ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 3 EXTENDED SUMMARY 5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 1.1 Μιτοχόνδριο 7 1.1.1 Λίγα Λόγια για το DNA 7 1.1.2. Κληρονόμηση Μιτοχονδριακού DNA 9 1.1.3. Ζωικό μιτοχονδριακό DNA 9 1.1.4. Μειονεκτήματα μιτοχονδριακών γενετικών δεικτών 15 1.1.5. Φυτικό μιτοχονδριακό DNA 16 1.2 Οργανισμοί μελέτης 18 1.2.1 Γνωριμία με τους οργανισμούς 18 1.2.2. Αρθρόποδα 18 1.2.3 Χηληκεραιωτά 20 1.2.4. Αραχνίδια 20 1.2.5. Αράχνες 20 1.2.6. Λίγα λόγια για τις Οικογένειες Αραχνών της μελέτης 25 1.3 DNA Barcoding στις αράχνες 40 1.3.1. Γενικά 40 1.3.2 Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.boldsystems.org 44 1.3.2.1 Database 46 1.3.2.2. Taxonomy 47 1.3.2.3. Identification 48 1.3.3. Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.araneae.unibe.ch 52 1.3.4. Επιλογή των Δειγμάτων 53 1.3.5 Ελληνικές και Ξένες Μελέτες και Προγράμματα για το DNA Barcoding στις Αράχνες 53 1.4 Σκοπός της Μελέτης 56 2. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ 57 2.1. Επιλογή και Συλλογή Δειγμάτων 57 2.2. Είδη, Οικογένειες και Παραομάδες 58 2.3. Πειραματική Διαδικασία 62 2.3.1. Εξαγωγή ολικού γενωμικού DNA 62 2.3.2. Πολλαπλασιασμός των γονιδίων-στόχων μέσω της PCR 64 1 2.3.3. Καθαρισμός του προιόντος της PCR 65 2.4. Επεξεργασία των αλληλουχιών 66 2.5 Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων 66 2.6 Φυλογενετικές αναλύσεις 67 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 68 3.1. Γενικά στοιχεία για τις αλληλουχίες του COI 68 3.2. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων 68 3.3. Ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining, NJ) 75 3.4. DNA Barcoding 80 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 91 4.1. Συντηρημένες, Μεταβλητές και Πληροφοριακές θέσεις 91 4.2. Νουκλεοτιδικά Τμήματα και Σύσταση των Αλληλουχιών 91 4.3. Γενετικές Αποστάσεις 92 4.4 Φυλογενετικά Δέντρα 93 4.4.1. Φυλογενετικό Δέντρο που Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση 93 4.4.2. Φυλογενετικό Δέντρο που Δεν Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση 98 4.4.3 Σύγκριση Αποτελεσμάτων με τη Φυλογένεση των Αραχνών 99 4.5. Φυλογενετικά Τμήματα Δέντρων του DNA Barcoding 101 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 105 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 108 ΔΙΑΔΥΚΤΙΑΚΕΣ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΕΣ 108 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 108 ΞΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 109 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 123 2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το μιτοχονδριακό DNA είναι μια μορφή μακρομορίου DNA, το οποίο βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα μέσα στα μιτοχόνδρια και κληρονομείται συνήθως από τις μητέρες. Αυτό το μακρομόριο διαθέτει πολλά εξελικτικά και τεχνικά πλεονεκτήματα για την χρησιμοποίηση του σε φυλογενετικές και άλλες αναλύσεις. Οι αράχνες είναι μια τάξη των αρθροπόδων με μεγάλη ποικιλότητα, καθώς περιλαμβάνει τουλάχιστον 45.539 διαφορετικά είδη παγκοσμίως. Επιπλέον στην Ελλάδα η παρουσία τους είναι σημαντική, καθώς ο αριθμός των ειδών που απαντούν εκεί εκτιμάται ότι αριθμεί περί τα 1200 είδη. Το γεγονός αυτό δημιουργεί έντονο ενδιαφέρον για τη μελέτη τους, τόσο από άποψη συστηματικής, όσο και φυλογένεσης και φυλογεωγραφίας. Η μέθοδος του DNA Barcoding πραγματοποιείται συνήθως με τη χρήση ενός μιτοχονδριακού γονιδίου, του COI (της υπομονάδας Ι του μιτοχονδριακού γονιδίου οξειδάση του κυτοχρώματος c), έχει ευρεία χρήση σε ερευνητικές μελέτες πληθυσμιακής γενετικής και μοριακής ταξινόμησης και παρουσιάζει τεράστιες δυνατότητες σε διάφορες άλλες ερευνητικές εφαρμογές και εφαρμοσμένους κλάδους (π.