Étude De L'activité Cosméceutique De L'achillea Millefolium L. Et De La

Étude de l’activité cosméceutique de l’Achillea millefolium L. et de la Brasenia schreberi J.F. Gmel.

par Jessica Fortin-Mimeault

Mémoire présenté à l’Université du Québec à Chicoutimi en vue de l’obtention du grade de Maître (M. Sc.) en Ressources renouvelables – Biologie

Québec, Canada

RÉSUMÉ

Depuis quelques décennies, les consommateurs sont à la recherche de produits cosmétiques écoresponsables, d’origine naturelle et ayant prouvé leur efficacité. Ceci pousse l’industrie cosmétique à chercher de nouveaux ingrédients dans le règne végétal. Les végétaux sont riches en composés chimiques de structures variées ayant des propriétés biologiques diverses. La forêt boréale québécoise est un réservoir riche en végétaux qui se retrouvent dans la médecine traditionnelle de peuples à travers le monde. L’Achillée millefeuille (Achillea millefolium L.) et la Brasénie de Schreber (Brasenia schreberi J.F. Gmel) font partie des plantes retrouvées dans les médecines traditionnelles autochtone et chinoise, respectivement. Dans le cadre de ce projet, le potentiel cosméceutique de ces deux plantes a été étudié. Premièrement, l’activité biologique des extraits et des huiles essentielles de l’Achillée millefeuille sauvage et cultivée ont été comparées. Il s’avère que l’Achillée millefeuille cultivée possède un rendement très faible en huile essentielle, tandis que celle sauvage a un rendement de 0,0918%. L’huile essentielle de l’Achillée millefeuille sauvage possède des propriétés antioxydantes (IC50 de 0,19 ± 0,03 % (v/v)), anti-inflammatoires (IC50 de 0,010 ± 0,001 % (v/v)) et antibactériennes contre Staphylococcus aureus (MIC90 de 2,9 ± 0,5 % (v/v)). Quant aux extraits d’Achillée millefeuille, l’extrait éthanolique obtenu à partir de feuilles de la plante cultivée présente des propriétés anti- inflammatoires (IC50 de 29 ± 7 µg/mL) et antioxydantes (IC50 de 0,22 ± 0,01 µg/mL) supérieures à celles de l’extrait éthanolique de feuilles provenant de la plante sauvage. Cette différence d’activité pourrait être due à une différence au niveau de la teneur en acide chlorogénique, un composé ayant des propriétés anti- inflammatoires et antioxydantes ; l’extrait éthanolique de feuilles cultivées contient 1,4 fois plus d’acide chlorogénique que celui de feuilles sauvages. L’extrait éthanolique obtenu à partir de feuilles de la plante cultivée pourrait être intéressant pour développer un produit anti-âge. Lors du deuxième volet du projet, les effets protéiques et transcriptomiques d’un extrait hydroalcoolique de Brasénie de Schreber ont été étudiés sur un substitut de peau humaine et sur des fibroblastes dermiques humains (WS-1), respectivement. L’extrait de Brasénie de Schreber augmente le niveau d’expression protéique de l’involucrine (3,8 fois), la loricrine (3,1 fois), la filaggrine (2,9 fois), l’aquaporine-3 (5 fois) et du collagène-1 (2,7 fois) par rapport au substitut de peau humaine non traité. Cet extrait présente également des propriétés antioxydantes (IC50 de 0,28 ± 0,02 µg/mL) et anti-inflammatoires (inhibe à 100 ± 6 % la production d’oxyde nitrique avec une concentration de 160 µg/mL). Les résultats obtenus avec l’extrait de Brasénie de Schreber sur les cellules humaines suggèrent que cet extrait pourrait prévenir le vieillissement de la peau en stimulant le renouvellement de l’épiderme, en améliorant l’hydratation de la peau ainsi que sa fonction barrière et en diminuant les altérations à la structure dermique. Pour ce qui est de l’étude de l’effet transcriptomique de la Brasénie de Schreber, elle permet de donner quelques pistes sur les mécanismes d’action de l’extrait qui devront être explorées plus en profondeurs. En fait, puisque l’extrait affecte l’expression génique de EGR1, EGR3 et DDIT4, il serait intéressant lors de prochaines études de vérifier comment l’extrait de Brasénie de Schreber affecte la synthèse du collagène, le cycle circadien, la différenciation des kératinocytes ainsi que comment l’extrait protège les cellules du stress oxydatif. En conclusion, nos résultats montrent que l’Achillée millefeuille et la Brasénie de Schreber possèdent tous les deux des propriétés anti-âge intéressantes.

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ...... ii TABLE DES MATIÈRES ...... iii LISTE DES TABLEAUX ...... vi LISTE DES FIGURES ...... vii LISTE DES ABRÉVIATIONS ...... viii REMERCIEMENTS ...... xii INTRODUCTION ...... 1 Problématique...... 1 Objectif principal ...... 4 Objectifs secondaires ...... 4 Structure du mémoire ...... 6 CHAPITRE 1 REVUE DE LITTÉRATURE ...... 7 1.1 Achillée millefeuille ...... 7 1.1.1 Description de la plante ...... 7 1.1.2 Usages traditionnels ...... 8 1.1.3 Propriétés pharmacologiques ...... 10 1.2 Brasénie de Schreber ...... 12 1.2.1 Description de la plante ...... 12 1.2.2 Usages traditionnels ...... 12 1.2.3 Propriétés pharmacologiques ...... 13 CHAPITRE 2 COMPARAISON DU POTENTIEL COSMÉCEUTIQUE DE L’ACHILLÉE MILLEFEUILLE CULTIVÉE À CELLE SAUVAGE DU SAGUENAY-LAC-SAINT-JEAN, QUÉBEC, CANADA ...... 15 2.1 Résumé ...... 15 COMPARISON OF WILD AND CULTIVATED ACHILLEA MILLEFOLIUM FROM THE SAGUENAY-LAC-ST-JEAN REGION (QUEBEC, CANADA) FOR COSMETIC USE ...... 17 2.2 Abstract ...... 18 2.3 Introduction ...... 19 2.4 Materials and methods ...... 20 2.4.1 Plant material ...... 20 2.4.2 Preparation of essential oils and solvent extracts ...... 20 2.4.3 Thin-layer chromatography (TLC) conditions ...... 21

2.4.4 High-performance liquid chromatography coupled with a mass spectrometer (HPLC- MS) conditions ...... 21 2.4.5 Gas chromatography coupled with a mass spectrometer (GC-MS) conditions ...... 21 2.4.6 Gas chromatography coupled with flame ionization detector (GC-FID) conditions . 22 2.4.7 Cell culture ...... 22 2.4.8 Preparation of the tested samples ...... 22 2.4.9 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay ...... 23 2.4.10 Cellular antioxidant assay ...... 23 2.4.11 Anti-inflammatory assay ...... 24 2.4.12 Cytotoxic assay ...... 24 2.4.13 Antibacterial assay – Hydrophobic ...... 25 2.4.14 Antibacterial assay – Broth microdilution assay ...... 26 2.4.15 Statistical analysis ...... 26 2.5 Results ...... 26 2.5.1 Achillea millefolium leaf extracts ...... 26 2.5.2 Achillea millefolium flower extracts ...... 28 2.5.3 Achillea millefolium essential oil ...... 29 2.6 Discussion ...... 31 2.7 Conclusion ...... 34 2.8 Supplementary results ...... 35 References...... 39 CHAPITRE 3 ÉTUDE DU POTENTIEL COSMÉCEUTIQUE D’UN EXTRAIT HYDROALCOOLIQUE DE BRASÉNIE DE SCHREBER (BRASENIA SCHREBERI) ...... 45 3.1 Résumé ...... 45 POTENTIAL COSMECEUTICAL EFFECTS OF A HYROALCOHOLIC BRASENIA SCHREBERI EXTRACT ...... 46 3.2 Abstract ...... 47 3.3 Introduction ...... 47 3.4 Materials and methods ...... 48 3.4.1 Extract preparation ...... 48 3.4.2 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay ...... 49 3.4.3 Cellular antioxidant assay ...... 49 3.4.4 Anti-inflammatory assay ...... 50 3.4.5 Cytotoxicity assay ...... 50

3.4.6 Patient and biopsies ...... 51 3.4.7 MTT assay ...... 52 3.4.8 In vitro reconstructed skin ...... 52 3.4.9 Histology and immunofluorescence stainings ...... 53 3.5 Results ...... 54 3.5.1 Antioxidant activity of Brasenia schreberi extract ...... 54 3.5.2 Cytotoxicity and anti-inflammatory activity of Brasenia schreberi extract ...... 55 3.5.3 Effect of Brasenia schreberi extract on the expression of proteins of cosmeceutical interest ...... 57 3.6 Discussion ...... 58 3.7 Conclusion ...... 61 3.9 Supplementary materials and methods ...... 62 3.9.1 Plant Extract ...... 62 3.9.2 Cell culture ...... 62 3.9.3 ARN extraction ...... 62 3.9.4 RT-qPCR ...... 63 3.9.5 Statistical analysis ...... 63 3.10 Supplementary results ...... 64 References...... 65 CHAPITRE 4 ÉVALUATION DE L’EFFET D’UN EXTRAIT HYDROÉTHANOLIQUE DE BRASÉNIE DE SCHREBER SUR LE TRANSCRIPTOME DE FIBROBLASTES DE PEAU HUMAINE ...... 71 4.1 Introduction ...... 71 4.2 Matériels et méthodes ...... 73 4.2.1 Culture cellulaire ...... 73 4.2.2 Traitements ...... 73 4.2.3 Extraction d’ARN ...... 74 4.2.4 Analyse des profils d’expression des ARNm par biopuce ...... 74 4.3 Résultats et discussion ...... 74 4.4. Conclusion ...... 79 CONCLUSION ...... 80 LISTE DE RÉFÉRENCES ...... 82

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Usages topiques de l’Achillée millefeuille à travers le monde ...... 8 Tableau 2 : Propriétés biologiques de l'Achillée millefeuille pour la peau ...... 11 Tableau 3 : Usages traditionnels de la Brasénie de Schreber ...... 13 Tableau 4 : Propriétés de la Brasénie de Schreber ...... 14 Table 5 : Yield and biological activity screening of the different A. millefolium leaf extracts ...... 27 Table 6 : Yield and biological activity screening of the different A. millefolium flower extracts ...... 29 Table 7 : Identification of the chemical composition of the wild A. millefolium essential oil with GC-MS ...... 30 Table 8 : Yield and biological activity of A. millefolium essential oil ...... 31 Table 9 : Pharmacological effect of compounds identified in A. millefolium ethanolic extracts ...... 32 Table 10 : Identified compounds in A. millefolium ethanolic extracts ...... 38 Table 11 : Surface area of the different compounds identified in A. millefolium ethanolic extracts ...... 39 Table 12 : Studied genes of cosmeceutical interest ...... 63

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : TLC of wild (A) and cultivated (B) leaf extract using the mobile phase CHCl3: MeOH : H2O: HCOOH

Figure 2 : TLC of wild (A) and cultivated (B) flower extracts using the mobile phase CHCl3: MeOH : H2O: HCOOH

(50: 15 : 1: 0.1) after revelation with H2SO4 in the visible (above) and with NP/PEG at 365 nm (below). Apigenin (A), methanolic extract (M), ethanolic extract (E), hydroethanolic extract (3:1) (E:H 3:1), hydroethanolic extract (1:1) (E:H 1:1) and aqueous extract (H)...... 36 Figure 3 : Chromatograms at 280 nm for the wild (A) and cultivated (B) leaf ethanol extracts and the wild (C) and cultivated (D) flower ethanol extracts ...... 37 Figure 4 : Chemical structure of compounds 1, 2, 5 and 6 ...... 38 Figure 5 : UV spectra of the identified compounds in the A. millefolium ethanolic extracts. Chlorogenic acid (A), rutin (B), dicaffeoylquinic acids (C and D), luteolin (E) and apigenin (F)...... 38 Figure 6 : Antioxidant activity of the B. schreberi extract and quercetin after absorption (60 min) by cells and subsequent exposition (90 min) to 200 µM t-BuOOH, using the cell-based assay. Data shown as the means ± standard deviation from one experiment (n=6)...... 55 Figure 7 : Effect of the B. schreberi extract on the cytotoxicity (A) and the nitric oxide production (B) after stimulation of the murine macrophage cell line RAW 264.7 with lipopolysaccharide. NG-nitro-L-arginine methyl ester (62.5 µg/mL) was used as a standard. Values are reported as mean ± standard deviation and are representative of an experiment (n=6)...... 56 Figure 8 : Cytotoxicity of the B. schreberi extract on human skin fibroblast cell line WS-1. Data shown as the means ± standard deviation from one experiment (n=6)...... 57 Figure 9 : Expression of collagen-1 on day seven of the air-liquid interface in skin substitutes treated with 50 µg/mL of B. schreberi extract (treated) or not (control) (N=1) ...... 58 Figure 10 : Expression of aquaporin-3, involucrin, filaggrin and loricrin on day 21 of the air-liquid interface in skin substitutes treated with 50 µg/mL of B. schreberi extract (treated) or not (control) (N=1) ...... 58 Figure 11 : Effect of 50 µg/mL of B. schreberi extract on collagen synthesis in NHDF (N=1) ...... 64 Figure 12 : Effect of 50 µg/mL B. schreberi extract on aquaporin-3, filaggrin and involucrin in NHEK (N=1)... 65 Figure 13 : Les étapes principales d’analyses des profils des transcrits à l’aide d'une biopuce à ADN ...... 72 Figure 14 : Expression génique en fonction de la concentration de l'extrait de Brasénie après une heure de traitement ...... 75 Figure 15 : Effet de l’extrait de Brasénie sur expression génique de DDIT4 en fonction de la concentration et du temps ...... 78

LISTE DES ABRÉVIATIONS

°C – Degré Celius

µg – Mircogramme

µL – Microlitre

µm - Micromètre

µM – Micromolaire

µmol – Micromole

3T3 – Lignée cellulaire de fibroblastes embryonnaires murins

A. millefolium – Achillea millefolium

A230 – Absorbance à 230 nm

A260 – Absorbance à 260 nm

A280 – Absorbance à 280 nm

AAPH – 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride

ADN – Acide désoxyribonucléique

AQP3 – Aquaporine-3

ARN – Acide ribonucléique

ARNm – Acide ribonucléique messager cDNA – Complentary deoxyribonucleic acid

CFU – Colony forming units

CHCl3 – Choroforme

CO2 – Dioxyde de carbone

COL1A1 – Collagène de type I α1

COL3A1 – Collagène de type III α1

COX-2 – Cyclooxygénase-2

DCFH – 2',7'-dichlorofluorescein

DCFH-DA – 2',7'-dichlorofluorescein-diacetate

DDIT4 – Gène DNA Damage Inducible Transcript 4

DDIT4 – Protéine DNA Damage Inducible Transcript 4

DMEM – Dulbecco-Vogt modification of Eagle's medium

DMSO – Diméthyle sulfoxide

DNA – Deoxyribonucleic acid

DUSP6 – Gène Dual specificity phosphatase 6

DUSP6 – Protéine Dual specificity phosphatase 6

E. coli. – Escherichia coli

EGR1 – Gène Early Growth Response 1

EGR1 – Protéine Early Growth Response 1

EGR3 – Gène Early Growth Response 3

EGR3 – Protéine Early Growth Response 3

ERK – Extracellular signal-regulated kinase

ERK 1/2 – Extracellular signal-regulated kinases 1/2

EtOH – Éthanol

FID – Détecteur d’ionisation de flamme

FLG – Filaggrine g – Gramme

GC – Chromatographie en phase gazeuse

GM-CSF – Facteur de stimulation des colonies granulocytes-macrophages

H2O – Eau

H2SO4 – Acide sulfurique

HBSS – Hanks' balanced salt solution

HCOOH – Acide formique

HPLC – Chromatographie liquide à haute performance

HPRT1 – Gène hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

IC20 – Concentration qui inhibe 20%

IC50 – Concentration qui inhibe 50%

IER2 – Gène Immediate early response gene 2

IER2 – Protéine Immediate early response gene 2 iNOS – Oxyde nitrique synthase inductible

IVL – Involucrine

L-NAME – Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride

LOEX – Centre de recherche en organogénèse expérimentale de l'Université Laval

LPS – Lipopolysaccharide m – Mètre m/z – Rapport masse sur charge

MeOH – Méthanol mg – Milligramme

MIC90 – Concentration minimale pour inhiber 90% de la croissance bactérienne min – Minute mL – Millilitre mM – Millimolaire mm – Millimètre

MS – Spectromètre de masse mTOR – Mammalian target of rapamycin

MTT – MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NaNO2 – Nitrite de sodium ng – Nanogramme

NHDF – Lignée cellulaire de fibroblastes dermiques humains normaux

NHEK – Lignée cellulaire de kératinocytes humains normaux nm – Nanomètre

NMF – Facteur d’hydratation naturel

NO – Oxyde nitrique

NP/PEG – Solution de révélation de 2-aminoethyl-diphenylborinate avec polyéthylène glycol

ORAC – Capacité d'absorption des radicaux oxygénés

PBS – Solution saline tamponnée au phosphate

PCR – Réaction en chaîne de la polymérase

PRAMEF8 – Gène PRAME Family Member 8

RAW 264.7 – Lignée cellulaire de macrophages murins

RNA – Ribonucleic acid

RT-qPCR – Réaction en chaîne à la polymérase en temps réel

S. aureus – Staphylococcus aureus

SDS – Sodium dodecylsulphate

TBP – Gène TATA-binding protein t-BuOOH – t-butyl hydroperoxyde

TE – Équivalent Trolox

TGF-β – Transforming growth factor beta

TLC – Chromatographie sur couche mince

UV – Ultraviolet

VIH – Virus de l'immunodéficience humaine

WS-1 – Lignée cellulaire de fibroblastes dermiques humains normaux

REMERCIEMENTS

J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de recherche Pr Jean Legault et mon codirecteur Pr André Pichette de m’avoir fait confiance avec ce projet de maîtrise et d’avoir accepté que je complète mon DESS en cosmétologie pendant ma période de rédaction de mémoire. Je remercie la compagnie Boréaceutique d'avoir financé le début de ma maîtrise.

