Svoluji k zapůjčení své diplomové práce ke studijním účelům a prosím, aby byla vedena přesná evidence vypůjčovatelů. Převzaté údaje je vypůjčovatel povinen řádně ocitovat. 1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru Ondřej Vít Praha 2010 2 Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Jitka Forstová, Csc. Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně, jen s použitím citované literatury a pod vedením vedoucí diplomové práce. Ondřej Vít 3 Na tomto místě bych chtěl poděkovat doc. RNDr. Jitce Forstové, CSc. neocenitelnou pomoc, rady a připomínky během vypracovávání této diplomové práce. Dále děkuji všem členům naší laboratoře za zaučení do metod a vytvoření příjemného pracovního prostředí. Děkuji Ondřeji Šebestovi za pomoc s konfokálním mikroskopem, Vojtěchu Žílovi za zhotovení elektronmikroskopických snímků a Ludmile Vítámvásové za pomoc s 2D elektroforézami. Děkuji svým rodičům za podporu, bez které bych nemohl tuto práci dokončit. Děkuji Evičce Vopálkové za toleranci, lásku a duševní podporu, bez které bych to nezvládl. 4 Předkládaná diplomová práce vznikla v letech 2007 – 2010 za podpory grantů 1M0508, MSM0021620858 a LC545 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky. 5 Studium minoritních kapsidových proteinů myšího polyomaviru Abstrakt. Myší polyomavirus (MPyV) je malý neobalený virus. Jeho kapsida se skládá ze 72 pentamerů hlavního kapsidového proteinu VP1. Vnitřní prohlubeň každého pentameru VP1 obsahuje jeden minoritní kapsidový protein, buď VP2 nebo VP3. Minoritní proteiny nejsou potřeba ke vzniku kapsidy, avšak pro infekci hostitelské buňky jsou nezbytné, pravděpodobně kvůli jejich předpokládaným funkcím během vstupu viru do buňky. Po vstupu do buňky jsou viriony MPyV dopraveny do endoplazmatického retikula (ER). Předpokládá se, že VP2 a VP3 jsou zodpovědné za narušení membrány ER, které je potřeba pro následné doručení virové DNA do jádra. V sekvenci VP2 a VP3 byly předpovězeny tři hydrofobní domény. První, v unikátní N-koncové oblasti VP2, druhá a třetí ve společné části sekvence VP2 a VP3. Třetí doména je zároveň C-koncovým α-helixem, zodpovědným za vazbu VP1. V naší laboratoři bylo již dříve zjištěno, že VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP mají při produkci v savčích buňkách obdobné VP2 a VP3 divokého typu, konkrétně afinitu k vnitrobuněčným membránám a vysokou cytotoxicitu. Aby bylo zjištěno, která z předpokládaných hydrofobních domén VP2 a VP3 je zodpovědná za afinitu k membránám a cytotoxicitu, byly připraveny expresní plazmidy, nesoucí mutované VP2 a VP3 fúzované k N-konci EGFP. Výsledky ukazují, že delece druhé hydrofobní domény vede ke ztrátě VP2 a VP3 interagovat s vnitrobuněčnými membránami a samotná unikátní N-koncová část VP2 (která obsahuje první hydrofobní doménu) nepostačuje k interakcím s vnitrobuněčnými membránami. Tyto výsledky naznačují, že druhá hydrofobní doména VP2 a VP3 je důležitá pro afinitu VP2 a VP3 k membránám. Dále byly pomocí SDS-PAGE pro analýzu hmotnostní spektrometrií (MS) separovány dvě izoformy VP2 a VP3, lišící se elektroforetickou mobilitou. MS analýzou byla nalezena acetylace N-koncového alaninu obou forem VP3. 2D elektroforézou byly detekovány nejméně čtyři izoformy VP2 a VP3, což je, společně s předběžnými výsledky MS analýz, náznakem existence několika fosforylací obou minoritních kapsidových proteinů. Klíčová slova: myší polyomavirus, VP2, VP3, kapsidové proteiny, posttranslační modifikace, vstup viru do buňky. 6 Studies of minor capsid proteins of the mouse polyomavirus Abstract. Mouse polyomavirus (MPyV) is a small non-enveloped virus. Its capsid consists of 72 pentamers of the major capsid protein VP1. The central cavity of each VP1 pentamer contains one minor capsid protein, either VP2, or VP3. The minor capsid proteins are dispensable for capsid formation, but their presence is required for infection of the host cell, presumably because of their anticipated functions during virus entry. After internalization, MPyV virions traffic to endoplasmic reticulum (ER). VP2 and VP3 have been proposed to function as factors responsible for penetration of ER membranes, which is required for subsequent delivery of the viral DNA into the nucleus, a key step of the early phase of MPyV infection. Three hydrophobic domains were predicted in the sequence of VP2 and VP3. First in the unique N-terminal part of VP2, second and third in the common part of VP2 and VP3. The third domain corresponds to C-terminal VP1-binding α-helix. It has been previously found in our laboratory, that VP2 and VP3 fused to N-terminus of EGFP, when expressed in mammalian cells, display properties similiar to the wild-type VP2 and VP3, namely affinity to intracellular membranes and high cytotoxicity. Expression plasmids carrying mutated VP2 and VP3 fused