DISS 2020 Thaís Pereira Feitosa Coelho.Pdf

Universidade Federal de Mato Grosso Instituto de Biociências

Programa de Pós-graduação em Zoologia

Múltiplas espécies e ampla polifilia no complexo Chionomesa fimbriata/lactea (Aves: Trochilidae) reveladas por análises vocais e moleculares

Thaís Pereira Feitosa Coelho

Cuiabá, MT

2020 ii

Thaís Pereira Feitosa Coelho

Múltiplas espécies e ampla polifilia no complexo Chionomesa fimbriata/lactea (Aves: Trochilidae) reveladas por análises vocais e moleculares

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Zoologia da Universidade Federal de Mato Grosso como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Zoologia.

Orientador: Prof. Dr. Vítor de Queiroz Piacentini

Coorientador: Prof. Dr. Paulo César Venere

Cuiabá, MT

2020 iii

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Dedico esta dissertação aos meus pais, Sueli e Alderi (in memoriam), e irmãs, Thainara e Girlene, pelo apoio, incentivo, amor incondicional e por sempre acreditarem em mim. vi

“A ignorância gera mais frequentemente confiança do que o conhecimento: são os que sabem pouco, e não aqueles que sabem muito, que afirmam de forma tão categórica que este ou aquele problema nunca será resolvido pela Ciência. ”

Charles Darwin vii

AGRADECIMENTOS

Agradecer nem sempre é uma tarefa fácil, são tantas pessoas que cruzam nosso caminho ao longo desse tempo que por vezes corremos o risco de ser injustos e deixar de citá-las por mero esquecimento, mas tentarei ser breve e justa!

Obrigada, Senhor Deus, por estar sempre ao meu lado, nos momentos de alegria, tristeza e, principalmente, nos momentos difíceis, me dando força, coragem e alimentando minha fé quando pensei que não iria conseguir.

Ao PPGZOO, pela oportunidade de ter uma excelente formação.

À CAPES, pela concessão da bolsa.

Ao querido orientador Vítor Piacentini, por ter me dado a oportunidade de desenvolver esse projeto tão lindo e cheio de desafios e, mais ainda, por acreditar em minha capacidade. Obrigada pela paciência (que é indiscutível), inúmeras conversas, conselhos, discussões construtivas e por estar sempre disponível!

Aos coorientadores, Paulo César Venere e Daniela Cristina Ferreira (Dani), pelo acolhimento no Laboratório de Genética Animal, pelas inúmeras orientações com o bê-á-bá da Biologia Molecular, discussões de análises estatísticas e por todos os ensinamentos não só acadêmico/científico, mas também de vida!

Ao João Batista de Pinho (Joãozito), pela amizade, conselhos e por abrir as portas do seu laboratório e me conceder um cantinho onde eu pudesse me dedicar à dissertação.

Agradeço aos curadores e técnicos de museus e coleções que gentilmente nos cederam as amostras de tecidos dos meus amados Chionomesa, no qual foram essenciais para o desenvolvimento desta pesquisa: Luís Fábio Silveira (MZUSP), Alexandre Aleixo (MPEG), Camila Ribas (INPA), Caio Graco (UEFS), Luciano Naka (UFPE), Leonardo Lopes (UFV), Ana Galvão, Luíz Gonzaga e Charles Ozanick (UFRJ). Ao Dr. Richard Prum e Kristof Zyskowski (Yale Peabody Museum), Dr. Paul Sweet e Thomas Trombone (American Museum of Natural History) e ao Dr. Ben Marks (Field Museum Natural History), pela gentileza e agilidade que se dispuseram em colaborar com este projeto, enviando amostras de C. fimbriata fimbriata e C. lactea zimmeri (único espécime com amostra de tecido disponível no mundo), essenciais para o preenchimento de lacunas amostrais nesta pesquisa, à Academy of Natural Sciences of Drexel University, Philadelphia, para que fossem sequenciados. Ao Dr. Jason D. viii

Weckstein, Janice Dispoto e Dr. Nate Rice (Academy of Natural Sciences of Drexel University, Philadelphia), pela disponibilidade, gentileza e agilidade em receber as amostras de tecidos dos museus americanos, extrair o DNA, amplificar e sequenciar esse material tão importante para esta pesquisa. Meu muito obrigada!

Ao Augusto Batisteli, por guardar um espécime de C. l. lactea na UNESP de Rio Claro e nos comunicar sobre isso através de uma publicação no Facebook. E à Ana Cristina Crestani (UNESP – Rio Claro), que gentilmente entrou em contato conosco e se dispôs a preparar e enviar o material à UFMT, após visualizar uma marcação e publicação no Facebook, na qual falávamos sobre a necessidade que tínhamos de amostras de C. lactea do estado de São Paulo (e pedíamos aos pesquisadores que tivessem e pudessem nos ceder amostras).

Ao Rafael Bessa, por rapidamente nos comunicar sobre uma importante amostra de C. f. tephrocephala que ele acabara de obter e gentilmente entregaria à UFRJ para que fosse enviado para nós, e assim preencheria nossa lacuna amostral.

À Dra. Sandra Mariotto, que gentilmente abriu as portas do seu laboratório, no IFMT – campus Bela Vista, no momento quase de desespero (as últimas PCRs já não funcionavam mais e eu não sabia mais o que fazer). Seu auxílio foi, sem dúvidas, primordial!

À Dra. Marielle Schneider, pelas inúmeras ajudas no Laboratório de Genética, especialmente com as PCRs do gene nuclear.

Ao Wagner Nogueira, pelo envio das fotos de peles de Chionomesa lactea depositadas no American Museum Natural History. À Nanny Simões e Priscila Diniz, pelo envio de fotos dos vouchers depositados no MPEG e INPA, respectivamente. Ao Andrés Cuervo, pelo envio de fotos de peles taxidermizadas de Chionomesa fimbriata, depositadas na Universidad Nacional de Colômbia.

Ao Dr. Fábio Amaral e Dra. Camila Ribas, por tirarem inúmeras dúvidas quando as PCRs do Beta-fibrinogênio insistiam em não amplificar (desespero total!).

Ao Gustavo Bravo, por ajudar com as taxas de evolução do gene mitocondrial no momento de calcular o tempo de divergência dos Chionomesa.

À Juliane Saldanha, pela paciência, conselhos, por estar sempre disposta a me ajudar com as análises estatísticas, correções no manuscrito e tantas outras ajudas que jamais esquecerei! ix

À minha família, meu maior e melhor alicerce, minha luz: mãe, Sueli e amadas irmãs, Narinha e Girlene.

Ao Giuliano, pela compreensão ao longo desses dois anos fora de casa, pelas inúmeras conversas e por acreditar que tudo daria certo.

À Mayane, essa amiga/irmã que o universo me presenteou ainda na graduação e que embarcou comigo para Cuiabá na busca de mais esse sonho de cursar pós-graduação. Obrigada pela amizade, companheirismo, irmandade e pelo ombro amigo nos momentos de tristeza e choro. Muito obrigada por tudo!

À família que construí em Cuiabá, Lívia Ferreira, Luan Gabriel, Antônio Moraes, Ravena Mendonça e Juliane Saldanha, pela amizade, inúmeros momentos de descontração, conversas, críticas construtivas e por amenizarem a saudade de ficar longe de casa.

Aos conterrâneos, Luanna e Vanderlei, pelo acolhimento e logística para o estabelecimento de moradia em Cuiabá.

Às meninas do LabGen (Gisele, Pábila e Jéssica Mudrek), por pararem de fazer suas inúmeras tarefas do doutorado e me ensinarem a fazer desde a extração de DNA até o envio das amostras para sequenciamento. Meu muito obrigada!

Aos amigos do Laboratório de Ecologia de Aves, Kamila, Elaine, Jéssica (Pretinha), Mayara, Tiago, Tainá, Thaynara, Moisés, pelos bons momentos, risadas e por tornarem os dias mais leves longe de casa.

À minha dupla favorita, Nathália e Victória, pela amizade, risos e inúmeros bons momentos ao longo desses dois anos em Cuiabá.

E, por último e não menos importante, aos amigos de longa data, lá do Piauí, que sempre torceram e torcem por mim. Eu amo muito todos vocês!

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Exemplo de sonograma de um canto territorial de Chionomesa lactea bartletti (XC146791, Bolívia, Riberalta) ilustrando as variáveis de tempo (vermelho) e frequência (azul) medidas em cada frase: FMA, frequência máxima; FMI, frequência mínima; IS, intervalo entre sílabas; DS, duração da sílaba. O número de sílabas numa frase e o número de frases em um canto completo variam entre emissões de um mesmo indivíduo e não foram aqui consideradas.

Figura 2. Área de ocorrência das onze subespécies do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea (modificada a partir de Piacentini e Ribenboim [2017]). A distribuição das localidades amostradas neste estudo está representada pelos símbolos quadrados, cujas cores refletem a identidade taxonômica das amostras de acordo com a cor dos respectivos polígonos. Os pontos de interrogação são áreas em que não se tem certeza sobre presença ou identidade taxonômica das populações.

Figura 3. Sonogramas de cantos representativos de diferentes táxons de Chionomesa ilustrando a variação dos cantos territoriais (A-G) e agonísticos (H-J) dentro do complexo. Os cantos territoriais representam: (A) Chionomesa fimbriata tephrocephala [WA 2407856, Brasil, Paraná]; (B) C. lactea bartletti [XC146791, Bolívia, Riberalta]; (C) C. f. fluviatilis [XC 364161, Equador, Zamora-Chinchipe]; (D) C. f. fimbriata [XC 44012, Guiana Francesa]; (E) C. f. alia [WA 2305409, Brasil, Pará]; (F) C. f. nigricauda [VQP-D14-191, Brasil, Ceará]; e (G) C. l. lactea [WA 21493, Brasil, São Paulo]. Os cantos agonísticos representam: (H) C. f. fluviatilis [XC 106244, Colômbia, Guaviare]; (I) C. f. nigricauda [WA 947591, Brasil, Alagoas]; e (J) C. l. lactea [WA 986992, Brasil, Minas Gerais]. Dados completos das gravações estão no Apêndice 1. O número de repetições de cada sílaba nos cantos territoriais é variável, podendo se estender por minutos.

