UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR Caracterização proteometabolômica dos componentes da teia da aranha Nephila clavipes utilizados na estratégia de captura de presas Franciele Grego Esteves Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio . Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular. Rio Claro São Paulo - Brasil Março/2017 FRANCIELE GREGO ESTEVES CARACTERIZAÇÃO PROTEOMETABOLÔMICA DOS COMPONENTES DA TEIA DA ARANHA Nephila clavipes UTILIZADOS NA ESTRATÉGIA DE CAPTURA DE PRESA Orientador: Prof. Dr. Mario Sergio Palma Co-Orientador: Dr. José Roberto Aparecido dos Santos-Pinto Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Campus de Rio Claro-SP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Celular e Molecular. Rio Claro 2017 595.44 Esteves, Franciele Grego E79c Caracterização proteometabolômica dos componentes da teia da aranha Nephila clavipes utilizados na estratégia de captura de presas / Franciele Grego Esteves. - Rio Claro, 2017 221 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Mario Sergio Palma Coorientador: José Roberto Aparecido dos Santos-Pinto 1. Aracnídeo. 2. Seda de aranha. 3. Glândulas de seda. 4. Toxinas. 5. Abordagem proteômica shotgun. 6. Abordagem metabolômica. I. Título. Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP Dedico esse trabalho à minha família e aos meus amigos. Agradecimentos AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus primeiramente por me fortalecer no dia a dia, por me capacitar a enfrentar os obstáculos e momentos difíceis da vida. Por me encorajar e estar ao meu lado na jornada que escolhi seguir e para a nova a qual Ele me guiará. E por acreditar e confiar que de alguma maneira está “olhando por mim”, me auxiliando a fazer as melhores escolhas para alcançar meus sonhos, objetivos e conquistas. Agradeço a minha mãe Adriana e o meu pai Cleber Cassiano por sempre estarem ao meu lado, pelo exemplo de pessoas de força, caráter, superação e fé. Vocês são inspiração para meu crescimento e amadurecimento pessoal, obrigada por transmitirem a mim valores tão preciosos, os quais me permitiram chegar até aqui! Obrigada pelo amor, paciência e por aceitarem as minhas escolhas. Ao meu irmão Lucas pelo companheirismo, risadas e momentos de distração. Eu amo muito vocês três! Aos meus avós Anabela e Paschoal, Aparecida e Osvaldo pelo apoio e o incentivo aos estudos, por confiarem em mim e no meu potencial.... Agradeço a todos pelo apoio, amor e carinho, enfim, toda a atitude e pensamentos positivos de vocês foram fundamentais para que eu chegasse até esta etapa da minha vida! Agradeço a minha amiga Manoela (Manu), pela amizade de anos, pelo carinho, troca de experiências e risadas, os nossos encontros são os melhores. Ao Julio pelo carinho e a amizade construída! Pela paciência, apoio e por me escutar sempre! E me fazer sorrir até nos momentos em que isso seria a última coisa que eu faria. Ao kenny pela amizade, conselhos e risadas! Maria Julia, Mitra e Letícia pela amizade mantida até hoje, mesmo que a distância.... Obrigada por vibrarem comigo a cada conquista e sempre torcerem pelo meu melhor! Sem dúvida vocês tiveram um papel fundamental neste percurso. Agradeço o meu orientador, Prof. Dr. Mario Sergio Palma, pela oportunidade, ensinamentos, orientação, e pelo exemplo de postura profissional e dedicação à pesquisa. Obrigada por nesses anos me ensinar o que é a ciência, para onde ela nos leva e quais são as responsabilidades quando decidimos e escolhemos seguir a carreira acadêmica, a qual representa “um universo” do prazer do conhecimento e aprendizagem, de mais perguntas do que respostas, de desafios e dificuldades, mas também de grandes oportunidades. Enfim, obrigada pela oportunidade cedida, por transferir a mim o conhecimento e amor pela ciência, pela paciência, e confiança em mim depositada. Muito obrigada! Agradeço também ao grupo do Laboratório de Biologia Estrutural e Zooquímica: Anally (Ana), Bibiana (Bibi), Caroline (Carol), José Roberto (Beto), Kenny, Agradecimentos Marcel e Nathalia, por toda ajuda direta ou indiretamente concedida e pela troca de experiências profissionais e conversas não profissionais também. Agradeço em especial ao meu co-orientador Dr. José Roberto, pela ajuda e dedicação durante o desenvolvimento deste trabalho, pela paciência e por todo ensinamento e conhecimento científicos transmitidos a mim! Você foi fundamental no meu amadurecimento profissional e desenvolvimento do trabalho em grupo. E claro, obrigada pelas conversas, risadas e pela amizade construída! A Caroool, pela troca de experiências profissionais, conversas