Universidade Estadual De Campinas Faculdade De Ciências Médicas Higor Campos Do Nascimento Proteína Transportadora De Ácidos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

HIGOR CAMPOS DO NASCIMENTO

PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE ÁCIDOS GRAXOS DE ADIPÓCITOS (A-FABP): SUAS RELAÇÕES COM OBESIDADE E CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA

CAMPINAS 2016

HIGOR CAMPOS DO NASCIMENTO

PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE ÁCIDOS GRAXOS DE ADIPÓCITOS (A-FABP): SUAS RELAÇÕES COM OBESIDADE E CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas, na área de concentração em Ciências Biomédicas

ORIENTADOR: Profª Drª Sílvia de Barros Mazon

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO HIGOR CAMPOS DO NASCIMENTO, E ORIENTADO PELA PROFª. DRª. SÍLVIA DE BARROS MAZON.

CAMPINAS 2016

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

HIGOR CAMPOS DO NASCIMENTO

ORIENTADORA: PROF.ª DR.ª SÍLVIA DE BARROS MAZON

MEMBROS:

1. PROF.ª DR.ª SÍLVIA DE BARROS MAZON

2. PROF. DR. LÁZARO ALESSANDRO SOARES NUNES

3. PROF.ª DR.ª DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 13/01/2016

Dedico este trabalho...

A todas as mulheres que foram acometidas pelo câncer de mama e que, com força e coragem, travam uma batalha diária para sobreviverem e superarem essa doença que aflige tantas mulheres pelo mundo.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, meu Pai celestial, que com Sua bondade e misericórdia infinitas permitiu com que eu chegasse até aqui. Minha fé Nele é o que me deu forças para caminhar e seguir em frente sem pestanejar.

Agradeço imensamente à minha orientadora Profª. Drª. Sílvia de Barros Mazon por ter me recebido de braços abertos em seu laboratório; pela confiança; por ter conduzido com muita dedicação, profissionalismo, seriedade e afinco esse trabalho; por sua paciência e pelos ensinamentos que me ajudaram nesse processo de amadurecimento pessoal, profissional e científico; por ter me auxiliado a desbravar rotas desconhecidas nesse “oceano da ciência” e nunca ter deixado com que eu parasse de navegar, sempre me incentivando, me mostrando o caminho e fazendo com que eu nunca perdesse o foco em atingir nossa meta.

O meu muito obrigado à Profª. Drª. Maria Salete Costa Gurgel (Departamento de Tocoginecologia/FCM) e à Profª. Drª. Eliana Cotta de Faria (Departamento de Patologia Clínica/FCM) pela colaboração e viabilização do projeto.

Gostaria de agradecer aos Professores que compuseram minha banca de Qualificação: Profª. Drª. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Lázaro Alessandro Soares Nunes e Profª. Drª. Denise Engelbrecht Zantut Wittmann, pelas observações pertinentes e contribuições ao meu trabalho que foram importantíssimas para o aprimoramento da minha dissertação.

Agradeço enormemente à minha amiga e colega de laboratório Aline Barros Santana, sem a qual eu não teria atingido os resultados nas proporções que foram atingidas, pois graças ao seu projeto de doutorado tive grande suporte ao meu projeto de mestrado. Agradeço todas as dicas, o companheirismo, os conselhos e orientações que foram essenciais para me transmitir serenidade em momentos tempestuosos.

Agradeço aos meus pais, Manoel Antônio e Araci, pela criação e educação que me deram, por todo amor e carinho, por sempre terem me incentivado a estudar e nunca desistir de meus sonhos. Agradeço principalmente à minha mãe,

a Dona Ara, por ter “me empurrado do ninho a força” e assim me possibilitou aprender “a voar e atingir os picos mais altos” que eu quisesse alcançar.

Agradeço aos funcionários do Departamento de Patologia Clínica da FCM: Paulo Henrique de Oliveira (o famoso Paulinho) e Bruna de Almeida Bianchini, pela amizade, pelos conselhos, pelos cafezinhos que foram preciosos nos momentos de tensão, pela companhia nos almoços (quando era possível), por sempre estarem dispostos a colaborar com os assuntos burocráticos com muita competência, eficiência e dedicação.

Agradeço a toda equipe da Pós-Graduação da FCM, em especial à funcionária responsável pelo Programa de Ciências Médicas, Márcia Aguiar dos Santos (a famosa Marcinha) por sempre sanar todas as dúvidas referentes ao programa com cordialidade, bom humor e sempre “quebrar um galho” nas situações adversas.

Agradeço ao meu amigo, irmão, companheiro de todas as horas, Claudecir Carmona, por seu ombro amigo, por me apoiar na fase final do projeto, pela confiança e paz que me transmitia toda vez que eu recorria aflito por seus conselhos que foram de fundamental importância para que eu conseguisse concluir esse projeto.

Agradeço ao meu amigo e colega de república, Alessandro Carlos Teixeira, por vivenciar comigo todo o processo desde o início, pelas palavras de incentivo quando eu estava estressado e em desespero, por me aturar nos momentos de angústia e por comemorar comigo nos momentos de alegria e vitória.

Agradeço à amizade e companheirismo da funcionária Simone de Cássia Dias Mesquita (Seção de Bioquímica Clínica da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP), que apesar de não ter atuado diretamente no auxílio à execução do meu projeto, foi minha grande confidente me dando apoio e incentivo em todas as horas.

Sou grato aos meus colegas, alunos da pós-graduação, por compartilharem seu conhecimento e proporcionarem um intercâmbio de aprendizagens dentro e fora das salas de aula; por compartilharem seus “medos e angústias”, mas também suas “alegrias e vitórias”; em especial o Vitor Wilson de

Moura Virginio (“Vitão”) e a Aline Cristina Gonçalves pelos papos e risadas que tornaram mais alegre esse momento de estudo tão sério.

Agradeço os alunos de Iniciação Científica: Rodrigo de Andrade Natal, Letícia Sathler Delfino, Fernanda Luz Paulino da Costa e Bárbara Cardoso Miranda que, apesar do breve período que estivemos juntos, foram de grande importância ao ajudarem no recrutamento das pacientes voluntárias, em especial o Rodrigo e a Bárbara que me proporcionaram momentos de descontração com sua amizade e assim tornaram essa fase da pesquisa mais prazerosa.

Quero agradecer também todos os meus colegas de trabalho da FCM e do HC; e amigas e amigos feitos ao longo desses anos, como a Camila (Patologia Clínica/FCM), a Daniela (Relações Públicas/FCM), a Karina (Almoxarifado/FCM), a Érica (Patologia Clínica/FCM), o Júnior (Gastropediatria/HC), a Jaqueline (Gastropediatria/HC), e tantos outros, que sempre estiveram ao meu lado, me incentivando e na torcida para que tudo corresse bem.

Meus sinceros agradecimentos:

À funcionária Juliana Luz Passos Argenton (Câmara de Pesquisa/FCM) pelo apoio com as análises estatísticas.

Aos funcionários da Seção de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas – UNICAMP, pelo suporte técnico, pela cordialidade e presteza com que sempre me receberam: Alexandre Augusto Camargo Cherubim, Ana Cristina Valença Ferreira de Souza, Andrea Domênica Teodoro da Silva, Janete Inácio Batista, Márcia Luciméia Fernandes Julian, Mariusa Terezinha dos Santos, Michelle Maria Monteiro dos Santos, Sandra Oliveira de Almeida Teixeira, Vítor Oliveira de Almeida e Walderez Márcia Gonçalves Volpini.

A todos os funcionários da Seção de Coleta de Exames da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP por terem me dado o treinamento técnico e me capacitado para a realização da coleta de amostras de sangue das pacientes.

Aos funcionários da Central de Recepção e Separação de Amostras da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP por terem auxiliado nas etapas pré- analíticas na realização dos exames bioquímicos e sorológicos das pacientes.

Aos funcionários do serviço de Enfermagem da Unidade de Internação - Seção Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM, pelo auxílio no acesso à agenda de internações das pacientes.

À funcionária Rogéria Elias Malaquias (in memoriam) do Serviço de Arquivo Médico do CAISM, pela forma bem humorada e atenciosa de nos receber e nos auxiliar na pesquisa com os prontuários das pacientes, que deixará saudades.

A todas as pacientes da Unidade de Internação - Seção Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM, por terem aceitado participar desta pesquisa e contribuírem de forma crucial para o avanço da ciência.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX), pelo apoio financeiro.

A todos aqueles que de alguma forma, direta ou indiretamente, estiveram presentes nessa fase de estudos e aprendizagem da minha vida e que de alguma forma contribuíram para que eu atingisse meu objetivo.

Meu Muito Obrigado!

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)

RESUMO O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Por outro lado, a obesidade tem sido associada ao desenvolvimento e progressão de vários tumores, incluindo o mamário. Além disso, a obesidade, que cursa com um estado inflamatório subclínico, está intimamente relacionada a diversas comorbidades, incluindo a síndrome metabólica (SM). O tecido adiposo secreta inúmeras moléculas bioativas, denominadas adipocinas e, entre elas, as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF- e a proteína transportadora de ácidos graxos de adipócitos (A-FABP). Na obesidade estas adipocinas estão presentes em concentrações mais elevadas, sendo que a A-FABP tem sido considerada um marcador de SM. Além disso, as citocinas inflamatórias e, mais recentemente, a A-FABP têm sido correlacionadas à carcinogênese e a piores prognósticos de vários tumores, incluindo o de mama. Com o objetivo de avaliar a associação conjunta dessas adipocinas com as características clínico-patológicas do câncer de mama, 159 pacientes foram classificadas em três grupos: não obesas (NO), n= 42; sobrepeso/obesidade (SP/O), n= 73; e sobrepeso/obesidade com síndrome metabólica (SP/O-SM), n= 44. Foram detectadas diferenças significativas das concentrações séricas de A-FABP entre os três grupos, com valores de mediana e variação interquartis (IQR) de 14,7 ng/mL (9,9–21,0), 27,2 ng/mL (17,9–35,2) e 35,6 ng/mL (25,4–50,5), respectivamente, para os grupos NO, SP/O e SP/O-SM, (p< 0,0001). Houve diferença nas concentrações de IL-6 entre os grupos NO e SP/O (0,89 pg/mL (0,53–2,03) vs 1,52 pg/mL (0,85–2,03)), p= 0,0242; e entre os grupos NO e SP/O-SM (0,89 pg/mL (0,53–2,03) vs 1,63 pg/mL (1,13–3,39)), p= 0,0046. Em relação às concentrações de TNF- foi encontrada diferença apenas entre os grupos NO e SP/O-SM (3,21 pg/mL (2,10–4,74) vs 4,86 pg/mL (2,91–6,74)), p= 0,0144. Em relação à associação de A-FABP com as características clínico-patológicas da doença, foram detectadas maiores concentrações de A-FABP em pacientes do grupo SP/O-SM apresentando estadio 2 (ECP II), p= 0,0083 e em portadoras de tumores HER2+, p= 0,0379, no grupo NO. Com relação à IL-6, concentrações mais elevadas foram detectadas em portadoras de tumores com ausência de expressão de receptor de progesterona (RP-), p= 0,0468 e também naquelas com tumores caracterizados como triplo-negativos, p= 0,0411, no grupo total de pacientes. Concentrações mais elevadas de TNF- foram detectadas em pacientes com

ECP III, tanto no grupo total (p= 0,0144), quanto no grupo SP/O (p= 0,0270). As concentrações séricas de A-FABP para o grupo total das pacientes correlacionaram- se diretamente com as de IL-6 (r= 0,2093; p= 0,0145) e de TNF- (r= 0,2761; p= 0,0011). Da mesma forma, no grupo total, foi encontrada correlação direta entre as citocinas IL-6 e TNF-, (r= 0,2096; p= 0,0143). O conjunto desses resultados demonstra que tanto a A-FABP quanto as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF- encontram-se associadas a características clínico-patológicas de maior gravidade. Concentrações mais elevadas de A-FABP foram detectadas no grupo SP/O-SM, sugerindo o papel de A-FABP como um biomarcador da SM, também em pacientes com câncer de mama. Além disso, esta adipocina mostrou associações com tumores de fenótipo mais agressivo e de pior prognóstico tanto no grupo SP/O-SM, como no grupo NO. Como essas associações foram mantidas após ajustes das variáveis IMC, CA e idade/estado menopausal os resultados sugerem relação da A-FABP com maior gravidade de câncer mamário independentemente de obesidade e incentivam o estudo mais aprofundado dessas relações.

Palavras-chave: A-FABP. Obesidade. Síndrome metabólica. Inflamação. Neoplasias da mama.

ABSTRACT Breast cancer is the second most common cancer worldwide and the most common among women. On the other hand, obesity has been linked to the development and progression of several tumors, including breast cancer. In addition, obesity, which is associated with a low-grade inflammatory condition, is closely related to several comorbidities including the metabolic syndrome (MetS). The adipose tissue secretes many bioactive molecules, known as adipokines, and among them, proinflammatory cytokines IL-6 and TNF- and the adipocyte fatty acid-binding protein (A-FABP). In obesity these adipokines are present in higher concentrations, wherein the A-FABP has been considered a marker of MetS. Furthermore, the inflammatory cytokines and, more recently, A-FABP have been correlated to carcinogenesis and worse prognosis of various tumors, including breast cancer. In order to assess the overall association of these adipokines with the clinicopathologic characteristics of breast cancer, 159 patients were classified into three groups: non- obese (NO), n= 42; overweight/obesity (OW/O), n= 73; and overweight/obesity with metabolic syndrome (OW/O-MetS), n= 44. Significant differences were detected in serum concentrations of A-FABP among the three groups, with median values and interquartile range (IQR) of 14.7 ng/mL (9.9 to 21.0), 27.2 ng/mL (17.9 to 35.2) and 35.6 ng/mL (25.4 to 50.5), respectively, for the NO group, OW/O and OW/O-MetS (p< 0.0001). There were differences in IL-6 concentrations between groups NO and OW/O (0.89 pg/mL (0.53 to 2.03) vs 1.52 pg/mL (0.85 to 2.03)), p= 0.0242; and between the NO groups and OW/O-MetS (0.89 pg/mL (0.53 to 2.03) vs 1.63 pg/mL (1.13 to 3.39)), p= 0.0046. In relation to TNF- difference in concentrations was found between the groups NO and OW/O-MetS (3.21 pg/mL (2.10 to 4.74) vs 4.86 pg/mL (2,91 to 6.74)), p= 0.0144. Regarding the association of A-FABP with the clinicopathologic characteristics of the disease, higher concentrations of A-FABP were detected in patients of the OW/O-MetS group with stage II tumors, p= 0.0083 and in patients of the NO group with HER2+ tumors, p= 0.0379. With respect to IL-6, higher concentrations were detected in patients with progesterone receptor negative tumors (PR-), p= 0.0468 and also in those with tumors characterized as triple negative, p= 0.0411, in total group. Higher concentrations of TNF- were detected in patients with stage III tumors, in the total group (p= 0.0144), as in the group OW/O (p= 0.0270). The serum concentrations of A-FABP for the total group of patients was

directly correlated with IL-6 (r= 0.2093, p= 0.0145) and with TNF- (r= 0.2761, p= 0.0011). Likewise, in the whole group has been found a direct correlation between IL-6 and TNF- cytokines, (r= 0.2096, p= 0.0143). These results demonstrate that A-FABP, IL-6 and TNF- are associated with more severe clinicopathologic characteristics. Higher concentrations of A-FABP were detected in OW/O-MetS group, suggesting the A-FABP as a biomarker of MetS, even in breast cancer patients. Furthermore, this adipokine showed associations with more aggressive phenotype of tumors and poor prognosis in both OW/O-MetS group as in NO group. As these associations were maintained after adjusting the variables BMI, WC and age/menopausal status these results suggest relation of A-FABP with greater severity of breast cancer regardless of obesity and encourage further study of these relationships.