Figura 4. Distribuição dos escores fatoriais dos dois primeiros componentes principais obtidos dos cantos territoriais dos táxons do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea. As elipses indicam o intervalo de confiança de 95%. As setas indicam os vetores de variação de cada variável: duração da sílaba (DS), intervalo entre as sílabas (IS), frequência máxima (FMA) e frequência mínima (FMI).

Figura 5. Distribuição dos escores fatoriais nas duas primeiras funções discriminantes do canto territorial dos táxons do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea. As elipses representam o intervalo de confiança de 95%. xi

Figura 6. Hipótese filogenética por Inferência Bayesiana e Máxima Verossimilhança do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea baseado em dados do gene mitocondrial ND2. Os valores de suporte dos nós estão localizados na parte anterior dos ramos e correspondem a probabilidade posterior e, após a barra, suporte bootstrap. Valores de suporte abaixo de 50% foram sumarizados na árvore de MV.

Figura 7. Hipótese filogenética por Inferência Bayesiana e Máxima Verossimilhança do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea, baseado em dados concatenados (ND2 e B-Fib7). Os valores de suporte dos nós estão localizados na parte anterior dos ramos e correspondem a probabilidade posterior e, após a barra, suporte bootstrap. Valores de suporte abaixo de 50% foram sumarizados na árvore de MV.

Figura 8. Rede de haplótipos construída pelo método Median-Joining para o complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea obtida a partir do marcador mitocondrial ND2. As cores indicam o táxon e o tamanho dos círculos corresponde ao número de indivíduos representados pelo haplótipo. Cada traço representa um passo mutacional.

Figura 9. Rede de haplótipos construída pelo método Median-Joining, para o complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea, obtida a partir do marcador nuclear βFib7. As cores indicam o táxon e o tamanho dos círculos corresponde ao número de indivíduos representados pelo haplótipo. Cada traço representa um passo mutacional.

Figura 10. Estimativa filogenética calibrada no tempo, com taxa de evolução do gene corrigida de 2,32% (0,01164 substituição/local/milhão de anos), calculada usando BEAST v. 1.8.0, com os dados de mtDNA ND2, utilizando como outgroup Chlorestes cyanus, Leucochloris albicollis, Hylocharis sapphirina, H. crysura, Elliotomyia chionogaster e E. viridicauda. As barras nos nós refletem intervalos de confiança de 95% das estimativas de idade.

Figura 11. Estimativa filogenética calibrada no tempo, com taxa de evolução do gene corrigida de 1,63% (0,00816) substituição/local/milhão de anos, calculada usando BEAST v. 1.8.0, com os dados de mtDNA ND2, utilizando como outgroup Chlorestes cyanus, Leucochloris albicollis, Hylocharis sapphirina, H. crysura, Elliotomyia chionogaster e E. viridicauda. As barras nos nós refletem intervalos de confiança de 95% das estimativas de idade xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Primers utilizados para amplificação dos fragmentos de DNA por meio da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), os quais foram, posteriormente, sequenciados pelo método de Sanger.

Tabela 2. Divergências genéticas entre populações do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea incluídas neste estudo, inferidas através do cálculo p-distance com 1000 réplicas de bootstrap. Os valores acima da diagonal representam o desvio-padrão. Em negrito, o menor e o maior valor de divergência genética. As abreviações “W” faz referência às C. f. nigricauda do Clado Oeste, “E” ao Clado Leste, “RR-CAI” às C. f. fimbriata de Caracaraí, Roraima, “RR- JUF” rio Jufari, Roraima, “SUR” Suriname e “AP” Amapá.

Tabela 3. Apêndice 1. Gravações das vocalizações do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea utilizadas para realizar a Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Função Discriminante (DFA). Além das gravações dos cantos agonísticos de C. f. nigricauda, C. f. fluviatilis e C. l. lactea.

Tabela 4. Apêndice 2. Procedência das amostras do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea utilizadas neste trabalho para as análises moleculares. As seguintes instituições estão indicadas pelas abreviações: AMNH – American Museum of Natural History; FMNH – Field Museum Natural History; INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; LSUMZ – Louisiana State University Museum of Natural Science; LZUFPI – Laboratório de Zoologia da Universidade Federal do Piauí; MPEG – Museu Paraense Emílio Goeldi; MZUSP – Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo; UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso; UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro; YPM – Yale Peabody Museum.

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RESUMO O gênero Chionomesa foi readotado recentemente para agrupar as espécies-irmãs C. fimbriata e C. lactea, antes reconhecidas como um complexo de espécies em Amazilia. Ambas são politípicas e ocorrem em boa parte da América do Sul; C. fimbriata tem atualmente sete subespécies reconhecidas, as quais se substituem ao longo dos diferentes hábitats tropicais; já C. lactea apresenta três subespécies com distribuições disjuntas entre si. Diante das incertezas acerca do relacionamento dos táxons subespecíficos e mesmo a validade de alguns deles como espécies, combinamos análises de caracteres vocais e moleculares para o complexo C. fimbriata e C. lactea, a fim de avaliar se os padrões de divergência e semelhança genéticas estão associados aos padrões vocais, estabelecer as relações de todas as subespécies reconhecidas, testar a validade de táxons questionáveis e verificar se as duas espécies são reciprocamente monofiléticas. Para isso, foram realizadas comparações do padrão vocal e análises multivariadas (PCA e DFA) para os caracteres vocais, análises filogenéticas (Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana), populacional (rede haplotípica) e tempo de divergência, com base no marcador mitocondrial NADH desidrogenase subunidade 2 (ND2) e no nuclear íntron 7 do Beta Fibrinogênio (βFib7). Parte dos táxons apresenta padrões vocais exclusivos e diagnosticáveis dos demais, mas tanto a PCA quanto a DFA mostraram sobreposição de alguns deles, inclusive táxons pertencentes a espécies diferentes, com exceção de C. f. tephrocephala, o qual segregou-se de todos os demais. Com os dados moleculares foi possível confirmar o monofiletismo do gênero Chionomesa, corroborando a taxonomia mais recente proposta. Entretanto, as relações internas das subespécies mostraram que tanto C. fimbriata quanto C. lactea são polifiléticas, inclusive a forma nominal de C. fimbriata, que foi recuperada em quatro linhagens distintas. Dois clados principais foram recuperados com alto suporte de bootstrap (98,9%) e probabilidade posterior (1): um formado por amostras do oeste da Amazônia, e o outro formado por espécimes do centro-sul e leste da Amazônia, além do Cerrado e leste do Brasil. As divergências genéticas entre as linhagens variaram de 0,2% a 5,2%. Além disso, na análise populacional, houve compartilhamento de haplótipos entre táxons subordinados a espécies distintas. As análises vocais combinadas com a filogenia molecular realizada para o complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea contribui para um melhor conhecimento da real diversidade de espécies dentro do gênero Chionomesa, bem como as relações filogenéticas entre os táxons, sugerindo múltiplas espécies para este complexo.

Palavras-chave: sistemática, taxonomia, ND2, βFib7, bioacústica, diversidade críptica, beija- flores. xiv

ABSTRACT The genus Chionomesa was recently ressurrected to group the sister species C. fimbriata and C. lactea, previously recognized as a species complex in Amazilia. Both are politypical and range in much of South America; C. fimbriata currently has seven recognized subspecies, which replace each other throughout the different tropical habitats; C. lactea has three subspecies with disjunct distributions. In view of the uncertainties about the relationship of subspecific taxa and even the validity of some of them as species, here we combined analyzes of vocal and molecular characters for the C. fimbriata and C. lactea complex, in order to assess whether the patterns of genetic divergence and similarity are associated with vocal patterns, establish the relationships of all recognized subspecies, test the validity of questionable taxa and verify if the two species are reciprocally monophyletic. For this, we compared the vocal patterns and ran multivariate analyzes (PCA and DFA) for the vocal characters, and undertook molecular analyzes on phylogeny (Maximum Likelihood and Bayesian Inference), population structure (haplotypic network) and divergence time, based on the mitochondrial marker NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) and the nuclear intron 7 of Beta Fibrinogen (βFib7). Part of the taxa had exclusive and diagnosable vocal patterns, but both the PCA and DFA showed overlap between some of them, including taxa belonging to different species, with the exception of C. f. tephrocephala, which segregated from all the others. The molecular data confirmed the monophyly of the genus Chionomesa, corroborating the most recent taxonomy proposed. However, the internal relationships of the subspecies showed that both C. fimbriata and C. lactea are polyphyletic, including the nominate subspecies of C. fimbriata, which was recovered as four distinct lineages. Two main clades were recovered with high bootstrap support (98.9%) and posterior probability (1): one formed by samples from western Amazonia, and the other formed by specimens from the south-central and eastern Amazonia, in addition to those from the Cerrado and eastern Brazil. The genetic divergences between the lineages ranged from 0.2% to 5.2%. In addition, haplotypes were shared between taxa subordinate to different species. The vocal analysis combined with the molecular phylogeny performed for the Chionomesa fimbriata and C. lactea complex contributes to a better understanding of the real diversity within Chionomesa, as well as the phylogenetic relationships between taxa, suggesting multiple species for this complex.