J’aimerais également remercier tous mes collègues du LASEVE qui ont su répondre à toutes mes questions et à m’aider durant mon cheminement académique. Je tiens particulièrement à remercier François Simard et Alexis St-Gelais qui m’ont aidée au niveau de la partie chimie de mon projet (extractions des plantes et analyses de la composition chimique). Pour la partie biologie de ma maîtrise, je tiens à remercier en particulier Audrey Bélanger, Karl Girard-Lalancette et Catherine Dussault pour leur patience et leurs conseils.

Je veux également remercier tous ceux qui, de près ou de loin, m’ont supportée tout au long de ma maîtrise. Merci beaucoup à mes amies, mes parents, mes sœurs et mon copain qui ont su m’encourager durant les hauts et les bas à continuer et à persévérer.

INTRODUCTION

Problématique

Le vieillissement est un processus inévitable qui entraine une perte progressive des fonctions maximales, de la résistance au stress, de l’efficacité métabolique et du potentiel adaptatif des différents organes du corps (Tigges et al. 2014). Vieillir entraine non seulement des changements au niveau de l’aspect de la peau, mais également des pertes de fonctions au niveau de la fonction barrière, de la réponse aux blessures, de la perméabilité et de la fonction immune (Farage et al. 2007).

L’inflammation et le stress oxydatif sont impliqués dans le vieillissement et sont interdépendants

(Biswas 2016). Ensemble, ils mènent à la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) du derme et

à des dommages aux macromolécules des cellules (acides nucléiques, protéines et lipides) (Zhuang et

Lyga 2014; Rinnerthaler et al. 2015). La peau jeune est capable de répondre efficacement au stress oxydatif via des mécanismes de défenses et de réparations, alors que chez celle âgée, la réponse au stress oxydatif est souvent altérée (Labunskyy et Gladyshev 2013). Ceci résulte en l’accumulation de dommages cellulaires chez les peaux âgées qui se traduisent éventuellement en signes cliniques du vieillissement (ex : rides, amincissement de la peau, diminution de l’élasticité de la peau, etc.) (Starr et

Starr 2014; Rinnerthaler et al. 2015). Également, les dommages causés par le stress oxydatif mènent à une réponse inflammatoire, qui entraine l’activation des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces dernières sont responsables de la dégradation de la MEC (Pillai et al. 2005).

Depuis quelques décennies, les consommateurs ont une tendance à aller vers ce qui est plus naturel (Duber-Smith 2011). En fait, ils sont plus conscients des effets nocifs sur l’environnement et la santé des ingrédients cosmétiques dérivés de la pétrochimie tels que le butylhydroxyanisol (BHA), le butyl hydroxytoluène (BHT) et l’oxybenzone (Amberg et Fogarassy 2019; Schneider et Lim 2019; David

Suzuki Foundation 2020). Par ailleurs, le mouvement végétaliste influence de plus en plus les consommateurs et les sensibilise à l’impact des produits contenant des ingrédients d’origine animale sur l’environnement (Credence Research 2019). Cette tendance vers des produits cosmétiques naturels

pousse donc l’industrie cosmétique à développer de nouveaux ingrédients d’origine végétale et à développer de nouveaux produits plus naturels et écoresponsables (Gasco-Buisson 2017).

Les végétaux produisent une importante variété de composés chimiques de structures variées

(Farnsworth 1994; Atanasov et al. 2015). Chez les plantes, il existe deux types de métabolites : les métabolites primaires classés en quatre grandes catégories (glucides, lipides, protéines et acides nucléiques), ainsi que les métabolites secondaires, tels que les composés phénoliques, les composés terpéniques, les phytostéroïdes, les saponines et les alcaloïdes (Bruneton 2009). Les métabolites secondaires sont des composés chimiques nécessaires pour l’interaction des plantes avec leur environnement; ils jouent un rôle de défense contre les stress biotiques (bactéries, fongus, insectes et animaux) et abiotiques (sècheresse, carences nutritionnelles et radiation) (Kliebenstein 2013; Borges et al. 2017). Ainsi, les métabolites secondaires d’une plante donnée varient en réponse à son environnement tel que le sol, le climat et la saison (Borges et al. 2017). Les métabolites secondaires sont souvent responsables des diverses activités biologiques des végétaux (Borges et al. 2017).

La médecine traditionnelle des différents peuples à travers le monde est basée, entre autres, sur l’usage des plantes pour traiter différents problèmes de santé. Ces plantes médicinales sont utilisées depuis des milliers d’années et, de nos jours, elles représentent une source importante de traitements médicinaux pour plusieurs pays (WHO 2013). Pour développer de nouveaux produits efficaces, il n’est guère surprenant que l’industrie cosmétique se tourne vers la médecine traditionnelle. Cette dernière est le résultat de l’accumulation de savoir populaire depuis des milliers d’années sur les activités biologiques possibles de plantes (Cox 1994). Ainsi, la médecine traditionnelle donne de bonnes indications sur les plantes qui contiennent probablement des substances biologiquement actives telles que des métabolites secondaires ainsi que le type d’extrait (Prance 1994).

La forêt boréale est une ressource riche en végétaux qui recouvre plus de la moitié du Canada

(Ministre de l'Environnement 2006). Certains de ces végétaux sont utilisés dans la médecine moderne

2 et dans des produits cosmétiques. Notamment, le paclitaxel, qui est utilisé comme agent chimiothérapeutique, a été extrait de l’écorce d’ifs retrouvés dans la forêt boréale (Fédération des producteurs forestiers du Québec 2019). De plus, l’extrait de thé du Labrador, une plante présente dans la forêt boréale, s’avère être l’ingrédient actif majeur de la gamme Age Control Supreme de Lise

Watier pour son action anti-âge (Lise Watier Cosmétiques 2020). À l’heure actuelle, bien que plusieurs végétaux soient étudiés pour leurs propriétés biologiques, très peu de plantes de la forêt boréale québécoise sont utilisées par les industries cosmétiques et pharmaceutiques. Il est donc important d’approfondir nos connaissances sur les activités biologiques des plantes de la forêt boréale afin de mieux les valoriser. Tel que mentionné précédemment, la médecine traditionnelle est un bon point de départ pour sélectionner des plantes d’intérêts.

Dans le cadre de ce projet, nous nous attarderons sur deux plantes qui sont particulièrement intéressantes. La première plante sélectionnée est l’Achillée millefeuille (Achillea millefolium L.), une plante que l’on retrouve dans la médecine traditionnelle autochtone (Moerman 2003). Cette plante a

été précédemment étudiée au sein du laboratoire d’analyse et de séparation des essences végétales

(LASEVE). Lors de ces études préliminaires, il a été montré que l’Achillée millefeuille possède des activités biologiques intéressantes pour le secteur cosmétique, telles que des activités anti- inflammatoires et antioxydantes. Bien que récolter de l’Achillée millefeuille dans la nature est moins dispendieux que de la cultiver, la culture de cette plante présente de nombreux avantages. En effet, sa culture pourrait protéger l’espèce sauvage ainsi que limiter la variabilité au niveau de l’activité biologique de la plante entre chaque lot de production (Lubbe et Verpoorte 2011). Pourtant, il n’y a que très peu d’études qui comparent l’Achillée millefeuille cultivée à celle sauvage (Agnihotri et al.

2005), et à notre connaissance, il ne semble pas y avoir d’études publiées comparant l’activité biologique d’extraits d’Achillée millefeuille cultivée aux extraits de la plante sauvage. Ainsi, il pourrait

être intéressant de comparer l’activité biologique de la plante cultivée à celle sauvage afin d’explorer la possibilité de la mise en culture de la plante et également développer de nouveaux extraits anti-âge.

Pour ce qui est de la seconde plante, la Brasénie de Schreber (Brasenia schreberi J.F. Gmel) se retrouve dans la médecine traditionnelle chinoise (Zhou et al. 2011). Tout comme l’Achillée millefeuille, la Brasénie de Schreber a également été précédemment étudiée au sein du LASEVE et il a été démontré qu’elle possède des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires (Legault et al. 2011). Jusqu’à maintenant, il ne semble pas y avoir d’articles publiés sur les effets de la Brasénie de Schreber sur des substituts de peau humaine. Il serait donc intéressant d’étudier plus en profondeur l’extrait de Brasénie sur les protéines d’intérêt dans le secteur cosmétique comme le collagène au niveau des fibroblastes de la peau et des marqueurs de différenciation pour les kératinocytes. Il serait également pertinent d’étudier son effet sur le transcriptome des cellules de la peau afin de mieux comprendre les différents mécanismes d’action de l’extrait. Ceci pourrait expliquer, entre autres, comment l’extrait peut entrainer une réponse anti-inflammatoire ou antioxydante, ou encore, découvrir de nouveaux effets cosméceutiques de l’extrait.

Objectif principal

L’objectif principal de ce projet est d’étudier le potentiel cosméceutique de l’Achillée millefeuille et de la Brasénie de Schreber.

Objectifs secondaires

Les objectifs secondaires de ce projet se divisent en deux volets en fonction des plantes

étudiées.

A. Pour l’Achillée millefeuille (Achillea millefolium), l’objectif secondaire est de comparer des

extraits et des huiles essentielles de la plante sauvage à celle cultivée.

I. Préparer les extraits et les huiles essentielles de l’Achillée millefeuille par

macération et entrainement à la vapeur, respectivement.

II. Évaluer les activités biologiques pour chacun des extraits et huiles essentielles.

Plus précisément, l’activité antioxydante, anti-inflammatoire, antibactérienne et

la cytotoxicité ont été étudiées lors de ce projet.

III. Analyser la composition chimique des extraits et des huiles essentielles par

chromatographie sur couche mince, chromatographie liquide à haute

performance et chromatographie en phase gazeuse.

B. Pour la Brasénie de Schreber (Brasenia schreberi), les objectifs secondaires sont d’étudier

l’effet d’un extrait de la plante sur les protéines et le transcriptome des cellules de la peau.

I. Évaluer l’effet de l’extrait de la Brasénie de Schreber sur des substituts de peau

saine, des analyses par immunofluorescences de différents marqueurs. Plus

précisément, le changement des niveaux d’expression de collagène-1, de

l’involucrine, de la loricrine, de la filaggrine et de l’aquaporine-3 a été évalué avec

des substituts de peau traités et non traités avec l’extrait.

II. Étudier l’effet transcriptomique de la Brasénie de Schreber sur les fibroblastes de

la peau.

a. Traiter les cellules WS-1 à différentes concentrations et à différents temps

d’incubations.

b. Extraire et quantifier l’ARN des cellules traitées aux différentes conditions.

c. Envoyer l’ARN extrait à Génome Québec pour qu’ils soient testés sur des

biopuces d’ADN.

d. Analyser les résultats obtenus et déterminer quels ARNm ont été modulés par

rapport au contrôle et qui seront plus en détail pour la suite des travaux.

Structure du mémoire

Dans ce mémoire, vous trouverez d’abord une revue de la littérature sur l’Achillée millefeuille et la Brasénie de Schreber (Chapitre 1). Par la suite, se trouve un article scientifique sur l’Achillée millefeuille (Chapitre 2), et d’un second article sur la Brasénie de Schreber (Chapitre 3). Il y a ensuite un chapitre sur les travaux effectués jusqu’à maintenant sur l’effet génomique de la Brasénie de

Schreber sur des fibroblastes de peau humaine (Chapitre 4). Pour terminer, il y a une conclusion et les perspectives dégagées de ce projet de maîtrise.

CHAPITRE 1

REVUE DE LITTÉRATURE

1.1 Achillée millefeuille

1.1.1 Description de la plante

Achillea millefolium subsp. Millefolium (Larivière 2007), Achillea millefolium, L. (Gleason et

Cronquist 1991; Frère Marie-Victorin et al. 2002; Daigle et Daigle 2003b), Achillée millefeuille, Herbe à dindes, Common yarrow et Field hop (Duke 1985) sont quelques noms donnés à cette plante parmi tant d’autres. Son nom latin Achillea provient d’Achille, un guerrier dans la mythologie grecque, qui l’utilisait pour soigner les blessures (Lacoursière et Therrien 1998; Larivière 2007), alors que millefolium vient du fait que ses feuilles sont très découpées donnant l’illusion qu’elle possède mille feuilles

(Lacoursière et Therrien 1998). Par ailleurs, le nom Herbe à dindes rappelle qu’autrefois les dindes

étaient nourries avec cette plante (Lacoursière et Therrien 1998; Larivière 2007). L’Achillée millefeuille est une plante herbacée faisant partie de la famille des Astéracées (Duke 1985; Gleason et Cronquist

1991; Larivière 2007). Elle fleurit durant la saison estivale et ses fleurs sont de couleur blanche à rosée

(Daigle et Daigle 2003b; Larivière 2007).

Cette plante est principalement répandue en Amérique du Nord, en Europe et en Asie (Harris et al. 2006; Ali et al. 2017). Elle possède 20 sous-espèces très variables au niveau de la ploïdie et de la morphologie (Benedek et al. 2007b). On la retrouve dans les pâturages, les prairies, les bois, le bord de la route et des ruisseaux en terrain usé et dans les champs. Elle pousse sur le sol sec ou sableux, sol humide, argileux et salé. (Harris et al. 2006) Puisqu’elle est polyploïde et qu’elle peut vivre dans différentes conditions, il n’est guère surprenant d’observer beaucoup de variabilité au niveau de sa morphologie et de sa composition chimique (Harris et al. 2006; Benedek et al. 2007b).

1.1.2 Usages traditionnels

Cette plante se retrouve dans la médecine traditionnelle de plusieurs cultures à travers le monde. En fait, elle était utilisée pour traiter divers problèmes de santé tels que les problèmes gastro- intestinaux (Europe, Iran, Italie, Pérou, Brésil, Inde (Ali et al. 2017)), respiratoires (Amérique du Nord

(Moerman 2003), Grande-Bretagne et Irlande (Ali et al. 2017)) et cutanés (Amérique du Nord

(Moerman 2003), Grande-Bretagne et Irlande, Europe, Pérou, Brésil, Chine (Ali et al. 2017)).

Dans le cadre de ce mémoire, nous allons seulement nous attarder aux usages de l’Achillée millefeuille sur la peau (voir Tableau 1). L’Achillée millefeuille a été utilisée pour traiter divers problèmes dermatologiques tels que dans les traitements d’abcès, d’irritations cutanées, d’inflammations, de blessures et d’infections cutanées (Miraldi et al. 2001; Moerman 2003; Allen et

Hatfield 2004; Bussmann et al. 2007; Jaric et al. 2007; Kultur 2007; Ugulu et Baslar 2010; Applequist et

Moerman 2011; Ali et al. 2017). Ces différents usages traditionnels peuvent en partie expliquer l’intérêt d’étudier plus en profondeur les activités biologiques de l’Achillée millefeuille.