Keywords: A-FABP. Obesity. Metabolic syndrome. Inflammation. Breast neoplasms

LISTA DE ESQUEMAS E FIGURAS

Esquema 1: Mecanismos propostos para explicar a associação da obesidade com tumores mamários RE positivos a partir da produção estrogênica extra glandular e da hiperinsulinemia que pode acompanhar a obesidade...... 26

Esquema 2: Relação entre obesidade, adipocinas pró-inflamatórias e comorbidades...... 27

Figura 1: Supostas funções das FABPs no interior das células...... 33

Figura 2: Modelo hipotético do papel da A-FABP (aP2) na via inflamatória nos macrófagos...... 34

Figura 3: Comparação das concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos de estudo de pacientes com câncer de mama...... 52

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1: Características demográficas, antropométricas e bioquímicas das pacientes com câncer de mama agrupadas segundo o estado nutricional...... 50

Tabela 2: Características demográficas, antropométricas e bioquímicas entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM...... 51

Tabela 3: Características clínico-patológicas da doença entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM de pacientes com câncer de mama...... 53

Tabela 4: Comparação das concentrações séricas de A-FABP com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 55

Tabela 5: Comparação das concentrações séricas de IL-6 com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 57

Tabela 6: Comparação das concentrações séricas de TNF- com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 59

Tabela 7: Correlação entre A-FABP e as citocinas pró-inflamatórias no grupo total e nos subgrupos de pacientes com câncer de mama...... 60

Tabela 8: Correlação entre a citocina IL-6 e a TNF- no grupo total e nos subgrupos de pacientes com câncer de mama...... 61

Quadro 1: Subtipos das proteínas transportadoras de ácidos graxos (FABPs) encontrados em humanos...... 30

Quadro 2: Especificações dos anticorpos...... 45

Quadro 3: Critérios para identificação de síndrome metabólica em mulheres...... 46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Português Inglês

proteína transportadora de ácidos graxos de adipocyte fatty acid- A-FABP - / adipócitos binding protein

CA - circunferência abdominal / ------

Hospital da Mulher Prof. Dr. José CAISM - Aristodemo Pinotti, Centro de Atenção / ------Integral à Saúde da Mulher

CEP - Comitê de Ética em Pesquisa / ------

Col-T - colesterol total / ------

DM2 - Diabetes Mellitus tipo 2 / ------

ECP - estadiamento clínico-patológico / ------

enzyme-linked ELISA - ensaio imunoenzimático / immunosorbent assay

FCM - Faculdade de Ciências Médicas / ------

Gli - glicose / ------

HC - Hospital de Clínicas / ------

fração do colesterol correspondente a high-density HDL-Col - / lipoproteína de alta densidade lipoprotein cholesterol human epidermal receptor tipo 2 do fator de crescimento HER2 - / growth factor receptor epidérmico humano 2 insulin-like growth IGF-1 - fator 1 de crescimento semelhante à insulina / factor 1

IB - proteína inibitória kappa B / inhibitory IB protein

IK - proteína quinase de IB / IB kinase

IL-1 - interleucina-1 / interleukin-1

IL-6 - interleucina-6 / interleukin-6

IMC - índice de massa corpórea / ------

IQR - variação interquartil / interquartile range

fração do colesterol correspondente a low-density lipoprotein LDL-Col - / lipoproteína de baixa densidade cholesterol monocyte MCP-1 - proteína 1 quimiotática de monócitos / chemoattractant protein-1 matrix MMP-9 - metaloproteinase 9 de matriz / metalloproteinase-9

NF-B - fator de transcrição nuclear kappa B / nuclear factor kappa B

NO - grupo de pacientes não-obesas / ------

World Health OMS - Organização Mundial da Saúde / Organization

PCR - proteína C reativa / ------

RE - receptor de estrógeno / ------

RP - receptor de progesterona / ------

RXR - receptor de retinoides X / retinoid X receptor

SAA - soro amilóide A / serum amyloid A

grupo de pacientes com SP/O - / ------sobrepeso/obesidade grupo de pacientes com SP/O-MS - sobrepeso/obesidade e síndrome / ------metabólica

TG - triglicérides / ------

tumor necrosis factor- TNF-α - fator de necrose tumoral-alfa / alpha T: extensão do tumor primário N: ausência ou presença e a extensão de TNM - metástase em linfonodos regionais / ------M: ausência ou presença de metástase à distância

UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas / ------

VR - valor de referência / ------

LISTA DE SÍMBOLOS cm - centímetro dL - decilitro g - grama h - hora kg - quilograma

L - litro

M - molar mg - miligrama min - minuto mL - mililitro mmHg - milímetro de mercúrio m2 - metro quadrado n - tamanho da amostra ng - nanograma nm - nanômetro p - p valor, nível de significância estatística pg - picograma rpm - rotação por minuto

ºC - grau Celsius

µg - micrograma

µL - microlitro

µm - micrômetro

SUMÁRIO 1. Introdução...... 23 1.1. O câncer de mama...... 23 1.2. A obesidade, a inflamação e o câncer de mama...... 24 1.3. A síndrome metabólica e o câncer de mama...... 28 1.4. Proteínas transportadoras de ácidos graxos (FABPs) e o câncer...... 29 1.5. Proteína transportadora de ácidos graxos de adipócitos (A-FABP)...... 32 1.6. Interleucina 6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) no contexto do câncer de mama e obesidade...... 37

1.7. Hipótese...... 40 2. Objetivos...... 40 2.1. Geral...... 40 2.2. Específicos ...... 40 3. Sujeitos e Métodos...... 41 3.1. Tipo de estudo...... 41 3.2. Tamanho amostral...... 41 3.3. Seleção dos sujeitos...... 42 3.3.1. Critérios de seleção...... 42 3.4. Coleta de dados gerais...... 43 3.5. Coleta de dados antropométricos...... 43 3.6. Coleta de material biológico...... 44 3.7. Coleta das informações clínico-patológicas...... 44 3.8. Procedimentos laboratoriais...... 45 3.8.1. Exame histopatológico...... 45 3.8.2. Quantificação das concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides e glicose...... 46

3.8.3. Caracterização da presença de síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em estudo...... 46

3.8.4. Quantificação das concentrações séricas de A-FABP...... 47

3.8.5. Quantificação das concentrações séricas de IL-6 e TNF-...... 48 3.9. Análise dos resultados...... 49 4. Resultados...... 49 4.1. Características da população em estudo...... 49 4.2. Comparação das concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos de estudo de pacientes com câncer de mama...... 52

4.3. Características clínico-patológicas da doença entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM...... 53

4.4. Comparação das concentrações séricas de A-FABP com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 54

4.5. Comparação das concentrações séricas de IL-6 com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 56

4.6. Comparação das concentrações séricas de TNF- com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas...... 58

4.7. Avaliação das correlações entre as concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF-α entre os grupos de estudo...... 60

5. Discussão...... 61 6. Conclusões...... 66 7. Referências...... 67 8. Apêndices...... 91 9. Anexos...... 95

1. INTRODUÇÃO

1.1. O câncer de mama

O câncer, de uma forma geral, é uma doença que continua desafiando a medicina e os pesquisadores da área, por se tratar de uma doença sem cura definitiva e pela sua alta incidência e prevalência, sendo responsável por aproximadamente 8,2 milhões de óbitos anuais no mundo todo, o que corresponde a 13% de todos os casos de morte por doença segundo a Organização Mundial da Saúde – OMS (WHO, 2012). Dentre os diversos tipos de neoplasias malignas existentes, o câncer de mama se destaca por ser o segundo tipo mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres, correspondendo a 25% dos casos novos a cada ano no Brasil (INCA, 2015a). Para o ano de 2015 foram estimados 57.120 casos novos, que representam uma taxa de incidência de 56,1 casos por 100.000 mulheres. Além disso, a taxa de mortalidade relacionada ao câncer de mama no país foi de 13,5% em 2012, sendo a causa mais frequente de morte por câncer em mulheres, contabilizando um total de 14.207 óbitos em 2013 (INCA, 2015b).

A causa do câncer de mama, assim como de outras neoplasias, é multifatorial. Os fatores hereditários representam 5 a 10% do total de casos da doença sendo que destes, 20% correspondem a mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 (Amendola e Vieira, 2005). Além do fator hereditário, um fator preponderante para o surgimento do câncer de mama é o avanço da idade, sendo que a partir dos 40 anos a taxa de incidência aumenta progressivamente acompanhada da taxa de mortalidade (INCA, 2015b). Outros fatores bem estabelecidos são a: menarca precoce (menor que 12 anos); menopausa tardia (após os 55 anos); primeira gravidez após os 30 anos; ausência de gestações (nuliparidade); uso de contraceptivos orais (estrogênio-progesterona); terapia de reposição hormonal pós- menopausa (estrogênio-progesterona); exposição a radiação; tabagismo; etilismo; sedentarismo aliado a maus hábitos alimentares provocando sobrepeso e obesidade, principalmente na pós-menopausa (Key et al., 2001; INCA, 2015c). Pesquisas recentes reportam que a obesidade é um dos fatores responsáveis pela alta incidência do câncer de mama, principalmente em países ou regiões mais desenvolvidas (Kuhl, 2005; Porter et al., 2006; Carmichael, 2006; Haakinson et al., 2012; Kamineni et al., 2013; Arnold et al., 2015; Copson et al., 2015; Goodwin e Stambolic, 2015). O estilo de vida ocidental moderno, que inclui dietas hipercalóricas aliadas ao sedentarismo, acarreta aumento da obesidade bem como da incidência 24 das comorbidades associadas, como o desenvolvimento de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer (Klein et al., 2002).

1.2. A obesidade, a inflamação e o câncer de mama

A obesidade se tornou um problema de saúde pública por afetar pessoas de todas as faixas etárias e sociais, atualmente sendo considerada pela OMS uma pandemia. Dados recentes revelam que mais de 600 milhões de adultos no mundo são obesos e que 1,9 bilhões estão com sobrepeso (WHO, 2015). No Brasil, mais de metade da população adulta está acima do peso (52,5%) e mais de 36,5 milhões apresentam obesidade, correspondendo a 17,9% da população total (Brasil, 2014). Devido ao número crescente de pessoas com sobrepeso/obesidade, esse tema assumiu grande relevância científica e social trazendo desafios relacionados à sua complexidade e às comorbidades associadas, tais como: hipertensão; dislipidemia; DM2; esteatose hepática não alcoólica (NAFLD); doença coronariana; e risco aumentado de desenvolvimento de câncer em diferentes tecidos/órgãos (Klein et al., 2002).

A obesidade tem sido associada ao câncer de mama em vários estudos (Trayhurn et al., 2004; Protani et al., 2010; Sinicrope et al., 2011; Campbell et al., 2012; Goodwin et al., 2012; Gilbert e Slingerland, 2013) e tem se mostrado responsável pelo aumento de 30 a 50% na taxa de acometimento de mulheres na pós-menopausa (Tehard, 2006). Além disso, outros estudos indicam que o aumento do índice de massa corpórea (IMC) está associado ao câncer de mama mais agressivo e a um período de sobrevida mais reduzido (Porter et al., 2006).

Várias hipóteses têm sido propostas para explicar a associação da obesidade com o câncer de mama em mulheres no período da pós-menopausa, porém duas delas possuem maior aceitação atualmente: uma delas relacionada ao aumento das concentrações séricas de estrógenos em mulheres obesas na pós- menopausa em comparação com as magras no mesmo período menopausal (Lorincz e Sukumar, 2006); e outra relacionada ao aumento em obesas, principalmente naquelas com Síndrome Metabólica (SM), da insulina e do fator 1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) circulantes, que além de exercerem ação mitogênica (estimulando o crescimento celular), participam de vias que ativam a transcrição de receptores de estrógeno (RE) nas células tumorais mamárias 25

(Moscho e Mantozoros, 2002). E mais recentemente, a inflamação subclínica que cursa com a obesidade, tem sido proposta como um terceiro mecanismo para explicar a associação da obesidade com a instalação e progressão do câncer de mama (Arnold et al., 2015; Strong et al., 2015).

Com relação ao aumento da concentração de estrógenos circulantes em obesas na pós-menopausa, sabe-se que antes da menopausa os estrógenos são produzidos principalmente nos ovários e após a menopausa passam a ser produzidos majoritariamente no tecido adiposo pela ação da enzima aromatase, que converte hormônios andrógenos (sintetizados em sua maioria pelas glândulas adrenais) em estrógenos. O aumento do peso corporal faz com que esta produção extra glandular de estrógeno também aumente, elevando sua concentração plasmática em mulheres obesas na pós-menopausa (Baglietto et al., 2009). Além disso, outros fatores como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e a interleucina 6 (IL-6), secretados pelos adipócitos, atuam de forma autócrina e parácrina estimulando a síntese de aromatase (Purohit et al., 2002). Concentrações mais elevadas de estrógeno circulante estão associadas a um risco aumentado de câncer de mama em mulheres na pós-menopausa (Key et al., 2011), e também a um fenótipo mais invasivo e metastático desses tumores (Vona-Davis e Rose, 2007). Entretanto, a capacidade de responder à ação deste hormônio é dependente da presença e concentração de RE nas células tumorais (Hemsell et al., 1974; Lorincz e Sukumar, 2006). Desta forma, a associação do estrógeno com o desenvolvimento do câncer mamário poderia ser decorrente de sua ação na proliferação das células epiteliais mamárias, ativando vias de sinalização intracelulares mediadas pelos RE (Yager, 2000; Strong et al., 2013). Este mecanismo poderia explicar a associação da obesidade com tumores mamários RE positivos, mas não a relação da obesidade com tumores RE negativos (Godden et al., 1992; Hou et al., 2007).

Conforme citado anteriormente, outro fator que tem sido associado à tumorigênese mamária em mulheres obesas na pós-menopausa é o aumento da concentração de insulina no sangue. Na obesidade ocorrem distúrbios metabólicos que podem causar resistência à insulina, fazendo com que o pâncreas produza esse hormônio em excesso, numa tentativa de equilibrar a glicemia (gerando um estado pré-diabético). O estado hiperinsulinêmico, presente também em pessoas com Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), está associado a um maior risco de desenvolvimento de câncer de mama em mulheres na pós-menopausa (Michels et al., 2003; Boyle et 26 al., 2012; De Bruijn et al., 2013). Nesse mesmo contexto, a grande biodisponibilidade de IGF-1, que pode tanto se ligar a seu receptor (IGF-1R) quanto aos receptores de insulina devido a alta semelhança estrutural entre eles (Gunter et al., 2009), juntamente com a própria insulina, podem atuar na proliferação das células tumorais mamárias, tendo em vista essas células frequentemente expressarem IGF-1R (Frasca et al., 2008). Além da ação mitogênica, a insulina e o IGF-1 podem ativar a transcrição do RE, como demonstrado em linhagens celulares de câncer de mama (Moschos e Mantozoros, 2002). Além disso, estudos demonstram ação sinérgica entre IGF-1 e estradiol na ativação transcricional de RE (Yee e Lee, 2000). Altas concentrações de insulina circulante aumentam a produção de estrogênio pelos ovários, além da produção pelo tecido adiposo e, em conjunto com o IGF-1, vão estimular vias de crescimento das células epiteliais mamárias através de seus respectivos receptores, promovendo a carcinogênese ou progressão tumoral (Jalving et al., 2010).

