ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΠΕΡΙΛΗΨΗ 3 EXTENDED SUMMARY 5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 1.1 Μιτοχόνδριο 7 1.1.1 Λίγα Λόγια για το DNA 7 1.1.2. Κληρονόμηση Μιτοχονδριακού DNA 9 1.1.3. Ζωικό μιτοχονδριακό DNA 9 1.1.4. Μειονεκτήματα μιτοχονδριακών γενετικών δεικτών 15 1.1.5. Φυτικό μιτοχονδριακό DNA 16 1.2 Οργανισμοί μελέτης 18 1.2.1 Γνωριμία με τους οργανισμούς 18 1.2.2. Αρθρόποδα 18 1.2.3 Χηληκεραιωτά 20 1.2.4. Αραχνίδια 20 1.2.5. Αράχνες 20 1.2.6. Λίγα λόγια για τις Οικογένειες Αραχνών της μελέτης 25 1.3 DNA Barcoding στις αράχνες 40 1.3.1. Γενικά 40 1.3.2 Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.boldsystems.org 44 1.3.2.1 Database 46 1.3.2.2. Taxonomy 47 1.3.2.3. Identification 48 1.3.3. Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.araneae.unibe.ch 52 1.3.4. Επιλογή των Δειγμάτων 53 1.3.5 Ελληνικές και Ξένες Μελέτες και Προγράμματα για το DNA Barcoding στις Αράχνες 53 1.4 Σκοπός της Μελέτης 56 2. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ 57 2.1. Επιλογή και Συλλογή Δειγμάτων 57 2.2. Είδη, Οικογένειες και Παραομάδες 58 2.3. Πειραματική Διαδικασία 62 2.3.1. Εξαγωγή ολικού γενωμικού DNA 62 2.3.2. Πολλαπλασιασμός των γονιδίων-στόχων μέσω της PCR 64

1

2.3.3. Καθαρισμός του προιόντος της PCR 65 2.4. Επεξεργασία των αλληλουχιών 66 2.5 Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων 66 2.6 Φυλογενετικές αναλύσεις 67 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 68 3.1. Γενικά στοιχεία για τις αλληλουχίες του COI 68 3.2. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων 68 3.3. Ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining, NJ) 75 3.4. DNA Barcoding 80 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 91 4.1. Συντηρημένες, Μεταβλητές και Πληροφοριακές θέσεις 91 4.2. Νουκλεοτιδικά Τμήματα και Σύσταση των Αλληλουχιών 91 4.3. Γενετικές Αποστάσεις 92 4.4 Φυλογενετικά Δέντρα 93 4.4.1. Φυλογενετικό Δέντρο που Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση 93 4.4.2. Φυλογενετικό Δέντρο που Δεν Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση 98 4.4.3 Σύγκριση Αποτελεσμάτων με τη Φυλογένεση των Αραχνών 99 4.5. Φυλογενετικά Τμήματα Δέντρων του DNA Barcoding 101 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 105 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 108 ΔΙΑΔΥΚΤΙΑΚΕΣ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΕΣ 108 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 108 ΞΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 109 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 123

2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Το μιτοχονδριακό DNA είναι μια μορφή μακρομορίου DNA, το οποίο βρίσκεται σε πολλά αντίγραφα μέσα στα μιτοχόνδρια και κληρονομείται συνήθως από τις μητέρες. Αυτό το μακρομόριο διαθέτει πολλά εξελικτικά και τεχνικά πλεονεκτήματα για την χρησιμοποίηση του σε φυλογενετικές και άλλες αναλύσεις. Οι αράχνες είναι μια τάξη των αρθροπόδων με μεγάλη ποικιλότητα, καθώς περιλαμβάνει τουλάχιστον 45.539 διαφορετικά είδη παγκοσμίως. Επιπλέον στην Ελλάδα η παρουσία τους είναι σημαντική, καθώς ο αριθμός των ειδών που απαντούν εκεί εκτιμάται ότι αριθμεί περί τα 1200 είδη. Το γεγονός αυτό δημιουργεί έντονο ενδιαφέρον για τη μελέτη τους, τόσο από άποψη συστηματικής, όσο και φυλογένεσης και φυλογεωγραφίας. Η μέθοδος του DNA Barcoding πραγματοποιείται συνήθως με τη χρήση ενός μιτοχονδριακού γονιδίου, του COI (της υπομονάδας Ι του μιτοχονδριακού γονιδίου οξειδάση του κυτοχρώματος c), έχει ευρεία χρήση σε ερευνητικές μελέτες πληθυσμιακής γενετικής και μοριακής ταξινόμησης και παρουσιάζει τεράστιες δυνατότητες σε διάφορες άλλες ερευνητικές εφαρμογές και εφαρμοσμένους κλάδους (π.χ. οικολογία της διατήρησης, ιχθυολογία κ. ά.). Ιδιαίτερα για τις αράχνες, το DNA Barcoding αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο τόσο για την ταυτοποίηση δύσκολα αναγνωρίσιμων ειδών, όσο και για προκαταρκτικές φυλογενετικές αναλύσεις, που όμως ακόμα δεν έχει αξιοποιηθεί πλήρως. Συγκεκριμένα, στο διαδικτυακό τόπο “Barcode of Life” (http://www.boldsystems.org/) υπάρχουν 5.074 εγγραφές για DNA barcodes από δείγματα αραχνών, ενώ άλλη πηγή πληροφόρησης για το DNA Barcoding σε αράχνες αποτελεί η εξειδικευμένη γι αυτές ιστοσελίδα “Araneae: Spiders of Europe” (www.araneae.unibe.ch). Και στις δύο αυτές βάσεις δεδομένων μπορεί κανείς να αναζητήσει όλες τις τρέχουσες και γνωστές πλέον αλληλουχίες για αράχνες και να τις συγκρίνει με τα δικά του ευρήματα. Αν και στο εξωτερικό έχουν γίνει διάφορες μελέτες σχετικά με το DNA Barcoding στις αράχνες, μέχρι σήμερα δεν έχει παρουσιαστεί καμία τέτοια μελέτη από την Ελλάδα. Στόχος, λοιπόν, της παρούσας μελέτης ήταν η παράδοση των πρώτων από τον ελλαδικό χώρο DNA barcodes αλληλουχιών αραχνών και η ανάδειξη της χρησιμότητας αυτής της μεθόδου μέσω της ανάλυσης των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη αλληλουχιών μεταξύ τους και με άλλες αλληλουχίες αραχνών από τις παγκόσμιες 3

βάσεις δεδομένων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 35 εργαστηριακά δείγματα και 85 δείγματα από την βάση δεδομένων GenBank, τα οποία περιλαμβάνονται σε 17 οικογένειες αραχνών. Για τη συλλογή των εργαστηριακών δειγμάτων έγινε εξαγωγή του ολικού γενωμικού DNA, πολλαπλασιασμός του γονιδίου COI μέσω της τεχνικής της PCR και καθαρισμός του προϊόντος, το οποίο στη συνέχεια αλληλουχήθηκε και «διαβάστηκε» με τις τρέχουσες τεχνικές και προγράμματα (Chromas v.2.1.1 και Sequencher v.4.10.1, ClustalX). Με τη βοήθεια του φυλογενετικού προγράμματος MEGA και βάσει του μοντέλου Tamura-Nei, υπολογίστηκαν οι γενετικές αποστάσεις των αλληλουχιών οι οποίες στη συνέχεια συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη δειγμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν δύο σετ δεδομένων (το πρώτο περιελάμβανε τις βάσεις και των τριών κωδικών θέσεων και το δεύτερο δεν περιελάμβανε την τρίτη κωδική θέση, προκειμένου να αφαιρεθεί ο ‘‘θόρυβος’’ των ομοπλασιών) και η ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ). Από τις φυλογενετικές αναλύσεις προέκυψε ότι με την αφαίρεση της τρίτης κωδικής θέσης μικραίνουν οι γενετικές αποστάσεις και άρα αφαιρείται φυλογενετική πληροφορία. Σε γενικές γραμμές παρατηρήθηκε ότι, ακόμα και με τόσο λίγα δείγματα (σε σχέση με το εύρος της ταξινομικής κλίμακας), έγινε μια πρώτη προσέγγιση των φυλογενετικών σχέσεων των συγκεκριμένων αραχνών σε επίπεδο οικογένειας. Επιπλέον, τα Μεσόθηλα αποτελούν τα πιο διαφοροποιημένα γενετικά είδη αραχνών και μπορούν να χρησιμοποιούνται ως εξωομάδες στα διάφορα φυλογενετικά δέντρα. Από την άλλη, τα Μυγαλόμορφα αποτελούν μια μονοφυλετική ομάδα που όμως εμφανίζει παραφυλετικότητες εντός της σε επίπεδο οικογενειών, πράγμα που συνηγορεί στην ανάγκη συνολικής αναθεώρησης της υποτάξης. Το γεγονός ότι οι Αρανεόμορφες οικογένειες των Dysderidae και των Palpimanidae συνδέονται με τα Μυγαλόμορφα, αν και δεν έχει μεγάλη στατιστική υποστήριξη, μπορεί να ερμηνευτεί από το ότι οι συγκεκριμένες οικογένειες αποτελούν αρκετά απομονωμένους κλάδους εντός των Αρανεομόρφων και οι ομάδες με τις οποίες φαίνεται να συν΄δεονται φυλογενετικά απουσίαζαν από τη συγκεκριμένη μελέτη. Τέλος τα Salticidae, μία μεγάλη οικογένεια αραχνών που αντιπροσωπεύθηκε εδώ με αρκετά μεγάλο αριθμό δειγμάτων, παρουσιάζουν παραφυλετικότητα εντός των γενών τους και συνδέονται με οικογένειες, με τις οποίες δεν έχουν φυλογενετική συγγένεια.

4

Από τα εξαγόμενα αποτελέσματα με την μέθοδο του DNA Barcoding, επιτεύχθηκε ο στόχος της δημιουργίας των πρώτων 35 DNA barcodes αλληλουχιών αραχνών από τον ελλαδικό χώρο στις παγκόσμιες βάσεις δεδομένων (GenBank) και επαληθεύτηκαν σε μεγάλο βαθμό οι φυλογενετικές σχέσεις των υπό μελέτη αραχνών.

EXTENDED SUMMARY

Mitochondrial DNA is a form of usually maternally inherited DNA macromolecule, located in many copies inside mitochondria. This kind of DNA has many evolutionary and technical advantages for phylogenetic and other studies. Spiders are a highly diversified order within Arthropoda, as they include at least 45.539 different species worldwide. Their presence in Greece is important too, as the estimated number of species to be recorded in it reaches about 1,200. This fact raises a great interest for their taxonomic, phylogenetic and phylogeographic study. DNA barcoding method usually uses the mitochondrial gene, COI (cytochrome c oxidase, subunit I) and finds a wide application in experimental studies of population genetics and molecular taxonomy and presents enormous potential in several other research applications (e.g. conservation ecology, ichthyology etc). As for other taxa, also for spiders, DNA barcoding is a useful tool for the identification of difficultly recognizable species, for taxonomic comparisons on the molecular level or for preliminary phylogenetic analyses. However, it is still not fully exploited. Specifically, in the website "Barcode of Life" (www.boldsystems.org), there are 5.074 DNA barcodes from spider specimens, while another information source specialized in spiders DNA barcoding is "Araneae: Spiders of Europe" (www.araneae.unibe.ch). In both websites the investigator can find all the current and known spider DNA sequences and compare them with his own findings. Till today, there has not been any study about spiders DNA barcoding in Greece. Aim of this study is the supply with the first DNA barcode sequences from spiders living in Greece and the promotion of DNA barcoding method, through the analysis of phylogenetic relationships of our laboratory samples with each other and with sequences from the international databases. For this purpose, 35 laboratory samples and 85 samples from the GenBank database were used, corresponding to 17 spider families in total. The dataset was chosen

5

in such way, so as to reflect the maximum diversity within the group, and to add new barcodes for the scientific community, representing the greek arachnofauna (common species found in Greece) as much as possible. For the laboratory samples, the whole genomic DNA was extracted, the COI gene was multiplied by PCR method and the final product was cleaned. Then the product was sequenced, edited and aligned with the current techniques and programs (Chromas v.2.1.1, Sequencher v.4.10.1 and ClustalX). Using the phylogenetic program MEGA and based on the Tamura-Nei model, the genetic distances of sequences were calculated and included in the phylogenetic analysis. The Neighbor-Joining (NJ) method and two data sets (the first included the bases of the three coding site and the second did not included the third coding site, in order to eliminate the ‘‘noise’’ of homoplasies) were used. The phylogenetic analysis showed that the withdrawal of the third coding site shortened the genetic distances, thus writing off noise, but also phylogenetic information. In general, it was observed that even with so few samples (relative to the width of the taxonomic scale) the first approach of the phylogenetic relationships among examined spider taxa, revealed the phylogeny of spiders at family level which was largely verified. Additionally, Mesothelae are the most genetically diverged spider infraorder, so they can be used as outgroups in various phylogenetic analyses of broad taxonomic scale. Also, Mygalomorphae are monophyletic as a whole infraorder, but shows paraphyletic groups at family level, suggesting the need of a full systematic revision. The observation that the Araneomorphae families of Dysderidae and Palpimanidae are connected with the Mygalomorphae, although there is not strong statistical support, can be explained by the fact that these families are isolated branches of the Araneomorphae infraorder, while the families with which they are normally connected, were absent in this study. Finally, Salticidae, a highly diversified spider family, which was represented with a lot of samples in this study, shows some paraphyletic groups at the genus level, with some genera connected to other families, with which they have not phylogenetic relationship. The results that arose with DNA barcoding method, achieved the target of creating the first 35 DNA barcodes of spiders from Greece. These will be submitted to the international databases (GenBank).

6

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.1 ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ DNA

1.1.1 Λίγα Λόγια για το DNA

Το DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) είναι ένα μακρομόριο αποτελούμενο από νουκλεοτίδια και αποτελεί το γενετικό υλικό των περισσοτέρων οργανισμών, με εξαίρεση κάποιους ιούς που έχουν ως γενετικό υλικό το RNA (RNA-ιοί). Η διαφορά μεταξύ του RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ) και του DNA είναι ότι το DNA έχει θυμίνες (T) σε αντίθεση με το RNA που έχει ουρακίλες (U) (Berg et al 2009), όπως φαίνεται στην Εικ. 1.

Εικ. 1: Συγκριτική απεικόνιση μεταξύ του RNA και του DNA.

Το DNA κωδικοποιεί τις πληροφορίες που κατευθύνουν την αύξηση, τη διαίρεση και όλες τις εσωτερικές και εξωτερικές λειτουργίες των κυττάρων. Επιπλέον αποκωδικοποιεί και εκείνες τις πληροφορίες που οδηγούν στη διαφοροποίηση των απογόνων του γονιμοποιημένου ωαρίου προς τα εκατομμύρια εξειδικευμένα κύτταρα των ανώτερων οργανισμών (Watson 2007).

7

Το γενετικό υλικό στα ευκαριωτικά κύτταρα, κατανέμεται στον πυρήνα, στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες. Με τον όρο γονιδίωμα αναφέρεται μόνο το ολικό πυρηνικό DNA, το οποίο μπορεί να υπάρχει είτε σε ένα μόνο αντίγραφο (απλοειδείς οργανισμοί), είτε να υπάρχει σε δύο αντίγραφα (διπλοειδείς οργανισμοί) (Αλεπόρου-Μαρίνου 2004). Αλλά σε οποιονδήποτε οργανισμό (μικρό ή μεγάλο), το γονιδίωμα είναι εξαιρετικά πολύπλοκο. Επιπλέον, για να περιγραφεί το μήκος ή η αλληλουχία ενός μορίου DNA χρησιμοποιούνται οι όροι αριθμός (για μονόκλωνο τμήμα) ή αλληλουχία (για δίκλωνο τμήμα) βάσεων. Στην πραγματικότητα, εννοείται ο αριθμός ή η ακολουθία των νουκλεοτιδίων, αλλά η απλούστευση αυτή γίνεται διότι μόνο η αζωτούχος βάση αλλάζει σε κάθε νουκλεοτίδιο. Έτσι για παράδειγμα, ένα τμήμα DNA λέμε ότι μπορεί να έχει μήκος 160 βάσεις ή ζεύγη βάσεων (bp: base pairs) αντίστοιχα (Αλεπόρου- Μαρίνου 2004). Όλες οι γενετικές πληροφορίες του DNA που καθορίζουν όλα τα χαρακτηριστικά ενός οργανισμού, οργανώνονται στα γονίδια. Τα γονίδια είναι τα τμήματα του DNA, στα οποία περιλαμβάνονται όλες οι πληροφορίες που καθορίζουν τη σύνθεση ενός πολυπεπτιδίου (ή και ολόκληρης της πρωτεΐνης) ή ενός μορίου RNA. Σε κάθε γονιδίωμα ενός κυττάρου υπάρχουν εκατομμύρια γονίδια. Μεταξύ των διαφορετικών ειδών, η δομή και η λειτουργία των γονιδίων δεν είναι ίδια, αλλά μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους γενικά είναι διατηρημένη, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι αυτά τα άτομα έχουν πανομοιότυπη γενετική σύσταση. Οι αλλαγές της γενετικής σύστασης είναι αποτέλεσμα διαδικασιών κατά τη διάρκεια της μείωσης ή μίτωσης των κυττάρων, δημιουργώντας μια ευρεία γενετική ποικιλότητα μέσα στο κάθε είδος. Οι φυσιολογικές διαδικασίες που δημιουργούν τη γενετική ποικιλότητα είναι η μεταλλαγή και ο ανασυνδυασμός. Επίσης, κατά τη διάρκεια της αντιγραφής μπορεί να γίνουν λάθη, τα οποία οδηγούν συνήθως σε νουκλεοτιδικές υποκαστάσεις, δηλαδή μεταβολή ενός νουκλεοτιδίου σε άλλο. Το αποτέλεσμα είναι μερικές φορές να υπάρχει αύξηση της γενετικής ποικιλότητας. Οι υποκαταστάσεις διακρίνονται στις μεταπτώσεις και τις μεταστροφές, από τις οποίες οι πρώτες είναι συχνότερες. Όταν η υποκατάσταση του νουκλεοτιδίου δεν αλλάζει το αμινοξύ που κωδικοποιεί το κωδικόνιο, τότε ονομάζεται συνώνυμη ή σιωπηλή υποκατάσταση, ενώ εάν η αλλαγή δημιουργεί ένα κωδικόνιο που κωδικοποιεί άλλο αμινοξύ τότε λέγεται μη-συνώνυμη υποκατάσταση. 8

Λάθη στην αντιγραφή του DNA αποτελούν οι προσθήκες και οι αφαιρέσεις νουκλεοτιδίων, οι οποίες πραγματοποιούνται όταν προστίθενται ή αφαιρούνται ένα ή περισσότερα νουκλεοτίδια από το μόριο του DNA αντίστοιχα. Το γενετικό υλικό μεταβιβάζεται από τους γονείς στους απογόνους με έναν γνωστό και συγκεκριμένο τρόπο, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι κάθε τμήμα του (πυρηνικό, μιτοχονδριακό, χλωροπλαστικό) κληρονομείται με ακριβώς τον ίδιο τρόπο. Άλλα τμήματα μεταφέρονται με διγονεϊκή κληρονομικότητα και άλλα με μονογονεϊκή. Παρακάτω περιγράφεται αναλυτικά το μιτοχονδριακό DNΑ, που κληρονομείται με μονογονεϊκή κληρονομικότητα.

1.1.2. Κληρονόμηση Μιτοχονδριακού DNA

Οι αμφιγονικά αναπαραγόμενοι οργανισμοί κληρονομούν το γενετικό τους υλικό με διγονεϊκή κληρονομικότητα, δηλαδή το ένα αντίγραφο του γενετικού υλικού προέρχεται από τη μητέρα και το άλλο από τον πατέρα. Όμως, ακόμα και σε αυτούς τους οργανισμούς υπάρχουν εξαιρέσεις, καθώς τμήματα του γενετικού υλικού τους κληρονομούνται από τον έναν μόνο γονέα (μονογονική κληρονόμηση), όπως για παράδειγμα το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA). Το μιτοχονδριακό DNA γενικά είναι μητρικής προελεύσεως, αλλά υπάρχουν και κάποιες εξαιρέσεις. Πιο αναλυτικά, έχουν παρατηρηθεί περιπτώσεις πατρικής κληρονόμησης σε ποντίκια (Gyllensten et al 1991), πουλιά (Kvist et al 2003) μύδια του γένους Mytilus (Zouros et al 1992), διάφορα είδη ψαριών όπως π.χ στο Alosa sapidissima και στο γαύρο (Bentzen et al 1988) και στον άνθρωπο (Schwartz and Vissing 2002). Εντούτοις, ο βαθμός της πατρικής προέλευσης του mtDNA είναι μάλλον μικρός, με εξαίρεση τα μύδια. Στα μύδια, τα θηλυκά άτομα κληρονομούν το mtDNA μόνο από τις μητέρες, ενώ τα αρσενικά και από τους δύο γονείς. Συνεπώς τα αρσενικά μύδια παρουσιάζουν το φαινόμενο της ετεροπλασμίας (περισσότεροι από ένας τύποι mtDNA).

1.1.3. Ζωικό μιτοχονδριακό DNA

Τα μιτοχόνδρια (Εικ. 2) είναι τα κυτταρικά οργανίδια παραγωγής ενέργειας, στα οποία λαμβάνουν χώρα μεταβολικές διεργασίες, όπως η διάσπαση της γλυκόζης 9

και η παραγωγή ATP μέσω της διαδικασίας της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Τα μιτοχόνδρια βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και εντοπίζονται τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα. Η παρουσία ανεξάρτητων μορίων DNA στα μιτοχόνδρια είναι αποτέλεσμα της ενδοσυμβίωσης ελεύθερων α-ροδοβακτηρίων σε αμοιβαδοειδή κύτταρα, προγονικά των σημερινών ευκαρυωτικών (Margulis 1970).

Εικ. 2: αναπαράσταση μιτοχονδρίου και του εσωτερικού του

Το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA) είναι ένα μικρό, δίκλωνο, συνήθως κυκλικό, υπερελικωµένο µόριο, με μέγεθός από 16 έως 20 χιλιάδες ζεύγη βάσεων (Brown 1983, Moritz et al. 1987), το οποίο υπάρχει σε πολλά αντίγραφα μέσα στα μιτοχόνδρια. Το mtDNA εντοπίζεται σε όλο το ζωικό βασίλειο και χαρακτηρίζεται από αξιοπρόσεχτη συντηρητικότητα ως προς το γονιδιακό του περιεχόμενο. Σε όλα τα ζώα και σε μερικά πρωτόζωα τα οποία έχουν μελετηθεί, το mtDNA περιλαμβάνει την ίδια ομάδα 37 γονιδίων: 22 γονίδια μεταφορικών RNA (tRNA), 13 πρωτεϊνικά γονίδια, 2 γονίδια ριβοσωμικών RNA (rRNA) και την περιοχή ελέγχου (D-loop) που είναι μια µη κωδική περιοχή που ελέγχει την αντιγραφή του DNA και τη μεταγραφή του RNA (Avise et al 1987) (Εικ. 3). Στο mtDNA δεν υπάρχουν ιντρόνια στα γονίδια, ενώ οι διαγονιδιακές αλληλουχίες είναι γενικά μικρές ή απούσες.

10

Εικ. 3: Απεικόνιση mtDNA και των γονιδίων που περιέχει.

Το μιτοχονδριακό DNA έχει δύο αλυσίδες: μια ελαφριά (L) και μια βαριά (H), οι οποίες διαφέρουν στο ποσοστό γουανίνης και θυµίνης (G+T) που περιέχουν. Αυτή η διαφορά προσδίδει διαφορετικές συμπεριφορές των αλυσίδων σε διαβάθμιση

πυκνότητας CsCl2 (Meyer 1993). Στο mtDNA των σπονδυλωτών, τα περισσότερα γονίδια, εκτός κάποιων εξαιρέσεων (το γονίδιο ND6 και οι 8 τύποι tRNA), κωδικοποιούνται από την H αλυσίδα. Τα μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες καθορίζονται από τις υπομονάδες ενζύμων που εμπλέκονται στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα. Τα γονίδια αυτά είναι: εφτά υπομονάδες της αφυδρογονάσης του NADH (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 και 6), μια υποµονάδα του κυτοχρώματος b, τρείς υποµονάδες της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (CO I, II, III) και δύο υποµονάδες της μιτοχονδριακής συνθετάσης του ΑTP (ATPαση 6 και 8) (Moritz et al. 1987). Όλα τα γονίδια είναι σφικτά πακεταρισμένα και η σειρά τους στο μόριο DNA είναι σταθερή σε κάθε φύλο (Wilson et al. 1985). Παρόλα αυτά, οι περισσότερες πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για τη λειτουργία των μιτοχονδρίων, κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια. Επομένως, το μιτοχόνδριο δεν λειτουργεί ανεξάρτητα από τον πυρήνα και γι’ αυτό χαρακτηρίζεται ως ημιαυτόνομο κυτταρικό οργανίδιο (Αλεπόρου-Μαρίνου 2004). Η εξάρτηση αυτή του mtDNA από το γονιδίωμα, καθώς και το γεγονός ότι τα γονιδιακά προϊόντα του 11

μιτοχονδρίου και του πυρήνα, τα οποία συνεργάζονται για να σχηματιστούν λειτουργικές πρωτεΐνες, εμφανίζουν παρόμοιο εξελικτικό ρυθμό, οδηγούν στην άποψη για τη συνεξέλιξη του γονιδιώματος και του mtDNA (Moritz et al 1987) Στο mtDNA υπάρχει μια μη κωδικοποιούσα περιοχή, η οποία έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με τον έλεγχο των διαδικασιών της αντιγραφής και της μεταγραφής. Αυτή η περιοχή στα περισσότερα είδη σπονδυλωτών εντοπίζεται ανάμεσα στα γονίδια του tRNA της προλίνης και της φαινυλανίνης και ονομάζεται περιοχή ελέγχου (control region) ή βρόγχος εκτόπισης (D-loop). Στα έντομα η περιοχή ελέγχου είναι πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη και γι’ αυτό ονομάζεται AT-rich region. Το μέγεθός της κυμαίνεται συνήθως από 100-2000bp, αν και σε ορισμένους οργανισμούς μπορεί να φθάσει στα 20kbp. Αυτή η διαφοροποίηση που παρουσιάζεται στο μέγεθος της περιοχής έλεγχου (ακόμη και μέσα στο ίδιο είδος), είναι αποτέλεσμα κυρίως της παρουσίας επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, με διαφορετικό αριθμό αντιγράφων ανάμεσα στους οργανισμούς. Αν και η περιοχή ελέγχου θεωρείται ιδιαίτερα διαφοροποιημένη, διάφορες φυλογενετικές μελέτες πάνω σε αρκετούς οργανισμούς δείχνουν ότι οι αλληλουχίες που σχετίζονται με τη ρύθμιση της αντιγραφής και της μεταγραφής, παρουσιάζουν εξελικτικό συντηρητισμό (Hoelzel 1993, Lee et al 1995 a,b). Τα γενετικά λάθη στο μιτοχονδριακό DNA είναι συνήθως απλά και αφορούν αντικαταστάσεις βάσεων και μεταλλαγές στο μήκος του μορίου, τα οποία συμβαίνουν συνήθως στις μικρές µη κωδικές περιοχές του (Brown 1985, Meyer 1993). H αντιγραφή και η μεταγραφή του μιτοχονδριακού DNA εξαρτώνται ως έναν βαθμό από παράγοντες οι οποίοι προέρχονται από τον πυρήνα. Οι δύο αυτές διαδικασίες συνδέονται μεταξύ τους, καθώς μετάγραφα DNA χρησιμεύουν ως εκκινητές για την έναρξη της σύνθεσης της αλυσίδας Η (Τaanman 1999). Η αντιγραφή του mtDNA ξεκινά με την αντιγραφή της αλυσίδας Η και έπεται η αλυσίδα L (Clayton 1991). Το σημείο έναρξης της αντιγραφής της αλυσίδας Η βρίσκεται μέσα στη D-loop (μια δομή τριπλής αλυσίδας), ενώ της αλυσίδας L εντοπίζεται έξω από την D-loop, σε μια περιοχή από όπου κωδικοποιούνται πέντε tRNAs. Η μεταγραφή, η οποία αρχίζει στον βρόγχο εκτόπισης και ολοκληρώνεται στο τέλος των ριβοσωμικών γονιδίων, γίνεται ξεχωριστά για κάθε αλυσίδα, αφού μιτοχονδριακά γονίδια εντοπίζονται και στις δύο αλυσίδες (Clayton 1991, Τaanman 1999). Οι συγκρίσεις της αμινοξικής αλληλουχίας διαφόρων μιτοχονδριακών 12

πρωτεϊνών και των κωδικονίων των αντιστοίχων γονιδίων έδειξαν ότι στα μιτοχόνδρια εμφανίζονται αποκλίσεις από το γενετικό κώδικα (Εικ. 4). Οι αποκλίσεις αυτές σχετίζονται με την παρουσία 22 μόνο tRNAs, σε αντίθεση με τα 32 που απαιτούνται για την κυτταροπλασματική πρωτεϊνοσύνθεση και αυτό διότι τα 22 tRNAs που κωδικοποιούνται στο mtDNA πιθανόν επαρκούν για τη σύνθεση των 13 μιτοχονδριακών πολυπεπτιδίων. Αυτό αιτιολογείται και με τους χαλαρότερους κανόνες σύνδεσης κωδικωνίου-αντικωδικωνίου κατά τη μιτοχονδριακή πρωτεϊνοσύνθεση.

Εικ. 4: Ο γενετικός κώδικας

Η γονιδιακή οργάνωση του μιτοχονδριακού DNA μέσα σε ένα υποφύλο, π.χ. των σπονδυλωτών, είναι σχεδόν παρόμοια. Μεγαλύτερες διαφορές παρατηρούνται όταν μελετάμε ομάδες οργανισμών με μεγάλη εξελικτική απόσταση, όπως όταν γίνεται σύγκριση της διάταξης των γονιδίων του mtDNA των νηματωδών σκωλήκων με αυτή των σπονδυλωτών (Wolstenholme 1992). Αυτές οι διαφορές χρησιμοποιούνται στη διερεύνηση των μακροεξελικτικών σχέσεων μεταξύ διαφόρων φύλων και κλάσεων (Wolstenholme 1992, Boore and Brown 1998). Παρόλο που το πυρηνικό DNA έχει μεγαλύτερο μέγεθος από το μιτοχονδριακό (16.000 – 20.000 ζεύγη βάσεων στο μιτοχονδριακό και 106 έως 109 ζεύγη βάσεων στο 13

πυρηνικό), στις περισσότερες μελέτες για τον υβριδισμό, τη βιογεωγραφία, τις φυλογενετικές σχέσεις, τη δομή πληθυσμών και τη γονιδιακή ροή έχει χρησιμοποιηθεί το μιτοχονδριακό DNA (Moritz et al. 1987, Avise 1994). Αυτό οφείλεται στο γεγονός, ότι διαθέτει διάφορα χαρακτηριστικά, τόσο από εξελικτικής όσο και από τεχνικής άποψης, που το καθιστούν εύκολο στην απομόνωση (υψηλός αριθμός αντιγράφων ανά κύτταρο) και ιδιαίτερα χρήσιμο σύστημα για την ανίχνευση γενετικών διαφορών σε διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο (απλοειδία, έλλειψη ανασυνδυασμού, γρήγορος ρυθμός μεταλλακτικότητας) (Harrison 1989, Avise 1994, Dawkins 1995, Scheffler 1999, Ballard & Whitlock, 2004). Πιο συγκεκριμένα, τα πλεονεκτήματα είναι: 1) Ο αριθμός των αντιγράφων του mtDNA στα κύτταρα είναι κατά πολύ μεγαλύτερος σε σχέση µε τα αντίγραφα του πυρηνικού DNA. 2) Το μιτοχονδριακό DNA είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένο σε σύγκριση µε το πυρηνικό (Hagelberg 1994). 3) Ο μητρικός τρόπος κληρονόμησης του mtDNA, ο οποίος υποδηλώνει ότι ένας µόνο τύπος mtDNA υπάρχει σε κάθε άτομο. Έτσι το μιτοχονδριακό DNA κάθε ατόμου (εξαίρεση πιθανές μεταλλαγές) είναι πανομοιότυπο µε το αντίστοιχο της μητέρας του (εξαίρεση ορισμένοι οργανισμοί που αναφέρθηκαν πριν). 4) Είναι απλοειδές και κατά συνέπεια δεν ανασυνδυάζεται, με αποτέλεσμα οι διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται να είναι καθαρά αποτέλεσμα μεταλλαγών και όχι ανασυνδυασµών (Hagelberg 1994, Birky 2001). 5) Έχει απλή γενετική δομή και δουλεύεται σχετικά εύκολα στο εργαστήριο. Δηλαδή το μικρό μέγεθος του mtDNA σε συνδυασμό με τη συντηρημένη οργάνωση των γονιδίων του υποδηλώνει ότι πολλά ζευγάρια γενικευμένων εκκινητών (universal primers) θα μπορούν να πολλαπλασιάσουν περιοχές του mtDNA σε ένα μεγάλο εύρος σπονδυλωτών και ασπονδύλων. 6) Διάφορα επιπρόσθετα γενετικά στοιχεία που χαρακτηρίζουν το πυρηνικό DNA, όπως τα μεταθετά στοιχεία, τα ψευδογονίδια, τα ιντρόνια και το επαναληπτικό DNA, απουσιάζουν (Avise et al. 1987). 7) Έχει γρήγορο εξελικτικό ρυθμό. Το mtDNA φαίνεται να εξελίσσεται 5-10 φορές ταχύτερα από το πυρηνικό DNA. Έχουν προταθεί διάφορες θεωρίες για να εξηγηθεί αυτό (Wilson et al. 1985, Meyer 1993). Από την άλλη, η χρήση των πυρηνικών δεικτών εμφανίζει ορισμένα μειονεκτήματα. Για παράδειγμα, οι πυρηνικοί δείκτες είναι πιο δύσκολο να 14

απομονωθούν, επειδή έχουν μικρό αριθμό αντιγράφων. Επιπλέον, η ύπαρξη διαφορετικών αλληλομόρφων στα ετεροζυγωτικά άτομα καθιστά ιδιαίτερα δύσκολο τον προσδιορισμό των αλληλουχιών του πυρήνα. Τέλος, ορισμένοι πυρηνικοί δείκτες δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επίλυση φυλογενετικών σχέσεων σε οποιοδήποτε γενετικό επίπεδο, εξαιτίας του χαμηλού ρυθμού μεταλλακτικότητάς τους (Rubinoff & Holland, 2005).

