Svoluji k zapůjčení své diplomové práce ke studijním účelům a prosím, aby byla vedena přesná evidence vypůjčovatelů. Převzaté údaje je vypůjčovatel povinen řádně ocitovat.

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie

Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru

Ondřej Vít

Praha 2010

2 Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Jitka Forstová, Csc.

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně, jen s použitím citované literatury a pod vedením vedoucí diplomové práce.

Ondřej Vít

3 Na tomto místě bych chtěl poděkovat doc. RNDr. Jitce Forstové, CSc. neocenitelnou pomoc, rady a připomínky během vypracovávání této diplomové práce. Dále děkuji všem členům naší laboratoře za zaučení do metod a vytvoření příjemného pracovního prostředí. Děkuji Ondřeji Šebestovi za pomoc s konfokálním mikroskopem, Vojtěchu Žílovi za zhotovení elektronmikroskopických snímků a Ludmile Vítámvásové za pomoc s 2D elektroforézami. Děkuji svým rodičům za podporu, bez které bych nemohl tuto práci dokončit. Děkuji Evičce Vopálkové za toleranci, lásku a duševní podporu, bez které bych to nezvládl.

4 Předkládaná diplomová práce vznikla v letech 2007 – 2010 za podpory grantů 1M0508, MSM0021620858 a LC545 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.

5 Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru

Abstrakt. Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní N-koncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým α-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní domény vede ke ztrátě VP2 a VP3 interagovat s vnitrobuněčnými membránami a samotná unikátní N-koncová část VP2 (která obsahuje první hydrofobní doménu) nepostačuje k interakcím s vnitrobuněčnými membránami. Tyto výsledky naznačují, že druhá hydrofobní doména VP2 a VP3 je důležitá pro afinitu VP2 a VP3 k membránám. Dále byly pomocí SDS-PAGE pro analýzu hmotnostní spektrometrií (MS) separovány dvě izoformy VP2 a VP3, lišící se elektroforetickou mobilitou. MS analýzou byla nalezena acetylace N-koncového alaninu obou forem VP3. 2D elektroforézou byly detekovány nejméně čtyři izoformy VP2 a VP3, což je, společně s předběžnými výsledky MS analýz, náznakem existence několika fosforylací obou minoritních kapsidových proteinů.

Klíčová slova: myší polyomavirus, VP2, VP3, kapsidové proteiny, posttranslační modifikace, vstup viru do buňky.

6 Studies of minor capsid proteins of the mouse polyomavirus

Abstract. Mouse polyomavirus (MPyV) is a small non-enveloped virus. Its capsid consists of 72 pentamers of the major capsid protein VP1. The central cavity of each VP1 pentamer contains one minor capsid protein, either VP2, or VP3. The minor capsid proteins are dispensable for capsid formation, but their presence is required for infection of the host cell, presumably because of their anticipated functions during virus entry. After internalization, MPyV virions traffic to endoplasmic reticulum (ER). VP2 and VP3 have been proposed to function as factors responsible for penetration of ER membranes, which is required for subsequent delivery of the viral DNA into the nucleus, a key step of the early phase of MPyV infection. Three hydrophobic domains were predicted in the sequence of VP2 and VP3. First in the unique N-terminal part of VP2, second and third in the common part of VP2 and VP3. The third domain corresponds to C-terminal VP1-binding α-helix. It has been previously found in our laboratory, that VP2 and VP3 fused to N-terminus of EGFP, when expressed in mammalian cells, display properties similiar to the wild-type VP2 and VP3, namely affinity to intracellular membranes and high cytotoxicity. Expression plasmids carrying mutated VP2 and VP3 fused to N-terminus of EGFP were prepared to determine the hydrophobic domain, responsible for previously observed membrane affinity and cytotoxicity. The results show, that deletion of the second hydrophobic domain results in loss of ability of VP2 and VP3 to interact with intracellular membranes, and that the unique part of VP2 (which contains the first hydrophobic domain) on its own is not sufficient for interaction with intracellular membranes. These results indicate that the second hydrophobic domain of is important for membrane affinity of VP2 and VP3. In addition, two isoforms of VP2 and VP3, differing in mobility on SDS-PAGE, were separated for mass spectrometry (MS) analysis and further characterized. The MS analysis showed acetylation of N-terminal alanine of both isoforms of VP3. At least four isoforms of VP2 and VP3 were identified by 2D electrophoresis, which, together with preliminary MS analysis results, indicate possible multiple phoshorylation sites on both minor capsid proteins.

Key words: mouse polyomavirus, VP2, VP3, capsid proteins, posttranslational modifications, virus cell entry.

7 Obsah 1. ÚVOD ...... 14 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED ...... 16 2.1. Polyomaviry ...... 17 2.2. Myší polyomavirus ...... 18 2.2.1. Struktura kapsidy ...... 18 2.2.1.1. Hlavní strukturní protein VP1 ...... 19 2.2.1.2. Minoritní strukturní proteiny VP2 a VP3 ...... 20 2.2.2. Organizace genomu ...... 24 2.2.3. Infekční cyklus MPyV ...... 24 2.2.3.1. Vstup viru do buňky a transport do perinukleárního prostoru ...... 25 2.2.3.2. Doručení virové DNA do buněčného jádra ...... 28 2.2.3.3. Časná transkripce ...... 32 2.2.3.4. Časné proteiny ...... 32 2.2.3.5. Replikace virové DNA ...... 33 2.2.3.6. Pozdní exprese ...... 34 2.2.3.7. Morfogeneze virionů ...... 35 2.2.3.8. Smrt hostitelské buňky – role VP2 a VP3 ...... 35 2.3. Virové kapsidové proteiny jiných virů podobné VP2 a VP3 polyomavirů ...... 38 2.3.1. VP4 poliovirů ...... 40 2.3.2. Protein γ nodavirů ...... 42 2.3.3. Protein μ1 reovirů ...... 42 2.3.4. VP5 rotavirů ...... 44 2.3.5. Kapsidové proteiny parvovirů ...... 45 2.3.6. L2 papillomavirů ...... 46 2.3.7. Protein VI adenovirů ...... 48 2.3.8. Viroporiny ...... 49 3. CÍLE PRÁCE ...... 52 4. MATERIÁL A METODY ...... 54 4.1. Materiál ...... 55 4.1.1. Přístroje ...... 55 4.1.2. Chemikálie ...... 56 4.1.3. Složení používaných roztoků ...... 57 4.1.4. Antibiotika ...... 58 4.1.5. Kultivační média ...... 58 4.1.5.1. Bakteriální média ...... 58 4.1.5.2. Média pro tkáňové kultury ...... 58

8 4.1.6. Protilátky ...... 59 4.1.6.1. Primární protilátky ...... 59 4.1.6.2. Sekundární protilátky ...... 59 4.1.7. Komerční roztoky ...... 60 4.1.8. Enzymy ...... 60 4.1.9. Markery molekulových hmotností ...... 60 4.1.10. Vektory ...... 61 4.1.11. Primery/oligonukleotidy ...... 62 4.1.12. Buněčné linie, bakteriální kmeny a viry ...... 63 4.1.13. Komerční soupravy ...... 63 4.1.14. Ostatní materiál ...... 63 4.2. Sterilizace ...... 64 4.3. Práce s bakteriemi ...... 64 4.3.1. Kultivace bakterií ...... 64 4.3.2. Příprava kompetentních buněk pro elektroporaci ...... 64 4.3.3. Transformace bakterií elektroporací ...... 64 4.3.4. Skladování bakterií ...... 65 4.4. Práce s tkáňovými kulturami ...... 65 4.4.1. Pasážování savčích buněk linie 3T3 a 3T6 ...... 65 4.4.2. Transfekce savčích buněk elektroporací ...... 65 4.4.3. Transfekce savčích buněk TurboFectem ...... 66 4.4.4. Fixace a permeabilizace buněk na mikroskopických sklíčkách ...... 66 4.4.5. Imunofluorescenční značení proteinů v buňkách ...... 66 4.4.6. Konfokální mikroskopie živých buněk ...... 67 4.4.7. Synchronizace savčích buněk před infekcí ...... 67 4.4.8. Infekce savčích buněk virem ...... 67 4.5. Izolace myšího polyomaviru ...... 67 4.5.1. Centrifugace přes sacharózový polštář ...... 68 4.5.2. Izopyknická centrifugace v rovnovážném gradientu CsCl ...... 68 4.5.3. Dialýza ...... 69 4.5.4. Hemaglutinační test ...... 69 4.5.5. Určení infekčního titru viru na kultuře myších fibroblastů ...... 70 4.6. Elektronová mikroskopie ...... 70 4.6.1. Negativní barvení ...... 70 4.7. Práce s DNA ...... 71 4.7.1. Agarózová elektroforéza ...... 71 4.7.2. Maxipreparace plazmidové DNA - alkalická metoda ...... 71

9 4.7.3. Minipreparace plazmidové DNA – alkalická metoda ...... 71 4.7.4. Odstranění RNA ze vzorku DNA ...... 72 4.7.5. Deproteinace DNA upraveným fenolem a chloroformem ...... 72 4.7.6. Srážení DNA etanolem ...... 72 4.7.7. Izolace fragmentů DNA z agarózového gelu ...... 73 4.7.8. Izolace plazmidové DNA zbavené endotoxinů pro transfekci savčích buněk ...... 73 4.7.9. Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) ...... 73 4.7.10. Štěpení DNA restrikčními endonukleázami ...... 74 4.7.11. Spojení komplementárních oligonukleotidů ...... 74 4.7.12. Ligace ...... 74 4.8. Práce s proteiny ...... 75 4.8.1. Příprava buněčného lyzátu ...... 75 4.8.2. SDS polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE) ...... 75 4.8.2.1. Příprava gelu ...... 75 4.8.2.2. Příprava gradientového gelu ...... 76 4.8.2.3. Příprava vzorku a vlastní SDS-PAGE ...... 76 4.8.2.4. Fixace a barvení SDS polyakrylamidového gelu ...... 76 4.8.3. Izoelektrická fokusace (IEF), 2D elektroforéza ...... 77 4.8.4. Imobilizace proteinů na membráně ...... 77 4.8.4.1. Dot blot ...... 77 4.8.4.2. Western blot ...... 77 4.8.5. Imunologická detekce proteinů imobilizovaných na membráně ...... 78 5. VÝSLEDKY ...... 79 5.1. Izolace myšího polyomaviru ...... 80 5.1.1. První izolace ...... 80 5.1.2. Druhá izolace ...... 81 5.1.3. Třetí izolace ...... 82 5.1.4. Čtvrtá izolace ...... 83 5.2. Studium izoforem proteinů VP2 a VP3 ...... 86 5.2.1. Sledování výskytu izoforem VP2 a VP3 v průběhu infekčního cyklu ...... 86 5.2.2. Příprava vzorků pro hmotnostní spektrometrii ...... 87 5.2.3. Výskyt izoforem VP2 a VP3 ve VLPs ...... 89 5.2.4. Rozdíl mezi izoformami proteinů VP2 a VP3 není způsoben proteolytickým štěpením na C-konci...... 90 5.2.5. Posttranslační modifikace VP2 a VP3 ...... 91 5.2.5.1. VP3 je na N-koncovém alaninu acetylovaný ...... 92 5.2.5.2. Fosforylace VP2 – předběžné výsledky ...... 94

10 5.2.5.3. MS analýza intaktních proteinů MPyV – předběžné výsledky ...... 94 5.2.6. Dvourozměrná elektroforéza strukturních proteinů MPyV ...... 95 5.3. Příprava plazmidů pro produkci deletovaných forem VP2 a VP3, fúzovaných s EGFP ...... 97 5.3.1. Příprava plazmidu pro expresi unikátní části VP2 (pUV2-NLS-EGFP) ...... 97 5.3.2. Příprava plazmidu pro expresi VP2 s deletovanou hydrofobní doménou 2 (pVP2ΔD2-EGFP) ...... 100 5.3.3. Příprava plazmidu pro produkci VP3 s deletovanou hydrofobní doménou 2 (pVP3ΔD2-EGFP) ...... 103 5.4. Sledování subcelulární lokalizace delečních mutant proteinů VP2 a VP3 fúzovaných s EGFP ...... 105 5.4.1. VP2 s deletovanou společnou částí VP2 a VP3 (kromě NLS), fúzovaný s EGFP (UV2-NLS-EGFP) ...... 105 5.4.2. VP2 s deletovanou hydrofóbní doménou 2, fůzovaný s EGFP (VP2ΔD2-EGFP) ...... 107 5.4.3. VP3 s deletovanou hydrofobní doménou 2, fúzovaný s EGFP (VP3ΔD2-EGFP) ...... 107 5.4.4. Sledování lokalizace mutovaných fúzních proteinů s EGFP v živých buňkách .. 110 6. DISKUSE ...... 112 6.1. Studium izoforem VP2 a VP3 MPyV ...... 113 6.2. Deleční varianty VP2 a VP3, fúzované s EGFP ...... 118 7. SOUHRN ...... 122 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...... 125

11 Seznam použitých zkratek

ATP adenosin trifosfát bp páry bazí BSA bovinní sérový albumin D1 předpokládaná hydrofobní doména 1 proteinu VP2 D2 předpokládaná hydrofobní doména 2 proteinů VP2 a VP3 DAPI 4′,6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid dATP deoxyadenosin trifosfát dCTP deoxycytidin trifosfát ddH2O demineralizovaná destilovaná H2O dGTP deoxyguanosin trifosfát dH2O destilovaná H2O DMEM Dulbeccem modifikované Eaglovo médium DMSO dimetylsulfoxid DPH 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien ds dvouřetězcová (double-stranded) DTT dithiothreitol dTTP deosythymidin trifosfát EDTA etylendiamin-tetraoctová kyselina EGFP enhanced green fluorescent protein EGTA etylenglykol-tetraoctová kyselina ER endoplazmatické retikulum ERAD degradace proteinů asociovaná s ER (ER associated protein degradation) FCS fetální telecí sérum f.f.u. fluorescence forming units FT-ICR iontová cyklotronová rezonance s fourierovou transformací GFP zelený fluorescenční protein (green fluorescent protein) HAU hemaglutinační jednotka (hemagglutination unit) HIV virus lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus) h.p.i. hodin po infekci h.p.t. hodin po transfekci CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonát IAA jodacetamid (iodacet IEF izoelektrická fokusace kbp tisíc párů bazí (base pairs) LT velký T antigen (large T)

12 MALDI-TOF laserová desorpce/ionizace za účasti matrice v kombinaci s detektorem doby letu (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) MCPyV Merkel Cell polyomavirus MPyV myší polyomavirus MS hmotnostní spektrometrie MS/MS tandemová hmotnostní spektrometrie MT střední T antigen (middle T) myr– polyomavirová mutanta, u které nedochází k myristylaci proteinu VP2 NLS jaderný lokalizační signál (nuclear localization signal) ori počátek replikace (origin of replication) PARP polymeráza poly(ADP)-ribózy PBS pufr fosfátových solí (phosphate buffered saline) PCR polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) PDI protein disulfid izomeráza PML promyelocytická leukémie PMSF fenylmetansulfonylfluorid PP2A protein fosfatáza 2A PTA fosfowolframová kyselina (phosphotungstic acid) RPM otáček za minutu (rotations per minute) SDS dodecyl sulfát sodný SDS-PAGE SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza Ser serin ss jednořetězcová (single-stranded) ST malý T antigen (small T) SV40 simian (vacuolating) virus 40 T triangulační číslo TEMED N,N,N',N'-Tetrametylethlenediamin TFA trifluoroctová kyselina tris tris(hydroxymetyl) aminometan Thr threonin Tyr tyrozin VLPs virům podobné částice (virus like particles) VP2/VP3 VP2 a/nebo VP3 VP2– mutanta MPyV neprodukující protein VP2 VP3– mutanta MPyV neprodukující protein VP3 VP2–/VP3– mutanta MPyV neprodukující proteiny VP2 a VP3 wt divoký typ

13 1. ÚVOD Modelové polyomaviry, myší polyomavirus (MPyV) a blízce příbuzný opičí virus SV40, se v minulosti staly předmětem intenzivního výzkumu hned z několika důvodů. Nejprve byly studovány pro svůj onkogenní potenciál, plynoucí z potřeby těchto malých DNA virů navodit u infikovaných buněk vstup do S fáze, aby mohlo dojít k replikaci virové DNA. Polyomaviry posléze posloužily pro pochopení některých základních molekulárně biologických mechanismů, včetně procesu replikace virové DNA a regulace genové exprese. Unikátní schopnost hlavního kapsidového proteinu polyomavirů samovolně se uspořádávat do virům podobných částicí později vedla ke snaze o využití této skutečnosti k terapeutickým účelům. Nejprve byla tato snaha směřována k využití myšího polyomaviru jako nástroje pro doručení cizorodé DNA do buněk, ukázalo se však, že takovýto proces není dostatečně účinný, aby mohl být k terapeutickým účelům využíván. V současné době je proto snaha o využití virům podobných částic myšího polyomaviru směřována spíše ke snaze zjistit, zda je možné jejich prostřednictvím do buněk doručit terapeutický protein, například enzym nebo imunogenní epitop. Touto otázkou se v současné době zabývá i naše laboratoř. Mezi polyomaviry byly postupně objeveny i lidské patogeny. V současné době je známo pět lidských polyomavirů, které vyvolávají u oslabených jedinců (například pacientů podstupujících transplantace) závažné komplikace. V souvislosti s lidskými polyomaviry nelze opomenout také jejich onkogenní potenciál. I z tohoto důvodu jsou polyomaviry intenzivně studovány z hlediska snahy o pochopení molekulárních mechanizmů jednotlivých fází virové infekce, jako je vstup viru do buňky, jeho morfogeneze a navození smrti hostitelské buňky. Tato diplomová práce je příspěvkem k širšímu studiu molekulárních mechanizmů interakcí myšího polyomaviru s hostitelskou buňkou.

15 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Polyomaviry Polyomaviry jsou malé neobalené viry, jejichž genomem je dvouřetězcová DNA. Podle Baltimorovy klasifikace tedy patří do skupiny I (dsDNA viry). Objev polyomavirů spadá do první poloviny 50. let 20. století, kdy byl při studiu viru myší leukémie objeven myší polyomavirus (MPyV) jako agens o odlišných fyzikálních vlastnostech než virus myší leukémie, navozující vznik nádorů u pokusných myší. MPyV byl původně označován pouze jako polyomavirus (z řeckého poly – mnoho a oma – nádor, neboť u myší infikovaných tímto virem se vyvinulo více typů nádorů). Během následujících desetiletí byly objeveny další polyomaviry savců a ptáků, vždy charakteristické svou hostitelskou specifitou a v mnoha případech určitým tkáňovým tropismem. Mezi nejstudovanější polyomaviry dodnes patří opičí virus SV40 [simian (vacuolating) virus 40], objevený v roce 1960, a jemu blízce příbuzné lidské viry BK a JC, objevené shodně v roce 1971 u imunosuprimovaných pacientů. JC virus byl později popsán jako původce poruchy způsobující demyelinizaci buněk centrálního nervového systému, označovanou jako progresivní multifokální leukoencefalopatie. BK virus byl popsán jako původce posttransplantační nefropatie a zánětů močových cest. U zdravých jedinců však tyto viry navozují pouze asymptomatickou latentní infekci. Až do roku 2000 byly polyomaviry a papillomaviry kvůli podobnostem ve struktuře kapsidy řazeny do společné čeledi Papovaviridae. Vzhledem k sekvenční nepříbuznosti a odlišné replikační strategii byla tato čeleď rozdělena na čeledi Polyomaviridae a Papillomaviridae. (IMPERIALE a MAJOR, 2007) Další dva lidské polyomaviry, blízce příbuzné virům SV40, BK a JC, byly objeveny v roce 2007 a nazvány WU (Washington University) virus a KI (Karolinska Institutet) virus. Oba tyto viry navozují, stejně jako BK a JC, asymptomatickou latentní infekci, avšak u kojenců a imunosuprimovaných pacientů mohou vyvolat onemocnění respiračního traktu. (ALLANDER et al., 2007, GAYNOR et al., 2007) Hned v následujícím roce byly objeveny sekvence dalšího lidského polyomaviru integrované v chromozomální DNA v karcinomech Merkelových buněk, agresivních kožních nádorech postihujících především starší a imunosuprimované jedince. Tento virus, první lidský polyomavirus, u kterého byla popsáno spojení se vznikem nádorů, byl nazván Merkel Cell polyomavirus (MCPyV). Oproti předchozím čtyřem lidským polyomavirům se však nejedná o typický primátí polyomavirus, je sekvenčně bližší spíše skupině polyomavirů, příbuzných myšímu polyomaviru (tzv. „hlodavčí větev“, viz obr. 2.1). (FENG et al., 2008)

17 Obr. 2.1. Fylogenetický strom čeledi Polyomaviridae na základě sekvence velkého T antigenu, rozdělený na tři podskupiny polyomavirů. Měřítko vyznačuje 0,1 aminokyselinových substitucí na pozici v sekvenci (upraveno podle FENG et al., 2008).

2.2. Myší polyomavirus

2.2.1. Struktura kapsidy Kapsida myšího polyomaviru je tvořena třemi strukturními proteiny – VP1, VP2 a VP3, které obklopují „nucleocore“ (virový minichromozom), tvořené virovou DNA v komplexu s hostitelskými histony H2A, H2B, H3 a H4 ve formě nukleozómů a proteinem VP1. Histon H1 je před vznikem virionů součástí virových minichromozomů (VARSHAVSKY et al., 1976) a během morfogeneze virionů je pravděpodobně vytěsněn proteinem VP1 (WINSTON et al., 1980). Strukturní proteiny vytvářejí kapsidu s ikosahedrální symetrií a triangulačním číslem T = 7. Kapsida je tvořena 360 molekulami hlavního strukturního proteinu VP1, uspořádaných do 72 pentamerů (obr. 2.2). S každým pentamerem je asociována jedna molekula proteinu VP2 nebo VP3. Kapsidy polyomavirů jsou stabilizovány Ca2+ ionty (BRADY et al., 1977).

A B

Obr. 2.2. A – model kapsidy polyomaviru SV40 (upraveno podle HARRISON, 2007), B – viriony MPyV pod elektronovým mikroskopem (úsečka = 100 nm, pořídil V. Žíla).

18 VP2 a VP3 jsou v krystalografické struktuře virionu viditelné jako elektrondenzní „hroty“, spojené s virovým minichromozomem a čnějící do centrální prohlubně pentamerů VP1 (obr. 2.3) (GRIFFITH et al., 1992).

A B

Obr. 2.3. A – Trojrozměrný model virionu myšího polyomaviru s částečným výřezem kapsidy, vytvořený na základě krystalografické struktury. Světlá část značí kapsidu tvořenou penamery VP1, tmavá část minoritní proteiny (vytvářející „hroty“) a virový minichromozom. B – Elektrondenzitní mapa průřezu pentamerem, hrotem a částí minichromozomu. Pentamer je tvořen jasně definovanou strukturou VP1 po stranách a méně definovanou strukturou minoritního proteinu ve středu pentameru vlivem jeho větší flexibility (převzato z GRIFFITH et al., 1992).

2.2.1.1. Hlavní strukturní protein VP1 Hlavní kapsidový protein VP1 má schopnost samovolně vytvářet pentamery, a při vhodných podmínkách (vhodná iontová síla, přítomnost Ca2+ iontů) i v nepřítomnosti proteinů VP2 a VP3 vytváří virům podobné částice (VLPs – virus like particles, pseudokapsidy) či jiné útvary. Tuto schopnost mají i VP1 purifikované po expresi v E. coli, přestože při expresi v prokaryotických expresních systémech není VP1 posttranslačně modifikován (SALUNKE et al., 1986). VP1 produkovaný E. coli vytváří in vitro kromě ikosahedrálních pseudokapsid složených z 72 pentamerů také struktury z 36, 24 a 12 pentamerů (SALUNKE et al., 1989) a tubulární struktury složené z pentamerů (BAKER et al., 1983). N-koncová oblast proteinu VP1 plní dvojí funkci: jednak se zde nachází sekvenčně nespecifická DNA vazebná doména (MORELAND et al., 1991), zároveň se zde v překryvu s touto doménou nachází jaderný lokalizační signál (MORELAND a GARCEA, 1991, CHANG et al., 1992b). Hlavní část proteinu VP1 je tvořena souborem převážně ß-řetězců, jež jsou propojeny smyčkami a na několika místech navíc krátkými α-helixy. Smyčky označované BC, DE a HI jsou orientovány na povrch kapsidy. Oblast VP1 zodpovědná za navázání MPyV na hostitelský receptor se nachází mezi smyčkami BC a HI. Smyčka označovaná EF je součástí Ca 2+ vazebného místa. C-konec VP1 se skládá z α-helixu, flexibilní části a C-koncového ramena.

19 (RAYMENT et al., 1982, STEHLE et al., 1994, STEHLE a HARRISON, 1997). Funkcí C-koncového ramena VP1 je vzájemné spojení pentamerů VP1 v kapsidě. Oblast posledních 63 aminokyselin každého VP1 vyčnívá z pentameru a váže se na sousední. (LIDDINGTON et al., 1991). VP1 je hostitelskými enzymy posttranslačně fosforylován. Fosforylovány jsou seriny a threoniny. (ANDERS a CONSIGLI, 1983) Fosforylace Thr 156 ovlivňuje morfogenezi virionů (LI a GARCEA, 1994), zatímco funkce fosforylace Thr 63 nebyla dosud objasněna. Může souviset se schopností VP1 navázat se na hostitelský receptor, neboť se nachází na BC smyčce (viz kap. 2.2.3.1). VP1 je dále acetylován (BOLEN et al., 1981), sulfatován (LUDLOW a CONSLIGLI, 1987), hydroxylován (LUDLOW a CONSIGLI, 1989) a methylován. Methylovány jsou lysiny a argininy na N-konci. Tato modifikace pravděpodobně usnadňuje vazbu VP1 na DNA (BURTON a CONSIGLI, 1996).

2.2.1.2. Minoritní strukturní proteiny VP2 a VP3 Minoritní kapsidové proteiny VP2 a VP3 sdílejí společnou část, která odpovídá přibližně C-koncovým dvěma třetinám délky sekvence proteinu VP2. VP2 má navíc ještě N-koncovou unikátní část (obr. 2.4). N-koncový glycin VP2 MPyV je myristylovaný (STREULI a GRIFFIN, 1987). Myristylace VP2 čeledi Polyomaviridae je evolučně konzervovaná, myristylované jsou i VP2 ptačích polyomavirů (SCHMIDT et al., 1989) a SV40, zástupce primátí větve polyomavirů (STREULI a GRIFFIN, 1987).

Obr. 2.4. Srovnání sekvecí proteinů VP2 a VP3. Modře je označena myristylovaná unikátní část proteinu VP2, žlutě společná část VP2 a VP3. Červeně je vyznačena VP1 vazebná doména (označena jako HX) a fialově jaderný lokalizační signál (NLS).

Funkce minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3 není příliš dobře definována. Především bylo zjištěno, že mutanty MPyV neprodukující buď VP2 nebo VP3 mají sníženou schopnost infikovat buňky: mutanta neprodukující VP3 (VP3–) má o jeden řád sníženou infektivitu, mutanta neprodukující VP2 (VP2–) o dva řády sníženou infektivitu (MANNOVÁ et al., 2002). V případě SV40 dospěli DANIELS et al., 2006a, ke shodným závěrům. SV40 s mutovanými iniciačními kodóny pro VP2/VP3 nebo s mutací VP1, která zamezuje interakci VP1 s VP2/VP3, dává vznik virovým částicím, které obsahují virovou DNA v komplexu s histony, vstupují do buňky, avšak nedoručí virovou DNA do jádra (NAKANISHI et al., 2007). Po transfekci genomem viru SV40 s mutovaným iniciačním kodónem pro VP2, VP3, nebo pro oba minoritní kapsidové proteiny, téměř nedochází k reinfekci dalších buněk

20 v kultuře, ačkoli dochází k lyzi infikovaných buněk (DANIELS et al., 2006a). Tato neschopnost reinfekce byla pozorována i u mutant MPyV, neprodukujících VP2 nebo VP3 (MANNOVÁ et al., 2002). Hlavní funkce VP2 a VP3 tedy nejspíš ovlivňují schopnost viru vstupovat do buňky nebo následnou schopnost doručit virovou DNA do jádra. Neschopnost reinfekce u mutant, které neobsahují VP2/VP3 je tedy pravděpodobně způsobena kombinací snížené schopnosti doručit virovou DNA do jádra s dalšími možnými funkcemi VP2 a VP3. Ačkoli se nabízí předpoklad, že funkcí myristylace VP2 je umožnění interakce tohoto proteinu s buněčnými membránami, tato hypotéza nebyla dosud prokázána a funkce této modifikace zůstává jen částečně objasněna. Myristylová kotva dodává proteinům určitou hydrofobicitu, která umožňuje reverzibilní membránové interakce, avšak pro přichycení proteinu k membráně vyžaduje další faktory, např. palmitylaci na blízkém cysteinu, sekvenci pozitivně nabitých aminokyselin, domény vázající fosfolipidy, transmembránové domény nebo přímé meziproteinové interakce. Funkcí myristylovaných proteinových domén je však v jiných případech také zprostředkování proteinových interakcí a navození konformačních změn, které ovlivňují proteinovou terciární a kvartérní strukturu. (MAURER-STROH a EISENHABER, 2004, review) Byly připraveny mutanty MPyV se záměnami N-koncového glycinu za glutamin, kyselinu glutamovou a histidin, u kterých nedochází k myristylaci (myr– mutanty). Tyto mutanty mají značně sníženou infektivitu oproti divokému typu (wt) MPyV, avšak nikoli tak nízkou jako u VP2– a VP3– mutant (viz výše). Výjimkou je mutanta se záměnou N-koncového glycinu za histidin, která infektivitou odpovídá VP2– mutantě, pravděpodobně v důsledku degradace VP2 vlivem zaujetí nesprávné konformace. Bylo pozorováno, že myr– mutanty jsou schopny infikovat a lyzovat buňky, jejich schopnost reinfekce je však nízká. Viriony s nemyristylovanými VP2 neinteragují s některými protilátkami, které váží povrchové epitopy VP1 wt MPyV. Myristylace má tedy pravděpodobně určitý podstatný vliv na konformaci, kterou zaujme VP1 ve vzniklé kapsidě. Je tedy možné, že u myr– mutant dochází k defektům v pozdní fázi infekce při morfogenezi virionů. (MANNOVÁ et al., 2002) Bylo doloženo, že myr– mutanty jsou méně stabilní než wt MPyV při sníženém pH (KRAUZEWICZ et al., 1990). Acidickému prostředí je MPyV vystaven během jeho vstupu do buňky a navíc bylo prokázáno, že jej vyžaduje pro úspěšné doručení virové DNA do jádra (LIEBL et al., 2006, viz kap. 2.2.3.1.). Pravděpodobnou funkcí myristylace VP2 je tedy stabilizace kapsid virionů, během této fáze vstupu viru do buňky. Teplotní stabilita virionů není myristylací ovlivněna, stejně tak nebyl prokázán vliv myristylace VP2 na schopnost enkapsidace virové DNA (SAHLI et al., 1993). VP2 a VP3 se ve virionu nacházejí ve vnitřních prohlubních pentamerů VP1. K jejich interakci s VP1 dochází prostřednictvím C-koncové sekvence aminokyselin, která je značně konzervovaná napříč čeledí Polyomaviridae. Tento segment obsahuje α-helix a část sekvence

21 bez sekundární struktury (obr. 2.5). Interakce mezi VP1 a touto sekvencí je založena především na hydrofobních interakcích (obr. 2.6). U VP2 a VP3 nebylo dosud možné pomocí X-ray krystalografie rozpoznat jiné sekundární struktury než tento α-helix, neboť zbylá část VP2 a VP3, která pravděpodobně neinteraguje s VP1, je příliš flexibilní a pravděpodobně je do značné míry nestrukturovaná. (CHEN et al., 1998) Nutno podoknout, že oblast VP2/VP3, u které byla určena struktura, představuje jen velmi malou část celkové délky proteinu (obr. 2.7) a ve zbylých částech VP2/VP3 se mohou vyskytovat další sekundární struktury.

Obr. 2.5. Stuhový model proteinu VP2 (označen červeně) vloženého do vnitřní prohlubně pentameru VP1 (označen odstíny modré, přední dvě molekuly VP1 nejsou zobrazeny). Plně vyobrazená část proteinu VP2 (aminokyseliny 279 – 296) byla krystalograficky přesně definována, tečkovaná část (aminokyseliny 269 – 278) byla definována bez určení polohy postranních řetězců, strukturu části značené přerušovanou čarou nebylo vlivem její flexibility možno určit. Do modelu není zahrnuta C-koncová oblast za VP1 vazebnou doménou (aminokyseliny 297-319) (převzato z CHEN et al., 1998).

Obr. 2.6. Hydrofobní interakce a vodíkové můstky mezi VP1 a VP2. Světle modře je značena neinteragující molekula VP1, tenká růžová linka značí mírnou strukturní změnu ve VP1 vázající VP2 (značen červeně). Černě popsané jsou aminokyseliny VP2, oranžově popsané jsou aminokyseliny VP1. VP2 se vmezeřuje mezi G2-G2' smyčky sousedících molekul VP1 (převzato z CHEN et al., 1998).

22 Obr 2.7. Délka sekvence VP2/VP3 s určenou prostorovou strukturou v porovnání s celkovou délkou proteinů VP2/VP3. Unikátní část VP2 je zobrazeně světle šedě, společná část VP2 a VP3 tmavě šedě. Sekvence VP2/VP3 s určenou strukturou je znázorněna třemi odstíny červené: nejsvětlejší část odpovídá sekvenci 269 – 278, která je na obr. 2.5 znázorněna tečkovanou čarou (nebyla u ní určena poloha postranních řetězců), prostřední část (279 – 286) je část sekvence bez sekundární struktury, část znázorněná tmavě červeně odpovídá α-helixu.

Protože VP2/VP3 MPyV koimunoprecipitují s histony (FORSTOVÁ et al., 1993, CAI et al., 1994), lze předpokládat, že uvnitř kapsidy pomocí této interakce vytvářejí „přemostění“ mezi VP1 a virovým minichromozomem. Proteinům VP2 a VP3 MPyV chybí na C-konci oproti minoritním proteinům primátích polyomavirů (SV40, BKV, JCV a dalším) DNA vazebná doména a další dodatečná VP1 vazebná doména (CLEVER et al., 1993, CHANG et al., 1992b, CAI et al., 1994, obr 2.8). Posledních 12 aminokyselin VP2 a VP3 MPyV (EEDGPQKKKRRL) slouží jako jaderný lokalizační signál (CHANG et al., 1992a).

Obr. 2.8. Srovnání sekvencí aminokyselin na C-konci proteinů VP2/VP3 u primátích polyomavirů (JCV, BKV, SV40) a myšího polyomaviru (PyV). a a b jsou sekvence jaderného lokalizačního signálu, c je DNA vazebná doména SV40 a zároveň předpokládaná DNA vazebná doména JCV a BKV. Tučně vyznačená sekvence okolo c je u SV40 zároveň druhou částí VP1 vazebné domény. (Převzato z SHISHIDO-HARA et al., 2004.)

Ačkoli není jasné, z jakého důvodu polyomaviry obsahují oba minoritní strukturní proteiny, z nichž VP3 je de facto pouze zkrácenou verzí VP2, současná přítomnost VP2 i VP3 je v genomech polyomavirů evolučně konzerovaná. Genom i kapsidu MPyV lze charakterizovat jako velmi efektivně organizované a malé viry o velikosti polyomavirů jsou pod stálým evolučním tlakem, který znemožňuje, aby obsahovaly nadbytečné oblasti genomu a nepotřebné části proteinů. Podle BAROUCH a HARRISON, 1994, lze proto vysvětlit přítomnost obou minoritních proteinů v genomu a kapsidě tím, že vnitřek virionu obsahující virový minichromozom nedovoluje vlivem nedostatku prostoru přítomnost 72 kopií VP2, který je pro úspěšný infekční cyklus nutný (např. pro úspěšný vstup viru do buňky). VP2 ale postačuje v určitém poměru k proteinu VP3, který díky přítomnosti společné části VP2/VP3 zajišťuje ve virionu strukturní funkce, ale také je dostatečně malý. Podrobnější rozbor dalších funkcí a vlastností VP2 a VP3 je rozebírán v následujících kapitolách.

23 2.2.2. Organizace genomu Genom MPyV lze rozdělit na časnou, pozdní a nekódující regulační oblast (obr. 2.9). Časné geny (pro T antigeny – nestrukturní regulační proteiny) jsou exprimovány ihned po doručení virové DNA do jádra a exprese pokračuje i v pozdějších fázích infekce. K produkci pozdních proteinů (kapsidových proteinů VP1, VP2 a VP3) dochází až po zahájení replikace virové DNA (v časných fázích infekce je detekována pouze nízká hladina exprese pozdních genů). Genom MPyV obsahuje jediný počátek DNA replikace (ori). Promotory a transkripční enhancery se nacházejí v blízkosti ori a společně tvoří nepřekládanou regulační oblast. Transkripce je orientována dvousměrně z iniciačních míst v blízkosti ori, přičemž časné a pozdní mRNA jsou transkribovány z opačných řetězců.

Obr. 2.9. Mapa genomu MPyV. Znázorněn je počátek reoplikace (origin), enhancerová oblast (enhancer) a poloha kódujících sekvencí. Jsou vyznačeny translatované oblasti (geny pro large T-antigen, middle T-antigen, small T-antigen, VP1, VP2, VP3), klikatou linkou jsou vyznačeny introny alternativního sestřihu (upraveno podle WIRTH et al., 2000).

2.2.3. Infekční cyklus MPyV Polyomavirus je schopen infikovat široké spektrum savčích buněk a infekce může být produktivní nebo abortivní. V některých buněčných typech dochází k replikaci virové DNA a následně k morfogenezi virionu a smrti hostitelské buňky. Tento proces je označován jako produktivní infekce a takovéto buňky jsou pro virus permisivní. Pokud v infikované buňce

24 nedochází k replikaci virové DNA, jedná se o abortivní infekci. Pro úspěšnou replikaci virového genomu je nutná adekvátní hladina LT antigenu – tento protein musí interagovat s virovým ori a hostitelskými replikačními faktory. MPyV LT antigen není schopen interagovat s replikačními faktory buněk primátů, což má za následek neschopnost MPyV množit se v lidských buňkách. V abortivně infikovaných buňkách však lze detekovat expresi časných antigenů, která může vést k transformaci buňky.

