TOPICOS SOBRE

FISIOLOGIA, TOXICOLOGIA Y BIOLOGIA MOLECULAR

831 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE GENES QUE CODIFICAN PARA QUITINASAS Y PROTEASAS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

Isolation and molecular characterization of chitinases and proteases encoding genes from entomopathogenic fungi

Miguel Silva-Flores1. Sergio Casas-Flores1. Ovidio Díaz-Gómez2, y Clara Monreal- Vargas2. 1División de Biología Molecular. Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICyT). Camino a la Presa San José No. 2055. Col. Lomas 4a. Sección, C.P. 7821. San Luis Potosí, SLP. Tel: + (444) 834 2000 Ext. 2079. Fax + (444) 834 2010 E-mail: miguel.silva @ipicyt.edu.mx; [email protected]; 2Fac. de Agronomía de la U.A.S.L.P., A. Obregón 64, Centro, 78000, San Luis Potosí, S.L.P. [email protected]

Palabras Clave: Entomopatógenos, quitinasa, proteasa.

Introducción En México se considera a Bactericera cockerelli (Sulc) como vector del agente causal de la fitoplasmosis en solanáceas (Garzón, 2002), mientras que en el resto del mundo es importante por el efecto que causan las toxinas que inyecta al alimentarse. En muchas ocasiones, en complejo con mosca blanca, esta especie devasta amplias zonas de cultivo, principalmente solanáceas, por lo que para su control se usa infinidad de elementos que van desde insecticidas químicos hasta productos biológicos. El Manejo Integrado de Plagas (MIP) contempla, además de insecticidas organosintéticos, la liberación de enemigos naturales, la aplicación de productos bioracionales y el uso de organismos entomopatógenos. Existen parasitoides y depredadores que han demostrado ser eficientes en el control de insectos plaga, además de productos bioracionales como los ácidos grasos, extractos vegetales, repelentes, reguladores de crecimiento, etc. Adicionalmente, se han evaluado hongos entomopatógenos, como Entomophtora virulenta, Beauveria bassiana. Verticillium lecanii, Metarhizium anisopliae y Paecilomyces fumosoroseus. Ese último reviste particular importancia dado que infecta a la mosquita blanca con excelentes resultados, en algunos casos, mejores a los obtenidos con control químico. En la actualidad, las herramientas que proporciona la biología molecular han permitido la manipulación genética de algunas cepas de hongos para potenciar la efectividad que estos presentan de manera natural. P. fumosoroseus ha demostrado ser efectivo para el control de la mosquita blanca, destacando por las epizootias que causa, en muchas ocasiones, de manera natural. La forma infectiva de los hongos son las conidias y las blastoconidias, que pueden llegar a penetrar al insecto a través de la cavidad bucal, de los espiráculos o de la cutícula (James, 2001). Cuando el hongo penetra a través de la cutícula, el mecanismo infectivo incluye la adhesión del conidio a la cutícula donde germina y forma una estructura llamada apresorio, el cual hace presión mecánica, junto con la secreción de hidrolasas; principalmente, proteasas, lipasas y quitinasas, que rompen la cutícula, permitiendo la entrada del hongo al hemocele del insecto. Este hongo posee la capacidad de evadir la respuesta de defensa del insecto y de digerir los órganos internos hasta causarles la muerte (Khachatourians, 1996; citado por Sánchez, 2004). Por lo anterior, es importante identificar y caracterizar los genes que

832 codifiquen estas enzimas para entender los mecanismos de patogenicidad, y posteriormente, mediante ingeniería genética, modificarlos para incrementar su virulencia hacia el huésped, como ya se ha hecho con algunos entomopatógenos (Metarhizium anisopliae. y Beauveria bassiana). Sin embargo, es importante contar con un amplio rango de genes caracterizados, para emplearlos de acuerdo a las necesidades, es decir, se requiere generar un banco que permita desarrollar herramientas mas diversas y competitivas para el control biológico de insectos. Por lo anterior se planteó el siguiente objetivo: Clonar y caracterizar genes que codifican para quitinasas y proteasas de hongos entomopatógenos.

Materiales y Método Se diseñaron oligonucleótidos degenerados en regiones consenso de quitinasas y proteasas de hongos entomopatógenos, con la finalidad de amplificar por PCR las regiones conservadas en el genoma de los hongos. Adicionalmente, se diseñaron oligonucleótidos sobre la secuencia obtenida, para amplificar los genes completos de proteasas y quitinasas de P. fumosoroseus, mediante la técnica de DNA-walking. Los productos amplificados por PCR fueron clonados en pGEM-Teasy y se seleccionaron algunas clonas que fueron secuenciadas por el método de Sanger. Las secuencias se analizaron utilizando el algorítmo BLASTX de NCBI. Mediante microscopia se identificó un hongo perteneciente al genero Cladosporium sp., el cual fue identificado parasitando al psilido del eucalipto Glycaspis brimblecombei MOORE. Con la finalidad de determinar la identidad de este hongo, se procedió a realizar la amplificación por PCR de los ITS y posteriormente se transformó y se clono en pGEM- Teasy. Se seleccionaron algunas clonas, para su posterior secuenciación.

Resultados y Discusión Por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando oligonucleótidos degenerados diseñados sobre regiones conservadas para quitinasas y proteasas de diferentes organismos, se obtuvieron las secuencias parciales de dos genes de P. fumosoroseus; uno de ellos codifica para una quitinasa, mientras que el segundo gen codifica para una probable proteasa. Posteriormente, utilizando el método de DNA Walking, se amplificó un fragmento de 1672 bp, que corresponde al gen completo de una posible quitinasa, lo cual se determinó utilizando el algorímo GENSCAN. Con el análisis tipo BLASTX se encontró que la secuencia de P. fumosoroseus presenta una identidad de 85% respecto a una quitinasa codificada por el entomopatógeno Lecanicillium lecanii (Fig. 1). Dado que ha la fecha no se había caracterizado el gen que codifica para la quitinasa en P. fumosoroseus, este es el primer reporte que se hace de esta naturaleza. Lo anterior es de importancia en la investigación, puesto que una vez caracterizado el gen, puede manipularse para generar cepas más virulentas. Analizando la secuencia amplificada por PCR con oiligonucleótidos universales para las regiones intergénicas de los RNA ribosomales de hongos, con respecto a la cepa de Cladosporium, se encontró mediante BLASTN, en el Gene bank, que la secuencia aislada alineó con el gen 18S ribosomal que pertenece el genero Cladosporium cladosporioides. Este hongo potencialmente puede ser un agente de control biológico, ya que, inicialmente se aisló de G. brimblecombei en eucalipto (Fig. 2); también se ha citado parasitando pupas de Cameraria ohridella (Samek et al., 2006).

833

Figura. 1. Alineamiento mediante BLASTN de la secuencia del DNA geonómico de P. fumosoroseus

a b

Fig. 2. Ninfas de Bactericera cockerelli parasitadas por el hongo Cladosporium cladosporioides aislado del psilido del eucalipto. a) fase inicial de la infección b) ninfa 8 DDA .

Las perspectivas de la investigación son: Cuantificar la expresión del gen de la quitinasa en diferentes condiciones de cultivo por medio de la técnica de PCR en tiempo real. Clonar genes para quitinasas y proteasas en C. cladosporioides. Transformar P. fumosoroseus con Agrobacterium tumefaciens, para interrumpir y sobreexpresar los genes de quitinasas y proteasas para determinar su papel durante el proceso de infección. Evaluar in vitro la actividad insecticida de las cepas, transformantes generadas de ambos hongos. Evaluar in vivo, bajo condiciones controladas, la efectividad biológica de las cepas transformantes de P. fumosoroseus sobre mosca blanca, y sobre B. cockerelli las de C. cladosporioides.

Conclusiones Se logró la secuenciación de un gen de P. fumosoroseus que codifica para una quitinasa, similar en 85% a una codificada por L. lecanii. La secuencia aislada de Cladosporium es parte del 18S ribosomal, que pertenece el genero C. cladosporioides.

Literatura Citada Garzón, T. J. A. 2002. El “Pulgón saltador “o la Paratrioza una amenaza para la horticultura de Sinaloa. Memoria de taller sobre Paratrioza cockerelli Sulc. como plaga y vector de fitoplasmas en hortalizas. Culiacán Sinaloa. Mexico, 100 pp.

834 James, R. R. 2001. Effects of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the silver leaf whitefly for two hyphomycetes. J. invertebr Pathol. 77 pp 99- 107. Pucheta, D. M. Flores M. A., Rodríguez N. S. y De la Torre M. 2006. Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos. INCI., vol. 31:12. pp. 856-860. Sánchez, M. R. 2004. Estudios sobre la reproducción asexual del hongo entomopatógeno Paecilomyces fumosoroseus. Tesis para obtener el grado de Doctor en Biotecnología. Centro de Investigación y de estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Unidad Zacatenco. México, D.F. T. Samek, D. Novotný y L. Jankovský. 2006. Infection of wintering pupae of horse- chestnut leaf miner. Cameraria ohridella Deschka et Dimić. by Verticillium lecanii (Zimmerman) Viégas. J. Forest Science, 52(3): pp. 136–140

835 DIEZ AÑOS DE MONITOREO DE LA RESISTENCIA EN POBLACIONES MEXICANAS DE Helicoverpa zea BODDIE A LA TOXINA Cry1Ac QUE PRODUCE EL ALGODONERO TRANSGÉNICO BOLLGARD® I

Ten years of monitoring the resistance in Mexican Populations of Helicoverpa zea Boddie to Cry1Ac toxin that produces the transgenic cotton Bollgard® I

Sotero Aguilar-Medel1 y J. Concepción Rodríguez-Maciel2. 1Universidad Autónoma del Estado de México. Centro Universitario Tenancingo. Tenancingo, Edo. de México. [email protected]. 2Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, Edo. de México. [email protected].

Palabras Clave: Toxina Cry1Ac, Helicoverpa zea, algodonero transgénico

Introducción En las décadas de los 60´s y 70´s, la resistencia a insecticidas de varias plagas del algodonero provocó que se dejará de sembrar algodón en las zonas agrícolas de Apatzingán, Michoacán; Tapachula, Chiapas y Matamoros, Tamaulipas. La zona algodonera de Tamaulipas se recuperó lentamente para sufrir otra crisis a mediados de la década de los 90´s debido a la resistencia del gusano tabacalero Heliothis virescens Fabricius a insecticidas piretroides (Terán-Vargas 1996). Otros factores como el bajo rendimiento, bajo precio, sequías, elevados costos de producción, falta de subsidios adecuados e importación de fibra barata, han impedido que la superficie nacional rebase las 140,000 ha al año (Martínez-Carrillo y Díaz-López 2005). Dentro de un escenario de elevados niveles de resistencia a insecticidas convencionales, el algodonero transgénico Bollgard® que produce la toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis var kustaki Berliner (Bt) (Perlak et al. 1991), representó una alternativa viable para cultivar algodonero. El algodonero Bollgard® es efectivo para controlar a H. virescens y Pectinophora gossypiella Saunders, pero solo controla infestaciones moderadas o bajas del gusano elotero, Heicoverpa zea Boddie (Meeusen y Warren 1989), plaga que está ampliamente distribuida en las zonas algodoneras de los estados de Chihuahua, Coahuila, Durango, Sonora y Tamaulipas en donde se presentan infestaciones de bajas a moderadas. Por lo tanto, en México, el gusano elotero ha estado bajo presión de selección con algodonero Bollgard® desde 1996, año en que se introdujo este cultivo al mercado mundial (Layton et al. 1997) y en México (Martínez-Carrillo y Díaz-López 2005). A la fecha no se han reportado casos de resistencia de H. zea en campo a las δ- endotoxinas de Bt. Sin embargo, en condiciones de laboratorio varias especies de lepidópteros sometidos a presión de selección con estas toxinas han desarrollado altos niveles de resistencia (Ferré y Van Rie 2002). En consecuencia, existe la preocupación de que las poblaciones de campo seleccionadas con cultivos Bt puedan llegar a desarrollar resistencia. Con la finalidad de mitigar el desarrollo de la resistencia al algodonero Bollgard®, se ha usado como estrategia la expresión de altas dosis de δ-endotoxina Cry1Ac en el cultivo Bollgard® y el establecimiento de áreas adyacentes con algodonero convencional

836 que sirven como refugio al permitir el desarrollo de individuos susceptibles que se espera copulen con aquellos que pudieran emerger de cultivo Bt (Alstad and Andow 1995). La eficacia de esta estrategia se mide mediante la evaluación de la respuesta a través de bioensayos de línea base y de dosis diagnóstica. El uso adecuado de la dosis de diagnóstica incrementa la posibilidad de detectar la aparición de fenotipos resistentes antes de que la resistencia sea un problema en campo, tal como lo sugieren Ffrench-Constant y R. T. Roush (1990). El objetivo del presente estudio consistió en evaluar durante el periodo 1998-2007, la respuesta a la dosis diagnóstica de la δ-endotoxina Cry1Ac (5 µg mL-1) en larvas neonatas de H. zea provenientes de zonas agrícolas donde se siembra el algodonero transgénico Bollgard®.

Materiales y Método Poblaciones de H. zea. Se colectaron individuos de ocho poblaciones provenientes de los estados de Chihuahua: Jiménez (1998-2001), Delicias y Juárez (2000-2007); Tamaulipas: Gonzáles (1998, 2000 y 2001), Costa y Ponciano (1998); Coahuila y Durango: La Laguna, (1998-2007); Sonora: Caborca (1999). En cada sitio se colectaron al menos 300 larvas de diferentes instares y se llevaron al laboratorio de Toxicología del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Estado de México. Como población susceptible de referencia se utilizó una colonia de H. zea proporcionada por el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMyT) ubicado en Texcoco, Estado de México. Esta población se ha mantenido por más de 15 años bajo condiciones de laboratorio y no ha sido sometida a presión de selección con insecticidas. Cría del gusano bellotero. Las larvas colectadas en campo fueron colocadas en una cámara de cría en condiciones controladas: temperatura de 271oC, humedad relativa del 705% y un fotoperiodo de 14 horas luz. Estas larvas se alimentaron con dieta artificial hasta obtener las pupas, las cuales se colocaron en jaulas entomológicas (25 x 25 x 35 cm) para la emergencia de los adultos, mismos que fueron alimentados con una solución azucarada al 10% (agua destilada y miel de abeja). Las hembras ovipositaron sobre la tela que recubría a la jaula, esta tela se cambió cada 24 horas durante el periodo de oviposición. Se obtuvieron larvas F1 con los que se realizaron los bioensayos correspondientes. Bioensayo de la dosis diagnóstica. Se utilizó el método descrito por Sims et al (1996), el cual consiste en colocar un mililitro de dieta artificial en cada cavidad de una charola para bioensayo (Bio-Assay Tray Bio-Ba-128; C-D Internatiotal, Inc.) y superficialmente se colocaron 200 L de la dosis diagnóstica de 5 µg/mL de la toxina Cry1Ac. Se usó como solvente una solución de agua-agar al 0.2%. Después de 24 horas de haber depositado la toxina en cada cavidad, se colocó en cada una de éstas una larva neonata; las larvas quedaron confinadas con un plástico transparente autoadherible, el cual tiene microperforaciones que permiten el intercambio gaseoso. Las charolas infestadas con larvas fueron colocadas en la cámara de cría en condiciones controladas anteriormente descritas. Cinco días después de haber infestado las charolas, se evaluaron las siguientes variables: a) porcentaje de mortalidad, b) porcentaje de larvas que alcanzaron el tercer instar y c) porcentaje de reducción del peso de larvas tratadas respecto al testigo. La mortalidad en los tratamientos respecto al testigo se ajustó mediante el empleo de la fórmula de Abbott (Abbott 1925). En cada bioensayo se hicieron cinco repeticiones en

837 diferentes días. Cada repetición consistió de 96 larvas expuestas a la dosis diagnóstica y un testigo de 32 larvas; en total se utilizaron 640 larvas por bioensayo. Toxina. Se utilizó el insecticida comercial MVP II (Mycogen, Corp. San Diego, CA), formulación sólida que contiene una protoxina híbrida similar a la -endotoxina Cry1Ac de B. thuringiensis var. kurstaki, expresada y encapsulada en Pseudomas fluorescens (Gilroy y Wilcox 1992). La concentración del ingrediente activo en el producto es 19.1%.

Análisis estadístico. Las medias de los porcentajes de mortalidad, y porcentajes de reducción del peso que se obtuvieron en los diferentes años, fueron comparados mediante análisis de varianza (ANOVA, =0.05) para determinar si existen cambios de susceptibilidad de H. zea a la toxina Cry1Ac a través de los años.

Resultados Mortalidad. Los porcentaje de mortalidad de las larvas fueron alrededor de 21%; aunque el menor porcentaje fue del 17.8% en la población de La Laguna en 1999, y el mayor fue del 27.8% en la población de González en 1998. En general, el 79% de las larvas tratadas sobrevivieron a la dosis diagnóstica (Cuadro1).

Cuadro 1. Mortalidad promedio de larvas neonatas de Helicoverpa zea Boddie después de cinco días de exposición a la dosis diagnóstica de la δ-endotoxina Cry1Ac (5 μg mL-1) de B. thuringiensis en cada año de evaluación. Población Mortalidad (%)a± EEb 1998 1999 2000 2001 2002 Costa 23.1±2.4 González 27.8±2.2a 20.9±3.0b 20.9±3.2b Jiménez 20.2±2.2a 18.3±4.2a 20.9±3.4a 23.7±1.7a Ponciano 19.5±4.9 Caborca 19.4±0.8 Laguna 20.5±6.8a 18.8±5.2a 18.9±3.2a 23.5±2.8a 19.4±3.4a Delicias 19.2±4.1a 24.0±3.9a 21.1±4.6a Juárez 21.4±2.9a 24.7±2.9a 21.7±4.4a Susceptible 28.2±3.0a 21.3±4.5b

Población Mortalidad (%)a± EEb 2003 2004 2005 2006 2007 Costa González Jiménez Ponciano Caborca Laguna 18.6±5.2a 21.6±3.2a 21.2±4.0a 21.6±3.3a 20.5±4.3a Delicias 20.1±4.6a 24.1±5.7a 21.3±3.8a 21.0±2.6a Juárez 22.1±5.5a 20.7±4.1a 20.7±2.5a 20.5±3.5a 20.4±2.3a Susceptible 19.8±3.6b 20.2±4.5b 21.9±4.6b 21.7±3.3b 20.4±6.0b Tamaño de muestra: 480 larvas expuestas a la dosis diagnóstica por población por año, 160 larvas en el testigo por población por año. Valores dentro de cada hilera que tengan la misma letra no son significativamente diferentes entre sí (Tukey, α = 0.05). aPorcentaje de mortalidad. bError estándar de la media.

838 Porcentaje de larvas del 3er instar. El 79% de las larvas que sobrevivieron a la dosis diagnóstica se mantuvieron entre el primero y el segundo instar, mientras que más del 83% de las larvas testigo se desarrollaron al tercer instar (Cuadro 2).

Cuadro 2. Porcentaje de larvas neonatas de Helicoverpa zea que se desarrollaron al tercer instar después de cinco días de exposición la dosis diagnóstica de la δ-endotoxina Cry1Ac (5 µg/mL) de B. thuringiensis. Población Tratamiento Larvas del tercer instar (%) ± SEa 1998 1999 2000 2001 2002 Costa Dosis Diag.b 0.0 Testigo 86.3±3.2 González Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 Testigo 93.1±2.3 89.7±2.8 91.3±3.6 Jiménez Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 90.0±2.3 88.5±4.2 89.0±3.9 90.9±3.6 Ponciano Dosis Diag. 0.0 Testigo 90.0±6.1 Caborca Dosis Diag. 0.0 Testigo 88.8±3.2 Laguna Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 93.8±6.6 89.6±4.4 89.6±3.7 92.8±4.9 89.4±5.0 Delicias Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 Testigo 89.4±4.2 90.3±3.0 90.4±3.3 Juárez Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 Testigo 89.4±3.2 91.3±3.6 89.0±4.6 Susceptible Dosis Diag. 0.0 0.0 Testigo 90.6±4.4 90.0±4.2

Población Tratamiento Larvas del tercer instar (%) ± SEa 2003 2004 2005 2006 2007 Costa Dosis Diag.b Testigo González Dosis Diag. Testigo Jiménez Dosis Diag. Testigo Ponciano Dosis Diag. Testigo Caborca Dosis Diag. Testigo Laguna Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 87.5±4.3 90.2±5.7 93.5±3.9 93.1±4.4 88.1±6.2 Delicias Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 87.1±4.3 84.0±13 90.2±4.7 91.9±4.2 Juárez Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 87.5±2.8 90.2±4.8 91.7±3.6 91.9±4.2 87.5±6.6 Susceptible Dosis Diag. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Testigo 90.6±4.0 87.5±4.4 93.1±5.4 91.9±3.2 83.1±4.2 Tamaño de muestra: 480 larvas expuestas a la dosis diagnóstica por población por año, 160 larvas en el testigo por población por año. a Error estándar de la media. b Dosis diagnóstica (5 µg/mL) de la δ-endotoxina Cry1Ac de B. thuringiensis.

839 Porcentaje de reducción del peso. El peso promedio de las larvas que sobrevivieron a la dosis diagnóstica fue alrededor de 0.2 mg, mientras que el peso de las larvas testigo fue de 22 mg en promedio, esto significa que el peso de las larvas tratadas con la dosis diagnóstica de la toxina Cry1Ac se redujo alrededor del 99% (Cuadro 2). Cuadro 3. Reducción del peso de larvas neonatas de Helicoverpa zea Boddie después de cinco días de exposición a la dosis diagnóstica (5 μg mL-1) de la δ-endotoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis. Población Mortalidad (%)a± EEb 1998 1999 2000 2001 2002 Costa 99.0±0.2 González 99.1±0.2a 99.0±0.2a 99.3±0.2a Jiménez 99.0±0.1a 99.1±0.2a 99.0±0.2a 99.3±0.2a Ponciano 99.2±0.2 Caborca 99.1±0.1 Laguna 99.2±0.0a 99.1±0.2a 99.0±0.1a 99.2±0.1a 98.9±0.2a Delicias 98.9±0.2a 99.2±0.1a 99.0±0.1a Juárez 98.8±0.1a 99.3±0.1a 99.0±0.2a Susceptible 99.0±0.1a 99.0±0.1a

Población Mortalidad (%)a± EEb 2003 2004 2005 2006 2007 Costa González Jiménez Ponciano Caborca Laguna 98.9±0.2a 99.0±0.2a 99.0±0.1a 98.9±0.2a 98.9±0.2a Delicias 98.7±0.3a 99.1±0.2a 99.0±0.2a 98.9±0.2a Juárez 98.7±0.2a 99.0±0.2a 99.0±0.2a 98.8±0.2a 98.9±0.2a Susceptible 98.7±0.3a 99.1±0.2a 98.9±0.3a 98.8±0.2a 98.8±0.2a Tamaño de muestra: 480 larvas expuestas a la dosis diagnóstica por población por año, 160 larvas en el testigo por población por año. Valores dentro de cada hilera que tengan la misma letra no son significativamente diferentes entre sí (Tukey, α = 0.05). aPorcentaje de mortalidad. bError estándar de la media.

