B950d65c8231ff7dad32f921e77f

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

ФЕДОТОВА ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Фармакогностическое изучение золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.–Nath.)

14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ КОНОВАЛОВ Д.А. ДОКТОР ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК, ПРОФЕССОР

ПЯТИГОРСК – 2014 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...... 6 ВВЕДЕНИЕ ...... 7 ГЛАВА 1 ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ РОДА ЗОЛОТАРНИК ...... 13 1.1 История и распространение видов рода Золотарник...... 13 1.2 Ботаническая характеристика видов рода Золотарник ...... 16 1.3 Систематическое положение рода Золотарник ...... 17 1.4 Химический состав изученных видов рода Золотарник ...... 18 1.5 Использование сырья видов рода Золотарник ...... 22 Выводы по обзору литературы ...... 29 ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...... 30 2.1 Объекты исследования ...... 30 2.2 Методы исследования ...... 31 2.2.1 Химические реакции ...... 31 2.2.2 Хроматографические методы исследования ...... 32 2.2.3 Спектральные методы ...... 33 2.2.4 Титриметрические методы ...... 34 2.2.5 Гравиметрические методы ...... 34 2.2.6 Ресурсоведческие исследования ...... 34 2.2.7 Фармакологические методы исследования ...... 35 2.2.8 Отбор проб для анализа ...... 36 2.2.9 Методы макро– и микроскопического анализа сырья ...... 36 2.2.10 Определение числовых показателей ...... 37 2.2.11 Валидация методики количественного определения ...... 37 2.2.12 Микробиологическая чистота ...... 37 2.2.13 Определение сроков годности ...... 37 2.2.14 Методы статистической обработки ...... 37

ГЛАВА 3 ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕСУРСОВЕДЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ВВЕДЕНИЯ ЕГО В КУЛЬТУРУ ...... 38 3.1 Определение урожайности травы золотарника кавказского...... 38 3.2 Расчет объема ежегодных заготовок ...... 39 3.3 Исследования по введению золотарника кавказского в культуру ...... 41 Выводы по главе...... 45 ГЛАВА 4 МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И АНАТОМО–ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО...... 46 4.1 Морфологическая характеристика «Золотарника кавказского травы» ...... 46 4.2 Анатомическое строение листа ...... 47 4.2.1 Строение листа с поверхности ...... 47 4.2.2 Строение листа на поперечном срезе ...... 50 4.3 Анатомическое строение стебля ...... 52 4.3.1 Строение стебля с поверхности ...... 52 4.3.2 Строение стебля на поперечном срезе ...... 53 4.3.3 Строение стебля на продольном срезе ...... 57 4.4 Анатомическое строение цветка...... 59 4.5 Микроскопический анализ измельченной «Золотарника кавказского травы» ...... 64 4.6 Микроскопический анализ порошка «Золотарника кавказского травы» ...... 66 4.7 Морфологическая характеристика корневищ с корнями золотарника кавказского ...... 68 4.8 Анатомическое строение корневищ с корнями золотарника кавказского .... 69 Выводы по главе...... 73 ГЛАВА 5 ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО ТРАВЫ ...... 74

5.1 Анализ травы и корневищ с корнями золотарника кавказского с помощью качественных реакций ...... 74 5.2 Изучение фенольных соединений травы золотарника кавказского методом БХ ...... 75 5.3 Обнаружение рутина методом ТСХ в «Золотарника кавказского траве» ..... 78 5.4 Изучение фенольных соединений золотарника кавказского травы методом ВЭЖХ ...... 79 5.5 Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин в «Золотарника кавказского траве» методом дифференциальной спектрофотометрии ...... 82 5.6 Количественное определение фенолкарбоновых кислот в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского методом спектрофотомерии в пересчете на кофейную кислоту ...... 89 5.7 Количественное определение дубильных веществ в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского ...... 93 5.8 Изучение тритерпеновых гликозидов травы золотарника кавказского ...... 95 5.9 Изучение полиацетиленовых соединений корневищ с корнями золотарника кавказского ...... 99 5.10 Количественное определение органических кислот в траве золотарника кавказского ...... 100 5.11 Изучение органических кислот травы золотарника кавказского методом ВЭЖХ ...... 101 5.12 Изучение углеводов травы золотарника кавказского ...... 103 5.13 Биологически активные соединения травы золотарника кавказского, идентифицированные методом ГЖХ–МС ...... 109 5.14 Изучение аминокислотного состава травы золотарника кавказского ...... 112 5.15 Изучение минерального состава травы золотарника кавказского ...... 113 5.16 Определение некоторых числовых показателей травы и корневищ с корнями золотарника кавказского ...... 115 5.17 Микробиологическая чистота «Золотарника кавказского травы» ...... 117

5.18 Установление срока годности «Золотарника кавказского травы» ...... 118 Выводы по главе...... 120 ГЛАВА 6 ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ «ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО ТРАВЫ ЭКСТРАКТА СУХОГО», СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕННОГО ЭКСТРАКТА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ...... 121 6.1 Получение «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» ...... 121 6.2 Разработка методик стандартизации «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» ...... 122 6.2.1 Общие показатели ...... 122 6.2.2 Изучение фенольных соединений ...... 124 6.2.3 Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом дифференциальной спектрофотометрии ...... 125 6.2.4 Количественное определение фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту методом спектрофометрии ...... 130 6.3 Установление срока годности «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» ...... 131 6.4 Предварительное изучение фармакологической активности ...... 132 6.4.1 Определение «острой» токсичности «Золотарника кавказского травы» . 133 6.4.2 Патоморфологические изменения в органах, вызванные введением извлечения из травы золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг ...... 134 6.4.3 Изучение диуретической активности «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» ...... 140 6.4.4 Изучение антибактериального действия «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» ...... 141 Выводы по главе...... 144 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...... 145

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...... 148

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАС – биологически активные соединения БХ – бумажная хроматография ВРПС – водорастворимые полисахариды ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГЖХ – газо-жидкостная хроматография ГЖХ-МС – газожидкостная хромато-масс-спектрометрия ГМЦ – гемицеллюлозы ЛД – летальная доза ЛРС – лекарственное растительное сырье ПВ – пектиновые вещества ПС – полисахариды СО – стандартный образец СРС – спирторастворимые сахара ТСХ – хроматография в тонком слое сорбента ФСП – фармакопейная статья предприятия Ara – арабиноза Gal – галактоза Glс – глюкоза Rha – рамноза UAc – уроновые кислоты Xyl – ксилоза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Заболевания мочеполовой сферы в мире по данным Всемирной организа- ции здравоохранения находятся на одном из лидирующих мест в общей струк- туре заболеваемости населения. На сегодняшний день среди мужчин старше 60 лет в 90% случаях диагностируются заболеваниями почек, мочевого пузыря и предстательной железы. У женщин старше 50 лет уролитиаз, цистит и т.п. отме- чается в 70% случаев [12]. Синтетические препараты успешно используются в качестве основных средств при фармакотерапии и профилактике заболеваний почек. Но, несмотря на высокую эффективность, они оказывают и неблагопри- ятное воздействие на функциональное состояние организма. Биологически ак- тивные соединения лекарственных растений обладают широким спектром дей- ствия, низкой токсичностью, что позволяет их рекомендовать для длительной терапии. Однако, выбор растительных лекарственных препаратов, оказываю- щих комплексное нефропротекторное воздействие, ограничен. Перспективным источником с точки зрения получения нового вида лекар- ственного растительного сырья (ЛРС) является ранее неизученный представи- тель флоры Кавказа – золотарник кавказский (Solidago caucasica Kem.-Nath.). Лекарственные средства на основе некоторых видов рода золотарник широко используются в мировой медицинской практике. Так, экстракт травы золотар- ника канадского входит в препарат «Марелин» (Украина), применяемый в каче- стве спазмолитического, диуретического и противовоспалительного средства при лечении и профилактике оксалатного и уратного уролитиаза, а также в со- став препарата «Простанорм» (Россия), рекомендуемого при простатите. Экс- тракт травы золотарника обыкновенного входит в состав препарата «Фитодо- лор» (Германия), противовоспалительная активность которого сопоставима с таковой индометацина. Подземная часть этого вида золотарника входит в состав

БАД «Мен'с формула Простата форте», а также используется в народной меди- цине Кавказа в качестве ранозаживляющего средства [43]. В связи с этим изучение золотарника кавказского мы посчитали целесооб- разным. Степень разработанности темы Золотарник кавказский является неизученным научной медициной пред- ставителем флоры Северного Кавказа. Цель и задачи исследования Целью работы являлось фармакогностическое изучение золотарника кав- казского и научное обоснование возможности использования его в качестве ис- точника сырья для получения лекарственных средств, оказывающих влияние на мочевыделительную систему. Для достижения этой цели необходимо было ре- шить следующие задачи: 1. Изучить данные научной литературы по распространению, фитохи- мическому и фармакологическому изучению представителей рода Solidago. 2. Оценить ресурсные характеристики золотарника кавказского в неко- торых районах Северного Кавказа и исследовать возможность его культивиро- вания. 3. Определить морфолого-анатомические признаки травы и корневищ с корнями золотарника кавказского. 4. Исследовать качественный состав и количественное содержание ос- новных групп биологически активных соединений (БАС) травы и корневищ с корнями золотарника кавказского. 5. Провести предварительное изучение «острой» токсичности, диуре- тической и антибактериальной активности травы и сухого экстракта золотарни- ка кавказского. 6. Разработать проект фармакопейной статьи предприятия на «Золо- тарника кавказского траву». Научная новизна В результате проведенных исследований нами впервые:

 определены ресурсы золотарника кавказского в отдельных районах его произрастания на Северном Кавказе и изучена возможность его культивиро- вания;  предложены морфологические и анатомо–диагностические призна- ки, позволяющие установить подлинность травы и корневищ с корнями золо- тарника кавказского;  методом ВЭЖХ установлено, что в траве золотарника кавказского содержатся 24 фенольных соединения, из которых идентифицированы флаво- ноиды (рутин, виценин, гесперидин), кумарины (умбеллиферон, эскулетин, ди- гидрокумарин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная);  в составе органических кислот в траве золотарника кавказского ме- тодом ВЭЖХ идентифицированы лимонная, яблочная и янтарная;  изучены углеводы травы золотарника кавказского, основными по содержанию являются фракции пектиновых веществ (ПВ) и гемицеллюлоз (ГМЦ);  установлено, что трава золотарника кавказского содержит тритер- пеновые гликозиды – производные олеаноловой кислоты;  методом ГЖХ–МС в траве золотарника кавказского обнаружены жирные кислоты (дигидроксипропионовая, тригидроксимасляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая кислоты), многоатомные спирты и их производные (глицерин, ксилит, рибит, инозит, мио–инозит, сцило–инозит, глюцитол) и др.;  методом жидкостной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе в траве золотарника кавказского впервые обнаружены 15 аминокислот, из которых 9 являются незаменимыми;  установлено, что трава золотарника кавказского содержит 5 макро- элементов и 16 микроэлементов. Из них эссенциальными являются 11 элемен- тов, условно–эссенциальными – 6 и условно–токсичными – 4 элемента;

 установлено количественное содержание суммы флавоноидов, фе- нолкарбоновых кислот, органических кислот, тритерпеновых гликозидов, ду- бильных веществ в траве и фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ в корневищах с корнями золотарника кавказского;  методом ВЭЖХ в сухом экстракте золотарника кавказского уста- новлено содержание 18 соединений, из которых идентифицированы рутин, лю- теолин–7–гликозид, умбеллиферон, виценин, эскулетин, гесперидин, галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная кислоты;  в сухом экстракте золотарника кавказского методом ВЭЖХ выяв- лено наличие лимонной, яблочной и янтарной кислот, среди которых по содер- жанию преобладает лимонная кислота;  установлено содержание суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в сухом экстракте золотарника кавказского;  изучена токсичность «Золотарника кавказского травы», определена диуретическая и антимикробная активность, полученного из нее экстракта. Теоретическая и практическая значимость работы Изучена возможность использования нового вида отечественного сырья – «Золотарника кавказского травы» для получения суммарного препарата («Золо- тарника кавказского травы экстракта сухого»), обладающего диуретической и антимикробной активностью. Разработаны методы качественного и количественного анализа травы зо- лотарника кавказского, основанные на обнаружении фенольных соединений, тритерпеновых гликозидов, органических кислот и полисахаридов. Разработана технологическая схема производства сухого экстракта травы золотарника кав- казского. Разработаны нормы, позволяющие стандартизовать траву золотарника кавказского и сухой экстракт из нее с учетом современных требований, предъ- являемых к качеству ЛРС и извлечений на его основе. Методология и методы исследования В работе были использованы методы позволившие провести комплексные фармакогностические (макро– и микроскопические, фитохимические, товаро-

ведческие и ресурсоведческие) исследования. В рамках отдельных технологиче- ских и фармакологических экспериментов с использованием соответствующих методов исследования были получены предварительные данные, позволившие обосновать возможные направления использования нового вида ЛРС. Фитохи- мические исследования проводились с использованием бумажной, тонкослой- ной, газожидкостной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хрома- тографии, газожидостной хромато–масс–спектрометрии, спектрофотометрии в УФ–, видимой и ИК– областях. Положения, выносимые на защиту:  результаты ресурсоведческих и интродукционных исследований зо- лотарника кавказского;  результаты морфолого-анатомического изучения травы и корневищ с корями золотарника кавказского;  результаты фитохимического изучения основных групп БАС в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского;  методики стандартизации «Золотарника кавказского травы» и сухо- го экстракта на ее основе;  результаты предварительных фармакологических исследований. Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полу- ченных результатов определяется объемностью изученной информационной ба- зы и обширностью исследования, использованием различных современных фи- зико–химических методов анализа, математико–статистической обработкой по- лученных данных. Основные положения диссертационной работы представлены на Между- народной научной конференции «Рациональное использование природных био- логических ресурсов» (Рим–Флоренция, 2013); на II Международной научно– практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012); на XХ Российском националь- ном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013); на региональных конфе- ренциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической про-

дукции» (Пятигорск, 2012, 2013, 2014); на научно-практической конференции молодых ученых и студентов ВолгГМУ "Актуальные проблемы эксперимен- тальной и клинической медицины" (Пятигорск, 2014); на региональном подго- товительном этапе Конкурса молодежных проектов Всекавказского молодежно- го Форума «Машук–2013» (Пятигорск, 2013); на Северо–Кавказском молодеж- ном Форуме «Машук–2013» (Пятигорск, 2013). По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 7 статей – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Личный вклад автора Автор участвовал во всех этапах экспериментальных работ, в получении исходных данных, их обработке и интерпретации, оформлении диссертацион- ной работы. Автором проведен фитохимический анализ травы и корневищ с корнями золотарника кавказского, исследованы ресурсы травы и изучена воз- можность введения в культуру золотарника кавказского, установлены морфоло- гические и анатомо-диагностические признаки сырья, проведены предваритель- ные фармакологические исследования экстракта из травы золотарника кавказ- ского. Объем и структура диссертации Работа изложена на 163 страницах текста компьютерного набора и состо- ит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, списка цитируемой литературы, включающего 163 источника, из которых 86 на иностранном языке, и приложе- ния. Диссертация иллюстрирована 53 рисунками и 35 таблицами.

ГЛАВА 1 ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ РОДА ЗОЛОТАРНИК

1.1 История и распространение видов рода Золотарник

Золотарник (Solidago L.) известен еще с библейских времен, по одной из версий он является жезлом Аарона. Когда израильтяне возроптали на перво- священника Аарона, Моисей, по повелению Божию, приказал начальникам ко- лен принести свои жезлы. На них Моисей написал имена тех, кому они принад- лежали. Все жезлы были положены в скинии собрания перед ковчегом. Оказа- лось, что только жезл Аарона чудесным образом расцвел за одну ночь, знаменуя этим избранность сословия священников (Библия, чис. 9:4). Русское название золотарник происходит от слова золото. Оно дано по зо- лотисто–желтым цветкам растения. Название золотая розга дано по форме стеб- ля и цветка. Стебель у этого растения прямой, желобчатый и похож на хлыст. Родовое название Solidago L. происходит от латинского solidus – крепкий, здо- ровый и agree – делающий. Французское название Verge d’or происходит от двух слов verge – розга (хлыст) и or – золото. Английское название Goldenrod имеет следующее происхождение: golden – золото и rod – розга. В словаре Н.И. Анненкова для золотарника обыкновенного (Solidago virgaurea L.) приводится более 50 синонимов, благодаря тому, что он в каждой российской губернии имел свое толкование и название: блошник, полетуха (Могил.), винокур (Нижег.), воронец, заячьи уши (Костр.), зверобой (Моск.), желтый цвет, золотое перо (Тверск.), живительная трава (Перм.), краснуха (Пск.), боровой пуховик (Влад.), перестрел, табака лесная (Гродн.), дикая цыкорiя (Минск.), жовтобрюх (Киев.), nawloc glowienki czerwone (Пол.), woolmete rohi (Эст.), keltainenkukka (Фин.) [2]. В Канаде, США и Мексике золотарник широко распространен как дико- растущее растение, в Европе – как возделываемое декоративное и одичалое

[112]. Впервые как декоративное интродуцированное растение золотарник заре- гистрирован в Ботаническом саду Лондона в 1758 г. [160]. Вскоре он был отме- чен в садах и питомниках континентальной Европы [159]. Золотарник стал ин- вазионным через 100 лет [126, 157] ввиду высокого уровня изменчивости мор- фолгических признаков [104]. В настоящее время ареал рода в Европе прости- рается от 42 до 63° с. ш. и ожидается дальнейшее расширение его границ в вос- точном направлении [158]. Помимо Европы золотарник также натурализовался в Японии, Корее [159] и на Дальнем Востоке РФ [67], в Новой Зеландии, Австралии, на Азорских и на Гавайских островах, а также в Мексике [159]. В СССР золотарник канадский был впервые введен в культуру в 1986 году на Украине c целью получения лекарственного растительного сырья для произ- водства препарата Марелин. После распада СССР культура золотарника канад- ского была апробирована в России в условиях Ставропольской возвышенности [40], нечерноземной зоне [76] и Московской области [50]. Распространение видов рода Золотарник во флоре России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) по данным Черепанова С.К. [73] пред- ставлено в таблице 1.1. Золотарник требователен к свету [22], однако обнаруживается и в тени [91, 126]. Чаще встречается на участках богатых азотом, предпочитает климат с умеренными летними и зимними температурами [104], обладает широкой ус- тойчивостью к влажности почвы [159]. Виды рода Золотарник являются корневищными гемикриптофитами [133] и имеют сложный жизненный цикл с поколениями корневищ и семян. Образо- вание семян, новых побегов и корневищ происходит каждый год, а все надзем- ные побеги отмирают в осенний период [89, 91]. В менее благоприятных усло- виях и под воздействием часто повторяющихся повреждающих факторов обра- зуется больше легких семян, что гарантирует рассеивание на дальние расстоя- ния [161, 162].

Таблица 1.1 – Распространение видов рода Золотарник в отдельных районах флоры России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) Район Вид

Восточная Европа S. altissima L. S. canadensis L. S. graminifolia (L.) Salisb. S. jailarum Juz. S. lapponica With. S. serotinoides A. & D. Love S. taurica Juz. S. virgaurea L. Кавказ S. alpestris Waldst. & Kit. ex Willd. S. arguta Ait. S. armena Kem.–Nath. ex Grossh. S. canadensis L. S. caucasica Kem.–Nath. S. juncea Ait. S. neglecta Torr. & Gray S. odora Ait. S. rupestris Rafin. S. serotinoides A. & D. Love S. turfosa Woronow ex Grossh. S. virgaurea L. Западная Сибирь S. dahurica Kitag. S. virgaurea L. Восточная Сибирь S. dahurica Kitag. S. juncea Ait. Дальний Восток S. compacta Turez. S. decurrens Lour. S. gigantea Ait. S. kurilensis Juz. S. multiradiata Ait. S. pacifica Juz. S. spiraefolia Fisch. ex Herd. Средняя Азия S. canadensis L. S. dahurica Kitag. S. kuhistanica M. Pop. ex Juz.

Таким образом, во флоре России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) встречаются 26 видов рода Золотарник.

1.2 Ботаническая характеристика видов рода Золотарник

Золотарник обыкновенный – Solidago virgaurea L. – многолетнее травя- нистое растение семейства астровых (Аsteraceae). Стебель золотарника обыкновенного чаще высокий 16-100 см и выше, прямостоячий или слегка извилистый, в нижней части голый, в верхней – слегка опушенный (рисунок 1.1). Листья голые или слабо опушенные, в особенности по краям и жилкам. Прикорневые листья яйцевидные, продолговато–яйцевидные или эллиптиче- ские, их край пильчатый. Стеблевые листья постепенно уменьшаются в разме- рах на постепенно укорачивающемся крылатом черешке, в конце сидячие, про- долговатые, эллиптические или ланцетные, суженные к обоим концам, на вер- хушке – острые. Соцветие верхушечное кистеобразное со сравнительно короткими и малоцветковыми веточ- ками, расположенными в пазухах кроющих листь- ев; или широкое метельчатое с удлиненными и многоцветковыми веточками, расположенными в пазухах менее крупных кроющих листьев. Корзин- ки многочисленные, средней величины: 10-15 мм длиной и шириной. Золотарник обыкновенный имеет горизон- тальное или косо восходящее корневище [68]. Отличительными морфологическими призна- Рисунок 1.1 – ками являются 4-, 6-рядная обвертка, корзинки 10- Золотарник обыкновенный 15 мм шириной, ножки корзинок c многочисленны-

ми прицветниками [13].