2.2.3.1. Vstup viru do buňky a transport do perinukleárního prostoru Za navázání polyomavirů na buněčný povrch je zodpovědný VP1 jakožto vnější kapsidový protein. VP1 se váže na oligosacharidy s α-2,3-koncovou kyselinu sialovou. Jako specifické receptory pro MPyV byly identifikovány vysoce glykosylované gangliosidy GD1a a GT1b, které obsahují koncovou sialovou kyselinu (TSAI et al., 2003). Kromě těchto receptorů nutných pro produktivní infekci se MPyV váže také na celou řadu pseudoreceptorů, makromolekul, jejich součástí je kyselina sialová (BAUER et al., 1999). Předpokládá se, že integrin α4β1 by mohl sloužit jako sekundární receptor pro MPyV (VP1 má na smyčkách DE a EF motiv pro vazbu k integrinu, VP2 v unikátní N-koncové části také, avšak u jiných polyomavirů – BK, JC,

SV40 a dalších – tento motiv není). Bylo zjištěno, že přirozené ligandy integrinu α4β1 kompetetivně snižují infektivitu MPyV. (CARUSO et al., 2003) Tento fakt je určitým náznakem možnosti, že VP2 může napomáhat ke způsobu internalizace MPyV, který vede k produktivní infekci. Z tohoto důvodu byly také v minulosti prováděny pokusy o důkaz, zda VLPs o různém složení strukturních proteinů (pouze VP1, VP1 a VP2, nebo VP1 a VP3) mohou interferovat s úspěšným vstupem virionů MPyV kompeticí o receptory nutné pro produktivní infekci. AN et al., 1999, a ŘÍPOVÁ, 2002, shodně uvádějí, že VLPs složené pouze z VP1 nebo z VP1 a VP3 neinhibují infekci wt MPyV, tedy nekompetují s viriony o vazebná místa na buněčeném povrchu, kdežto VLPs tvořené VP1 a VP2 mají schopnost inhibovat vstup virionů MPyV do buněk. Podobných výsledků bylo dosaženo u viru SV40. Bylo zjištěno, že viriony SV40 složené pouze z VP1 a VP2 se váží na buněčný povrch ve větší míře než viriony divokého typu SV40, kdežto viriony složené z VP1 a VP3 nebo jen z VP1 mají znatelně nižší schopnost vázat se na buněčný povrch než viriony wt SV40 (DANIELS et al., 2006a). V publikaci CHEN et al., 1998, zabývající se krystalografickou strukturou minoritních kapsidových proteinů MPyV, autoři navrhují model, podle kterého by během vstupu virionů MPyV docházelo k takové konformační změně, která by vedla k zvětšení ~12,5 Å póru, který pentamer VP1 vytváří okolo osy ve svém středu (viz obr. 2.10). Skrz něj by mohlo dojít k externalizaci N-konce VP2 a interakci VP2 s membránami hostitelské buňky či případným koreceptorem. Takováto externalizace, spojená se zásadní změnou konformace VP2 by však pravděpodobně vyžadovala spoluúčast pomocného hostitelského faktoru, např. chaperonové aktivity. Konformační změny kapsidových proteinů polyomavirů po navázání na povrchový

25 receptor se dosud nepodařilo přímo objasnit, je však jisté, že k nim dochází. In vitro vazba virionů k solubilním fragmentům receptorů zvyšuje v in vitro pokusech odolnost VP1 i minoritních proteinů proti proteázám, což je nepřímý důkaz, že kyselina sialová podněcuje konformační změnu VP1, která se přenáší i na VP2 a VP3 a může ovlivňovat funkci minoritních proteinů v dalších fázích vstupu viru do buňky. (CAVALDESI et al., 2004)

Obr. 2.10. Schématické znázornění pentameru VP1 (černě) v komplexu s VP2/3 (červeně). Vyznačen je α-helix, hypotetická poloha N koncové části VP2/VP3 a ~12,5 Å pór okolo osy ve středu pentameru VP1 (převzato z CHEN et al., 1998).

I samotná přítomnost VP2 a/nebo VP3 ve VLPs poněkud pozměňuje vnější strukturu kapsidy. Některé protilátky, namířené proti povrchovým smyčkám BC a DE VP1, rozpoznávají VLPs složené pouze z VP1, ale za přítomnosti VP2 nebo VP3 ve VLPs nikoli (DELOS et al., 1995, LI et al., 1995). VP2 dále dosud neobjasněným způsobem zprostředkovává fosforylaci threoninu na BC-smyčce VP1 (na Thr 63), která se nachází na povrchu virionu a je součástí vazebného místa pro virový receptor. Při expresi v heterologním expresním systému k této fosforylaci ve větší míře dochází jen při koexpresi VP1 a VP2, ale ne při koexpresi VP1 s VP3 či expresi samotného VP1. Na Thr 63 je však fosforylována jen malá část syntetizovaných VP1 (~20% VP1 na virion), není tedy zcela jisté, zda by tato fosforylace mohla přispívat k zvýšení účinnosti navázání VP1 na receptor. (FORSTOVÁ et al., 1993, LI et al., 1995) Pro fosforylaci VP1 Thr 63 je nutný také MT (GARCEA et al., 1985, LI a GARCEA, 1994). Konkrétní funkce VP2 v jejím zprostředkování je však zatím zcela neznámá. MT antigen mj. interaguje s tyrozinovou kinázou c-Src (COURTNEIDGE a SMITH, 1983) a protein fosfatázou 2A (PP2A) (PALLAS et al., 1990). Je tedy možné, že tyto hostitelské enzymy nepřímo ovlivňují fosforylaci Thr 63 VP1. Vzhledem k tomu, že je MPyV schopen interagovat s mnoha molekulami na buněčném povrchu, pravdepodobně využívá ke vstupu do buňky více endocytických drah. Ve studii RICHTEROVÉ et al., 2001, byla popsána závislost vstupu MPyV do buňky na membránových raftech. Ke shodným výsledkům dospěli GILBERT a BENJAMIN, 2004. Caveolární

26 endocytóza je proces spojený s membránovými rafty. Ke kolokalizaci MPyV s markerem caveolární endocytózy, caveolinem, při vstupu MPyV do buňky ve značné míře dochází (RICHTEROVÁ et al., 2001). MPyV však využívá i jiných endocytických drah, neboť vliv blokace caveolární i clathrinové endocytózy na internalizaci virionů MPyV nebyl prokázán (GILBERT a BENJAMIN, 2000). Pokusy s buněčnou linií, která neprodukuje caveolin a neumožňuje caveolární endocytózu, potvrdily, že MPyV využívá i endocytické mechanismy nezávislé na caveolinu (LIEBL et al., 2006). MPyV po internalizaci kolokalizuje s markery časného endozómu EEA1 (LIEBL et al., 2006) a GTPázou Rab5 a markerem pozdního endozómu, GTPázou Rab7 (QIAN et al., 2009). Časné a pozdní endozómy jsou charakteristické svou postupnou acidifikací a v případě MPyV byla prokázána závislost na kyselém pH endozómů pro úspěšné doručení virové DNA do jádra (LIEBL et al., 2006, QIAN et al., 2009). Lidské polyomaviry BK a JC jsou na acidifikaci endozómů taktéž závislé, zatímco jim blízce příbuzný virus SV40 kyselé pH endozómů nevyžaduje (ASHOK a ATWOOD, 2003, EASH et al., 2004). Bylo prokázáno, že vliv sníženého pH na viriony MPyV spočívá v indukci konformační změny VP1, která následně napomáhá rozvolnění VP1, ke které dochází v ER (viz kap. 2.2.3.2). Během pohybu virionů MPyV cytoplazmou je možné pozorovat tranzientní disorganizaci aktinových vláken a kolokalizaci virionů s mikrotubuly (RICHTEROVÁ et al., 2001, GILBERT a BENJAMIN, 2004). Disrupce mikrotubulů kolcemidem do 8 h.p.i. zásadním způsobem snižuje infektivitu MPyV, zatímco stabilizace mikrotubulů paclitaxelem nemá vliv na infektivitu. MPyV tedy nejspíš využívá mikrotubulů k pohybu od cytoplazmatické membrány. Disrupce aktinových mikrofilament a zamezení polymerace aktinu infektivitu MPyV zvyšuje, zatímco stabilizace aktinových mikrofilament infektivitu MPyV snižuje. K tomuto vlivu dochází v nejčasnějších fázích infekce (do 2 h.p.i.). (GILBERT et al., 2003) MPyV posléze využívá retrográdního transportu (kolokalizace s markery recyklujících endozómů Rab11 a transferrinem 3 h.p.i.), který je nezávislý na coatomerech recyklujících endozómů COPI a infektivita MPyV není zásadním způsobem ovlivněna inhibitorem COP I transportu brefeldinem A (MANNOVÁ a FORSTOVÁ, 2003). K opačnému závěru dospěli GILBERT a BENJAMIN, 2004, kteří ve své studii poukazují na vliv brefeldinu A na infektivitu MPyV. V případě viru SV40 byla prokázána závislost na COPI váčcích a brefeldin A výrazně snižuje infektivitu SV40 (NORKIN et al., 2002). MPyV během internalizace neprochází Golgiho aparátem. Dále se předpokládá, že je MPyV doručen do ER, kam je pravděpodobně transportován stále navázaný na gangliosidy GD1a nebo GT1b. (GILBERT a BENJAMIN, 2004) Bylo prokázáno, že transport MPyV do ER zajišťuje gangliosid GD1a. Fluorescenční částice Quantum Dot (20 nm) pokrytá protilátkou proti gangliosidu GD1a, čímž mimikuje virus s afinitou ke gangliosidu GD1a, je taktéž internalizována a doručena do ER. (QIAN et al., 2009) Kolokalizaci VP1 s markerem ER, BiP je obvykle možné pozorovat 3 h.p.i. (MANNOVÁ

27 a FORSTOVÁ, 2003). Dosud nebyla vyloučena možnost, že k produktivní infekci MPyV může docházet únikem viru z acidifikovaného endozómu, nicméně volné viriony, putující po cytoskeletálních vláknech k buněčnému jádru nebyly nikdy pozorovány (LIEBL et al., 2006). Proces vstupu MPyV do buňky a transportu do perinukleárního prostoru je shrnut na obr. 2.11.

Obr. 2.11. Shrnutí procesu vstupu MPyV do buňky. Proteiny označené černými obdélníky jsou proteiny, u nichž byla pozorována kolokalizace s MPyV během vstupu do buňky. Silné šipky vyznačují experimentálně potvrzené procesy, přerušované šipky hypotetické procesy (upraveno podle LIEBL et al., 2006).

2.2.3.2. Doručení virové DNA do buněčného jádra Poté, co MPyV doputuje do ER, dochází k jeho rozvolnění. V případě, že jsou internalizovány VLPs, dochází pravděpodobně po rozvolnění k degradaci kapsidových proteinů, neboť je následně nelze detekovat v jádře (RICHTEROVÁ et al., 2001). V případě viru SV40 bylo ukázáno, že po rozvolnění virionů v ER je poprvé během vstupu viru do buňky možné detekovat epitopy VP2 a VP3 (NORKIN et al., 2002). MPyV využívá Derlin-2, transmembránový protein ER, jehož funkcí je transport nesprávně poskládaných proteinů z ER do cytoplazmy k degradaci. Byla navržena hypotéza, podle které jsou VP1, nebo VP2 a VP3 po rozvolnění kapsidy MPyV rozpoznány Derlinem-2 a dalšími komponentami ERAD (ER associated protein degradation – kaskáda zodpovědná za rozpoznání špatně poskládaných proteinů v ER za a transport do cytoplazmy za účelem degradace proteazomem) jako nesprávně poskládané proteiny a tím je umožněn transport komplexu kapsidových proteinů a virové DNA z ER do cytoplazmy. (LILLEY et al., 2006) Takový proces byl již popsán u některých bakteriálních toxinů (TSAI, 2007, review, viz kap. 2.3.).

28 ERp29 (chaperon nacházející se v ER, strukturně příbuzný protein disulfid izomerázám (PDI), avšak postrádající thioredoxinovou doménu) a další 31 kDa protein ER, který obsahuje thioredoxinovou doménu, pozměňují konformaci C-koncového ramena VP1 a stimulují afinitu virionů MPyV k membránám lipozomů. Za tuto afinitu k membránám jsou zodpovědné VP2 a VP3, neboť VLPs složené pouze z VP1 po vystavení účinkům proteinů ER afinitu k membránám lipozómů nevykazují, přestože ke změně konformace VP1 u nich dochází stejným způsobem. Byla navržena hypotéza, podle které tato konformační změna VP1 a následná vazba VP2 a VP3 k membránám umožňuje translokaci celého virionu přes membránu do cytoplazmy, neboť virová částice i nucleocore jsou příliš velká na to, aby k této translokaci využívaly membránový kanál určený k translokaci rozvolněných proteinů. (MAGNUSON et al., 2005) Za interakci ERp29 s VP1 je zodpovědná C-koncová doména ERp29, která pravděpodobně slouží jako substrát vazebná doména (RAINEY-BARGER et al., 2009). Kromě na Erp29 je MPyV závislý také na aktivitě PDI v ER. Bylo zjištěno, že potlačení exprese PDI blokuje infektivitu MPyV, protože virus není bez aktivity PDI schopen opustit ER. (GILBERT et al., 2006) V případě viru SV40 závisí úspěšné doručení virové DNA do jádra na ERp57 (protein disulfid izomeráza, označovaná rovněž jako PDIA3 nebo GRP57) a na proteinech Derlin-1 a Sel1L (proteiny ERAD, Derlin-1 má shodnou funkci jako Derlin-2 popisovaný výše u MPyV, Sel1L je transmembránový protein zodpovědný za rozpoznávání substrátů ERAD). Konkrétní vliv ERp57 na kapsidu SV40 se oproti vlivu PDI na kapsidu MPyV podařilo popsat do většího detailu. ERp57 izomerizuje intermolekulární interpentamerický disulfidický můstek Cys 9 – Cys 9 VP1 tak, že vzniká intramolekulární disulfidický můstek Cys 9 – Cys 104 (konzervované cysteiny, které u MPyV odpovídají Cys 19 a Cys 114), přičemž pravděpodobně dochází k uvolnění pentavalentních pentamerů VP1 (pentamerů, sousedících s pěti dalšími pentamery). (SCHELHAAS et al., 2007) Studie RAINEY-BARGER et al., 2007, v návaznosti na výsledky MAGNUSONA et al., 2005, rozšiřuje hypotézu mechanismu úniku MPyV z ER: MPyV „aktivovaný“ proteinem ERp29 perforuje membrány ER poté, co ERp29 vyvolává konformační změnu VP1 a jsou odhaleny epitopy minoritních kapsidových proteinů. Ty pravděpodobně nadále zůstávají navázány na virion, avšak po tomto rozvolnění povrchu virionů je jim umožněno vázat se na membrány ER. Na základě analýzy sekvence VP2 a VP3 programem „Membrane Protein Explorer“ byly predikovány 3 hydrofobní domény VP2, z nichž první (aminokyseliny 69-101) se nachází v unikátní části VP2, druhá (126-165) ve společné části VP2/VP3 blízkosti N-konce VP3 a třetí (287 – 305) odpovídá C-koncovému α-helixu, zodpovědnému za vazbu k VP1 pentameru (viz obr 2.12). Autoři na základě experimentů s mikrozómy z myšího pankreatu v prostředí extraktu z lumen ER (takové uspořádání se značně blíží skutečnému fyziologickému prostředí lumen ER) uvádí, že VP2 perforuje membrány ER, ale VP3 se do membrány pouze zabudovává.

29 Vzhledem k tomu, že hydrofobní doména 3 je zodpovědná za asociaci VP2/VP3 s VP1, RAINEY-BARGER et al., 2007 předpokládají, že se na tomto procesu nepodílí (ačkoli je například možné, že vlivem konformačních změn VP1 během vstupu viru do buňky tato asociace zaniká, viz výše), a že za disrupci membrán ER je zodpovědná hydrofobní doména 1, nacházející se pouze v proteinu VP2. Hydrofobní doména 2 je dle autorů zodpovědná na inkorporaci VP2 a VP3 do membrány, aniž by jejím přičiněním docházelo k disrupci membrány. Obdobná analýza sekvence VP2/VP3 programem „Memrbane Protein Explorer“ byla provedena i u viru SV40. Jejím výsledkem byla predikce pěti hydrofobních domén proteinu VP2, avšak nutno podotknout, že předpovězené hydofobní domény 2 a 3 VP2 SV40 se nacházejí v těsné blízkosti a svou polohou v sekvenci společně odpovídají hydrofobní doméně 2 VP2 MPyV. Je tedy možné, že hydrofobní doména 2 VP2 MPyV ve skutečnosti obsahuje dvě těsně sousedící hydrofobní oblasti, které program v případě VP2 MPyV nebyl schopen oddělit. Další predikovaná hydrofobní doména VP2/VP3 SV40, která není přítomna v sekvenci MPyV se nachází ve střední části sekvence společné části VP2 a VP3. (DANIELS et al., 2006a).

Obr. 2.12. Transmembránové domény predikované programem Membrane Protein Explorer na základě aminokyselinové sekvence proteinu VP2 MPyV. Na vodorovné ose pořadí aminokyselin v sekvenci VP2, na svislé ose hydropatie dané části sekvence, vypočtená programem (v kcal/mol), svislá přerušovaná čára značí začátek sekvence proteinu VP3 (převzato z RAINEY-BARGER et al., 2007).

V případě viru SV40 bylo na základě tzv. „GST pulldown assay“ navrženo, že VP2 a VP3 vytvářejí heterooligomery a navíc se spontánně inkorporují do membrány ER (obr. 2.13). V přítomnosti pentamerů VP1 je tato schopnost VP2/VP3 integrovat se do membrán inhibována, což autoři vysvětlují tak, že VP1 do určité fáze rozvolnění virionu zamezuje VP2 a VP3 perforovat membránu ER. (DANIELS et al., 2006a)

30 Dostupná literatura tedy hovoří o dvou zcela odlišných faktorech, přispívajících k průniku MPyV přes membránu ER po rozvolnění virionu – o komponentách ERAD a schopnostech VP2 a VP3 interagovat s membránami či je perforovat. Pokud derliny či další součásti ERAD vytvářejí pór, který by polyomaviry využívaly k translokaci do cytoplazmy, muselo by dojít k jejich oligomerizaci, která by umožnila průchod částice s průměrem 45 nm. Schopnost VP2 a VP3 interagovat s membránami pak může buď souviset se schopností VP2 a VP3 vytvořit hydrofobní povrch, usnadňující průchod virionu membránou (TSAI, 2007, review), nebo, jak navrhují DANIELS et al., 2006a, může docházet k uvolnění VP2 a VP3 z virionů za vzniku oligomerních pórů v membráně ER, umožňujících translokaci zbylé části rozvolněné virové částice do cytoplazmy. V takovém případě je však nejasné, jaká je v tomto procesu role proteinů ERAD. Další rozvolnění kapsid MPyV v cytoplazmě zajišťuje chaperon Hsc70 (CHROMY et al., 2006). K následnému doručení virové DNA do jádra dochází skrz komplex jaderného póru – pokud je zabráněno prostupnosti jadeného póru, je zabráněno i importu virové DNA do jádra (CLEVER et al., 1991). VP2 a VP3 sehrávají důležitou roli ještě po úniku virionů z ER. U viru SV40 bylo prokázáno, že při injikaci protilátek proti VP2 a VP3 do cytoplazmy je zabráněno doručení virové DNA do jádra (NAKANISHI et al., 1996). Předpokládá se, že k jadernému importu virové DNA dochází v komplexu z kapsidovými proteiny (NAKANISHI et al., 2002, NAKANISHI et al., 2007). Nelze však vyloučit možnost, že k doručení virové DNA do jádra dochází odlišnými způsoby. DANIELS et al., 2006a, například uvádějí možnost, že je virová DNA transportována z ER přímo do jádra přes oblast kontinuálně spojující ER s lumen jaderného obalu (obr. 2.13). Některé elektronmikroskopické práce staršího data také uvádějí, že ke vstupu virové DNA z cytoplazmy do jádra u polyomavirů dochází přes jaderný obal nezávisle na komplexu jaderného póru (MACKAY a CONSIGLI, 1976, MAUL et al., 1978). Celkově je proces doručení virové DNA do jádra velice neefektivní, pouze zlomek virionů je schopno svou DNA do jádra doručit (MANNOVÁ a FORSTOVÁ, 2003). Pro kompletní uvolnění genomu MPyV je nutný jaderný enzym polymeráza poly(ADP)-ribózy (PARP). VP1 stimuluje aktivitu PARP a nekovalentně váže poly(ADP)-ribózu. Funkcí této interakce je dle hypotézy CARBONE et al., 2006, uvolnění VP1 z rozvolněného virionu, aby mohlo dojít k časné genové expresi: VP1 během vstupu do buňky stimuluje aktivitu PARP, čímž dochází k automodifikaci PARP. VP1 následně váže poly(ADP)-ribózu. Předpokládaný poly(ADP)-rybosyl vazebný motiv na VP1 se překrývá s DNA vazebnou doménou a podle této hypotézy je tedy vazba VP1 k poly(ADP)-ribóze nutná k vyvázání VP1 z virového minichromozómu, aby mohlo dojít k časné transkripci. Infektivita závisí na aktivitě PARP u MPyV (CARBONE et al., 2006) i u SV40 (BUTIN-ISRAELI et al., 2010).

31 Obr. 2.13. Navrhovaný model vstupu SV40 do ER a penetrace membrány ER. Na navázání na buněčný povrch se podílí ta část kapsidy, kde se vyskytuje VP2 (1). Virus vstupuje do kaveoly (2), je endocytován a putuje do kaveozomu (3), odkud je dopraven do ER (4), kde dochází rozvolnění kapsidy za pomoci hostitelského chaperonu (5). Vlivem rozpadu kapsidy jsou uvolneny minoritní proteiny (6), které oligomerizují (7) a jsou vloženy do membrány ER (8a) nebo jaderné membrány (8b). Skrz takovýto pór by mohla být translokována virová DNA, v případě translokace do cytoplazmy by doručení virové DNA do jádra jaderným pórem napomáhal virový kapsidový protein, který váže DNA a má NLS (v případě SV40 libovolný kapsidový protein, v případě MPyV jen VP1) (9) (převzato z DANIELS et al., 2006a).

2.2.3.3. Časná transkripce Po vstupu DNA MPyV do jádra dochází k transkripci hostitelskou RNA polymerázou II, která transkribuje celou časnou oblast genomu do jediného primárního transkriptu, ze kterého alternativním sestřihem vznikají tři různé mRNA. Z nich jsou translatovány časné proteiny ST (small T), MT (middle T) a LT (large T). Syntéza časných antigenů myšího polyomaviru začíná 6 – 8 hodin (LT) a 16 – 18 hodin (ST, MT) po infekci. (CHEN a FLUCK 2001)

2.2.3.4. Časné proteiny Všechny tři časné regulační proteiny – T antigeny: velký (LT), střední (MT) a malý (ST) T antigen – mají společnou N-koncovou sekvenci a odlišnou C-koncovou oblast, mRNA, které je kódují, vznikají alternativním sestřihem ze společné pre-mRNA (viz obr. 2.9).

32 LT je multifunkční regulační protein, klíčový pro záhájení replikace polyomavirů a další funkce. Jedná se o DNA vazebný protein, který se váže do regulační oblasti virové DNA, kde specificky interaguje s pentanukleotidovou sekvencí GA(G)GGC. Po navázání LT v počátku virové replikace za přítomnosti ATP se LT uspořádává do hexamerů, které mají ATPázovou a helikázovou aktivitu (IMPERIALE a MAJOR, 2007). Interaguje s buněčnými proteiny, účastnícími se replikace DNA, např. s α-primázou a replikačním proteinem A (RPA) (DORNREITER et al., 1990). Specifita interakcí LT s replikačními proteiny buňky, zejména α-primázou a RPA, je hlavním určujícím faktorem tropizmu polyomaviru (SCHNEIDER et al. 1994). LT interaguje s buněčnými proteiny důležitými pro regulaci buněčného cyklu včetně tumor supresorového proteinu Rb. Velký T antigen myšího polyomaviru na rozdíl od LT antigenu viru SV40 neinteraguje s proteinem p53, a proto není schopen buňku transformovat, pouze imortalizovat (DILWORTH, 1990, review). Na N-konci polyomavirových T antigenů (společná část ST, MT a LT) se nachází tzv. J doména, pojmenovaná na základě homologie s rodinou DnaJ chaperonů. Tato doména je zodpovědná za interakci s Hsc70 prostřednictvím níž je například uvolněn z komplexu Rb-E2F transkripční faktor E2F, čímž je umožněno zahájení transkripce na E2F závislých genů, které jsou důležité pro virovou replikaci. (BRODSKY a PIPAS, 1998, review). Chaperonová aktivita T antigenů může také hrát roli při morfogenezi virionu (CHROMY et al., 2003). Střední T antigen je kódován pouze myším polyomavirem a blízce příbuznými polyomaviry. Po své syntéze se nachází v plazmatické membráně, kde je zakotven svou C–koncovou hydrofobní doménou (CARMICHAEL et al., 1982). Zde interaguje s některými buněčnými komponentami drah signální transdukce a regulace buněčného růstu. MT antigen interaguje s c-Src (COURTNEIDGE a SMITH, 1983). Tato interakce vede k aktivaci tyrozinkinázové aktivity této kinázy. Dále MT interaguje s fosfatidylinositol-3-kinázou (PI3K) (AUGER et al., 1992), Shc proteinem (CAMPBELL et al., 1994) a protein fosfatázou 2A (PP2A) (PALLAS et al., 1990). MT antigen mimikuje roli aktivovaného buněčného receptoru, tím, že aktivuje kinázy Src rodiny, PI3K a ostatní proteiny, které zprostředkovávají dráhy signální transdukce vedoucí k buněčné transformaci. Malý T antigen interaguje s katalytickou a strukturní podjednotkou PP2A (PALLAS et al., 1990). Tato interakce odstraní podjednotku B PP2A, což má za následek inhibici fosfatázové aktivity PP2A (YANG et al., 1991) a ovlivnění MAP kinázové dráhy.

2.2.3.5. Replikace virové DNA Replikaci virové DNA je zahajována z počátku replikace (ori) a účastní se jí LT antigen a většina buněčných proteinů, jež se účastní replikace buněčné DNA. LT antigen se v přítomnosti ATP naváže v podobě dvou hexamerů do počátku virové replikace (HUANG et al., 1998). Hexamery tvořené LT pak vytvářejí komplex s proteiny zajištujícími replikaci

33 buněčné DNA. Po iniciaci replikace probíhá syntéza DNA dvousměrně od počátku replikace stejným mechanismem jako probíhá replikace buněčné DNA – dochází k syntéze vedoucího řetězce i Okazakiho fragmentů. U virové DNA neexistuje specifické místo terminace replikace. Ta je ukončena 180° od ori. Pro separaci dceřiných molekul je nutná topoisomeráza II (YANG et al., 1987).

2.2.3.6. Pozdní exprese Molekuly primárního transkriptu jsou extrémně dlouhé – jsou to několikanásobné kopie celého genomu (ACHESON, 1978). mRNA vznikající z těchto prokurzorů obsahují jednu kopii kódující sekvence pro pozdní protein sestřiženou k mnoha kopiím netranslatované „leader“ sekvence (obr. 2.14). Využívá se zde tzv. „leader-to-leader“ sestřih, kdy jsou k sobě sestřiženy 57 bp dlouhé nekódující „leader“ sekvence z jednotlivých kopií genomu a celý zbytek polyomavirového genomu je vystřižen (KAMEN et al., 1980). Gen pro VP1 je translatován z jiného čtecího rámce než VP2/VP3 a přesahuje 3' konec genů pro VP2 a VP3 o 30 nukleotidů (SOEDA et al., 1980). Pro každý pozdní protein je alternativním sestřihem generována odlišná pozdní mRNA ze společného prekurzoru (obr. 2.9) (SIDDELL et al., 1978).

Obr. 2.14. Schématické znázornění leader-to-leader sestřihu primárního transkriptu. Leader sekvence je označena jako LL (late leader), pro zjednodušení je z kódujících sekvencí znázorněna pouze sekvence VP1. Pozdní transkripty mají heterogenní délku, na schématu je pro příklad uveden transkript, který vznikl přepisem, který byl ukončen po druhém přepisu pozdní oblasti. Dochází zde jednak k sestřihu intronu mezi leader sekvencí a kódující sekvencí (leader-to-body sestřih), jednak k sestřihu celé oblasti mezi leader sekvencemi (leade-to-leader sestřih), čímž vznikají tandemové repetice leader sekvence, přítomné v maturovaném pozdním transkriptu (upraveno podle ADAMI et al., 1989).

S nejvyšší pravděpodobností dochází k sestřihu mRNA v sestřihovém místě pro VP1 mRNA, nikoli však vlivem cis-acting regulátorů, ale pravděpodobně vlivem relativní pozice sestřihového místa (BATT et al., 1994). Ve virem infikovaných buňkách představuje mRNA, ze které je translatován protein VP1 80% virové mRNA (KAMEN a SHURE, 1976), ale v heterologních expresních systémech, kde dochází k translaci mRNA pro VP1 a minoritní proteiny ve shodném množství lze i tak pozorovat výrazně vyšší množství produkovaného proteinu VP1 oproti minoritním proteinům. Ke kontrole exprese pozdních proteinů tedy pravděpodobně dochází na úrovni translace (STAMATOS et al., 1987, FORSTOVÁ et al., 1993).

34 2.2.3.7. Morfogeneze virionů VP2 a VP3 pravděpodobně krátce po translaci asociují s VP1 pentamery a jsou v tomto komplexu transportovány do jádra (BAROUCH a HARRISON, 1994), kde dochází k morfogenezi virionů. Morfogeneze virionů se účastní chaperony (rodiny Hsc70, Hsp70) a svou roli pravděpodobně sehrává také chaperonová J-doména LT antigenu. (CHROMY et al., 2003) Funkce VP2 a VP3 v morfogenezi virionů dosud nebyla prokázána. Pro vznik VLPs z VP1 při produkci heterologním expresním systémem v hmyzích buňkách nejsou proteiny VP2 a VP3 potřeba (MONTROSS et al., 1991) a do VLPs je při expresi VP1 v hmyzích buňkách inkorporována heterogenní buněčná DNA v komplexu s histony, i když nedochází ke koexpresi VP2, VP3 (GILLOCK et al., 1997). Taktéž virové mutanty MPyV VP2–, VP3– i VP2–/VP3– vedou ke vzniku virionů, které obsahují virovou DNA (MANNOVÁ et al., 2002).

2.2.3.8. Smrt hostitelské buňky – role VP2 a VP3 Polyomaviry jsou neobalené viry a s tím je spojena jejich schopnost navozovat destrukci buňky, pro neobalené viry nutný krok k uvolnění nově vzniklých virionů z infikované buňky. Proces buněčné smrti zahrnující permeabilizaci buněčných membrán a vylití cytosolických komponent se oznacuje jako nekróza a je z tohoto pohledu pro neobalené viry ideální. Nevýhodou nekrózy je z pohledu virů to, že vyprovokovává zánětlivou imunitní reakci. Té je zabráněno při apoptóze. Apoptóza je ovšem cesta, při které dochází ke vzniku apoptotických tělísek, ve kterých by neobalené viry zůstaly uzavřeny a bylo by jim degradací zabráněno v sekundární infekci. (DANIELS et al., 2006b, PROSKURYAKOV et al., 2003, review) Infekční cyklus MPyV je dokončen mezi 36 – 48 h.p.i. a cytopatické efekty je možné pozorovat v čase, který odpovídá produkci velkého množství virových strukturních proteinů. Jako následek cytotoxických efektů při infekci MPyV dochází k nekróze (>40% buněk v kultuře myších fibroblastů 3T6, 72 h.p.i.) a v menší míře také k apoptóze (5 – 10%), zatímco rekombinantní VLPs složené ze všech tří strukturních proteinů buněčnou smrt nevyvolávají. (AN et al., 2000) Při expresi proteinů viru SV40 v bakteriálních buňkách bylo ukázáno, že VP2/VP3, ale i samotný VP3 mají inherentní schopnost permeabiliziovat bakteriální membrány a lyzovat bakterie. Zároveň bylo prokázáno, že VP2/VP3 permeabilizují membrány eukaryotických buněk včetně jaderné membrány a membrán ER. (DANIELS et al., 2006b) Při samostatné expresi VP2 a VP3 MPyV v savčích buňkách byly pozorovány deformace jaderné membrány a fragmentace jádra (KEČKÉŠOVÁ, 2003). Podobné efekty byly pozorovány při samostatné expresi VP2 a VP3, fúzovaných s EGFP. Kromě toho byla pozorována změna lokalizace histonu H1 z jádra do cytoplazmy či úplná absence histonu H1 v buňkách exprimujících tyto fúzní proteiny. (BOUŘA, 2004) Pokusy o sledování vlivu extracelulárního přidání VP2/VP3 produkovaných

35 v bakteriích jako fúzní proteiny s thioredoxinem se nezdařily, neboť takto připravené proteiny byly značně nerozpustné a vytvářely agregáty (navíc už při produkci v bakteriálních buňkách vytvářely inkluze). (JIRÁSKO, 2006) V případě, že jsou VP2 a VP3 exprimovány samostatně, zůstává jejich výrazný podíl zadržován cytoplazmě (DELOS et al., 1993). Koexprese VP1 vede k zvýšení podílu VP2 a VP3 přítomných v jádře (KEČKÉŠOVÁ, 2003). Obdobné vlastnosti jako u wt VP2 a VP3 byly pozorovány u VP2 a VP3 fúzovaných k N-konci EGFP (VP2-EGFP a VP3-EGFP). Cytoplazmatická lokalizace těchto proteinů je pravděpodobně způsobena afinitou k intracelulárním membránovým strukturám, jako jsou ER a mitochondrie. Pokud jsou VP2 a VP3 naopak fúzovány k C-konci EGFP (EGFP-VP2 a EGFP-VP3), ztrácejí afinitu k intracelulárním membránám a vykazují pouze jadernou lokalizaci. Obdobně nižší afinitu k membránám má forma VP3, zkrácená na N-konci tak, že postrádá předpokládanou hydrofobní doménu 2 (viz kap. 2.2.3.2), fúzovaná oběma způsoby k EGFP (tVP3-EGFP a EGFP-tVP3). (HUÉRFANO et al., 2010) Hydrofobní sekvence může vlivem membránové nebo meziproteinové interakce zamezit jadernému importu u proteinů s NLS (VAN ZEE et al., 1991). Výsledky HUÉRFANO et al., 2010 ukazují, že míra afinity těchto fúzních proteinů k buněčným membránám koreluje s jejich cytotoxicitou. Při expresi VP2-EGFP a VP3-EGFP dochází ke štěpení kaspázy 3 a PARP, a také k morfologickým změnám, charakteristickým pro apoptózu a dalším projevům apoptózy. Apoptóza indukovaná VP2- a VP3-EGFP je závislá na aktivaci kaspáz. Při infekci MPyV však VP2 a VP3 přispívají k cytotoxickým efektům jen mírně (VP2–/VP3– mutanta MPyV vyvolává jen o málo mírnější cytotoxické efekty než wt MPyV). (HUÉRFANO et al., 2010) To pravděpodobně souvisí s faktem, že VP1 při infekci MPyV vyvazuje naprostou většinu VP2 a VP3, čímž brání jejich zabudování do membrán a s tím spojeným cytotoxickým efektům. U viru SV40 byla ve velmi pozdních časech po infekci (nejdříve 72 h.p.i.) detekována translace zkrácené formy VP2/VP3, nazvaná VP4. Tento protein odpovídá 125 C-koncovým aminokyselinám, jeho translace začíná na vnitřním AUG kodónu na společné mRNA pro SV40 VP2/VP3 a má velikost přibližně 15 kDa. VP4 není přítomen ve virionech SV40, přestože obsahuje VP1 a DNA vazebné domény. Při in vitro translaci mRNA pro VP2/VP3/VP4 v přítomnosti pentamerů VP1 je VP4 jen velmi omezeně inkorporován do VP1 pentamerů. VP4 je velice cytotoxický a pokud je koexprimován v bakteriích společně s VP3, navozuje jejich lyzi. Na základě porovnání schopností kapsidových proteinů SV40 a VP4 vázat GST-VP3 bylo usouzeno, že VP4 a VP3 oligomerizují a vytvářejí membránové póry, podobně jako viroporiny (viz kap. 2.3.8). VP4 je exprimován ve velmi pozdní fázi infekce, autoři navrhují model podle kterého uniká SV40 před apoptózou souhrou LT (inhibuje apoptózu vyvazováním p53) a VP4 (navozuje lyzi – nekrózu – a tím umožní uvolnění nově vzniklých virionů z buňky). (DANIELS et al., 2007)

36 Obr. 2.15. Navrhovaný model pozdní fáze infekce virem SV40. Je syntetizován VP1 (A), který tvoří pentamery (B), do nichž jsou zabudovány minoritní proteiny (C) a dochází k vzniku nových virionů (D). Stechiometrický poměr strukturních proteinů má za následek, že se vyskytují i volné minoritní proteiny, které nemůžou být zabudovány do kapsidy (E) a tak je po zahájení syntézy VP4 (nebo akumulaci VP4) umožněna oligomerizace VP4 s VP2/VP3 (F), která vede ke tvorbě pórů, lyzi buňky a uvolnění nově vzniklých virionů z cytoplazmy (G) (převzato z DANIELS et al., 2007).

Jiný způsob, jakým VP2 a VP3 navozují buněčnou smrt byl doložen rovněž pro virus SV40, jehož protein VP3 interaguje s polymerázou poly(ADP)-ribózy (PARP). PARP je jaderný enzym s DNA vazebnou doménou, který detekuje zlomy na řetězci DNA a katalyzuje připojení ADP-ribózy na některé proteiny za spotřeby NAD+. Funkcí této aktivity je ovlivnění struktury chromatinu poly(ADP)-ribosylací histonů a laminu, tak, aby byla umožněna oprava poškozené DNA, a dále ovlivnění metabolismu DNA modifikací replikačních faktorů i samotného PARP. Poly(ADP)-ribosylace nese záporný náboj, což vede ke ztrátě afinity modifikovaných proteinů k DNA. Jedním z projevů apoptózy je štěpení PARP kaspázami, čímž je zajištěno, že DNA není zbytečně opravována namísto degradace chromatinu během apoptózy, dále degradace PARP usnadňuje přístup nukleáz k chromatinu. Při velkém poškození DNA může být PARP přestimulován, což vede k zvýšené spotřebě NAD+, depleci energie a k následné nekróze. Stejného efektu lze dosáhnout inhibicí aktivity kaspáz. (OLIVER et al., 1999, review) VP2 a VP3 viru SV40 také stimulují aktivitu PARP, čímž způsobují nekrózu hostitelské buňky. Kompetitivní inhibitor PARP znatelně zabraňuje cytopatickým efektům v průběhu infekce a uvolňování viru z buněk. VP1 také interaguje s PARP, neovlivňuje však jeho aktivitu, k stimulaci PARP tak může docházet navázáním komplexu VP15-VP3. V průběhu infekce pak není PARP štěpen a nedochází k apoptóze. Oblast VP2/VP3 zodpovědná za vazbu PARP se nachází na úplném C-konci proteinu, tj. v oblasti, která není ve VP2 a VP3 MPyV na rozdíl od VP2 a VP3 primátích polyomavirů přítomna. (GORDON-SHAAG et al., 2003)

37 2.3. Virové kapsidové proteiny jiných virů podobné VP2 a VP3 polyomavirů Klíčovým krokem v infekčním cyklu všech virů je doručení virového genomu do místa jeho exprese. Pro neobalené viry je pro uskutečnění tohoto kroku nezbytné nějakým způsobem překonat buněčné membrány, ať se jedná o cytoplazmatickou membránu, endozomální struktury, nebo ER. Z toho důvodu jsou součástí kapsid neobalených DNA i RNA virů proteiny, jejichž funkcí je narušení membrán, nebo jiné interakce, které vedou k úniku těchto virů z membránových struktur. Toto je pravděpodobně funkcí minoritních kapsidových proteinů polyomavirů. Tato kapitola shrnuje poznatky o proteinech jiných neobalených DNA a RNA virů, o nichž se předpokládá, že mají tuto funkci. Jmenovitě se jedná o proteiny virů z čeledí Picornaviridae, Nodaviridae, Reoviridae, Parvoviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae a Adenoviridae. Mechanismy nutné pro translokaci virové nukleové kyseliny do cytoplazmy (v případě DNA virů následně do jádra), kterými tyto viry prostřednictvím svých kapsidových proteinů narušují membrány, vykazují určité společné znaky. Proces, který vede k dosažení tohoto pro neobalené viry klíčového kroku, lze rozdělit do čtyř kroků: 1) pohyb virové částice do buněčného kompartmentu, ve kterém dochází k interakci s membránami 2) vystavení virové částice buněčnému faktoru, který pozmění strukturu virionů (např. hostitelský receptor, chaperon, proteáza, nízké pH, koncentrace určitých iontů) 3) samotná interakce kapsidových proteinů s hostitelskou membránou, vedoucí k její permeabilizaci 4) translokace hydrofobní virové částice, komplexu virových proteinů s virovou nukleovou kyselinou, nebo pouze samotné virové nukleové kyseliny přes membránu do cytoplazmy. Zatím nebyl proveden experiment, přímo dokazující transport neobalené virové částice nebo subvirové částice z jedné strany membrány na druhou. Pokusy o měření velikosti „pórů“, vzniklých působením některých kapsidových proteinů neobalených virů, vedly k datům, která ukazují, že pórem nemohou procházet molekuly o velikosti odpovídající virové částici. Výsledek těchto měření lze vysvětlit tím, že mechanismem působení těchto kapsidových proteinů není tvorba stabilního póru, ale celkové zvýšení permeability membrány. U některých z těchto neobalených virů bylo prokázáno, nebo se alespoň předpokládá, že přes membránu již neprostupuje kompaktní virová částice, nýbrž spíše komplex strukturních proteinů a nukleové kyseliny. (TSAI, 2007, review) Pro vysvětlení mechanismu permeabilizace membrán kapsidovými proteiny neobalených virů mohou posloužit informace o antimikrobiálních peptidech, které jsou součástí nespecifických

38 mechanismů imunitního systému. Antimikrobiální peptidy způsobující permeabilizaci membrán se mohou volně vyskytovat buď jako monomery a zaujmout amfipatickou konformaci (tj. konformaci, u níž je zformována hydrofobní a hydrofilní oblast, typicky α-helix, který v jedné orientaci obsahuje hydrofilní postranní řetězce a druhé orientaci hydrofobní) teprve po kontaktu s membránou, nebo jako oligomery, vzájemně skrývající svou hydrofobní oblast a exponující svou hydrofilní oblast v roztoku. Následná asociace s membránami se uskuteční dvěma různými mechanismy, mechanismem „sudových latěk“, nebo „kobercovým“ mechanizmem. Mechanismus „sudových latěk“ (obr. 2.16) je vyvolán hydrofobní interakcí povrchu proteinu s lipidickým core membrány a následným zformováním oligomerního svazku proteinů, přičemž transmembránový segment proteinu musí být minimálně ~22 aminokyselin dlouhý v případě α-helixu, nebo cca 8 aminokyselin dlouhý v případě β-listu, a jen velmi malé množství takovýchto pórů je potřeba k zrušení transmembránového potenciálu buněk. „Kobercový“ mechanismus (obr. 2.17) oproti „sudovým laťkám“ nevyžaduje tvorbu oligomerů, transmembránových kanálů, ani specifickou strukturu daného proteinu. Proteiny se nejprve navazují na povrch membrán pomocí hydrofilních oblastí a pokud dosáhnou prahové koncentrace, vnořují se svou hydrofilní oblastí do core lipidické membrány a dynamicky vytvářejí transientní póry. Tento mechanismus připomíná působení detergentů. (SHAI, 2002)

Obr. 2.16. Membránová permeabilizace mechanismem „sudových latěk“. Proteiny vyskytující se jako monomery nebo oligomery asociují s membránami (A), vnořují se do nich pomocí hydrofobních oblastí a následně vytvářejí oligomerní pór (B). Oranžově jsou znázorněny hydrofilní a fialově hydrofobní povrchy proteinů (převzato ze SHAI, 2002).