Tableau 1 : Usages topiques de l’Achillée millefeuille à travers le monde

Usage topique Nation Références Traiter les furoncles Amérique du Nord (Bella Coola, Crow Moerman (2003) et Shoshoni) Traiter les plaies Amérique du Nord (Blackfoot, Klallam, Moerman (2003) Kutenai, Kwakiult, Lakota, Menominee, Paiute, Squaxin, Thompson, Pomo Kashaya, Costanoan, Great Basin Indian, Navajo, Shoshoni, Washo) Traiter les enflures et Amérique du Nord (Carrier, Kwakiult, Moerman (2003) l’inflammation de la peau Menominee, Paiute, Winnebago, Shoshoni, Washo) Europe Ali et al. (2017) Iran Miraldi et al. (2001) Traiter les hémorragies Amérique du Nord (Cherokee) Moerman (2003) Europe Ali et al. (2017) Traiter les problèmes Amérique du Nord (Cherokee) Moerman (2003) intestinaux Appliquer aux éruptions Amérique du Nord (Chippewa) Moerman (2003) cutanées

8 Laver les cheveux Amérique du Nord (Cowliz, Okanagan- Moerman (2003) Colville) Traiter les plaies ouvertes Amérique du Nord (Crow) Moerman (2003) Traiter les blessures Amérique du Nord (Flathead, Karok, Moerman (2003) Kutenai, Lakota, Costanoan) Europe Ali et al. (2017) Hongrie Applequist et Moerman (2011) Brésil Ali et al. (2017) Grande-Bretagne et Irlande Allen et Hatfield (2004) Chine Applequist et Moerman (2011) Serbie Jaric et al. (2007) Turquie Kultur (2007); Ugulu et Baslar (2010) Traiter les hématomes Amérique du Nord (Gosiute, Malecite, Moerman (2003) Mendocino Indian, Micmac, Ute) Traiter les problèmes de peau Amérique du Nord (Kutenai, Moerman (2003) Thompson) Brésil Ali et al. (2017) Traiter l’exanthème Amérique du Nord (Menominee, Moerman (2003) Thompson, Paiute, Shoshoni) Traiter l’eczéma Amérique du Nord (Menominee) Moerman (2003) Utiliser comme nettoyant pour Amérique du Nord (Okanagon, Moerman (2003) les mains gercées Thompson) Utiliser comme nettoyant pour Amérique du Nord (Okanagon, Moerman (2003) les piqûres d’insectes Thompson) Utiliser comme nettoyant pour Amérique du Nord (Okanagon, Moerman (2003) les boutons Thompson) Traiter les coupures Amérique du Nord (Paiute, Thompson, Moerman (2003) Navajo) Traiter l’irritation causée par le Amérique du Nord (Shuswap) Moerman (2003) sumac vénéneux Utiliser comme nettoyant Amérique du Nord (Thompson) Moerman (2003) Utiliser comme nettoyant pour Amérique du Nord (Meskwaki) Moerman (2003) les endroits souffrants du corps Appliquer sur des morsures Amérique du Nord (Ojibwa) Moerman (2003) d’araignées Utiliser pour aider à extraire Amérique du Nord (Shoshoni) Moerman (2003) une écharde Appliquer pour réduire la Amérique du Nord (Shoshoni) Moerman (2003) douleur afin d’ouvrir une blessure Traiter les brûlures Hongrie Applequist et Moerman (2011) Traiter les infections cutanées Pérou Bussmann et al. (2007) Traiter les morsures de serpent Chine Applequist et Moerman (2011) Traiter les ulcères Serbie Jaric et al. (2007) Utiliser pour la cicatrisation de Europe sud-est Jaric et al. (2007) plaies

9 Utiliser sur les rides Turquie Ugulu et Baslar (2010) Utiliser comme antiseptique Turquie Kultur (2007) pour nettoyer les plaies

1.1.3 Propriétés pharmacologiques

Puisque l’Achillée millefeuille se retrouve dans la médecine traditionnelle de plusieurs peuples

à travers le monde, il n’est guère surprenant que plusieurs équipes de recherche se soient attardées à

étudier ses propriétés biologiques pour tenter d’expliquer les usages traditionnels de la plante afin de l’incorporer à la médecine moderne. L’Achillée millefeuille possède entre autres des propriétés hépatoprotectrices (Gadgoli et Mishra 2007), antitumorales (Li et al. 2012c) et analgésiques

(Noureddini et Rasta 2008).

Le Tableau 2 présente les propriétés biologiques de l’Achillée millefeuille qui pourraient être intéressantes d’un point de vue dermatologique. Cette plante possède des propriétés anti- inflammatoires (Burk et al. 2010), antioxydantes (Keser et al. 2013), cicatrisantes (Sabet Jalali et al.

2007) et régénératrices de la peau (Pain et al. 2011). L’activité anti-inflammatoire de la plante s’explique en partie par la présence des flavonoïdes et d’acides dicaffeoylquiniques (DCQA) qui inhibent l’élastase neutrophile humaine et les métalloprotéinases matricielles 2 et 9, respectivement

(Benedek et al. 2007a). Pour ce qui est de l’activité antioxydante de la plante, elle s’explique en partie par la présence d’acide caféique, d’acide néochlorogénique, d’acide férulique, de lutéoline, d’apigénine, de rutine, de lutéoline 7-O-glucoside et d’acide chlorogénique (Wojdylo et al. 2007;

Vitalini et al. 2011).

L’huile essentielle de l’Achillée millefeuille possède des propriétés anti-inflammatoires (Chou et al. 2013), antioxydantes (Chou et al. 2013), antifongiques (Falconeri et al. 2011), antibactériennes

(Mazandarani et al. 2012) et anti-mélanogenèse (Peng et al. 2014). L’activité antioxydante de l’huile essentielle est en partie due à sa teneur en carvacrol, thymol, bornéol, camphre, eucalyptol, α-pinène et β-terpinol (Candan et al. 2003; Kazemi 2015).

10 Tableau 2 : Propriétés biologiques de l'Achillée millefeuille pour la peau

Propriétés Type d’extrait Références Anti-inflammatoire Huile essentielle des parties aériennes provenant Tadic et al. (2017) de Serbie Huile essentielle provenant d’Australie Chou et al. (2013) Extrait aqueux des inflorescences provenant de Burk et al. (2010) Bulgarie Extrait méthanolique 20 % des parties aériennes Benedek et al. (2007a) provenant d’Italie Extrait méthanolique des parties aériennes Yassa et al. (2007) provenant d’Iran Huile essentielle des feuilles provenant du Brésil Lopes et al. (2005) Fraction hydrosoluble d’un extrait de chloroforme Goldberg et al. (1969) de fleurs provenant du New Jersey Antioxydante Huile essentielle des parties aériennes Kazemi (2015) Extrait éthanolique des fleurs et extrait aqueux Keser et al. (2013) des graines provenant de Turquie Huile essentielle de la plante provenant Chou et al. (2013) d’Australie Extrait méthanolique des parties aériennes Vitalini et al. (2011) provenant d’Italie Extraits éthanolique 50 % des parties aériennes Fraisse et al. (2011) provenant de France Extrait méthanolique 20 % de la plante provenant Wojdylo et al. (2007) de Pologne Huile essentielle Turquie Candan et al. (2003) Antimicrobienne Huile essentielle des parties aériennes provenant Falconeri et al. (2011) d’Italie et du Portugal Huile essentielle des patries aériennes en fleurs Mazandarani et al. provenant d’Iran (2012) Huile essentielle et extrait méthanolique de la Candan et al. (2003) plante provenant de Turquie Extrait hexane: éther: méthanol des parties Stojanovic et al. (2005) aériennes provenant de la Serbie Extrait éthanolique 80 % de plant provenant de Kokoska et al. (2002) Russie Régénération de la Non précisé Pain et al. (2011) peau Anti-mélanogenèse Huile essentielle provenant d’Australie Peng et al. (2014) Cicatrisante Extrait aqueux des parties aériennes provenant Sabet Jalali et al. d’Iran (2007) Extrait éthanolique 80 % des feuilles provenant Ghobadian et al. d’Iran (2015)

11 1.2 Brasénie de Schreber

1.2.1 Description de la plante

La Brasénie de Schreber est connue sous plusieurs noms : Brasenia schreberi J.F. Gmel., Water- shield et Watershield (Daigle et Daigle 2003a; Brandenburg 2010). Elle fait partie de la famille des

Cabombacées qui est une famille de plantes herbacées aquatiques ayant de grandes feuilles enracinées dans la vase (Marie-Victorin et al. 2002).

Cette plante aquatique est retrouvée dans les étangs et lacs principalement en Amérique (Frère

Marie-Victorin et al. 2002; Daigle et Daigle 2003a; Tiner 2009). On la retrouve également par stations isolées à travers le monde tels qu’au sud-ouest de l’Afrique, à l’est de l’Australie, en Inde, au Japon et en Mandchourie (Frère Marie-Victorin et al. 2002). Toutes les parties submergées de la plante sont recouvertes d’une substance gélatineuse constituée de polysaccharides : les mucilages (Crow et

Hellquist 2000; Frère Marie-Victorin et al. 2002). Seulement, l’envers de ses feuilles flottantes n’est pas recouvert de mucilages (Daigle et Daigle 2003a; Brandenburg 2010). Ses fleurs sont de pourpre à marrons (Daigle et Daigle 2003a; Brandenburg 2010).

1.2.2 Usages traditionnels

Les Autochtones d’Amérique du Nord auraient utilisé les racines broyées en farine de la

Brasénie de Schreber pour s’alimenter (Les 2017). La Brasénie de Schreber a principalement été utilisée traditionnellement en Asie comme le montre le Tableau 3. Les jeunes feuilles, les tiges et les bourgeons se retrouvent dans certains mets de la cuisine chinoise et japonaise (Misaki et Smith 1962; Li et al.

2007). Les jeunes feuilles sont considérées comme un légume de haute valeur nutritionnelle et médicinale (Hong et Blackmore 2015). Cette plante est cultivée depuis plus de 2000 ans en Chine (Hong et Blackmore 2015). On retrouve cette plante notamment dans la médecine traditionnelle chinoise pour traiter différents problèmes de santé tels que la dysenterie, la jaunisse, l’inflammation et la tuberculose (Zhou et al. 2011; Bolotova 2015).

12 Tableau 3 : Usages traditionnels de la Brasénie de Schreber

Usage Nation Références Nutraceutique Chine Li et al. (2007) Japon Misaki et Smith (1962) Amérique du Nord Les (2017) Améliorer les sécrétions Chine Li et al. (2007) gastriques Prévenir l’apparition de lésions Chine Li et al. (2007) au foie Guérir la dysenterie causée par Chine Les (2017); Li et al. (2007); la chaleur Zhou et al. (2011) Traiter la jaunisse Chine Li et al. (2007); Zhou et al. (2011) Traiter l’inflammation Chine Li et al. (2007); Zhou et al. (2011) Traiter la douleur Chine Li et al. (2007) Traiter les furoncles Chine Li et al. (2007) Prévenir le cancer Chine Li et al. (2007) Utiliser comme tonique Chine Bolotova (2015) Utiliser comme astringent Chine Bolotova (2015); Les (2017) Utiliser pour le traitement des Chine Bolotova (2015) maladies respiratoires Utiliser pour le traitement de Chine Bolotova (2015); Les (2017) la tuberculose Utiliser pour le traitement de Chine Zhou et al. (2011); Bolotova problèmes au niveau du (2015) système génito-urinaire Traiter les abcès Chine Zhou et al. (2011)

1.2.3 Propriétés pharmacologiques

La Brasénie de Schreber possède de nombreuses propriétés intéressantes comme le montre le Tableau 4. La plante possède des propriétés anti-VIH (virus de l'immunodéficience humaine) grâce à l’inhibition de l’activité ADN polymérase et ARNase H de la transcriptase inverse du VIH-1 ainsi qu’à l’inhibition de la réplication du VIH-1 (Hisayoshi et al. 2014; Hisayoshi et al. 2015). Puisque les mucilages qui recouvrent la Brasénie de Schreber possèdent des propriétés lubrifiantes, son utilisation pour l’enrobage de comprimés est un bon moyen de faciliter la déglutition (Li et al. 2012a; Les 2017). Les mucilages de la Brasénie possèdent également des propriétés hypocholestérolémiantes; lors d’une

étude in vivo chez des rongeurs traités pendant 3 semaines avec les mucilages, une diminution significative du taux de cholestérol total du plasma a été observée (Kim et al. 2014).

13 Tableau 4 : Propriétés de la Brasénie de Schreber

Activité étudiée Extrait Références Antibactérienne Fractions d’un extrait méthanolique Elakovich et Wooten (1987) Anti-algue Extrait méthanolique Elakovich et Wooten (1987) Allélopathique Extrait d’acétone Elakovich et Wooten (1987) Hypoglycémique Fractions de polysaccharides du Feng et al. (2019) mucilage de la plante Anti-VIH Extraits aqueux et éthanolique Hisayoshi et al. (2014) Extraits aqueux et éthanolique Hisayoshi et al. (2015) Hypocholestérolémiante 2% de mucilage Kim et al. (2014) Antioxydante Extraits méthanolique et aqueux Legault et al. (2011)

Fractions de polysaccharides Xiao et al. (2016) hydrosolubles du mucilage Anti-inflammatoire 7-O-β-D-glucopyranoside de quercétine Legault et al. (2011) provenant d’un extrait méthanolique Lubrifiante Mucilage Li et al. (2012a) Mucilage Liu et al. (2014) Anti-hyperlipidémique Extraits éthanolique et aqueux Takahashi et al. (2011) Purification de l’eau usée La plante vivante Xiang et al. (2018)

La Brasénie de Schreber possède également des propriétés antioxydantes et anti- inflammatoires (Legault et al. 2011; Xiao et al. 2016). Les propriétés antioxydantes des feuilles de la

Brasénie sont en partie dues à la présence de la 7-O-β-D-glucopyranoside de quercétine et de l’acide gallique dans des extraits méthanolique et aqueux, respectivement (Legault et al. 2011). Les mucilages de la Brasénie ont également des propriétés antioxydantes qui seraient dues à la présence de radicaux sulfuriques et de l’acide uronique (Xiao et al. 2016). Quant aux propriétés anti-inflammatoires de la plante, c’est la présence de la 7-O-β-D-glucopyranoside de quercétine dans les feuilles de la Brasénie qui inhibe l’expression de facteurs impliqués dans l’inflammation : l’oxyde nitrique synthase inductible

(iNOS), la cyclooxygénase-2 (COX-2) et le facteur de stimulation des colonies granulocytes- macrophages (GM-CSF) ainsi que la relâche d’oxyde nitrique (NO) par les macrophages (Legault et al.

2011).

14 CHAPITRE 2

COMPARAISON DU POTENTIEL COSMÉCEUTIQUE DE L’ACHILLÉE MILLEFEUILLE CULTIVÉE À CELLE

SAUVAGE DU SAGUENAY-LAC-SAINT-JEAN, QUÉBEC, CANADA

2.1 Résumé

Le vieillissement cutané résulte de l’inhabilité de la peau à réparer de manière efficace les dommages cellulaires causés par les stress internes et externes. Le stress oxydatif et l’inflammation jouent des rôles importants dans le processus du vieillissement cutané et peuvent altérer le fonctionnement d’une variété de macromolécules présentes dans la peau ainsi que contribuer à la détérioration de la matrice extracellulaire. Puisque les consommateurs recherchent des produits plus naturels, l’industrie cosmétique s’adapte à sa clientèle en utilisant des ingrédients tels que des extraits de plantes. L’Achillée millefeuille est une plante médicinale avec des propriétés antioxydantes et anti- inflammatoires. Cultiver l’Achillée millefeuille pour usage cosmétique pourrait éviter de mettre de la pression sur l’espèce sauvage et également de limiter la variabilité de l’activité biologique de la plante entre chaque lot. Cependant, peu d’études comparent l’activité biologique d’extraits d’Achillée millefeuille cultivée à celle d’extraits de plantes sauvages. Le but de cette étude est donc de réaliser un criblage préliminaire des activités antioxydantes et anti-inflammatoires d’extraits de plantes sauvages et cultivées, afin de sélectionner l’extrait ayant le meilleur potentiel anti-âge pour le développement de produits cosmétiques naturels. Tous les extraits testés possèdent des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. L’extrait le plus prometteur est l’extrait éthanolique de feuilles cultivées, car bien qu’il soit toxique à de hautes concentrations (IC20 de 77 ± 11 µg/mL) sur des cultures in vitro de fibroblastes humains, cet extrait présente des activités antioxydantes et anti-inflammatoires à de très faibles concentrations, soit des IC50 de 0,22 ± 0,01 µg/mL et 29 ± 7 µg/mL respectivement. Cet extrait est deux fois plus antioxydant et 3,8 fois plus anti-inflammatoire que l’extrait éthanolique de feuilles sauvages. Cette différence pourrait être expliquée par une différence au niveau de la teneur en acide chlorogénique, un composé ayant des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. L’extrait

éthanolique de feuilles cultivées contient 1,4 fois plus d’acide chlorogénique que l’extrait de feuilles sauvages. Pour ce qui est des huiles essentielles de l’Achillée millefeuille, il est intéressant de noter que la plante cultivée ne produit pratiquement pas d’huile essentielle, tandis que la plante sauvage a un rendement de 0,0918% en huile essentielle. L’huile essentielle de la plante sauvage a des propriétés antioxydantes (IC50 de 0,19 ± 0,03 % (v/v)), anti-inflammatoires (IC50 de 0,010 ± 0,001 % (v/v)) et antibactériennes contre Staphylococcus aureus (MIC90 de 2,9 ± 0,5 % (v/v)). L’extrait éthanolique des feuilles cultivées ainsi que l’huile essentielle de la plante sauvage pourraient présenter des propriétés anti-âge intéressantes.