Золотарник кавказский (Solidago caucasica Kem.–Nath.) – многолетнее травянистое растение со стеблями, немного приподнимающимися при основа-

нии или прямостоячими, высотой 30-70 см, у основания слегка или полностью окрашены антоцианом в красный цвет. Листья яйцевидно–продолговатые, продолговато–ланцетные или ланцет- ные, пильчатые, суженые в окрыленный черешок, короче листовой пластинки. Самые верхние листья нередко сидячие. Соцветие колосовидное, сжатое, плотное или рыхловатое, обычно пре- рванное. Ножки цветочных корзинок без прицветников или с немногочислен- ными прицветниками, чаще сильно опушенные. Корзинки крупные, высотой 1-1,5 см, 1,5-2 см в диаметре. Обвертка кони- чески–колокольчатая. Листочки корзинки рыхло расположенные, немногоряд- ные, наружные ланцетные в 1,5-2 раза короче узколинейных внутренних, те и другие слегка опушенные, острые. Язычки краевых цветков узкопродолговатые, равные по длине обвертке или слегка короче ее. Цветки мелкие желтые, плод семянка [68]. Отличительными морфологическими признаками являются 2-, 3-рядная обвертка, корзинки 15-20 мм шириной, ножки корзинок обычно без прицветни- ков [13].

1.3 Систематическое положение рода Золотарник

Систематическое положение рода Золотарник рассмотрено в соответствии с системой магнолиофитов А.Л. Тахтаджяна [55].  отдел Magnoliophyta  семейство Asteraceae  класс Magnoliopsida  подсемейство Asteroideae  подкласс Asteridae  триба Astereae  надпорядок Asteranae  poд Solidago  порядок Asterales

1.4 Химический состав изученных видов рода Золотарник

S. virgaurea L. – з. обыкновенный Полифенолы: Флавоноиды: рутин, кверцетин, кверцитрин, астрагалин [7, 149], изо- кверцитрин, рамноглюкозид кемпферола [145], кемпферол, изорамнетин, нар- циссин, глюкорамнозид рамнетина [6, 23], никотифлорин, афзелин (3–рамнозид кемпферола) [113], кверцетин–D–глюкозид, кемпферол–D–глюкозид, кемпфе- рол–3–О–рутинозид [114] Фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая [87], кофейная, изохлороге- новая гидроксикоричная, хинная [149] Фенольные соединения: лейокарпозид [141], виргауреозид А [118, 119] Кумарины: эскулетин, эскулин [113] Дубильные вещества Антоцианы: 3–гентиобиозид цианидина [87] Сапонины: виргауреасапонины (виргауреасапонин–3 [85]), в гидролизате виргауреагенин А [118], виргауреагенин В (олеаноловая кислота), виргауреаге- нины С, D, Е, виргауреагенины G (полигаловая кислота), Н [164], солидагоса- понин 21 – 30 (рисунок 1.2) [135], байогенин [152] Дитерпеноиды [96] Тритерпеноиды [117, 127] Полиацетиленовые соединения: 2,8–цис–цис–матрикариаэфир, матрика- риа–лактон, лахнофиллумлактон [129] Бром 0,055% [46] Углеводы: полисахариды 3-8%, в гидролизате галактуроновая кислота, га- лактоза, глюкоза, арабиноза, ксилоза, рамноза [41, 42, 74, 78] Фитоэкдизоны Жирное масло 14,4% Каучук [19]

Компоненты эфирного масла: лимонен, β–элемен, δ–элемен, гермак- рен В , гермакрен D, δ–кадиен, α–пинен, β–мирцен [153]

Солидагосапонин 21 R1=Xyl; R2=H; R3=H; R4=A Солидагосапонин 26 R1=Glc; R2=H; R3=H; R4=A Солидагосапонин 22 R1=Xyl; R2=H; R3=A; R4=H Солидагосапонин 27 R1=H; R2= Glc; R3=H; R4=H Солидагосапонин 23 R1=Xyl; R2=H; R3=Api–Ac; R4=A Солидагосапонин 28 R1=Glc; R2=H; R3= Api; R4=Ac Солидагосапонин 24 R1=Xyl; R2=H; R3=H; R4=B Солидагосапонин 29 R1=H; R2= Glc; R3= Api; R4=Ac Солидагосапонин 25 R1=Xyl; R2=H; R3=H; R4=H Солидагосапонин 30 R1=Glc; R2=H; R3=H; R4=H

Рисунок 1.2 – Солидагосапонины

Solidago canadensis L. – золотарник канадский Полифенолы: Флавоноиды: кемпферол, кверцетин, изорамнетин, астрагалин, кемпфе- рол–3–О–глюкорамнозид, кверцетин–3–О–глюкопиранозид, рутин, кверцетин– 3–О–(611–О–ацетил)–глюкопиранозид, изорамнетин–3–О–глюкопиранозид, изо- рамнетин–3–О–рутинозид (нарциссин), рамнетин–3–О–глюкорамнозид, изо- рамнетин–3–О–(611–О–ацетил)–глюкопиранозид Фенолкарбоновые кислоты: кофейная кислота Кумарины: скополетин, умбеллиферон [45]

Тритерпеновые сапонины: гликозиды олеаноловой кислоты, канаденси- сапонины 1 – 8, 3β–(3R–ацетоксигексадеканоилокси)–люп–20(29)–ен, 3β–(3– кетогексадеканоилокси)–люп–20(29)– ен, 3β–(3R–ацетоксигекса-деканоил- окси)–29–нор–люпан–20–он,3β–(3–гетогексадеканоилокси)– 29– нор–люпан– 20–он [136, 144], байогенинсапонины 1 – 4 [86, 116, 124] Компоненты эфирного масла: лимонен, β–элемен,δ–элемен, гермакрен В, гермакрен D [163], α–пинен, β–мирцен [153], 3–эпи–α–кубебен, 3–эпи–β– кубебен [106] Полиацетиленовые соединения: матрикариаэфир, клеродан, колавеноло- вая кислота [140] Аминокислоты, горечи, полисахариды [153]

S. gigantea Ait. – з. гигантский Полифенолы: Флавоноиды: кемпферол–3–О–рутинозид, кемпферол [98] Фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая [155] Компоненты эфирного масла: α–пинен, β–мирцен [153], эпи–ториленол, 1,10–секо–эудесма–4(15), 5(10)–диен–1–aл, цис–эудесм–4(10)– ен–1–oн [98] Сапонины: гигантеасапонины 1 – 6 [130]

S. virgaurea var. gigantean Полифенолы: Флавоноиды: кемпферол–3–О–рутинозид Тритерпеноиды: эритродиол–3–ацетат [95, 99], β–амирина ацетат [95] Витамины: α–токоферол–квинон [99] Производное изопрена: транс–фитол [95, 99] Компоненты эфирного масла: β–диктиоптерол [95]

S. daurica Kitag. – з. даурский Полифенолы: Флавоноиды Кумарины Тритерпеноиды: сквален Стероиды: лолиолид [120] Углеводы Ациклические полиацетиленовые соединения Сесквитерпеновые лактоны [80]

S. decurrens Lour. – з. низбегающий Полифенолы: Фенолкарбоновые кислоты: кофейная, хлорогеновая Фенольные соединения: лейокарпозид [33] Ароматические соединения: 5–бензилметоксибензоат, 3–метокси–4– ацетоксициннамоилангелат, 3,5–диметокси–4–ацетосициннамоилангелат, 2– метоксибензил–2,3,6–триметоксибензоат, 2–метоксибензил–2,6– диметоксибензоат, бензил–2–гидрокси–6–метоксибензоат, метил (2E,8Z)– декадиен–4,6–диноат, бензил–2,6–диметоксибензоат, метил (2Z,8Z)–декадиен– 4,6–диноат [88] Антоцианы: цианидин–3–глюкозил–гликозид [33] Стероиды: ситостерин Тритерпеновые сапонины: [115] Полиацетиленовые соединения [88, 115]

S. odora Ait. – з. душистый Компоненты эфирного масла: α–пинен, β–мирцен [134]

S. elongate Nutt. Дитерпеноиды: элонгатолид A, B, C, D, E [82]

S. graminifolia (L.) Salisb. – з. кустистый Полифенолы: Фенольные соединения: изошафтозид [155]

S. rugosa Mill. – з. морщинистый Дитерпеноиды: (+)–18–тиглоксиманнол, 18–гидроябиета–7,13(14)–диен, 18–тиглоксиябиета–7,13(14)–диен, 7–гидро–13,15–дигидроксиябиета–8 (14)– ен–18–оик кислота, 15–гидройдегидроабиетик кислота [102]

S. altissima L. – з. высочайший Полифенолы: Флавоноиды: кемпферол–3–O–рутинозид–7–O–β–D–апиофуранозид Фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая кислота, кофейная кислота и ее производные) Фенольные гликозиды: транс–тилирозид [77] Ацетиленовые соединения и терпеноиды: дегидроматрикариалактон, Е,7α–ацетоксилколавеновая кислота (солидагоновая кислота), колавенол [92].

1.5 Использование сырья видов рода Золотарник

Применение золотарника в народной медицине В народной медицине настой и отвар травы золотарника обыкновенного используется как диуретическое, антисептическое, противовоспалительное средство при болезнях почек и мочевого пузыря (мочекаменная болезнь, холе- цистит, язвенный цистит, энурез), гипертрофии предстательной железы. Одна- ко, сфера применения золотарника намного шире. Он оказывает вяжущее, пото- гонное, отхаркивающее, гемостатическое действие, применяется при желчнока- менной болезни, сахарном диабете, бронхиальной астме, туберкулезе легких, острых респираторных инфекциях, остром ларингите, ангине, коклюше, подаг-

ре, артритах, энтерите, колите, меноррагии, белях, экземе, асците. В Молдавии, Белоруссии соцветия используют наружно в смеси со сливками, свиным жиром или сливочным маслом при туберкулезе кожи, дерматитах, ожогах, ревматизме. В Коми АССР, на Кавказе, в Сибири – при скрофулезе. В китайской народной медицине семена золотарника обыкновенного применяют для разжижения кро- ви и устранения вздутия кишечника, а также при нарушениях менструального цикла, холере, диарее, появлении крови в моче у детей. На Кавказе настойки подземной части золотарника применяются в качестве ранозаживляющего сред- ства [43]. Применение золотарника в научной медицине Золотарник обыкновенный, з. канадский и з. гигантский включены в Ев- ропейскую фармакопею [108], з. канадский и з. гигантский – в Британскую тра- вяную фармакопею [90]. В СССР была разработана ФС «Трава золотарника ка- надского» [69]. Для видов рода Золотарник установлен целый спектр фармакологической активности. Мочегонная активность Флавоноидная фракция золотарника обыкновенного в дозе 25 мг/кг пока- зывала увеличение диуреза у крыс на 88% через 24 ч по сравнению с контроль- ным образцом (NaCl, 5 мл, пероральное введение), при этом наблюдалось сни- жение ночной экскреции калия и натрия и увеличение экскреции кальция. Значительное увеличение диуреза у крыс с повышенным выведением на- трия, калия и хлорид–ионов наблюдалось после приема внутрь золотарника обыкновенного (0,3% флавоноидов, 4,64 мл / кг и 10,0 мл / кг). Причем низкая доза оказалась более эффективной [146]. Противовоспалительная активность Противовоспалительная активность сапонинов золотарника обыкновенно- го была испытана на модели отека у крыс. В результате наблюдалось значи- тельное снижение отека после внутривенного введения 1,25-2,5 мг/кг комплекса тритерпеновых сапонинов [121, 125].

Лабдановые дитерпены, выделенные из золотарника чилийского, при хло- ровородно–этанольно индуцированных поражениях желудка у мышей проявили гастропротектиновую активность [147]. Дитерпен солидагогенон, содержащийся в водном экстракте из соцветий золотарника чилийского, также проявил гастропротективную активность [111]. На крысах был протестирован препарат Phytodolor на противовоспали- тельную, обезболивающую и жаропонижающую активность. Активность была такой же, как и у стандартных образцов салицилового спирта и индометацина [137, 138, 150]. Сапонины, флавоноиды и кофейная кислота, выделенные из золотарника обыкновенного ингибировали активность лейкоцитарной эластазы и протеазы, участвующих в прогрессировании воспаления. Сапонины стимулировали синтез и высвобождение глюкокортикоидов в надпочечниках [131]. Водный экстракт золотарника обыкновенного значительно подавлял вос- палительную реакцию на коже морских свинок, индуцированную рентгенов- ским излучением [156]. 46% водно–спиртовый экстракт золотарника чилийского оказывал проти- вовоспалительную активность за счет ингибирования дигидрофолат редуктазы. Лейокарпозид, выделенный из золотарника чилийского, оказывал проти- вовоспалительный и болеутоляющий эффект [111, 154]. Выделенная из золотарника гигантского 3,5–ди–О–кофейная кислота об- ладала противовоспалительными свойствами, не имея побочных эффектов, и поэтому исследовалась как потенциальное лекарственное средство [159]. Антиоксидантная активность

Водно–спиртовый экстракт золотарника обыкновенного как компонент препарата Phytodolor ингибировал образование активных форм кислорода [142].

Анальгетическая активность

Экстракт золотарника обыкновенного проявлял анальгетическую актив- ность, воздействуя на брадикининовые рецепторы [107, 132]. Установлена эффективность жидкого экстракта золотарника чилийского при лечении люмбаго: в течение 15 дней кожу смазывали гелем, содержащим 5% экстракта золотарника чилийского, и добились значительного анальгетиче- ского эффекта [109]. Спазмолитическая активность

Наличие флавоноидов (кверцетин и кемпферол) в золотарнике обыкно- венном обуславливало установленное вазодилаторное действие, зависящее от ингибирования протеинкиназы С, ингибирования фосфодиэстеразы и цикличе- ских нуклеотидов, а также уменьшения поступления ионов Ca2 + [103].

Антибактериальная активность

Эфирное масло золотарника обыкновенного и з. канадского оказывало ан- тибактериальную активность в отношении Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa [27, 93]. Сухие и жидкие водно–спиртовые экстракты золотарника обыкновен- ного, з. канадского, з. гигантского эффективны против Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Chlamydia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa [94, 101, 128]. Водный экстракт корневищ золотарника чилийского подавлял активность Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa [97,110].

Противогрибковая активность

Деацилированные тритерпеновые сапонины золотарника обыкновенного проявляли противогрибковую активность в отношении видов рода Candida (Candida аlbicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C. guilliermondi, C. glabrata и Cryptococcus neoformans) выше, чем смесь сапонинов [85]. В других экспериментах показана противогрибковая активность спиртово-

го экстракта золотарника обыкновенного в отношении дерматофитов, особенно в отношении Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum и M. canin. Противогрибковая активность в отношении Candida albicans была очень низкой. Противомикробную активность также проявляет и золотарник гигантский [139].

Противоопухолевая активность

Тритерпеновые сапонины проявляют противоопухолевую активность [100]. Значительная противоопухолевая активность виргауреасапонина Е, выде- ленного из золотарника обыкновенного, в дозе 1 мг/кг/сут. была установлена в экспериментальной модели саркомы у мышей [105]. В другой серии экспери- ментов был продемонстрирован противоопухолевый эффект полисахаридов зо- лотарника обыкновенного в отношении простаты, рака молочной железы, мела- номы и рака легких. Рост опухоли подавлялся в дозе 5 мг/кг [83]. Противоопухолевая активность наблюдалась у гексанового, хлороформ- ного, этилацетатного и 50% водно–спиртового экстракта золотарника канадско- го в отношении клеток линии HeLa и MCF–7 [143]. Иммуномодулирующая активность

Иммуномодулирующая активность (индукция макрофагов и активация NK–клеток), а также противоопухолевая активность тритерпенового сапонина виргауреасапонина Е была показана в экспериментах in vitro [122].

Антиагрегантная активность

Дитерпены, содержащиеся в водном экстракте золотарника чилийского, ингибировали АДФ–индуцированную агрегацию тромбоцитов в крови челове- ка; а сапонины блокировали кальциевые каналы, что свидетельствовало об ан- тиагрегантной активности золотарника чилийского [110, 123].

Сырье золотарника входит в состав 21 наименования мирового фармацев- тического рынка, из которых в России представлены 6 (таблица 1.2).

Таблица 1.2 – Фармацевтическая продукция, в состав которой входит золотарник № Название Вид рода Применение Золотарник В Государственный реестр лекарственных средств РФ [17] входят лекарственные средства 1 Простанорм (Россия) З. канадский Простатит 2 Золотарника канадского З. канадский Диуретик экстракт сухой (Россия) Гомеопатические лекарственные средства 3 Псоризер (Россия) З. обыкновенный Псориаз 4 Солидаго композитум С З. обыкновенный Острые и хронические (Германия) заболеваниях почек 5 Нефронал Эдас-928 З. обыкновенный Мочекаменная болезнь (Россия) В Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию в РФ, входит следующая БАД [44] 6 Антиник (Россия) Вид не указан Облегчает симптомы отмены никотина Иностранная фармацевтическая продукция, не зарегистрированная на территории РФ [58] 7 Цистиум солидаго раствор З. гигантский Инфекций мочевыво- (Германия) дящих путей и мочека- менная болезнь 8 Солидагорен моно З. обыкновенный Нефрит и мочекаменная (Германия) болезнь 9 Марелин (Украина) З. канадский Мочекаменная болезнь 10 Фитодолор (Германия) З. обыкновенный Полиартрит 11 Простамед (Германия) З. канадский Простатит 12 Мен'с формула Простата S. adorax Простатит форте (США) 13 Простамакс (Германия) З. обыкновенный Простатит 14 Биофорс Солидаго ком- З. обыкновенный Мочекаменная болезнь плекс (Германия) 15 Хомвиокорин–N З. обыкновенный Хроническая сердечная (Германия) недостаточность 17 Чай Иван Кузьмич №5 З. обыкновенный Мочекаменная болезнь (Польша) 18 Урофлюкс (Германия) Вид не указан Мочегонное средство 19 Уронат медивит (Польша) З. обыкновенный Инфекций мочевыво- дящих путей 20 Витерган (США) З. обыкновенный Инфекций мочевыво- дящих путей 21 Биолайн Простейт (США) З. обыкновенный Простатит

Золотарник обыкновенный имеет медоносное значение [3]; является кор- мовым растением для северных оленей, амурского горала и бобров. Однако, для овец это растение ядовито [43]. Применялся в качестве дубильного и красильного растения, из травы и цветков которого извлекали желтую и коричневую краски [18]. Эфирное масло золотарника обладает оригинальным запахом [77]. Листья золотарника используются как ароматическая приправа [43]. Таким образом, виды рода золотарник являются довольно распространен- ными растениями, содержащими богатый комплекс БАС, нашедшими свое при- менение не только в медицине, но и в других сферах деятельности.

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

1. В результате изучения литературных данных установлено, что фитохими- ческое изучение золотарника кавказского не проводилось, но имеются данные, что для видов рода Золотарник установлено присутствие таких классов биологически активных соединений, как флавоноиды, фенолкар- боновые кислоты, кумарины, сапонины, полиацетиленовые соединения, полисахариды, ароматические соединения. 2. Изученные в большей или меньшей степени виды рода Золотарник обла- дают широким спектром фармакологической активности: диуретическим, спазмолитическим, противовоспалительным и т.д. 3. Приведенные сведения о культивировании видов рода Золотарник свиде- тельствуют о перспективности изучения возможностей выращивания зо- лотарника кавказского. 4. Анализ данных литературы показал, что золотарник кавказский является фармакогностически неизученным растением Кавказа.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

Объектами исследования являлись трава и корневища с корнями золотар- ника кавказского (рисунок 2.1). Трава заготавливалась в начале цветения путем срезания верхней части длиной 25-30 см без грубых оснований стеблей с изме- нившими окраску листьями в 2009–2013 гг. на территории Северного Кавказа: Республика Карачаево–Черкесия, Карачаевский район (перевал Гумбаши, уще- лье р. Даут к перевалу Учкулан, верховье р. Даут на перевале Эпчик), Респуб- лика Кабардино–Балкария, Чегемский район (г. Чегем) и Зольский район (уро- чище Джилы–Су), также использовалась трава, заготовленная от культивируе- мых растений в 2011– 2013 гг. Траву з. кавказского сушили на воздухе в тени под навесами и в хорошо проветриваемых помещениях. После сушки из сырья удаляли часть стеблей, почерневшие листья и посторонние примеси. Корневища с корнями заготавливали от культивируемого золотарника кавказского ранней весной 2014 г., выкапывая вручную. Корневища с корнями очищали от остатков надземных частей и земли, промывали, сушили в хорошо проветриваемом по- мещении.

Рисунок 2.1 – Золотарник кавказский (Solidago caucasica Kem.–Nath.)