Obr. 2.17. Membránová permeabilizace „kobercovým“ mechanismem. Proteiny vyskytující se jako monomery nebo oligomery asociují s membránami prostřednictvím svých hydrofilních oblastí (A), pokud je dosaženo prahové koncentrace proteinových monomerů, dochází k tvorbě tranzientních pórů (B), v případě vyšší koncentrace proteinu může také dojít k úplné disintegraci membrány (C). Barevné značení je stejné jako na předchozím obr. (převzato ze SHAI, 2002).

39 Bakteriální toxiny často využívají pro vstup do buněčné cytoplazmy v některých ohledech podobné postupy, jako zmiňované kapsidové proteiny neobalených virů. U některých (např. botulinový, antraxový a záškrtový toxin) dochází k internalizaci kaveolární nebo clathrinovou endocytózou a po acidifikaci v endozomálním váčku dochází v ke změně konformace jejich „těžkých“ podjednotek, což napomáhá jejich vložení do membrány endozómu a translokaci „lehké“ katalytické podjednotky do cytoplazmy. (BLAUSTEIN et al., 1989, REN et al., 1999, KORIAZOVA a MONTAL, 2003) Zásadní rozdíl samozřejmě spočívá v rozdílu velikostí – zatímco neobalené viry, probírané v této kapitole, mají velikost průměru od ~25 do 100 nm, proteinový komplex bakteriálního toxinu je většinou menší než ~5 nm. (TSAI, 2007, review) SEKIYA et al., 1993, pozorovali na membránách erytrocytů kruhové póry o průměru 30 nm, formované toxinem streptolysinem O. Možnost, že by virové proteiny byly schopné formovat póry o podobné velikosti, nebyla zatím prokázána, avšak nemůže být vyloučena. Jinou strategii průniku přes membránu využívají např. cholerový toxin, shiga toxin a LTIIb toxin. Tyto toxiny se skládají z katalytické podjednotky A, která je obklopena pentamerem podjednotky B, zodpovědné za navázání na buněčný receptor. Podobně, jako v případě kapsidových proteinů polyomavirů, které navíc zaujímají podobné uspořádání, jsou tyto toxiny internalizovány do ER. Tam jsou rozpoznány proteiny určenými pro kontrolu správné konformace protein, jako by se jednalo o nesprávně poskládané proteiny. Následně jsou translokovány do cytoplazmy pro degradaci proteazomem, avšak katalytická podjednotka degradaci uniká. Tohoto procesu se účastní PDI a proteinová rodina derlinů, podobně jako bylo pozorováno u polyomavirů (viz kap. 2.2.3.2). (HAZES a READ, 1997)

2.3.1. VP4 poliovirů Kapsida poliovirů a dalších picornavirů se skládá z 60 kopií proteinů VP1, VP2, VP3 a VP4, které vznikají z prekurzorového polyproteinu. Po vstupu virové RNA do buňky dochází k translaci polyproteinu, který je kotranslačně štěpen na polyproteiny P1, P2 a P3. P1 je na N-konci myristylovaný a obsahuje sekvenci všech čtyř kapsidových proteinů. Štěpením virovou proteázou 3CD z P1 vznikají proteiny VP1, VP3 a VP0. Enkapsidace virové RNA vede ke vzniku provirionu, prekurzoru infekční virové částice, který se skládá z RNA, a 60 kopií VP1, VP3 a VP0, přičemž VP0 je autokatalyticky rozštěpen na VP2 a VP4. (HOGLE, 2002, review)

40 Obr. 2.18. Sled konformačních změn kapsidových proteinů poliovirů, umožňující vstup virové RNA do cytoplazmy. Barevné značení: buněčný receptor (černě je vyznačena transmembránová oblast receptoru), VP1 (světle modře je vyznačena N-koncová část VP1, černě „pocket factor“, což je lipidická molekula stabilizující kapsidu. Na obrázcích c a d je černě vyznačena N-koncová část VP1, která vytváří transmembránový α-helix), VP3, VP4 (černě je vyznačen N-koncový myristyl), virová RNA. a: navázání viru na buněčný povrchový receptor; b: receptor indukuje konformační změnu, která otevře receptor vazebné místo; c: dochází k dalším konformačním změnám kapsidových proteinů, které vedou k vložení amfipatického α-helixu VP1 a myristylu VP4 do membrány a vytvoření transmembránového kanálu; d: je indukováno rozšíření transmembránového póru (předpokládá se možný vliv snížení koncentrace Ca2+) a vstup virové RNA do cytoplazmy je umožněn dočasným uvolněním VP3, který vytváří „zátku“ póru (převzato z HOGLE, 2002, review).

Strukturní protein polioviru VP4 je tedy na N-konci myristylovaný. Ztráta myristylového zbytku mutací N-koncového glycinu má za následek tvorbu neinfekčních virových částic. Při interakci s buněčným receptorem dochází ke konformačním změnám kapsidy a ireverzibilní ztrátě VP4. (MARC et al., 1989) Tento sled konformačních změn byl do podrobna popsán: Myristylovaný N-konec VP4 je zakotven do buněčné membrány a napomáhá zformování membránového póru dalším kapsidovým proteinem VP1, který vytváří amfipatické transmembránové α-helixy. Tímto pórem je virové RNA umožněno proniknout do cytoplazmy. (obr. 2.18) Na konformačních změnách kapsidových proteinů vedoucích k formaci VP1/VP4 póru se může podílet také změna koncentrace Ca2+ iontů. Na rozdíl od dalších příkladů kapsidových proteinů uvedených v této kapitole není tento proces závislý na změně pH a dochází k němu na buněčném povrchu, nikoli v endozomálním váčku. (HOGLE, 2002, review)

41 2.3.2. Protein γ nodavirů Nodaviry jsou malé neobalené +RNA viry infikující hmyz. Jejich kapsida o průměru ~30 nm se skládá z proteinů β a γ, které během maturace vznikají autokatalytickým štěpením prekurzorového proteinu α. Protein γ (~5 kDa) se nachází uvnitř kapsidy, přičemž jeho C-koncová oblast váže genomovou RNA a N-koncová oblast obsahuje amfipatickou sekvenci, u které byla prokázána schopnost premeabilizovat lipozómy. Předpokládá se tedy, že protein γ po rozvolnění virionu permeabilizuje membránu endocytického váčku a současně přes ní translokuje virovou RNA do cytoplazmy. (BONG et al., 1999) Mutantní virus, který není schopen podstoupit maturační proteolytické štěpení je neinfekční (SCHNEEMANN et al., 1992). Bylo zjištěno, že interakcí N-koncové oblasti γ proteinu s lipozómy dochází k indukci helicity a vzniklý amfipatický α-helix asociuje s lipidickou dvojvrstvou v paralelní poloze (obr. 2.19.), aniž by docházelo k tvorbě stabilního oligomerního póru (BONG et al., 2000). Schopnost proteinu γ navodit permeabilizaci membrány je závislá na acidickém pH v endozomálním váčku, do kterého je virus během vstupu do buňky internalizován (ODEGARD et al., 2009).

Obr. 2.19. Způsob asociace proteinu γ s lipidickou dvojvrstvou (převzato z BONG et al., 2000).

2.3.3. Protein μ1 reovirů Reoviry jsou neobalené viry s dsRNA genomem a dvouvrstevnou kapsidou. Vnější část kapsidy je zodpovědná za navázání viru na receptor a vnitřním část (core) po doručení do cytoplazmy slouží jako transkripční komplex. Součástí vnější vrstvy kapsidy je protein μ1 (76 kDa), jenž se vyskytuje v počtu 200 trimerů na virion. Protein μ1 je na N-koncovém glycinu myristylovaný. Autokatalyticky je štěpen na fragmenty μ1N (4 kDa) a μ1C (72 kDa) a místo, kde dochází ke štěpení je sekvenčně podobné místu štěpení u taktéž myristylovaného proteinu VP0/VP4 poliovirů (viz kap. 2.3.1). (NIBERT et al., 1991) Pokud je mutací zamezeno tomuto proteolytickému štěpení, virus se stává neinfekčním (LIEMANN et al., 2002). Protein μ1 je

42 chráněn a jeho aktivita je regulována hlavním proteinem vnější kapsidy σ3, s nímž vytváří komplex. Jakmile je virus vystaven proteázám v intestinálním lumen nebo v endocytických váčcích, dochází ke uvolnění σ3, změně konformace dalšího proteinu vnější kapsidy σ1 a proteolytickému štěpení μ1C na proteiny δ a φ. Takto vzniklá virová částice je nazývána ISVP (infectious subviral particle, obr. 2.20). (DRYDEN et al., 1993, LIEMANN et al., 2002). Proteolytické štěpení μ1C v endocytickém váčku je závislé na acidickém pH (STURZENBECKER et al., 1987). Následně dochází k přesmyku na tzv. ISVP*, který je urychlen zvýšenou teplotou a K+ ionty. ISVP* je oproti ISVP charakterizován mj. ztrátou σ1 a konformačními změnami, které umožní uvolnění μ1N a φ, zatímco δ zůstává dál asociován s virovou částicí (viz obr. 2.20) (AGOSTO et al., 2008).

Obr. 2.20. Změny kapsidy reovirů během vstupu do buňky. A: V – intaktní virus, I – ISVP, která ztrácí kapsidový protein σ3 a dochází u ní ke štěpení μ1 na δ a φ, I* – ISVP*, u které dochází ke konformační změně, vedoucí k uvolnění φ a μ1N z virionu, zatímco δ zůstává navázaný na kapsidě, zároveň dochází u uvolnění σ1. B: Stav proteinu μ1 v intaktním virionu (V), ISVP (I) a ISVP* (I*). Vyznačeno je proteolytické štěpení a fialovou vlnovkou N koncová myristylace (převzato z IVANOVIC et al., 2008).

I neštěpený μ1 je schopen vyvolat permeabilizaci membrán – uvolnění 51Cr z buněk (LUCIA- JANDRIS et al., 1993) nebo hemoglobinu z erytrocytů (CHANDRAN a NIBERT, 1998). Pokusy o zjištění velikosti předpokládaných pórů, vytvářených proteinem μ1N vedly k údajům o maximálním průměru 9 nm, což je pouze přibližně desetina velikosti reovirové částice. Dále bylo zjištěno, že k optimální aktivitě μ1N přispívá uvolněný protein φ. Předpokládá se, že buď solubilizuje μ1N před insercí do membrány nebo umožňuje μ1N zaujetí vhodné konformace. Reovirové částice po permeabilizaci proteinem μ1N asociují s membránami. (IVANOVIC et al., 2008) Vzhledem k tomu, že do cytoplazmy je translokována celá subvirionová struktura (core), uvnitř níž poté dochází ke transkripci a replikaci virové dsRNA, předpokládá se, že dochází k rozšíření těchto pórů a následné osmolyzi endozómu (obr. 2.21) (AGOSTO et al., 2006). K tomuto procesu může například přispívat hostitelský faktor, který by po asociaci reovirové částice s pórem umožnil rozšíření póru. Možný kandidát pro tento proces je Hsc70. (IVANOVIC et al., 2007)

43 Obr. 2.21. Předpokládaná role Hsc70 při translokaci reovirů z endozómu do cytoplazmy. Intaktní virion je označen jako V, ISVP jako I. ISVP* je označena jako I*. Hsc70 umožňuje uvolnění ISVP* z endozómu do cytoplazmy a uvolnění proteinu δ z ISVP*. Následně vzniklá částice se nazývá core (označeno jako C), což je částice, ve které dochází k transkripci (převzato z IVANOVIC et al., 2007).

2.3.4. VP5 rotavirů Rotaviry (čeleď Reoviridae), původci gastroenteritidy u savců a ptáků, jsou neobalené viry se segmentovaným dsRNA genomem a komplexní ikosahedrální třívrstvou kapsidou (obr. 2.22). Vnější vrstva kapsidy se skládá z proteinů VP7 a VP4. VP4 (88 kDa) se nachází na jejím povrchu a vytváří 60 hrotovitých struktur složených z dimerů VP4 a vyčnívajících asi 12 nm z povrchu vnější vrstvy kapsidy. Viriony postrádající tuto vrstvu kapsidy jsou neinfekční. Prostřední vrstva kapsidy se skládá z VP6 a vnitřní vrstva z VP1, VP2 a VP3. (PRASAD et al., 1990) VP4 je zodpovědný za navázání na receptor na povrchu hostitelské buňky (LUDERT et al., 1996) a podstupuje proteolytické štěpení trypsinem za vzniku VP5 (60 kDa) a VP8 (28 kDa), které je nezbytné pro následnou penetraci membrán hostitelských buněk, avšak není potřeba pro navázání viru na receptor. Toto štěpení není závislé na sníženém pH. (KALJOT et al., 1988) VP4 interaguje prostřednictvím oblasti, která je součástí následně vzniklého proteinu VP5, ještě se sekundárním receptorem rotavirů, jímž je integrin α2β1. Existuje varianta rotaviru nezávislá na primárním receptoru s kyselinou sialovou, která je schopná interagovat přímo s tímto sekundárním receptorem. (ZÁRATE et al., 2000) Za samotnou penetraci membrány je pak zodpovědný VP5, zatímco VP8 nikoli (BURNS et al., 1988). Konkrétně je pro tuto funkci nezbytná vnitřní hydrofobní doména (aminokyseliny 385 – 404) VP5 (DOWLING et al., 2000). Tato doména je sekvencí aminokyselin značně podobná hydrofobním doménám fúzogenních obalových proteinů zcela nepříbuzných obalených alfavirů (MACKOW et al., 1988). Schopnost rotavirů permeabilizovat hostitelské membrány je kromě proteolytického štěpení trypsinem dále závislá na rozvolnění virionů, jehož hlavním předpokladem je deplece Ca2+ iontů v endocytickém váčku (RUIZ et al., 1994). Důvodem je pravděpodobně skutečnost, že Ca2+ ionty stabilizují strukturu kapsidy (NANDI et al., 1992). Rozvolnění kapsidy v závislosti na snížení koncentrace Ca2+ závisí na VP7 (RUIZ et al., 1996). Podle CHEMELLO et al., 2002, závisí infektivita rotaviru do značné míry na aktivitě

44 endozomální H+ ATPázy, nikoli však na sníženém pH, ale na vytvoření elektrochemického gradientu, který umožňuje (společně s koncentračním gradientem Ca2+) extruzi Ca2+ iontů z endozómu do cytoplazmy. Svou roli při vstupu rotavirů do buňky hraje po navázání na receptor Hsc70, který interaguje s VP5 (ZÁRATE et al., 2003). Bylo prokázáno, že Hsc70 navozuje konformační změnu VP5 (PÉREZ-VARGAS et al., 2006).

Obr. 2.22. Třívrstevná kapsida rotaviru. Vnější vrstva se skládá z VP4, zodpovědného na navázání na receptor a následnou penetraci membrán, a VP7, střední kapsida je tvořena VP6, vnitřní je tvořena VP2 a minoritními kapsidovými proteiny VP1 a VP3 (nejsou vyznačeny) (převzato z ARIAS et al., 2002, review).

2.3.5. Kapsidové proteiny parvovirů Parvoviry mají neobalenou kapsidu o průměru ~25 nm s ikosahedrální T = 1 symetrií, sestávající se ze 60 proteinových podjednotek – hlavního kapsidového proteinu VP2 (90% všech kapsidových proteinů psího parvoviru, 67 kDa) a minoritního kapsidového proteinu VP1 (10%, 83 kDa). VP1 obsahuje celou sekvenci VP2, doplněnou o unikátní 16 kDa N-koncovou doménu. Oba kapsidové proteiny vznikají přepisem alternativně sestřižené mRNA. (BERNS a PARRISH, 2008) Parvoviry potřebují pro produktivní infekci kyselé pH endozomů, není však známo, zda je nutné ke změně konformace určitých částí kapsidových proteinů, nebo k aktivitě určitého hostitelského faktoru, například proteázy. Prvních 15 – 22 aminokyselin na N-konci některých proteinů VP2 může být u některých parvovirů hostitelskými proteázami odštěpeno, čímž vzniká protein VP3. Toto štěpení usnadňuje uvolnění N-koncové části VP1 na povrch kapsidy. N-konec VP1 obsahuje jednak jaderný lokalizační signál a jednak doménu s aktivitou fosfolipázy A2 (PLA2, odštěpuje acylovou skupinu na C2 pozici glycerolového zbytku fosfolipidu). Obě tyto vlastnosti VP1 jsou nezbytné pro doručení virové DNA do jádra. (HARBISON et al., 2008, review)

PLA2 aktivita VP1 přímo či nepřímo souvisí s únikem parvovirů z endozómů do cytoplazmy, neboť mutanty s inaktivní PLA2 nejsou schopny uniknout z membránového váčku do cytoplazmy. PLA2 aktivita VP1 může ovlivňovat zakřivení membrány, konkrétní souvislost

45 s penetrací membrány však dosud není zřejmá. Předpokládá se, že dochází pouze k tranzientní permeabilizaci membrány. (HARBISON et al., 2008, review) Bylo zjištěno, že kapsida psího parvoviru zvyšuje neuspořádanost v membránové dvojvrstvě lipozómů bohatých na cholesterol (nikoli v lipozómech bez cholesterolu) při sníženém pH a při přítomnosti N-konce VP1 s PLA2 doménou. Samotná kontrolní sekretorická PLA2 takový efekt ovšem nenavozuje. (PAKKANEN et al., 2009) Na permeabilizaci membrány endozómu by se kromě unikátní části VP1 mohla podílet N-koncová část VP3, vzniklá proteolytickým štěpením VP2, která obsahuje konzervovanou hydrofobní polyglycinovou sekvenci. (SUIKKANEN et al., 2003)

2.3.6. L2 papillomavirů Hlavní kapsidový protein L1 a minoritní kapsidový protein L2 jsou u papillomavirů uspořádány podobným způsobem jako kapsidové proteiny polyomavirů: L1 vytváří 72 pentamerů, které se skládají do T = 7 ikosahedrální struktury. L2 se nachází uvnitř kapsidy v centrálních prohlubních pentamerů (obr. 2.23), přičemž na rozdíl od VP2 a VP3 se jedná o protein o větší molekulové hmotnosti než je hlavní kapsidový protein a lze předpokládat, že zasahuje i mimo prohlubeň pentamerů, některé části L2 zasahují i na povrch kapsidy (LIU et al., 1997). Podle BUCK et al., 2008, je možné, že jednotlivé L2 proteiny uvnitř kapsidy vytvářejí kontakty, které by mohly sloužit k stabilizaci kapsidy a ke koordinaci konformačních změn kapsidových proteinů po navázání viru na buněčný receptor. L2 asociuje s L1 hydrofobní interakcí a doména L2 zodpovědná za tuto interakci se podobně, jako u minoritních proteinů polyomavirů, nachází na C-konci. (FINNEN et al., 2003)

A B

Obr. 2.23. Uspořádání minoritního kapsidového proteinu L2 ve vztahu k hlavnímu strukturnímu proteinu L1. A – zobrazeny jsou tři z pěti proteinů L1 pentameru, L2 je vyznačen červeně (převzato z LOWE et al., 2008). B – L2 je vyznačen červeně, L1 modro-bíle (převzato z BUCK et al., 2008).

L2 je po navázání virionu na buněčný receptor štěpen proteázou furinem. Primární navázání na receptor pravděpodobně vyvolává konformační změnu, která umožní toto štěpení. Následně se předpokládá, že dochází k „vytrčení“ L2 z kapsidy ven a vazba L2 (nebo L1) na sekundární

46 receptor, který umožní vstup viru do buňky (obr. 2.24). Štěpení L2 furinem je dále nutné k pozdějšímu úniku virové DNA z endozómu. (RICHARDS et al., 2006, DAY et al., 2008) Za vazbu L2 na buněčný povrch (není známo jakým mechanismem k ní dochází) je zodpovědná N-koncová sekvence aminokyselin 108 – 120. Peptid odpovídající této sekvenci se váže na buněčný povrch a vstupuje do cytoplazmy. (KAWANA et al., 2001) Konformační změny L2 po štěpení furinem mohou být zprostředkovány cyklofiliny, rodinou peptidyl-prolyl cis/trans izomeráz, z nichž některé se vyskytují na buněčném povrchu (BIENKOWSKA-HABA et al., 2009). Papillomaviry jsou po tomto procesu endocytovány různými typy endocytózy (SAPP a BIENKOWSKA-HABA, 2009).

Obr. 2.24. Konformační změny minoritního kapsidového proteinu L2 během vstupu papillomavirů do buňky. Modře jsou znázorněny pentamery L1, červeně L2, zeleně N-koncový peptid L2 odštěpený furinem. A – povrch kapsidy před navázáním na primární receptor, B – po navázání na primární receptor dochází ke konformační změně obou kapsidových proteinů a N-konec L2 se stává přístupný proteolytickému štěpení, C – po štěpení N-konce L2 furinem dochází k další konformační změně, která umožní vazbu na sekundární receptor a endocytózu virionu (převzato z DAY et al., 2008).

C-koncová doména L2 obsahuje sekvenci podobnou části antimikrobiálního peptidu histatinu 5, jež se nachází v lidských slinách a má schopnost destabilizovat a depolarizovat bakteriální membrány. Stejně tak se C-konec L2 integruje do buněčných membrán a permeabilizuje je. Bylo zjištěno, že VLPs složené z L1 a L2, zkráceného o tuto C-koncovou doménu, nejsou na rozdíl od wt PV schopny uniknout z časného endozómu. Tato C-koncová doména se skládá ze segmentu hydrofobních aminokyselin navazujících na segment bazických aminokyselin a pro efekt destabilizace membrán jsou nutné obě tyto části. Předpokládá se, že bazické aminokyseliny umožňují těsnou asociaci L2 se záporně nabitými lipidy buněčné membrány a následná inzerce hydrofobní části L2 do membrány způsobí torzní napětí, který vede k narušení membrán. Nízká koncentrace molekul L2 v endozómu nesoucím jednu virovou částici a taktéž nízká koncentrace L2 nutná k cytotoxickým efektům naznačuje, že mechanizmus účinku L2 není tvorba pórů jako u viroporinů, ale je podobný mechanizmu účinku detergentů, resp. se jedná o tzv. „kobercový mechanizmus“ (viz kap. 2.3). Působení L2 na membrány je taktéž závislé na kyselém pH. (KÄMPER et al., 2006) Tím lze vysvětlit i závislost infektivity papillomavirů na nižším pH endozómů (SELINKA et al., 2002, DAY et al., 2003). L2 v pozdní fázi infekce asociuje oblastí na svém C-konci s buněčným chaperonem Hsc70, čímž je pravděpodobně maskována funkce C-koncové hydrofobní domény L2 v průběhu

47 infekčního cyklu papillomavirů. Při vstupu viru do buňky však Hsc70 přítomen není a je tak umožněna disrupce endozomální membrány. (FLORIN et al., 2004) L2 obsahuje DNA vazebnou doménu i NLS. Předpokládá se, že po úniku viru z endozómu je zodpovědný za doručení virové DNA do jádra. (FAY et al., 2004) V jádře byla pozorována asociace L2 s jadernými PML tělísky. Předpokládá se, že do PML tělísek L2 přivádí také L1 pentamery pro následnou morfogenezi virionů. (DAY et al., 1998, FLORIN et al., 2002) Pro enkapsidaci virové DNA do virionů během jejich morfogeneze je interakce mezi L1 a L2 taktéž nezbytná. (OKUN et al., 2001)

2.3.7. Protein VI adenovirů Adenoviry jsou neobalené viry, mají kapsidu s ikosahedrální symetrií (T = 25) o relativně velkém průměru (90 nm) a vysoké komplexitě v porovnání s menšími neobalenými viry. Vstup adenovirů do hostitelské buňky je zahájen navázáním globulární domény virových „vláken“ (fibers), vyčnívajích z vrcholů ikosaherdální kapsidy, na receptor. Následně je virus pomocí proteinu III (tzv. pentonová báze) navázán na sekundární receptor (jímž je integrin αvβ5) a endocytován do membránových váčků. Pro rozvolnění virionu a následnou permeabilizaci membrány je nutné kyselé prostředí endozómu. (WICKHAM et al., 1993, WICKHAM et al., 1994) Dříve se předpokládalo, že za permeabilizaci endocytických váčků zodpovědný protein III, protože protilátky proti němu blokují membránovou permeabilizaci navozenou virovými částicemi (SETH et al., 1984). Tento jev byl však později vysvětlen tak, že navázané protilátky znemožňovaly rozvolnění virionu, které disrupci endozomálních membrán musí předcházet, protože za ní je zodpovědný vnitřní kapsidový protein VI. Molekuly tohoto proteinu se nacházejí ve vrcholech ikosahedrální kapsidy pod peripentonálními hexony v celkovém množství 360 monomerů na kapsidu a uvnitř kapsidy jsou uspořádány jako trimery dimerů (STEWART et al., 1993). Na N-konci proteinu VI se nachází amfipatický α-helix, který je u adenovirů značně konzervovaný. Protein VI produkovaný v bakteriích je schopný permeabilizovat lipozómy, po deleci tohoto amfipatického α-helixu však tuto schopnost ztrácí. Závislost adenovirů na nízkém pH je podle autorů způsobena spíše jeho vlivem na rozvolnění kapsidy, které následně umožní uvolnění VI z kapsidy, než vlivem pH na schopnost proteinu VI interagovat s membránami. Stejně tak i interakce proteinu III s integrinem αvβ5 je důležitá pro rozvolnění kapsidy. Proces permeabilizace membrány endozómu nesoucího adenovirový virion je shrnut na obr. 2.25.

48 Obr. 2.25. Hypotetický model disrupce endozomální membrány adenovirovým proteinem VI. Pentonová báze (PB = protein III) interaguje s integrinem αvβ5 a virus se dostává do membránového váčku (A), acidifikace endozómu navodí rozvolnění kapsidy, disociaci proteinu VI z peripentonálních hexonů (B) a disrupci membrány endozómu (C) (upraveno podle WIETHOFF et al., 2005).

WIETHOFF et al., 2005 se domnívají, že mechanismus permeabilizace membrány endozómu spočívá ve vložení proteinu VI do membrány paralelně k úrovni lipidické dvojvrstvy a následné permeabilizaci membrány podobným mechanismem jako uvádí KÄMPER et al., 2006, v případě L2 papillomavirů a BONG et al., 2000, v případě nodavirů, tedy permeabilizací bez tvorby stabilních pórů. (WEITHOFF et al., 2005) Virus je následně transportován cytoplazmou ke komplexu jaderného póru, kde je virová DNA uvolněna do jádra a kapsida je disociována (GREBER et al., 1993). Dalšími funkcemi proteinu VI je, že napomáhá jadernému importu kapsidovému proteinu II (hexonu) (WODRICH et al. 2003), stimuluje virovou proteázu L3/p23 během morfogeneze virionů (MANGEL et al., 1993) a slouží jako vnitřní strukturní protein, jenž stabilizuje kapsidu. (STEWART et al., 1993)

2.3.8. Viroporiny Viroporiny jsou uměle vytvořená skupina nepříbuzných virových proteinů, převážně nestrukturních, jejichž společnou vlasností je malá délka sekvence (60-120 aminokyselin, tj. cca 7 – 15 kDa), přítomnost amfipatického α-helixu a schopnost vytvářet oligomerní membránové póry. Všechny dosud popsané viroporiny, odpovídající této definici, vytvářejí malé póry ve smyslu iontových kanálů. Typickými příklady nestrukturních viroporinů jsou proteiny picornavirů 2B a 3A, alfavirový protein 6K, Vpu viru HIV a p7 flavivirů. Důsledkem

49 exprese těchto viroporinů je permeabilizace hostitelských membrán. Funkcemi viroporinů je často usnadnění uvolnění nově vzniklých virionů z hostitelské buňky, častěji se však hovoří o ovlivnění sekrece a vnitrobuněčného transportu hostitelské buňky. Výjimkou je M2 viru chřipky, který je přítomný v lipidickém obalu virionu a lze jej tedy považovat za strukturní protein. M2 sehrává roli iontového kanálu v při vstupu viru do buňky, kdy umožňuje influx H+ iontů z endozómu do virové částice, čímž je umožněno její následné rozvolnění. Kromě toho je však M2 důležitý také v pozdní fázi infekce podobným způsobem jako výše zmíněné nestrukturní viroporiny. (GONZALEZ a CARRASCO, 2003, review) Bylo prokázáno, že exprese 2B, 3A, 6K, p7, M2 a dalších viroporinů v eukaryotických buňkách vede k narušení buněčné homeostázy a k apoptóze závislé na uvolnění cytochromu c z mitochondrií. Pravděpodobnou příčinou indukce apoptózy je narušení vnitrobuněčných membrán viroporiny. (MADAN et al., 2007) V nedávné době bylo zjištěno, že agnoprotein, pozdní nestrukturní protein, vyskytující se u primátích polyomavirů (v genomu MPyV a příbuzných polyomavirů není kódován) vykazuje vlastnosti viroporinu. Agnoprotein JC viru je schopný oligomerizovat a má výraznou afinitu k intracelulárním membránám. Předpokládanou funkcí agnoproteinu jakožto viroporinu je navození lyze hostitelské buňky. (SUZUKI et al., 2010) Afinita agnoproteinu k membránám byla potvrzena i u BK viru (UNTERSTAB et al., 2010). Vzhledem k velikosti agnoproteinu (8 kDa), prokázané schopnosti oligomerizovat jako integrální membránový protein a skutečnosti, že se jedná a nestrukturní protein je zcela legitimní zařadit jej mezi viroporiny. Oproti tomu VP2 a VP3 definici viroporinů neodpovídají molekulovou hmotností a dosud nebylo přesvědčivě prokázáno, že vytvářejí oligomerní póry. Přesto se v litertuře někdy označují za proteiny s viroporinovými vlastnostmi (DANIELS et al., 2006a, HUÉRFANO et al., 2010).

50 Velikost Protein Mechanismus Cílové místo Translokovaná struktura Spouštěcí mechanusmus Další faktory kapsidy interagující s penetrace membránami Picornaviry ~30 nm VP1 a VP4 Tvorba póru, přímo spojeného s kapsidou, Cytoplazmatická RNA Navázání viru na receptor ? translokace virové RNA skrz pór membrána Nodaviry ~30 nm γ Tranzientní permeabilizace endozomální Endozomální RNA v komplexu s Rozvolnění virionu, kyselé prostředí ? membrány (?) membrána proteinem γ (?) endozómu Reoviry ~85 nm μ1N Tvorba pórů, osmolytická disrupce Endozomální Virové core Proteolytické štěpení, kyselé prostředí Hsc70 (?) endozómů (?) membrána endozómu, K+ ionty (?) Rotaviry ~100 nm VP5 Disrupce membrán pomocí vnitřní Endozomální Rozvolněný virion (?) Rozvolnění virionu, deplece Ca2+ iontů Hsc70 hydrofobní domény (?) membrána Parvoviry ~25 nm VP1 a VP3 (?) PLA2 aktivita VP1 a/nebo permeabilizace Endozomální Virion s pozměněnou Kyselé prostředí endozómu, ? membrány proteinem VP3 (?) membrána povrchovou strukturou (?) proteolytické štěpení VP2 na VP3 (?) Polyomaviry ~45 nm VP2 a VP3 Interakce s ERAD, penetrace membrán, Endoplazmatické Částečně rozvolněný Navázání viru na receptor, ERAD, PDI nebo navození hydrofobního povrchu retikulum (?) virion nebo virion s endozomální acidifikace, změny virionů (?) hydrofobním povrchem (?) uspořádání a/nebo rozvolnění VP1 (?) Papillomaviry ~55 nm L2 Tranzientní permeabilizace endozomální Endozomální Virový minichromozom v Proteolytické štěpení N-konce L2, cyklofiliny membrány (?) membrána komplexu s L2 (?) kyselé prostředí endozómu, rozvolnění virionu Adenoviry ~90 nm VI Tranzientní permeabilizace endozomální Endozomální Částečně rozvolněný Navázání viru na receptor, rozvolnění ? membrány (?) membrána virion nebo virion s virionu hydrofobním povrchem (?)

Tab. 2.1. Shrnující tabulka kapsidových proteinů neobalených virů, zodpovědných za penetraci membrán během vstupu těchto virů do buňky. 3. CÍLE PRÁCE Jednou z oblastí studia životního cyklu polyomavirů v naší laboratoři je dlouhodobě problematika funkcí minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3 polyomavirů – především myšího polyomaviru (MPyV), ale od nedávna také BK viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium vlastností minoritních kapsidových proteinů MPyV. Typickým znakem virů s malým úsporným genomem, kódujícím malé množství genů, jako v případě polyomavirů, je multifunkčnost jejich nestrukturních ale i strukturních genových produktů. Hlavní předpokládanou funkcí VP2 a VP3 je penetrace membrány endoplazmatického retikula (ER) pro uvolnění částečně rozvolněných virionů do cytoplazmy a jejich další cestu přes jaderné póry do buněčného jádra. Dalšími uvažovanými funkcemi VP2 a VP3 mohou být příspěvek k destrukci hostitelské buňky, příspěvek k funkčně správné morfogenezi polyomavirů, ovlivnění signálních drah v infikované buňce či jiné, zcela neznámé interakce s hostitelskými strukturami. Cíle této diplomové práce proto byly tyto: ● Přispět k objasnění příčiny výskytu a vlastností izoforem VP2 a VP3, detekovaných proteinovou elektroforézou jako dvojité proužky. Tento cíl zahrnuje: • Izolaci a purifikaci MPyV z infikovaných tkáňových kultur. • Separaci strukturních proteinů MPyV elektroforetickými metodami pro analýzu vzorků pomocí hmotnostní spektrometrie. • Další charakteriaci těchto izoforem VP2 a VP3 (výskyt v průběhu infekčního cyklu, 2D elektroforéza) ● Příprava expresních plazmidů pro produkci zkrácených variant VP2 a VP3, fúzovaných k N-konci EGFP, v savčích buňkách pro srovnání jejich vlastností s dříve připravenými a charakterizovnými variantami VP2 a VP3, fúzovanými k N-konci či C-konci EGFP (HUÉRFANO et al., 2010). Tento cíl zahrnuje: • Přípravu plazmidu pUV2-NLS-EGFP pro produkci fúzního proteinu sestávajícího se z unikátní části VP2, jaderného lokalizačního signálu a EGFP. • Přípravu plazmidů pVP2ΔD2-EGFP a pVP3ΔD2-EGFP pro produkci fúzních proteinů sestávajících se z VP2 či VP3 s deletovanou předpokládanou transmembránovou doménou 2 (D2) a EGFP. • Sledování vlastností těchto fúzních proteinů pomocí konfokální mikroskopie.

53 4. MATERIÁL A METODY 4.1. Materiál

4.1.1. Přístroje • Aparatura pro horizontální agarózovou elektroforézu multiSub Mini (Cleaver). • Aparatura pro izoelektrickou fokusaci Protean IEF Cell (Bio-Rad). • Aparatura pro přípravu gradientu SG 50 (Hoefer). • Aparatura pro SDS-PAGE SE 260 (Hoefer), Criterion Cell (Bio-Rad). • Aparatura pro Western blot TE22 (Amersham Biosciences). • Centrifuga Beckman Centrifuge GS-15R, rotor S4180 (Beckman), mikrocentrifuga Microfuge Lite 16, rotor A46544 (Beckman) mikrocentrifuga Microfuge Lite, rotor F1802 (Beckman), mikrocentrifuga Microfuge R, rotor F241.5 (Beckman), mikrocentrifuga MiniSpin plus, rotor IL 016 (Eppendorf), centrifuga Megafuge 1.0R (Heraeus Sepatech), centrifuga pro kapiláry MPW 300, rotor CM-304 (Mechanika Precyzyjna Warszawa), centrifuga 3K30, rotory 12171, 12154-H, 18776-H, (Sigma), centrifuga s výkymným rotorem MSE (MSE).

• CO2 termostat (Forma Scientific). • Elektronový mikroskop JEOL JEM 1200 EX. • Elektroporátor Gene Pulser Apparatus (Bio-Rad). • Fluorescenční mikroskop BX-60 (Olympus), fluorescenční invertovaný mikroskop IX71 (Olympus). • Invertovaný mikroskop (Carl Zeiss-Jena), invertovaný mikroskop CK40 (Olympus). • Konfokální mikroskop TCS SP2 Laser Scanning Confocal Microscope (Leica). • Kultivační třepačky Orbital Shaker (Forma Scientific), Orbi-Safe TS (Gallenkamp). • Laminární box (Forma Scientific). • Magnetická míchačka B212 (Bibby), magnetická míchačka Bigsquid (Ika). • PCR cykler Mastercycler EPgradient S (Eppendorf). • Peristaltická pumpa (F.A. Hughes). • pH metr PH 114 (Snail Instruments), pH metr S20 SevenEasy (Mettler Toledo). • Refraktometr ABBE (Carl Zeiss Jena). • Sonikátor Bransonic 5 (Cole-Parmer Instrument Company) • Spektrofotometr Heλios β (Thermo Electron). • Termobloček CH-100 (Biosan). • Termostat TCH 100 (laboratorní přístroje Praha). • Třepačky Duomax 1030 (Heidolph), Mini Labroller, Shaker 30 (Labnet). • Ultracentrifuga Optima TM L-90K, rotory SW 28, SW 41 (Beckman).

55 • UV transluminátor (BioLum). • Vortex-Genie 2 (Scientific Industries). • Vodní lázeň SUB (Grant). • Zdroje elektrického napětí Consort EV265 (Isogen), E-C Apparatus EC3000P (Lehman), Gene Line Power Supply (Beckman), OSP-250L Power Supply (Lightning Volt).

4.1.2. Chemikálie (Řazeno podle výrobce.) • Agaróza pro elektroforézu (Amresco). • CsCl (BDH). • dATP, dCTP , dGTP , dTTP (Fermentas). • Deoxycholát sodný, DPH (1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien), PTA {fosfowolframová kyselina,

H3[P(W3O10)4]} (Fluka).

• Aceton, bromfenolová modř, CH3COOH (99%), DMSO (dimetylsulfoxid), etanol (96%),

HCl (35%), HClO4 (70%), chloroform, izoamylalkohol, izopropanol, KCl, KH2PO4,,

MgCl2, MgSO4, Na2HPO4·12H2O, metanol, NaCl, sacharóza (Lachner/Lachema).

• CH3COONa (Merck).