Discusión y Conclusiones La dosis diagnóstica de 5 μg/mL de la toxina Cry1Ac fue determinada previamente en bioensayos de la línea base de una población susceptible, con esta dosis se espera que ninguna larva nenonata se desarrolle al tercer instar en cinco días de exposición bajo condiciones controladas previamente indicadas; en caso de registrarse larvas que alcancen este estado de desarrollo en la dosis diagnóstica, existe la posibilidad de que las poblaciones estén desarrollando resistencia. Hasta ahora, en ninguna población y en ninguna temporada se han registrado larvas del tercer instar, esto significa que las poblaciones de H. zea que han sido monitoreadas no han desarrollado resistencia a la toxina Cry1Ac que produce el algodonero transgénico Bollgard®. Las razones por las cuales no se ha desarrollado la resistencia, posiblemente porque H. zea es una plaga altamente polífaga y se alimenta de otros cultivos que no producen la toxina de B. thuringiensis. El cultivo del maíz también es hospedera de esta plaga y en cada año se siembran por lo menos ocho millones de hectáreas; así también, es poca la superficie de algodón transgénico que se siembra en México (52, 000 ha en el 2006) respecto a otros países como Estado Unidos, China, y La India donde en cada uno de ellos rebasan el millón de hectáreas

840 de algodón transgénico. Además, las zonas algodoneras de México no están compactadas, es decir, distan a grandes distancias entre una y otra zona, este aspecto beneficia la migración de individuos adultos y se diluye la resistencia. Por estas razones y en base a los resultados de monitoreo obtenidos en laboratorio durante diez años, se concluye que las poblaciones del gusano bellotero H. zea siguen siendo susceptibles a la toxina Cry1Ac que produce el algodonero transgénico Bollgard®.

Literatura Citada Alstad, D. N., and D. A. Andow. 1995. Implementing management of insect resistance to transgenic crops. AgBiotech news 8: 177-181. Ferré, J., and J. Van Rie. 2002. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. Annu. Rev. Entomol. 47: 501–533. Ffrench-Constant, R. H., and R. T. Roush. 1990. Resistance detection and documentation: the role of pesticidal and biochemical assays, pp. 4-38. In R. T. Roush and B. E. Tabashnik, [eds.], Pesticide resistance in arthropods. Chapman and Hall. Gilroy, T. E., and E. R. Wilcox. 1992. Hybrid Bacillus thuringiensis gene, plasmid, and transformed Pseudomonas fluorescens. U. S. Patent 5, 128,130. Layton, M. B., M. R. Williams, and S. Stewart. 1997. Bt-cotton in Mississippi: the first year, pp. 861-863. Proc. Beltwide Cotton Conference, 6-10 January 1997. New Orleans, Louisiana. National Cotton Council of America, New Orleans, LA. Martínez-Carrillo, J. L., and N. Díaz-López. 2005. Nine years of transgenic cotton in México, adoption and resistance management results, pp. 1368-1372. In Proc. Beltwide Cotton Conference, 4-7 January 2005, New Orleans, Louisiana. National Cotton Council of America, Memphis TN. Meeusen, R. L., and G. Warren. 1989. Insect control with genetically engineered crops. Ann. Rev. Entomol. 34: 373-381. Perlak, F. J., R. L. Fuchs, D. A. Dean, S. L. McPherson, and D. A. Fischhoff. 1991. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3324-3328. Sims, S. B., J. T. Greenplate, T.B. Stone, M. A. Caprio, and F. L. Gould. 1996. Monitoring strategies for early detection of Lepidoptera resistance to Bacillus thuringiensis insecticidal proteins, pp. 229-242. in T. M. Brown [ed.], Molecular genetics and evolution of pesticide resistance. ACS Symposium Series No. 645. American Chemical Society, Washington, DC. Terán-Vargas, A. P. 1996. Insecticide resistance of tobacco budworm in the Southern Tamaulipas, México, pp. 784-786. In Proc. Beltwide Cotton Conference, 9-12 January 1996, Nashville, TN. National Cotton Council of America, Memphis, TN.

841 MONITOREO DE LA RESISTENCIA DE Helicoverpa zea BODDIE A LA TOXINA Cry2Ab QUE PRODUCE EL ALGODONERO TRANSGÉNICO BOLLGARD® II

Monitoring the resistance of Helicoverpa zea Boddie to Cry2Ab toxin that produces the transgenic cotton Bollgard II®

Sotero Aguilar-Medel1 y J. Concepción Rodríguez-Maciel2. 1Universidad Autónoma del Estado de México. Centro Universitario Tenancingo. Tenancingo, Estado de México. [email protected]. 2Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco, Estado de México. [email protected].

Palabras Clave: gusano elotero, resistencia, algodón transgénico

Introducción El algodonero transgénico Bollgard® I produce la toxina Cry1Ac (Perlak et al. 1990, 1991), y ofrece buen control contra algunas plagas lepidópteros, tales como el gusano tabacalero Heliothis virescens F., el gusano rosado Pectynophora gossypiella Saunders (Meeusen y Warrn, 1989) y un control moderado en el gusano bellotero Helicoverpa zea Boddie. Los cultivos que producen una sola toxina de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) son considerados como cultivos de la primera generación. Los adelantos de la ingeniería genética han permitido desarrollar cultivos que expresan más de una toxina de Bt en la misma planta (cultivos de la segunda generación). La expresión de ambas toxinas en la misma planta ofrece la ventaja de incrementar el rango de insectos que controlan y la de eliminar a los insectos que desarrollen resistencia a una de las toxinas (Adamcyzk et al 2001). Desde un principio, el algodonero transgénico Bt tuvo una amplia aceptación por parte de los agricultores de todo el mundo, por lo que en el 2007 se sembraron más de 12 millones de hectáreas (ISAAA, 2007), y a pesar de que estos cultivos Bt producen la toxina durante todo su ciclo de cultivo y ya se han sembrado por más de una década (1996-2007), hasta ahora no se han reportado casos de resistencia en el campo; sin embargo, en condiciones de laboratorio varias plagas lepidópteros sometidos a presión de selección con toxinas Bt han desarrollado altos niveles de resistencia (Ferre´ y Van Rie, 2002); razón por la cual, existe la probabilidad de que las poblaciones de campo puedan llegar a desarrollar resistencia a estas toxinas. Con la finalidad de mitigar la evolución de la resistencia, se han implementado estrategias que retarden el desarrollo de la resistencia, como es el establecimiento de las áreas de refugio cuya función es la de preservar los genes de susceptibilidad (Alstad and Andow 1995), la expresión de altas dosis de toxina por parte de la planta y la expresión de más de una toxina en la misma planta cuyos receptores en el intestino medio de los insectos blanco no son los mismos para las dos toxinas. Como parte de las estrategias del manejo de la resistencia, se ha implementado el monitoreo de la resistencia, que consiste en evaluar periódicamente el nivel de susceptibilidad de las plagas a las toxinas que produce el algodonero transgénico Bollgard®, ya que en condiciones de laboratorio, es donde se espera se detecten los genotipos resistentes antes de que la resistencia sea un problema en campo. En México, el algodonero transgénico Bollgar® I se empezó a cultivar en 1996, mientras que el algodonero transgénico Bollagard® II que produce las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab se introdujo en nuestro país con fines experimentales en el 2002. Hasta ahora no se

842 ha autorizado su uso comercial, pero desde en el 2002 se vienen realizando evaluaciones de efectividad biológica en campo. En condiciones de laboratorio se han realizando estudios de susceptibilidad mediante bioensayos de la línea base y bioensayos de la dosis diagnóstica (Aguilar-Medel 2002; Aguilar-Medel et al 2007). En México, el programa del monitoreo de la resistencia se inició desde que se empezó a cultivar el algodonero transgénico Bollgard® I (1996); con la introducción del algodonero transgénico Bollgard® II, se hace necesario incluir dentro de este programa el monitoreo de la resistencia a la toxina Cry2Ab; por lo que en el presente trabajo se presentan los resultados obtenido sobre el monitoreo de la resistencia del gusano bellotero H. zea a la toxina Cry2Ab que produce el algodonero transgénico Bollgard® II, desde el 2002 hasta el 2007.

Materiales y Método Poblaciones de H. zea. En el 2002 las poblaciones que se evaluaron la susceptibilidad a la toxina Cry2Ab fueron: “La Laguna” (Ejidos Florida y Las Vegas, municipio de Francisco I. Madero; Ejidos Coyote y Compuertas, municipio de Matamoros; Ejidos Urquizos, municipio de San Pedro de las Colonias, Coahuila), “La Huasteca” (municipios de Mante y Altamira, Tamaulipas), y “Delicias” (Ejido Lázaro Cárdenas, municipio de Meoqui, Chihuahua). En el 2003 se monitoreó la población de “Juárez” (Ejido Esperanza, municipio de Praxedis Gilberto Guerrero y Ejido Tres Jacales, municipio Guadalupe, Chihuahua). En el 2004: La Laguna, Juárez, Delicias y la población de referencia, y en el 2007: La Laguna, Juárez y la población de referencia. En el 2007 las poblaciones de la Huasteca y Delicias se dejaron de monitorear debido a que en estos lugares ya no se cultiva el algodonero Bollgard® o la superficie se redujo considerablemente. Durante el ciclo primavera-verano de cada temporada (año), en cada población se colectaron al menos 300 larvas de diferentes ínstares. Las larvas se llevaron al laboratorio de Toxicología del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Estado de México y se criaron hasta obtener larvas neonatas de la generación F1 con los cuales se realizaron los bioensayos de la dosis diagnóstica 5 µg/mL de la toxina Cry2Ab. Como referencia de susceptibilidad se utilizó una población que proporcionó el Centro Internacional del Mejoramiento del Maíz y Trigo (CIMMyT), ubicado en Texcoco, Edo. de México. Esta población se recolectó en campo hace 15 años y desde entonces se ha mantenido en condiciones de laboratorio libre de presión de selección con insecticida. Cría del gusano bellotero. Las larvas colectadas en campo se colocaron individualmente en vasitos con diez mL de dieta artificial (Tobacco Bollworm; Southland Products Inc.) y se mantuvieron en una cámara de cría en condiciones controladas: temperatura de 271oC, humedad relativa del 705% y un fotoperiodo de 14 horas luz. Las larvas se mantuvieron en dieta hasta obtener las pupas; estas pupas se colocaron en jaulas entomológicas (25 x 25 x 35 cm) para la emergencia de los adultos, mismos que fueron alimentados con una solución azucarada al 10% (agua destilada y miel de abeja). Las hembras ovipositaron sobre la tela que recubría a la jaula, esta tela se cambió cada 24 horas durante el periodo de oviposición y se enjuagó en un recipiente con agua clorada al 5% para desinfectar y desprender los huevecillos de la tela. Los huevecillos suspendidos en el agua se recolectaron con un tamiz de 60 mallas por pulgada, y se colocaron sobre un papel filtro en una caja circular de 20 cm de diámetro. Las cajas con los huevecillos fueron colocadas en la cámara de cría para la emergencia de las larvas F1 que serían utilizadas para realizar los bioensayos correspondientes.

843 Bioensayo de la dosis diagnóstica. Se utilizó el método descrito por Sims et al (1996), el cual consiste en colocar un mililitro de dieta artificial en cada cavidad de una charola para bioensayo (Bio-Assay Tray Bio-Ba-128; C-D Internatiotal, Inc.). Una vez que la dieta solidificó, se depositaron superficialmente en cada cavidad 200 L de la dosis diagnóstica de 5 µg/mL de la toxina Cry2Ab. Se usó como solvente una solución de agua- agar al 0.2% (Bacto Nutrient Agar Dehydrated; Difco Laboratories).

Después de 24 horas de haber depositado la toxina en cada cavidad se colocó en cada una de éstas una larva neonata, las larvas quedaron confinadas con un plástico transparente autoadherible (Pull N’ Peel Tab Bio-CV-16; C-D Internacional, Inc.), el cual tiene microperforaciones que permiten el intercambio gaseoso.

Las charolas de bioensayos con larvas tratadas fueron colocadas a la cámara de cría en condiciones controladas (temperatura de 271oC, humedad relativa de 705% y un fotoperiodo de 14 horas luz). Cinco días después de haber infestado la dieta tratada con larvas neonatas, se evaluaron las siguientes variables: a) porcentaje de mortalidad, b) porcentaje de larvas que alcanzaron el tercer instar y c) porcentaje de reducción del peso de larvas tratadas respecto al testigo. La mortalidad en los tratamientos respecto al testigo se ajustó mediante el empleo de la fórmula de Abbott (Abbott 1925).

El nivel de mortalidad máximo aceptable para el testigo fue del 10%. La dosis diagnóstica de 5 g/mL de la toxina fue validada previamente en una población susceptible mediante bioensayos de la línea base. El principal criterio usado en estos bioensayos de la dosis diagnóstica, es de que con esta dosis, ninguna larva neonata de H. zea se desarrolla al tercer instar. En cada bioensayo se hicieron cinco repeticiones en diferentes días. Cada repetición consistió de 96 larvas expuestas a la dosis diagnóstica y un testigo de 32 larvas; en total se utilizaron 640 larvas por bioensayo.

Toxina. Como fuente de la δ-endotoxina Cry2Ab, se utilizó tejido liofilizado de la planta de maíz, Zea mays L., modificada genéticamente y que produce dicha toxina a la concentración de 0.6%.

Análisis estadístico. Las medias de los porcentajes de mortalidad, y porcentajes de reducción del peso que se obtuvieron en los diferentes años, fueron comparados mediante análisis de varianza (ANOVA, =0.05) para determinar si existen cambios de susceptibilidad de H. zea a la toxina Cry2Ab a través de los años.

Resultados Mortalidad. Los porcentajes de mortalidad registrados en la población de la Laguna son similares desde el 2002 hasta el 2007; esta fluctuó entre el 37.5 y 40.3%. En la población de Juárez la mortalidad varió del 36.1 al 38.4%. En Delicias, en el 2002 fue del 31.9%, mientras que en el 2004 del 37.5%. En la población Huasteca solo se monitoreó la resistencia en el 2002, en esta temporada la mortalidad fue del 31.7%. Los porcentajes de mortalidad que se registraron en la población susceptible fueron alrededor del 40%, este porcentaje es similar a los registrados en las poblaciones de campo (Cuadro 1).

844 Cuadro 1. Porcentaje de mortalidad de larvas de Helicoverpa zea por efecto de la dosis diagnóstica 5 µg/mL de la toxina Cry2Ab. Poblaciones 2002 2003 2004 2007 Laguna 40.3a 38.2a 37.5a Juárez 37.1a 38.4a 36.1a Delicias 31.9b 37.5a * Huasteca 31.7 * * * Susceptible 34.7b 42.5a 39.3a Las medias con la misma letra en cada fila, no difieren estadísticamente (Tukey = 0.05). * En estas localidades se redujo considerablemente la siembra del algodonero Bollgard®.

Porcentaje de larvas del 3er instar. Aproximadamente el 60% de las larvas sobrevivieron a la dosis diagnóstica, pero ninguna de ellas se desarrollaron al tercer instar; mientras que en sus respectivos testigos, más del 80% de las larvas se desarrollaron al tercer instar (Cuadro 2).

Cuadro 2. Porcentaje de larvas del 3er instar de Helicoverpa zea por efecto de la dosis diagnóstica 5 ug/mL de la toxina Cry2Ab. Poblaciones 2002 2003 2004 2007 Laguna 0.0 0.0 0.0 Juárez 0.0 0.0 0.0 Delicias 0.0 0.0 * Huasteca 0.0 * * * Susceptible 0.0 0.0 0.0 * En estas localidades se redujo considerablemente la siembra del algodonero Bollgard®.

Porcentaje de reducción del peso. El peso promedio de las larvas que sobrevivieron a la dosis diagnóstica de 5 ug/mL de la toxina Cry2Ab fue de 0.2 mg, mientras que el peso promedio de las larvas testigo fue de 20 mg; esto significa que el peso de las larvas expuestas a la toxina Cry2Ab se redujo alrededor del 99% (Cuadro 3). Los resultados obtenidos desde el 2002 hasta el 2007 fuero similares estadísticamente.

Cuadro 3. Porcentaje de reducción del peso de larvas de Helicoverpa zea por efecto de la dosis diagnóstica 5 ug/mL de la toxina Cry2Ab. Poblaciones 2002 2003 2004 2007 Laguna 98.8a 98.7a 98.2a Juárez 98.6a 98.7a 98.9a Delicias 99.1a 98.7a * Huasteca 98.9 * * * Susceptible 99.1a 98.6a 98.8a Las medias con la misma letra en cada fila, no difieren estadísticamente (Tukey = 0.05). *En estas localidades se redujo considerablemente la siembra del algodonero Bollgard®.

Discusión y Conclusiones El mayor porcentaje de mortalidad de las larvas con la dosis diagnóstica de 5 μg/mL de la toxina Cry2Ab fue del 40%, lo que significa que más 60% de las larvas sobrevivieron a esta dosis diagnóstica. La mortalidad es una variable ampliamente usada en toxicología

845 para estudiar resistencia a plaguicidas convencionales; sin embargo, en el caso de las toxinas que produce la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt), no se considera como un parámetro confiable para evaluar resistencia en insectos lepidópteros (Sims et al 1996), debido a que estas toxinas a diferencia de los insecticidas convencionales, el efecto es relativamente más lento y presentan efectos subletales sobre las larvas, por lo que la mortalidad a los cinco días, realmente no se trata de la mortalidad absoluta, ya que posteriormente las larvas se siguen muriendo, o bien, sobreviven pero su calidad de vida se reduce significativamente, la cual repercute en su estado adulto o en su capacidad reproductiva, razón por la cual se midieron otros parámetros como es el porcentaje de larvas que se desarrollaron al tercer instar y el porcentaje de reducción del peso. En el caso del porcentaje de larvas que se desarrollaron al tercer instar, se espera que ninguna de ellas se desarrolle a este estado de desarrollo si la población es susceptible, ya que las larvas que fungen como testigo, más del 80% alcanzaron este estado de desarrollo. En el caso de las poblaciones evaluadas, en ninguna temporada hubo desarrollo de larvas del tercer instar, además el peso de estas larvas se redujo poco más del 98%. Es decir, las larvas que sobrevivieron a la dosis diagnóstica de 5 μg/mL de la toxina Cry2Ab a los cinco días, son extremadamente pequeñas y su calidad de vida se reduce significativamente, razón por la cual, se concluye que las poblaciones del gusano bellotero Helicoverpa zea procedentes de las regiones algodoneras de la Planice Huasteca, Comarca Lagunera, Juárez y Delicias Chih., siguen siendo susceptibles a la toxina Cry2Ab que produce el algodonero transgénico Bollgard® II.

Literatura Citada Abbott, W. S. 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18: 265-267. Adamcyzk, J. J., Jr., L. C. Adams, and D. D. Hardee. 2001. Field efficacy and seasonal expression profiles for terminal leaves of single and double Bacillus thuringiensis toxin cotton genotypes. J. Econ. Entomol. 94:1589–1593. Aguilar-Medel, S. 2002. Susceptibilidad del gusano bellotero Helicoverpa zea BODDIE (Lepidóptera: Noctuidae) a la δ-endotoxina CryIA(c) de Bacillus thuringiensis BERLINER var. kurstaki. Tesis de Maestría. Colegio de Postgraduados. Montecillo, Edo. de México. Méx. Aguilar-Medel, S., J. C. Rodríguez-Maciel, O. Díaz-Gómez, J. L. Martínez-Carrillo, J. López-Collado, C. A. Blanco y A. Lagunez-Tejeda. 2007. Susceptibilidad de Helicoverpa zea (Boddie) a la delta-endotoxina Cry2Ab de Bacillus thuringiensis Berliner. Agrociencia. 41: 653-662. Alstad, D. N. and D. A. Andow. 1995. Implementing management of insect resistance to transgenic crops. AgBiotech news 8:177-181. Ferre´, J., and J. Van Rie. 2002. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. Annu. Rev. Entomol. 47:501–533. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications [ISAAA] 2007. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/37/pptslides/default.html Meeusen, R. L. and G. Warren. 1989. Insect control with genetically engine ered crops. Ann. Rev. Entomol. 34:373-381.

846 Perlak, F. J., R. L. Fuchs, D. A. Dean, S. L. McPherson, and D. A. Fischhoff. 1991. Modification of the coding sequence enhances plat expression of insect control protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3324-3328. Perlak, F. J., R. W. Deaton, T. A. Armstrong, R. L. Fuchs, S. R. Sims, J. T. Greenplate, and D. A. Fischoff. 1990. Insect resistant cotton plants Bio Technology. 8: 939-943. Sims, S. B., J. T. Greenplate, T.B. Stone, M. A. Caprio and F. L. Gould. 1996. Monitoring strategies for early detection of Lepidoptera resistance to Bacillus thuringiensis insecticidal insecticidal proteins, pp. 229-242. in T. M. Brown (ed.) Molecular Genetics and Evolution of Pesticide Resistance. ACS Symposium Series No. 645. American Chemical Society, Washington, DC.

847 EFECTO DEL INHIBIDOR DE TRIPSINA DE LA SEMILLA DE CHAN (Hyptis suaveolens) SOBRE EL DESARROLLO DE Prostephanus truncatus HORN. (COLEÓPTERA:BOSTRICHIDAE)

Effect of the trypsin inhibitor from chan seeds (Hyptis suaveolens) on the development of Prostephanus truncatus Horn. (Coleoptera:Bostrichidae)

José Luis Castro-Guillén1, Elizabeth Mendiola-Olaya1, Lucrecia Contreras-Rivera1, Luis González-De la Vara1, Cesar Leobardo Aguirre-Mancilla2, Alejandro Blanco-Labra1. 1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas. Departamento de biotecnología y Bioquímica. Km. 9.6 Libramiento Norte, Carretera Irapuato-León, Irapuato, Guanajuato, México. Apartado postal 629, C. P. 36821. 2Instituto Tecnológico de Roque, Celaya, Guanajuato. Km. 8 Carretera Celaya-Juventino Rosas, Apartado Postal 508, C. P. 38110. [email protected]

Palabras Clave: Prostephanus truncatus, inhibidores de proteasas, proteasas digestivas.

Introducción Prostephanus truncatus (Horn) (Coleóptera: Bostrichidae) es un insecto nativo de mesoamérica (Chittenden, 1911), que habita en zonas tropicales, encontrándose desde el sur de Estados Unidos, México y Centroamérica, hasta el noreste de Sudamérica (Golob y Hodges, 1982; Nissen, 1991; Hodges, 1994). Este insecto fue introducido accidentalmente en África a finales de los 70’s, causando grandes pérdidas en cultivos como yuca y maíz (Golob y Hodges, 1982; Wright et al. 1993). Recientemente se ha reconocido que este insecto es la plaga más destructiva en África (Boxall, 2002). Reportes bien documentados de África y Latinoamérica muestran que las pérdidas causadas por P. truncatus varían del 9 al 45%, dependiendo del periodo de almacenamiento (Hodges, et. al., 1983; Markham, et. al., 1991). La capacidad de infestación de P. truncatus se debe, en gran parte, a la habilidad de reproducirse en amplios rangos de temperatura y humedad (Bell y Watters, 1982), a su amplia movilidad aérea (Fadamiro, 1996), a una longevidad de 35 semanas (Nissen, 1991) y a su habilidad para subsistir aún en la ausencia de los cultivos que normalmente ataca, teniendo como alimento a la madera. (Nang’ayo, 1996). Se han probado diferentes tipos de insecticidas para el control de esta plaga (McFarlane, 1988), no obstante, además de sus efectos contaminantes, a la fecha no han podido ofrecer una respuesta definitiva para su control (Giga y Canhao, 1991). Por otra parte, el uso de insecticidas puede afectar, por su falta de especificidad, a otros insectos benéficos que interactúen con este cultivo (Kumar, 2002). Se han planteado otras estrategias de control que no involucren el uso de insecticidas, como por ejemplo, estrategias de antagonismo. Sin embargo, dichas estrategias han probado ser poco efectivas en el caso de P. truncatus. Recientemente, se han desarrollado estrategias que utilizan metabolitos de defensa de plantas (inhibidores enzimáticos, lectinas o metabolitos secundarios) para el control de plagas de algunos cultivos importantes (Gatehouse y Gatehouse, 1998), las cuales han probado ser eficaces para ciertos insectos. De igual manera, se han desarrollado estrategias

848 con otras proteínas de defensa de plantas, como los inhibidores de proteasas, los cuales reducen el crecimiento y desarrollo del insecto, mediante, el bloqueo de las proteasas digestivas de las larvas, limitando la asimilación de aminoácidos de la proteína que sirve de alimento (Pompermayer, et. al., 2001). En su aplicación, ha habido tanto éxitos, como fracasos (Ryan, 1990; Broadway, 1997; Franco, et. al., 2004; Bažok, et. al., 2005; Pilon, et. al., 2006). En el 2004, Aguirre Mancilla y col., caracterizaron al inhibidor de tripsina proveniente de la semilla de chan (HSTI), el cual fue potente inhibidor in vitro de la mayoría de las actividades proteolíticas tipo tripsina del intestino de P. truncatus, además de ser específico, ya que no tubo efecto sobre proteasas de otros insectos. Este inhibidor, puede constituir la base de una estrategia de control para P. truncatus, no obstante, es necesario conocer primero su efecto en condiciones normales de crecimiento y desarrollo (ensayos in vivo). Con este propósito fue necesario desarrollar una dieta artificial, que fuera aceptada por el insecto para su oviposición y desarrollo, semejando al grano de maíz. Esta estrategia nos permite evaluar el posible efecto del inhibidor en el crecimiento y desarrollo de P. truncatus. Los resultados muestran que el HSTI, por si solo, no fue capaz de afectar de manera significativa el desarrollo de P. truncatus. Este comportamiento puede deberse al incremento de otro tipo de actividad proteolítica que le permite compensar la pérdida de la actividad suprimida por el HSTI, o bien, que existan proteasas que no reconozcan a este inhibidor y lo hidrolicen al igual que a cualquier otra proteína. Actualmente hemos podido detectar en nuestro laboratorio, la presencia de una serín proteasa tipo quimotripsina, la cual es insensible al HSTI y por lo tanto, está siendo estudiada para su caracterización.