2.2 Методы исследования

2.2.1 Химические реакции Наличие биологически активных веществ в траве и корневищах с корнями з. кавазского устанавливали с помощью общепринятых качественных реакций [4, 35, 40, 71, 72]. Для обнаружения флавоноидов использовали спиртовое извлечение (спирт этиловый 70%) в соотношении 1:10, с которым проводили цианидино- вую пробу (восстановление магнием в присутствии хлористоводородной кисло- ты концентрированной) и реакцию с алюминия хлоридом. Для установления наличия тритерпеновых сапонинов готовили водное из- влечение 1:10 кипячением на водяной бане в течение 10 минут, охлаждали и фильтровали. В 2 пробирки помещали по 2 мл фильтрата. В первую пробирку прибавляли хлористовородную кислоту 0,5 М, во вторую – натрия гидроксид 0,5 М. Пробирки встряхивали и наблюдали пену как в кислой, так и в щелочной средах (тритерпеновые сапонины). Для проведения реакции Либермана– Бурхарда навеску травы золотарника кавказского (10,0 г) обезжиривали бензо- лом, проводили экстракцию последовательно хлороформом и метанолом. Мета- нольное извлечение упаривали и к сухому остатку прибавляли укусный ангид- рид и серную кислоту концентрированную. Присутствие дубильных веществ определяли в водном извлечении (мас- со–объемное соотношение 1:10, продолжительность экстракции 5 мин) по реак- ции с раствором квасцов железоаммонийных. Для обнаружения кумаринов была использована лактонная проба. Гото- вили извлечение из сырья золотарника кавказского спиртом этиловым 95% в соотношении 1:10 путем кипячения в течение 15–20 мин на водяной бане с об- ратным холодильником. К 5 мл приготовленного извлечения прибавляли 10 ка- пель спиртового раствора натрия гидроксида 10% и нагревали на водяной бане. Затем добавляли 10 мл воды и 15 капель хлористоводородной кислоты 10%.

Идентификацию аминокислот проводили в кислотном извлечении (хлори- стоводородная кислота, массо–объемное соотношение 1:10, температура 70 ºС, 10 мин) по биуретовой реакции и реакции с нингидрина раствором. Обнаружение углеводов осуществляли с помощью реакции Бертрана и со спиртом этиловым 95%.

2.2.2 Хроматографические методы исследования Для проведения хроматографического анализа использовалась хромато- графическая бумага «Filtrak», а также пластинки «Sorbfil» (ПТСХ–П–В–УФ). Пластинки для ТСХ–анализа предварительно выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100–105 °С в течение 1 часа с целью их активирования. Мето- дика обнаружения: на линию старта хроматографической пластинки размером 15×15 или хроматографической бумаги наносили с помощью микрошприца по 5 мкл или 10 мкл соответственно извлечения из травы з. кавказского. Параллель- но наносили по 5 мкл растворов рабочих стандартных образцов. Хроматографи- ческие камеры предварительно насыщали парами растворителей в течение 40 – 60 мин в случае ТСХ и в течение 12–16 часов в случае бумажной хроматогра- фии. Хроматографирование осуществляли восходящим способом в герметично закрытой камере, содержащей соответствующую систему растворителей. Анализ хроматограммы проводили, когда фронт растворителя достигал 13 см для ТСХ или 40 см для БХ. После хроматографирования пластинки высуши- вали на воздухе под вытяжным шкафом, просматривали в видимом и УФ–свете, обрабатывали определенным реагентом с помощью пульверизатора [1, 32, 75]. ВЭЖХ использовалась для анализа фенольных соединений и органиче- ских кислот. Анализ проводили на хроматографе фирмы «Gilston» с последую- щей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью програм- мы «Мультихром» для «Windows». Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, со времена- ми удерживания растворов стандартных образцов. Оценку количественного со-

отношения идентифицированных веществ проводили по площади пиков, ис- пользуя метод внутренней нормализации [29]. Для установления моносахаридного состава углеводов проводили их ки- слотный гидролиз. Нейтральные сахара идентифицировали методом ГЖХ. ГЖХ – анализ образцов снимали на хроматографе Сhrom-5 с пламенно– ионизационным детектором, стеклянная колонка (1,5 м × 0,3 м) 5% Silicone XE – 60 на хроматоне NAW – 0,200×0,250 меш, 210 °С; газ–носитель – гелий, 30 мл/мин в виде ацетатов альдононитрилов. Также для анализа БАС травы золотарника кавказского использовали хромато–масс–спектрометр AT–5850/5973 Agillent Technologies (США). Масс– спектрометр квадрупольный с диапазоном масс 2 – 950 а.е.м. имеет разрешаю- щую способность 0,5 а.е.м. во всем рабочем диапазоне. Ионизация электро- нами 70 эВ. Чувствительность прибора составляет 0,01 нг по метилстеарату. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колон- ку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Непод- вижная фаза НР–5ms Хьюлетт–Паккард с толщиной слоя 0,2 мкм. Хроматогра- фирование проводили в режиме программирования температуры от 135 до 320 °С со скоростью 7 град/мин. Температура инжектора и интерфейса 280 °С. Об- работку данных проводили с помощью штатных программ прибора. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных про- грамм с базой данных масс–спектров NIST.

2.2.3 Спектральные методы Метод УФ–спектрофотометрии был использован для качественного и ко- личественного определения флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и тритерпе- новых гликозидов. УФ–спектры поглощения регистрировали на спектрофото- метрах СФ–56 и СФ–2000 в кюветах с толщиной слоя 10 мм в области от 200 до 600 нм [5, 14].

ИК–спектры образцов углеводов снимали на спектрофотометре Perkin– Elmer model 2000 в таблетках с KBr в соответствии с требованиями ОФС «Спектрометрия в инфракрасной области» [14]. Определение содержания макро– и микроэлементов в траве з. кавказского проводили с помощью полуколичественного спектрального метода. Анализ был проведен в центральной испытательной лаборатории «Кавказгеолсъемка». Изу- чение элементного состава осуществляли на дифракционном спектрографе ДФС–8–1 методом испарения.

2.2.4 Титриметрические методы Количественное определение дубильных веществ в траве золотарника кавказского проводили методом перманганатометрического титрования по ме- тодике ГФ XI, вып. 1 [15]. Содержание свободных органических кислот опре- деляли алкалиметрическим методом титрования по методике ГФ XI, вып. 2, ст. 39 «Плоды шиповника» [16].

2.2.5 Гравиметрические методы Изучение углеводов травы золотарника кавказского проводили гравимет- рически по методу, изложенному в монографии Н.К. Кочеткова [30] и M. Sinner [148].

2.2.6 Ресурсоведческие исследования Ресурсоведческие исследования были проведены согласно методическим указаниям [10, 31, 34]. Учетные площадки закладывались площадью 1 м2, на одной учетной пло- щадке помещалось в среднем 5–6 взрослых экземпляров растений. При этом форма площадки (прямоугольная, квадратная, округлая) существенной роли не играла. После закладки учетных площадок на каждой из них собирали всю сырье- вую фитомассу. Собранное сырье после сушки взвешивали. Расчеты проводили с помощью формул (1, 2, 3, 4):

1. Средняя арифметическая урожайности ( X ):

(1)

2 где xi – масса сырья собранного с 1 м ; n – количество учетных площадок. 2. Дисперсия (S2) и среднее квадратичное отклонение (S):

(x  x) 2 S2   i n 1 (2)

2 S  S (3) S 3. Ошибка средней арифметической (m): m  (4) n Определение запасов проводили на конкретных зарослях. Запас лекарст- венного растительного сырья рассчитывали как произведение средней урожай- ности на общую площадь заросли. Объем возможной ежегодной заготовки сырья рассчитывали как частное от деления эксплуатационных запасов на оборот заготовки, включающий год заготовки и продолжительность периода восстановления заросли. Эксплуатационный запас сырья показывает, сколько сырья можно загото- вить при однократной эксплуатации заросли. Однако при расчете ежегодной за- готовки сырья необходимо учитывать период, в течение которого заросль после проведения заготовок восстанавливается до первоначального состояния.

2.2.7 Фармакологические методы исследования Изучение «острой» токсичности проводилось по методу Кербера [48, 51]. «Острая» токсичность была изучена на 42 аутбредных белых мышах сам- цах весом 22-30 г, прошедших карантин в течение 10 дней. Экстракт золотарни- ка кавказского вводили внутрижелудочно при помощи зонда. Контрольная группа животных получала эквиобъемное количество физиологического рас- твора. Наблюдение за опытными животными проводилось в течение 2–х недель,

в первый день непрерывно. Фиксировалось общее состояние животных, особен- ности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, время наступления смерти после введения препарата. Все расчеты проводились мето- дом наименьших квадратов с использованием пробит анализа и обрабатывались с помощью программы «StatPlus 2009». Изучение диуретической активности сухого экстракта золотарника кав- казского было проведено на 24 белых крысах–самцах линии «Wistar» массой 300–450 г. Мочу собирали утром натощак в течение 2–х часов после 2,5% вод- ной нагрузки. Сухой экстракт золотарника кавказского в виде водного раствора вводили за час до создания водной нагрузки. Интактная группа животных полу- чала эквиобъемное количество воды. Антибактериальное действие изучали в соответствии с ГФ XII [14].

2.2.8 Отбор проб для анализа Отбор проб для анализа осуществляли в соответствии с ОФС 42–0013–03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» [38].

2.2.9 Методы макро– и микроскопического анализа сырья Макроскопический анализ лекарственного растительного сырья проводи- ли визуально по ГФ XI [16]. Анатомические исследования выполняли по методике ГФ XI [16] и Г.Г. Фурста [70]. Микропрепараты изучали с помощью микроскопов «Биолам» и «Биомед». Использовали объективы ×4, ×8, ×10, ×40, окуляр 16×. Микрофото- съемка выполнена с использованием цифровых камер Nikon Coolpix и L33.0 mp cmos microscope digital camera eyepiece new. Для проведения микроскопического анализа использовали временные препараты, приготовленные из высушенного сырья. Цельное сырье просветляли в системе спирт этиловый – глицерин – вода в соотношении 1:1:1. Срезы, полу- ченные вручную с помощью лезвия, окрашивали реактивом на одревеснения –

спиртовый раствор флороглюцина 1% и раствор серной кислоты 50%. Анато- мическое строение рассмотрено в соответствии с ГФ XI, вып. 1 [15].

2.2.10 Определение числовых показателей Определение влажности, золы общей, золы, нерастворимой в 10% кислоте хлористоводородной, экстрактивных веществ в траве золотарника кавказского проводили по методикам, описанным в ГФ XI изд., вып. 1 и 2 [15, 16], а также ГФ XII изд. [14].

2.2.11 Валидация методики количественного определения Валидация методики количественного определения флавоноидов в траве золотарника кавказского проводилась в соответствии руководством ICH «Вали- дация аналитических методик. Содержание и методология» [47].

2.2.12 Микробиологическая чистота Определение микробиологической чистоты сырья золотарника кавказско- го проводили в соответствии с требованиями ГФ ХII, вып.1, с.160, ОФС 42– 0067–07 «Микробиологическая чистота» [14].

2.2.13 Определение сроков годности Для определения срока годности использовали сырье, хранившееся в су- хом, хорошо проветриваемом и защищенном от прямых солнечных лучей по- мещении, в тканевых мешках в соответствии с ГОСТ 30090–93. Для определе- ния срока годности экстракта, он был заложен на длительное хранение в естест- венных условиях при комнатной температуре. В процессе хранения испытуе- мых образцов каждые 6 месяцев определялись числовые показатели по ГФ XI [15] и ГФ XII [14], а также содержание БАС.

2.2.14 Методы статистической обработки Статистическую обработку результатов исследований проводили в соот- ветствии с требованиями ГФ ХI, вып.1 [15]. Расчеты осуществляли с использо- ванием программы Microsoft Office Excel.

ГЛАВА 3 ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕСУРСОВЕДЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ВВЕДЕНИЯ ЕГО В КУЛЬТУРУ

3.1 Определение урожайности травы золотарника кавказского

Первым этапом нашей работы являлось изучение природных ресурсов зо- лотарника кавказского, поскольку подобные исследования ранее не проводи- лись. Для реализации данного этапа нами были поставлены следующие задачи:  изучить ареал распространения золотарника кавказского в некоторых районах Северного Кавказа;  определить урожайность травы золотарника кавказского;  определить биологический и эксплуатационный запас травы золотарника кавказского, а также рассчитать объем возможной ежегодной заготовки;  разработать рекомендации по сбору и сушке данного вида сырья. Золотарник кавказский распространен в Предкавказье, Восточном и За- падном Закавказье. Предпочитает альпийские и субальпийские луга, заросли рододендрона, можжевельника, высокогорных ив, осыпи, опушки лесов у верх- ней их границы, вырубки и лесные поляны в высокогорных лесах до 3500 м. При выборе районов исследования учитывали данные литературы о местах оби- тания золотарника кавказского [13,68]. Учитывая, что золотарник кавказский – многолетнее травянистое расте- ние, сырьем которого является трава, урожайность определяли методом учет- ных площадок. В таблице 3.1 представлен подробный пример расчета урожай- ности травы золотарника кавказского в районе г. Чегем (Кабардино–Балкарская Республика).

Таблица 3.1 – Расчет урожайности травы золотарника кавказского

№ учетной Метрологические характе- x площадки i ристики 1 15,8 2 14,2 3 19 4 15,5 5 20,2 6 18,5 X = 17,3 S2 = 3,45 7 15,6 S = 1,86 8 17 m = 0,48 9 20,5 17,3±0,48 г/м2 10 17,2 11 18,3 12 15,6 13 17,1 14 16,3 15 18,8

Таким образом, урожайность травы золотарника кавказского 17,3±0,48 г/м2, что с 1 га составляет 173±4,8 кг.

3.2 Расчет объема ежегодных заготовок

В результате экспедиционных работ обследованы некоторые районы про- израстания золотарника кавказского на Северном Кавказе: Республика Карачае- во–Черкесия, Карачаевский район (перевал Гумбаши, ущелье р. Даут к перевалу Учкулан, верховье р. Даут на перевале Эпчик), Республика Кабардино– Балкария, Чегемский район (г. Чегем) и Зольский район (урочище Джилы–Су). Для определения периодичности заготовки сырья были проведены иссле- дования по определению скорости восстановления надземной фитомассы после ее срезки. Для этого в ущелье р. Даут (Карачаево–Черкесская Республика) были заложены площадки площадью около 50 м2, на которых проводили заготовку

сырья в четырех различных вариантах: I – ежегодная срезка; II – один год «от- дыха» после срезки; III – два года «отдыха» после срезки; IV – три года «отды- ха» после срезки надземной массы. В результате проведенных исследований по заготовке сырья золотарника кавказского были получены следующие результаты. При ежегодной заготовке травы золотарника кавказского на одном и том же участке наблюдалось отставание в росте на 10–15 см по сравнению с кон- трольными экземплярами. Урожайность воздушно–сухого сырья при ежегодной заготовке составляла около 10 г/м2. В то время, как в других вариантах экспе- римента с «отдыхом» один, два и три года наблюдалось постепенное улучшение состояния растений и повышение накопления фитомассы. Экспериментально установлено, что урожайность надземной части травы золотарника кавказского в варианте с трехлетним «отдыхом» (15 г/м2 ) близка к урожайности на контрольной площадке (17 г/м2). Поэтому мы рекомендуем увеличить продолжительность перерыва в эксплуатации зарослей еще на один год в целях гарантии надежного восстановления надземной фитомассы, т.е. за- готовку сырья на одной и той же площадке проводить лишь по истечении четы- рех лет после предыдущей, соблюдая при этом строгую очередность эксплуата- ции массивов. Таким образом, периодичность заготовок сырья золотарника кавказского составляет 4 года, так как это оптимальный срок для восстановления его зарос- лей (таблица 3.2).

Таблица 3.2 – Ежегодные рекомендуемые заготовки травы золотарника кавказского

Запасы, кг

Ежегодно ре- Районы Площадь Биологический Эксплуатацион- комендуемые зарослей, запас, кг ный запас, кг га заготовки, кг г. Чегем (Чегем- 6,33 1096 980 245 ский район, КБР) урочище Джи- лы–Су (Зольский 7,47 1442 1289 322 район, КБР) перевал Гумба- ши (Карачаев- 6,81 1267 1017 254 ский район, КЧР) ущелье р. Даут к перевалу Учку- 4,61 866 752 188 лан (Карачаев- ский район, КЧР) верховье р.Даут на перевале Эп- 3,5 682 592 148 чик (Карачаев- ский район, КЧР) Итого 28,4 5353 4630 1157

В результате этих исследований установлено, что общая площадь зарос- лей травы золотарника кавказского в 5 исследованных районах Северного Кав- каза составляет около 28 га, при этом объем возможных ежегодных заготовок – более 1150 кг.

3.3 Исследования по введению золотарника кавказского в культуру

Для сохранения дикорастущих зарослей золотарника кавказского нами была предпринята попытка введения его в культуру.

Интродукционные исследования проводились в Ставропольском крае, г. Зеленокумск СПК агрофирма «Дружба» в 2009–2014 гг. Посадочный материал был заготовлен в урочище Джилы-Су Кабардино-Балкарской Республики. Первоначально была установлена лабораторная всхожесть семян. Проращивание семян золотарника кавказского проводили в чашках Пет- ри, на дно которых укладывали смоченную водой фильтровальную бумагу. Се- мена раскладывали на дне чашки Петри равномерно на расстоянии 0,5-1 см друг от друга. Проращивание проводили при комнатной температуре (22-24 °С). В результате было установлено, что семена начинают прорастать на 3 день. Однако период прорастания может варьировать от 3 до 20 дней. При этом всхожесть свежесобранных семян достаточна низкая (около 30%), но при хра- нении она увеличивается. Через месяц после сбора всхожесть составляет 37%, через два – 45%. Максимальная всхожесть наблюдается через полгода после сбора – 82% и уменьшается при длительном хранении. При хранении в течение 1 года – 74%, через 2 – 50%. Для определения полевой всхожести были проведены два посева: осенний (в ноябре) и весенний (в апреле). Поскольку семена очень мелкие и легкие, пе- ред посевом их смешивали с песком. Семена сеяли по поверхности, слегка при- сыпали землей и немного утрамбовывали. Полевая всхожесть семян при всех сроках посева не превысила 20%. Вы- сота сеянцев в конце первого года жизни составляла 1-10 см, всходы длительное время оставались мелкими, вступление в генеративную фазу на второй год у растений отмечалось единично, на третий год – массово. Таким образом, семенной способ размножения золотарника имеет ряд за- труднений: мелкие семена, медленный рост всходов, зарастание посевов сорня- ками, выход товарной продукции лишь на третий год развития золотарника кав- казского. Более перспективным является размножение отрезками корневищ. Раз- множение отрезками корневищ осуществляли осенью (октябрь). Корневища зо- лотарника кавказского разделяли так, чтобы у каждой посадочной единицы со-

хранилось не менее двух почек возобновления. Растения вступали в генератив- ную фазу уже в первый год жизни (80%). В дальнейшем проводили повторные опыты разделения корневищ весной и осенью. Максимальная приживаемость отрезков корневищ (рисунок 3.1) наблюда- лась при осенней посадке (80%), при весенней посадке процент приживаемости составил 65.

Рисунок 3.1 – Появление всходов золотарника кавказского при размножении отрезками корневищ

Урожайность травы при размножении золотарника кавказского отрезками корневищ при осенней посадке составила 204 ± 5,6 кг/га, а корневищ с корнями – 143 ± 4,8 кг/га. В результате наблюдений за золотарником кавказским выделены следую- щие фенологические фазы:  начало вегетации;

 фаза стеблевания – один побег (или сразу несколько) достигает длины 1 см у 10% растений. Массовое стеблевание – побег достигает длины 1 см у 50% растений, конец стеблевания – побег достигает длины 1 см у последних единичных растений;  фаза бутонизации – один бутон или несколько окрашиваются. Начало фазы – при окрашивании бутонов у 10% растений, массовая фаза – при окрашивании бутонов у 50% растений, конец фазы бутонизации – при окрашивании бутонов у последних единичных растений;  фаза начала цветения – при раскрывании одного или сразу нескольких цветков у 10% растений. Массовое цветение – при раскрывании цветков у 50% растений. Конец фазы – при раскрывании цветков у последних единичных растений.  фаза плодоношения – при появлении плодов. Траву золотарника кавказского собирали в фазу начала цветения. Сушили на воздухе в тени и в хорошо проветриваемых помещениях или в сушилках при температуре 50-60 °С. После сушки из сырья удаляли стебли, почерневшие ли- стья и посторонние примеси. Сырье хорошо хранится, не подвержено порче вредителями и плесенью.

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

1. Проведено ресурсоведческое исследование травы золотарника кавказско- го в 5 районах Северного Кавказа: Республика Карачаево–Черкесия, Ка- рачаевский район (перевал Гумбаши, ущелье р. Даут к перевалу Учкулан, верховье р. Даут на перевале Эпчик), Республика Кабардино–Балкария, Чегемский район (г. Чегем) и Зольский район (урочище Джилы–Су). Урожайность травы золотарника кавказского составляет 173–204 кг/га в зависимости от места сбора сырья. Урожайность корневищ с корнями, за- готовленных от культивируемого золотарника кавказского, – 143 ± 4,8 кг/га. 2. Общая площадь зарослей травы золотарника кавказского на обследован- ной территории Северного Кавказа составляет около 28 га, при этом ре- комендуемый объем заготовок – более 1 т. Таким образом, золотарник кавказский обладает достаточной сырьевой базой. 3. Изучение возможностей введения золотарника кавказского в культуру да- ли положительный результат. Установлено, что наиболее эффективным является размножение отрезками корневищ, т.к. растение вступает в гене- ративную фазу уже в первый год жизни. В связи с полученными результа- тами рекомендуем заготавливать сырье, как от дикорастущего, так и от культивируемого золотарника кавказского.