• CH3COOK, glycerol, NaOH (Penta). • DTT (dithiothreitol) (Roche). • Akrylamid, bisakrylamid (N,N'-metylen bisakrylamid), Coomassie Brilliant Blue G 250, CsCl, EDTA-disodium (etylendiamin-tetraacetát disodný), EGTA (etylenglykol-

tetraoctová kyselina), etidum bromid, glukóza, glycin, H3BO3, persíran amonný, tris [tris(hydroxymetyl) aminometan] (Serva). • Versen (Sevac).

• Aprotinin, BSA (bovinní sérový albumin), CaCl2, DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid), fenol upravený [destilovaný, pufrovaný 1 M tris-HCl (pH = 8),

s přidáním 0,1% 8-hydroxycholinu – upraveno výrobcem], H2O2 (30%), CHAPS {3-[(3- Cholamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonát}, IAA (jodacetamid), L-glutamin, p-kumarová kyselina, luminol, 2-merkaptoetanol, NP-40 (Nonident P-40), paraformaldehyd, PMSF (fenylmetansulfonylfluorid), SDS (dodecyl sulfát sodný), TEMED (N,N,N',N'-Tetrametylethlenediamin), Triton X-100, Tween 20, urea, želatina z prasečí kůže (Sigma).

56 4.1.3. Složení používaných roztoků

(Pokud není uvedeno jinak, jedná se o roztoky v destilované H2O.) • 30% akrylamid/bisakrylamid: 29% (w/v) akrylamid, 1% (w/v) bisakrylamid,

rozpuštěno v ddH2O při 65°C.

• Barvící roztok pro polyakrylamidové gely: 3,5% (v/v) HClO4, 0,5% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G 250.

• B pufr: 10 mM tris-HCl (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 μM CaCl2.

• 3M CH3COONa: 3M CH3COONa (pH upraveno ledovou kyselynou octovou na 5,2). • 0,5 M EDTA-NaOH (pH = 8,0): 0,5 M EDTA (pH upraveno roztokem NaOH na pH = 8,0). • Ekvilibrační pufr pro 2D elektroforézu s DTT: 6 M urea, 375 mM tris-HCl (pH = 8,8), 2% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 13 mM DTT. • Ekvilibrační pufr pro 2D elektroforézu s IAA: 6 M urea, 375 mM tris-HCl (pH = 8,8), 2% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 13,5 mM IAA.

• 2000× koncentrovaný etidiumbromid: 1 mg etidiumbromidu na 1 ml dH2O.

• Fixační roztok pro polyakrylamidové gely: 50% (v/v) metanol, 5% (v/v) HClO4. • Chloroform, upravený: chloroform s izoamylalkoholem v poměru 24:1. • 5× Laemmliho pufr: 50% (v/v) glycerol, 25% (v/v) 2-merkaptoetanol, 50 mM tris-HCl

(pH = 6,8), 5% (w/v) SDS, 0,005% (w/v) bromfenolová modř v ddH2O.

• Luminol: Roztok A: 18 ml dH2O, 2 ml 1 M tris-HCl (pH = 8,5), 200 µl 0,5% (w/v) luminolu v DMSO, 88 µl 1,5% (w/v) kyseliny p-kumarové v DMSO. Roztok B: 18 ml

ddH2O, 2 ml 1 M tris-HCl (pH = 8,5), 20 µl H2O2. Roztoky A a B byly smíchány bezprostředně před aplikací na nitrocelulózovou membránu.

• PBS (phosphate buffered saline): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM Na 2HPO4,

6,5 mM KH2PO4, doplněno ddH2O do 1000 ml, pH bylo pomocí HCl upraveno na 7,4.

• Pufr pro SDS-PAGE: 25 mM tris, 192 mM glycin, 0,1% (w/v) SDS v ddH2O, pH upraveno HCl na 8,3.

• Pufr pro Western blot: 25 mM tris, 192 mM glycin, 20% (v/v) metanol v ddH2O. • Rehydratační pufr pro IEF: 8 M urea, 1% (w/v) CHAPS, 20 mM DTT, 1× koncentrovaný pufr Bio-Lyte 3/10 Ampholyte (Bio-Rad), 0,01% bromfenolová modř • RIPA pufr: 50 mM tris-HCl (pH = 7,4), 1 mM EDTA-NaOH (pH = 8,0), 150 mM NaCl, 1% (v/v) NP-40, 1% (w/v) deoxycholát sodný, 0,1% (w/v) SDS. • RNáza: 10 mg RNázy A (Serva) na 1 ml roztoku 10 mM tris-HCl (pH = 8,0) a 15 mM NaCl (případné DNázy byly inaktivovány povařením roztoku po dobu 5 minut). • Roztok I: 50 mM glukóza, 25 mM tris-HCl (pH = 8,0), 10 mM EDTA-NaOH (pH = 8,0). • Roztok II: 0,2 M NaOH, 1% (w/v) SDS.

57 • Roztok III: 60 ml 5 M CH3COOK, 11,5 ml CH3COOH (99%), 28,5 ml dH2O.

• 0,5× TBE pufr: 45 mM Tris, 45 mM H3BO3, 1 mM EDTA-NaOH (pH = 8,0). • TE pufr: 10 mM tris-HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA-NaOH (pH = 8,0). • 1 M tris-HCl: 1 M tris (upraveno HCl na požadované pH). • Trypsin: 0,25% roztok Trypsinu v PBS. • Versen: 0,02% roztok versenu v PBS. • 5× koncentrovaný vzorkový pufr pro agarózovou elektroforézu: 0,1% bromfenolová modř, 50% glycerol v 0,5× koncentrovaném TBE pufru.

4.1.4. Antibiotika • Kanamycin: používán v konečné koncentraci 50 μg/ml (Sigma). • Směs antibiotik pro tkáňové kultury: používán 100× koncentrovaný roztok obsahující 10000 jednotek ampicilinu, 10 mg streptomycinu a 25 mg amphotericinu B na 1 ml (Sigma).

4.1.5. Kultivační média

4.1.5.1. Bakteriální média • LB médium: 1% (w/v) pepton pro bakteriologii (Imuna), 0,5% (w/v) kvasničný autolyzát (Imuna), 1% (w/v) NaCl. • SOC médium: 2% (w/v) pepton pro bakteriologii, 0,5% (w/v) kvasničný autolyzát,

20 mM glukóza, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 (MgCl2

a MgSO4 byly sterilizovány odděleně a k médiu přidány bezprostředně před použitím, glukóza byla sterilizována odděleně pomocí 0,22 μm filtru a k médiu přidána před použitím). • TPN médium: 0,5% (w/v) kvasničný autolyzát, 2% (w/v) pepton pro bakteriologii, 0,5% (w/v) NaCl. • Živný bujón č. 2: 2% živný bujón č. 2 (Imuna). • Živný agar č. 2: 4% živný agar č. 2 (Imuna).

4.1.5.2. Média pro tkáňové kultury • DMEM bez FCS: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma), 2 mM L-glutamin, dle potřeby 1% (v/v) směs antibiotik pro tkáňové kultury. • DMEM s FCS: DMEM, 10% (v/v) FCS (fetální telecí sérum, Gibco), 2 mM L-glutamin, dle potřeby 1% (v/v) směs antibiotik pro tkáňové kultury.

58 • DMEM s FCS pro mikroskopii živých buněk: DMEM bez fenolové červeně (Sigma), 10% (v/v) FCS, 2 mM L-glutamin, dle potřeby 1% (v/v) směs antibiotik pro tkáňové kultury. • RPMI s FCS: RPMI-1640 (Sigma), 5% (v/v) FCS, 2 mM L-glutamin.

4.1.6. Protilátky

4.1.6.1. Primární protilátky • Králičí polyklonální protilátka proti BiP. Pro imunofluorescenční značení ředěno 200× (Alexis). • Králičí polyklonální protilátka proti GFP. Pro Western blot ředěno 1000× (Abcam). • Myší monoklonální protilátka proti histonu H1. Pro imunofluorescenční značení ředěno 200× (Santa Cruz). • Kozí polyklonální protilátka proti laminu B. Pro imunofluorescenční značení ředěno 100×. (Santa Cruz). • Potkaní monoklonální protilátka LT4 proti LT antigenu myšího polyomaviru. Pro imunofluorescenční značení neředěno. Připraveno S. Dilworthem, Imperial College of Medicine, Londýn, Velká Británie • Myší monoklonální protilátka A proti proteinu VP1 myšího polyomaviru. Pro dot blot ředěno 2× (FORSTOVÁ et al., 1993). • Myší monoklonální protilátka 2C8 proti společné části proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru. Pro western blot ředěno 2× (FORSTOVÁ et al., 1993).

4.1.6.2. Sekundární protilátky • Kozí protilátka proti králičím imunoglobulinům konjugovaná s Alexa Fluor 546. Pro imunofluorescenční značení ředěno 1000× (Molecular Probes). • Kozí protilátka proti králičím imunoglobulinům konjugovaná s křenovou peroxidázou. Pro western blot ředěno 1000× (Pierce). • Kozí protilátka proti myším imunoglobulinům konjugovaná s Alexa Fluor 546. Pro imunofluorescenční značení ředěno 1000× (Molecular Probes). • Kozí protilátka proti myším imunoglobulinům konjugovaná s křenovou peroxidázou. Pro western blot ředěno 1000× (Bio-Rad). • Kozí protilátka proti potkaním imunoglobulinům konjugovaná s Alexa Fluor 546. Pro imunofluorescenční značení ředěno 1000× (Molecular Probes). • Oslí protilátka proti kozím imunoglobulinům konjugovaná s Alexa Fluor 546. Pro imunofluorescenční značení ředěno 1000× (Molecular Probes).

59 4.1.7. Komerční roztoky • 100× koncentrovaný pufr Bio-Lyte 3/10 Ampholyte pro IEF, GTporator-M Electroporation Solution (Bio-Rad). • 10× koncentrovaný pufr pro DNA ligázu bakteriofága T4; 10× koncentrované pufry pro restrikční enzymy: pufr pro BamH I, pufr pro Kpn I, pufr pro Sac I, pufr R, pufr Tango™; 6× koncentrovaný vzorkový pufr pro agarózovou elektroforézu Orange DNA Loading Dye; TurboFect™ in vitro Transfection Reagent (Fermentas). • Ustalovač Fomafix, vývojka LP-T (Foma). • PBS pro tkáňové kultury (Lonza). • 10× koncentrovaný Thermo Pol pufr pro Vent DNA polymerázu (New England BioLabs). • Směs inhibitorů proteáz Complete Mini, EDTA-free (Roche).

4.1.8. Enzymy • DNA ligáza bakteriofága T4, restrikční endonukleázy BamH I, Bgl II, Hind III, Kpn I, Nhe I, Sac I, Xho I (Fermentas). • Vent DNA polymeráza (New England BioLabs). • RNáza A (Serva). • Neuraminidáza z Vibrio cholerae, trypsin (Sigma).

4.1.9. Markery molekulových hmotností O'GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder (Fermentas) pro agarózovou DNA elektroforézu.

Obr. 4.1. Velikosti DNA fragmentů v párech bazí a jejich množství u markeru molekulových hmotností O'GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder pro agarózovou DNA elektroforézu.

60 Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas) pro SDS-PAGE.

Obr. 4.2. Velikosti proteinů v kDa u markeru Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder pro SDS-PAGE.

Color Marker Low Range C3187 (Sigma) pro SDS-PAGE. ~45

Obr. 4.3. Velikosti proteinů v kDa u markeru Color Marker Low Range C3187 pro SDS- ~29 PAGE. ~20

~14,2

~6,5

4.1.10. Vektory • pEGFP-N1: Vektor určený k expresi proteinu zájmu fúzovaného k N-konci EGFP v savčích buňkách. Sekvence genu pro EGFP je v tomto vektoru umístěna mezi polylinkerem a polyadenylačním signálem viru SV40. Vektor dále obsahuje origin SV40 pro replikaci v savčích buňkách exprimujících LT antigen viru SV40, časný promotor SV40, gen pro rezistenci k neomycinu a kanamycinu a polyadenylační signál z genu pro thymidin kinázu viru Herpes simplex, umožňující stabilně transfekovaným buňkám selekci na G418. Součástí vektoru je i bakteriální promotor pro expresi genu pro kanamycin v E. coli, origin replikace pro propagaci v E. coli (pUC) a origin replikace pro produkci ssDNA (f1). Protein fúzovaný s EGFP je exprimován z časného promotoru lidského cytomegaloviru (HCMV) (pro mapu plazmidu viz obr. 5.22) (Clontech). • pVP2-EGFP: Vektor připravený E. Bouřou, vzniklý zaklonováním sekvence pro protein VP2 do polylinkeru plazmidu pEGFP-N1. pVP2-EGFP v savčích buňkách zajišťuje expresi proteinu VP2 fúzovaného k N-konci EGFP (viz BOUŘA, 2004).

61 • pVP3-EGFP: Vektor připravený E. Bouřou, vzniklý zaklonováním sekvence pro protein VP3 do polylinkeru pEGFP-N1. pVP3-EGFP v savčích buňkách zajišťuje expresi proteinu VP3 fúzovaného k N-konci EGFP (viz BOUŘA, 2004). • pUV2-EGFP: Vektor připravený E. Bouřou, vzniklý vyštěpením sekvence společné části proteinů VP2 a VP3 z plazmidu pVP2-EGFP. pUV2-EGFP v savčích buňkách zajišťuje expresi unikátní část proteinu VP2 fúzovanou k N-konci EGFP (viz BOUŘA, 2004).

4.1.11. Primery/oligonukleotidy • NLS-A: oligonukleotid určený k vložení jaderného lokalizačního signálu do plazmidu pUV2-EGFP - "sense" řetězec, na 5'-konci fosforylovaný (viz kap. 5.3.1): 5'-p-CTA CAC AAC GAA GAG GTC CCT ACT GTA AAT AGA AAT GAG GAA GAT GGC CCC CAA AAG AAA AAG CGG CGT CTC GAG CTC CGG

Modře je vyznačena část unikátní sekvence VP2 od restrikčního místa pro Kpn I po konec unikátní části VP2 (nukleotidy 311 – 345 od začátku kódující sekvence VP2), červeně je vyznačena sekvence jaderného lokalizačního signálu, podtrženo je restrikční místo pro Sac I. • NLS-B: oligonukleotid určený k vložení jaderného lokalizačního signálu do plazmidu pUV2-EGFP - "antisense" řetězec, na 5'-konci fosforylovaný (viz kap. 5.3.1): 5'-p-G ATC CCG GAG CTC GAG ACG CCG CTT TTT CTT TTG GGG GCC ATC TTC CTC ATT TCT ATT TAC AGT AGG GAC CTC TTC GTT GTG TAG GTA C

Barevné značení shodné jako u NLS-A. • VP2 Bgl II/1: „upstream“ primer pro PCR od 5'-konce sekvence VP2 s restrikčním místem pro Bgl II (podtrženo): TT GAC AGA TCT ATG GGA GCC GCA CTG

• VP2/3 BamH I/2: „downstream“ primer pro PCR od restrikčního místa pro BamH I uvnitř sekvence společné části VP2/VP3 (podtrženo): C AGA CGG ATC CCG CCA TGG TAT CAA CGC CT

• VP2/3ΔD2 BamH I/1: „upstream“ primer pro PCR od konce sekvence předpokládané hydrofobní domény 2 VP2/VP3 (306. aminokyselina) s restrikčním místem pro BamH I (podtrženo): CAG ACG GAT CCA GCC GAA ACA CAA CAC AGA CTG GA

• VP2/3 Hind III/2: „downstream“ primer pro PCR od 3'-konce sekvence VP2/VP3 s restrikčním místem pro Hind III (podtrženo): AT CTG AAG CTT TCG CCA AGT CCC GAG ACG CCG CTT TTT C

62 • VP3ΔD2 Nhe I/1: „upstream“ primer pro PCR od 5'-konce sekvence VP3 s restrikčním místem pro Nhe I (podtrženo): TT GAC GCT AGC ATG GCG TTG ATA CCA

Oligonukleotidy NLS-A a NLS-B byly připraveny firmou Sigma, primery VP2 Bgl II/1, VP2/3 BamH I/2, VP2/3ΔD2 BamH I/1, VP2/3 Hind III/2 a VP3ΔD2 Nhe I/1 byly připraveny firmou Invitrogen.

4.1.12. Buněčné linie, bakteriální kmeny a viry • Escherichia coli DH5α: recA1, endA1, thi-1, hsdR17, supE44, gyrA96, relA1, Δ(lacZYA-argF)U169 (Φ80lacZΔM15) (Stratagene). • Myší polyomavirus, kmen A2: Získán od prof. P. Amati, Universita La Sapienza, Řím. • Myší polyomavirus, kmen BG: Získán od prof. B. E. Griffin, Imperial College of Medicine, Londýn • NIH 3T3: Myší fibroblasty odvozené z embryonálních tkání. Použité pro transfekci expresními vektory. Tato buněčná linie byla získána ze sbírky American Type Culture Collection. • NIH 3T6: Myší fibroblasty odvozené z embryonálních tkání. Použité pro infekci myším polymavirem a jeho izolaci. Tato buněčná linie byla získána ze sbírky American Type Culture Collection. • WME: Whole mouse embryo. Primární buněčná linie myších embryonálních buněk, připravena Mgr. M. Stančíkovou.

4.1.13. Komerční soupravy • EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen). • NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel).

4.1.14. Ostatní materiál • Elektroporační kyvety Bio-Rad Gene Pulser® Cuvette, gel pro SDS-PAGE Criterion™ Precast Gel, strip pro IEF ReadyStrip™ IPG Strip (Bio-Rad). • RTG film Medix XBU X-Ray Film (Foma). • Dialyzační membrány Servapor 16 mm a 21 mm (regenerovaná celulóza, průměr póru 2,5 nm), nitrocelulózová membrána NC 45 (Serva).

63 4.2. Sterilizace Roztoky, špičky k pipetám a mikrozkumavky byly sterilizovány v autoklávu (30 minut, 120 kPa, 127°C). Roztoky, které nemohly být sterilizovány v autoklávu byly sterilizovány filtrací (0,22 μm filtry). Plastové zkumavky byly sterilizovány 24 hodin parami kyseliny peroctové. Pinzety, mikrobiologické hokejky a kličky byly sterilizovány plamenem po namočení do etanolu.

4.3. Práce s bakteriemi

4.3.1. Kultivace bakterií Bakterie byly kultivovány na pevném agaru staticky v termostatu při 37°C nebo v tekutém médiu aerobně v termostatové třepačce při 37°C. Pokud bakterie obsahovaly plazmid zajišťující rezistenci na antibiotika, byla přidána selekční antibiotika v doporučené koncentraci.

4.3.2. Příprava kompetentních buněk pro elektroporaci (DOWER et al., 1988) Bakterie Escherichia coli kmene DH5α byly zaočkovány do 10 ml TPN média a přes noc aerobně kultivovány při 37°C. Druhý den byla změřena optická denzita (vlnová délka 560 nm, šířka kyvety 1 cm) a do 400 ml TPN média byl zaočkován takový objem buněčné suspenze, aby výsledná optická denzita odpovídala hodnotě 0,1. Bakterie byly kultivovány za stejných podmínek do dosažení optické denzity 0,5-0,7. Poté byla buněčná suspenze centrifugována (4300 RPM, 15 min., 4°C, centrifuga Megafuge 1.0 R) a pelet resuspendován ve 400 ml vychlazené (4°C) ddH2O a suspenze byla znovu centrifugována za stejných podmínek. Pelet byl stejným způsobem promyt v 200 ml vychlazené ddH2O, poté v 8 ml vychlazeného 10% glycerolu v ddH2O a nakonec v 800 μl vychlazeného 10% glycerolu v ddH2O. Výsledná suspenze byla rozdělena po 60 μl do mikrozkumavek, zmrazena v tekutém dusíku a skladována při -80°C.

4.3.3. Transformace bakterií elektroporací (DOWER et al., 1988) Kompetentní Escherichia coli kmene DH5α byly rozmraženy na ledu. Bylo přidáno 13 μl ligační směsi plazmidové DNA, směs byla promíchána a inkubována 1 minutu na ledu. Poté byla směs převedena do vychlazené elektroporační kyvety (vzdálenost elektrod 2 mm). Na elektroporátoru byl aplikován puls o parametrech 25 μF, 2,5 kV, 200 Ω. Optimální délka pulsu činila 4,5 ms. K bakteriím v elektroporační kyvetě byl ihned přidán 1 ml SOC média, obsah kyvety byl převeden do sterilní kultivační nádoby a bakterie byly aerobně kultivovány

64 1 hodinu při 37°C. Bakterie byly poté v různých koncentracích vysety na živný agar s příslušným antibiotikem a kultivovány 12 – 24 hodin v termostatu při 37°C.

4.3.4. Skladování bakterií Bakterie na Petriho miskách, zabezpečené proti vyschnutí, byly krátkodobě skladovány při 4°C. Pro dlouhodobé skladování byly čerstvě narostlé bakterie v živném bujónu smíchány se sterilním glycerolem do výsledné koncentrace 15%, zmrazeny v tekutém dusíku a skladovány při -80°C.

4.4. Práce s tkáňovými kulturami

Savčí buňky byly kultivovány v CO2 termostatu při 37°C v 5% CO2.

4.4.1. Pasážování savčích buněk linie 3T3 a 3T6 Z konfluentně narostlé kultivační misky bylo odsáto médium, buňky byly opláchnuty 0,02% roztokem versenu v PBS, bylo přidáno vhodné množství 0,25% roztoku trypsinu v PBS (500 μl v případě kultivační misky ∅ 100 mm, 250 μl v případě kultivační misky ∅ 60 mm) a buňky byly inkubovány v termostatu při 37°C přibližně 5 minut, dokud se neuvolnily ode dna misky. Trypsinizace byla zastavena přidáním vhodného množství média DMEM s 10% fetálního telecího séra (FCS) (v případě kultivační misky ∅ 100 mm do objemu 10 ml, v případě kultivační misky ∅ 60 mm do objemu 6 ml), buňky byly v médiu důkladně resuspendovány, posléze (zpravidla poměrem 1:6) rozděleny na kultivační misky a bylo doplněno DMEM s 10% FCS (v případě kultivační misky ∅ 100 mm do objemu 10 ml, v případě kultivační misky ∅ 60 mm do objemu 6 ml). Pro potřebu kultivace buněk na mikroskopických sklíčkách v 24 jamkové destičce bylo přidáno 60 μl buněčné suspenze a objem byl doplněn DMEM s 10% FCS do 1 ml.

4.4.2. Transfekce savčích buněk elektroporací Od buněk na kultivační misce narostlých do 50 – 70% konfluence bylo odsáto médium, buňky byly pomocí trypsinu převedeny do suspenze (viz kapitolu 4.4.1) a poté byla koncentrace buněk na 1 ml suspenze spočítána v Bürkerově komůrce. Pro jednu transfekci byl odebrán objem homogenní buněčné suspenze odpovídající 4×106 buněk a suspenze byla centrifugována na centrifuze MSE (1500 RPM, 10 min., při laboratorní teplotě). Buněčný sediment určený na jednu transfekci byl resuspendován v 80 μl GTporator-M Electroporation Solution (Bio-Rad), bylo přidáno 6 μg plazmidové DNA zbavené endotoxinů (viz kap. 4.7.8) a suspenze byla převedena do elektroporační kyvety (Bio-Rad Gene Pulser Cuvette, vzdálenost elektrod

65 2 mm). Na elektroporátoru Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) byl aplikován puls s napětím 200 V a délkou 20 ms. Po elektroporaci bylo k buňkám ihned přidáno 0,5 ml média RPMI s 5% FCS, buněčná suspenze byla převedena do sterilní mikrozkumavky a inkubována 15 min. při 37°C. Poté byla suspenze převedena na kultivační misku či 24 jamkovou destičku s mikroskopickými sklíčky s DMEM s 10% FCS. Po 2 – 3 hodinách bylo médium vyměněno za čerstvé.

4.4.3. Transfekce savčích buněk TurboFectem TurboFect™ in vitro Transfection Reagent je vodný roztok kationického polymeru, který vytváří s DNA stabilní kladně nabité komplexy. Tyto komplexy chrání DNA před degradací a umožňují její doručení do eukaryotických buněk. Pro transfekci buněk rostoucích na mikroskopických sklíčkách ve 24 jamkové destičce byl 1 μg DNA zbavené endotoxinů (viz kap. 4.7.8) smíchán se 100 μl DMEM bez FCS, byly přidány 2 μl TurboFect™ in vitro Transfection Reagent a směs byla inkubována 15 – 20 minut při laboratorní teplotě. Pro tranfekci buněk rostoucích na ∅ 35 mm Petriho miskách pro mikroskopii živých buněk bylo 4 μg DNA zbavené endotoxinů zředěno v 400 μl DMEM bez FCS, bylo přidáno 6 μl TurboFect™ in vitro Transfection Reagent a směs byla inkubována 15 – 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs přidána do DMEM s 10% FCS k buňkám narostlým do 50 – 70% konfluence. Médium bylo jemně promícháno, aby byla zajištěna rovnoměrná distribuce směsi TurboFectu™ s DNA. Buňky byly inkubovány v termostatu při 37°C a exprese transfekovaných genů byla pozorována po 4 – 48 hodinách.

4.4.4. Fixace a permeabilizace buněk na mikroskopických sklíčkách Buňky narostlé na mikroskopických sklíčkách byly opláchnuty PBS, 15 minut fixovány 4% paraformaldehydem v PBS a permeabilizovány 5 minut 0,2% Tritonem X-100 v PBS (obojí při pokojové teplotě). Poté byly 3× po 10 minutách promývány PBS na třepačce.

4.4.5. Imunofluorescenční značení proteinů v buňkách Fixované a permeabilizované buňky narostlé na mikroskopických sklíčkách byly vysyceny inkubací v roztoku 0,25% želatiny a 0,25% BSA v PBS po dobu 30 minut až přes noc. Poté byly promyty PBS, inkubovány s primární protilátkou zředěnou v roztoku 0,25% želatiny a 0,25% BSA v PBS (1 hodinu při laboratorní teplotě či přes noc při 4°C) a promývány 3× po 10 minutách v PBS. Následně byly buňky inkubovány 30 minut ve tmě se sekundární protilátkou zředěnou v roztoku 0,25% želatiny a 0,25% BSA v PBS a opět promyty 3× po 10 minutách v PBS. Sklíčka byla ponechána uschnout a položena buňkami na kapku 70% glycerolu s DAPI o koncentraci 0,1 μg/ml na podložním skle. Preparáty byly prohlíženy fluorescenčním mikroskopem BX-60 (Olympus) nebo konfokálním mikroskopem TCS SP2 Laser Scanning Confocal Microscope (Leica).

66 4.4.6. Konfokální mikroskopie živých buněk (HUÉRFANO et al., 2010) Buňky 3T3 narostlé na ∅ 35 mm Petriho miskách se skleněným dnem (MatTek) byly transfekovány (viz kap. 4.4.3) plazmidem určeným pro expresi EGFP a/nebo proteinů fúzovaných s EGFP. Když byla fluorescenčním invertovaným mikroskopem IX71 (Olympus) pozorována exprese EGFP a/nebo fúzních proteinů v dostatečné míře, bylo odsáto médium a přidáno médium bez fenolové červeně. Pro obarvení membránových struktur byl přidán 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) do konečné koncentrace 10 μM, médium bylo promícháno a buňky byly v inkubovány 30 minut v CO2 termostatu při 37°C. Následně byla Petriho miska umístěna do komůrky pro pozorování živých buněk konfokálním mikroskopem, vytemperované na 37°C s dodávaným CO2. Buňky byly prohlíženy konfokálním mikroskopem TCS SP2 Laser Scanning Confocal Microscope (Leica).

4.4.7. Synchronizace savčích buněk před infekcí

Buňky byly synchronizovány do G0 fáze buněčného cyklu 20 – 24 hodinovou inkubací v DMEM médiu bez FCS.

4.4.8. Infekce savčích buněk virem (TÜRLER a BEARD, 1985) Virové inokulum bylo minutu sonikováno ve stolním sonikátoru. Od buněk narostlých do 50 – 70% konfluence bylo odsáto DMEM s 10% FCS a buňky byly opláchnuty DMEM bez FCS. Na misku ∅ 150 mm bylo přidáno 2 ml DMEM bez FCS, na misku ∅ 100 mm byl přidán 1 ml DMEM bez FCS, na mikroskopické sklíčko v 24 jamkové destičce bylo přidáno 200 μl DMEM bez FCS. Bylo přidáno takové množství virového inokula, aby bylo dosaženo požadované multiplicity infekce. Buňky byly inkubovány za občasného kývání v termostatu 1 – 1,5 hod. Po uplynutí této doby bylo k buňkám přidáno DMEM médium se sérem. Doba infekce byla počítána od okamžiku přidání viru.

4.5. Izolace myšího polyomaviru (TÜRLER a BEARD, 1985) Buňky (linie 3T6 nebo WME) narostlé do 50 – 70% konfluence byly infikovány myším polyomavirem s multiplicitou infekce 0,1 f.f.u. (fluorescence forming units) na buňku. V případě buněčné linie 3T6 bylo infikováno 6 takto porostlých kultivačních misek ∅ 150 mm, v případě WME 19 kultivačních misek ∅ 100 mm. Pátý až šestý den po infekci bylo odebráno DMEM s 10% FCS, uschováno při 4°C nebo při -20°C a k buňkám bylo přidáno čerstvé

67 DMEM s 10% FCS. Osmý až dvanáctý den po infekci byly kultivační misky s narostlými buňkami i médiem třikrát zmraženy v -80°C a znovu rozmraženy, následně byly seškrábány škrabátkem a centrifugovány na centrifuze Sigma 3K30 společně s médiem odebraným při infekci (4800 RPM, 30 min., 4°C). Supernatant byl uschován při 4°C, pelet byl resuspendován v 10 mM tris-HCl, pH = 7,4 (1 ml na 10 kultivačních misek ∅ 100 mm nebo 1,5 ml na 6 kultivačních misek ∅ 150 mm) a vzniklá suspenze byla homogenizována na ledu ve skleněném homogenizátoru přerušovaně v 10 cyklech po 10 pohybech pístem vždy s odstupem dvou minut. K homogenizované směsi byl přidán inhibitor proteáz aprotinin v koncentraci 2 μg/ml směsi a neuraminidáza v koncentraci 0,01 U/ml směsi a lyzát byl přes noc inkubován při laboratorní teplotě za stálého míchání. Druhý den byl lyzát centrifugován na centrifuze Sigma 3K30 (4800 RPM, 40 min., 4°C), supernatant byl spojen s předchozím a uschován při 4°C, pelet byl resuspendován v 1 ml 10 mM tris-HCl (pH = 9,0) a inkubován 4 hodiny za stálého míchání při laboratorní teplotě. Poté byla směs opět centrifugována na centrifuze Sigma 3K30 (4800 RPM, 40 min., 4°C), supernatant byl spojen s předchozími a uschován při 4°C.

4.5.1. Centrifugace přes sacharózový polštář Médium obsahující viriony (supernatanty získané z infikovaných buněk a médií) byly přečištěny centrifugací přes 10% sacharózový polštář. Takto byly viriony zbaveny části kontaminujících proteinů a zároveň zahuštěny. Médium bylo v ultracentrifugačních kyvetách (Beckman Polyallomer Centrifuge Tubes 25×89 mm) podvrstveno cca 2,5 ml 10% sacharózy v B pufru a centrifugováno na ultracentrifuze Beckman Optima L-90K (rotor SW 28, 25 000 RPM, 3 hod., 4°C). Sediment byl resuspendován v B pufru za použití skleněného homogenizátoru.

4.5.2. Izopyknická centrifugace v rovnovážném gradientu CsCl (TÜRLER a BEARD, 1985) Centrifugace v rovnovážném gradientu CsCl umožňuje separaci virionů a pseudokapsid na základě jejich rozdílné vznášivé hustoty. Do centrifugačních kyvet (Beckman Polyallomer Ultra-Clear Centrifuge Tubes 14×89 mm) byl rozdělen roztok B pufru obsahující virus, získaný centrifugací přes sacharózový polštář a spojen s CsCl v hmotnostním poměru 2,5:1,2 (výsledná hustota vzorku 1,3 g/ml; pro centrifugační kyvetu určenou do rotoru SW 41 je optimální poměr 7,9 g virové suspenze naředěné v B pufru a 3,79 g CsCl.). Po úplném rozpuštění CsCl byl změřen refraktometrický index směsi, který se měl pohybovat v rozmezí 1,363 – 1,366 (vznášivá hustota virionů je ~1,33 g/ml). Roztok v ultracentrifugační zkumavce byl převrstven parafinovým olejem, zkumavky byly vyváženy a roztok centrifugován na ultracentrifuze

68 Beckman Optima L-90K (rotor SW 41, 35 000 RPM, 20 – 24 hod., 18°C). Vzniklý gradient byl rozdělen pomocí peristaltické pumpy na frakce po 300 – 400 μl. U jednotlivých frakcí byl změřen refraktometrický index a byla zjištěna přítomnost proteinu VP1 metodou dot blot. Na základě těchto analýz byly frakce pospojovány, CsCl byl ze vzorků odstraněn dialýzou.

4.5.3. Dialýza Tato metoda je založena na průchodu nízkomolekulárních látek, jako je např. CsCl, semipermeabilní membránou z prostředí o vyšší koncentraci roztoku do prostředí o nižší koncentraci. Viriony (nebo vysokomolekulární látky jako proteiny a DNA) jsou zadrženy uvnitř dialyzační membrány. Dialyzační membrána o průměru 16 mm [Servapor, regenerovaná celulóza, pruměr póru 2,5 nm (Serva)] byla 10 min vařena v destilované vodě, do membrány opatřené dialyzačními svorkami byl nanesen vzorek (spojené frakce z centrifugace v rovnovážném gradientu CsCl). Dialýza probíhala ve 100 – 200 násobném objemu B pufru nejprve 3 hodiny při 4°C za stálého míchání, poté byl B pufr vyměněn za nový a dialýza dále probíhala přes noc za stejných podmínek. Po dialýze byl vzorek zahuštěn centrifugací přes sacharózový polštář (rotor SW 41, 35 000 RPM, 3 hod., 4°C). Sediment byl resuspendován v malém objemu B pufru za použití skleněného homogenizátoru.

4.5.4. Hemaglutinační test (TÜRLER a BEARD, 1985) Hemaglutinační test umožnuje stanovit približné množství virových částic (HAU = haemaglutination units) pomocí aglutinace erytrocytů, která je založena na schopnosti proteinu VP1 interagovat s kyselinou sialovou buněčných membránových receptorů na povrchu morčecích erytrocytů. Míra aglutinace erytrocytů závisí na množství přidaných částic. Neaglutinované erytrocyty tvoří na dně jamky s kulatým dnem na mikrotitrační destičce ohraničený terčík, zatímco aglutinované erytrocyty nesedimentují. Počet hemaglutinačních jednotek potom odpovídá takovému ředění viru, které ještě aglutinovalo erytrocyty. Morčecí krev byla centrifugována na centrifuze Sigma 3K30 (2500 RPM, 20 min., 4°C) a třikrát promyta roztokem 0,2% BSA v PBS. Stanovení koncentrace erytrocytů bylo provedeno odečtením hematokritu. Suspenze erytrocytů byla promíchána, do heparinizované kapiláry bylo naneseno 30 μl suspenze, kapilára byla na jednom konci zatavena pomocí lihového kahanu a centrifugována v centrifuze MPW 300 (Mechanika Precyzyjna Warszawa) s rotorem pro hematokrit CM-304 (2500 RPM, 5 min. při laboratorní teplotě). Hematokrit byl odečten jako procentuální poměr výšky hladiny tekutiny v kapiláře k výšce sloupce erytrocytů. Suspenze erytrocytů byla na základě hematokritu naředěna roztokem 0,2% BSA v PBS na koncentraci 0,4% erytrocytů. Do všech jamek mikrotitrační destičky s kulatým dnem bylo naneseno 50 μl

69 0,2% BSA v PBS. Do první jamky bylo přidáno 50 μl 10× naředěné virové suspenze v B pufru. Obsah jamky byl dobře promíchán, z jamky bylo odebráno 50 μl a ty byly přepipetovány do jamky následující. Postup byl opakován až k poslední jamce v řadě a takto byla vytvořena ředící řada viru. Nakonec bylo do všech jamek přidáno 50 μl 0,4% suspenze morčecích erytrocytů. Mikrotitrační destička byla uložena do lednice a výsledky byly odečteny nejdříve po 6 hodinách podle rovnice HAU = d × 2h de d je ředění virové suspenze (obvykle 10×) a h je pořadí jamky s nejvyšším ředěním virové suspenze, které ještě aglutinovalo erytrocyty. Pro myší polyomavirus 1 HAU odpovídá 107 virionů/ml.

4.5.5. Určení infekčního titru viru na kultuře myších fibroblastů Virové inokulum o neznámém titru bylo naředěno 1000×, 10 000× a 100 000× v DMEM bez FCS. Buňky narostlé na mikroskopických sklíčkách byly infikovány naředěným inokulem (viz kapitolu 4.4.8) a 24 hodin po infekci byly fixovány a imunofluorescenčně značeny pomocí protilátky proti LT antigenu. Pozitivní buňky byly spočítány při zvětšení objektivu 40×, kdy je plocha zorného pole 0,237 mm2. Výsledný titr virového inokula (f.f.u./ml – fluorescence forsming units/ml) byl vypočten jako součin průměrného počtu infikovaných buněk na zorné pole, faktoru přepočtu (pro tuto plochu zorného pole je faktor přepočtu 844), výchozího ředění virového inokula a násobku objemu virového inokula v konečném objemu média (tj. 5).

4.6. Elektronová mikroskopie Všechny elektronmikroskopické experimenty, jejichž výsledky jsou prezentovány v této diplomové práci, provedl Vojtěch Žíla.

4.6.1. Negativní barvení Byly použity Cu síťky (200 mesh) pokryté parlodionovým podložním filmem s napařenou vrstvou uhlíku. Podložní film na síťkách byl aktivován vysokonapěťovým výbojem v pokovovací aparatuře. Cu síťka s parlodionovou pouhlíkovanou membránou byla položena na 5 μl kapku vzorku, který byl 5 – 10 minut ponechán adsorbovat. Síťky byly promyty dvakrát po

30 sekundách na 100 μl kapkách dH20 a byly obarveny na dvou 100 μl kapkách 2% vodného roztoku PTA {H3[P(W3O10)4]}, pH = 7,0 (na obou kapkách byly inkubovány 1 minutu). Barvivo bylo opatrně odsáto filtračním papírem a síťky byly ponechány zaschnout. Preparáty byly pozorovány elektronovým mikroskopem JEOL JEM 1200EX při 60 kV.

70 4.7. Práce s DNA

4.7.1. Agarózová elektroforéza (SAMBROOK et al., 1989) 0,8 – 2% agarózový gel byl připraven rozvařením odpovídajícího množství agarózy v adekvátním množství 0,5× koncentrovaného TBE pufru. Po ochlazení přibližně na 50°C byl agarózový gel nalit do předem připraveného plastového bločku, byl přidán zásobní roztok 2000× koncentrovaného etidiumbromidu do výsledné koncentrace 0,5 μg/ml a vložen hřeben. Po ztuhnutí gelu byl vytažen hřeben, gel byl vložen do aparatury pro horizontální elektroforézu a přelit 0,5× koncentrovaným TBE pufrem. Vzorky byly smíchány s 5× koncentrovaným vzorkovým purem s bromfenolovou modří či komerčním vzorkovým pufrem 6× Orange DNA Loading Dye (Fermentas) a naneseny do jamek gelu. Nanesen byl také marker molekulových vah. Aparatura byla připojena ke zdroji stejnosměrného napětí a proudu zvolenému tak, aby elektroforéza probíhala při napětí 5V/cm. Po skončení elektroforézy byl gel prohlédnut na UV transluminátoru.

4.7.2. Maxipreparace plazmidové DNA - alkalická metoda (BIRNBOIM a DOLY, 1979) Bakterie byly aerobně kultivovány přes noc při 37°C v 100 ml živného bujónu č. 2. Bakteriální suspenze byla centrifugována (4800 RPM, 15 min., 4°C, centrifuga Sigma 3K30) a sediment byl resuspendován na ledu v 4 ml roztoku I. Bylo přidáno 8 ml čerstvě připraveného roztoku II, směs byla opatrně promíchána pomalým převracením zkumavky a inkubována 10 minut při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 6 ml vychlazeného roztoku III, směs byla opatrně promíchána pomalým převracením zkumavky, inkubována 20 minut na ledu a centrifugována (4800 RPM, 15 min., 4°C). Supernatant byl přefiltrován přes tři vrstvy gázy a bylo přidáno 0,7 objemu izopropanolu. Směs byla jemně promíchána, inkubována 15 minut při laboratorní teplotě a centrifugována (4800 RPM, 30 min. při laboratorní teplotě). Sediment byl promyt 80% etanolem, vysušen při laboratorní teplotě, a rozpuštěn v 600 μl TE pufru. Z takto získané DNA byla odstraněna RNA inkubací s RNázou A (viz kapitolu 4.7.4). Proteiny byly odstraněny extrakcí upraveným fenolem a chloroformem (viz kapitolu 4.7.5). Kvalita získané DNA byla ověřena elektroforeticky.