Materiales y Método El HSTI fue aislado de las semillas de chan, de la siguiente manera: Se hizo una extracción acuosa (1:20 p/v) con la harina de estas semillas, el sobrenadante fue centrifugado y precipitado con (NH4)2SO4 al 70% de saturación. Concluida la precipitación, la muestra fue centrifugada a las mismas condiciones y la pastilla fue recuperada, resuspendida y dializada con una membrana de 3 kDa de exclusión contra agua desionizada. El extracto dializado fue sometido a cromatografía de exclusión molecular, con una resina de sephadex G-75, y con NH4HCO3 como fase móvil. A las fracciones resultantes se les midió la absorbancia a 280 nm y se les determinó la actividad inhibitoria de acuerdo al método de Schwertz y Takenaka (1955). Se seleccionaron las fracciones que tenían actividad inhibitoria y se reunieron en una sola muestra (pool), que se liofilizó. El liofilizado enriquecido con HSTI fue pesado y se utilizó en la elaboración de las semillas artificiales. Los insectos fueron mantenidos en recipientes con maíz Cacahuazintle a 28° C ± 2º C y 60% de humedad relativa, bajo foto-periodos de luz-oscuridad de 12 h x 12 h. Para la extracción de larvas y huevecillos, se rompieron cuidadosamente los granos de maíz, se tamizó la harina resultante y se colectó cada uno de los individuos. En el caso de los huevecillos, estos fueron colocados cuidadosamente en agujeros hechos a las semillas artificiales, y cubiertos con la harina residual de la perforación de las semillas. Las larvas fueron contadas, clasificadas de acuerdo a su estadío de desarrollo y pesadas para el análisis de cada tratamiento.

849 Se hicieron 4 tratamientos (0.001, 0.01, 0.1 y 0.15% p/p de HSTI) utilizando semillas artificiales de harina maíz Cacahuazintle de acuerdo a Shade y col. (1986), con algunas modificaciones. Se usaron 7 semillas para cada tratamiento, incluyendo al control, con tres huevecillos cada una. Las semillas fueron incubadas 2 días antes de su uso, para descartar aquellas que pudieran contaminarse; posteriormente fueron colocados los huevecillos e incubadas 25 días en las condiciones utilizadas para el crecimiento de los insectos. Se hizo el análisis estadístico utilizando el paquete de diseños experimentales FAUANL, versión 2.5.

Resultados y Discusión Durante la purificación del HSTI, se fue eliminando secuencialmente proteína no específica; esto se refleja al incrementarse la actividad específica conforme a cada paso de purificación (de 294 a 4537), esto es, que cada vez hay más proteína con actividad inhibitoria. De igual forma, se obtuvieron 15 veces de purificación, en relación a la primera extracción (Cuadro 1), lo que nos indica que el HSTI tiene una pureza aceptable.

Cuadro 1: Cuadro de purificación del inhibidor de tripsina de la semilla de chan (HSTI).

Actividad Actividad Específica % de Veces de Muestra Total (UI) (UI/mg de proteína) Recuperación Purificación

Extracto Crudo 4,803 294 100 1.00 Extracto precipitado 3,020 676 63 2.30 y dializado Cromatografía de 2,557 4,537 53 15.5 exclusión molecular

La proteína seleccionada para los bioensayos provino de la cromatografía de exclusión molecular, en la cual se eliminaron las proteínas de alto peso molecular. Únicamente se colectó el pico correspondiente a la mayor actividad inhibitoria. Las semillas artificiales demostraron ser capaces de permitir la oviposición de P. truncatus, y además permitieron el desarrollo de este insecto, el cual emergió como adulto durante los ensayos (Fig. 1). Otra característica mencionada es la facilidad de homogenización del HSTI a diferentes concentraciones y la estabilidad de éste al final del proceso de preparación de las semillas, lo cual se obtuvo al medir la actividad inhibitoria de las semillas pulverizadas, después de su preparación.

a) b)

Figura 1: Semillas artificiales. a) Semillas infestadas. b) Semillas horadadas y completas.

850 A pesar de que P. truncatus pudo ovipositar en las semillas, no era posible conocer directamente cuantos huevecillos pudiesen ser depositados por el insecto; por lo que se optó por colocar los huevecillos manualmente y con esto, saber cuantos individuos se tienen inicialmente para el ensayo. Al colectarse todos los individuos de P. truncatus de acuerdo a cada tratamiento, se encontró que el HSTI no tuvo efecto tóxico aparente, ya que estadísticamente, no se encontraron diferencias entre el número de individuos de los diferentes tratamientos con respecto al control. Además, el número de individuos variaba entre repeticiones. Todos los individuos fueron pesados y clasificados de acuerdo a su estadío de desarrollo. Para el análisis estadístico, se correlacionaron los pesos de las larvas de acuerdo al tratamiento y se obtuvo el peso promedio de cada estadío, en cada tratamiento utilizado (figura 2), lo cual nos indicó que no había una diferencia significativa entre las larvas de un mismo estadío en diferentes tratamientos.

6 Control 5 0.001% de HSTI 0.01% de HSTI

4 0.1% de HSTI

0.15% de HSTI

3

(mg) 2

Peso promedio del insecto insecto del promedio Peso 1

0 1er 2do 3er 4to Pupa Estadío Estadío Estadío Estadío s Figura 2: Relación de peso promedio de individuos de P. truncatus, separados por estadío de desarrollo; de acuerdo a cada tratamiento con HSTI

Por otro lado, se hizo un análisis de varianza con el software antes mencionado, con base a un arreglo factorial y posteriormente un análisis de medias con la prueba de Tukey. El análisis confirmo lo que se vio en la figura 2, que no había diferencia significativa entre los tratamientos y que por lo tanto, bajo estas condiciones, el HSTI no tiene efecto en el desarrollo de P. truncatus, Dentro de los factores que pueden influir, se encuentra la sobre-expresión de la enzima inhibida (Jongsma, et.al., 1995) o bien, la presencia de otra enzima, a la cual el inhibidor no reconoce y es posible que, este último, lejos de ejercer algún efecto, sea metabolizado por el insecto. Reportes indican que es posible hacer efectiva la acción de un inhibidor, introduciendo otro inhibidor diferente (Oppert, et. al., 2003; Pompermayer, et. al., 2003). Por lo tanto, es posible que el HSTI pueda ser efectivo al suprimir la proteasa o proteasas que puedan estar degradándolo, por medio de otro inhibidor de diferente especificidad. Con el fin de conocer si existen otras serín proteasas que el HSTI no reconoce, se encontró una proteasa intestinal de P. truncatus que fue resistente al HSTI, la cual fue identificada como una serín proteasa tipo quimotripsina, lo que podría ser una explicación para su insensibilidad.

851 Agradecimientos Al Ing. Javier Luevano por haber proporcionado los insectos de P. truncatus y por su apoyo en el manejo de estos.

Literatura Citada Aguirre-Mancilla, C., Valdéz-Rodríguez, S., Mendoza-Hernández, G.,Rojo-Domínguez, A. y Blanco-Labra, A. 2004. A novel 8.7 kDa protease inhibitor from chan seeds (Hyptis suaveolens L.) inhibits proteases from the larger grain borer Prostephanus truncatus (Coleóptera: Bostricidae). Comparative Biochemistry and Physology. Part B. 138:81-89. Bažok, R., Barĉić, J. I. y Edwards, C. R. 2005. Effects of proteinase inhibitors on western corn rootworm life parameters. JEN 129(4):185–190. Bell, R. J. y Watters. F. L. 1982. Enviromental factors influencing the development and rate of increase of Prostephanus truncatus (Horn) (Coleóptera: Bostrichidae) on stored maize. Journal of Stored Products Research. 18: 131-142. Boxall, R.A., 2002. Damage and loss caused by the larger grain borer Prostephanus truncatus. Integral Pest Management Reviews. 7, pp. 105–121. Broadway, R. M. 1997. Dietary regulation of serine proteinase that are resistant to serine proteinase inhibitors. Journal of Insect Physiology. 43(9):855-874. Chittenden, F.H. 1911. Papers on insects affecting stored products.” U.S. Dept. Agricul. Bull. 96 (III), 48–52. Fadamiro, H. Y. 1996. Free Flight capacity determination in a sustained flight tunnel: Effects of age and sexual state on the flight duration of Prostephanus truncatus. Phisiologic. Entomology 22: 29-36. Franco, O. C., Días, S. C., Magalhães, C. P., Monteiro, A.C. S., Bloch, Jr. C., Melo, F. R., Oliveira-Neto, O. B., Monnerat, R. G. y Grossi-de-Sá, M. F. 2004. Effects of soybean Kunitz trypsin inhibitor on the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). Phytochemistry 65 (2004) 81–89 Gatehouse, A.M.R., Gatehouse, J.A., 1998. Identifying proteins with insecticidal activity: use of encoding genes to produce insect-resistant transgenic crops. Pest. Sci. 52, 165–175. Giga, D.P., Canhao, J., 1991. Relative toxicity and persistence of pyrethroid deposits on different surfaces for the control of Prostephanus truncatus (Horn) and Sitophilus zeamais (Motsch.). Journal of Stored Products Research 27, 153–160. Golob, P. y Hodges, R. J. 1982. Study on an outbreak of Prostephanus truncatus (Horn) in Tanzania. Report G. London., Trop. Prod. Inst. 164. Hodges, R.J., Dunstan, W.R., Magazini, I. and Golob, P. 1983. An outbreak of Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera: Bostrichidae) in East Africa. Protection Ecol. 5, 183–94. Hodges, R. J. 1994. Recent advances in the biology and control of Prostephanus truncatus (Coleoptera: Bostrichidae). The 6th International Working Conference on stored- product Protection, Camberra, Australia. Jongsma, M. A., Bakker, P. L., Peters, J., Bosch, D. y Stiekema, W. J. 1995. Adaptation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinase inhibitors by induction of gut proteinase activity insensitive to inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:8041- 8045.

852 Kumar, H. 2002. Resistance in maize to the Larger Grain Borer, Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera: Bostrichidae)”. Journal of stored products research. 38:267- 280. McFarlane, J.A., 1988. Pest management strategies for Prostephanus truncatus (Horn). (Coleoptera; Bostrichidae) as a pest of stored maize grain: present status and prospects. Tropical Pest Management 34, 121–132. Markham R.H., Wright, V.F. y Rios Ibarra, R.M. 1991. A selective review of research on Prostephanus truncatus (Horn) (Col.: Bostrichidae) with an annotated and updated bibliography. CEIBA 32(1), 90pp. Nang'ayo, F. L. O. 1996. Ecological Studies on Larger Grain Borer in Savannah Woodlands of Kenya. London, U. K., Ph. D. thesis. Imperial College. Nissen, U., Laborius, G.A., and Shulz, F.A. 1991. Comparison of populations of Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera: Bostrichidae) of different geographical origins. Journal of Applied Entomology 112: 124-137. Oppert, B., Morgan, T. D., Hartzer, K., Lenarcic, B., Galesa, K., Brzin, J., Turk, V., Yoza, K., Ohtsubo, K. y Kramer, K. J. 2003. Effects of proteinase inhibitors on digestive proteinases and growth of the red flour beetle, Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae). Comparative Biochemistry and Physiology Part C 134:481–490. Pilon, A. M., Oliveira, M. G. A. y Guedes, R. N. C. 2006. Protein digestibility, protease activity, and post-embryonic development of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis) exposed to the trypsin-inhibitor benzamidine. Pesticide Biochemistry and Physiology 86: 23–29. Pompermayer, P., Lopes, A.R., Terra, W.R., Parra, J.R.P., Falco, M.C. y Silva, M.C., 2001. Effects of soybean proteinase inhibitor on development, survival and reproductive potential of the sugarcane borer, Diatraea saccharalis. Entomol. Exp. Appl. 99, 79– 85. Pompermayer, P., Falco, M. C., Parra, J. R. P. y Silva-Filho, M. C. 2003. Coupling diet quality and Bowman-Birk and Kunitz-type soybean proteinase inhibitor effectiveness to Diatraea Saccharalis development and mortality Ryan, C.A., 1990. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens. Ann. Rev. Phytopathol. 28, 425–440. Shade, R. E., Murdock, L. L., Foard, D. F. and Pomeroy, M. A. 1986. Artificial Seed System for Bioassay of Cowpea weevil (Coleoptera: Bruchidae) Growth and development. Environmental Entomology. 15:1286-1291. Schwertz, G. W. y Takenaka, Y. (1955). “A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin activity”. Biochem. Biophys. Acta. 16:571-575. Wright, M.A.P., Akrou-Edi, D. y Stabrawa, A. 1993. Larger Grain Borer Project Togo. Infestation of dried cassava and maize by Prostephanus truncatus: entomological and socioeconomic assessments for the development of loss reduction strategies. Report R1941. Chatham: Natural Resources Institute, U.K.

853 ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE RESPUESTA INMUNE DE Triatoma longipennis INFECTADOS CON Tripanosoma cruzi MEDIANTE ELECTROFORESIS

Immune response proteins analysis from Triatoma longipennis infected with Tripanosoma cruzi trough electrophoresis.

Imbert-Palafox, J.L.1; De La Cruz-Pantoja, M.M2; Becerril-Flores, M.A.1 y Evangelista- Martinez, Z.1,1Instituto de Ciencias de la Salud. Área Académica de Medicina. Laboratorio Bioquímica. UAEH. Carretera Pachuca-Actopan-Tilcuautla. Ex Hacienda “La Concepción” s/n. Municipio San Agustín Tlaxiaca. Hidalgo. C.P. 42160. [email protected]. 2Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería. Área Académica Biología. Licenciatura en Biología. UAEH.

Palabras Clave: T. longipennis, Infección T. cruzi, Proteínas, Hemolinfa,.

Introducción. En la tripanosomiasis americana, miles de estudios han tratado de resolver la compleja y variada relación entre tres elementos muy importantes: los hospederos representados por el ser humano, las chinches y los reservorios, el huésped representado por variantes del tripanosoma casi idénticos pero no iguales y el ambiente representado por lo que se denominan los ciclos selváticos, domésticos y peri-domésticos. A diferentes niveles, desde el molecular hasta el social, multitud de personas, han buscado una respuesta o solución global, integral, unificada, definitiva sin hallarla. En este sentido, es escasa la información genética, bioquímica o inmunológica que se ha generado con respecto a la interacción tripanosoma-triatomino o parásito-vector. La importancia del estudio de los triatominos radica en que son considerados los únicos transmisores de importancia epidemiológica de la enfermedad de Chagas, la cual ocupa el segundo lugar en importancia en Latinoamérica después del paludismo. (Labra,O.C.S.). A la fecha se han descrito 123 especies de Triatominae en el mundo, de las cuales se conocen 30 en México, y 25 de ellas pertenecen al género Triatoma Laporte (Vidal-Acosta, 2000). Estos vectores son insectos del orden de Hemiptera, familia Reduviidae y subfamilia Triatominae. En el caso de la Trypanosomiasis americana se ha estudiado el intestino del insecto como órgano blanco, en él se ha descrito el desarrollo del tripanosoma, sin embargo no se sabe aun como se mantiene la transmisión del patógeno, que sucede en otros órganos o tejidos como la hemolinfa, el cuerpo graso, el músculo o las glándulas salivales. También se desconoce porque algunas especies de insectos son mejores trasmisoras que otras. Afortunadamente se empieza a estudiar y ya se ha descrito una proteína-lectina semejante a xilulosa kinasa que podría jugar un papel importante en el desarrollo de T. rangeli en la hemolinfa del vector Rhodnius prolixus. Este conocimiento es relevante para entender aspectos como la transmisión, pues aunque se ha tratado de romper la cadena de transmisión de la enfermedad, por los que se ha considerado los eslabones más débiles, es decir el hospedero humano y el huésped, quizás debiera considerarse que más que una cadena se trata de una red con varias dimensiones bioesféricas por lo que es necesario ampliar los estudios hacia el otro de los hospederos, los triatomas o chinches.

854 Respuesta inmune en insectos: Los insectos son particularmente resistentes a infecciones microbianas, el sistema de defensa de los insectos consiste en diferentes reacciones innatas, como la inmunidad innata que se basa en reconocer las moléculas microbianas, así como los lipopolisacaridos (LPS) y los peptidoglicanos, por medio de receptores específicos para activar la respuesta celular lo que incluye la fagocitosis, el encapsulamiento y la respuesta humoral. Inmediatamente después de ser infectados el cuerpo graso del insecto y algunas células sanguíneas comienzan a producir potentes antimicrobianos y péptidos antifungicos, estas moléculas actúan destruyendo la invasión de los microorganismos; la inmunidad innata constituye la primera línea de defensa en la fase temprana de la infección microbiana, por lo que se considera un mecanismo de defensa ancestral. Se ha citado que todos los estadios ninfales (fig. 1, Cuadro 1) por los que pasan los insectos son infectivos, lo cual significa que durante aproximadamente dos años, desde que el insecto eclosiona hasta que muere, es capaz de mantener y transmitir al parásito. ¿Como hace el organismo del insecto para controlar o evadir la presencia del parásito en el resto de su organismo si en el caso de Tripanosoma rangeli el triatoma si es invadido?. Debido a esta situación, en el presente trabajo se propone estudiar la posible respuesta inmune humoral del insecto vector denominado Triatoma longippennis cuando se infecta con el parásito Trypanosoma cruzi. Es decir que se busca estudiar la susceptibilidad de Triatoma longipennis, originaria de Nayarit, infectadas por la ruta natural con una cepa de Trypanosoma cruzi aislada de la zona de la hausteca hidalguense, evaluando esta por medio del perfil de proteínas de la hemolinfa y de las tasas de excreción del parásito en heces y orina.

Huevos

Adultos

1ºEst

♂ ♀

5º Est 2º Est

4º Est 3º Est

Figura 1. Ciclo de vida de Triatoma longipennis.

855 Cuadro 1. Periodos de tiempo de eclosión de T.longippenis. (días) Estadio Ninfas F2. (n) Promedio Mínimo Máximo N1 51 18.91 11 35 N2 26 17.5 10 29 N3 26 21.06 13 35 N4 5 38 28 44 N5 2 N.D. N.D. N.D. Total. 95.47 62 143

Materiales y Método Cultivo y alimentación de los triatominos. Los 12 ejemplares de la colonia original de triatominos provinieron del estado de Nayarit y se ha mantenido durante cuatro generaciones, en condiciones de laboratorio a una temperatura de 27-31º C, una humedad de 60%-70% RH y con un ciclo de día noche que hace que las chinches tengas las condiciones adecuadas para su sobre vivencia. Para estos estudios se emplearon chinches de la generación F3 y F4 (Fig. 1) Los triatominos se mantienen en recipientes de plástico con cartones plegadizos, y están cubiertos con una tapa con malla para facilitar su alimentación, la cual se realiza con ratas anestesiadas. Transcurridos cinco días después de la alimentación, se procede a inmovilizar a cada ejemplar y con ayuda del microscopio estereoscopico se efectúa una punción a nivel de la coxa para la obtención de la hemolinfa, la cual inmediatamente se pone en acido tricloroacetico a 4°C para detener cualquier alteración o transformación de las proteínas, y posteriormente realizar el PAGE-SDS con las proteínas mas puras. Infección de los triatominos. Se alimentaron 11 ejemplares de triatomas dejando picar a ratones infectados con Tripanosoma cruzi, cepa hidalguense, y que mostraron parasitemia positiva al octavo día. A diferentes intervalos de algunos días se procedió a obtener la hemolinfa, la cual se proceso como se describe abajo, y a analizar la orina y las heces de estos insectos en fresco para observar a los tripanosomas en movimiento. Estas preparaciones también se fijaron una vez secas y después se tiñeron con Giemsa y se volvieron a buscar, contando y fotografiando a las diferentes formas del Tripanosoma. Preparación de la hemolinfa para PAGE-SDS. Para obtener las proteínas en la forma mas pura y natural, se utilizo el protocolo de acido tricloroacetico (TCA), que a continuación se describe, inmediatamente después de obtener la muestra de hemolinfa. Precipitación de proteínas por el protocolo de TCA. 1. Agregar un volumen de 1 de TCA a 4 volúmenes de proteínas. 2. Incubar 10 min. a 4º C. 3. Centrifugar a 14,000 rpm, 5 min. 4. Remover el sobrenadante, dejando intacto el botón de proteínas formado. 5. Lavar el botón con 200µl de acetona fría. 6. Centrifugar a 14,000 rpm, 5min. 7. Repetir del paso 4-6 un total 2 veces lavando con acetona. 8. Evaporar la acetona a 95º de 5-10 min. 9. Para PAGE-SDS, agregar 2X o 4X de buffer y calentar la muestra por 10min a 95ºC.

PAGE-SDS. Preparación del gel separador desnaturalizante. Poner las soluciones en el orden siguiente: Agua destilada, Solución Monómero: Acrilamida, Tris pH 8.8, SDS 10%, Persulfato de Amonio 10% y TEMED. (Tetrametiletilendiamina). Verter la solución en la cámara de electroforesis vertical y enseguida añadir alcohol isopropílico para obtener una superficie horizontal y esperar a que polimerice. Después lavar con agua para eliminar el alcohol y secar.

856 Preparación del gel concentrador. Poner las siguientes soluciones: Agua destilada, Solución Monómero: Acrilamida, Tris pH 6.8, SDS 10%, Persulfato de Amonio 10% y TEMED, (Tetrametiletilendiamina). Mezclar suavemente y agregar sobre el gel separador, insertar el peine y esperar a que polimerice. Antes de quitar el peine conviene marcar los pozos para ubicarlos mejor. Tinción y análisis de los geles. Los geles se tiñeron con el colorante de Coomasie y con plata. Después se fotografiaron en formato digital y se analizaron con el programa Ultra-Lum TotalLab v1.11 para resolver, marcar y calcular el Rf y la masa molecular de las bandas.