16 COMPARISON OF WILD AND CULTIVATED ACHILLEA MILLEFOLIUM FROM THE SAGUENAY-LAC-ST-

JEAN REGION (QUEBEC, CANADA) FOR COSMETIC USE

Jessica Fortin-Mimeault1, André Pichette1, Jean Legault1

Affiliations:

1Centre de recherche sur la boréalie (CREB), Laboratoire d’analyse et de séparation des essences végétales (LASEVE), Département des Sciences Fondamentales, Université du Québec à Chicoutimi,

Chicoutimi (Québec), Canada.

Address for reprint requests:

Jean Legault, Ph.D. (Corresponding author)

Université du Québec à Chicoutimi (UQAC)

555 Boulevard de l'Université, Chicoutimi, QC G7H 2B1

Tel : (1) 418-545-5011 ext. 2334

Fax: +1 418 545 5012

E-mail : [email protected]

17 2.2 Abstract

Skin ageing results in the skin's inability to effectively repair cellular damages caused by internal and external stresses. Oxidative stress and inflammation play essential roles in the skin ageing process, including deteriorating the extracellular matrix and altering various macromolecules present in the skin. Because consumers want more natural products, the cosmetic industry uses more natural ingredients such as plant extracts. Achillea millefolium is a medicinal plant with antioxidant and anti- inflammatory properties. Cultivating Achillea millefolium for cosmetic purposes could help reduce the pressure on the wild species and limit the variability in the plant's biological activity between batches.

However, few studies have compared the biological activities of cultivated Achillea millefolium extracts to the wild extracts. Therefore, this study aimed to conduct a preliminary screening of the antioxidant and anti-inflammatory effects of wild and cultivated Achillea millefolium extracts to select a potential anti-ageing extract to develop natural cosmetic products. All the extracts obtained had antioxidant and anti-inflammatory activities. Although it presents toxicity at high concentrations (IC20 of 77 ± 11 µg/mL) on in vitro human fibroblast cultures, the most promising extract was the cultivated leaf ethanol extract. It has antioxidant and anti-inflammatory properties at lower levels (IC50 of 0.22 ± 0.01 µg/mL and 29 ± 7 µg/mL, respectively). This extract has twice the antioxidant and 3.8 times the anti- inflammatory properties of the wild leaf ethanol extract. This difference could be explained, in part, by a difference in chlorogenic acid content, a compound with antioxidant and anti-inflammatory properties. Indeed, the cultivated leaf ethanol extract contains 1.4 times more chlorogenic acid than its wild counterpart. As for the Achillea millefolium essential oils, it is interesting to note that the cultivated plant produces trace amounts of essential oil, while the wild plant has a yield of 0.0918%.

The wild essential oil possesses antioxidant (IC50 of 0.19 ± 0.03% (v/v)), anti-inflammatory (IC50 of 0.010

± 0.001% (v/v)) and antibacterial (MIC90 of 2.9 ± 0.5% (v/v) for Staphylococcus aureus) activities. Both the cultivated leaf ethanol extract and the wild essential oil have interesting anti-ageing properties.

18 2.3 Introduction

Skin, the largest organ of the human body, is the most noticeable organ that reflects our age

(Tobin 2006; Farage et al. 2013). It protects us daily from external factors present in our environments such as microorganisms, temperature changes and ultraviolet (UV) radiation (Venus et al. 2011). As we grow old, our skin functions are altered; reduced sweat production, increased itching sensation and decreased skin resistance and elasticity are a few of the visible changes that occur (Farage et al. 2007).

These changes in the ageing skin result in its inability to effectively repair cellular damages caused by environmental and internal stresses (Labunskyy and Gladyshev 2013). Both oxidative stress and inflammation play essential roles in the ageing process and are interdependent (Zhuang and Lyga 2014;

Rinnerthaler et al. 2015; Biswas 2016). Together, they can deteriorate the extracellular matrix and alter various macromolecules, including proteins, lipids and nucleic acids (Zhuang and Lyga 2014;

Rinnerthaler et al. 2015).

Using natural ingredients has been on the rise in cosmetic products for quite some time due to consumers becoming more environmentally and health-conscious (Amberg and Fogarassy 2019).

Plants are sources of natural compounds that can possess pharmacological properties attractive to the cosmetic industry, such as antioxidant and anti-inflammatory effects (Borges et al. 2017).

Achillea millefolium, a plant in the family of Asteraceae (Frère Marie-Victorin et al. 2002), has been used throughout history to treat different disorders by nations worldwide. Indeed, this plant can be found in Chinese medicine to treat wounds, snake bites and tuberculosis (Ali et al. 2017). It was used in Europe to treat pain, inflammation, and injuries (Ali et al. 2017). A. millefolium was also used by many tribes of Native Americans against pain, fever, swelling and wounds, to name a few traditional uses (Moerman 2003). This plant possesses anti-inflammatory and antioxidant effects (Ali et al. 2017).

These activities make A. millefolium quite an attractive plant for the cosmetic industry.

Cultivation could help reduce pressure on the species and limit the plant's biological activity variability between each production lot (Lubbe and Verpoorte 2011). Few studies have compared

19 cultivated A. millefolium plants to their wild counterparts (Agnihotri et al. 2005). To our knowledge, there have, however, not been any published studies that compare the biological activities of cultivated

A. millefolium plant extracts to the wild plant extracts. Therefore, this study aimed to screen the antioxidant and anti-inflammatory effects of extracts from wild and cultivated plant material to select a potential anti-ageing extract to develop natural cosmetic products.

2.4 Materials and methods

2.4.1 Plant material

The flowering aerial parts of cultivated A. millefolium were collected from a field in Canton-

Tremblay, Quebec. As for the wild A. millefolium, it was harvested from a meadow in St-Fulgence,

Quebec. Both the wild and cultivated plants were collected in July. The plants were authenticated by

Mr. Patrick Nadeau (Université du Québec à Chicoutimi), and voucher specimens (No. 623152 (wild) and No. 623153 (cultivated)) was deposited at the Louis-Marie Herbarium of Université Laval, Quebec

City, Quebec, Canada. After collection, plants were air-dried for two weeks before extraction unless mentioned otherwise.

2.4.2 Preparation of essential oils and solvent extracts

The A. millefolium essential oil was obtained by the steam distillation of 500 g of fresh aerial parts in water for 4 hours. The extracts were obtained by maceration: 25 g of ground dried plant material in 500 mL of solvent for 16 hours. The leaves and the flowers were macerated separately with five different solvents: methanol (MeOH), ethanol (EtOH), EtOH:H2O (3:1), EtOH:H2O (1:1) and water.

Solvent extracts were then filtered and were either evaporated or lyophilized until a dry extract was obtained.

20 2.4.3 Thin-layer chromatography (TLC) conditions

Silicycle supplied the thin-layer chromatography (TLC) plates (silica gel ultrapure 250 lm,

F254). The TLC mobile phase was CHCl3:MeOH:H2O:HCOOH (50:15:1:0.1). Phenolic compounds were detected by spraying 2-aminoethyl-diphenylborinate with polyethylene glycol (NP/PEG) reagent and observing them under ultraviolet light (365 and 254 nm). Triterpene compounds were detected using a 20% H2SO4 in MeOH spray reagent followed by 5 minutes at 100°C and observing them under visible light and 365 nm.

2.4.4 High-performance liquid chromatography coupled with a mass spectrometer (HPLC-MS) conditions

HPLC analyses were carried out with an Agilent system consisting of a serie 1200 degasser

(G1379B), a serie 1100 pump with a solvent cabinet (G1310A), a serie 1200 automatic injector, a serie

1100 temperature-controlled column compartment (G1316A), a serie 1100 diode array detector

(G1315B) and a mass selective detector Agilent serie 1100 (G1956B) model equipped with an APCI source. A Phenomenex kinetex 5µm Biphenyl 100Å column (250 x 4.6 mm) was used to separate the different compounds contained in the samples. An injection volume of 10 µL of the sample and standards dissolved in MeOH (10 mg/mL and 0.5 mg/mL, respectively) was used. Flow rate was 1 mL/min and a gradient method of 10 % to 100 % MeOH with 0.1 % HCOOH in H2O with 0.1 % HCOOH for 30 min. Between each sample, there was a 10 min period of washing with 100 % MeOH with 0.1 %

HCOOH. MS spectra of purified compounds were obtained with the MM-ES + APCI multimode ionization and negative polarity. The standards used were chlorogenic acid, rutin, luteolin and apigenin.

2.4.5 Gas chromatography coupled with a mass spectrometer (GC-MS) conditions

GC-MS analysis were carried out on an Agilent GC–MS comprising a 7890A GC system fitted with a split/splitless inlet, a GC sampler 80, and a 5975C MSD (EI mode 70 eV). Separations were performed on an Agilent HP-5 capillary column (30 m× 0.320 mm di ×0.25 μm film thickness). The

21 carrier gas was helium with a flowthrough of 1 mL/min. The temperature was set at 60°C and held for

2 min, then 60°C to 250°C at a rate of 3°C/min, 250°C to 280°C at a rate of 15°C/min and 280°C to 100°C at a rate of 45°C/min. Injections were performed in split mode with an 800:1 ratio. Compounds were identified by their retention index, mass spectra using Wiley 6n, HPCH2205, FFSNC and NIST148 database.

2.4.6 Gas chromatography coupled with flame ionization detector (GC-FID) conditions

GC-FID analysis were carried out on an Agilent 7890A GC-FID system fitted with a split/splitless inlet and an automatic liquid sampler. Separations were performed on the same capillary column using the same method as GC-MS analysis. Compounds were identified from their retention indexes as calculated from C7 to C40 alkane (0.2 mg/mL in hexane; Sigma-Aldrich). Quantification was derived from the FID detector response on the HP-5 column without any correction factor.

2.4.7 Cell culture

Human skin fibroblasts WS-1 (ATCC CRL-1502) and murine macrophage RAW 264.7 (ATCC TIB-

71) were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cells were grown in a humidified atmosphere at 37°C and 5 % CO2, in Dulbecco's Minimum Essential Medium supplemented with 10 % fetal calf serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 1x MEM Vitamins (Corning,

Manassas, VA, USA), 100 IU of penicillin and 100 µg/mL streptomycin (Cellgro®, Mediatech, Manassas,

VA, USA). The complete medium was refreshed twice a week. Cells were frozen in liquid nitrogen until needed for the following experiments.

2.4.8 Preparation of the tested samples

Stock solutions of extracts were prepared in DMSO and stored at -20°C until needed. The

DMSO final concentration in the culture medium was maintained at 0.5 % (v/v) to avoid solvent toxicity

22 for all the assays on cells. The concentrations tested for the extracts ranged from 0 to 200 µg/mL. The essential oil was diluted in DMSO for most assays (MeOH for the antibacterial assay). The concentration tested for the essential oil ranged from 0 to 0.3 % (v/v).

2.4.9 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay

The assay was performed as described by Ou et al. (2001) with modifications. This test measures the capacity of the extracts to neutralize peroxyl radicals. First, dilutions of the samples and the internal standards, quercetin and trolox (both tested at 1.25 mg/mL and 5 mg/mL), were prepared and transferred in a black flat-bottom 384-wells (Greiner Bio-One). Afterwards, the fluorochrome was added. The kinetic started when the oxidant, 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), was added. The plate was then read by the Fluoroskan Ascent FLTM plate reader (Labsystems, Milford,

MA, USA) (excitation: 485 nm; emission: 538 nm) for an hour. If a sample were antioxidant, it would slow down the fluorochrome's oxidation, which, once oxidized, loses its fluorescence. So, a potent antioxidant gives slower kinetics of loss of fluorescence (Ou et al. 2001). The final results were calculated by comparing the net areas under the fluorescein decay curves between the blank and the samples. ORAC values were expressed in micromoles of trolox equivalents (TE) per milligram (μmol

TE/mg) for the extracts and in µmol TE per millilitre (µmol TE/mL) for the essential oil.

2.4.10 Cellular antioxidant assay

The procedure was performed as described by Girard-Lalancette et al. (2009). Briefly, to determine the sample's antioxidant potential, human skin fibroblasts WS-1 were seeded into a 96-well

4 plate (1 x 10 cells per well) and incubated at 37°C; 5 % CO2 for 24 hours. The cells were rinsed with

150 μL of phosphate buffer saline (PBS) before incubating for 30 min with 100 μL of 5 μM 2',7'- dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) in Hanks' balanced salt solution (HBSS). Afterwards, the cells were rinsed again with PBS and incubated for one hour with the different concentrations of the tested extracts, essential oil and the positive standard, quercetin (levels tested ranged from 0 to 6.25 µg/mL).

23 Then, for the oxidative stress, 200 μM tert-butyl hydroperoxide (t-BuOOH) was added, and the fluorescence was monitored directly after the administration of the t-BuOOH and after two hours.

Measurements were performed with a plate reader (Fluoroskan Ascent FLTM, Labsystems, Milford,

MA, USA) using an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 530 nm.

Antioxidant activity was expressed as the concentration of extract inhibiting 50 % (IC50) of DCFH oxidation (Girard-Lalancette et al. 2009). If a sample were antioxidant, it should be oxidized instead of the DCFH-DA. Indeed, the more a sample is antioxidant, the more the fluorochrome is protected from oxidation resulting in less important fluorescence detection. So, the more fluorescence detected, the less the sample has antioxidant properties.

2.4.11 Anti-inflammatory assay

The assay was performed as described previously by Legault et al. (2011). Briefly, this test measures nitric oxide (NO) produced by the macrophages RAW 264.7 in the presence of Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS). The macrophages were seeded into a 96-well plate (7.5 x 104 cells per well) and incubated for 16 hours. Afterwards, cells were treated with extracts or the essential oil dissolved in DMSO at different concentrations or the positive control, Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) (levels tested were 250 µM and 1 mM), and then incubated for 24 hours. Cells were treated with LPS (100 ng/mL) to stimulate the release of NO and incubated for 24 hours. After that, 100 μL of cell supernatant was mixed with 100 μL of Griess reagent, prepared as described by

Green et al. (1990), and incubated at room temperature and shielded from the light for 20 min. Nitrite quantification was estimated using a NaNO2 standard curve, and the absorbance was read at 540 nm using a Multiskan GO plate reader (Thermo Electron).

2.4.12 Cytotoxic assay

The test performed was previously described by Legault et al. (2011). Briefly, WS-1 cells were plated in flat-bottom 96-well plates at a density of 5 x 103 cells per well in 100 μL of culture medium

24 and to adhere for 24 hours before treatment. Increasing concentrations of the extracts, the essential oil or of the positive control, Etoposide (concentrations tested ranged from 0 to 50 µM), were then added (100 μL per well). The cells were incubated for 48 hours in the presence or absence of these samples. Then, cytotoxicity was assessed using the resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one10- oxide) reduction test (O'Brien et al. 2000). The fluorescence was measured on a Fluoroskan Ascent FL™ plate reader (Labsystems, Milford, MA, USA) using excitation and emission wavelengths of 530 nm and

590 nm, respectively. Cytotoxicity is expressed as the lowest concentration of tested extract inhibiting

20 % or more of cell growth in comparison to untreated cells. Following the resazurin test, the quantification of DNA was performed with the Hoechst 33342 staining dye solution. From each well, supernatants were removed, and a solution of SDS 0.01 % was added to break cell membranes. Then, the 96-well plates were frozen overnight at -20°C before adding a solution of Hoechst 30 µg/mL (100

µL), which becomes fluorescent when it binds to the DNA (Data not shown). The fluorescence was measured using excitation and emission wavelengths of 360 nm and 460 nm, respectively. IC20 was expressed as the concentration that inhibits 20 % of cellular growth.

2.4.13 Antibacterial assay – Hydrophobic

The test was performed as described by Côté et al. (2016). Briefly, 100 μL of Nutrient Broth

Agar were distributed in 96-well plates and were kept at room temperature for one hour. A volume of

MeOH (20 μL) containing growing concentrations of essential oil was spread on the Nutrient Broth Agar of 96-well plates. Plates were then were kept at room temperature for two hours or until the solvent was evaporated entirely. Bacterial strains (20 μL), including E. coli (ATCC 25922) and Staphylococcus aureus (ATCC 25923), were added at a concentration of 25 x 104 colony forming units (CFU)/mL in

Nutrient Broth. Bacterial suspension without treatment was used as a negative control (where maximal growth was observed), and bacterial suspension plus solvent was tested in parallel to demonstrate the absence of solvent toxicity. Blank consisted of culture medium only and was subtracted from all subsequent measurements of every other well. 96-well plates were then incubated at 37°C for five

25 hours for bacterial growth. Then, 100 μL of resazurin sodium salt solution at 50 μg/mL (Sigma R-2127) was added to each well. After two hours for S. aureus, and three hours for E. coli, the fluorescence was read with a Fluoroskan Ascent FL™ plate reader (Labsystems, Milford, MA, USA) using excitation and emission wavelengths of 530 nm and 590 nm, respectively. MIC90 was expressed as the lowest concentration inhibiting 90% of bacterial growth.