4.7.3. Minipreparace plazmidové DNA – alkalická metoda Kolonie bakterií vyrostlých na selekčním médiu s antibiotikem byly párátkem naneseny na plotnu s živným agarem č. 2 a selekčním antibiotikem, následně důkladně resuspendovány v mikrozkumavce s 700 μl živného bujónu č. 2 se selekčním antibiotikem a takto kultivovány

71 přes noc při 37°C za stálého třepání. Buněčná suspenze byla centrifugována na stolní centrifuze (5000 RPM, 1 min.), živný bujón byl odebrán a bakterie byly resuspendovány v 250 μl TE pufru. Bylo přidáno 250 μl roztoku II a směs byla krátce promíchána převracením mikrozkumavek. Ihned bylo přidáno 250 μl roztoku III, směs byla jemně promíchána a centrifugována 5 minut při 13 000 RPM. Supernatant byl odebrán a bylo k němu přidáno 500 μl izopropanolu, směs byla jemně promíchána a centrifugována 10 minut při 13 000 RPM. Supernatant byl odebrán, pelet byl opláchnut 200 μl 80% etanolu, vysušen od zbytků etanolu při laboratorní teplotě a rozpuštěn v 20 μl TE pufru s Rnázou A. 5 – 10 μl bylo použito pro štěpení restrikčními endonukleázami.

4.7.4. Odstranění RNA ze vzorku DNA (SAMBROOK et al., 1989) Ke vzorku DNA bylo přidáno 0,1 objemu RNázy A a vzorek byl inkubován 30 minut při laboratorní teplotě. RNáza byla ze vzorku odstraněna deproteinací upraveným fenolem a chloroformem a vzorek byl přesrážen etanolem.

4.7.5. Deproteinace DNA upraveným fenolem a chloroformem (SAMBROOK et al., 1989) Roztok DNA byl před deproteinací upraveným fenolem a chloroformem v případě potřeby zředěn v TE pufru. K roztoku DNA byl přidán 1 objem upraveného fenolu, směs byla dobře promíchána a centrifugována 5 minut při 13 000 RPM na stolní centrifuze. Po centrifugaci se vytvořila spodní fenolová fáze, horní vodná fáze a mezifáze tvořená vysráženými proteiny. Vodná fáze byla opatrně odebrána a bylo přidáno 0,5 objemu upraveného fenolu a 0,5 objemu upraveného chloroformu. Směs byla opět promíchána a centrifugována 5 minut při 13 000 RPM na stolní centrifuze. Vodná fáze byla opět odebrána a tento krok byl opakován dokud nezmizela mezifáze tvořená vysráženými proteiny. Nakonec bylo k vodné fázi přidán 1 objem upraveného chloroformu, směs byla opět promíchána a centrifugována 5 minut při 13 000 RPM na stolní centrifuze. Horní vodná fáze byla odebrána a v ní obsažená DNA byla srážena vychlazeným etanolem.

4.7.6. Srážení DNA etanolem (SAMBROOK et al., 1989)

K roztoku DNA bylo přidáno 0,1 objemu 3M CH3COONa a 2,5 objemu 96% etanolu vychlazeného na -20°C. Směs byla promíchána a inkubována 30 minut při -80°C. Vysrážená DNA byla sedimentována centrifugací 15 300 RPM 30 minut při 4°C. Sediment byl promyt 80% etanolem vychlazeným na -20°C, vysušen od jeho zbytků a rozpuštěn v TE pufru.

72 4.7.7. Izolace fragmentů DNA z agarózového gelu Po rozdělení fragmentů DNA agarózovou elektroforézou byla pro izolaci fragmentu DNA z gelu použita komerční souprava NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) přesně podle přiloženého protokolu.

4.7.8. Izolace plazmidové DNA zbavené endotoxinů pro transfekci savčích buněk Pro potřeby transfekce savčích buněk je nutné, aby byla izolovaná DNA ve vysoké koncentraci a aby byla zbavena endotoxinů (toxinů, uvolňovaných při lyzi bakterií, především lipopolysacharidy vnější membrány u gramnegativních bakterií), neboť značně snižují účinnost transfekce. Pro tyto potřeby byla izolace a purifikace DNA provedena komerční soupravou EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) přesně podle přiloženého protokolu. Kolonie bakterií vyrostlých na selekčním médiu s antibiotikem byla sterilním párátkem zaočkována do 5 ml LB média s příslušným selekčním antibiotikem a bakterie byly aerobně kultivovány 8 hodin při 37°C, poté bylo 200 μl z narostlé kultury zaočkováno do 100 ml LB média se selekčním antibiotikem a aerobně kultivováno 16 hodin při 37°C. Bakterie byly centrifugovány (6000 × g, 15 min., 4°C a dále zpracovány dle přiloženého protokolu. Izolovaná plazmidová DNA byla precipitována centrifugací v doporučeném objemu izopropanolu (15 000 × g, 30 min., 4°C), promyta 80% etanolem a rozpuštěna v TE pufru zbaveném endotoxinů (součást soupravy).

4.7.9. Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) PCR byla vždy prováděna v celkovém reakčním objemu 50 μl. Složení reakční směsi bylo následující:

40 μl ddH20 1,5 μl primeru 1 (10 μM) 1,5 μl primeru 2 (10 μM) 0,5 μl templátové DNA 1 μl 10 mM směsi dATP, dCTP, dGTP a dTTP 5 μl 10× koncentrovaného Thermo Pol pufru (New England BioLabs) 0,5 μl Vent DNA polymerázy (New England BioLabs) PCR program byl nastaven následovně: 1. 3 min, 94°C (denaturace DNA) 2. 40 s, 94°C (denaturace DNA) 3. 50 s, 54 – 58°C (nasednutí primerů, teplota je specifická pro použité primery) 4. 1 min, 72°C (polymerace) 5. 7 min, 72°C (polymerace) 6. 4°C po skončení PCR

73 Kroky 2. – 4. byly 30× cyklicky opakovány. PCR produkt byl před dalším použitím elektroforeticky ověřen. Před štěpením konců PCR fragmentu byly odstraněny proteiny pomocí fenolu a chloroformu a DNA byla vysrážena etanolem (viz kap. 4.7.5 a 4.7.6).

4.7.10. Štěpení DNA restrikčními endonukleázami Složení směsi pro štěpení DNA restrikčními endonukleázami a inkubační podmínky byly zvoleny podle instrukcí výrobce, při volbě množství štěpené DNA bylo přihlédnuto k účelu štěpení. Složení směsi bylo následovné:

ddH2O do celkového objemu 10 – 30 μl 1 – 10 μg štěpené DNA 1 – 3 μl 10× koncentrovaného pufru pro restrikční endonukleázy 5 – 12 U restrikčního enzymu Restrikční enzym byl do směsi přidán jako poslední. V případě, že byla vektorová DNA štěpena dvěma restrikčními enzymy zároveň, byl vzájemný poměr restrikčních endonukleáz a pufr zvolen podle doporučení výrobcem ve webové aplikaci DoubleDigest™ (http://fermentas.com/doubledigest/). Směs byla promíchána a inkubována 1 – 2,5 hodiny, případně přes noc při 37°C. Kvalita štěpení byla ověřena elektroforeticky.

4.7.11. Spojení komplementárních oligonukleotidů Dvojice komplementárních oligonukleotidů rozpuštěných v TE pufru byla ve sterilní mikrozkumavce smíchána do požadované koncentrace a mikrozkumavka byla vložena do vroucí vodní lázně. Var byl zastaven a vzorky byly ponechány ve vodní lázni do jejího vychladnutí přibližně na laboratorní teplotu. Spojení v dsDNA bylo ověřeno elektroforeticky.

4.7.12. Ligace Ligační směs byla připravena tak, aby byl poměr linearizované vektorové DNA k DNA vkládaného fragmentu byl 1:2 nebo 1:3. Složení ligační směsi a inkubační podmínky byly zvoleny podle instrukcí výrobce. Složení směsi bylo následovné:

ddH2O do celkového objemu 20 μl 150 μg DNA linearizovaného vektoru a vkládaného fragmentu 2 μl 10× koncentrovaného pufru pro T4 DNA ligázu 2,5 U DNA ligázy bakteriofága T4 DNA ligáza bakteriofága T4 byla do směsi přidána jako poslední. Ligační reakce probíhala 12 – 24 hodin při pokojové teplotě a byla ukončena zahřátím směsi na 65°C po dobu 10 minut. Následně byly 2 – 3 μl takto připravené ligační směsi přímo použita pro transformaci bakterií elektroporací, nebo byla ligační směs přečištěna pomocí komerční soupravy NucleoSpin Extract

74 II (Macherey-Nagel) přesně podle přiloženého protokolu (k eluci DNA byl použit minimální objem elučního pufru – 15 μl – a pro transformaci bakterií elektroporací byla použita polovina tohoto objemu).

4.8. Práce s proteiny

4.8.1. Příprava buněčného lyzátu Kultura savčích buněk byla opláchnuta PBS a seškrabána škrabátkem. Buňky byly centrifugovány na centrifuze MSE (1500 RPM, 10 min., při laboratorní teplotě). Buněčný sediment byl resuspendován ve vhodném množství (50 – 300 μl podle množství buněk) RIPA pufru s přidaným inhibitorem proteáz [PMSF o výsledné koncentraci 100 μg/ml, aprotinin o koncentraci 2 μg/ml nebo směs inhibitorů proteáz Complete Mini, EDTA Free (Roche)] a směs byla inkubována 20 minut na ledu. V případě, že byla směs příliš viskózní, byla 10× protažena injekční jehlou. Poté byla suspenze centrifugována na centrifuze Beckman Microfuge R (15300 RPM, 15 min., 4°C), supernatant byl odebrán a použit pro další účely.

4.8.2. SDS polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE)

4.8.2.1. Příprava gelu Skla aparatury pro nalévání gelu byla dobře omyta a usušena a aparatura byla sestavena.

Těsnost aparatury byla vyzkoušena nalitím ddH2O. Aparatura byla vysušena filtračním papírem a bylo nalito přibližně 5 ml spodního gelu a nalitý gel byl převrstven ddH 2O. Složení spodního gelu (s 10%, 12% nebo 15% akrylamidu/bisakrylamidu) bylo následovné: 10% gel: 4 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 4,5 ml 1 M tris-HCl (pH = 8,8), 3,25 ml

ddH2O, 120 μl 10% SDS, 40 μl 10% persíranu amonného, 8,5 μl TEMED. 12% gel: 4,8 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 4,5 ml 1 M tris-HCl (pH = 8,8),

2,45 ml ddH2O, 120 μl 10% SDS, 40 μl 10% persíranu amonného, 8,5 μl TEMED. 15% gel: 6 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 4,5 ml 1 M tris-HCl (pH = 8,8), 1,25 ml

ddH2O, 120 μl 10% SDS, 40 μl 10% persíranu amonného, 8,5 μl TEMED. Persíran amonný a TEMED byly do roztoku přidány bezprostředně před jeho nalitím do aparatury. Po ztuhnutí gelu (cca 30 min) byla voda odstraněna, byl nalit vrchní gel a umístěn hřeben. Složení vrchního gelu bylo následovné:

500 μl 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 375 μl 1 M tris-HCl (pH = 6,8), 2,11 ml ddH2O, 30 μl 10% SDS, 20 μl 10% persíranu amonného, 5 μl TEMED. Po ztuhnutí gelu byl hřeben vyjmut, gel byl vložen do aparatury a byl přelit pufrem pro SDS-PAGE. Jamky byly před aplikací vzorku vypláchnuty pufrem pro SDS-PAGE.

75 4.8.2.2. Příprava gradientového gelu (WALKER, 2002) Aparatura pro nalévání gelu byla připravena stejným způsobem (viz kapitolu 4.8.2.1). Byly připraveny dva roztoky po 5 ml o rozdílné koncentraci akrylamidu/bisakrylamidu, roztok o vyšší koncentraci navíc obsahoval 15% (w/v) sacharózy, aby byla usnadněna tvroba gradientu. Složení roztoků bylo následovné: 20% gel: 75 mg sacharózy, 3,35 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 930 μl 2 M

tris-HCl (pH = 8,8), 200 μl ddH2O, 50 μl 10% SDS, 2×15 μl 10% persíranu amonného, 2×2 μl TEMED. 16% gel: 75 mg sacharózy, 2,7 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 930 μl 2M tris-HCl

(pH = 8,8), 870 μl ddH2O, 50 μl 10% SDS, 2×15 μl 10% persíranu amonného, 2×2 μl TEMED. 8% gel: 1,35 ml 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 930 μl 2M tris-HCl (pH = 8,8),

1,35 ml ddH2O, 50 μl 10% SDS, 2×15 μl 10% persíranu amonného, 2×2 μl TEMED 5% gel: 835 μl 30% akrylamidu/bisakrylamidu, 930 μl 2M tris-HCl (pH = 8,8), 3,15 ml

ddH2O, 50 μl 10% SDS, 2×15 μl 10% persíranu amonného, 2×2 μl TEMED 15 μl 10% persíranu amonného a 2 μl TEMED bylo do roztoku přidány bezprostředně před jeho nalitím do aparatury pro tvorbu gradientu Hoefer SG50, kam bylo přidáno po 2,5 ml od obou roztoků. Do sloupce blíže k výpusti aparatury pro tvorbu gradientu byl nalit koncentrovanější roztok (20% nebo 16%), do druhého sloupce odděleného uzávěrem byla nalit méně koncentrovaný roztok (5% nebo 8%). Roztoky byly přemístěny do aparatury pro nalévání gelu pomocí peristaltické pumpy a hladina roztoků v obou sloupcích byla v případě potřeby udržována ve stejné úrovni tlakem pístu. Roztok procházející sloupcem blíže výpusti byl promícháván magnetickým míchadlem. Uzávěr mezi sloupci aparatury pro tvorbu gradientu byl otevřen krátce poté, co byla spuštěna peristaltická pumpa. Nalitý gel byl následně převrstven ddH2O, po jeho ztuhnutí byla voda odstraněna a byl nalit vrchní gel stejným způsobem jako je uvedeno v kapitole 4.8.2.1.

4.8.2.3. Příprava vzorku a vlastní SDS-PAGE Vzorky byly smíchány s 5x koncentrovaným Laemliho pufrem v poměru 4:1, 5 min povařeny ve vodní lázni, krátce centrifugovány při 13000 RPM na mikrocentriguze a naneseny do jamek gelu v množství 5 – 30 μl. Vlastní SDS-PAGE probíhala nejprve při napětí 8 V/cm2 (30 min) a poté při napětí 14 V/cm2 (3 hod).

4.8.2.4. Fixace a barvení SDS polyakrylamidového gelu Po skončení elektroforézy byl poylarylamidový gel opatrně vyjmut z aparatury a byl fixován

1 – 2 hod ve fixačním roztoku. Poté byl propláchnut v 3,5% roztoku HClO4, vložen do barvícího

76 roztoku a při laboratorní teplotě barven přes noc. Barvicí roztok byl slit pro další použití a gel byl odbarvován několik hodin v destilované vodě. V případě, že bylo potřeba uschovat gel pro další použití, byl uchováván v 1 – 2% roztoku CH3COOH při 4°C.

4.8.3. Izoelektrická fokusace (IEF), 2D elektroforéza 2D elektroforézou byly v této diplomové práci separovány pouze proteiny virionů MPyV izolovaných podle TÜRLER a BEARD, 1985. K roztoku virionů v B pufru byl přidán 1 objem 2× koncentrovaného RIPA pufru, 0,1 objemu 100 mM EGTA, 0,1 objemu čerstvě připraveného

100 mM dithiothreitolu v dH2O a směs byla důkladně promíchána. Proteiny byly následně vysráženy acetonem: bylo přidáno 10 objemů acetonu vychlazeného při -20°C, vzorek byl promíchán a centrifugován (5 min., 20 000 × g, při pokojové teplotě), supernatant byl odstraněn a pelet vysušen. K peletu bylo přidáno 200 μl rehydratačního pufru pro IEF a byl za občasného vortexování rozpuštěn, následně byl rozpuštěný vzorek rovnoměrně nanesen do drážky pro rehydrataci stripu pro IEF a překryt stripem (ReadyStrip™ IPG Strip, Bio-Rad). Rehydratace stripu probíhala 2 – 4 hodiny. Poté byl rehydratovaný strip vložen do aparatury pro

IEF (katoda a anoda byly podloženy papírky navlhčenými dH2O) a převrstven minerálním olejem. IEF probíhala při 20°C ve čtyřech krocích: 1. 250 V (prudký nárůst) 15 minut 2. 8000 V (pomalý nárůst) 1 hodinu 3. 8000 V do dosažení 25000 Vh 4. 500 V (prudká změna) přes noc (udržovací krok).

Po skončení IEF byl strip opláchnut dH2O, pufrem pro SDS-PAGE, 10 minut promýván v ekvilibračním pufru s DTT, poté znovu opláchnut dH2O a 10 minut promýván v ekvilibračním pufru s IAA. Strip byl opláchnut dH2O a pufrem pro SDS-PAGE, vložen do jamky gelu pro SDS-PAGE a přelit 0,5% agarózou s bromfenolovou modří. Poté co agaróza ztuhla, byla spuštěna SDS-PAGE (viz kap. 4.8.2.3).

4.8.4. Imobilizace proteinů na membráně

4.8.4.1. Dot blot Vzorky proteinu byly nakapány na nitrocelulózovou membránu NC 45 (Serva) po 1 – 5 μl a ponechány při laboratorní teplotě, aby zaschly.

4.8.4.2. Western blot Nitrocelulózová membrána NC 45 (Serva), papíry Whatman a filtrační papíry (vše odpovídající velikosti gelu) a polyakrylamidový gel po skončené SDS-PAGE byly namočeny do blotovacího

77 pufru. Byl sestaven blotovací sendvič v tomto pořadí: podložka ze savé hmoty, 1 papír Whatman, 3 – 4 filtrační papíry, polyakrylamidový gel se separovanými proteiny, nitrocelulózová membrána, 3 – 4 filtrační papíry, 1 papír Whatman a podložka ze savé hmoty. Z blotovacího sendviče byly vytlačeny bubliny a sendvič byl uzavřen v mřížce aparatury pro Western blot TE22 (Amersham Biosciences). Takto připravená mřížka byla vložena do aparatury pro Western blot tak, že nitrocelulózová membrána byla blíže k anodě a polyakrylamidový gel ke katodě, a přelita blotovacím pufrem. Přenos proteinů na membránu probíhal 3 hodiny při 100 V a 250 mA za stálého chlazení aparatury na ledu. V případě western blotu 2D elektroforézy přenos probíhal 4,5 hodiny. Po skončení přenosu byla membrána promyta v PBS a bylo přistoupeno k imunologické detekci proteinů.

4.8.5. Imunologická detekce proteinů imobilizovaných na membráně Membrána s imobilizovanými proteiny byla inkubována 30 minut při laboratorní teplotě nebo přes noc při 4°C v 5% odtučněném mléce v PBS s 0,3% Tween 20. Membrána byla opláchnuta PBS s 0,2% Tween 20 a inkubována minimálně 1 hodinu s primární protilátkou naředěnou v 5% odtučněném mléce v PBS s 0,2% Tween 20. Po uplynutí této doby byla membrána minimálně 3× po 10 minutách promyta v PBS s 0,2% Tween 20 a inkubována 30 minut se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou naředěnou v 5% odtučněném mléce v PBS s 0,2% Tween 20. Membrána byla opět promyta minimálně 3× po 10 minutách v PBS s 0,3% Tween 20. Detekce byla provedena v temné komoře ponořením membrány do roztoku luminolu na 30 sekund, vložením membrány do pruhledné folie a priložením RTG filmu. Doba expozice se pohybovala mezi 10 sekundami a 15 minutami. Film byl vyvolán ve vývojce a v ustalovači.

78 5. VÝSLEDKY 5.1. Izolace myšího polyomaviru Virus byl pro potřebu studia izoforem proteinů VP2 a VP3 izolován celkem čtyřikrát. První tři izolace byly provedeny z kultury myších fibroblastů infikovaných myším polyomavirem (kmenem A2), jak je popsáno v kapitole 4.5. Virus byl vždy purifikován centrifugací přes sacharózový polštář, izopyknickou centrifugací v rovnovážném gradientu CsCl, rozdělen na frakci prázdných kapsid, plných virionů a zbylý materiál. Tyto frakce byly opět zahuštěny centrifugací přes sacharózový polštář.

5.1.1. První izolace V tab. 5.1. jsou uvedeny refraktometrické indexy (η) frakcí získaných z CsCl gradientu a na obr. 5.1. dot blot frakcí testovaných na přítomnost proteinu VP1. Na jejich základě byl materiál rozdělen do tří spojených frakcí – frakce I (η = 1,3755 – 1,3700), frakce II (η = 1,3680 – 1,3640, frakce plných infekčních virionů) a frakce III (η = 1,3630 – 1,3600, frakce prázdných kapsid).

Obr. 5.1. Detekce proteinu VP1 při izolaci MPyV. Dot blot frakcí vzniklých rozdělením vzorku po centrigufaci v rovnovážném gradientu CsCl. Detekováno pomocí primární protilátky proti proteinu VP1 a sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou.

č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 η 1,3755 1,3765 1,3745 1,3715 1,3700 1,3680 1,3660 1,3655 1,3650 1,3640 1,3640 1,3630 1,3625 1,3615 1,3600 1,3590 Frakce I Frakce II Frakce III ---

Tab. 5.1. Refraktometrické indexy (η) frakcí po centrifugaci v rovnovážném CsCl gradientu.

Spojené frakce byly dialyzovány proti B pufru. U každé frakce byl určen infekční titr zjišťovaný na kultuře myších fibroblastů (f.f.u./ml – fluorescence forming units/ml – viz kapitolu 4.5.5) a hemaglutinační titr (viz kapitolu 4.5.4). Hodnoty infekčních a hemaglutinačních titrů jsou uvedeny v tab. 5.2. Kvalita izolace byla ověřena elektronovou mikroskopií (obr. 5.2). Ve frakci II se vyskytovaly plné viriony a malé množství nečistot. Ve frakci III se vyskytovalo velké množství nečistot, plné viriony i prázdné kapsidy .

80 Obr. 5.2. Výsledek první izolace myšího polyomaviru po purifikaci v CsCl gradientu. Vlevo frakce II (plné viriony), vpravo frakce III (prázdné kapsidy). Úsečka = 100 nm, zhotovil V. Žíla.

Frakce I II III

f.f.u./ml 0 1,14·107 1,01·107

virionů/ml 0 5,12·1010 2,56·1010

Tab. 5.2. Infekční titr (f.f.u./ml) a hemaglutinační titr (virionů/ml) spojených frakcí.

5.1.2. Druhá izolace Na základě refraktometrických indexů (η) frakcí z CsCl gradientu (tab. 5.3.) a dot blotu frakcí testovaných na přítomnost proteinu VP1 (obr. 5.3) byl materiál rozdělen do tří spojených frakcí – frakce I (η = 1,3750 – 1,3720), frakce II (η = 1,3680 – 1,3640, frakce plných infekčních virionů) a frakce III (η = 1,3630 – 1,3605, frakce prázdných kapsid).

Obr. 5.3. Detekce proteinu VP1 při izolaci myšího polyomaviru – dot blot frakcí vzniklých rozdělením vzorku po centrigufaci v rovnovážném gradientu CsCl. Detekováno pomocí primární protilátky proti proteinu VP1 a sekundární protilátky konjugované s peroxidázou. PK – pozitivní kontrola (vzorek z předešlé izolace MPyV), NK – negativní kontrola (lyzát z neinfikovaných buněk).

č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 η 1,3750 1,3720 1,3680 1,3665 1,3645 1,3640 1,3630 1,3625 1,3620 1,3615 1,3605 1,3580 Frakce I Frakce II Frakce III ---

Tab. 5.3. Refraktometrické indexy frakcí po centrifugaci v rovnovážném CsCl gradientu.

81 Spojené frakce byly dialyzovány proti B pufru a zahuštěny centrifugací přes sacharózový polštář. Tabulka 5.4. ukazuje infekční a hemaglutinační titr spojených frakcí a snímky z elektronové mikroskopie na obr. 5.4 ukazují kvalitu izolace. Ve frakci II se vyskytovaly plné viriony a menší množství prázdných kapsid. Ve frakci III většina prázdných kapsid a také malé množství plných virionů.

Frakce I II III

f.f.u./ml 0 1,92·107 1,29·107

virionů/ml 0 2,05·1011 5,12·1010

Tab. 5.4. Infekční titr (f.f.u./ml) a hemaglutinační titr (virionů/ml) spojených frakcí.

Obr. 5.4. Výsledek druhé izolace myšího polyomaviru po purifikaci přes CsCl gradient a sacharózový polštář. Vlevo frakce II (plné viriony), vpravo frakce III (prázdné kapsidy). Úsečka = 100 nm. Pořídil V. Žíla.

5.1.3. Třetí izolace V tab. 5.5. jsou uvedeny refraktometrické indexy (η) frakcí získaných rozebráním CsCl gradientu a na obr. 5.5 dot blot frakcí testovaných na přítomnost proteinu VP1, na jejichž základě byl materiál rozdělen do tří spojených frakcí – frakce I (η = 1,3735 – 1,3710 a 1,3590 – 1,3580), frakce II (η = 1,3675 – 1,3635, frakce plných infekčních virionů) a frakce III (η = 1,3630 – 1,3600, frakce prázdných kapsid).

Obr. 5.5. Detekce proteinu VP1 při izolaci MPyV – dot blot frakcí vzniklých rozdělením vzorku po centrigufaci v rovnovážném gradientu CsCl. Detekováno pomocí primární protilátky proti proteinu VP1 a sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou.

82 č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 η 1,3735 1,3710 1,3675 1,3650 1,3635 1,3635 1,3630 1,3620 1,3620 1,3615 1,3610 1,3600 1,3590 1,3580 Frakce I Frakce II Frakce III Frakce I

Tab. 5.5. Refraktometrické indexy frakcí po centrifugaci v rovnovážném CsCl gradientu.

Spojené frakce byly dialyzovány proti B pufru a zahuštěny centrifugací přes sacharózový polštář. Jejich infekční titry, zjišťované na kultuře myších fibroblastů, a počty virových částic na ml (hemaglutinační titry), jsou uvedeny v tab. 5.6. Kvalita izolace byla ověřena elektronovou mikroskopií (obr. 5.6). Frakce II obsahovala plné viriony a určité množství prázdných kapsid a nečistot. Frakce III obsahovala prázdné kapsidy i určité množství plných virionů.

Frakce I II III

f.f.u./ml 3,75·106 2,08·108 2,03·108

virionů/ml 3,2·109 5,12·1010 5,12·1010

Tab. 5.6. Infekční titr (f.f.u./ml) a hemaglutinační titr (virionů/ml) spojených frakcí.

Obr. 5.6. Výsledek třetí izolace myšího polyomaviru po purifikaci přes CsCl gradient a sacharózový polštář. Vlevo frakce plných virionů, vpravo frakce prázdných kapsid. Úsečka = 100 nm.

5.1.4. Čtvrtá izolace Po čtvrté byl k izolaci MPyV použit kmen BG, který byl pomnožen na primárních myších embryonálních buňkách (WME – whole mouse embryo). Tyto buňky byly použity proto, že v nich oproti myším fibroblastům 3T6 dochází k rychlejšímu pomnožení MPyV a výtěžek z izolace by proto měl být vyšší. Postup izolace byl stejný jako v předešlých izolacích . V tab. 5.7. jsou uvedeny refraktometrické indexy frakcí získaných rozebráním pěti CsCl gradientů (ve snaze o lepší separaci plných virionů a prázdných kapsid byl vzorek rozdělen

83 do pěti ultracentrifugačních kyvet). Obr. 5.7 ukazuje dot blot frakcí testovaných na přítomnost proteinu VP1. Na základě těchto analýz byl materiál získaný rozdělen pro každý gradient do tří spojených frakcí – frakce I, frakce II (frakce plných infekčních virionů) a frakce III (frakce prázdných kapsid), jak je uvedeno v tab. 5.7. a poté byly pospojovány frakce se stejným číslem (I, II nebo III) ze všech pěti gradientů.

Obr. 5.7. Detekce proteinu VP1 při izolaci myšího polyomaviru – dot blot frakcí vzniklých rozdělením pěti vzorků po centrigufaci v rovnovážném gradientu CsCl. Detekováno pomocí primární protilátky proti proteinu VP1 a sekundární protilátky konjugované s peroxidázou.

č. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 η 1,3745 1,3750 1,3730 1,3705 1,3695 1,3680 1,3675 1,3665 1,3660 1,3645 1,3645 1,3640 1,3635 1,3630 1,3630 Frakce I Frakce II

č. 1.16 1.17 1.18 1.19 1.20 1.21 1.22 1.23 1.24 1.25 1.26 1.27 1.28 1.29

η 1,3630 1,3630 1,3625 1,3625 1,3620 1,3620 1,3610 1,3610 1,3605 1,3600 1,3595 1,3585 1,3580 1,3570

Frakce II Frakce III ---

č. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 2.15 η 1,3705 1,3740 1,3715 1,3695 1,3685 1,3660 1,3655 1,3650 1,3640 1,3635 1,3630 1,3630 1,3630 1,3620 1,3620 Frakce I Frakce II Frakce III

č. 2.16 2.17 2.18 2.19 2.20 2.21 2.22 2.23 2.24

η 1,3615 1,3610 1,3605 1,3605 1,3600 1,3595 1,3580 1,3570 1,3555

Frakce III ---

84 č. 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 η 1,3715 1,3745 1,3720 1,3695 1,3680 1,3700 1,3655 1,3645 1,3640 1,3635 1,3630 1,3630 1,3630 1,3625 1,3620 Frakce I Frakce II Frakce III

č. 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24

η 1,3620 1,3615 1,3615 1,3610 1,3605 1,3600 1,3590 1,3580 1,3570

Frakce III ---

č. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 η 1,3720 1,3740 1,3725 1,3710 1,3695 1,3675 1,3665 1,3665 1,3650 1,3640 1,3635 1,3630 1.3625 1,3620 1,3620 Frakce I Frakce II F. III

č. 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 4.22 4.23 4.24

η 1,3615 1,3605 1,3605 1,3600 1,3605 1,3600 1,3590 1,3590 1,570

Frakce III ---

č. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 η 1,3720 1,3735 1,3720 1,3700 1,3685 1,3675 1,3660 1,3650 1,3640 1,3640 1,3635 1,3630 1,3625 1,3625 1,3620 Frakce I Frakce II F. III

č. 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25

η 1,3615 1,3615 1,3610 1,3610 1,3605 1,3600 1,3595 1,3585 1,3565 1,3560

Frakce III ---

Tab. 5.7. Refraktometrické indexy frakcí po centrifugaci v rovnovážném gradientu CsCl.

Spojené frakce byly dialyzovány proti B pufru a zahuštěny centrifugací přes sacharózový polštář. U každé frakce byl určen infekční titr zjišťovaný na kultuře myších fibroblastů a hemaglutinační titr, které jsou uvedeny v tab. 5.6. Kvalita izolace byla ověřena elektronovou mikroskopií (obr. 5.8). I přes snahu o lepší separaci frakce II a III obsahovaly přibližně stejné množství plných virionů a prázdných kapsid. To může být způsobeno tím, že došlo k vzájemnému smísení vzorků, např. při pipetování frakcí z rozděleného CsCl gradientu do dialyzační membrány, pravděpodobněji však došlo k narušení CsCl gradientu při manipulaci s centrufugačními kyvetami.

Frakce I II III

f.f.u./ml 1,79·105 4,85·108 6,73·108

virionů/ml 2·1010 1,35·1013 1,23·1012

Tab. 5.6. Infekční titr (f.f.u./ml) a hemaglutinační titr (virionů/ml) spojených frakcí.

85 Obr. 5.8. Výsledek čtvrté izolace myšího polyomaviru po purifikaci přes CsCl gradient a sacharózový polštář. Vlevo frakce II, vpravo frakce III. Úsečka = 100 nm, pořídil V. Žíla.

Izolovaný virus byl následně použit pro separaci izoforem proteinů VP2 a VP3 pomocí SDS- PAGE, pro 2D elektroforézu virových kapsidových proteinů a pro infekci buněk pro sledování výskytu izoforem VP2 a VP3 v průběhu infekčního cyklu.

5.2. Studium izoforem proteinů VP2 a VP3 Cílem experimentů, popsaných v této kapitole, bylo charakterizovat vlastnosti izoforem VP2 a VP3, jež je možné detekovat pomocí SDS-PAGE jako dvojité proužky.

5.2.1. Sledování výskytu izoforem VP2 a VP3 v průběhu infekčního cyklu Aby bylo ověřeno, v jaké části infekčního cyklu MPyV dochází k předpokládané modifikaci proteinů VP2 a VP3, jež vede ke vzniku jejich izoforem, kultury myších fibroblastů 3T6 synchronizované do G0 fáze buněčného cyklu byly infikovány s multiplicitou infekce 2 a kultivovány po dobu 36 a 48 h. Pro případ, že by ke vzniku jedné z forem VP2 a VP3 docházelo až ve velmi pozdní fázi infekce, během zrání virionů, byly stejným způsobem infikované buňky kultivovány po dobu 60 h. Po uplynutí doby inkubace byly buňky lyzovány RIPA pufrem a proteiny VP2 a VP3 byly detekovány western blotem s použitím primární protilátky proti společné části proteinů VP2 a VP3 a sekundární kozí protilátky proti myším imunoglobulinům, konjugované s křenovou peroxidázou. Jak je vidět na obr. 5.9, v lyzátech buněk sklizených 36 h.p.i. byly detekovány pouze formy VP2 a VP3 s vyšší elektroforetickou mobilitou. Proteinové dublety byly pozorovány až 48 h.p.i., tedy ve velmi pozdní části infekce. V čase 60 h.p.i. byly izoformy s nižší elektroforetickou mobilitou zastoupeny výrazněji.

86 Obr. 5.9. Detekce proteinů VP2 a VP3 v lyzátech myších fibroblastů 3T6 v různých časech po infekci (36, 48 a 60 h.p.i.). Druhé proužky o vyšší molekulové hmotnosti se objevují nejdříve 48 h.p.i., tedy ve velmi pozdní fázi infekce. NK – lyzát z neinfikovaných buněk. Western bot, detekce pomocí primární protilátky proti společné části proteinů VP2 a VP3 a sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou.

5.2.2. Příprava vzorků pro hmotnostní spektrometrii Pro analýzu proteinových dubletů hmotnostní spektrometrií byly izolované viriony separovány pomocí SDS-PAGE a proteiny byly obarveny pomocí Coomassie Brilliant Blue (CBB). V případě virionů z prvních tří izolací (kap. 5.1.1, 5.1.2 a 5.1.3) bylo možné použít pouze frakci II (plné viriony), neboť vzorky frakce III (prázdné kapsidy) obsahovaly velké množství kontaminujících proteinů (obr. 5.10). V případě virionů ze čtvrté izolace (kap. 5.1.4) bylo možné k separaci izoforem VP2 a VP3 použít obě frakce.

Obr. 5.10. Příklad SDS-PAGE proteinů z frakce III izolace virionů MPyV, která obsahuje velké množství kontaminujících proteinů. Separováno na 10% polyakrylamidovém gelu, barveno CBB.

Virové proteiny byly nejprve separovány v 15% polyakrylamidovém gelu, avšak takováto separace se ukázala být pro potřeby hmotnostní spektrometrie nedostačující, neboť proužky v dubletech proteinů VP2 a VP3 splývaly i při delším běhu elektroforézy (obr. 5.11). Jako řešení tohoto problému se nejprve osvědčila gradientová SDS-PAGE, u které dochází k značnému zaostření separovaných proteinů. Optimální rozpětí gradientu bylo 8 – 16% koncentrace akrylamidu (obr. 5.12). Později byl využíván běžný 10% polyakrylamidový gel, neboť při dostatečně dlouhém běhu elektroforézy (takovém, kdy protein VP3 ještě nevyputoval z gelu) docházelo ke zcela postačující separaci obou minoritních kapsidových proteinů (obr. 5.13). Od gradientové elektroforézy bylo v následujících pokusech upuštěno také z toho důvodu, že k dobré separaci izoforem VP2 a VP3 došlo vždy jen v učité oblasti gelu, kterou bylo nutné na základě předchozí zkušenosti odhadovat. Při práci s koncentračním gradientem polyakrylamidu se tak často stávalo, že elektroforéza byla zastavena, fixována a obarvena

87 ve fázi separace proteinů, kdy nebyly izoformy VP2 a VP3 dostatečně rozděleny, čímž docházelo k plýtvání materiálem. Klíčovým faktorem přispívajícím k optimální separaci izoforem VP2 a VP3 se ukázala být také dostatečná délka vrchního 5% gelu. V případě, kdy byla délka vrchního gelu cca 1 cm, docházelo ke vzniku zcela rovných proužků, pokud byla délka vrchního gelu kratší, docházelo k zakřivení proužků, které vedlo k splývání izoforem a takovýto vzorek byl pro rozlišení izoforem hmotnostní spektrometrii zcela nepoužitelný. Dalším faktorem, ovlivňující kvalitu separace izoforem VP2 a VP3 byla koncentrace SDS v Laemmliho pufru. Pokud bylo používáno složení Laemmliho pufru, uvedené v kap. 4.1.3, s výsledným 1% (w/v) SDS, byla kvalita separace dobrá, v případě, že bylo použito Laemmliho pufru s nižší koncentrací SDS, byly proužky zakřivené či znehodnocené vzájemně splývajícími šmouhami obarvených proteinů. Elektroforézy s kvalitně separovnými izoformami VP2 a VP3, jako ty uvedené na obr. 5.12 a 5.13, byly použity pro analýzu hmotnostní spektrometrií.

Obr. 5.11. Separace proteinů izolovaných virionů myšího polyomaviru na 15% SDS polyakrylamidovém gelu. Slabší proužek o poněkud vyšší molekulové hmotnosti je viditelný u proteinu VP2, ale u proteinu VP3 oba proužky splývají. Obarveno pomocí CBB.

Obr. 5.12. Separace proteinů virionů myšího polyomaviru na SDS polyakrylamidovém gelu s 8 – 16% gradientem polyakrylamidu. Slabší proužek o poněkud vyšší elektroforetické mobilitě je viditelný u proteinů VP2 i VP3. Obarveno CBB.

88 Obr. 5.13. Separace proteinů virionů myšího polyomaviru na 10% polyakrylamidovém gelu. Slabší proužek o poněkud vyšší elektroforetické mobilitě je viditelný u proteinů VP2 i VP3. Obarveno CBB.

5.2.3. Výskyt izoforem VP2 a VP3 ve VLPs Dvojitý proužek izoforem byl pozorován u VP2 N-koncově fúzovaného s thioredoxinem produkovaného v bakteriích (JIRÁSKO, 2006). Již dříve bylo ukázáno, že obě izoformy VP2 a VP3 vznikají i při produkci strukturních proteinů MPyV bakulovirovým expresním systémem (FORSTOVÁ et al., 1993). Protože při produkci VLPs složených z VP1 a VP2 nebo VP1 a VP3 bakulovirovým expresním systémem dochází k vysoké expresi vložených genů vlivem silného polyhedrinového promotoru, lze získat vyšší a zároveň čistší výtěžky strukturních proteinů MPyV než v případě izolace virionů MPyV z tkáňové kultury myšších buněk. Proto byly pro srovnání s viriony MPyV použity VP1/VP2 a VP1/VP3 VLPs, produkované bakulovirovým expresním systémem a izolované z hmyzích Sf9 buněk, poskytnuté M. Jelínkem (JELÍNEK, 2009). Ukázalo se však, že ačkoli přinejmenším v případě VP1/VP2 VLPs je možné pomocí obarvení separovaných proteinů CBB detekovat izoformy VP2 (obr. 5.14), spodní izoforma je přítomna v značně větším množství než vrchní, což činí obtíže při jejich separaci (při malé nanášce vzorku na gel není vrchní izoforma detekovatelná, při vyšší nanášce dochází kvůli intenzitě proužku spodní izoformy ke splynutí obou proužků). V případě VP1/VP3 VLPs bylo navíc v oblasti proteinu VP3 detekováno pozadí kontaminujících proteinů (obr. 5.14). Proto bylo od pokusů použít VLPs produkovaných bakulovirovým expresním systémem ke studiu izoforem VP2 a VP3 dále upuštěno.