1.1.4. Μειονεκτήματα μιτοχονδριακών γενετικών δεικτών

Οι μιτοχονδριακοί γενετικοί δείκτες είναι εξαιρετικά χρήσιμοι στις μελέτες της μοριακής οικολογίας, αλλά πρέπει να δουλεύονται με προσοχή στο κάθε εργαστήριο, διότι έχουν ορισμένα μειονεκτήματα: 1) Κάθε μιτοχόνδριο συμπεριφέρεται ως μια μονάδα και το DNA του σαν ένας γενετικός τόπος. Με τα δεδομένα από ένα γενετικό τόπο μπορεί κάποιος να ιχνηλατήσει τη γενετική ιστορία αυτού μόνο του γενετικού τόπου, που μπορεί, είτε να συμφωνεί, είτε όχι, με την εξελικτική ιστορία του υπό εξέταση είδους. Στα μιτοχονδριακά DNA αυτό είναι ακόμα πιο εμφανές, διότι έχουν μειωμένο ενεργό πληθυσμιακό μέγεθος σε σχέση με το πυρηνικό DNA, με αποτέλεσμα να υπάρχει μεγαλύτερη πιθανότητα να εξαφανιστούν απλότυποι. Η εξαφάνιση απλοτύπων μπορεί να οδηγήσει τους ερευνητές σε υπεραπλούστευση της πληθυσμιακής ιστορίας ή σε υποεκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας (Ballard & Whitlock 2004). 2) Πολλές φορές, οι μιτοχονδριακοί γενετικοί δείκτες δεν αντιπροσωπεύουν ολόκληρο τον πληθυσμό. 3) Τα μιτοχονδριακά ψευδογονίδια ή numts (nuclear copies of mtDNA sequences) είναι αντίγραφα του mtDNA, τα οποία μεταφέρονται στο πυρηνικό γονιδίωμα και συνεχίζουν (ως μη λειτουργικά) να υφίστανται, ανεξάρτητα από το mtDNA. Αυτά τα γονίδια δημιουργούν πρόβλημα κατά τη διαδικασία της PCR, εάν οι θέσεις πρόσδεσης των εκκινητών έχουν συντηρηθεί και στο ψευδογονίδιο. Αν συμβαίνει αυτό, τότε κατά την PCR μπορεί να πολλαπλασιαστεί και το ψευδογονίδιο ή μόνο αυτό, αντί του επιθυμητού μιτοχονδριακού γονιδίου. Τα numts έχουν προσδιοριστεί σε περισσότερα από 80 είδη ευκαρυωτικών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων μυκήτων, φυτών, ασπόνδυλων και σπονδυλωτών (Bensasson et al. 2001). 15

4) Τα μιτοχονδριακά γονίδια δεν είναι αυστηρά ουδέτερα. Ακόμα κι αν χρησιμοποιηθεί ένας μιτοχονδριακός δείκτης, ο οποίος δεν παρέχει κάποιο επιλεκτικό πλεονέκτημα, ο δείκτης αυτός δεν θεωρείται ουδέτερος (Meiklejohn et al., 2007), για το λόγο ότι δεν υπάρχει ανασυνδυασμός στο μιτοχονδριακό DNA. Ως εκ τούτου, η επιλογή μίας συγκεκριμένης περιοχής του μορίου έχει ως αποτέλεσμα την επιλογή ολόκληρου του μορίου. 5) Τα μιτοχόνδρια, ως ημιαυτόνομα οργανίδια, διαθέτουν γονίδια που κωδικοποιούν κάποιες υπομονάδες ενζύμων, ενώ οι υπόλοιπες κωδικοποιούνται από τον πυρήνα. Έτσι, αν υπάρχει επιλογή σε ένα πυρηνικό γονίδιο που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που εισέρχεται στα μιτοχόνδρια, τότε αυτή θα επηρεάσει άμεσα και την επιλογή των μιτοχονδρίων.

1.1.5. Φυτικό μιτοχονδριακό DNA

Στα περισσότερα ανώτερα φυτά, όπως και στα ζώα, το μιτοχονδριακό DNA προέρχεται από τη μητέρα, αλλά υπάρχουν και εξαιρέσεις. Στο κοκκινόξυλο είδος Sequoia sempervirens υπάρχει πατρική κληρονόμηση, ενώ σε διάφορα είδη του γένους Pelargonium το mtDNA κληρονομείται και από τους δύο γονείς. Οι λειτουργίες των μιτοχονδρίων είναι παρόμοιες τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα, όμως η δομή τους διαφέρει. Σε αντίθεση με το ζωικό, το φυτικό mtDNA ανασυνδυάζεται (Birky 2001), με αποτέλεσμα να αλλάζει η γενετική ποικιλότητα ταχύτερα εξαιτίας των γονιδιακών διπλασιασμών και ανακατατάξεων. Ως αποτέλεσμα, το μέγεθος του φυτικού mtDNA ποικίλει εντυπωσιακά (από 40.000 έως 2.500.000bp), ενώ οι όποιες γενικεύσεις είναι δύσκολες μέχρι και αδύνατες (Palmer 1991). Αν και έχει ταχύτατο εξελικτικό ρυθμό, ο ρυθμός διαφοροποίησής του είναι μικρός, όσον αφορά στον αριθμό των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων. Στα περισσότερα φυτά ο συνολικός ρυθμός διαφοροποίησης είναι 100 φορές πιο αργός από αυτόν του ζωικού mtDNA. Συνεπώς, ο χαμηλός μεταλλακτικός ρυθμός σε συνδυασμό με τον υψηλό ρυθμό ανασυνδυασμού υποδηλώνει ότι το φυτικό mtDNA είναι ακατάλληλο για μελέτες μοριακής οικολογίας. Αν και υπάρχουν ορισμένες εφαρμογές του φυτικού mtDNA σε φυλογεωγραφικές μελέτες φυτών (Gamache et al 2003), συνηθίζεται ωστόσο περισσότερο η χρήση του χλωροπλαστικού DNA (cDNA) που

16

εμφανίζει ιδιότητες, οι οποίες διευκολύνουν την ανάδειξη μοριακών δεικτών (Wolfe et al 1987, Gielly & Taberlet 1994).

1.2 Οργανισμοί μελέτης

1.2.1. Γνωριμία με τους οργανισμούς

17

Οι οργανισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης είναι οι αράχνες, οι οποίες ανήκουν στα αρθρόποδα. Οι περισσότερες πληροφορίες που παρατίθενται, περιέχονται στη μεταφρασμένη έκδοση του βιβλίου “Ζωολογία. Ολοκληρωμένες αρχές” (Hickman et al 2002).

1.2.2. Αρθρόποδα

Εικ. 5 :Tα μη εξαφανισμένα υποφύλα των αρθροπόδων (από Hickman et al 2002). Το φύλο των αρθροπόδων ( άρθρον + πους) είναι το φύλο με την πιο πλούσια ποικιλία ειδών στο ζωικό βασίλειο, καθώς περιλαμβάνει περισσότερα από τα τρία τέταρτα όλων των γνωστών ειδών. Συγκεκριμένα καταγράφονται 3.886.620 είδη αρθροπόδων (www.boldsystems.org), δείχνοντας ότι δεν ζούμε στην εποχή των Θηλαστικών (όπως ανθρωποκεντρικά έχουμε μάθει να ονομάζουμε την εποχή μας), αλλά στην εποχή των αρθροπόδων (Εικ. 6). Επιπλέον, υπάρχει μια σημαντική καταγραφή απολιθωμάτων που φτάνει πίσω στο παρελθόν, από το τέλος του Προκαμβρίου και έπειτα.

18

Τα αρθρόποδα διαιρούνται σε πέντε διαφορετικά υποφύλα: τα Μυριάποδα (χειλόποδα, διπλόποδα, κ.λ.π.) τα Εξάποδα ή Έντομα (κολεόπτερα, ορθόπτερα, κ.λ.π.), τα Χηληκεραιωτά (αράχνες, σκορπιοί, φαλάγγια, κ.λ.π.), τα Καρκινοειδή (αστακοί, γαρίδες, ισόποδα, κ.λ.π.) (Εικ. 5) και τους εξαφανισμένους Τριλοβίτες. Αν και δεν είναι πλήρως γνωστές οι σχέσεις μεταξύ των υποφύλων, πιστεύεται ότι οι Τριλοβίτες ήταν το αρχαιότερο υποφύλο των αρθροπόδων. Σε σύγκριση με οποιοδήποτε άλλο Εικ. 6: Κόσμος των αρθροπόδων, φαίνονται όλοι οι πληθυσμοί παγκοσμίως ευκαρυωτικό φύλο, τα αρθρόποδα έχουν την πιο ευρεία κατανομή, που περιλαμβάνει πολλές περιοχές του πλανήτη (Εικ. 6). Εκτενέστερα, επιβιώνουν από τα βαθύτερα σημεία των ωκεανών έως τα ψηλά βουνά και από τις τροπικές περιοχές και τις ερήμους μέχρι και σε κάποια τμήματα των πόλων. Ακόμη, υπάρχουν είδη αρθροπόδων που ζουν πάνω και μέσα σε φυτά και άλλα ζώα και σε περιοχές, στις οποίες κανένα άλλο ζώο δεν μπορεί να επιβιώσει. Τα διαφορετικά είδη αρθροπόδων, λοιπόν, μπορούν να ζουν σε διαφορετικό περιβάλλοντα, διότι διαθέτουν ποικίλες προσαρμογές, γεγονός που εξηγεί την μεγάλη εξελικτική τους επιτυχία. Η σχέση μεταξύ των ανθρώπων και των αρθροπόδων είναι πολύπλευρη. Από τη μία, πολλά αρθρόποδα προκαλούν ζημιές σε καλλιέργειες ή μεταδίδουν πολλές σοβαρές ασθένειες. Αλλά από την άλλη, τα αρθρόποδα παίζουν κρίσιμο θετικό ρόλο στην παγκόσμια οικολογία, καθώς χρειάζονται στην επικονίαση πολλών φυτών και αποτελούν αναπόσπαστο κρίκο της τροφικής αλυσίδας. Επίσης, χρησιμεύουν ως τροφή του ανθρώπου, παρέχουν φάρμακα και παράγουν προϊόντα όπως το μετάξι, το μέλι, το κερί και διάφορες χρωστικές. Οπότε τα αρθρόποδα αν και έχουν κάποιες αρνητικές επιπτώσεις, είναι απαραίτητα για τον άνθρωπο και τόσο η προστασία όσο και η μελέτη τους είναι επιτακτική.

1.2.3. Χηληκεραιωτά

Τα Χηληκεραιωτά είναι ένα από τα πέντε υποφύλα των αρθροπόδων, οι πρόγονοι των οποίων πρωτοεμφανίστηκαν στην Προκάμβριυα περίοδο (500 εκατομμύρια χρόνια) (Meglitsch 1972), και περιλαμβάνουν τα ευρυπτερίδια, τα ξιφοσουρίδια, τις αράχνες, τους σκορπιούς, τα φαλάγγια και άλλες ομάδες ζώων. Αυτά διακρίνονται σε τρεις ομοταξίες: τα Μερόστομα, όπου ανήκουν τα Ευρυπτερίδια και 19

τα Ξιφόσουρα, με 40 είδη, τα Πυκνογονίδια ή θαλάσσιες αράχνες με 2161 είδη και τα Αραχνίδια με 192991 είδη (τα αριθμητικά στοιχεία προέρχονται από την διαδικτυακή ιστοσελίδα www.boldsystems.org).

1.2.4. Αραχνίδια

Η ομοταξία των Αραχνιδίων εμφανίζει εξαιρετικά μεγάλη διαφοροποίηση, καθώς σε αυτήν ανήκουν οι αράχνες, οι σκορπιοί, τα φαλάγγια, οι ψευδοσκορπιοί, τα ακάρεα και άλλα ζώα. Επιπλέον, ήταν από τα πρώτα αρθρόποδα που μετέβησαν σε χερσαίους βιότοπους (Decae 1984). Για παράδειγμα, οι αράχνες είχαν εμφανιστεί στην στεριά μέχρι το τέλος του Παλαιοζωικού αιώνα (Dunlop & Selden 2009). Τα Αραχνίδια εμφανίζουν τρομερή ανατομική ποικιλία, καθώς παρουσιάζουν μεταξύ τους πολλές διαφορές όσον αφορά τη μορφή και τα εξαρτήματά τους (π.χ. η μορφή και η χρήση των χηληκεραίων, ή των ποδοπροσακτρίδων ή της ύπαρξης ή όχι τέλσου κ.ά.).

1.2.5. Αράχνες

Οι αράχνες (Eικ. 7) είναι η ομάδα των αρθροπόδων, με την οποία ασχολείται η μελέτη. Αυτές υπάρχουν στη γη τουλάχιστον για 312 εκατομμύρια χρόνια (Dunlop & Selden 2009) και ήταν γνωστές σε αρχαίους πολιτισμούς, αποτελώντας αντικείμενο λατρείας σε διάφορες θρησκείες. Για παράδειγμα υπάρχουν αναφορές στην ελληνική μυθολογία, στον πολιτισμό των ινδιάνων ακόμα και στην Βίβλο και το Κοράνι. Οι αράχνες αποτελούν τη μεγαλύτερη ομάδα Αραχνιδίων, με 45.539 είδη (www.wsc.nmbe.ch) να έχουν ταυτοποιηθεί και διακρίνονται σε 2 υπερτάξεις: τα Οπισθόθηλα και τα Μεσόθηλα, με

τα πρώτα να διακρίνονται με Εικ. 7 : Παράδειγμά αράχνης (http://www.crashonline.gr/) 20

την σειρά τους σε δύο υποτάξεις: τα Αρανεόμορφα και τα Μηγαλόμορφα (Platnick & Gertsch 1976). Στην Ευρώπη υπάρχουν 61 οικογένειες, 636 γένη και 4484 είδη αραχνών, σύμφωνα με τα δεδομένα του www.araneae.unibe.ch. Στον Πιν. 1 παρατίθενται, τόσο ο συνολικός αριθμός ειδών παγκοσμίως, όσο και ο αριθμός των ειδών στα οποία έχει πραγματοποιηθεί ανάλυση του DNA Barcoding για τις 17 οικογένειες της μελέτης μας. Στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 856 είδη (Bosmans & Chatzaki 2005). Πιο πρόσφατες μελέτες ανάγουν τον αριθμό αυτό σε περισσότερα από 1200 είδη. Δεδομένου ότι στη χώρα μας δεν έχουν μελετηθεί ακόμα σε ικανοποιητικό επίπεδο, ο πραγματικός αριθμός των ειδών αναμένεται να είναι πολύ μεγαλύτερος.

Πιν. 1: Ο συνολικός αριθμός των ειδών των οικογενειών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία και ο αριθμός και το ποσοστό των ειδών των ίδιων οικογενειών, που έχουν αναλυθεί με τη μέθοδο του DNA Barcoding. Τα δεδομένα είναι από τη διαδικτυακή ιστοσελίδα www.araneae.unibe.ch και αφορούν μόνο την Ευρώπη.

Ποσοστό (%) Σύνολο των Είδη με DNA αρίθμιση Οικεγένειες των ειδών με ειδών Barcoding DNA Barcoding

1. Amaurobiidae 40 10 25.0

2. Araneidae 136 58 42.6

3. Clubionidae 50 24 48.0

4. Ctenizidae 8 0 0

21

5. Dysderidae 362 49 13.5

6. Gnaphosidae 437 92 21.1

7. Hexathelidae 2 1 50.0

8. Linyphiidae 1245 351 28.2

9. Nemesiidae 68 4 5.9

10. Oxyopidae 11 3 27.3

11. Palpimanidae 6 1 16.7

12. Philodromidae 89 27 30.3

13. Salticidae 355 97 27.3

14. Sparassidae 15 8 53.3

15. Thomisidae 197 57 28.9

16. Zodariidae 116 11 9.5

Οι αράχνες έχουν παγκόσμια εξάπλωση καταλαμβάνοντας σχεδόν όλα τα χερσαία, αλλά ακόμα και τα υδάτινα οικοσυστήματα. Παραδείγματος χάρη, το υδρόβιο είδος Argyroneta aquatica ζει κάτω από το νερό, φτιάχνοντας μια φούσκα από ιστό γεμάτη αέρα (http://animaldiversity.org/accounts/Argyroneta_aquatica/). Γενικά, τα περισσότερα είδη αραχνών είναι χερσαίοι, νυκτόβιοι, δραστήριοι οργανισμοί, οι οποίοι ζουν σε ασφαλείς τοποθεσίες (Decae). Επιπλέον, οι αράχνες παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό ενδημισμού, πάνω από 20%. Τα μεγέθη τους ξεκινούν από 1mm και φτάνουν τα 10cm, ενώ με ανοιγμένα τα πόδια μπορεί να φτάσουν και τα 30cm! Στις αράχνες υπάρχει και μια τεράστια ποικιλία χρωμάτων και σχημάτων του σώματος τους, που έχει να κάνει κυρίως με την εναρμόνισή τους με το φυσικό περιβάλλον (Roberts 1995). Το σώμα των αραχνών είναι σχετικά συμπαγές και αποτελείται από τον κεφαλοθώρακα (πρόσωμα) και την κοιλιά (οπισθόσωμα). Αυτά τα δύο μέρη δεν έχουν

22

συνήθως μεταμέρεια και ενώνονται μεταξύ τους με ένα λεπτό μίσχο. Από τον κεφαλοθώρακα συγκεκριμένα, εκφύονται όλα τα πρόσθια εξαρτήματα και βρίσκονται τα περισσότερα όργανα του ζώου. Τα θηλυκά άτομα είναι σχεδόν πάντα πολύ μεγαλύτερα από τα αρσενικά και ζουν συνήθως περισσότερο (υπάρχουν μακρόβια θηλυκά που μπορεί να ζήσουν μέχρι 10-12 χρόνια). Η πλειονότητα των ειδών ολοκληρώνουν τον κύκλο της ζωής τους μέσα σ’ ένα χρόνο και ο χρόνος αυτός εξαρτάται από το κλίμα μιας περιοχής. Ως αποτέλεσμα, πολλά είδη εμφανίζουν διαφορετικούς βιολογικούς ρυθμούς όταν βρίσκονται π.χ. στη βόρεια ή στη νότια Ευρώπη. Οι αράχνες είναι γνωστές, κυρίως, για την ικανότητα παραγωγής της λεπτής ίνας μεταξιού, που έχει πρωταρχική σημασία για τη ζωή τους. Οι ίνες μεταξιού βγαίνουν από μικρές οπές στις άκρες των δύο ή τριών ζευγών αραχνίων θηλών, ή αλλιώς κλωστριδίων, και συνδέονται με ειδικούς μεταξογόνους αδένες, που βρίσκονται στο κάτω μέρος της κοιλιάς των αραχνών. Το σκληροπρωτεϊνικής σύστασης έκκριμα βγαίνει ως υγρό από τις αράχνιες θηλές και στερεοποιείται κατά την έξοδο (με την έκθεσή του στον αέρα) σχηματίζοντας την ελαφριά, ελαστική, λεπτή και ανθεκτική ίνα του μεταξιού. Μάλιστα, αυτή η ίνα είναι πιο ανθεκτική από ατσάλινες ίνες ίδιας διαμέτρου και υπολείπεται σε αντοχή μόνο εκείνων του συντηγμένου χαλαζία. Από τις ίνες μεταξιού, πολλά είδη αραχνών υφαίνουν ιστούς, η μορφή των οποίων ποικίλει ανάλογα με το είδος. Οι αράχνες δεν χρησιμοποιούν τις ίνες μεταξιού μόνο για την κατασκευή ιστού. Πιο αναλυτικά, με τις ίνες μεταξιού επενδύουν εσωτερικά τη φωλιά τους, σύρουν τη λεία τους, κατασκευάζουν δίχτυα για την αποθήκευση του σπέρματος, σάκους για τα αυγά τους, γέφυρες, προειδοποιητικά νήματα, νήματα έκδυσης, δίσκους προσκόλλησης και δίχτυα για την φροντίδα των νεαρών τους, καλύπτουν τη λεία τους ή τις χρησιμοποιούν για την μετακίνησή τους σε μακρινές αποστάσεις. Επιπλέον δεν κατασκευάζουν όλες οι αράχνες ιστούς παγίδευσης της λείας, όπως οι αράχνες-λύκοι (Lycosidae) και οι αλματικές αράχνες (Salticidae), που απλώς κυνηγούν και συλλαμβάνουν τη τροφή τους. Οι αράχνες είναι θηρευτές και τρέφονται κυρίως με έντομα, τα οποία σκοτώνουν με το δηλητήριο που παράγουν. Τα θηράματά τους πιάνονται από τις αράχνες είτε κυνηγώντας τα ενεργητικά, είτε στηνοντάς τους ενέδρα, είτε παγιδευοντάς τα στους ιστούς που φτιάχνουν. Λόγω του ότι είναι θηρευτές, η θέση των αραχνών στα οικοσυστήματα είναι σημαντική, διότι ελέγχουν τον πληθυσμό των θηραμάτων τους 23

και η έλλειψή τους δίνει τη δυνατότητα για συλλογή αξιόλογων συμπερασμάτων ως προς τις διαταραχές που μπορεί να έχει υποστεί ένας βιότοπος. Πάντως, αν και θηρευτές, είναι αξιοπερίεργο ότι οι αράχνες έχουν δημιουργήσει τόσο μεγάλο φόβο στους ανθρώπους, γιατί είναι μικρά, δειλά και αδύναμα ζώα για αυτούς. Μάλιστα, αντί για επικίνδυνους εχθρούς, μάλλον αποτελούν συμμάχους του ανθρώπου στον αγώνα κατά των βλαβερών εντόμων και των άλλων αρθροπόδων. Επιπλέον, το δηλητήριο, που παράγουν οι αράχνες για τη θανάτωση της λείας τους, είναι συνήθως ακίνδυνο για τον άνθρωπο και το χρησιμοποιούν όταν απειλούνται ή προστατεύουν τα αυγά και τα μικρά τους. Εξαίρεση αποτελούν κάποια είδη αραχνών στην Αυστραλία και στην Β. και Ν. Αμερική, που το δηλητήριο τους μπορεί να επιφέρει σοβαρά προβλήματα, μέχρι και θάνατο. Τέτοια παραδείγματα είναι η μαύρη χήρα (Latrodectus) και ο καστανός ερημίτης (Loxosceles).

1.2.6. Λίγα λόγια για τις Οικογένειες Αραχνών της μελέτης

Οι περισσότερες πληροφορίες, που παρατίθενται σε αυτό το υποκεφάλαιο, προέρχονται από τo βιβλίο SPIDERS Of Britain & Northern Europe του Michael J. Roberts (1995). Ο συνολικός αριθμός όλων των οικογενειών των αραχνών παγκοσμίως είναι 110 (Nentwig 2013), αλλά από αυτές μόλις 17 οικογένειες χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη. Στην Εικ. 8 παρουσιάζεται ένα φυλογενετικό κλαδόγραμμα (Nentwig 2013) για το σύνολο των οικογενειών των αραχνών, το οποίο συνδυάζει τις πιο εμπεριστατωμένες μελέτες για τις φυλογενετικές σχέσεις των αραχνών. Επιπλέον, για τις οικογένειες των αραχνών αυτής της μελέτης παρατίθενται κάποιες επιπρόσθετες πληροφορίες.

24

25

26

27

Εικ. 8: Το φυλογενετικό κλαδόγραμμα (Nentwig 2013). Μέσα σε πλαίσιο βρίσκονται οι οικογένειες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη.

Οπισθόθηλα

Τα Οπισθόθηλα είναι η μεγαλύτερη υπέρταξη αραχνών, η οποία διακρίνεται στις δύο υποτάξεις Αρανεόμορφα και Μυγαλόμορφα (Platnick & Gertsch 1976).

Αρανεόμορφα

Τα Αρανεόμορφα ή Λαβιδόγναθα είναι υποτάξη των αραχνών, που έχουν χηληκεραίες, οι οποίες κινούνται μέσα-έξω (λειτουργούν σαν τανάλια). Σε αυτήν την υπόταξη ανήκουν οι περισσότερες οικογένειες της παρούσας μελέτης (13 οικογένειες).

Amaurobiidae

Την οικογένεια των Amaurobiidae αποτελούν αράχνες μεγέθους 4 με 15mm, που ανήκουν στις Cribellate αράχνες (περιέχουν cribellum και calamistrum, δύο όργανα παραγωγής και ύφανσης μεταξιού αντίστοιχα). Ζουν σε σωληνωτά καταφύγια μέσα σε τρύπες τοίχων και φλοιών δέντρων, καθώς και κάτω από πέτρες, κούτσουρα και σκουπίδια. Στην είσοδο των καταφυγίων τους σχηματίζουν ένα ανοιχτό μπλε, μεταξωτό ιστό, για να προστατεύονται από θηρευτές και να συλλαμβάνουν την τροφή τους.

Araneidae

Τα Araneidae αποτελούν αράχνες που τα πόδια τους είναι γεμάτα με πολλά αγκάθια και οι χηληκεραίες έχουν ένα εξωτερικό κόνδυλο και πολλά εσωτερικά δυνατά δόντια. Αυτές οι αράχνες είναι γνωστές για τους ιστούς τους. Συγκεκριμένα, τα Araneidae υφαίνουν ιστούς που μοιάζουν με στόχο σκοποβολής (γεωμετρικοί ιστοί- orb webs, Εικ. 9), στους οποίους ο ομφαλός (το κέντρο του ιστού) έχει ένα πλέγμα νημάτων, αντί για μια τρύπα. Σε αυτούς τους ιστούς υπάρχει συχνά μια γραμμή νήματος, που οδηγεί μακριά από τον ομφαλό, όταν η αράχνη θέλει να απομακρυνθεί

28

σε κάποιο φυτό ή αλλού. Εκεί η αράχνη περιμένει μέχρι να νιώσει τις δονήσεις από ένα παγιδευμένο θήραμα και τότε ορμά κατά πάνω του.

Εικ. 9: Γεωμετρικός ιστός (orb web)..

Clubionidae

Οι αράχνες της οικογένειας Clubionidae είναι από τις πιο πολυπληθείς και πιο ευρέως εξαπλωμένες αράχνες παγκοσμίως. Αποτελούν νυκτόβια ζώα, τα οποία έχουν την ικανότητα να πηδάνε και ξοδεύουν τις πρωινές ώρες στη μεταξένια φωλιά τους, που βρίσκεται κάτω από πέτρες ή φλοιούς δέντρων ή μέσα στην βλάστηση. Κάποια από τα Clubionidae εμφανίζονται σε αρκετά υγρά περιβάλλοντα στο επίπεδο του εδάφους και άλλα πιο ψηλά πάνω σε θάμνους και δέντρα. Κύριο χαρακτηριστικό των Clubionidae είναι το κάτω χείλος τους, που είναι αισθητά μακρύ, και το μπροστινό τμήμα του κεφαλοθώρακα, που είναι εκτενές. Αν και τα Clubionidae μοιάζουν αρκετά με τα Gnaphosidae, εντούτοις στα Clubionidae, τα οπίσθια μάτια είναι κυκλικά και σε μεγαλύτερη απόσταση μεταξύ τους, ενώ οι αράχνιες θηλές είναι πάντα στενά τοποθετημένες και μικρότερες σε σχέση με αυτές που παρατηρούνται στις περισσότερες οικογένειες.

29

Dysderidae

Η οικογένεια των Dysderidae είναι αράχνες με έξι μάτια, που είναι τοποθετημένα σε σχηματισμό κύκλου, και στην κοιλιακή χώρα τους δεν υπάρχουν χαρακτηριστικά σχήματα. Αυτές κυνηγούν τις βραδινές ώρες ισόποδα, τα οποία οι άλλες αράχνες είτε δεν τρώνε, είτε δεν μπορούν να πιάσουν. Αντίθετα, το πρωί μένουν στις φωλιές τους.

Gnaphosidae

Οι αράχνες της οικογένειας Gnaphosidae κυνηγούν συνήθως το βράδυ, με κάποιες εξαιρέσεις όπως τα μέλη του γένους Micaria, που κυνηγούν τις πρωινές ώρες. Τα περισσότερα Gnaphosidae είναι γκρι-καφέ ή κατάμαυρες αράχνες, χωρίς σχηματισμούς στην κοιλία τους, και έχουν κυλινδρικές κλωστρίδες (εξαίρεση τα Micaria). Επίσης, στα πιο πολλά είδη (εξαίρεση τα Scotophaeus και μερικά Zelotes) τα οπίσθια μεσαία μάτια έχουν οβάλ ή ακανόνιστο σχήμα ή μοιάζουν με σχισμή.

Linyphiidae

Η οικογένεια των Linyphiidae είναι μια από τις πολυπληθέστερες οικογένειες αραχνών σε αριθμό ειδών παγκοσμίως. Το μεγαλύτερο ποσοστό αυτών των αραχνών έχουν γκρι ή μαύρη κοιλιά, χωρίς κάποιο σχήμα και είναι γνωστές με το όνομα ‘money spiders’. Όλες οι άλλες Linyphiidae έχουν στην κοιλιακή χώρα χαρακτηριστικές γραμμές και σχήματα και ονομάζονται linen weavers. Αυτές οι αράχνες συνήθως, είναι μεγαλύτερες από τις money spiders. Παλιότερα, η οικογένεια των Linyphiidae διακρινόταν σε δύο υποοικογένειες, τα Linyphiinae και τα Erigoniinae. Σήμερα όμως αυτή η διάκριση δεν αναγνωρίζεται, διότι έχει αποδειχθεί ότι δεν υπάρχει φυλογενετικό υπόβαθρο για μια τέτοια διαίρεση μέσα στην οικογένεια των Linyphiidae. Τα Linyphiidae υφαίνουν ιστούς που μοιάζουν με σεντόνι (sheet webs, Εικ. 10) σχηματίζοντας μια υπερδομή από κάθετα και σταυρωτά νήματα. Συγκεκριμένα, κάποια 30

είδη υφαίνουν μεγάλους ιστούς, ενίοτε θολωτούς, άλλα φτιάχνουν πολύ μικρούς ιστούς και κάποια δεν φτιάχνουν καθόλου. Πάνω στους ιστούς, οι αράχνες ανεβοκατεβαίνουν και πιάνουν όλα τα παγιδευμένα έντομα. Κάποια είδη βρίσκονται στο έδαφος και άλλα πάνω σε φυτά ή γύρω από τα σπίτια.

Εικ. 10: Ιστός σεντόνι (sheet web).

Oxyopidae

Οι αράχνες της οικογένειας Oxyopidae είναι ημερήσιοι κυνηγοί, οι οποίοι τρέχουν πολύ γρήγορα σε χαμηλή βλάστηση, ώστε να πιάσουν το θήραμά τους. Επίσης, έχουν την ικανότητα να κάνουνε άλματα, είτε για να αποφύγουν την αιχμαλωσία, είτε για να μετακινηθούν από το ένα φύλλο στο άλλο, είτε για να πιάσουν την τροφή τους. Χάρη στις δύο αυτές ικανότητές τους, τα Oxyopidae ονομάζονται αλλιώς και lynx spiders (αράχνες λίγκας). Αυτές οι αράχνες διαθέτουν μια από τις πιο ακριβείς οράσεις μεταξύ όλων των αραχνών και στα μακριά πόδια τους υπάρχουν μακριά αγκάθια.