ГЛАВА 4 МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И АНАТОМО– ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО

4.1 Морфологическая характеристика «Золотарника кавказского травы»

Цельное сырье. «Золотарника кавказского трава» представляет собой смесь цельных или измельченных листьев, верхушек цветущих побегов длиной 25-30 см, отдельных осыпавшихся цветков, недозрелых плодов, их хохолков, а также целых соцветий (рисунок 4.1). Стебли цилиндрические. Листья яйцевид- но–продолговатые, продолговато–ланцетные или ланцетные, пильчатые, суже- ные в окрыленный черешок, короче листовой пластинки. Корзинки мелкие 15– 20 мм шириной, собранные в колосовидное соцветие. Обвертка конически– колокольчатая. Листочки корзинки рыхло расположенные, 2–3–рядные, наруж- ные ланцетные в 1,5-2 раза короче узколинейных внутренних, те и другие слег- ка опушенные, острые. Цветки мелкие желтые. Плод – семянка с хохолком из тонких белых волосков. Запах специфический, вкус горьковатый, слабовяжу- щий. Отличительными морфологическими признаками являются 2-, 3-рядная обвертка, корзинки 15-20 мм шириной, ножки корзинок обычно без прицветни- ков. Измельченное сырье. Кусочки стеблей, листьев зеленого цвета, соцветий, цветков желтого цвета различной формы и незрелых плодов, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Запах специфический. Вкус водного извлечения пряный, горьковатый. Порошок. Порошок травы зеленого цвета с желтыми вкраплениями, про- ходящий сквозь сито с отверстиями размером 0,25 мм. Запах и вкус водного из- влечения специфический.

Рисунок 4.1 – Цельная «Золотарника кавказского трава»

4.2 Анатомическое строение листа

4.2.1 Строение листа с поверхности При рассмотрении листа с поверхности [57] видны клетки верхнего эпи- дермиса (рисунок 4.2), они изодиаметрические, многогранные, овальные или округлые. Стенки клеток слабоизвилистые, их утолщенность равномерная. Мес- тами может наблюдаться слабо выраженная морщинистость кутикулы (про- дольно–морщинистая). Имеются устьица; околоустьичных клеток 4-5, они та- кой же формы, как и основные клетки эпидермиса (аномоцитный тип устьично- го аппарата). Замыкающие клетки устьиц чечевицевидные овальной формы. Устьица расположены в одной плоскости с эпидермисом (рисунок 4.3). Волоски железистые и простые. Железистые короткие на одно–, двухклеточной ножке и с одноклеточной головкой, их места прикрепления обычные (рисунок 4.4). Во- лоски простые многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых во- лосков образуется розетка из клеток эпидермиса (рисунок 4.5). Секреторные ка- налы, млечники, вместилища, каналы, включения не обнаружены. Нижний эпидермис (рисунок 4.6) состоит из клеток многогранной формы с более извилистыми стенками. Клетки меньших размеров, чем на верхнем эпи-

дермисе; устьиц больше на нижнем эпидермисе. Устьичный аппарат аномоцит- ного типа, околоустьичных клеток 3-6 (рисунок 4.7). Имеются простые и желе- зистые волоски такого же типа, как в верхнем эпидермисе, но простые волоски более короткие.

Рисунок 4.2 – Фотография строения верхнего эпидермиса листа золотарника кавказского с поверхности (ув. ×640)

Рисунок 4.3 – Строение верхнего эпидермиса листа с поверхности золотарника кавказского: 1 – основные клетки эпидермиса, 2 – устьице, 3 – железистый волосок, 4 – простой многоклеточный волосок, 5 – розетка из клеток эпидермиса

Рисунок 4.4 – Фотография строения железистых волосков на верхнем эпидермисе листа золотарника кавказского (ув. ×640)

Рисунок 4.5 – Фотография строения простых волосков на верхнем эпидермисе листа золотарника кавказского (ув. ×160)

Рисунок 4.6 – Фотография строения нижнего эпидермиса листа золотарника кавказского с поверхности (ув. ×640)

Рисунок 4.7 – Строение нижнего эпидермиса листа с поверхности золотарника кавказского: 1 – основные клетки эпидермиса, 2 – устьице, 3 – железистый волосок, 4 – простой многоклеточный волосок

4.2.2 Строение листа на поперечном срезе Лист на поперечном срезе имеет дорсовентральный тип строения. Жилки хорошо выделяются на нижней стороне. Клетки верхнего эпидермиса квадрат- ной формы, плотно расположены в один слой. Содержимое клеток бесцветное. Имеются устьица и волоски простые многоклеточные и железистые на одно–, двухклеточной ножке и одноклеточной головкой темно–коричневого цвета (ри- сунок 4.8). Нижний эпидермис состоит из клеток меньших размеров, чем верхний, также имеюся устьица, простые и железистые волоски. Мезофилл листа дифференцирован на палисадный и губчатый. Палисад- ный (верхний) мезофилл – это два слоя клеток овальной и прямоугольной фор- мы, расположенный под верхним эпидермисом, клетки живые тонкостенные, содержат большое количество хлоропластов. Палисадный мезофилл занимает чуть более половины объема пластинки листа. Губчатый (нижний) мезофилл

состоит из клеток округлой или овальной формы с хлоропластами, которых меньше, чем в клетках палисадного мезофилла. Располагается губчатый мезо- филл между палисадным и нижним эпидермисом (рисунок 4.9). По жилке листа встречается колленхима. Ее первый участок расположен под верхним эпидермисом и несколько слоев клеток – под нижним эпидерми- сом. На границе жилки с пластинкой расположена хлоренхима. Центральная часть жилки занята большим проводящим пучком. Пучок ок- руглой формы, коллатерального типа, имеется камбий (открытый тип). Сосуды ксилемы располагаются рядами. По объему ксилемы чуть больше, чем флоэмы. Со стороны ксилемы и флоэмы располагается уголковая колленхима. Вокруг пучка хорошо видны обкладочные клетки, которые располагаются в 1-2 слоя и содержат хлоропласты. Остальная часть жилки занята выполняющей паренхи- мой. Клетки ее округлой или многогранной формы, более круглые в средней части под пучком и над пучком около хлоренхимы.

Рисунок 4.8 – Фотография строения листовой пластинки з. кавказского на поперечном срезе (ув. ×128)

Рисунок 4.9 – Рисунок и схема строение листовой пластинки золотарника кавказского на поперечном срезе: 1 – простой кроющий волосок, 2 – железистый волосок, 3 – эпидермис верхний, 4а – мезофилл палисадный, 4б – мезофилл губчатый, 5 – эпидермис нижний, 6 – колленхима уголковая,7 – клетки обкладочные, 8 – ксилема, 9 – камбий, 10 – флоэма, 11 – паренхима

4.3 Анатомическое строение стебля

4.3.1 Строение стебля с поверхности Покровная ткань стебля представлена эпидермисом. Его клетки много- гранной формы разных размеров с прямыми и слабоизвилистыми стенками, снаружи слабоутолщенными (рисунок 4.10). Кутикула слабо выраженной про- дольно–морщинистой формы. Устьичный аппарат аномоцитного типа; побоч- ных клеток 3 – 6, устьица овальные, замыкающие клетки чечевицевидные. Во-

лоски простые многоклеточные остроконусовидные и железистые, места их прикрепления обычные (рисунок 4.11).

Рисунок 4.10 – Фотография строения эпидермиса стебля золотарника кавказского (ув. ×640)

Рисунок 4.11 – Строение эпидермиса стебля золотарника кавказского: 1 – основные клетки эпидермиса, 2 – устьице, 3 – простой многоклеточный волосок, 4 – железистый волосок

4.3.2 Строение стебля на поперечном срезе На поперечном срезе стебля видны три основных блока: покровная ткань, кора и центральный осевой цилиндр.

Покровная ткань представлена эпидермисом. Это один слой тонкостенных плотно расположенных клеток со слабоутолщенной наружной стенкой. На эпи- дермисе имеются простые многоклеточные волоски. Устьица встречаются в не- большом количестве. Секреторные каналы, млечники, вместилища, кристаллы и включения не обнаружены. Кора состоит из уголковой колленхимы, хлоренхимы, выполняющей па- ренхимы и эндодермы. Колленхима располагается по ребрам отдельными уча- стками. Ее клетки имеют утолщения по углам. Между участками колленхимы находится хлоренхима (по граням). Ее клетки имеют овальную или округлую форму и расположены в 2-3 слоя. В клетках имеются хлоропласты. Внутренняя кора представлена хорошо выраженной 1-2-слойной эндодермой с довольно мелкими клетками в основном овальной формы, содержащими хлоропласты. Остальная часть коры занята выполняющей паренхимой, клетки которой имеют разные размеры, овальной, округлой или многогранной формы, расположенные в 4-7 слоев (рисунки 4.12, 4.13). Центральный цилиндр стебля включает проводящие пучки, расположен- ные по кругу в количестве 29-30. Проводящие пучки открытые коллатеральные, широкояйцевидной формы, армированные со стороны флоэмы и ксилемы. Уча- стки склеренхимы, прилегающие со стороны флоэмы более крупные (рисунки 4.14, 4.15). Весь остальной стебель занят паренхимой. Большая ее часть прихо- дится на сердцевину стебля, которая может составлять до 50% его объема. Ме- жду проводящими пучками имеются сердцевинные лучи, состоящие из более мелких клеток паренхимы с одревесневшими стенками.

Рисунок 4.12 – Схема строения стебля з. кавказского на поперечном срезе: 1 –простой многоклеточный волосок, 2 – железистый волосок, 3 – эпидермис, 4 – колленхима уголковая, 5 – хлоренхима, 6 – паренхима коры, 7 – эндодерма, 8 – склеренхима, 9 – флоэма, 10 – камбий, 11 – ксилема, 12 – паренхима сердцевины

Рисунок 4.13 – Фотография строения стебля золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. ×128)

Рисунок 4.14 – Фотография строения фрагмента стебля золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. ×160)

Рисунок 4.15 – Рисунок и схема фрагмента строения стебля золотарника кавказского на поперечном срезе: 1 – эпидермис, 2 – колленхима уголковая, 3 – паренхима коры, 4 – эндодерма, 5 – склеренхима, 6 – флоэма, 7 – камбий, 8 – ксилема, 9 – сердцевинный луч, 10 – паренхима сердцевины, 11 – простой многоклеточный волосок, 12 – хлоренхима, 13 – железистый волосок

4.3.3 Строение стебля на продольном срезе Клетки эпидермиса имеют продолговатую форму с прямыми поперечны- ми перегородками, наружная стенка слабо утолщена. Имеются простые много- клеточные и железистые волоски. Клетки колленхимы более широкие и более длинные по сравнению с клетками эпидермиса; имеют утолщенные стенки, поперечные перегородки прямые или наклонные (рисунок 4.16). Клетки хлоренхимы имеют хлоропласты, они более короткие по сравнению с клетками колленхимы. Паренхима коры

представлена тонкостенными клетками удлиненной формы, более широкими и с прямыми или наклонными поперечными перегородками. Эндодерма: клетки мелкие, короткие, имеют хлоропласты. Склеренхим- ные клетки удлиненные с утолщенными стенками, полость небольшая, перего- родки наклонные, реже прямые. Флоэма – живая ткань, состоит из узких удлиненных клеток с выражен- ными ситовидными пластинами, слоев клеток 3-4. Клетки камбия живые тонко- стенные, узкие, удлиненные с заостренными концами (рисунок 4.17). Ксилема занимает большой объем по сравнению с флоэмой, представлена проводящими элементами – сосудами и клетками паренхимы. Сосуды в составе первичной ксилемы кольчатые и спиральные; имеют вид длинных тонких тру- бочек, с утолщениями в виде колец или спиралей. Вторичная ксилема состоит из пористых сосудов, они более широкие; хорошо видны поры, поперечные стенки прямые. Клетки паренхимы в составе ксилемы мелкие, с утолщенными стенками, слегка удлиненные. Остальная часть стебля представлена сердцевинной паренхимой. Клетки в основном прямоугольной формы, тонкостенные, более круглые к центру серд- цевины, поперечные стенки прямые [57].

Рисунок 4.16 – Фотография фрагмента строения стебля золотарника кавказского на продольном срезе (ув. ×128)

Рисунок 4.17 – Строение стебля золотарника кавказского на продольном срезе: 1 – паренхима сердцевины, 2 – ксилема, 3 – камбий, 4 – флоэма, 5 – склеренхима, 6 – паренхима коры, 7 – колленхима, 8 – эпидермис, 9 – простой многоклеточный волосок

4.4 Анатомическое строение цветка

При рассматривании ложноязычковых цветков с обеих сторон видны прямоугольные клетки эпидермиса с прямыми или слабоизвилистыми равно- мерно утолщенными стенками, с округлыми хроматопластами (рисунок 4.18). Кутикула поперечно-морщинистая, устьица не обнаружены (рисунок 4.19). У основания цветка имеются простые многоклеточные тупоконусовидные волос- ки, тонкостенные с гладкой поверхностью (рисунок 4.20). При рассмотрении эпидермиса трубчатого цветка (рисунок 4.21-1) видны прямоугольные клетки с прямыми или слабоизвилистыми равномерно утол- щенными стенками, с многоугольными хроматопластами (рисунок 4.21-3). Ку- тикула поперечно-морщинистая, устьица не обнаружены (рисунок 4.21-2). По краю цветка встречаются пучковые волоски, состоящие их нескольких клеток, сросшихся друг с другом (рисунок 4.21-4).

Рисунок 4.18 – Фотография строения эпидермиса ложноязычкового цветка золотарника кавказского (ув. ×128)

Рисунок 4.19 – Хроматопласты и морщинистость кутикулы ложноязычкового цветка золотарника кавказского (ув. ×160)

Рисунок 4.20 – Простые волоски у основания ложноязычкового цветка золотарника кавказского (ув. ×128)

Имеются многочисленные простые многоклеточные волоски с толстой стенкой и тонкой полостью внутри. Некоторые волоски двухконечные (рисунок 4.21-5). Пыльца округлая, поверхность шиповатая, трехбороздная (рисунок 4.21-6).

1 2

3 4

5 6

Рисунок 4.21 – Микрофотографии трубчатого цветка золотарника кавказского: 1 – общий вид (ув. ×64); 2 – складчатость кутикулы (ув. ×160); 3 – хроматопласты (ув. ×160); 4 – пучковые волоски (ув. ×128); 5 – простые волоски (ув. ×128); 6 – пыльца (ув. ×640)

Клетки эпидермиса листочков обвертки также прямоугольные с прямыми или слабоизвилистыми равномерно утолщенными стенками и поперечно- морщинистой кутикулой. Имеются многочисленные устьица. Устьичный аппа- рат аномоцитного типа, околоустьичных клеток 4-6. Замыкающие клетки усть- иц чечевицевидные или сферовидные. Устьица расположены в одной плоско- сти с эпидермисом. Головчатые волоски на одноклеточной ножке с одно-, двух- клеточной головкой (рисунок 4.22). По краю цветка располагаются сосочковид- ные выросты (рисунок 4.23-1). На поверхности видны простые многоклеточные остроконусовидные и бичевидные волоски (рисунок 4.23-2). По краю листочков располагаются бахромчатые волоски (рисунок 4.23-3). Эфирномасличные же- лезки ярусного типа (рисунок 4.23-4).

Рисунок 4.22 – Эпидермис листочка обвертки золотарника кавказского (ув. ×640): 1 – эфирномасличная железка, 2 – складчатость кутикулы, 3 – устьице, 4 – головчатый волосок

1 2

3 4

Рисунок 4.23 – Микрофотографии листочка обвертки золотарника кавказского: 1 – сосочковидные выросты по краю листочка (ув. ×160); 2 – простые волоски (ув. ×160); 3 – бахромчатые волоски (ув. ×160); 4 – эфирномасличная железка (ув. ×640)

В микроперпарате цветка встречаются многочисленные щетинистые во- лоски (волоски летучки), состоящие из сросшихся друг с другом волосков раз- ной длины со свободными заостренными концами (рисунок 4.24).

Рисунок 4.24 – Щетинистые волоски цветка золотарника кавказского (ув. ×160)

4.5 Микроскопический анализ измельченной «Золотарника кавказского травы»

Анализ проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микро- скопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» и по методике приготовления микропрепаратов измельченной (резаной или порошка) травы (листья, цветки, стебли) (ГФ XI, в. 1, с. 278 [16]). При рассмотрении микропрепаратов (рисунок 4.25) с поверхности верх- ней стороны листа видны изодиаметрические клетки эпидермиса многогран- ной, овальной или округлой формы со слабоизвилистыми равномерно утолщен- ными стенками. Клетки нижнего эпидермиса мельче, с более извилистыми бо- ковыми стенками. Местами может наблюдаться слабо выраженная морщини- стость кутикулы (продольно–морщинистая). Устьичный аппарат аномоцитного типа; околоустьичных клеток 4-5. Они такой же формы, как и покровные клет- ки эпидермиса. Замыкающие клетки устьиц чечевицевидные овальной формы. Устьица расположены в одной плоскости с эпидермисом. Волоски железистые и простые. Железистые короткие на одно–, двухклеточной ножке и с однокле- точной головкой, их места прикрепления обычные. Волоски простые многокле- точные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых волосков образуется розет- ка из клеток эпидермиса. Пыльца округлая, поверхность ее шиповатая, трехбо- роздная. Таким образом, для цельного и измельченного сырья «Золотарника кав- казского трава» можно выделить следующие диагностические признаки: клетки эпидермиса с извилистыми стенками и слабо выраженной продольно– морщинистой кутикулой. На обеих сторонах листа встречаются многочислен- ный волоски и железки. Волоски простые многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых волосков образуется розетка из клеток эпидермиса. Желе-

зистые волоски короткие на одно-, двухклеточной ножке и с одноклеточной го- ловкой.

1 2

3 4

Рисунок 4.25 – Микрофотографии измельченного сырья золотарника кавказского (ув. ×640): 1 – эпидермис верхней стороны листа; 2 – эпидермис нижней стороны листа; 3 – волоски простой и железистый; 4 – пыльца

Характерной особенностью золотарника кавказского является то, что уча- стки колленхимы коры стебля чередуются с хлоренхимой, а эндодерма содер- жит хлоропласты. На эпидермисе листочков обвертки встречаются эфирномас-

личные железки ярусного типа. Пыльца округлая, поверхность шиповатая, трехбороздная.

4.6 Микроскопический анализ порошка «Золотарника кавказского травы»

Анализ проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микро- скопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» и по методике приготовления микропрепаратов порошка травы (ГФ XI, в. 1, с. 278 [16]). При рассмотрении микропрепаратов порошка (рисунок 4.26) видны об- рывки элементов эпидермиса многогранной, овальной или округлой формы со слабоизвилистыми или извилистыми равномерно утолщенными стенками. Устьичный аппарат аномоцитного типа; околоустьичных клеток 4-5. Они такой же формы, как и покровные клетки эпидермиса. Замыкающие клетки устьиц чечевицевидные овальной формы. Видны железистые волоски и обрывки про- стых волосков. Железистые короткие на одно–, двухклеточной ножке и с одно- клеточной головкой, их места прикрепления обычные. Волоски простые много- клеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых волосков образуется ро- зетка из клеток эпидермиса. Видны обрывки сосудов. Пыльца округлая, поверх- ность ее шиповатая, трехбороздная.

3 4

55 6

Рисунок 4.26 – Микрофотографии порошка «Золотарника кавказского травы»: 1 – железистый волосок (ув. ×640); 2 – обрывок простого волоска (ув. ×160); 3 – эпидермис нижней стороны листа (ув. ×160); 4 – эпидермис верхней стороны листа (×160); 5 – обрывки сосудов (ув. ×160); 6 – пыльца (ув. ×640)

Таким образом, в микропрепарате порошка «Золотарника кавказского травы» обнаруживается достаточное количество диагностических элементов, позволяющих установить подлинность сырья.

4.7 Морфологическая характеристика корневищ с корнями золотарника кавказского

Корневища золотарника кавказского ползучие узловатые с придаточными корнями (рисунок 4.27). Корневища цилиндрические, твердые, плотные, слегка изогнутые, не очищенные от опробковевшего слоя, придаточные корни тонкие. Поверхность корневищ продольно-бороздчатая, кора тонкая, пробка местами отслаивается. Излом шероховатый, неровный. Корневища с корнями 3-7 см длиной, 0,3-0,6 см толщиной. Цвет снаружи серовато-коричневый, при отслаи- вании пробки желтоватый, на изломе желтоватый, вкус горьковатый [63].

Рисунок 4.27 – Корневища с корнями золотарника кавказского

4.8 Анатомическое строение корневищ с корнями золотарника кавказского

На поперечном срезе корневище (рисунок 4.28) округлое, покровная ткань представлена перидермой. Клетки перидермы прямоугольной формы, плотно расположены, стенки темные. Кора, которая занимает небольшой объем, представлена клетками парен- химы. Клетки многогранной формы, тонкостенные, плотно расположены. Пе- риферический слой клеток коры выделяется более утолщенными неодревес- невшими стенками. Центральный цилиндр занимает большую часть корневища, проводящая система пучкового типа. Пучки коллатеральные, открытые (имеется камбий), расположены по кругу, тип стели – эустель. В молодом корневище объем кси- лемы и флоэмы небольшой. Над флоэмой имеется небольшое количество кле- ток с утолщенными одревесневшими стенками. Это клетки перициклической склеренхимы. Над флоэмой в области эндодермы располагаются эфиромаслич- ные канальца, количество которых соответствует количеству проводящих пуч- ков. В молодом корневище большая часть его представлена сердцевиной. Клет- ки сердцевины разные по размерам, в основном округлой формы, расположены плотно, имеются небольшие межклетники, стенки клеток тонкие.