Key Words: sistematics, taxonomy, ND2, βFib7, bioacustic, cryptic diversity, hummingbirds.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... x LISTA DE TABELAS ...... xii RESUMO ...... xiii ABSTRACT ...... xiv INTRODUÇÃO ...... 16 MATERIAL E MÉTODOS ...... 19 Amostragem vocal ...... 19 Amostragem molecular ...... 20 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA ...... 21 Análises filogenéticas e de diversidade ...... 23 Tempo de divergência ...... 24 Análise de estrutura populacional ...... 24 RESULTADOS ...... 25 Análises vocais ...... 25 Análises filogenéticas e de diversidade ...... 28 Estrutura populacional ...... 32 Tempo de divergência ...... 34 DISCUSSÃO ...... 37 Implicações taxonômicas ...... 38 CONCLUSÕES ...... 40 REFERÊNCIAS ...... 41 APÊNDICES...... 45

INTRODUÇÃO Dentro da classificação zoológica, as aves conhecidas popularmente como beija-flores estão agrupadas em uma única família, Trochilidae, e seus parentes mais próximos são os andorinhões (Apodidae). Possuem uma diversidade estimada em pouco mais de 340 espécies descritas (Clements et al. 2017) e, tradicionalmente eram reconhecidos em duas subfamílias: Phaethornithinae, que incluía os beija-flores ermitões (balança-rabos, rabos-brancos e afins), e Trochilinae, com todos os demais beija-flores (Bleiweiss et al. 1997). Estudos da diversificação dos Trochilidae revelam que eles invadiram a América do Sul há ≅ 22 Mya, mais tarde diversificando em nove principais clados: topázios, ermitões, mangos, coquetes, brilhantes, patagona, gemas-de-montanha, esmeraldas e abelhas (McGuire et al. 2007, McGuire et al. 2009). Destes clados, cinco foram reconhecidos como subfamílias e quatro como tribos, com a subfamília Trochilinae possuindo a maior riqueza em número de espécies (Piacentini e Ribenboim 2017). Na filogenia atual proposta por McGuire et al. (2014), com base em dados de sequência de DNA para 275 espécies de beija-flores, as relações da família Trochilidae foram bastante esclarecedoras, porém o relacionamento das espécies revelou bastante conflito. Para a subfamília Trochilinae, a tribo Trochilini, cujas espécies são também chamadas de “esmeraldas”, com pouco mais de 100 espécies reconhecidas, mostrou ter a maior incongruência entre a classificação tradicional e a filogenia mais recente, revelando polifilia generalizada em muitos gêneros (Stiles et al. 2017a, b). O gênero Amazilia Lesson, 1843, por exemplo, agrupava anteriormente 31 espécies, oito delas (A. brevirostris, A. chionogaster, A. fimbriata, A. lactea, A. leucogaster, A. rondoniae, A. versicolor e A. viridigaster) ocorrendo no território brasileiro (Piacentini et al. 2015). Contudo, as espécies tradicionalmente reconhecidas em Amazilia foram recuperadas como um grupo polifilético nas análises filogenéticas e, com isso, foram reorganizadas em 10 gêneros (Stiles et al. 2017b). O redefinido gênero Amazilia, que tem como espécie-tipo Amazilia rutila, ficou atualmente restrito a três espécies: A. rutila, A. yucatenensis e A. tzacatl, com distribuição em parte da América do Norte, Central e do Sul (Stiles et al. 2017b). Dentre os “novos” gêneros reconhecidos está Chionomesa Simon, 1921, o qual passou a incluir as espécies-irmãs Chionomesa fimbriata e C. lactea (Stiles et al. 2017b). Chionomesa lactea (Lesson, 1832), conhecido popularmente por beija-flor-de-peito-azul, é caracterizado por apresentar garganta azul-violeta e uma faixa branca que desce pelo peito até o 17

abdome, com as costas e a nuca verdes brilhantes, as asas douradas a verde-bronze e toda a cauda em azul escuro. Possui comprimento que varia de 8 a 11 cm e massa corpórea entre 4 a 5 gramas (Weller et al. 2018a), possui maxila enegrecida, mandíbula rosada com a ponta escura. A fêmea difere ligeiramente na cor da plumagem da garganta, que se apresenta mais acinzentada. Esta espécie apresenta três subespécies com populações distribuídas de forma disjunta: a forma nominal, C. l. lactea, ocorre do interior da Bahia até o sudeste do Brasil e marginalmente no nordeste da Argentina (Chebez et al. 2004, Güller e Elias 2013), enquanto C. l. bartletti (Gould, 1866) ocorre no oeste da Amazônia (Piacentini e Ribenboim 2017, Weller et al. 2018a). Já a terceira subespécie, C. l. zimmeri (Gilliard, 1941), possui distribuição restrita aos Tepuis venezuelanos. Por ocorrerem em duas populações com distribuições isoladas e apresentarem diferenças tanto na plumagem quanto na vocalização, alguns autores já vêm tratando C. l. lactea e C. l. bartletti como espécies distintas (e.g., del Hoyo et al. 2014, 2018, Weller et al. 2018a). Por sua vez, Chionomesa fimbriata (Gmelin, 1788), conhecido popularmente como beija-flor- de-garganta-verde, tem o verde-claro como sua cor dominante, com desenho afunilado branco do abdome até o peito, as asas escuras e cauda arredondada. Possui comprimento que varia de 8 a 12 cm e massa corpórea de 3,5 a 6,2 g. Possui bico longo e reto, com a maxila preta e a mandíbula de cor rosada com a ponta escura (Piacentini e Ribenboim 2017, Weller et al. 2018b). Não havendo dimorfismo sexual. Tem ocorrência em todo o Brasil, sendo reconhecidas atualmente sete subespécies: C. f. fimbriata, do nordeste da Venezuela, Escudo Guianense e norte na Amazônia; C. f. tephrocephala (Vieillot, 1818), da costa sudeste e sul do Brasil, desde o Espírito Santo até o Rio Grande do Sul; C. f. apicalis (Gould, 1861), da Colômbia ao leste dos Andes; C. f. fluviatilis (Gould, 1861), do sudeste da Colômbia e leste do Equador; C. f. nigricauda (Elliot, 1878), do leste da Bolívia e norte, nordeste e centro-oeste do Brasil, ao sul do Rio Amazonas; C. f. laeta (Hartert, 1900), nordeste do Peru e oeste do Brasil no Rio Solimões e, C. f. elegantíssima (Todd, 1942), do extremo nordeste da Colômbia e norte e nordeste da Venezuela. Além destas sete subespécies, Grantsau (2010) ainda reconhece como válida a subespécie C. f. alia (Zimmer, 1950), descrita do baixo Amazonas e posteriormente sinonimizada por Weller et al. (2018b) à forma nominal. Por outro lado, a validade de C. f. laeta vem sendo questionada desde Zimmer (1950), dada a fragilidade de seus alegados caracteres diagnósticos (e.g., apenas a média no tamanho do bico em C. f. fluviatilis ser maior em relação à C. f. laeta, mas que em alguns pontos de distribuição ocorre sobreposição). Além das diferenças de plumagem, muitas das subespécies 18

parecem estar associadas com diferentes tipos de hábitat, provavelmente envolvendo duas, talvez até quatro espécies válidas (Piacentini e Ribenboim 2017). A diagnose de plumagem bem marcada em C. f. nigricauda e C. f. tephrocephala (e.g., branco puro nas penas do crisso; Weller e Schuchmann 1997, Grantsau 1988, 2010) levou ao recente tratamento destas duas formas como espécies independentes por Grantsau (2010). Adicionalmente, informações inéditas de vocalização sugerem que algumas subespécies alocadas em C. fimbriata podem ser mais proximamente relacionadas à C. lactea do que com as demais subespécies (V. Q. Piacentini, com. pess.). Em aves, o fenótipo vocal pode ser o único caráter que permite a diferenciação em muitos táxons (Marler 1957), podendo melhor refletir padrões de divergência genética do que outros caracteres fenotípicos (e. g., coloração da plumagem; Rheindt et al. 2008, Greig e Webster 2013). Adicionalmente, os sinais vocais atuam como prováveis mecanismos de isolamento (Edwards et al. 2005) devido ao seu papel central na escolha dos parceiros e no reconhecimento específico (Catchpole e Slater 2008). Os beija-flores, assim como os pássaros canoros e psitacídeos, desenvolveram, ao longo da evolução, traços de aprendizado no repertório vocal (Jarvis et al. 2000). Somado a isso, sabe-se que as espécies que apresentam canto aprendido têm taxas de evolução vocal mais rápida quando que comparadas às que apresentam canto inato (Mason et al. 2016). Estudos filogenéticos de espécies politípicas são de fundamental importância, pois têm sido capazes de reconhecer novas espécies ao contribuir para diagnosticar unidades evolutivas independentes dentro de espécies já descritas, porém apresentadas de modo equivocado como representantes de uma única unidade evolutiva (Aleixo 2007). Nesse contexto, dada as incertezas acerca do relacionamento dos táxons subespecíficos e do status taxonômico de alguns deles já reconhecidos como espécies válidas por recentes autores, faz-se necessário um estudo da validade e das relações filogenéticas das subespécies dentro do gênero Chionomesa. Assim sendo, o uso de dados moleculares combinados com dados sobre características fenotípicas, como a vocalização, pode ser de fundamental importância na designação de táxons em nível de espécie. De maneira ideal, para avaliar o status taxonômico das populações candidatas a espécie, a evidência genética deve ser apoiada por evidências complementares de caracteres independentes (Tobias et al. 2010, Cotterill et al. 2014). Aqui, nossa proposta foi utilizar uma combinação de caracteres vocais e moleculares dentro do complexo C. fimbriata/lactea, a fim de: (1) determinar possíveis diagnoses vocais para táxons/populações do gênero; (2) avaliar se os padrões de divergência e semelhança genética estão 19

associados aos padrões vocais; (3) estabelecer as relações de todas as subespécies do complexo; (4) testar o monofiletismo das duas espécies hoje reconhecidas pela maioria dos autores; e (5) identificar linhagens intraespecíficas divergentes que possam representar espécies em potencial.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem vocal