2.4.14 Antibacterial assay – Broth microdilution assay

The assay was performed as described by Banfi et al. (2003) with modifications. Briefly, growing bacterias were plated in 96-well plates in 50 μL nutrient broth (Difco). The two bacterial strains used are E. coli and S. aureus at the concentration of 5 × 104 and 35 × 104 CFU/mL, respectively.

Increasing levels of extracts (diluted in DMSO) were then added (100 µL), and microplates were incubated for 24 hours at 37°C. Absorbance was measured after 24 hours at 600 nm using a Multiskan

GO plate reader (Thermo Electron).

2.4.15 Statistical analysis

All the biological assays were carried out in triplicate in one independent experiment (N=1).

The results are expressed as mean values and standard deviation.

2.5 Results

2.5.1 Achillea millefolium leaf extracts

All the leaf extracts, whether wild or cultivated, contained triterpene saponins and flavonoids

(Supplementary Figure 1). Both wild and cultivated leaf ethanol extracts' chemical composition was evaluated with HPLC-MS. The leaf extracts' chromatograms and the identified compounds' UV spectra can be found in the supplementary figures (Figure 3 and Figure 5). Both extracts contain chlorogenic acid, rutin and dicaffeoylquinic acids. The retention time and m/z of the identified compounds can be

26 found in the supplementary Table 10, and their chemical structure is shown in the supplementary

Figure 4. The wild leaf ethanol extract contains 2.5 times more rutin than the cultivated leaf ethanol extract (supplementary Table 11). However, the cultivated leaf ethanol extract contains 1.4 times more chlorogenic acid than the wild leaf ethanol extract.

Table 5 : Yield and biological activity screening of the different A. millefolium leaf extracts

Anti- ORAC Cellular Cytotoxicity Yield Place Solvent inflammatory (µmol antioxidant IC20 (%) 1 2 3 4 IC50 (µg/mL) TE/mg) IC50 (µg/mL) (µg/mL) Wild MeOH 7.75 >160 2.4 ± 0.3 0.50 ± 0.09 >200 Wild EtOH 4.00 111 ± 18 2.6 ± 0.6 0.44 ± 0.07 >200 EtOH:H O Wild 2 15.11 >160 5.8 ± 0.9 0.18 ± 0.07 >200 (3:1) EtOH:H O Wild 2 16.39 >160 4.4 ± 0.4 0.36 ± 0.06 >200 (1:1) Wild H2O 10.12 >160 0.6 ± 0.2 20 ± 7 >200 Cultivated MeOH 7.68 80 ± 9 2.7 ± 0.4 0.6 ± 0.1 80 ± 14 Cultivated EtOH 2.64 29 ± 7 2.9 ± 0.5 0.22 ± 0.01 77 ± 11 EtOH:H O Cultivated 2 14.42 >160 2.6 ± 0.4 1.2 ± 0.1 >200 (3:1) EtOH:H O Cultivated 2 14.35 >160 1.4 ± 0.2 0.86 ± 0.10 >200 (1:1) Cultivated H2O 11.16 >160 0.33 ± 0.08 18 ± 7 12 ± 8

All experiments were carried out in triplicate. 1L-NAME (1 mM), used as a positive anti-inflammatory control, produced a NO production inhibition of 68 %. 2Trolox, used as an ORAC positive control, had an ORAC value of 4.4 ± 0.7 µmol TE/mg. 3 Quercetin, used as a positive antioxidant control, had an IC50 of 0.064 ± 0.001 µg/mL. 4 Etoposide, used as a positive cytotoxic control, had an IC20 of 0.6 ± 0.1 µM

The obtained A. millefolium leaf extracts had yields between 2.6 and 16.4 % (Table 5). The ethanol macerations had the lowest yields, while the hydroethanolic extracts had the highest yields.

Also, leaf extracts from wild A. millefolium seemed to have higher yields. As for the biological activities, both leaf ethanol extracts had an anti-inflammatory effect, but the cultivated leaf ethanol extract had the most potent activity with an IC50 of 29 ± 7 µg/mL (Table 5). The leaf ethanolic extracts also presented some antioxidant activities. Still, the leaf extract with the most potent antioxidant effect was the wild leaf hydroethanolic (3:1) extract with a cellular antioxidant IC50 of 0.18 ± 0.07 µg/mL and an

ORAC of 5.8 ± 0.9 µmol TE/mg. Most leaf extracts did not present cytotoxicity at the highest concentration tested of 160 µg/mL. However, some of the cultivated leaf extracts exhibited cellular

27 toxicity at the tested concentrations. The cultivated leaf ethanol extract inhibited 20 % of cell growth at a concentration of 77 µg/mL. Interestingly, this extract's anti-inflammatory and antioxidant activities were present at lower concentrations than its toxicity. It has twice the antioxidant and 3.8 times the anti-inflammatory properties than the wild leaf ethanol extract. None of the leaf extracts tested had an antibacterial effect against E. coli and S. aureus at the highest concentration tested (200 µg/mL)

(Data not shown).

2.5.2 Achillea millefolium flower extracts

All flower extracts also contained compounds from the chemical families' triterpene saponins and flavonoids (Supplementary Figure 2). The chemical composition of both wild and cultivated flower ethanol extracts was evaluated with HPLC-MS. The flower extracts' chromatograms and the identified compounds' UV spectra can be found in the supplementary figures (Figure 3 and Figure 5). The retention time and m/z of the identified compounds in these extracts can be found in the supplementary Table 10, and their chemical structure is shown in the supplementary Figure 4. Both flower ethanol extracts contain chlorogenic acid, dicaffeoylquinic acids and apigenin (Table 11). While the wild flower ethanol extract contained rutin, the cultivated one contained luteolin. The wild flower ethanol extract also contained about twice the amount of chlorogenic acid compared to the cultivated flower extract.

The obtained flower extracts had yields between 5.2 and 21.3 % (Table 6). The flower extracts followed similar trends to the leaf extracts in yields. As for the biological activities, all flower extracts presented anti-inflammatory and antioxidant activities at the tested concentrations except for the water extracts (Table 6). Most of the extracts tested presented some cytotoxicity. The most potent anti-inflammatory extract was the cultivated flower ethanol extract with an IC50 of 6.8 ± 0.7 µg/mL.

This extract was also the one that presented the most cytotoxicity with an IC50 of 13 ± 6 µg/mL. None of the flower extracts tested had an antibacterial effect (Data not shown).

28 Table 6 : Yield and biological activity screening of the different A. millefolium flower extracts

Anti- ORAC Cellular Yield Cytotoxicity Place Solvent inflammatory (µmol antioxidant 4 (%) 1 2 3 IC20 (µg/mL) IC50 (µg/mL) Trolox/mg) IC50 (µg/mL) Wild MeOH 10.53 110 ± 6 3.1 ± 0.5 0.37 ± 0.04 110 ± 13 Wild EtOH 7.87 57 ± 4 3.2 ± 0.5 0.65 ± 0.07 120 ± 16 EtOH:H O Wild 2 16.72 117 ± 2 6 ± 1 0.40 ± 0.03 110 ± 80 (3:1) EtOH:H O Wild 2 19.95 150 ± 6 2.6 ± 0.4 0.3 ± 0.1 >200 (1:1) Wild H2O 15.57 >160 0.52 ± 0.07 14 ± 5 >200 Cultivated MeOH 9.87 14 ± 2 4.8 ± 0.7 0.85 ± 0.03 34 ± 5 Cultivated EtOH 5.22 6.8 ± 0.7 3.1 ± 0.3 0.29 ± 0.01 13 ± 6 EtOH:H O Cultivated 2 17.19 33 ± 7 2.9 ± 0.3 0.27 ± 0.03 57 ± 9 (3:1) EtOH:H O Cultivated 2 21.30 24 ± 3 2.8 ± 0.4 0.4 ± 0.1 41 ± 2 (1:1) Cultivated H2O 9.41 >160 0.43 ± 0.07 2.4 ± 0.3 >200 All experiments were carried out in triplicate. 1L-NAME (1 mM), used as a positive anti-inflammatory control, produced a NO production inhibition of 68 %. 2Trolox, used as an ORAC positive control, had an ORAC value of 4.4 ± 0.7 µmol TE/mg. 3 Quercetin, used as a positive antioxidant control, had an IC50 of 0.064 ± 0.001 µg/mL. 4 Etoposide, used as a positive cytotoxic control, had an IC20 of 0.6 ± 0.1 µM

2.5.3 Achillea millefolium essential oil

The wild essential oil was mainly composed of germacrene D, chamazulene and sabinene found in the proportion of 18.4 %, 12.9 % and 7.59 %, respectively (Table 7). Almost 90 % of the essential oil content was identified.

A yield of 0.092 % of the essential oil was obtained from the wild plant (Table 8). However, only trace amounts of essential oil were obtained by steam distillation for the cultivated plant.

Unfortunately, it was not possible to determine the cultivated essential oil’s chemical composition nor evaluate its biological activity due to an insufficient amount. The wild A. millefolium essential oil has

IC50 for antioxidant and anti-inflammatory at the concentrations of 0.19 ± 0.03 % (v/v) and 0.010 ±

0.001 % (v/v), respectively (Table 8). It was also not toxic at the highest concentrations tested on the

WS-1. The wild essential oil was not active against E. coli at the highest concentration tested (5 % (v/v)) but was active against S. aureus with a MIC90 of 2.9 ± 0.5 % (v/v).

29 Table 7 : Identification of the chemical composition of the wild A. millefolium essential oil with GC-

Proportion Compounds RI AI (%) Tricyclene 931 921 0.119 α-Pinene 937 932 0.698 Camphene 953 946 0.998 Sabinene 979 969 7.59 β-Pinene 983 974 3.87 Myrcene 997 988 5.55 α-Phellandrene 1010 1002 3.89 α-Terpinene 1022 1014 0.217 ρ-Cymene 1031 1020 2.05 Limonene 1034 1024 0.982 1,8-Cineole 1045 1026 1.52 (E)-β-Ocimene 1053 1044 0.103 γ-Terpinene 1064 1054 1.34 Terpinolene 1095 1086 0.205 cis-Thujone 1121 1101 0.443 trans-Thujone 1131 1121 7.75 Camphor 1162 1141 3.29 Borneol 1182 1165 0.346 Terpinen-4-ol 1192 1174 0.348 α-Terpineol 1208 1186 0.191 Bornyl acetate 1302 1287 1.11 Caryophyllene 1428 1417 5.06 α-Humulene 1462 1452 0.736 (E)-β-Farnesene 1466 1454 0.589 Germacrene D 1493 1484 18.4 Bicyclogermacrene 1506 1500 0.853 (E,E)- α-Farnesene 1517 1505 0.811 Cadinene δ 1533 1522 0.680 (E)-Nerolidol 1602 1561 1.18 Caryophyllene oxide 1614 1582 1.36 cis-Guaia-3,9-dien-11-ol 1665 1648 0.538 Himachalol 1669 1652 0.724 α-Cadinol 1674 1652 1.11 Chamazulene 1750 1730 12.9 Total 87.5

30 Table 8 : Yield and biological activity of A. millefolium essential oil

Anti- ORAC Cellular Cytotoxicity Essential oil Yield (%) inflammatory (µmol antioxidant 4 1 2 3 IC20 (% (v/v)) IC50 (% (v/v)) Trolox/mL) IC50 (% (v/v)) Wild 0.092 0.010 ± 0.001 104 ± 30 0.19 ± 0.03 >0.125 Cultivated Trace - - - -

2.6 Discussion

Many studies over the past decades have shown that A. millefolium possesses quite a few pharmacological properties. Some of its most interesting anti-ageing effects are its anti-inflammatory and antioxidant properties (Ali et al. 2017). This study aimed to compare these biological activities in wild and cultivated plant extracts from the Saguenay-Lac-St-Jean region in Quebec, Canada. A. millefolium flower and leaf ethanol extracts presented the most potent anti-inflammatory activities.

The cultivated ethanol extracts exhibited more potent cellular antioxidant and anti-inflammatory activities than wild ethanol extracts. However, the flower extracts displayed more cytotoxicity than the leaf extracts. Although the cultivated leaf ethanolic extract exhibited some toxicity compared to its wild counterpart, it was considered the most promising extract for cosmetic use. Its anti-inflammatory and antioxidant activities were present at lower concentrations than its cytotoxicity. The cultivated leaf ethanol extract has twice the antioxidant and 3.8 times the anti-inflammatory properties than the wild leaf ethanol extract. Unfortunately, the cultivated A. millefolium had only trace amounts of essential oil.

Because of their anti-inflammatory and antioxidant activities, the ethanolic extracts were chosen to investigate their chemical content further. All of the compounds identified in the ethanol extracts have also been found in A. millefolium by other researchers: chlorogenic acid, rutin, dicaffeoylquinic acids, luteolin and apigenin (Benedek et al. 2007a; Benetis et al. 2008). These

31 compounds can partly explain the potent antioxidant and anti-inflammatory effects obtained for the ethanolic extracts (Table 9). All of the compounds identified in the ethanolic extracts have previously been found to have anti-inflammatory activities, and all of them except dicaffeoylquinic acids have antioxidant properties. The differences observed in the extracts' toxicity and potency could be explained by the proportion of compounds and other unidentified compounds found in the extracts.

For example, the difference in the strength of the ethanolic leaf extracts' anti-inflammatory and antioxidant activities could be due to their different chlorogenic acid content. The extract with the most potent anti-inflammatory and antioxidant activities, the cultivated leaf ethanol extract, contains

1.4 times more chlorogenic acid than its wild counterpart. It could be relevant in the future to compare the anti-inflammatory effects of the different compounds identified in these extracts to comprehend better their synergistic interaction (Gilbert and Ferreira Alves 2003). For example, luteolin and apigenin found in the cultivated flower ethanol extract could have a synergistic effect on the extract's anti- inflammatory activity. It could explain why the wild flower ethanol extract's anti-inflammatory activity is not as potent because it does not contain luteolin.

Table 9 : Pharmacological effect of compounds identified in A. millefolium ethanolic extracts

Compound Effect Reference Apigenin Anti-inflammatory Man et al. (2012) Antioxidant Sanchez-Marzo et al. (2019) Chlorogenic acid Anti-inflammatory Shan et al. (2009) Antioxidant Sato et al. (2011) Dicaffeoylquinic acids Anti-inflammatory Benedek et al. (2007b) Luteolin Anti-inflammatory Guo et al. (2017) Antioxidant Guo et al. (2017) Rutin Anti-inflammatory Choi et al. (2014) Antioxidant Choi et al. (2016)

As for the wild A. millefolium essential oil, it seems to have anti-inflammatory and antioxidant activities. These properties have already been reported in an essential oil by Chou et al. (2013). Since there were insufficient amounts of essential oil to determine its density, the concentrations are

32 expressed in volume per volume and not in mass per volume, making it difficult to compare the values obtained with the literature. The wild A. millefolium essential oil was active against S. aureus. These results corroborate those found in the literature (Candan et al. 2003; Boucher 2015). However, Boucher

(2015) also found that A. millefolium essential oil from La Doré (Saguenay-Lac-St-Jean, Qc) is also active against E.coli but not as active as against S. aureus. It could be possible that the essential oil used in

Boucher's study was tested at higher concentrations than with the wild A. millefolium essential oil tested, which permitted Boucher to detect an inhibitory effect on the growth of E. coli. The wild essential oil has a similar chemical composition to the essential oil from Boucher's study but presents differences in the proportions in its content (Boucher 2015). The main constituents of the wild essential oil in this article are germacrene D (18.4 %), chamazulene (12.9 %) and sabinene (7.59 %). In contrast, in Boucher's study, there is less germacrene D (6.7 %) and sabinene (5.6 %) and more chamazulene

(16.1 %).

The differences observed in biological activities of wild and cultivated plant extracts and the difference in the essential oil yield could be explained by environmental factors they were exposed to during their growth. Factors such as nutrients, metals, water, salinity, temperature, and radiation affect the plant's chemical content (Borges et al. 2017). When plants exposed to stresses such as nutrient deficiency, lack of water, and high UV solar radiation levels, they tend to produce pharmacologically active compounds, secondary metabolites (Borges et al. 2017). It has been demonstrated that water deficiency can affect plants' essential oil yield (Bettaieb et al. 2011). Tatar et al. (2016) studied the soil water content's effect on the essential oil yields in A. millefolium. They demonstrated that a deficiency or excess water augmented its essential oil yield (Tatar et al. 2016). Perhaps, the wild plants in this study were not exposed to the same amount of water and the same type of soil as the cultivated ones due to the agricultural practices, which resulted in a difference in essential oil yield and differences in the potency of the studied biological activities.

33 The differences between wild and cultivated A. millefolium could also be due to variability in the

A. millefolium aggregate subspecies. This plant has 20 subspecies that differ in ploidy level, morphology and chemical composition (Benedek et al. 2007b). For this study, it would have been interesting to know which subspecies the wild and the cultivated A. millefolium belonged to and could explain the difference observed in the plant extracts' biological activities. Benedek et al. (2007b) studied the distribution of the phenolic compounds in the European A. millefolium aggregate and found variability in the chemical content between the different subspecies tested. As for the essential oil, Spinarova et

Petrikova (2003), who also studied the European A. millefolium, demonstrated that the essential oil content and yield varied with the subspecies of the A. millefolium aggregate. So, the wild and cultivated

A. millefolium could be from different subspecies.

2.7 Conclusion

This study demonstrates that both the wild and cultivated A. millefolium have anti- inflammatory and antioxidant properties, but their potency differs. The most promising extract for cosmetic use was the cultivated leaf ethanol extract. However, this extract presents some toxicity at higher concentrations. More studies are needed on these extracts to identify which compounds are responsible for the extracts' toxicity and if they can be removed from them without reducing their anti- inflammatory and antioxidant activities. Interestingly, the cultivated plant only produced trace amounts of essential oil while the wild plant had a measurable yield. It would also be interesting to study further what types of environmental stresses influence the biological activities of A. millefolium and which subspecies is best for cosmetic purposes.

34 2.8 Supplementary results

Figure 1 : TLC of wild (A) and cultivated (B) leaf extract using the mobile phase CHCl3: MeOH : H2O:

HCOOH (50: 15 : 1: 0.1) after revelation with H2SO4 in the visible (above) and with NP/PEG at 365 nm (below). Apigenin (A), methanolic extract (M), ethanolic extract (E), hydroethanolic extract (3:1)

(E:H 3:1), hydroethanolic extract (1:1) (E:H 1:1) and aqueous extract (H).

Figure 2 : TLC of wild (A) and cultivated (B) flower extracts using the mobile phase CHCl3: MeOH :

H2O: HCOOH (50: 15 : 1: 0.1) after revelation with H2SO4 in the visible (above) and with NP/PEG at

365 nm (below). Apigenin (A), methanolic extract (M), ethanolic extract (E), hydroethanolic extract

(3:1) (E:H 3:1), hydroethanolic extract (1:1) (E:H 1:1) and aqueous extract (H).

Figure 3 : Chromatograms at 280 nm for the wild (A) and cultivated (B) leaf ethanol extracts and the

wild (C) and cultivated (D) flower ethanol extracts

37 Table 10 : Identified compounds in A. millefolium ethanolic extracts

Retention time Peaks Compounds m/z (min) 1 Chlorogenic acid 11.5 353.1 2 Rutin 16.9 609.2 3 Dicaffeoylquinic acid 17.2 515.1 4 Dicaffeoylquinic acid 17.4 515.1 5 Luteolin 21.4 285.0 6 Apigenin 23.0 269.0

Figure 4 : Chemical structure of compounds 1, 2, 5 and 6

Figure 5 : UV spectra of the identified compounds in the A. millefolium ethanolic extracts.

Chlorogenic acid (A), rutin (B), dicaffeoylquinic acids (C and D), luteolin (E) and apigenin (F).

38 Table 11 : Surface area of the different compounds identified in A. millefolium ethanolic extracts

Surface area of the peaks Extract 1 2 3 4 5 6 Wild ETOH leaf 5664.9 6450.8 3674.4 8718.2 - - extract Cultivated EtOH leaf 7948.1 2616.2 5700.6 5439.1 - - extract Wild EtOH flower 5050.3 2309.0 4981.7 6393.6 - 1294.1 extract Cultivated EtOH 2601.2 - 5025.1 3641.0 1360.7 1164.4 flower extract

References

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44 CHAPITRE 3

ÉTUDE DU POTENTIEL COSMÉCEUTIQUE D’UN EXTRAIT HYDROALCOOLIQUE DE BRASÉNIE DE

SCHREBER (BRASENIA SCHREBERI)

3.1 Résumé

Un ralentissement du renouvellement de l’épiderme, une réduction de la fonction barrière de la peau, une peau plus sèche et une structure dermique altérée ainsi que le stress oxydatif et une inflammation chronique de faible intensité sont associés au vieillissement de la peau. Lors de travaux précédents, nous avons étudié les propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes d’extraits méthanolique et aqueux de feuilles d’une plante utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise, soit la Brasénie de Schreber. La présente étude a pour but d’examiner plus en détail l’effet d’un extrait hydroalcoolique de la Brasénie de Schreber sur des cellules en culture in vitro ainsi que sur un substitut de peau humaine. Nos résultats montrent que cet extrait possède des propriétés antioxydantes cellulaires avec un IC50 de 0,28 ± 0,02 µg/mL. Avec une concentration de 160 µg/mL, l’extrait inhibe à

100 ± 6 % la production d’oxyde nitrique par les macrophages RAW 264.7. L’extrait de Brasénie de

Schreber est également en mesure d’induire l’expression de protéines d’intérêt cosméceutique soit l’involucrine, la loricrine, la filaggrine, l’aquaporine-3 et le collagène-1 dans des substituts de peau reconstruits in vitro par génie tissulaire. Les activités biologiques de l’extrait à partir de ce modèle de peau humaine suggèrent une prévention au niveau du vieillissement de la peau. En stimulant la production de collagène-1, l’extrait de Brasénie de Schreber pourrait diminuer les altérations de la structure dermique associées au vieillissement. De par son effet sur l’involucrine, la filaggrine et la loricrine, il pourrait aussi améliorer le renouvellement de l’épiderme et sa fonction barrière. Cet extrait pourrait également avoir un effet bénéfique sur l’hydratation de la peau grâce à son effet sur la filaggrine et l’aquaporine-3. L’extrait de Brasénie de Schreber est un ingrédient actif d’origine naturelle ayant des propriétés anti-âge prometteuses pour l’industrie cosmétique.

POTENTIAL COSMECEUTICAL EFFECTS OF A HYROALCOHOLIC BRASENIA SCHREBERI EXTRACT

Jessica Fortin-Mimeault1, André Pichette1, Jean Legault1

Affiliations:

Chicoutimi (Québec), Canada.

Address for reprint requests:

Jean Legault, Ph.D. (Corresponding author)

Université du Québec à Chicoutimi (UQAC)

555 Boulevard de l'Université, Chicoutimi, QC G7H 2B1

Tel : (1) 418-545-5011 ext. 2334

Fax: +1 418 545 5012

E-mail : [email protected]

46 3.2 Abstract

Aged skin is associated with a slower epidermal turnover, a reduced barrier function, dry skin and an altered dermal structure, as well as oxidative stress and chronic low-grade inflammation. We previously studied the Brasenia schreberi leaves, which possess interesting anti-ageing properties such as antioxidant and anti-inflammatory effects and are also used in traditional Chinese medicine. In this present study, we examine the effect of a hydroalcoholic Brasenia schreberi extract on cell cultures in vitro and on a human skin model. Results show that this extract presents cellular antioxidant properties with an IC50 of 0.28 ± 0.02 µg/mL. At a 160 µg/mL concentration, the extract inhibits 100 ± 6 % inhibition of the nitric oxide production by RAW 264.7 macrophages. This Brasenia schreberi extract also induces the expression of proteins of cosmeceutical interest (involucrin, loricrin, filaggrin, aquaporin-3, and collagen-1) in a human reconstructed skin model. We concluded that the extract’s effects on the human skin substitutes suggest that it could prevent skin ageing. By enhancing collagen-1 production, the extract could help reduce the dermal structure alterations associated with ageing. The extract could improve the epidermal cell turnover and its barrier function by stimulating the expression of involucrin, filaggrin, and loricrin. It could also play a role in skin hydration because of its effect on filaggrin and aquaporin-3. The Brasenia schreberi extract is a promising anti-ageing candidate of natural origins for the cosmetic industry.

3.3 Introduction

Ageing is a process that results in the deterioration of biological functions and the inability to adapt to different stresses (Bennett et al. 2008). As the skin ages, the epidermal cell turnover is slower

(Kottner et al. 2013), the skin's barrier function is reduced (Kottner et al. 2013), the skin is naturally less hydrated (Engelke et al. 1997), and wrinkles are more frequent (Tobin 2017). These clinical signs of ageing are, in part, caused by an alteration to older skin's response to stress, such as oxidative stress and inflammation (Labunskyy and Gladyshev 2013). Both oxidative stress and chronic low-grade inflammation (inflammaging) contribute to the ageing process (Zhuang and Lyga 2014; Rinnerthaler et

47 al. 2015). They are interdependent; the damages of oxidative stress can lead to inflammation and vice versa (Biswas 2016). Together, they undertake the destruction of the dermis extracellular matrix (ECM) and damage the different macromolecules present in the skin cells (nucleic acids, proteins and lipids)

(Zhuang and Lyga 2014; Rinnerthaler et al. 2015). The accumulation of those cellular damages in the elderly eventually is reflected by the clinical signs of ageing, such as wrinkles, skin thinning, and reduced elasticity (Starr and Starr 2014; Rinnerthaler et al. 2015).

Because the green movement has influenced the consumers for the past few decades, the cosmetic industry is still searching for new active ingredients from natural origins (Amberg et Fogarassy

2019). The boreal forest is a vast reservoir abundant in plants (Ministre de l'Environnement 2006) that have been traditionally used and is an excellent source of potentially active plant extracts. Brasenia schreberi, an aquatic plant of the Cabombaceae family (Frère Marie-Victorin et al. 2002), was previously studied by our research team for its antioxidant and anti-inflammatory properties (Legault et al. 2011). This plant is used in traditional Chinese medicine to treat various disorders such as swellings, pain, edema, abscess, boils, and cancer prevention (Li et al. 2007; Zhou et al. 2011). We previously demonstrated the antioxidant and anti-inflammatory properties of aqueous and methanolic

B. schreberi leaf extracts were in part due to gallic acid and quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside in the leaves (Legault et al. 2011). In this study, we first investigated the antioxidant and anti-inflammatory effect of a hydroalcoholic B. schreberi leaf extract on cell cultures in vitro. We also investigated the extract’s effect on the expression of proteins of cosmeceutical interest in an in vitro tissue-engineered human skin substitute.

3.4 Materials and methods

3.4.1 Extract preparation

The hydroalcoholic extract (EtOH: H2O, 75:25) was obtained by reflux extraction. Stock solutions were prepared in DMSO and stored at -20°C until needed. For the treatments, stock solutions

48 were then diluted in cell culture media. The final concentration of DMSO in the culture medium was maintained at 0.5 % (v/v) to avoid solvent cytotoxicity.

3.4.2 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay

The assay was performed as described by Ou et al. (2001) with modifications. This test measures the capacity of the extracts to neutralize peroxyl radicals. First, the samples' dilutions and the internal standards, quercetin and trolox (both tested at 1.25 mg/mL and 5 mg/mL), were prepared and transferred in a black flat-bottom 384-wells (Greiner Bio-One). Afterwards, the fluorochrome was added. The kinetic started when the oxidant, 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), was added. The plate was then read by the Fluoroskan Ascent FLTM plate reader (Labsystems, Milford,

TE/mg).

3.4.3 Cellular antioxidant assay

The procedure was performed as described by Girard-Lalancette et al. (2009). Briefly, to determine the sample's antioxidant potential, human skin fibroblasts WS-1 (ATCC CRL-1502) were

4 seeded into a 96-well plate (1 x 10 cells per well) and incubated at 37°C; 5 % CO2 for 24 hours. The cells were rinsed with 150 μL of phosphate buffer saline (PBS) before incubating for 30 min with 100

μL of 5 μM 2',7'-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) in Hanks' balanced salt solution (HBSS).

Afterwards, the cells were rinsed again with PBS and incubated for one hour with the different concentrations of the tested extract and the positive standard, quercetin (concentrations tested ranged from 0 to 6.25 µg/mL). Then, for the oxidative stress, 200 μM tert-butyl hydroperoxide (t-

49 BuOOH) was added, and the fluorescence was monitored directly after the administration of the t-

BuOOH and after two hours. Measurements were performed with a plate reader (Fluoroskan Ascent

FLTM, Labsystems, Milford, MA, USA) using an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 530 nm. Antioxidant activity was expressed as the concentration of extract inhibiting 50

% (IC50) of DCFH oxidation (Girard-Lalancette et al. 2009). If a sample were antioxidant, it should be oxidized instead of the DCFH-DA. Indeed, the more a sample is antioxidant, the more the fluorochrome is protected from oxidation resulting in less important fluorescence detection. So, the more fluorescence detected, the less the sample has antioxidant properties.

3.4.4 Anti-inflammatory assay

The assay was performed as described previously by Legault et al. (2011) Legault et al. (2011).

Briefly, this test measures the production of nitric oxide (NO) by the macrophages RAW 264.7 (ATCC

TIB-71) in the presence of Escherichia coli lipopolysaccharides (LPS). The macrophages were seeded into a 96-well plate (7.5 x 104 cells per well) and incubated for 16 hours. Afterwards, cells were treated with extract dissolved in DMSO at different concentrations or the positive control, Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) (levels tested were 250 µM and 1 mM), and then incubated for

24 hours. To stimulate the release of NO, cells were treated with LPS (100 ng/mL) and incubated for 24 hours. After that, 100 μL of cell supernatant was mixed with 100 μL of Griess reagent, prepared as described by Green et al. (1990), and incubated at room temperature and shielded from the light for

20 min. Nitrite quantification was estimated using a NaNO2 standard curve, and the absorbance was read at 540 nm using a Multiskan GO plate reader (Thermo Electron).

3.4.5 Cytotoxicity assay

The test performed was previously described by Legault et al. (2011). Briefly, WS-1 cells were plated in flat-bottom 96-well plates at a density of 5 x 103 cells per well in 100 μL of culture medium and to adhere for 24 hours before treatment. Increasing concentrations of the extract or positive

50 control, etoposide (concentrations tested ranged from 0 to 50 µM), were then added (100 μL per well).

The cells were incubated for 48 hours in the presence or absence of these samples. Then, cytotoxicity was assessed using the resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one10-oxide) reduction test (O'Brien et al. 2000). The fluorescence was measured on a Fluoroskan Ascent FL™ plate reader (Labsystems,

Milford, MA, USA) using excitation and emission wavelengths of 530 nm and 590 nm, respectively.

Cytotoxicity is expressed as the lowest concentration of tested extract inhibiting 20 % or more of cell growth in comparison with untreated cells. Following the resazurin test, the quantification of DNA was performed with the Hoechst 33342 staining dye solution. From each well, supernatants were removed, and a solution of SDS 0.01 % was added to break cell membranes. Then, the 96-well plates were frozen overnight at -20°C before adding a solution of Hoechst 30 µg/mL (100 µL), which becomes fluorescent when it binds to the DNA (Data not shown). The fluorescence was measured using excitation and emission wavelengths of 360 nm and 460 nm, respectively. IC20 was expressed as the concentration that inhibits 20 % of cellular growth.

3.4.6 Patient and biopsies

All procedures involving the donor were in agreement with the Declaration of Helsinki, and performed under the guidelines of the Research Ethics Committee of the “Centre Hospitalier

Universitaire (CHU) de Québec” (ethic code: DR-002-1121, protocol renewal approved on 30 January

2019). The donor was given adequate information to allow them to provide written consent. The skin substitutes were produced with cells from a consenting healthy donor's biopsies during a breast reduction surgery. The donor was a Caucasian female of 46 years old. Fibroblasts were extracted with the isolation method using thermolysin and collagenase (Auger et al. 1995). The keratinocytes were obtained with the isolation method using thermolysin and trypsin (Germain et al. 1993). Extracted cells were frozen in liquid nitrogen until needed for the following experiments.

51 3.4.7 MTT assay

Normal human keratinocytes were plated into 96-well plates at 4 x 103 cells per well with 6.4 x 103 cells per well of murine 3T3 fibroblasts feeders. Twenty-four hours after seeding, the cells were treated with growing plant extract concentrations for 24 hours. Cells were then washed with PBS. A solution of thiazolyl blue tetrazolium bromide (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) (0.5 mg/mL) was added to each well and incubated for 4 hours at 37°C in an incubator containing 8 % CO2. Then, culture medium (0.2 mL) was aspired and replaced with an equal volume of acidic isopropanol (EMD Chemicals,

Gibbstown, NJ, USA) to dissolve the intracellular dark-blue formazan crystal formed at room temperature. The absorbance was read at 570 nm after the crystals were completely dissolved. The cytotoxicity for keratinocytes was determined by subtracting the cell viability measured in keratinocyte and feeder culture with that in feeder-alone culture as described by Poon et Burd (2004).

3.4.8 In vitro reconstructed skin

In vitro reconstructed skin substitutes were produced according to the LOEX's self-assembly method (Jean et al. 2009; Belanger et al. 2019; Grenier et al. 2019). Briefly, human dermal fibroblasts at their sixth passage were seeded in 6-well cell culture plates and cultured in the Dulbecco-Vogt modification of Eagle's medium (DMEM) until they formed manipulable sheets. Then, these sheets were superimposed and incubated to create a new dermal layer. To create an epidermal layer, keratinocytes at their third passage were seeded on the dermal layer and were cultured in submerged conditions to promote proliferation. Keratinocytes were cultured in a combination of DMEM and Ham's

F12 (3:1). Seven days later, skin substitutes were raised to the air-liquid interface and further cultured for 21 days with culture medium exempt of EGF to obtain a stratified epithelium representative of in vivo skin.

For the skin substitutes treatments, dilutions of the stock solutions were prepared in a culture medium on the first day of the air-liquid interface. These dilutions were added directly to the petri dish

52 with the skin substitutes. The skin substitutes were treated every two days throughout the week with the diluted extract. Then, samples of each skin substitute condition at days seven, 14 and 21 of the air- liquid interface were taken and analyzed by histology and immunofluorescence staining. Experiments were performed in duplicate in one independent assay.

3.4.9 Histology and immunofluorescence stainings

For histological analyses, samples of each skin substitute were fixed in Histochoice® solution

(Amresco, Solon, OH, USA) and embedded in paraffin wax. Five micrometre-thick sections were stained with Masson's trichrome using Weigert's hematoxylin, fuchsin-ponceau, and aniline blue dyes.

For immunofluorescence analyses, samples were embedded in Tissue-Tek OCT compound

(Somagen Diagnostics, Edmonton, AB, CA) and frozen in liquid nitrogen. Indirect immunofluorescence assays were performed on five µm-thick cryosections permeabilized with acetone. The antibodies used were: rabbit polyclonal anti-collagen-1 (dilution 1:400; Millipore Chemicon, Oakville, ON, CA), rabbit polyclonal anti-aquaporin-3 (dilution 1:500; Abcam, Cambridge, UK), rabbit polyclonal anti-filaggrin

(dilution 1:1600; Cedarlane Covance, Burlington, ON, CA), mouse monoclonal anti-involucrin (IgG1)

(dilution 1:800; Sigma, Oakville, ON, CA) and rabbit polyclonal anti-loricrin (dilution 1:500; Cedarlane

Covance, Burlington, ON, CA). The secondary antibody was either donkey anti-rabbit IgG (H + L) Alexa

488 (dilution 1:1000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) or goat anti-mouse IgG (H + L) Alexa 488

(dilution 1:1200; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Cell nuclei were counterstained with Hoechst reagent 33258 (dilution 1:100; Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA) added to the secondary antibody solution. Negative controls consisted of the omission of primary antibodies during the labelling reaction, and frozen sections of normal human skin were used as positive controls.

Histological and immunofluorescence sections were observed under a Zeiss Axio Imager (Carl

Zeiss Canada Ltd., Toronto, ON, CA) with fixed exposure times and enhancement parameters and

53 photographed with an AxioCam ICc1 digital camera. The fluorescence intensity of the stainings was measured by pixel intensity using ImageJ software. The entire image was analyzed by adjusting the threshold brightness to the same value for each protein. The obtained data were used to compare the fluorescence intensity between treated and non-treated substitutes.

3.5 Results

3.5.1 Antioxidant activity of Brasenia schreberi extract

The antioxidant activities of the B. schreberi extract and quercetin were assessed using the

ORAC assay. The B. schreberi extract and quercetin have ORAC values of 2.4 ± 0.2 and 21 ± 3 µmol

TE/mg, respectively. Figure 6 presents the protective effects of both the extract and quercetin against the oxidation of DCFH in a cell-based assay. Both the extract and the quercetin show interesting antioxidant properties. The B. schreberi extract has an IC50 of 0.28 ± 0.02 µg/mL, while quercetin has one of 0.16 ± 0.03 µg/mL.

Figure 6 : Antioxidant activity of the B. schreberi extract and quercetin after absorption (60 min) by

cells and subsequent exposition (90 min) to 200 µM t-BuOOH, using the cell-based assay. Data

shown as the means ± standard deviation from one experiment (n=6).

3.5.2 Cytotoxicity and anti-inflammatory activity of Brasenia schreberi extract

We studied the cytotoxicity of the B. schreberi extract on the murine macrophage RAW 264.7 cell line. The results shown in Figure 7A demonstrates that extract is not cytotoxic at all the tested concentrations with a survival rate of over 80 %. The B. schreberi extract's anti-inflammatory effect was evaluated on lipopolysaccharide-stimulated Raw 264.7 macrophages (Figure 7B). During this experiment, L-NAME was used as a positive control. Figure 7B shows that the extract at its highest concentration (160 µg/ml) almost completely inhibited nitric oxide production by the RAW 264.7 cell line, with 100 ± 6 % inhibition.

Figure 7 : Effect of the B. schreberi extract on the cytotoxicity (A) and the nitric oxide production (B) after stimulation of the murine macrophage cell line RAW 264.7 with lipopolysaccharide. NG-nitro-

L-arginine methyl ester (62.5 µg/mL) was used as a standard. Values are reported as mean ±

standard deviation and are representative of an experiment (n=6).

The cytotoxicity of the extract was also assessed on healthy human skin fibroblasts (WS-1).

The cells were incubated for 48 hours in the presence of growing concentrations of extract ranging from 0 to 200 µg/mL. The B. schreberi extract does not present cytotoxicity against the WS-1 cell line at concentrations of 100 µg/ml and below, with a survival rate higher than 80 % (Figure 8).

Figure 8 : Cytotoxicity of the B. schreberi extract on human skin fibroblast cell line WS-1. Data

shown as the means ± standard deviation from one experiment (n=6).

3.5.3 Effect of Brasenia schreberi extract on the expression of proteins of cosmeceutical interest

The effect of the B. schreberi hydroalcoholic extract on the expression of proteins of cosmeceutical interest was assessed in an in vitro reconstructed human skin model. With a 50 µg/mL concentration, the extract increases the expression of collagen-1 of 2.7 folds in skin substitutes on day seven of the air-liquid interface compared to the untreated control (Figure 9). With the same concentration, the extract increases the expression of aquaporin-3, involucrin, filaggrin and loricrin in skin substitutes on day 21 of 5 folds, 3.8 folds, 2.9 folds and 3.1 folds, respectively, compared to the control (Figure 10).

Figure 9 : Expression of collagen-1 on day seven of the air-liquid interface in skin substitutes

treated with 50 µg/mL of B. schreberi extract (treated) or not (control) (N=1)

Figure 10 : Expression of aquaporin-3, involucrin, filaggrin and loricrin on day 21 of the air-liquid

interface in skin substitutes treated with 50 µg/mL of B. schreberi extract (treated) or not (control)

(N=1)

3.6 Discussion

In this present study, we first evaluated the antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of a hydroalcoholic B. schreberi extract. In a previous study, these effects were investigated with water and methanol extracts and demonstrated that the methanol extract, which contains

58 quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside has potent anti-inflammatory and antioxidant effects (Legault et al. 2011). Both the B. schreberi extract in this study and the one in our previous study present antioxidant and anti-inflammatory properties, although their extraction solvent differs (Legault et al.

2011). However, because methanol is considered toxic for the skin (Chan et Chan 2018), for this study, we decided to work with a greener and less harmful alternative but just as effective, a hydroethanolic extract (Capello et al. 2007). This extract will be more appealing to the cosmetic industry because of the consumers' preferences in products containing healthy and environmentally friendly ingredients

(Amberg and Fogarassy 2019).

We also examined the effect of the hydroalcoholic B. schreberi extract on the expression of proteins of cosmeceutical interest on reconstructed skin substitute. We found that B. schreberi extract upregulates the protein expression of collagen-1, involucrin, loricrin, filaggrin and aquaporin-3. Similar results were found in previously unpublished data (see Supplementary results) with the mRNA of these proteins with an ethanolic B. schreberi extract.

The B. schreberi extract could also help prevent the alteration of dermal structure associated with ageing by stimulating the production of collagen-1. As we age, there is a decreasing content of collagen-1 in our dermis caused by a shift in the balance between its synthesis and its degradation

(Lovell et al. 1987; Landau 2007). The B. schreberi extract could perhaps help restore the balance in collagen-1’s synthesis and degradation. However, it could be pertinent to investigate the effect of the extract on collagenases and the production of other types of collagen found in the dermis, such as collagen VI and VII. Collagen VI and collagen VII are present in lower levels at the base of wrinkles, suggesting that they may contribute to wrinkle formation (Contet-Audonneau et al. 1999).

The results obtained on the skin substitute suggest that the B. schreberi extract can stimulate the epidermal turnover by enhancing the expression of the keratinocyte differentiation markers: involucrin, filaggrin and loricrin. Stimulating the epidermal turnover could be beneficial to prevent skin

59 ageing. The epidermal turnover of young adults takes about 28 days, while in the elderly requires 40 to 60 days (Grove and Kligman 1983). A slower epidermal turnover affects the skin's barrier function and healing abilities (Grove and Kligman 1983). The cornified envelope (CE) is partly composed of filaggrin, loricrin and involucrin, among others (Rinnerthaler et al. 2013). The CE is responsible, along with the corneocytes, lipids and junctional proteins, for the skin's barrier function (Natsuga 2014).

There are changes in the CE composition with ageing, such as a lower content in loricrin and filaggrin

(Rinnerthaler et al. 2013). An impairment in the keratinocyte differentiation and the cornified envelope could alter the corneal layer's protective barrier function, which has been associated with skin ageing

(Kottner et al. 2013; Dos Santos et al. 2015). Because the B. schreberi extract has a positive effect on the expression of keratinocyte differentiation markers, this extract could positively affect the epidermal turnover.

The B. schreberi extract could prevent skin dryness linked with ageing because of its stimulating effect on aquaporin-3 and filaggrin. Aquaporin-3 plays a role in maintaining the skin's water content (Ma et al. 2002; Hara-Chikuma and Verkman 2008). The levels of aquaporin-3 in the epidermis decrease with age and could explain the skin dryness associate with ageing (Seleit et al. 2017). The B. schreberi extract seems to be an excellent potential hydrating extract because it upregulates the expression of aquaporin-3. Another possible cause for dry skin is a low content in natural moisturizing factors (NMF) in the stratum corneum (Takahashi and Tezuka 2004). NMF are by-products of the degradation of filaggrin in the inner stratum corneum (Fowler 2012; McAleer et al. 2018). Because filaggrin expression is lower in older skin than in younger skin, it can partially explain the link between dry skin and ageing (Takahashi and Tezuka 2004). Because the B. schreberi extract stimulates filaggrin expression, this extract seems promising for its effect on skin hydration.

60 3.7 Conclusion

The hydroalcoholic B. schreberi extract has anti-inflammatory and antioxidant properties without cytotoxicity at effective concentrations. The extract also stimulates the expression of collagen-

1, involucrin, filaggrin, loricrin and aquaporin-3 in human skin substitutes. These results suggest that the extract could prevent skin ageing by enhancing epidermal cell turnover, improving skin hydration and its barrier function and reducing dermal structure alterations. The B. schreberi extract is a promising anti-ageing candidate of natural origins for the cosmetic industry. However, further research is needed to confirm the effect of the extract on aged human skin cells in either an in vitro 3D skin ageing model or clinical trials.

61 3.9 Supplementary materials and methods

3.9.1 Plant Extract

An ethanolic extract obtained by reflux extraction was used to evaluate the effect of B. schreberi on the gene expression of collagen type I α1 and type III α1, aquaporin-3, filaggrin and involucrin in skin cells.

3.9.2 Cell culture

Primary normal human epidermal keratinocytes NHEK (00192627) and primary normal human dermal fibroblasts NHDF-Ad (CC-2511) were obtained from Lonza (Basel, Switzerland). The NHEK cell line was cultivated in KGM-Gold medium (Lonza) and used between passage 3 and 5. The NHDF cell line was cultivated in FGM-2 medium (Lonza) and were used between passage 5 and 9. Both cell lines were grown in a humidified atmosphere at 37°C in 5 % CO2.

Cells were plated 6-well plates 2.5 x 105 cells per well. After incubating 16 hours, the medium was removed and replaced by a fresh medium containing different treatments. Control cells were exposed only to the vehicle or activated with 10 ng/mL of TGF-β (R&D Systems). After 24 hours of treatment, the supernatant was removed, and the wells were rinsed with cold PBS. After completely removing the rinsing buffer, 600 µL of lysis buffer (RLT, Qiagen) added per well.

3.9.3 ARN extraction

The ARN was extracted using the RNeasy mini kit from Qiagen. Briefly, the cell lysates were first prepared with a homogenisator Precellys 24 by using ceramic microbeads before adding DNAse

(DNAse RNAse-free Set, Qiagen) to digest the genomic DNA. The lysates were then transferred to the columns to extract total ARN. The quality of the purified ARN was verified by microfluidic chromatography using a Bioanalyzer (Agilent Technologies). The concentration and the absorbance

62 ratios A260/A280 and A230/A260 were determined using the spectrophotometer NanoDrop

(Thermofisher).

3.9.4 RT-qPCR

For each condition, 450 ng of ARN were transcribed into complementary DNA (cDNA) using the retrotranscriptase (Superscript III mix, Invitrogen). The specific primer for each studied gene (RT2 qPCR Primer Assays) and the PCR buffer (RT2 SYBR Green/ROX PCR Master Mix) was bought from

Qiagen (Table 12). The housekeeping genes used in this experiment were hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) and TATA-binding protein (TBP). The method Delta-Delta Ct

(ΔΔCt) with the software PCR Profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen) was used to quantify each gene's expression and compare the samples.

Table 12 : Studied genes of cosmeceutical interest

Cell type Gene Common name AQP3 NHEK Aquaporin-3 NM_004925 FLG NHEK Filaggrin NM_002016 IVL NHEK Involucrin NM_005547 COL1A1 NHDF Collagen type I α1 NM_000088 COL3A1 NHDF Collagen type III α1 NM_000090

3.9.5 Statistical analysis

The experiment was carried in duplicates for each condition and presented as average ± standard deviation.

63 3.10 Supplementary results

The extract significantly upregulates collagen type I α1 and type III α1 expression compared to the untreated cells (Figure 11). However, the plant extract does not upregulate the collagen Iα1 expression as much as the TGF-β.

Figure 11 : Effect of 50 µg/mL of B. schreberi extract on collagen synthesis in NHDF (N=1)

The B. schreberi plant extract significantly upregulates aquaporin-3 and filaggrin expression in the NHEK cell line compared to the untreated and the TGF-β activated cells (Figure 12). The aquaporin-

3 expression is significantly upregulated in the TGF-β activated cells and in the cells treated with 50

µg/mL of B. schreberi extract.

Figure 12 : Effect of 50 µg/mL B. schreberi extract on aquaporin-3, filaggrin and involucrin in NHEK

(N=1)

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70 CHAPITRE 4

ÉVALUATION DE L’EFFET D’UN EXTRAIT HYDROÉTHANOLIQUE DE BRASÉNIE DE SCHREBER SUR LE

TRANSCRIPTOME DE FIBROBLASTES DE PEAU HUMAINE

4.1 Introduction

Depuis le projet de séquençage du génome humain, plusieurs technologies ont été développées afin de traiter le génome, le transcriptome, le protéome et le microbiome dans leur entièreté (Younis et al. 2017). La transcriptomique est l’étude de l’ensemble des transcrits d’ARN exprimés dans un tissu spécifique (Younis et al. 2017). Ceci peut permettre la comparaison de transcriptomes afin d’identifier des gènes exprimés différentiellement entre différents types cellulaires ou encore entre différents traitements. Les études des profils transcriptomiques peuvent se faire par biopuce ou plus récemment par séquençage de nouvelle génération (Younis et al. 2017). Ces études permettent d’améliorer les connaissances biomédicales dans différents secteurs de recherche, dont la dermatologie. L’établissement du profil transcriptomique peut être utilisé en dermatologie pour

étudier l’effet de maladies (Oestreicher et al. 2001), du vieillissement (Robinson et al. 2009), de l’exposome (He et al. 2004; Liao et al. 2020) et de traitements sur le transcriptome des cellules de la peau (Cho et al. 2020). L’étude du transcriptome peut permettre d’aider à élucider les différents mécanismes d’action impliqués dans ces différents processus. Il existe quelques articles qui montrent l’effet d’extraits de plantes ayant des potentiels cosméceutiques sur le transcriptome de cellules de la peau (Shin et al. 2013; Nanashima et al. 2018; Cho et al. 2020; Im et al. 2020).

Le but de ce chapitre est de présenter les résultats de l’effet d’un extrait hydroalcoolique de

Brasénie de Schreber sur le transcriptome des fibroblastes de peau humaine (WS-1). Cette étude préliminaire sur biopuce à ADN pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes d’action de cet extrait de Brasénie liés aux effets antioxydants, anti-inflammatoires ainsi que sur la stimulation de protéines importantes pour la peau (ex. : collagène, filaggrine, loricrine, involurine et aquaporine) (voir

Chapitre 3). De plus, cette étude pourrait également mener à la découverte de nouvelles applications cosméceutiques pour l’extrait de Brasénie.

Figure 13 : Les étapes principales d’analyses des profils des transcrits à l’aide d'une biopuce à ADN

La Figure 13 explique le fonctionnement d’analyses de transcriptome sur biopuce à ADN. Tout d’abord, les sondes sont générées à partir d’une séquence annotée du génome et sont placées sur une lamelle de biopuce. L’ARN est extrait de différentes conditions expérimentales et est étiqueté avec des colorants fluorescents par transcription inverse. La cible étiquetée est ensuite hybridée avec les sondes sur la biopuce. La fluorescence émise est détectée par un dispositif de balayage à barrettes. Ensuite, l’analyse des images, la filtration de la qualité, la transformation des données et la normalisation sont effectuées. (Ehrenreich 2006)

Les résultats obtenus lors de cette étude sur biopuce à ADN devront être confirmés par RT-qPCR et ensuite par immunobuvardage de type Western ou par immunofluorescence afin de s’assurer que les effets observés sur le transcriptome sont également présents au niveau protéomique. En effet, plusieurs études ont montré que les niveaux d’expression d’ARNm et de leurs protéines respectives

72 n’étaient pas toujours corrélés (Guo et al. 2008). Il sera donc important de valider que l’effet de l’extrait de Brasénie sur l’expression de l’ARNm d’un gène donné est également présent sur l’expression de sa protéine encodée du même gène.

4.2 Matériels et méthodes

4.2.1 Culture cellulaire

La lignée de fibroblastes de peau humaine WS-1 (ATCC CRL-1502) utilisée dans cette expérimentation provient de American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont

été cultivées dans un milieu de culture Dulbecco’s Minimum Essential Medium supplémenté avec 10

% de sérum de veau (Hyclone, Logan, UT, USA), 1x MEM Vitamins (Corning, Manassas, VA, USA), 100

IU de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine (Cellgro®, Mediatech, Manassas, VA, USA) dans un incubateur humidifié à une température de 37 °C avec 5 % de CO2. Le milieu de culture complet a été changé deux fois par semaine.

4.2.2 Traitements

Les cellules de passage 15 ont été ensemencées à 2 millions de cellules par boîte de Pétri de

100 mm. Lorsque les cellules dans les boîtes de Pétri étaient confluentes, elles ont été traitées avec un extrait hydroalcoolique (EtOH:H2O 75:25) de Brasénie de Schreber obtenu par reflux. Les cellules ont

été incubées avec différentes concentrations de l’extrait de Brasénie, soit 0 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL ou 100 µg/mL, et ce, pendant une heure, trois heures ou six heures. Les concentrations sélectionnées pour les traitements ne présentent pas de toxicité après un traitement de six heures; elles ont été choisies en fonction du test de cytotoxicité (0 à 200 µg/mL) effectué préalablement.

73 4.2.3 Extraction d’ARN

À la fin des traitements, l’ARN des cellules a été extrait avec le RNeasy mini kit de Qiagen

(Hilden, Allemange). Brièvement, les cellules ont été lysées directement en utilisant 600 µl de tampon

RLT (Qiagen, Allemange). Les lysats de cellules ont ensuite été passés cinq fois dans une seringue libre d’ARNase avec une aiguille de calibre 20. Les lysats ont par la suite été transférés sur les colonnes pour extraire l’ARN total. La concentration et les ratios d’absorbance A260/A280 et A230/A260 ont été déterminés avec le spectrophotomètre Nanodrop (Thermofisher).

4.2.4 Analyse des profils d’expression des ARNm par biopuce

L’ARN extrait a été étudié sur la biopuce Clariom S human de Affymetrix (Thermofisher) par

Génome Québec. Les résultats obtenus ont ensuite été analysés avec le logiciel Transcriptome analysis

Console (TAC) de Thermofisher.

4.3 Résultats et discussion

L’analyse transcriptomique de fibroblastes de peau humaine a été explorée afin d’éclaircir les mécanismes d’action de l’extrait de Brasénie sur la production de collagène ainsi que sur les processus inflammatoires et oxydants. Les résultats préliminaires présentés dans cette section sont ceux dont l’expression génique est augmentée ou diminuée d’au moins un facteur deux par rapport aux cellules non traitées et qui semblent présenter une relation concentration dépendante et/ou temps dépendant.

La Figure 14 montre l’expression génique de différents gènes après une heure de traitement avec l’extrait de Brasénie de Schreber à différentes concentrations. L’expression de ces gènes semble s’accroître en fonction de la concentration croissante de l’extrait. Cependant, l’expression de ces gènes ne semble pas suivre une relation temps-dépendant (résultats non présentés). Les paragraphes suivants discuteront des gènes ressortis dans la figure ci-dessous et leurs rôles connus.

Figure 14 : Expression génique en fonction de la concentration de l'extrait de Brasénie après une

heure de traitement

Le gène DUSP6 est un gène codant pour une phosphatase à double spécificité qui lie spécifiquement et inactive la phospho-ERK1/2 par déphosphorylation dans les cellules des mammifères

(Rhim et al. 2009). La protéine DUSP6 déphosphoryle ERK et empêche les signaux de croissances cellulaires (Furukawa et al. 2003). Ceci fait en sorte que le gène DUSP6 est considéré comme un gène suppresseur de tumeur (Toriseva et al. 2012).

Le gène IER2 (connu également sous le nom ETR101) est un gène de réponse immédiate précoce (Rollins et Stiles 1989). Ce gène code pour la protéine IER2 qui est impliquée dans la régulation, la motilité cellulaire et l’adhésion, l’angiogenèse et l’invasion des cellules tumorales et des métastases

(Neeb et al. 2012; Wu et al. 2015a; Wu et al. 2015b; Xu et al. 2017). Cette protéine est potentiellement un facteur de transcription, mais la façon dont elle est impliquée dans régulation de la transcription de gènes n’est pas encore bien comprise (Ueda et al. 2019).

75 Le gène PRAMEF8 (également connu sous le nom PRAMEF24) code pour une protéine qui serait impliquée dans la prolifération cellulaire, l’apoptose et la différenciation cellulaire selon la déduction d’annotations électroniques (National Center for Biotechnology Information 2020). À ma connaissance, il n’y a pas d’article publié sur ce gène.

Le gène EGR1 (connu également sous les noms NGF1-A, TIS8, Krox24, zif268 et ZENK) est celui qui semble réagir le plus fortement à l’augmentation de la concentration de l’extrait. EGR1 est un gène de réponse immédiate précoce dont l’induction de son expression est rapide et transitoire (Sukhatme et al. 1987). Son expression est induite par plusieurs stimuli extracellulaires tels que les rayons UV, la stimulation mécanique, l’hypoxie, les hormones et les facteurs de croissance (Havis et Duprez 2020).

Ce gène code la protéine EGR1 qui fonctionne comme un régulateur de transcription impliqué dans la croissance cellulaire, la différenciation, la sénescence et l’apoptose (Rhim et al. 2009; Havis et Duprez

2020). L’augmentation de l’expression de l’ARNm de EGR1 pourrait expliquer l’effet de l’extrait de

Brasénie sur la production de collagène (Chapitre 3). En fait, EGR1 stimule la production de collagène et accélère la cicatrisation (Bryant et al. 2000). Bryant et al. (2000) ont démontré que la thérapie génique avec EGR1 dans un modèle de guérison d’une excision chez des rongeurs améliore la production de collagène, la réépithélialisation, l’angiogenèse et la contraction de la blessure. Il pourrait donc être intéressant d’étudier l’effet de l’extrait de Brasénie dans un modèle de guérison de plaies tel que le scratch assay sur fibroblastes de la peau pour commencer (Martinotti et Ranzato 2020).

Également, il pourrait être intéressant d’étudier plus en profondeur la mécanistique derrière l’augmentation de collagène de type I induit par l’extrait de Brasénie.

Le gène EGR3 (connu également sous le nom PILOT) est un gène de réponse précoce dont l’induction de son expression est retardée et soutenue comparativement à EGR1 (O'Donovan et al.

76 1998). Ce gène code pour la protéine EGR3 laquelle est impliquée dans le cycle circadien, la réponse fibrogénique et l’immunité (Morris et al. 1998; Li et al. 2012b; Fang et al. 2013). Son expression est induite en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines, l’hypoxie et aux forces mécaniques associées aux blessures et aux stress (Fang et al. 2013). Malgré le fait que l’effet transcriptomique de l’extrait de Brasénie a seulement été étudié sur une lignée cellulaire de fibroblastes de la peau, l’augmentation de l’expression de l’ARNm de EGR3 observée pourrait potentiellement aussi être impliquée dans l’effet de l’extrait de Brasénie sur la différenciation des kératinocytes. Kim et al. (2019) ont démontré que le gène EGR3 est impliqué dans la différenciation tardive de l’épiderme. Cette hypothèse pourrait être confirmée en étudiant l’effet de l’extrait de Brasénie sur le transcriptome des kératinocytes. Ceci pourrait éclaircir les mécanismes d’action de l’extrait de la Brasénie au niveau de l’épiderme.

Les gènes EGR1 et EGR3 sont également impliqués dans le cycle circadien (Rusak et al. 1992;

Morris et al. 1998). Puisque l’extrait de Brasénie module l’expression de EGR1 et EGR3, il pourrait être

également intéressant d’étudier l’effet de l’extrait de Brasénie sur le rythme circadien au niveau de la peau en étude clinique. Plusieurs paramètres de la peau sont contrôlés par le rythme circadien comme la perte d’eau insensible, la production de sébum, le pH de la peau et la circulation sanguine (Reinberg et al. 1996; Latreille et al. 2004). Il pourrait donc être intéressant d’évaluer comment l’extrait de

Brasénie peut jouer sur ces paramètres contrôlés par le rythme circadien.

Figure 15 : Effet de l’extrait de Brasénie sur expression génique de DDIT4 en fonction de la

concentration et du temps

La Figure 15 présente l’expression génique du DDIT4 en fonction de la concentration d’extrait et de la durée du traitement. Les résultats montrent que l’expression du gène DDIT4 semble diminuer en suivant des relations concentrations et temps dépendants. DDIT4 (également connu sous les noms

REDD1 et RTP801) est un gène de réponse au stress dont l’expression est induite par l’hypoxie, l’ADN endommagé, la carence en nutriments ou en énergie, ou par des stress au niveau du réticulum endoplasmique (Ellisen et al. 2002; Shoshani et al. 2002; Brugarolas et al. 2004; Lin et al. 2005; Sofer et al. 2005; Wang et al. 2006; DeYoung et al. 2008). La protéine DDIT4 est un inhibiteur connu de mTOR; cependant, il n’y a pas de mTOR dans les fibroblastes de peau humaine (DeYoung et al. 2008; The

Human Protein Atlas 2020). Il a été montré que l’expression du gène DDIT4 est impliquée dans la régulation du stress oxydatif (Shoshani et al. 2002). En effet, son expression est augmentée en présence de stress oxydatif (Ellisen et al. 2002). Par conséquent, la diminution de l’expression du gène DDIT4 pourrait peut-être s’expliquer par le potentiel antioxydant de l’extrait de Brasénie. D’autre part, il pourrait également être intéressant d’étudier plus en profondeur comment le pouvoir antioxydant de l’extrait de Brasénie affecte les signaux cellulaires des cellules de la peau.

78 4.4. Conclusion

Lors de l’analyse de l’effet transcriptomique de l’extrait hydroalcoolique de Brasénie de

Schreber sur des fibroblastes de peau humaine, quelques gènes sont ressortis étant donné leur augmentation ou diminution d’expression suivant une cinétique concentration ou temps dépendants.

Entre autres, EGR1, EGR3 et DDIT4 sont des gènes intéressants dont l’expression a été modulée par l’extrait. L’expression du gène EGR1, impliqué dans la synthèse de collagène et la cicatrisation, est stimulée par l’extrait de Brasénie. L’extrait stimule également l’expression du gène EGR3 qui est connu pour être impliqué dans la différenciation tardive de l’épiderme. DDIT4, dont l’expression du gène est réprimée, a été impliqué dans la régulation de divers stress cellulaires notamment oxydatifs suggérant un effet protecteur de l’extrait de Brasénie. Pour la suite des travaux, il sera important de confirmer la modulation de l’expression de gènes identifiés par qPCR ainsi que de confirmer la présence des protéines. Pour de prochaines études, il pourrait être intéressant d’étudier plus en profondeur la mécanistique derrière l’augmentation de collagène de type I et les marqueurs de différenciation tardive des kératinocytes, mais également les propriétés antioxydantes de l’extrait de Brasénie affectant les signaux cellulaires des cellules de la peau.

79 CONCLUSION

Dans le cadre de ce projet de recherche, deux plantes issues de la forêt boréale, l’Achillée millefeuille (Achillea millefolium) et la Brasénie de Schreber (Brasenia schreberi), ont été étudiées pour leurs potentiels cosméceutiques à partir de plusieurs modèles in vitro.

Durant le premier volet du projet, des extraits et les huiles essentielles d’Achillée millefeuille de plantes sauvages et de plantes cultivées ont été comparés au niveau de leur activité biologique et de leur composition chimique. Au meilleur de nos connaissances, c’est la première étude qui compare l’activité biologique de l’Achillée millefeuille sauvage à celle cultivée. Nous avons démontré que l’Achillée millefeuille cultivée étudiée ne produisait pratiquement pas d’huile essentielle comparativement à la plante sauvage. L’huile essentielle de l’Achillée millefeuille a des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et antibactériennes contre S. aureus. Les feuilles de l’Achillée millefeuille cultivée, lorsqu’extraites à l’éthanol, avaient des propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes qui rendaient cette plante intéressante pour des usages cosmétiques. Les différences en activités biologiques et en composition chimique observées chez l’Achillée millefeuille sauvage et celle cultivée peuvent s’expliquer en partie par une différence d’environnement. Lors de cette partie de projet, il aurait pu être pertinent de déterminer la sous-espèce des plantes sauvages et celles cultivées.

Cette différence possible aurait pu expliquer les variations en activité biologiques des extraits et des rendements d’huiles essentielles. Pour la suite des travaux, il pourrait être intéressant d’étudier plus en profondeur l’effet de stress environnementaux sur les activités biologiques de l’Achillée millefeuille afin de déterminer les conditions optimales pour la cultiver.

Lors du deuxième volet du projet, l’effet d’un extrait de feuille de Brasénie de Schreber a été

étudié sur l’expression 1) protéique et 2) transcriptomique des cellules de la peau humaine. Cette

étude est la seule au meilleur de nos connaissances qui étudie l’effet des feuilles de Brasénie sur un substitut de peau. L’extrait de Brasénie de Schreber possède des propriétés antioxydantes et anti-

inflammatoires. Cet extrait augmente les niveaux protéiques de collagène-1, d’involucrine, de loricrine, de filaggrine et d’aquaporine-3 dans un substitut de peau humaine. Ces activités biologiques suggèrent que l’extrait de Brasénie de Schreber possède des propriétés anti-âge. L’extrait pourrait entre autres prévenir le vieillissement en stimulant le renouvellement de l’épiderme, en améliorant l’hydratation de la peau ainsi que sa fonction barrière et en diminuant les altérations à la structure dermique. Il pourrait être intéressant pour un prochain projet d’étudier l’effet de la Brasénie de Schreber sur un modèle 3D de peau humaine âgée ou encore en étude clinique sur la peau de personnes âgées. En ce qui concerne la seconde partie, grâce à l’étude de l’effet de la Brasénie de Schreber sur le transcriptome, nous avons identifié quelques pistes du mode d’action des effets que nous avions précédemment observés associées à cet extrait. Par exemple, la stimulation de l’expression de l’ARNm du gène EGR1 chez les fibroblastes WS-1 sur biopuce d’ADN pourrait expliquer l’augmentation de l’expression protéique du collagène-1 au niveau du derme du substitut de peau. Les résultats obtenus de l’effet transcriptomique de la Brasénie de Schreber sur biopuce à ADN n’ont pas pu être confirmés par RT-qPCR pour l’ARNm des gènes qui nous intéressent, ainsi que par immunofluorescence ou immunobuvardage de type Western pour les protéines codées par l’ARNm. Pour un prochain projet, il serait intéressant d’étudier plus en profondeur les différents mécanismes d’action de l’extrait de la

Brasénie de Schreber pour bien comprendre sur quoi (récepteur, facteur de transcription …) et de quelle manière l’extrait entraine des effets anti-âge.

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