Рисунок 4.28 – Фотография микроструктуры корневища золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. ×128): 1 – перидерма, 2 – паренхима коры, 3 – перициклическая склеренхима, 4 – эфиромасличный каналец, 5 – флоэма, 6 – ксилема, 7 – паренхима

В люминесцентном свете хорошо видны эфиромасличные канальца схизо- генного происхождения, овальной формы (рисунок 4.29).

Рисунок 4.29 – Фотография фрагмента корневища золотарника кавказского на поперечном срезе в люминесцентном свете (ув. ×160)

Придаточный корень на поперечном срезе имеет округлую форму (рису- нок 4.30), тип анатомического строения – первичное. Покровная ткань пред- ставлена эпиблемой (эпидермисом), клетки ее имеют тонкие стенки, есть вы- росты в виде корневых волосков.

Рисунок 4.30 – Фотография микроструктуры придаточного корня золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. ×64): 1 – корневые волоски

Кора занимает около 50% объема. Различают экзодерму – наружный слой клеток, мезодерму и эндодерму. Клетки экзодермы многогранной формы с тем- ными стенками расположены в 2-3 слоя. Клетки мезодермы многогранной фор- мы, плотно расположены, стенки клеток не одревесневшие, утолщенные. Более толстые стенки в периферической зоне коры. Эндодерма представлена одним слоем клеток. Клетки плотно расположены, стенки утолщены и темного цвета. Центральный цилиндр включает проводящие ткани и перицикл. Перицикл располагается непосредственно за эндодермой – это наружный слой клеток цен- трального цилиндра. В области перицикла имеются семь эфиромасличных ка- налец овальной формы.

Флоэма располагается прерывистым кольцом, которое окружает ксилему. Проводящих элементов флоэмы больше в участках расположенных между лу- чами ксилемы. Клетки флоэмы бесцветные мелкие, тонкостенные без видимых включений. Центральная часть корня занята паренхимой и ксилемой, которая содер- жит довольно крупные сосуды, расположенные беспорядочно по срезу. Пери- ферическая часть ксилемы имеет форму семилучевой звездочки. Клетки парен- химы многогранной формы, имеют одревесневшие стенки (рисунок 4.31).

Рисунок 4.31 – Фотография микроструктуры придаточного корня золотарника кавказского на поперечном срезе (ув. ×160): 1 – эпиблема, 2 – экзодерма, 3 – мезодерма, 4 – эндодерма, 5 – перицикл, 6 – эфиромасличный каналец, 7 – флоэма, 8 – ксилема, 9 – паренхима

Таким образом, для анатомо-диагностического строения корневища ха- рактерен небольшой объем коры, эфиромасличные канальцы располагаются над флоэмой, их количество соответствует количеству проводящих пучков. Для придаточных корней характерен первичный тип строения, широкая кора, эфи- ромасличные канальцы находятся в области перицикла [63].

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

1. Отличительными морфологическими признаками золотарника кавказского являются 2-, 3-рядная обвертка, корзинки 15-20 мм шириной, ножки корзинок обычно без прицветников. 2. Основные анатомо-диагностические признаки «Золотарника кавказского травы»: клетки эпидермиса с извилистыми стенками и слабо выраженной продольно–морщинистой кутикулой. На обеих сторонах листа встречаются многочисленный волоски и железки. Волоски простые многоклеточные остроконусовидные, тонкостенные с гладкой поверхностью; места их прикрепления обычные или у основания некоторых волосков образуется розетка из клеток эпидермиса. Железистые волоски короткие на одно-, двухклеточной ножке и с одноклеточной головкой. Характерной особенностью золотарника кавказского является то, что участки колленхимы коры стебля чередуются с хлоренхимой, а эндодерма содержит хлоропласты. На эпидермисе листочков обвертки встречаются эфирномасличные железки ярусного типа. Пыльца округлая, поверхность шиповатая, трехбороздная. 3. Для анатомо-диагностического строения корневища характерен небольшой объем коры, эфиромасличные канальцы располагаются над флоэмой, их количество соответствует количеству проводящих пучков. Для придаточных корней характерен первичный тип строения, широкая кора, эфиромасличные канальцы находятся в области перицикла.

ГЛАВА 5 ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО ТРАВЫ

5.1 Анализ травы и корневищ с корнями золотарника кавказского с помощью качественных реакций

Предварительное обнаружение БАС в траве и корневищах с корнями зо- лотарника кавказского проводили с помощью общепринятых качественных ре- акций в извлечениях, полученных согласно методикам, описанным в главе 2. Полученные результаты приведены в таблице 5.1. Таблица 5.1 – Анализ травы и корневищ с корнями золотарника кавказского с помощью качественных реакций Результат Группа Аналитический Реакции Корневища с БАС эффект реакции Трава корнями 1 2 3 4 5 – цианидиновая розовое + – проба окрашивание Флавоноиды – реакция с алю- желто–зеленое + – миния хлоридом окрашивание образование пе- – реакция пенооб- ны в кислой и разования (метод + + Тритерпено- щелочной сре- Фонтан-Канделя) вые глико- дах зиды фиолетово– – реакция Либер- зеленое окраши- + + мана-Бурхарда вание черно- – реакция с раство- черно-синее или черно-синее Дубильные зеленое ром квасцов желе- черно-зеленое окраши- вещества окраши- зоаммониевых окрашивание вание вание Кумарины лактонная проба помутнение + –

Продолжение таблицы 5.1 1 2 3 4 5 сине– – биуретовая реак- фиолетовое ок- + + ция Амино- рашивание кислоты сине– – реакция с нин- фиолетовое ок- + + гидрином рашивание красно– – реакция Бертрана коричневый + + осадок Углеводы сгустки, выпа- – осаждение спир- дающие в оса- том этиловым 95% + + док белого цвета

Таким образом, в результате проведенных исследований в траве золотар- ника кавказского обнаружены флавоноиды, тритерпеновые гликозиды, дубиль- ные вещества, кумарины, аминокислоты и углеводы; в корневищах с корнями золотарника кавказского – тритерпеновые гликозиды, дубильные вещества, аминокислоты и углеводы.

5.2 Изучение фенольных соединений травы золотарника кавказского методом БХ

Для изучения фенольных соединений методом бумажной хроматографии 50,0 г измельченной травы золотарника кавказского заливали спиртом этило- вым 70% до «зеркала», колбу соединяли с обратным холодильником и нагрева- ли, поддерживая кипение в течение 1 часа. Извлечение фильтровали и повторя- ли операцию еще 2 раза. Спиртовое извлечение выпаривали при пониженном давлении. Затем проводили экстракцию эфиром, этилацетатом и бутанолом по- следовательно до полного истощения извлечения. Полученные экстракты про- пускали через натрия сульфат безводный, упаривали при пониженном давлении. Эфирное и бутанольное извлечение досушивали на воздухе. Остаток эфирного

экстракта растворяли в спирте этиловом 95%, а остаток бутанольного – в спирте этиловом 40%. Полученные извлечения – эфирное, этилацетатное и бутаноль- ное – исследовали методом бумажной хроматографии. На линию старта хроматографической бумаги наносили микрошприцом по 10 мкл извлечений: водного (точка 1), эфирного (точка 2), этилацетатного (точка 4) и бутанольного (точка 5). В точку 3 наносили 10 мкл СО рутина. Хо- матографирование проводили в двух системах растворителей: 1) уксусная ки- слота 15% (рисунок 5.1 А); 2) бутанол – уксусная кислота – вода 4 : 1 : 5 (рису- нок 5.1 Б). После прохождения фронтом растворителей около 30 см хромато- грамму вынимали и высушивали; просматривали в видимом и УФ–свете до и после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида.

• • . • • • • • • • 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 А Б

Рисунок 5.1 – Схема бумажной хроматограммы водного (точка 1), эфирного (точка 2), этилацетатного (точка 4) и бутанольного (точка 5) извлечений из травы золотарника кавказского, а также СО рутина (точка 3) после обработки спиртовым раствором алюминия хлорида в УФ–свете: А – в системе уксусной кислоты 15%; Б – в системе растворителей бутанол – уксусная кислота – вода 4 : 1 : 5

В процессе хроматографического определения (таблица 5.2) были выяв- лены зоны адсорбции, предположительно соответствующие флавоноидам (жел- тые и коричневые цвета), фенолкарбоновым кислотам (синие), хлорофиллу (красные). Таблица 5.2 – Результаты хроматографического определения фенольных соединений травы золотарника кавказского методом бумажной хроматографии Цвет зон ад- Цвет зон ад- Значение сорбции после сорбции после Извлечения из Rf в систе- Значение проявления проявления травы золотарника ме уксус- Rf в систе- раствором раствором кавказского, сви- ной кисло- ме БУВ алюминия алюминия детель ты (4:1:5) хлорида в УФ– хлорида в УФ– 15% свете свете Светло– 0,29-0,31 0,71-0,73 Синий коричневый Водное извлечение 0,36-0,67 Голубой 0,85-0,88 Голубой 0,70-0,73 Розовый 0,64-0,66 Коричневый 0,03-0,04 Ярко–желтый Бледно– Эфирное 0,76-0,79 Желтый 0,09-0,1 желтый извлечение 0,86-0,87 Синий 0,40-0,42 Синий 0,99 Красный 0,71-0,74 Синий Рутин 0,64-0,65 Коричневый 0,54-0,55 Коричневый 0,64-0,66 Коричневый 0,03-0,04 Ярко–желтый 0,69-0,73 Синий 0,39-0,42 Синий Этилацетатное из- 0,77-0,81 Желтый 0,54-0,56 Коричневый влечение 0,87-0,89 Синий 0,66-0,69 Синий 0,99 Красный 0,80-0,82 Желтый Светло– 0,41-0,43 0,54-0,56 Коричневый Бутанольное из- коричневый влечение 0,63-0,65 Коричневый 0,67-0,69 Синий 0,69-0,72 Синий 0,79-0,81 Желтый

Таким образом, зоны адсорбции с Rf = 0,63-0,66 (в системе уксусной ки- слоты 15%), Rf = 0,54-0,56 (в системе БУВ 4:1:5) отнесены к рутину. Получен-

ные данные свидетельствуют о наличии в траве золотарника кавказского фла- воноидов и фенолкарбоновых кислот, что позволило продолжить дальнейшие исследования.

5.3 Обнаружение рутина методом ТСХ в «Золотарника кавказского траве»

В качестве метода экспресс–анализа флавоноидов была использована тон- кослойная хроматография в различных системах растворителей: бутанол– уксусная кислота–вода (БУВ) (4:1:2), БУВ (4:1:5), хлороформ–этанол–вода (14:6:0,2), уксусная кислота 2%, 15% и 30% с использованием извлечений, по- лученных с помощью следующих экстрагентов: эфир, этилацетат и бутанол, а также извлечений из сырья спиртом этиловым 40% и 70%. В результате для об- наружения рутина в траве золотарника кавказского была разработана следую- щая методика. Аналитическую пробу золотарника кавказского травы измельчали до ве- личины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 50 мл спирта этилового 40%. Колбу присоединяли к обратному хо- лодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее извлечение фильтровали, 25 мл фильтрата переносили в выпарительную чашку и упаривали на кипящей водяной бане до удаления запаха спирта. Остаток раз- бавляли водой и помещали в делительную воронку вместимостью 100 мл, при- бавляли 20 мл эфира и экстрагировали в течение 10 мин. Водный (нижний) слой отбрасывали, эфирное извлечение переносили в круглодонную колбу и упаривали на водяной бане при пониженном давлении досуха. Сухой остаток растворяли в 2 мл спирта этилового 70%. На линию старта пластинки «Sorbfil» (ПТСХ–П–В–УФ) размером 10×10 см микрошприцем наносили в первую точку 5 мкл извлечения из золотарника кавказского травы, во вторую – 5 мкл СО ру- тина. Пластинку с нанесенными пробами помещали в камеру, предварительно

насыщенную не менее 30 мин уксусной кислотой 15%. После хроматографиро- вания пластинку вынимали из камеры и сушили на воздухе 10 мин, обрабатыва- ли спиртовым раствором алюминия хлорида 2% и прогревали в сушильном шкафу при температуре 100–105 °С в течение 5 мин. На хроматограмме испы- туемого извлечения появилась зона адсорбции коричневого цвета с Rf 0,71±0,02, соответствующая рутину. Таким образом, разработана методика обнаружения рутина в золотарника кавказского траве методом ТСХ в системе уксусной кислоты 15%, проявитель – спиртовый раствор алюминия хлорида 2%.

5.4 Изучение фенольных соединений золотарника кавказского травы методом ВЭЖХ

Изучение качественного состава фенольных соединений травы з. кавказ- ского продолжили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON», модель 305, ФРАНЦИЯ; инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 США с последующей компьютерной обработкой результатов исследова- ния с помощью программы Мультихром для «Windows». В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колон- ка размером 4,6×250 мм KROMASIL C18, размер частиц 5 микрон. В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителей метанол - вода - фосфорная кислота (400:600:5). Анализ проводили при комнатной тем- пературе. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа 60 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ–детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм и 360 нм. Для исследования траву золотарника кавказского измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм по (ГОСТ 214–83). Около 3,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимо- стью 150 мл, прибавляли по 40 мл спирта этилового 70%, присоединяли к об-

ратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 50 мл и дово- дили спиртом этиловым 70% до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в 70% спирте этиловом: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин–7–гликозида, галловой ки- слоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида, гесперидина, апигенина, кемпферола, виценина, феруловой кислоты, цикориевой кислоты, умбеллиферона, дигидрокумарина, скополетина, эскулетина, кумарина, дикума- рина, дигидрокверцитина, катехина, эпикатехина. По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хро- матограф и хроматографировали в выше приведенных условиях. Результаты представлены в таблице 5.3.

Таблица 5.3 – Результаты идентификации фенольных соединений травы золотарника (извлечение 70% спиртом этиловым) Содержание,% от суммы фе- Время, Высота, Площадь, № нольных со- Название мин mV mV·сек единений в извлечении 1 2 3 4 5 6 1 3,13 854,03 15087,31 18,31 галловая кислота 2 3,57 265,57 6651,66 8,07 неидент. 3 4,28 359,04 12752,60 15,48 умбеллиферрон 4 5,76 71,12 1995,22 2,42 цикориевая кислота хлорогеновая 5 6,15 62,67 1780,40 2,16 кислота 6 6,90 77,82 2532,05 3,07 виценин 7 7,32 56,51 1666,60 2,02 неидент. 8 8,34 109,40 3457,71 1,85 эскулетин 9 8,83 101,51 5165,78 6,27 кофейная кислота

Продолжение таблицы 5.3 1 2 3 4 5 6

10 10,53 39,02 1793,60 2,18 дигидрокумарин 11 11,55 22,04 629,28 0,76 неидент. 12 12,00 21,71 895,42 1,09 неидент. 13 13,28 97,81 5526,00 6,71 неидент. 14 14,82 61,46 2343,52 2,84 гесперидин 15 15,46 72,81 3931,26 4,77 рутин 16 17,19 12,87 1055,40 1,28 неидент. 17 18,84 10,74 1079,62 1,31 неидент. 18 22,61 147,57 11556,81 14,03 неидент. 19 27,43 6,70 735,19 0,89 неидент. 20 29,46 4,62 478,47 0,58 неидент. 21 34,92 10,95 1438,89 1,75 неидент. 22 41,51 2,35 791,85 0,96 неидент. 23 46,94 3,42 500,03 0,61 неидент. 24 52,33 2,38 472,73 0,57 неидент.

Впервые установлено, что в траве золотарника кавказского содержатся 24 фенольных соединения, из которых идентифицированы рутин, умбеллиферон, виценин, эскулетин, дигидрокумарин, гесперидин, галловая кислота, цикорие- вая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота [59].

5.5 Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин в «Золотарника кавказского траве» методом дифференциальной спектрофотометрии

При разработке методики количественного определения флавоноидов в траве золотарника кавказского учитывалось то, что при анализе растительного сырья, содержащего флавоноиды, наибольшее распространение имеют спек- трофотометрические методы, основанные на определении продуктов реакции комплексообразования с алюминия хлоридом [8, 9]. Методы позволяют не ис- пользовать дополнительные трудоемкие операции по очистке и при этом повы- сить избирательность определения. Были проведены исследования по использо- ванию метода дифференциальной спектрофотометрии для определения флаво- ноидов в траве золотарника кавказского. Максимумы светопоглощения флавоноидов извлечений из травы золотар- ника кавказского не проявляются вследствие наложения более интенсивных по- лос поглощения сопутствующих веществ. Поэтому использование прямой спек- трофотометрии нецелесообразно. Изучение литературных данных показало, что при использовании дифференциальной спектрофотометрии, основанной на ре- акции комплексообразования с алюминия хлоридом, происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов от 330 – 350 до 390 – 412 нм [5, 8, 9, 28]. Применение в качестве раствора сравнения испытуемого раствора без ре- актива позволяет исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ, вы- делить полосу поглощения комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом, значительно повысить избирательность определения. Дифференциальный спектр извлечения из золотарника кавказского травы совпадает по положению максимума с дифференциальным спектром рутина, что позволяет определять сумму флавоноидов в пересчете на рутин (рисунки 5.2, 5.3).

Рисунок 5.2 – Спектр поглощения комплекса СО рутина с алюминия хлоридом

Рисунок 5.3 – Спектр поглощения комплекса суммы флавоноидов золотарника кавказского с алюминия хлоридом

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2,0 г (точная навеска) из- мельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добав- ляли 100 мл спирта этилового 70%. Колбу присоединяли к обратному холо- дильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок колбы. Горячее извлечение фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы час- тицы сырья не попадали на фильтр. После охлаждения объем извлечения дово- дили спиртом этиловым 70% до метки и перемешивали (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл извлечения (раствор А), 0,5 мл уксусной кислоты 33%, 1 мл раствора алюминия хлорида 2% и дово- дили объем раствора спиртом этиловым 95% до метки (раствор Б). Через 40 ми- нут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 ± 2 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. В качестве раство- ра сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл извлечения (раствор А), 0,5 мл раствора уксусной кислоты 33% и доведенный спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность раствора СО рутина. Содержание суммы фла- воноидов в пересчете на рутин в процентах (Х) вычисляли по формуле (5):

(5)

где A – оптическая плотность испытуемого раствора;

A0 – оптическая плотность раствора СО рутина; m – масса золотарника кавказского травы, в г;

m0 – масса СО рутина, в г; W – потеря в массе при высушивании сырья, в %.

Примечания 1. Приготовление раствора стандартного образца рутина: Около 0,05 г (точная навеска) рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в

течение 3 ч, растворяли в 85 мл спирта этилового 95% в мерной колбе вмести- мостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, доводили объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивали. Срок годности раствора 1 месяц. 2. Приготовление спиртового раствора алюминия хлорида 2%: 2,0 г алюминия хлорида растворяли в 40 мл спирта этилового 95% в мерной колбе вместимо- стью 100 мл и доводили объем раствора тем же спиртом до метки. Срок хране- ния раствора 3 месяца. Статистически обработанные результаты определения суммы флавонои- дов в траве золотарника кавказского представлены в таблице 5.4.

Таблица 5.4 – Содержание флавоноидов в «Золотарника кавказского траве» (в пересчете на воздушно-сухое сырье) г. Чегем урочище перевал ущелье верховье Культиви- Год (Чегемс– Джилы–Су Гумбаши р.Даут к пе- р.Даут на руемый зо- (Зольский (Карачаев- ревалу Уч- перевале лотарник кий район, КБР) район, КБР) ский район, кулан (Ка- Эпчик (Ка- кавказский КЧР) рачаевский рачаевский район, КЧР) район, КЧР) Место сбора 1,83±0,05 1,68±0,04 1,76±0,04 1,82±0,04 1,85±0,03 2010 – ε = 2,82 ε = 2,54 ε = 2,37 ε = 1,98 ε = 1,53 1,57±0,03 1,75±0,07 1,88±0,04 1,70±0,02 1,91±0,07 1,91±0,05 2011 ε = 2,01 ε = 3,84 ε = 2,05 ε = 1,36 ε = 3,49 ε = 2,69 1,72±0,06 1,60±0,02 1,81±0,06 1,86±0,06 1,82±0,04 1,95±0,05 2012 ε = 3,68 ε = 1,35 ε = 3,32 ε = 3,04 ε = 2,00 ε = 2,81

Таким образом, содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского составляет от 1,57±0,03% до 1,95±0,05% [62]. Для подтверждения пригодности методики количественного определение флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского методом дифференциальной спектрофотометрии проводили валидацию [47]. Для этого была установлена область линейной зависимости оптической плотности от кон- центрации флавоноидов. Извлечения из травы золотарника кавказского готови- ли по вышеописанной методике из навесок сырья 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 г.

По результатам проведенного эксперимента построен градировочный график рассматриваемой зависимости (рисунок 5.4).