Obr. 5.14. Srovnání lyzátů izolovaných virionů MPyV a VLPs složených z VP1 a VP2 (VP1/2 VLPs) nebo VP1 a VP3 (VP1/3 VLPs) produkovaných v hmyzích buňkách. Separace SDS-PAGE s 8 – 16% gradientem polyakrylamidu, obarveno CBB.

89 5.2.4. Rozdíl mezi izoformami proteinů VP2 a VP3 není způsoben proteolytickým štěpením na C-konci. Analýzu prezentovanou v této kapitole provedl Mgr. Petr Jedelský z Laboratoře hmotnostní spektrometrie biologické sekce PřF UK. Vzhledem k tomu, že dvě izoformy se vyskytují jak u proteinu VP2, tak u VP3, byla nejprve ověřena možnost, zda u obou proteinů nedochází např. během maturace virionů nebo při jiných fázích infekčního cyklu MPyV k proteolytickému štěpení na společném C-konci. Vzorky proteinů z gelu byly štěpeny sekvenčně specifickými proteázami, buď trypsinem (štěpí peptidickou vazbu za lysinem nebo argininem, pokud další aminokyselina není prolin), nebo proteinázou Asp-N (štěpí peptidickou vazbu před aspartátem). Spektra vzniklých peptidů byla analyzována hmotnostním spektrometrem Bruker Autoflex II MALDI-TOF/TOF. Spektra byla vyhodnocena pomocí softwaru Bruker FlexAnalysis 3.0. Výsledné hodnoty molekulových hmotností byly odeslány do softwaru Bruker Biotools 3.1 a pomocí programu Mascot na základě aminokyselinových sekvencí proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru porovnány s teoretickými molekulovými hmotnostmi peptidických fragmentů, vznikajících štěpením proteinů VP2 a VP3 trypsinem a proteinázou Asp-N. Pro obě izoformy proteinů VP2 a VP3 bylo pokrytí sekvence shodné. Pokrytí sekvence proteinu VP2 peptidy o molekulové hmotnosti odpovídající naměřeným hodnotám (červeně je označena pokrytá část sekvence):

1 MGAALTILVD LIEGLAEVST LTGLSAEAIL SGEALAALDG EITALTLEGV 51 MSSETALATM GISEEVYGFV STVPVFVSRT AGAIWLMQTV QGASTISLGI 101 QRYLHNEEVP TVNRNMALIP WRDPALLDIY FPGVNQFAHA LNVVHDWGHG 151 LLHSVGRYVW QMVVQETQHR LEGAVRELTV RQTHTFLDGL ARLLENTRWV 201 VSNAPQSAID AINRGASSAS SGYSSLSDYY RQLGLNPPQR RALFNRIEGS 251 MGNGGPTPAA HIQDESGEVI KFYQAQVVSH QRVTPDWMLP LILGLYGDIT 301 PTWATVIEED GPQKKKRRL

Pokrytí sekvence proteinu VP3 peptidy o molekulové hmotnosti odpovídající naměřeným hodnotám (červeně je označena pokrytá část sekvence):

1 MALIPWRDPA LLDIYFPGVN QFAHALNVVH DWGHGLLHSV GRYVWQMVVQ 51 ETQHRLEGAV RELTVRQTHT FLDGLARLLE NTRWVVSNAP QSAIDAINRG 101 ASSASSGYSS LSDYYRQLGL NPPQRRALFN RIEGSMGNGG PTPAAHIQDE 151 SGEVIKFYQA QVVSHQRVTP DWMLPLILGL YGDITPTWAT VIEEDGPQKK 201 KRRL

Ve všech případech byla pozorována intaktní C-koncová část. Ke vzniku variant proteinů VP2 a VP3 tedy nedochází následkem proteolytického štěpení na C-konci.

90 5.2.5. Posttranslační modifikace VP2 a VP3 Analýzu prezentovanou v této kapitole provedl RNDr. Petr Man, PhD. z laboratoře charakterizace molekulární struktury Mikrobiologického ústavu Akademie věd ČR. Prezentované výsledky byly zpracovány v programu „mMass Data Miner“ (www.mmass.org, STROHALM et al., 2009). Proteiny VP2 a VP3 tvoří z pohledu analýzy posttranslačních modifikací hmotnostní spektrometrií (MS) obtížný problém, jelikož nelze jednoduše dosáhnout proteolýzy poskytující peptidické fragmenty, vhodné svou molekulovou hmotností pro analýzu MS. Nejčastěji používaný trypsin vede u obou proteinů ke směsi obsahující dlouhé peptidy, které se obtížně detekují. Proteázy s jinou specifitou, např. GluC, chymotrypsin a AspN také nepředstavují uspokojivé řešení. Proto je nutné volit štěpení dvěma či třemi různými proteázami, případně jejich kombinaci. Jako nejvhodnější se dle teoretické analýzy jeví trypsin, GluC a chymotrypsin, případně jejich kombinace (obr. 5.15). Vhodné je také štěpení trypsinem, následované doštěpením vzniklých peptidů pomocí bromkyanu (CNBr – štěpí za Met a mění jej na homoserinlakton). Tento postup však může vést ke ztrátě labilních modifikací, protože štěpení probíhá přes noc za velmi nízkého pH (v přítomnosti 70% kyseliny trifluoroctové).

Obr. 5.15. Teoretická mapa pokrytí sekvence po digesci VP2-VP3 pomocí trypsinu (modrá), AspN (červená), chymotrypsinu (zelená) a GluC (žlutá). Počátek VP3 je označen černým trojúhelníkem. Methioniny (zásahová místa pro štěpení CNBr) jsou vyznačeny červenými rámečky.

91 5.2.5.1. VP3 je na N-koncovém alaninu acetylovaný Proteiny, které byly dostatečným způsobem separovány pomocí SDS-PAGE a detekovány CBB (viz kap. 5.2.2) byly vyříznuty z gelu a rozřezány na kostičky o hraně přibližně 1 mm. Gely byly následně odbarveny sonikací ve směsi acetonitrilu a 50 mM ethylmorfolin acetátu (pH = 8,3).

Po odbarvení byly gely opakovaně promývány ddH2O a sraženy acetontrilem (odstranění solí, pufrů, SDS) a následně vysušeny pod vakuem. Vysušené gely byly rehydratovány ve štěpícím pufru (50mM ethylmorfolin acetát pH 8,3, 10% acetonitril) s proteázou o koncentraci 5 ng/μl (trypsin, chymotrypsin, GluC, nebo AspN). Po digesci, probíhající přes noc, byly peptidy z gelu extrahovány přídavkem acetonitrilu do výsledné koncentrace 50% a kyseliny trifluoroctové do výsledné koncentrace 0,1%. Peptidy byly analyzovány pomocí MALDI-TOF MS (Bruker UltraFlex III ToF/ToF, Bruker Daltonics) přímo a nebo po odsolení na minikolonkách s obrácenou fází (v případě MS spektra uvedeného na obr. 5.16). V dosud provedených pokusech nebyl nalezen rozdíl mezi oběma formami VP2 či VP3. U VP3 byla jednoznačně potvrzena absence N-koncového Met a acetylace N-koncového Ala (obr. 5.16, obr. 5.17 a obr. 5.19) v obou proužcích VP3, separovaných pomocí SDS-PAGE.

Obr. 5.16. MALDI-MS spektrum tryptického digestu VP3. Identifikované peptidy jsou znázorněny ve formě šedých proužků u sekvence VP3 na obr. 5.17. Pík o hodnotě m/z 797,48 odpovídá N-koncovému tryptickému peptidu nesoucímu acetylaci.

92 Obr. 5.17. Sekvence proteinu VP3 a peptidy, identifikované pomocí MALDI-TOF MS, znázorněné ve formě šedých proužků.

Přítomnost acetylové skupiny na N-koncovém alaninu VP3 byla potvrzena pomocí tandemové MS (MS/MS). Nomenklatura peptidů, které vznikají během fragmentace při MS/MS je znázorněna na obr. 5.18, předpovězené hodnoty m/z (poměr hmotnosti a náboje) fragmentů, vzniklých při MS/MS N-koncového peptidu „Ac-ALIPWR“ jsou uvedeny v tab. 5.7 a MALDI- MS/MS spektrum s vyznačenými detekovanými fragmenty je na obr. 5.19.

Obr. 5.18. Schématické znázornění fragmentace peptidů při MS/MS. Vyznačeny jsou tzv. a-ionty (značeny zeleně), b-ionty (červeně) a y-ionty (modře), které vznikají při fragmentaci. Barevné značení odpovídá značení na tab. 5.7 a obr 5.19. a-ionty a b-ionty jsou N-koncové fragmenty, zatímco y-ionty jsou C-koncové fragmenty. (Upraveno podle WESTERMEIER a NAVEN, 2002.)

a b b-18 res. y y-17 y-18 86.06 114.06 96.05 1 A 6 199.15 227.14 209.13 2 L 5 684.42 667.39 666.41 312.23 340.22 322.21 3 I 4 571.34 554.31 553.33 409.28 437.28 419.27 4 P 3 458.25 441.23 440.24 595.36 623.36 605.35 5 W 2 361.20 344.17 343.19 6 R 1 175.12 158.09 157.11

Tab. 5.7. Předpokládané m/z hodnoty peptidů, vzniklých fragmentací N-koncového peptidu Ac-ALIPWR z proteinu VP3 při MS/MS analýze. Identifikované a-ionty jsou vyznačeny zeleně, b-ionty červeně a y-ionty modře. Barevné značení odpovídá značení na obr. 5.17 a obr. 5.18. b-18, y-17 a y-18 odpovídají iontům, které během fragmentace ztratily H2O (-18) nebo NH3 (-17).

93 Obr. 5.19. MALDI-MS/MS spektrum N-koncového acetylovaného peptidu z proteinu VP3. Nalezené fragmentové ionty jsou barevně vyznačeny (a-ionty zeleně, b-ionty červeně, y-ionty modře a imoniové ionty a interní fragmenty fialově a kurzívou).

5.2.5.2. Fosforylace VP2 – předběžné výsledky Ve snaze zjistit, zda jsou proteiny VP2 a VP3 fosforylovány, a určit polohu fosforylovaných aminokyselin bylo provedeno nabohacení fosfopeptidů na mikrokolonkách s TiO2 (THINGHOLM et al., 2009, review). V prvním provedeném pokusu byly detekovány tři peptidové signály, které byly přítomny pouze v jedné formě VP2, a to v proužku s vyšší mobilitou – spodním proužku. Jejich přiřazení na základě intaktní hmotnosti však nebylo možné. Kvůli nízké intenzitě neposkytl následný MS/MS experiment fragmenty umožňující přiřazení určité sekvenci, pouze potvrdil přítomnost fosforylace jelikož jediný signál odpovídal ztrátě fosfátu. Pro potvrzení tohoto předběžného výsledku budou provedeny další pokusy, které budou zahrnovat detailní analýzu digestů pomocí různých proteáz a bude znovu prováděno nabohacení fosfopeptidů na kolonkách s TiO2 či kolonkách IMAC s ionty galia (THINGHOLM et al., 2009, review).

5.2.5.3. MS analýza intaktních proteinů MPyV – předběžné výsledky V dalším předběžném experimentu byl proveden pokus použít k analýze strukturních proteinů MPyV metodu top-down (SIUTI a KELLEHER, 2007, review). Tato technika využívá vysoké

94 přesnosti a rozlišení, které jsou dostupné pouze na instrumentech s iontově cyklotronovou rezonancí (FT-ICR). V optimálním případě by bylo možné pomocí této metody určit molekulové hmotnosti jednotlivých izoforem VP2 a VP3 s přesností na 1 až 0,1 Da. Zjištěný rozdíl v molekulové hmotnosti by následně mohl být využit k určení posttranslační modifikace. K intaktním izolovaným virionům v B pufru byl přidán tris(2-karboxyethyl)fosfin do výsledné koncentrace 50 mM a guanidin do výsledné koncentrace 1 M. Směs byla zahřáta na 65°C po dobu 10 minut, následně okyselena pomocí trifluoroctové kyseliny (TFA) a aplikována na mikrokolonku s obrácenou fází. Po důkladném odmytí pufru a solí pomocí 0,2% TFA byly proteiny eluovány 80% acetonitrilem s 0,1% TFA. Přečištěné proteiny byly odpařeny na rotační vakuové odparce a resuspendovány v 0,2% kyselině mravenčí a 5% acetonitrilu. Tato směs byla nastříknuta na kolonu s obrácenou fází fází a proteiny byly separovány pomoci lineárního acetonitrilového gradientu. Kolona byla přímo napojena na instrument FT-ICR (9.4T APEX-Qe Ultra, Bruker Daltonics). S ohledem na velmi malé množství vzorku nebylo detekováno více izoforem proteinů. Byl detekován pouze signál odpovídající VP2 modifikovanému jen myristylací. Určená molekulová hmotnost byla 34 783 Da (teoretická je 34 781,98Da) což odpovídá chybě měření 29 ppm, která je úměrná malé intenzitě signálu. Tento pokus bude opakován s větším množstvím vzorku.

5.2.6. Dvourozměrná elektroforéza strukturních proteinů MPyV Veškeré 2D elektroforézy prezentované v této diplomové práci byly provedeny pomocí vybavení Laboratoře genomických a proteomických technik biologické sekce PřF UK. Pro další charakterizaci izoforem VP2 a VP3 byla použita dvourozměrná elektroforéza. Touto metodou lze zjistit, zda dochází ke tvorbě izoforem proteinů, lišících se svým izoelektrickým bodem (pI). Dřívější pokusy o separaci proteinů VP2 a VP3 v celobuněčných lyzátech 2D elektroférzou selhávaly, pravděpodobně z důvodu nerozpustnosti těchto proteinů v pufrech pro izoelektrickou fokusaci (IEF). Z tohoto důvodu byla příprava vzorku – izolovaných virionů MPyV – pro IEF prováděna pomocí pufrů vhodných pro špatně rozpustné proteiny. Kapsidy virionů byly nejprve rozvolněny v RIPA pufru pomocí 10 mM EGTA a 10 mM DTT, proteiny byly následně vysráženy acetonem a rehydratovány v pufru s 1% CHAPS (pro podrobnější postup viz kap. 4.8.3). Tímto postupem se podařilo separovat na 2D elektroforéze 4 formy VP2 a 4 formy VP3, viditelné po barvení pomocí Coomassie Brilliant Blue (CBB) (obr. 5.20).

95 Obr. 5.20. 2D elektroforéza proteinů izolovaných virionů MPyV, obarveno CBB. Jednotlivé izoformy VP2 a VP3 jsou označeny šipkami. Hvězdičkami jsou označeny další spoty o vyšší mobilitě v druhém rozměru, které byly detekovány i na western blotu 2D elektroforézy (obr. 5.21).

Aby byla potvrzena identita spotů, přisuzovaných VP2 a VP3, byl proveden western blot 2D elektroforézy. VP2 a VP3 byly detekovány myší protilátkou proti společné části VP2 a VP3 a sekundární kozí protilátkou proti myším imunoglobulinům. Kromě forem na gelech obarvených CBB byly detekovány další spoty, odpovídající polohou na 2D elektroférze proteinům VP2 a VP3. Kromě toho byly protilátkou obarveny i slabší spoty VP2 a zvláště VP3 s vyšší mobilitou ve druhém rozměru 2D elektroforézy (obr. 5.21). Tyto spoty je možné vidět také na gelu obarveném CBB (obr. 5.20) a může se jednat buď o produkty degradace, nebo o izoformy proteinů VP2 a VP3 o vyšší mobilitě. Na jednorozměrné elektroforéze byly však vždy proužky izoforem o vyšší mobilitě intenzivnější (viz kap. 5.2.2).

Obr. 5.21. Western blot 2D elektroforézy s detekovanými proteiny VP2 a VP3. Na základě polohy byly označeny jednotlivé spoty, odpovídající spotům detekovaným na 2D elektroféze obarvené CBB (označeny shodným zbůsobem jako na obr. 5.20), další detekované formy VP2 a VP3 jsou označeny šipkami směřujícími zespodu. Hvězdičkami jsou označeny spoty o vyšší mobilitě v druhém rozměru.

96 5.3. Příprava plazmidů pro produkci deletovaných forem VP2 a VP3, fúzovaných s EGFP

5.3.1. Příprava plazmidu pro expresi unikátní části VP2 (pUV2-NLS-EGFP) Při samostatné expresi VP2 a VP3 fúzovaných s EGFP v savčích buňkách nebyly nalezeny výrazné rozdíly mezi VP2 a VP3. Oba proteiny byly cytotoxické a jejich lokalizace v buňkách byla částečně jaderná, velká subpopulace obou proteinů však byla detekována také na intracelulárních membránách a oba proteiny indukovaly velmi záhy po jejich samostatné tranzientní produkci apoptózu. (HUÉRFANO et al., 2010) Se záměrem odhalit vlastnosti a případně funkci unikátní části proteinu VP2 (UV2) byl připraven expresní plazmid pro samostatnou produkci unikátní části VP2 v myších buňkách. Proteiny VP2 a VP3 mají jaderný lokalizační signál (NLS) na společné C-koncové sekvenci. Aby byla unikátní část VP2 dopravována na místo své přirozené lokalizace, bylo k ní třeba připojit NLS. Pro srovnání s předchozími experimenty (HUÉRFANO et al., 2010) a také proto, že proti unikátní oblasti VP2 se dosud nepodařilo připravit protilátku, byla konstrukce navržena tak, aby vznikl fúzní produkt s EGFP, připojeným za na C-konec UV2 a NLS – protein UV2-NLS-EGFP. Výchozím vektorem pro plazmid pUV2-NLS-EGFP a plazmidy přímo využité k jeho konstrukci byl plazmid pEGFP-N1 (Clontech), který v savčích buňkách zajišťuje expresi proteinu EGFP (enhanced GFP) a umožňuje konstrukci plazmidů exprimujících v savčích buňkách proteiny fúzované k N-konci EGFP. Plazmid pVP2-EGFP, připravený v naší laboratoři E. Bouřou, byl získán vložením PCR fragmentu, který obsahoval sekvenci kódující protein VP2, do polylinkeru pEGFP-N1 přes restrikční místa pro endonukleázy Bgl II a Hind III. Tento PCR fragment byl připraven pomocí primerů obsahujících restrikční místa pro endonukleázy Bgl II a Hind III a jako templát pro PCR byl použit plazmid pMJΔG, nesoucí celý genom myšího polyomaviru. Výchozím vektorem pro přípravu pUV2-NLS-EGFP byl plazmid pUV2-EGFP připravený taktéž E. Bouřou. Plazmid pUV2-EGFP byl získán štěpením plazmidu pVP2-EGFP restrikční endonukleázou BamH I a následnou recirkularizací. BamH I má na tomto plazmidu dvě restrikční místa, jedno je v polylinkeru a druhé v blízkosti rozhraní sekvence unikátní části VP2 a společné části VP2 a VP3, konkrétně je začátek restrikčního místa BamH I 20 bazí za rozhraním těchto částí sekvence VP2. Takto byla deletována sekvence, kódující společnou část proteinů VP2 a VP3. (BOUŘA, 2004) Samotný plazmid pUV2-NLS-EGFP byl připraven vyštěpením fragmentu mezi restrikčními místy pro endonukleázy Kpn I (35 bazí před rozhraním sekvence unikátní části VP2 a společné části VP2 a VP3) a BamH I (použitou při konstrukci plazmidu pUV2-EGFP), čímž vznikly dva fragmenty o velikostech přibližně 4,6 kbp a 60 bp. Větší fragment byl izolován z gelu a ligován se syntetickým fragmentem, nesoucím sekvenci oblasti mezi restrikčním místem Kpn I

97 a rozhraním unikátní části sekvence proteinu VP2, sekvenci dvanácti kodónů pro jaderný lokalizační signál a unikátní restrikční místo pro endonukleázu Sac I pro restrikční test. Jako aminokyselinová sekvence jaderného lokalizačního signálu byla zvolena sekvence EEDGPQKKKRRL nacházející se na C-konci proteinů VP2 a VP3, popsaná jako jaderný lokalizační signál proteinů VP2 a VP3 (CHANG et al., 1992a). Jako nukleotidová sekvence byla zvolena odpovídající sekvence z genomu myšího polyomaviru. Mapa plazmidu pEGFP-N1 s detailem polylinkeru a schématem konstrukce plazmidů pVP2- EGFP, pUV2-EGFP, pUV2-NLS-EGFP je znázorněna na obr. 5.22.

Obr. 5.22. Mapa výchozího klonovacího vektoru pEGFP-N1 (Clontech) s detailní sekvencí polylinkeru (MCS) a schématem konstrukce plazmidů pVP2-EGFP, pUV2-EGFP a pUV2-NLS-EGFP. Vyznačena jsou restrikční místa použitá při konstrukci těchto plazmidů – pro detaily viz text.

Vkládaný fragment byl navržen jako dvojice komplementárních ssDNA, fosforylovaných na 5' konci, které byly připraveny firmou Sigma (viz kap. 4.1.11). Po spojení obou ssDNA (obr. 5.23) vznikl dsDNA fragment s kohezními konci, odpovídajícími koncům po štěpení restrikčními endonukleázami Kpn I (5' konec) a BamH I (3' konec) (obr. 5.24) a tento fragment byl ligován do vektoru štěpeného shodnými restikčními endonukleázami.

98 Obr. 5.23. Spojení dvou komplementárních jedořetězcových oligonukleotidů do dsDNA. Vzorky byly smíchány do výsledné koncentrace 50 ng/μl, elektroforeticky ověřeny a dsDNA použita k ligaci v poměru 1:5 s vektorem. M – marker (velikosti v bp).

____CTACACAACGAAGAGGTCCCTACTGTAAATAGAAATGAGGAAGATGGCCCCCAAAAGAAAAAGCGGCGTCTCGAGCTCCGG____ ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATGGATGTGTTGCTTCTCCAGGGATGACATTTATCTTTACTCCTTCTACCGGGGGTTTTCTTTTTCGCCGCAGAGCTCGAGGCCCTAG

Obr. 5.24. Sekvence fragmentu nesoucího konec sekvence unikátní části proteinu VP2 (modře), sekvenci pro jaderný lokalizační signál (purpurově) a restrikční místo pro endonukleázu Sac I (zeleně). Žlutě jsou vyznačeny kohezní konce odpovídající koncům po štěpení restrikčními endonukleázami Kpn I (5' konec – vlevo) a BamH I (3' konec vpravo). Dva šedě označené páry bazí byly přidány, aby odpovídal čtecí rámec následující sekvence EGFP.

Ligační směs byla do bakteriálního kmene Escherichia coli DH5α vnesena elektroporací. Z narostlých bakteriálních kolonií byly minipreparací získány plazmidy, které byly otestovány restrikčním štěpením. Ověřená monokolonie byla použita k maxipreparaci plazmidové DNA. Kontrolní restrikční štěpení plazmidu pUV2-NLS-EGFP je na obr. 5.25 a obr. 5.26.

Obr. 5.25. Kontrolní štěpení plazmidů pUV2-NLS- EGFP (N) a pUV2-EGFP (U). Restrikční endonukleázy BamH I a Kpn I štěpí oba plazmidy, endonukleáza Sac I pouze plazmid pUV2-NLS- EGFP vzhledem k přítomnosti kontrolního restrikčního místa na vloženém fragmentu nesoucím sekvenci NLS (viz obr.). M – marker (velikosti v bp), vpravo neštěpené plazmidy.

Obr. 5.26. Elektroforetické ověření velikosti vyštěpeného fragmentu u plazmidů pUV2-EGFP (U) a pUV2- NLS-EGFP (N) při současném štěpení restrikčními endonukleázami BamH I a Kpn I. Pro srovnání fragment nesoucí NLS, který byl použit k ligaci (F). M – marker (velikosti v bp).

Exprese proteinu UV2-NLS-EGFP byla ověřena pozorováním imunofluorescence v živých 3T3 myších fibroblastech, transfekovaných plazmidem pUV2-NLS-EGFP a pro srovnání také plazmidem pEGFP-N1, 16 hodin po transfekci (h.p.t.). Lokalizace proteinu UV2-NLS-EGFP byla prokazatelně jaderná, zatímco EGFP byl rovnoměrně distribuován v celé buňce (obr. 5.27). Dále byla exprese proteinu UV2-NLS-EGFP ověřena western blotem lyzátů transfekovaných

99 buněk. Myší fibroblasty linie 3T3 byly transfekovány elektroporací plazmidy pUV2-NLS-EGFP a pEGFP-N1. 4 h po transfekci byly buňky sklizeny a lyzovány. Buněčné lyzáty byly použity na SDS-PAGE a následný western blot. Kromě silného signálu proteinu o molekulové hmotnosti odpovídající UV2-NLS-EGFP (~40 kDa) byly v lyzátech buněk transfekovaných plazmidem pUV2-NLS-EGFP vždy detekovány další slabší proužky, pravděpodobně degradační produkty proteinu UV2-NLS-EGFP. Počet a intenzita těchto proužků se v různých preparacích lišila a pokud byla použita směs inhibitorů proteáz Complete Mini (Roche), bylo jejich množství nižší (obr. 5.28). Tyto degradáty tedy pravděpodobně vznikaly během přípravy vzorků. Po ověření exprese proteinu UV2-NLS-EGFP byla izolována plazmidová DNA zbavená endotoxinů pro transfekci savčích buněk.

UV2-NLS-EGFP EGFP

Obr. 5.27. Srovnání jaderné lokalizace proteinu UV2-NLS- EGFP s EGFP, distribuovaným v jádře i cytoplazmě. Živé 3T3 myší fibroblasty. Buňky byly trasfekovány TurboFectem™ a 16 h.p.t. byly pozorovány invertovaným fluorescenčním mikroskopem IX71 (Olympus).

Obr. 5.28. Ověření exprese fúzního proteinu UV2- NLS-EGFP a pro srovnání exprese proteinu EGFP v myších fibroblastech linie 3T3. Produkované proteiny byly detekovány králičí polyklonální protilátkou proti GFP a sekundární kozí protilátkou proti králičím imunoglobulinům, konjugovanou s křenovou peroxidázou. Předpokládaná velikost fúzního proteinu UV2-NLS-EGFP je ~40 kDa, velikost EGFP je 27 kDa.

5.3.2. Příprava plazmidu pro expresi VP2 s deletovanou hydrofobní doménou 2 (pVP2ΔD2-EGFP) Jak již bylo zmíněno v kapitole 2.2.3.2, předpokládá se, že protein VP2 kóduje tři hydrofobní oblasti, první v oblasti své unikátní části, druhou v oblasti začátku společné části VP2 a VP3 a třetí na C-konci společné části VP2 a VP3. Proteiny VP2-EGFP a VP3-EGFP mají výraznou afinitu k intracelulárním membránám. V naší laboratoři jsme se proto rozhodli připravit sérii mutant proteinů VP2-EGFP a VP3-EGFP s delecemi právě těchto hydrofobním segmentů, aby bylo možné určit, který z nich je zodpovědný za interakci proteinů VP2-EGFP a VP3-EGFP s membránami. V. Žíla již dříve připravil plazmid pro produkci proteinu VP3ΔHX-EGFP, který

100 svým uspořádáním odpovídá proteinu VP3-EGFP s delecí třetí hydrofobní domény. Protože protein VP3ΔHX-EGFP vlivem této delece neztratil afinitu k intracelulárním membránám, byly v rámci této diplomové práce připraveny plazmidy pro expresi proteinů VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP v savčích buňkách. Ty svým uspořádáním odpovídají proteinům VP2-EGFP a VP3-EGFP s delecí předpokládané hydrofobní domény na počátku společné části VP2 a VP3. Plazmid pVP2ΔD2-EGFP byl připraven zaklonováním PCR fragmentu nesoucího sekvenci proteinu VP2 s deletovanou předpokládanou hydrofobní doménou 2 (aminokyseliny 126 – 165 proteinu VP2), do donorového vektoru pEGFP-N1. Schéma konstrukce plazmidu pVP2ΔD2- EGFP je na obr. 5.29.

Obr. 5.29. Mapa výchozího klonovacího vektoru pEGFP-N1 (Clontech) s detailní sekvencí polylinkeru (MCS) a schématem konstrukce plazmidů pVP2ΔD2-EGFP a pVP3ΔD2-EGFP. Vyznačena jsou restrikční místa použitá při konstrukci těchto plazmidů – pro detaily viz text.

Konstrukce byla navržena jako vložení dvou PCR fragmentů do donorového vektoru pEGFP- N1, linearizovaného restrikčními endonukleázami Bgl II a Hind III. První fragment fragment byl připraven pomocí PCR s využitím primerů VP2 Bgl II/1 a VP2/3 BamH I/2. Výsledný PCR fragment nesl sekvenci odpovídající prvním 371 bp VP2 s přidaným restrikčním místem pro Bgl II na 5' konci a restrikčním místem pro BamH I, které je součástí sekvence VP2/VP3, na 3' konci. Druhý fragment byl vytvořen s využitím primeru VP2/3ΔD2 Bam HI/1 (který překlenoval sekvence sousedící s deletovanou hydrofobní doménou 2) a primeru VP2/3 Hind III/2. Výsledný PCR fragment nesl sekvence odpovídající 366 – 375 bp VP2

101 (sekvence od restrikčního místa BamH I před deletovanou hydrofobní doménou 2) a 496 – 957 bp VP2 (sekvence za deletovanou hydrofobní doménou 2) s restrikčním místem pro BamH I na 5' konci a přidaným restrikčním místem pro Hind III na 3' konci. Jako templát byl použit plazmid pVP2-EGFP. Při štěpení restrikčními endonukleázami BamH I a Bgl II vznikají shodné kohezní konce a při pokusech zaklonovat současně oba PCR fragmenty do pEGFP-N1 linearizovaného restrikčními endonukleázami Bgl II a Hind III docházelo preferenčně k ligaci PCR fragmentu štěpeného na koncích Bgl II a BamH I v opačné orientaci. Proto byly oba PCR fragmenty následně štěpeny pouze BamH I, ligovány, fragment o správné velikosti, vzniklý ligací obou fragmentů, byl izolován z agarózového gelu a amplifikován pomocí primerů VP2 Bgl II/1 a VP2/3 Hind III/2. Vzniklý PCR fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Bgl II a Hind III, izolován z agarózového gelu, a ligován s donorovým vektorem pEGFP-N1 štěpeným stejnými restrikčními endonukleázami (donorový vektor byl taktéž izolován z agarózového gelu). Ligační směs byla do bakteriálního kmene DH5α vnesena elektroporací. Z narostlých bakteriálních kolonií byly minipreparací získány plazmidy, které byly testovány restrikčními enzymy (obr. 5.30).

Obr. 5.30. Kontrolní štěpení plazmidu pVP2ΔD2- EGFP. Štěpení plazmidu pEGFP-N1 je uvedeno jako kontrola. Restrikční endonukleázy Bgl II a Hind III vyštěpují z pVP2ΔD2-EGFP vkládaný ~900 bp fragment, BamH I vyštěpuje z pVP2ΔD2- EGFP ~500 bp fragment, zatímco pEGFP-N1 je BamH I linearizován díky jedinému restrikčnímu místu. Restrikční místo pro Xho I bylo v pVP2ΔD2-EGFP ostraněno, zatímco v pEGFP- N1 se nachází a tento plazmid je Xho I linearizován. Bgl II linearizuje pVP2ΔD2-EGFP. M – marker (velikosti v bp).

Ověřená monokolonie byla použita k maxipreparaci plazmidové DNA. Ta byla posléze použita k transfekci buněk pro ověření exprese fúzního proteinu VP2ΔD2-EGFP. Myší fibroblasty 3T3 byly transfekovány elektroporací plazmidem pVP2ΔD2-EGFP a 4 hodiny po transfekci byly sklizeny a lyzovány. Buněčné lyzáty byly použity na SDS-PAGE a western blot. Protein VP2ΔD2-EGFP byl detekován jednak pomocí protilátky proti GFP, jednak pomocí protilátky proti společné části proteinu VP2. V obou případech byl detekován silný signál proteinu o velikosti ~60 kDa, což odpovídá očekávané velikosti proteinu VP2ΔD2-EGFP. Kromě tohoto proteinu bylo detekováno také několik slabších proužků, pravděpodobně degradačních produktů proteinu VP2ΔD2-EGFP (obr. 5.32). Dále byla exprese proteinu VP2ΔD2-EGFP ověřena

102 pozorováním buněk transfekovaných plazmidem pVP2ΔD2-EGFP konfokálním mikroskopem. Myší fibroblasty linie 3T3 byly 4 hodiny po transfekci fixovány, permeabilizovány a značeny pomocí protilátky proti společné části VP2 a VP3 a sekundární protilátky konjugované s Alexa Fluor 546. Signál fluorescence EGFP se překrýval se signálem protilátkami značeného proteinu a lokalizace obou signálů byla jaderná (obr 5.33), zatímco samotné EGFP by se vyskytovalo stejnou měrou v jádře i cytoplazmě. Z těchto výsledků lze vyvodit, že dochází k expresi proteinu VP2ΔD2-EGFP v jeho plné délce a degradáty vznikají pravděpodobně během manipulace se vzorkem. Po ověření exprese proteinu VP2ΔD2-EGFP byla izolována plazmidová DNA zbavená endotoxinů pro transfekci savčích buněk.

5.3.3. Příprava plazmidu pro produkci VP3 s deletovanou hydrofobní doménou 2 (pVP3ΔD2-EGFP) Plazmid pVP3ΔD2-EGFP byl připraven zaklonováním PCR fragmentu nesoucího sekvenci proteinu VP3 s deletovanou předpokládanou hydrofobní doménou 2 (aminokyseliny 11 – 50, počítáno od počátku sekvence VP3), do donorového vektoru pEGFP-N1. Schéma konstrukce plazmidu pVP3ΔD2-EGFP je na obr. 5.29. PCR fragment vkládaný do donorového vektoru byl získán pomocí primerů VP3ΔD2 Nhe I/1 a VP2/3 Hind III/2 (výsledný PCR fragment nesl sekvenci odpovídající 1 – 30 bp a 151 – 612 bp VP3 s přidanými restrikčními místy pro Nhe I na 5' konci a Hind III na 3' konci). Jako templát byl použit plazmid pVP3ΔD2-EGFP. Po štěpení PCR fragmentu příslušnými restrikčními endonukleázami byl izolován z agarózového gelu. Následně byl ligován s plazmidem pEGFP-N1 (štěpeným stejnými restrikčními endonukleázami a přečištěným taktéž izolací z agarózového gelu). Ligační směs byla do bakteriálního kmene DH5α vnesena elektroporací. Z narostlých bakteriálních kolonií byly minipreparací získány plazmidy, které byly testovány restrikčními enzymy (obr. 5.31). Ověřená bakteriální monokolonie byla použita k maxipreparaci plazmidové DNA a exprese fúzního proteinu VP3ΔD2-EGFP byla ověřena shodným způsobem jako v případě proteinu VP2ΔD2-EGFP, tj. transfekcí buněk izolovanou plazmidovou DNA, western blotem lyzátů transfekovaných buněk (předpokládaná velikost proteinu VP3ΔD2-EGFP je ~48 kDa) a konfokální mikroskopií transfekovaných buněk, značených protilátkou proti společné části VP2 a VP3 (kap. 5.3.2, obr. 5.32 a 5.33). Po ověření exprese byla izolována plazmidová DNA zbavená endotoxinů pro transfekci savčích buněk.

103 Obr. 5.31. Kontrolní štěpení plazmidů pVP3ΔD2- EGFP a pEGFP-N1. Restrikční endonukleázy Nhe I a Hind III vyštěpují z pVP3ΔD2-EGFP vkládaný ~500 bp fragment, BamH I vyštěpuje z pVP3ΔD2-EGFP ~500 bp fragment, zatímco pEGFP-N1 je BamH I linearizován díky jedinému restrikčnímu místu. Restrikční místo pro Bgl II bylo v pVP3ΔD2-EGFP ostraněno, zatímco v pEGFP-N1 se nachází a tento plazmid je Bgl II linearizován. Nhe I linearizuje pVP3ΔD2-EGFP. M – marker (velikosti v bp).

Obr. 5.32. Ověření exprese fúzních proteinů VP2ΔD2-EGFP (označen VP2) a VP3ΔD2-EGFP (označen VP3). Produkovné fúzní proteiny byly detekovány jednak králičí polyklonální protilátkou proti GFP (αGFP) a sekundární kozí protilátkou proti králičím imunoglobulinům, konjugovanou s křenovou peroxidázou, jednak myší protilátkou 2C8 proti společné části proteinů VP2 a VP3 (αVP2/3) a sekundární kozí protilátkou proti myším imunoglobulinům, konjugovanou s křenovou peroxidázou. Předpokládaná velikost fúzních proteinů VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP je ~60 kDa a ~48 kDa.

VP2ΔD2-EGFP

Obr. 5.33. Ověření exprese fúzních VP3ΔD2-EGFP proteinů VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2- EGFP. Zeleně fluorescence EGFP, červeně byly označeny proteiny VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP protilátkou 2C8 proti společné části proteinů VP2 a VP3 a sekundární kozí protilátkou proti myším imunoglobulinům, konjugovanou s Alexa Fluor 546. Úsečka = 5 μm.

104 5.4. Sledování subcelulární lokalizace delečních mutant proteinů VP2 a VP3 fúzovaných s EGFP

5.4.1. VP2 s deletovanou společnou částí VP2 a VP3 (kromě NLS), fúzovaný s EGFP (UV2-NLS-EGFP) Zajímalo nás, zdali unikátní část VP2, obsahující předpokládanou hydrofobní doménu 1 a N-koncovou mirystylovou skupinu bude také, podobně jako VP2 i VP3 interagovat s vnitrobuněčnými membránami, nebo bude-li její lokalizace v buňce výhradně jaderná. Proto byl plazmid pUV2-NLS-EGFP transfekován do myších fibroblastů linie 3T3 s použitím TurboFectu™, buňky byly fixovány 24 h.p.t. a značeny protilátkami proti laminu B pro označení jaderného obalu, BiP (marker ER) pro označení ER, nebo proti histonu H1, aby bylo zjištěno, zda dochází ke kolokalizaci histonu H1 s UV2-NLS-EGFP. Buňky byly následně pozorovány konfokálním mikroskopem Leica TCS SP2. Lokalizace proteinu UV2-NLS-EGFP byla vždy převážně jaderná, pouze nízkou úroveň fluorescence EGFP bylo možné sledovat v cytoplazmě. Protein UV2-NLS-EGFP nekolokalizoval s žádným z použitých buněčných markerů. Typická distribuce proteinu UV2-NLS-EGFP ve srovnání s výše zmíněnými značenými buněčnými proteiny je zobrazena na obr. 5.34. Z analýzy konfokální mikroskopií vyplývá, že samotná unikátní část VP2 tedy nemá, na rozdíl od celého proteinu VP2 a VP3, schopnost interagovat s membránami takovým způsobem, aby byl potlačen jaderný import, závislý na jaderném lokalizačním signálu. Nepotvrdila se rovněž interakce unikátní části VP2 s histonem H1.

105 A – značené ER

B – značený jaderný obal

C – značený histon H1

Obr. 5.34. Subcelulární lokalizace proteinu UV2-NLS-EGFP ve srovnání s BiP (A, marker ER), s laminem B (B, marker laderného obalu) a s histonem H1 (C). Jednotlivé optické řezy konfokálním mikroskopem. Zeleně fluorescence proteinu UV2-NLS-EGFP, červeně výše uvedené buněčné markery. V pravém sloupci je překryv obou signálů. Úsečka = 5 μm.