Os beija-flores do complexo Chionomesa emitem três tipos principais de voz: um chamado indiferenciável entre os táxons; um canto territorial (mais comumente emitido ao amanhecer); e um canto agonístico, usado em interações agressivas entre indivíduos (V.Q. Piacentini, obs. pess.). Para as análises dos caracteres vocais, selecionamos gravações do canto territorial de 28 indivíduos, compiladas a partir dos bancos de dados online Xeno-canto (www.xeno-canto.org) e WikiAves (www.wikiaves.com.br), além de gravações próprias não arquivadas (Apêndice 1). Destas, 18 gravações eram de Chionomesa fimbriata atribuídas a cinco subespécies (C. f. fimbriata, C. f. tephrocephala, C. f. fluviatilis, C. f. nigricauda e C. f. alia) e 10 de C. lactea, de duas subespécies (nominal e C. l. bartletti). A partir disto, analisamos cada um dos sonogramas e tipo de vocalização das gravações utilizando o software Raven Pro 1.5 (Cornell Lab of Ornithology, Ithaca, NY, USA) para gerar sonogramas e oscilogramas, a partir dos quais extraímos medidas das seguintes variáveis (ver Fig. 1): (1) duração da sílaba (DS, em s), (2) intervalo entre as sílabas (IS, em s), (3 e 4) frequências mínima e máxima (FMI, FMA, em kHz). Ao final destas medidas, calculamos uma média para cada indivíduo/gravação para ser usada posteriormente nas análises estatísticas. Além disso, caracterizamos o canto territorial de cada população/táxon quanto à sua sintaxe (i.e. número de notas em cada sílaba, repetições, etc.). A fim de quantificar a diferenciação acústica entre as subespécies, realizamos análises multivariadas, incluindo a Análise de Componentes Principais (PCA), em que buscamos identificar o quanto as medidas individuais contribuem para a variação geral das variáveis dos cantos, e Análise de Função Discriminante (DFA), a fim de determinar se a voz permite diferenciar cada táxon do complexo. Para realização desta última análise, identificamos os indivíduos a priori de acordo com sua distribuição e taxonomia atual, C. fimbriata fimbriata, C. f. nigricauda, C. f. alia, C. f. tephrocephala e C. f. fluviatilis; C. l. lactea e C. l. bartletti. Com os escores obtidos foi montado um gráfico para melhor visualização do padrão de discriminação dentro do 20

complexo Chionomesa. Todas as análises estatísticas foram realizadas no ambiente R Studio, com os pacotes ggbiplot (Vu 2011) e MASS (Venables e Ripley 2002), respectivamente.

Adicionalmente, observações feitas por V. Q. Piacentini em diversas idas a campo, encontrou similaridade no canto agonístico entre C. f. nigricauda e C. l. lactea, porém não havia realizado comparações até então. Deste modo, obtivemos gravações de 13 cantos agonístico para três subespécies, sendo duas de C. fimb. fluviatilis, cinco de C. f. nigricauda, e seis de C. l. lactea. Em função do baixo número amostral e qualidade de algumas gravações, os cantos agonísticos foram comparados apenas quanto ao seu padrão geral, sem análises estatísticas.

Amostragem molecular

Foram amostrados 35 indivíduos do gênero Chionomesa; C. fimbriata sspp. (n=30) e C. lactea sspp. (n=5), a partir de tecidos musculares obtidos de diversas coleções científicas (Fig. 2; Apêndice 2). Estas amostras representam todas as subespécies tradicionalmente reconhecidas para o complexo C. fimbriata/lactea, com exceção de C. f. apicalis e C. f. elegantissima, as quais não conseguimos amostras de tecido. Foram sequenciados um gene mitocondrial (NADH desidrogenase subunidade 2 [ND2]) e um gene nuclear (íntron 7 do β-fibrinogênio [βFib7]). Sequências adicionais de C. fimbriata fluviatilis (n=1) e C. lactea bartletti (n=1), para os mesmos genes, foram obtidas do GenBank 21

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A procedência das amostras utilizadas neste estudo foi fornecida pelas coleções e museus de origem e, a determinação taxonômica das amostras foi revisada de acordo com a distribuição geográfica e caracteres morfológicos de plumagem (conferidos por fotos dos vouchers). Para compor o grupo externo, utilizamos sequências disponíveis no GenBank para Chlorostilbon lucidus (GenBank EU042539.1), Elliotomyia chionogaster (AY830462.1), Elliotomyia viridicauda (GU167206.1), dentre outras oriundas da filogenia proposta por McGuire et al. (2014) e proximamente relacionadas à C. fimbriata e C. lactea.

Extração, amplificação e sequenciamento de DNA

O DNA total foi obtido utilizando o protocolo de extração salina, com modificações, descrito por Aljanabi e Martinez (1997) para as amostras de tecido conservadas em álcool absoluto. Após a 22

realização deste processo, a visualização do DNA total foi feita pela técnica de eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com gel red a fim de verificar a integridade do DNA. As sequências dos genes selecionados foram amplificadas pela técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR), utilizando-se os primers L5219 e H5766, L5758 e H6313 para o gene mitocondrial ND2; FIB-B17U e FIB-B17L para o gene nuclear βFib7 (Tabela 1).

Tabela 1. Primers utilizados para amplificação dos fragmentos de DNA por meio da PCR, os quais foram, posteriormente, sequenciados pelo método de Sanger.

Gene Primer Sequência do Primer (5’- 3’) Referência ND2 L5219 CCCATACCCCGAAAATGATG Sorenson et al. 1999 ND2 H5766 GGATGAGAAGGCTAGGATTTTKCG Sorenson et al. 1999 ND2 L5758 GGCTGAATRGGMCTNAAYCARAC Sorenson et al. 1999 ND2 H6313 CTCTTATTTAAGGCTTTGAAGGC Sorenson et al. 1999 βFib7 FIB-B17U GGAGAAAACAGGACAATGACAATTCAC Prychitko e Moore, 1997 βFib7 FIB-B17L TCCCCAGTAGTATCTGCCATTAGGGTT Prychitko e Moore, 1997

Para cada reação de PCR foram utilizados cerca de 10 ng de DNA, em um volume final de 25 µl, juntamente com as concentrações dos seguintes reagentes: 2,5 µl de tampão para reação 10X, 1,5

µl de dNTP (1,25 µM), 1,0 µl de MgCl2 (50 mM), 0,5 µl de cada primer (10 µM), 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Ludwig) e água para completar a reação. Algumas modificações foram feitas para a reação de PCR do nDNA. Em um volume final de 25 µl foram adicionados 2,5 µl de tampão para reação 10X, 1,0 µl de dNTP (1,25 µM), 0,5 µl de MgCl2 (50 mM), 1,0 µl de cada primer (2 µM), 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Ludwig) e água para completar a reação. As PCRs para as regiões selecionadas do mtDNA foram realizadas em um termociclador automático, com a seguinte configuração de ciclo: uma desnaturação inicial de 5 min. a 95ºC; seguidos de 35 ciclos com 1 min de desnaturação a 95ºC, 1 min. de anelamento a 55ºC, 1 min de extensão a 72ºC; e uma extensão final de 5 min. a 72ºC. Já para a amplificação do gene nuclear, a configuração dos ciclos no termociclador foi a seguinte: uma desnaturação inicial de 2 min. a 94ºC; seguidos de 30 ciclos com 45 s de desnaturação a 94ºC, 1 min. de anelamento a 58ºC, 2 min de extensão a 74ºC; e uma extensão final de 15 min. a 74ºC. 23

Os produtos resultantes da PCR foram purificados pelo método enzimático com Exo+Sap (Exonuclease I e Alkaline phosphatase) para eliminar os resíduos. As duas fitas (forward e reverse) foram sequenciadas com os mesmos primers usados na PCR (Tabela 1) e BigDyeTerminator v. 3.1 Cycle Sequencing, seguindo o protocolo do fabricante para o Sequencer ABI 3730 (Applied Biosystems). As sequências obtidas para ambos os genes (ND2 e βFib7) foram visualizadas e a fita consenso foi montada no programa Geneious. Posteriormente, as sequências foram editadas manualmente e alinhadas utilizando o algoritmo Muscle no programa MEGA ver. 6.0 (Tamura et al. 2013). Todas as sequências obtidas no presente trabalho serão depositadas no Genbank.

Análises filogenéticas e de diversidade

Realizamos a busca do modelo evolutivo de substituição de nucleotídeos através do programa Partition Finder v. 2.1.1 (Cognato e Vogler 2001), utilizando o Critério de Informação Bayesiana (BIC) para a seleção do melhor modelo. Fizemos isso separadamente para o mtDNA (ND2), nDNA (βFib7) e com os dados concatenados. O esquema de partição mais apropriado para o conjunto de dados do mtDNA foi o HKY+I+G, TRN+I e TIM+I+G, para a primeira, segunda e terceira posição do códon, respectivamente. Já para o nDNA, o modelo evolutivo mais apropriado foi o F81+I, para as três posições do códon. Para o conjunto de dados com os genes concatenados, o esquema de partição mais apropriado foi o F81+I, para o nDNA, HKY+G, HKY, TIM, para a primeira, segunda e terceira posição do códon do mtDNA, respectivamente. Posteriormente, estes modelos foram utilizados para as análises de Máxima Verossimilhança (MV) e Inferência Bayesiana (IB). A análise de MV foi realizada no programa GARLI 2.0 (Zwickl 2006), com suporte nodal de 1000 réplicas de bootstrap. A análise de IB foi realizada no programa MrBayes v. 3.2.6 (Ronquist e Huelsenbeck 2003), com quatro cadeias, 20 milhões de gerações, uma amostragem de árvores a cada 1000 gerações e 25% de burn-in. Tanto a MV quanto a IB foram realizadas através da plataforma online CIPRES (Miller et al. 2010). As duas análises foram realizadas separadamente para o conjunto de genes (MV e IB para o ND2, βFib7 e dados concatenados). As árvores de MV, obtidas após análise no GARLI 2.0 foram sumarizadas por consenso de maioria no programa Geneious a fim de se obter uma única árvore. As topologias obtidas na MV e IB foram visualizadas e editadas no programa FigTree v. 1.4.3 (Rambaut 2016). As distâncias genéticas foram calculadas no MEGA v. 6.0 (Tamura et al. 2013) usando o critério p-distance.