Рисунок 5.4 – Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов в траве золотарника кавказского

Из представленного рисунка видно, что почти все экспериментальные точки (за исключением последней) лежат на линии тренда. Следовательно, об- ласть линейной зависимости наблюдается в концентрациях 0,00686-0,00699 г/10 мл. Однако, для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелирует с коэффициентом r, значение которого должно быть r  0,99. Промежуточные данные для вычис- ления коэффициента корреляции r, который вычисляли с помощью программы Microsoft Exel 2007 по формуле (6), представлены в таблице 5.5.

m m m m xi yi   xi  yi r  1 1 1 (6)  m m 2  m m 2  2   2   m xi  xi  m yi  yi    1  1   1  1  

Таблица 5.5 – Промежуточные данные для вычисления коэффициента корреляции

2 2 № xi yi xi×yi xi yi 1 0,00686 0,1221 0,000838 4,706×10-5 0,01491 2 0,00690 0,1795 0,001239 4,761×10-5 0,03222 3 0,00693 0,2416 0,001674 4,802×10-5 0,05837 4 0,00695 0,3014 0,002095 4,83×10-5 0,09084 5 0,00699 0,3958 0,002767 4,886×10-5 0,15666 Итого: 0,03463 1,2404 0,008612 0,0002399 0,35300

Рассчитанное значение коэффициента корреляции составило 0,992, коэф- фициенты а и b: 2140,5 и –14,6 соответственно. Таким образом, уравнение линейной зависимости имеет вид:

y = 2140,5x – 14,6

Значение коэффициента корреляции максимально приближено к 1, поэто- му можно утверждать о наличии линейной зависимости значений оптической плотности от содержания флавоноидов в исследуемом образце. На рисунке 5.6 график не проходит через начало координат, но значение коэффициента b составляет менее 2% от коэффициента а, что укладывается в допустимое отклонение. Определение прецизионности методики (на уровне повторяемости) про- водили в девяти параллельных измерениях, результаты которых представлены в таблице 5.6.

Таблица 5.6 – Результаты количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского Оптическая Метрологические Навеска, г плотность, А X ,% i характеристики

1,0199 0,1246 1,75 0,9671 0,1195 1,77 0,9987 0,1241 1,78 X =1,72 2,0822 0,2471 1,70 S=0,0510 2,2016 0,2582 1,68 x =0,04 2,2626 0,2622 1,66 ɛ=2,24% 3,3405 0,3941 1,69 RSD = 2,97% 3,2049 0,3960 1,77 3,3789 0,3892 1,65

Относительное стандартное отклонение равно 2,97%, следовательно, ме- тодика позволяет получить удовлетворительные по сходимости результаты. Правильность данной методики устанавливали с помощью определения количественного содержание флавоноидов в пересчете на рутин в извлечениях, полученных путем добавления стандартного образца рутина к навеске сырья. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.7.

Таблица 5.7 – Оценка правильности методики количественного определения флавоноидов в траве золотарника кавказского Добавка ру- Расчетное тина, г Открывае- Метрологические ха- № содержа- Найдено,% к навеске мость,% рактеристики ние,% сырья 1 г 1 0 1,72 - - 2 0,0052 2,24 2,22 99,12 =100,37 3 0,0106 2,78 2,85 102,52 S=2,4042 4 0,0153 3,25 3,31 101,85 =2,40 5 0,0208 3,80 3,73 98,16 ɛ=2,40% 6 0,0251 4,23 4,36 103,07 RSD = 2,40% 7 0,0305 4,77 4,65 97,48

Из представленных результатов следует, что средний процент открывае- мости составил 100,37%, а относительное стандартное отклонение – 2,40%, что соответствует величине RSD, оптимальному для данного метода анализа.

5.6 Количественное определение фенолкарбоновых кислот в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского методом спектрофотомерии в пересчете на кофейную кислоту

Для количественного определения фенолкарбоновых кислот были полу- чены извлечения из травы и корневищ с корнями золотарника кавказского с по- мощью спирта этилового 40% и 70%, измерены их спектры поглощения в ин- тервале длин волн 200–600 нм и сравнены со спектром поглощения кофейной кислоты. Спектры поглощения извлечений из травы золотарника кавказского имеют характерные полосы поглощения с максимумами 292 и 329 нм, а извле- чений из корневищ с корнями – с максимумами 329 нм. При этом наибольшая оптическая плотность наблюдалась у 40% спиртового извлечения. Спектры по- глощения СО кофейной кислоты (рисунок 5.5) и спиртового извлечения из тра- вы (рисунок 5.6) и корневищ с корнями золотарника кавказского (рисунок 5.7) имеют аналогичный характер.

Рисунок 5.5 – УФ–спектр поглощения СО кофейной кислоты

Рисунок 5.6 – УФ–спектр извлечения из травы золотарника кавказского спиртом этиловым 40%

Рисунок 5.7 – УФ–спектр извлечения из корневищ с корнями золотарника кавказского спиртом этиловым 40%

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2,0 г (точная навеска) из- мельченной травы или около 1,0 г (точная навеска) измельченных корневищ с корнями помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добавляли 100 мл спирта этилового 40%. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и на- гревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Горячее извлечение фильт- ровали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. После охлаждения объем извлечения доводили спиртом этиловым 40% до метки и перемешивали (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл извлечения (раствор А) и доводили объем раствора спиртом этиловым 95% до метки (раствор Б). Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине вол- ны 329 ± 2 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм (рисунок 5.8). В каче- стве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95%. Параллельно в ана- логичных условиях измеряли оптическую плотность раствора СО кофейной ки- слоты. Содержание суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту в процентах (Х) вычисляли по формуле (7):

(7)

где A – оптическая плотность испытуемого раствора;

A0 – оптическая плотность раствора СО кофейной кислоты;

m – масса сырья золотарника кавказского, в г;

m0 – масса СО кофейной кислоты, в г; W – потеря в массе при высушивании сырья, в %. Примечание Приготовление раствора стандартного образца кофейной кислоты: около 0,05 г (точная навеска) кофейной кислоты помещали в мерную колбу вместимо- стью 250 мл, растворяли в 200 мл спирта этилового 40% при нагревании на ки- пящей водяной бане, охлаждали, доводили объем раствора тем же растворите- лем до метки и перемешивали. Результаты количественного определения фенолкарбоновых кислот в пе- ресчете на кофейную кислоту приведены в таблице 5.8.

Таблица 5.8 – Количественное определение фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского Оптиче- Содержание фенолкар- ская боновых кислот,% в пе- Метрологические Навеска, г плот- ресчете на воздушно- характеристики ность сухое сырье 1 2 3 4 Трава золотарника кавказского 2,2158 0,5759 0,91 1,9265 0,5227 0,85 X =0,88 S=0,0280 2,0358 0,5178 0,89 S X =0,0115 2,1459 0,5344 0,87 x =0,03 2,1852 0,5225 0,84 ɛ=3,20% 2,0162 0,5162 0,90

Продолжение таблицы 5.8 1 2 3 4 Корневища с корнями золотарника кавказского 1,1450 0,4101 1,32 X =1,35 1,0817 0,3963 1,35 S=0,0405 1,0056 0,3475 1,27 S X =0,0184 0,9913 0,3715 1,38 x =0,05 1,1539 0,4352 1,39 ɛ=3,34% 1,1271 0,4183 1,37

Таким образом, содержание фенолкарбоновых кислот в траве золотарника кавказского составляет 0,88±0,03%, а в корневищах с корнями – 1,35±0,05%.

5.7 Количественное определение дубильных веществ в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского

Количественное определение дубильных веществ в траве и корневищах с корнями золотарника кавказского проводили методом перманганатометриче- ского титрования по методике ГФ XI, вып. 1 [15]. Результаты представлены в таблице 5.9.

Таблица 5.9 – Количественное определение дубильных веществ в траве и

корневищах с корнями золотарника кавказского (Vко = 4,1 мл)

Содержание дубиль- Объем ных веществ,% в пе- Метрологические Навеска, г титранта, ресчете на воздушно- характеристики мл сухое сырье Трава золотарника кавказского

2,0256 8,3 9,31

2,2284 8,8 9,47 X =9,50 1,7475 7,7 9,25 S=0,2016 S X =0,0823 2,3825 9,3 9,80 x =0,20 ɛ 2,0239 8,4 9,54 =2,12%

1,8685 8,1 9,61

Корневища с корнями золотарника кавказского

2,3969 7,8 7,15

2,5621 8,1 7,23 =7,27 1,7861 6,9 7,26 S=0,1256 =0,0513 1,9731 7,3 7,51 =0,13 ɛ 1,1501 5,9 7,25 =1,73%

2,3802 7,8 7,20

Таким образом, содержание дубильных веществ в траве золотарника кав- казского составляет 9,50±0,20%, а в корневищах с корнями – 7,27±0,13%.

5.8 Изучение тритерпеновых гликозидов травы золотарника кавказского

Изучение тритерпеновых гликозидов (далее – гликозидов) травы золотар- ника кавказского проводилось по методике проф. Э.Т. Оганесяна, исследовав- шего механизм реакции взаимодействия тритерпеноидов с серной кислотой и разработавшего способ их количественного определения в растениях [36]. УФ– спектрофотометрическое определение гликозидов при взаимодействии с серной кислотой применяется в анализе корневищ аралии маньчжурской [26]. Около 100,0 г (точная навеска) сырья заливали бензолом «до зеркала» и настаивали в течении суток, периодически перемешивая. Затем бензол сливали и сырье вновь обрабатывали бензолом (кратность операции 3). Далее сырье вы- сушивали, и в аппарате Сокслета проводили многократную экстракцию хлоро- формом до обесцвечивания получаемого извлечения, после чего сырье высуши- вали и экстрагировали в аппарате Сокслета метанолом. Метанол отгоняли до 1/20 от первоначального объема, и из оставшегося сгущенного извлечения гли- козиды осаждали десятикратным объемом эфира. Надосадочную жидкость сли- вали, осадок затирали стеклянной палочкой в присутствии эфира, после чего фильтровали и сушили в эксикаторе над серной кислотой концентрированной. Далее проводили гидролиз гликозидов по методике [25]. По окончании гидролиза реакционную смесь охлаждали, разбавляли водой и агликоны экстра- гировали эфиром. Эфирный экстракт промывали водой до нейтральной реакции и обезвоживали над натрия сульфатом. Эфир отгоняли, агликоны сушили на воздухе. К 0,0004 г полученных агликонов прибавляли 10 мл серной кислоты концентрированной и термостатировали при 70 °С в течение 1 часа. Спектро- фотометрическое определение проводили в диапазоне длин волн 200–400 нм. Максимум светопоглощения наблюдался при 314 нм, что соответствует макси- муму поглощения олеаноловой кислоты. Таким образом, было установлено, что гликозиды золотарника кавказско- го являются производными олеаноловой кислоты.

Следующим этапом работы было спектрофотометрическое определение содержания суммы гликозидов в пересчете на агликон – олеаноловую кислоту. Аналитическую пробу травы золотарника кавказского измельчали до раз- мера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 2,5 г (точная навеска) сырья заливали 50 мл бензола и настаивали в течение суток. Извлечение фильтровали, бензол сливали, сырье высушивали на воздухе до удаления запаха бензола. Затем прибавляли 50 мл хлороформа и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, хлороформ сливали, сырье высушивали на воздухе до удаления запаха хлороформа. Далее сырье трехкратно экстрагировали метанолом пор- циями по 50 мл на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч. Метанол отгоняли и проводили гидролиз гликозидов по методике [25]. Смесь охлаждали, разбавляли водой в 5 раз, а агликоны экстрагировали эфиром. Эфир отгоняли, полученный остаток (сумма агликонов) сушили на воздухе. За- тем к нему прибавляли 10 мл серной кислоты концентрированной и термоста- тировали при 70 °С в течение 1 ч (раствор А). 1 мл раствора А помещали в мер- ную колбу на 100 мл и доводили серной кислотой концентрированной до метки (раствор Б). Спектрофотометрическое определение проводили в диапазоне длин волн 200–400 нм (рисунок 5.8).

Рисунок 5.8 – УФ–спектр раствора суммы агликонов тритерпеновых гликозидов травы золотарника кавказского в серной кислоте концентрированной

Приготовление раствора стандартного образца олеаноловой кислоты: к 0,0004 г олеаноловой кислоты прибавляли 10 мл серной кислоты концентриро- ванной (точный объем) и термостатировали при 70 °С в течение 1 часа. К 2 мл полученного раствора прибавляли 2 мл серной кислоты концентрированной и проводили спектрофотометрическое определение в диапазоне длин волн 200– 400 нм (рисунок 5.9).

Рисунок 5.9 – УФ–спектр раствора СО олеаноловой кислоты в серной кислоте концентрированной

Расчет содержания суммы агликонов в траве золотарника кавказского в пересчете на олеаноловую кислоту проводили по формуле (8):

(8)

где A – оптическая плотность испытуемого раствора;

A0 – оптическая плотность раствора СО олеаноловой кислоты; m – масса травы золотарника кавказского, в г;

m0 – масса СО олеаноловой кислоты, в г; W – потеря в массе при высушивании сырья, в %. Результаты проведенного определения представлены в таблице 5.10.

Таблица 5.10 – Содержание суммы агликонов в пересчете на олеаноловую кислоту в траве золотарника кавказского Содержание суммы аглико- Навеска Оптическая Метрологические нов,% в пересчете на воз- сырья, г плотность характеристики душно-сухое сырье 2,9335 0,8415 1,02

2,9057 0,8580 1,05 X = 1,01 3,1325 0,8635 0,98 S = 0,0274 S 2,9128 0,8519 1,04 X = 0,0112 x = 0,03 3,1752 0,8702 0,97 ε = 2,70% 3,1125 0,8641 0,99

Содержание суммы агликонов тритерпеновых гликозидов в траве золо- тарника кавказского в пересчете на олеаноловую кислоту, определенное мето- дом УФ–спектрофотометрии, составляет 1,01±0,03%.

5.9 Изучение полиацетиленовых соединений корневищ с корнями золотарника кавказского

Для выделения полиацетиленовых соединений из корневищ с корнями зо- лотарника кавказского навеску сырья массой 40,0 г заливали эфиром петролей- ным в соотношении 1:10 и настаивали в течение трех недель в темном месте. Полученное извлечение фильтровали, эфир петролейный отгоняли при пони- женном давлении и температуре 40±5 °С. Полученный сухой остаток растворя- ли в гексане и исследовали методом двумерной ТСХ в системе растворителей хлороформ – эфир петролейный 1:10. В результате была обнаружена зона ад-

сорбции с голубой флуоресценцией в УФ-свете с Rf=0,53-0,55. Данную зону ад- сорбции смывали эфиром петролейным и регистрировали УФ-спектр (рисунок 5.10). Полученный УФ-спектр с максимумами при длинах волн 239, 251, 263,

100

278 нм по литературным данным [151] соответствует полиацетилену матрика- риаэфиру.

Рисунок 5.10 – УФ–спектр матрикариаэфира корневищ с корнями золотарника кавказского

Таким образом, в корневищах с корнями золотарника кавказского нами обнаружено соединение полиацетиленовой природы – матрикариаэфир, ранее идентифицированное в других видах рода Золотарник [129, 140].

5.10 Количественное определение органических кислот в траве золотарника кавказского

Количественное определение органических кислот в траве золотарника кавказского проводили методом алкалиметрии по методике ГФ XI, вып. 2, ст. 39 «Плоды шиповника» [16]. Результаты представлены в таблице 5.11.

101

Таблица 5.11 – Результаты количественного определения органических кислот в траве золотарника кавказского Содержание ор- ганических ки- Навеска сы- Объем тит- Метрологические слот,% в пере- рья, г ранта, мл характеристики счете на воздуш- но-сухое сырье 25,2069 1,84 1,30

26,0412 1,96 1,34 X =1,31 25,6875 1,93 1,34 S=0,0283 S X =0,0115 24,8903 1,80 1,29 x =0,03 ɛ 25,2967 1,87 1,32 =2,16%

25,0731 1,78 1,27

Таким образом, содержание органических кислот в траве золотарника кавказского составляет 1,31±0,03%.

5.11 Изучение органических кислот травы золотарника кавказского методом ВЭЖХ

Исследование органических кислот проводили методом ВЭЖХ. Для этого около 3,0 г сырья (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 70 мл воды очищенной, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объем доводили водой до метки. Приготовление растворов сравнения органических кислот: по 0,025 г ас- корбиновой, лимонной, щавелевой, яблочной, янтарной, виннокаменной кислот

102

помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл растворяли в 25 мл раствора серной кислоты 0,005 М и доводили тем же растворителем до метки. Условия хроматографирования: высокоэффективный жидкостной хрома- тограф фирмы «Gilston», Франция; металлическая колонка размером 6,5×300 мм ALTECH OA–1000 Organic Acids; температура колонки 60 °С; подвижная фаза – раствор кислоты серной 0,005 М; скорость подачи элюента 3 мл/мин; продолжительность анализа 65 минут; детектирование: УФ детектор, длина волны 190 нм. Результаты представлены в таблице 5.12.

Таблица 5.12 – Результаты идентификации органических кислот в траве золотарника кавказского (водное извлечение)

Конц., % от суммы Время Высота Площадь No органических Название мин mV mV×сек кислот в из- влечении 1 1,71 0,05 0,25 0,00 неидент. 2 2,14 0,20 0,00 0,00 неидент. 3 7,48 157,26 8528,10 16,71 лимонная кислота 4 9,22 46,96 1670,70 3,27 яблочная кислота 5 10,47 69,87 3820,70 7,49 неидент. 6 11,20 51,68 4484,00 8,79 янтарная кислота 7 13,00 28,74 430,03 0,84 неидент. 8 13,17 28,71 343,29 0,67 неидент. 9 14,83 38,12 7266,89 14,24 неидент. 10 18,68 77,40 8366,73 16,40 неидент. 11 23,14 46,53 10503,02 20,58 неидент. 12 26,98 20,13 2379,79 4,66 неидент. 13 29,16 11,73 180,54 0,35 неидент. 14 29,54 11,60 166,41 0,33 неидент. 15 29,71 11,55 108,22 0,21 неидент. 16 29,87 11,54 2776,22 5,44 неидент.

103

В траве золотарника кавказского выявлено наличие лимонной, яблочной и янтарной кислот, среди которых основной по содержанию является лимонная кислота [60].

5.12 Изучение углеводов травы золотарника кавказского

Для изучения углеводов травы золотарника кавказского навеску сырья (30,0 г) двукратно экстрагировали хлороформом (100 мл) с последующим вы- сушиванием. Затем остаток сырья дважды экстрагировали кипящим спиртом этиловым 82% для выделения спирторастворимых сахаров (СРС). Полученные экстракты упаривали и хроматографировали на бумаге Filtrak FN 7, 12 в системе бутанол– пиридин–вода (6:4:3) в течение 17-18 часов со стандартными образцами ней- тральных моносахаридов. СРС по данным БХ представлены глюкозой, галакто- зой (проявитель кислый фталат анилина), фруктозой и сахарозой (проявитель 5% мочевина). Идентификацию углеводов проводили в сравнении со стандарт- ными образцами и по величине Rf. Затем проводили выделение полисахаридов, последовательно экстрагируя водорастворимые полисахариды водой (ВРПС), смесью растворов щавелевой кислоты и аммония оксалата – пектиновые вещества (ПВ), раствором щелочи – гемицеллюлозы (ГМЦ). Шрот, полученный после экстракции спиртом этиловым 82%, высушива- ли и проводили трехкратную экстракцию водой в соотношении 1:10; 1:5; 1:2 в условиях постоянного промешивания. Извлечения объединяли, фильтровали, упаривали при пониженном давлении с использованием роторного испарителя до 1/5 первоначального объема извлечения при температуре 45-50 ºС, затем осаждали трехкратным объемом спирта этилового 95%. Осадок центрифугиро- вали, промывали спиртом этиловым, обезвоживали ацетоном, высушивали и взвешивали.

104

Для выделения пектиновых веществ остаток сырья, полученный после проведения предыдущих операций, экстрагировали смесью растворов щавеле- вой кислоты 0,5% и аммония оксалата 0,5% в равных пропорциях в соотноше- нии шрот – экстрагент 1:5, 1:4 и 1:2 на водяной бане при 85-90 ºС в течение 3 часов. Далее экстракты объединяли, центрифугировали и диализовали. Прово- дили упаривание полученного извлечения до 1/20 первоначального объема, осаждали шестикратным объемом спирта этилового 95%. Полученный осадок центрифугировали, промывали спиртом этиловым, высушивали и взвешивали. Для выделения гемицеллюлоз полученный остаток сырья экстрагировали четырех- и трехкратным объемом натрия гидроксида 5% при комнатной темпе- ратуре. Полученные экстракты объединяли, нейтрализовали уксусной кислотой, диализовали, упаривали диализат до 1/10 первоначального объема и осаждали трехкратным объемом спирта этилового 95%. Осадок очищали, высушивали, как описано выше, и взвешивали. Для установления моносахаридного состава углеводов проводили их ки- слотный гидролиз серной кислотой 10% в соотношении 1:4,9 при температуре 100-105 ºC в течение 10 часов для ВРПС; 24 ч – ПВ; 72 ч – для ГМЦ в запаян- ных ампулах [53, 54]. Затем содержимое ампул переносили в стаканчики, ампу- лы промывали 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной среды. Полученные растворы фильтровали, фильт- ры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. Далее прибавляли трехкрат- ный объем спирта этилового 95%, тщательно перемешивали, отстаивали 1-2 ч и образовавшиеся осадки фильтровали. Фильтраты упаривали на кипящей водя- ной бане до объема около 1 мл. Осадки бариевых солей уроновых кислот деио- низировали катионитом КУ-2 (Н+) до рН 3-4. Растворы фильтровали, упаривали до получения объема около 1 мл раствора. Нейтральные сахара идентифицировали методом ГЖХ. ГЖХ – анализ об- разцов снимали на хроматографе Сhrom – 5 с пламенно–ионизационным детек- тором, стеклянная колонка (1,5 м × 0,3 м) 5% Silicone XE – 60 на хроматоне NAW – 0,200×0,250 меш, 210 ºС; газ-носитель – гелий, 30 мл/мин, в виде ацета-

105

тов альдононитрилов. По количеству составляющих моносахаридов выделен- ные ВРПС и ПВ относятся к галактанам, ГМЦ – ксиланам. Наибольшее коли- чество галактозы обнаружено во фракциях ПВ. Основными по содержанию яв- ляются фракции ПВ и ГМЦ. Количество уроновых кислот определяли фотоэлектроколорометрическим методом по реакции взаимодействия с карбазолом в сернокислой среде [21]. Глюкуроновые кислоты идентифицированы во всех фракциях, особенно в ПВ. Результаты представлены в таблице 5.13. Таблица 5.13 – Содержание и моносахаридный состав углеводов травы золотарника кавказского

Соотношение моносахаридных ос- Выход ПС, Кол–во Полисахариды татков % Gal Glc Ara Xyl Rha UAc,% ВРПС 3,10 4,8 1,3 1,0 1,2 сл. 25,3 ПВ 6,23 40,0 сл. 7,2 4,0 1,0 74,2

ГМЦ 6,60 1,0 1,1 1,0 7,6 – 15,8 Примечание: Gal – галактоза, Glс – глюкоза, Ara – арабиноза, Xyl – ксилоза, Rha – рамноза, UAc – уроновые кислоты

Количественное определение свободных (Кс) и этерифицированных (Кэ) карбоксильных групп проводили титриметрическим методом с потенциометри- ческой фиксацией точки эквивалентности на рН-метре марки «рН-340» [11] с последующим вычислением степени этерификации. ВРПС представляют собой порошок темно–коричневого цвета. При рас- творении в воде имеют показатель вязкости 3,0 (с 1%, вода). Титрометрическим методом установлено Кс = 1,98%, Кэ = 4,6%. Степень этерификации при этом составляет 69,9%. Следовательно, ВРПС являются высокоэтерифицированны- ми, что является основанием для их рекомендации к использованию в качестве вспомогательных веществ при приготовлении лекарственных форм: гелеобразо- вателей, загустителей, стабилизаторов и др.