Palpimanidae

Τα Palpimanidae είναι μια μικρή πληθυσμιακά οικογένεια αραχνών, που φτιάχνουν ecribellate μεταξένιους ιστούς (Griswold et. al. 1999). Ζουν κυρίως στο επίπεδο του εδάφους και δραστηριοποιούνται το βράδυ. Τα Palpimanidae, για να πιάσουν το θήραμά τους, περπατούν πολύ αργά, τραβώντας τον εαυτό τους με τα

31

μπροστινά πόδια τους, και όταν το θήραμα είναι στο πεδίο βολής τους, ορμάνε κατά πάνω του. Τα μέλη των Palpimanidae έχουν σκούρο καφετί ή κοκκινωπό χρώμα σώματος και χαρακτηρίζονται από τις μεγάλες προδοπροσακτρίδες τους και τα δυσανάλογα δυνατό και σκληρό πρώτο ζεύγος μπροστινών ποδιών τους. Σε γενικές γραμμές, τα είδη σε αυτήν την οικογένεια είναι ευρέως κατανεμημένα σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές του κόσμου (εκτός από την Αυστραλία) και παρουσιάζουν υψηλό βαθμό ενδημισμού (Dippenaar-Schoeman 2014). Στη χώρα μας αντιθέτως, υπάρχει μόνο ένα είδος (το Palpimanus gibbulus) που κατανέμεται σε ολόκληρη την επικράτεια (Bosmans & Chatzaki 2005).

Philodromidae

Οι αράχνες της οικογένειας Philodromidae μοιάζουν με τις αράχνες της οικογένειας Thomisidae και παλιότερα, οι επιστήμονες τις κατέτασσαν στην ίδια οικογένεια. Αυτή ήταν τα Thomisidae, τα οποία διακρίνονταν σε δύο υποοικογένειες, τα Philodrominae και τα Misumeninae (σημερινά Thomisidae). Σήμερα όμως γενετικά δεδομένα διαφόρων εργασιών (Benjamin et al 2008, Nandkishor et al 2014) δείχνουν ότι αυτές οι δύο οικογένειες είναι ξεκάθαρα διακριτές μεταξύ τους. Τα Philodromidae έχουν γενετική ποικιλία και τα γένη παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία στην γενική εμφάνιση τους. Αυτές οι αράχνες αναφέρονται στην βιβλιογραφία και ως running crab spiders για δύο λόγους. Πρώτον, τα Philodromidae μοιάζουν με καβούρια, αλλά όχι όσο τα Thomisidae, επειδή τα πρόσθια ζεύγη ποδιών τους είναι σπανίως πιο μεγάλα από τα οπίσθια ζεύγη ποδιών. Δεύτερον, κυνηγάνε πιο ενεργητικά από τα Thomisidae. Οι αράχνες και των δύο οικογενειών μπορούν και καμουφλάρουν με εξαιρετική επιτυχία τον εαυτό τους μέσα στην γύρω φύση. Αλλά, ενώ τα Thomisidae περιμένουν υπομονετικά να αρπάξουν το θήραμα τους, τα Philodromidae, εκτός από αυτό, μπορούν να κυνηγήσουν τρέχοντας πολύ γρήγορα το θήραμά τους. Επιπλέον, τα Philodromidae έχουν δηλητήριο, το οποίο είναι πολύ τοξικό για έντομα όπως οι αγριομέλισσες, οι οποίες είναι πιο μεγάλες από τις αράχνες αυτές. Έτσι, όταν το θήραμα πλησιάσει, αυτές ανοίγουν τα μπροστινά τους πόδια, αρπάζουν το θήραμά τους και το σκοτώνουν με το δηλητήριο που τους διοχετεύουν.

32

Salticidae

Τα Salticidae ή jumping spiders (οι αράχνες που κάνουν άλμα) είναι πολύ ενεργητικά ζώα, τα οποία ζούνε κυρίως σε ζεστές περιοχές του πλανήτη. Η κύρια ικανότητα τους είναι ότι μπορούνε να πηδάνε, είτε για να πιάσουν το θήραμα τους είτε για να ξεφύγουν. Για τα άλματά τους χρησιμοποιούν το τρίτο ή τέταρτο ζεύγος ποδιών και ένα μεταξωτό νήμα, ως υπόστρωμα για να εκτοξεύονται. Τα Salticidae έχουν την ακριβέστερη όραση μεταξύ όλων των αραχνών και αυτό τα βοηθάει στο κυνήγι. Συγκεκριμένα, με την βοήθεια της όρασης τους, καταδιώκουν το θήραμα και τελικά πηδάνε, ώστε να το πιάσουν. Αυτές οι αράχνες διαθέτουν οκτώ μάτια και πολλά είδη τους εμφανίζουν εντυπωσιακά και χαρακτηριστικά χρώματα και σχήματα στη ράχη τους.

Sparassidae

Τα Sparassidae (πρώην Heteropodidae) είναι μια οικογένεια αραχνών, η οποία είναι γνωστή ως huntsman spiders, λόγω της ταχύτητας και του τρόπου με τον οποίον κυνηγούν, ενώ υπάρχουν και διάφορες άλλες ονομασίες σε διάφορα μέρη του κόσμου που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό αυτό (Larsen 2010). Τα περισσότερα είδη Sparassidae εμφανίζονται σε περιοχές του πλανήτη με υψηλές θερμοκρασίες, μεταξύ των οποίων είναι η λεκάνη της Μεσογείου (Isbister & Hirst 2003). Τα Sparassidae ζουν κάτω από πέτρες, το φλοιό δέντρων, σπίτια και άλλα παρόμοια καταφύγια. Επιπρόσθετα δεν φτιάχνουν ιστούς, αλλά κυνηγούν την τροφή τους, ταξιδεύουν πολύ γρήγορα, κάνοντας άλματα και τρέχοντας, και προσκολλώνται στις επιφάνειες που περπατάνε, κάτι που τα βοηθάει και στο κυνήγι αλλά και στην άμυνά τους (Filmer 1997). Λόγω του μεγέθους τους, τα μεγάλα είδη των Sparassidae δεν ξεχωρίζουν εύκολα από τις ταραντούλες στο μάτι του μη ειδικού. Κύριο χαρακτηριστικό των αραχνών αυτής της οικογενείας είναι το τριχωτό σώμα τους με τις δυσδιάκριτες αποχρώσεις του καφέ ή γκρι χρώματος (Filmer 1997). Τα Sparassidae χρησιμοποιούν δηλητήριο για να ακινητοποιήσουν τη λεία και να βοηθηθούν την πέψη τους. Είναι γνωστό ότι προκαλούν αμυντικά τσιμπήματα, αλλά δεν θεωρούνται επικίνδυνες για 33

τους ανθρώπους (Skaife S.H. 1963). Αντίθετα είναι ευεργετικές, επειδή τρέφονται με βλαβερά έντομα, όπως οι κατσαρίδες.

Thomisidae

Τα Thomisidae (παλιά υποοικογένεια Misumeninae, δες Philodromidae) ή crab spiders, γιατί μοιάζουν με καβούρια, αποτελούν την οικογένεια με τα περισσότερα δείγματα στην παρούσα εργασία. Τα Thomisidae έχουν γενετική ποικιλομορφία και τα γένη παρουσιάζουν πολλές διαφορές στη γενική εμφάνιση μεταξύ τους. Αυτές οι αράχνες στήνουν ενέδρα στα θηράματά τους και παρόλο που τα χρώματα του σώματός τους είναι συχνά έντονα, καταφέρνουν να καλύπτονται εξαιρετικά από το γύρω φυσικό περιβάλλον τους. Σε αυτό τους βοηθάει η τεράστια ποικιλία σε χρώματα και σχήματα και η προσαρμοστικότητά τους. Τα πρόσθια ζεύγη ποδιών είναι αισθητά πιο μεγάλα από τα οπίσθια ζεύγη ποδιών, έτσι μπορούνε να περπατάνε πλευρικά και προς τις δύο κατευθύνσεις. Τα Thomisidae δεν παράγουν ιστό για να πιάσουν τα θηράματά τους, αλλά τις περισσότερες φορές στέκονται ακίνητα, χρησιμοποιώντας τα δύο πρόσθια ζεύγη ποδιών, και όταν το θήραμα πλησιάσει αρκετά, το αρπάζουν.

Zodariidae

Τα Zodariidae είναι εδαφικές αράχνες που κινούνται γρήγορα και τρέφονται αποκλειστικά με μυρμήγκια. Η ραχιαία πλευρά της κοιλιάς των Zodariidae είναι σκουρόχρωμη, σε αντίθεση με την κοιλιακή πλευρά, που είναι ανοιχτόχρωμη. Αυτός ο χρωματισμός, σε συνδυασμό με το φως που ανακλάται από την άνω πλευρά, δίνει σε αυτές ένα είδος καμουφλάζ. Τα Zodariidae μοιάζουν πολύ στην εξωτερική τους εμφάνιση, όπως και στα γενετικά τους όργανα, γι’ αυτό υπάρχει μια σημαντική σύγχυση σχετικά με τις ονομασίες και τη διάκριση τους.

Μυγαλόμορφα

Τα Μυγαλόμορφα ή Ορθόγναθα είναι μια σημαντική υποτάξη των αραχνών που ζουν για μεγάλο χρονικό διάστημα σε σχέση κυρίως με τα Αρανεόμορφα (Raven 1988, Platnick 2000). Αυτά διαβιούν συνήθως σε μεσογειακές και τροπικές περιοχές 34

του πλανήτη. Σε πολλά οικοσυστήματα είναι οι κυρίαρχοι θηρευτές αρθροπόδων, ενώ έχει παρατηρηθεί ότι κυνηγούν και άλλες ζωικές ομάδες, όπως μικρά θηλαστικά (Raven 2010). Τα Μυγαλόμορφα έχουν διατηρήσει προγονικά χαρακτηριστικά, όπως τον τρόπο ζωής και διάφορα μορφολογικά χαρακτηριστικά (http://www.arachne.org.au/01_cms/details.asp?ID=2343, Raven 1988, Platnick 2000). Κύριο χαρακτηριστικό τους είναι οι μεγάλες και προς τα εμπρός εκβαλλόμενες (από τον κεφαλοθώρακα) χηληκεραίες, οι οποίες κινούνται στο κατακόρυφο επίπεδο (πάνω-κάτω). Τα Μυγαλόμορφα έχουν την κοινή ονομασία ταραντούλες. Από τις οικογένειες της παρούσας μελέτης, τρεις ανήκουν σε αυτήν την υπόταξη:

Ctenizidae

Οι αράχνες της οικογένειας Ctenizidae αποτελούν μια ανομοιογενή ομάδα αραχνών (Raven 1985, Goloboff 1993) με συνήθως μαύρο χρώμα σώματος, οι οποίες ζουν πολλά χρόνια και είναι απομονωμένες μεταξύ τους. Για παράδειγμα στην Μεσόγειο υπάρχουν μόνο τρία γνωστά γένη: τα Ummidia, Cteniza και Cyrtocarenum, εκ των οποίων το τρίτο απαντάται στην περιοχή του Αιγαίου (Decae 2008). Οι αράχνες αυτές ανήκουν στις Trap-door spiders. Οι Trap-door spiders, με τις τεράστιες χηληκεραίες τους, σκάβουν τρύπες στο έδαφος, όπου ζουν τον περισσότερο χρόνο τους, και καλύπτουν τις φωλιές τους με ένα καπάκι που φτιάχνουν από χώμα και νήμα και το οποίο δεν διακρίνεται από το υπόλοιπο υπόστρωμα, προσφέροντας ένα τέλειο καμουφλάζ. Τα Ctenizidae δεν ζουν πάντα κάτω από το έδαφος, αλλά περνούν χρόνο και στην επιφάνεια του, π.χ. για να κυνηγήσουν. Με τα μπροστινά κοντόχοντρα πόδια και τις ποδοπροσακτρίδες τους, τα Ctenizidae συλλαμβάνουν το θήραμα και εν συνεχεία με τις χηληκεραίες τους το συνθλίβουν (Coyle 1981). Η μελέτη και η ανεύρεση των Ctenizidae είναι δύσκολη, και χρειάζεται εμπειρία πεδίου (Moggridge 1873, 1874).

Nemesiidae

Η οικογένεια Nemesiidae είναι μια εξαπλωμένη και πολυποίκιλη οικογένεια αραχνών παγκοσμίως και περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά είδη (Platnick 2003). Τα Nemesiidae έχουν μέγεθος από 9mm έως 31mm και ανήκουν στις Trap-door spiders, 35

δηλαδή ζουν κάτω από το έδαφος και φτιάχνουν τις φωλιές τους σκάβοντας λαγούμια. Επιπλέον, στις φωλιές τους βάζουν ‘πόρτες’, που τους παρέχουν κάλυψη και προστασία (Decae 2005). Ο όρος Trap-door spiders, αναφέρεται και στο γεγονός, ότι αυτές οι αράχνες περνούν ένα σημαντικό διάστημα της ζωής τους στην επιφάνεια του εδάφους, κυρίως για να κυνηγήσουν. Τα Nemesiidae ξεχωρίζουν από τις άλλες Trap- door spiders, επειδή έχουν θαμπό καφετί χρώμα και αιχμηρά άκρα στις χηληκεραίες τους. Η μελέτη και η ταξινομική αναγνώριση των Nemesiidae είναι δύσκολη, και η συλλογή τους απαιτεί εμπειρία πεδίου (Thorell 1870, Moggridge 1873, 1874).

Hexathelidae

Τα Hexathelidae έχουν μέγεθος από 1cm έως 5cm, είναι νυκτόβια ζώα και συνήθως ζουν σε λαγούμια, τα οποία κατασκευάζουν είτε στο έδαφος είτε σε κοιλότητες δέντρων (Gray 1987). Σε αντίθεση με τα περισσότερα Μυγαλόμορφα, φτιάχνουν ιστούς, συνήθως σε ψηλά σημεία όπως δέντρα και σπίτια, σε σχήμα χωνιού (funnel-web, Εικ. 11), για να πιάνουν τα θηράματα τους (Gray 1987). Τα Hexathelidae αποτελούν σκουρόχρωμες αράχνες (μαύρες ή καφέ) με ένα γυαλιστερό κέλυφος, που καλύπτει το μπροστινό μέρος του σώματος τους. Στην Ευρώπη υπάρχει μόνο ένα γένος Hexathelidae, το Macrothele, το οποίο δεν είναι γνωστό αν είναι αυτόχθον ή ενδημικό που έχει φτάσει στην Ευρώπη από τον άνθρωπο. Στη δεύτερη περίπτωση απαιτούνται περαιτέρω έρευνες, για να διευκρινιστεί αν οι πιο κοντινοί συγγενείς του Macrothele είναι τα ασιατικά ή τα αφρικανικά Hexathelidae (Arnedo & Ferràndez 2007).

36

Εικ 11: Ιστός χωνί (funnel-web)

Μεσόθηλα

Τα Μεσόθηλα αποτελούν κυρίως μια αρχαία υπερτάξη αραχνών, που περιλαμβάνει μόλις μια οικογένεια ζώντων αραχνών, τα Liphistiidae (Platnick & Gertsch 1976).

Liphistiidae

Η οικογένεια Liphistiidae περιλαμβάνει 8 γένη και 91 είδη αραχνών από τη Νοτιοανατολική Ασία, την Κίνα και την Ιαπωνία (Xu, X. et al. 2015). Τα Liphistiidae ζουν πολλά χρόνια και είναι δραστήρια τη νύχτα (Coddington & Levi 1991). Συνήθως, μια από αυτές τις αράχνες χρησιμοποιείται ως ρίζα στα φυλογενετικά δέντρα των αραχνών, επειδή είναι τα μοναδικά Μεσόθηλα και διαφέρουν πολύ σε γενετικό επίπεδο από όλες τις άλλες οικογένειες αραχνών, που βρίσκονται εν ζωή (Goloboff 1993). Κύριο χαρακτηριστικό τους, όπως και στα Μυγαλόμορφα, αποτελούν οι πελώριες και προς τα εμπρός εκβαλλόμενες χηληκεραίες, οι οποίες κινούνται στο κατακόρυφο επίπεδο (πάνω-κάτω). Επιπλέον, τα Liphistiidae έχουν φαινομενικά μια τμηματοποιημένη κοιλιά, που αποτελεί απομεινάρι της μεταμέρειας που εμφανίζουν άλλα Αραχνίδια (Coddington & Levi 1991). Τα περισσότερα Liphistiidae δημιουργούν καταφύγια σκάβοντας λαγούμια στο έδαφος (Decae), και κάποια σκάβοντας τρύπες 37

στους τοίχους σπηλαίων, αλλά και οι δύο ομάδες καλύπτουν την είσοδο της φωλιάς τους με ιστό (Murphy F. & Murphy J. 2000, Haupt 2004).

1.3 DNA Barcoding στις αράχνες

38

1.3.1 Γενικά

Τα περισσότερα στοιχεία που δίνονται σε αυτό το υποκεφάλαιο προέρχονται από το διαδικτυακό τόπο www.araneae.unibe.ch Το DNA barcoding είναι μια σχετικά νέα πρακτική μέθοδος που εμφανίστηκε το 2003, στην οποία χρησιμοποιείται συνήθως ένα τμήμα (650 έως 700 bp) από το πρώτο ήμισυ του μιτοχονδριακού γονιδίου οξειδάση του κυτοχρώματος c υπομονάδα Ι (COI) ως εργαλείο διάγνωσης και ταυτοποίησης των ειδών, καθώς και της γενετικής και ταξινομικής ποικιλότητας κυρίως στο ζωικό βασίλειο (Hebert et al. 2003, Barrett & Hebert 2005, Waugh 2007, Hebert et al. 2010, Savolainen et al. 2005, www.araneae.unibe.ch). Δηλαδή, με το DNA barcoding επικεντρώνονται οι προσπάθειες των μοριακών ταξινομιστών σε ένα μόνο τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, το οποίο επιλέχθηκε, επειδή παρουσιάζει διατηρημένες περιοχές σε όλα τα είδη και είναι κατάλληλο για το σχεδιασμό εκκινητών, ενώ συμπεριλαμβάνει και πολυμορφισμούς μεταξύ και εντός των ειδών (Hebert et al. 2003). Το DNA barcoding δεν χρησιμοποιείται μόνο για τα ζώα, αλλά και για άλλους οργανισμούς, όπως τα φυτά, τα πρωτόζωα και τους μύκητες (www.boldsystems.org). Η ευρεία χρήση του DNA barcoding σε μελέτες (Lambert 2005, Hajibabaei et al. 2006, Clare et al. 2007, Dawnay et al. 2007, Hajibabaei et al. 2007, Borisenko et al. 2008, Ward et al. 2009, Shokralla et al. 2010, Bucklin et al. 2011, Hausmann et al. 2011, Nagy et al 2013) δείχνει την αναγνώρισή του ως ένα πολλά υποσχόμενο μοριακό εργαλείο στην ταξινόμηση των ειδών. Ακόμη, το DNA barcoding έχει τεράστιες δυνατότητες τόσο για την εκτίμηση και παρακολούθηση της βιοποικιλότητας (Plaisance et al. 2009, Naro-Maciel et al. 2009, Grant et al. 2011) όσο και στο πλαίσιο της βιολογικής διατήρησης (Neigel et al. 2007, Rubinoff 2006, Dalton and Kotze 2011), διαχείρισης νέων ειδών (Laiou 2013) και μελέτης ειδών με ιατρική σημασία. Τέλος, το DNA barcoding μπορεί να βρει εφαρμογή και σε εφαρμοσμένους κλάδους, όπως στην αλιεία (DeSalle and Birstein 1996, Marko et al. 2004, Jacquet and Pauly 2008, Wong and Hanner 2008, Ardura et al. 2010b, Ardura et al. 2010c, Barbuto et al. 2010, Filonzi et al. 2010, Miller and Mariani 2010, Garcia-Vazquez et al. 2011, Ardura et al. 2013). Παρόλα αυτά το DNA barcoding δεν είναι πανάκεια για όλα τα ταξινομικά προβλήματα, καθώς δεν λαμβάνει υπόψη του το κεντρικό ταξινομικό ερώτημα ‘‘σε 39

ποιό είδος πραγματικά ανήκει ο υπό μελέτη οργανισμός;’’(Nagy et al 2013). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το DNA barcoding συγκρίνει απλώς τη μοριακή ποικιλομορφία των υπό εξέταση ατόμων, δίνοντας μια γενική συγκριτική εικόνα και χωρίς να λαμβάνει υπόψη του άλλους παράγοντες (π.χ. την κλασική ταξινόμηση ή τη γεωγραφική κατανομή). Επιπλέον, το DNA barcoding έχει ορισμένους εγγενείς περιορισμούς (Valentini et al. 2009). Αρχικά, το DNA barcoding βασίζεται σε ένα μόνο γενετικό τόπο, το COI, από ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα. Αυτό έγινε για να διευκολύνονται οι μελέτες, καθώς κληρονομείται μόνο από τον ένα γονέα (τη μητέρα) (Hartl & Clark 2007), μπορεί να δείχνει ετεροπλασμίες (Kmiec et al. 2006, Vollmer et al. 2011) και τέλος μπορεί να υπάρχει και σε πυρηνικά αντίγραφα. Ωστόσο, η εξέλιξη των γονιδίων δεν ταυτίζεται απαραίτητα με την εξέλιξη των υπό μελέτη ειδών (Nichols, 2001). Αυτό συμβαίνει, διότι όταν βασιζόμαστε σε ένα γονίδιο, ουσιαστικά στις μετέπειτα αναλύσεις αποτυπώνεται η εξελικτική πορεία αυτού του γονιδίου. Συνεπώς, αν χρησιμοποιήσουμε διαφορετικά γονίδια, από την ανάλυση του κάθε γονιδίου μπορεί να προκύψει ένα διαφορετικό αποτέλεσμα. Για να αποτυπωθεί λοιπόν, η πραγματική εξελικτική ιστορία των ειδών, πρέπει να περιλαμβάνονται διάφορα γονίδια (Maddison 1997). Αν και για τη χρήση του COI έχει καλά εκτιμηθεί αυτός ο περιορισμός (Ballard & Whitlock 2004, Toews & Brelsford 2012) και δεν αποτελεί τόσο πρόβλημα, υπάρχουν μελέτες που δεν στηρίζουν την επιλογή του COI, αλλά προβάλλουν την υπεροχή π.χ. του 16S (Lopardo & Uhl 2014), ως καλύτερου μοριακού δείκτη. Επίσης, η χρήση του DNA barcoding για την οριοθέτηση των ειδών απαιτεί οι διαειδικές γενετικές αποστάσεις να είναι υψηλότερες από τις ενδοειδικές. Παρόλο που έχει αποδειχθεί ότι αυτή η παραδοχή αληθεύει σε πολλά είδη, υπάρχουν και αντίθετα παραδείγματα (Amaral et al. 2007, Wiemers & Fiedler 2007, Viricel & Rosel 2012), ιδίως όταν τα υπό μελέτη είδη δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. (Meyer & Paulay 2005). Παραδείγματος χάρη, όταν μεταξύ δύο ειδών υπάρχουν παραφυλετικές ή πολυφυλετικές ομάδες, το DNA barcoding αδυνατεί από μόνο του να διακρίνει αυτά τα δύο είδη μεταξύ τους (Meyer & Paulay 2005). Παρά τους προαναφερθέντες περιορισμούς, το DNA barcoding είναι χρήσιμο σε μελέτες τόσο για καλά προσδιορισμένες όσο και για λιγότερο γνωστές ομάδες σε ταξινομικό επίπεδο. Για παράδειγμα, υπάρχουν μελέτες τροπικών αρθροπόδων που

40

συχνά περιλαμβάνουν πολλά είδη, τα οποία δεν έχουν επίσημα ονόματα (Smith et al. 2005, Janzen et al. 2009). Έτσι, αν το DNA barcoding συνδυαστεί με την ανάλυση των μορφολογικών χαρακτήρων, τότε μπορεί να αποτελέσει σημαντικό εργαλείο για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών στη μελέτη της βιοποικιλότητας (Dayrat 2005, Will et al. 2005, Goldstein & DeSalle 2011, η Riedel et al. 2013). Στις αράχνες, το DNA barcoding είναι ένα ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο με μια ποικιλία δυνατοτήτων και εφαρμογών:

• στην επιβεβαίωση της αναγνώρισης των ειδών που έχει πραγματοποιηθεί από τους ειδικούς με τη χρήση κλασικών μεθόδων. Σε τέτοιες περιπτώσεις, το DNA barcoding θα μπορούσε να παρέχει έναν μεγαλύτερο βαθμό ακρίβειας και αντικειμενικότητας στον ταξινομικό προσδιορισμό.

• στη δημιουργία παγκόσμιων βιβλιοθηκών για τις DNA barcode αλληλουχίες των αραχνών (Astrin et al. 2013, www.dnabank-network.org). Οι παλιές μέθοδοι αποθήκευσης αραχνών (π.χ. με 70%-80% αιθανόλη) δεν συντηρούσαν επ’ αόριστο το DNA των αραχνών, καθώς με το πέρας του χρόνου το DNA αποσυντίθετο όσο καλή και αν ήταν η μέθοδος (Vink et al. 2005). Αντίθετα, με την μέθοδο του DNA barcoding δίνεται η δυνατότητα να διατηρείται η αλληλουχία για πάντα σε ηλεκτρονική μορφή, χωρίς την υποχρέωση της διατήρησης όλου του ζώου. Σε αυτή την περίπτωση διατηρείται τουλάχιστον ένα μέρος της μοριακής ποικιλότητας επ’ αόριστον. Επιπλέον, μέσω του διαδικτύου το γενετικό υλικό θα μπορεί να είναι προσβάσιμο από οποιοδήποτε ερευνητή σε ολόκληρο τον κόσμο.

• στην ταυτοποίηση νεαρών ατόμων αραχνών, τα οποία γενικά δεν είναι αναγνωρίσιμα σε επίπεδο είδους με βάση τους μορφολογικούς χαρακτήρες.

• στην ταυτοποίηση των θηλυκών ατόμων σε γένη ή είδη, όταν αυτό δεν μπορεί να γίνει με τη βοήθεια μορφολογικών χαρακτήρων.

• στο ταίριασμα των δύο φύλων ενός είδους, όταν αυτά συλλέγονται σε διαφορετική χρονική στιγμή ή/και τοποθεσία. 41

• στην πιθανή διάκριση ειδών ανάμεσα σε πληθυσμούς που εμφανίζουν κρυπτική ποικιλομορφία.

Όλες οι παραπάνω εφαρμογές συμπληρώνουν την παραδοσιακή ταξινομική (Hebert et al. 2004, Hebert et al. 2010) και είναι ιδιαίτερα χρήσιμες, όπου οι παραδοσιακοί φαινοτυπικοί χαρακτήρες δεν εκφράζονται επαρκώς ή δεν συσχετίζονται με την γονοτυπική ποικιλότητα. Συνήθως σε αυτές τις περιπτώσεις δημιουργούνται ερωτήματα, όπως το αν η διαδικασία της ειδογένεσης έχει ήδη προχωρήσει τόσο, ώστε τα εξεταζόμενα άτομα να πρέπει να βρίσκονται πραγματικά στην ίδια ταξινομική ομάδα. Τέτοια παραδείγματα, όπου το DNA barcoding έδωσε αποτελέσματα, ήταν σε αδερφά είδη και ομάδες πολύ συγγενικών ειδών και σε είδη με ευρεία εξάπλωση σε εκτενείς περιοχές. Για να μπορεί κάποιος να επωφεληθεί από τις δυνατότητες του DNA barcoding στις αράχνες, είναι απαραίτητο να γίνει barcode σε όσο το δυνατόν πιο πολλά είδη αραχνών, από διάφορους πληθυσμούς καλά κατανεμημένους επί του συνολικού εύρους κατανομής τους, με αρκετά δείγματα ανά πληθυσμό. Εκτός από αυτήν τη βασική δεξαμενή δεδομένων, μια πιο εξειδικευμένη βάση δεδομένων του DNA barcoding μπορεί να έχει νόημα για είδη, τα οποία έχουν διερευνηθεί πιο εμπεριστατωμένα.

1.3.2. Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.boldsystems.org

42

Εικ. 12: Αρχική σελίδα της ιστοσελίδας www.boldsystems.org

Η βάση δεδομένων Barcode of Life Data Systems (www.boldsystems.org) (Ratnasingham & Hebert 2007), έχει σχεδιαστεί για την καταχώρηση, τη δημιουργία και τη χρήση των δεδομένων DNA barcodes των περισσοτέρων οργανισμών (όχι μόνο αράχνες ή ζωικούς οργανισμούς) παγκοσμίως και η χρησιμότητά της είναι τεράστια όπως φαίνεται από διάφορες μελέτες (π.χ. Sonet et al 2013). Στην αρχική σελίδα του διαδικτυακού τόπου (Εικ. 12) υπάρχουν τέσσερις κύριες ενότητες:

1. Public data portal 2. Database of barcode clusters (barcode index numbers) 3. DNA Barcode educational portal 4. Data collection workbench

Το public data portal είναι μια βάση δεδομένων, στην οποία επιτρέπεται η αναζήτηση σε πάνω από 1,3 εκατομμύρια αρχεία του www.boldsystems.org 43

χρησιμοποιώντας διάφορα κριτήρια. Κάποια από αυτά είναι η γεωγραφία και η ταξινόμηση των οργανισμών, οι βάσεις δεδομένων και οι αλληλουχίες. Τα αποτελέσματα της αναζήτησης σε αυτήν τη βάση υπάρχει η δυνατότητα να συνοψιστούν, να απεικονιστούν σε χάρτες υψηλής ανάλυσης και να αποθηκευτούν. Το database of barcode clusters (barcode index numbers, bins) (Ratnasingham & Hebert 2007) είναι μια βάση δεδομένων που διακρίνει τα είδη, τα οποία δεν έχουν μεγάλη απόκλιση μεταξύ τους, χρησιμοποιώντας συστοιχίες αλληλουχιών. Επιπλέον, κάποιος μπορεί να χρησιμοποιήσει και να επικυρώσει γρήγορα barcode δεδομένα για αλληλουχίες, στις οποίες τα ταξινομικά στοιχεία τους είναι ελλιπή ή δεν έχουν διασταυρωθεί. Το DNA Barcode educational portal είναι μια ελεύθερη πλατφόρμα για εκπαιδευτικούς σκοπούς. Δηλαδή, με αυτό το εργαλείο μπορεί κάποιος να περιηγηθεί σε όλα τα DNA barcodes και να συμβάλει στη δημιουργία νέων DNA barcodes για το www.boldsystems.org. Το data collection workbench είναι ένα εργαλείο στο οποίο συλλέγονται και αναλύονται νέα δεδομένα, με στόχο να δημιουργηθούν νέα DNA barcodes και άλλες βοηθητικές αλληλουχίες. Για να χρησιμοποιήσει κάποιος αυτήν την επιλογή πρέπει να έχει προσωπικό κωδικό. Επιπλέον στην αρχική σελίδα του www.boldsystems.org. (Εικ.. 12) υπάρχουν στο πάνω μέρος πέντε ακόμη επιλογές: Database, Taxonomy, Identification, Workbench και Resources. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι τρεις πρώτες, οι οποίες αναλύονται εκτενέστερα παρακάτω. Η επιλογή Workbench είναι ακριβώς ίδια με το data collection workbench, ενώ η επιλογή Resources περιλαμβάνει το σύνολο των πηγών και των χρήσιμων διαδικτυακών εργαλείων, που αφορούν αυτό το διαδικτυακό τόπο.

1.3.2.1. Database

44

Εικ. 13: Σελίδα Databases της ιστοσελίδας www.boldsystems.org

Στο Databases βρίσκονται όλες οι βάσεις δεδομένων του www.boldsystems.org, οι οποίες διακρίνονται στις βασικές βάσεις δεδομένων (οι public data portal και BIN) και αυτές που διαδραματίζουν υποστηρικτικό ρόλο (publication και primer databases). Η βάση δεδομένων publication περιέχει ένα δείγμα από δημοσιευμένα barcodes και από δημοσιεύσεις στις οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί barcode αρχεία. Η βάση δεδομένων primer databases περιλαμβάνει κάποιους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για παραγωγή barcode αλληλουχιών. Η συγκεκριμένη βάση συντηρείται από τους χρήστες του www.boldsystems.org.

1.3.2.2. Taxonomy

45

Εικ. 14: Σελίδα Taxonomy της ιστοσελίδας www.boldsystems.org

Στο Taxonomy υπάρχουν στατιστικά στοιχεία, μεγέθη πληθυσμών και γεωγραφικές πληροφορίες των οργανισμών αυτού του διαδικτυακού τόπου, που έχουν αναλυθεί ή όχι με τη μέθοδο του DNA barcoding. Συγκεκριμένα, το σύνολο των καταχωρημένων οργανισμών (ατόμων) στο www.boldsystems.org είναι 5.487.059, και από αυτά μόνο τα 4.090.361 έχουν barcodes, τα οποία αντιστοιχούν σε 239.297 είδη. Σε αυτήν την αρχική σελίδα φαίνεται το κάθε βασίλειο ευκαρυωτικών οργανισμών (ζώα, φυτά, μύκητες και πρώτιστα) και τάξο, μαζί με τον αριθμό των ατόμων που περιλαμβάνει καθένα από αυτά στη βάση. Για παράδειγμα, ο συνολικός αριθμός των ατόμων των αρθροπόδων που έχουν καταχωρηθεί στη βάση, είναι 4.205.184. Ακόμη, αν πατήσει κάποιος πάνω σε ένα από τα τάξα, π.χ. αρθρόποδα, θα δει περαιτέρω στοιχεία, όπως, πόσα άτομα έχουν barcodes (στα αρθρόποδα είναι 3.194.091), άλλες πληροφορίες σχετικά με το τάξο (άτομα με αλληλουχία, σύνολο των ειδών του τάξου, είδη με barcodes, δημοσιεύσεις αρχείων, δημοσιεύσεις ειδών και δημοσιεύσεις στο BIN), σε πόσες κλάσεις διακρίνεται το κάθε τάξο και με πόσα άτομα η κάθε μια, 46

γεωγραφική κατανομή των οργανισμών, εικόνες, μια συνοπτική περιγραφή του τάξου (από το Wikipedia) και άλλα ενδιαφέροντα στατιστικά στοιχεία. Η αναζήτηση μπορεί να συνεχιστεί παρόμοια και σε πιο χαμηλά ταξινομικά επίπεδα (κλάση, οικογένεια, υποοικογένεια, γένος, οργανισμός), με παρόμοιες πληροφορίες κάθε φορά. Έτσι, ο χρήστης μπορεί από τη συγκεκριμένη πλατφόρμα να πάρει όλη την πληροφορία που χρειάζεται σχετικά με το επίπεδο μελέτης μιας ταξινομικής ομάδας, ως προς το barcode.