Além dos dois mecanismos anteriormente propostos, o tecido adiposo, que por muito tempo foi considerado um mero reservatório energético, nas últimas décadas ganhou destaque como órgão endócrino, pela demonstração de sua capacidade de síntese e secreção de diversos produtos bioativos que atuam tanto localmente (ação parácrina) como à distância (ação endócrina), participando ativamente do controle de uma grande diversidade de funções biológicas (Ahima e Flier, 2000; Frayn et al., 2003). Essas moléculas bioativas são coletivamente denominadas adipocinas e podem atuar no metabolismo lipídico, glicídico, 27 homeostase vascular e angiogênese. Há uma diversidade considerável de adipocinas em termos de estrutura proteica e funções, dentre elas, a leptina (hormônio que atua na homeostase energética), a adiponectina (com propriedades antidiabetogênica, antiaterogênica e anti-inflamatória), o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), a proteína 1 quimiotática de monócitos (MCP-1), o inibidor 1 do ativador do plasminogênio (PAI-1), as citocinas pró-inflamatórias TNF-, IL-6, IL-8 e IL-1β, a proteína de fase aguda, SAA (que é predominantemente sintetizada no fígado, mas também pelos adipócitos), entre outras (Trayhurn et al., 2006). Na vigência da obesidade, o aumento do tecido adiposo faz com que haja uma secreção alterada dessas adipocinas, sendo que ocorre um aumento da síntese de citocinas e proteínas pró-inflamatórias (como TNF-, IL-6, IL-1 e SAA) e diminuição da secreção de adiponectina, contribuindo para o desenvolvimento da SM, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer (Fantuzzi, 2005; Poitou et al., 2006). O tecido adiposo é o responsável pela inflamação crônica de baixo grau que acompanha a obesidade (Tilg et al., 2006; Baumgarten et al., 2012), apresentando também a capacidade de recrutar e interagir com outras células do sistema imune, tais como os macrófagos (Hotamisligil, 2006; Deiuliis et al., 2011). Harford e colaboradores (2011) sugerem que a infiltração de macrófagos no tecido adiposo contribui para a manutenção da resposta inflamatória da obesidade, pois estes liberam citocinas, tais como: IL-1β, IL-6 e TNF-; aumentando o estímulo inflamatório.

Esquema 2: Relação entre obesidade, adipocinas pró-inflamatórias e comorbidades.

A inflamação é comum no câncer de mama e a liberação contínua de mediadores inflamatórios, bem como a produção desregulada de adipocinas pelo 28 tecido adiposo, têm sido propostas como mecanismos importantes na instalação e progressão da doença (Hou et al., 2007; Blann et al., 2002). Sua associação com a promoção de carcinogênese tem sido demonstrada por processos complexos, como a polarização de macrófagos associados ao tumor (TAM), via ação de citocinas e subsequente produção de fatores de crescimento tumoral, ou pela promoção de angiogênese (De Nardo e Coussens, 2007; Ulrich et al., 2006). Vários componentes da resposta de fase aguda estão elevados no câncer de mama, incluindo IL-6, IL-1, TNF-, proteína C reativa (PCR) e SAA (Blann et al., 2002; Alokail et al., 2014). Entretanto, essa associação parece não se limitar à simples elevação de níveis séricos, muitas vezes sugerindo participação efetiva nos mecanismos causais e/ou evolutivos da doença.

1.3. A síndrome metabólica e o câncer de mama

A obesidade ocasiona várias disfunções, incluindo alterações no metabolismo lipídico, da glicose e da função arterial, e estas alterações encontram- se associadas com o estado inflamatório subclínico (Alberti et al., 2009). A SM é caracterizada pela presença de pelo menos três dos seguintes critérios: hipertensão arterial sistêmica, hiperglicemia, redução plasmática de HDL-colesterol, aumento das concentrações plasmáticas de triglicérides e obesidade central (NCEP-ATP III, 2005). Vários estudos têm associado a SM ao risco aumentado de desenvolvimento de câncer de mama e também ao seu pior prognóstico (Rosato et al., 2011; Bao et al., 2013). Alguns estudos mostram a associação da SM com características de maior gravidade no câncer de mama de mulheres no período pós- menopausa. No estudo de Agnoli e colaboradores (2015) foi demonstrado que a SM se associa a um risco maior de desenvolvimento do câncer mamário em mulheres na pós-, mas não em mulheres na pré-menopausa. Outro estudo verificou que pouco mais da metade (51%) das pacientes na pós-menopausa com tumores em estágios mais avançados (II e IV) apresentavam SM (Healy et al., 2010).

Além disso, a presença de SM também foi associada a tumores mamários triplo-negativos, sugerindo possíveis interações entre as alterações metabólicas e a gravidade dos tumores (Maiti et al., 2010). Em relação à sobrevida livre de doença, Pasanisi e colaboradores (2006) demonstraram que a chance de pacientes com câncer de mama que apresentavam SM ao diagnóstico desenvolver metástase 29

(local, contralateral ou à distância) era três vezes maior do que as que não apresentavam.

Por outro lado, alguns estudos reportam que o próprio tratamento quimioterápico adjuvante pode ser um dos fatores que contribui para o surgimento da SM em mulheres com câncer de mama. Esses estudos demonstram que ocorre um aumento significativo na adiposidade corporal dessas mulheres, seja no aumento da massa de gordura, seja na alteração da distribuição desta adiposidade ou na alteração do perfil lipídico, levando ao desenvolvimento da SM (Levine et al.,1991; Campbell et al., 2007; Arpino et al., 2015; Vagenas et al., 2016).

1.4. Proteínas Transportadoras de Ácidos Graxos (FABPs) e o câncer

Durante as últimas décadas um grande número de pesquisas vem sendo direcionado à compreensão de mecanismos moleculares e vias metabólicas relacionadas à carcinogênese e à progressão do câncer de mama (Hammamieh et al., 2005; Liu et al., 2011), assim como de diversos tipos de cânceres, tais como: de pele (Slipicevic et al., 2008), próstata, bexiga, rim (Tolle et al., 2011),cólon, pulmão, pâncreas e estômago (Xu et al., 2010). Portanto, existe uma crescente importância no entendimento desses mecanismos e interações biológicas, tanto para o aprimoramento do diagnóstico precoce, pela caracterização de biomarcadores (Hammamieh et al., 2005; Liu et al., 2011), como para dar suporte científico a uma futura aplicabilidade terapêutica (Hammamieh et al., 2005).

Pesquisas recentes relacionam inúmeras moléculas biológicas com um tipo específico de câncer, atribuindo-lhes importância em mecanismos como a apoptose, angiogênese, indução de fatores pró-inflamatórios, entre outros (Boord et al., 2002; Xu et al., 2006; Mohlig et al., 2007; Xu et al., 2010; Furuhashi et al., 2011). Dentre essas moléculas estão as chaperonas lipídicas da família das proteínas transportadoras de ácidos graxos (FABPs, sigla em inglês para fatty acid-binding proteins) (Slipicevic et al., 2008; Storch et al., 2008; Furuhashi et al., 2008; Owada et al., 2008; Liu et al., 2011; Tolle et al., 2011).

Desde a descoberta inicial das FABPs em 1972 (Ockner et al., 1972) pelo menos doze subtipos de FABPs foram encontradas em tecidos de animais vertebrados, sendo que dez destes foram isolados em órgãos ou tecidos de mamíferos. Cada um desses subtipos possui uma função específica, além de funções interligadas, normalmente relacionadas ao transporte e metabolismo de 30

ácidos graxos de cadeia longa (Storch et al., 2009). Originalmente essas proteínas foram nomeadas de acordo com o primeiro tecido em que foram detectadas ou isoladas, como segue no Quadro 1:

Quadro 1: Subtipos das proteínas transportadoras de ácidos graxos (FABPs) encontrados em humanos Gene Nome comum Nomes alternativos 1º Local de isolamento

FABP1 Liver FABP L-FABP fígado

FABP2 Intestinal FABP I-FABP intestino

FABP3 Heart FABP H-FABP, MDGI coração

FABP4 Adipocyte FABP A-FABP, aP2, ALBP tecido adiposo

E-FABP, K-FABP, PA-FABP, FABP5 Epidermal FABP pele mal1

FABP6 Ileal FABP IL-FABP, I-BABP, gastrotropin íleo

FABP7 Brain FABP B-FABP, MRG cérebro

M-FABP, My-FABP, mielina-P2, sistema nervoso FABP8 Myelin FABP PMP2 periférico

FABP9 Testis FABP T-FABP testículo

FABP12 Não possui Não possui retinoblastoma

Adaptado de: Furuhashi M e Hotamisligil GS Nat Rev Drug Discov. 2008 Jun;7(6):489-503

Entretanto, atualmente a nomenclatura numérica para os vários genes das FABPs vem sendo utilizada, pelo fato destas proteínas mostrarem ampla distribuição em diferentes tecidos (Furuhashi et al., 2008), como segue: FABP1 (L-FABP) expressa pelo fígado, intestino, pâncreas, rins, pulmão e estômago; FABP2 (I-FABP) expressa pelo intestino e fígado; FABP3 (H-FABP) expressa no tecido muscular cardíaco e esquelético, cérebro, rins, pulmão, estômago, testículos, aorta, glândula adrenal, glândula mamária, placenta, ovário e tecido adiposo marrom; FABP4 (A-FABP) expressa principalmente pelos adipócitos maduros e macrófagos, mas também pelas células dendríticas, células endoteliais microvasculares e camadas do trofoblasto da placenta humana; FABP5 (E-FABP) expressa pela epiderme, língua, adipócitos, macrófagos, células dendríticas, glândula mamária, coração, cérebro, intestino, rins, pulmão, retina, músculo 31 esquelético, testículos, fígado e baço; FABP6 (IL-FABP) encontrada no íleo, ovário, glândula adrenal e estômago; FABP7 (B-FABP) expressa pelo sistema nervoso central, células da glia, retina e glândula mamária; FABP8 (M-FABP) expressa no sistema nervoso periférico e células de Schwann; FABP9 (T-FABP) expressa pelos testículos, glândulas salivares e mamárias; e FABP12 encontrada na retina e testículos murinos e retinoblastoma humano (Storch e Corsico, 2008; Liu et al., 2008; Scifres et al., 2012).

Muitos estudos relacionam as FABPs com oncologia, correlacionando-as a diversos processos celulares, como crescimento e invasão. Alta expressão de FABP1 foi detectada em linhagens de células do fígado durante a proliferação celular como a carcinogênese ou regeneração (Chen et al., 1986); FABP7 está envolvida com a proliferação celular e invasão in vitro, e pode estar associada com a progressão do melanoma (Slipicevic et al., 2008). Das e colaboradores (2001), observaram que em células tumorais de próstata a FABP4 e FABP5 apresentaram uma redução de 3 a 20 vezes em sua expressão quando comparadas com células prostáticas normais, ao passo que a expressão de FABP1 e FABP2 apresentou um aumento de 5 a 9 vezes. Foi demonstrado que a superexpressão da FABP5 em linhagens celulares de carcinoma de células escamosas bucal aumenta a proliferação celular e modula a síntese da metaloproteinase 9 de matriz (MMP-9), que é uma das proteínas responsáveis pelo aumento da invasividade das células metastáticas (Fang et al., 2010). Em outro estudo feito com linhagens celulares de colangiocarcinoma intra-hepático a superexpressão da FABP5 também foi correlacionada com um aumento na proliferação celular e invasão (Jeong et al., 2012).

Já com relação ao câncer de mama, altas expressões de FABP1 e FABP2 foram observadas em linhagens celulares de câncer mamário humano, mas não em linhagem de células mamárias normais (Hammamieh et al., 2005). A alta expressão de FABP5 foi relacionada a uma menor sobrevida global e livre de doença em pacientes com tumores triplo-negativos (Liu et al., 2011). Também foi observada nesse tipo de tumor (que é naturalmente mais agressivo e de pior prognóstico), uma maior expressão de FABP7, mas ainda não foi esclarecido seu papel na progressão tumoral (Tang et al., 2010).

1.5. Proteína Transportadora de Ácidos Graxos de Adipócitos (A-FABP)

A A-FABP também chamada de FABP4 (nome do lócus do gene humano), aP2 (adipocyte Protein 2 - nome do lócus do gene murino) ou ALBP (Adipocyte Lipid-Binding Protein), é uma proteína de peso molecular de 14,6 kDa, possuindo 132 resíduos de aminoácidos, cuja localização cromossomal é 8q21 (GenBank accession number NM_024406; Protein Data Bank code: 2hnx). Assim como as demais FABPs, a A-FABP está envolvida no transporte intracelular dos ácidos graxos (AG) para organelas ou compartimentos específicos na célula, como: gotículas de lipídeo (para armazenamento); retículo endoplasmático (para sinalização, transporte e síntese de membrana); mitocôndria ou peroxissomo (para oxidação); enzimas citosólicas ou outras enzimas (para regular sua atividade); núcleo (para o controle transcricional via receptores hormonais nucleares - NHRs ou outros fatores transcricionais ativados por lipídeos); ou ainda fora da célula, para sinalização de forma autócrina ou parácrina (Figura 1).

De forma geral, a A-FABP se liga apenas a um AG de cadeia longa (C16- 20) de cada vez, ou seja, a relação estequiométrica é de 1:1. A A-FABP é uma das proteínas intracelulares transportadoras de lipídios mais abundante nos adipócitos maduros, podendo atingir até 6% do total de proteína celular (Baxa et al., 1989). Também interage com fatores de transcrição da família de Receptores Ativados por Proliferadores de Peroxissomas (PPARs), mais especificamente o PPAR-que modula sua expressão(Tan et al., 2002). A expressão da A-FABP é altamente regulada durante a diferenciação dos adipócitos, e seu mRNA é transcricionalmente controlado por ácidos graxos, agonistas do PPAR- e pela insulina (Haunerland e Spener, 2004; Makowski e Hotamisligil, 2005).

Figura 1: Supostas funções das FABPs no interior das células: Como chaperonas lipídicas, as FABPs atuam no transporte de ácidos graxos para compartimentos específicos da célula: a gotículas lipídicas para estocagem; ao retículo endoplasmático para sinalização, síntese e transporte de membrana; à mitocôndria ou ao peroxissomo para oxidação; a enzimas citosólicas ou outras enzimas para regular sua atividade; ao núcleo para o controle transcricional via receptores hormonais nucleares (NHRs) ou outros fatores transcricionais ativados por lipídeos; ou mesmo fora da célula para sinalização de forma autócrina ou parácrina. AG, ácidos graxos; FABP, proteína transportadora de ácidos graxos; NHRs, receptores hormonais nucleares. Adaptado de: Furuhashi M e Hotamisligil GS Nat Rev Drug Discov. 2008 Jun;7(6):489-503.

Dentre as isoformas da família de FABPs, a A-FABP é a mais amplamente estudada e melhor caracterizada. Camundongos deficientes para aP2 (análoga à A-FABP em humanos) com obesidade induzida por dieta, apresentaram redução na hiperinsulinemia, na hiperglicemia e na resistência à insulina, quando comparados com camundongos normais (selvagens) submetidos às mesmas condições (Hotamisligil et al., 1996; Uysal et al., 2000). A expressão reduzida de A-FABP no tecido adiposo humano mostrou correlação com concentrações séricas de triglicérides diminuídas e risco reduzido para desenvolvimento de DM2 (Tuncman et al., 2006). Também foi demonstrado que em macrófagos de camundongos 34

deficientes em aP2, a produção de citocinas inflamatórias (como a IL-6 e o TNF-) e quimiocinas (como a proteína 1 quimiotática de monócitos, MCP-1) é comprometida, pois na ausência de aP2, os ácidos graxos livres inibem a via clássica do fator de transcrição nuclear-kappa B (IKK/NF-B), sugerindo que a A-FABP age como um fator regulador da atividade inflamatória dos macrófagos (Figura 2) (Makowski et al., 2005).