106

Пектиновые вещества представляют собой порошок темно–коричневого цвета, при нагревании растворяются в воде, образуя вязкие растворы (коэффи- циент вязкости 10,17). Содержание Кс = 6,75%, Кэ = 3,78%, λ = 35,89%. Следо- вательно, ПВ являются низкоэтерифицированными, а достаточно высокое со- держание свободных карбоксильных групп делает перспективным данный рас- тительный объект для выделения пектинов с выраженными сорбционными свойствами, особенно в отношении ионов металлов. Гемицеллюлозы – сыпучий порошок, светло–коричневого цвета, раство- ряется в щелочи. ИК–спектры образцов (рисунки 5.11 и 5.12) регистрировали на ИК–Фурье спектрометре фирмы Perkin–Elmer, модель 2000, в пластинках, прессованных с KBr в интервале 4000-500 см-1. На основании анализа выявленных характеристических полос поглощения в ИК–спектрах углеводных образцов [20] можно сделать следующее заключе- ние. Практически во всех спектрах анализируемых фракций в областях 3300– 3700 см–1 наблюдается широкая и интенсивная полоса валентных колебаний, как первичных, так и вторичных OH–групп, ассоциированных внутри– и меж- молекулярными водородными связями. Наличие данной полосы поглощения можно объяснить присутствием характерных донорно–акцепторных водород- ных связей гидроксила с замещенным гидроксилом. В области 2930-2810 см–1 находятся полосы валентных колебаний СН–групп. Наличие выраженных полос валентных колебаний в областях 1758-1605 см–1 и 1479-1412 см–1 характерно для несимметричных и симметричных иони- зированных карбоксильных групп соответственно, что предполагает присутст- вие кислот, прежде всего уроновых, по–видимому, связанных электростатиче- ской связью с ионами некоторых S–металлов. Наличие полосы 1753-1742 см–1 в спектрах водорастворимой и кислотной фракциях свидетельствует о валентных колебаниях несимметричных С=О сложноэфирных карбоксильных групп, т.е. о

107

наличии в указанных объектах этерифицированных по карбоксильным группам уроновых кислот. Кроме того, появление полос поглощения в области 1370 см–1 в ПВ дока- зывает наличие метоксильной составляющей, т.е. этерификации метанолом кар-

боксильных групп.

спектр ВРПС золотарника кавказского

ИК

–

1 Рисунок Рисунок 5.1

108

спектр ПВ золотарника кавказского

ИК

–

2 Рисунок Рисунок 5.1

109

Следовательно, в исследуемых объектах имеющиеся уроновые кислоты характеризуются ионизированными и молекулярными карбоксильными груп- пами, в том числе связанными с ионами S–металлов и этерифицированными ме- танолом. Таким образом, учитывая достаточно высокий выход углеводов в траве золотарника кавказского (15,93% в пересчете на воздушно-сухое сырье), поли- сахариды можно считать перспективной в дальнейшем изучении группой био- логически активных веществ [61].

5.13 Биологически активные соединения травы золотарника кавказского, идентифицированные методом ГЖХ–МС

В большинстве лекарственных препаратов из других видов рода Золотар- ник (Марелин, Цистиум солидаго раствор, Солидагорен, Фитодолор) основу со- ставляют различные экстракты, поэтому для анализа было приготовлено водно– спиртовое извлечение с целью изучения его компонентного состава с помощью ГЖХ–МС. Траву золотарника кавказского экстрагировали спиртом этиловым 50%, извлечение впоследствии упаривали и высушивали. Полученное извлечение из травы золотарника кавказского (до 1 мг) сили- лировали в 20 мкл БСТФА (N,O–бис–(триметилсилил)–трифторацетамид) 15 мин при 80 оС и разбавляли гексаном до 100 мкл. Для анализа 1 мкл смеси вво- дили в инжектор системы газожидкостного хроматографа – масс–спектрометра в автоматическом режиме. Исследования проводили на хромато–масс– спектрометре AT–5850/5973 Agillent Technologies (США). Результаты проведенного исследования представлены на рисунке 5.13 и в таблице 5.14.

110

2 1 .5 2

2 1 .3 8 2 1 .2 2

2 0 .8 8 2 0 .1 6

2 0 .0 0

1 8 .3 1

1 8 .0 0

1 7 .6 2

кавказского

1 6 .2 8

1 6 .0 0

1 6 .0 2 1 5 .9 3

золотарника

1 4 .8 2

1 4 .3 9 1 4 .0 0

1 3 .9 7

1 3 .7 7

1 3 .6 8

1 3 .3 7 1 3 .2 5

1 3 .1 2 1 3 .0 0

1 2 .4 4

1 2 .2 6

1 2 .1 1

1 2 .0 0

1 1 .9 2 1 1 .8 2

TIC: ZOLOT AR .D

1 1 .3 6

производных травы

1 1 .0 9 –

1 0 .9 2

1 0 .3 7 1 0 .2 5

1 0 .0 0 9 .5 4

9 .2 0

8 .2 4 8 .0 0

7 .5 1

7 .1 0 мма триметилсилил

6 .9 2

6 .5 9 6 .0 0

6 .0 4

Хроматогра

–

4 .0 0 4 .0 9

3 .8 8

3 .5 8 3 .4 9

Рисунок 5.13

1 e + 0 7

2 e + 0 7

3 e + 0 7

2 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

1 .2 e + 0 7

1 .4 e + 0 7

1 .6 e + 0 7

1 .8 e + 0 7

2 .2 e + 0 7

2 .4 e + 0 7

2 .6 e + 0 7 2 .8 e + 0 7

T i m e - - > A b u n d a n c e 111

Таблица 5.14 – Вещества, обнаруженные в траве золотарника кавказского методом ГХ–МС Время удер- % от суммы № живания, Обнаруженные вещества веществ в мин извлечении 1 3,486 глицерин 1,37 2 3,581 фосфорная кислота 6,39 3 3,873 янтарная кислота 1,39 4 4,097 дигидроксипропионовая кислота 0,80 5 6,037 яблочная кислота 5,49 6 6,586 оксопролин (пироглутаминовая кислота) 0,63 7 6,925 тригидроксимасляная кислота 1,03 8 7,101 тригидроксимасляная кислота (изомер) 0,49 9 7,508 гидроксимасляная кислота 1,49 10 8,234 арабинонолактон 0,37 11 9,197 ксилит 0,50 12 9,543 рибит 0,56 13 10,248 кетоглюконовая кислота 1,15 14 10,364 арабинофураноза 1,89 15 10,913 фруктоза 14,98 16 11,089 фруктоза (изомер) 2,25 17 11,361 альтроза 2,36 18 11,822 мио–инозит 3,35 19 11,917 глюконолактон 1,30 20 11,998 глюцитол 1,09 21 12,107 маннопираноза 2,17 22 12,263 альтроза (изомер) 1,58 23 12,439 мио–инозоза 3,19 24 12,995 сцило–инозит 2,06 25 13,117 альтроза (изомер) 1,36 26 13,246 талоза 3,29 27 13,368 инозит 4,87 28 13,680 глюконовая кислота 3,84 29 13,768 пальмитиновая кислота 1,50 30 13,972 инозит (изомер) 0,48 31 14,392 сахарная кислота (неизвестная) 6,48 32 14,813 инозит (изомер) 0,82 33 15,925 линолевая кислота 0,58 34 16,020 линоленовая кислота 0,37 35 16,278 стеариновая кислота 0,19 36 17,621 глицеро–галакто–пираноза 0,48 37 18,312 глюкуроновая кислота 1,12 38 20,157 сахароза 3,59 39 20,883 сахароза (изомер) 3,95 40 21,215 дисахар 0,74 41 21,378 дисахар (изомер) 1,04 42 21,520 сахароза (изомер) 7,44 Сумма 100,00

112

Таким образом, в водно–спиртовом извлечении из травы золотарника кав- казского обнаружены жирные кислоты (дигидроксипропионовая, тригидрокси- масляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеари- новая кислоты), многоатомные спирты и их производные (глицерин, ксилит, рибит, инозит, мио–инозит, глюцитол, сцило–инозит), олигосахариды (араби- нофураноза, фруктоза, альтроза, маннопираноза, мио–инозоза, талоза, глицеро– галакто–пираноза, сахароза), аминокислота (оксопролин), органические кисло- ты (яблочная и янтарная кислоты), альдоновая кислота (глюконовая кислота), уроновая кислота (глюкуроновая кислота), кетокислота (кетоглюконовая кисло- та), минеральная кислота (фосфорная кислота), лактоны (глюконолактон, ара- бинонолактон).

5.14 Изучение аминокислотного состава травы золотарника кавказского

Определение свободных и связанных аминокислот в траве золотарника кавказского проводили на базе лаборатории патологии обмена веществ ГНИУ животноводства и кормопроизводства методом жидкостной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе «Amino Acid Analyzer T 339». Для этого сырье подвергнули кислотному гидролизу (хлористоводородная кислота 6 М, 110 ºС, 72 ч). Для анализа использовалась колонка Waters AccQ Tag размером 3,9 × 150 мм [81] с использованием градиентного метода элюиро- вания [84]: элюент I (рН 3,5): лимонная кислота – натрия цитрат – натрия хло- рид – каприловая кислота – тиогликоль (28,6 : 16,1 : 40,6 : 0,3 : 14,3); элюент II (рН 4,25): та же система (20,2 : 24,5 : 48,3 : 0,3 : 6,7); элюент III (рН 9,5): лимон- ная кислота – натрия цитрат – натрия хлорид – борная кислота – натрия гидро- ксид – каприловая кислота – тиогликоль (11,5 : 59,8 : 9,6 : 4,5 : 8,8 : 0,2 : 5,5). Для разбавления элюентов применена буферная смесь (рН 2,2): лимонная ки- слота – натрия хлорид – каприловая кислота – тиогликоль (30,7 : 25,2 : 0,2 : 43,9). Детектирование зон адсорбции аминокислот осуществлялось с использо-

113

ванием раствора нингидрина 1%, приготовленного на основе ацетатного буфера с рН 5,5. Для количественной оценки автоматически определяли площади пиков идентифицированных аминокислот (таблица 5.15).

Таблица 5.15 – Аминокислотный состав травы золотарника кавказского Содержание, в пересчете на воздушно-сухое сырье Аминокислота % г/кг Аспарагиновая кислота 1,03 10,27 Треонин* 0,49 4,88 Серин 0,65 6,48 Глутаминовая кислота 1,89 18,89 Глицин 0,91 9,08 Аланин 0,79 7,93 Валин* 0,39 3,92 Метионин* 0,18 1,82 Изолейцин* 0,23 2,28 Лейцин* 0,83 8,31 Тирозин 0,55 5,52 Фенилаланин* 0,76 7,65 Гистидин* 0,51 5,08 Лизин* 0,58 5,82 Аргинин* 0,53 5,26 *Примечание – незаменимые аминокислоты Таким образом, в траве золотарника кавказского впервые обнаружены 15 аминокислот, из которых 9 являются незаменимыми. Суммарное содержание незаменимых аминокислот составляет 4,5% в пересчете на воздушно-сухое сы- рье [56].

5.15 Изучение минерального состава травы золотарника кавказского

Определение содержания макро– и микроэлементов в траве золотарника кавказского проводили с помощью полуколичественного спектрального метода. Анализ был проведен в центральной испытательной лаборатории «Кавказге- олсъемка». Навеску травы золотарника кавказского (10,0 г) подвергали озоле-

114

нию в муфельной печи при 550 °С в течение 2 ч при доступе воздуха. Получен- ную золу охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Изучение элементного состава осуществляли на дифракционный спектрографе ДФС–8–1 методом испарения. Результаты исследования элементного состава данного вида сырья пред- ставлены в таблице 5.16. Элементы, содержащиеся в траве золотарника кавказского, по степени полезности для организма человека можно разделить на следующие группы [5249]: 1. Эссенциальные (жизненно–важные) элементы: Ca, K, Mg, Na, P, Cr, Cu, Fe, Mn, Zn, Mo. 2. Условно–эссенциальные (жизненно–важные, но опасные в определенных до- зах) микроэлементы: Ag, Al, B, Ni, Si, V. 3. Условно–токсичные микроэлементы Ba, Ti, Zr, Sr. Содержание условно-токсичных элементов не превышало предельно допустимых уровней [49]. Таблица 5.16 – Минеральный состав травы золотарника кавказского № п/п Название Содержание,% в пересчете на Предел обна- элемента воздушно-сухое сырье ружения,% 1 2 3 4 Макроэлементы 1 Натрий 0,0954 0,01 2 Калий 1,908 0,6 3 Магний 0,318 0,001 4 Фосфор 0,1272 0,03 5 Кальций 1,272 0,1 Микроэлементы 6 Железо 0,01272 0,001 7 Кремний 0,0636 0,001 8 Бор 0,000636 0,01 9 Марганец 0,00636 0,0003 10 Цинк 0,001908 0,002 11 Алюминий 0,01272 0,001 12 Молибден 0,0000636 0,00003 13 Медь 0,000636 0,00003 14 Никель 0,0001272 0,0002

115

Продолжение таблицы 5.16 1 2 3 4 15 Барий 0,00636 0,02 16 Стронций 0,00318 0,01 17 Титан 0,0001908 0,001 18 Серебро 0,000000636 0,00001 19 Ванадий 0,00001908 0,0003 20 Хром 0,00001908 0,0002 21 Цирконий 0,00000064 0,0008

Таким образом, нами впервые установлено, что трава золотарника кавказ- ского содержит 5 макроэлементов и 16 микроэлементов. Присутствие эссенциальных элементов подчеркивает терапевтическую значимость травы золотарника кавказского, а содержание токсичных элементов в пределах допустимых уровней свидетельствует о ее безопасности [56].

5.16 Определение некоторых числовых показателей травы и корневищ с корнями золотарника кавказского

Для анализа была использована трава золотарника кавказского, заготов- ленная на территории Северного Кавказа: Республика Карачаево–Черкесия, Ка- рачаевский район (перевал Гумбаши, ущелье р. Даут к перевалу Учкулан, вер- ховье р. Даут на перевале Эпчик), Республика Кабардино–Балкария, Чегемский район (г. Чегем) и Зольский район (урочище Джилы–Су); а также трава и корне- вища с корнями золотарника кавказского, заготовленные от культивируемых растений. Определение влажности, золы общей, золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, экстрактивных веществ проводили в соответствии с ГФ XI изд., вып. 1 и 2 [15, 16], а также ГФ XII изд. [14]. Приме- си и измельченность травы золотарника кавказского определяли в соответствии с ГФ XI вып. 1 [15] на тех же образцах. Результаты представлены в таблице 5.17.

116

Таблица 5.17 – Числовые показатели травы и корневищ с корнями золотарника кавказского Трава Корневища с Цельное сы- Измельченное корнями цель- Показатель Порошок рье сырье ные содержа- содержание,% содержание,% содержание,% ние, % Влажность 5,81–7,42 5,79–7,71 5,84–7,85 9,76–10,74 Зола общая 4,36–6,37 4,31–6,45 4,28–6,50 9,29–9,99 Зола, нераствори- 0,54–1,23 0,52–1,20 0,52–1,21 1,03–1,13 мая в 10% HCl Экстрактивные вещества – 24,91–26,05 – 30,74–31,56 (экстрагент спирт этиловый 50%) Органические 1,88–2,65 2,13–2,79 – – примеси Минеральные 1,02–1,19 1,24–1,40 – – примеси Пожелтевшие и побуревшие ли- 6,48–9,22 8,92–9,15 – – стья Стебли 14,06–14,93 13,96–14,51 – – Частиц, проходя- щих сквозь сито с отверстиями раз- 8,75–9,56 – – – мером 7 мм Частиц, не прохо- дящих сквозь си- то с отверстиями – 9,24–9,68 – – размером 7 мм Частиц, проходя- щих сквозь сито с отверстиями раз- – 8,32–9,47 84,25–92,49 – мером 0,25 мм Частиц, проходя- щих сквозь сито с отверстиями раз- – – 1,24–1,67 – мером 0,1 мм

117

Таким образом, нормы качества «Золотарника кавказского травы» сле- дующие: Цельное сырье. Экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50%, не менее 24%; влажность не более 8%; золы общей не более 7%; золы, не- растворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 1,5%; час- тиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм, не более 10%; по- желтевших и побуревших листьев не более 10%; стеблей не более 15%; органи- ческой примеси не более 3%; минеральной примеси не более 1,5%. Измельченное сырье. Экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом эти- ловым 50%, не менее 24%; влажность не более 8%; золы общей не более 7%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 1,5%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиям размером 7 мм, не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,25 мм, не более 10%; пожелтевших и побуревших листьев не более 10%; стеблей не более 15%; органической примеси не более 3%; минеральной примеси не более 1,5%. Порошок. Экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50%, не менее 24%; влажность не более 8%; золы общей не более 7%; золы, нерас- творимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 1,5%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,25 мм, не менее 80%.

5.17 Микробиологическая чистота «Золотарника кавказского травы»

Определение микробиологической чистоты сырья золотарника кавказско- го проводилось в соответствии с требованиями ГФ ХII, ч.1, с.160, ОФС 42– 0067–07 «Микробиологическая чистота» [14]. Результаты представлены в таб- лице 5.18.

118

Таблица 5.18 – Результаты определения микробиологической чистоты «Золотарника кавказского травы» Норма Трава золотарника Показатели (категория 4А) кавказского Общее число аэробных бактерий, в 1 г Не более 107 243 Общее число грибов, в 1 г Не более 105 Не обнаружено Escherichia coli, в 1 г Не более 102 Не обнаружено

Полученные результаты свидетельствуют о соответствии золотарника кавказского травы требованиям ГФ XII изд., предъявляемым к лекарственному растительному сырью по показателю «Микробиологическая чистота».

5.18 Установление срока годности «Золотарника кавказского травы»

Для определения срока годности сырья золотарника кавказского прово- дились анализы через каждые 6 месяцев, результаты представлены в таблице 5.19.

Таблица 5.19 – Показатели качества «Золотарника кавказского травы» в процессе хранения

12 18 24 30 36 42 Показатели качества 0 мес. 6 мес. мес. мес. мес. мес. мес. мес. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Внешние признаки Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Микроскопия Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Подлинность (качест- венные реакции, хро- Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. матография) Числовые показатели - содержание флаво- ноидов в пересчете на 1,67 1,61 1,53 1,42 1,35 1,28 1,17 0,98 рутин (не менее 1,0%) - экстрактивные веще- ства (экстрагент спирт 25,16 24,94 24,75 24,62 24,51 24,33 24,19 24,03 этиловый 50%) (не ме- нее 24%)

119

Продолжение таблицы 5.19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - влажность (не более 6,15 6,18 6,54 6,72 6,98 7,06 7,54 8,12 8%) - зола общая (не более 5,89 5,95 6,13 5,99 6,21 6,17 5,90 6,08 7%) - зола, не растворимая в 10% хлористоводо- 0,99 1,03 1,02 0,98 1,04 1,02 0,98 1,01 родной кислоте (не более 1,5%) - частиц, проходящих сквозь сито с отвер- 7,73 7,59 8,01 7,62 7,84 8,05 7,80 7,93 стиями размером 7 мм (не более 10%) - пожелтевшие и по- буревшие листья (не 8,02 8,10 8,44 8,42 8,75 8,39 9,13 9,27 более 10%) - стебли (не более 13,89 13,45 14,59 14,22 13,35 13,64 14,20 13,83 15%) - органические приме- 1,12 1,19 1,07 1,10 1,13 1,12 1,05 1,09 си (не более 3%) - минеральные приме- 0,85 0,87 0,90 0,84 0,87 0,85 0,83 0,85 си (не более 1,5%) Микробиологическая Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. чистота Не со- Заключение Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. Соотв. отв.