1.3.2.3. Identification

Εικ. 15: Σελίδα Identification της ιστοσελίδας www.boldsystems.org

Στο Identification γίνεται ταυτοποίηση άγνωστων αλληλουχιών DNA Barcoding. Συγκεκριμένα υπάρχουν τρείς επιλογές: Animal Identification (COI), Fungal Identification (ITS) και Plant Identification (rbcl & matK). Οι διαφορές μεταξύ τους είναι ότι η κάθε μια επιλογή αναζητά είδη σε διαφορετικά βασίλεια (ζώα, μύκητες 47

και φυτά αντίστοιχα) με βάση διαφορετικά γονίδια κάθε φορά (COI, ITS, rbcl & matK). Επειδή η διεξαγόμενη μελέτη αφορά τις αράχνες, χρησιμοποιήθηκε μόνο η πρώτη επιλογή. Στην επιλογή Animal Identification, το σύστημα ανίχνευσης του διαδικτυακού τόπου www.boldsystems.org δέχεται αλληλουχίες από την 5' αμετάφραστη περιοχή του μιτοχονδριακού γονιδίου του κυτοχρώματος c οξειδάσης υπομονάδας Ι (γονίδιο COI) και επιστρέφει μια ταυτοποίηση της αλληλουχίας σε επίπεδο ειδών, όταν αυτή είναι δυνατή. Στην επιλογή αυτήν (Εικ. 15) φαίνονται οι ανανεώσεις των βάσεων δεδομένων, που γίνονται ετησίως τον Ιούλιο του κάθε έτους, το πλαίσιο όπου τοποθετούνται οι αλληλουχίες και τέσσερις διαφορετικές βάσεις δεδομένων, που θέτουν τους δικούς τους περιορισμούς και αποτελούν την πηγή αναζήτησης για την ταυτοποίηση της υπό αναζήτηση αλληλουχίας. Αυτές είναι η All Barcode Records on BOLD, η Species Level Barcode Records, η Public Record Barcode Database και η Full Length Record Barcode Database. Η βάση δεδομένων All Barcode Records on BOLD, στην οποίαν ανήκουν 3.327.998 αλληλουχίες, περιλαμβάνει κάθε αλληλουχία COI, που έχει ελάχιστο μήκος 500bp, με barcode στο διαδικτυακό τόπο www.boldsystems.org (συμπεριλαμβανομένων των αλληλουχιών που βρίσκονται σε μη πιστοποιημένες βιβλιοθήκες). Συγκεκριμένα, εμπεριέχονται πολλά είδη που αντιπροσωπεύονται από μόνο ένα ή δύο δείγματα, ανεξάρτητα από το επίπεδο ταξινομικής αναγνώρισης (ακόμα και εκείνα που δεν φέρουν κανένα ταξινομικό χαρακτηριστικό). Η αναζήτηση σε αυτήν τη βάση δεδομένων επιστρέφει μια λίστα με τις πλησιέστερες (συγγενικές) αλληλουχίες, χωρίς να τοποθετεί την υπό μελέτη αλληλουχία σε κάποια ταξινομική βαθμίδα. Στη βάση δεδομένων Species Level Barcode Records, που αποτελεί υποσύνολο της προηγούμενης, ανήκουν 2.026.042 αλληλουχίες από 160.560 είδη. Σε αυτήν τη βάση περιλαμβάνεται κάθε αλληλουχία COI με ελάχιστο μήκος 500bp, η οποία έχει barcode και είναι αναγνωρισμένη στο επίπεδο του είδους. Δηλαδή, υπάρχουν πολλά είδη που αντιπροσωπεύονται από ένα ή δύο δείγματα, καθώς και όλα τα είδη με τελική ή προσωρινή ταξινόμηση. Στην βάση δεδομένων Public Record Barcode Database ανήκουν 727.807 αλληλουχίες από 75.873 είδη και περιλαμβάνονται όλα τα δημοσιευμένα αρχεία για

48

COI από το www.boldsystems.org και την GenBank, που οι αλληλουχίες τους έχουν ελάχιστο μήκος 500bp. Η βάση δεδομένων Full Length Record Barcode Database περιλαμβάνει 1.437.245 αλληλουχίες από 144.357 είδη και αποτελεί υποσύνολο της προηγούμενης βιβλιοθήκης. Σε αυτήν τη βάση δεδομένων περιέχονται τόσο δημόσια όσο και ιδιωτικά αρχεία, στα οποία το ελάχιστο μήκος των αλληλουχιών είναι στα 640bp. Αυτή η βιβλιοθήκη προορίζεται για ταυτοποίηση μικρών αλληλουχιών, διότι έχει τις λιγότερες barcode αλληλουχίες, άρα με λίγες αναγνώσεις επιτυγχάνεται η γρηγορότερη ταυτοποίηση αλληλουχιών. Προκειμένου ο χρήστης να κάνει ταξινομική αναγνώριση μιας αλληλουχίας και να έχει το αποτέλεσμα της Εικ 16, από όλες τις παραπάνω βάσεις δεδομένων πρέπει να επιλέξει την πρώτη, διότι συμπεριλαμβάνει το μεγαλύτερο αριθμό διαθέσιμων barcodes. Έπειτα, οφείλει να γράψει την αλληλουχία στο ειδικό πλαίσιο σε μορφή fasta και να προχωρήσει με την επιλογή submit (Εικ. 15).

49

Εικ. 16: Το αποτέλεσμα της αναζήτησης που προηγήθηκε για την ταξινομική αναγνώριση μιας αλληλουχίας στην ιστοσελίδα www.boldsystems.org

Ως αποτέλεσμα, δημιουργείται αυτή η σελίδα (Εικ. 16) που περιλαμβάνει πληροφορίες σχετικά με το ποιες είναι οι 20 πλησιέστερες (πιο συγγενικές) αλληλουχίες με την αλληλουχία ενδιαφέροντος, πόσο ταιριάζουν με αυτήν (ποσοστό ομοιότητας), γεωγραφικές πληροφορίες για τις αλληλουχίες, σε ποια ομάδα ανήκει η καθεμία από αυτές (βασίλειο, κλάση, τάξη, οικογένεια, υποοικογένεια, γένος, είδος) και παρέχεται η δυνατότητα με το tree based Identification να φανεί το αποτέλεσμα σε ένα φυλογενετικό δέντρο, με βάση το μοντέλο σύνδεσης γειτόνων (N.J.).

1.3.3. Παρουσίαση της ιστοσελίδας www.araneae.unibe.ch 50

Εικ. 17: Αρχική σελίδα της ιστοσελίδας www.araneae.unibe.ch

Στη διαδικτυακή ιστοσελίδα www.araneae.unibe.ch (Nentwig et al 2012) καταχωρούνται, εκτός των άλλων, όλες οι αλληλουχίες αραχνών της Ευρώπης, που έχουν αναλυθεί με τη μέθοδο του DNA barcoding. Εδώ κάποιος μπορεί να βρει πολλές πληροφορίες σχετικά με την ταξινομική αναγνώριση των αραχνών, για το σύνολο των ευρωπαϊκών οικογενειών, γενών και ειδών αραχνών, κλειδιά αναγνώρισης των οικογενειών, γλωσσάρι όπου δίνονται ορισμοί σχετικοί με τις αράχνες, όλα τα άρθρα που είναι σχετικά με το DNA barcoding για αράχνες της Ευρώπης, στατιστικά και άλλα στοιχεία σχετικά με το DNA barcoding για τις ευρωπαϊκές αράχνες (π.χ. Εικ. 18).

51

Εικ. 18: Ποσοστό των ευρωπαϊκών ειδών αραχνών που περιλαμβάνονται στο araneae με barcode. Τα στοιχεία του τρέχοντος έτους καταχωρήθηκαν στις 24/02/2015. Από την ιστοσελίδα www.araneae.unibe.ch (Πηγή δεδομένων: www.boldsystems.org)

1.3.4. Επιλογή των Δειγμάτων

Από τη συλλογή των αραχνών του εργαστηρίου επιλέχθηκαν 35 είδη, για να αναλυθούν με τη μέθοδο του DNA Barcoding, τα οποία παρουσιάζονται στο υποκεφάλαιο 2.2. Τα κριτήρια επιλογής των ειδών παρουσιάζονται αναλυτικά στο υποκεφάλαιο 2.1.

1.3.5. Ελληνικές και Ξένες Μελέτες και Προγράμματα για το DNA Barcoding στις Αράχνες

Αν και έχουν γίνει κάποιες εργασίες σχετικές με το DNA Barcoding με οργανισμούς που απαντούν στην Ελλάδα (Stahls et al 2009, Triantafyllidis et al 2011, Bosmali et al 2012, Theodoridis et al 2012), δεν υπάρχουν τέτοιες εργασίες για τις αράχνες ή τα αρθρόποδα γενικά από την Ελλάδα. Βέβαια στο εξωτερικό υπάρχουν αρκετές ερευνητικές ομάδες που ασχολούνται συστηματικά με το DNA Barcoding στις αράχνες και εξασφαλίζουν χρηματοδότηση γι’ αυτό (Barrett R.D.H & Hebert P.D.N 2005). Παρακάτω, παρουσιάζονται κάποια ερευνητικά προγράμματα, που αφορούν barcoding για τις ευρωπαϊκές αράχνες (http://www.araneae.unibe.ch/):

52

• Οι αράχνες της Βουλγαρίας [SPIEU]: Αραχνολόγοι του Ζωολογικού Ινστιτούτου (πλέον Ινστιτούτου βιοποικιλότητας και οικοσυστημικής έρευνας) διοργάνωσαν στη Βουλγαρική Ακαδημία Επιστημών τις πρώτες συλλογές αραχνών για barcoding το 2009. Μετά από τρία χρόνια, το 2012, το πρόγραμμα περιείχε 1420 barcoded δείγματα από 269 είδη, 129 γένη και 28 οικογένειες. Συμμετείχαν οι Deltshev C., Naumova M., Lazarov S., Blagoev G.

• Οι αράχνες της Τουρκίας [TURAR] (από τις ευρωπαϊκές και ασιατικές περιοχές). Το έργο ξεκίνησε το 2010. Μέχρι το 2012, το πρόγραμμα περιείχε 1985 barcoded δείγματα από 248 είδη, 166 γένη και 45 οικογένειες. Συμμετείχαν οι Boğaç Kunt K., Marusik Y, Blagoev G.

• Οι αράχνες της Ρωσίας [SPIRU] (από ευρωπαϊκά και ασιατικά μέρη). Το έργο ξεκίνησε το 2010. Σε αυτό το έργο έχουν γίνει barcode μέχρι στιγμής περίπου 1894 δείγματα από 263 είδη, 139 γένη και 17 οικογένειες. Εμπλεκόμενοι φορείς είναι το Ινστιτούτο Βιολογικών Προβλημάτων του Βορρά, η Ρωσική Ακαδημία Επιστημών και το Ζωολογικό Μουσείο του Πανεπιστημίου του Turku στην Φινλανδία. Συμμετείχαν οι Marusik Y., Koponen S., Omelko M. M, Fomichev A. A., Blagoev G.

• Ένα έργο για τις αλπικές αράχνες από το Ινστιτούτο Βιολογίας του Επιστημονικού Κέντρου Ερευνών της Σλοβενικής Ακαδημίας Επιστημών και Τεχνών (Λουμπλιάνα, Σλοβενία). Ξεκίνησε το 2011 ένα πρόγραμμα barcoding, με στόχο τη συλλογή, τον ακριβή εντοπισμό, την αποθήκευση σε κατάψυξη και την δημιουργία DNA barcodes για το ένα τέταρτο της πανίδας των αραχνών που μοιράζονται τις περιοχές μεταξύ της Σλοβενίας και της Ελβετίας και που είναι περίπου 275 είδη. Συμμετείχαν οι Kuntner M., Kropf C., Gregorič M., Čandek K. http://ezlab.zrc-sazu.si/

• Barcoding για τη Χλωρίδα και Πανίδα της Ολλανδίας. Στο Naturalis (Μουσείο Φυσικής Ιστορίας του Leiden στην Ολλανδία) επιχειρείται να γίνει DNA barcode μέχρι και τεσσάρων εκπροσώπων από κάθε ένα ολλανδικό είδος αράχνης, ιδανικά, σε καθένα από τα τέσσερα τεταρτημόρια της χώρας. Συμμετείχαν οι van Helsdingen P. και Miller J. http://science.naturalis.nl/dnabarcoding

53

• Το γερμανικό Barcode of Life (GBOL), Στη Γερμανία, ένα δίκτυο από διάφορα μουσεία και άλλα ιδρύματα (με κεντρικό το Zoologisches Forschungsmuseum Koenig Α, ZFMK στη Βόννη) ξεκίνησε το γερμανικό Barcode of Life πρόγραμμα, το οποίο χρηματοδοτείται από το 2012 έως το 2015 από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας. Το πρόγραμμα εστιάζει σε πολυκύτταρους οργανισμούς όπου περιλαμβάνονται και οι αράχνες. Οι ερευνητές που εμπλέκονται στο barcoding των αραχνών είναι οι Astrin J. (ZFMK), Holstein J. (ΔΠΕ-Στουτγάρδη), Hofer H. (ΔΠΕ- Καρλσρούη), Rulik B. (ZFMK). https://www.bolgermany.de/

• Barcoding της Βαυαρικής πανίδας. Από το 2010, η Ζωολογική Βαυαρική Κρατική Συλλογή (Μόναχο, Γερμανία) έχει κάνει barcoding στο σύνολο των 34.000 ζωικών ειδών της Βαυαρίας. http://www.faunabavarica.de/

• Στην Ελβετία, ένα DNA barcoding πρόγραμμα, το οποίο χρηματοδοτείται από το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών, υλοποιείται κατά τα έτη 2012-2015 και σκοπεύει να χρησιμοποιήσει barcodes για να διερευνήσει ταξινομικά προβλήματα των αραχνών. Συμμετέχουν οι: Kropf C., Nentwig V., Lasut L.

• Το ελβετικό Barcode of Life (SwissBOL) εν μέρει υποστηρίζει το barcoding των ελβετικών αραχνών (2013/2014).

• Η πρωτοβουλία για Barcoding των Ιβηρικών αραχνών είναι ένα τριετές πρόγραμμα, που χρηματοδοτείται από τον αυτόνομο οργανισμό Ισπανικών Εθνικών Πάρκων και ξεκίνησε το 2013. Το πρόγραμμα έχει ως στόχο να διερευνήσει την ποικιλομορφία και βιογεωγραφικά πρότυπα των κοινοτήτων των αραχνών στα ισπανικά εθνικά πάρκα με τη σύγκλιση ημι-ποσοτικών βιοανιχνευτών και DNA barcoding εργαλείων. Συμμετέχουν οι: Arnedo M. και Ribera C. (UB-IRBio), Moya-Laraño J. (EEZA), Jimenez-Valverde A. (MNCN) και Cardoso P. (UH-FMNH) .http: //www.marnedo.net/.

Στα παραπάνω ερευνητικά προγράμματα προστίθεται το υπό εξέλιξη πρόγραμμα «Οι εδαφικές αράχνες ως πρέσβειρες για την ταχεία ανάδειξη πυρήνων βιοποικιλότητας στην Ελλάδα - SPIDOnet.GR». Το πρόγραμμα αυτό, μεταξύ άλλων, ξεκίνησε τη 54

διαδιακασία του DNA Barcoding των αραχνών της Ελλάδας. Πραγματοποιείται στο Τμήμα Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής του Δημοκριτείου Πανεπιστημίου Θράκης, υπό το συντονισμό της Αλεξίου-Χατζάκη Μ. Μέρος των αποτελεσμάτων αυτής της εργασίας παρουσιάζονται στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία. (πρόγραμμα Αριστεία-II).

1.4 Σκοπός της Μελέτης

Οι στόχοι της παρούσας μελέτης είναι:

1) Η παροχή των πρώτων από τον ελλαδικό χώρο DNA barcodes αραχνών τόσο ειδών για τα οποία υπάρχουν αντίστοιχα ενημερωμένα barcodes (GenBank) συμπληρώνοντας την παγκόσμια βάση δεδομένων με αντιπροσώπους τους από την Ελλάδα, όσο και ειδών για τα οποία δεν υπάρχουν DNA barcodes.

2) Η ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη οργανισμών μεταξύ τους, με άλλες αλληλουχίες από τις διάφορες διαδικτυακές τοποθεσίες (GenBank και boldsystems), ώστε να αναδειχθεί η χρησιμότητα του DNA Barcoding σε αυτά τα δείγματα.

55

2. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Επιλογή και Συλλογή Δειγμάτων

Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία συμπεριλήφθηκε η πληροφορία DNA Barcoding από 35 δείγματα του εργαστηριού και από 85 δείγματα από την βάση δεδομένων GenBank (συνολικά 120 δείγματα). Η βάση δεδομένων GenBank είναι η πιο έγκυρη πηγή εύρεσης αλληλουχιών γονιδίων, για το λόγο αυτό και επιλέχθηκε ως η πηγή για το συγκριτικό υλικό της μελέτης. Η επιλογή των δειγμάτων του εργαστηρίου δεν ήταν τυχαία, αλλά έπρεπε να πληρεί κάποιες προϋποθέσεις. Δηλαδή τα δείγματα θα έπρεπε να:

1) είναι διαθέσιμα και εύκολα διαχειρίσιμα στο εργαστήριο, για να πραγματοποιηθεί όσο το δυνατό πιο γρήγορα η εργαστηριακή εργασία.

2) είναι ταξινομήσιμα και καλά αναγνωρισμένα, ώστε για τα DNA Barcoding, που παρήχθησαν, να είμαστε σίγουροι ότι αντιστοιχούν στο κάθε υπό εξέταση είδος.

3) είναι σε καλή κατάσταση το DNA τους, καθώς θα αποτελέσουν την ταυτότητα (barcode) του κάθε υπό εξέταση είδους, οπότε κάθε ‘‘ασάφεια’’ της αλληλουχίας θα μπορούσε να οδηγήσει σε λάθος συμπεράσματα.

4) μην έχουν ενημερωμένες αλληλουχίες του είδους τους στην GenBank, διότι στόχος ήταν να προστεθούν καινούρια barcodes αραχνών στην παγκόσμια βάση δεδομένων της GenBank

Για να πληρούν τις προϋποθέσεις ένα και δύο, τα εργαστηριακά δείγματα θα έπρεπε να έχουν διατηρηθεί σε καλή κατάσταση από την αρχική συλλογή τους και μετά. Αυτό ήταν δυνατό μόνο για όσα δείγματα είχαν συλλεχθεί με το χέρι και όχι όσα είχαν μαζευτεί με την μέθοδο των παγίδων εδάφους, διότι τα τελευταία υφίστανται εκτεταμένη έκθεση σε χημικές ουσίες (αιθανογλυκόλη) και ακατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες (π.χ. υψηλές θερμοκρασίες) που οδηγούν στην αλλοίωση του γενετικού τους υλικού. Αντίθετα, τα δείγματα, που συλλέγονται με το χέρι, 56

μπορούν να δεχτούν επεξεργασία σε σύντομο χρονικό διάστημα από τη συλλογή τους και να δώσουν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Ακόμα και στην περίπτωση συλλογής δειγμάτων με το χέρι, αν αυτά έχουν διατηρηθεί σε 70% αιθανόλη (και όχι απόλυτη), τότε η πιθανότητα καταστροφής του γενετικού τους υλικού είναι μεγάλη. Με βάση τα παραπάνω, ο αριθμός των διαθέσιμων δειγμάτων στο εργαστήριο ή και αυτών που συλλέχθησαν από την ομάδα εργασίας του προγράμματος ΑΡΙΣΤΕΙΑ κατά τη διάρκεια του περασμένου έτους, παρέμεινε μικρός. Προκειμένου να υπάρξει ένα ικανοποιητικό σύνολο DNA barcodes για να μπορεί να ολοκληρωθεί η ανάλυση, έπρεπε να χρησιμοποιηθούν επιπλέον δείγματα, από τα ήδη καταχωρημένα στις αντίστοιχες βάσεις δεδομένων (GenBank). Συγκεκριμένα, όταν προσδιορίστηκε το σύνολο των οικογενειών των εργαστηριακών δειγμάτων, επιλέχτηκαν όλες οι αλληλουχίες αραχνών για το γονίδιο της COI από τις αντίστοιχες βάσεις δεδομένων, στις οποίες αλληλουχίες τα είδη τους ανήκαν στις παραπάνω οικογένειες αραχνών. Έτσι, μπορούσε να γίνει φυλογενετική ανάλυση των δειγμάτων με στόχο τον προσδιορισμό της μεταξύ τους συγγένειας.

2.2 Είδη, οικογένειες και παραομάδες

Στην ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν αλληλουχίες του μιτοχονδιακού γονιδίου COI από 17 διαφορετικές οικογένειες αραχνών. Αυτές αντιπροσωπεύθηκαν τόσο από δείγματα του εργαστηρίου που αναλύσαμε στην παρούσα εργασία, όσο και από αλληλουχίες που αντλήθηκαν από τη βάση των γενετικών δεδομένων GenBank. Πληροφορίες που αφορούν στις αλληλουχίες (είδος και οικογένεια) των δειγμάτων του εργαστηρίου μαζί με τους κωδικούς εξαγωγής DNA δίνονται στον Πιν. 2. Αντίστοιχες πληροφορίες δίνονται για τις αλληλουχίες της βάσης GenBank (κωδικοί - Accession Numbers, βιβλιογραφικές αναφορές) στον Πιν. 3.

57

Πιν. 2: Ταξινομική ταυτοποίηση και κωδικοί εργαστηρίου των δειγμάτων της συλλογής μας, τα οποία αλληλουχήθηκαν για το γονίδιο COI.

Οικογένεια Είδος κωδικός δείγματος DNA 1. Amaurobiidae Amaurobius deelemane 1 551 2. Amaurobiidae Amaurobius deelemane 2 552 3. Amaurobiidae Amaurobius deelemane 3 553 4. Amaurobiidae Amaurobius deelemane 4 554 5. Araneidae Araneus grossus 607 6. Clubionidae Clubiona brevipes 614 7. Ctenizidae Cyrtocarenum cunicularium 536 8. Ctenizidae Cyrtocarenum grajum 513 9. Dysderidae Dysdera gigas 555 10. Dysderidae Dysdera spinicrus 556 11. Gnaphosidae Anagraphis pallens 563 12. Gnaphosidae Civizelotes caucasius 626 13. Gnaphosidae Civizelotes solstitialis 561 14. Gnaphosidae Gnaphosa lucifaga 624 15. Gnaphosidae Micaria caarctata 612 16. Gnaphosidae Nomisia exornata 560 17. Gnaphosidae Nomisia ripariensis 1 608 18. Gnaphosidae Nomisia ripariensis 2 610 19. Gnaphosidae Pterotricha lentiginosa 565 20. Gnaphosidae Zelotes cingarus 562 21. Hexathelidae Macrothele cretica 606 22. Linyphiidae Crematoneta mutinesis 615 23. Nemesiidae Nemesia sp 542 24. Oxyopidae Oxyopes lineatus 620 25. Oxyopidae Oxyopes nigripalpis 621 26. Palpimanidae Palpimanus gibbulus 550 27. Philodromidae Philodromus longipalpis 609 28. Philodromidae Philodromus lunatus 627 29. Salticidae Heliophanus patagiotus 617 30. Salticidae Mogrus neglectus 611 31. Salticidae Pellenes moreanus 618 32. Sparassidae Olios argelasius 622 33. Thomisidae Heriaeus simoni 632 34. Thomisidae Xysticus acerbus 633 35. Zodariidae Zodarion musarum 628

58

Πιν. 3: Αναλυτικά όλων των αλληλουχιών τα είδη και οι οικογένειες με τους κωδικούς και τις βιβλιογραφικές αναφορές τους, που πήραμε από τη GenBank για το γονίδιο COI

Κωδικός Οικογένεια Είδος Αναφορά αλληλουχίας 1 Araneidae Anepsion depressum AB808480 Αδημοσίευτη αλληλουχία 2 Araneidae Anepsion japonicum AB808476 Αδημοσίευτη αλληλουχία 3 Araneidae Araneus diadematus JN018130 Cruaud,C. and Couloux,A. 2012 4 Araneidae Argiope amoena NC024282 Αδημοσίευτη αλληλουχία 5 Araneidae Argiope bruennichi NC024281 Αδημοσίευτη αλληλουχία 6 Araneidae Cyclosa alba AB453390 Αδημοσίευτη αλληλουχία 7 Araneidae Cyclosa maritime AB453763 Αδημοσίευτη αλληλουχία 8 Araneidae Cyclosa mulmeinensis AB453766 Αδημοσίευτη αλληλουχία 9 Araneidae Cyclosa sachikoae AB453770 Αδημοσίευτη αλληλουχία 10 Araneidae Cyclosa vallata AB453771 Αδημοσίευτη αλληλουχία 11 Araneidae Cyrtarachne akirai AB820892 Αδημοσίευτη αλληλουχία 12 Araneidae Cyrtarachne nagasakiensis AB820877 Αδημοσίευτη αλληλουχία Cyrtarachne 13 Araneidae AB820880 Αδημοσίευτη αλληλουχία yunoharuensis 14 Araneidae Mecynogea lemniscata DQ029239 Greenstone,M.H.et.al 2005 15 Araneidae Ordgarius hobsoni AB820882 Αδημοσίευτη αλληλουχία 16 Araneidae Ordgarius sexspinosus AB820885 Αδημοσίευτη αλληλουχία 17 Araneidae Pasilobus hupingensis AB820887 Αδημοσίευτη αλληλουχία 18 Clubionidae Clubiona kiowa DQ029240 Greenstone,M.H.et.al 2005 19 Ctenizidae Stasimopus robertsi JN018121 Cruaud,C. and Couloux,A. 2012 20 Dysderidae Dysdera cf. KF005631 Rezac,M., et. al. 2014 21 Dysderidae Dysdera crocata JN018196 Cruaud,C. and Couloux,A. 2012 22 Dysderidae Dysdera microdonta KF005620 Rezac,M., et. al. 2014 23 Dysderidae Dysdera moravica KF005638 Rezac,M., et. al. 2014 24 Dysderidae Dysdera ninnii KF005624 Rezac,M., et. al. 2014 25 Dysderidae Dysdera sp. 1 KF005625 Rezac,M., et. al. 2014 26 Linyphiidae Bolyphantes alticeps AYO78691 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 27 Linyphiidae Frontinella communis DQ029221 Greenstone,M.H.et.al 2005 28 Linyphiidae Grammonota texana DQ029222 Greenstone,M.H.et.al 2005 29 Linyphiidae Labulla thoracica AY078694 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 30 Linyphiidae Lepthyphantes minutus AY078689 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 31 Linyphiidae Linyphia triangularis AY078693 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 32 Linyphiidae Mermessus fradeorum KJ561375 Αδημοσίευτη αλληλουχία 33 Linyphiidae Microlinyphia dana AY078690 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 34 Linyphiidae Neriene radiate AY078696 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 35 Linyphiidae Neriene variabilis AY078699 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 36 Linyphiidae Orsonwelles malus AY078697 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 37 Linyphiidae Pitohyphantes costatus AY078695 Hormiga,G. RT. Et. al. 2003 38 Liphistiidae Ryuthela nishihirai AB778127 Αδημοσίευτη αλληλουχία 39 Nemesiidae Calisoga longitarsis EU523754 Αδημοσίευτη αλληλουχία 40 Palpimanidae Palpimanidae sp. 1 KP201208 Αδημοσίευτη αλληλουχία 41 Philodromidae Pagiopalus nigriventis EU168155 Benjamin,S.P et. al 2008 42 Philodromidae Philodromus sp. EU168157 Benjamin,S.P et. al 2008 43 Philodromidae Proemus stigmaticus EU168156 Benjamin,S.P et. al 2008 59

44 Salticidae Eupoa nezha EF201668 Wayne P. M. et. al. 2014 Maddison,W.P. and 45 Salticidae Galianora bryicola DQ665758 Needham,K.M. 2006 Maddison,W.P. and 46 Salticidae Galianora sacha DQ665754 Needham,K.M. 2006 Maddison,W.P. and 47 Salticidae Goleba lyra DQ665755 Needham,K.M. 2006 48 Salticidae Habronattus oregonensis AY571145 Αδημοσίευτη αλληλουχία Maddison,W.P. and 49 Salticidae Heliophanus cupreus DQ665756 Needham,K.M. 2006 Maddison,W.P. and 50 Salticidae Holcolaetis sp. DQ665757 Needham,K.M. 2006 51 Salticidae Onomastus pethiyagodai EU168160 Benjamin,S.P et. al 2008 52 Salticidae Onomastus rattotensis EU168158 Benjamin,S.P et. al 2008 Maddison,W.P. and 53 Salticidae Phaeacius cf fimbriatus DQ665759 Needham,K.M. 2006 54 Salticidae Phidippus audax DQ029234 Greenstone,M.H.et.al 2005 55 Salticidae Servaea incana JF949752 Αδημοσίευτη αλληλουχία 56 Salticidae Servaea sp. 1 JF949741 Αδημοσίευτη αλληλουχία 57 Salticidae Servaea sp. 2 JF949750 Αδημοσίευτη αλληλουχία 58 Salticidae Servaea spinibarbis JF949740 Αδημοσίευτη αλληλουχία 59 Salticidae Servaea villosa JF949749 Αδημοσίευτη αλληλουχία Maddison,W.P. and 60 Salticidae Sitticus palustris DQ665760 Needham,K.M. 2006 Maddison,W.P. and 61 Salticidae Thrandina parocula DQ665761 Needham,K.M. 2006 62 Thomisidae Bobaropactus sp. EU168187 Benjamin,S.P et. Al 2008 63 Thomisidae Cebrenninius rugosus EU168175 Benjamin,S.P et. al 2008 64 Thomisidae Cyriogonus sp. EU168168 Benjamin,S.P et. al 2008 65 Thomisidae Diaea sp. EU168169 Benjamin,S.P et. Al 2008 66 Thomisidae Diaea subdola EU168174 Benjamin,S.P et. Al 2008 67 Thomisidae Epidius parvati EU168163 Benjamin,S.P et. al 2008 68 Thomisidae Haplotamarus sp. EU168173 Benjamin,S.P et. al 2008 69 Thomisidae Lysiteles sp. EU168183 Benjamin,S.P et. Al 2008 70 Thomisidae Lysiteles sp. EU168184 Benjamin,S.P et. Al 2008 71 Thomisidae Monases sp. EU168172 Benjamin,S.P et. Al 2008 72 Thomisidae Monases sp. EU168186 Benjamin,S.P et. Al 2008 73 Thomisidae Oxytate taprobane EU168161 Benjamin,S.P et. al 2008 74 Thomisidae Psedoporrhopis granum EU168170 Benjamin,S.P et. al 2008 75 Thomisidae Runcinia-acuminata EU168166 Benjamin,S.P et. Al 2008 76 Thomisidae Runcinia albostriata EU168178 Benjamin,S.P et. Al 2008 77 Thomisidae Stephanopis sp. EU168185 Benjamin,S.P et. al 2008 78 Thomisidae Stephanopis sp. EU168167 Benjamin,S.P et. al 2008 79 Thomisidae Thomisus granulifrons EU168162 Benjamin,S.P et. Al 2008 80 Thomisidae Thomisops piger EU168171 Benjamin,S.P et. Al 2008 81 Thomisidae Thomisus sp. EU168164 Benjamin,S.P et. Al 2008 82 Thomisidae Thomisus sp. EU168176 Benjamin,S.P et. Al 2008 83 Thomisidae Tmarus angulatus EU168180 Benjamin,S.P et. al 2008 84 Thomisidae Xysticus californicus EU168181 Benjamin,S.P et. al 2008 85 Thomisidae Xysticus sp. EU168182 Benjamin,S.P et. al 2008 60

Πιο αναλυτικά, οι 120 αλληλουχίες αραχνών διακρίνονται σε 17 οικογένειες (Amaurobiidae, Araneidae, Clubionidae, Ctenizidae, Dysderidae, Gnaphosidae, Hexathelidae, Linyphiidae, Liphistiidae (αυτή η οικογένεια αντιπροσωπεύεται μόνο από μια αλληλουχία και επιπλέον αποτελεί τη μοναδική οικογένεια που ανήκει στην υπερτάξη των Μεσόθηλων, οπότε για λόγους ευκολίας αντί για την οικογένεια αναφέρεται η υπερτάξη Μεσόθηλο), Nemesiidae Oxyopidae, Palpimanidae, Phylodromidae, Salticidae, Sparassidae, Thomisidae και Zodariidae) δύο υπερτάξεις (τα Οπισθόθηλα και τα Μεσόθηλα) και δύο υποτάξεις των Οπισθόθηλων (τα Αρανεόμορφα και τα Μυγαλόμορφα). Σημειώνεται ότι στα δείγματα από την GenBank δεν περιλαμβάνονται οι οικογένειες Amaurobiidae, Gnaphosidae, Hexathelidae, Oxyopidae, Sparassidae και Zodariidae δεδομένου ότι δεν υπήρξε κανένας αντιπρόσωπος των οικογενειών αυτών ανάμεσα στις αλληλουχίες της GenBank. Στη μελέτη η οικογένεια με τα περισσότερα δείγματα (26) είναι τα Thomisidae, ενώ με ένα δείγμα αντιπροσωπεύονται τέσσερις οικογένειες: Liphistiidae, Hexathelidae, Sparassidae και Zodariidae. Επιπλέον η υπόταξη των Αρανεόμορφων υπάρχουν 113 δείγματα, ενώ η υπερτάξη των Μεσόθηλων έχει μόλις ένα δείγμα στην παρούσα μελέτη.