Figura 2: Modelo hipotético do papel da A-FABP (aP2) na via inflamatória nos macrófagos: Na presença da aP2 (ilustração à esquerda) a disponibilidade de ácidos graxos (AG) é restrita e, consequentemente, os AGs ficam incapazes de interagir com os alvos, como PPAR e componentes da via IKK/NF-B. Assim, a aP2 pode controlar a sinalização através dessas vias. Na ausência da aP2 (ilustração à direita) o aumento na disponibilidade de AGs inibe a via IKK/NF-B, resultando no bloqueio das respostas inflamatórias, e aumento da atividade PPAR. AG, ácido graxo; RXR, receptor X de retinóides; PPAR, receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma; NF-B, fator nuclear kappa B; IKK, proteína quinase de IB; IB, proteína inibitória de kappa B Adaptado de: Makowski L et al. J Biol Chem. 2005 Apr 1;280(13):12888-95.

Há pouco menos de uma década pesquisas mostraram que a A-FABP, além de ser encontrada no citosol celular, é encontrada abundantemente no soro humano (Xu et al., 2006; Tso et al., 2007; Yeung et al., 2007). A partir de então, vários experimentos in vitro, em modelos animais, e estudos populacionais foram conduzidos a fim de esclarecer qual função ou funções essa proteína poderia exercer nos processos locais ou à distância e por quais vias ou mecanismos seria secretada (Xu et al., 2007; Cabré et al., 2010; Durovcová et al., 2010; Kim et al., 2011; Das, 2013; Huang et al., 2013; Kralisch et al., 2013; Wu et al., 2014). No estudo pioneiro de Xu e colaboradores (2006), as concentrações séricas de A-FABP foram quantificadas em homens e mulheres, sendo observados valores mais elevados em indivíduos com sobrepeso/obesidade de ambos os sexos, em 35 comparação com os não obesos e também foi constatado que as concentrações eram menores em homens do que nas mulheres, entre aqueles com sobrepeso/obesidade, mas não houve diferença entre os não obesos. No mesmo estudo, altas concentrações séricas de A-FABP foram correlacionadas com circunferência abdominal elevada, dislipidemia, hipertensão e resistência à insulina, ou seja, todos os componentes da SM, sugerindo que a A-FABP poderia ser clinicamente utilizada como um biomarcador para o diagnóstico de distúrbios cardiovasculares e metabólicos relacionados à obesidade.

Foi demonstrado que essa proteína participa da interação entre a via metabólica e a via imunológica, sendo também relacionada ao estado de inflamação crônica associada a vários distúrbios metabólicos, tais como obesidade, resistência à insulina, DM2, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia e aterosclerose, apresentando valores mais elevados de concentração plasmática nesses casos (Xu et al., 2006; Storch et al., 2009; Terra et al., 2011; Furuhashi et al., 2011; Wang, 2012).

Recentemente Ertunc e colaboradores (2015) demonstraram que a A-FABP age como uma adipocina para regular o metabolismo sistêmico e é secretada por uma rota alternativa, já que estudos moleculares demonstraram que não possui o sinal peptídico necessário para a via clássica de secreção pelo aparelho de Golgi/retículo endoplasmático. A A-FABP pode ainda agir sobre outros órgãos, como o fígado, atuando nos processos de gliconeogênese, modulando o metabolismo energético no jejum prolongado (Cao et al., 2013).

Além de suas funções no metabolismo lipídico e inflamação, a A-FABP foi associada ao crescimento de células tumorais e ao aumento de seu poder de invasão (Nieman et al., 2011; Cataltepe et al., 2012; Lee et al., 2014). Nieman e colaboradores (2011), ao estudarem a relação entre os adipócitos peritumorais de metástase no omento e as células ovarianas do tumor primário humano, verificaram maior expressão de A-FABP nas metástases do omento em comparação com o tumor primário. Além disso, observaram uma menor proliferação tumoral e metástase, em camundongos deficientes em A-FABP (aP2-/-). Já, em estudo com glioblastomas, foi observado que a porcentagem de células que expressavam a A-FABP era diretamente proporcional ao aumento do grau do tumor, com expressão significantemente maior em comparação com o tecido cerebral normal e com tumores gliais de baixo grau (Cataltepe et al., 2012). 36

Herroon e colaboradores (2013) observaram alta expressão de A-FABP em metástase óssea de tumor prostático de humanos e de camundongos obesos, sendo que em lesões benignas ou tumor primário a expressão era reduzida em relação às metástases. Contrariamente, em células de linhagem tumoral de próstata (DU145) que não expressam A-FABP, verificou-se que quando estas eram transfectadas com vetor contendo o cDNA de A-FABP, as células tumorais eram induzidas à apoptose, sugerindo à A-FABP um papel de supressora tumoral (De Santis et al., 2004). Outro estudo também verificou baixa ou nenhuma expressão de A-FABP em lesões invasivas de carcinoma urotelial humano, enquanto que as biópsias não malignas e não invasivas apresentaram alta expressão (Ohlsson et al., 2005). No estudo de Hancke e colaboradores (2010) a A-FABP foi associada ao risco de desenvolvimento do câncer mamário, ao serem verificadas concentrações séricas mais elevadas em pacientes com câncer de mama quando comparadas com pacientes que apresentavam apenas lesões benignas. Além disso, nesse mesmo estudo, a A-FABP foi associada a tumores de pior prognóstico, sendo que pacientes com acometimento de linfonodos regionais e com tumores maiores que 2 cm apresentaram concentrações séricas mais elevadas. Porém, a literatura direcionada ao câncer de mama ainda é escassa. Há um crescente número de estudos genômicos e funcionais/mecanicistas com intuito de se compreender melhor as diversas vias em que a A-FABP participa, visando uma aplicabilidade clínica, tanto para atribuir valor de molécula biomarcadora de risco para o surgimento de determinada doença, como para ser utilizada como fator prognóstico (Tuncman et al., 2006; Chan et al., 2010; Khalyfa et al., 2010; Saksi et al., 2014). Descobertas recentes demonstram a importância do estudo dessa proteína como alvo de pesquisas farmacêutico- bioquímicas, com finalidades terapêuticas para as doenças metabólicas. Entre elas destaca-se o desenvolvimento de moléculas capazes de bloquearem a ligação dos ácidos graxos à A-FABP (como o BMS309403, o HTS01037 e a pimozida) impedindo sua ação (Furuhashi et al., 2007; Sulsky et al., 2007; Hertzel et al., 2009; Wang et al., 2015); de fármacos, como a sitagliptina, capazes de reduzir as concentrações séricas de A-FABP através de mecanismos indiretos (Furuhashi et al., 2015); de medicamentos cujo efeito adverso seja a inibição da A-FABP, como é o caso do antibiótico levofloxacino (Wang et al., 2014) e do agente uricosúrico benzbromarona (Cai et al., 2013); de anticorpos monoclonais capazes de neutralizarem sua ação (Miao et al., 2015) ou ainda de interferência por RNA (RNAi), capaz de suprimir a expressão de A-FABP (Won et al., 2014). Desta forma, a 37 possibilidade de se utilizar esses bloqueadores ou inibidores como auxiliares no tratamento dos cânceres, incentiva ainda mais a investigação dos mecanismos fisiopatológicos que envolvem a A-FABP nos diferentes tipos de câncer.

1.6. A interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-) no contexto do câncer de mama e obesidade

A interleucina-6 (IL-6) é uma molécula pleiotrópica que desempenha uma ampla variedade de atividades biológicas em diferentes tipos celulares, incluindo células tumorais (Guo et al., 2012). Pode atuar como uma citocina pró-inflamatória ou como uma miocina anti-inflamatória (Petersen e Pedersen, 2005). Na vigência de uma inflamação, fatores como a interleucina-1 (IL-1), lipopolissacarídeos (LPS) e TNF- podem estimular a síntese de IL-6 pela via transcricional NF-B em diversas populações celulares, sendo os fibroblastos, células endoteliais, monócitos, macrófagos, linfócitos B e T e adipócitos suas principais fontes. É importante ressaltar que todas essas populações celulares podem ser encontradas no microambiente tumoral (Sullivan, 2011). A IL-6 desenvolve um papel importante nas respostas inflamatórias, atuando sobre os hepatócitos que são estimulados a sintetizarem proteínas de fase aguda, como a proteína C reativa (PCR) e a soro amilóide A (SAA). O tecido adiposo é uma importante fonte de IL-6 para a circulação sistêmica, existindo uma correlação direta entre produção de IL-6 e a massa adiposa (Mohamed-Ali et al., 1997) e havendo evidências de que o tecido adiposo visceral é o maior responsável por esta produção (Fried et al., 1998). Por outro lado, a redução da massa adiposa através do emagrecimento, é acompanhada de redução das concentrações circulantes de IL-6 (Bastard et al., 2000). Em concentrações normais a IL-6 é essencial nas modulações de mecanismos de defesa do hospedeiro, porém em altas concentrações está associada a diversas patologias, atuando em processos que geram resistência à insulina e podendo atuar na progressão de tumores, estimulando angiogênese, inibindo a apoptose de células tumorais e causando resistência à quimioterapia (Guo et al., 2012). Além disso, diversos estudos constataram elevadas concentrações séricas de IL-6 em pacientes com câncer de mama em comparação com grupo controle de mulheres saudáveis (Zhang e Adachi, 1999; Purohit et al., 2002; Sullivan 38 et al., 2009), e também correlação direta com o estadio do tumor (Kozlowski et al., 2003). A alta expressão de IL-6 em tumores de mama primários, acompanhada de concentrações séricas elevadas, tem sido associada a um pior prognóstico nessas pacientes, podendo ser considerada um biomarcador precoce de metástase (Zhang e Adachi, 1999; Bachelot et al., 2003; Salgado et al., 2003). No estudo de Dirat e colaboradores (2011) foi verificada alta expressão de IL-6 nos adipócitos peritumorais, e esta expressão foi associada a um perfil fenotípico mais agressivo das células tumorais mamárias. Concentrações séricas mais elevadas de IL-6 são observadas em pacientes com tumores que não apresentam receptores de estrógeno (RE-), que são tumores de pior prognóstico. O mecanismo dessa correlação inversa é bem caracterizado, uma vez que o RE se liga diretamente a proteínas da via NF-B, evitando a expressão do gene IL6 (Galien e Garcia, 1997). O TNF-, assim como a IL-6, é uma citocina pleiotrópica que induz respostas celulares, tais como: a proliferação celular; a produção de mediadores inflamatórios; a morte celular; e resistência à insulina (Hotamisligil, 2005; Schwabe e Brenner, 2006). Esta citocina é sintetizada por macrófagos ativados, monócitos, hepatócitos e também por adipócitos (Hotamisligil et al., 1995; Ajuwon e Spurlock, 2005; Choi et al., 2011). Em concentrações moderadas, o TNF- medeia os efeitos sistêmicos da inflamação, tais como: febre; síntese de proteínas de fase aguda (como a PCR e a SAA); e produção de leucócitos pela medula óssea (Pfeffer, 2003). Entretanto, a produção de TNF- não é restrita apenas ao contexto de inflamação, estando fortemente associada à obesidade, pelo aumento de suas concentrações séricas (Dandona et al., 1998), sendo que com a perda de peso estas concentrações diminuem (Kern et al., 1995; Ziccardi et al., 2002). Além disso, a concentração sérica elevada desta citocina está associada à hipertrigliceridemia, resistência à insulina, DM2, baixas concentrações circulantes de HDL-Col e altas concentrações de LDL- Col, hipertensão arterial e SM (Uysal et al., 1997; Moller, 2000; Willerson e Ridker, 2004; Dandona et al., 2005). O TNF- foi a primeira citocina inflamatória identificada como sendo secretada por adipócitos (Hotamisligil et al., 1993), sendo descobertas outras citocinas e adipocinas ao longo dos anos subsequentes, tais como: IL-6; IL-1β; SAA; leptina; adiponectina; omentina; visfatina; adipolina; e resistina; entre outras (Smitka e Maresova, 2015). Uma vez secretado, o TNF- atua preferencialmente por meio de dois receptores: o TNF-R1 e o TNF-R2. A ligação do TNF- a estes receptores 39 induz a transmissão do sinal intracelular que pode resultar na ativação de diferentes eventos, como regulação de apoptose e ativação da transcrição de genes de resposta inflamatória, inclusive genes codificadores de outras citocinas como IL-1β, IL-6, IL-10 e o próprio TNF- (Hotamisligil, 2003). Apesar dessa citocina ter sido nomeada como sendo um fator de necrose tumoral, o TNF- desempenha um papel paradoxal na gênese e evolução câncer. Na administração local de altas concentrações de TNF- ocorre uma regressão seletiva nos vasos sanguíneos que irrigam os tumores, além de outras ações antitumorais (Lejeune et al., 1998). Mas, quando produzido cronicamente, o TNF- pode agir como um promotor tumoral endógeno, contribuindo para o remodelamento tecidual e o desenvolvimento estromal, necessários para o crescimento e invasividade do tumor (Balkwill e Mantovani, 2001). Os processos globais relacionados à promoção da gênese tumoral pelo TNF- podem ser mediados pela sua capacidade de induzir funções pró-angiogênicas, de promover a expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e moléculas de adesão endotelial e de causar danos ao DNA, via espécies reativas de oxigênio (Balkwill, 2002). A expressão de TNF- no microambiente tumoral foi detectada em diferentes tipos de câncer, incluindo o de mama (Szlosarek e Balkwill, 2003). Concentrações séricas aumentadas de TNF- no pré-operatório foram associadas a tumores mamários em estágios mais avançados (Sheen-Chen et al., 1997). Alokail e colaboradores (2014) analisaram transcritos de TNF- e IL-6, pela técnica de PCR em tempo real, em leucócitos do sangue periférico de pacientes com câncer de mama e observaram um aumento de expressão de 2,1 e 2,3 vezes, respectivamente, comparado com controles saudáveis, sugerindo que essas citocinas poderiam ser utilizadas como marcadoras da doença.

A literatura apresenta vários estudos que demonstram as associações entre câncer de mama e obesidade (Protani et al., 2010; Sinicrope et al., 2010; Wang e DuBois, 2012), A-FABP e obesidade (Makowski e Hotamisligil, 2004; Xu et al., 2006; Furuhashi et al., 2011; Wang et al., 2012) e A-FABP e citocinas pró- inflamatórias (Xu et al., 2006; Terra et al., 2011; Huang et al., 2013; Das, 2013; Hao et al., 2014). Todavia, até o momento, a relação conjunta entre A-FABP, obesidade e câncer mamário só foi explorada em um único estudo (Hancke et al., 2010), mas que não avaliou a associação com citocinas pró-inflamatórias, nem com a presença de SM. 40

Desta forma, o presente trabalho tem como finalidade ampliar esta abordagem, por investigar a associação da A-FABP e citocinas pró-inflamatórias com obesidade e SM, em portadoras de câncer de mama, na pré ou pós- menopausa. Este estudo poderá trazer contribuição importante para o complexo cenário da fisiopatologia do câncer de mama associado à obesidade.

1.7. Hipótese

Pacientes com concentrações mais elevadas de A-FABP apresentarão características clínico-patológicas de maior gravidade e esta condição será dependente de obesidade, podendo estar associada às concentrações séricas das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-.

2. OBJETIVOS

2.1. Geral:

Avaliar a associação entre as concentrações séricas de A-FABP e das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF- com a obesidade e com as características clínico-patológicas do câncer mamário.

2.2. Específicos:

 Investigar a presença de síndrome metabólica (SM) entre os grupos de portadoras de câncer de mama com sobrepeso/obesidade (SP/O) e não obesas (NO).

 Comparar as concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos de estudo.

 Investigar a associação das concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- com as características clínico-patológicas da doença.

 Investigar a correlação entre as concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF-.