Resultados y Discusión Ag 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 2. PAGE-SDS al 12% de hemolinfa proveniente de Triatoma longipennis. Carril Ag proteínas marcadores Sigma. Carriles 5, 6, 7, 8 y 9 proteínas de Adulto ♂, Adulto ♀, Ninfa de 5º estadio, Adulto ♀, Ninfa 5º estadio respectivamente. Gel teñido con Coomasie.

Cuaro 2. Rf y numero de bandas de proteínas de hemolinfa de Triatoma longipennis. Adulto ♂ 15 bandas, Adulto ♀ 16 bandas, Ninfa de 5º estadio 17 bandas, Adulto ♀ 16 bandas, Ninfa 5º estadio 15 bandas.

N. Adulto Adulto Ninfa Adulto Ninfa Marcas banda ♂ ♀ 5° ♀ 5° Rf 1 .012 .015 .027 .020 .020 .013 2 .025 .024 .035 .034 .032 .115 3 .042 .047 .095 .057 .098 .171 4 .105 .100 .105 .118 .139 .215 5 .137 .135 .142 .157 .176 .231 6 .159 .173 .181 .177 .203 .274 7 .191 .196 .210 .200 .271 .384 8 .269 .271 .277 .279 .286 .447 9 .313 .296 .308 .328 .384 10 .367 .316 .394 .556 .548 .546 11 .548 .384 .526 .609 .627 12 .602 .551 .551 .700 .651 13 .695 .604 .607 .729 .715 .711 14 .744 .707 .688 .752 .758 15 .835 .746 .736 .849 .839 .814 16 .844 .766 .874 .856 17 .849

857

Figura 3. PAGE-SDS al 12% de hemolinfa proveniente de Triatoma longipennis, infectada con Tripanosoma cruzi. Carriles 1 y 6 proteínas marcadores Sigma. Carriles 2, 3, 4 y 5 proteínas de Ninfa de 5º estadio, Adulto ♂, Adulto ♀, Adulto ♀.

Cuadro 3. Rf y numero de bandas de proteínas de hemolinfa de Triatoma longipennis infectadas con Tripanosoma cruzi. Ninfa de 5º estadio 16 bandas, Adulto ♂ 14 bandas, Adulto ♀ 14 bandas,

N. Ninfa Adulto Adulto Adulto Marcas banda 5°, 11 ♂, 1 ♀, 5 ♀, 9 Rf /kDa 1 .155 .170 .167 .162 2 .173 .186 .181 .177 3 .188 .200 .191 .190

4 .202 .236 .362 .226

5 .360 .317 .385 .285

6 .383 .368 .408 .312

7 .408 .385 .440 .363

8 .434 .407 .500 .380 9 .499 .433 .527 .398 10 .521 .521 .549 .426 .403 / 66 11 .546 .569 .619 .511 .555 / 45 12 .782 .923 .782 .561 .653 / 36 13 .872 .951 .919 .771 .718 / 29 14 .925 .970 .973 .850 .791 / 24 15 .954 .913 16 .981 .970 .925 / 20 17 .990 / 14

La diferencia que se observa es el diferente patrón en cuanto el peso molecular de las proteínas que se están expresando, pues en las infectadas aparecen tres grupo, uno con Rf´s arriba de 0.900, otro con corrimientos en el rango de 0.400 y otro con valores de 0.300. En la tabla 3 hay nueve proteínas con un peso molecular por debajo de 66,000kDa que no se observan en la tabla 2. Es decir, hay una distribución homogénea del peso molecular, en las proteínas de las no infectadas. En el caso de ejemplares de T. longipennis adultas, se han reportado los siguientes picos: 2,3,4,6,8,10,11 y 12 que corresponden a moléculas proteicas con un peso molecular de 195,000; 170,000; 140,000; 115,000; 84,000; 75,000; 43,000 y 34,000kDa. Estos resultados difieren de lo hallado en este trabajo pues se detectan otras proteínas con diferentes pesos moleculares. Lo mismo sucede con las

858 proteínas de las ninfas de 5º estadio pues se detectan los picos 4, 5, 6, 7 y 9 que corresponden a pesos moleculares de 205,000; 170,000; 155,000; 115,000 y 57,000 kDa. Se elimino el efecto de barrido reportado (Labra, 1993) al tratar previamente las muestras de hemolinfa con la adición del TCA, ya que aumento el numero de bandas, pues de 12 bandas reportadas en las hembras adultas, en nuestro estudio suben hasta 17, es decir 5 bandas mas. En el caso de las ninfas de 5º estadio de nueve reportadas, este numero se incremento hasta 16 lo que significa la detección de 8 proteínas mas. Los adultos machos muestran un número similar al de las hembras. Por otro lado, los triatomas han permanecido infectados por más de 160 días, lo que representa medio año de un estado de susceptibilidad. Resalta que la ninfa de 4° estadio, después de las mudas a 5° y a adulto macho se mantuvo infectado. Mediante la observación de las muestras y de los organos teñidas con Giemsa se determinaran que tipo o formas del tripanosoma se están produciendo, lo cual dará una idea del desarrollo del parásito en este vector. Por el momento, estos resultados sugieren la existencia de una respuesta de adaptación entre la cepa de trypanosoma local y el vector o triatoma foráneo. También estamos realizando estudios para determinar a que tipo de proteínas corresponden las bandas que se encuentran pues se ha reportado que hay proteasas, esterasas y aglutininas.

Cinética de infección de Trypanosoma cruzi en Triatoma longipennis. 1er Inoculo 2do. Inoculo 18-10-07 17-01-08 No. Triatoma Días Pos-Infección 23-10-07 27-10-07 13-12-07 21-01-08 12-02-08 25-03-08 5 40 56 95 117 159 1 ♂ - O + O ++ - ++ O + 2 ♂ - - - - ND - 3 ♂ - - - ND ND - 4 ♀ - - - ND ND - 5 ♀ - - - + + H +++ (†) 6 ♀ - - - ND ND - 7 ♀ - - - ND ND - 8 ♀ - - - ND - ND 9 ♀ - - - ++ ++ O ++ 10 ♀ - - - ND - - 11 Ninfa O + - ++ ND ++ ND *Ninfa de 4º estadio, mudo a 5º y después a adulto macho y se mantuvo infectado. Muestra: H heces, O orina. (†) Muerte.

Agradecimientos. Para la TLC Martha Martínez Corona. Lab. Bioq. ICSA-UAEH.

Literatura Citada. P. Azambuja, N. A. Ratcliffe and Garcia, E.S. (2005). Towards an understanding of the interactions of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli within the reduviid insect host Rhodnius prolixus. Anais da Academia Brasileira de Ciências 77(3): 397-404. Mello CB, Nigam Y, Garcia ES, Azambuja P, Newton RP, Ratcliffe NA. 1999. Studies on a haemolymph lectin isolated from Rhodnius prolixus and its interaction with Trypanosoma rangeli. Exp Parasitol. Apr;91(4):289-96. Labra Olivares Cruz Sara. 1993. Empleo de patrones electroforeticos de la hemolinfa como criterio bioquímico en la identificación de especies de triatominos (Insecta: Reduviidae). Tesis profesional. Escuela de Quimica. Universidad Motolinia, A.C. Asesor Nogueda Torres B, (ENCB-IPN). 45pp.

859 PROTEASAS DIGESTIVAS EN LARVAS DE LA PALOMILLA DE NOPAL (MELITARA SP. WALKER).

Digestive proteases in cactus pear plant moth larvae (Melitara sp. Walker).

Jorge Ariel Torres-Castillo1, Candelario Mondragón-Jacobo2, Rocío Chuc-Mezquita3 Rafael Zetina-Rodríguez3 y Alejandro Blanco-Labra1. 1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del I.P.N. Campus Guanajuato Km 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León A. P. 629. Irapuato, Gto., México 36821. 2 Campo Experimental-Bajío INIFAP. Km. 6.5 Carr. Celaya S. M. Allende, Gto. México. 3 Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Quintana Roo. Avenida Bacalar No. 38 Manzana 1, Super manzana 46. Fracc. La Herradura II C.P. 77506, Cancún Quintana Roo.

Palabras Clave: Palomilla del Nopal, Digestión, Proteasas.

Introducción El nopal (Opuntia spp.) es un cultivo importante para México, ya que genera una derrama económica de alrededor de tres mil millones de pesos (Comunicado 275 IPN, (2006)). Al igual que otros cultivos éste ha sido centro de numerosas investigaciones enfocadas en el fitomejoramiento, calidad de frutos, propiedades nutricionales, utilización como forraje para ganado, así como fisiología (Mohamed-Yaseen et al., (1996), López- García et al., (2001), Mondragón, (2001) y Stintzing & Carle, (2005)). Desde el punto de vista ecológico, el género Opuntia juega un papel clave en las zonas desérticas debido a que proporciona alimento y refugio para algunas especies animales (CONABIO, 2007). El nopal como cultivo posee problemas fitosanitarios importantes con fitopatógenos y con insectos (CESAVEG, 2004). En el aspecto fitosanitario contra insectos, se ha mostrado un marcado interés por combatir plagas nativas como son picudo barrenador del nopal (Cactophagus spinolae Gyllenhal), picudo de las espinas (Cylindrocopturus biradiatus Champion), cochinilla (Dactylopius indicus Green) y las chinches (Hesperolabops gelastops Kirkaldy y Chelinidea tabulatus Burmeister), y en el caso de plagas exóticas, la palomilla del nopal, Cactoblastis cactorum Berg. Las plagas están bien identificadas, y ya existen algunas medidas de control que han funcionado. Cabe mencionar que se conoce poco respecto a la fisiología de las plagas de Opuntia. El entender la fisiología de los insectos plaga permitirá sentar la base para el diseño de nuevas estrategias de control. Un proceso fisiológico importante durante el ciclo vital de los animales es la digestión, la cual les permite la obtención de los nutrientes para mantenerse y completar su desarrollo. Atendiendo a este fenómeno, las plantas han desarrollado entre sus mecanismos de defensa la presencia de proteínas antidigestivas. Dentro de las más estudiadas se encuentran los inhibidores de proteasas que son proteínas que se unen a las proteasas e impiden que estas enzimas digestivas corten las proteínas y liberen aminoácidos útiles para el insecto (Lawrence and Koundal, (2002); Fenton, (2005)). Para fundamentar una estrategia basada en la utilización de los mecanismos de defensa de las plantas, es necesario conocer los elementos que participan en el proceso digestivo. En el caso de los insectos plaga de Opuntia, hay ejemplos extremadamente voraces, entre ellas las palomillas del nopal entre las que podemos mencionar, aparte de C. cactorum, al gusano cebra (Olycella nephelepsa Dyar), gusano blanco (Lanifera cyclades Druce), y al barrenador azul del nopal (Melitara

860 sp), siendo el estado larvario de las palomillas el que mayor daño ocasiona. Las larvas barrenan el interior de los cladodios, donde consumen el tejido parenquimatoso, debilitando a la planta pudiendo incluso llegar a matarla, dependiendo del grado de infestación. Dentro de los cladodios pasan gran parte de su ciclo vital. Al final de su estado larvario forman pupas que pueden quedar en los restos de la planta devastada o en el suelo cercano a la planta que infestaron (Bugbee y Reigel, (1945); Badii & Flores, (2001); CESAVEG, (2004)). Recientemente se reportó la incidencia de palomillas exóticas en algunas islas del Caribe Mexicano, particularmente en Isla Mujeres y Contoy, la cual, gracias a los esfuerzos coordinados de personal de SENASICA, SANIDAD VEGETAL, SAGARPA y otras instituciones logró controlarse. En esas infestaciones localizadas se pudo comprobar la presencia de C. cactorum y Melitara sp. Con la finalidad de ampliar el conocimiento sobre la fisiología de estos insectos que atacan al nopal se realizó una colecta de larvas de palomillas encontradas en el nopal. Por lo cual se procedió a colectar larvas de lo que se tenía reportado como Melitara sp. Durante la colecta realizada en Isla Contoy se observaron dos tipos de larvas de diferente color, algunas presentaron un color azul y otras larvas tenían tonos grisáceos. No se tenía antecedente si se trataban de diferentes especies o de diferentes instares larvales. Por lo que en este trabajo se llevó a cabo el análisis de las proteasas digestivas de las larvas encontradas.

Materiales y Método Detección de actividad proteolítica en intestinos de larvas de palomillas del nopal. Las larvas fueron colectadas en Isla Contoy, Municipio de Isla mujeres Quintana Roo, contando con el apoyo del personal del Programa de Erradicación de la Palomilla del Nopal. Una vez localizada la presencia de las larvas, se realizaron cortes en la zona de entrada, caracterizada por la presencia de abultamientos cerosos y se siguió el curso de la galería hasta encontrar las larvas de interés. Estas se colectaron dejándose en trozos del hospedero y se mantuvieron en el laboratorio hasta su sacrificio. Los intestinos se separaron y se almacenaron en hielo hasta su transportación al CINVESTAV Campus Guanajuato. Los intestinos obtenidos fueron sometidos a una extracción de proteínas mediante su maceración en agua deionizada. Posteriormente, la mezcla se sometió a centrifugación y el sobrenadante se utilizó como fuente de proteasas intestinales. La actividad inhibitoria fue monitoreada por la hidrólisis de BapNa, de acuerdo a Erlanger et al. (1961), donde una unidad de actividad inhibitoria fue definida como el decremento en 0.01 unidades de absorbancia por minuto a 37°C. El blanco fue preparado con 180 μl de buffer (Trsi- HCl 0.1 M pH 8.0) a 37 °C y 20 μl de sustrato BapNa (4.35 mg/ml en DMSO) a 37 °C; la reacción control de enzima fue medida bajo las misma condiciones con 10 μl de tripsina por 15 minutos. Visualización de las proteasas intestinales mediante análisis SDS-PAGE. Los extractos de proteínas intestinales se liofilizaron y se cargaron en electroforesis en geles de poliacrilamida de acuerdo al sistema de Shagger y Von Jaghow (1981). Se hicieron dos geles con el mismo patrón, un gel se utilizó como gel de referencia en el que se visualizó el perfil de proteínas presentes en la muestra; el segundo gel se lavó con Tritón X-100 y se incubó en una solución de gelatina al 2% (proteína sustrato) en buffer Tris-HCl pH8 a 37°C por espacio de 2 horas. Los geles se fijaron con solución Metanol-Acido Acético-Agua y se tiñeron con azul de Coomassie G.

861 Interpretación de geles. Para la determinación del perfil de proteínas, éstas aparecen como bandas azules sobre fondo blanco, en el caso de zimogramas, bandas claras sobre fondo azul, indican la presencia de proteasas (degradación de proteína).

Resultados Las larvas fueron encontradas utilizando como hospederos a Opuntia dilenii (Ker- Gawl.) Haw y una especie de Cereus sp (“uña de gato”). Se probaron pH 6 y pH 8 para los ensayos de actividad proteolítica y solamente se detectó actividad a pH 8. Una vez detectada la actividad mediante ensayos in vitro se procedió a realizar un análisis proteico y enzimático de los extractos intestinales utilizando electroforesis en geles de poliacrilamida. Los perfiles proteicos fueron muy similares entre los dos tipos de larvas analizados, presentándose un barrido a partir del peso molecular relativo de 20 KDa, lo que es un indicativo de degradación por acción de las propias proteasas intestinales. En el ensayo zimograma, se detectó un patrón de proteasas bastante similar entre los dos tipos de larvas, encontrándose la presencia de actividad proteolítica (bandas blancas sobre fondo oscuro) con pesos moleculares relativos de 25, 40 y 70 KDa. Se incluyó Tripsina como proteasa estándar (Figura 1). M 10 20 30 T M 10 20 30 T 16 A) 160 B) 0 50

50 30 25 30 20 25 20 10

160

10

50

30 25 20

10

862

160 C) 160 D)

50 50

30 30 25 25 20 20

10 10

Figura 1. Perfiles electroforéticos y zimogramas de actividad proteolítica para los extractos intestinales de las larvas de Melitara sp. A y B provienen de extractos de larvas de último instar en color azul; C y D muestran extractos de larvas de primeros instares en tono grisáceo.

Discusión y Conclusión Partiendo de una comunicación del personal del programa de Erradicación de Palomilla del Nopal en la península de Yucatán, quienes han estudiado el ciclo vital de Melitara sp incidente en isla Convoy, los dos tipos larvarios detectados corresponden a diferentes estados de desarrollo, siendo la larva de color azul el último instar larval. Los patrones proteicos encontrados de los extractos de intestinos parecen indicar que los dos tipos de larvas estudiadas comparten características en común, quizá debido a que poseen una dieta muy similar; sin embargo, cuando se analiza el patrón de proteasas digestivas se puede apreciar que éste es muy similar entre ambos tipos larvarios lo cual parecería confirmar que se trata de la misma especie. Y que a través de los últimos instares larvales el patrón de enzimas digestivas se mantiene constante. La diversidad de enzimas digestivas va a depender del tipo de dieta del insecto, por ejemplo los insectos oligófagos poseen enzimas especializadas para su dieta restringida, en cambio los insectos polífagos presentarán una mayor diversidad de enzimas. De acuerdo a las observaciones durante la colecta, estas larvas de palomillas que inciden sobre nopal, también atacan a otra cactácea lo cual se puede relacionar con la presencia de varias enzimas proteolíticas, aunque todavía resta analizar el resto de enzimas digestivas. Para poder planear el uso de estrategias adecuadas para el control de insectos, resulta necesario un entendimiento más profundo de su fisiología. En este trabajo se presentan los resultados que permiten entrever la complejidad de los elementos que participan en un proceso fundamental como es el proceso digestivo de proteínas en Melitara sp.

Agradecimientos Agradecemos al personal del Programa de Erradicación de Palomilla del Nopal en la península de Yucatán por el apoyo brindado durante la colecta y por todas las facilidades prestadas. Agradecemos al CONCYTEG FOMIX por el apoyo financiero.

863 Literatura Citada

Badii M. H. y A. E. Flores. 2001. Prickly pear cacti pests and their control in Mexico. Florida Entomologist Vol. 84 No. 4: 503-505. Bugbee R. E. y A. Reigel. 1945. The Cactus Moth, Melitara dentata (Grote), and its Effect on Opuntia macrorrhiza in Western Kansas. American Midland Naturalist, Vol. 33, No. 1: 117-127. CESAVEG. 2004. Folleto de la Campaña de Manejo Fitosanitario de Agave y Nopal. Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato. Comunicado de Prensa del Instituto Politécnico Nacional. 275 IPN 2006. Erlanger B., Kokowsky N. and Cohen W. 1961. The preparation and properties of two chromogenic substrates of trypsin. Arch. Biochem. Biophys. 95, 271-278. Felton G. W. 2005. Indigestion is a plant's best defense. PNAS vol. 102 no. 52: 18771– 18772 Lawrence P. K. & K. R. Koundal. 2002. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. Electron. J. Biotechnol. 5, 1-17. López-García J. J., Fuentes-Rodríguez J.M. and R.A. Rodríguez. 2001. Production and use of Opuntia as forage in northern Mexico. Cactus (Opuntia spp.) as Forage. Candelario Mondragón Jacobo and Salvador Pérez-González Eds. FAO 169.

864 BIOENSAYOS CON DOSIS DISCRIMINANTES PARA DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ACARICIDAS EN Eotetranychus lewisi (Acari: Tetranychidae)

Discriminating-dose bioassay for detecting acaricide resistance in Eotetranychus Lewisi (Acari: Tetranychidae)

Gerardo Pérez-Santiago, Jesús Loera Corrales y Manuel A. Esparza Ayala. CIIDIR-IPN U. Durango Sigma s/n. Fracc. 20 de Noviembre II Durango, Dgo. CP 34220 México. * Becarios COFAA. E-mail: [email protected]

Palabras Clave: Resistencia, ácaros, bioensayos.

Introducción En Zacatecas y Durango, el ácaro de Lewis Eotetranychus lewisi (INIFAP, 1974) es la principal plaga en las huertas de duraznero, por lo que se han empleado por varios años acaricidas organosintéticos para su control. En el pasado, cuando las poblaciones de ácaros dejaban de ser controladas con algún acaricida registrado, se sustituía con el empleo de otro compuesto con modo de acción diferente hasta que demostraba su ineficiencia, en consecuencia, se ha favorecido el desarrollo de plagas secundarias que no causaban daños de importancia (Dennehy et al. 1987). Mena (1990) ha señalado la presencia de algunos casos de resistencia en ácaros en huertas de durazno en Zacatecas. En un programa de Manejo integrado de plagas, la detección oportuna de la resistencia a un plaguicida es fundamental para el desarrollo de una estrategia de control químico a largo plazo, tomando en cuenta el reemplazo de plaguicidas que ya no son efectivos (Lagunes-Tejeda y Villanueva-Jiménez, 1994. Por su parte, Snodgrass y Scott (1999), Roush y Millar (1986) han empleado bioensayos de laboratorio con la aplicación dosis discriminantes para la detección de resistencia a productos piretroides, organofosfoardos e insecticidas ciclodienos, donde han demostrado la utilidad de estos bioensayos para la detección de resistencia. Por lo que, el objetivo de este trabajo fue determinar algún caso de resistencia a través de bioensayos de tres poblaciones de Eotetranychus lewisi provenientes de huertas de duraznero del estado de Zacatecas, a los acaricidas avermectina, bifentrina, etion y propargite.

Materiales y Métodos Material biológico. Durante 2001 se colectaron colonias de ácaros de E. lewisi de tres localidades del estado de Zacatecas, de huertas con historial de aplicación de productos químicos para el control de ácaros en Los Haro (LN 22º 45.2’ LW 102º 49’), Los Félix (LN220º 46.3´ LW102º 58.8’) y Caracoles (LN 22o 59.4’ LW103º 28.2’), los ácaros se mantuvieron en plantas de frijol. Las plantas se mantuvieron en jaulas cubiertas de organdí en condiciones de: 25 ± 2º C, fotoperiodo 14:10 (L: O), y 50-70% humedad relativa, sobre muestras de ácaros de estas colonias se emplearon dosis discriminantes a nivel de CL90, del valor obtenido de susceptibilidad con anterioridad para etion y propargite (Pérez, et al. 1998), para avermectina se determinó el valor inicial de susceptibilidad inicial en una colonia susceptible. Se emplearon valores a nivel de CL90, para determinar un posible caso de resistencia hacia algún producto de acuerdo a trabajos previos para este tipo de bioensayos (Roush y Miller 1986). Se emplearon los siguientes plaguicidas en formulación

865 comercial para los bioensayos toxicológicos: avermectina (Agrimec 1.8 % CE, Novartis Agro), etion (Rhodocide 48.6 %, Rhone-Poulec Agro), y propargite (Omite-6E 68.1%, Uniroyal, Chemical Co., Inc.). Pruebas de laboratorio con el empleo de concentraciones discriminantes de acaricidas Se realizaron bioensayos con el empleo de concentraciones discriminantes a nivel de CL90, para lo cual se prepararon soluciones al 1% y posteriormente diluciones para obtener los valores de CL90, se empleo el mismo tipo de bioensayo residual de inmersión de hoja FAO (1969) Pérez, et al. (1998) para determinar mortalidad o sobrevivencia a estas concentraciones. Adicionalmente, se empleo el método de bioensayo de aspersión en hoja, el cual consistió en la aplicación de aproximadamente 1.57 mg/cm-2, de las mismas soluciones acaricidas a nivel de CL90, con el empleo de la Torre de aspersión de Potter- Bourgerjon. Análisis de resultados. La determinación de los valores de CL50 y CL90 incluyendo los parámetros Intervalo de Confianza y pendiente, se realizaron con el método Log-probit del Programa SAS (SAS Institute 2000). La mortalidad promedio para cada acaricida se comparó con la prueba de Tukey (α = 0.05). La mortalidad natural en los tratamientos de cada grupo se corrigió con la mortalidad del testigo con la formula de Abbot (1925).