2.3. Πειραματική διαδικασία

Η τυπική διαδικασία που ακολουθήθηκε στο εργαστήριο μετά τη συλλογή των δειγμάτων, περιλάμβανε συνοπτικά τα ακόλουθα στάδια:

Α) Εξαγωγή ολικού γενωμικού DNA Β) Πολλαπλασιασμός τμήματος του επιθυμητού γονιδίου μέσω της τεχνικής της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Γ) Καθαρισμός του προϊόντος της PCR

2.3.1 Πρωτόκολλο εξαγωγής ολικού γενωμικού DNA

Για την απομόνωση του ολικού DNA των αραχνών που μελετήθηκαν, χρησιμοποιήθηκε ειδικό πρωτόκολλο εξαγωγής με τη χρήση σειράς αντιδραστηρίων NucleoSpin Tissue kit της εταιρείας MACHEREY – NAGEL. Σε γενικές γραμμές

61

ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο εξαγωγής όπως δίνεται στις οδηγίες χρήσης. Η μόνη διαφοροποίηση έχει να κάνει με την προετοιμασία του ιστού πριν την εφαρμογή του πρωτοκόλλου, προκειμένου να υπάρχει η μέγιστη απόδοση στη συνέχεια. Η εξαγωγή του DNA των αραχνών έγινε από τμήματα των ποδιών. Τα τμήματα αυτά τοποθετούνται σε φυαλίδια eppendorf του 1,5ml όπου κόβονται σε μικρότερα μέρη, ώστε να αποκαλυφθεί ο ιστός και να απομονωθεί από το περίβλημα της χιτίνης. Στη συνέχεια, τα φυαλίδια αφήνονται με τα καπάκια ανοιχτά στους 37oC για μία ώρα, για να εξατμιστεί η μεγαλύτερη ποσότητα της αιθανόλης. Προκειμένου να αφαιρεθεί πλήρως το υπόλειμμα της αλκοόλης, η οποία είναι αναστολέας των ενζύμων που χρησιμοποιούνται στα ακόλουθα πειραματικά βήματα, γίνεται πλύση με διάλυμα TE9 σε τρείς επαναλήψεις. Συγκεκριμένα προστίθεται στα φυαλίδια ποσότητα 800-1000 μl διαλύματος TE9 (500 mM Tris, 20 mM EDTA, 10 mM NaCl, pH 9.0) (Shiozawa et al. 1992, Chakraborty et al. 2006) και τα σωληνάρια τοποθετούνται σε θερμοαναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου, στις 1000 στροφές. Κάθε δύο ώρες φυγοκεντρούνται στις 11000 στροφές για τρία λεπτά και το διάλυμα αντικαθίσταται. Ακολούθως, οι ιστοί λειοτριβούνται και επωάζονται για τρεις ώρες σε διάλυμα εξαγωγής (extraction buffer), που περιέχει απορρυπαντική ουσία και στο οποίο έχει προστεθεί μικρή ποσότητα (10-20λ) πρωτεϊνάσης Κ (10mg/ml). Στη φάση αυτή η συνδυασμένη δράση του απορρυπαντικού και της πρωτεϊνάσης Κ προκαλεί ρήξη των μεμβρανών των κυττάρων. Κατόπιν ακολουθείται η διαδικασία που προβλέπεται από τις οδηγίες του πρωτοκόλλου του πακέτου Nucleospin Tissue. Όσον αφορά την εξαγωγή με τη χρήση του kit, η εφαρμοζόμενη μέθοδος στηρίζεται στη δέσμευση του DNA σε μεμβράνη πυριτίου και στην ακόλουθη απελευθέρωση του με τη βοήθεια διαλύματος κατάλληλης ιοντικής ισχύος, προκειμένου να εξαχθεί η μεγαλύτερη δυνατή ποσότητα ολικού DNA στη μεγαλύτερη δυνατή συγκέντρωση. Ο έλεγχος της απόδοσης της εξαγωγής του DNA γίνεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε διάλυμα TBE 1Χ, χρησιμοποιώντας 3μl από το τελικό προϊόν, που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο (5g/dl). Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί 45min σε τάση 90Volt και από τη φωτογραφία που λαμβάνεται, με έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως, εκτιμάται η ποσότητα και η ποιότητα του εξαγόμενου DNA. Επειδή η εμπειρία δείχνει ότι συχνά δείγματα DNA που δεν εμφανίζουν τη χαρακτηριστική

62

‘‘μπάντα’’ κατά την ηλεκτροφόρηση, έπειτα δουλεύουν στην PCR, όλα τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν στις επόμενες φάσεις της πειραματικής πορείας. Στις περιπτώσεις που το ένα πόδι δεν απέδωσε ικανοποιητική ποσότητα DNA ή υπήρξε κάποιο άλλο πρόβλημα κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, χρησιμοποιήθηκε ολόκληρο το ζώο για επανάληψη όλης της παραπάνω διαδικασίας.

2.3.2 Πολλαπλασιασμός των γονιδίων-στόχων μέσω της PCR

Ο μοριακός δείκτης που επιλέχτηκε για τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη αραχνών, ήταν το μιτοχονδριακό γονίδιο COI (υπομονάδα I της κυτοχρωμικής οξειδάσης), που αποτελεί και το δείκτη του DNA Barcoding. Προκειμένου να πολλαπλασιαστεί το τμήμα του μιτοχονδριακού γονιδίου COI, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR: Polymerase Chain Reaction). Η PCR επιτρέπει, μέσα σε λίγες ώρες, να παραχθεί ένας πολύ μεγάλος αριθμός αντιγράφων της επιθυμητής ακολουθίας DNA, με τη χρησιμοποίηση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών και της ειδικής θερμοανθεκτικής πολυμεράσης (Taq) του DNA. Οι δύο εκκινητές υβριδίζουν σε συμπληρωματικές θέσεις των δυο αλυσίδων στα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος DNA. Η PCR ξεκινάει με ένα στάδιο αρχικής αποδιάταξης, ενώ ακολουθούν 40 επαναλαμβανόμενοι κύκλοι αποδιάταξης, υβριδοποίησης και επιμήκυνσης. Η διάρκεια και η θερμοκρασία τους καθορίζονται μέσω κατάλληλων προγραμμάτων του θερμοκυκλοποιητή. Τα πρωτόκολλα PCR που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζονται στον Πιν. 4.

Πιν. 4: Παρουσιάζονται αναλυτικά τα χαρακτηριστικά των δύο προγραμμάτων PCR που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη.

Στάδια της PCR Πρωτόκολλο 1 Πρωτόκολλο 2 Αρχική αποδιάταξη 94 oC 3min 94 oC 3min Αποδιάταξη 94 oC 30sec 94 oC 1min Υβριδοποίηση 45 oC 45sec 40 oC 1min Επιμήκυνση 72 oC 1min 72 oC 1min Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι 40 40 Τελικό βήμα επιμήκυνσης 72 oC 5min 72 oC 5min Stand by θερμοκρασία 4 oC 4 oC

63

Η απόδοση της αντίδρασης PCR ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας 1μl από το τελικό προϊόν για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, όπως και στην περίπτωση της εξαγωγής (ίδιες συγκεντρώσεις, χρόνος και τάση). Από τη φωτογραφία, που λήφθηκε με έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως (Εικ. 19), έγινε εκτίμηση της επιτυχίας της αντίδρασης, του μήκους του προϊόντος που πολλαπλασιάσαμε, της ποσότητας του πολλαπλασιασμένου προϊόντος και του κατά πόσο αυτό το προϊόν έχει την κατάλληλη ποσότητα και ποιότητα (καθαρότητα), προκειμένου να χρησιμοποιηθεί στα επόμενα βήματα της πειραματικής διαδικασίας

Εικ. 19: Παράδειγμα φωτογραφίας, που λήφθηκε με έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως.

2.3.3 Καθαρισμός του προϊόντος της PCR

Για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) των προϊόντων στης PCR, θα πρέπει να απομακρυνθούν τα υπολείμματα των εκκινητών, των νουκλεοτιδίων και της πολυμεράσης από το προϊόν. Για τη διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση όλης της ποσότητας του προϊόντος της PCR, κόψιμο της αντίστοιχης ζώνης και καθαρισμός του προϊόντος από το πήκτωμα αγαρόζης.

64

Ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR έγινε με τη χρησιμοποίηση σειράς αντιδραστηρίων Nucleospin “Gel and PCR Clean-up’’ purification kit της εταιρείας MACHEREY – NAGEL με τη μέθοδο της δέσμευσης και αποδέσμευσης του DNA σε μεμβράνη πυριτίου, ακολουθώντας το πρωτόκολλο που προτείνεται από τους κατασκευαστές για τον καθαρισμό προϊόντων από πήκτωμα αγαρόζης. Στη συνέχεια ηλεκτροφορήθηκε ξανά 1 μl των δειγμάτων, όπως και στην περίπτωση της PCR, για να εκτιμηθεί η συγκέντρωση των τελικών προϊόντων της PCR. Ο προσδιορισμός των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε σε αναλυτή ABI 3730XL της εταιρείας CEMIA (Λάρισσα).

2.4 Επεξεργασία των αλληλουχιών

Η επεξεργασία των χρωματογραφημάτων των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε με τα ειδικά προγράμματα λογισμικού Chromas v.2.1.1 και Sequencher v.4.10.1, που περιλαμβάνει τη διόρθωση (με το μάτι) σφαλμάτων που προκύπτουν κατά το ‘‘διάβασμα’’της αλληλουχίας και τη στοίχιση τους (alignment), που αποσκοπεί στον προσδιορισμό των ομόλογων θέσεων των αλληλουχιών. Με βάση τις διαφορές σε αυτές τις θέσεις υπολογίζονται οι εξελικτικές σχέσεις των υπό μελέτη αλληλουχιών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε το πρόγραμμα ClustalX (Thompson et al., 1997, Larkin et al., 2007) και τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του.

2.5 Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων

Οι γενετικές αποστάσεις (ανά ζεύγη) των αλληλουχιών εκτιμήθηκαν με βάση το μοντέλο Tamura-Nei (Tamura and Nei 1993), με τη βοήθεια του φυλογενετικού προγράμματος MEGA (v. 5.0, Tamura et al. 2011) τόσο για το σετ δεδομένων που περιλαμβάνει τις βάσεις και των τριών κωδικών θέσεων, όσο και για το σετ δεδομένων που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση. Με τον ίδιο τρόπο εκτιμήθηκαν και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ επιλεγμένων κλάδων/ομάδων του φυλογενετικού δένδρου για τον μοριακό δείκτη COI. Σημειώνεται ότι οι γενετικές αποστάσεις εκτιμήθηκαν και για τα δυο διαφορετικά σετ δεδομένων, διότι αφαιρώντας την τρίτη κωδική θέση, απομακρύνεται η θέση του γονιδιώματος που συσσωρεύει τις περισσότερες ομοπλασίες. 65

2.6 Φυλογενετικές αναλύσεις

Πραγματοποιήθηκε η ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ) (Saitou & Nei, 1987), που στηρίζεται στην εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων μεταξύ των ατόμων. Η NJ πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα MEGA 5, βασισμένη στις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura–Nei (TrN) (Tamura & Nei 1993). Η στατιστική μέθοδος των bootstrap (BSPs; Felsenstein, 1985) εφαρμόστηκε για τη στατιστική υποστήριξη των κλάδων του παραγόμενου φυλογενετικού δέντρου (1000 επαναλήψεις bootstrap).

66

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1. Γενικά στοιχεία για τις αλληλουχίες του COI

Οι αλληλουχίες των 120 ειδών (από τη βάση δεδομένων της GenBank και την παρούσα εργασία) δεν περιείχαν κωδικόνια λήξης καθώς κωδικοποιούν τη σύνθεση πρωτεΐνης. Αυτό αποτελεί δείκτη της σωστής αλληλούχησης και διόρθωσης των αλληλουχιών. Το μήκος των αλληλουχιών και η νουκλεοτιδική τους σύσταση δίνεται στο παράρτημα. Γενικά πάντως, τα μήκη των αλληλουχίων των δειγμάτων του εργαστηρίου κυμαίνονταν από 636bp έως 640bp και η μέση νουκλεοτιδική σύσταση τους είναι: θυμίνη (Τ) 42,5%, κυτοσίνη (C) 13,4%, αδενίνη (Α) 24,9% και γουανίνη (G) 19,2%. Αυτή η νουκλεοτιδική σύσταση συμφωνεί με άλλες εργασίες που έχουν γίνει για το COI (Bond 2004, Sta and Savolainen 2007), αλλά δεν ισχύει το ίδιο και σε άλλα μιτοχονδριακά γονίδια, όπως το cyt b, όπως αυτό παρουσιάζεται σε αντίστοιχες μελέτες (Irwin et al. 1991, Surget-Groba et al. 2001,). Επίσης, για το σύνολο των αλληλουχιών, εκτιμήθηκε ο αριθμός και το ποσοστό των συντηρημένων θέσεων, των μεταβλητών θέσεων και των πληροφοριακών θέσεων, με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας (Πιν. 5).

Πιν. 5: Ο αριθμός και τα ποσοστά των συντηρημένων, των μεταβλητών και πληροφοριακών θέσεων, με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας, για όλες τις αλληλουχίες του γονίδιο COI.

Άτομα Συντηρημένες θέσεις Μεταβλητές θέσεις Πληροφοριακές θέσεις Όλα 272 (42,5%) 368(57,5%) 329(51,4%) Χωρίς την εξωομάδα 280(43,75%) 360(56,25%) 326(50,94%)

3.2 Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων

Για λόγους απλότητας, παρουσιάζονται από τα αποτελέσματα περιληπτικά: 1) οι μεγαλύτερες και μικρότερες γενετικές αποστάσεις μεταξύ των υπό εξέταση αλληλουχιών για το σύνολό τους και για τα διάφορα τάξα (στους Πιν. 6 και 8 παρουσιάζονται οι τιμές σε κάθε κατηγορία και στους Πιν. 7 και 9 παρουσιάζονται τα ζεύγη των αλληλουχιών/ειδών σε κάθε κατηγορία) 2) η μέση γενετική απόσταση στο

67

εσωτερικό των τάξων (Πιν. 6 και 8), 3) οι μέσες γενετικές αποστάσεις μεταξύ και εντός των τάξων στους Πιν. 10 και 11. Στους Πιν. 6 και 8 δίνονται δυο μεγάλες τιμές στην κατηγορία ‘‘όλες οι αράχνες’’, η μία είναι με το είδος Ryuthela nishihirai (Mesothelae) και η άλλη χωρίς αυτό. Αυτό έγινε, επειδή το είδος Ryuthela nishihirai (Mesothelae) είναι πολύ διαφοροποιημένο γενετικά από τις υπόλοιπες αράχνες (γι’ αυτό άλλωστε χρησιμοποιήθηκε και ως εξωομάδα), οπότε είχε σημασία να φανεί ποια ζώα (πέραν του Ryuthela nishihirai) απείχαν περισσότερο μεταξύ τους, μέσα στο υπόλοιπο φυλογενετικό δέντρο. Στους ίδιους πίνακες υπήρχαν δύο κατηγορίες με δυο μικρές τιμές, διότι η μικρότερη τιμή, σε εκείνες τις περιπτώσεις, ήταν 0 και προέρχονταν από τους οργανισμούς Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius της οικογένειας Gnaphosidae. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μηδενική αυτή τιμή επηρέασε όχι μόνο τη σύγκριση μέσα στην οικογένεια αυτή, αλλά αποτέλεσε και την κατώτατη τιμή στην κατηγορία Αρανεόμορφα που συμπεριλαμβάνει όλες τις οικογένειες που εντάσσονται στην υπόταξη αυτή. Έτσι, στις περιπτώσεις αυτές σημειωνόταν και η δεύτερη (πραγματική) μικρότερη τιμή της κάθε κατηγορίας. Ακόμη, οι γενετικές αποστάσεις κατηγοριοποιηθήκαν σε ‘‘όλες τις αράχνες’’, στο επίπεδό των υποτάξεων και στο επίπεδο των οικογενειών, με μόνο όρο η κάθε κατηγορία να περιέχει το λιγότερο τρία είδη, διότι μεταξύ δύο ατόμων δεν μπορεί να μετρηθεί μεγάλη, μικρή και μέση γενετική απόσταση. Με την κατηγοριοποίηση αυτή επιτεύχθηκε να συγκριθούν όλες αυτές οι κατηγορίες μεταξύ τους και να παρατηρηθεί το εύρος των γενετικών αποστάσεων σε κάθε μία από αυτές. Τέλος, η διαφορά των Πιν. 6, 7 και 10 με τους αντίστοιχους Πιν. 8, 9 και 11 έγκειται στο γεγονός, ότι στους πρώτους τρείς πίνακες οι γενετικές αποστάσεις βγήκαν με βάση και τις τρείς κωδικές θέσεις, ενώ στους άλλους τρεις πίνακες δεν συμπεριλαμβανόταν η τρίτη κωδική θέση.

68

Πιν. 6: Οι μεγαλύτερες, μικρότερες και οι μέσες γενετικές αποστάσεις (τρεις κωδικές θέσεις) μεταξύ των αλληλουχιών μέσα σε κάθε τάξο με βάση το μοντέλο των Tamura & Nei για τις αλληλουχίες του COI. Μέσα σε παρενθέσεις είναι 1) για τις μεγαλύτερες τιμές, η μεγαλύτερη απόσταση χωρίς την εξωομάδα Ryuthela nıshihirai και 2) για τις μικρότερες τιμές, η μικρότερη τιμή μεταξύ αλληλουχιών που δεν ανήκουν στο ίδιο είδος.

Ομάδα Μεγαλύτερη τιμή Μικρότερη τιμή Μέση τιμή

Όλες οι αράχνες 0,468 (0,384) 0 (0,002) 0,221

Araneomorpha 0,359 0 (0,002) 0,211

Mygalomorpha 0,311 0,215 0,264

Thomisidae 0,212 0,094 0,147

Salticidae 0,269 0,029 0,183

Amaurobiidae 0,041 0,019 0,032

Gnaphosidae 0,192 0 (0,008) 0,151

Philodromidae 0,157 0,055 0,119

Linyphiidae 0,258 0,128 0,187

Dysderidae 0,245 0,039 0,172

Araneidae 0,232 0,072 0,166

Ctenizidae 0,251 0,215 0,237

69

Πιν. 7: Τα ζεύγη των μεγαλύτερων και μικρότερων γενετικών αποστάσεων σε κάθε κατηγορία.

Ομάδα Ζεύγος Μεγαλύτερης τιμής Ζεύγος Μικρότερης τιμής Όλες οι αράχνες Ryuthela nishihirai - Calisoga longitarsis Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Macrothele cretica – Holcolaetis sp) (Oxyopes (lineatus – nigripalpis) ) Araneomorpha Eupoa nezha - Dysdera cf KF005631 Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Oxyopes (lineatus – nigripalpis) ) Mygalomorpha Calisoga longitarsis - Cyrtocarenum grajum Cyrtocarenum (grajum – cunicularium) Thomisidae Lysiteles sp. – Haplotamarus sp Runcinia (albostriata – acuminate) Salticidae Phaeacius cf fimbriatus – Eupoa nezha Servaea (sp. 1 – spinibarbis) Amaurobiidae Amaurobius deelemane (551–553) Amaurobius deelemane (551–552) Gnaphosidae Pterotricha lentiginosa – Anagraphis pallens Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Nomisia ripariensis (608-610) ) Philodromidae Philodromus sp. – Pagiopalus nigriventris Philodromus (lunatus – longipalpis Linyphiidae Bolyphantes alticeps – Neriene variabilis Linyphia triangularis – Microlinyphia dana Dysderidae Dysdera (ninnii – crocata) Dysdera (ninnii – cf KF005631) Dysdera (ninnii – microdonta) Araneidae Ordgarius sexspinosus – Cyclosa alba Cyclosa (mulmeinensis – vallata) Ctenizidae Cyrtocarenum grajum - Stasimopus robertsi Cyrtocarenum (grajum – cunicularium)

70

Πιν. 8: Οι μεγαλύτερες, μικρότερες και οι μέσες γενετικές αποστάσεις (χωρίς την τρίτη κωδική θέση) μεταξύ των αλληλουχιών μέσα σε κάθε τάξο με βάση το μοντέλο των Tamura & Nei για τις αλληλουχίες του COI. Μέσα σε παρενθέσεις είναι 1) για τις μεγαλύτερες τιμές, η μεγαλύτερη απόσταση χωρίς την εξωομάδα Ryuthela nıshihirai και 2) για τις μικρότερες τιμές, η μικρότερη τιμή μεταξύ αλληλουχιών που δεν ανήκουν στο ίδιο είδος.

Ομάδα Μεγαλύτερη τιμή Μικρότερη τιμή Μέση τιμή

όλες οι αράχνες 0,245 (0,194) 0 0,087

Araneomorpha 0,182 0 0,081

Mygalomorpha 0,123 0,062 0,092

Thomisidae 0,083 0,006 0,039

Salticidae 0,132 0,004 0,067

Amaurobiidae 0 0 0

Gnaphosidae 0,054 0 (0,002) 0,036

Philodromidae 0,047 0,005 0,028

Linyphiidae 0,101 0,024 0,06

Dysderidae 0,056 0,014 0,036

Araneidae 0,067 0,01 0,04

Ctenizidae 0,119 0,067 0,96

71

Πιν. 9: Tα ζεύγη των μεγαλύτερων και μικρότερων γενετικών αποστάσεων σε κάθε κατηγορία.

Ομάδα Ζεύγος Μεγαλύτερης τιμής Ζεύγος Μικρότερης τιμής Όλες οι αράχνες Ryuthela nishihirai - Eupoa nezha Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Cyrtocarenum cunicularium – Holcolaetis sp) (Oxyopes (lineatus – nigripalpis) ) Amaurobius deelemane (όλα) Araneomorpha Galianora sacha – Dysdera microdonta Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Oxyopes (lineatus – nigripalpis) ) Amaurobius deelemane (όλα) Mygalomorpha Macrothele cretica - Stasimopus robertsi Cyrtocarenum cunicularium – Nemesia sp. Thomisidae Lysiteles sp. – Cebrenninius rugosus Thomisus (sp.EU168176 – granulifrons) Salticidae Phaeacius cf fimbriatus – Eupoa nezha Servaea (incana - villosa) Servaea (incana - sp. 2) Amaurobiidae Amaurobius deelemane (όλα) (0) Gnaphosidae Pterotricha lentiginosa – Anagraphis pallens Zelotes cingarus –Civizelotes caucasius (Nomisia ripariensis (608-610) ) Philodromidae Philodromus sp. – Pagiopalus nigriventris Philodromus (lunatus – longipalpis Linyphiidae Lepthyphantes minutus – Neriene radiate Linyphia triangularis – Microlinyphia dana Dysderidae Dysdera (ninnii – crocata) Dysdera (ninnii – cf KF005631) Dysdera (ninnii – gigas) Dysdera (moravica– gigas) Dysdera (microdonta – gigas) Araneidae Ordgarius sexspinosus – Cyclosa alba Cyrtarachne akirai – Pasilobus hupingensis Ctenizidae Cyrtocarenum grajum – Stasimopus robertsi Cyrtocarenum (grajum – cunicularium)

72

Πιν. 10: Οι εκτιμώμενες γενετικές αποστάσεις και με τις τρεις κωδικές θέσεις μεταξύ των οικογενειών με βάση το μοντέλο των Tamura & Nei για τις αλληλουχίες του COI. Στη διαγώνιο οι τιμές αντιπροσωπεύουν την εντός των οικογενειών διαφοροποίηση (όπου υπάρχει παύλα ‘‘-‘’ υπήρχε μόνο ένα άτομο στην οικογένεια) που παρατηρείται βάσει του ίδιου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης 1 Araneidae, 2 Mesothelae, 3 Linyphiidae, 4 Nemesiidae, 5 Ctenizidae, 6 Hexathelidae, 7 Palpimanidae, 8 Dysderidae, 9 Thomisidae, 10 Sparassidae, 11 Philodromidae, 12 Salticidae, 13 Oxyopidae, 14 Gnaphosidae, 15 Amaurobiidae, 16 Clubionidae, 17 Zodariidae.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1. 0,17 2. 0,35 - 3. 0,21 0,4 0,19 4. 0,29 0,43 0,29 0,24 5. 0,3 0,43 0,31 0,26 0,25 6. 0,32 0,42 0,32 0,29 0,28 - 7. 0,24 0,4 0,24 0,26 0,28 0,31 0,19 8. 0,26 0,43 0,27 0,28 0,28 0,31 0,25 0,17 9. 0,22 0,38 0,22 0,28 0,28 0,28 0,24 0,27 0,15 10. 0,2 0,36 0,21 0,26 0,25 0,3 0,21 0,24 0,16 - 11. 0,21 0,36 0,22 0,29 0,3 0,31 0,22 0,27 0,21 0,19 0,12 12. 0,23 0,4 0,22 0,29 0,3 0,32 0,23 0,28 0,22 0,19 0,2 0,18 13. 0,21 0,38 0,22 0,28 0,27 0,31 0,22 0,26 0,15 0,16 0,19 0,2 0,002 14. 0,21 0,36 0,22 0,27 0,26 0,3 0,22 0,25 0,2 0,19 0,19 0,2 0,171 0,15 15. 0,19 0,37 0,21 0,27 0,27 0,3 0,22 0,24 0,18 0,17 0,18 0,18 0,168 0,18 0,03 16. 0,23 0,38 0,23 0,29 0,3 0,31 0,25 0,28 0,19 0,18 0,21 0,2 0,19 0,19 0,19 0,13 17. 0,2 0,37 0,22 0,28 0,28 0,29 0,22 0,25 0,19 0,17 0,18 0,19 0,19 0,2 0,17 0,2 -

Σε γενικές γραμμές, οι αποστάσεις (στην περίπτωση που περιλαμβάνονται και οι τρεις κωδικές θέσεις) κυμαίνονται από 0,147 έως 0,433, με τη μέση γενετική απόσταση να είναι 0,255. Στα Αρανεόμορφα οι γενετικές αποστάσεις κυμαίνονται από 0,147 έως 0,279, με μέση απόσταση το 0,210, ενώ στα Μυγαλόμορφα η διακύμανση είναι από 0,262 έως 0,289 με μέση απόσταση το 0,276. Σημειώνεται ότι η μέση γενετική απόσταση μεταξύ των Αρανεόμορφων και Μυγαλόμορφων είναι 0,288.

73

Πιν. 11: Οι εκτιμώμενες γενετικές αποστάσεις χωρίς την τρίτη κωδική θέση μεταξύ των οικογενειών με βάση το μοντέλο των Tamura & Nei για τις αλληλουχίες του COI. Στη διαγώνιο οι τιμές αντιπροσωπεύουν την εντός των οικογενειών διαφοροποίηση (όπου υπάρχει παύλα ‘‘-‘’ υπήρχε μόνο ένα άτομο στην οικογένεια) που παρατηρείται βάσει του ίδιου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης 1 Araneidae, 2 Mesothelae, 3 Linyphiidae, 4 Nemesiidae, 5 Ctenizidae, 6 Hexathelidae, 7 Palpimanidae, 8 Dysderidae, 9 Thomisidae, 10 Sparassidae, 11 Philodromidae, 12 Salticidae, 13 Oxyopidae, 14 Gnaphosidae, 15 Amaurobiidae, 16 Clubionidae, 17 Zodariidae.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 0,04 2 0,163 - 3 0,072 0,202 0,06 4 0,104 0,196 0,12 0,096 5 0,128 0,22 0,13 0,081 0,073 6 0,143 0,219 0,15 0,093 0,116 - 7 0,088 0,194 0,1 0,101 0,124 0,141 0,05 8 0,092 0,193 0,11 0,098 0,114 0,133 0,1 0,036 9 0,089 0,197 0,1 0,102 0,127 0,116 0,1 0,114 0,039 10 0,073 0,176 0,08 0,089 0,106 0,121 0,08 0,076 0,053 - 11 0,08 0,172 0,09 0,103 0,126 0,13 0,09 0,104 0,091 0,071 0,028 12 0,089 0,211 0,09 0,111 0,141 0,147 0,09 0,115 0,093 0,074 0,081 0,07 13 0,087 0,194 0,1 0,103 0,129 0,124 0,09 0,111 0,051 0,056 0,082 0,1 0 14 0,07 0,18 0,08 0,09 0,115 0,12 0,08 0,087 0,071 0,055 0,062 0,07 0,07 0,036 15 0,066 0,205 0,09 0,091 0,108 0,127 0,09 0,095 0,079 0,064 0,074 0,08 0,08 0,063 0 16 0,1 0,21 0,1 0,101 0,136 0,125 0,09 0,121 0,071 0,06 0,09 0,08 0,07 0,064 0,08 0,03 17 0,081 0,169 0,1 0,104 0,129 0,121 0,08 0,089 0,076 0,061 0,08 0,08 0,09 0,073 0,08 0,08 -

Σε γενικές γραμμές, οι αποστάσεις (στην περίπτωση που περιλαμβάνονται μόνο οι πρώτη και δεύτερη κωδικές θέσεις) κυμαίνονται από 0,051 έως 0,220, με τη μέση γενετική απόσταση να είναι 0,106. Στα Αρανεόμορφα οι γενετικές αποστάσεις κυμαίνονται από 0,051 έως 0,121 με μέση απόσταση το 0,083, ενώ στα Μυγαλόμορφα η διακύμανση είναι από 0,081 έως 0,116 με μέση απόσταση το 0,097. Σημειώνεται, ότι η μέση γενετική απόσταση μεταξύ των Αρανεόμορφων και Μυγαλόμορφων είναι 0,121.

3.3 Ανάλυση Σύνδεσης-Γειτόνων (Neighbor-Joining, NJ)

Στις Εικ. 20 και 21 παρουσιάζονται τα φυλογενετικά δέντρα βάση της μεθόδου NJ με το μοντέλο Tamura-Nei (Tamura & Nei 1993), τόσο για το dataset που περιλαμβάνει τις βάσεις και των τριών κωδικών θέσεων, όσο και για το dataset που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση. H στατιστική υποστήριξη των κλάδων εκτιμήθηκε μέσω της δοκιμασίας bootstrap, πραγματοποιώντας 1000 ψεύδο- επαναλήψεις.

74

75

Εικ. 20: Το δένδρο Neighbor-Joining βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Tamura- Nei (Tamura & Nei 1993) για το γονίδιο του COI όλων των ειδών και για τις τρεις κωδικές θέσεις. Τα ειδη στο γκρί πλαίσιο ανήκουν στην υπερτάξη των Μυγαλόμορφων. Μόνο οι τιμές bootstrap που είναι μεγαλύτερες από 50% παρουσιάζονται.

76

77

Εικ. 21: Το δένδρο Neighbor-Joining βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Tamura- Nei (Tamura & Nei 1993) για το γονίδιο του COI όλων των ειδών και για το dataset που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση. Τα ειδη στο γκρί πλαίσιο ανήκουν στην υπερτάξη των Μυγαλόμορφων. Μόνο οι τιμές bootstrap που είναι μεγαλύτερες από 50% παρουσιάζονται. 78

Σύμφωνα με την ανάλυση NJ και τα δύο φυλογενετικά δέντρα (με και χωρίς την τρίτη κωδική θέση) συγκλίνουν σε μία σχετικά κοινή τοπολογία, χαρακτηριστικό της οποίας είναι η χαμηλή στατιστική υποστήριξη των σχέσεων μεταξύ των κλάδων. Υπάρχουν όμως και εξαιρέσεις στα δύο δέντρα, όπου σχηματίζονται μονοφυλετικές ομάδες μεταξύ ατόμων του ίδιου είδους, ειδών της ίδιας οικογένειας, ακόμη και της ίδιας υπόταξης, αλλά αυτές οι περιπτώσεις είναι μεμονωμένες. Οι εξαιρέσεις αυτές είναι:

1) Η υπόταξη των Μυγαλομόρφων γενικά.

2) Όλα τα είδη των οικογενειών Dysderidae, Philodromidae, Amaurobiidae, Clubionidae και Oxyopidae.