3. SUJEITOS E MÉTODOS

3.1. Tipo de estudo

Trata-se de estudo transversal com pacientes com câncer de mama. As pacientes foram atendidas nos ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia Clínica do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti - Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM), pertencente à Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

3.2. Tamanho amostral

Para definição do tamanho amostral foi considerada a frequência de portadoras de câncer de mama eutróficas (não obesas), atendidas nos ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia Clínica do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti (CAISM-UNICAMP) que corresponde a 37% do total de atendimentos (cerca de 350 casos de todos os tipos de câncer de mama por ano) (Zorlini et al., 2008). Desta forma, o tamanho teórico da amostra total (n= 258) foi determinado a partir de estimativa aproximada entre a frequência de portadoras de câncer de mama eutróficas (n= 129) pareada com o número de portadoras com sobrepeso/obesidade. Todavia, para a classificação das pacientes desse estudo foi preconizado o uso simultâneo de dois critérios: Índice de massa corpórea (IMC) e presença/ausência de adiposidade central inferida pela medida da circunferência abdominal (CA) (WHO, 1997). Desta forma, na prática, a soma de critérios (IMC e CA) para a composição do grupo de não obesas (NO) impediu o alcance do tamanho amostral teórico. Isto se justificou pelo fato da frequência de eutrofia de 37% estimada por Zorlini e colaboradores (2008) só ter levado em conta o IMC. Na realidade, a frequência de eutróficas verdadeiras (duplo critério) é bem mais baixa, devido à alta frequência de adiposidade central entre as pacientes. A proporção encontrada foi de aproximadamente 1/3 de pacientes eutróficas para aquelas com sobrepeso/obesidade (SP/O), o que inviabilizou o estudo tipo caso/controle, passando a caso/comparação. Além disso, os critérios de seleção no presente estudo limitaram ainda mais o alcance do tamanho amostral teórico. Sendo assim, a amostra final foi composta por 159 pacientes: 117 no grupo com (SP/O) e 42 no grupo de comparação (NO). 42

3.3. Seleção dos sujeitos

Durante o período de Novembro de 2009 a Fevereiro de 2014 foram incluídas no estudo, consecutivamente, pacientes adultas com carcinoma ductal invasivo (CDI) na fase pré ou pós-menopausa (sendo que a fase pós-menopausa foi determinada pela ausência de menstruação por doze meses consecutivos (Izetbegovic et al., 2013)), e que tivessem assinado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice 1).

3.3.1. Critérios de seleção

Os critérios de inclusão para o grupo SP/O foram: diagnóstico de CDI; sobrepeso ou obesidade (IMC ≥25 kg/m2 e presença de gordura abdominal - CA >88 cm), e que aceitaram participar do estudo proposto.

Os critérios de inclusão para o grupo NO foram: diagnóstico de CDI; IMC normal: 18,5 a 24,9 kg/m2 e CA ≤ 88 cm e que aceitaram participar do estudo proposto.

Não foram incluídas nesse estudo as pacientes com as seguintes características (Check List – Apêndice 3):  que não aceitaram participar do estudo;  com IMC abaixo do normal (IMC < 18,5);  que tivessem recebido tratamento quimioterápico e/ou radioterápico prévio;  que tivessem outro tipo de câncer associado;  com sinais clínicos e/ou relato de infecções ou inflamações agudas ou crônicas;  relato de doença autoimune;  relato de doenças alérgicas ou pulmonares crônicas;  relato de cardiopatias;  relato de vacinação recente;  relato de imunossupressão.

3.4. Coleta de dados gerais

As pacientes foram identificadas na véspera da cirurgia quando de suas internações para remoção cirúrgica de seus tumores. Foram esclarecidas sobre as características do estudo e convidadas a participar dele. Após leitura e assinatura do TCLE, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas (FCM), UNICAMP, sob o registro no 782/2009 e adendo (Anexo 1), foram submetidas a uma única entrevista para a verificação da possibilidade de inclusão no estudo. No momento da entrevista, as pacientes respondiam um questionário sobre seus hábitos alimentares, prática de atividade física e uso de medicamentos. Além disso, eram submetidas à coleta de dados antropométricos. Os dados relativos à etnia e às características clínico-patológicas da doença foram obtidos dos prontuários de cada paciente para preenchimento da ficha de coleta de dados (Apêndice 2).

3.5. Coleta de dados antropométricos

Foram obtidos dados antropométricos das pacientes (peso, altura e medida da circunferência abdominal – CA) na véspera da cirurgia. As medidas de peso e altura foram utilizadas para o cálculo do índice de massa corpórea (IMC), categorizado de acordo com a OMS (WHO 2013): IMC normal: ≥ 18,5 ≤ 24,99 kg/m2, IMC sobrepeso: ≥ 25 kg/m2 ≤ 29,99 kg/m2 e IMC obesidade: ≥ 30 kg/m2. Já a CA foi obtida por meio de fita métrica, na altura da cicatriz umbilical (Jansen et al., 2004) e com ponto de corte estabelecido de acordo com a OMS: normal: ≤ 88 cm; elevado: > 88 cm (WHO, 1997).

3.6. Coleta de material biológico

No dia da cirurgia, as pacientes em jejum prévio de 12 horas, foram submetidas à coleta de duas amostras de 8 mL de sangue (em tubos Vacuette® com gel separador e ativador de coágulo). Após 30 minutos à temperatura ambiente, para retração do coágulo, o sangue foi centrifugado por 10 minutos, a 2.500 r.p.m. (centrífuga Beckman-GPR, Indianápolis, IN, EUA) a 25°C. O soro foi distribuído em alíquotas de 500 L em microtubos tipo eppendorf. Uma das alíquotas era encaminhada imediatamente para análise bioquímica e as demais armazenadas a -80ºC até o momento das demais análises.

3.7. Coleta das informações clínico-patológicas

As informações clínico-patológicas das pacientes foram coletadas dos prontuários médicos, aproximadamente 60 dias após a cirurgia mamária. Estas incluíram o estadiamento clínico-patológico (ECP) da doença, bem como os resultados do exame anatomopatológico e do status dos receptores de estrógeno (RE), progesterona (RP) e do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2). O ECP foi determinado de acordo com o sistema TNM: T- extensão do tumor primário, N- ausência ou presença e a extensão de metástases em linfonodos regionais, M- ausência ou presença de metástase à distância (lNCA, 2004) (Anexo 2). O estadiamento inicialmente foi clínico, baseando-se no tamanho mamográfico do tumor, palpação das axilas e exames de rastreamento de metástases, que incluíram: radiografia do tórax (antero-posterior e perfil); ultrassonografia abdominal; e cintilografia óssea. O estadiamento final foi feito com base nos achados anatomopatológicos levando-se em conta o tipo histológico definitivo, tamanho macroscópico do tumor, número de linfonodos invadidos e presença ou ausência de metástase à distância. Foi adotado o critério preconizado pela Union for International Cancer Control (UICC) em 1997, com a última modificação em 2002 pelo American Joint Commitee On Cancer (AJCC) (Singletary et al., 2002).

3.8. Procedimentos laboratoriais

3.8.1. Exame histopatológico

As peças cirúrgicas obtidas por mastectomia ou quadrantectomia, foram submetidas a exame anatomopatológico, rotineiramente realizado pelo Laboratório de Anatomia Patológica do HC/UNICAMP segundo os critérios da OMS (Tavassoli e Devilee, 2003). Foram realizados cortes histológicos de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados por hematoxilina e eosina. Foi determinado o tipo histológico do tumor, bem como a classificação de seu grau de diferenciação histológica e nuclear. Estes últimos foram classificados de acordo com os critérios de Scarff, Bloom e Richardson modificados (Bloom et al., 1957; Scarff e Torloni, 1968; Frierson et al., 1995). As expressões dos receptores RE, RP e HER2 foram avaliadas pelo método imunoistoquímico. Este procedimento foi realizado no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti/CAISM, UNICAMP, utilizando-se a técnica da Estreptavidina-Biotina- Peroxidase (Hsu et al., 1981). O Quadro 2 relaciona os respectivos anticorpos monoclonais que foram utilizados para a análise imunoistoquímica:

Quadro 2: Especificações dos anticorpos.

Anticorpo Clone Fabricante HER2 c-erbB-2 Oncoprotein Dako Receptor de estrógeno 1D5 Dako Receptor de progesterona PgR 636 Dako

Os resultados desses exames juntamente com informações clínicas presentes nos prontuários das pacientes foram utilizados para a classificação clínico-patológica da doença.

3.8.2. Quantificação das concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides e glicose

As concentrações séricas de colesterol total (Col-T) e frações (LDL-Col, HDL-Col), triglicérides (TG) e glicose (Gli), foram determinadas por métodos enzimático-colorimétricos no mesmo dia em que as amostras foram coletadas, imediatamente após sua centrifugação, em sistema de automação (Boehringer Mannhein Hitachi 917-Roche-Basileia, Suíça) utilizando reagentes comerciais da Roche (Mannhein, Alemanha) e expressos em mg/dL. Estas análises foram realizadas na Seção de Bioquímica Clínica da Divisão de Patologia Clínica do HC/UNICAMP. Para a caracterização de dislipidemia foram adotados os valores de referência que seguem as recomendações da V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (2013) e para a hiperglicemia, as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2009). Valores de referência adotados para excluir dislipidemia ou hiperglicemia: Col-T< 200 mg/dL, LDL-Col< 160 mg/dL, HDL- Col ≥ 50 mg/dL (para mulheres), TG< 150 mg/dL, Gli< 100 mg/dL.

3.8.3. Caracterização da presença de síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em estudo

Os resultados das análises bioquímicas foram utilizados para estimar a frequência de pacientes com SM, que, no presente trabalho, foi definida a partir da presença de três ou quatro dos seguintes critérios:

Quadro 3: Critérios para identificação de síndrome metabólica em mulheres

Critérios Definição

Circunferência abdominal  88 cm

Glicemia de jejum# ≥ 100 mg/dL

Triglicérides ≥ 150 mg/dL

HDL-colesterol < 50 mg/dL

sistólica ≥ 130 mmHg e Pressão arterial diastólica ≥ 85 mmHg Adaptado de: National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III. Circulation. 2005; 112: 2735–52. #International Diabetes Federation. Worldwide definition of the metabolic syndrome. 47

O parâmetro hipertensão arterial (pressão sistólica ≥ 130 mmHg e diastólica ≥ 85 mmHg) não foi considerado no presente trabalho, pela ausência de diagnóstico clínico, visto que as pacientes incluídas no estudo tiveram apenas um contato com o pesquisador, na véspera do procedimento cirúrgico. Além disso, a maioria das pacientes era encaminhada de outros serviços e a totalidade não apresentava registro de diagnóstico de hipertensão arterial em seus prontuários.

3.8.4. Quantificação das concentrações séricas de A-FABP

As concentrações séricas de A-FABP foram determinadas por meio de reação imunoenzimática (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), tipo sanduíche, utilizando-se kit comercial (Biovendor®, Brno, República Tcheca), com sensibilidade de 0,05 ng/mL. Duplicatas das seis diluições da curva padrão da A-FABP humana, dos controles de qualidade alto e baixo, e das amostras de soro (diluídas 1:10), foram adicionadas às microplacas revestidas com anticorpo policlonal de camundongo anti-A-FABP humana (anticorpo de captura) e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação. Após 5 lavagens com 300µL de tampão de lavagem em cada pocinho, seguiu-se a incubação com o anticorpo anti-A-FABP humana biotinilado (anticorpo de detecção), por 1 hora à temperatura ambiente, sob agitação. Novamente após 5 lavagens, seguiu-se a incubação com o conjugado enzima-avidina (Streptavidin-Horseradish Peroxidase - HRP), por 30 minutos à temperatura ambiente, sob agitação. Seguiu-se novo ciclo de 5 lavagens e incubação com o substrato (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine-TMB), por até 10 minutos protegido da luz à temperatura ambiente, sob agitação. A reação foi interrompida com a adição da solução de parada (ácido sulfúrico diluído). A intensidade da cor produzida foi correspondente a uma determinada densidade óptica (D.O.), detectada por espectrofotometria em leitora de placas, utilizando-se os filtros 450/650nm. A D.O. foi proporcional à concentração da A-FABP presente na amostra, calculada a partir da curva padrão, obtida por equação polinomial do segundo grau. As concentrações finais das amostras foram obtidas após multiplicação pelo fator de diluição (x10). O ensaio foi considerado válido quando os controles de qualidade estavam dentro da faixa esperada (controle baixo 15,7-23,6 ng/mL e controle alto 41,0-61,5 ng/mL), e a diferença entre as densidades óticas das duplicatas da curva, dos controles de qualidade e das amostras foram ≤5% (os coeficientes de variação intra e interensaio foram respectivamente de 6,5% e 2,8%). Os ensaios foram 48 realizados exclusivamente para esta pesquisa, no Laboratório de Imunorregulação do Departamento de Patologia Clínica da FCM/UNICAMP.

3.8.5. Quantificação das concentrações séricas de IL-6 e TNF-

As concentrações de IL-6 e TNF-foram determinadas nas amostras de soro, por meio do kit comercial de Imunoensaio Multiplex da marca Millipore (Billerica, MA, EUA) Catálogo# HSTCMAG28SK-02 (IL-6 e TNF-) - Lote: 2522044. A sensibilidade do kit para cada analito foi de 0,18 pg/mL para IL-6 e de 0,20 pg/mL para TNF-. A tecnologia xMAP (MAP= Multiple Analyte Profiling, x= sua variável ex: citocinas, endócrino, oligo), envolve um processo exclusivo que utiliza microesferas magnéticas sensibilizadas com anticorpos específicos contra o analito de interesse. Cada microesfera xMAP possui proporções precisas de dois fluorocromos incorporados ao seu material que concedem um sinal fluorescente único, possibilitando serem criados até 100 conjuntos diferentes de microesferas que podem ser identificadas pelo instrumento MagPix™. Anticorpos de captura específicos para cada analito (IL-6 e TNF-) estão imobilizados às microesferas através de ligações covalentes não reversíveis. Após a incubação dos padrões e das amostras de soro diluídas com as microesferas, os analitos (IL-6 ou TNF-) se ligam aos anticorpos de captura localizados na superfície das respectivas microesferas. Após ser feito o procedimento de lavagem automatizada, para a retirada do excedente que não se ligou aos anticorpos específicos, foi feita a incubação com anticorpos de detecção biotinilados. Outra lavagem foi realizada, para eliminação do que não se ligou e foi feita uma incubação com o conjugado estreptavidina-ficoeritrina, que se liga ao anticorpo biotinilado e emite sinal fluorescente. O resultado final é um ensaio “sanduíche”, em que as microesferas foram capturadas por uma placa magnética e a classificação foi feita por dois lasers. Um laser excita a mistura de fluocromos no interior das microesferas (para que seja classificada pelo código fluorescente único e assim pode se saber qual anticorpo está adsorvido a ela) e o segundo laser excita o fluorocromo do conjugado na superfície das microesferas (para se quantificar o sinal de fluorescência emitido e dessa forma ser calculada a concentração do analito na amostra). O ensaio foi feito pelo equipamento MagPix e interpretado pelo Software xPonent/Analyst versão 4.2. 49

O ensaio foi considerado válido quando os controles de qualidade estavam dentro da faixa esperada (IL-6 controle baixo: 7-15 pg/mL; controle alto: 36- 74 pg/mL; e TNF- controle baixo: 16-33 pg/mL; controle alto: 80-167 pg/mL) e as variações inter e intraensaio foram menores que 1%.

3.9. Análise dos dados

Devido à ausência de distribuição normal, as variáveis numéricas foram transformadas em postos (ranks) e suas comparações entre os grupos foram realizadas pelos testes não-paramétricos de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal- Wallis (3 grupos), acompanhado do teste post hoc de Dunn. A comparação das variáveis categóricas entre os grupos foi realizada pelo teste Qui-quadrado ou exato de Fisher e as análises de correlação entre as variáveis numéricas foram feitas pelo teste de Spearman. Para comparar os valores de A-FABP, IL-6 e TNF- entre as variáveis categóricas, foi utilizada a análise de covariância (ANCOVA) ajustada para IMC, CA e idade ou estado menopausal no caso da A-FABP e TNF-, e também para atividade física, no caso da IL-6. As análises foram realizadas pelo programa GraphPad Prisma 5 e SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 13.0 para Windows. O nível de significância adotado foi de 5% (p< 0,05).

4. RESULTADOS

4.1. Características da população em estudo

A Tabela 1 descreve as principais características demográficas e antropométricas das pacientes com câncer de mama classificadas segundo seu estado nutricional em NO (n= 42) e SP/O (n= 117). Conforme o esperado foram encontradas diferenças significativas para as variáveis IMC e CA entre os grupos NO e SP/O (p< 0,0001). A proporção de pacientes entre os grupos SP/O e NO foi de aproximadamente 3:1. Já a proporção entre pós- e pré-menopausa foi de aproximadamente 2:1.

Ao se analisar os resultados dos parâmetros bioquímicos (colesterol total e frações; triglicérides; glicose) verificou-se alta frequência de pacientes com resultados alterados, principalmente no grupo SP/O. Desta forma, foi de interesse investigar a presença de síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em estudo. Então, ao se considerar três ou mais dos seguintes critérios: CA >88 cm, HDL-Col 50

<50 mg/dL, TG ≥150 mg/dL e Gli ≥ 100 mg/dL, foi observada a presença de SM em 37,6% das pacientes do grupo SP/O. Entretanto, no grupo NO não foram encontradas pacientes com SM, de acordo com os critérios utilizados.

Tabela 1. Características demográficas, antropométricas e bioquímicas das pacientes com câncer de mama agrupadas segundo o estado nutricional SP/O NO p n = 117 n = 42 Idade (anos) a 54 (47-62) 50 (44-58) ns

IMC (kg/m2) a 30 (28-33) 22 (21-23) <0.0001*

CA (cm) a 100 (95-107) 84 (79-86) <0.0001*

Col-T ≥ 200 mg/dL b 39 (33,1) 19 (45,2) ns

LDL-Col ≥ 160 mg/dL b 07 (5,9) 03 (7,1) ns

HDL-Col < 50 mg/dL b 83 (70,3) 16 (38,1) 0,0004*

Triglicérides ≥ 150 mg/dL b 39 (33,1) 04 (9,5) 0,0024*

Glicose ≥ 100 mg/dL b 25 (21,4) 07 (16,7) ns

Estado Menopausal b Pré-menopausa 41 (35,0) 17 (40,5) Pós-menopausa 76 (65,0) 25 (59,5) ns Presença de Síndrome 44 (37,6) 0 (0,0) Metabólica b Grupo sobrepeso/obesidade (SP/O): IMC ≥ 25 kg/m2 e CA > 88 cm; grupo de não obesas (NO): IMC ≥ 18,5 e ≤ 24,99 kg/m2 e CA ≤ 88 cm. Col-T: colesterol total; HDL-Col: lipoproteína de alta densidade; LDL-Col: lipoproteína de baixa densidade; ns: não significativo. Para a classificação de síndrome metabólica (SM), foi considerada a presença de 3 ou mais das seguintes alterações: circunferência abdominal para mulheres >88 cm, glicemia de jejum ≥ 100mg/dL, triglicérides ≥150 mg/dL, HDL-colesterol para mulheres <50mg/dL. ªDados expressos como Mediana e IQR (variação interquartil) e comparação feita pelo teste de Mann-Whitney. bDados expressos como frequência absoluta (n) e relativa (%) e analisados pelo teste exato de Fisher. *O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).

Devido à alta frequência de pacientes do grupo SP/O apresentando SM, julgou-se pertinente subdividir este grupo em pacientes sem (SP/O) e com síndrome metabólica (SP/O-SM), e realizar todas as análises entre os três grupos: NO, SP/O e SP/O-SM. Na análise das características demográficas, antropométricas e bioquímicas entre os três grupos (Tabela 2) foi observado que não houve diferença de IMC e CA entre os grupos SP/O e SP/O-SM. Entretanto o grupo SP/O-SM apresentou idade mais elevada tanto em relação ao grupo NO (p= 0,0187), quanto ao grupo SP/O (p= 0,0296). Consequentemente foi detectada frequência mais 51

elevada de pacientes na pós-menopausa no grupo SP/O-SM em relação ao grupo SP/O (p= 0,0158). Já na análise da frequência de parâmetros bioquímicos alterados foram verificadas maiores frequências de concentrações alteradas de HDL-Col, TG e glicose no grupo SP/O-SM em relação aos grupos NO e SP/O.

Tabela 2. Características demográficas, antropométricas e bioquímicas entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM.

NO SP/O SP/O-SM Valores de p n = 42 n = 73 n = 44 NO vs NO vs SP/O vs SP/O SP/O-SM SP/O-SM Idade (anos) a 51 (44–59) 52 (45–62) 57 (51–65) ns 0,0187* 0,0296*

IMC (kg/m2) a 22,4 (21,3–23,2) 30,9 (28,4–32,8) 29,9 (26,9–33,6) <0,0001* <0,0001* ns

CA (cm) a 84 (79–86) 100 (95–106) 102 (94–109) <0,0001* <0,0001* ns

Col-T ≥ 200 mg/dL b 19 (45,2) 22 (30,1) 17 (38,6) ns ns ns

LDL-Col ≥ 160 mg/dL b 03 (7,1) 04 (5,5) 03 (6,8) ns ns ns

HDL-Col < 50 mg/dL b 16 (38,1) 40 (54,8) 43 (97,7) ns <0,0001* <0,0001*

TG ≥ 150 mg/dL b 04 (9,5) 04 (5,5) 35 (79,5) ns <0,0001* <0,0001*

Glicose ≥ 100 mg/dL b 07 (16,7) 07 (9,6) 18 (40,9) ns 0,0176* <0,0001*

Estado Menopausal b Pré-menopausa 17 (40,5) 32 (43,8) 9 (20,5) Pós-menopausa 25 (59,5) 41 (56,2) 35 (79,5) ns ns 0,0158*

Grupo sobrepeso/obesidade (SP/O): IMC ≥ 25 kg/m2 e CA > 88 cm; grupo de não obesas (NO): IMC ≥ 18,5 e ≤ 24,99 kg/m2 e CA ≤ 88 cm. Col-T: colesterol total; HDL-Col: lipoproteína de alta densidade; LDL-Col: lipoproteína de baixa densidade; TG: triglicérides; ns: não significativo. Para a classificação de síndrome metabólica (SM), foi considerada a presença de 3 ou mais das seguintes alterações: circunferência abdominal para mulheres >88 cm, glicemia de jejum ≥ 100mg/dL, triglicérides ≥150 mg/dL, HDL-colesterol para mulheres <50mg/dL. ªDados expressos como Mediana e IQR (variação interquartil) e comparação feita pelo teste de Kruskal-Wallis (com análise de comparação múltipla de Dunn como teste post hoc). bDados expressos como frequência absoluta (n) e relativa (%) e analisados pelo teste de Qui-quadrado ou exato de Fisher. *O nível de significância adotado foi de 5% (p< 0,05).

4.2. Comparação das concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos de estudo de pacientes com câncer de mama.

A Figura 3 demonstra a comparação das concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos de estudo NO, SP/O e SP/O-SM.

Figura 3: A) Comparação das concentrações séricas de A-FABP no grupo NO (n=42), SP/O (n= 69) e SP/O-SM (n= 41), p< 0,0001. B) Comparação das concentrações séricas de IL-6 no grupo NO (n=41), SP/O (n= 62) e SP/O-SM (n= 35), p= 0,0087. C) Comparação das concentrações séricas de TNF-α no grupo NO (n=41), SP/O (n= 65) e SP/O-SM (n= 37), p= 0,0224. Dados expressos como Mediana e IQR (variação interquartil). Análises realizadas pelo teste de Kruskal-Wallis (com múltipla comparação de Dunn como teste post hoc). *p< 0,05 para NO vs SP/O; **p< 0,05 para NO vs SP/O-SM; ***p< 0,05 para SP/O vs SP/O-SM.

Houve diferença significativa das concentrações séricas de A-FABP entre os três grupos, com maiores concentrações no grupo SP/O-SM, seguido pelos grupos SP/O e NO. Os valores de mediana e variação interquartis (IQR) encontrados foram: NO [14,7 ng/mL (9,9–21,0)] vs SP/O [27,2 ng/mL (17,9–35,2)], p< 0,0001; NO vs SP/O-SM [35,6 ng/mL (25,4–50,5)], (p< 0,0001), e SP/O vs SP/O-SM, p= 0,0017. Para as concentrações séricas de IL-6 foram encontrados valores aumentados no grupo SP/O [1,52 pg/mL (0,85–2,03)] vs NO [0,89 pg/mL (0,53– 2,03)], p= 0,0242 e grupo SP/O-SM [1,63 pg/mL (1,13–3,39)] vs NO, p= 0,0046. Já entre os grupos SP/O e SP/O-SM não houve diferença significativa, p= 0,1861. Nas análises das concentrações de TNF- foi encontrada diferença significativa apenas entre os grupos NO vs SP/O-SM, em que o último apresentou valores aumentados [4,86 pg/mL (2,91–6,74)] em relação ao primeiro [3,21 pg/mL (2,10–4,74)], p= 0,0144.

4.3. Características clínico-patológicas da doença entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM.

A Tabela 3 descreve as características clínico-patológicas da doença entre as pacientes com câncer de mama agrupadas em NO, SP/O e SP/O-SM. Quanto ao estadiamento clínico-patológico (ECP), quando os três grupos foram analisados em conjunto, observou-se diferença entre as frequências de ECP II e III entre os grupos NO vs SP/O (p= 0,0276) e NO vs SP/O-SM (p= 0,0306), com maiores frequências de ECP III nos grupos SP/O e SP/O-SM. Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos estudados, quanto à frequência da expressão dos receptores hormonais (RE e RP) e do HER2, nem com relação ao tamanho e acometimento de linfonodos (p> 0,05). Tabela 3: Características clínico-patológicas da doença entre os grupos NO, SP/O e SP/O- SM de pacientes com câncer de mama.

SP/O-SM Valores de p NO SP/O n= 42 n=73 n= 44 n (%) n (%) n (%) NO vs SP/O NO vs SP/O-SM SP/O vs SP/O-SM

ECP I 11 (26) 27 (37) 13 (30) II 25 (60) 25 (34) 16 (36) III 6 (14) 21 (29) 15 (34) 0,0276* 0,0306* ns

Tamanho do tumor T1 17 (41) 32 (44) 15 (34) T≥ 2 25 (60) 41 (56) 29 (66) ns ns ns

Linfonodos acometidos N0 27 (64) 42 (58) 23 (52) N≥ 1 15 (36) 31 (43) 21 (48) ns ns ns

RE positivo 33 (79) 57 (78) 32 (73) negativo 9 (21) 16 (22) 12 (27) ns ns ns

RP positivo 28 (67) 46 (63) 24 (55) negativo 14 (33) 27 (37) 20 (46) ns ns ns

HER2 n= 41 n= 68 n= 42 positivo 14 (34) 23 (34) 13 (31) negativo 27 (66) 45 (66) 29 (69) ns ns ns

Triplo Negativo n= 41 n= 68 n= 42 positivo 3 (7) 4 (6) 5 (12) negativo 38 (93) 64 (94) 37 (88) ns ns ns

ECP - estadiamento clínico-patológico; T - extensão do tumor primário; N - ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais; RE - receptor de estrógeno; RP - receptor de progesterona; HER2 - receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2; ns - não significativo. A comparação das frequências foi realizada pelo teste exato de Fisher. *O nível de significância adotado foi de 5% (p˂ 0,05). 54

4.4. Comparação das concentrações séricas de A-FABP com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

Para se averiguar a associação das concentrações séricas de A-FABP com as características clínico-patológicas da doença, as pacientes foram reclassificadas de acordo com cada característica apresentada, tanto no grupo total de pacientes como em cada subgrupo (Tabela 4).

Para o estadiamento clínico-patológico (ECP) do tumor, foram classificadas em três grupos: ECP I, ECP II e ECP III. Com relação ao grupo total de pacientes não foram encontradas diferenças nas concentrações séricas de A-FABP entre os três estadios. Porém, nas análises por subgrupos foi encontrada diferença entre os três estadios no subgrupo de pacientes SP/O-SM, sendo que foram verificadas concentrações séricas significativamente mais elevadas de A-FABP nas pacientes classificadas com ECP II, em relação ao ECP I, p= 0,0083.

Nas comparações entre os grupos classificados de acordo com a expressão ou não dos receptores hormonais (RE e RP), não foram encontradas diferenças significativas entre as concentrações séricas de A-FABP, tanto no grupo total de pacientes, quanto nos subgrupos.

Já nas comparações entre os grupos classificados de acordo com a expressão ou não de HER2, foram encontradas concentrações séricas de A-FABP aumentadas em pacientes com tumores HER2 positivos no grupo de não obesas (NO), p= 0,0379.

Em relação às pacientes com presença vs ausência de tumores triplo- negativos, não foram encontradas diferenças significativas para o grupo total ou subgrupos.

Os resultados foram mantidos e confirmados pela análise de covariância (ANCOVA), após ajuste para as variáveis IMC, CA e idade/estado menopausal.

Tabela 4: Comparação das concentrações séricas de A-FABP com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

A-FABP (ng/mL) TOTAL NO SP/O SP/O-SM n= 152 n= 42 n= 69 n= 44

n p n p n p n p ECP I 48 27,2 (19,4 – 35,6) 11 16,8 (14,4 – 28,2) 25 30,4 (21,1 – 40,9) 11 26,6 (21,4 – 35,6) II 63 21,4 (14,3 – 35,0) ns 25 13,6 (9,65 – 20,4) ns 22 23,1 (17,9 – 31,5) ns 16 42,7 (34,6 – 55,7) 0,0083** III 41 23,5 (14,3 – 36,0) 6 12,0 (7,3 – 18,8) 21 22,5 (13,8 – 33,3) 14 31,8 (23,1 – 50,0)

RE positivo 117 25,3 (15,9 – 35,6) 33 14,7 (10,1 – 20,4) 54 29,1 (17,5 – 38,1) 30 34,6 (25,7 – 44,0) negativo 35 21,4 (17,5 – 33,3) ns 9 15,3 (9,4 – 28,0) ns 14 21,1 (18,0 – 28,2) ns 11 44,7 (21,4 – 57,0) ns

RP positivo 97 23,5 (14,7 – 35,1) 28 14,4 (9,75 – 19,8) 45 28,5 (17,1 – 36,3) 24 35,4 (25,1 – 42,3) negativo 55 27,2 (17,6 – 36,7) ns 14 16,5 (10,7 – 25,7) ns 24 26,0 (19,1 – 34,3) ns 17 36,7 (25,2 – 55,5) ns

HER2 positivo 50 26,2 (17,6 – 35,1) 14 18,3 (12,4 – 25,5) 23 24,7 (17,5 – 31,9) 13 36,7 (29,2 – 45,2) negativo 95 22,1 (14,4 – 35,5) ns 27 13,6 (9,1 – 18,7) 0,0379* 42 27,9 (19,0 – 38,1) ns 26 29,1 (23,1 – 53,6) ns

Triplo- Negativo positivo 11 21,2 (11,0 – 31,3) 3 9,6 (7,5 – 11,0) 4 24,3 (20,8 – 30,3) 4 41,2 (16,9 – 110,4) negativo 139 24,7 (16,6 – 35,6) ns 39 15,3 (10,2 – 22,1) ns 65 27,2 (17,6 – 35,4) ns 35 35,1 (24,8 – 45,6) ns

Dados expressos como Mediana e IQR (variação interquartil). ECP - Estadiamento clínico-patológico com base no sistema TNM: T - Extensão do tumor primário; N - Ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais; M- ausência ou presença de metástase à distância; RE - Receptor de estrógeno; RP - Receptor de progesterona; HER2 - Receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2; ns – não significativo. Análises realizadas pelo teste de Mann-Whitney (dois grupos) ou Kruskal-Wallis (com análise de comparação múltipla de Dunn como teste post hoc), seguido de ANCOVA com ajuste para idade, IMC e CA. *O nível de significância adotado foi de 5% (p˂ 0,05). **p< 0,05 para ECP I vs ECP II. 56

4.5. Comparação das concentrações séricas de IL-6 com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

Para se comparar as concentrações séricas de IL-6 com relação às características clínico-patológicas da doença, procedeu-se da mesma forma como descrito no item 4.4., quanto à reclassificação dos grupos.

Conforme se verifica na Tabela 5, para ECP, status de RE e HER2, não foram encontradas diferenças significativas entre as pacientes do grupo total ou subgrupos.

Já as pacientes com tumores RP negativos (RP-) no grupo total, apresentaram concentrações séricas de IL-6 aumentadas em relação àquelas com tumores RP positivos (RP+), p= 0,0468. Entretanto, nos subgrupos não foram encontradas diferenças significativas.

Na comparação entre pacientes com presença vs ausência de tumores triplo-negativos, no grupo total, as portadoras de tumores triplo-negativos apresentaram concentrações séricas de IL-6 mais elevadas (p= 0,0411). Porém não houve diferença significativa entre os subgrupos.

As diferenças observadas foram mantidas, mesmo após ajuste para as variáveis IMC, CA, idade/estado menopausal e atividade física, pela análise de covariância (ANCOVA).

Tabela 5: Comparação das concentrações séricas de IL-6 com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

IL-6 (pg/mL) TOTAL NO SP/O SP/O-SM n= 138 n= 41 n= 62 n= 44 n p n p n p n p ECP I 44 1,55 (0,63 – 2,30) 11 1,46 (0,60 – 4,80) 25 1,50 (0,64 – 2,09) 17 1,38 (1,00 – 1,85) II 59 1,17 (0,76 – 2,10) ns 24 0,82 (0,56 – 1,36) ns 20 1,58 (0,87 – 2,28) ns 15 1,63 (0,89 – 3,69) ns III 35 1,38 (0,85 – 1,88) 6 0,52 (0,40 – 1,22) 17 1,38 (1,00 – 1,85) 12 1,54 (1,17 – 3,22)

RE positivo 106 1,24 (0,67 – 2,05) 32 0,79 (0,52 – 1,85) 49 1,38 (0,82 – 1,93) 25 1,78 (0,89 – 3,32) negativo 32 1,66 (0,96 – 2,33) ns 9 1,00 (0,65 – 2,57) ns 13 1,77 (1,09 – 2,28) ns 10 1,57 (1,33 – 3,68) ns

RP positivo 86 1,15 (0,65 – 1,99) 27 0,85 (0,46 – 1,46) 39 1,38 (0,80 – 2,10) 20 1,54 (0,89 – 2,91) negativo 52 1,55 (0,86 – 2,73) 0,0468* 14 0,98 (0,60 – 3,08) ns 23 1,58 (0,87 – 1,83) ns 15 1,78 (1,34 – 3,67) ns

HER2 positivo 47 1,34 (0,72 – 1,88) 13 0,72 (0,49 – 1,08) 23 1,58 (0,87 – 2,20) 11 1,51 (0,68 – 2,96) negativo 84 1,45 (0,81 – 2,28) ns 27 1,09 (0,57 – 2,27) ns 35 1,52 (0,80 – 2,00) ns 22 1,78 (1,07 – 4,11) ns

Triplo- Negativo positivo 8 2,97 (1,33 – 3,74) 3 2,27 (1,44 – 3,75) 0 0 4 3,68 (1,89 – 17,1) negativo 123 1,37 (0,74 – 2,04) 0,0411* 36 0,80 (0,53 – 1,40) ns 0 0 - 29 1,56 (0,89 – 3,10) ns

Dados expressos como Mediana e IQR (variação interquartis). ECP - Estadiamento clínico-patológico com base no sistema TNM: T - Extensão do tumor primário; N - Ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais; M- ausência ou presença de metástase à distância; RE - Receptor de estrógeno; RP - Receptor de progesterona; HER2 - Receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2; ns – não significativo. Análises realizadas pelo teste de Mann-Whitney (dois grupos) ou Kruskal-Wallis (com análise de comparação múltipla de Dunn como teste post hoc), seguido de ANCOVA com ajuste para idade, IMC, CA e atividade física. *O nível de significância adotado foi de 5% (p˂ 0,05). 58

4.6. Comparação das concentrações séricas de TNF- com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

A Tabela 6 apresenta as análises das concentrações séricas de TNF- entres os diferentes grupos classificados de acordo com as características clínico- patológicas da doença. Para ECP foi encontrada diferença significativa (p= 0,0144) entre os grupos ECP I vs ECP III, no grupo total de pacientes, sendo que as pacientes com tumores ECP III apresentaram valores aumentados das concentrações séricas de TNF-. Esta diferença foi verificada também no subgrupo SP/O, ECP I vs ECP III, p= 0,0270. No subgrupo SP/O-SM não houve diferença significativa das concentrações de TNF- entre os três estadios, porém quando as pacientes com ECP II e III foram reunidas para comparação com o grupo ECP I, foi encontrada diferença significativa, em que o novo grupo (ECP II + III) mostrou concentrações séricas de TNF- significativamente mais elevadas [5,68 pg/mL (3,73–6,90)] do que o grupo ECP I [3,37 pg/mL (2,28–4,40)], p= 0,0418. Em relação à expressão ou não de receptores hormonais (RE e RP) e de HER2, não foram observadas diferenças significativas das concentrações séricas de TNF- no grupo total de pacientes, nem nos subgrupos. Também não foram encontradas diferenças significavas entre as pacientes com presença ou ausência de tumores triplo-negativos. Todos os resultados foram mantidos após o ajuste das variáveis IMC, CA e idade/estado menopausal pela análise de covariância (ANCOVA).

Tabela 6: Comparação das concentrações séricas de TNF- com relação às características clínico-patológicas da doença entre as pacientes estudadas.

TNF- (pg/mL) TOTAL NO SP/O SP/O-SM n= 143 n= 41 n= 65 n= 37 n p n p n p n p ECP I 47 3,55 (2,02 – 5,14) 11 3,21 (1,19 – 6,61) 26 4,12 (1,65 – 5,16) 10 3,37 (2,28 – 4,40) II 61 4,16 (2,31 – 5,69) 24 3,15 (2,14 – 4,72) ns 22 4,79 (2,58 – 5,44) 15 6,31 (3,73 – 9,19) ns III 35 5,24 (3,28 – 6,21) 0,0144* 6 3,25 (1,35 – 6,82) 17 5,34 (3,18 – 6,11) 0,0270* 12 5,56 (3,46 – 6,69)

RE positivo 109 3,75 (2,64 – 5,86) 32 3,19 (1,75 – 4,72) 51 4,29 (2,65 – 5,81) 26 4,21 (2,51 – 7,79) negativo 34 4,74 (2,98 – 5,50) ns 9 3,75 (2,14 – 4,74) ns 14 4,84 (3,35 – 5,24) ns 11 5,44 (3,73 – 6,61) ns

RP positivo 86 3,73 (2,28 – 5,82) 27 3,17 (1,65 – 4,74) 40 4,45 (2,76 – 5,44) 19 3,85 (2,14 – 7,79) negativo 57 4,29 (2,66 – 5,81) ns 14 3,48 (2,14 – 4,74) ns 25 4,63 (2,66 – 5,73) ns 18 5,15 (3,59 – 6,64) ns

HER2 positivo 48 4,64 (2,76 – 5,99) 14 2,20 (1,26 – 4,86) 23 4,87 (3,46 – 6,01) 11 5,68 (3,73 – 6,44) negativo 88 3,80 (2,64 – 5,44) ns 26 3,25 (2,65 – 4,74) ns 38 4,12 (1,93 – 5,27) ns 24 4,07 (2,64 – 7,57) ns

Triplo- Negativo positivo 10 4,74 (3,92 – 5,22) 3 4,74 (4,16 – 4,74) 2 2,65 (0,15 – 5,14) 5 4,86 (3,74 – 6,03) negativo 126 3,91 (2,65 – 5,85) ns 36 3,16 (1,75 – 4,58) ns 63 4,60 (2,66 – 5,44) ns 30 5,13 (2,65 – 7,12) ns

Dados expressos como Mediana e IQR (variação interquartis). ECP - Estadiamento clínico-patológico com base no sistema TNM: T - Extensão do tumor primário; N - Ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais; M- ausência ou presença de metástase à distância; RE - Receptor de estrógeno; RP - Receptor de progesterona; HER2 - Receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2; ns – não significativo. Análises realizadas pelo teste de Mann-Whitney (dois grupos) ou Kruskal-Wallis (com análise de comparação múltipla de Dunn como teste post hoc), seguido de ANCOVA com ajuste para idade, IMC e CA. *O nível de significância adotado foi de 5% (p˂ 0,05). 60

4.7. Avaliação das correlações entre as concentrações séricas de A-FABP, IL-6 e TNF- entre os grupos estudados.

As concentrações séricas de A-FABP para o grupo total das pacientes correlacionaram-se diretamente com as concentrações séricas de IL-6 e de TNF-. Porém, realizando-se as análises para cada grupo isoladamente, não foram encontradas correlações entre a A-FABP e as citocinas pró-inflamatórias (p> 0,05), conforme se observa na Tabela 7.

Tabela 7: Correlação entre A-FABP e as citocinas pró-inflamatórias no grupo total e nos subgrupos de pacientes com câncer de mama.

A-FABP (ng/mL) Total NO SP/O SP/O-SM n= 136 n= 41 n= 61 n= 34

IL-6 (pg/mL) r 0,2093 0,0720 0,1008 0,0762 p 0,0145* ns ns ns

TNF- (pg/mL) r 0,2761 0,0613 0,1528 0,2340 p 0,0011* ns ns ns

Grupo sobrepeso/obesidade (SP/O): IMC ≥ 25 kg/m2 e CA > 88 cm; grupo de não obesas (NO): IMC ≥ 18,5 e ≤ 24,99 kg/m2 e CA ≤ 88 cm. Para a classificação de síndrome metabólica (SM), foi considerada a presença de 3 ou mais das seguintes alterações: circunferência abdominal para mulheres >88 cm, glicemia de jejum ≥ 100mg/dL, triglicérides ≥150 mg/dL, HDL-colesterol para mulheres <50mg/dL. ns= não significativo. Análises realizadas pelo teste de Spearman. *O nível de significância adotado foi de 5% (p< 0,05).

Em relação à correlação entre as citocinas IL-6 e TNF-, no grupo total foi encontrada correlação direta entre elas (p= 0,0143), assim como no subgrupo de pacientes não obesas (NO), p= 0,0120. Porém nos demais subgrupos não houve correlação entre elas, conforme se observa na Tabela 8.

Tabela 8: Correlação entre a citocina IL-6 e a TNF- no grupo total e nos subgrupos de pacientes com câncer de mama.

IL-6 (pg/mL) Total NO SP/O SP/O-SM n= 136 n= 40 n= 62 n= 34

TNF- (pg/mL) r 0,2096 0,3937 0,0366 0,1105 p 0,0143* 0,0120* ns ns

5. DISCUSSÃO

O presente trabalho confirma a alta prevalência de sobrepeso/obesidade entre as portadoras de câncer de mama em nossa população, estando de acordo com o estudo de Zorlini e colaboradores (2008) e também descreve a proporção de 2:1 entre pacientes na pós- e pré-menopausa, estando de acordo o estudo de Pinheiro e colaboradores (2009). Além disso, vale destacar a alta frequência de alterações metabólicas no grupo de pacientes com SP/O, o que nos levou à constituição de um novo subgrupo (SP/O-SM) para a totalidade das análises, tendo em vista que a SM está associada a tumores mamários com características clínico-patológicas de pior prognóstico (Calip et al., 2014). Conforme o esperado, as concentrações séricas de A-FABP apresentaram-se mais elevadas no grupo SP/O do que no grupo NO, o que se justifica pelo fato do tecido adiposo ser a maior fonte de A-FABP circulante (Xu et al., 2006) e a literatura demonstrar forte correlação das concentrações séricas de A-FABP com IMC e CA (Maeda et al., 2005; Stejskal et al., 2008). Além disso, foram observadas concentrações séricas de A-FABP ainda mais elevadas no grupo de pacientes com SM, que foram, inclusive, significantemente maiores do que as encontradas no grupo SP/O, estando de acordo com outros estudos que 62

correlacionam as concentrações séricas de A-FABP com a presença de SM e a preconizam como seu marcador precoce (Xu et al., 2007; Terra et al., 2011). Quanto ao estado menopausal, pacientes na pós-menopausa apresentaram concentrações mais elevadas de A-FABP do que aquelas na pré- menopausa, sendo que tanto na pré- quanto na pós-menopausa as concentrações de A-FABP se apresentaram mais elevadas nos grupos SP/O e SP/O-SM do que no grupo NO (dados não mostrados), estando de acordo com os dados da literatura (Stefanska et al., 2014; Hao et al., 2015). Com relação à associação da A-FABP com as características clínico- patológicas da doença, foram verificadas concentrações séricas mais elevadas em pacientes com estadio mais avançado (ECP II) e pertencentes ao grupo com SM, o que, pelo nosso conhecimento, é um achado inédito até o presente momento. Essa demonstração pode sugerir a associação de A-FABP com o câncer mamário de pior prognóstico em pacientes que possuem a SM. Estudos recentes demonstram que a SM está associada a um risco maior de desenvolvimento de câncer de mama e pior prognóstico e os autores ressaltam que a adiposidade central, a dislipidemia e resistência à insulina contribuem para o surgimento e a progressão tumoral (Calip et al., 2014; Capasso et al., 2014). Entretanto, os mecanismos envolvidos nessa relação ainda não foram completamente elucidados. A maioria dos estudos disponíveis na literatura abordam a presença ou surgimento da SM após o tratamento ou após recidivas e/ou metástases, porém nosso estudo foi conduzido com pacientes recém-diagnosticadas, ampliando a gama de observações de associação da SM também para a doença primária, ainda sem tratamento. Além disso, foram observadas concentrações mais elevadas de A-FABP em pacientes NO com tumores que expressavam HER2. Tendo em vista que a superexpressão de HER2 está associada a um tempo menor de sobrevida global ou livre de doença (Choi et al., 2009), a A-FABP estaria novamente associada a um pior prognóstico. A A-FABP é um indicador de SM e no presente trabalho relacionou-se a tumores primários mais avançados, sugerindo um potencial papel de biomarcador de maior gravidade. Desta forma, poderia ser aventada como um marcador de dupla importância no câncer mamário, sugerindo a sua aplicação na investigação precoce de SM nas pacientes ainda no pré-operatório, com vistas a orientar eventuais 63

mudanças no estilo de vida e direcionar o tratamento, para o alcance de maior sobrevida.