Resultados y Discusión La concentración letal 90 (CL90) se muestran en el Cuadro 1, del etion y propargite se tomaron los valores disponibles con anterioridad, para avermectina se determinó ex profeso.

Cuadro 1.- Concentración letal 90 (CL90) empleada sobre hembras adultas de Eotetranychus lewisi en Durango, Mexico (*Determinados por Pérez, et al. 1998) Producto CL90 (ppm)

3.5x10-3 Avermectina Etion* 812 Propargite* 1234

Mortalidad obtenida por medio del método de inmersión por hoja. Los resultados de mortalidad con el empleo de dosis discriminantes CL90 se muestran en le Cuadro 2, se observa que el producto avermectina fue el que ocasionó los mayores porcentajes de mortalidad (98 – 100%) en las muestras de las tres colonias de diferente origen, le sigue en toxicidad el propargite con porcentajes de mortalidad superiores al 90, mientras que el etion ocasionó una mortalidad menor (57 – 94%). En dos de las colonias de dos localidades, los porcentajes de mortalidad se mantienen altos, no así en la colonia de ácaros proveniente de Los Félix, la mortalidad fue menor del orden de 50%, lo cual nos indica un posible caso de resistencia hacia este producto, caso que se confirma con el empleo de dosis discriminantes CL90, por el método de aspersión.

866 Cuadro 2.- Mortalidad en ácaros causada por dosis discriminante por el método de inmersión de hoja al nivel de CL90. Localidad testigo avermectina propargite etion Los Haro, Zac. 9ª 100ª 98ª 55ª Los Félix, Zac. 0.86ª 100ª 83ª 37ª Caracoles, Zac 2.6ª 98a 98a 57a Valores dentro de cada columna con la misma letra, son iguales entre sí (Tukey, 0.05).

Se encontró alta mortalidad con avermectina, se debe básicamente a que este es un producto de los de la ultima generación y su uso no es muy común en las áreas de donde se colectaron los pies de cría para el establecimiento de las colonias de ácaros, resultados similares se obtuvieron por el método de aspersión, no existió diferencia significativa (P< 0.05) con respecto en el porcentaje de mortalidad, por lo que se tiene la certeza que las tres colonias de ácaros son susceptibles a este producto. En el caso del propargite, que es un plaguicida organoazufrado, ocasionó una mortalidad del 83 al 98 %, resultados de mortalidad que coinciden con el concepto de mortalidad debida a un valor de CL90, si bien se encontró que la colonia proveniente de la localidad de Los Félix, el porcentaje de mortalidad fue menor, esto puede ser debido a que en esta localidad se ha realizado mas intensamente el empleo de productos químicos para el control de la araña roja. En este método la mortalidad más baja se presentó en el acaricida etion perteneciente al grupo de los organofosforado, en particular del grupo de los tiofosforados. Mena en 1990 señaló algún caso de resistencia por parte de ácaros el duraznero hacia el grupo de los plaguicidas tiofosforados. A excepción de los datos donde se encontró baja mortalidad en trabajos de campo efectuados en huertas de la región de Jerez, por lo que el presente trabajo de laboratorio confirma un caso de resistencia hacia este producto y la bondad del método de laboratorio en la detección de casos de resistencia con el empleo de dosis discriminantes.

Cuadro No 3. Mortalidad causada con dosis discriminantes por el método de aspersión al nivel de CL90. Localidad testigo avermectina propargite etion Los Haro, Zac. 0a 100ª 95ª 1.8ª Los Félix, Zac. 0a 100ª 96ª 2.7ª Caracoles, Zac 0a 100a 96a 1a Valores dentro de cada columna con la misma letra, son iguales entre sí (Tukey, 0.05).

Mortalidad obtenida por medio del método de aspersión. Los resultados se muestran en el Cuadros 3. En este método la mortalidad del testigo fue 0 % y se presentó de manera constante en las tres poblaciones de ácaros. El acaricida avermectina causo un 100% de mortalidad, en las tres colonias procedentes de las tres localidades del estado de Zacatecas, la mortalidad que ocasionó el producto es alta a una baja concentración. Se observa una gran susceptibilidad a este producto ya que su empleo ha sido poco generalizado y de reciente introducción al

867 mercado, par su empleo en las huertas para el control de araña roja. Por lo que, el producto esta ofreciendo una buena protección al cultivo actualmente. De acuerdo con los resultados que se obtuvieron con el acaricida propargite los porcentajes de mortalidad varían de 95 a 96 % en las tres colonias de ácaros, los porcentajes obtenidos nos permiten conocer mas a cerca de las tres poblaciones de ácaros sometidas a dicho experimento demostrando ser susceptibles al grupo de los acaricidas organoasufrados que desde hace no más de 10 años se han estado aplicándose en la región sin embargo no se descarta la posibilidad de que aparezca la resistencia divido a su uso tan prolongado en esta región. En el caso del acaricida etion se presentaron las mayores diferencias en cuanto a la razón de mortalidad en las tres colonias de ácaros con valores de 1 % al 57 % (de acuerdo con el método). Estos resultados demuestran que en las tres poblaciones de ácaros sometidos a dicho experimento existen individuos resistentes al grupo de los acaricidas organofosforados básicamente hacia los tiofosforados, nuestros datos coinciden con la investigación que realizó Mena (1990) donde mencionaba la presencia de resistencia a los productos de este grupo toxicológico, la presencia de resistencia se debe principalmente a un uso prolongado de este producto en estas regiones productoras de durazno del estado de Zacatecas, ya que de acuerdo con entrevistas a productores locales mencionan el empleo de este producto data de un período mayor de 15 años, por esta razón los ácaros han desarrollado la tolerancia a este producto que técnicamente se conoce como resistencia.

Conclusiones A través de bioensayos de laboratorio es posible determinar resistencia a plaguicidas, como se presentó en este trabajo para el caso del etion. El método de aspersión presentó mayor sensibilidad y mejor reproductibilidad.

Literatura Citada Abbot, W. S.1925. A method for computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18: 265-267. Dennehy, T.J., J. Grannett, T.F. Leigh, y A. Colvin. 1987. Laboratory and field investigations of spider mite (Acari: Tetranychidae) resistance to the selective acaricide propargite. J. Econ. Entomol. 80: 565-574. FAO. 1969. Recommended methods for detection and measurement of resistance of agricultural pest to pesticides (Tentative methods for spider mites and their eggs, Tetranychus spp. and Panonychus ulmi Koch) FAO, Method No. 10 Plant Prot. Bull. 17 Lagunas-Tejeda, A. y J. A. Villanueva–Jiménez. 1994. Toxicología y manejo de insecticidas. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas. México. 264 pp. INIFAP. 1974. Mesa redonda: La problemática actual del duraznero en Aguascalientes. CIAB Campo Experimental de Pabellón, Aguascalientes, México Mena, C, J. 1990. Resistencia en campo de Eotetranychus lewisi McGregor (Acarina: Tetranychidae) en duraznero, a los acaricidas del grupo tiofosforados. INIFAP. Sociedad de Entomología, Memorias del XXV Congreso Nacional de Entomología, Oaxaca, México. P 384.

868 Perez, S. G., M.P. González C., M. Piedra S. y J.M. Vigueras C. 1998. Susceptibilidad de Eotetranychus lewisi (Acari: Tetranychidae) a los acaricidas etion y propargite. Memorias del XXXIII Congreso Nacional de Entomología. 7-9. Roush, R. T. y G. L. Miller. 1986. Considerations for design of insecticide resistance monitoring programs. J. Econ. Entomol. 90: 293-298. SAS Institute. 1996. The SAS system for Windows, release 6.12. Cary, N.C. Snodgrass, G. L. y W. P. Scott. 1999. A discriminating-dose bioassay for detecting pyrethroid resistance in tarnished plant bug (Heteroptera: Miridae) populations. Southwestern Entomologist. 24(4): 301-307.

869 DOSIS DE ACEITES VEGETALES PARA EL CONTROL DEL Sitophilus zeamais Motschulsky EN SEMILLA DE MAÍZ

Dose of vegetal oils for the control of the Sitophilus zeamais, Motschulsky in maize seed

Juana Martínez-López1, Federico Facio-Parra1, Alejandra Torres-Tapia1, Antonio Valdez- Oyervides1, Ismael Hernández-Betancourt2.1Centro de Capacitación y Desarrollo en Tecnología de Granos y Semillas, 2 Departamento de Parasitología, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, C. P. 25315, Buenavista Saltillo, Coahuila, México. juanita_ [email protected]

Palabras Clave: Sitophilus zeamais, Semilla de Maíz, Aceites Vegetales, Dosis.

Introducción El maíz es uno de los alimentos básicos en la alimentación del mundo, utilizado como consumo directo e industrial; con una creciente demanda debido al incremento de la población, por lo que surge la necesidad de aumentar la producción de maíz y minimizar las pérdidas que varían entre un 10 al 30 % (Trematerra & Sciaterra 2004). Uno de los organismos que mas pérdidas causan en este cereal, es el Sitophilus zeamais tanto en su estado larvario como adulto, ocasionando daños físico en los granos y semillas. En el control de este, se han empleado en forma continua, plaguicidas sintéticos lo cual ha ocasionado resistencia, acumulación en el ambiente e intoxicaciones. Esta situación da lugar a buscar alternativas de control sustentable, por consiguiente, se han utilizado aceites de origen vegetal para combatir diferentes insectos y entre ellos se encuentran las plagas de almacén (Davidson, et al., 1991). En este sentido el objetivo de este trabajo fue determinar las mejores dosis que tengan el efecto insecticida de 10 aceites vegetales en el control del gorgojo del maíz Sithophilus zeamais.

Materiales y Método La reproducción del insecto y el experimento fueron realizados en el laboratorio de Acondicionamiento y Control de Calidad de Granos y Semillas, de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Se utilizó semilla de maíz de la variedad VAN – 210 por ser un material de composición amilosa. Para el tratamiento de la semilla se utilizaron aceites comerciales de origen vegetal obtenidos en centros botánicos, estos fueron, Ajonjolí (Sesamum indicum L.), Albahaca (Ocimun basilicum L.), Almendra (Prumus amygdalus), Canola (Brassica napus), Jojoba (Simmondsia chinensis), Laurel (Laurus nobilis L.), Lila (Melia azedarach), Maíz (Zea mays), Soya (Glicine max), Orégano (Origanum vulgare L.), Cacahuate (Arachis hypogaea L.). Los aceites de ajonjolí y cacahuate, se evaluaron a 100, 200, 300, 400, 500, 600 ppm, albahaca 100, 200, 300, 400, 500, 700 ppm, almendras y canola 100, 200, 300, 400, 600, 800 ppm, laurel 200, 300, 400, 500, 700, 800 ppm, lila 50, 100, 200, 300, 400, 500 ppm, maíz 300, 400, 500, 600, 700, 800 ppm, soya 100, 200, 300, 400, 600 ppm y orégano 10, 20, 40, 60, 80, 100 ppm.

870 Los bioensayos, consistieron en depositar 50 gr de semilla previamente tratada con los aceites en frascos de vidrio de 250 ml posteriormente se depositaron 25 S. zeamais y estos se evaluaron a las 24 horas después de la infestación. Resultados y Discusión El análisis de varianza de la mortandad de S. zeamais a las 24 horas después de la infestación, mostró diferencias significativas (P≤0.01) en los diez aceites evaluados. De acuerdo a la comparación de medias (Cuadro 1) para el factor dosis en la evaluación de mortandad de insectos a las 24 horas después de la infestación, los mejores resultados se encontraron en las dosis más altas de cada tratamiento. En cuanto al resto de los productos estos también alcanzaron altos niveles de mortalidad en sus diferentes dosis, excepto el ajonjolí quien en su dosis más alta (600 ppm) presentó 68.73 % de mortandad, además, la media general fue de 34.34 % siendo este el menor porcentaje obtenido. En función a las concentraciones bajas, algunos de estos tratamientos no superaron el 10 % de mortandad, estos se pueden considerar como productos no prometedores a las 24 horas después de la infestación, según lo señala Páez (1987).

Cuadro 1. Comparación de medias de mortandad de S. zeamais a las 24 horas de infestación. Dosis Ajonjolí Jojoba Dosis Albahaca Cacahuate Dosis Almendra Canola

600 68.73 a 93.47 a 700 100.00 a 100.00 a 800 84.37 a 87.05 a 500 66.76 a 91.27ab 500 90.75 b 94.81 ab 600 61.40 a 65.42 b 400 31.63 b 75.11 b 400 46.65 c 86.71 b 400 60.02 a 52.01 c 300 23.05 bc 45.62 c 300 33.15 d 85.95 b 300 18.21 b 43.98 cd 200 14.61 c 7.67 d 200 18.52 e 54.76 c 200 6.47 b 34.65 d 100 2.96 d 2.96 d 100 4.00 f 22.71 d 100 5.55 b 14.80 e Media 34.34 46.09 Media 44.74 61.75 Media 37.12 43.57 LSD 2.17 2.17 LSD 2.17 2.17 LSD 2.17 2.17

Dosis Laurel Dosis Maíz Dosis Lila Dosis Soya Dosis Orégano 800 100.00 a 800 96.00 a 500 100.00 a 800 92.06 a 100 100.00 a 700 95.42 a 700 94.81 a 400 96.53 a 600 65.58 b 80 95.42 a 500 39.96 b 600 72.18 b 300 94.81 a 400 61.67 b 60 94.81 a 400 24.88 c 500 65.65 b 200 89.59 b 300 16.75 c 40 70.78 b 300 3.46 d 400 39.86 c 100 70.78 c 200 7.67 cd 20 42.61 c 200 2.96 d 300 6.53 d 50 25.30 d 100 2.50 d 10 6.53 d Media 41.38 Media 53.59 Media 65.94 Media 38.13 Media 58.03 LSD 2.17 LSD 2.17 LSD 2.17 LSD 2.17 LSD 2.17 Los valores con la misma letra dentro de cada columna son iguales estadísticamente (LSD α = 0.05 %)

En resumen se observó que los aceites que presentaron las mejores medias generales (Fig. 1) fueron el de lila 65.94 %, cacahuate 61.75 % y orégano 58.03 %, además alcanzaron un 100 % de mortandad del S. zeamais a las 24 horas después de la infestación en las dosis más altas. Como se puede observar estos resultados sobrepasan el 50% de mortalidad, y por lo tanto los tratamientos se consideran como prometedores de una buena alternativa en el control del insecto (Lagunas, 1994).

871

Figura 1.- Medias de Mortalidad del Sitophilus zeamais por el efecto insecticida de aceites vegetales.

Conclusiones  En general los aceites vegetales evaluados en este estudio son una buena opción para controlar el S. zeamais en maíz almacenado, utilizando dosis altas para su control.

 Los aceites de lila, cacahuate y orégano presentaron los mejores resultados en las medias generales, por lo tanto, estos se consideran como lo más prometedores en su utilización.

Agradecimientos Al Dr. Eugenio Guerrero Rodríguez+, por sus valiosas aportaciones durante el desarrollo de estos trabajos.

Literatura Citada Davidson, N. J. Dibble, M. Flint, P. Marere, A. Guye. 1991. Managing insects and mites with Spray oils. IPM Education and Publications. Division of Agriculture and Natural. Resources. Publication 3347. USA. 47 p. Trematerra, P. & A. Sciaterra. 2004. Spatial distribution of some beetles infesting a feed mill with spatio-temporal dynamics of Oryzaephilus surinamensis, Tribolium castaneum and ribolium confusum. J. Stored Prod. Res. 40: 363-377. Lagunes, A. 1994. Extractos, polvos vegetales, y polvos minerales para el combate de plagas del maíz y del frijol en la agricultura de subsistencia. Colegio de Postgraduados/USAID/CONACYT/ BORUCONSA. México. 35 p. Paez, A. 1987. Uso de polvos vegetales e inertes minerales como una alternativa para el combate del gorgojo del maíz Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae) en maíz almacenado. Tesis (Maestro en Ciencias) Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas. Montecillo, México. 135p.

872 DOSIS DE ACEITES VEGETALES A SEMILLAS DE FRIJOL PARA EL CONTROL DE Acanthoscelides obtectus. Say

Doce of vetegetal oils in bean seeds for the control of Acanthoscelides obtectus Say

Daniel Chepetla Calderón, Federico Facio-Parra, Alejandra Torres-Tapia, Antonio Valdez- Oyervides, Juana Martínez-López. Centro de Capacitación y Desarrollo en Tecnología de Granos y Semillas, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, C. P. 25315, Buenavista Saltillo, Coahuila. [email protected]

Palabras Clave: Acanthoscelides Obtectus Say, Fríjol, Aceites Vegetales, Dosis.

Introducción El fríjol es un grano estratégico en la alimentación y del desarrollo de México, es el segundo cultivo agrícola , se cultivan alrededor de 1, 904,100 hectáreas de Fríjol las cuales producen 1,414,903 toneladas de esta leguminosa (SAGARPA, 2003) , así como por al número de productores dedicados a este cultivo, y la gran demanda que tiene esta leguminosa, y por el aporte de proteína de excelente calidad, principalmente (Serrano, 2004). El almacenamiento por su parte se ve afectado por causa de plagas de almacén como algunos insectos que son los responsables y posiblemente el más importante deterioro biológico de los granos de Maíz, Fríjol, Sorgo, Arroz, Trigo, etc., esto incluye pérdida de peso, reducción de los índices de germinación, pérdida de valor comercial, aumento de la temperatura por densas poblaciones, que producen humedad en el grano y la infestación por hongos (Hernández, 2005). Las principales plagas en fríjol almacenado es el gorgojo pinto del fríjol Zabrotes subfasciatus y el gorgojo común del fríjol Acanthoscelides Obtectus Say, éste último de importancia para climas templados y fríos por su adaptación por lo tanto se presentan pérdidas hasta de un 70% del grano almacenado. Lo que presentan pérdidas económicas muy altas para el productor (SAGARPA, 2003). A partir de la necesidad por encontrar una nueva alternativa natural para el control de insectos plagas y reemplazar así los pesticidas sintéticos aparecen los insecticidas botánicos en este caso los aceites vegetales ofreciendo seguridad para el medio ambiente y una eficiente opción agronómica (Borembaum, 1989). En este trabajo se pretende encontrar el rango de dosis óptimas donde los aceites pueden actuar en el control de Acanthoscelides Obtectus Say, para posteriormente trabajar con tres dosis que nos permita determinar residualidad en los tiempos de almacenamiento y efectos en la calidad de semilla.

Materiales y Método Los insectos que fueron utilizados fue de una colecta regional e incrementados en condiciones óptimas, los aceites vegetales que se aplicaron; Ajonjolí (Sesamum indicum L.), Albahaca (Ocimun basilicum L.), Almendra (Prumus amygdalus), Cacahuate (Arachis hypogaea L.) y Jojoba (Buxus chinensis) son del tipo comercial y se utilizó la variedad de fríjol flor de mayo. Se aplicaron dosis en: 0, 100, 200, 300, 400, 500, y 600 ppm, a muestras de fríjol de 50 grs. , cada una con tres repeticiones colocados en frascos de vidrio

873 y teniendo así, un total de 21 muestras por aceite a las que infestaron con 15 gorgojos por muestra. Los conteos de los gorgojos muertos y vivos se realizaron a las 24 hrs.

Resultados y Discusión El análisis de varianza para el factor dosis en la evaluación de mortandad a las 24 horas después de la infestación, mostró diferencias significativas (P≤0.05) en los cinco aceites evaluados. Podemos mencionar en concreto que los aceites que presentaron porciento de mortandades altas fue el aceite de albahaca con un 52.39% siguiéndole el de 50.62% y el de jojoba con un 41.71%. Por lo consiguiente los aceites que presentaron menor porcentaje de mortandad fueron el ajonjolí con 38.88% y el de almendra con un 26.13 % (Fig. 1).

Figura 1.- Medias generales en porciento de mortandad de los aceites vegetales

Cuadro 1. Comparación de medias para la variable dosis en la evaluación en porciento de mortandad de insectos a las 24 horas de infestación.

Dosis Ajonjolí Dosis Albahaca Dosis Almendra Dosis Cacahuate Dosis Jojoba

400 74.35 a 400 94.19 a 600 76.98 a 600 88.37 a 600 94.72 a

300 64.09 ab 500 90.23 a 400 32.56 b 500 87.50 a 400 57.78 b

600 48.71 ab 600 89.32 a 300 30.23 b 400 65.12 ab 500 55.55 b

500 38.46 bc 300 19.53 b 500 15.50 bc 300 34.88 bc 300 28.89 c

200 5. 12 cd 200 15.44 b 200 1.55 c 200 24.03 cd 200 11.11 d

100 2.56 d 100 5.68 b 100 0.00 c 100 3.87 d 100 2.22 d

Medi 38.88 52.39 26.13 50.62 41.71 a

Cubas (2002) utilizo diferentes tipos de aceites vegetales como el de maíz, soya u eucalipto para el control de plagas en almacén y encontró un rango de mortandad de 91.60% a 71.50% lo cual no se obtuvieron.

874 Conclusiones  Los aceites de almendra y jojoba podemos trabajar en 600ppm y probarlas con dos dosis arriba para ver resultados.

 El aceite de albahaca se puede probar en rangos de 400 a 600 ppm o bien meter dosis de 400,600, y 800 ppm para ver resultados.

 El aceite de cacahuate ya que, se encuentran resultados.

Literatura Citada.

Barembaim R. C. 1989. Insecticidas naturales a partir de extractos vegetales. En linea: http://www.monografias.com/trabajos18/insecticidas-naturales/insecticidas- naturales.shtml. Actualización: Actualización Septiembre 2007.

Hernández , J. 2005. Plagas de los granos almacenados. En línea: http://www.reshet.net/agrevo/02a_cont.html. Actualización : Noviembre 2007.

SAGARPA. 2003. Servicio de información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera. Consulta de indicadores de Producción Nacional de Fríjol.

Serrano, C. L. 2004. Análisis del caso fríjol. Universidad Autónoma de Chapingo.

875 UN MECANISMO DE ACTIVACIÓN INMUNOLÓGICA CONSERVADO EVOLUTIVAMENTE DE INSECTOS A MAMÍFEROS

An insect to mammal evolutionarily conserved mechanism for immune activation

Erick García-García1, Patricia Lucero García-García2, y Carlos Rosales1. 1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas; y 2 Departamento de Ecología y Recursos Naturales, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México D.F, MÉXICO.

Palabras Clave: Inmunidad, Orthoptera, Coleoptera, Lepidoptera, fagocitosis, inflamación.