3) Όλα τα είδη των γενών Galianora, Heliophanus, Servaea και Onomastus της οικογένειας Salticidae, Nomisia και (μόνο για το δέντρο που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση) Zelotes της οικογένειας Gnaphosidae και (μόνο για το δέντρο που περιλαμβάνει και τις τρείς κωδικές θέσεις) Ordgarius της οικογένειας Araneidae.

Κοινό τοπολογικό χαρακτηριστικό των δυο δέντρων είναι επίσης ότι το είδος Ryuthela nishihirai (Μεσόθηλα), είναι πολύ διαφοροποιημένο γενετικά από τις υπόλοιπες αράχνες και για αυτό επιλέχθηκε ως εξωομάδα. Αντίθετα, παρατηρούμε ότι και στα δύο δέντρα η οικογένεια Salticidae εμφανίζεται ιδιαίτερα διασπασμένη και συνδεόμενη με οικογένειες με τις οποίες δεν συνδέεται φυλογενετικά (βάση μορφολογικών χαρακτήρων).

3.4 DNA Barcoding

Στο διαδικτυακό τόπο www.boldsystems.org παρήχθησαν 35 φυλογενετικά δέντρα από τις αλληλουχίες των δειγμάτων του εργαστηρίου, έπειτα από την περαίωση της διαδικασίας του DNA Barcoding. Από αυτά, επιλέχτηκαν τα 25 πιο πληροφοριακά τμήματα δέντρων και παρουσιάζονται εδώ. Τα υπόλοιπα δέντρα είτε ήταν πολύ ασαφή λόγω έλλειψης κοντινής πληροφορίας (περίπτωση Dysdera gigas), είτε έδιναν

79

πανομοιότυπα αποτελέσματα με άλλα που παρουσιάζονται εδώ (περίπτωση των Amaurobiidae, Nomisia ripariensis και Zelotes cingarus – Civizelotes caucasius). Από τα υπόλοιπα ιεραρχικά neighbor-joining φυλογενετικά δέντρα παρουσιάζονται στις Εικ. 22 έως 46 τμήματά τους, που δείχνουν τους κοντινότερους αντιπροσώπους των δειγμάτων της μελέτης αναφορικά με τη βάση δεδομένων του boldsystems.

Εικ. 22: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Amaurobius deelemane (Unknown Specimen) και για τα τέσσερα δείγματα (551, 552, 553 και 554) της μελέτης). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

80

Εικ. 23: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Araneus grossus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 24: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του 81

Clubiona brevipes (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 25: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Cyrtocarenum grajum (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 26: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Cyrtocarenum cunicularium (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 27: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Dysdera spinicrus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

82

Εικ. 28: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Heliophanus patagiotus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 29: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Heriaeus simoni (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

83

Εικ. 30: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Crematoneta mutinesis (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 31: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Gnaphosa lucifaga (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

84

Εικ. 32: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Macrothele cretica (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 33: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Morgus neglectus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

85

Εικ. 34: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Nomisia exornata (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 35: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI και των δυο Nomisia ripariensis (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 36: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Oxyopes lineatus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

86

Εικ. 37: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Oxyopes nigripalpis (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 38: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Olios argilasius (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη.

Εικ. 39: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Palpimanus gibbulus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 40: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Philodromus longipalpis (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

87

Εικ. 41: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Philodromus lunatus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 42: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Pterotricha lentiginosa (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 43: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Xysticus acerbus (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 44: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI τόσο για το Zelotes cingarus όσο και για το Civizelotes caucasius (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

88

Εικ. 45: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Civizelotes solstitialis (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μπλέ ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι δημοσιευμένη, ενώ όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

Εικ. 46: Τμήμα του δένδρου Neighbor-Joining από το www.boldsystems.org, βασισμένο στις γενετικές αποστάσεις βάση του μοντέλου Kimura 2 Parameters (Kimura 1980) για το γονίδιο του COI του Zodarion musarum (Unknown Specimen). Όπου φαίνεται μαύρη ονομασία, η αλληλουχία του συγκεκριμένου είδους είναι αδημοσίευτη.

89

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

4.1. Συντηρημένες, Μεταβλητές και Πληροφοριακές θέσεις

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τόσο με την εξωομάδα Ryuthela nishihirai, όσο και χωρίς αυτήν, παρατηρείται ότι οι μεταβλητές είναι περισσότερες από τις συντηρημένες θέσεις, με αποτέλεσμα οι αλληλουχίες μεταξύ τους να εμφανίζουν μεγάλη ποικιλότητα. Ο λόγος αυτής της παρατήρησης είναι ότι χρησιμοποιείται ένας μιτοχονδριακός δείκτης, στον οποίο γίνονται συχνές μεταλλάξεις, οι οποίες συσσωρεύονται (Hebert et al. 2003), επειδή οι διορθώσεις του μιτοχονδριακού DNA δεν πραγματοποιούνται τόσο συχνά, όπως στο πυρηνικό DNA, κατά τη διαδικασία της αντιγραφής του (Wilson et al. 1985). Επιπλέον, οι πιο πολλές από τις μεταβλητές θέσεις είναι και πληροφοριακές θέσεις. Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων με την εξωομάδα Ryuthela nishihirai και χωρίς αυτήν, είναι ότι στη δεύτερη ομάδα αποτελεσμάτων αυξάνονται οι συντηρημένες και μειώνονται αναλογικά οι μεταβλητές θέσεις. Η διαφορά αυτή είναι μικρή και αναμενόμενη, επειδή το είδος Ryuthela nishihirai (Mesothelae) είναι πολύ διαφοροποιημένο γενετικά από τις υπόλοιπες αράχνες. Άρα με την παρουσία του εμφανίζονται περισσότερες μεταβλητές θέσεις.

4.2 Νουκλεοτιδικά Τμήματα και Σύσταση των Αλληλουχιών

Οι αλληλουχίες των 120 ειδών (από τη βάση δεδομένων της GenBank και την παρούσα εργασία) κωδικοποιούν τη σύνθεση της πρωτεΐνης του μιτοχονδριακού γονιδίου οξειδάση του κυτοχρώματος c υπομονάδας Ι (COI). Αν και για πιο ακριβή συμπεράσματα θα πρέπει να ελεγχθούν και άλλα τμήματα ή όλο το μιτοχονδριακό DNA, εντούτοις το COI είναι ένα αντιπροσωπευτικό τμήμα του, διότι παρουσιάζει διατηρημένες περιοχές σε όλα τα είδη αραχνών και συμπεριλαμβάνει πολυμορφισμούς μεταξύ και εντός των ειδών (Hebert et al. 2003). Στη νουκλεοτιδική σύσταση παρατηρείται ότι τα ποσοστά της θυμίνης (Τ) είναι ξεκάθαρα τα μεγαλύτερα από τα ποσοστά των άλλων αζωτούχων βάσεων, σε όλες τις αλληλουχίες των αραχνών της μελέτης μας (παράρτημα). Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα, ότι το γονίδιο ανήκει στην βαριά (H) αλυσίδα του μιτοχονδριακού DNA 90

(Meyer 1993). Τα ποσοστά της αδενίνης (Α) είναι σε γενικές γραμμές τα δεύτερα μεγαλύτερα, ενώ τα μικρότερα ποσοστά είναι της κυτοσίνης (C). Κλείνοντας, μια χαρακτηριστική απεικόνιση της γενετικής σύστασης των οργανισμών της μελέτης αποτελεί η μέση νουκλεοτιδική σύσταση (Avg.) η οποία, όπως προαναφέρθηκε, συμφωνεί με άλλες μελέτες, που έχουν γίνει για το COI (Bond 2004, Sta and Savolainen 2007).

4.3 Γενετικές Αποστάσεις

Η παρουσίαση των γενετικών αποστάσεων είναι σημαντική, διότι τα φυλογενετικά δέντρα που παράγονται σύμφωνα με το μοντέλο Neighbor Joining, βασίζονται στις αποστάσεις αυτές (Saitou & Nei 1987). Επιπλέον, η απλή παρουσίαση των φυλογενετικών δέντρων δεν είναι αρκετή. Τα φυλογενετικά δέντρα, αν και είναι εύκολα κατανοητά δίνοντας χρήσιμες πληροφορίες (όπως η οπτική παρουσίαση των δεδομένων, η ανάδειξη της φυλογενετικής πορείας και των σχέσεων μεταξύ των ειδών και τα μήκη των κλάδων του δέντρου δείχνουν μια τάση για το μέγεθος των γενετικών αποστάσεων), δεν περιέχουν αριθμητικές τιμές (πέρα από τις τιμές bootstrap), ούτε κάποια άλλη πληροφορία άμεσα συγκρίσιμη. Επομένως η παρουσίαση των γενετικών αποστάσεων είναι επιτακτική, καθώς απεικονίζονται με αριθμούς αυτά που δείχνουν τα φυλογενετικά δέντρα, τα αποτελέσματα γίνονται άμεσα συγκρίσιμα, μπορούν πλέον να πραγματοποιηθούν και άλλες στατιστικές αναλύσεις και διευκρινίζονται τυχόν παρερμηνείες, με τελικό στόχο την καλύτερη κατανόηση των φυλογενετικών δέντρων. Παρουσιάστηκαν λοιπόν, οι γενετικές αποστάσεις συμπεριλαμβανομένων των βάσεων τόσο και των τριών κωδικών θέσεων, όσο μόνο της πρώτης και δεύτερης κωδικής θέσης, γιατί έτσι θα αναδεικνυόντουσαν οι πραγματικές ομοιότητες και διαφορές μεταξύ τους, απομακρύνοντας το ‘‘θόρυβο’’ των ομοπλασιών που υπάρχει στην τρίτη κωδική θέση. Είναι εύλογο ότι στην δεύτερη περίπτωση το εύρος των μέσων τιμών των γενετικών αποστάσεων ήταν κατά πολύ μικρότερο, ενώ ορισμένες φορές ήταν και μηδενικό. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν οι γενετικές αποστάσεις των ειδών που ανήκουν στις οικογένειες Amaurobiidae και Oxyopidae. Αυτό το συμπέρασμα είναι λογικό, διότι όταν αφαιρείται η τρίτη κωδική θέση, αφαιρείται και φυλογενετική πληροφορία, που δεν είναι μόνο φυλογενετικός θόρυβος, αλλά μέρος της είναι πραγματική γενετική ανομοιότητα. Το πόσο σημαντική είναι αυτή η γενετική 91

πληροφορία που χάνεται με την αφαίρεση της τρίτης κωδικής θέσης θα πρέπει να ερευνάται κατά περίπτωση. Επιπλέον παρατηρείται ιδιαίτερα υψηλή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των αραχνών, καθώς οι αράχνες αποτελούν ένα από τα πιο πολυποίκιλα και γενετικά διαφοροποιημένα είδη στον κόσμο με 45.539 είδη (www.wsc.nmbe.ch). Βάση των αποτελεσμάτων της εργασίας, η μέγιστη γενετική απόσταση μεταξύ δύο διαφορετικών ειδών αραχνών είναι 0,468 (στα αποτελέσματα και για τις τρεις κωδικές θέσεις) και 0,245 (στα αποτελέσματα μόνο για την πρώτη και δεύτερη κωδικές θέσεις), που αποτελούν ιδιαίτερα μεγάλες τιμές γενετικών αποστάσεων. Για παράδειγμα, τα αριστερόστροφα και δεξιόστροφα σαλιγκάρια του γένους Albinaria, που συλλέχθηκαν από τοποθεσίες της Λακωνίας και της Μεσσηνίας για το ίδιο γονίδιο COI, παρουσιάζουν πιο μικρές τιμές γενετικών αποστάσεων (Σταματάκη 2013). Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν τη μεγάλη διαφοροποίηση των αραχνών σε σύγκριση με άλλους οργανισμούς.

4.4 Φυλογενετικά Δέντρα

Και τα δύο φυλογενετικά δέντρα σχηματίστηκαν σύμφωνα με το μοντέλο N.J. και αποτελούν την οπτική απεικόνιση των αποτελεσμάτων.

4.4.1 Φυλογενετικό Δέντρο που Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση

Με μια απλή παρατήρηση του φυλογενετικού δέντρου, αυτό μπορεί να διακριθεί σε 10 βασικούς κλάδους, οι οποίοι αντιστοιχούν ως έναν βαθμό στις οικογένειες, όπου ανήκουν τα 120 δείγματα της μελέτης:

Α) τα Thomisidae, τα Oxyopidae, το Sparassidae και τα Clubionidae Β) τα Amaurobiidae και από τα Salticidae, τα Onomastus Γ) τα Gnaphosidae Δ) τα Philodromidae Ε) τα υπόλοιπα Salticidae Στ) το Zodariidae Ζ) τα Palpimanidae, τα Μυγαλόμορφα και τα Dysderidae 92

Η) τα Linyphiidae Θ) τα Araneidae Ι) το Μεσόθηλο (ως εξωομάδα)

Στο συγκεκριμένο φυλογενετικό δέντρο δεν υπάρχει ισχυρή στατιστική υποστήριξη των αποτελεσμάτων και κυρίως στις διασυνδέσεις μεταξύ των οικογενειών. Οι περισσότερες τιμές boostrap είναι κάτω από το όριο αξιοπιστίας (70%), επομένως τα όποια συμπεράσματα σε πολλές περιπτώσεις δεν είναι άξια κριτικής. Εξαιρέσεις σε αυτόν τον κανόνα βρίσκονται σε διάφορες οικογένειες, οι οποίες είναι κάποια Dysderidae, τα Galianora, Heliophanus, Onomastus και Servaea από τα Salticidae, τα Philodromidae, τα Nomisia και το ζεύγος Zelotes cingarus – Civizelotes caucasius από τα Gnaphosidae, τα Amaurobiidae, τα Clubionidae, τα Oxyopidae και τα Ordgarius από τα Araneidae. Όσο για τα μήκη των κλάδων, γενικά αυτά είναι μεγάλα με εξαίρεση τα Oxyopidae, τα Onomastus και Servaea (Salticidae), τα Amaurobiidae, τα Nomisia ripariensis και το ζεύγος Zelotes cingarus – Civizelotes caucasius (Gnaphosidae), τα Philodromus (Philodromidae), τα Dysderidae και τα Cyclosa (Araneidae). Στο επίπεδο των υπερτάξεων και υποτάξεων, γενικά πέρα από το Μεσόθηλο, που λειτουργεί ως εξωομάδα, τα Μυγαλόμορφα φαίνεται ότι έχουν ισχυρή συγγένεια μεταξύ τους και όλα τα δείγματα των Μυγαλομόρφων σχηματίζουν έναν κοινό κλάδο, με ισχυρή στατιστική υποστήριξη (τιμή bootstrap 74%). Επιπλέον, οπτικά φαίνεται ότι αποτελούν μια εσωτερική ομάδα των Αρανεόμορφων. Το Μεσόθηλο, Ryuthela nishihirai, διαφέρει πολύ σε γενετικό επίπεδο από τα άλλα δείγματα αραχνών της παρούσας μελέτης, διότι αποτελεί τον μοναδικό εκπρόσωπο της συγκεκριμένης υπέρταξης. Η επιλογή του έγινε για να ελέγχεται αν το φυλογενετικό δέντρο είναι σωστό. Αυτό επιτυγχάνεται με τον εξής τρόπο: εφόσον διαφέρει σημαντικά σε γενετικό επίπεδο από τα άλλα δείγματα τις παρούσας μελέτης, το Ryuthela nishihirai δεν θα πρέπει να σχηματίζει κλάδο με κανένα άλλο δείγμα και θα πρέπει να συνδέεται απευθείας με τη ρίζα του φυλογενετικού δέντρου. Αν αυτό δεν συμβαίνει τότε σίγουρα υπάρχει κάποιο πρόβλημα με τις συγκεκριμένες αλληλουχίες. Οι οικογένειες των Μυγαλομόρφων διακρίνονται σε μονοφυλετικές ομάδες τόσο στο επίπεδο των οικογενειών, όσο και στο επίπεδο των γενών με χαμηλή στατιστική υποστήριξη στη σύνδεση των περισσοτέρων δειγμάτων. Επιπλέον, τα μήκη των 93

κλάδων τους είναι μεγάλα. Το γεγονός αυτό οφείλεται μάλλον στον αριθμό των δειγμάτων, ο οποίος είναι πολύ μικρός για την υπόταξη των Μυγαλομόρφων (μόλις έξι δείγματα για έξι είδη), οδηγώντας στην μη παραγωγή πιο λεπτομερούς εικόνας, όσο αφορά τις σχέσεις μεταξύ τόσο των ειδών όσο και των οικογενειών μέσα στα Μυγαλόμορφα. Στα Αρανεόμορφα, ξεκινώντας με τα δύο είδη Oxyopidae, η σύνδεση μεταξύ τους παρουσιάζει γενετικές αποστάσεις σχεδόν μηδενικές (0,002) με ισχυρότατη στατιστική υποστήριξη (τιμή bootstrap 99%). Επομένως, αυτά τα δύο είδη αραχνών δεν παρουσιάζουν απλώς μονοφυλετικότητα, αλλά σε μοριακό επίπεδο φαίνεται σαν να αποτελούν το ίδιο είδος. Πιθανόν είτε η διαφοροποίησή τους έγινε στο πρόσφατο παρελθόν είτε η απόστασή τους από όλα τα υπόλοιπα εξεταζόμενα άτομα να είναι πολύ σαφής, ενώ η μεταξύ τους απόσταση να μην είναι τόσο. Για να εξακριβωθεί η αλήθεια θα έπρεπε να εξεταστούν και άλλα γονίδια και πολύ περισσότερα είδη του ίδιου γένους. Τα Clubionidae σχηματίζουν μονοφυλετική ομάδα, με ισχυρή στατιστική υποστήριξη (τιμή boostrap 88%) και η γενετική τους απόσταση είναι 0,126. Επιπρόσθετα, το ένα δείγμα προέρχεται από το εργαστήριο (Clubiona brevipes), ενώ το άλλο από τη βάση δεδομένων της GenBank (Clubiona kiowa). Με αυτά τα δεδομένα, επιβεβαιώνεται η παραδοχή ότι αυτές οι δυο αλληλουχίες ανήκουν στην ίδια οικογένεια, άρα πραγματοποιήθηκε σωστή εργαστηριακή αναγνώριση και υπολογιστική εργασία. Και οι τέσσερις αλληλουχίες των Amaurobiidae είναι δείγματα της παρούσας μελέτης και δεν ανήκουν απλώς στην ίδια οικογένεια, αλλά και στο ίδιο είδος (Amaurobius deelemane). Επιπλέον, στο φυλογενετικό δέντρο παρουσιάζονται μαζί, με ισχυρότατη στατιστική υποστήριξη (τιμή bootstrap 99%). Παρατηρώντας τα Amaurobiidae, φαίνεται ξεκάθαρα ότι δεν αποτελούν ταυτόσημους οργανισμούς (όπως στην περίπτωση των Oxyopidae), επειδή τα μήκη των κλάδων τους δεν είναι μηδενικά. Όσο αφορά τις αλληλουχίες μεταξύ τους, το δείγμα 551 συνδέεται στενότερα με το δείγμα 552, ενώ το δείγμα 553 συνδέεται στενότερα με το δείγμα 554 και στην συνέχεια αυτοί οι δύο κλάδοι ενώνονται μεταξύ τους. Αυτή η σχέση απεικονίζεται στην Εικ. 20, και αντανακλά τη γεωγραφική συσχέτιση των συγκεκριμένων ατόμων, καθώς τα δύο πρώτα προέρχονται από την περιοχή της Δυτικής Κρήτης (Χανιά), ενώ τα άλλα δύο δείγματα προέρχονται, το 553 από το Ρέθυμνο και το 554 από το Λασίθι.

94

Τα Gnaphosidae στην παρούσα μελέτη, αποτελούν μια ομάδα δέκα δειγμάτων, όλα προερχόμενα από το εργαστήριο. Αυτά, σε επίπεδο οικογένειας δημιουργούν μια μονοφυλετική ομάδα με χαμηλή όμως στατιστική υποστήριξη. Επιπλέον, η μονοφυλετικότητα εμφανίζεται και σε επίπεδο γένους τόσο στα Nomisia όσο και στα Civizelotes, συμπεριλαμβανομένου του Zelotes cingarus. Πιο ειδικά στα Nomisia, το Nomisia exornata και Nomisia ripariensis ναι μεν φαίνονται, με ισχυρή στατιστική υποστήριξη (τιμή bootstrap 98%), ότι συνδέονται μεταξύ τους, αλλά δεν ταυτίζονται, καθώς έχουν γενετικές αποστάσεις 0,089 (Nomisia exornata-608Nomisia ripariensis) και 0,084 (Nomisia exornata-610Nomisia ripariensis). Απ’ την άλλη, τα δύο Nomisia ripariensis είναι σχεδόν ταυτόσημοι οργανισμοί, διότι η μεταξύ τους γενετική απόσταση είναι 0,008. Στην περίπτωση των Zelotes cingarus και Civizelotes caucasius, φαίνεται να πρόκειται για τον ίδιο οργανισμό, αφού η μεταξύ τους γενετική απόσταση είναι 0. Μάλιστα από τα αποτελέσματα, τόσο αυτού του φυλογενετικού δέντρου όσο και του επόμενου, φαίνεται ότι ο διαχωρισμός τους δεν μπορεί να γίνει με τα εργαλεία της παρούσας μελέτης (το γονίδιο COI και την ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ) βασισμένη στις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura–Nei). Αυτή η ταύτιση οργανισμών μάλλον οφείλεται σε κάποιο λάθος στην πειραματική διαδικασία (π.χ. λάθος αναγνώριση των ειδών ή χρήση λάθους ετικέτας ή κάποιο είδος μόλυνσης), αλλά επειδή το DNA από τα συγκεκριμένα δείγματα έχει εξαντληθεί και οι οργανισμοί έχουν χρησιμοποιηθεί εξ’ ολοκλήρου, δεν είναι δυνατό να ελεγχθούν. Στα Philodromidae, τα μισά δείγματα προέρχονται από τη βάση δεδομένων της GenBank (3 δείγματα) και τα άλλα μισά είναι της παρούσας εργασίας (2 δείγματα). Επίσης, οι γενετικές αποστάσεις τους κυμαίνονται από 0,055 έως 0,157, με μέσο όρο 0,127, και παρουσιάζουν, τόσο σε επίπεδο οικογένειας όσο και σε επίπεδο ειδών, μονοφυλετικές ομάδες, με ευδιάκριτη διάκριση των ειδών και με ισχυρή στατιστική υποστήριξη (η μικρότερη τιμή bootstrap είναι 84%). Πιο αναλυτικά, όλα τα είδη Philodromus σχηματίζουν έναν κοινό και αξιόπιστο κλάδο, ξεχωριστό από τον κλάδο των άλλων δύο γενών (Proernus stigmaticus και Pagiopalus nigriventris). Στον κλάδο των Philodromus, τα δείγματα της παρούσας εργασίας (Philodromus longipalpis και Philodromus lunatus) σχηματίζουν πρώτα μεταξύ τους έναν κλάδο και μετά συνδέονται με το άλλο Philodromus (Philodromus spEU168157). Αυτή η σχηματοποίηση του κλάδου των Philodromus είναι η αναμενόμενη, επειδή τα δύο 95

δείγματα του εργαστηρίου προέρχονται από την Ελλάδα, ενώ του άλλου δείγματος η προέλευση δεν είναι γνωστή, αλλά σίγουρα δεν είναι από την χώρα μας. Άρα οι οργανισμοί που βρίσκονται γεωγραφικά πιο κοντά μοιάζουν και περισσότερο. Με άλλα λόγια η γενετική απόσταση ακολουθεί τόσο την κλασική ταξινομική (όλα τα είδη του ίδιου γένους ομαδοποιούνται καταρχήν) όσο και τις γεωγραφικές αποστάσεις. Επιπροσθέτως, και στα δύο φυλογενετικά δέντρα, τα Philodromidae αποτελούν διαφορετική ομάδα αραχνών από τα Thomisidae. Οι αράχνες της οικογένειας Philodromidae μοιάζουν εμφανισιακά με τις αράχνες της οικογένειας Thomisidae και παλιότερα, οι επιστήμονες τις κατέτασσαν στην ίδια οικογένεια. Αυτή ήταν τα Thomisidae, τα οποία διακρίνονταν σε δύο υποοικογένειες, τα Philodrominae και τα Misumeninae (σημερινά Thomisidae). Γενετικά δεδομένα διαφόρων εργασιών (Benjamin et al 2008, Nandkishor et al 2014) και τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, επιβεβαιώνουν ότι αυτές οι δύο οικογένειες αραχνών είναι ξεκάθαρα διακριτές μεταξύ τους και ενισχύουν την ορθότητα του διαχωρισμού τους. Στα Salticidae παρουσιάζονται μονοφυλετικές ομάδες στο επίπεδο ειδών με ισχυρή στατιστική υποστήριξη. Πιο συγκεκριμένα, στα Onomastus η τιμή bootstrap είναι 99%, στα Heliophanus η τιμή bootstrap είναι 94%, στα Galianora η τιμή bootstrap είναι 87% και στα Servaea οι τιμές bootstrap κυμαίνονται από 73% έως 99%. Δηλαδή, αυτό το φυλογενετικό δέντρο μπορεί να διακρίνει στην οικογένεια των Salticidae τα διαφορετικά γένη και είδη με αξιοπιστία, αλλά δεν μπορεί να ομαδοποιήσει όλα μαζί τα Salticidae σε έναν κοινό κλάδο με ισχυρή στατιστική υποστήριξη. Στα Palpimanidae και τα Dysderidae παρατηρούνται μονοφυλετικές ομάδες σε επίπεδο οικογενειών με ισχυρή στατιστική υποστήριξη και στα δύο φυλογενετικά δέντρα. Συγκεκριμένα, σε αυτό το φυλογενετικό δέντρο στα Dysderidae η τιμή bootstrap είναι 91%, ενώ στο επόμενο φυλογενετικό δέντρο (που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση) παρατηρείται ότι τα Palpimanidae έχουν τιμή bootstrap 82%, και τα Dysderidae έχουν τιμή bootstrap 99%. Συμπερασματικά λοιπόν, η ανάλυση Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ) παράγει φυλογενετικά δέντρα, τα οποία μπορούν να ομαδοποιήσουν αυτές τις δύο οικογένειες. Τέλος, στα Araneidae παρατηρείται ότι σχεδόν όλα τα δείγματα της οικογένειας (εκτός από το Anepsion japonicum) σχηματίζουν μια ομάδα, αλλά με χαμηλή στατιστική υποστήριξη. Στο επίπεδο των γενών, στην πλειονότητα των δειγμάτων τα 96

γένη αναμειγνύονται, εκτός από τα δύο Ordgarius (τιμή bootstrap 96%) και τα δύο Araneus, τα οποία όμως συνδέονται μεταξύ τους με χαμηλή στατιστική υποστήριξη.

4.4.2 Φυλογενετικό Δέντρο που Δεν Περιλαμβάνει την Τρίτη Κωδική Θέση

Η βασική διαφορά αυτού του φυλογενετικού δέντρου από το προηγούμενο έγκειται στο γεγονός ότι εμφανίζει θεωρητικά λιγότερο θόρυβο, αλλά συνάμα βασίζεται σε μικρότερο αριθμό βάσεων, άρα περιλαμβάνει λιγότερη φυλογενετική πληροφορία. Επιπλέον, θα πρέπει να επισημανθεί ότι με την αφαίρεση της τρίτης κωδικης θέσης μικραίνουν οι γενετικές αποστάσεις, το οποίο φαίνεται τόσο από τα μικρότερα μήκη κλάδων αυτού του φυλογενετικού δέντρου, όσο και από τις ίδιες τις γενετικές αποστάσεις (παράγραφος 4.3). Η πιο ουσιαστική διαφορά και επιπλέον πληροφορία που μας δίνει αυτό το φυλογενετικό δέντρο σχετίζεται με την υπόταξη των Μυγαλόμορφων. Δηλαδή, αφαιρώντας την τρίτη κωδική θέση, αυξάνεται η στατιστική υποστήριξη (όλες οι τιμές bootstrap είναι πάνω από 50%, ενώ στο προηγούμενο δέντρο δεν υπάρχουν τόσο μεγάλες τιμές για αυτήν την υπόταξη) και επιλύονται οι γενετικές σχέσεις των Μυγαλόμορφων. Οι γενετικές σχέσεις που προκύπτουν παρουσιάζουν παραφυλετικότητες τόσο για τα δύο Nemesiidae, όσο και για τα τρία Ctenizidae. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν απόλυτα με δεδομένα από πυρηνικά γονίδια των Μυγαλόμορφων (Bond et al 2012), τα οποία οδηγούν στο συμπέρασμα ότι μπορεί να χρειαστεί να αναθεωρηθεί η συστηματική των Μυγαλόμορφων συνολικά. Για την υπόταξη των Αρανεόμορφων υπάρχουν δύο σημαντικές παρατηρήσεις. Αρχικά, στην οικογένεια των Thomisidae, παρατηρείται ότι τα bootstraps για ορισμένα ζεύγη ειδών αυξάνονται (π.χ. τα δύο είδη του γένους Xysticus (Xysticus spEU168182 και Xysticus acerbus)) σε σχέση με το δέντρο της Εικ. 20. Επίσης, στα άτομα των οικογενειών Amaurobiidae και Oxyopidae, παρατηρώντας τόσο τις γενετικές αποστάσεις όσο και τα φυλογενετικά δέντρα προκύπτει ότι για την ανάλυση που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση, οι γενετικές αποστάσεις και τα μήκη των κλάδων μηδενίζονται. Δηλαδή οι γενετικές διαφορές που υπήρχαν μεταξύ των δειγμάτων (στο εσωτερικό των οικογενειών) παύουν να υφίστανται και τα δείγματα φαίνονται σαν να προέρχονται από τον ίδιο οργανισμό. Ως αποτέλεσμα χάνεται γενετική πληροφορία που είναι μάλλον σημαντική, 97

διότι βάση αυτής διακρίνονταν τα είδη μεταξύ τους σε αυτές τις δύο οικογένειες στο προηγούμενο φυλογενετικό δέντρο. Επομένως, τίθενται τα ερωτήματα του κατά πόσο σημαντική είναι η γενετική πληροφορία που χάνεται και του αν η πρακτική της αφαίρεσης της τρίτης κωδικής θέσης πρέπει να εφαρμόζεται και πότε. Κλείνοντας με μια πιο γενική παρατήρηση και για τα δυο φυλογενετικά δέντρα, αν και προκύπτουν από αυτά διάφορα χρήσιμα και αξιόπιστα συμπεράσματα, παρατηρείται ότι κυρίως στις διασυνδέσεις μεταξύ των οικογενειών, οι τιμές bootstrap είναι σε πολλές περιπτώσεις κάτω από 50%. Ως εκ τούτου δεν μπορούμε να είμαστε σίγουροι για τις συγκεκριμένες διασυνδέσεις. Το φυλογενετικό δέντρο που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση σε κάποια σημεία βελτιώνει την εικόνα των σχέσεων, ενώ αλλού τη χειροτερεύει. Παραδείγματος χάρη, στα Μυγαλόμορφα στο πρώτο φυλογενετικό δέντρο υπάρχει μόνο μια αξιόπιστη τιμή (74%), ενώ στο φυλογενετικό δέντρο που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση υπάρχουν στην ίδια υπόταξη τέσσερις αξιόπιστες τιμές. Από την άλλη, στα Philodromidae, όλες οι αλληλουχίες της συγκεκριμένης οικογένειας συνδέονται μεταξύ τους με αξιόπιστες τιμές bootstrap, καθώς η χαμηλότερη τιμή που παρατηρείται είναι 84%, ενώ στο φυλογενετικό δέντρο που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση υπάρχουν μόνο τρεις αξιόπιστες τιμές bootstrap (90%, 76% και 70%).

4.4.3. Σύγκριση Αποτελεσμάτων με τη Φυλογένεση των Αραχνών

Στην προσπάθεια μας να βάλουμε τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης σε ένα γενικότερο πλαίσιο φυλογενετικών σχέσεων εντός της τάξης των αραχνών, χρησιμοποιήσαμε ένα γενικευμένο φυλογενετικό κλαδόγραμμα (Nentwig 2013) που αντικατοπτρίζει τις περισσότερες εμπεριστατωμένες και πιο σύγχρονες μελέτες για τις φυλογενετικές σχέσεις των αραχνών Από τη σύγκριση αυτή προκύπτει ότι τα Μεσόθηλα (εδώ το Ryuthela nishihirai) αποτελούν σε όλες τις περιπτώσεις τις εξωομάδες των φυλογενετικών δέντρων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα Μεσόθηλα έχουν τις περισσότερες γενετικές διαφορές από όλες τις άλλες αράχνες παγκοσμίως, και επομένως και από όλα τα δείγματα της παρούσας εργασίας, καθώς αποτελούν διαφορετική υπέρταξη από τα Οπισθόθηλα, στα οποία περιλαμβάνονται τα Μυγαλόμορφα και τα Αρανεόμορφα.

98

Από την άλλη, όλες οι υπόλοιπες οικογένειες αραχνών παρουσιάζουν σε αρκετές περιπτώσεις διαφορετική τοπολογία στο φυλογενετικό κλαδόγραμμα συγκριτικά με τα δικά μας αποτελέσματα. Αιτία αυτού είναι αφενός το γεγονός ότι η παρούσα μελέτη έχει στηριχθεί σε αποκλειστικά έναν μοριακό δείκτη, το COI, και σε κανένα άλλο χαρακτήρα, ενώ στο φυλογενετικό κλαδόγραμμα η ανάλυση έχει προκύψει από μια σειρά μοριακών και μορφολογικών χαρακτήρων. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη απουσιάζουν πολλές από τις οικογένειες αραχνών που σχετίζονται μεταξύ τους και προφανώς διαφοροποιούν τις συνδέσεις των διαφόρων κλάδων. Η πιο σημαντική απόκλιση των αποτελεσμάτων μας από τη συνολική εικόνα που παρουσιάζουν οι φυλογενετικές σχέσεις των αραχνών, είναι το γεγονός ότι τα Μυγαλόμορφα μπαίνουν μέσα στους κλάδους των Αρανεόμορφων και συνδέονται με τα Dysderidae και τα Palpimanidae (μάλιστα στο δέντρο που δεν περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση, μαζί με αυτά τα τάξα συμπεριλαμβάνονται στον ίδιο φυλογενετικό κλάδο και τα δύο Onomastus (Onomastus pethiyagodai και Onomastus rattotensis) της μελέτης, που ανήκουν στην οικογένεια Salticidae). Παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει ισχυρή στατιστική υποστήριξη αυτής της σύνδεσης, θα πρέπει να σημειώσουμε ότι, μεταξύ των οικογενειών που βλέπουμε να συνδέονται με τις εν λόγω Αρανεόμορφες οικογένειες (Dysderidae και Palpimanidae) στο φυλογενετικό κλαδόγραμμα, καμία δεν συμπεριλαμβάνεται στη μελέτη μας. Έτσι, είναι αρκετά απομακρυσμένες από όλες τις υπόλοιπες οικογένειες Αρανεόμορφων, αποτελώντας ξεχωριστές υπεροικογένειες η καθεμία (Dysderoidea και Palpimanoidea αντίστοιχα). Με εξαίρεση το είδος Labulla thoracica, της οικογένειας Linyphiidae στο πρώτο φυλογενετικό δέντρο (με τη χρήση και των τριών κωδικών θέσεων) και την οικογένεια Oxyopidae και στα δύο φυλογενετικά δέντρα μας, όλες οι άλλες οικογένειες, που περιλαμβάνονται στον πρώτο μεγάλο κλάδο, ανήκουν στις Διόνυχες αράχνες (Clubionidae, Gnaphosidae, Philodromidae, Salticidae, Sparassidae και Thomisidae) και στον ευρύτερο κλάδο RTA (Amaurobiidae και Zodariidae). Ωστόσο οι συνδέσεις μέσα στον κλάδο αυτό δεν ακολουθούν κάποια σαφή και γνωστή φυλογενετική σχέση, όπως φαίνεται από τη σύγκριση με το φυλογενετικό κλαδόγραμμα, ενώ άλλωστε δεν υποστηρίζονται από υψηλά bootstraps. Τέλος στα Araneoidea (Araneidae και Linyphiidae) εμφανίζεται παραφυλετικότητα, αφού οι δύο οικογένειες δεν πάνε μαζί, αλλά τα Linyphiidae

99

μπαίνουν στον ευρύτερο κλάδο των υπόλοιπων Αρανεόμορφων και των Μυγαλομόρφων, Dysderidae και Palpimanidae.

4.5 Φυλογενετικά Τμήματα Δέντρων του DNA Barcoding

Αναλύοντας τα τμήματα των φυλογενετικών δέντρων που παρουσιάστηκαν, γενικά όλα τα δείγματα τοποθετούνται μαζί με αλληλουχίες της ίδιας οικογένειας (παραδείγματος χάρη οι περιπτώσεις των Crematoneta mutinesis, Morgus neglectus και Heliophanus patagiotus) και τα περισσότερα, και με είδη του ίδιου γένους. Για παράδειγμα, τα Amaurobius deelemane φαίνονται ότι δημιουργούν φυλογενετικό κλάδο με αλληλουχίες του είδους Amaurobius erberi από διάφορα μέρη της Ευρώπης. Αντίθετα, στο επίπεδο του είδους, τα μισά δείγματα συνδυάζονται με αλληλουχίες άλλου είδους (π.χ. τα Philodromus longipalpis και Philodromus lunatus) και τα υπόλοιπα περίπου με αλληλουχίες του ίδιου είδους (όπως οι περιπτώσεις των Nomisia exomata και Nomisia ripariensis). Αυτό συμβαίνει, διότι ένα από τα κριτήρια με το οποίο επιλέχθηκαν τα δείγματα του εργαστηρίου ήταν να μην υπάρχει ενημερωμένη αλληλουχία στην GenBank για το κάθε επιλεγόμενο είδος. Επομένως, αναμενόταν να μην υπάρχουν ούτε στο www.boldsystems.org αντίστοιχες αλληλουχίες. Ωστόσο, στο www.boldsystems.org υπάρχουν καταχωρημένες barcode αλληλουχίες, οι οποίες δεν είναι αναρτημένες σε καμία βάση δεδομένων. Κατ’ αυτόν τον τρόπο βρέθηκαν δείγματα, τα οποία σχημάτισαν φυλογενετικούς κλάδους με αλληλουχίες του ίδιου είδους, αποτέλεσμα που καταρχήν δεν ήταν αναμενόμενο. Η μόνη εξαίρεση στη διαδικασία που περιγράφηκε, υπήρξε στην περίπτωση του είδους Olios argelasius. Το συγκεκριμένο δείγμα συνδέθηκε με δημοσιευμένη στην GenBank αλληλουχία (Moradmand et al 2014) του ίδιου είδους. Αυτό συνέβη διότι η συγκεκριμένη δημοσίευση στην GenBank πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας (πολύ μετά την επιλογή των δειγμάτων) και δεν ήταν δυνατό να είμαστε ενήμεροι γι’ αυτήν, τη δεδομένη χρονική στιγμή που έγινε η επιλογή των δειγμάτων. Επιπροσθέτως, γενικά παρατηρείται ότι τα περισσότερα από τα δείγματα δημιουργούν φυλογενετικούς κλάδους με αλληλουχίες αραχνών που προέρχονται από γειτονικές χώρες με την Ελλάδα (την Τουρκία και την Βουλγαρία), όταν αυτό είναι εφικτό, δηλαδή όταν υπάρχουν διαθέσιμες αλληλουχίες από τόσο κοντινές περιοχές. Για παράδειγμα, τα Nomisia ripariensis (δύο δείγματα), σχηματίζουν κοινό κλάδο με 100

άλλα Nomisia από την Τουρκία. Αυτά τα Nomisia δεν είναι γνωστό σε ποιο είδος ανήκουν, αλλά υποθέτουμε ότι πρέπει να είναι Nomisia ripariensis. Η περίπτωση αυτή αντανακλά τη δυνατότητα που δίνεται μέσω αυτή της διαδικασίας (του DNA barcoding και της χρήσης του διαδικτυακού τόπου boldsystems) να ταυτοποιηθούν δείγματα, των οποίων η πλήρης ταυτότητα (επίπεδο είδους) δεν ήταν για οποιονδήποτε λόγο εφικτή. Παρομοίως, τα δύο Cyrtocarenum (Cyrtocarenum grajum και Cyrtocarenum cunicularium) εμφανίζονται να σχηματίζουν κοινό φυλογενετικό κλάδο με κάποια Cyrtocarenum της Τουρκίας, που δεν είναι γνωστό σε ποιο είδος ανήκουν και αυτά. Επειδή όμως το Cyrtocarenum grajum έχει εντοπιστεί μόνο στην Ελλάδα, σε αντίθεση με το Cyrtocarenum cunicularium που βρίσκεται και στην Ελλάδα και στην Τουρκία (www.wsc.nmbe.ch), και τα μήκη των κλάδων στο Cyrtocarenum cunicularium είναι μικρότερα από του Cyrtocarenum grajum, θεωρούμε ότι τα Cyrtocarenum της Τουρκίας πρέπει να είναι Cyrtocarenum cunicularium. Για τα Oxyopes lineatus και Oxyopes nigripalpis παράχθηκε ακριβώς το ίδιο φυλογενετικό δέντρο, όπως φαίνεται στις Εικ. 36 και 37. Συγκεκριμένα, και τα δύο δείγματα φαίνεται να σχηματίζουν πανομοιότυπο κλάδο με διάφορα Oxyopes lineatus από την Τουρκία. Εάν συνδυαστεί αυτό τόσο με τις σχεδόν μηδενικές γενετικές αποστάσεις μεταξύ των δύο συγκεκριμένων δειγμάτων (0,002 στο φυλογενετικό δέντρο που περιλαμβάνει την τρίτη κωδική θέση και 0 σε εκείνο που δεν την περιλαμβάνει), όσο και με αυτά που έχουν αναφερθεί στο υποκεφάλαιο 4.4.1., προκύπτει ότι τα δύο δείγματα πιθανόν ανήκουν στο ίδιο είδος ή ότι, αν μην τι άλλο, σε γενετικό επίπεδο βρίσκονται πολύ κοντά. Η εικόνα που παρουσιάζουν τα είδη Zelotes cingarus και Civizelotes caucasius είναι αινιγματική και μάλλον παραπέμπει σε κάποιο λάθος κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Τα δύο είδη εμφανίζουν μηδενική γενετική διαφοροποίηση και σχηματίζουν κοινό φυλογενετικό κλάδο (Εικ. 44), με δύο άτομα Zelotes caucasius από τη Βουλγαρία (ας σημειωθεί ότι πολύ πρόσφατα τα είδη Zelotes caucasius και Zelotes solstitialis έχουν μεταφερθεί στο γένος Civizelotes, επομένως πρόκειται για τα ίδια είδη με διαφορετικό όνομα). Από αυτό, και αν δεχτούμε ως σωστή την αναγνώριση των δύο αλληλουχιών της Βουλγαρίας, υποθέτουμε ότι υπήρξε είτε κάποιο λάθος ή πρόβλημα στην αναγνώριση του Zelotes cingarus (ανάμιξη του γενετικού υλικού των δύο δειγμάτων, κάποιο μπέρδεμα στις ετικέτες τους ή άλλο). Σε κάθε περίπτωση, δεν είναι πλέον δυνατό να βρούμε την απάντηση, αφού και τα δύο δείγματα έχουν 101

καταστραφεί μετά την εξαγωγή του DNA. Ωστόσο εντύπωση προκαλεί η σύνδεση του άλλου είδους Civizelotes, του Civizelotes solstitialis, το οποίο συνδέεται πιο στενά με άλλα είδη του γένους Zelotes από την Τουρκία και όχι με το Civizelotes caucasius των δικών μας δειγμάτων, που θα ήταν το αναμενόμενο. Φυσικά, δεν αποκλείεται το είδος Zelotes sp. (Εικ. 45) με το οποίο το C. solstitialis συνδέεται πιο στενά, να ανήκει σε κάποιο είδος αυτής της ομάδας (Civizelotes). Το Macrothele cretica σχηματίζει κοινό φυλογενετικό κλάδο με δύο Macrothele gigas, αλλά πέραν αυτού, οι περισσότερες από τις υπόλοιπες αλληλουχίες, με τις οποίες συνδέεται, το μόνο κοινό που έχουν είναι ότι ανήκουν στην ίδια υπόταξη των Μυγαλομόρφων. Συγκεκριμένα, φαίνεται να συνδέεται με ένα Promyrmekiaphila, ένα Conothele, ένα Nemesia pannonica αλλά ακόμα και με ένα Αρανεόμορφο Dysdera scabricula (πράγμα που σχετίζεται και με την τοπολογία των φυλογενετικών δέντρων που προέκυψε). Επίσης, παρατηρούνται ιδιαίτερα μεγάλα μήκη κλάδων, που σημαίνει ότι αυτοί οι οργανισμοί δεν έχουν πάρα πολλά κοινά γενετικά χαρακτηριστικά μεταξύ τους. Ως απόρροια αυτού του κλάδου θα πρέπει να σημειωθεί η ανάγκη για περαιτέρω τόσο μελέτης όσο και περισσότερων DNA barcodes για την υπόταξη των Μυγαλομόρφων, που θα βοηθήσει στην καλύτερη αποτύπωση των φυλογενετικών σχέσεων των τάξεων που περιέχονται σε αυτήν. Το Xysticus acerbus σχηματίζει κοινό φυλογενετικό κλάδο, τόσο με αλληλουχίες του ίδιου είδους, όσο και με αλληλουχίες του Xysticus kempeleni. Αυτό μπορεί να σημαίνει, είτε ότι έχουμε εδώ μια περίπτωση υβριδισμού μεταξύ των δύο ειδών, είτε ότι πρόκειται για λανθασμένη αναγνώριση ενός από τα δύο αυτά είδη. Το δεύτερο φαίνεται να είναι πιο πιθανό, δεδομένου ότι τα άτομα του είδους X. kempeleni που παρατίθενται, αποτελούν μια ενιαία ομάδα ατόμων που όλα προέρχονται από εργαστήριο της Βουλγαρίας, ενώ εκείνα του X. acerbus προέρχονται από ξεχωριστά δείγματα εργαστηρίων της Γερμανίας και της Σλοβενίας. Θεωρώντας λιγότερο πιθανό η αναγνώριση δύο ειδών από δύο διαφορετικές ομάδες να είναι λανθασμένη, φαίνεται πιο πιθανό η αναγνώριση του X. kempeleni από τη Βουλγαρία να είναι λανθασμένη (και να αναφέρεται στο είδος X. acerbus). Αξίζει να σημειωθεί ότι η διάκριση των δύο ειδών είναι αρκετά δύσκολη, ειδικά όταν δεν υπάρχουν αρσενικά άτομα και στηρίζεται μόνο σε θηλυκά (Komnenov, προσωπική επικοινωνία).

102

5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από την παρούσα εργασία συνοψίζονται στα ακόλουθα:

1) Η υπομονάδα Ι του μιτοχονδριακού γονιδίου οξειδάση του κυτοχρώματος c (COI) αποτελεί μία έγκυρη πηγή πληροφορίας για τη μοριακή ταυτότητα των οργανισμών και για να δώσει μία πρώτη εικόνα της φυλογενετικής τους θέσης σε σχέση με άλλους συγγενικούς τους. Για το λόγο αυτό, και επειδή μπορεί η πληροφορία αυτή να εξαχθεί εύκολα και γρήγορα για τους περισσότερους 103

οργανισμούς, χρησιμοποιείται ως ο πρώτος δείκτης γενετικής πληροφορίας, αποτελώντας έτσι το βασικό εργαλείο «γενετικής αποτύπωσης» των οργανισμών. Η διαδικασία του DNA barcoding αποσκοπεί ακριβώς στην έκφραση της βιολογικής ποικιλότητας μέσω αυτής της γενετικής αποτύπωσης. 2) Με βάση το παραπάνω, η παρούσα μελέτη έδωσε τις πρώτες 35 DNA barcodes αλληλουχίες από κοινά είδη αραχνών από τον ελλαδικό χώρο για τις οποίες δεν υπήρχαν προηγούμενα δεδομένα και τις παραχώρησε στις παγκόσμιες βάσεις δεδομένων (GenBank). 3) Παρά το γεγονός ότι αυτή η μελέτη θεωρείται προκαταρκτική για την αναγνώριση των φυλογενετικών σχέσεων των αραχνών συνολικά, πραγματοποιήθηκε η ανασκευή ενός φυλογενετικού δέντρου και έγινε μια πρώτη προσέγγιση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των βασικών οικογενειών που αντιπροσωπεύουν την ελληνική αραχνοπανίδα. Το παραπάνω κατέστη δυνατό χάρη στη διαθεσιμότητα άλλων αλληλουχιών που υπάρχουν διαθέσιμες στις σχετικές παγκόσμιες βάσεις δεδομένων (www.boldsystems.org, GENBANK). 4) Η χρησιμότητα των παγκόσμιων βάσεων δεδομένων είναι πολλαπλή. Έτσι, εκτός από τη διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων των υπό μελέτη οργανισμών (και τη δυνατότητα διεύρυνσης των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη βοήθεια των ήδη υπαρχόντων αλληλουχιών), ο ερευνητής μέσω του www.boldsystems.org μπορεί να επαληθεύσει την ταξινόμηση των προς εξέταση δειγμάτων του, να επισημάνει τυχόν λάθη ή να επεκτείνει/υποβοηθήσει την πλήρη ταυτοποίηση, εάν αυτό δεν είναι δυνατό με τις κλασικές μεθόδους. Τα παραδείγματα που ακολουθούν είναι ενδεικτικά: 5) Επαληθεύτηκε και μέσω των DNA barcodes η διάκριση μεταξύ των οικογενειών Philodromidae και Thomisidae που παλιότερα εντάσσονταν σε μία, αφού η μεταξύ τους γενετική απόσταση δεν αφήνει καμία αμφισβήτηση της διάκρισής τους. 6) Μέσω της σύνδεσης των δειγμάτων με άλλα πλήρως ταυτοποιημένα δείγματα, πολλές από τις αλληλουχίες που έχουν αναγνωριστεί μέχρι το γένος (π.χ. Zelotes sp.) θα μπορούσαν να αναγνωριστούν σε είδος με σχετική ασφάλεια, ή τουλάχιστον να διευκρινιστεί πού κοντά τοποθετούνται ταξινομικά. 7) Αναδείχθηκαν πιθανά λάθη στην ταυτοποίηση των ειδών της δικής μας μελέτης ή αλληλουχιών που βρίσκονται στη βάση δεδομένων. Η περίπτωση των ειδών Zelotes cingarus και Civizelotes caucasius (Gnaphosidae) που έδωσαν 104

πανομοιότυπη γενετική ταυτότητα είναι χαρακτηριστική: αν και ο βασικός στόχος της μελέτης δεν ήταν η ταυτοποίηση των δειγμάτων, φάνηκε ότι, αν είχαν διατηρηθεί τα ζώα για επανεξέταση, μετά την εξαγωγή του DNA, θα ήταν δυνατή η ανίχνευση τυχόν λάθους στην ταξινομική αναγνώριση των δύο αυτών ειδών. Επίσης αναδείχθηκε η ασάφεια στην αναγνώριση άλλων δημοσιευμένων αλληλουχιών (όπως για παράδειγμα η περίπτωση του Xysticus acerbus (Thomisidae). 8) Οι γενετικές αποστάσεις που αναδείχθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη ακολουθούν την ταξινομική θέση των δειγμάτων πρωτίστως (οι μικρότερες αποστάσεις καταγράφονται μεταξύ ειδών του ίδιου γένους και ακολουθούν τα γένη της ίδιας οικογένειας), αλλά επίσης συχνά αποτυπώνουν τις γεωγραφικές συνδέσεις μεταξύ των τάξων που συγκρίνονται (είδη ή άτομα του ίδιου είδους συνδέονται πιο στενά όταν οι γεωγραφικές αποστάσεις μεταξύ τους είναι πιο κοντινές). 9) Στις φυλογενετικές αναλύσεις, όταν αφαιρείται η τρίτη κωδική θέση, απομακρύνεται ο φυλογενετικός θόρυβος των ομοπλασιών, δίνοντας πιθανόν πιο ξεκάθαρα αποτελέσματα στις τοπολογίες των αλληλουχιών, αλλά ενίοτε αφαιρείται και φυλογενετική πληροφορία, που αποτελεί σημαντική ή πραγματική γενετική ανομοιότητα μεταξύ των αλληλουχιών. Έτσι η εφαρμογή φυλογενετικών αναλύσεων με ή χωρίς την τρίτη κωδική θέση θεωρείται απαραίτητη. 10) Σε όλες της φυλογενετικές αναλύσεις, το είδος Ryuthela nishihirai, το οποίο ανήκει στην υπέρταξη των Μεσόθηλων, είναι το πιο διαφοροποιημένο γενετικά είδος αράχνης της εργασίας. Έτσι, αυτός ο οργανισμός, και όλα τα άλλα Μεσόθηλα, μπορούν να χρησιμοποιούνται ως εξωομάδες στα φυλογενετικά δέντρα και κλαδογράμματα, με σκοπό να επαληθεύεται η ορθότητα των αποτελεσμάτων, ειδικά όταν οι υπό μελέτη ομάδες είναι τόσο απομακρυσμένες μεταξύ τους (π.χ. όλες οι αράχνες). 11) Το πρόβλημα της ανάγκης ταξινομικής αναθεώρησης των Μυγαλόμορφων αραχνών που έχει φανεί και αλλού, αναδείχθηκε και στην παρούσα μελέτη, καθώς οι οικογένειες μέσα στην υπέρταξη παρουσιάζονται παραφυλετικές και οι μεταξύ τους σχέσεις παραμένουν ανεπίλυτες. 12) Τα Dysderidae και τα Palpimanidae, αν και ανήκον στα Αρανεόμορφα, σχηματίζουν κοινό φυλογενετικό κλάδο με τα Μυγαλόμορφα και αποτελούν τις γενετικά πιο διαφοροποιημένες οικογένειες Αρανεόμορφων της παρούσας 105

μελέτης. Το παραπάνω δεν υποστηρίζεται με πολύ μεγάλη βεβαιότητα, αλλά εμφανίζεται ως αποτέλεσμα και στις δύο φυλογενετικές αναλύσεις. Έτσι, αν πρέπει να το αξιολογήσουμε ως αληθές, τότε, αφενός δείχνει ότι οι παραπάνω δύο οικογένειες είναι πολύ απομονωμένες σε σχέση με όλα τα υπόλοιπα Αρανεόμορφα που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, αφετέρου ότι ακόμα και στο επίπεδο των υπερτάξεων των αραχνών, υπάρχει ανάγκη φυλογενετικής αναθεώρησης. 13) Μια από τις πολυπληθέστερες οικογένειες της μελέτης ήταν τα Salticidae. Τα μέλη της οικογένειας αυτής φαίνονται διασκορπισμένα και στα δύο φυλογενετικά δέντρα, αδυνατώντας να σχηματίσουν έναν κοινό φυλογενετικό κλάδο. Επιπλέον, τα διασκορπισμένα τμήματά τους είναι συνδεδεμένα με οικογένειες με τις οποίες δεν συνδέονται φυλογενετικά. Και στην περίπτωση αυτή φαίνεται να υπάρχουν ανεπίλυτες σχέσεις και προβλήματα που χρήζουν περισσότερης και πιο ενδελεχούς μελέτης.

6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

ΔΙΑΔΥΚΤΙΑΚΕΣ ΙΣΤΟΣΕΛΙΔΕΣ http://www.boldsystems.org http://www.araneae.unibe.ch http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.plosone.org http://www.dnabank-network.org/ http://www.intergenetics.eu/ http://www.scientificamerican.com/article/four-strand-dna-structure-found-cells/ http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog http://tjsgarden.com/2012/08/23/spider-that-make-tunnel-web-funnel-web-spiders/ http://www.crashonline.gr/ http://www.arachne.org.au/01_cms/details.asp?ID=2343 106

www.wsc.nmbe.ch

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Αλεπόρου-Μαρίνου Β., Αργυροκαστρίτης Α., Κομητοπούλου Αι., Πιαλόγλου Π., Σγουρίτσα Β. 2004. ΒΙΟΛΟΓΙΑ Θετικής κατεύθυνσης Γ’ τάξης Ενιαίου Λυκείου, Εκδοση Δ’, ΑΡ. Σύμβασης 133/22/03/04, Εκτύπωση-Βιβλιοδεσία: Ν. Λιάπης Βιβλιοδετική Α.Ε., σελ. 61. (PCR) Σταματακη Ε. 2013: Αντιστροφή περιέλιξης στο χερσαίο σαλιγκάρι Albinaria: τι λένε τα μοριακά δεδομένα;, Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L. 2009: Βιοχημεία, τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης Emberlin J.C. 1983. : Εισαγωγή στην οικολογία, Εκδόσεις "Τυπωθήτω", Hickman C.P., Roberts L.S., Keen S.L., Larson A., Anson H. & Eisenhour D.J. 2002. Ζωολογία Ολοκληρωμένες Αρχές. Τόμος 1. Δεύτερη Ελληνική Έκδοση. Μεταφρασμένη, Εκδόσεις Utopia Watson J.D., Caudy A. A., Myers R.M. & Witkowski J.A. 2007: Ανασυνδυασμένο DNA: ΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΑ – ΜΙΑ ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ, Τρίτη Αγγλική Έκδοση και Πρώτη Ελληνική Έκδοση, Ακαδημαικές Εκδόσεις Ι Μπάσδρα & Σία Ο.Ε., ISBN: 978-960-88412-5-3

ΞΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Amaral A.R., Sequeira M., Coelho M.M. 2007: A first approach to the usefulness of cytochrome c oxidase I barcodes in the identification of closely related delphinid cetacean species. Marine and Freshwater Research 58: 505–510. doi: 10.1071/MF07050 Ardura A., Pola I.G., Ginuino I., Gomes V., Garcia-Vazquez E. 2010: Application of Barcoding to Amazonian commercial fish labeling. Food Research International 43: 1549–1552. doi: 10.1016/j.foodres.2010.03.016

107

Ardura A., Pola I.G., Linde A.R., Garcia-Vazquez E. 2010: DNA-based methods for species authentication of Amazonian commercial fish. Food Research International 43: 2259–2302. doi: 10.1016/j.foodres.2010.08.004 Ardura A., Planes S. & Garcia-Vazquez E. 2013: Applications of DNA barcoding to fish landings: authentication and diversity assessment, ZooKeys 365: 49–65. doi: 10.3897/zookeys.365.6409 Arnedo M. A. & Ferràndez M. A. 2007: Mitochondrial markers reveal deep population subdivision in the European protected spider Macrothele Calpeiana (Walckenaer 1805) (Araneae, Hexathelidae), Conserv. Genet. DOI 10.1007/s10592- 006-9270-2. Astrin J. J., Zhou X. & Misof B. 2013: The importance of biobanking in molecular taxonomy, with proposed definitions for vouchers in a molecular context 1, ZooKeys 365: 67–70. doi: 10.3897/zookeys.365.5875 Avise J. C., Arnold J., Ball R. M., Bermingham E., Lamb T., Neigel J. E., Reeb C. A. and Saunders N. C. 1987: Intraspecific Phylogeography: The Mitochondrial DNA Bridge Between Population Genetics and Systematics Annual Review of Ecology and Systematics, Vol. 18, pp 489-522 Avise J.C. 1994: Molecular Markers, Natural History, and Evolution, Chapman & Hall, New York Ballard J.W.O. & Whitlock M.C. 2004: The incomplete natural history of mitochondria. Molecular Ecology 13: 729–744. doi: 10.1046/j.1365- 294X.2003.02063.x Barrett R. D. H. & Hebert P. D. N. 2005: Identifying spiders through DNA barcodes, Canadian Journal of Zoology, 83(3): 481-491, 10.1139/z05-024 Barbuto M., Galimberti A., Ferri E., Labra M., Malandra R., Galli P., Casiraghi M. 2010: DNA barcoding reveals fraudulent substitutions in shark seafood products: The Italian case of ‘‘palombo” (Mustelus spp.). Food Research International 43: 376– 381. doi: 10.1016/j. foodres.2009.10.009 Benjamin S.P., Dimitrov D., Gillespie R.G. and Hormiga G. 2008: Family ties: molecular phylogeny of crab spiders (Araneae: Thomisidae), Cladistics 24:(5)708-722 Bensasson D., Zhang D.-X., Hartl D.L., Hewitt G.M. 2001: Mitochondrial pseudogenes: Evolution’s misplaced witnesses. Trends Ecol Evol 16:314–321

108

Bentzen P.W., Leggett C. and Brown G.G. 1988: Length and restriction site heteroplasmy in the mitochondrial DNA of American shad (Alosa sapidissima). Genetics 118:509-518. Birky C. W. 2001: The inheritance of genes in mitochondria and chloroplasts: laws, mechanisms, and models, Annual Review of Genetics 35: 125-148. Bond J. E. 2004: Systematics of the Californian euctenizine spider genus Apomastus (Araneae : Mygalomorphae : Cyrtaucheniidae): the relationship between molecular and morphological taxonomy, Invertebrate Systematics 18(4) 361 - 376 Bond J. E., Hendrixson B. E., Hamilton1 C. A. & Hedin M. 2012: A reconsideration of the classification of the spider infraorder Mygalomorphae (Arachnida: Araneae) based on three Nuclear genes and Morphology, Volume 7, Issue 6, e38753, www.plosone.org Boore J.L. & Brown W.M. 1998: Big trees from little genomes: mitochondrial gene order as a phylogenetic tool. Current Opinion in Genetics and Development, 8:668- 674. Borisenko A.V., Lim B.K., Ivanova N.V., Hanner R.H. & Hebert P.D.N. 2008: DNA barcoding in surveys of small mammal communities: a field study in Suriname. Molecular Ecology Resources 8: 471–479. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01998.x Bosmali I., Ganopoulos I., Madesis P. and Tsaftaris A. 2012: Microsatellite and DNA-barcode regions typing combined with High Resolution Melting (HRM) analysis for food forensic uses: A case study on lentils (Lens culinaris), Volume 46, Issue 1, Pages 141–147, Food Research International Bosmans R. & Chatzaki M. 2005: A catalogue of the spiders of Greece: A critical review of all spider species cited from Greece with their localities, Arachnological Contributions, Cited by 42 Brown W. M. 1983: Evolution of animal mitochondrial DNA. Sinauer, Sunderland, Massachusetts, Brown W. M. 1985: The mitochondrial genome of animals. In: MacIntyre, RJ eds. Molecular evolutionary genetics. Plenum, New York, pp. 95-130 Bucklin A., Steinke D. & Blanco-Bercial L. 2011: DNA barcoding of marine metazoa. Annual Review of Marine Science 3: 471–508. doi: 10.1146/annurev-marine- 120308-080950 109

Chakraborty A., Sakai M. & Iwatsuki Y. 2006: Museum fish specimens and molecular taxonomy: A comparative study on DNA extraction protocols and preservation techniques. J. Appl. Ichthyol. 22, 160–166. Chatzaki M. 2010: New data on the least known zelotines (Araneae, Gnaphosidae) of Greece and adjacent regions . Zootaxa 2564, S. 43–61, ISSN 1175-5334. Clare E.L., Lim B.K., Engstrom M.D., Eger J.L., Hebert P.D.N. 2007: DNA barcoding of Neotropical bats: species identification and discovery within Guyana. Molecular Ecology Notes 7: 184–190. doi: 10.1111/j.1471-8286.2006.01657.x Clayton D.A. 1991: Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA. Annu. Rev. Cell. Biol. 7:453-478. Coddington J. A. & Levi H. W. 1991: Systematics and Evolution of Spiders (Araneae). Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 565-592 .doi: 10.1146/annurev.es.22.110191.003025 Coyle F.A. 1981: Notes on the behavior of Ummidia trapdoor spiders (Araneae, Ctenizidae), burrow construction, prey capture and the functional morphology of the peculiar third tibia, Bulletin of the British arachnological Society 5(4): 159-165 Cruaud C. and Couloux A. 2012: Genoscope - Centre National de Sequencage (Web : www.genoscope.cns.fr), BP 191 91006 EVRY cedex, France, J. Mol. Evol. 74: (1- 2)81-95 Dalton D.L. & Kotze A. 2011: DNA barcoding as a tool for species identification in three forensic wildlife cases in South Africa. Forensic Science International 207: e51– e54. doi: 10.1016/j.forsciint.2010.12.017 Dayrat B. 2005: Towards integrative taxonomy. Biological Journal of the Linnean Society 85: 407–415. doi: 10.1111/j.1095-8312.2005.00503.x Dawkins, R. 1995: River out of Eden. Basic Books, New York. Dawnay N., Ogden R., Mcewing R., Carvalho G.& Thorpe R. 2007: Validation of the barcoding gene COI for use in forensic genetic species identification. Forensic Science International 173: 1–6. doi: 10.1016/j.forsciint.2006.09.013 Decae A.E.: Diversity and distribution of mygalomorph spiders in the Mediterranean region, General introduction, Thesis submitted to the University Gent. Decae A.E. 1984: A theory on the origin of spiders and the primitive function of spider silk, Journal of arachnology 12: 21-28

110

Decae A.E. 2005: Trapdoor spiders of the genus Nemesia Audouin, 1826 on Majorca and Ibiza: taxonomy, distribution and behaviour (Araneae, Mygalomorphae, Nemesiidae), Bulletin British arachnological Society 13 (5) 145-168. Decae A.E. 2008: Patterns of Distribution and Diversity in European Mygalomorph Spiders, Natural History Museum, Bern. Switzerland, ISSN 1660-9972 Deltshev C. 2013: On the identity of the poorly known spider species Zelotes strandi (Araneae: Gnaphosidae) . Arachnologische Mitteilungen 45, S. 4–7, ISSN 1018-4171, doi:10.5431/aramit4502 DeSalle R., Birstein V.J. 1996: PCR identification of black caviar. Nature 381: 197– 198. doi:10.1038/381197a0 Dippenaar-Schoeman A. 2014: Field Guide to the Spiders of South Africa, LAPA Publishers, ISBN: 978-0-7993-6018-9 Dunlop J.A. & Selden P.A. 2009: Calibrating the chelicerate clock: a paleontological reply to Jeyaprakash and Hoy, Exp. Appl. Acarol 48:183-197. Emberlin J.C. 1983:. Εισαγωγή στην οικολογία, Εκδόσεις "Τυπωθήτω" Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39(4), 783-791. Filmer R.M. 1997: Southern African Spiders, City: BHB International / Struik. ISBN 1-86825-188-8. Filonzi L., Chiesa S., Vaghi M., Marzano F.N. 2010: Molecular barcoding reveals mislabeling of commercial fish products in Italy. Food Research International 43: 1383–1388. doi: 10.1016/j.foodres.2010.04.016 Gamache I., Jaramillo-Correa J. P., Payette S. and Bousquet J. 2003: Diverging patterns of mitochondrial and nuclear DNA diversity in subarctic black spruce: imprint of a founder effect associated with postglacial colonization. Mol. Ecol. 12, 891-901 Garcia-Vazquez E., Perez J., Martinez J.L., Pardiρas A.F., Lopez B., Karaiskou N., Casa M.F., Machado-Schiaffino G., Triantafyllidis A. 2011: High Level of Mislabeling in Spanish and Greek Hake Markets Suggests the Fraudulent Introduction of African Species. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 475–480. doi: 10.1021/jf103754r Gielly L. & Taberlet P. 1994: The use of chloroplast DNA to resolve plant phylogenies: noncoding versus rbcL sequences, Molecular Biology and Evolution : 11(5):769-77 111

Goldstein P.Z. & DeSalle R. 2011: Integrating DNA barcode data and taxonomic practice: Determination, discovery, and description. Bioessays 33: 135–147. doi: 10.1002/ bies.201000036 Goloboff P.A. 1993: A reanalysis of mygalomorph spider families, American Museum Novitates 3056:1-32 Grant R.A., Griffiths H.J., Steinke D., Wadley V. & Linse K. 2011: Antarctic DNA barcoding, a drop in the ocean? Polar Biology 34: 775–780. doi: 10.1007/s00300-010- 0932-7 Gray M.R. 1987: Distribution of the funnel web spiders, In Covacevich, J., P. Davie & J. Pearn (eds.), Toxic plants and animals: A guide for Australia. Queensland Museum, Brisbane, pp. 312-321. Greenstone M.H., Rowley D.L., Heimbach U., Lundgren J.G., Pfannenstiel R.S. and Rehner S.A. 2005. Barcoding generalist predators by polymerase chain reaction: carabids and spiders. Mol. Ecol. 14: (10) 3247-3266 Griswold C.E., Coddington J.A., Platnick N.I. & Forster R.R. 1999: Towards a Phylogeny of Entelegyne Spiders (Araneae, Araneomorphae, Entelegynae), Journal of Arachnology 27: 53-63. Gyllensten U., Wharton D., Josefson A. and Wilson A. 1991: Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice. Nature 352:255–257. Hagelberg E. 1994: Mitochondrial DNA from Ancient Bones, Springer New York, Ancient DNA, pp 195-204, DOI 10.1007/978-1-4612-4318-2_13 Hajibabaei M., Janzen D.H., Burns J.M., Hallwachs W. & Hebert P.D.N. 2006: DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 103: 968–971. doi: 10.1073/pnas.0510466103 Hajibabaei M., Singer G.A., Clare E.L. & Hebert P.D.N. 2007: Design and applicability of DNA arrays and DNA barcodes in biodiversity monitoring. BMC Biology 5: 24. doi: 10.1186/1741-7007-5-24 Harrison R. G. 1989: Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology, TREE, 4(1): 6-11 Hartl D.L., Clark A.G. 2007: Principles of Population Genetics. Sinauer and Associates, Sunderland, MA.