Maiores concentrações séricas de IL-6 foram observadas no grupo SP/O em comparação ao grupo NO, o que está de acordo com estudos de marcadores de obesidade que mostram aumento significativo das concentrações séricas de IL-6 em mulheres obesas (Esposito et al., 2003; Clark e Dillon, 2011). O tecido adiposo é responsável por uma significante secreção de IL-6 circulante, sendo a maior parte secretada pelo tecido adiposo visceral em relação ao subcutâneo (Fain et al., 2004), o que justifica essa maior concentração encontrada no grupo SP/O. Também foram observadas maiores concentrações séricas de IL-6 no grupo SP/O-SM quando comparado ao grupo NO. Estes resultados estão de acordo com estudo em modelo animal, no qual as concentrações de IL-6 correlacionaram-se com diversos fatores de risco para a SM (Bao et al., 2015). Entretanto, estão discordantes dos resultados obtidos em estudo com sobreviventes ao câncer mamário, que tiveram as concentrações séricas de IL-6 determinadas 3 a 5 anos após o diagnóstico e tratamento (Babaei et al., 2015), situação essa que diferiu do nosso trabalho, no qual as quantificações foram realizadas no pré-operatório. Com relação à associação das concentrações séricas de IL-6 com as características clínico-patológicas da doença, observamos maiores concentrações desta citocina em pacientes com tumores RP negativos, estando de acordo com o estudo de Chavey e colaboradores (2007). A detecção de concentrações mais elevadas de IL-6 em pacientes com tumores RP negativos associa esta citocina ao pior prognóstico do câncer mamário, de acordo com a literatura (Purdie et al., 2014). Além disso, encontramos concentrações séricas mais elevadas de IL-6 em pacientes com tumores triplo-negativos. Esses tumores são caracterizados pela ausência dos receptores hormonais (RE e RP) e de HER2, correspondem a 12-17% dos subtipos moleculares de tumores mamários e são considerados de pior prognóstico, por apresentarem um fenótipo mais agressivo e por não poderem ser tratados com a hormonioterapia convencional ou bloqueadores dos receptores HER2 (Foulkes et al., 2010). Nosso achado está de acordo com estudo que demonstrou expressões aumentadas de RNAm de diversas citocinas inflamatórias, e, entre elas, a IL-6 em culturas de células de tumores triplo-negativos (Perez et al., 2012). Outro estudo com cultura de células tumorais triplo-negativas sugere um efeito de retroalimentação autócrina da IL-6, ativando diversas vias de sinalização 64

intracelulares, responsáveis pelo crescimento celular e diminuição de apoptose (Hartman et al., 2013). Dessa forma, altas concentrações séricas de IL-6 estariam correlacionadas à gravidade da doença. Comparando as concentrações séricas de TNF- entre os três grupos, foram encontradas maiores concentrações no grupo SP/O-SM em relação ao grupo NO, estando de acordo com estudos que mostram valores aumentados de TNF- em pacientes com SM (Sonnenberg et al., 2004; Hutley e Prins, 2005; Ritchie e Connell, 2007). Em relação às características clínico-patológicas, pacientes do grupo total e do subgrupo SP/O apresentaram maiores concentrações séricas de TNF- entre as pacientes com estadio III, sugerindo que concentrações séricas mais elevadas de TNF- podem estar associadas a tumores mais avançados e, portanto, de pior prognóstico. A literatura mostra que quando o TNF- é produzido cronicamente (na obesidade, por exemplo), pode atuar como um promotor endógeno de tumor, contribuindo para a remodelação do tecido e desenvolvimento estromal necessários para o crescimento e propagação tumoral (Balkwill e Mantovani, 2001; Balkwill, 2009). Tendo em vista o papel da A-FABP como moduladora dos processos inflamatórios nos macrófagos e sua produção aumentada na vigência da obesidade, foi de interesse investigar sua relação com as principais citocinas pró-inflamatórias secretadas pelos adipócitos e também pelos macrófagos, a IL-6 e o TNF-. Foram observadas correlações diretas entre as concentrações séricas da A-FABP e as concentrações das citocinas IL-6 e TNF-. Embora os coeficientes de correlação encontrados tenham sido fracos, estes resultados são inéditos em pacientes com câncer de mama. Huang e colaboradores (2013) constataram correlação direta de A-FABP com TNF-, mas não com IL-6, mas a doença estudada pelos autores foi a sepse. Já em um estudo voltado para pacientes obesas submetidas à cirurgia bariátrica, Terra e colaboradores (2011), também encontraram correlação da A-FABP com a citocina IL-6. A inflamação é um processo fundamental na regulação da progressão e gravidade do câncer de mama. As citocinas inflamatórias são raramente ou minimamente expressas no epitélio mamário normal, mas são significativamente elevadas em diversos subtipos de câncer de mama (Soria et al., 2011). Além disso, 65

a recidiva e a metástase estão associadas ao aumento da expressão de TNF-, IL-1 e IL-6, indicando que essas citocinas possuem funções relacionadas à progressão tumoral (Sullivan et al., 2009; Soria et al., 2011). Outros estudos têm demonstrado que a exposição prolongada de células tumorais da mama a citocinas inflamatórias leva à transição epitélio-mesenquimal (TEM), que é o mecanismo primário associado à geração de células-tronco neoplásicas, ao desenvolvimento de resistência ao tratamento, e à iniciação e progressão de metástases (Hugo et al., 2007; Lopez- Novoa e Nieto, 2009; Sullivan et al., 2009; Pradhan et al., 2010). Desta forma, considerando as características de IL-6 e TNF- como citocinas pró-inflamatórias, nossos resultados podem sugerir eventual associação entre a A-FABP e o estado inflamatório no câncer de mama. Todavia, somente estudos mais aprofundados poderão confirmar a hipótese de participação da A-FABP no processo inflamatório presente no câncer mamário. Nossos resultados demonstram que tanto a A-FABP quanto as citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF-) encontraram-se mais elevadas em pacientes com SP/O e/ou SP/O-SM e também associadas a características clínico-patológicas de pior prognóstico. Como essas associações foram mantidas após ajustes das variáveis IMC, CA e idade/estado menopausal, os resultados sugerem relação da A-FABP e das citocinas com a maior gravidade de câncer mamário, independentemente de obesidade, incentivando o estudo mais aprofundado dessas relações.

6. CONCLUSÕES

 Houve maior freqüência de parâmetros bioquímicos alterados no grupo SP/O, resultando na constituição do subgrupo SP/O-SM.

 Concentrações séricas de A-FABP encontraram-se mais elevadas no grupo SP/O, em comparação ao grupo NO, e ainda mais elevadas no grupo SP/O-SM, havendo diferença significativa entre os grupos SP/O e SP/O-SM, sugerindo à A-FABP o papel de marcador de SM também em pacientes com câncer de mama.

 Concentrações séricas de IL-6 encontraram-se mais elevadas nos grupos SP/O e SP/O-SM em relação ao grupo NO.

 Concentrações séricas de TNF- encontram-se mais elevadas no grupo SP/O-SM em relação ao grupo NO.

 Concentrações séricas mais elevadas de A-FABP associaram-se a doença mais avançada (ECP II) em pacientes do grupo SP/O-SM, independentemente de IMC, CA e estado menopausal, sugerindo-lhe potencial papel de marcador prognóstico.

 Concentrações séricas mais elevadas de A-FABP associaram-se a tumores HER2+ em pacientes do grupo NO, sugerindo que a A-FABP também pode ter papel de marcador de pior prognóstico, independente de obesidade ou SM.

 Concentrações séricas mais elevadas de IL-6 associaram-se a tumores RP- e triplo-negativos, considerados de pior prognóstico.

 Concentrações séricas mais elevadas de TNF- associaram-se a doença mais avançada (ECP III) em pacientes do grupo total e SP/O.

 Foram detectadas correlações positivas entre a A-FABP e as citocinas pró- inflamatórias, IL-6 e TNF-, sugerindo associação da A-FABP com o estado inflamatório do câncer mamário. 67

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8. APÊNDICES Apêndice 1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

Termo de consentimento pós – informação a ser obtida das pacientes, redigido de acordo com as resoluções 196/96 e 347/05, para participação no estudo intitulado: SAA e adiponectina – caracterização no câncer de mama na fase pós-menopausa e relação com obesidade

Nome do paciente: ......

Idade:...... anos RG:...... HC:......

Endereço:......

Nome do responsável legal (se paciente incapacitado): ......

......

RG:...... Grau de parentesco: ......

Endereço:......

Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei uma amostra de sangue (volume: 15 ml) a ser colhida em veia de um dos braços. Sei que posso sentir dor de pequena intensidade e de curta duração no local e no momento da coleta de sangue. Sei também que não terei outros prejuízos com a realização deste exame. Estou ciente de que este sangue será utilizado para a avaliação da quantidade de algumas proteínas que podem estar alteradas por causa do câncer de mama. Isso ainda não está comprovado. Estou ciente que um pedaço do tumor retirado durante a minha cirurgia para tratamento do câncer será examinado para a avaliação de características próprias deste tumor e que isso faz parte da rotina do serviço. Outro pequeno pedaço da mama retirada na cirurgia será utilizado para o estudo das mesmas proteínas que serão pesquisadas no sangue. Estou ciente que uma pequena parte do segundo pedaço será congelado, em caso dos resultados do estudo atual necessitarem complementação ou confirmação com 92 outra metodologia. Sei que posso não autorizar esse congelamento. Sei que posso sentir dor no local da extração, após passar o efeito do anestésico utilizado. O resultado do exame do tumor será colocado no meu prontuário médico. Estou ciente que as informações relativas ao meu peso, altura, medida da cintura e quadril e também relativas aos meus hábitos alimentares e de atividade física serão utilizadas nesse estudo. Estou ciente de que não terei prejuízos nem benefícios com a participação nesse estudo. No entanto, caso esse estudo auxilie no entendimento da causa ou da gravidade do câncer de mama, outras pessoas poderão se beneficiar no futuro. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento e que isto não vai prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei ainda, que meus dados pessoais serão mantidos em sigilo pelo pesquisador. Se tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar a Dra. Sílvia de Barros Mazon, do Departamento de Patologia Clínica, Tel: 3521-9435, 3521-7064. Se tiver reclamações sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a secretaria do Comitê de Ética em Pesquisa FCM/UNICAMP. Tel: 3521- 8936. Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.

......

Assinatura do paciente

......

Assinatura do responsável legal

......

Assinatura do pesquisador legal

Campinas,...... / ...... / ......

Apêndice 2: Ficha de coleta de dados

QUESTIONÁRIO

NOME: ______IDADE: ______anos

HC: ____ . ____ . ____ - __ DATA CIRURGIA:______

DATA NASCIMENTO: CA: PESO: QUADRIL: Cintura: Pescoço: ALTURA: RCQ: IMC: MENOPAUSA: DOENÇAS MEDICAMENTOS: ASSOCIADAS: ESCOLARIDADE: ESTADO CIVIL:

FATORES RACIAIS: caucasóide parda negra amarela

IDADE AO DIAGNÓSTICO: ______anos FATORES HISTOPATOLÓGICOS:

GH: GN: RE: ( + ) ( - ) RP: ( + ) ( - ) C-HERB B2: (0/+) (++) (+++) ESTADIAMENTO: T: N: M: ECp:

Apêndice 3: Critérios de seleção das pacientes voluntárias

Check List Nome: N° do Caso: HC: Data da Cirurgia: Critérios Inclusão Sim Não Pós-menopausa ( ) ( ) Peri-menopausa ( ) ( ) Pré-menopausa ( ) ( ) Imc ≥ 18,5 kg/m² ( ) ( )

Critérios Exclusão Não Sim Qt. Prévia ( ) ( ) Rt. Prévia ( ) ( ) Outro Câncer ( ) ( ) Doença Reumatológica ( ) ( ) Doença Alérgica ( ) ( ) Infecções Recente (até 15 dias) ( ) ( ) Vacina Recente (até 15 dias) ( ) ( ) Doença Pulmonares Crônica ( ) ( ) Imunossupressão ( ) ( ) Terapia de Reposição Hormonal ( ) ( ) Anticoncepcional ( ) ( ) Cardiopatia Grave ( ) ( ) ( ) Incluído ( ) Não Incluído

OBS:

9. ANEXOS Anexo 1: Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

Anexo 2 – Classificação TNM para o Estadiamento Clínico Patológico (ECP) do câncer de mama

Quadro 1: Classificação do T (tamanho do tumor primário)

T (Tamanho do tumor) Descrição

Tx O tumor primário não pode ser avaliado

T0 Não há evidências de tumor primário

Tis Carcinoma in situ

T1 Tumor ≤ 2 cm em sua maior dimensão:

T1mic* ≤ 0,1 cm

T1a > 0,1 ≤ 0,5 cm

T1b > 0,5 ≤ 1,0 cm

T1c > 1,0 ≤ 2,0 cm

T2 Tumor > 2 ≤ 5 cm em sua maior dimensão

T3 Tumor >5 cm em sua maior dimensão

Tumor de qualquer tamanho, com extensão direta à parede torácica T4 e/ou à pele: Extensão à parede torácica (costelas, músculos intercostais e serrátil T4a anterior). Não inclui o músculo peitoral Edema (inclusive tipo “casca de laranja”), ulceração da pele ou T4b nódulos cutâneos satélites confinados à mesma mama**

T4c Associação de T4a e T4b

T4d Carcinoma inflamatório***

*Microinvasão: invasão das células neoplásicas além da membrana basal, para os tecidos adjacentes, com nenhum foco maior que 0,1 cm em sua maior dimensão. Quando há vários focos, somente o tamanho do maior é usado para classificar a microinvasão.

**Invasão da derme: por si só não caracteriza como T4.

***Carcinoma inflamatório: endurecimento difuso da pele, com borda erisipeloide e frequentemente sem massa subjacente.

Quadro 2: Classificação do N (acometimento de linfonodos regionais)

N (lifonodos regionais)* Descrição

Nx Linfonodos regionais não podem ser avaliados

N0 Linfonodos regionais sem sinal de metástase

Metástase(s) em lifonodo(s) axilar(es) regional(ais) níveis I e II N1 móvel(eis)

N2 Metástase em lifonodo(s) regional(ais):

N2a Axilar(es) nível(eis) I e II, fixos entre si ou a outras estruturas

Da cadeia mamária interna, clinicamente detectada**, sem evidência N2b clínica de comprometimento de lifonodo(s) axilar(es)

N3 Metástase(s) em lifonodo(s) regional(ais):

Infraclavilar(es) nível III, com ou sem comprometimento de N3a lifonodo(s) axilar(es)

Da cadeia mamária interna, clinicamente detectada**, com evidência N3b clínica de comprometimento de lifonodo(s) axilar(es)

Supraclavicular(es), com ou sem comprometimento de lifonodo(s) N3c axilar(es) ou da mamária interna * Linfonodos regionais ou homolaterais são aqueles localizados no mesmo lado do tumor na mama. Quando em outras localizações, são codificados como metástase(s) (M1), inclusive os cervicais, supra e infraclaviculares e mamários internos contralaterais.

**Metástase clinicamente detectada: é assim definida quando detectada por exame clínico ou por estudos de imagem (excluindo linfocintigrafia), com características altamente suspeitas de malignidade, identificadas no exame citológico de material, obtido por aspiração com agulha fina. É designada com o sufixo (f) [Ex: cN3a(f)].

100

Quadro 3: Classificação do M (metástase à distância)

M (metástase à distância) Descrição

Mx Metástase à distância não pode ser avaliada

M0 Ausência de metástase à distância

Metástase à distância. Esta categoria pode ser adicionalmente especificada de acordo com as seguintes localizações, entre M1 outras: CER (cerebral); MO (medula óssea); LIN (linfonodos); CUT (pele); HEP (hepática); OSS (óssea); PLE (pleura); PER (peritônio); OUT (outras)

Fonte: Adaptado pelo INCA, a partir de material divulgado pela Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil do Rio de Janeiro, em 2004, e atualizado de acordo com a 7ª Edição do Estadiamento Clínico - TNM - UICC, 2010. Quadro 4: Grupamento por estádios para a composição do Estadiamento Clínico Patológico (ECP)

Estádio Tumor Linfonodo Metástase

0 Tis* N0 M0

IA T1** N0 M0

I T0 N1mic M0 IB T1 N1mic M0 T0 N1 M0 IIA T1** N1 M0 II T2 N0 M0 T2 N1 M0 IIB T3 N0 M0

T0 N2 M0 T1** N2 M0 IIIA T2 N2 M0

T3 N1 M0 III T3 N2 M0 T4 N0 M0 IIIB T4 N1 M0 T4 N2 M0 IIIC Qualquer T N3 M0

IV Qualquer T Qualquer N M1

*Tis = Carcinoma in situ **T1 inclui T1mic