to N-terminus of EGFP were prepared to determine the hydrophobic domain, responsible for previously observed membrane affinity and cytotoxicity. The results show, that deletion of the second hydrophobic domain results in loss of ability of VP2 and VP3 to interact with intracellular membranes, and that the unique part of VP2 (which contains the first hydrophobic domain) on its own is not sufficient for interaction with intracellular membranes. These results indicate that the second hydrophobic domain of is important for membrane affinity of VP2 and VP3. In addition, two isoforms of VP2 and VP3, differing in mobility on SDS-PAGE, were separated for mass spectrometry (MS) analysis and further characterized. The MS analysis showed acetylation of N-terminal alanine of both isoforms of VP3. At least four isoforms of VP2 and VP3 were identified by 2D electrophoresis, which, together with preliminary MS analysis results, indicate possible multiple phoshorylation sites on both minor capsid proteins. Key words: mouse polyomavirus, VP2, VP3, capsid proteins, posttranslational modifications, virus cell entry. 7 Obsah 1. ÚVOD .................................................................................................................................. 14 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED ...................................................................................................... 16 2.1. Polyomaviry ................................................................................................................. 17 2.2. Myší polyomavirus ....................................................................................................... 18 2.2.1. Struktura kapsidy .................................................................................................. 18 2.2.1.1. Hlavní strukturní protein VP1 ....................................................................... 19 2.2.1.2. Minoritní strukturní proteiny VP2 a VP3 ...................................................... 20 2.2.2. Organizace genomu .............................................................................................. 24 2.2.3. Infekční cyklus MPyV .......................................................................................... 24 2.2.3.1. Vstup viru do buňky a transport do perinukleárního prostoru ....................... 25 2.2.3.2. Doručení virové DNA do buněčného jádra ................................................... 28 2.2.3.3. Časná transkripce .......................................................................................... 32 2.2.3.4. Časné proteiny .............................................................................................. 32 2.2.3.5. Replikace virové DNA ................................................................................. 33 2.2.3.6. Pozdní exprese .............................................................................................. 34 2.2.3.7. Morfogeneze virionů .................................................................................... 35 2.2.3.8. Smrt hostitelské buňky – role VP2 a VP3 ..................................................... 35 2.3. Virové kapsidové proteiny jiných virů podobné VP2 a VP3 polyomavirů ................... 38 2.3.1. VP4 poliovirů ....................................................................................................... 40 2.3.2. Protein γ nodavirů ................................................................................................. 42 2.3.3. Protein μ1 reovirů ................................................................................................. 42 2.3.4. VP5 rotavirů ......................................................................................................... 44 2.3.5. Kapsidové proteiny parvovirů .............................................................................. 45 2.3.6. L2 papillomavirů .................................................................................................. 46 2.3.7. Protein VI adenovirů ............................................................................................ 48 2.3.8. Viroporiny ............................................................................................................ 49 3. CÍLE PRÁCE ....................................................................................................................... 52 4. MATERIÁL A METODY .................................................................................................... 54 4.1. Materiál ........................................................................................................................ 55 4.1.1. Přístroje ...............................................................................................................