Tempo de divergência

Para estimar o tempo de divergência, utilizamos uma abordagem de coalescência bayesiana, executada no programa BEAST v. 1.8.0 (Drummond et al. 2013), com base apenas no DNA mitocondrial (ND2), pois um único marcador nuclear, com baixa informação filogenética, pode ser problemático em análises coalescentes (Xi et al. 2015). Para compor o grupo externo, incluímos as mesmas sequências que foram utilizadas para as análises de MV e IB. O arquivo utilizado para execução no BEAST foi criado no programa BEAUTi (distribuído junto ao pacote BEAST), utilizando um modelo de substituição (TRN+G) determinado pelo Partition Finder v. 2.1.1, sem particionar cada posição do códon. Aplicamos relógio molecular relaxado não correlacionado e utilizamos duas taxas de substituição: a primeira de 2,32% (0,01164 substituição/locus) por milhão de anos, e a segunda de 1,63% (0,00816), ambas com distribuição lognormal e modelo de especiação Yule process (Drummond et al. 2007). Utilizamos estas duas taxas com base em Nabholz et al. (2016), os quais atualizaram a taxa de evolução do gene ND2 para aves, divergindo, portanto, da taxa única de 2,1% (0,0105; DP ± 0,1) por milhão de anos tradicionalmente utilizada em datações com genomas mitocondriais com relógio molecular estrito (Weir e Schluter 2008). Realizamos uma corrida de 30 milhões de gerações, com árvores e parâmetros estimados a cada 1000 gerações. A convergência dos resultados, no qual os valores de ESS (tamanho amostral efetivo, em sua sigla no inglês) foram superiores a 200, foi verificada no programa TRACER v. 1.7.1 (Rambaut et al. 2018). As topologias das árvores foram avaliadas no programa TreeAnnotator v. 1.8.0 e posteriormente foram visualizadas e editadas no programa FigTree v. 1.4.3.

Análise de estrutura populacional

Utilizamos o programa DnaSP v.5 (Librado e Rozas 2009) para obter o número de haplótipos (H), usando sequências de DNA mitocondrial (ND2). A visualização das relações entre os haplótipos foi através de uma rede construída pelo método Median-Joining (Bandelt et al. 1999) no programa PopArt v. 1.7 (http://popart.otago.ac.nz).

RESULTADOS

Análises vocais

A estrutura geral do canto territorial e a composição das notas são bastante simples, variando de duas a sete notas nas diferentes subespécies avaliadas, com a variação segregando geograficamente/taxonomicamente. Na população que ocorre na costa sul e sudeste do Brasil (C. f. tephrocephala), encontramos clara distinção vocal em relação a todos os demais táxons do complexo, o qual apresentou, em todas as vocalizações analisadas ao longo de sua distribuição, um padrão de sílabas compostas por apenas duas notas, com rápidas emissões (Fig. 3A). Para as populações do táxon C. l. bartletti, que se diferenciou dos demais táxons de sua espécie e se mostrou semelhante a C. f. fluviatilis, nota-se a ocorrência de similaridades na estrutura geral do som, mas com diferenças no número de notas. O canto de C. l. bartletti apresenta sílabas compostas por quatro a cinco notas decrescentes (Fig. 3B), já o de C. f. fluviatilis, apresenta sílabas com sete notas espaçadas (Fig. 3C). O padrão encontrado nas populações atribuídas a C. f. fimbriata e C. f. alia, formam, em sua maioria, sílabas com três e quatro notas, respectivamente, emitidas em tom constante, demonstrando bastante similaridade. Em ambos os táxons, a primeira nota é ligeiramente menor em frequência (Fig. 3, D e E). Similarmente, C. f. nigricauda e C. l. lactea, que inclusive são tratadas em espécies diferentes, compartilharam semelhanças não apenas no canto territorial, mas também no canto agonístico. Ambas apresentam cantos territoriais com sílabas compostas por três notas e presença de harmônicos marcantes (Fig. 3, F e G). No canto agonístico, tais táxons compartilham uma sequência rápida e decrescente de notas (Fig. 3, I e J), sem diferença apreciável entre si, mas divergindo claramente de C. f. fluviatilis, cujo canto é emitido num ritmo mais lento, com notas em menor número e de maior amplitude de frequência (Fig. 3H). 26

Figura 3. Sonogramas de cantos representativos de diferentes táxons de Chionomesa ilustrando a variação dos cantos territoriais (A-G) e agonísticos (H-J) dentro do complexo. Os cantos territoriais representam: (A) Chionomesa fimbriata tephrocephala [WA 2407856, Brasil, Paraná]; (B) C. lactea bartletti [XC146791, Bolívia, Riberalta]; (C) C. f. fluviatilis [XC 364161, Equador, Zamora- Chinchipe]; (D) C. f. fimbriata [XC 44012, Guiana Francesa]; (E) C. f. alia [WA 2305409, Brasil, Pará]; (F) C. f. nigricauda [VQP-D14-191, Brasil, Ceará]; e (G) C. l. lactea [WA 21493, Brasil, São Paulo]. Os cantos agonísticos representam: (H) C. f. fluviatilis [XC 106244, Colômbia, Guaviare]; (I) C. f. nigricauda [WA 947591, Brasil, Alagoas]; e (J) C. l. lactea [WA 986992, Brasil, Minas Gerais]. Dados completos das gravações estão no Apêndice 1. O número de repetições de cada sílaba nos cantos territoriais é variável, podendo se estender por minutos. 27

Nas análises multivariadas, a Análise de Componentes Principais indica que o componente principal 1 (CP1) foi positivamente correlacionado com todas as variáveis. Os maiores coeficientes do CP1 estão associados às variáveis duração da sílaba (DS), seguido por intervalo entre as sílabas (IS), frequência máxima (FMA) e frequência mínima (FMI). O componente principal 2 (CP2) tem correlação positiva com duas variáveis: duração da sílaba (DS) e intervalo entre as sílabas (IS), sendo que as duas variáveis contribuíram de maneira similar (Fig. 4). As variáveis frequência máxima (FMA) e frequência mínima (FMI) apresentaram correlação negativa com o CP2. No gráfico desta análise, as gravações atribuídas aos táxons C. f. fimbriata e C. f. alia mostraram total sobreposição dos dados. Além disso, táxons que hoje são tratados em espécies distintas apresentaram grande sobreposição, por exemplo, C. f. nigricauda e C. l. lactea; C. f. fluviatilis e C. l. bartletti. O único táxon que não se sobrepôs com qualquer outro foi C. f. tephrocephala.

Igualmente à PCA, a Análise de Função Discriminante (DFA) evidenciou total segregação do táxon de C. f. tephrocephala e sobreposição entre alguns dos demais táxons, C. f. fimbriata sobrepondo com C. f. alia, inclusive os táxons atribuídos a espécies diferentes, C. f. nigricauda e C. l. lactea. A única diferença em relação à PCA foi para as subespécies C. f. fluviatilis e C. l. bartletti, as quais mostraram uma tendência de segregação (Fig. 5), diferente da PCA, na qual que se mostraram totalmente sobrepostas.

Análises filogenéticas e de diversidade

As análises filogenéticas (MV e IB) baseadas no marcador mitocondrial recuperaram árvores de topologias muito semelhantes e com alto suporte dos nós (MV = 98,9% e IB = 1). Os resultados 29

confirmaram que o gênero Chionomesa é, de fato, monofilético. Entretanto, as relações internas das subespécies mostraram que, tal qual circunscritas atualmente, tanto C. fimbriata quanto C. lactea são polifiléticas. Dois clados principais foram recuperados dentro do gênero: um formado por amostras do oeste e norte da Amazônia (Clado Oeste) e outro clado composto por amostras do centro-sul e leste da Amazônia, além do Cerrado e leste do Brasil (Clado Leste; Fig. 6). Nos dois clados estão inseridas tanto amostras de C. fimbriata quanto de C. lactea. Já no Clado Leste, tanto na MV quanto na IB, recuperamos C. f. tephrocephala como grupo- irmão de três linhagens bem suportadas: uma que inclui parte das amostras de C. f. nigricauda (do Cerrado e Caatinga) agrupada com as amostras de C. l. lactea, outra que inclui as demais amostras de C. f. nigricauda (Pantanal e sul da Amazônia) juntamente com C. f. alia e C. fimbriata nominal (FMNH 391268, Amapá) e, a terceira, com o táxon C. f. fimbriata (YPM 25195, Suriname), recuperada como grupo-irmão dos dois últimos. Assim, a subespécie nominal de C. fimbriata foi recuperada como polifilética em nossas análises, visto que a mesma apareceu em quatro linhagens diferentes, duas delas extremamente divergentes no Clado Oeste e duas outras no Clado Leste.

Figura 7. Hipótese filogenética por Inferência Bayesiana e Máxima Verossimilhança do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea, baseado em dados concatenados (ND2 e βFib7). Os valores de suporte dos nós estão localizados na parte anterior dos ramos e correspondem a probabilidade posterior e, após a barra, suporte bootstrap. Valores de suporte abaixo de 50% foram sumarizados na árvore de MV.

A árvore βFib7 não nos forneceu suporte acerca do relacionamento entre os táxons, recuperando apenas uma linhagem distinta dentro de Chionomesa, mas com suporte baixo na MV (54,5%) e alto na IB (1). Esta linhagem, de modo semelhante ao que foi recuperado na árvore ND2, inclui amostras de C. l. bartletti (UFAC 1574) e C. f. laeta (INPA A 23494). Todas as demais foram recuperadas em uma enorme politomia. Por outro lado, as análises feitas com os dados concatenados recuperaram seis linhagens, todas com alto suporte dos nós (MV=92,9% e IB=1; Fig. 7). A topologia foi semelhante aos resultados com 32

o mtDNA; o relacionamento entre os táxons manteve-se pouco inalterado, com exceção para os táxons C. f. fluviatilis e C. f. laeta, que nas análises com o mtDNA foram recuperados como grupo- irmão de C. l. bartletti e, nestas análises, saíram como grupo-irmão das amostras de C. f. fimbriata (amostras coletadas no rio Jufari, Roraima, Brasil). Os valores de divergência genética não corrigida (p-distance) entre as linhagens atribuídas ao complexo C. fimbriata/lactea variaram de 0,2% a 5,2% (Tabela 2). Para as populações atribuídas ao táxon que hoje é tratado como C. f. fimbriata, a divergência genética intraespecífica variou de 1,2% (entre as amostras do Suriname e Amapá) a 5,2% (entre as amostras do rio Jufari e Amapá). Já entre as subespécies agrupadas em C. lactea, as divergências variaram de 1,7%, entre C. l. bartletti e C. l. zimmeri, a 4,6%, entre C. l. lactea e C. l. zimmeri.