χ. οικολογία της διατήρησης, ιχθυολογία κ. ά.). Ιδιαίτερα για τις αράχνες, το DNA Barcoding αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο τόσο για την ταυτοποίηση δύσκολα αναγνωρίσιμων ειδών, όσο και για προκαταρκτικές φυλογενετικές αναλύσεις, που όμως ακόμα δεν έχει αξιοποιηθεί πλήρως. Συγκεκριμένα, στο διαδικτυακό τόπο “Barcode of Life” (http://www.boldsystems.org/) υπάρχουν 5.074 εγγραφές για DNA barcodes από δείγματα αραχνών, ενώ άλλη πηγή πληροφόρησης για το DNA Barcoding σε αράχνες αποτελεί η εξειδικευμένη γι αυτές ιστοσελίδα “Araneae: Spiders of Europe” (www.araneae.unibe.ch). Και στις δύο αυτές βάσεις δεδομένων μπορεί κανείς να αναζητήσει όλες τις τρέχουσες και γνωστές πλέον αλληλουχίες για αράχνες και να τις συγκρίνει με τα δικά του ευρήματα. Αν και στο εξωτερικό έχουν γίνει διάφορες μελέτες σχετικά με το DNA Barcoding στις αράχνες, μέχρι σήμερα δεν έχει παρουσιαστεί καμία τέτοια μελέτη από την Ελλάδα. Στόχος, λοιπόν, της παρούσας μελέτης ήταν η παράδοση των πρώτων από τον ελλαδικό χώρο DNA barcodes αλληλουχιών αραχνών και η ανάδειξη της χρησιμότητας αυτής της μεθόδου μέσω της ανάλυσης των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη αλληλουχιών μεταξύ τους και με άλλες αλληλουχίες αραχνών από τις παγκόσμιες 3 βάσεις δεδομένων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 35 εργαστηριακά δείγματα και 85 δείγματα από την βάση δεδομένων GenBank, τα οποία περιλαμβάνονται σε 17 οικογένειες αραχνών. Για τη συλλογή των εργαστηριακών δειγμάτων έγινε εξαγωγή του ολικού γενωμικού DNA, πολλαπλασιασμός του γονιδίου COI μέσω της τεχνικής της PCR και καθαρισμός του προϊόντος, το οποίο στη συνέχεια αλληλουχήθηκε και «διαβάστηκε» με τις τρέχουσες τεχνικές και προγράμματα (Chromas v.2.1.1 και Sequencher v.4.10.1, ClustalX). Με τη βοήθεια του φυλογενετικού προγράμματος MEGA και βάσει του μοντέλου Tamura-Nei, υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις των αλληλουχιών οι οποίες στη συνέχεια συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη δειγμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν δύο σετ δεδομένων (το πρώτο περιελάμβανε τις βάσεις και των τριών κωδικών θέσεων και το δεύτερο δεν περιελάμβανε την τρίτη κωδική θέση, προκειμένου να αφαιρεθεί ο ‘‘θόρυβος’’ των ομοπλασιών) και η ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ). Από τις φυλογενετικές αναλύσεις προέκυψε ότι με την αφαίρεση της τρίτης κωδικής θέσης μικραίνουν οι γενετικές αποστάσεις και άρα αφαιρείται φυλογενετική πληροφορία. Σε γενικές γραμμές παρατηρήθηκε ότι, ακόμα και με τόσο λίγα δείγματα (σε σχέση με το εύρος της ταξινομικής κλίμακας), έγινε μια πρώτη προσέγγιση των φυλογενετικών σχέσεων των συγκεκριμένων αραχνών σε επίπεδο οικογένειας. Επιπλέον, τα Μεσόθηλα αποτελούν τα πιο διαφοροποιημένα γενετικά είδη αραχνών και μπορούν να χρησιμοποιούνται ως εξωομάδες στα διάφορα φυλογενετικά δέντρα. Από την άλλη, τα Μυγαλόμορφα αποτελούν μια μονοφυλετική ομάδα που όμως εμφανίζει παραφυλετικότητες εντός της σε επίπεδο οικογενειών, πράγμα που συνηγορεί στην ανάγκη συνολικής αναθεώρησης της υποτάξης. Το γεγονός ότι οι Αρανεόμορφες οικογένειες των Dysderidae και των Palpimanidae συνδέονται με τα Μυγαλόμορφα, αν και δεν έχει μεγάλη στατιστική υποστήριξη, μπορεί να ερμηνευτεί από το ότι οι συγκεκριμένες οικογένειες αποτελούν αρκετά απομονωμένους κλάδους εντός των Αρανεομόρφων και οι ομάδες με τις οποίες φαίνεται να συν΄δεονται φυλογενετικά απουσίαζαν από τη συγκεκριμένη μελέτη. Τέλος τα Salticidae, μία μεγάλη οικογένεια αραχνών που αντιπροσωπεύθηκε εδώ με αρκετά μεγάλο αριθμό δειγμάτων, παρουσιάζουν παραφυλετικότητα εντός των γενών τους και συνδέονται με οικογένειες, με τις οποίες δεν έχουν φυλογενετική συγγένεια. 