Introducción. Aún careciendo de un sistema inmunológico adaptativo, los organismos invertebrados sobreviven en un mundo poblado de microorganismos potencialmente patógenos, incluyendo bacterias, hongos y virus. Tras una infección los invertebrados activan diversos mecanismos de defensa, como la activación del sistema de la fenol oxidasa, la encapsulación, el estallido respiratorio, la producción de óxido nítrico, la liberación de substancias microbicidas, y la fagocitosis. La fagocitosis ocurre de manera conjunta a otras respuestas celulares destructivas, como el estallido respiratorio, y la liberación de substancias tóxicas y microbicidas. Debido a su potencial destructivo, el proceso de fagocitosis debe ser controlado rigurosamente. En mamíferos, los fagocitos responden a señales de activación y de diferenciación aumentando su capacidad fagocítica (García-García y Rosales, 2005). En humanos la eficiencia de fagocitosis puede incrementarse a través una gran variedad de estímulos; incluyendo péptidos bacterianos, componentes de la membrana o de la pared celular de microorganismos, citocinas, y mediadores proinflamatorios lipídicos (García-García y Rosales, 2005). Poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de una respuesta inmunológica efectiva en invertebrados. Algunas substancias derivadas de microorganismos han demostrado poseer propiedades inmuno-activadoras en distintos phyla de invertebrados. Dentro de estas substancias se encuentran los lipopolisacáridos (Charalambidis et al., 1996), la pared celular de levaduras (zymosan) (García-García et al., 2008), algunos glicanos (Lacchini et al., 2006), y algunos péptidos bacterianos (Yip et al., 2001). En fagocitos de mamífero, el tripéptido bacteriano fMLP funciona como un potente activador de la fagocitosis y como quimioatrayente. Esta sustancia ha demostrado ser quimioatrayente en hemocitos de mejillón (Schneeweiss y Renwrantz, 1993) y de camarón (Yip et al., 2001); y muy recientemente se reportó que puede activar la migración de los hemocitos del gusano cornudo del tabaco Manduca sexta (Merchant et al., 2008). La posibilidad de que esta sustancia active la capacidad fagocita de hemocitos no ha sido explorada en ninguna especie de invertebrados. Para determinar si el tripéptido fMLP puede activar la capacidad fagocítica de hemocitos de insectos, se realizaron ensayos de fagocitosis in vitro en presencia de concentraciones crecientes de fMLP. Se utilizaron insectos de distintos Órdenes: Acheta

876 domesticus (Orthoptera), Zophobas morio (Coleoptera), y Galleria mellonella (Lepidoptera). Materiales y Método Partículas fagocitables. Perlas de látex carboxilado fluorescentes fueron adquiridas de Polysciences (Warrington, PA, USA). El zymosan se preparó a partir de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae. Bacterias gram-negativas (Escherichia coli), bacterias gram- positivas (Streptomyces lividans) y zymosan, se permeabilizaron con etanol y se marcaron fluorescentemente con dextran-fluoresceina. Células. Se utilizaron neutrófilos humanos como control positivo de activación por fMLP. Los neutrófilos se purificaron de sangre periférica de donadores sanos (García- García y Rosales, 2007). Insectos adultos de Acheta domesticus, y larvas de Zophobas morio y Galleria mellonella, fueron obtenidos de un productor local. Los insectos fueron anestesiados por incubación a 4 °C por 30 minutos antes de la extracción de la hemolinfa. La hemolinfa de A. domesticus se extrajo seccionando la patas al nivel de la coxa, y aspirando la hemolinfa con una micropipeta. Las larvas de Z. morio y G. mellonella fueron inyectadas con disolución anticoagulante. Tras la inyección, la punta del abdomen de las larvas de Z. morio fue seccionada, y la hemolinfa aspirada con una micropipeta. Las larvas de G. mellonella se perforaron en varias secciones abdominales, y la hemolinfa fue aspirada con una micropipeta. Cada experimento se preparó agrupando la hemolinfa de un mínimo de 7 insectos. Los hemocitos, aislados del resto de la hemolinfa por centrifugación, se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640, y se transfirieron a pozos individuales de una placa de cultivo de 96 pozos (0.75 - 2.00 X 105 células por pozo). Ensayos de fagocitosis. Los ensayos de fagocitosis con neutrófilos humanos se realizaron en fase líquida (García-García et al., 2007). Los hemocitos de insecto se incubaron por 15 minutos a 26 °C con diferentes concentraciones de fMLP, antes de adicionar las partículas fagocitables. Tras 2 horas de incubación a 26 °C las células se lavaron tres veces con PBS. Las partículas no internalizadas se desprendieron de la superficie celular con tripsina. Las células se desprendieron del fondo del pozo y se fijaron con 2.6% de paraformaldehido. La fagocitosis se analizó por citometría de flujo (García- García et al., 2007). Las fagocitosis se analizó en dos componentes: Porcentaje de células positivas (células que internalizan al menos una partícula fluorescente), y puntaje de fagocitosis (proporción de células positivas x intensidad de fluorescencia promedio de la población positiva). En los ensayos de activación de fagocitosis el puntaje de fagocitosis en el estado basal se consideró 100%. Los cambios en estos valores, inducidos por el tratamiento con fMLP, se graficaron como un porcentaje del puntaje de fagocitosis del estado basal. Análisis estadístico. Los datos se analizaron por medio de pruebas ANOVA, con comparaciones múltiples post-hoc (Dunnett), utilizando el paquete estadístico SPSS v8.0. Los valores máximos de p se indican en los pies de figura, para los datos con diferencias estadísticamente significativas respecto al control sin fMLP.

Resultados. Los fagocitos de distintas especies presentan diferentes niveles de fagocitosis. Para determinar la capacidad del fMLP de activar la fagocitosis se realizaron ensayos con diferentes partículas fagocitables: látex, bacterias gram-negativas (E. coli), bacterias gram- positivas (S. lividans), y zymosan (S. cerevisiae). En el estado basal ([fMLP] = 0) los

877 neutrófilos humanos presentaron el nivel más alto de fagocitosis hacia bacterias gram- positivas (69.52 + 8.86% de células positivas), seguido de bacterias gram-negativas (27.95 + 6.96% de células positivas), de zymosan (19.07 + 11.69% de células positivas), y finalmente de látex (18.06 + 11.11% de células) (Figura 1A). Los hemocitos de G. mellonella presentaron el mayor de niveles de fagocitosis hacia látex (32.51 + 18.04% de células positivas), seguido de bacterias gram-positivas (19.05 + 3.84% de células positivas), de bacterias gram-negativas (13.39 + 12.046% de células positivas), y finalmente de zymosan (7.85 + 3.6% de células positivas) (Figura 1B). Los hemocitos de Z. morio, también presentaron el mayor nivel de fagocitosis hacia látex (29.02 + 6.86% de células positivas), seguido de bacterias gram-positivas (9.92 + 6.14% de células positivas), de bacterias gram-negativas (5.97 + 2.65% de células positivas), y finalmente de zymosan (2.25 + 1.07% de células positivas) (Figura 1C). Los hemocitos de G. mellonella presentaron niveles similares de fagocitosis de látex y de bacterias gram-negativas (19.49 + 8.42% y 18.64 + 11.17% de células positivas, respectivamente), mientras que la fagocitosis de zymosan fue menor (1.65 + 0.67% de células positivas) (Figura 1D). Activación de la fagocitosis por fMLP en neutrófilos humanos. Está bien establecido que en neutrófilos humanos el fMLP es un potente activador de la fagocitosis de partículas opsonizadas con inmunoglobulinas y con complemento. Utilizando diferentes partículas fagocitables sin opsonizar, observamos que fMLP indujo un incremento significativo en la fagocitosis de látex, de zymosan, y de bacterias gram-negativas, pero no de bacterias gram-positivas (Figura 2). La concentración de fMLP para inducir un aumento significativo de fagocitosis fue distinta, en función de la partícula fagocitable utilizada. La fagocitosis de látex se incrementó significativamente con concentraciones de fMLP de 10-7 a 10-6 M, la fagocitosis de E. coli se incrementó significativamente con 10-9 a 10-8 M, mientras que la fagocitosis de zymosan se incrementó significativamente con concentraciones de fMLP de 10-10 a 10-9 M. Activación de la fagocitosis por fMLP en hemocitos de insectos. Al igual que en neutrófilos, el fMLP activó la actividad fagocítica de hemocitos de insectos (Figura 3). En hemocitos de G. mellonella (Figura 3A), el fMLP activó la fagocitosis de látex a concentraciones de 10-7 a 10-6 M. La fagocitosis de bacterias gram-negativas presentó un aumento, aunque no significativo, con una concentración de fMLP de 10-10 M. En cambio, la fagocitosis de bacterias gram-positivas y de zymosan se vio reducida, aunque no significativamente, por concentraciones de fMLP de 10-7 a 10-6 M. En hemocitos de Z. morio (Figura 3B), al igual que en neutrófilos, la fagocitosis de látex se incrementó significativamente con concentraciones de fMLP de 10-7 a 10-6 M; la fagocitosis de E. coli se incrementó significativamente con 10-9 a 10-8 M de fMLP, mientras que la fagocitosis de zymosan se incrementó significativamente con una concentración de fMLP de 10- 10 M. En hemocitos de A. domesticus (Figura 3C) la fagocitosis de látex se incrementó significativamente a una concentración de fMLP de 10-7 M, mientras que la fagocitosis de bacterias gram-negativas se incrementó significativamente a una concentración de fMLP de 10-10 M, y la fagocitosis de zymosan se incrementó significativamente a una concentración de fMLP de 10-8 M. En conjunto, estos resultados sugieren que la activación de la fagocitosis fMLP es un mecanismo inmuno-regulador conservado evolutivamente, que podría jugar un papel importante en los mecanismos de activación de la respuesta inmunológica global en invertebrados.

878 Conclusiones y Discusión. Poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de una respuesta inmunológica efectiva en invertebrados. Dentro de las pocas substancias cuyas propiedades inmuno-activadoras se han explorado en invertebrados están loslipopolisacáridos, la pared celular de levaduras (zymosan), algunos glicanos, y algunos péptidos bacterianos.

Figura 1.- Los fagocitos de distintas especies presentan diferentes niveles de fagocitosis. Neutrófilos humanos, y hemocitos de diferentes especies de insectos, fueron incubados en presencia de diferentes partículas fagocitables marcadas fluorescentemente: látex, levaduras (zymosan), bacterias gram-negativas (E. coli), y bacterias gram-positivas (S. lividans). Los datos corresponden a la media + desviación estándar de los porcentajes de células positivas (n = 6, A; n > 16, B-D).

Figura 2.- Activación de la fagocitosis por fMLP en neutrófilos humanos. Neutrófilos humanos fueron incubados con diferentes concentraciones de fMLP y diferentes partículas fagocitables marcadas

879 fluorescentemente: látex, levaduras (zymosan), bacterias gram-negativas (E. coli), y bacterias gram-positivas (S. lividans). El puntaje de fagocitosis del estado basal ([fMLP] = 0) se consideró 100%. Los cambios en los puntajes de fagocitosis se graficaron como un porcentaje del estado basal. Los datos corresponden a la media + error estándar. Los símbolos negros indican valores que no son significativamente diferentes del control. Los símbolos blancos indican valores significativamente distintos del control. Látex, p < 0.028, n = 6; zymosan, p < 0.01, n = 6; E. coli, p < 0.046, n = 6; S. lividans, n = 6.

Figura 3.- Activación de la fagocitosis por fMLP en hemocitos de insectos. Hemocitos de diferentes insectos fueron incubados con diferentes concentraciones de fMLP y diferentes partículas fagocitables marcadas fluorescentemente: látex, levaduras (zymosan), y bacterias gram-negativas (E. coli) o gram-positivas (S. Lividans. El puntaje de fagocitosis del estado basal ([fMLP] = 0) se consideró 100%. Los cambios en los puntajes de fagocitosis se graficaron como un porcentaje del estado basal. Los datos corresponden a la media + error estándar. Los símbolos negros indican valores que no son significativamente diferentes del control. Los símbolos blancos indican valores significativamente distintos del control. A) Látex, p < 0.018, n > 12; zymosan, n = 6; E. coli, n > 24; S. lividans, n = 6. B) Látex, p < 0.03, n = 8; zymosan, p < 0.043, n = 20 ; E. coli, p < 0.000, n = 16; S. lividans, n = 10. C) Látex, p < 0.018, n > 12; zymosan, p < 0.04, n = 8 ; E. coli, p < 0.012 n = 22.

Estas substancias han mostrado capacidad de activar el sistema de la susfenol oxidasa (Charalambidis et al., 1996), el estallido respiratorio (García-García et al., 2008; Lacchini et al., 2006), o la actividad migratoria de hemocitos (Merchant et al., 2008; Schneeweiss y Renwrantz, 1993; Yip et al., 2001) en algunos invertebrados marinos e insectos terrestres. Poco se sabe acerca de la capacidad de substancias derivadas de microorganismos de activar otras respuestas celulares importantes, como lo es la fagocitosis, en el contexto de los mecanismos de inmunidad innata. Un solo estudio ha demostrado la capacidad del lipopolisacárido de activar la fagocitosis en una línea celular de hemocitos (Wittwer et al., 1997). En fagocitos de mamífero el fMLP funciona como activador de la fagocitosis, y agente quimioatrayente. Muy recientemente se reportó que el fMLP puede activar la migración de los hemocitos del gusano cornudo del tabaco Manduca sexta (Merchant et al.,

880 2008). En este trabajo exploramos la capacidad del fMLP de activar la fagocitosis de diversas partículas, encontrando que esta sustancia es capaz de activar la fagocitosis en hemocitos de los Órdenes Orthoptera, Coleoptera, y Lepidoptera. Es interesante señalar que la activación de la fagocitosis por fMLP ocurrió con una corta exposición a este agente, pues en el estudio de (Wittwer et al., 1997) la activación eficiente de la fagocitosis se observó tras 24 horas de exposición a LPS. Esta diferencia sugiere que el fMLP podría ser un activador inmunológico muy eficiente en insectos. Las curvas dosis-respuesta de activación de fagocitosis fueron distintas entre distintos Órdenes de insectos, y también se observaron diferencias en las concentraciones de fMLP requeridas para activar significativamente la fagocitosis de diferentes partículas. En mamíferos, el fMLP activa la fagocitosis a través de un receptor específico acoplado a proteínas G heterotriméricas. La estimulación de este receptor, de forma conjunta a receptores fagocíticos, parece activar sinergísticamente la maquinaria molecular que regula el proceso de fagocitosis (García-García y Rosales, 2005). Es posible que las diferencias observadas en las curvas de activación de fagocitosis, entre los distintos Órdenes de insectos, se relacione con diferencias en la afinidad del receptor de fMLP por su ligando; o bien por los posibles mecanismos de activación sinergística de la maquinaria fagocítica, de los hemocitos de insectos. El estudio de substancias inmuno-moduladoras en insectos podría tener una importante aplicación en el área del control biológico. Substancias inmunodepresoras de insectos podrían utilizarse de manera conjunta a patógenos específicos, para el control biológico de plagas. La descripción de los mecanismos moleculares de inflamación en insectos es un área de investigación en crecimiento. Es posible que la aplicación de técnicas de investigación moleculares y celulares (que se aplican actualmente en la investigación biomédica) al campo de la inmunología de insectos rinda frutos dentro del área de control biológico, en un corto periodo de tiempo.

Literatura Citada Charalambidis, N. D., Foukas, L. C., Zervas, C. G., y Marmaras, V. J.1996. Hemocyte surface phenoloxidase (PO) and immune response to LPS in Ceratitis capitata. Insect Biochem Mol Biol 26, 867-874. García-García, E., Brown, E. J. y Rosales, C.2007. Transmembrane Mutations to FcRIIA Alter Its Association with Lipid Rafts: Implications for Receptor Signaling. J Immunol 178, 3048 – 3058. García-García, E., Prado-Alvarez, M., Novoa, B., Figueras, A. y Rosales, C.2008. Immune responses of mussel hemocyte subpopulations are differentially regulated by enzymes of the PI 3-K, PKC, and ERK kinase families. Dev Comp Immunol 32, 637-653. García-García, E. y Rosales, C.2005. Adding Complexity to Phagocytic Signaling: Phagocytosis- Associated Cell Responses and Phagocytic Efficiency, En Molecular Mechanisms of Phagocytosis. C. Rosales, editor. (Georgetown, Texas: Landes Biosciences/Eurekah.com and Springer Science+Business Media), pp. 58-71. García-García, E. y Rosales, C.2007. Nuclear factor activation by FcR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J Immunol Methods 320, 104- 118. Lacchini, A. H., Davies, A. J., Mackintosh, D. y Walker, A. J.2006. Beta-1, 3-glucan modulates PKC signalling in Lymnaea stagnalis defence cells: a role for PKC in H2O2 production and downstream ERK activation. J Exp Biol 209, 4829-4840.

881 Merchant, D., Ertl, R. L., Rennard, S. I., Stanley, D. W. y Miller, J. S. 2008. Eicosanoids mediate insect hemocyte migration. J Insect Physiol 54, 215-221. Schneeweiss, H. y Renwrantz, L.1993. Analysis of the attraction of haemocytes from Mytilus edulis by molecules of bacterial origin. Dev Comp Immunol 17, 377-387. Wittwer, D., Weise, C., Gotz, P. y Wiesner, A.1997. LPS-activated immune responses in a hemocyte cell line from Estigmene acraea (Lepidoptera). Dev Comp Immunol 21, 323-336. Yip, E. C., Wong, Y. H. y Wong, J. T.2001. Bacterial formyl peptide mediated chemotaxis and extracellular acidification in shrimp haemocytes. Dev Comp Immunol 25, 269-277.

882 BIOSINTESIS DE MACRONUTRIENTES DEL NOPAL POR EL METABOLISMO DE LOS INSECTOS Metamasius spinolae V. y Lanifera cyclades D

Biosynthesis of macronutrients of nopal by the metabolism of insects Metamasius spinolae V. and Lanifera cyclades D.

Jorge Rivero-Martínez1, Ma. Carmen Herrera-Fuentes2, Virginia Melo-Ruíz3, UNAM- CCH1 plantel oriente, Prol. Periférico Oriente s/n esq. Sur 24 Col. Agrícola Oriental C.P. 08500 México, D.F. UAM-I.2 Av. San Rafael Atlixco 186, México, D.F. C.P 09340. UAM- X.3 Calz. del hueso 1100, Villa Quietud, México, D.F. C.P. 04960. [email protected], [email protected], [email protected]

Palabras Clave: biosíntesis, proteínas, lípidos, L. cyclades D., M. spinolae V.

Introducción El nopal es originario del Continente Americano. Los aztecas llamaban a esta hortaliza nopalli, y en la actualidad México es el primer productor de nopal verdura para consumo humano (SIAP-SAGARPA, 2005).El nopal es una planta xerófita de la familia de las cactáceas, propia de regiones áridas y semiáridas, suculenta, cuyas partes básales con el tiempo se vuelven leñosas; el tallo en forma de raquetas llamados cladodios y sus hojas reducidas a espinas las hacen resistentes a la sequía (Bravo, 1978). Es una planta con alto valor nutritivo. El nopal es hospedero de diversos insectos fitófagos, varios de estos son considerados plaga, como la palomilla Lanifera cyclades D. y el picudo del nopal Metamasius spinolae V., que llevan a cabo su ciclo de vida en los cladodios viejos, ovipositan en la superficie y las larvas recién eclosionadas barrenan los cladodios, permaneciendo ahí hasta alcanzar la etapa adulta; sin embargo las larvas de estos insectos son utilizadas como alimento humano por su alto contenido proteico y de grasas (Rivero, 2004). Mucho del éxito de los insectos como grupo ha sido atribuido a su capacidad de alimentarse de un amplio rango de alimentos y esto parece ser verdad para los insectos fitófagos (Behmer, 2006). Las proteínas de las plantas son la fuente principal de aminoácidos, los insectos fitófagos que adquieren de ellas los nutrientes necesarios para el crecimiento, la reproducción y el mantenimiento; aunque las necesidades nutricionales de todos los insectos son en general muy similares, los que se alimentan de plantas tienen algunas necesidades especiales debido a que su dieta es pobre en carbohidratos, aunque estos no son nutrientes esenciales porque los insectos pueden obtenerlos de grasas y proteínas por medio de la gluconeogénesis (Behmer, 2006). La regulación de nutrientes es un componente crítico para determinar el éxito individual de cualquier insecto incluyendo las plagas importantes. El objetivo de este trabajo es demostrar la biosíntesis de algunos macronutrientes (proteínas, carbohidratos y lípidos) provenientes del nopal durante el metabolismo de los insectos mencionados. Se analiza el valor nutritivo de las L. cyclades D. y M. spinolae V. después de alimentarse del nopal.

883 Materiales y Método Un estudio longitudinal se llevo a cabo en dos nopaleras de Milpa Alta, Distrito Federal, Santa Mónica y San Pedro Atocpan, durante el año de 2007, para investigar el aprovechamiento de nutrimentos del nopal por los insectos mencionados. La delegación Milpa Alta se ubica al sureste del Distrito Federal, presenta una Latitud 19º11’32’’ N, Longitud 99º01’23’’ W, está a una altitud de 2410 msnm, colinda al norte con las delegaciones de Xochimilco y Tlahuac; al este con los municipios de Chalco, Tenango del Aire y Juchitepec del Estado de México; al oeste colinda con las delegaciones de Tlalpan y Xochimilco. Se realizaron dos muestreos el primero durante la primavera en donde se capturaron larvas de la palomilla L. cyclades D. el segundo en el verano del mismo año, se capturaron larvas del escarabajo M. spinolae V.

Cuadro 1.- Biodisponibilidad de los insectos Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic Especie Lanifera cyclades D. Palomilla ▓ ▓ ▓ ▓ Metamasius spinolae V. Escarabajo ▒ ▒ ▒ ▒ ▒ ▒ ▒

Posteriormente se realizó un estudio para determinar el aprovechamiento de los nutrimentos del nopal por los insectos obtenidos. El material se proceso en el laboratorio de bromatología de la UAM-X donde se realizó el análisis proximal en base seca por los métodos AOAC 1995., deshidratación en estufa a 60º C por 24 hrs, material inorgánico en mufla a 600º C por 2 hrs; proteínas por el método de Kjeldhal que dio nitrógeno total, este se multiplico por 6.25 para obtener nitrógeno proteico; lípidos por extracción con éter etílico en aparato soxlhet, fibra cruda por hidrólisis ácida e hidrólisis alcalina y carbohidratos solubles por diferencia.

Resultados Los resultados obtenidos fueron: Cuadro 2.- Análisis de macronutrientes del nopal y del insecto comestible g/100g base seca Localidad Proteínas Lípidos Minerales Fibra Carbohidratos Cladodios de Santa Mónica, 7.90 6.31 24.59 12.76 48.44 Milpa Alta Especie Proteínas Lípidos Minerales Fibra Carbohidratos Lanifera cyclades D. 43.25 31.24 5.95 1.12 18.44 Larva N Proteico = N total x 6.25 Carbohidratos o Extracto Libre de Nitrógeno = E.L.N. Las muestras se analizaron por triplicado y se reporta la media

Lepidoptera: Coleoptera: Pyralidae Curculionidae Lanifera Metamasius cyclades D. espinolae V.

884

Cuadro 3.- Análisis de macronutrientes del nopal y el insecto comestible g/100g base seca Localidad Proteínas Lípidos Minerales Fibra Carbohidratos Cladodios de San Pedro 9.52 4.77 16.93 19.75 49.03 Atocpan, Milpa Alta Especie Proteínas Lípidos Minerales Fibra Carbohidratos Metamasius spinolae V. 40.31 29.75 6.15 0.97 22.82 Larva N Proteico = N total x 6.25 Carbohidratos o Extracto Libre de Nitrógeno = E.L.N. Las muestras se analizaron por triplicado y se reporta la media

Discusión y Conclusión De acuerdo a los resultados obtenidos, tabla 2, se observa la concentración que hacen las larvas L. cyclades D. de proteínas y lípidos con respecto a lo que aportan los cladodios. Siendo aproximadamente de 5 veces más. En la tabla 3 se observa la concentración que hacen las larvas de M. spinolae V. de proteínas y lípidos con respecto a lo que aportan los cladodios. Siendo aproximadamente de 5 a 6 veces más. Mucho del éxito de los insectos como grupo es atribuido a la capacidad de alimentarse de casi todo, en el caso de los fitófagos metabolizan proteínas y grasas concentrando las cantidades de estos macronutrientes en forma considerable.

Literatura Citada

Behmer, S.T. 2006. Insect dietary needs: plants as food for insects. In: Encyclopedia of Plant and Crop Science (Ed. R. M. Goodman), Marcel Dekker Publishers, New York, NY. Behmer, S.T.; Nes, W.D. Insect sterol nutrition and physiology: a global overview. Adv. Insect Physiol. 2004, 31,1-72. Bravo, H.1978. Las cactáceas de México. 2ª ed Vol. 1. U.N.A.M. México. Rivero, J.,López, G., Herrera, M.C., Melo, V., 2004. Aprovechamiento de los insectos del nopal en alimentación humana., X Congreso nacional y VIII Congreso Internacional sobre conocimiento y aprovechamiento del nopal y otras cactáceas de valor económico. Fitth International Congress on Cactus Pear and Cochineal. Universidad Autónoma de Chapingo, Estado de México. SIAP-SAGARPA. 2005. Anuario estadístico de la producción agrícola 2005.