Tabela 2. Divergências genéticas entre populações do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea incluídas neste estudo, inferidas através do cálculo p-distance com 1000 réplicas de bootstrap. Os valores acima da diagonal representam o desvio-padrão. Em negrito, o menor e o maior valor de divergência genética. As abreviações “W” faz referência às C. f. nigricauda do Clado Oeste, “E” ao Clado Leste, “RR-CAI” às C. f. fimbriata de Caracaraí, Roraima, “RR-JUF” rio Jufari, Roraima, “SUR” Suriname e “AP” Amapá.

Táxon/população 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1. C. f. nigricauda_W 0,004 0,004 0,001 0,005 0,007 0,003 0,002 0,005 0,007 0,007 0,007 0,007 2. C. f. nigricauda_E 0,022 0,001 0,004 0,006 0,007 0,004 0,004 0,005 0,007 0,006 0,006 0,006 3. C. l. lactea 0,021 0,002 0,004 0,006 0,007 0,004 0,004 0,005 0,007 0,006 0,006 0,006 4. C. f. alia 0,004 0,019 0,019 0,005 0,007 0,003 0,002 0,005 0,007 0,007 0,007 0,007 5. C. f. fimbriata_RR-CAI 0,032 0,037 0,037 0,031 0,005 0,006 0,005 0,006 0,005 0,006 0,005 0,005 6. C. f. fimbriata_RR-JUF 0,052 0,047 0,047 0,049 0,022 0,007 0,007 0,007 0,004 0,004 0,003 0,003 7. C. f. fimbriata_SUR 0,013 0,020 0,020 0,010 0,033 0,049 0,003 0,005 0,007 0,007 0,007 0,007 8. C. f. fimbriata_AP 0,008 0,021 0,021 0,006 0,033 0,052 0,012 0,006 0,007 0,007 0,007 0,007 9. C. f. tephrocephala 0,033 0,030 0,030 0,031 0,039 0,045 0,031 0,033 0,006 0,007 0,006 0,006 10. C. l. bartletti 0,049 0,045 0,046 0,047 0,032 0,015 0,046 0,049 0,044 0,004 0,003 0,003 11. C. l. zimmeri 0,051 0,047 0,046 0,049 0,033 0,016 0,049 0,052 0,047 0,017 0,002 0,002 12. C. f. laeta 0,047 0,043 0,042 0,046 0,029 0,012 0,045 0,048 0,043 0,013 0,006 0,001 13. C. f. fluviatilis 0,047 0,043 0,042 0,046 0,029 0,012 0,045 0,048 0,043 0,013 0,006 0,002

Estrutura populacional

A partir de 37 sequências de indivíduos do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea, a rede de haplótipos mostrou grande segregação dos 26 haplótipos encontrados na amostragem. Baseando- se nos agrupamentos filogenéticos e identidade taxonômica das amostras, os diferentes haplótipos foram aqui reconhecidos em dez haplogrupos, separados por pelo menos cinco passos mutacionais (Fig. 8). A diversidade haplótípica (Hd) estimada foi de 0,9655. 33

O maior haplogrupo reúne as amostras de populações atribuídas a três táxons, havendo compartilhamento de haplótipos entre C. f. alia e C. f. nigricauda. O terceiro táxon presente nesse haplogrupo, C. f. fimbriata, apareceu ainda em outras três linhagens (em 3 haplogrupos) separadas por pelo menos 15 passos mutacionais, refletindo o polifiletismo do táxon nominal encontrado nas análises filogenéticas. Houve também compartilhamento de haplótipos entre táxons subordinados às diferentes espécies de Chionomesa, i.e. C. f. nigricauda e a forma nominal de C. lactea. Por fim, cabe destacar a grande divergência dos haplótipos recuperados para C. f. tephrocephala em relação às demais subespécies, os quais se diferenciaram por 32 passos mutacionais dos haplótipos mais próximos. Por outro lado, tal qual esperado com base nos resultados das análises filogenéticas, o gene nuclear βFib7 não apresentou estrutura populacional na rede de haplótipos (Fig. 9).

Tempo de divergência

De acordo com a árvore ND2, calibrada com a taxa de divergência de 2,32% (0,01164) por milhão de anos (Fig. 10), a separação de Chionomesa em relação aos gêneros Hylocharis e Elliotomyia, ocorreu há aproximadamente 3,73 milhões de anos (intervalo de confiança [IC] 5,25 a 2,5 Mya). Estima-se que a primeira grande divergência dentro de Chionomesa tenha ocorrido há 2,63 Mya (IC 3,75 a 1,75 Mya), separando-o em dois grupos principais: clados Leste vs. Oeste. No Clado Leste, ocorreu a separação de C. f. tephrocephala há aproximadamente 1,99 Mya (IC 3,0 a 1,0 Mya), seguido pela primeira divisão dentro do Clado Oeste, na qual segrega a amostra de C. f. fimbriata (A6668, amostra coletada no Parque Nacional do Viruá, RR, Brasil) das demais linhagens do clado em torno de 1,68 Mya. No Clado Leste, as linhagens atribuídas a C. f. nigricauda, tiveram sua divisão datada por volta de 1,38 Mya (IC 2,25 a 0,75 Mya), segregando C. f. nigricauda em duas linhagens (Fig. 10). 35

Quando a árvore é calibrada com a taxa de diversificação mais lenta, de 1,63% (0,00816) por milhão de anos, um momento bem mais tardio, as datações são antecipadas em cerca de 1,3 milhão de anos, com a separação de Chionomesa há aproximadamente 5,05 Mya (IC 7,25 a 3,25 Mya), com a primeira grande diversificação dentro do gênero ocorrendo por volta de 3,8 Mya, segregando os dois grandes clados que aqui reconhecemos como Leste e Oeste (Fig. 11).

DISCUSSÃO

Os resultados encontrados nas análises vocais mostraram que muitas das subespécies reconhecidas atualmente possuem padrões de canto próprios e distintos das demais, o que, juntamente com os resultados moleculares, sugere que múltiplas espécies estão presentes no complexo Chionomesa. Nas análises filogenéticas, recuperamos o monofiletismo do gênero Chionomesa, indicando ainda a existência de dois clados principais, com forte suporte de bootstrap e probabilidade posterior. Por outro lado, o relacionamento interno do gênero mostrou ser bastante complexo, revelando que as espécies de Chionomesa tradicionalmente reconhecidas são polifiléticas, com bastante estruturação filogeográfica tanto em C. fimbriata quanto em C. lactea. Em aves, até mesmo aquelas em que se reconhece traços de aprendizado vocal, como é o caso dos beija-flores (Jarvis et al 2000), a vocalização parece ter importante sinal filogenético, fornecendo resultados mais robustos quando combinados com dados moleculares. Aqui, alguns táxons que exibem diferenças no fenótipo e que, por conseguinte, são tratados como espécies ou subespécies diferentes, compartilham cantos (e. g. C. f. nigricauda x C. l. lactea; C. f. fluviatilis x C. l. bartletti; C. f. fimbriata [ao menos as do Escudo Guianense] x C. f. alia). Tais resultados são congruentes aos encontrados nas análises moleculares, dado que os táxons que se mostraram proximamente relacionados na filogenia e que compartilharam haplótipos foram os que justamente apresentaram sobreposição nas análises dos caracteres vocais. A maior cobertura taxonômica e, principalmente, geográfica do presente trabalho preenche lacunas amostrais da filogenia proposta por McGuire et al. (2014), na qual foi apontada uma diversificação relativamente recente entre as espécies-irmãs C. fimbriata e C. lactea. No entanto, naquela filogenia, apenas dois táxons do gênero Chionomesa foram amostrados, coincidentemente C. f. fluviatilis e C. l. bartletti, os quais se mostraram um dos grupos-irmãos de diversificação mais recente nas nossas análises. Assim, a expansão amostral em nossos estudos confirma que a diversificação dentro de Chionomesa iniciou em um momento muito anterior ao apresentado por McGuire et al. (2014), de alguns poucos milhões de anos (2,63-3,8, a depender da taxa utilizada), ante apenas aproximadamente 0,7 Mya no trabalho desses autores. Diante do polifiletismo geral encontrado aqui, em contraste com o tratamento taxonômico tradicional, fica claro que o critério utilizado historicamente para agrupar os táxons de Chionomesa em duas espécies distintas – i.e. coloração da garganta azul vs. verde – não tem sinal filogenético, sugerindo múltiplas mudanças (e possíveis reversões) da cor da garganta ao longo da evolução do 38

grupo, ainda que isto não tenha sido explicitamente testado aqui. A coloração da garganta parece ter um importante papel no reconhecimento específico em outros grupos de beija-flores, inclusive com pares de espécies divergindo justamente entre o verde e o azul, como recentemente descrito para Oreotrochilus (Sornoza-Molina et al. 2018). Uma forte seleção sexual em Chionomesa poderia explicar a marcada divergência fenotípica da cor da garganta entre linhagens irmãs (ou proximamente relacionadas) aqui recuperadas e que se mostraram pouco divergentes geneticamente (e.g., C. f. fluviatilis x C. l. zimmeri [0,6%]; C. f. fluviatilis x C. l. bartletti [1,3%]), havendo mesmo compartilhamento de haplótipos entre táxons que sempre foram tratados como espécies distintas, como C. f. nigricauda e C. l. lactea. Essas divergências baixas (ou mesmo inexistentes) chamam ainda a atenção quando confrontadas com aquela encontrada dentro de C. f. nigricauda (cerca de 2,2%) entre os dois clados recuperados com amostras desta subespécie. Este cenário geral novamente faz paralelo com aquele encontrado em Oreotrochilus, no qual também se detectou compartilhamento de haplótipos mitocondriais entre espécies morfologicamente distintas, possivelmente como resultado de seleção sexual em um tempo de divergência muito recente (Sornoza-Molina et al. 2018; ver também Amaral et al. 2018). Alternativamente, dado que C. f. nigricauda e C. l. lactea são parcialmente simpátricas (Weller et al. 2018a, b), não se pode descartar a possibilidade de que o compartilhamento de haplótipos detectado aqui seja resultado de eventual hibridização entre as duas espécies de Chionomesa no Brasil central, ainda que não haja qualquer informação da literatura sugerindo introgressão entre esses dois táxons. O uso de sequenciamento massivo de dados moleculares, tal qual utilizado por Amaral et al. (2018), poderá elucidar os processos por trás do padrão aqui encontrado, sendo igualmente desejável a inclusão de novas amostras de C. l. lactea.

Implicações taxonômicas

Nossos resultados sugerem que múltiplas espécies devem estar envolvidas dentro de Chionomesa, embora no momento não seja possível precisar quantas realmente devam ser reconhecidas. O polifiletismo de Chionomesa lactea, com C. l. bartletti distantemente relacionada à C. l. lactea e mais próxima de táxons atribuídos a C. fimbriata, corrobora o reconhecimento como espécie à parte para C. l. bartletti, conforme já adotado por del Hoyo et al. (2014, 2018). Argumento similar se aplicaria a C. l. zimmeri, táxon bastante distinto de todos os demais na plumagem (obs. pess.) e que é proximamente relacionado a C. f. fluviatilis, embora apenas uma amostra do primeiro 39

táxon esteja atualmente disponível em coleções de tecido do mundo. Curiosamente, del Hoyo et al. (2014, 2018), sem maiores justificativas, mantiveram C. l. zimmeri subordinada a C. l. lactea, o que não se sustenta diante dos resultados aqui reportados. O posicionamento da forma nominal de C. fimbriata não foi resolvido em nenhuma das filogenias obtidas, visto que a mesma se revelou polifilética. Dada a alta divergência entre as linhagens, é possível que haja espécies crípticas envolvidas dentro do que hoje é reconhecido como C. fimbriata nominal. Diante do conjunto de dados limitados neste estudo, não temos como afirmar precisamente qual das linhagens representa, de fato, C. f. fimbriata. O táxon C. f. tephrocephala, com distribuição na região litorânea do sul e sudeste do Brasil, foi recuperado em uma linhagem independente, com alto suporte na probabilidade posterior (1) e em bootstrap (99%). Embora contando apenas com amostras de quatro exemplares, três das quais de uma única localidade, esta subespécie mostrou divergências genéticas relativamente altas (acima de 3%) em relação a todas as demais linhagens, sendo separada por 32 passos mutacionais do haplótipo mais próximo. Somados à distinção vocal encontrada para este táxon, que mostrou total segregação vocal em relação aos demais táxons nas análises multivariadas. Os dados genéticos aqui apresentados corroboram o tratamento de C. f. tephrocephala como espécie independente, como já adotado por Grantsau (2010) com base em sua também marcada distinção morfológica (20% maior que todos os demais táxons, entre outras características; ver também Weller et al. 2018b). Por outro lado, o status taxonômico de C. f. nigricauda é mais complexo, uma vez que foi recuperado em duas linhagens distintas dentro do Clado Leste, sendo uma linhagem representada por amostras do Pará, Amazonas e Mato Grosso e a outra linhagem com amostras do Nordeste e Goiás, as quais têm divergência genética de 2,2% entre si. Esta última linhagem é mais relacionada à C. l. lactea, com quem inclusive compartilha haplótipos; as demais amostras de C. f. nigricauda, por sua vez, são proximamente relacionadas à C. f. alia e C. f. fimbriata. Assim, os dados genéticos não corroboram a independência taxonômica de C. f. nigricauda (em relação à C. fimbriata) adotada por Grantsau (2010). Por outro lado, ainda que C. f. nigricauda compartilhe haplótipos e padrão de canto com C. lactea, os dois táxons ocorrem em simpatria em parte de suas distribuições, sem sinal de livre fluxo gênico ou introgressão, o que evidencia que as duas populações devem ser tratadas como espécies independentes (Remsen 2015). O táxon C. f. alia tem sua validade taxonômica questionada por muitos autores, por alegarem não haver diagnoses morfológicas que permitam diferenciá-la de C. f. fimbriata (e. g., Schuchmann 1999 e Weller et al. 2018b). Esta conclusão foi em parte corroborada aqui, tendo em vista que C. f. 40

alia se mostrou pouco diferenciada em relação às amostras de C. f. fimbriata, tanto em dados genéticos quanto em dados vocais. Por outro lado, mostrou-se proximamente relacionada a C. f. nigricauda, táxon que possui plumagem distinta de C. f. alia (e. g., infracaudais puramente brancas vs. manchadas; garganta sem tonalidade azulada vs. com tons azulados; Zimmer 1950, Grantsau 1988, 2010). Desse modo, a independência taxonômica de C. f. alia como subespécie não foi completamente elucidada em nossos estudos, havendo a necessidade de inclusão de mais amostras a fim de testar sua validade taxonômica. Por fim, a baixa divergência genética de C. f. laeta em relação a C. f. fluviatilis, encontrada em nossas análises, sustenta o questionamento histórico da independência taxonômica entre essas duas subespécies (cf. Zimmer 1950, Grantsau 2010). Por outro lado, o tamanho amostral baixo (apenas uma amostra de cada) torna desejável a inclusão de novas amostras para elucidar a possível sinonímia entre estas duas formas.

CONCLUSÕES A filogenia molecular combinada com as análises bioacústicas aqui realizadas para o complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea contribui para o conhecimento da real diversidade de Chionomesa, bem como suas relações filogenéticas, com ampla amostragem geográfica e taxonômica deste gênero. Os resultados das hipóteses filogenéticas, ainda que com dados genéticos limitados, sugerem múltiplas espécies para este complexo, mas com diferentes agrupamentos taxonômicos em relação à taxonomia tradicional, a qual era baseada exclusivamente em padrões morfológicos. O polifiletismo geral encontrado sugere que a cor da plumagem da garganta não é um critério seguro na delimitação sistemática do complexo, ao contrário do caráter vocal, que corroborou o relacionamento entre as subespécies recuperadas nos dados genéticos.

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Apêndice 1. Gravações das vocalizações do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea utilizadas para realizar a Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Função Discriminante (DFA). Além das gravações dos cantos agonísticos de C. f. nigricauda, C. f. fluviatilis e C. l. lactea. Táxon Localidade Gravação Data Base de dados Latitude Longitude C. f. fimbriata Guiana Francesa 44012 11/05/2008 Xeno-canto 5º 44' 00.2''N 53º 54' 00.4''W C. f. fimbriata Guiana Francesa, La Carapa, Macouria 64831 28/10/2010 Xeno-canto 4º 54' 39.2''N 52º 27' 26.4''W C. f. fimbriata Suriname 271900 08/03/2014 Xeno-canto 5º 51' 05.0''N 55º 12' 08.6''W C. f. fimbriata Brasil, Roraima, Margem esquerda do Rio Uraricuera, a leste da BRA-174 354859 26/01/2017 Xeno-canto 3º 28' 22.8''N 60º 53' 49.9''W C. f. tephrocephala Brasil, Santa Catarina, Governador Celso Ramos 119721 11/03/2010 WikiAves 27º 18' 53''S 48º 33' 33''W C. f. tephrocephala Brasil, Rio de Janeiro, Quissamã 320606 08/05/2010 WikiAves 22º 06' 24''S 41º 28' 20''W C. f. tephrocephala Brasil, São Paulo. Ubatuba 555036 10/11/2010 WikiAves 23º 26' 02''S 45º 04' 16''W C. f. tephrocephala Brasil, Santa Catarina, Garopaba 972983 08/05/2010 WikiAves 28º 01' 24''S 48º 36' 48''W C. f. tephrocephala Brasil, Paraná, Matinhos 2407856 18/12/2016 WikiAves 25º 49' 03''S 48º 32' 34''W C. f. fluviatilis Equador, Zamora-Chinchipe, Rio Bombiscaro 237939 24/03/2003 Xeno-canto 4º 06' 28''S 78º 57' 50.4''W C. f. fluviatilis Equador, Napo, Archidona 260483 06/08/1999 Xeno-canto 0º 55' 01.2 ''S 77º 48' 00.0''W C. f. fluviatilis Colômbia, San Jose de Guaviare 106244 28/06/2012 Xeno-canto 2º 40' 01.2''N 72º 36' 54.0''W C. f. fluviatilis Equador, Zomora-Chinchipe, Rio Bombiscaro 364161 07/2003 Xeno-canto 4º 06' 50.4''S 78º 57' 50.4''W C. f. nigricauda Brasil, Alagoas, Pão de Açúcar 947591 24/04/2013 WikiAves 09º 44' 54''S 37º 26' 12''W C. f. nigricauda Brasil, Alagoas, Caetité 2744216 25/01/2011 WikiAves 14º 04' 10''S 42º 28' 30''W C. f. nigricauda Brasil, Goiás, Caldas Novas 3312938 24/03/2019 WikiAves 17º 44' 30''S 48º 37' 30''W C. f. nigricauda Brasil, Minas Gerais, Botumirim 2981529 20/04/2018 WikiAves 16º 52' 20''S 43º 00' 39''W C. f. nigricauda Brasil, Ceará, Crato, Floresta Nacional do Araripe VQP-D14-191 30/08/2014 Próprio 7º 14' 55.7''S 39º 29' 43.0''W C. f. nigricauda Brasil, Piauí, Parnaíba 2896263 25/02/2018 WikiAves 02º 54' 17''S 41º 46' 36''W C. f. nigricauda Brasil, Alagoas, Pão de Açúcar 947591 24/04/2013 WikiAves 09º 44' 54''S 37º 26' 12''W C. f. nigricauda Brasil, Goiás, Santa Rita do Novo Destino 2915039 17/03/2018 WikiAves 15º 08' 07''S 49º 07' 13''W C. f. nigricauda Brasil, Bahia, Muquém do São Francisco VQP-H7-201 22/08/2007 Próprio 12º 11' 55''S 43º 49' 58''W C. f. nigricauda Brasil, Bahia, Lençóis 130456 15/05/2012 Xeno-canto 12º 33' 06.1''S 41º 23' 54.2''W C. f. alia Brasil, Amazonas, Iranduba 3236847 10/06/2018 Wikiaves 03º 17' 05''S 60º 11' 10''W C. f. alia Brasil, Pará, Santarém 2305409 01/10/2016 WikiAves 02º 26' 35''S 54º 42' 30''W C. f. alia Brasil, Pará, Santarém 182130 27/07/2010 WikiAves 02º 26' 35''S 54º 42' 30''W C. l. lactea Brasil, Minas Gerais, Belo Vale 173324 26/04/2013 Xeno-canto 20º 24' 29.5''S 44º 01' 40.4''W C. l. lactea Brasil, Minas Gerais, Tiradentes 84852 13/09/2003 Xeno-canto 21º 07' 00.1''S 44º 09' 00.4''W C. l. lactea Brasil, São Paulo, Embu-Guaçu 214393 23/09/2010 WikiAves 23º 49' 56''S 46º 48' 41''W C. l. lactea Brasil, Minas Gerais, Carmópolis de Minas 986992 28/04/2013 WikiAves 20º 32' 29''S 44º 38' 06''W 46

C. l. lactea Brasil, Espírito Santo, Aracruz 885723 01/02/2013 WikiAves 19º 49' 13''S 40º 16' 24''W C. l. lactea Brasil, Rio de Janeiro, Três Rios 182373 20/08/2010 WikiAves 22º 07' 00''S 43º 12' 33''W C. l. lactea Brasil, São Paulo, Mogi das Cruzes 859008 13/01/2013 WikiAves 23º 31' 22''S 46º 11' 18''W C. l. lactea Brasil, Minas Gerais, Carmópolis de Minas 986992 28/04/2013 WikiAves 20º 32' 29''S 44º 38' 06''W C. l. lactea Brasil, Minas Gerais, Serro 1897733 01/11/2015 WikiAves 18º 36' 17''S 43º 22' 46''W C. l. lactea Brasil, São Paulo, Águas da Prata 389010 27/01/2014 Xeno-canto 21º 54' 56.9''S 46º 43' 43.3''W C. l. lactea Brasil, São Paulo, Botucatu 417043 26/05/2018 Xeno-canto 22º 53' 03.1''S 48º 26' 39.1''W C. l. bartletti Peru, San Martin, Shatayacu, SE Tarapoto 465209 15/07/2016 Xeno-canto 6º 34' 58.8''S 76º 19' 01.2''W C. l. bartletti Bolívia, Puerto Hamburgo, Riberalta 146791 29/08/2013 Xeno-canto 11º 01' 08.0''S 66º 05' 58.2''W C. l. bartletti Peru, Amazonia Lodge, Madre Dios 465202 31/07/2011 Xeno-canto 12º 51' 57.2''S 71º 22' 01.2''W C. l. bartletti Brasil, Acre, Manoel Urbano, Rio Chandless, Parque Estadual Chandless 477094 17/02/2008 Xeno-canto 9º 33' 28.8''S 70º 02' 52.8''W C. l. bartletti Peru, Villa Carmen Research Station 493466 08/08/2019 Xeno-canto 12º 53' 20.4''S 71º 23' 56.4''W 47

Apêndice 2. Procedência das amostras do complexo Chionomesa fimbriata e C. lactea utilizadas neste trabalho para as análises moleculares. As seguintes instituições estão indicadas pelas abreviações: AMNH – American Museum of Natural History; FMNH – Field Museum Natural History; INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; LSUMZ – Louisiana State University Museum of Natural Science; LZUFPI – Laboratório de Zoologia da Universidade Federal do Piauí; MPEG – Museu Paraense Emílio Goeldi; MZUSP – Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo; UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso; UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro; YPM – Yale Peabody Museum. Táxon Voucher Tecido GenBank Localidade Latitude Longitude C. l. bartletti MPEG 60496 MPEG T3636 Brasil, Acre, Plácido de Castro, Ramal Novo 10° 07' 42.2"S 67° 19' 42.5"W Horizonte, km 09 C. l. bartletti MPEG 63276 MPEG T5826 Brasil, Acre, Manuel Urbano, margem direita Rio 09° 01' 04.7"S 69° 32' 21.8"W Purus, Santa Cruz Velha C. l. bartletti LSUMZ B-9484 GU167203 Bolívia, Pando Department 10° 47' 56.00"S 66° 59' 55.68"W C. l. zimmeri AMNH DOT 11836 Venezuela, Bolivar, Cerro Guaiquinima 05° 48' 34.00"N 63° 44' 45.00"W C. l. lactea UFMT 4876 M-3155 Brasil, São Paulo, Rio Claro, campus da UNESP 22º 23' 44.9''S 47º 32' 42.7''W C. l. lactea UFMT 4416 M-2560 Brasil, Minas Gerais, Florestal, campus da 19° 52' 51"S 44° 24' 49"W Universidade Federal de Viçosa C. f. fimbriata YPM 25195 Suriname, Commewijne, Distrito Peperpot 05° 46' 43.58"N 55° 07' 45.82"W C. f. fimbriata MZUSP 93651 MZUSP 93651 Brasil, Roraima, Caracaraí, Rio Jufari, Igarapé 01º 06' 00"S 62º 01' 48" W Caicubi, sítio São Bento C. f. fimbriata MZUSP 93650 MZUSP 93650 Brasil, Amazonas, Barcelos, Rio Jufari, "Ilha da 01º 04' 02.2" S 62º 07' 47"W Campina"

C. f. fimbriata MPEG FMNH 391268 Brasil, Amapá, Tartarugalzinho, Fazenda Casimiro 01°23' 07.0"N 50° 45' 30.0"W C. f. fimbriata INPA A6668 Brasil, Roraima, Caracaraí, Parque Nacional do 01º 24' 45.9"N 60° 59' 20.4"W Viruá, Estrada Perdida, km 12, 50 km SE C. f. alia MPEG 76583 T19757 Brasil, Pará, Jacareacanga, Vila Mamãe anã, 05º 47' 34.27"S 57º 24' 0.16"W margem direita Tapajós C. f. alia INPA A16582 Brasil, Amazonas, Manaus, Ponta Negra, Hotel 03° 03' 43.12"S 60° 06' 27.85" W Tropical C. f. alia INPA 5550 A19978 Brasil, Amazonas, Manaus, Campus I do INPA 03° 05' 40.38"S 59° 59' 21.28"W C. f. alia INPA A23758 Brasil, Amazonas, Ilha Grande, Rio Solimões 03º 48' 48.2"S 62º 11' 47.3"W C. f. alia UFMT 4013 BLM 767 Brasil, Pará, Altamira, UHE de Belo Monte 03° 21' 02"S 52° 04' 17"W C. f. alia MPEG 73803 T16388 Brasil, Amazonas, Autazes, Uricurituba, Ilha 03º 35' 31.2"S 58º 56' 35.6"W 48

C. f. alia MZUSP 101202 MZUSP 101202 Brasil, Pará, Vitória do Xingu, Rio Xingu 03º 15' 04"S 51º 47' 01"W (margem esquerda) C. f. alia MZUSP 99463 MZUSP 99463 Brasil, Rondônia, Machadinho d'Oeste, Rio Ji- 08º 50' 39"S 62º 12' 03"W Paraná (margem direita), UHE Tabajara C. f. nigricauda MPEG 83224 T25866 Brasil, Pará, Ilha de Marajó, Muaná, Fazenda 01° 05' 32.33"S 49° 12' 56.33"W Espírito Santo C. f. nigricauda MPEG 83331 T26511 Brasil, Pará, Ilha de Marajó, Muaná, Fazenda 01° 09' 17.3"S 49° 11' 56.2"W Santo André C. f. nigricauda LZUFPI 0451 T9741 Brasil, Piauí, Teresina, Campus da Universidade 05° 03' 31.36"S 42° 47' 54.66"W Federal do Piauí C. f. nigricauda MZUSP 81523 MZUSP 81523 Brasil, Bahia, Muquém do São Francisco, Quebra 12º 27' 23"S 43º 14' 47"W Linha C. f. nigricauda MZUSP 81524 MZUSP 81524 Brasil, Bahia, Muquém do São Francisco, Fazenda 12º 15' 52"S 43º 17' 04"W Santo Antônio C. f. nigricauda MZUSP 101809 MZUSP 101809 Brasil, Goiás, Campo Alegre de Goiás, BR-050 17° 38' 8.27"S 47° 46' 7.33"W C. f. nigricauda MZUSP 97045 MZUSP 97045 Brasil, Pará, Santana do Araguaia, Fazenda Fartura 09° 44' 19.49"S 50° 11' 18.38"W C. f. nigricauda UFMT 4457 M-2691 Brasil, Mato Grosso, Cáceres, Fazenda Baía de 16° 27' 59"S 58° 09' 06"W Pedra C. f. nigricauda UFMT 4277 M-2422 Brasil, Mato Grosso, Poconé, Fazenda Retiro 16º 21' 48.6''S 56º 17' 28.7''W Novo, pantanal de Pirizal C. f. nigricauda INPA 3345 A3125 Brasil, Pará, Canaã dos Carajás, Flona Carajás 06º 04' 26''S 50º 14' 48'' W C. f. nigricauda UFMT 4279 M-2424 Brasil, Mato Grosso, Poconé, Fazenda Retiro 16° 21' 48.60"S 56° 17' 28.68"W Novo, Pantanal de Pirizal C. f. nigricauda UFMT 4354 M-2499 Brasil, Mato Grosso, Várzea Grande, Asa Bela 15° 39' 10.11"S 56° 10' 21.34"W C. f. tephrocephala UFRJ 1068 UFRJ 1068 Brasil, Rio de Janeiro, Quissamã 22º 06' 24''S 41º 28' 20''W C. f. tephrocephala MZUSP 78779 MZUSP 78779 Brasil, Santa Catarina, Florianópolis, Serrinha 27° 35' 52.80"S 48° 31' 38.28"W C. f. tephrocephala MZUSP 82614 MZUSP 82614 Brasil, Santa Catarina, Florianópolis, Serrinha 27° 35' 52.80"S 48° 31' 38.28"W C. f. tephrocephala UFMT 4390 M-2535 Brasil, Santa Catarina, Florianópolis, Serrinha 27° 35' 52.80"S 48° 31' 38.28"W C. f. fluviatilis LSUMZ B 5956 EU0425201 Equador, Morona Santiago C. f. laeta A23494 T27093 Brasil, Amazonas, Tefé, RDS Mamirauá 03° 07' 29.7''S 64° 46' 32.4''W