112

Haupt J. 2004: The Mesothelae - a monograph of an exceptional group of spiders (Araneae: Mesothelae). Zoologica 154: 8. ISSN 0044-5088, ISBN 3-510-55041-2 — Abstract Hausmann A., Haszprunar G. & Hebert P.D. 2011: DNA barcoding the geometrid fauna of Bavaria (Lepidoptera): successes, surprises, and questions. PLoS ONE 6: e17134. doi: 10.1371/journal.pone.0017134 Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L. & R. de Waard J. 2003: Biological identifications through DNA barcodes, DOI: 10.1098/rspb.2002.2218 Hebert P.D., Ratnasingham S., de Waard J.R. 2003: Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc. Biol. Sci. 270 Suppl 1: S96–9. doi:10.1098/rsbl.2003.0025. PMC 1698023. PMID 12952648. Hebert P.D.N., Stoeckle M.Y., Zemlak T.S., Francis C.M. 2004: Identification of birds through DNA barcodes. PLoS Biology 2: 1657–1663. doi: 0.1371/journal.pbio.0020312 Hebert P.D.N., de Waard J.R., Landry J.F. 2010: DNA barcodes for 1/1000 of the animal kingdom. Biology Letters 6: 359–362. doi: 10.1098/rsbl.2009.0848 Hoelzel A.R. 1993: Evolution by DNA turnover in the control region of vertebrate mitochondrial DNA. Current Opinion in Genetics and Development, 3:891-895. Hormiga G., Arnedo M. and Gillespie R.G. 2003. Speciation on a conveyor belt: sequential colonization of the hawaiian islands by Orsonwelles spiders (Araneae, Linyphiidae), Syst. Biol. 52:(1)70-88 Irwin D.M., Kocher T.D. & Wilson A.C. 1991: Evolution of the cytochrome b gene of Mammals. J. Mol. Evol., 32, 128-144. Isbister G. K. & Hirst D. 2003: "A prospective study of definite bites by spiders of the family Sparassidae (huntsmen spiders) with identification to species level", Toxicon 42 (2): 163–171, doi:10.1016/S0041-0101(03)00129-6 Jacquet J.L. & Pauly D. 2008: Trade secrets: Renaming and mislabeling of seafood. Marine Policy 32: 309–318. doi: 10.1016/j.marpol.2007.06.007 Janzen D.H., Hallwachs W., Blandin P., Burns J.M., Cadiou J.-M., Chacon I., Dapkey T., Deans A.R., Epstein M.E., Espinoza B., Franclemont J.G., Haber W.A., Hajibabaei M., Hall J.P.W., Hebert P.D.N., Gauld I.D., Harvey D.J., Hausmann A., Kitching I.J., Lafontaine D., Landry J.-F., Lemaire C., Miller J.Y., 113

Miller J.S., Miller L., Miller S.E., Montero J., Munroe E., Green S.R., Ratnasingham S., Rawlins J.E., Robbins R.K., Rodriguez J.J., Rougerie R., Sharkey M.J., Smith M.A., Solis M.A., Sullivan J.B., Thiaucourt P., Wahl D.B., Weller S.J., Whitfield J.B., Willmott K.R., Wood D.M., Woodley N.E., Wilson J.J. 2009: Integration of DNA barcoding into an ongoing inventory of complex tropical biodiversity. Molecular Ecology Resources 9 (Suppl. 1): 1–26. doi: 10.1111/j.1755- 0998.2009.02628.x Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 16:111- 120. Kmiec B., Woloszynska M., Janska H. 2006: Heteroplasmy as a common state of mitochondrial genetic information in plants and animals. Current Genetics 50: 149– 159. doi: 10.1007/ s00294-006-0082-1 Kvist L., Martens J., Higuchi H., Nazarenko A.A., Valchuk O.P. & Orell M. 2003: Evolution and genetic structure of the great tit (Parus major) complex., PMID: 12965008, [PubMed - indexed for MEDLINE], PMCID: PMC1691391 Laiou A., Mandolini L.A., Piredda R., Bellarosa R., Simeone M.C. 2013: DNA barcoding as a complementary tool for conservation and valorisation of forest resources. In: Nagy ZT, Backeljau T, De Meyer M, Jordaens K (Eds) DNA barcoding: a practical tool for fundamental and applied biodiversity research. ZooKeys 365: 197– 213. doi: 10.3897/zookeys.365.5670 Lambert D.M. 2005: Is a Large-Scale DNA-Based Inventory of Ancient Life Possible? Journal of Heredity 96: 279–284. doi: 10.1093/jhered/esi035 Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J. and Higgins D.G., 2007. Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics, 23(21): 2947–2948 Larsen N. 2010: Palystes (rain spiders, lizard-eating spiders, Iziko Museums of Cape Town, Biodiversity Explorer. Lee S. C., Chang J. T. and Tsu Y. Y. 1995a: Genetic relationships of four Taiwan mullets (Pisces: Perciformes: Mugilidae). Journal of Fish Biology 46:159-162.

114

Lee W.J., Conroy J., Huntting W., Howell N. and Kocher T.D. 1995b: Structure and evolution of teleost mitochondrial control regions. J. Mol. Evol. 41:54-66. Lopardo L. & Uhl G. 2014: Testing mitochondrial marker efficacy for DNA barcoding in spiders: a test case using the dwarf spider genus Oedothorax (Araneae : Linyphiidae : Erigoninae), CSIRO Publishing, Invertebrate Systematics, 28, 501– 521, http://dx.doi.org/10.1071/IS14017, www.publish.csiro.au/journals/is Maddison W.P. 1997: Gene trees in species trees, Systematic Biology, 46(3): 523-536 Maddison W.P. and Needham K.M. 2006: Lapsiines and hisponines as phylogenetically basal salticid spiders (Araneae: Salticidae), Zootaxa 1255:37-55 Maddison W. P. Li D., Bodner M., Zhang J., Xu X., Liu Q., Liu F. 2014: The deep phylogeny of jumping spiders (Araneae, Salticidae), Zookeys. 2014; (440): 57–87. Margulis L. 1970: Origin of Eukaryotic Cells, Yale University Press, New Haven, CT., ISBN 0-300-01353-1 Marko P.B., Lee S.C., Rice A.M., Gramling J.M., Fitzhenry T.M., McAlister J.S., Harper G.R., Moran A.L. 2004: Mislabeling of a depleted reef fish. Nature 430: 309– 310. doi: 10.1038/430309b Meglitsch P.A. 1972: Invertebrate Zoology 2nd Ed. Oxford University Press. Meiklejohn C.D., Montooth K.L. & Rand D.M. 2007: Positive and negative selection on the mitochondrial genome, TRENDS in Genetics, 23(6): 259-263 Meyer A. 1993: Evolution of mitochondrial DNA in fishes. Pp. l-38 in I? W. HOCHACHKA and T. P MOMMSEN, eds. Molecular biology frontiers, biochemistry and molecular biology of fishes. Vol. 2. Elsevier Science Publishers, Amsterdam Meyer C. P., Paulay G. 2005 DNA barcoding: error rates based on comprehensive sampling. PLoS Biology 3: e422. doi: 10.1371/journal.pbio.0030422 Miller D. D., Mariani S. 2010: Smoke, mirrors, and mislabeled cod: poor transparency in the European seafood industry. Frontiers in Ecology and the Environment 8: 517– 521. doi: 10.1890/090212 Moggridge J. T. 1873: Harvesting Ants and Trap-Door Spiders, L. Reeve & Co. London. Moggridge J. T. 1874: Supplement to Harvesting Ants and Trap-Door Spiders, L. Reeve & Co. London. Moradmand M., Schönhofer A.L., Jäger P. 2014: Molecular phylogeny of the spider family Sparassidae with focus on the genus Eusparassus and notes on the RTA-clade 115

and 'Laterigradae', Mol Phylogenet Evol. 2014 May;74:48-65. doi: 10.1016/ PMID: 24508702 [PubMed - indexed for MEDLINE] Moritz C., Dowling T.E. and Brown W.M. 1987: Evolution of animal mitochondrial DNA: Relevance for population biology and systematics. Annual Review of Ecology and Systematic, 18:269-292.

MURPHY F. & MURPHY J. 2000: An Introduction to the Spiders of South East Asia. Malaysian Nature Society, Kuala Lumpur. Nagy Z. T., Backeljau T., Meyer de M., Jordaens K. 2013: ZooKeys: DNA BARCODING: a practical tool for fundamental and applied biodiversity research, ZooKeys. 2013; Nandkishor W., Navin S., Punam T., Mumtaz B. 2014: Genetic Diversity Analysis of Crab Spider (Araneae: Thomisidae) based on RAPD-PCR, Indian Journal of Applied Research, Volume: 4, Issue: 8, ISSN - 2249-555X Naro-Maciel E., Reid B., Fitzsimmons N. N., Le M., DeSalle R., Amato G. 2009: DNA barcodes for globally threatened marine turtles: a registry approach to documenting biodiversity. Molecular Ecology Resources 10: 252–263. doi: 10.1111/j.1755-0998.2009.02747.x Neigel J., Domingo A., Stake J. 2007: DNA barcoding as a tool for coral reef conservation. Coral Reefs 26: 487–499. doi: 10.1007/s00338-007-0248-4 Nentwig W., Blick T., Gloor D., Hänggi A., Kropf C. 2012: Spiders of Europe. www.araneae.unibe.ch. Version of access date Nentwig W. 2013: Spider Ecophysiology, Appendix, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, doi: 10.1007/978-3-642-33989-9. Nichols R. 2001. Gene trees and species trees are not the same, TRENDS in Ecology & Evolution, 16(7): 358-364 Palmer J.D. 1991: Comparison of chloroplast and mitochondrial genome evolution in plants. I. In: Hermann, RG eds. (1991) Plant Gene Research, Vol. 6, Organelles. pringer-Verlag, Wien Plaisance L., Knowlton N., Paulay G., Meyer C. 2009: Reef-associated crustacean fauna: biodiversity estimates using semi-quantitative sampling and DNA barcoding. Coral Reefs 28: 977–986. doi: 10.1007/s00338-009-0543-3 Platnick N. I. & Gertsch W.J. 1976: The suborders of spiders: a cladistic analysis (Arachnida, Araneae), American Museum Novitates 2607: 1-15 116

Platnick, N. I.. 2000: A relimitation and revision of the Australasian ground spider family Lamponidae (Araneae: Gnaphosoidea). Bulletin of the American Museum of Natural History 254: 1-330. Platnick N. I.. 2003-2010: The world spider catalog, versions 3.5-10.5, American Museum of National History, New York. Ratnasingham S. & Hebert P. D. N., 2007. BOLD: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes 7, 355-364. Ratnasingham S. & Hebert P. D. N., 2013, A DNA-Based Registry for All Animal Species: The Barcode Index Number (BIN) System. PLoS ONE 8(8): e66213. Raven R.J. 1980: The evolution and biogeography of the mygalomorph spider family Hexathelidae (Araneae, Chelicerata), Journal of Arachnology. 8: 251-266. Raven R. J. 1985: The Spiders of the Infraorder Mygalomorphae (Araneae): Cladistics and Systematics, Bulletin of the American Museum of Natural History 182 (1): 1-180. Raven R.J. 1988: The current status of Australian spider systematics, pp. 37-47. In, Austin, A.D. & N.W. Heather, eds. Australian Arachnology. The Australian Entomological Society, Misc. Pub. 5.: Brisbane. Raven R. J. 2010: A review of the Mygalomorphae: biology, morphology and systematics, Book of abstract 18th International Congress of Arachnology, Siedlce, Poland Rezac M., Gasparo F., Kral J. and Heneberg P. 2014. Integrative taxonomy and evolutionary history of a newly revealed spider Dysdera ninnii complex (Araneae: Dysderidae) Zool. J. Linn. Soc. 172:(2)451-474 Riedel A., Sagata K., Suhardjono Y.R., Tänzler R. & Balke M. 2013: Integrative taxonomy on the fast track – towards more sustainability in biodiversity research. Frontiers in Zoology 10: 15. http://www.frontiersinzoology.com/content/10/1/15, doi: 10.1186/1742-9994-10-15 Roberts M. J. 1995: SPIDERS of Britain & Northern Europe, Collins Field Guide, HarperCollinsPublisers, ISBN: 0002199815 Rubinoff,D. and Holland B.S. 2005: Between Two Extremes: Mitochondrial DNA is neither the Panacea nor the Nemesis of Phylogenetic and Taxonomic Inference. Systematic Biology 54: 952-961. Rubinoff D. 2006: Utility of mitochondrial DNA barcodes in species conservation. Conservation Biology 20: 1026–1033. doi: 10.1111/j.1523-1739.2006.00372.x 117

Saitou N. & Nei M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. & Evol. 4: 406-425. Savolainen V., Cowan R.S., Vogler A.P., Roderick G.K. & Lane R. 2005: Towards writing the encyclopedia of life: an introduction to DNA barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society B 360: 1805–1811. doi: 10.1098/rstb.2005.1730 Scheffler I.E. 1999. Mitochondria, John Wiley & Sons, Inc., New York Schwartz M. and Vissing J. M.D., 2002: Paternal Inheritance of Mitochondrial DNA, New England Journal Medicine 347:576-580, DOI: 10.1056/NEJMoa020350 Shiozawa D.K., Kudo J., Evans R.P., Woodward S.R., Williams R.N., 1992. DNA extraction from preserved trout tissues. Great Basin Nat. 52, 29–34. Skaife S.H. 1963: A Naturalist Remembers, Longmans South Africa. Smith M.A., Fisher B.L., Hebert P.D.N. 2005: DNA barcoding for effective biodiversity assessment of a hyperdiverse arthropod group: the ants of Madagascar. Philosophical Transactions of the Royal Society B 360: 1825–1834. doi: 10.1098/rstb.2005.1714 Sonet G., Jordaens K., Braet Y., Bourguignon L., Dupont E., Backeljau T., De Meyer M., Desmyter S. 2013: Utility of GenBank and the Barcode of Life Data Systems (BOLD) for the identification of forensically important Diptera from Belgium and France. In: Nagy ZT, Backeljau T, De Meyer M, Jordaens K (Eds) DNA barcoding: a practical tool for fundamental and applied biodiversity research. ZooKeys 365: 307– 328. doi: 10.3897/ zookeys.365.6027 Stahls G. & Savolainen E. 2007, MtDNA COI barcodes reveal cryptic diversity in the Baetis vernus group (Ephemeroptera, Baetidae) Stahls G., Vujic A., Perez-Banon C., Radenkovic S., Rojo S. & Petanidou T. 2009, COI barcodes for identification of Merodon hoverflies (Diptera, Syrphidae) of Lesvos Island (Greece), Volume 9, Issue 6, pages 1431–1438, Molecular Ecology Resources Surget-Groba Y., Heulin B., Guillaume C.P., Thorpe R.S., Kypriyanova L., Vogrin N., Maslak R., Mazzotti S., Venczel M., Ghira I., Odierna G., Leontyeva O., Monney J. C. & Smith N. 2001. Intraspecific Phylogeography of Lacerta vivipara and the Evolution of Viviparity. Mol. Phyl. Evol., 18(3), 449-459. Taanman J.W. 1999: The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta 1410:103-123.

118

Tamura K. & Nei M. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10: 512-526. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M. & Kumar S., 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731- 2739. Theodoridis S., Stefanaki A., Tezcan M., Aki C., Kokkini S. & Vlachonasios K. E. 2012, DNA barcoding in native plants of the Labiatae (Lamiaceae) family from Chios Island (Greece) and the adjacent Çeşme-Karaburun Peninsula (Turkey), Volume 12, Issue 4, pages 620–633, Molecular Ecology Resources Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. & Higgins D.G. 1997: The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool. Nucleic Acids Research 24: 4876-4882. Thorell T. 1870: On European spiders, Nova Acta R. Soc. Scient. upsal., (3)7: 109- 242. Toews D.P.L. & Brelsford A. 2012: The Biogeography of Mitochondrial and Nuclear Discordance in Animals. Molecular Ecology 21: 3907–3930. doi: 10.1111/j.1365- 294X.2012.05664.x Triantafyllidis A., Bobori D., Koliamitra C., Gbandi E., Mpanti M., Petriki O. & Karaiskou N. 2011, DNA barcoding analysis of fish species diversity in four north Greek lakes, Vol. 22, No. S1 , Pages 37-42 (doi:10.3109/19401736.2010.542242) Valentini A., Pompanon F., Taberlet P. 2009: DNA barcoding for ecologists. Trends in Ecology & Evolution 24: 110–117. doi: 10.1016/j.tree.2008.09.011 Vink C.J., Thomas S.M., Paquin P., Hayashi C.Y., Hedin M. 2005: The effects of preservatives and temperatures on arachnid DNA. Invertebrate Systematics 19: 99–104. doi: 10.1071/ IS04039 Viricel A. & Rosel P.E. 2012: Evaluating the utility of COI for cetacean species identification. Marine Mammal Science 28: 37–62. doi: 10.1111/j.1748- 7692.2010.00460.x Vollmer N.L., Viricel A., Wilcox L., Moore M.K., Rosel P. 2011: The occurrence of mtDNA heteroplasmy in multiple cetacean species. Current Genetics 57: 115-131. doi: 10.1007/ s00294-010-0331-1 119

Ward R.D., Hanner R., Hebert P.D.N. 2009: The campaign to DNA barcode all fishes, FISHBOL. Journal of Fish Biology 74: 329–356. doi: 10.1111/j.1095- 8649.2008.02080.x Shokralla S, Singer G, Hajibabaei M (2010) Direct PCR amplification and sequencing of specimens’ DNA from preservative ethanol. BioTechniques 48: 233–234. doi: 10.2144/000113362 Waugh J. 2007: DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls, Issue BioEssays, DOI: 10.1002/bies.20529 Wiemers M., Fiedler K. 2007: Does the DNA barcoding gap exist? – a case study in blue butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae). Frontiers in Zoology 4: 8. doi: 10.1186/1742-9994-4-8 Will K.W., Mishler B.D., Wheeler Q.D. 2005: The perils of DNA barcoding and the need for integrative taxonomy. Systematic Biology 54: 844–851. doi: 10.1080/10635150500354878 Wilson E., Larson D., Young L., & Sprague K. 1985: A large region controls tRNA gene transcription. J Mol Biol, 183, 153-63. Wilson A. C., Cann R. L., Carr S. M., George M., Gyllensten U. B., Helm- Bychowski K. M., Higuchi R. G., Palumbi S. R., Prager E. M., Sage R. D. and Stoneking M., 1985: Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological Journal of the Linnean Society, 26: 375–400. doi: 10.1111/j.1095- 8312.1985.tb02048.x Wolfe K.H., Li W.-H., Sharp P.M. 1987: Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAs. Proc Natl Acad Sci USA 84:9054–9058 Wolstenholme D.R. 1992: Genetic novelties in mitochondrial genomes of multicellular animals. Current Opinion in Genetics and Development, 2:918-925. Wong E.H.K., Hanner R.H. 2008: DNA barcoding detects market substitution in North American seafood. Food Research International 41: 828–837. doi: 10.1016/j.foodres.2008.07.005 Xu X., Fengxiang L, Jian C., Hirotsugu O., Daiqin L. & Matjaž K. 2015: A genus- level taxonomic review of primitively segmented spiders (Mesothelae, Liphistiidae). ZooKeys, 488: 121-151. doi: 10.3897/zookeys.488.8726

120

Zouros E., Freeman K.R., Oberhauser-Ball A. and Pogson G.H. 1992: Direct evidence for extensive parental mitochondrial DNA inheritance in the marine mussel Mytilus. Nature 359:412-414.

7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: η μέση νουκλεοτιδική σύσταση των αλληλουχιών, το μήκος τους για το κάθε είδος ξεχωριστά και ο μέσος όρος αυτών (Avg.).

Είδη T(U) C A G Total

1. 513Cyrtocarenum grajum 42,0 13,3 23,0 21,7 640,0

2. 536Cyrtocarenum cunicularium 44,7 12,3 18,9 24,1 640,0

3. 542Nemesia sp 40,6 12,7 23,0 23,7 638,0

4. 550Palpimanus gibbulus 43,6 13,2 21,9 21,3 638,0

5. 551Amaurobius deelemane 42,8 12,0 27,5 17,7 640,0

6. 552Amaurobius deelemane 42,8 11,9 28,0 17,3 640,0

7. 553Amaurobius deelemane 43,1 11,9 27,5 17,5 640,0

8. 554Amaurobius deelemane 43,3 11,7 28,1 16,9 640,0

9. 555Dysdera gigas 41,2 12,8 20,8 25,2 639,0

10. 556Dysdera spinicrus 40,2 12,7 23,6 23,6 640,0

11. 560Nomisia exornata 43,8 12,3 23,9 20,0 640,0

12. 561Civizelotes solstitialis 42,3 12,3 25,8 19,5 640,0

13. 562Zelotes cingarus 41,4 12,0 27,3 19,2 640,0

121

14. 563Anagraphis pallens 41,6 12,7 25,9 19,8 640,0

15. 565Pterotricha lentiginosa 43,0 12,8 24,9 19,2 639,0

16. 606Macrothele cretica 39,6 14,9 20,9 24,5 636,0

17. 607Araneus grossus 38,4 14,4 27,7 19,5 640,0

18. 608Nomisia ripariensis 43,3 12,3 24,1 20,3 640,0

19. 609Philodromus longipalpis 41,8 12,4 28,2 17,7 639,0

20. 610Nomisia ripariensis 43,3 12,3 24,2 20,2 640,0

21. 611Mogrus neglectus 42,5 12,7 25,9 18,9 640,0

22. 612Micaria caarctata 42,3 12,7 25,6 19,4 640,0

23. 614Clubiona brevipes 40,6 13,1 28,3 18,0 640,0

24. 615Crematoneta mutinesis 43,3 13,1 23,9 19,7 640,0

25. 617Heliophanus patagiotus 41,9 13,1 25,9 19,1 640,0

26. 618Pellenes moreanus 43,1 12,8 24,4 19,7 640,0

27. 620Oxyopes lineatus 42,8 12,3 26,7 18,1 640,0

28. 621Oxyopes nigripalpis 42,8 12,3 26,9 18,0 640,0

29. 622Olios argelasius 43,0 12,8 24,5 19,7 640,0

30. 624Gnaphosa lucifaga 41,4 13,1 25,8 19,7 640,0

31. 626Civizelotes caucasius 41,5 11,9 27,3 19,3 638,0

32. 627Philodromus lunatus 41,6 13,0 28,1 17,3 640,0

33. 628Zodarion musarum 42,7 13,6 25,9 17,8 640,0

34. 632Heriaeus simoni 43,6 13,6 23,6 19,2 640,0

35. 633Xysticus acerbus 43,3 13,1 25,3 18,3 640,0

36. Anepsion depressumAB808480 42,2 13,6 25,3 18,9 609,0

37. Anepsion japonicumAB808476 40,9 14,4 25,1 19,5 609,0

38. Araneus diadematusJN018130 42,1 13,2 24,9 19,7 598,0

39. Argiope amoenaNC 024282 40,3 15,2 24,8 19,7 640,0

40. Argiope bruennichiNC 024281 39,7 13,3 26,9 20,2 640,0

41. Bobaropactus spEU168187 43,0 14,3 25,1 17,5 446,0

122

42. Bolyphantes alticepsAY078691 41,3 13,9 23,0 21,9 640,0

43. Calisoga longitarsisEU523754 39,8 13,3 19,5 27,3 640,0

44. Cebrenninius rugosusEU168175 45,2 14,6 22,7 17,6 529,0

45. Clubiona kiowaDQ029240 39,1 13,7 27,7 19,4 350,0

46. Cyclosa albaAB453390 39,2 15,9 24,8 20,1 592,0

47. Cyclosa maritimaAB453763 40,0 14,4 27,2 18,4 592,0

48. Cyclosa mulmeinensisAB453766 41,2 13,3 27,0 18,4 592,0

49. Cyclosa sachikoaeAB453770 39,7 14,4 26,0 19,9 592,0

50. Cyclosa vallataAB453771 41,6 13,2 26,7 18,6 592,0

51. Cyriogonus spEU168168 42,9 14,0 24,0 19,1 529,0

52. Cyrtarachne akiraiAB820892 42,4 12,4 26,8 18,4 630,0

53. Cyrtarachne nagasakiensisAB820 38,7 15,9 25,2 20,2 630,0

54. Cyrtarachne yunoharuensisAB820 40,8 13,2 26,3 19,7 630,0

55. Diaea spEU168169 43,4 14,1 25,3 17,1 525,0

56. Diaea subdolaEU168174 44,2 13,4 25,9 16,4 529,0

57. Dysdera cfKF005631 41,2 12,8 21,3 24,7 563,0

58. Dysdera crocataJN018196 40,2 13,1 20,3 26,4 640,0

59. Dysdera microdontaKF005620 41,6 11,9 22,6 23,8 562,0

60. Dysdera moravicaKF005638 42,3 13,0 21,5 23,3 563,0

61. Dysdera ninniiKF005624 41,6 12,4 22,6 23,4 563,0

62. Dysdera sp 1KF005625 40,6 12,8 21,6 25,0 640,0

63. Epidius parvatiEU168163 43,3 15,9 23,8 17,0 471,0

64. Eupoa nezhaEF201668 47,1 12,0 25,0 15,9 408,0

65. Frontinella communisDQ029221 44,7 14,8 22,5 17,9 418,0

66. Galianora bryicolaDQ665758 44,9 13,5 24,8 16,9 408,0

67. Galianora sachaDQ665754 43,9 13,6 23,8 18,7 412,0

68. Goleba lyraDQ665755 44,8 15,4 23,6 16,2 402,0

69. Grammonota texanaDQ029222 43,8 13,6 23,7 18,9 418,0

123

70. Habronattus oregonensisAY57114 42,7 12,8 24,5 20,0 640,0

71. Haplotamarus spEU168173 43,2 13,8 26,0 17,0 465,0

72. Heliophanus cupreusDQ665756 45,3 13,1 23,8 17,8 411,0

73. Holcolaetis sp d036DQ665757 42,8 13,3 26,0 17,9 407,0

74. Labulla thoracicaAY078694 42,2 12,7 24,6 20,6 545,0

75. Lepthyphantes minutusAY078689 39,5 13,9 26,3 20,3 640,0

76. Linyphia triangularisAY078693 42,7 13,8 23,0 20,6 640,0

77. Lysiteles spEU168183 42,6 14,7 24,0 18,6 462,0

78. Lysiteles spEU168184 44,8 13,6 24,4 17,2 529,0

79. Mecynogea lemniscataDQ029239 41,1 14,4 28,0 16,5 418,0

80. Mermessus fradeorumKJ561375 43,2 12,5 26,8 17,5 600,0

81. Microlinyphia danaAY078690 42,5 14,4 23,0 20,2 640,0

82. Monases spEU168172 44,2 13,8 25,1 16,8 529,0

83. Monases spEU168186 43,9 13,6 24,6 17,9 435,0

84. Neriene radiataAY078696 44,3 14,8 25,8 15,1 418,0

85. Neriene variabilisAY078699 40,9 16,3 22,2 20,6 418,0

86. Onomastus pethiyagodaiEU168160 46,1 12,7 25,0 16,1 527,0

87. Onomastus rattotensisEU168158 45,6 12,7 23,4 18,3 529,0

88. Ordgarius hobsoniAB820882 42,2 13,2 24,8 19,8 630,0

89. Ordgarius sexspinosusAB820885 44,4 12,2 24,9 18,4 630,0

90. Orsonwelles malusAY078697 42,1 14,8 23,2 19,9 418,0

91. Oxytate taprobaneEU168161 43,9 13,0 23,6 19,5 529,0

92. Pagiopalus nigriventrisEU16815 43,9 12,7 27,4 16,1 529,0

93. Palpimanidae sp 1KP201208 42,7 12,7 23,1 21,6 640,0

94. Pasilobus hupingensisAB820887 41,6 12,5 27,1 18,7 630,0

95. Phaeacius cf fimbriatusDQ66575 41,5 13,4 27,1 18,0 410,0

96. Phidippus audaxDQ029234 45,0 14,1 23,7 17,2 418,0

97. Philodromus spEU168157 42,9 14,4 26,1 16,6 529,0

124

98. Pityohyphantes costatusAY07869 44,5 13,9 25,4 16,3 418,0

99. Proernus stigmaticusEU168156 43,7 14,0 25,9 16,4 501,0

100. Pseudoporrhopis granumEU168170 45,2 13,6 24,4 16,8 471,0

101. Runcinia-acuminataEU168166 43,5 14,0 25,5 17,0 529,0

102. Runcinia albostriataEU168178 41,8 14,2 26,7 17,4 529,0

103. Ryuthela nishihiraiAB778127 32,7 22,0 29,4 15,9 578,0

104. Servaea incanaJF949752 43,7 13,5 26,0 16,8 423,0

105. Servaea sp 1JF949741 44,0 13,5 24,3 18,2 423,0

106. Servaea sp 2JF949750 43,0 14,2 24,8 18,0 423,0

107. Servaea spinibarbisJF949740 44,4 13,2 24,6 17,7 423,0

108. Servaea villosaJF949749 44,2 13,5 25,8 16,5 423,0

109. Sitticus palustrisDQ665760 45,9 13,7 24,1 16,3 410,0

110. Stasimopus robertsiJN018121 44,0 12,3 18,6 25,1 618,0

111. Stephanopis spEU168167 43,5 13,6 24,8 18,1 529,0

112. Stephanopis spEU168185 43,5 14,6 26,4 15,5 439,0

113. Thomisops pigerEU168171 44,2 13,8 24,8 17,2 529,0

114. Thomisus granulifronsEU168162 43,1 13,2 27,4 16,3 529,0

115. Thomisus spEU168164 42,3 13,0 28,2 16,6 447,0

116. Thomisus spEU168176 41,8 14,3 25,8 18,1 481,0

117. Thrandina paroculaDQ665761 46,3 12,3 25,1 16,3 406,0

118. Tmarus angulatusEU168180 42,7 13,3 27,0 17,0 525,0

119. Xysticus californicusEU168181 45,9 14,2 24,0 15,9 529,0

120. Xysticus spEU168182 43,6 13,8 23,5 19,1 528,0

121. Avg. 42,5 13,4 24,9 19,2 556,0

125