e risadas! Agradeço a vocês por todo nosso empenho, esforço e trabalho em equipe, tentando dar o nosso melhor sempre! Considero ter sorte por ter colegas de trabalho como vocês. Contem sempre comigo. Enfim, obrigada pelo apoio e pela ENORME ajuda. Vocês são parte deste trabalho. Agradeço à Universidade pela infraestrutura e pelo apoio acadêmico. Ao Luiz, a Ivana e o Felipe da Pós-graduação, sempre atenciosos! Agradeço aos funcionários por todos os serviços prestados e ao CEIS pela infraestrutura e materiais cedidos. A FAPESP, pelo suporte financeiro concedido durante o desenvolvimento deste projeto (Proc. 2015/14220-8), junto ao programa BIOprocpecTA/FAPESP (Proc. 2011/51684-1). Agradeço especialmente a todas as aranhas que foram utilizadas no presente estudo, em prol do conhecimento e desenvolvimento da ciência. “Um dia você aprende que o tempo não é algo que possa voltar para trás, e que não importa em quantos pedaços seu coração foi partido, o mundo não vai parar para que você o conserte. Portanto... plante seu jardim e decore sua alma, ao invés de esperar que alguém lhe traga flores. E você aprende que realmente pode suportar... que realmente é forte, e que pode ir muito mais longe depois de pensar que não se pode mais. E que realmente a vida tem valor e que você tem valor diante da vida! ” - Willian Shakespeare “Assim cada pessoa deixa sua marca em minha vida para sempre, umas porque me ajudam na construção, outras porque me apresentam projetos de sonho e outras ainda porque me desafiam a construí-los” (autor desconhecido modificado por Franciele). Enfim, á todos o meu MUITO OBRIGADA! Lista de abreviações e símbolos LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS FA - Ácido fórmico % - por cento α - Alfa FDR - False Discovery Rate β - Beta FLA - Glândula flageliforme ∆ - Delta FM - Fórmula molecular °C - Graus Celsius FOG - termonebulizador γ - gama GC - Cromatografia gasosa µg - Micrograma GC-MS - Cromatografia gasosa acoplada ao espectrometro de massas µL - Microlitro GCxGC-MS - Cromatografia gasosa bidimensional abrangente acoplada ao espectrômetro de massas ϕ - Diâmetro GO - Gene Ontology Å - Ângstron HFBA - ácido Heptafluorobutírico ACN - Acetonitrila HPLC - Cromatografia líquida de alta pressão IAA - Iodoacetamida AGRE - Glândula agregada iGlu - receptores ionotróficos de glutamato AMA - Glândula ampulada maior AME - Glândula ampulada menor IP - Índice de Preferência CID - Dissociação induzida por colisão kDa - Kilodalton cm - Centímetro L/min - Litros por minuto Da - Dalton LC-MS/MS - Cromatografia líquida acoplada a espectrometro de massas DDT - Ditreitol LC-MS-IT-TOF - Cromatografia líquida acoplada ao espectrometro de massas ion trap time-of-fligth DI - Diâmetro M - Molar ECD - Dissociação por captura de elétrons MEV - Microscopia eletrônica de varredura ESI - Ionização por eletrospray MET - Microscopia eletrônica de transmissão ETD - Dissociação por transferência de elétrons mg - Miligrama Lista de abreviações e símbolos mL - Mililitros SCAN - varredura de espectro mL/min - Mililitros por minuto TFA - Ácido trifluoracético ML - Microscopia de luz TIC - Cromatograma de íons totais Min – minutos Tr1 - tempo de retenção da primeira dimensão mM - Milimolar Tr2 - tempo de retenção da segunda dimensão mm - Milímetros UBV - ultrabaixo volume MS - Espectrometria de massas US$ - dólares MS/MS - Espectrometria de massas sequencial ug/cm² - micrograma por centímetro quadrado m/v - Massa por volume V - Volts m/z - Massa por carga VE - Vesículas extracelulares MW - Peso molecular VMLs - Vesículas multilamelares N - Normal V/min - Volts por minuto NanoLC-MSn - Cromatografia líquida em v/v - volume volume nanoescala acoplada a espectrometria de massas NCBI - National Center for Biotecnology Information ng - Nanograma ng/µL - Nanograma por microlitro nm - Nanômetro ns - Nanosegundo PIP – Probabilidade de Identificação da Proteínas PTMs - Modificações pós- traducionais RMN - Ressonância magnética nuclear RP-HPLC - Cromatografia líquida de alto desempenho RP-LCMS - Cromatografia líquida de alto desempenho acoplada ao espectrômetro de massas rpm - Rotações por minuto Lista de figuras LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. a) Nephila clavipes - aranha construtora de teia aérea orbital coletada no campus da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) localizado na cidade de Rio Claro, São Paulo. b) Em detalhe os fios de coloração amarelada que formam a teia orbital............................................................................................................... 21 Figura 2. a) Esquema representativo