIO AL 2.5%. TRUJILLO, 2009

FUENTE DE SUMA DE GRADOS DE CUADRADO RAZÓN F SIGNIFICACIÓN VARIACIÓN CUADRADOS LIBERTAD MEDIO POSGRADO

Entre grupos 1466.6 4 366.65DE 28.705 p<0.01 Dentro de grupos 1085.722 85 12.77

TOTAL 2552.322 89

DIGITAL

BIBLIOTECA

TABLA N° 3

TEST DE MEDIAS 2 A 2 DE LA SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA DEL

ENTEROCOCCUS FAECALIS FRENTE A DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE ACEITE DE COPAIBA E HIPOCLORITO DE

SODIO AL 2.5%. TRUJILLO, 2009

TEST MDS 2 A 2 COPAIBA 100% COPAIBA 75% COPPAIBA 50% COPAIBA 25% HIPOCLORITO DE SODIO AL 2.5%

15.44 9.11 8.28 POSGRADO4.28 4.61 DE

DIGITAL

BIBLIOTECA

IV. DISCUSIÓN

Se ha evaluado la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis frente a diferentes

concentraciones de aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) en comparación

con hipoclorito de sodio al 2.5%; habiendo encontrado resultados favorables,

manifestados a través de los halos de susceptibilidad bacteriana. Lo cual demuestra que

el aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) tiene efectos inhibitorios sobre el

crecimiento del Enterococcus faecalis y que solo requiere determinar la concentración

del aceite más apropiada. POSGRADO Nuestros resultados confirman lo encontrado por otros autores; como lo demostrado por

Oliveira et al. 34, quienes afirman que el aceite obtenidoDE de la Copaifera officinalis tiene

actividad bactericida contra especies gran positivas (Staphylococcus aureus, methicillin-

resistant S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, y Enterococcus

faecalis) con una concentración mínima inhibitoria de 31.3-62.5 µg/ml,; en este estudio DIGITAL sólo se utilizó el aceite de copaiba puro extraído directamente del árbol de Copaifera

officinalis de la selva brasileña, en cambio nuestro estudio comparó la acción

bactericida del aceite de copaiba al 100%, 75%, 50% y 25%.

Los resultados del presente estudio confirman la acción antimicrobiana del aceite

esencial de Copaifera officinalis (copaiba), que concuerda con lo obtenido por Gálvez35, BIBLIOTECA Sousa y col.36, quienes concluyeron que el aceite de copaiba tiene efecto antibacteriano

contra el Streptococcus mutans. Asimismo, De Melo y col.37 concluyeron que el aceite

esencial de copaiba tiene efecto antibacteriano contra cepas de Streptococcus viridans.

Esto debido a que el aceite de copaiba daña la pared celular, provocando liberación de

los componentes citoplasmáticos, alteración en la morfología y disminución del

volumen celular.

Los promedios del halo de susceptibilidad bacteriana del Enterococcus faecalis en el

presente trabajo, mostraron un aumento creciente a medida que la concentración del

aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) va en aumento. Estos resultados,

demuestran que el aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba), además de tener

acción antibacteriana, tiene relación directa con la concentración utilizada del aceite de copaiba; es decir, que a mayor concentración del aceite de copaibaPOSGRADO se tiene mayor efecto antibacteriano; considerando que en el presente trabajo se utilizó el aceite de copaiba en

diferentes concentraciones (25%, 50%, 75%, 100%),DE lo cual no se realizó en los trabajos

referidos.

Se demuestra también, que la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus DIGITAL faecalis frente al aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) al 100%, 75% y 50%

fue mayor que la susceptibilidad bacteriana in vitro del Enterococcus faecalis frente al

hipoclorito de sodio al 2.5%, y éste fue semejante al obtenido por el aceite de copaiba

al 25%. Estos resultados pueden deberse a la inestabilidad química que presenta el

hipoclorito de sodio.

BIBLIOTECA El hipoclorito de sodio ocasiona la alteración biosintética del metabolismo celular,

destrucción de fosfolípidos y formación de cloraminas que interfieren en el

metabolismo celular, y su acción oxidativa lleva a inactivación enzimática y

degradación de lípidos y ácidos grasos. El promedio del halo de susceptibilidad

bacteriana del Enterococcus faecalis frente al hipoclorito de sodio al 2.5% encontrado

en el presente estudio fue de 4.61 mm, a diferencia de Estrela y col., quienes

encontraron una media de 10 mm de halo de inhibición del Enterococcus faecalis frente

al hipoclorito de sodio al 2%. La diferencia puede deberse al tiempo de incubación de

las placas petri, pues en nuestro trabajo el periodo de incubación fue de 24 horas en

cambio en el estudio de Estrela y col. fue de 48 horas.

POSGRADO

DIGITAL

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V. CONCLUSIONES

- Enterococcus faecalis es susceptible frente a las diferentes concentraciones

utilizadas de aceite esencial de Copaifera officinalis (copaiba) y esta susceptibilidad

fue mayor que la del hipoclorito de sodio al 2.5%.

- Enterococcus faecalis fue susceptible frente a todas las concentraciones de aceite

esencial de Copaifera officinalis (copaiba) y esta susceptibilidad fue directamente

proporcional a la concentración utilizada. POSGRADO

DIGITAL

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VI. RECOMENDACIONES

- Realizar nuevos estudios in vitro y ensayos clínicos con los que se pueda corroborar

la veracidad de los resultados obtenidos en esta investigación.

- Se recomienda investigar sobre las propiedades terapéuticas de los recursos

vegetales de nuestra región.

- Realizar investigaciones experimentales para determinar la eficacia, tolerancia y seguridad para su uso posterior en seres humanos. POSGRADO

DE - Recomendar el uso racional de sustancias terapéuticas tóxicas en los tratamientos

endodónticos y promover la búsqueda de alternativas de origen natural.

- Promover la investigación científica sobre nuestros productos naturales en la DIGITAL aplicación terapéutica estomatológica.

BIBLIOTECA

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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DIGITAL

BIBLIOTECA

POSGRADO

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ANEXO 01

FICHA DE REGISTRO DE LAS ZONAS DE SUSCEPTIBILIDAD

FECHA: ......

PLACA Nº: ......

GRUPO: ......

POSGRADO SUSTANCIA: ......

DIÁMETRO DEL OBSERVACIONES

HALO EN mm SENSIBLE RESISTENTE

1) DIGITAL 2)

Control después de 3)

24 horas 4)

6) BIBLIOTECAPROMEDIO: