APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DEL CÓDIGO DE BARRAS DE LA VIDA PARA EVALUAR LA DIVERSIDAD DE ESPECIES EN LA FAMILIA () EN LA RESERVA GUADUALITO, QUINDÍO.

Alfonso Andrade-Campuzano 1, Luisa Arcila-Cardona 2, Nicola S. Flanagan 3 y Rodrigo Bernal 4.

1. Pontificia Universidad Javeriana-Cali. Correo: [email protected] 2. Universidad del Valle. Correo: [email protected] 3. Pontificia Universidad Javeriana-Cali. Correo: [email protected] 4. Reserva Natural Guadualito. Correo: [email protected]

Resumen: La pérdida de biodiversidad a nivel global es un gran reto en términos ambientales, e identificar esta biodiversidad para implementar estrategias de conservación eficaces es el desafío de la taxonomía moderna. El método de Código de Barras de la Vida (Barcoding), es una aproximación desarrollada para identificar especies de una manera rápida y precisa usando regiones genéticas cortas y estandarizadas. Los lepidópteros son un orden altamente diverso que presenta varios casos de cripticismo entre sus especies. La familia Crambidae es una familia de polillas altamente diversa y difícil de identificar morfológicamente, y frecuentemente son confundidas con especies de su familia hermana Pyralidae. Las especies de la familia Crambidae han sido estudiadas por ser plagas de cultivos, pero se presenta un gran vacío en cuanto a la riqueza de esta familia. En este estudio se realizó un inventario de la diversidad de las polillas Crambidae en la Reserva Guadualito, ubicada en la zona Andina colombiana. Se muestrearon 45 individuos, de los cuales 24 correspondieron a 20 especies distintas con un porcentaje de identidad genética mayor a 97%. Las otras 21 muestras se pudieron identificar sólo hasta el nivel de género o taxonomía superior. De las 20 especies identificadas, 10 son nuevos registros para . Estos resultados confirman que el código de barras de la vida es una herramienta que aporta en el reconocimiento de la riqueza de especies de Lepidoptera, y se recalca que debe usarse más ampliamente para aumentar los registros de especies. Sin embargo, es esencial aplicar esta técnica de forma complementaria con la taxonomía basada en caracteres morfológicos, ya que las bases de datos de referencia (BOLD Systems y GenBank) todavía carece de un registro completo.

Palabras Clave: Barcoding, Polillas, Molecular Operational Taxonomic Unit (MOTU), Taxonomía.

Summary: The loss of biodiversity at a global level is a great challenge in environmental terms, and identifying this biodiversity to implement effective conservation strategies is the challenge of modern . The Barcode of Life (Barcoding) method is an approach developed to identify species in a fast and precise way using short and standardized genetic regions. Lepidoptera are a highly diverse order that presents several cases of crypticism among its species. The Crambidae family is a highly diverse family of that is difficult to identify morphologically, and they are frequently confused with species from their sister family Pyralidae. Species of the Crambidae family have been studied for being crop pests, but there is a great gap in the richness of this family. In this study, an inventory of the diversity of Crambidae moths was carried out in the Guadualito Reserve, located in the Colombian Andean zone. 45 individuals were sampled, of which 24 corresponded to 20 different species with a percentage of genetic identity greater than 97%. The other 21 samples could be identified only up to the or higher taxonomy level. Of the 20 species identified, 10 are new records for Colombia. These results confirm that the life barcode is a tool that contributes to the recognition of the species richness of Lepidoptera, and it is emphasized that it should be used more widely to increase species records. However, it is essential to apply this technique in a complementary way with the taxonomy based on morphological characters, since the reference databases (BOLD Systems and GenBank) still lack a complete registry.

Keywords: Barcoding, , Molecular Operational Taxonomic Unit (MOTU), Taxonomy.

Introducción

Colombia es uno de los países con mayor diversidad en el mundo (Poveda et al., 2010). Cuenta con un registro aproximado de 51 330 especies, cifra que lo posiciona como el país más biodiverso en aves y orquídeas, y el segundo en plantas, anfibios, peces dulceacuícolas y lepidópteros. En Lepidoptera son 1905 especies registradas hasta ahora, de las cuales aproximadamente el 16% (305) son endémicas (SiB Colombia, 2020). Esta biodiversidad se ve reflejada en el reconocimiento de dos importantes “hotspots” en el país: el Choco biogeográfico y los Andes tropicales, siendo este último, el hotspot más crítico para la conservación de la biodiversidad en la tierra (Myers et al., 2000).

La gran biodiversidad de estos hotspots y en general del país se está perdiendo a causa de la transformación y deforestación de bosques naturales, ocasionadas por actividades como la ganadería extensiva, la agricultura y la minería (Poveda et al., 2010). Para tomar acciones que salvaguarden esta diversidad a nivel global, distintas entidades se han enfocado en generar un inventario de diversidad biológica (SCBD, 2020).

El número de registros de todas las especies reconocidas en el planeta es aproximadamente de 1,8 a 1.9 millones y se estima que faltan entre 5 y 10 millones de especies por identificar (May y Harvey, 2009; Roskov et al., 2020). A pesar de los esfuerzos taxonómicos, la brecha de especies por describir, registrar e inventariar, se debe a la poca exploración de ciertas zonas del planeta y a los retos que representa la identificación morfológica de algunos taxa (Paz et al., 2011). Este problema es más difícil en grupos como insectos y plantas, debido a la gran diversidad que existe, combinado con la deficiencia en especialistas taxonómicos (Blaxter, 2003).

El orden Lepidoptera es entre los insectos uno de los más numerosos, con aproximadamente 150.000 especies descritas (Van Nieukerken et al., 2011). La familia Crambidae, junto a Pyralidae conforman la super familia Pyraloidea, con alrededor de 16.000 especies en el mundo. Crambidae es la tercera familia con mayor número de especies dentro del orden (Solis, 2007) y la de mayor número de especies dentro de la super familia Pyraloidea (Acosta-Vásquez et al., 2017), con un total de 9,655 especies descritas en todo el mundo.

Las especies de Pyraloidea se caracterizan morfológicamente por tener escamas en la base de la probóscide, órganos timpánicos abdominales ubicados en el esternito 2, y venas Rs2 y Rs3 del ala anterior fusionadas en una misma vena principal (Minet, 1991; Regier et al., 2012; Solis y Metz, 2016; Acosta-Vásquez, et al., 2017). La característica más relevante que diferencia a Crambidae de Pyralidae es la forma de los órganos timpánicos. En Pyralidae la cámara timpánica generalmente está cerrada o en algunos casos presenta una pequeña apertura anterior. En Crambidae, la cámara timpánica tiene una amplia apertura anteromedial y presenta una membrana en forma de colgajo llamada praecinctorium, ausente en Pyralidae (Guenée, 1854; Kristensen, 1998). Debido al tamaño pequeño de las especies, la diferenciación de ambas familias se basa en la observación detallada bajo el estereoscopio de estos órganos timpánicos (Solis, 2007).

A simple vista Crambidae y Pyralidae son indistinguibles, a menos que sean observadas por un taxónomo experto (Regier et al., 2012). De igual forma, al interior de ambas familias, la taxonomía se basa en rasgos de genitalia inconspicuos. Estas características de difícil

1 observación, sumado a su gran diversidad, ocasiona que las especies crípticas de este grupo taxonómico sean obviadas comúnmente (Smith et al., 2006). Por ende, a pesar de ser una de las familias más numerosas entre los lepidópteros (Solis, 2007), la taxonomía de la familia Crambidae siempre ha tenido brechas y muy pocos avances sistemáticos en comparación a otras familias de lepidópteros (Regier et al., 2012)

La familia Crambidae incluye especies que son plagas importantes, que causan daños económicos a los cultivos, bosques y productos almacenados (Nagaharish et al., 2017; Solis, 2007; Solis y Metz, 2016). Por ejemplo, en Colombia recientemente se ha descrito la nueva especie Eoreuma insuastii como plaga importante de la caña de azúcar (Solis et al., 2020a). A pesar de la importancia económica de este grupo, su taxonomía en Colombia no se ha estudiado de manera exhaustiva, debido a la dificultad para encontrar caracteres diagnósticos que permitan separar especies en esta familia con el uso de la taxonomía morfológica.

La identificación taxonómica de algunas especies representa grandes desafíos cuando se utilizan métodos enfocados en la delimitación a partir de rasgos morfológicos diferenciales. Los retos de clasificación en estos casos se originan, ya sea porque la especiación ocurre sin cambios morfológicos o porque las estructuras morfológicas son difíciles de estudiar (Padial et al., 2010). Ambos casos pueden resultar en grupos de especies crípticas, las cuales se definen como dos o más especies clasificadas como una sola especie nominal porque morfológicamente son indistinguibles (Bickford et al., 2007).

En los lepidópteros la ocurrencia de especies crípticas se ha detectado a través de diferentes familias, como Hesperiidae (Hebert et al., 2004), Papilionidae (Lukhtanov et al., 2016), Pyralidae y Crambidae (Haines y Rubinoff, 2012; Regier et al., 2012). El reconocimiento de esta diversidad críptica es esencial para el desarrollo de estrategias efectivas de conservación, debido a las problemáticas que ocasiona las especies Crambidae por su rol de plaga de cultivos (Solis, 2007; Solis y Metz, 2016).

Una alternativa para trabajar con especies taxonómicamente problemáticas es usar las Unidades Taxonómicas Operativas Moleculares (MOTU por sus siglas en inglés). La aplicación de las MOTUs son una alternativa para aproximarse a la sistemática de un grupo que presenta diversidad críptica (Bálint et al., 2011). El termino proviene de OTU, Unidad Taxonómica Operativa y fue acuñado por Floyd et al., 2002. También se les denomina “filotipos” o “genoespecies”, y se definen como grupos de secuencias similares en un locus de ADN y diferentes a otras secuencias pertenecientes al mismo locus. Si dos muestras generan secuencias similares dentro de un límite o umbral de divergencia establecido, se consideran la misma MOTU (Blaxter, 2004). El uso de las MOTU como sistema alternativo de taxonomía permite la caracterización rápida y efectiva de la diversidad, con aplicaciones en estudios evolutivos y ecológicos. Adicionalmente, la detección de MOTUs indica en donde enfocarse para futuros estudios taxonómicos basados en rasgos fenotípicos (Floyd et al., 2002; Blaxter, 2004; Bálint et al., 2011)

El concepto de las MOTUs se articula con la iniciativa del Códigos de Barras de la Vida (Barcode of Life ó Barcoding) lo cual, de manera similar, surgió como una respuesta a la dificultad taxonómica de identificar especies. El barcoding constituye una herramienta diseñada para identificar de forma rápida y precisa las especies a partir de una secuencia de ADN corta y estandarizada (Hebert et al., 2003). Este método de análisis molecular no busca remplazar o excluir a la taxonomía morfológica convencional. Más bien, esta

2 herramienta molecular se convierte en un complemento de la taxonomía convencional que permite generar registros más precisos y eficaces (Padial y De La Riva, 2007).

La región de ADN más utilizada para trabajar con animales es la del gen citocromo c oxidasa subunidad 1 (CO1) del genoma mitocondrial (Paz et al., 2011). Esta técnica fue sujeta a prueba en Lepidoptera, grupo en el cual ha sido ampliamente aplicada (Kerr et al., 2009). La secuencia codificante de CO1 es de aproximadamente 648p.b. (Hebert et al., 2003) y presenta una alta tasa de sustitución, lo que genera una acumulación de sustituciones en nucleótidos de distintas posiciones entre diferentes especies, especialmente en aquellas recientes, permitiendo su diagnóstico a partir de estas secuencias de ADN (Hebert et al., 2003).

Esta alta tasa de sustitución, puede conllevar a un incremento en la variación de la secuencia entre individuos de la misma especie, provocando dificultades para determinar el límite entre dos especies hermanas (Hebert et al., 2003). Sin embargo, estudios demuestran la presencia del conocido barcoding gap, en donde la variación genética interespecífica excede la variación intraespecífica hasta el punto de que existe una brecha que permite distinguir individuos de diferentes especies con poco error (Hebert et al., 2003; Barrett y Hebert, 2005; Wiemers y Fiedler, 2007). Estudios previos estandarizaron los valores de divergencia de esta manera, una diferencia menor a 3% corresponde a individuos conespecíficos, menor a 7% corresponde a individuos congenéricos y de menos del 10% a individuos de la misma familia (Hebert et al., 2003; Hebert et al., 2004). Dependiendo del porcentaje de divergencia se pueden obtener datos útiles para corroborar la información taxonómica, y también se pueden presentar datos nuevos que no concuerden con la base de datos y que sugieran falta de información o una nueva especie (Paz et al., 2011).

Si se detectan valores de divergencia entre individuos de la misma especie mayores a 3% esto puede indicar la existencia de varias especies dentro de un grupo o complejo críptico (Paz et al., 2011). Un claro ejemplo es el caso del lepidóptero Astraptes fulgerator (Walch, 1775), que tiene una distribución desde América del Norte hasta América del Sur. A lo largo de todo este rango de distribución se presentan adultos idénticos, provenientes de larvas con morfotipos asociados a diversas fuentes de alimentación. Previo al uso del barcoding se clasificaban los diferentes morfotipos bajo la especie nominal Astraptes fulgerator, pero después de un trabajo en el que se integró la taxonomía convencional y el código de barras de ADN, se pudo dilucidar que se trataba de un complejo críptico de diez especies (Hebert et al., 2004).

Dadas las dificultades taxonómicas en la familia Crambidae y la probabilidad de la presencia de especies crípticas. Esta investigación tiene como objetivo caracterizar la diversidad de Crambidae, aplicando la técnica de código de barras de la vida en un área natural protegida de la región Andina de Colombia. Para esto se identificarán molecularmente las muestras capturadas en la reserva Guadualito y se generara un listado de especies de la familia Crambidae presente en la reserva.

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Materiales y Métodos

Área de estudio

El estudio se llevó acabo en la Reserva Guadualito (4° 34' 10.75" N, 75° 48' 34.80" W, a 1200 msnm), en la Vereda El Gigante, Municipio Montenegro, Departamento de Quindío, Colombia (Figura 1). La reserva consiste en nueve hectáreas de bosque andino, guaduales y jardines, extendiéndose 470 metros a lo largo del Río Roble, en medio de una zona dedicada a cultivos de banano, plátano, café y piña, además de tener presencia ganadera. Sin embargo, a pesar de la alta deforestación que hay en la zona, la reserva cuenta con fragmentos de bosque restaurado (IDEAM, 2020). La mayoría de bosque dentro de la reserva es secundario.

Figura 1: Mapa de la reserva Guadualito.

Se llevaron a cabo muestreos nocturnos el 19 de mayo, 28 y 29 septiembre de 2019, en la zona norte de la reserva, que está cerca de un acantilado en orientación hacia la cuenca del Rio Roble. Esta zona se caracteriza por tener mayor cobertura de bosque y poca iluminación artificial.

Para los muestreos se utilizó una trampa de luz (Hulcr et al., 2007) con luz blanca y luz ultravioleta, puesto que este espectro de luz atrae más a las polillas (Callahan, 1968). La

4 trampa consistió en una bombilla de luz blanca (50 w y 4500 LM, Probelco), junto a un tubo de neón de luz ultravioleta (18-20W, 11V), todo esto apoyado en una estructura de tubos de PVC (Figura. 1) con una tela blanca de fondo. La trampa se colocó hacia un acantilado entre las 7 pm y las 2 am (7 horas). Se colectaron las polillas que cayeran en la trampa, enfocando la colecta en las especies Crambidae, distinguibles por sus caracteres morfológicos generales: palpos labiales en forma de hocico y antenas hacia atrás.

Al colectar las muestras, se definieron el mayor número de diferentes morfotipos que pudiesen pertenecer a Crambidae. Se colectó dos individuos por morfotipo, sin embargo, esto no siempre fue posible, puesto que algunos morfotipos solo se observaron una vez en la trampa de luz.

Debido al tamaño pequeño de los especímenes, se aplicó el sacrificio por medio de cámara letal (Gray, 1947). Se suministraron dos gotas de acetato de etilo a la cámara para las muestras pequeñas y cuatro para las más grandes. Una vez muertas, se les extrajeron las patas del lado derecho del cuerpo y se almacenaron en tubos eppendorf con alcohol al 96% para el análisis molecular (Simmons y Scheffer, 2004), dejando un espécimen “voucher” que será depositado en el Museo de Entomología de la Universidad del Valle (MUSENUV). Los especímenes grandes se dispusieron en sobres de papel milano de forma triangular (Andrade, 2013) y los de menor tamaño se guardaron en tubos eppendorf, en donde fueron transportados al laboratorio dentro de un contenedor tipo tupper, con arroz seco como deshidratante. Una vez en el laboratorio, los cuerpos de los especímenes se guardaron en la nevera para el montaje. Para el montaje se siguió el método de Landry y Landry (1994).

Figura 2:Marco de la trampa de luz elaborado con tubos de PVC por Luisa Arcila.

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Identificación Taxonómica

La identificación taxonómica de cada morfotipo se realizó con una consulta previa sobre la diversidad de las 32 especies registradas previamente en la Reserva Guadualito (R. Bernal pers. com.). Para empezar, se tuvo como guía las sinapomorfias de Pyraloidea junto a Crambidae y Pyralidae. Estos caracteres son: la base de probóscide cubierta de escamas, la disposición de sus palpos labiales los cuales se asemejan a un hocico; órganos timpánicos en el abdomen; y venación del ala anterior donde Rs2 y Rs3 son coincidentes (Minet, 1991; Solis y Metz, 2016; Acosta-Vásquez et al., 2017). También la presencia de antenas bipectinadas o serratiformes en algunos casos en dirección hacia la parte anterior del cuerpo (Minet, 1981; Minet, 1991).

Generación de secuencias de ADN

Para la extracción de ADN genómico de los especímenes más grandes (> 30 mm) se utilizó una sola pata, la cual se partió en tres segmentos iguales (frente al mechero) con un bisturí previamente esterilizado en un mechero. Para los especímenes más pequeños se usaron de a 2 o 3 patas según el tamaño y se cortaron a la mitad. Se utilizó el kit UltraClean® Tissue & Cells DNA Isolation (MOBIO Laboratories Inc. USA), realizando algunas modificaciones en las especificaciones del fabricante: se agregó 400 uL de TD1 luego de realizarse la maceración del espécimen en una mezcla inicial de 60 uL de TD1 y 20 uL de Proteinasa K; se hizo la elución final de ADN en 60 uL de H 2O libre de nucleasas (Thermo Fisher Scientific, AM9922)

La concentración del ADN genómico extraído fue medida utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) y luego la extracción fue sujeta a dilución para lograr una concentración final de 20uM de cada muestra.

Para la amplificación por PCR del locus de citocromo oxidasa 1 (CO1) del genoma mitocondrial se utilizaron los primers LCO1490 (5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’) y HCO2198 (5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’) (Folmer, 1994; Wahlberg & Wheat, 2008). Todas las reacciones de PCR se realizaron a un volumen total de 60 μl que consistió en los siguientes componentes con concentración final: ADN genómico a una concentración final de 6.67 μM, MgCl2 a 3 mM, dNTPs a 0,4 mM, Taq buffer (Thermo Fisher Scientific) a 1X, primers LCO/HCO a 0,25 μM cada uno, Taq Polymerasa a 1 U y H20 libre de nucleasas para completar el volumen total.

Se corrió el programa de PCR en un termociclador ESCO Swift MiniPro. El programa consistió en un ciclo de 94ºC por 1min, seguido por 35 ciclos de 94ºC por 30 seg, 53.8ºC por 40 seg y 72ºC por 1min, por último, un ciclo final de extensión a 72ºC por 5min. Para verificar los productos de la PCR se utilizaron electroforesis en geles de agarosa al 1.5% con buffer de carga SB 1x y se utilizó EZ-Vision (Thermo Fisher Scientific) para la tinción de los amplicones.

Los productos de PCR se limpiaron utilizando la metodología de precipitación con iso- propanol (N. Flanagan pers. com.) y los fragmentos secuenciados en ambas direcciones utilizando los mismos primers que se usaron para la PCR.

Análisis de la información

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A las secuencias de ADN obtenidas se les evaluó su calidad por medio del programa CodonCode Aligner 9.0.1. (CodonCode Corporation, Dedham, MA, USA) (Elias et al., 2007). Se editaron, cortando los extremos con baja resolución y posteriormente se generó la secuencia consenso para cada muestra, alineando el par de secuencias forward y reverse para cada espécimen. Las secuencias consenso generadas se consultaron en las bases de datos de Barcode of Life Data System (BOLD, http://www.boldsystems.org/ ) y NCBI GenBank database (GenBank, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) para determinar las accesiones con mayor similitud.

Se elaboró un árbol filogenético con el algoritmo Neighbor-joining Tree (N-J) (Saitou y Nei 1987) (Liu et al., 2014), se incluyeron todas las secuencias obtenidas en esta investigación y se agregó una secuencia de Lepidostoma unicolor (Banks, 1911) (Lepidostomatidae) como grupo externo. El árbol fue construido usando MEGA X (Kumar et al., 2018) con el modelo evolutivo Kimura-2-parametric (K2P) (Hebert et al., 2003). Para soportar los datos de las ramas del árbol se realizó un re-muestreo (Bootstrap) de 1000 interacciones, los demás parámetros se dejaron con la configuración predeterminada. Los grupos monofiléticos obtenidos se designaron como MOTUs, utilizando los valores de divergencia genética estandarizados para lepidópteros (Hebert et al., 2003; Hebert et al., 2004).

La delineación de MOTUs a partir de las secuencias de CO1 se basó en las agrupaciones formadas en las ramas más apicales del árbol y en el umbral de divergencia propuesto por Hebert et al., (2003; 2004). De esta forma las secuencias que correspondieron a la misma rama terminal del árbol filogenético se consideraron la misma MOTU cuando los valores de divergencia entre ellas estuvieron por debajo del umbral del 3% (Ng’endo et al., 2013).

Generación del registro BOLD

El registro de los datos se realizó siguiendo los pasos del manual de BOLD Systems (http://www.boldsystems.org/Resources). Las fotografías digitales de cada individuo, junto con los detalles de su colección y los datos moleculares, se encuentran en el sitio web de Barcodes of Life (BoLD) (www.barcodinglife.com) bajo dominio privado hasta la publicación de este documento.

Resultados

Consulta en bases de datos Genbank y BOLD

En las colectas realizadas en mayo y septiembre del 2019 se obtuvieron y secuenciaron 45 especímenes (Tabla 1) (Figura 3). De estos especímenes, 33 tuvieron un porcentaje de identidad (ID) mayor a 97% a una accesión presente en GenBank, BOLD o en ambas bases de datos. Sin embargo, de estas 33, sólo 24 coincidieron con una accesión identificada hasta especie. Entre estas 24 secuencias, cuatro correspondieron a la especie ecclesialis (Guenée, 1854), y dos a la especie Polygrammodes hercules (Felder, 1875). En total se identificaron 20 especies diferentes (Tabla 2). De las nueve muestras restantes con un porcentaje de ID mayor al 97%, cinco se emparejaron con accesiones identificadas hasta género, y cuatro se emparejaron con accesiones identificadas sólo hasta familia. De estas muestras ninguna tuvo replica.

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Tabla 1: Identificación de las muestras colectadas en Guadualito a partir de a los emparejamientos en los bases de datos Bold y GenBank.

ID en Bold (primera linea) % Muestra MOTU y Genbank (segunda Similitu Accesión Subfamilia Familia linea) d BLPCM906- 12 Argyria centrifugens 98.7 Crambinae AA26 08 Crambidae

Argyria centrifugens 98.7 JQ558257 Crambinae MHMXZ1817 Hyalorista exuvialis 99.8 Pyraustinae 38 -09 AA62 Crambidae Lepidoptera 99.7 GU665488 Pyraustinae BOLD:AAB1203 BLPAA11257 Portentomorpha xanthialis 100 Pyraustinae AA63 5 -17 Crambidae Lepidoptera 100 GU665473 Pyraustinae BOLD:AAA0367 CMAZA202- Pyrausta tyralis 98.8 Pyraustinae AA59 10 09 Crambidae Pyrausta tyralis 98.8 HM406319 Pyraustinae BLPAA4399- Asturodes junkoshimurae 99.7 Spilomelinae AA81 17 17 Crambidae Lepidoptera 99.7 GU665494 Spilomelinae BOLD:AAA0406 MHAMA472- Conchylodes ovulalis 99.4 Spilomelinae AA46 06 15 Crambidae Lepidoptera 100 JN284589 Spilomelinae BOLD:AAB3668 BLPCB249- Desmia ploralis 100 Spilomelinae 08 AA75 19 Crambidae Lepidoptera 100 GU654180 Spilomelinae BOLD:AAA0441 MHMXG927- Diaphania hyalinata 100 Spilomelinae AA25 6 07 Crambidae Diaphania hyalinata 100 JQ544347 Spilomelinae TXLEP298- Loxomorpha flavidissimalis 97.2 Spilomelinae 16 AA49 7 Crambidae Spilomelinae 93.4 JN305177 Spilomelinae BOLD:AAC4681 MHMXD981- AA30 Omiodes indicata 99.8 Spilomelinae 4 06 Crambidae

Omiodes indicata 99.8 JQ526348 Spilomelinae BOLD:AAY8 AA17 Diaphania BioLep8244 100 Spilomelinae 25 244 Crambidae

Palpita nigropunctalis 99.7 JX017901 Spilomelinae MHMXH013- Pantographa expansalis 97.8 Spilomelinae AA80 18 07 Crambidae Pantographa expansalis 97.8 JQ544390 Spilomelinae MHMYK9615 Pilocrocis ramentalis 100 Spilomelinae AA38 37 -15 Crambidae Pilocrocis ramentalis 100 JQ533278 Spilomelinae BLPAA2667- Polygrammodes elevata 100 Spilomelinae AA35 22 17 Crambidae Polygrammodes BioLep606 100 JQ577140 Spilomelinae

8

BLPCB810- Polygrammodes hercules 98 Spilomelinae AA50 21 08 Crambidae Polygrammodes hercules 98 JQ550379 Spilomelinae BLPCB810- Polygrammodes hercules 98.3 Spilomelinae AA86 21 08 Crambidae Polygrammodes hercules 98 JQ550379 Spilomelinae BLPAA2559- Samea ecclesialis 99.8 Spilomelinae AA18 8 17 Crambidae Samea ecclesialis 99.8 MK768328 Spilomelinae LPYPB890- Samea ecclesialis 100 Spilomelinae AA34 9 08 Crambidae Spilomelinae spiloBioLep01 100 JQ546571 Spilomelinae LPYPB890- Samea ecclesialis 100 Spilomelinae AA65 9 08 Crambidae Spilomelinae spiloBioLep01 100 JQ546571 Spilomelinae BLPAA2559- Samea ecclesialis 99.8 Spilomelinae AA85 8 17 Crambidae Samea ecclesialis 99.8 MK768328 Spilomelinae BLPAA13484 Syngamia florella 100 Spilomelinae AA40 14 -18 Crambidae Syngamia florella 100 JQ547893 Spilomelinae BLPBC875- Bleptina confusalis 100 Herminiinae AA87 34 07 Erebidae Bleptina confusalis 100 JQ577662 Herminiinae Heterogramma BLPAC697- 99.7 Herminiinae AA60 36 circumflexalis 06 Erebidae noctBioLep01 99.7 JQ579042 Herminiinae BLPDA803- axis 98.7 Bagisarinae AA82 31 09 Noctuidae Amyna axis 98 GU801860 Bagisarinae BLPAA2296- Azochis 97.1 Spilomelinae AA19 17 Crambidae 3 Lepidoptera 96.3 HM409178 Spilomelinae BOLD:AAA0358 cramMalaise01 GMACC016- 98.4 Spilomelinae Crambidae AA43 16 Malaise6043 15

Spilomelinae spiloBioLep01 96.9 JQ602144 Spilomelinae BLPEA779- spiloBioLep01 BioLep264 94.8 Spilomelinae 11 Crambidae AA22 20 Lepidoptera 94.8 JN297264 Spilomelinae BOLD:AAV4127 BLPEA779- spiloBioLep01 BioLep264 94.8 Spilomelinae 11 Crambidae AA28 20 Lepidoptera 94.8 JN297264 Spilomelinae BOLD:AAV4127 BLPEA779- spiloBioLep01 BioLep264 94.8 Spilomelinae 11 Crambidae AA29 20 Lepidoptera 94.8 JN297264 Spilomelinae BOLD:AAV4127 BLPDM1330- scopaBioLep01 BioLep693 98.1 Scopariinae 10 Crambidae AA79 11 Lepidoptera 98.1 HM410161 Scopariinae BOLD:AAH5811 - - - - Crambidae AA89 29 Megastes pusialis 95.5 JQ554236 Spilomelinae

9

BLPDV7620- Oxyelophila 99.4 Acentropinae 18 Crambidae AA74 24 Lepidoptera 95 HM409267 Acentropinae BOLD:AAA0360 MHAMB299- Patania 99.8 Spilomelinae 06 Crambidae AA32 13 Lepidoptera 99.8 GU665345 Spilomelinae BOLD:AAA0563 BLPCJ292- Petrophila 99.4 Acentropinae 08 Crambidae AA58 23 Lepidoptera 100 GU697444 Acentropinae BOLD:AAC3644 BLPAA13772 Depressariin Machimia crucifera 96.7 Depressariida -18 ae AA57 26 e Lepidoptera Depressariin 96.8 GU699352 BOLD:AAA1171 ae IBOLG179- Metalectra 99.8 Boletobiinae Erebidae AA64 33 08

Noctuidae noctBioLep01 99.8 JQ548058 Boletobiinae QUNOD190- Dyspyralis noloides 95.4 Hypenodinae Erebidae AA69 32 10

Dyspyralis 95.3 HQ970464 Hypenodinae BLPDQ432- Hypena 95 Hypeninae 10 Erebidae AA52 35 Lepidoptera 95 HQ555726 Hypeninae BOLD:AAM8721 Chrysaugina chryBioLep01 BioLep554 98.4 BLPDI380-09 e Pyralidae AA51 30 Lepidoptera Chrysaugina 98.4 HM407653 BOLD:AAA0306 e MHMYL167- Epipaschiina epipaBioLep01 BioLep09 99 11 e AA77 28 Pyralidae Lepidoptera Epipaschiina 99 HM402359 BOLD:AAA2910 e

Tabla 2: Resultado de las 20 especies (24 muestras) identificadas en este estudio y su registro en bases de datos (BOLD, SIB, iNaturalist y GBIF). Las muestras en gris hacen referencia a los 10 registros nuevos para Colombia en bases de datos.

Muestra ID en Bold (primera línea) y Genbank (segunda línea) SIB GBIF iNaturalist

AA26 Argyria centrifugens Dyar, 1914 no no no Guenée, 1854 AA62 Hyalorista exuvialis no no no Guenée, 1854 AA63 Portentomorpha xanthialis si si no

AA59 Pyrausta tyralis Guenée, 1854 si si si Solis, 2020 AA81 Asturodes junkoshimurae no no no

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Guenée, 1854 AA46 Conchylodes ovulalis si si si Guenée, 1854 AA75 Desmia ploralis si si si

AA25 Diaphania hyalinata Linnaeus, 1767 no si si Grote, 1878 AA49 Loxomorpha flavidissimalis no no no

AA30 Omiodes indicata Fabricius, 1775 si no no

AA17 Palpita nigropunctalis no no no Bremer, 1864 AA80 Pantographa expansalis Lederer, 1863 no no no AA38 no no no Pilocrocis ramentalis Lederer, 1863

AA35 Fabricius, 1777 si si si Polygrammodes elevata

AA50 si si no Polygrammodes hercules Felder 1875

AA86 si si no Polygrammodes hercules Felder 1875

AA18 si si si Samea ecclesialis Guenée, 1854

AA34 Guenée, 1854 si si si Samea ecclesialis

AA65 Guenée, 1854 si si si Samea ecclesialis

AA85 si si si Samea ecclesialis Guenée, 1854

AA40 si si si Syngamia florella Cramer, 1781

AA87 no no no Bleptina confusalis Guenée, 1854

AA60 Guenée, 1854 no no no Heterogramma circumflexalis

AA82 Amyna axis Guenée, 1852 no no no

Doce especímenes tuvieron emparejamiento con similitud menor a 97% a una accesión disponible en las bases de datos. Para cuatro de estas muestras se pudo identificar el espécimen hasta el nivel de género (AA52, AA57, AA69 y AA89) (Tabla 1). Para tres muestras (AA22, AA28 y AA29), la accesión con mayor similitud arrojó el mismo resultado tanto en GenBank como en BOLD, el cual fue una identificación hasta subfamilia (Tabla 1). Por último, las otras cinco muestras tuvieron los porcentajes de Identidad más bajos y arrojaron resultados inconclusos, emparejándose con porcentajes de similaridad semejantes a múltiples accesiones de diferentes familias (Tabla 3).

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Figura 3: Polillas Crambidae encontradas en la Reserva Natural Guadualito. Están agrupadas de acuerdo su identificación.

Crambidae

Muestra 17 Muestra 18 Muestra 19 Muestra 25 Muestra 26

Muestra 32 Muestra 34 Muestra 35 Muestra 38 Muestra 30

Muestra 40 Muestra 43 Muestra 46 Muestra 49 Muestra 50

Muestra 58 Muestra 59 Muestra 62 Muestra 63 Muestra 65

Muestra 74 Muestra 75 Muestra 79 Muestra 80 Muestra 81

Muestra 85 Muestra 86 Crambidae no identificadas hasta especie

Muestra 89 Muestra 22 Muestra 28 Muestra 29 Muestra 23

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Muestra 45 Muestra 47 Muestra 71 Polillas que no son Crambidae

Muestra 51 Muestra 52 Muestra 57 Muestra 60 Muestra 64

Muestra 69 Muestra 77 Muestra 82 Muestra 84 Muestra 87

De las 45 muestras, 40 tuvieron secuencias de buena calidad en ambas direcciones (Forward y Reverse), mientras que cinco muestras obtuvieron una secuencia de buena calidad en un solo sentido. Las cinco secuencias fueron las de las muestras AA30, AA45, AA47, AA69 y AA89. Si bien, es recomendable contar con las secuencias en ambas direcciones para aumentar la resolución de la secuencia consenso. La calidad de algunas de estas secuencias únicas se verificó analizando los electroferogramas de cada una, lo cual se pudo corroborar con la muestra AA30, que tuvo similaridad de 99.8% a las accesiones correspondiente a la especie Omiodes indicata (Fabricius, 1775) (Tabla 1). Las secuencias de las muestras AA45 y AA47 fueron idénticas a la secuencia consenso de la muestra AA23 (Tabla 3) (Figura 4). Las secuencias de las muestras AA69 y AA89 tuvieron una similaridad menor a 97% a accesiones en GenBank, pero se pudieron identificar hasta el nivel de género.

De las 24 muestras identificadas con nombre especifico, 10 son nuevos registros para Colombia en la base de datos BOLD Systems. De estas, siete son de la familia Crambidae: Argyria centrifugens, Asturodes junkoshimurae, Hyalorista exuvialis, Loxomorpha flavidissimalis, Palpita negropunctalis, Pantographa expansalis y Pilocrocis ramentalis. Dos nuevos registros pertenecen a la familia Erebidae: Bleptina confusalis y Heterogramma circumflexalis y una Amyna axis, a la familia Noctuidae. Estos resultados se determinaron a partir de consultas realizadas en las bases de datos de SIB, iBOL, iNaturalist y GBIF (Tabla 2). Además, se generó el primer registro de diversidad basado en barcoding para la reserva Guadualito con 17 especies de Crambidae identificadas (Tabla 2) (Figura 3).

De las 45 secuencias obtenidas, 37 correspondían a la superfamilia Pyraloidea, con 35 secuencias asociadas a la familia Crambidae y dos secuencias de la familia Pyralidae. Al interior de la familia Crambidae, las muestras correspondieron a cinco subfamilias: Spilomelinae (24 individuos), Pyraustinae (seis individuos), Acentropinae (dos individuos), Crambinae (dos individuos) y Scopariinae (un individuo). Ocho accesiones correspondieron

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a otras familias, Erebidae (5 individuos), Depressariidae (2 individuos), y Noctuidae (1 individuo).

Tabla 3: Accesiones de las muestras inconclusas de bajo porcentaje de similitud.

Análisis de MOTUs

Este estudio tuvo como objetivo evaluar la diversidad de la familia Crambidae usando el Código de barras de la Vida, mas no realizar una filogenia de la familia puesto que el gen COI no es el más indicado para esto. Por ende, suponemos que los valores Bootstrap bajos para las ramas interiores de los árboles filogenéticos (Figura 4) se debe a la alta sustitución del gen COI y a que las muestras fueron de diferentes especies de la familia Crambidae, pero no de la totalidad de las especies de la familia. Sin embargo, los extremos de las ramas de los árboles filogenéticos (Figura 4) dieron valores de re muestreo aceptables (de 100, lo que quiere decir que de los 1000 emparejamientos del árbol en el 100% dieron esa agrupación o clado) para las MOTU que tenían más de una secuencia.

Las muestras AA18, AA34, AA65 y AA85 corresponden según los emparejamientos con las accesiones de BOLD y GenBank a la especie S. ecclesialis. Sin embargo, estas cuatro muestras no fueron agrupadas en la misma MOTU por el análisis NJ de MEGAX (Figura 4), por lo cual se realizó una prueba de Parwise Distance en MEGAX que arrojó que las muestras de la MOTU 8 (AA18 y AA85) tienen una diferencia genética de 11.3% con las muestras de la MOTU 9 (AA34 y AA65).

Colectas repetidas del mismo MOTU

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De las 38 MOTUS, doce se clasificaron como muestras repetidas de la misma especie/MOTU (Figura 4). Las muestras del MOTU 21: AA50 y AA86, ambas correspondieron a P. hercules (Spilomelinae: Crambidae). Las muestras del MOTU 8: AA18, AA85 y las muestras del MOTU 9: AA34 y AA65 correspondieron a la especie S. ecclesialis (Spilomelinae: Crambidae). Las muestras del MOTU 20: AA22, AA28 y AA29, tuvieron como secuencia más cercana un taxa sin identificar de la subfamilia Spilomelinae (Crambidae) (Tabla 1). Por ultimo las muestras del MOTU 1: AA23, AA45 y AA47 resultaron con secuencias idénticas, pero, no pudieron ser identificadas (Tabla 3).

Discusión

Utilidad del código de Barras de la Vida

Destacamos el uso del Barcoding como una herramienta de gran utilidad para caracterizar de forma rápida y precisa la diversidad de especies, al igual que lo mencionan Herbert et al., (2003), (2004); Lukhtanov et al., (2016). Teniendo en cuenta las investigaciones de Floyd et al., (2002); Begerow et al., (2010); Ng´endo et al., (2013). El Barcoding tiene una aplicación útil en grupos taxonómicos que presentan dificultades en su clasificación con base en la taxonomía morfológica. Esta herramienta ha resultado ser particularmente práctica para caracterizar la diversidad biológica en regiones mega biodiversas como son los Andes tropicales como lo menciona Padial y De La Riva, (2007).

El poder de esta aproximación de la identificación molecular se evidencia con el hallazgo de 10 especies que se registran por primera vez en bases de datos web para Colombia en este estudio, limitado a una sola región y consistiendo en 45 muestras, incluyendo 20 especies en total. Generando un registro molecular, físico (voucher) y fotográfico de 20 especies.

Sobre las 10 muestras que se emparejaron a una accesión identificada hasta el nivel de especie y que se encontraban registradas en las bases de datos del país, se documentaron especies reconocidas por ser plagas de cultivos como: Conchylodes ovulalis (Guenée, 1854), la cual se distribuye por los trópicos y se alimenta de especies del género Platanus (Forbes, 1923); Diaphania hyalinata (Linnaeus, 1767) también conocida como gusano del melón, y considerada plaga clave del pepino (Picanço & Marquini, 1999); O. indicata, conocida por ser una plaga grave de la soja (Dung et al., 2011); y P. hercules, especie reportada como plaga de Guamos (Gallego, 1946). Además de especies consideradas plagas, se registraron otras que cumplen funciones de polinización, como S. ecclesialis conocida como una especie polinizadora de pequeñas flores (Atwater 2013), al igual que Syngamia florella (Cramer, 1781) (Kimball, 1965). Las otras cuatro especies carecen de información confiable sobre su ecología.

Entre las otras 10 muestras que se emparejaron a una accesión identificada hasta el nivel de especie, que no habían sido registradas en el país anteriormente, hay también especies consideradas plagas como Asturodes junkoshimurae (Solis, 2020), la cual se distribuye principalmente desde México hasta el norte de América de Sur y se alimenta de árboles y arbustos de la familia Rhamnaceae (Solis et al., 2020b). La especie Loxomorpha flavidissimalis (Grote, 1878), se distribuye principalmente en el Norte y Centro de América, y se conoce por ser plaga de cactus (Lara-Villalón et al., 2016). Palpita nigropunctalis (Bremer, 1864) es una especie registrada principalmente en Asia y Rusia como plaga de plantas de la familia Oleaceae (Gotoh et al., 2011). Pilocrocis ramentalis (Lederer, 1863),

15 se distribuye principalmente en Norte y Centro America, y se alimenta preferiblemente de plantas del género Boehmeria, Odontonema y Pachystachys (Döring 2020). Por otro lado, también se identificó la especie Amyna axis (Guenée, 1852) (la cual junto a Bleptina confusalis y Heterogramma circumflexalis son las únicas especies que no pertenecen a Crambidae), es de la familia Noctuidae y es conocida por depredar insectos polífagos (Ramesh babu et al., 2019). Las otras cinco especies identificadas carecen de información ecológica confiable. Estos registros subrayan la importancia de profundizar más en los estudios de diversidad y ecología de las familias Crambidae y aliadas, para entender mejor sus roles como posibles plagas de cultivos, y además su función ecológica en los ecosistemas andinos.

Limitación en la información disponible en las bases de datos

Cualquier esfuerzo de identificación de especies que emplee códigos de barras de ADN será tan bueno como lo permitan las secuencias de referencia disponibles, según menciono Begerow et al., (2010). A pesar de que el Consorcio para el Código de Barras lleva más de diez años, actualmente hay algunas bases de datos que carecen de información, ya se por falta de investigación, proyectos no culminados o datos no digitalizados. En cualquiera de los casos, esta carencia de información presenta obstáculos para el uso del barcoding en el diagnóstico de las especies Crambidae y familias cercanas. Como ejemplo de esto, las consultas realizadas en BOLD arrojaron14 (31%) muestras de las cuales no se tuvo un nombre de una posible identificación, donde cinco eran muestras con un porcentaje de identidad mayor al 97% que se emparejaron con accesiones que no contaban con una identificación hasta especie. Otras seis (13%) muestras no se emparejaron a ninguna accesión en BOLD (muestra AA23, AA45, AA47, AA71, AA84 y AA89). En el caso de las consultas en Genbank, hubo 23 (51%) muestras que no arrojaron un nombre especifico, de esas 23, 14 (31%) fueron muestras con un porcentaje de identidad mayor al 97%.

Basado en lo anterior, este estudio indica que fueron más eficientes y confiables las indagaciones realizadas en BOLD para arrojar una identificación al nivel de especie. Esto se puede deber a que como menciona Begerow et al., (2010), esta base de datos se especializa en códigos de barras de la vida, CO1. En esta base de datos las accesiones cuentan con información mucho más completa, incluyendo el registro fotográfico del espécimen. Además, todas las accesiones de BOLD están respaldadas por un espécimen depositado en una colección biológica. En contraste, en Genbank se encuentran accesiones que solo proporcionar secuencias y no los electroferogramas subyacentes y la información de calidad de secuencia, lo cual es uno de los estatutos del Consorcio para el código de barras de la vida (2009). Esta diferencia entre estas bases de datos puede deberse al hecho de que todas las accesiones de BOLD requieren accesiones en GenBank mas no viceversa, lo cual hace que BOLD sea un filtro de calidad de las accesiones de GenBank. La escasez de información en ambas bases de datos puede deberse a la falta de información sobre la familia Crambidae y familias cercanas, ó a la falta de digitalización de los proyectos de investigación depositados en los museos (por ejemplo, MUSENUV y Colección de la Universidad del Quindío – CIUQ).

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Figura 4: Árbol filogenético con las secuencias de cada muestra colectada, su asignación de MOTU y la información sobre la familia de cada muestra.

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El número de muestras que no se pudieron identificar hasta el nivel de especie fue de 21(47%), lo que concuerda con lo mencionado por Zhang et al., (2011), donde se menciona que la cobertura de las bases de datos a menudo será incompleta ya que habrá mucha biodiversidad sin código s de barras. De esas 21 muestras, 6 arrojaron accesiones con un porcentaje de identidad mayor al 97% pero solo se pudieron identificar hasta el nivel de género según la identificación en la base de datos. Las 15 muestras restantes, tuvieron porcentajes menores al 97%, es decir la accesión más cercana en la base de datos no correspondía a la misma especie. Estos resultados resaltan los vacíos todavía existentes en las bases de datos para esta familia de lepidópteros, ya que casi la mitad de las muestras no se identificaron usando la técnica de código de barras. Es necesario seguir alimentando las bases de datos con las secuencias de código de barras para los taxa en esta familia. Alternativamente, estos resultados también podrían indicar la presencia de una especie sin describir. Para diferenciar estas dos posibilidades, será necesario estudiar la morfología taxonómica de estas muestras.

Cinco muestras dieron porcentajes bajos de similaridad a las accesiones más cercanas, de menor de 92% e igual entre varias accesiones diferentes. Para una de estas (AA71) todas las accesiones más cercanas pertenecieron a la familia Crambidae. Tres muestras (AA23, AA45 y AA47) pertenecieron al mismo MOTU, y junto a la muestra AA84, tuvieron valores de emparejamiento similares a accesiones de tres y cuatro familias diferentes respectivamente, con bajo porcentaje de identidad impidiendo su identificación como integrante a una u otra de las familias. Lo que cual sugiere que su identidad taxonómica pertenece a una familia todavía no incluida en los bases de datos. Aunque esto también puede deberse a que son registros de nuevas especies sin describir, para lo cual es necesario realizar el estudio taxonómico morfológico para comprobar su identidad.

Accesiones poco confiables

El método del Barcoding depende de que la identidad taxonómica registrada en las bases de datos sea confiable. Al contrario de lo mencionado por Liu et al., (2014). En este estudio se pudieron diferenciar dos especies estrechamente relacionadas. Se obtuvieron los MOTU 8 y 9, entre las cuales se registró una diferencia genética de 11.3% usando una prueba de Parwise Distance en MEGAX. Sin embargo, en ambas bases de datos BOLD y Genbank ambos MOTUs arrojaron la misma identidad de S. ecclesialis. Esto podría ser un caso de especies crípticas y se requiere más estudios de taxonomía basado en caracteres morfológicos para corroborar estos resultados.

Para las muestras AA79, AA43 y AA51, tanto BOLD como Genbank suministraron identificaciones inconclusas que solo permitieron la identificación hasta el nivel de subfamilia. Algo parecido ocurrió con las AA19, AA58 y AA74, para las cuales las accesiones de BOLD y Genbank solo llegaron hasta género. Estos resultados ponen en duda la utilidad y veracidad de las bases de datos cuando se trata de especies no registradas o nuevas, puesto que las bases de datos son parte fundamental del barcoding como lo aceptan otros autores al nombrar las librerías como el corazón de la iniciativa (Meyer y Paulay 2005; Begerow et al., 2010; Zhang et al., 2011).

Para poder que el barcoding sea un método más confiable se deben tener librerías confiables, la plataforma Genbank acepta grandes cantidades de datos, algunos con información poco útil y mal identificada como lo menciona Wiemers y Fiedler, (2007), puesto que da como resultados accesiones inconclusas y poco trabajadas como es el caso de la accesión JN297264 de las muestras AA22, AA28 y AA29, la cual lleva publicada desde el

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2011 y continua sin información completa. Como esta hay muchas más accesiones que deberían no ponerse públicas para no encasillar especies posiblemente nuevas en una MOTU inservible. Estas accesiones no cumplen los requisitos propuestos por el Consorcio para el código de barras de la vida (2009), donde se menciona que las secuencias depositadas deben provenir de especímenes bien identificados que incluyan información completa del comprobante y datos de referencia geográfica

Futuros estudios

Concordamos con varios autores (Puillandre et al., 2011; Taylor y Harris, 2012) en que el trabajo realizado por barcoding para identificar especies debe ser apoyado con trabajo morfológico y arboles filogenéticos, puesto que sin eso el método solo sirve para dar cifras de diversidad e informar sobre MOTU desconocidos que requieren una investigación más profunda.

Se considera necesario pasar claves taxonómicas basadas en rasgos morfológicos a todas las muestras utilizadas en este estudio, tanto para las emparejadas hasta una identificación a nivel de especies como a las que no tuvieron emparejamientos exitosos. Esto debido a que es posible que haya fallos en los emparejamientos hasta nivel de especies, como caso puntal esta la muestra AA17, la cual se emparejo a una accesión identificada como Palpita nigropunctalis, esta especie se distribuye en Asia y Rusia (Gotoh et al., 2011). La ecología de P. nigropunctalis ha sido bien descrita por Gotoh et al., (2011), donde se muestra que es una especie estacional y que hiberna en temporadas frías. Adicionalmente la muestra AA17 se emparejo con un porcentaje de identidad del 100% a BOLD:AAY8244 que es una accesión identificada a varias especies del género Palpita. Por lo cual es muy probable que debido a la distribución geográfica de P. nigropunctalis, la identificación de esta muestra sea otra como Palpita quadristigmalis que si está registrada en Sudamérica o sea un nuevo reporte de distribución de P. nigropunctalis.

Otro caso similar es el de la muestra AA81, emparejada con una accesión identificada como Asturodes junkoshimurae, quien presenta una problemática taxonómica con A. fimbriauralis (Guenée), A. bioalfae (Solis) y A. encisoensis (Solis) como lo muestra el estudio de Solis et al., (2020). Estas especies son morfológicamente muy parecidas y la muestra AA81 se emparejo a accesiones de A. junkoshimurae y A. fimbriauralis. Por lo cual es necesario analizar las claves morfológicas para asegurar los resultados arrojados por las bases de datos.

Se recomienda que este tipo de estudios se deben replicar en diferentes regiones del país, e incluso se debe indagar más en estudios ya realizados. Volviendo a analizar accesiones de estudios previos con taxonomía clásica, análisis moleculares y enfoques filogenéticos como los propuestos por Herbert et al., (2003), la metodología bayesiana utilizada por Elias et al., (2007), la máxima parsimonia de Ekrem et al., (2007) o incluso métodos novedosos basados en inteligencia artificial como los utilizados por Zhang et al., (2008). Puesto que las bases de datos son alimentadas constantemente, el uso de estos enfoques mencionados anteriormente generaría que especies antes no identificadas ya puedan tener claridad y así se pueda reducir el número de MOTUS sin identificar.

Los resultados aquí mostrados de los 10 nuevos registros para el país en estas bases de datos, fueron producto de colectas realizadas en tres noches, en las cuales solo se capturaron 45 muestras, lo cual quiere decir que si se aumenta el esfuerzo de muestreo en

19 lugares menos intervenidos daría resultados de mayor impacto, con posibles novedades para la ciencia y la biodiversidad del país.

Conclusión

En conclusión, el método de barcoding se propone como una aproximación rápida para generar cifras de diversidad, lo cual se confirma con este estudio de envergadura limitada, en el que se identificaron 38 MOTUS diferentes. Además, se valida su gran utilidad en la identificación diagnostica de especies en grupos taxonómicos muy diversos y poco estudiados en localidades específicas.

Estos resultados indican que esta aproximación se debe aplicar más ampliamente en el país, para entender mejor la diversidad, particularmente de grupos poco estudiados como la familia Crambidae. Sin embargo, se evidencia las limitaciones en la información de Código de Barras de la Vida depositada en las bases de datos BOLD y GenBank. Este resultado resalta la necesidad de complementar la aproximación de código de barras de vida con trabajos de taxonomía tradicional, para seguir alimentando y perfeccionando la información disponible en la base de datos BOLD.

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