4 Από τα εξαγόμενα αποτελέσματα με την μέθοδο του DNA Barcoding, επιτεύχθηκε ο στόχος της δημιουργίας των πρώτων 35 DNA barcodes αλληλουχιών αραχνών από τον ελλαδικό χώρο στις παγκόσμιες βάσεις δεδομένων (GenBank) και επαληθεύτηκαν σε μεγάλο βαθμό οι φυλογενετικές σχέσεις των υπό μελέτη αραχνών. EXTENDED SUMMARY Mitochondrial DNA is a form of usually maternally inherited DNA macromolecule, located in many copies inside mitochondria. This kind of DNA has many evolutionary and technical advantages for phylogenetic and other studies. Spiders are a highly diversified order within Arthropoda, as they include at least 45.539 different species worldwide. Their presence in Greece is important too, as the estimated number of species to be recorded in it reaches about 1,200. This fact raises a great interest for their taxonomic, phylogenetic and phylogeographic study. DNA barcoding method usually uses the mitochondrial gene, COI (cytochrome c oxidase, subunit I) and finds a wide application in experimental studies of population genetics and molecular taxonomy and presents enormous potential in several other research applications (e.g. conservation ecology, ichthyology etc). As for other taxa, also for spiders, DNA barcoding is a useful tool for the identification of difficultly recognizable species, for taxonomic comparisons on the molecular level or for preliminary phylogenetic analyses. However, it is still not fully exploited. Specifically, in the website "Barcode of Life" (www.boldsystems.org), there are 5.074 DNA barcodes from spider specimens, while another information source specialized in spiders DNA barcoding is "Araneae: Spiders of Europe" (www.araneae.unibe.ch). In both websites the investigator can find all the current and known spider DNA sequences and compare them with his own findings. Till today, there has not been any study about spiders DNA barcoding in Greece. Aim of this study is the supply with the first DNA barcode sequences from spiders living in Greece and the promotion of DNA barcoding method, through the analysis of phylogenetic relationships of our laboratory samples with each other and with sequences from the international databases. For this purpose, 35 laboratory samples and 85 samples from the GenBank database were used, corresponding to 17 spider families in total. The dataset was chosen 5 in such way, so as to reflect the maximum diversity within the group, and to add new barcodes for the scientific community, representing the greek arachnofauna (common species found in Greece) as much as possible. For the laboratory samples, the whole genomic DNA was extracted, the COI gene was multiplied by PCR method and the final product was cleaned. Then the product was sequenced, edited and aligned with the current techniques and programs (Chromas v.2.1.1, Sequencher v.4.10.1 and ClustalX). Using the phylogenetic program MEGA and based on the Tamura-Nei model, the genetic