106 5.4.2. VP2 s deletovanou hydrofóbní doménou 2, fůzovaný s EGFP (VP2ΔD2-EGFP) 3T3 myší fibroblasty byly pomocí TurboFectu™ transfekovány plazmidem pVP2ΔD2-EGFP a 24 h.p.t. fixovány, stejně jako v případě sledování UV2-NLS-EGFP byly značeny protilátkami proti laminu B, BiP a histonu H1 a pozorovány konfokálním mikroskopem Leica TCS SP2. Lokalizace proteinu VP2ΔD2-EGFP byla taktéž vždy převážně jaderná a pouze nízkou úroveň fluorescence EGFP bylo možné sledovat v cytoplazmě. Typická distribuce VP2ΔD2-EGFP ve srovnání s výše zmíněnými značenými proteiny je zobrazena na obr. 5.35. VP2ΔD2-EGFP se nevyskytoval ani na jaderném obalu (nekolokalizoval s laminem B) ani na membránách ER (nekolokalizoval s BiP). Tento protein stejně jako UV2-NLS-EGFP nemá afinitu k intracelulárním membránám. Delece druhé hydrofobní domény (D2) tedy vede ke ztrátě afinity k membránovým strukturám. Zajímavé zjištění bylo učiněno při analýze transfekovaných buněk s použitím protilátky proti histonu H1. V buňkách transfekovaných VP2ΔD2-EGFP nebylo možné histon H1 detekovat, pouze u některých buněk bylo možno pozorovat slabý signál histonu H1 v cytoplazmě. (obr. 5.35 C). Ztráta histonu H1 svědčí o tom, že VP2 s deletovanopu hydrofobní doménou 2 si zachoval cytotoxické vlastnosti, které však souvisí spíše s poškozením buněčného jádra, než s poškozením cytoplazmatických membrán.

5.4.3. VP3 s deletovanou hydrofobní doménou 2, fúzovaný s EGFP (VP3ΔD2-EGFP) Výsledky konfokální mikroskopie myších fibroblastů linie 3T3 transfekovaných plazmidem pVP3ΔD2-EGFP, fixovaných 24 h.p.t, a označených protilátkami jako v předešlých experimentech (kapitoly 5.4.1 a 5.4.2), jsou uvedeny na obr 5.36. Lokalizace proteinu VP3ΔD2- EGFP a její porovnání s lokalizací buněčných markerů byly zcela shodné jako v případě proteinu VP2ΔD2-EGFP. Typická distribuce VP3ΔD2-EGFP ve srovnání s výše zmíněnými značenými proteiny je zobrazena na obr. 5.36. Delece hydrofobní domény v blízkosti N-konce VP3 vede, stejně jako v případě delece D2 proteinu VP2 (VP2ΔD2-EGFP) ke ztrátě afinity k vnitrobuněčným membránovým kompartmentům. V buňkách transfekovaných VP3ΔD2-EGFP nebylo možné detekovat histon H1 nebo byl pozorován výskyt histonu H1 v cytoplazmě, stejně jako v případě VP2ΔD2-EGFP (obr. 5.36 C).

107 A – značené ER

B – značený jaderný obal

C – značený histon H1

Obr. 5.35. Subcelulární lokalizace proteinu VP2ΔD2-EGFP ve srovnání s BiP (A, marker ER), s laminem B (B, marker jaderného obalu) a s histonem H1 (C). V případě značení histonu H1 jsou zobrazeny transfekované i netransfekované buňky. V transfekovaných buňkých byl histon H1 detekován pouze slabě v cytoplazmě (bílá šipka). Jednotlivé optické řezy konfokálním mikroskopem. Zeleně fluorescence proteinu VP2ΔD2-EGFP, červeně výše uvedené buněčné markery. V pravém sloupci je překryv obou signálů. Úsečka = 5 μm.

108 A – značené ER

B – značený jaderný obal

C – značený histon H1

Obr. 5.36. Subcelulární lokalizace proteinu VP3ΔD2-EGFP ve srovnání s BiP (A, marker ER), s laminem B (B, marker laderného obalu) a s histonem H1 (C). U značení histonu H1 jsou zobrazeny transfekované i netransfekované buňky. V transfekovaných buňkých byl histon H1 detekován pouze slabě v cytoplazmě (bílé šipky). Jednotlivé optické řezy konfokálním mikroskopem. Zeleně fluorescence proteinu VP3ΔD2-EGFP, červeně výše uvedené buněčné markery. V pravém sloupci je překryv obou signálů. Úsečka = 5 μm.

109 5.4.4. Sledování lokalizace mutovaných fúzních proteinů s EGFP v živých buňkách Aby bylo možné potvrdit, že proteiny UV2-NLS-EGFP, VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP skutečně nemají afinitu k intracelulárním membránovým kompartmentům, byla pozorována lokalizace těchto proteinů fúzovaných s EGFP v živých buňkách, v nichž byly membrány značeny pomocí DPH (1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien). Myší fibroblasty linie 3T3 byly pomocí TurboFectu™ transfekovány plazmidy pUV2-NLS-EGFP, pVP2ΔD2-EGFP a pVP3ΔD2-EGFP a dále plazmidem pEGFP-N1, produkujícím samotné EGFP, jakožto negativní kontrolou afinity k membránám a pro pozitivní kontrolu plazmidem pVP3-EGFP, neboť protein VP3-EGFP má vysokou afinitu k intracelulárním membránám. Konfokálním mikroskopem Leica TCS SP2 byly pozorovány buňky transfekované plazmidy pUV2-NLS-EGFP, pVP2ΔD2-EGFP, pVP3ΔD2- EGFP a pEGFP-N1 16 h.p.t. a plazmidem pVP3-EGFP 4 h.p.t., vzhledem k vysoké cytotoxicitě proteinu VP3-EGFP. Zatímco v případě proteinu VP3-EGFP byla pozorována silná afinita k vnitrobuněčným membránám (obr. 5.37 A), která do značné míry převážila jaderný import, proteiny UV2-NLS-EGFP, VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP, nesoucí shodnou sekvenci jaderného lokalizačního signálu stejně jako ve fixovaných buňkách vykazovaly převážně jadernou lokalizaci a nezůstávaly asociované s vnitrobuněčnými membránami (obr. 5.37 B, C a D). Tyto pokusy tedy potvrdily důležitost druhé předpovězené hydrofobní domény (D2) pro interakci minoritních proteinů s vnitrobuněčnými membránami. Na obr. 5.37 E je pro srovnání buňka produkující samotné EGFP.

110 A - VP3-EGFP

B - UV2-NLS-EGFP

C - VP2ΔD2-EGFP

D - VP3ΔD2-EGFP

E - EGFP

Obr. 5.37. Lokalizace mutovaných proteinů fúzovaných s EGFP v živých myších fibroblastech linie 3T3. Jednotlivé optické řezy konfokálním mikroskopem. Zeleně fluorescence proteinů fúzovaných s EGFP, modře membrány, obarvené 1,6-difeny-1,3,5-hexatrienem. Ve třetím sloupci je překryv obou signálů. Grafy v pravém sloupci znázorňují profil intenzity modrého a zeleného signálu, který byl měřen ve směru žluté šipky, znázorněné na obrázcích překryvu obou signálů. Úsečka = 5 μm.

111 6. DISKUSE 6.1. Studium izoforem VP2 a VP3 MPyV Výskyt dvou izoforem VP2 a VP3 zmiňuje již studie GIBSON, 1974. Shodně s výsledky této diplomové práce popisuje detekci dvou podtypů VP2 a VP3, z nichž forma o vyšší elektroforetické mobilitě je zastoupena výrazněji než forma o nižší mobilitě (obr. 6.1.). Dále uvádí, že formy VP2 a VP3 o nižší mobilitě nebyly v čase 48 h.p.i. detekovány v buněčných lyzátech infikovaných buněk (linie BMK – baby mouse kidney), zatímco ve virionech izolovaných pomocí izopyknické ultracentrifugace v CsCl gradientu detekovány byly. Autor této studie tento jev vysvětluje jako možný důsledek maturace virionů MPyV. Sledování výskytu izoforem VP2 a VP3 v průběhu infekčního cyklu, prezentované v této diplomové práci (kap. 5.2.1.), vedlo k odlišnému závěru. V čase 36 h.p.i. byla na western blotu lyzátů infikovaných NIH 3T6 myších fibroblastů detekována pouze izoforma VP2 a VP3 s vyšší mobilitou, avšak v čase 48 h.p.i. již byly detekovány obě izoformy VP2 i VP3. Rozdílný výsledek oproti práci GIBSON, 1974 může být způsoben použitím odlišné buněčné linie či odlišného kmene MPyV. Žádná pozdější práce se výskytem izoforem VP2 a VP3 nezabývá v takové míře, jako GIBSON, 1974, nicméně i tak lze z některých prací vypozorovat určité poznatky. Např. ve studii KRAUZEWICZ et al., 1990 je na SDS-PAGE proteinů virionů MPyV detekován VP2 pomocí značení 3H myristovou kyselinou a na výsledné autoradiografii je viditelný dvojitý proužek VP2 (obr. 6.2.). Izoformy VP2 se tedy neliší myristylací. Tento závěr je také podporován skutečností, že dvojice izoforem se vyskytuje také u proteinu VP3. Rozdíl mezi nimi je tedy způsoben buď posttranslační modifikací ve společné části VP2 a VP3, nebo proteolytickým štěpením na C-konci obou proteinů.

Obr. 6.2. Podtypy VP2 se neliší Obr. 6.1. Podtypy VP2 a VP3 myristylací. Autoradiografie o odlišné lektroforetické mobilitě. VP2 elektroforetické separace proteinů je zde označen jako 3a, 3b, VP3 jako 4a, virionů myšího polyomaviru 4b. 1 – dimer VP1 spojený značeného pomocí 3H myristové disulfidickým můstkem, 2 – VP1, kyseliny (vlevo prázdné kapsidy, 5 – 7 – histony (převzato z GIBSON, vpravo viriony) (převzato 1974). z KRAUZEWICZ et al., 1990).

113 Ke vzniku izoforem VP2 a VP3 dochází také v heterologních expresních systémech. Dublety VP2 je možné detekovat na SDS-PAGE při produkci VP2 bakulovirovým expresním systémem v hmyzích buňkách (FORSTOVÁ et al., 1993) i při produkci VP2 fúzovaného s thioredoxinem v bakteriích (JIRÁSKO, 2006). Izolace VLPs produkovaných bakulovirovým expresním systémem obecně vede k vyšším výtěžkům a čistotě vzorku, než izolace virionů MPyV z kultury myších buněk. VLPs, složené z VP1 a VP2 (VP1/VP2) nebo VP1 a VP3 (VP1/VP3), by tedy mohly být s výhodou využity k MS analýze izoforem VP2 a VP3. Při pokusech o separaci izoforem VP2 a VP3 z VLPs složených z VP1/VP2 nebo VP1/VP3 se však ukázalo, že izoformy VP2 a VP3 s nižší elektroforetickou mobilitou jsou oproti izoformám s vyšší mobilitou přítomny ve značně malém množství a nedařilo se je vzájemně dostatečně separovat. (viz kap. 5.2.3) Z tohoto důvodu nebyly VLPs pro MS analýzu využity. Používány byly separované proteinové izoformy z izolovaných virionů MPyV. V rámci této diplomové práce byly provedeny čtyři izolace MPyV. Pomocí ultracentrifugace v rovnovážném gradientu CsCl byly vždy odděleny viriony MPyV od prázdných kapsid. Tyto prázdné kapsidy jsou při izolacích MPyV vždy přítomny a předpokládá se, že jsou vedlejším produktem, vznikajícím při produkci strukturních proteinů MPyV infikovanými buňkami. Frakce prázdných kapsid však převážně nebylo možné pro MS analýzu využít, protože obsahovaly velké množství kontaminujících proteinů. Frakce virionů byly vždy izolovány pro MS analýzu v dostatečné čistotě. Nejvhodnějším způsobem separace proteinů z virionů MPyV, umožňujícím dobré rozlišení izoforem VP2 a VP3, se ukázala být běžná SDS-PAGE s diskontinuálním uspořádáním a 10% separačním polyakrylamidovým gelem. Gely byly barveny pomocí Coomassie Brilliant Blue (viz kap. 5.2.2). Pomocí MS analýzy bylo nejprve ověřeno, zda není rozdíl mezi izoformami VP2 a VP3 způsoben proteolytickým štěpením na společném C-konci. MALDI-TOF analýza, provedená P. Jedelským (Laboratoř hmotnostní spektrometrie biologické sekce PřF UK), tuto možnost vyloučila, neboť byl detekován intaktní C-konec u obou izoforem VP2 i VP3 (viz kap. 5.2.4). Z toho výsledku vyplývá, že rozdíl mezi izoformami obou minoritních kapsidových proteinů je pravděpodobně způsoben posttranslační modifikací. P. Manem (Laboratoř charakterizace molekulární struktury MBÚ AVČR) byly následně prováděny pokusy o vyhledání posttranslačních modifikací VP2 a VP3 pomocí MALDI-TOF. Touto metodou byla zjištěna acetylace N-koncového alaninu, která byla potvrzena pomocí MS/MS. Methionin, translatovaný z iniciačního kodónu obou forem proteinu VP3 je tedy před touto modifikací odštěpen. K acetylaci N-koncové aminokyseliny dochází v savčích buňkách u ~80% proteinů. Jedná se o modifikaci, ke které dochází kotranslačně, je ireverzibilní a je katalyzována N-terminálními acetyltransferázami. Pouze u velmi malého množství proteinů byla pro N-koncovou acetylaci nalezena nějaká funkce. Nejznámějším příkladem je aktin, u kterého N-koncová acetylace

114 napomáhá sestavování do mikrofilament a interakci s tropomyozinem. (MOGK a BUKAU, 2010, review) V zcela čerstvé studii HWANG et al., 2010, bylo na kvasinkovém modelu ukázáno, že N-koncová acetylace proteinů tvoří „podmínečný degron“, tj. signál pro rozpoznání proteinu ubiquitin ligázami pro jejich následnou proteazomální degradaci. Rozpoznání tohoto signálu je podmíněno přístupností N-konce daného proteinu ubiquitin ligáze. K nepřístupnosti acetylovaného N-konce ubiquitin ligáze podle hypotézy autorů dochází při zaujetí správné konformace daného proteinu, stabilní vazbou přirozených interakčních partnerů v multiproteinovém komplexu, nebo navázáním „protektivního“ chaperonu. Je tedy pravděpodobné, že fyziologickými funkcemi N-koncové acetylace proteinů jsou kontrola správných konformací proteinů a zajištění správné stechiometrie proteinů, vyskytujících se v multiproteinových komplexech. (HWANG et al., 2010) Takovýto způsob regulace degradace proteinů a jejich obratu v metabolismu eukaryotické buňky představuje tzv. „všeobecnou proteolýzu“, jeho opakem je již dříve popsaná „regulovaná proteolýza“, u které dochází k rozpoznání proteinu ubuquitin ligázami mj. vlivem výskytu „destabilizující“ aminokyseliny na N-konci. Destabilizujícími jsou bazické aminokyseliny (arginin, histidin, lyzin) a velké hydrofobní aminokyseliny (leucin, izoleucin, fenylalanin, tryptofan, threonin). Takovéto aminokyseliny se však na úplném N-konci proteinů nevyskytují, protože pokud následují za iniciačním methioninem, není methionin odštěpen methionin aminopeptidázou a zůstává na N-konci daného proteinu. Aby došlo k výskytu destabilzující aminokyseliny na N-konci proteinu, musí tedy buď dojít k proteolytickému štěpení, kterým se destabilizující aminokyselina dostane na N-konec, nebo k enzymatické úpravě N-konce. (MOGK a BUKAU, 2010, review) Sekundární a terciární struktura převážné části proteinů VP2 a VP3 není známa (viz kap. 2.2.1.2, obr. 2.7). Uvádí se však, že VP2 i VP3 vykazují značnou flexibilitu a jsou tedy do značné míry nestrukturované (CHEN et al., 1998). Tato skutečnost ostatně může přispívat k předpokládanému rozpoznání těchto proteinů kaskádou ERAD v průběhu vstupu do buňky (viz kap. 2.2.3.2) Při vzniku komplexu pentamerů VP1 s VP2 nebo VP3 pravděpodobně zůstává určitý podíl volných molekul VP2 a VP3. V souladu s hypotézou HWANGA et al., 2010, je tedy možné, že N-koncový acetyl volných VP3 je přístupný ubiquitin ligázám, zatímco VP3, navázané do komplexu s pentamery VP1 zůstávají chráněny. Tímto mechanismem může být zabráněno proteinu VP3 v poškozování intracelulárních membrán a v související indukci apoptózy v průběhu replikačního cyklu viru (viz kap. 2.2.3.8). Ostatně práce HUÉRFANO et al., 2010, uvádí, že VP2 a VP3 nemají při infekci MPyV podstatný vliv na míru cytotoxických efektů v pozdní fázi infekce. Způsob, jakým by mohla být regulována cytotoxicita proteinu VP2, však není známa.

115 Další posttranslační modifikace VP2 a VP3 se pomocí MALDI-TOF zatím nepodařilo určit. Problémem se ukázala být nevhodná délka peptidických fragmentů, vznikajících při štěpení VP2 a VP3 proteázami. Následkem toho nebyla při MS analýze pokryta celá sekvence proteinů (viz kap. 5.2.5). V dalších expreimentech proto budou požity kombinace různých proteáz. Pokusy o zjištění rozdílu v molekulových hmotnostech intaktních izoforem VP2 a VP3 pomocí FT-ICR se zatím taktéž nezdařily (viz kap. 5.2.5.3). V pracích PONDER et al., 1977 a BOLEN et al., 1981 byla pomocí značení 32P zjištěna fosforylace VP2 a VP3, není však známo, které aminokyseliny jsou fosforylovány a zda je fosforylována jedna či více aminokyselin VP2 a VP3. Projevem fosforylace proteinů je výskyt izoforem při izoelektrické fokusaci a 2D elektroforéze. Pro zjištění počtu izoforem VP2 a VP3, lišících se svým pI proto byly provedeny 2D elektroforézy strukturních proteinů virionů MPyV. Na gelech obarvených pomocí CBB byly detekovány 4 izoformy VP2 a VP3. Při detekci VP2 a VP3 pomocí western blotu 2D elektroforézy byla zjištěna existence dalších izoforem, které nebylo možné detekovat barvením pomocí CBB (viz kap. 5.2.6) V případě proteinu VP2 bylo možné pozorovat „vláček“ sedmi izoforem směrem k acidickému pI. Tento jev je pravděpodobně pouze artefakt a lze jej vysvětlit karbamylací lyzinů v přítomnosti močoviny (tzv. „carbamylation train“, MCCARTHY et al., 2003).

V prvním předběžném pokuse o nabohacení fosfopeptidů na kolonkách s TiO2 a následnou MS analýzu byly detekovány fosfopeptidy pouze u izoformy VP2 z vyšší mobilitou a nikoli u izoformy VP2 s nižší mobilitou. Tento výsledek je pouze předběžný a pokus bude potřeba zopakovat, protože detekované fosfopeptidy se na základě molekulové hmotnosti nepodařilo přiřadit k sekvenci VP2. Pokud je rozdíl mezi izoformami VP2 a VP3 způsoben fosforylací (vzhledem k několika izoformám VP2 a VP3 na 2D elektroforéze můžou být VP2 a VP3 fosforylovány na více aminokyselinách) a potvrdí se, že fosforylována je izoforma s vyšší mobilitou, je možné, že rozdíl v mobilitě izoforem VP2 a VP3 je způsoben rozdílem náboje. Fosfoskupina udává proteinu silný záporný náboj, čímž může přispět k zvýšení mobility proteinu při SDS-PAGE. Zvýšení molekulové hmotnosti proteinu o jednu fosfoskupinu činí jen ~80 Da, je tedy možné, že v případě VP2 a VP3 vliv změny náboje na mobilitu převažuje nad vlivem změny molekulové hmotnosti. V souvislosti s tím lze výsledek sledování výskytu izoforem v průběhu infekčního cyklu MPyV (kap. 5.2.1) interpretovat jako neschopnost hostitelských kináz v pokročilé fázi infekčního cyklu fosforylovat všechny syntetizované VP2 a VP3, zatímco v čase 36 h.p.i. byla zachycena fáze, kdy byla exprese VP2 a VP3 ještě nízká a všechny detekované VP2 a VP3 byly fosforylované. Na western blotu byly kvůli tomu detekovány jen izoformy VP2 a VP3 s vyšší mobilitou. Predikce fosforylací VP2 a VP3 pomocí programu „NetPhosK 1.0“ (BLOM et al., 2004, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/) vedla k výsledku, kdy pouze čtyři pozice na sekvenci VP2 (a jim odpovídající tři pozice na sekvenci VP3) měly pravděpodobnostní

116 hodnotu vyšší než 0,6 (přičemž maximum je 1, minimum je 0) a ve všech případech se jednalo o sekvence rozpoznávané protein kinázou C (tab. 6.1). Tuto predikci je však potřeba brát se značnou rezervou.

pozice kináza score Thr 179 (Thr 64) PKC 0,850 Thr 72 PKC 0,750 Ser 154 (Ser 39) PKC 0,670 Tab. 6.1. Predikce fosforylace aminokyselin proteinů VP2 a VP3 Ser 221 (Ser 106) PKC 0,614 na základě jejich aminokyselinové sekvence pomocí programu NetPhosK 1.0. Ve sloupci „Pozice“ je uvedena aminokyselina a její Thr 46 CKI 0,580 pořadí v sekvenci proteinu VP2 (v závorce je uvedeno pořadí Thr 183 (Thr 68) PKA 0,572 v sekvenci proteinu VP3 – při zadání sekvence proteinu VP3 do programu vyšly u těchto aminokyselin shodné hodnoty jako při Tyr 67 Src 0,558 zadání sekvence VP2). Zkratky kináz: PKC – protein kináza C, CKI Ser 94 PKC 0,534 – casein kináza I, PKA – protein kináza A. Pozice jsou seřazeny podle programem vypočteného „score“ (hodnoty pravděpodobnosti Thr 22 cdc2 0,533 dané fosforylace, maximum je 1, minimum 0). Uvedeno je pouze Thr 6 PKC 0,527 prvních 10 výstupů.

S ohledem na uvedené výsledky je nutné zmínit studii FANG et al., 2010, která byla publikována v závěru dokončování této diplomové práce. Autoři zde popisují detailní analýzu posttranslačních modifikací strukturních proteinů lidského polyomaviru BK. Stejně jako v případě práce provedené P. Manem bylo využito několik proteáz ke štěpení kapsidových proteinů VP1, VP2 a VP3. Vzniklé štěpy byly následně analyzovány pomocí spojení kapalinové chromatografie a tandemové hmotnostní spektrometrie. Autoři popisují až zarážející množství modifikací počínaje oxidacemi a konče fosforylacemi. Řada z popisovaných modifikací je však obecně považována za artefakty přípravy vzorku, což v článku není vůbec diskutováno. Např. oxidace a dioxidace methioninu, tryptofanu a histidinu je klasickým příkladem modifikace vznikající v průběhu přípravy vzorku přítomností vzdušného kyslíku. Další modifikace, formylace, taktéž není považována za typ posttranslační modifkace, mající funkční význam. V metodice je popsáno, že extrakce peptidů z gelu je prováděna v 5% kyselině mravenčí a následná MS/MS analýza je prováděna za přítomnosti 0,1% kyseliny mravenčí. Takovéto prostředí může velmi snadno vést, zejména při delším skladování vzorku, k formylaci. Modifikace typu oxidace kyseliny asparagové (Asp 30 u VP3) a karboxymethylace a ethylace či methylthiolace jsou popsány buď jako chemické modifikace nebo modifikace objevující se za patologických stavů buňky a při stárnutí. Obecně je v článku snaha prezentovat veškeré nalezené modifikace jako funkční, ale není zde vůbec diskutováno, ani že se může jednat o artefakty, ani jak by bylo případně tvorbě možných artefaktů zabránit (práce v ochranné atmosféře dusíku či argonu, nahrazení kyseliny mravenčí kyselinou octovou, atd.). V neposlední řadě pak nelze opomenout fakt, že protein modifikovaný do té míry jak je v práci prezentováno, by pravděpodobně měl značně narušenou strukturu a byl proto velmi nestabilní. Jelikož není

117 v článku detailně uvedeno nastavení vyhledávacího algoritmu (zejména z pohledu vyhodnocení věrohodnosti daných přiřazení) a řada z prezentovaných MS/MS spekter je velmi sporných, nelze se ubránit domněnce zda takto nalezené modifikace nejsou jen chybná přiřazení. Je totiž známým faktem že čím více možných modifikací se vyhledávacím programům zadá, tím více se zvyšuje počet falešně pozitivních identifikací nesoucích zadané modifikace. (P. Man, osobní sdělení, NIELSEN et al., 2006) Ve shodě s výsledky MS analýz provedených P. Manem, FANG et al., 2010, uvádějí acetylaci na N-konci VP3, avšak nikoli na N-koncovém alaninu, ale na na neodštěpeném methioninu. Podle HWANG et al., 2010, methionin stejně jako alanin patří mezi aminokyseliny, které jsou často acetylovány, pokud se nacházejí na N-konci, a acetylace u methioninu plní stejnou funkci jako u alaninu (viz výše). FANG et al., 2010, dále uvádějí fosforylaci tří serinů VP2 a jednoho serinu VP3 BK viru. Z nich pouze serin 223 VP2 BK viru svou pozicí odpovídá serinu 220 VP2 MPyV, další fosforylované seriny minoritních kapsidových proteinů BK viru nemají u MPyV svůj protějšek.

6.2. Deleční varianty VP2 a VP3, fúzované s EGFP Tato část diplomé práce navazuje na práci HUÉRFANO et al., 2010, provedené nedávno v naší laboratoři. V této práci bylo zjištěno, že fúzní proteiny VP2-EGFP a VP3-EGFP při své samostatné produkci v savčích buňkách (tj. v nepřítomnosti VP1) vykazují podobné vlastnosti, jako wt VP2 a VP3, tedy afinitu k intracelulárním membránám a vysokou cytotoxicitu. Oproti tomu opačně orientované fúzní proteiny EGFP-VP2 a EGFP-VP3 afinitu k intracelulárním membránám nemají a jejich cytotoxicita je výrazně nižší. Zkrácená forma VP3 (delece prvních 101 aminokyselin, zahrnující předpokládanou hydrofobní doménu na N-konci VP3) fúzovaná k EGFP oběma způsoby (tVP3-EGFP a EGFP-tVP3) je jen mírně cytotoxická (srovnatelně se samotným EGFP). Tyto výsledky dohromady naznačují, že pro afinitu k intracelulárním membránám a související cytotoxicitu je buď nutný volný N-konec VP2 a VP3 a/nebo jejich předpokládaná hydrofobní doména 2 (viz kap. 2.2.3.2), kterou tVP3-EGFP neobsahuje. (HUÉRFANO et al., 2010) Pro ověření této hypotézy je v současné době v naší laboratoři připravována dodatečná série delečních mutant těchto fúzních proteinů. V rámci této diplomové práce byly připraveny plazmidy pro expresi tří různých mutovaných fúzních proteinů v savčích buňkách. Protein UV2-NLS-EGFP obsahuje unikátní část proteinu VP2 (tj. i v ní obsaženou předpokládanou hydrofobní doménu 1), jaderný lokalizační signál (aby bylo ověřeno, zda je takovýto protein i přes přítomnost jaderného lokalizačního signálu zadržován na cytoplazmatických membránách, či nikoliv) a EGFP. Proteiny VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP jsou uspořádáním shodné s proteiny VP2-EGFP a VP3-EGFP, jejich předpokládaná hydrofobní doména 2 (počítáno od začátku VP2 jsou to aminokyseliny 126 – 165, počítáno od začátku VP3 aminokyseliny 7 – 46) je však deletována.

118 Exprese proteinů UV2-NLS-EGFP, VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP byla ověřena nejprve detekcí těchto proteinů western blotem lyzátů transfekovaných buněk. Na western blotech byly detekovány proteiny o odpovídající molekulové hmotnosti, avšak také další proteiny s nižší molekulovou hmotností, pravděpodobně degradační produkty. Konfokální mikroskopií fixovaných transfekovaných buněk, značených pomocí protilátky proti společné části proteinů VP2 a VP3, byl prokázán překryv fluorescence mutovaných proteinů, fúzovaných s EGFP, s fluorescencí proteinů označených protilátkami. V případě proteinu UV2-NLS-EGFP nebylo možné provést značení protilátkou, protože protilátku proti unikátní části VP2 se dosud nepodařilo připravit. Jaderná lokalizace tohoto proteinu je však důkazem, že dochází k expresi tohoto fúzního proteinu s jaderným lokalizačním signálem, neboť samotný EGFP se vyskytuje v cytoplazmě i jádře. Při tranzientní expresi v myších fibroblastech byly všechny tři mutované proteiny detekovány převážně v jádrech buněk. Nebyla u nich nikdy pozorována kolokalizace s markery ER a jaderného obalu. Stejně tak v živých buňkách, produkujících tyto proteiny, nebyla pozorována kolokalizace s membránovými strukturami, obarvenými pomocí DPH. Z těchto výsledků vyplývá, že předpokládaná hydrofobní doména 1, obsažená v unikátní části VP2, kterou obsahují fúzní proteiny UV2-NLS-EGFP a VP2ΔD2-EGFP, nepostačuje k zadržování těchto proteinů na intracelulárních membránových strukturách. Delece předpokládané hydrofobní domény 2 u fúzních proteinů VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP vede ke ztrátě afinity k vnitrobuněčným membránám. Třetí hydrofobní doména proteinů VP2 a VP3, C-koncový hydrofobní α-helix, zodpovědný za interakci s proteinem VP1, je deletována u fúzního proteinu VP3ΔHX-EGFP (plazmid pVP3ΔHX-EGFP byl připraven V. Žílou). Konfokální mikroskopií buněk produkujících tento fúzní protein byla pozorována kolokalizace VP3ΔHX-EGFP s markery ER a jaderného obalu. Delece třetí hydrofobní domény VP2/VP3 tedy nevede ke ztrátě afinity k intracelulárním membránám. (V. Žíla, osobní sdělení) Tento výsledek je podpořen také vlastnostmi proteinu tVP3-EGFP, který obsahuje pouze třetí hydrofobní doménu a nemá afinitu k vnitrobuněčným membránami. Pro potvrzení vlastností proteinů UV2-NLS-EGFP, VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP a dalších proteinů z této série delečních mutant bude dále v budoucnu potřeba provést charakterizaci jejích cytotoxicity obdobným způsobem, jako v práci HUÉRFANO et al., 2010. Předběžné měření cytotoxicity proteinu VP3ΔHX-EGFP dále ukazuje, že tento protein je cytotoxický srovnatelným způsobem jako proteiny VP2-EGFP a VP3-EGFP, zatímco protein UV2-NLS- EGFP je pouze málo cytotoxický. Celkově lze tedy učinit závěr, že k afinitě k membránovým strukturám a s ní pravděpodobně související cytotoxicitě je nutná sekvence předpokládané hydrofobní domény 2. Přehled všech fúzních variant proteinů VP2 a VP3 i všech studovaných delečních mutant a jejich prozatím zjištěných vlastností je shrnut v tab. 6.2.

119 K produkci těchto fúzních proteinů dochází k cytoplazmě, a v případě VP2-EGFP a VP3-EGFP dochází k vazbě k intracelulárním membránovým strukturám z cytoplazmatické strany. Tím se tyto proteiny zásadním způsobem liší od VP2 a VP3, obsažených ve virových částicích, vstupujících do infikovaných buněk. Zda je předpokládaná hydrofobní doména 2 VP2/VP3 zodpovědná za interakci s hostitelskými membránami také po vstupu viru do buňky, tj. „z druhé strany“ membránových kompartmentů, bude potřeba v budoucnu ověřit také pomocí virové deleční mutanty, neboť vlastnosti prostředí lumen endozómů a ER se od vlastností prostředí cytoplazmy v mnoha ohledech liší. Problémem je, že mutace VP2 a VP3 je nutno provést tak, aby nezamezovaly vazbě minoritních strukturních proteinů s pentamery VP1. V takovém případě by nebyly mutované VP2 a VP3 začleněny do kapsidy. V případě delecí hydrofobních domén 1 a 2 bude pravděpodobně možné takovou mutaci provést, delecí třetí hydrofobní domény, která je zodpovědná za inerakci VP2 a VP3 s VP1, by však tento problém nastal.

PROTEIN CYTOTOXICITA AFINITA K MEMBRÁNÁM EGFP-VP2 nízká ne

EGFP-VP3 nízká ne

EGFP-tVP3 velmi nízká ne

VP2-EGFP vysoká ano

VP3-EGFP vysoká ano

tVP3-EGFP velmi nízká ne

UV2-NLS-EGFP nízká* ne

VP2ΔD1-EGFP ? ?

VP2ΔD2-EGFP ? ne

VP3ΔD2-EGFP ? ne

VP2ΔHX-EGFP ? ?

VP3ΔHX-EGFP vysoká* ano

Tab. 6.2. Přehled variant VP2 a VP3 MPyV fúzovaných s EGFP, připravených v naší laboratoři a plánovaných, a jejich vlastností. * = předběžné výsledky, ? = dosud nebylo provedeno/připraveno. Modře je vyznačena unikátní část proteinu VP2 (D1 = předpokládaná hydrofobní doména 1), žlutě společná část VP2 a VP3 (D2 = předpokládaná hydrofobní doména 2; HX = C-koncový hydrofobní α-helix; NLS – jaderný lokalizační signál) a zeleně EGFP.

120 BOUŘA, 2004, ve své diplomové práci uvádí, že u buněk produkujících fúzní protein VP2- EGFP docházelo ke kolokalizaci histonu H1 s proteinem VP2-EGFP a „zmizení“ histonu H1 z jádra. Proto byl pro konfokální mikroskopii buněk produkující fúzní proteiny UV2-NLS- EGFP, VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP značen nepřímou fluorescencí také histon H1. V případě buněk produkujících protein UV2-NLS-EGFP takovýto jev nebyl pozorován, avšak u většiny buněk produkujících proteiny VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP nebyla v čase 24 h.p.t. detekována přítomnost histonu H1 v jádrech. PLEVKA, 2002, uvádí, že u části buněk v pozdní fázi infekce MPyV dochází k tvorbě vláken proteinu VP1, která kolokalizují mj. S jaderným cytoskeletem. V těchto buňkách taktéž nebyl detekován histon H1. Je tedy možné, že pokud dojde k narušení jaderného obalu, není možné detekovat histon H1 vlivem jeho následné degradace. K transportu histonu H1 do cytoplazmy dále dochází při poškození chromozomální DNA ozářením v závislosti na p53 (KONISHI et al., 2003) a je jedním z obecných projevů apoptózy (WU et al., 2002, GINÉ et al., 2008). Jev „zmizení“ histonu H1 v buňkách produkujících proteiny VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP by mohl být interpretován jako projev určité cytotoxicity těchto proteinů, nezávislý na interakci těchto proteinů s membránovými strukturami. Prozatím však zůstává nevysvětlen a v budoucnu jej bude zapotřebí dále studovat.

121 7. SOUHRN Souhrn výsledků této diplomové práce lze podle stanovených cílů rozdělit na dvě části:

Objasnění příčiny výskytu a vlastností izoforem minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru, detekovaných proteinovou elektroforézou jako dvojité proužky: • Zastoupení obou izoforem proteinů VP2 a VP3 bylo sledováno v různých časech po infekci. Bylo zjištěno, že izoformy s nižší elektroforetickou mobilitou vznikají až ve velmi pozdní fázi infekce, zřejmě během morfogeneze virionů. • Byly provedeny izolace virionů MPyV a nalezeny podmínky pro dostatečnou separaci izoforem proteinů VP2 a VP3 z lyzátů izolovaných virionů na SDS-PAGE. • Elektroforeticky rozdělené izoformy VP2 a VP3 byly použity pro analýzu hmotnostní spektrometrií. • Pomocí MALDI-TOF analýzy (P. Jedelský) bylo zjištěno, že rozdílu mezi izoformami VP2 a VP3 není způsoben proteolytickým štěpením. • MALDI-TOF analýza (P. Man) prokázala, že N-koncový alanin obou izoforem proteinu VP3 je acetylovaný. • Na 2D elektroforéze obarvené CBB byly detekovány 4 izoformy u proteinů VP2 a VP3, lišící se svým pI. Western blot 2D elektroforéz odhalil přítomnost dalších izoforem VP2 a VP3, které nebylo možné detekovat na gelu obarveném pomocí CBB. Předběžné výsledky P. Mana ukazují, že pouze jedna ze dvou izoforem VP2, rozdělených na SDS- PAGE, je fosforylovaná.

Příprava expresních plazmidů pro produkci delečních mutant VP2 a VP3 myšího polyomaviru (fúzovaných k N-konci EGFP) v savčích buňkách pro srovnání jejich vlastností s dříve připravenými a charakterizovnými variantami VP2 a VP3, fúzovanými k N-konci či C-konci EGFP: • Byly konstruovány tři expresní plazmidy pro produkci delečních mutant VP2 a VP3 v myších buňkách: ◦ pUV2-NLS-EGFP pro produkci fúzního proteinu, sestávajícího se z unikátní části VP2, jaderného lokalizačního signálu a EGFP, ◦ pVP2ΔD2-EGFP pro produkci fúzního VP2 s deletovanou předpokládanou transmembránovou doménou 2, ◦ pVP3ΔD2-EGFP pro produkci fúzního VP3, rovněž s deletovanou předpokládanou transmembránovou doménou 2. • Konfokální mikroskopií ve spojení s imunofluorescenčním značením buněčných proteinů a konfokální mikroskopií živých buněk s membránami obarvenými pomocí

123 DPH nebyla pozorována afinita těchto delečních mutant VP2 a VP3 k vnitrobuněčným membránám, z čehož lze vyvodit, že předpokládaná transmembránová doména 2 je důležitá pro interakci proteinů VP2 a VP3 s buněčnými membránami. • V jádrech buněk produkujících proteiny VP2ΔD2-EGFP a VP3ΔD2-EGFP nebyl detekován histon H1, podobně jako u buněk produkujících intaktní VP2 a VP3, což naznačuje, že tyto mutované proteiny si i přes patrnou ztrátu afinity k membránám uchovaly cytotoxické vlastnosti.

124 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Adami, G.R., Marlor, C.W., Barrett, N.L., Carmichael, G.G. (1989): Leader-to-leader splicing is required for efficient production and accumulation of polyomavirus late mRNAs. J. Virol. 63(1):85-93.

Agosto, M.A., Ivanovic, T., Nibert, M.L. (2006): Mammalian reovirus, a nonfusogenic nonenveloped virus, forms size-selective pores in a model membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(44):16496-501.

Agosto, M.A., Myerxs, K.S., Ivanovic, T., Nibert, M.L. (2008): A positive-feedback mechanism promotes reovirus particle conversion to the intermediate associated with membrane penetration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105(30):10571-6.

Acheson, N.H. (1978): Polyoma virus giant RNAs contain tandem repeats of the nucleotide sequence of the entire viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75(10):4754-8.

Allander, T., Andreasson, K., Gupta, S., Bjerkner, A., Bogdanovic, G., Persson, M.A., Dalianis, T., Ramqvist, T., Andersson, B. (2007): Identification of a third human polyomavirus. J. Virol. 81(8):4130-6.

An, K., Fattaey, H.K., Paulsen, A.Q., Consigli, R.A. (2000): Murine polyomavirus infection of 3T6 mouse cells shows evidence of predominant necrosis as well as limited apoptosis. Virus Res. 67(1):81-90.

An, K., Gillock, E.T., Sweat, J.A., Reeves, W.M., Consigli, R.A. (1999): Use of the baculovirus system to assemble polyomavirus capsid-like particles with different polyomavirus structural proteins: analysis of the recombinant assembled capsid-like particles. J. Gen. Virol. 80(4):1009-16.

Anders, D.G., Consigli, R.A. (1983): Comparison of nonphosphorylated and phosphorylated species of polyomavirus major capsid protein VP1 and identification of the major phosphorylation region. J. Virol. 48(1):206-17.

Arias, C.F., Iša, P., Guerrero, C.A., Méndez, E., Zárate, S., López, T., Espinosa, R., Romero, P., López, S. (2002): Molecular biology of rotavirus cell entry. Arch. Med. Res. 33(4):356-61.

Ashok, A., Atwood, W.J. (2003): Contrasting roles of endosomal pH and the cytoskeleton in infection of human glial cells by JC virus and simian virus 40. J. Virol. 77(2):1347-56.

Auger, K.R., Carpenter, C.L., Shoelson, S.E., Piwnica-Worms, H., Cantley, L.C. (1992): Polyoma virus middle T antigen-pp60c-src complex associates with purified phosphatidylinositol 3-kinase in vitro. J. Biol. Chem. 267(8):5408-15.