885 PERSISTENCIA Y TOXICIDAD DE SPINOSAD Y METOXIFENOCIDA SOBRE Spodoptera exigua Y Spodoptera frugiperda

Persistente and toxicity of spinosad and methoxyfenozide on Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda

Ma. Cristina Zamora-Vuelvas,1 Ana Mabel Martínez-Castillo,1 Marcela Inés Schneider,2 Samuel Pineda-Guillermo.1 1Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, 58880 Tarímbaro, Michoacán, México. 2Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores CEPAVE (CCT CONICET La Plata)-UNLP, Calle 2 N 584, 1900 La Plata, Buenos Aires, Argentina. [email protected].

Palabras Clave: Spodoptera exigua, insecticidas biorracionales, spinosad, metoxifenocida, toxicidad.

Introducción Con el fin de disminuir el impacto ambiental derivado de las medidas de control dirigidas al gusano soldado, Spodoptera exigua, y gusano cogollero, Spodoptera frugiperda, ambos (Lepidoptera: Noctuidae), en la última década se ha reconocido la gran necesidad por encontrar nuevas alternativas de control que sean más selectivas, seguras y compatibles con prácticas de manejo integrado de plagas. Aunado a lo anterior, el alarmante aumento de organismos resistentes a compuestos organosintéticos ha sido otra de las razones por las cuales se ha impulsado el desarrollo de nuevas moléculas con propiedades insecticidas. La investigación en el campo de la Toxicología de Insectos se ha dirigido a una mejor definición de los diversos sitios de acción, y en la mayoría de los casos, se ha enfocado hacia el sistema nervioso central. Por ello, se ha puesto atención en los compuestos derivados de fuentes biológicas que actúan específicamente sobre este sitio, es el caso de las avermectinas y espinosinas. Sin embargo, cabe señalar que diversas investigaciones se han enfocado al desarrollo de compuestos que interfieren con el crecimiento y desarrollo de los insectos, constituyendo así una de las más importantes líneas de investigación científica en lo concerniente al control de plagas (Casida y Quistad 1998).

Materiales y Método Cría de los insectos. Los individuos de S. frugiperda y S. exigua utilizados en este estudio se obtuvieron de las colonias mantenidas en el Laboratorio de Entomología Agrícola del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo en Morelia, Michoacán. Las larvas de ambas especies se criaron sobre dieta artificial de Poitout y Bues (1974) y los adultos se alimentaron con una solución al 15% de miel de abeja. Los insectos se mantuvieron en condiciones controladas de 25  2ºC, 75  5% de humedad relativa y un fotoperiodo de 16:8 h (Luz:Oscuridad). Efecto de los residuos de metoxifenocida y spinosad en larvas de S. exigua. Plantas de chile pimiento, Capsicum annum L. “Zidenka” (Rjikzwan de México, S.A. de C.V., México, D.F.) con aproximadamente 30-50 cm de altura, fueron tratadas con un

886 aspersor manual hasta punto de goteo con 144 y 120 mg de i.a./L de metoxifenocida (Intrepid®, 23.26% de metoxifenocida) y spinosad (SpinTor®, 11.60% de spinosad), respectivamente. Para aumentar la deposición de los insecticidas sobre las hojas, se utilizó el adherente SDS al 0.01%. Las plantas del testigo se asperjaron solamente con agua destilada más el adherente. Se utilizaron 17 plantas por cada insecticida y testigo, las cuales se distribuyeron al azar en un área de 7 m2 en el centro de un invernadero de 8 x 15 m. Para determinar la mortalidad causada por los residuos de metoxifenocida y spinosad, se realizaron ensayos de toxicidad bajo condiciones de laboratorio a los 0 (2 h después de la aplicación), 2, 5, 10, 20, 30 y 40 días después de la aplicación. Para cada fecha, un disco de 2.8 cm diámetro fue cortado de una hoja de cada tratamiento. No se utilizaron hojas de los nuevos brotes de las plantas, esto con la finalidad de asegurar la presencia de los insecticidas en las hojas seleccionadas. Los discos de hojas se colocaron individualmente en celdas de cajas para cultivo de tejidos de seis celdas, las cuales contenía aproximadamente 1 ml de agar solidificado al 2% para evitar su desecación. Se colocaron 10 larvas de tercer estadio de S. exigua sobre cada disco de hoja. Cada tratamiento o insecticida tuvo un mínimo de tres y un máximo de cinco repeticiones. Las larvas del testigo se alimentaron con discos de hojas tratadas solamente con SDS. Los discos de hojas se removieron 48 h después y las larvas fueron proveídas con dieta artificial sin tratar. La mortalidad larvaria se registró cada 24 h durante seis días. Efectos letales y subletales de metoxifenocida en larvas de S. furgiperda. Larvas de quinto estadio ( 8 h después de la ecdisis) de S. frugiperda se alimentaron, hasta su pupación, sobre dieta semisintética tratada con dos concentraciones subletales de metoxifenocida (CL10 = 0.41 y CL25 = 1.52 mg de i.a/kg de dieta) determinadas en previos estudios. Las larvas del testigo se alimentaron con dieta sin tratar. Se utilizaron 504, 622 y 238 larvas para las CL10, CL25 y testigo, respectivamente. Las larvas se transfirieron individualmente a celdas de cajas de plástico (de 24 celdas), mismas que contenían un cubo de dieta tratada con el insecticida o sin tratar. Las larvas fueron examinadas diariamente para registrar su mortalidad, o en su caso, se siguió su desarrollo y se determinó el porcentaje de formación de pupas y de adultos. Análisis de datos. Los datos del efecto de los residuos de metoxifenocida y spinosad sobre las larvas del tercer estadio de S. exigua se sometieron a un análisis de varianza. Las medias se separaron con la prueba de diferencias mínimas significativas (P < 0.05) mediante el programa Statgraphics (STSC 1987). En los casos donde las varianzas no fueron homogéneas aun con las transformaciones Log(X + 1) o arcoseno√x, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis. El efecto (mortalidad de larvas y pupas y formación de adultos) causado por las CL10 y CL25 de metoxifenocida en larvas de quinto estadio de S. frugiperda se comparó con el testigo a través de la prueba de máxima similitud (Prueba G) usando el programa GLIM.

Resultados Mortalidad causada por los residuos de metoxifenocida y spinosad presentes en hojas de chile pimiento. Las larvas de tercer estadio de S. exigua fueron altamente susceptibles a metoxifenocida. Este compuesto causó, excepto para el residuo de 0 días (92.5%), el 100% de mortalidad acumulada a las 72 h de exposición en todas las edades de residuos ensayados (Figuras 1A-G). Sorpresivamente, el residuo de 20 días de edad también causó 100% de mortalidad en tan sólo 48 horas después de exponer las larvas al tóxico (Figura 1E). El efecto de spinosad fue muy similar al causado por metoxifenocida, al

887 menos en los residuos de 0, 2, 5, 10 y 20 días de edad (Figuras 1A-E). El efecto causado por spinosad se redujo drásticamente en los residuos de 30 y 40 días de edad ya que en ambos experimentos se observaron porcentajes de mortalidad acumulada de alrededor del 50% (Figura 1F-G). En el testigo se observaron porcentajes de mortalidad entre el 10 y 16% en los residuos de 5, 10, 30 y 40 días de edad al final del experimento (Figuras 1C, D, F, G). Esto generalmente ocurrió debido a la falta de alimento después de las 24 horas del tratamiento, lo cual resultó en canibalismo.

Efectos de metoxifenocida en larvas de S. frugiperda. Las larvas de quinto estadio de S. frugiperda que se alimentaron hasta su pupación con dos concentraciones subletales de metoxifenocida, sufrieron una mortalidad positivamente relacionada con la concentración (Cuadro 1). Este efecto fue altamente significativo, ya que ambas concentraciones sobrepasaron el 90% de mortalidad, comparada con el 25% registrado en el testigo. Es importante aclarar que del 91.50% de mortalidad causado por la CL10, el 18.65% está representado por individuos que murieron con características entre larva y pupa (Figura 2). Las pupas provenientes de las larvas tratadas también tuvieron una mortalidad significativa. En este caso, sólo se registró la mortalidad de pupas en la CL10 ya que en la CL25 no hubo ningún sobreviviente al momento de la formación de pupas. El efecto subletal de metoxifenocida se vio reflejado en el desarrollo final de los individuos tratados ya que solamente se obtuvo un 12% de formación de adultos en la CL10, comparado con el 89% registrado en el testigo.

Discusión En el presente estudio se demostró que spinosad y metoxifenocida persistieron sobre las hojas de las plantas de chile pimiento durante los periodos de tiempos evaluados (0, 2, 5, 10, 20, 30 y 40 días después de la aplicación). Sin embargo, la toxicidad de spinosad disminuyó conforme a la edad de los residuos ya que los porcentajes de mortalidad causados por los residuos de 30 (52.5%) y 40 (48%) días fueron menores comparados con los del resto de los residuos en los que se obtuvieron mortalidades arriba del 80%. Estos resultados difieren de los encontrados por Liu et al. (1999) quienes reportaron que residuos de spinosad de 36 días de edad presentes en hojas de col causaron 100% mortalidad en larvas de tercer estadio de Trichoplusia ni (Hübner). Estas diferencias pueden ser debido a que las plantas de col utilizadas por estos autores se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio, en cambio las plantas de pimiento usadas en el presente estudio se mantuvieron en un invernadero que permite la entrada del 70% de luz solar. La reducción de la efectividad de spinosad registrada en este estudio puede ser debido a la sensibilidad que éste tiene a la luz solar, siendo la fotólisis es el principal factor de degradación (Liu et al. 1999). Respecto a metoxifenocida, nuestros resultados difieren de los encontrados por Waldstein y Reissig (2001), quienes reportaron que la mortalidad causada por tebufenocida (un compuesto de la misma familia que metoxifenocida) disminuyó 89.5% y 65% en brotes tiernos y hojas bien desarrolladas de manzano Malus spp., respectivamente, cuando las larvas neonatas de Choristoneura rosaceana (Harris) fueron expuestas a residuos de 10 días de edad.

888 De igual forma, Knight (2000) observó que la persistencia en campo de tebufenocida sobre follaje de manzano, declinó 76% después de la aplicación, lo cual pudo ser debido a la degradación del compuesto.

120

100 A B

80 60 0 días 2 40 días TESTIGO SPINOSAD METOXIFENOCIDA 20

1200

100 C D

80

60 5 10 días 40 días

20

1200

100 E F

80 mortalidad Porcentaje de de Porcentaje 30 60 días 40 20 días

20

0 120 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h G 100

80

60 40 días Días después de la exposición a los residuos. 40

20

0 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h

Figura 1. Mortalidad causada por los residuos de spinosad y metoxifenocida contenidos en hojas de chile pimiento sobre larvas del tercer estadio de S. exigua.

Cuadro 1. Efecto causado por metoxifenocida en larvas de quinto estadio de S. frugiperda expuestas, hasta su pupación, a dos concentraciones de metoxifenocida incorporadas a la dieta. Concentra-ciones No. Total de % de mortalidad de % de mortalidad de % de formación larvas larvas pupasa (N) de adultosb (N) Testigo 238 24.78 11.25 (179) 88.73 (158)

0.41 504 91.50*** 88.37 (43)*** 11.62 (5)***

1.52 646 100*** ------

El efecto causado por cada una de las concentraciones de metoxifenocida se comparó de forma separada con el testigo mediante la prueba de G (gl = 1, P < 0.001) a,bTomando como referencia el número total de larvas tratadas y número total de pupas formadas, respectivamente. N = Total de pupas o adultos formados.

889

Figura 2. Efecto de metoxifenocida en larvas de S. frugiperda tratadas en el quinto estadio. El individuo presenta características intermedias entre larva y pupa.

Previamente, Charmillot et al. (2001) reportaron que los reguladores del crecimiento de los insectos (RCIs) son muy estables y pueden resistir a la lluvia. Sin embargo, es importante mencionar que el crecimiento de las hojas puede causar dilución de los residuos. Este factor pudo ser el principal responsable de la pérdida de efectividad de tebufenocida registrada por Waldstein y Reissig (2001) en brotes tiernos de manzano. Para evitar tales efectos, en el presente estudio se utilizaron hojas de pimiento completamente desarrolladas y el adherente-dispersante usado también pudo facilitar la deposición del insecticida y probablemente ser un factor que contribuyó a su alta eficacia en todas las edades de residuos ensayados. Muchas especies de insectos exhiben un incremento significativo de la mortalidad en subsecuentes estadios o estados de desarrollo cuando son alimentadas con compuestos ecdisteroidales (Aller y Ramsay 1988, Chandler et al. 1992). En este estudio, las larvas de quinto estadio de S. frugiperda alimentadas con dos concentraciones subletales de metoxifenocida sufrieron mortalidades altamente significativas tanto en el subsecuente estadio larvario (sexto estadio) como en el estado de pupa, dando como resultado una baja formación de adultos. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Biddinger et al. (2006), quienes observaron una mortalidad positivamente relacionada con la concentración en larvas neonatas y de tercer estadio de Platynota idaeusalis (Walter) tratadas con tebufenocida. Este efecto se debe generalmente, a que los RCIs interrumpen los procesos hormonales de los insectos, en lugar de matarlos rápidamente como es el caso de los insecticidas neurotóxicos.

Agradecimientos Este trabajo fue financiado por la Fundación Internacional para la Ciencia (IFS; Estocolmo, Suecia; ref: C/3699-2), el COECYT-Michoacán a través del proyecto CB0702151_6, la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH y el PROMEP-PTC-101. Se agradece a DowAgrosciences, Zamora, Michoacan, México, por la donación de los insecticidas comerciales SpinTor® e Intrepid®.

Literatura Citada Aller, E. y R. Ramsay. 1988. RH-5849-A novel insect growth regulator with a new mode of action. En: Brighton Crop Protection Conference-Pest and Diseases. 511-518 p.

890 Biddinger, D., L. Hull, H. Huang, B. Mcpheron y M. Loyer. 2006. Sublethal effects of chronic exposure to tebufenozide on the development, survival, and reproduction of the tufted apple bud moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Economic Entomology (99): 834-842 Casida, E. y Quistad, B. 1998. Golden age of insecticide research: Past, present, or future?. Annual Review of Entomology (43): 1-16. Chandler, D., D. Pair y E. Harrison. 1992. RH-5992, a new growth regulator active against corn earworm and fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae). Jounal of Economic Entomology (85): 1099-1103. Charmillot, P. J., A. Gourmelon, A. L. Fabre, y D. Pasquier. 2001. Ovicidal and larvicidal effectiveness of several insect growth inhibitors and regulators on the codling moth Cydia pomonella L. (Lep., Tortricidae). Journal of Applied Entomology (125): 147- 153. Knight, L. 2000. Tebufenozide targeted against codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) alduts, eggs and larvae. Journal of Economic Entomology (93): 1760-1767. Liu, X., N. Alton, J. R. Sparks, H. William, Hendrix III y B. Yue. 1999. Effects of Spin Tor (Spinosad) on cabbage looper (Lepidoptera:Noctuidae): Toxicity and persistence of leaf residue on cabbage under field and laboratory conditions. Journal of Economic Entomology (92): 1266-1273. Poitout, S. y R. Bues. 1974. Elevage de chenilles de veingt-huit espeses de lépidopterés Noctuidae. Annales de Zoologie Ecologie Animale (6): 341-411. STSC. 1987. Statgraphics user's guide, version 5.0. Graphic software system, STSC, Rockville, MD.

891 ACTIVIDAD DEL PIRETRO ORNAMENTAL (Tanacetum coccineum WILLD GRIERSON) CONTRA INSECTOS

Activity of ornamental pirethtum (Tanacetum coccineum Willd Grierson) against insects

Agustín de Santiago-de Santiago. Colegio de Postgraduados, Instituto de Fitosanidad, Programa de Entomología y Acarología. Instituto de Fitosanidad, Km 36.5 carr. México- Texcoco, Montecillo, Estado de México, C.P. 56230. [email protected].

Palabras Clave: Piretro Tanacetum coccineum, insecticidas botánicos

Introducción Los piretros son crisantemos perennes que incluyen a diversas especies, entre ellas Tanacetum coccineum (Willd.) Grierson. Las piretrinas producidas por estas plantas se utilizan como insecticidas naturales. Los piretroides son insecticidas sintéticos con estructura química similar a las piretrinas (Elliot, 1995). Por los daños que causan los insecticidas sintéticos al hombre y al ambiente, está resurgiendo el uso de insecticidas de origen vegetal, principalmente piretrinas (Wink, 1993), que controlan numerosos insectos y ácaros, poseen efecto rápido, inducen poca resistencia en organismos tratados, no son inflamables, son de mínima residualidad, no son fitotóxicas y, principalmente, son de baja toxicidad al hombre y animales de sangre caliente (Jovetic, 1994). Debido a dichas cualidades, las piretrinas se utilizan más que cualquier otro insecticida en áreas urbanas: almacenes de productos alimenticios, casas habitación, restaurantes, hoteles, hospitales, escuelas, fábricas, supermercados y bares. También se utilizan en predios pecuarios, bosques (Casida y Quistad, 1995) y en medios acuáticos para combatir crustáceos parásitos de peces (Pyrethrum Bureau, 1990). Las piretrinas son los únicos insecticidas exentos de límites de residuos (Sugavanam, 1995), por lo que se utilizan en agricultura orgánica (Yepsen, 1976) y en cultivos de exportación que tienen alto valor económico (Sugavanam, 1995). Las piretrinas se venden en diversas formulaciones comerciales, pero se usan poco en forma de extractos naturales (Pyrethrum Bureau, 2004). Por tal razón el objetivo del presente trabajo fue evaluar la efectividad de extractos acuosos de piretro contra insectos.

Materiales y Método El piretro utilizado en este experimento se cultivó previamente en Montecillo, Texcoco, Estado de México, a una ubicación geográfica de 19˚ 29’ L N y 98˚ 54’ L W, altitud de 2250 msnm, y clima semiseco subhúmedo con lluvias en verano (García, 1973). Los insectos utilizados fueron larvas de segundo instar de mariposa de rayas blancas (Chlosyne ehrenbergii Séller, Leidoptera: Nynphalidae), las cuales se criaron en laboratorio, a temperaturas mínimas de 18.6±2.5 °C, y máximas de 23.6±1.5 °C. Los insectos fueron alimentados durante dos meses con hojas frescas de su hospedante natural, que es el tepozán (Buddleia sessiliflora Kunth: Loganeaceae). Así se logró una segunda generación de larvas experimentales sanas, uniformes en edad, de igual tamaño y longitud. Los bioensayos se iniciaron en mayo de 2002. Primeramente se determinaron Ventanas Biológicas, utilizando extractos acuosos preparados a partir de polvo de

892 inflorescencias de piretro, a concentraciones entre 0.001% y 5%. Con base en estas Ventanas Biológicas se eligieron cinco tratamientos que consistieron en las siguientes concentraciones porcentuales: 0.0, 0.005, 0.025, 0.05 y 0.1. De cada tratamiento se utilizaron cuatro repeticiones, cada una de las cuales consistió de 10 larvas, las cuales fueron sumergidas en el extracto respectivo durante 10 segundos. El tratamiento de 0.0% se consideró como testigo y consistió en sumergir las larvas en agua destilada. Cada Unidad Experimental consistió de un vaso del número 8 de plástico, en el cual se colocaron las larvas de un solo tratamiento y una sola repetición y se taparon con un trapo de tul. Se utilizó un Diseño Experimental de Bloques al Azar, colocando en cada bloque o repetición larvas que visualmente fueran de la misma longitud. Las larvas sobrevivientes de cada Unidad Experimental (vaso) fueron alimentadas durante 12 días, de igual forma que en las pruebas de Ventanas Biológicas. Diariamente se hicieron evaluaciones cualitativas, durante 12 días, para conocer los efectos causados por el piretro en la conducta y desarrollo del insecto. En el último día de evaluación se midió además la mortalidad de larvas. A los datos recabados se les aplicó un Análisis de Varianza ( = 0.05), para saber si hubo diferencias entre tratamientos. Además se realizó la Prueba de Tukey ( = 0.05) con el fin de comparar los tratamientos. Para conocer la mortalidad real del insecto, la mortalidad registrada se corrigió mediante la Formula de Abbott que es la siguiente:

MC=[(X-Y)/(100-Y)] [100], Donde: MC=Mortalidad corregida (%) X=Mortalidad en el tratamiento (%) Y=Mortalidad en el testigo (%) Resultados y Discusión El piretro probado tuvo actividad insecticida, la cual se manifestó por mortalidad de las larvas tratadas. También hubo efecto insectistático, el cual se reconoció por regurgitación, convulsiones, parálisis, disminución del movimiento, reducción de la alimentación e inhibición de la metamorfosis. A este último respecto, todas las concentraciones probadas provocaron estados biológicos intermedios, entre larva y pupa. También se obtuvieron estados intermedios entre pupa y adulto, en los cuales no se diferenciaron las alas pero sí las patas, de tal manera que los insectos permanecieron vivos, y aunque no podían volar se desplazaban caminando. Hubo diferencias altamente significativas (pF = 0.001) en mortalidad entre los tratamientos probados. En el Cuadro 1 se muestra la mortalidad no corregida, la cual se consideró para interpretar la prueba de Tukey. Al respecto, los mejores tratamientos estuvieron representados por las concentraciones de 0.1% y 0.05% de piretro, siguió en efectividad la concentración de 0.025 %, después la de 0.005 %. Por último estuvo la concentración de 0%, que representó al testigo, en cuyo caso hubo mortalidad de 5% por causas ajenas al experimento. El mismo Cuadro 1 muestra la mortalidad real, es decir la corregida mediante la fórmula de Abbott. Así todos los tratamientos que contenían piretro causaron mortalidad notoria. Las concentraciones de 0.1 y 0.05 de piretro causaron mortalidad real de 100%, la concentración de 0.025% de piretro causó 73% de mortalidad y la de 0.005% de piretro

893 ocasionó 39% de mortalidad. En el tratamiento testigo (0.0% de piretro) la mortalidad corregida equivale a 0%.

Cuadro 1. Mortalidad de larvas de mariposa de rayas blancas (Chlosyne ehrenbergii). Tratamientos Mortalidad no Mortalidad (Concentración de Piretro) Corregida (%) Corregida (%) 0.1 100 a 100 0.05 100 a 100 0.025 75 a 73 0.005 42 a 39 0.0 (Testigo) 5 a 0 Valores con la misma letra no difieren significativamente según la Prueba de Tukey (P 0.05).

La efectividad del piretro mostrada en ese trabajo podría justificar mayor investigación y cultivo la planta, la cual se ha producido comercialmente en más de 25 países (Gullickson, 1995). En la República Mexicana el piretro es poco conocido, pero ya se ha cultivado por ejemplo en Montecillo Estado de México (De Santiago, 2005). También se espera que la planta se utilice con mayor frecuencia como extracto natural, sobre todo en comunidades rurales de escasos recursos económicos, donde los agricultores tienen pocas posibilidades de comprar insecticidas comunes que en general son costosos.

Conclusiones El piretro probado (Tanacetum coccineum) mostró actividad insecticida con todas las concentraciones probadas en larvas de mariposa de rayas blancas Chlosyne ehrenbergii. Con extracto acuoso a 0.005% de piretro la mortalidad real fue de 39%, con 0.025% de piretro fue de 73%, mientras que 0.05 y 0.1% de piretro causaron mortalidad de 100%. El piretro mostró actividad insectistática, manifestada por regurgitación, convulsiones, arálisis, disminución de la alimentación, reducción del movimiento, así como inhibición de la metamorfosis al impedir cambios de estados biológicos de larva a pupa o de pupa a adulto.

Agradecimientos Al Dr. Iram Bravo Mojica, Dr. Jesús Romero Nápoles, Dr. J. Concepción Rodríguez Maciel y Dr. Ángel Villegas Monter, quienes me asesoraron en el Colegio de Postgraduados, mientras permanecí en esa institución realizando este trabajo. A la Ing. María de los Ángeles Rodríguez Pacheco, Yair Agustín de Santiago Rodríguez e Isael de Santiago Rodríguez, por su apoyo en el manejo de insectos y plant5as experimentales.

Literatura Citada Casida, J. E. and G. B. Quistad. 1995. Pyrethrum-a benefit to human welfare. In: Pyrethrum Flowers: Production, Chemistry, Toxicology and Uses. J E Casida, G B Quistad (eds). Oxford University Press. Oxford. pp:345-356. De Santiago-de Santiago, A., J. C. Rodríguez Maciel, H. Bravo Mojica, Á. Villegas Monter y J. Romero Nápoles. 2005. Producción de inflorescencias y tallos florales de piretro (Tanacetum coccineum) en Montecillo, México. Revista Fitotecnia Mexicana 28(3): 279-285.

894 Elliot, M. 1995. Chemicals in insect control. In: Pyrethrum Flowers: Production, Chemistry, Toxicology and Uses. J E Casida, G B Quistad (eds). Oxford University Press. Oxford. pp:3-31. García, E. 1973. Modificaciones al Sistema de Clasificación Climática de Köppen (para adaptarlo a las condiciones de la República Mexicana). Universidad Nacional Autónoma de México, D. F. pp:9, 11, 69, 132. Gullickson, W. D. 1995. History of pyrethrum in the 1970s and 1980s. In: Pyrethrum Flowers: Production, Chemistry, Toxicology and Uses. J E Casida, G B Quistad (eds). Oxford University Press. Oxford, England. pp:32-46. Jovetic, S. 1994. Natural pyrethrins and biotechnological alternatives. Biotech.and Develop. Monitor 21:12-13. Pyrethrum Bureau. 1990. News and features: Pyrethrum against a common pest of salmon fish in Norway. Report Reaching Pyrethrum Bureau. Pyrethrum Post 17:157-158. Pyrethrum Bureau. 2004. Pyrethrum. Nakuru, Kenya. 7 p. Sugavanam, B. 1995. Technical and Marketing Assistance to Pyrethrum Producing Countries. United Nations Industrial Development Organization (UNIDO). Rwanda. pp:41-52. Wink, M. 1993. Production and application of phytochemicals from an agricultural prospective. In: Phytochemistry and Agriculture Proceedings of the Phytochemical Society of Europe. T A Van Beek, H Breteler (eds). Clarendon Press, Oxford. pp:180-186. Yepsen, R. B. Jr. (ed.). 1976. Organic plant protection. Rodale Press, Pennsylvania. pp:39- 51.

895 ESTIMACIÓN DE LA CANTIDAD DE TEJIDO NECESARIA DE Algarobius prosopis (LECONTE) (COLEOPTERA: BRUCHIDAE) PARA CUANTIFICAR PROTEÍNA TOTAL

Estimation of the Quantity of Necessary Tissue of Algarobius prosopis (LeConte) (Coleoptera: Bruchidae) for Quantification of Total Protein

Ismael Hernández-Betancourt, Alberto Flores-Olivas y Mariano Flores-Dávila. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Buenavista, Saltillo, Coahuila, C.P. 25315, México. [email protected]

Palabras Clave: Mezquite, Algarobius prosopis, Cuantificación de proteínas

Introducción La resistencia inducida en los insectos por el uso de químicos sintéticos principalmente, preocupa en todo el mundo. Paradójicamente así como se ha logrado aumentar la producción y productividad mediante el uso de plaguicidas, al mismo tiempo, se han ocasionado alteraciones de todo tipo, incluyendo el de resistencia en las plagas (Zettler y Keever, 1994). Entre las metodologías que existen para la detección de resistencia destacan: (1) El empleo de bioensayos con el manejo de tiempos y concentraciones múltiples, los cuales señalan las dosis o tiempos letales (DL o TL) que son efectivas para matar a un porcentaje determinado de la población, es decir las DLx y TLx; (2) por otra parte, está el uso de la biología molecular para la elaboración de los perfiles de ADN, con lo que se puede detectar a los genes responsables de la resistencia; y (3) las pruebas bioquímicas, que sirven para determinar los contenidos de enzimas específicas que actúan en el fenómeno. También evaluar las cantidades de proteína mediante pruebas bioquímicas sirve para que en base a ésta, se examinen diversos componentes en algún sistema biológico; Armienta-Aldana et al. (2003), por medio de la cuantificación de proteína, estudiaron el patrón de isoenzimas proteolíticas para encontrar las relaciones genéticas entre poblaciones naturales de diferentes zonas geográficas, con el objeto de instaurar la estabilidad genética de Prostephanus truncatus. Entre los métodos bioquímicos más usados para determinar proteína están el de Lowry (1951), el de Layne (1957), y el de Bradford (1976), que es el más estable, solo que para usarse se precisa de estimar la cantidad de tejido necesaria, de acuerdo al tamaño de la especie, porque el método tiene un rango de sensibilidad de entre 60 y 140 μg; y ha sido utilizado y se ha constatado su efectividad en muchos casos, por ejemplo en Anopheles albimanus (Brogdon, 1984) y Plutella xylostella (Maa y Liao, 2000). El presente estudio se realizó para adaptar un método de cuantificación de proteína total, que definiera el número de individuos o cantidad de tejido necesaria para efectuar la medición en Algarobius prosopis, que es el integrante más numeroso del complejo de insectos de la familia Bruchidae que ataca la semilla de mezquite (Prosopis spp) y ocasiona daño limitando su forma natural de dispersión (Johnson, 1983); también el estudio conlleva obtener la información preliminar y las destrezas fundamentales para posteriormente trabajar en la cuantificación de enzimas específicas relacionadas con resistencia a insecticidas en esa especie.

896 Materiales y Método Los individuos de A. prosopis usados en el estudio fueron obtenidos de muestras de vainas maduras de mezquite recolectadas en la Región Sureste de Coahuila, y fue necesario identificarlos mediante las claves taxonómicas y a través de la genitalia, debido a que los brúquidos que atacan la semilla de mezquite en campo integran un complejo y poseen similitudes morfológicas difíciles de diferenciar a simple vista. El trabajo se realizó en el Laboratorio de Parasitología Molecular de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN). Para el efecto se precisó de crear una curva estándar y se utilizó como proteína de referencia la Albúmina Sérica Bobina (BSA), con una concentración de 1.4 mg/mL (Kit-II de Bio-Rad). Se definieron seis valores de concentración de 0.05, 0.15, 0.25, 0.35 0.45 y 0.50 mg/mL y se corrieron con 15 repeticiones cada una. Las lecturas de proteína se hicieron por colorimetría, empleando los valores de absorbancia y con los promedios se estimó la curva de referencia; el instrumento usado fue un lector de placas Stat-Fax 2100 (Awareness Technology, Palm, City Florida) (Fig. 1). Los homogenatos se prepararon mediante la maceración de los ejemplares con un homogenizador de tejidos en tubos Eppendorf de 1.5 mL y buffer de fosfato con el pH ajustado a 7.2. Tomando en cuenta la sensibilidad que presenta el método se utilizaron homogenatos preparados de 1.0 mL con 3, 2, 1, 0.50, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25 y 0.05 insectos, para explorar los valores de contenido de proteína, y poder definir la cantidad de insectos y/o fracciones adecuadas a la prueba. La preparación de las fracciones se hizo a partir de un individuo y se realizaron 15 repeticiones en las lecturas a 620 nm con tiempo 0, es decir con lectura inmediata de cada homogenato. Con los datos obtenidos y usando la curva de referencia, se determinó el contenido total de proteína a través de los valores de absorbancia resultantes

Resultados y Discusión El la Figura. 1 y en el Cuadro1 se consignan los resúmenes estadísticos básicos obtenidos, tanto del cálculo de la curva estándar como de la de las lecturas de cada homogenato y en términos generales se reporta una variación pequeña.

1.800

1.600

1.400

1.200

1.000

0.800 0.600 y = 1.5246x + 0.8794 2

Absorbancia(nm) R = 0.9146 0.400

0.200

0.000 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Cont. de proteína (mg/mL)

Figura. 1. Curva estándar para la estimación de la cantidad de proteína en Algarobius prosopis

897 La curva de referencia seguramente aún puede ser mejorada, tomando en cuenta la R2 resultante, es este caso es posible que el tiempo de almacenamiento de los reactivos en el laboratorio haya influido en el valor obtenido (0.91).

Cuadro 1. Lecturas de Absorbancia (nm) para la estimaciónde proteína total en Algarobius prosopis Número de Insectos Repetición 3 2 1 0.5 0.4 0.35 0.30 0.25 0.05 1 1.700 1.489 1.378 1.073 1.056 1.013 0.995 0.885 0.659 2 1.740 1.477 1.527 1.178 1.018 0.997 0.972 0.918 0.674 3 1.667 1.497 1.498 1.137 1.022 1.003 0.983 0.915 0.680 4 1.671 1.552 1.493 1.140 1.073 1.081 1.060 0.926 0.669 5 1.704 1.519 1.471 1.170 1.070 1.062 1.035 0.932 0.694 6 1.601 1.551 1.517 1.193 1.065 1.039 1.015 0.895 0.676 7 1.695 1.517 1.433 1.174 1.023 1.038 1.020 0.925 0.695 8 1.678 1.509 1.539 1.158 1.069 1.067 1.047 0.904 0.684 9 1.673 1.502 1.535 1.179 1.042 1.047 1.025 0.869 0.702 10 1.779 1.576 1.576 1.158 1.065 1.038 1.010 0.917 0.674 11 1.777 1.519 1.510 1.163 1.073 1.030 1.010 0.900 0.701 12 1.806 1.550 1.476 1.166 1.068 1.036 1.016 0.911 0.705 13 1.799 1.520 1.481 1.175 1.094 1.051 1.029 0.953 0.719 14 1.824 1.529 1.473 1.085 1.066 1.032 1.018 0.934 0.705 15 1.840 1.581 1.475 1.136 1.049 1.014 0.995 0.946 0.693

Media 1.730 1.526 1.492 1.152 1.057 1.037 1.015 0.915 0.689 Varianza 0.005 0.001 0.002 0.001 0.000 0.001 0.001 0.001 0.000 Desviación estándar 0.070 0.031 0.047 0.034 0.022 0.023 0.023 0.022 0.017 Coef. de variación 4.058 2.005 3.167 2.949 2.072 2.262 2.280 2.454 2.400

Contenido de proteína mg/mL 0.558 0.424 0.402 0.179 0.116 0.103 0.089 0.024 -0.125

Es importante evitar la transferencia de fragmentos de tejido a los pozos de las placas, ya que esto ocasiona errores en las lecturas, que pueden ser detectados en la revisión de los valores individuales de cada celda (Hemingway, 1986). Se tuvo una variación pequeña entre las lecturas de absorbancia, lo cual es una característica valiosa que indica una buena manipulación de las muestras. Debido a que el método de Bradford (1976), presenta la sensibilidad en el rango de 60 a 140 μg, con los resultados obtenidos se concluye que para la cuantificación de proteína en A. prosopis se deben de emplear entre 0.50 y 0.30 individuos de esta especie; con la información generada se está en condiciones de pasar a la etapa posterior de cuantificación de enzimas específicas relacionadas con resistencia a insecticidas en esa especie.

Agradecimientos En memoria del Dr. Eugenio Guerrero-Rodríguez, gran maestro y valioso amigo; a un año de su partida.

898 Literatura Citada Armienta-Aldana, E., M. Vázquez-Arista, M. Alvarado-Balleza y M. G. L. Basurto- Cadena. 2003. Estabilidad proteolítica de Prostephanus truncatus (Horn) (Coleoptera: Bostrichidae) en México. Acta Universitaria 13(1): 25-28. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for cuantification of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72: 248-254. Brogdon, W. G. 1984. Mosquito protein microassay-I, protein determination for small potions of single mosquito homogenates. Comp. Biochem. Physiol. 79B: 457-460. Hemingway, J. 1986. Techniques to detect insecticide resistance mechanisms (field and laboratory manual). World Health Organization. 33p. Johnson, C. D. 1983. Handbook on seed insects of Prosopis species. FAO. Rome, Italy. Layne E. 1957. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Methods in Enzimoligy 10: 447-455. Lowry, O. H., N. J. Rosbrough, A. L. Far, and R. J. Randall.1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 265-275. Maa, W. C. and S. C. Liao. 2000. Culture-dependent variation in esterase isozymes and malathion susceptibility of diamondback moth Plutella xylostella L. Zoological Studies 39: 375-386. Zettler, J. L., Keever, D. W., 1994. Phosphine resistance in cigarette beetle (Coleoptera: Anobiidae) associated with tobacco storage in the southeastern United States. J. Econ. Entomol. 87: 546-550.

899 AISLAMIENTO DE ATRAYENTES NATURALES EN EL PICUDO DE LA GUAYABA Conotrachelus dimidiatus

Isolation of natural attractants in the guava weevil Conotrachelus dimidiatus

Karina Contreras-Montañez y Felipe Tafoya. Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes, Av. Universidad #940, 20100, Aguascalientes, Aguascalientes, México. [email protected]

Palabras Clave: Volátiles, aireación dinámica, SPME, Psidium guajava, Aguascalientes.

Introducción La guayaba Psidium guajava L. fruta apreciada por su exquisito sabor y aroma, en la actualidad se le cultiva en todas las áreas tropicales y subtropicales del mundo (González, 2002; Mata y Rodríguez, 1990). Los principales países productores de guayaba son India y México, con una producción de 200 mil y 115 mil toneladas, y superficies de 60 mil y 20 mil hectáreas respectivamente (Cortés et al. 1994). Aunque la composición química varia de manera significativa entre cultivares y localidades sus compuestos generalmente son: vitamina A, vitamina B3, vitamina C, vitamina G4, agua, proteína, grasa, azúcares, carbohidratos, fibras, taninos, cenizas. También cuenta con calcio, hierro, fósforo, tiamina, riboflavina, niacina y ácido ascórbico (Mata y Rodríguez, 1990). Sus constituyentes volátiles han sido objeto de investigaciones globales; por medio de cromatografía de gases se han identificado 22 compuestos de una fracción volátil de puré de guayaba. También se reportan 11 terpenos de guayaba, con importancia en el sabor y en la atracción de insectos. El mayor componente en el β-cariofileno (95%), el cuál puede desempeñar un papel importante en el aroma (Mata y Rodríguez, 1990). Torline, citado por Dupaigne (1978), encontró e identificó por cromatografía de gases al menos 37 constituyentes volátiles, muchos de los cuales se encuentran también en frutos de otras especies frutales. De los compuestos identificados, 55% fueron ésteres; siendo los mas representativos: etil acetato (25%), etil exanoato (15.5%) y etil butanoato (8.7%). Se detectaron dos hidrocarbonos monoterpenos, que constituyeron el 1.5% de la esencia; dentro de ellos se encontró más humuleno que β-cariofileno (Mata y Rodríguez, 1990). El ácido ascórbico es el compuesto principal en esta fruta; su contenido es mayor en la cáscara que en la pulpa y que en el “corazón”. En su constitución son importantes algunos ácidos orgánicos; entre ellos se encuentran: láctico, málico, cítrico, galacturónico, glicólico y fumárico (Mata y Rodríguez, 1990). El fruto del guayabo se ve afectado por diversos organismos plaga, los daños pueden ser directos, como por ejemplo, el caso de picudos y mosca de la fruta que dañan frutos y ocasionan pérdidas en la producción, o indirectos como el provocado por la mosquita blanca, que ocasiona la presencia de fumagina en las hojas que trae consigo una disminución en la eficiencia fotosintética. Los principales insectos plaga que afectan la productividad de las huertas de guayabo de la región de Calvillo (Aguascalientes) y Cañón de Juchipila (Zacatecas) son: el complejo de picudos de la guayaba (género Conotrachelus

900 spp), mosca de la fruta (Anastrepha striata) y Temolillo (Cyclocephala lunulata) (González, 1983). El picudo de la guayaba Conotrachelus dimidiatus es considerado como la principal plaga del cultivo del guayabo en la región Calvillo-Cañones, ya que llega a infestar hasta 70% de la superficie (Villaseñor, 1977) y, en casos extremos, provoca la pérdida de hasta el 60% de la producción (Velázquez. 1975). En este trabajo se reportan las técnicas de aislamiento de los volátiles asociados tanto al fruto de la guayaba e insectos adultos del picudo de la guayaba; así como una identificación preliminar de los mismos. La estrategia a mediano y largo plazo es emplear tales compuestos como atrayentes naturales para el picudo de la guayaba para su uso como estrategia de manejo integrado en huertos comerciales de guayabo en Calvillo, Aguascalientes.

Materiales y Método La investigación se llevó a cabo en el laboratorio de Ecología de la Universidad Autónoma de Aguascalientes. El material biológico se tomó de huertos de guayaba en el Municipio de Calvillo, Aguascalientes, localizado en longitud W 102°51’, latitud N 21º 51´ y 1667 m de altitud. Dicho material biológico consistió en la recolección de guayabas en diferentes etapas de maduración. Adicionalmente se colectaron adultos de picudo de la guayaba que fueron previamente separados por sexo previo al aislamiento por aireación dinámica (AD). Este procedimiento consiste en colocar el material biológico en un recipiente con una entrada conectada a una bomba de aire, adaptada a un filtro de carbón activado para limpiar el aire que entra al sistema. Una segunda manguera funciona como salida del aire donde se inserta una trampa empacada con 50 mg de adsorbente Super-Q (Alltech), para capturar los volátiles desprendidos del material biológico. El flujo del sistema fue de 1lt min -1. La captura de los volátiles se realizó durante 24 h a 23±2 ºC. Los volátiles fueron eluídos del adsorbente con 3 ml de hexano, y concentrados a 60 µl con corriente suave de nitrógeno para su posterior análisis en el cromatógrafo de gases. Complementariamente se realizó la técnica de micro extracción en fase sólida (SPME), donde los volátiles se capturaron usando una fibra recubierta con 100µm de polidimetilsiloxano (Supelco). Mediante esta técnica, libre de solventes, se coloca el material biológico en un recipiente de vidrio cerrado herméticamente hasta alcanzar las condiciones de equilibrio, posteriormente se insertó y expuso una fibra de polaridad media de SPME por un tiempo de 15 min. Para el análisis de los aislamientos de tomarán muestras de 1 µl y se inyectaron en un cromatógrafo de gases Agilent (modelo 6850) equipado con sistema de inyección manual, inyector split-splitless y detector de ionización de flama. Con nitrógeno como gas acarreador y columna capilar HP1. La temperatura inicial del horno fue 50 ºC por un min, rampa 1 °C min-1 hasta alcanzar 70 °C durante 1 min. Luego se aumenta 5 °C min-1 hasta 250 °C manteniéndose por 21 min. Para la identificación preliminar de compuestos se empleó un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (GC-MS) y la biblioteca NIST 98 (National Institute of Standar and Technology).

901 Resultados Para los volátiles obtenidos de material vegetal (frutos verdes de guayaba) en la técnica de aireación dinámica detectó 11/12 picos principales del aislamiento. El mayor compuesto para los volátiles verdes mediante esta técnica se obtuvo a los 7.11 min Por otra parte la técnica de micro extracción en fase sólida por su parte detecto 9/12 picos principales, siendo el de mayor concentración a los 7.89 min. (Tabla 1).

Cuadro 1.- Comparación de captura (presencia – ausencia) de volátiles de guayaba verde mediante aireación dinámica y micro-extracción en fase sólida (SPME).

Tiempo de Técnica de aislamiento retención (min) Aireación SPME dinámica 2.8 Si No 2.6 No Si 3.8 Si Si 4.7 Si No 7.1 Si * No 7.2 Si Si 7.8 Si Si * 8.3 Si Si 8.6 Si Si 8.9 Si Si 9.0 Si Si 9.3 Si Si * Pico de mayor concentración

En los aislamientos obtenidos a partir de insectos se obtuvo, comparativamente con los aislamientos de frutos verdes, una menor cantidad de compuestos. Ambas técnicas ofrecieron un perfil semejante para machos y hembras. Sin embargo la aireación dinámica (Fig. 1) detectó un número mas variado de compuestos con respecto a la micro extracción en fase sólida (Fig. 2) que se concentraron en la parte media del cromatograma. Una identificación preliminar de tales compuestos, mediante la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, mostró compuestos como limoneno, alfa-pineno y cariofileno en los frutos verdes de guayaba y el 3 hexen – 1 ol, 1-hexanol 2-etil y tetradecano para los aislamientos de machos y hembras.

F I D 41machos05jul07

41machos06_Jul_2007.dat

0.20 Retention Time 0.20 Name

7.063

0.15 0.15

Volt Volt

0.10 0.10 11.386

8.997

3.513 10.217 4.822

0.05 2.799 0.05

7.637

9.505 9.961

8.546

8.368

10.791

13.383 6.388

7.879

3.735 6.599

11.887 12.516

4.426 5.908

4.092 5.525 13.939

9.335 0.00 0.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Minutes Figura. 1.- Volátiles de machos de Conotrachelus dimidiatus aislados mediante la técnica de aireación dinámica. Cuarenta y un machos, 21 hrs de captura de volátiles.

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F I D SPMEmachos06jul07 Retention Time Name

0.20 0.20

9.108

0.15 0.15

9.212

Volt Volt

0.10 0.10

7.803

8.573

8.756

8.858

0.05 9.343 0.05

7.051

10.771 9.422

0.00 8.958 0.00

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Minutes Figura 2.- Volátiles de machos de Conotrachelus dimidiatus aislados mediante la técnica de micro extracción en fase sólida. Cinco machos adultos, 15 min de captura de volátiles.

Discusión y Conclusiones

Las técnicas de aireación dinámica y micro extracción resultaron eficientes en la captura y retención de volátiles de frutos de guayaba e insectos adultos. Aunque ambos procedimientos pueden capturar un número similar de compuestos si ocurren variaciones en la cantidad de compuestos que logra retener cada una de ellas. Es probable que resulte determinante la afinidad entre la polaridad de los compuestos y los solventes (aireación) o las fibras (SPME) que se emplean en cada tipo de extracción (Pawliszyn, 1997). Para efecto de aislar e identificar compuestos la técnica de SPME parece ofrecer algunas ventajas sobre la aireación dinámica en los siguientes aspectos: amplia gamma de fibras de distinta polaridad, sensible para capturar compuestos en pequeñas concentraciones (ppm), no se requiere ninguna modificación para insertar las fibras en el equipo de cromatografía de gases y por no usar solventes disminuye el riesgo de contaminación. En caso de ser necesaria mayor cantidad de compuestos para correr muestras de un solo aislamiento en varios equipos o para varias técnicas, la técnica de aeración dinámica se ve favorecida. Así mismo la aireación permite mantener insectos vivos durante horas o días para la captura continúa de volátiles. Algunos de los compuestos aislados de los frutos de guayaba han sido previamente reportados como el caso del cariofileno, limoneno y 3-hexen 1-ol (Mata y Rodríguez, 1990; Stevens et al. 1970). Este ultimo compuesto también apareció en nuestros aislamientos de insectos probablemente como consecuencia de haber sido alimentados previamente sobre frutos de guayaba.

Literatura Citada Cortés B., J., A. Nava C. y V. H. Santoyo C. 1994. Perspectivas del cultivo de guayabo en la Región Centro-Norte de México ante el TLC, In: El TLC y sus repercusiones en

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