Baker, T.S., Caspar, D.L., Murakami, W.T. (1983): Polyoma virus 'hexamer' tubes consist of paired pentamers. Nature. 303(5916):446-8.

Barouch, D.H., Harrison, S.C. (1994): Interactions among the major and minor coat proteins of polyomavirus. J. Virol. 68(6):3982-9.

Batt, D.B., Rapp, L.M., Carmichael, G.G. (1994): Splice site selection in polyomavirus late pre-mRNA processing. J. Virol. 68(3):1797-804.

Bauer, P.H., Cui, C., Liu, W.R., Stehle, T., Harrison, S.C., DeCaprio, J.A., Benjamin, T.L. (1999): Discrimination between sialic acid-containing receptors and pseudoreceptors regulates polyomavirus spread in the mouse. J. Virol. 73(7):5826-32.

126 Berns K., Parrish, C.R. (2007): Parvoviridae. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (eds.): Fields Virology. Fifth Edition, Lippincott Wiliams & Wilkins, Philadelphia, 2437-77.

Bienkowska-Haba, M., Patel, H.D., Sapp, M. (2009): Target cell cyclophilins facilitate human papillomavirus type 16 infection. PLoS Pathog. 5(7):e1000524.

Birnboim, H.C., Doly, J. (1979): A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7(6):1513-23.

Blaustein, R.O., Koehler, T.M., Collier, R.J., Finkelstein, A. (1989): Anthrax toxin: channel- forming activity of protective antigen in planar phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86(7):2209-13.

Blom, N., Sicheritz-Pontén, T., Gupta, R., Gammeltoft, S., Brunak, S. (2004): Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence. Proteomics. 4(6):1633-49.

Bolen, J.B., Anders, D.G., Trempy, J., Consigli, R.A. (1981): Differences in the subpopulations of the structural proteins of polyoma virions and capsids: biological functions of the multiple VP1 species. J. Virol. 37(1):80-91.

Bong, D.T., Janshoff, A., Steinem, C., Ghadiri, M.R. (2000): Membrane partitioning of the cleavage peptide in flock house virus. Biophys. J. 78(2):839-45.

Bong, D.T., Steinem, C., Janshoff, A., Johnson, J.E., Reza Ghadiri M. (1999): A highly membrane-active peptide in Flock House virus: implications for the mechanism of nodavirus infection. Chem. Biol. 6(7):473-81.

Bouřa, E. (2004): Studium minoritních strukturních proteinů myšího polyomaviru. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

Brady, J.N., Wihnston, V.D., Consigli, R.A. (1977): Dissociation of polyoma virus by chlelation of calcium ions found associated with purified virions. J. Virol. 23:717-724.

Brodsky, J.L., Pipas, J.M. (1998): Polyomavirus T antigens: molecular chaperones for multiprotein complexes. J. Virol. 72(7):5329-34. Review.

Buck, C.B., Cheng, N., Thompson, C.D., Lowy, D.R., Steven, A.C., Schiller, J.T., Trus, B.L. (2008): Arrangement of L2 within the papillomavirus capsid. J. Virol. 82(11):5190-7.

Burns, J.W., Greenberg, H.B., Shaw, R.D., Estes, M.K. (1988): Functional and topographical analyses of epitopes on the hemagglutinin (VP4) of the simian rotavirus SA11. J. Virol. 62(6):2164-72.

Burton, K.S., Consigli, R.A. (1996): Methylation of the polyomavirus major capsid protein VP1. Virus Res. 40(2):141-7.

Butin-Israeli, V., Drayman, N., Oppenheim, A. (2010): Host-virus interactions: SV40 infection triggers balanced network that includes apoptotic, survival and stress pathways. J. Virol. 84(7):3431-42.

Cai, X., Chang, D., Rottinghaus, S., Consigli, R.A. (1994): Expression and purification of recombinant polyomavirus VP2 protein and its interactions with polyomavirus proteins. J. Virol. 68(11):7609-13.

127 Campbell, K.S., Ogris, E., Burke, B., Su, W., Auger, K.R., Druker, B.J., Schaffhausen, B.S., Roberts, T.M., Pallas, D.C. (1994): Polyoma middle tumor antigen interacts with SHC protein via the NPTY (Asn-Pro-Thr-Tyr) motif in middle tumor antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(14):6344-8.

Carbone, M., Reale, A., Di Sauro, A., Sthandier, O., Garcia, M.I., Maione, R., Caiafa, P., Amati, P. (2006): PARP-1 interaction with VP1 capsid protein regulates polyomavirus early gene expression. J. Mol. Biol. 363(4):773-85.

Carmichael, G.G., Schaffhausen, B.S., Dorsky, D.I., Oliver, D.B., Benjamin, T.L. (1982): Carboxy terminus of polyoma middle-sized tumor antigen is required for attachment to membranes, associated protein kinase activities, and cell transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79(11):3579-83.

Caruso, M., Belloni, L., Sthandier, O., Amati, P., Garcia, M.I. (2003): α4β1 integrin acts as a cell receptor for murine polyomavirus at the postattachment level. J. Virol. 77(7):3913-21.

Cavaldesi, M., Caruso, M., Sthandier, O., Amati, P., Garcia, M.I. (2004): Conformational changes of murine polyomavirus capsid proteins induced by sialic acid binding. J. Biol. Chem. 279(40):41573-9.

Clever, J., Dean, D.A., Kasamatsu, H. (1993): Identification of a DNA binding domain in simian virus 40 capsid proteins VP2 and VP3. J. Biol. Chem. 268(28):20877-83.

Clever, J., Yamada, M., Kasamatsu, H. (1991): Import of simian virus 40 virions through nuclear pore complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88(16):7333-7.

Courtneidge, S.A., Smith, A.E. (1983): Polyoma virus transforming protein associates with the product of the c-src cellular gene. Nature. 303(5916):435-9.

Daniels, R., Rusan, N.M., Wadsworth, P., Hebert, D.N. (2006a): SV40 VP2 and VP3 insertion into ER membranes is controlled by the capsid protein VP1: implications for DNA translocation out of the ER. Mol. Cell. 24(6):955-66.

Daniels, R., Rusan, N.M., Wilbuer, A.K., Norkin, L.C., Wadsworth, P., Hebert, D.N. (2006b): Simian virus 40 late proteins possess lytic properties that render them capable of permeabilizing cellular membranes. J. Virol. 80(13):6575-87.

Daniels, R., Sadowicz, D., Hebert, D.N. (2007): A very late viral protein triggers the lytic release of SV40. PLoS Pathog. 3(7):e98.

Day, P.M., Gambhira, R., Roden, R.B., Lowy, D.R., Schiller, J.T. (2008): Mechanisms of human papillomavirus type 16 neutralization by L2 cross-neutralizing and L1 type-specific antibodies. J. Virol. 82(9):4638-46.

Day, P.M., Lowy, D.R., Schiller, J.T. (2003): Papillomaviruses infect cells via a clathrin- dependent pathway. Virology. 307(1):1-11.

Day, P.M., Roden, R.B., Lowy, D.R., Schiller, J.T. (1998): The papillomavirus minor capsid protein, L2, induces localization of the major capsid protein, L1, and the viral transcription/replication protein, E2, to PML oncogenic domains. J. Virol. 72(1):142-50.

Delos, S.E., Cripe, T.P., Leavitt, A.D., Greisman, H., Garcea, R.L. (1995): Expression of the polyomavirus minor capsid proteins VP2 and VP3 in Escherichia coli: in vitro interactions with recombinant VP1 capsomeres. J. Virol. 69(12):7734-42.

128 Delos, S.E., Montross, L., Moreland, R.B., Garcea, R.L. (1993): Expression of the polyomavirus VP2 and VP3 proteins in insect cells: coexpression with the major capsid protein VP1 alters VP2/VP3 subcellular localization. Virology. 194(1):393-8.

Dilworth, S.M. (1990): Cell alterations induced by the large T-antigens of SV40 and polyoma virus. Semin. Cancer Biol. 1(6):407-14. Review.

Dornreiter, I., Höss, A., Arthur, A.K., Fanning, E. (1990): SV40 T antigen binds directly to the large subunit of purified DNA polymerase alpha. EMBO J. 9(10):3329-36.

Dower, W.J., Miller, J.F., Ragsdale, C.W. (1988): High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleid Acids Res. 16, 6127-6145.

Dowling, W., Denisova, E., LaMonica, R., Mackow, E.R. (2000): Selective membrane permeabilization by the rotavirus VP5* protein is abrogated by mutations in an internal hydrophobic domain. J. Virol. 74(14):6368-76.

Dryden, K.A., Wang, G., Yeager, M., Nibert, M.L., Coombs, K.M., Furlong, D.B., Fields, B.N., Baker, T.S. (1993): Early steps in reovirus infection are associated with dramatic changes in supramolecular structure and protein conformation: analysis of virions and subviral particles by cryoelectron microscopy and image reconstruction. J. Cell. Biol. 122(5):1023-41.

Eash, S., Querbes, W., Atwood, W.J. (2004): Infection of vero cells by BK virus is dependent on caveolae. J. Virol. 78(21):11583-90.

Fang, C.Y., Chen, H.Y., Wang, M., Chen, P.L., Chang, C.F., Chen, L.S., Shen, C.H., Ou, W.C., Tsai, M.D., Hsu, P.H., Chang, D. (2010): Global analysis of modifications of the human BK virus structural proteins by LC-MS/MS. Virology. (V tisku.)

Fay, A., Yutzy, W.H. 4th, Roden, R.B., Moroianu, J. (2004): The positively charged termini of L2 minor capsid protein required for bovine papillomavirus infection function separately in nuclear import and DNA binding. J. Virol. 78(24):13447-54.

Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P.S. (2008): Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319(5866):1096-100.

Finnen, R.L., Erickson, K.D., Chen, X.S., Garcea, R.L. (2003): Interactions between papillomavirus L1 and L2 capsid proteins. J. Virol. 77(8):4818-26.

Florin, L., Becker, K.A., Sapp, C., Lambert, C., Sirma, H., Müller, M., Streeck, R.E., Sapp, M. (2004): Nuclear translocation of papillomavirus minor capsid protein L2 requires Hsc70. J. Virol. 78(11):5546-53.

Florin, L., Sapp, C., Streeck, R.E., Sapp, M. (2002): Assembly and translocation of papillomavirus capsid proteins. J. Virol. 76(19):10009-14.

Forstová, J., Krauzewicz, N., Wallace, S., Street, A.J., Dilworth, S.M., Beard, S., Griffin B.E. (1993): Cooperation of structural proteins during late events in the life cycle of polyomavirus. J. Virol. 67(3):1405-13.

Garcea, R.L., Ballmer-Hofer, K., Benjamin, T.L. (1985): Virion assembly defect of polyomavirus hr-t mutants: underphosphorylation of major capsid protein VP1 before viral DNA encapsidation. J. Virol. 54(2):311-6.

129 Gaynor, A.M., Nissen, M.D., Whiley, D.M., Mackay, I.M., Lambert, S.B., Wu, G., Brennan, D.C., Storch, G.A., Sloots, T.P., Wang, D. (2007): Identification of a novel polyomavirus from patients with acute respiratory tract infections. PLoS Pathog. 3(5):e64.

Gibson, W. (1974): Polyoma virus proteins: a description of the structural proteins of the virion based on polyacrylamide gel electrophoresis and peptide analysis. Virology. 62(2):319-36.

Gilbert, J.M., Benjamin, T.L. (2000): Early steps of polyomavirus entry into cells. J. Virol. 74(18):8582-8. J. Virol. 74(18):8582-8.

Gilbert, J.M., Benjamin, T.L. (2004): Uptake pathway of polyomavirus via ganglioside GD1a. J. Virol. 78(22):12259-67.

Gilbert, J.M., Goldberg, I.G., Benjamin, T.L. (2003): Cell penetration and trafficking of polyomavirus. J. Virol. 77(4):2615-22.

Gilbert, J.M., Ou, W., Silver, J., Benjamin, T.L. (2006): Downregulation of protein disulfide isomerase inhibits infection by the mouse polyomavirus. J. Virol. 80(21):10868-70.

Gillock, E.T., Rottinghaus, S., Chang, D., Cai, X., Smiley, S.A., An, K., Consigli, R.A. (1997): Polyomavirus major capsid protein VP1 is capable of packaging cellular DNA when expressed in the baculovirus system. J. Virol. 71(4):2857-65.

Giné, E., Crespo, M., Muntanola, A., Calpe, E., Baptista, M.J., Villamor, N., Montserrat, E., Bosch, F. (2008): Induction of histone H1.2 cytosolic release in chronic lymphocytic leukemia cells after genotoxic and non-genotoxic treatment. Haematologica. 93(1):75-82.

Gonzalez, M.E., Carrasco, L. (2003): Viroporins. FEBS Lett. 552(1):28-34. Review.

Gordon-Shaag, A., Yosef, Y., Abd El-Latif, M., Oppenheim, A. (2003): The abundant nuclear enzyme PARP participates in the life cycle of simian virus 40 and is stimulated by minor capsid protein VP3. J. Virol. 77(7):4273-82.

Greber, U.F., Willetts, M., Webster, P., Helenius, A. (1993): Stepwise dismantling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell. 75(3):477-86.

Griffith, J.P., Griffith, D.L., Rayment, I., Murakami, W.T., Caspar, D.L.D. (1992): Inside polyomavirus at 25-Å resolution. Nature 355(6361):652-54.

Harbison, C.E., Chiorini, J.A., Parrish, C.R. (2008): The parvovirus capsid odyssey: from the cell surface to the nucleus. Trends Microbiol. 16(5):208-14. Review.

Harrison, S.C. (2007): Principles of Virus Structure. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (eds.): Fields Virology. Fifth Edition, Lippincott Wiliams & Wilkins, Philadelphia, 59-98.

Hazes, B., Read, R.J. (1997): Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36(37):11051-4.

Hogle, J.M. (2002): Poliovirus cell entry: common structural themes in viral cell entry pathways. Annu. Rev. Microbiol. 56:677-702.

130 Huang, S.G., Weisshart, K., Gilbert, I., Fanning, E. (1998): Stoichiometry and mechanism of assembly of SV40 T antigen complexes with the viral origin of DNA replication and DNA polymerase α-primase. Biochemistry. 37(44):15345-52.

Huérfano, S., Žíla, V., Bouřa, E., Španielová, H., Štokrová, J., Forstová, J. (2010): Minor capsid proteins of mouse polyomavirus are inducers of apoptosis when produced individually but are only moderate contributors to cell death during the late phase of viral infection. FEBS J. 277(5):1270-83.

Hwang, C.S., Shemorry, A., Varshavsky, A. (2010): N-terminal acetylation of cellular proteins creates specific degradation signals. Science. 2010 327(5968):973-7.

Chandran, K., Nibert, M.L. (1998): Protease cleavage of reovirus capsid protein μ1/μ1C is blocked by alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle. J. Virol. 72(1):467-75.

Chang, D., Haynes, J.I. II., Brady, J.N., Consigli, R.A. (1992a): Identification of a nuclear localization sequence in the polyomavirus capsid protein VP2. Virology. 191(2):978-83.

Chang, D., Haynes, J. I., Brady, J. N., Consigli, R.A. (1992b): The use of additive and subtractive approaches to examine the nuclear localization sequence of the polyomavirus major capsid protein VP1. Virology. 189(2):821-827.

Chemello, M.E., Aristimuño, O.C., Michelangeli, F., Ruiz, M.C. (2002): Requirement for vacuolar H+-ATPase activity and Ca2+ gradient during entry of rotavirus into MA104 cells. J. Virol. 76(24):13083-7.

Chen, L., Fluck, M. (2001): Kinetic analysis of the steps of the polyomavirus lytic cycle. J. Virol. 75(18):8368-79.

Chen, X.S., Stehle, T., Harrison, S.C. (1998): Interaction of polyomavirus internal protein VP2 with the major capsid protein VP1 and implications for participation of VP2 in viral entry. EMBO J. 17(12):3233-40.

Chromy, L.R., Oltman, A., Estes, P.A., Garcea, R.L. (2006): Chaperone-mediated in vitro disassembly of polyoma- and papillomaviruses. J. Virol. 80(10):5086-91.

Chromy, L.R., Pipas, J.M., Garcea, R.L. (2003): Chaperone-mediated in vitro assembly of Polyomavirus capsids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(18):10477-82.

Imperiale, M.J., Major, E.O. (2007): Polyomaviruses. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (eds.): Fields Virology. Fifth Edition, Lippincott Wiliams & Wilkins, Philadelphia, 2263-98.

Ivanovic, T., Agosto, M.A., Chandran, K., Nibert, M.L. (2007): A role for molecular chaperone Hsc70 in reovirus outer capsid disassembly. J. Biol. Chem. 282(16):12210-9.

Ivanovic, T., Agosto, M.A., Zhang, L., Chandran, K., Harrison, S.C., Nibert, M.L. (2008): Peptides released from reovirus outer capsid form membrane pores that recruit virus particles. EMBO J. 27(8):1289-98.

Jelínek, M. (2009): Využití pseudokapsid ke studiu funkcí minoritních strukturních proteinů polyomavirů. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

Jirásko, V.G. (2006): Studium funkcí VP2 a VP3 strukturních minoritních proteinů myšího polyomaviru. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

131 Kaljot, K.T., Shaw, R.D., Rubin, D.H., Greenberg, H.B. (1988): Infectious rotavirus enters cells by direct cell membrane penetration, not by endocytosis. J. Virol. 62(4):1136-44.

Kamen, R., Favaloro, J., Parker, J. (1980): Topography of the three late mRNAs of polyoma virus which encode the virion proteins. J. Virol. 33(2):637-51.

Kamen, R., Shure, H. (1976): Topography of polyoma virus messenger RNA molecules. Cell. 7(3):361-71.

Kämper, N., Day, P.M., Nowak, T., Selinka, H.C., Florin, L., Bolscher, J., Hilbig, L., Schiller, J.T., Sapp, M. (2006): A membrane-destabilizing peptide in capsid protein L2 is required for egress of papillomavirus genomes from endosomes. J. Virol. 80(2):759-68.

Kawana, Y., Kawana, K., Yoshikawa, H., Taketani, Y., Yoshiike, K., Kanda, T. (2001): Human papillomavirus type 16 minor capsid protein L2 N-terminal region containing a common neutralization epitope binds to the cell surface and enters the cytoplasm. J. Virol. 75(5):2331-6.

Kečkéšová, Z. (2003): Myší polyomavírus: štúdium skorej fázy infekcie a roľa minoritných štruktúrnych proteínov. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

Konishi, A., Shimizu, S., Hirota, J., Takao, T., Fan, Y., Matsuoka, Y., Zhang, L., Yoneda, Y., Fujii, Y., Skoultchi, A.I., Tsujimoto, Y. (2003): Involvement of histone H1.2 in apoptosis induced by DNA double-strand breaks. Cell. 114(6):673-88.

Koriazova, L.K., Montal, M. (2003): Translocation of botulinum neurotoxin light chain protease through the heavy chain channel. Nat. Struct. Biol. 10(1):13-8.

Krauzewicz, N., Streuli, C.H., Stuart-Smith, N., Jones, M.D., Wallace, S., Griffin, B.E. (1990): Myristylated polyomavirus VP2: role in the life cycle of the virus. J. Virol. 64(9):4414-20.

Li, M., Delos, S.E., Montross, L., Garcea, R.L. (1995): Polyomavirus VP1 phosphorylation: coexpression with the VP2 capsid protein modulates VP1 phosphorylation in Sf9 insect cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(13):5992-6.

Li, M., Garcea, R.L. (1994): Identification of the threonine phosphorylation sites on the polyomavirus major capsid protein VP1: relationship to the activity of middle T antigen. J. Virol. 68(1):320-7.

Liddington, R.C., Yan, Y., Moulai, J., Sahli, R., Benjamin, T.L., Harrison, S.C. (1991): Structure of simian virus 40 at 3.8-Å resolution. Nature. 354(6351):278-84.

Liebl, D., Difato, F., Horníková, L., Mannová, P., Štokrová, J., Forstová, J. (2006): Mouse polyomavirus enters early endosomes, requires their acidic pH for productive infection, and meets transferrin cargo in Rab11-positive endosomes. J. Virol. 80(9):4610-22.

Liemann, S., Chandran, K., Baker, T.S., Nibert, M.L., Harrison, S.C. (2002): Structure of the reovirus membrane-penetration protein, μ1, in a complex with is protector protein, σ3. Cell. 108(2):283-95.

Lilley, B.N., Gilbert, J.M., Ploegh, H.L., Benjamin, T.L. (2006): Murine polyomavirus requires the endoplasmic reticulum protein Derlin-2 to initiate infection. J. Virol. 80(17):8739-44.

132 Liu, W.J., Gissmann, L., Sun, X.Y., Kanjanahaluethai, A., Müller, M., Doorbar, J., Zhou, J. (1997): Sequence close to the N-terminus of L2 protein is displayed on the surface of bovine papillomavirus type 1 virions. Virology. 227(2):474-83.

Lowe, J., Panda, D., Rose, S., Jensen, T., Hughes, W.A., Tso, F.Y., Angeletti, P.C. (2008): Evolutionary and structural analyses of alpha-papillomavirus capsid proteins yields novel insights into L2 structure and interaction with L1. Virol. J. 5:150.

Lucia-Jandris, P., Hooper, J.W., Fields, B.N. (1993): Reovirus M2 gene is associated with chromium release from mouse L cells. J. Virol. 67(9):5339-45.

Ludert, J.E., Feng, N., Yu, J.H., Broome, R.L., Hoshino, Y., Greenberg, H.B. (1996): Genetic mapping indicates that VP4 is the rotavirus cell attachment protein in vitro and in vivo. J. Virol. 70(1):487-93.

Ludlow, J.W., Consigli, R.A. (1987): Polyomavirus major capsid protein VP1 is modified by tyrosine sulfuration. J. Virol. 61(5):1708-11.

Ludlow, J.W., Consigli, R.A. (1989): Hydroxyproline in the major capsid protein VP1 of polyomavirus. J. Virol. 63(6):2881-4.

Mackay, R.L., Consigli, R.A. (1976): Early events in polyoma virus infection: attachment, penetration, and nuclear entry. J. Virol. 19(2):620-36.

Mackow, E.R., Shaw, R.D., Matsui, S.M., Vo, P.T., Dang, M.N., Greenberg, H.B. (1988): The rhesus rotavirus gene encoding protein VP3: location of amino acids involved in homologous and heterologous rotavirus neutralization and identification of a putative fusion region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85(3):645-9.

Madan, V., Castelló, A., Carrasco, L. (2008): Viroporins from RNA viruses induce caspase- dependent apoptosis. Cell Microbiol. 10(2):437-51.

Magnuson, B., Rainey, E.K., Benjamin, T., Baryshev, M., Mkrtchian, S., Tsai, B. (2005): ERp29 triggers a conformational change in polyomavirus to stimulate membrane binding. Mol. Cell. 20(2):289-300.

Mangel, W.F., McGrath, W.J., Toledo, D.L., Anderson, C.W. (1993): Viral DNA and a viral peptide can act as cofactors of adenovirus virion proteinase activity. Nature. 361(6409):274-5.

Mannová, P., Forstová, J. (2003): Mouse polyomavirus utilizes recycling endosomes for a traffic pathway independent of COPI vesicle transport. J. Virol. 77(3):1672-81.

Mannová, P., Liebl, D., Krauzewicz, N., Fejtová, A., Štokrová, J., Palková, Z., Griffin, B.E., Forstová, J. (2002): Analysis of mouse polyomavirus mutants with lesions in the minor capsid proteins. J. Gen. Virol. 83(9):2309-19.

Marc, D., Drugeon, G., Haenni, A.L., Girard, M., van der Werf, S. (1989): Role of myristoylation of poliovirus capsid protein VP4 as determined by site-directed mutagenesis of its N-terminal sequence. EMBO J. 8(9):2661-8.

Maul, G.G., Rovera, G., Vorbrodt, A., Abramczuk, J. (1978): Membrane fusion as a mechanism of simian virus 40 entry into different cellular compartments. J. Virol. 28(3):936-44.

Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. (2004): Myristoylation of viral and bacterial proteins. Trends Microbiol. 12(4):178-85. Review.

133 McCarthy, J., Hopwood, F., Oxley, D., Laver, M., Castagna, A., Righetti, P.G., Williams, K., Herbert, B. (2003): Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis - myth or reality? J. Proteome. Res. 2(3):239-42.

Mogk, A., Bukau, B. (2010): When the beginning marks the end. Science. 327(5968):966-7. Review.

Montross, L., Watkins, S., Moreland, R.B., Mamon, H., Caspar, D.L., Garcea, R.L. (1991): Nuclear assembly of polyomavirus capsids in insect cells expressing the major capsid protein VP1. J. Virol. 65(9):4991-8.

Moreland, R.B., Garcea, R.L. (1991): Characterization of a nuclear localization sequence in the polyomavirus capsid protein VP1. Virology 185(1):513-18.

Moreland, R.B., Montross, L., Garcea, R.L. (1991): Characterization of the DNA-binding properties of the polyomavirus capsid protein VP1. J. Virol. 65(3):1168-76.

Nakanishi, A., Clever, J., Yamada, M., Li, P.P., Kasamatsu, H. (1996): Association with capsid proteins promotes nuclear targeting of simian virus 40 DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93(1):96-100.

Nakanishi, A., Itoh, N., Li, P.P., Handa, H., Liddington, R.C., Kasamatsu, H. (2007): Minor capsid proteins of simian virus 40 are dispensable for nucleocapsid assembly and cell entry but are required for nuclear entry of the viral genome. J. Virol. 81(8):3778-85.

Nakanishi, A., Shum, D., Morioka, H., Otsuka, E., Kasamatsu, H. (2002): Interaction of the VP3 nuclear localization signal with the importin α2/β heterodimer directs nuclear entry of infecting simian virus 40. J. Virol. 76(18):9368-77.

Nandi, P., Charpilienne, A., Cohen, J. (1992): Interaction of rotavirus particles with liposomes. J. Virol. 66(6):3363-7.

Nibert, M.L., Schiff, L.A., Fields, B.N. (1991): Mammalian reoviruses contain a myristoylated structural protein. J. Virol. 65(4):1960-7.

Nielsen, M.L., Savitski, M.M., Zubarev, R.A. (2006): Extent of modifications in human proteome samples and their effect on dynamic range of analysis in shotgun proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 5(12):2384-91.

Norkin, L.C., Anderson, H.A., Wolfrom, S.A., Oppenheim, A. (2002): Caveolar endocytosis of simian virus 40 is followed by brefeldin A-sensitive transport to the endoplasmic reticulum, where the virus disassembles. J. Virol. 76(10):5156-66.

Odegard, A.L., Kwan, M.H., Walukiewicz, H.E., Banerjee, M., Schneemann, A., Johnson, J.E. (2009): Low endocytic pH and capsid protein autocleavage are critical components of Flock House virus cell entry. J. Virol. 83(17):8628-37.

Okun, M.M., Day, P.M., Greenstone, H.L., Booy, F.P., Lowy, D.R., Schiller, J.T., Roden, R.B. (2001): L1 interaction domains of papillomavirus L2 necessary for viral genome encapsidation. J. Virol. 75(9):4332-42.

Oliver, F.J., Menissier-de Murcia, J., de Murcia, G. (1999): Poly(ADP-ribose) polymerase in the cellular response to DNA damage, apoptosis, and disease. Am. J. Hum. Genet. 64(5):1282-8. Review.

134 Pakkanen, K., Kirjavainen, S., Mäkelä, A.R., Rintanen, N., Oker-Blom, C., Jalonen, T.O., Vuento, M. (2009): Parvovirus capsid disorders cholesterol-rich membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 379(2):562-6.

Pallas, D.C., Shahrik, L.K., Martin, B.L., Jaspers, S., Miller, T.B., Brautigan, D.L., Roberts, T.M. (1990): Polyoma small and middle T antigens and SV40 small t antigen form stable complexes with protein phosphatase 2A. Cell. 60(1):167-76.

Pérez-Vargas, J., Romero, P., López, S., Arias, C.F. (2006): The peptide-binding and ATPase domains of recombinant hsc70 are required to interact with rotavirus and reduce its infectivity. J. Virol. 80(7):3322-31.

Plevka, P. (2002): Vliv polyomaviru a jeho strukturního proteinu VP1 na cytoskelet a organizaci vybraných jaderných proteinů. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

Ponder, B.A., Robbins, A.K., Crawford, L.V. (1977): Phophorylation of polyoma and SV40 virus proteins. J. Gen. Virol. 37(1):75-83.

Prasad, B.V., Burns, J.W., Marietta, E., Estes, M.K., Chiu, W. (1990): Localization of VP4 neutralization sites in rotavirus by three-dimensional cryo-electron microscopy. Nature. 343(6257):476-9.

Proskuryakov, S.Y., Konoplyannikov, A.G., Gabai, V.L. (2003): Necrosis: a specific form of programmed cell death? Exp. Cell. Res. 283(1):1-16. Review.

Qian, M., Cai, D., Verhey, K.J., Tsai, B. (2009): A lipid receptor sorts polyomavirus from the endolysosome to the endoplasmic reticulum to cause infection. PLoS Pathog. 5(6):e1000465.

Rainey-Barger, E.K., Magnuson, B., Tsai, B. (2007): A chaperone-activated nonenveloped virus perforates the physiologically relevant endoplasmic reticulum membrane. J. Virol. 81(23):12996-3004.

Rainey-Barger, E.K., Mkrtchian, S, Tsai, B. (2009): The C-terminal domain of ERp29 mediates polyomavirus binding, unfolding, and infection. J. Virol. 83(3):1483-91.

Rayment, I., Baker, T.S., Caspar, D.L., Murakami, W.T. (1982): Polyoma virus capsid structure at 22.5 Å resolution. Nature. 295(5845):110-5.

Ren, J., Kachel, K., Kim, H., Malenbaum, S.E., Collier, R.J., London, E. (1999): Interaction of diphtheria toxin T domain with molten globule-like proteins and its implications for translocation. Science. 284(5416):955-7.

Richards, R.M., Lowy, D.R., Schiller, J.T., Day, P.M. (2006): Cleavage of the papillomavirus minor capsid protein, L2, at a furin consensus site is necessary for infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(5):1522-7.

Richterová, Z., Liebl, D., Horák, M., Palková, Z., Štokrová, J., Hozák, P., Korb, J., Forstová, J. (2001): Caveolae are involved in the trafficking of mouse polyomavirus virions and artificial VP1 pseudocapsids toward cell nuclei. J. Virol. 75(22):10880-91.

Ruiz, M.C., Alonso-Torre, S.R., Charpilienne, A., Vasseur, M., Michelangeli, F., Cohen, J., Alvarado, F. (1994): Rotavirus interaction with isolated membrane vesicles. J. Virol. 68(6):4009-16.

135 Ruiz, M.C., Charpilienne, A., Liprandi, F., Gajardo, R., Michelangeli, F., Cohen, J. (1996): The concentration of Ca2+ that solubilizes outer capsid proteins from rotavirus particles is dependent on the strain. J. Virol. 70(8):4877-83.

Řípová, K. (2002): Arteficielní kapsidy myšího polyomaviru a jejich interakce s hostitelskou buňkou. Diplomová práce, Katedra genetiky a mikrobiologie, Př.F. U.K., Praha.

Sahli, R., Freund, R., Dubensky, T., Garcea, R., Bronson, R., Benjamin, T. (1993): Defect in entry and altered pathogenicity of a polyoma virus mutant blocked in VP2 myristylation. Virology. 192(1):142-53.

Salunke, D.M., Caspar, D.L., Garcea, R.L. (1986): Self-assembly of purified polyomavirus capsid protein VP1. Cell. 46(6):895-904.

Salunke, D.M., Caspar, D.L., Garcea, R.L. (1989): Polymorphism in the assembly of polyomavirus capsid protein VP1. Biophys. J. 56(5):887-900.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989): Molecular cloning. A laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sapp, M., Bienkowska-Haba, M. (2009): Viral entry mechanisms: human papillomavirus and a long journey from extracellular matrix to the nucleus. FEBS J. 276(24):7206-16.

Sekiya, K., Satoh, R., Danbara, H., Futaesaku, Y. (1993): A ring-shaped structure with a crown formed by streptolysin O on the erythrocyte membrane. J. Bacteriol. 175(18):5953-61.

Selinka, H.C., Giroglou, T., Sapp, M. (2002): Analysis of the infectious entry pathway of human papillomavirus type 33 pseudovirions. Virology. 299(2):279-287.

Seth, P., Fitzgerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M., Pastan, I. (1984): Evidence that the penton base of adenovirus is involved in potentiation of toxicity of Pseudomonas exotoxin conjugated to epidermal growth factor. Mol. Cell. Biol. 4(8):1528-33.

Shai, Y. (2002): Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers. 66(4):236-48.

Shishido-Hara, Y., Ichinose, S., Higuchi, K., Hara, Y., Yasui, K. (2004): Major and minor capsid proteins of human polyomavirus JC cooperatively accumulate to nuclear domain 10 for assembly into virions. J. Virol. 78(18):9890-903.

Schelhaas, M., Malmström, J., Pelkmans, L., Haugstetter, J., Ellgaard, L., Grünewald, K., Helenius, A. (2007): Simian Virus 40 depends on ER protein folding and quality control factors for entry into host cells. Cell. 131(3):516-29.

Schmidt, M., Müller, H., Schmidt, M.F., Rott, R. (1989): Myristoylation of budgerigar fledgling disease virus capsid protein VP2. J. Virol. 63(1):429-31.

Schneemann, A., Zhong, W., Gallagher, T.M., Rueckert, R.R. (1992): Maturation cleavage required for infectivity of a nodavirus. J. Virol. 66(11):6728-34.

Schneider, C., Weisshart, K., Guarino, L.A., Dornreiter, I., Fanning, E. (1994): Species- specific functional interactions of DNA polymerase α-primase with simian virus 40 (SV40) T antigen require SV40 origin DNA. Mol. Cell. Biol. 14(5):3176-85.

136 Siddell, S.G., Smith, A.E. (1978): Polyoma virus has three late mRNA's: one for each virion protein. J. Virol. 27(2):427-31.

Siuti, N., Kelleher, N.L. (2007): Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat. Methods. 4(10):817-21. Review.

Soeda, E., Arrand, J.R., Smolar, N., Walsh, J.E., Griffin, B.E. (1980): Coding potential and regulatory signals of the polyoma virus genome. Nature. 283(5746):445-53.

Stamatos, N.M., Chakrabarti, S., Moss, B., Hare, J.D. (1987): Expression of polyomavirus virion proteins by a vaccinia virus vector: association of VP1 and VP2 with the nuclear framework. J. Virol. 61(2):516-25.

Stehle, T., Harrison, S.C. (1997): High-resolution structure of a polyomavirus VP1-oligosaccharide complex: implications for assembly and receptor binding. EMBO J. 16:5139-5148.

Stehle, T., Yan, Y., Benjamin, T.L., Harrison, S.C. (1994): Structure of murine polyomavirus complexed with an oligosaccharide receptor fragment. Nature. 369(6476):160-3.

Stewart, P.L., Fuller, S.D., Burnett, R.M. (1993): Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. EMBO J. 12(7):2589-99.

Streuli, C.H., Griffin, B.E. (1987): Myristic acid is coupled to a structural protein of polyoma virus and SV40. Nature. 326(6113):619-22.

Strohalm, M., Hassman, M., Kosata, B., Kodícek, M. (2008): mMass data miner: an open source alternative for mass spectrometric data analysis. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 22(6):905-8.

Sturzenbecker, L.J., Nibert, M., Furlong, D., Fields, B.N. (1987): Intracellular digestion of reovirus particles requires a low pH and is an essential step in the viral infectious cycle. J. Virol. 61(8):2351-61.

Suikkanen, S., Antila, M., Jaatinen, A., Vihinen-Ranta, M., Vuento, M. (2003): Release of canine parvovirus from endocytic vesicles. Virology. 316(2):267-80.

Suzuki, T., Orba, Y., Okada, Y., Sunden, Y., Kimura, T., Tanaka, S., Nagashima, K., Hall, W.W., Sawa, H. (2010): The human polyoma JC virus agnoprotein acts as a viroporin. PLoS Pathog. 6(3):e1000801.

Thingholm, T.E., Jensen, O.N., Larsen, M.R. (2009): Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9(6):1451-68. Review.

Tsai, B. (2007): Penetration of nonenveloped viruses into the cytoplasm. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 23:23-43. Review.

Tsai, B., Gilbert, J.M., Stehle, T., Lencer, W., Benjamin, T.L., Rapoport, T.A. (2003): Gangliosides are receptors for murine polyoma virus and SV40. EMBO J. 22(17):4346-55.

Türler, H., Beard, P. (1985): Simian virus 40 and polyoma virus: growth, titration, transformation and purification of viral components. In: Mahy, B.W.J. (ed.): Virology: a practical approach. IRL Press, Oxford, 169-192.

137 Unterstab, G., Gosert, R., Leuenberger, D., Lorentz, P., Rinaldo, C.H., Hirsch, H.H. (2010): The polyomavirus BK agnoprotein co-localizes with lipid droplets. Virology. 399(2):322-31. van Zee, K., Appel, F., Fanning, E. (1991): A hydrophobic protein sequence can override a nuclear localization signal independently of protein context. Mol. Cell. Biol. 11(10):5137-46.

Varshavsky, A.J., Bakayev, V.V., Chumackov, P.M., Georgiev, G.P. (1976): Minichromosome of simian virus 40: presence of histone HI. Nucleic Acids Res. 3(8):2101-13.

Walker, J.M. (2002): Gradient SDS Polyacrylamide Electrophoresis of Proteins. In: Walker, J.M. (ed.): The Protein Protocols Handbook. Second Edition, Humana Press, Totowa, New Jersey, 69-72.

Westermeier, R., Naven, T. (2002): Tandem Mass Spectrometry. In: Westermeister, R., Naven, T. (eds.): Proteomics in Practice. Wiley-VCH Verlag GmbH, Freiburg, 125-35.

Wickham, T.J., Filardo, E.J., Cheresh, D.A., Nemerow, G.R. (1994): Integrin αvβ5 selectively promotes adenovirus mediated cell membrane permeabilization. J. Cell. Biol. 127(1):257-64.

Wickham, T.J., Mathias, P., Cheresh, D.A., Nemerow, G.R. (1993): Integrins αvβ3 and αvβ5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell. 73(2):309-19.

Wiethoff, C.M., Wodrich, H., Gerace, L., Nemerow, G.R. (2005): Adenovirus protein VI mediates membrane disruption following capsid disassembly. J. Virol. 79(4):1992-2000.

Winston, V.D., Bolen, J.B., Consigli, R.A. (1980): Isolation and characterization of polyoma uncoating intermediates from the nuclei of infected mouse cells. J. Virol. 33(3):1173-81.

Wirth, J.J., Chen, L., Fluck, M.M. (2000): Systemic polyomavirus genome increase and dissemination of capsid-defective genomes in mammary gland tumor-bearing mice. J. Virol. 74(15):6975-83.

Wodrich, H., Guan, T., Cingolani, G., von Seggern, D., Nemerow, G., Gerace, L. (2003): Switch from capsid protein import to adenovirus assembly by cleavage of nuclear transport signals. EMBO J. 22(23):6245-55.

Wu, D., Ingram, A., Lahti, J.H., Mazza, B., Grenet, J., Kapoor, A., Liu, L., Kidd, V.J., Tang, D. (2002): Apoptotic release of histones from nucleosomes. J. Biol. Chem. 277(14):12001-8.

Yang, L., Wold, M.S., Li, J.J., Kelly, T.J., Liu, L.F. (1987): Roles of DNA topoisomerases in simian virus 40 DNA replication in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84(4):950-4.

Yang, S.I., Lickteig, R.L., Estes, R., Rundell, K., Walter, G., Mumby, M.C. (1991): Control of protein phosphatase 2A by simian virus 40 small-t antigen. Mol. Cell. Biol. 11(4):1988-95.

Zárate, S., Cuadras, M.A., Espinosa, R., Romero, P., Juárez, K.O., Camacho-Nuez, M., Arias, C.F., López, S. (2003): Interaction of rotaviruses with Hsc70 during cell entry is mediated by VP5. J. Virol. 77(13):7254-60.

Zárate, S., Espinosa, R., Romero, P., Guerrero, C.A., Arias, C.F., López, S. (2000): Integrin α2β1 mediates the cell attachment of the rotavirus neuraminidase-resistant variant nar3. Virology. 278(1):50-4.

138