Исходя из полученных данных, рекомендуемый срок годности «Золотар- ника кавказского травы» составляет не более 3 лет. Основными показателями доброкачественности являются содержание флавоноидов (не менее 1%) и экс- трактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 40% (не менее 27%).

120

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

1. Впервые в траве золотарника кавказского идентифицирвоаны флавоноиды (рутин, виценин, гесперидин), кумарины (умбеллиферон, эскулетин, дигидрокумарин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, цикориевая, хлорогеновая и кофейная), органические кислоты (лимонная, яблочная и янтарная), жирные кислоты (дигидроксипропионовая, тригидроксимасляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая), 15 аминокислот, 5 макроэлементов и 16 микроэлементов. 2. Впервые установлено количественное содержание в траве золотарника кавказского в пересчете на воздушно-сухое сырье флавоноидов (1,57– 1,95%), фенолкарбоновых кислот (0,88±0,03%), дубильных веществ (9,50±0,20%), агликонов тритерпеновых гликозидов (1,01±0,03%), органи- ческих кислот (1,31±0,03%), углеводов (15,93%). 3. Основными показателями доброкачественности «Золотарника кавказского травы» являются: содержание флавоноидов (не менее 1%) и экстрактив- ных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50% (не менее 24%). В ка- честве метода экспресс–анализа флавоноидов предложена ТСХ в системе уксусной кислоты 15%. После проявления спиртовым раствором алюми- ния хлорида 2% обнаруживается коричневая зона адсорбции, соответст- вующая рутину. 4. В корневищах с корнями золотарника кавказского обнаружены фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, полиацетиленовые соединения, тритерпеновые гликозиды, углеводы и аминокислоты. Количественное содержание в пересчете на воздушно-сухое сырье фенолкарбоновых кислот составляет 1,35±0,05%, дубильных веществ – 7,27±0,13%.

121

ГЛАВА 6 ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ «ЗОЛОТАРНИКА КАВКАЗСКОГО ТРАВЫ ЭКСТРАКТА СУХОГО», СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕННОГО ЭКСТРАКТА И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Сухой экстракт травы золотарника кавказского получали на базе экспери- ментальной лаборатории ЗАО «Вифитех».

6.1 Получение «Золотарника кавказского травы экстракта сухого»

Для обеспечения полноты извлечения действующих веществ и максимальной скорости экстрагирования к экстрагенту предъявляют следующие требования: селективность, химическая и фармацевтическая индифферентность, малая токсичность, доступность. Спирт этиловый является хорошим растворителем для многих веществ, в частности для флавоноидов. Однако, золотарник кавказский также содержит растворимые в воде и в спирто-водных растворах сапонины. Поэтому нами был выбран этиловый спирт 50%. Кроме того, экстрагент этой концентрации используется для приготовления экстракта золотарника обыкновенного, входящего в лекарственный препарат Фитодолор [39] и для приготовления сухого экстракта золотарника канадского, выпускаемого ЗАО «ВИФИТЕХ». Для получения «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» была выбрана мацерация как наиболее простой и компактный способ, широко используемый в промышленности, в частности для получения сухого экстракта золотарника канадского, выпускаемого ЗАО «ВИФИТЕХ». «Золотарника кавказского траву» измельчали до размера частиц не более 7 мм, помещали в мацерационный бак и заливали спиртом этиловым 50% в со-

122

отношении 1:10. Экстракция осуществлялась методом дробной мацерации в 4 стадии. Объединенное извлечение фильтровали в колбу вакуум–выпарного ап- парата через тройной слой марли для освобождения его от кусочков сырья и взвешенных частиц. Сгущение вытяжки проводили выпариванием при пони- женном давлении при температуре 50-60 ºС и разрежении 600–500 мм до над- лежащей густоты. Густой экстракт помещали в вакуум–сушильный шкаф и вы- сушивали до остаточной влажности не более 5% при температуре 60-65 ºС (ри- сунок 6.1). Выход конечного продукта не менее 24% в пересчете на воздушно- сухое сырье [65].

6.2 Разработка методик стандартизации «Золотарника кавказского травы экстракта сухого»

6.2.1 Общие показатели Описание. Порошок темно–коричневого цвета со специфическим аромат- ным запахом и слабо горьким вкусом. Растворимость. Легко растворим в воде, спирте этиловом 40%, практи- чески нерастворим в хлороформе (ГФ XII, ч.1, ОФС 42–0049–07, с. 92 [14]). Подлинность. 1. Около 0,01 г сухого экстракта помещали в пробирку, прибавляли 5 мл спирта этилового 95% и взбалтывали в течение 3 минут. Затем прибавляли 10 капель хлористоводородной кислоты концентрированной, 0,015 г магния металлического и нагревали на кипящей водяной бане 3 минуты. Через 5 минут наблюдали розовое окрашивание (флавоноиды). 2. УФ–спектр поглощения испытуемого раствора Б (см. раздел «Количе- ственное определение») в интервале длин волн от 350 до 450 нм имеет макси- мум при длине волны 410 нм ± 2 нм (флавоноид рутин). Влага. Около 0,5 г (точная навеска) экстракта сушили в сушильном шкафу при температуре 102,5±2,5 ºС в течение 5 ч, затем охлаждали в эксикаторе в те- чение 30 мин и взвешивали (ГФ XI, вып. 2, с. 160–161 [16]). Результаты опреде-

123

лений представлены в таблице 6.1.

Таблица 6.1 – Потеря в массе при высушивании «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» Результаты высушивания,% Метрологические характеристики 4,12 X =4,17 4,03 S=0,1250 4,38 S 4,19 X =0,0510 4,07 x =0,13 4,21 ε =3,15%

Потеря в массе при высушивании «Золотарника кавказского травы экс- тракта сухого» не превышает 5%. Тяжелые металлы. Содержание тяжелых металлов в экстракте составля- ет не более 0,01% (ГФ XII, ч. 1, ОФС 42–0059–07, с. 121 [14]). Микробиологическая чистота. Экстракт выдерживает требования, ука- занные в ГФ ХII, вып.1, с.160, ОФС 42–0067–07 (категория 3.2) [14].

Таблица 6.2 – Результаты испытания микробиологической чистоты «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» Показатели Норма Сухой экстракт (категория 3.2) Общее число аэробных бактерий, Не более 104 318 КОЕ в 1 г Общее число грибов, КОЕ в 1 г Не более 102 35 Энтеробактерий, КОЕ в 1 г Не более 102 21 Escherichia coli, КОЕ в 1 г Отсутствие Отсутствует Salmonella, КОЕ в 10 г Отсутствие Отсутствует Pseudomonas aeruginosa, КОЕ в 1 г Отсутствие Отсутствует Staphylococcus aureus, КОЕ в 1 г Отсутствие Отсутствует

Полученные результаты (таблица 6.2) свидетельствуют о соответствии ис- следуемого экстракта требованиям ГФ XII, предъявляемым к субстанциям при-

124

родного происхождения, в том числе растительного, по показателю «Микро- биологическая чистота».

6.2.2 Изучение фенольных соединений Изучение качественного состава фенольных соединений сухого экстрак- та золотарника кавказского проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON», модель 305, Франция; инжектор ручной, мо- дель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой резуль- татов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows» . В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6×250 мм Kromasil C18, размер частиц 5 микрон. В качестве подвижной фазы метанол–вода– фосфорная кислота концен- трированная, в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной тем- пературе. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа 50 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ–детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151 при длинах волн 254 нм и 360 нм. Для исследования около 0,6 г (точная навеска) экстракта золотарника кав- казского помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл спирта этилового 70%, помещали в ультразвуковую баню при температуре 50 °С в течение 15 минут. Объем раствора доводили до метки тем же растворите- лем (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в спирте этило- вом 70%: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин–7–гликозида, галловой ки- слоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, гиперозида, гесперидина, апигенина, кемпферола, феруловой кислоты, цикориевой кислоты, умбеллифе- рона, дигидрокумарина, скополетина, эскулетина, виценина, кумарина, дикума- рина, дигидрокверцитина, катехина, эпикатехина. По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хро- матограф и хроматографировали по вышеприведенной методике. Результаты представлены в таблице 6.3.

125

Таблица 6.3 – Результаты идентификации фенольных соединений «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» методом ВЭЖХ

рутин Флавоноиды виценин гесперидин эскулетин Кумарины умбеллиферон цикориевая кислота хлорогеновая кислота Фенолкарбоновые кислоты кофейная кислота галловая кислота

Таким образом, методом ВЭЖХ впервые в экстракте золотарника кав- казского идентифицированы флавоноиды (рутин, виценин, гесперидин), кума- рины (умбеллиферон, эскулетин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, цико- риевая, хлорогеновая, кофейная) [66].

6.2.3 Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом дифференциальной спектрофотометрии

Около 0,5 г (точная навеска) экстракта помещали в мерную колбу вме- стимостью 50 мл, растворяли в 30 мл спирта этилового 70% и доводили тем же растворителем до метки (раствор А) и далее поступали также, как описано в п. 5.5. Полученный дифференциальный спектр извлечения из экстракта травы золотарника кавказского (рисунок 6.1) совпадает по положению максимума с дифференциальным спектром рутина (рисунок 5.2).

126

Рисунок 6.1 – Спектр поглощения комплекса флавоноидов экстракта золотарника кавказского с алюминия хлоридом

Результаты количественного определения суммы флавоноидов в пересче- те на рутин в сухом экстракте золотарника кавказского представлены в таблице 6.4.

Таблица 6.4 – Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в «Золотарника кавказского травы экстракте сухом» Результаты определе- Навеска экстракта, Оптическая Метрологические ния, % в пересчете на г плотность характеристики сухой экстракт 0,5375 0,2376 3,02 X =3,03 0,6106 0,2735 3,06 S=0,0337 0,5269 0,2298 2,98 S 0,5684 0,2546 3,06 X =0,0138 0,5541 0,2474 3,05 x =0,02 0,5293 0,2324 3,00 ε =0,88%

127

Таким образом, содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин со- ставляет 3,030,02% [62]. Для подтверждения пригодности методики количественного определение флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте золотарника кавказского мето- дом дифференциальной спектрофотометрии проводили валидацию [47]. Для этого была установлена область линейной зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов. Определение содержания флавоноидов прово- дили по вышеописанной методике из навесок экстракта 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1 г. По результатам проведенного эксперимента построен градировочный график рассматриваемой зависимости (рисунок 6.2).

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Оптическая Оптическая плотность, А 0,0238 0,024 0,0242 0,0244 0,0246 0,0248 0,025 Концентрация вещества, г/10 мл

Рисунок 6.2 – Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов экстракта золотарника кавказского

128

г/10 мл. Рассчитанное значение коэффициента корреляции составило 0,996. Промежуточные данные для вычисления коэффициента корреляции представ- лены в таблице 6.5.

Таблица 6.5 – Промежуточные данные для вычисления коэффициента корреляции 2 2 № xi yi xi×yi xi yi 1 0,02393 0,0455 0,001089 0,0005726 0,00207 2 0,02418 0,1325 0,003204 0,0005847 0,01756 3 0,02435 0,2305 0,005613 0,0005929 0,05313 4 0,02454 0,3114 0,007642 0,0006022 0,09697 5 0,02471 0,4095 0,010119 0,0006106 0,16769 Итого: 0,12171 1,1294 0,027666 0,0029630 0,33742

Рассчитанное значение коэффициента корреляции составило 0,992, коэф- фициенты а и b 469,4 и –11,2 соответственно.

Таким образом, уравнение линейной зависимости имеет вид: y = 469,4x – 11,2 Значение коэффициента корреляции максимально приближено к 1, поэто- му можно утверждать о наличии линейной зависимости значений оптической плотности от содержания флавоноидов в исследуемом образце. Определение прецизионности методики (на уровне повторяемости) про- водили в девяти параллельных измерениях, результаты которых представлены в таблице 6.6.

129

Таблица 6.6 – Результаты количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте золотарника кавказского Оптическая Метрологические Навеска, г плотность, А X ,% i характеристики

0,3093 0,1384 3,09 0,3082 0,1297 2,91 0,3059 0,1343 3,03 X =3,00 0,5046 0,2155 2,95 S=0,0856 0,5127 0,2308 3,11 x =0,07 0,5089 0,2263 3,07 ɛ=2,15% 0,7115 0,3062 2,97 RSD = 2,85% 0,7043 0,3101 3,04 0,7072 0,2930 2,86

Относительное стандартное отклонение равно 2,85%, следовательно, ме- тодика позволяет получить удовлетворительные по сходимости результаты. Правильность данной методики устанавливали с помощью определения количественного содержание флавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных путем добавления стандартного образца рутина к навеске экстрак- та. Результаты эксперимента представлены в таблице 6.7.

Таблица 6.7 – Оценка правильности методики количественного определения флавоноидов в экстракте золотарника кавказского Добавка рути- на, г Расчетное Открывае- Метрологические № Найдено,% к навеске экс- содержание,% мость,% характеристики тракта 0,5 г 1 0 3,00 - - 2 0,0053 3,53 3,61 102,27 =99,78 3 0,0104 4,04 3,97 98,26 S=2,6029 4 0,0154 4,54 4,52 99,56 =2,57 5 0,0205 5,05 4,93 97,62 ɛ=2,60% 6 0,0252 5,52 5,72 103,62 RSD = 2,61% 7 0,0303 6,03 5,87 97,35

130

Из представленных результатов следует, что средний процент открывае- мости составил 99,78%, а относительное стандартное отклонение – 2,61%, что соответствует величине RSD, оптимальному для данного метода анализа.

6.2.4 Количественное определение фенолкарбоновых кислот в пересчете на кофейную кислоту методом спектрофометрии Около 0,5 г (точная навеска) экстракта помещали в мерную колбу вме- стимостью 50 мл, растворяли в 30 мл спирта этилового 40% и доводили тем же растворителем до метки (раствор А) и далее поступали также, как описано в п. 5.6. Полученный спектр извлечения из экстракта травы золотарника кавказ- ского (рисунок 6.3) совпадает по положению максимума со спектром кофейной кислоты (рисунок 5.5).

Рисунок 6.3 – УФ–спектр извлечения из экстракта травы золотарника кавказского спиртом этиловым 40%

131

Результаты количественного определения фенолкарбоновых кислот в пе- ресчете на кофейную кислоту приведены в таблице 6.8. Таблица 6.8 – Содержание фенолкарбоновых соединений в пересчете на кофейную кислоту в экстракте золотарника кавказского Содержание фе- нолкарбоновых Навеска экстрак- Оптическая плот- Метрологические кислот,% в пере- та, г ность характеристики счете на сухой экстракт 0,5092 0,5229 1,77

0,4971 0,4932 1,71 X = 1,72 0,4810 0,4660 1,67 S = 0,0422 S X = 0,0172 0,5235 0,5315 1,75 x = 0,04 0,5198 0,5247 1,74 ε = 2,45%

0,5206 0,5044 1,67

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что со- держание суммы фенолкарбоновых кислот в сухом экстракте травы золотарника кавказского в пересчете на кофейную кислоту составляет 1,72±0,04%.

6.3 Установление срока годности «Золотарника кавказского травы экстракта сухого»

Для определения срока годности экстракта золотарника кавказского про- водились анализы через каждые 6 месяцев, результаты представлены в таблице 6.9.

132

Таблица 6.9 – Показатели качества «Золотарника кавказского травы экстракта сухого» в процессе хранения

Срок хра- Описание Подлин- Влага,% Содер- Микро- Соот- нения, (порошок ность (циа- (не более жание фла- биоло- ветствие годы темно- нидиновая 5%) вонои- гическая требо- коричне- реакция, дов,% (не чистота ваниям вого цвета) УФ-спектр) менее (категория проекта 2,5%) 3.2) ФСП - Соотв. Соотв. 4,17 3,03 Соотв. Соотв. 0,5 Соотв. Соотв. 4,38 2,90 Соотв. Соотв. 1,0 Соотв. Соотв. 4,52 2,82 Соотв. Соотв. 1,5 Соотв. Соотв. 4,76 2,69 Соотв. Соотв. 2,0 Соотв. Соотв. 4,91 2,54 Соотв. Соотв. 2,5 Соотв. Соотв. 5,10 2,46 Соотв. Не соотв.

Исходя из полученных данных, рекомендуемый срок годности экстракта золотарника кавказского составляет не более 2 лет. Основным показателем доб- рокачественности является содержание флавоноидов (не менее 2,5%).

6.4 Предварительное изучение фармакологической активности

Предварительное изучение фармакологической активности травы и экс- тракта золотарника кавказского проводилось под руководством к. ф. н., заве- дующего кафедрой морфологии и патологии Пятигорского медико– фармацевтического института – филиала ВолгГМУ Минздрава России Терехо- ва Александра Юрьевича.

133

6.4.1 Определение «острой» токсичности «Золотарника кавказского травы»

Для определения «острой» токсичности травы золотарника кавказского из нее было приготовлено извлечение. Поскольку в лекарственные препараты на основе других видов рода Золотарник (Солидагорен, Марелин, Фитодолор) он включен в виде экстрактов, нами было приготовлено водно–спиртовое извлече- ние. Траву золотарника кавказского экстрагировали спиртом этиловым 50%, из- влечение впоследствии упаривали и высушивали. «Острую» токсичность определяли по методике, изложенной в п. 2.2.7. Результаты представлены в таблице 6.10 и на рисунке 6.4. Таблица 6.10 – Определение острой токсичности травы золотарника кавказского Исследуемые дозы, мг/кг 500 1000 2500 5000 7500 10000 Выжило 6 5 4 2 1 0 Погибло 0 1 2 4 5 6 ЛД50 с доверитель- ным интервалом 4173±900,7

ЛД10 173,2 ЛД16 1052,3 ЛД84 7292,9 ЛД100 8852,9 Уровень значимости 0,05

Рисунок 6.4 – График зависимости летальности животных от дозы спиртового извлечения из травы золотарника кавказского

134

В результате проведенного эксперимента установлена ЛД50 = 4173±900,7 мг/кг, что позволяет отнести спиртовое извлечение из травы золотарника кав- казского к малотоксичным веществам [37].

6.4.2 Патоморфологические изменения в органах, вызванные введением извлечения из травы золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг

Проводили морфологическую экспертизу на малом увеличении срезов пе- чени, почек, миокарда, легких, надпочечников, желудка следующих экспери- ментальных групп: Группа 1. Интактные животные. Группа 2. Животные, получавшие золотарник кавказский в дозе 10000 мг/кг массы. Печень группы 1 При обзорном исследовании гистологические препараты печени имеют равномерную окраску по всей площади срезов. Центральные вены округлой или овальной формы, содержат большое количество эритроцитов. Гепатоциты в пе- ченочных балках тесно прилегают друг к другу по ходу балок. Между печеноч- ными балками хорошо видны резко расширенные синусоиды, с грубой извито- стью, свободны от содержимого. Гепатоциты имеют равномерную гомогенную окраску, цитоплазма содержит зернистость. Радиальная ориентацию печеноч- ных балок не нарушена. Ядра правильной округлой формы, размещены в центре цитоплазмы. В портальных зонах отчетливо различаются триады. Сосуды пече- ни не гиперемированы. Просветы сосудов триады зияют, правильной округлой формы. Вокруг зоны триад определяется небольшая лимфоцитарная инфильт- рация. Признаков дистрофических и некротических изменений гепатоцитов не обнаружено.

135

Печень группы №2 Балочная система долек резко нарушена, особенно в периваскулярных зо- нах центра долек и портальных трактов. Центральные вены резко гиперемиро- ваны и значительно расширены, заполнены аморфным содержимым. Контуры эритроцитов в сосудах не определяются, что указывает на выраженный гемолиз эритроцитов. Отек сосудистых стенок и околососудистых зон паренхимы. В пе- риваскулярнызх зонах также определяются участки дистрофических и некроти- ческих изменений гепатоцитов (рисунок 6.5.А). Почки группы №1 На срезах почек поверхность гладкая ровная. Капсула прилежит к поверх- ность почек без отслоений по всей поверхности. В корковом слое хорошо раз- личимы клубочки и капсулы нефронов, расположенные в гомогенно окрашен- ной ткани коркового вещества. Извитые канальцы коркового вещества зияют, просвет их свободен от содержимого. Эпителиальные клетки канальцев плотно прилегают к стенке канальцев по всей поверхности, представлены одним слоем клеток, равномерно окрашенных с центральным расположением ядер. В сосудах коркового вещества находится небольшое количество эритроцитов. Клубочки нефронов округлой формы размещены ближе к одному полюсу капсулы, кото- рая имеет серповидную форму. Просвет капсулы свободен от содержимого. Эпителий капсулы не изменен. Мозговое вещество пирамиды равномерно ок- рашено, просветы многочисленных канальцев свободны от содержимого. Эпи- телий без изменений, расположен непрерывным одноклеточным пластом с цен- тральным расположением ядер и гомогенной цитоплазмой. Почки группы №2 Корковое вещество почек. Контуры мальпигиевх клубочков размыты. Ка- пилляры клубочков отёчны, увеличены, занимают все пространство капсул. В части извитых канальцев эпителиальные клетки десквамированы, их просветы заполнены аморфным или зернистым эозинофильным содержимым. Сосуды коркового и мозгового слоев гиперемированы. Вокруг них определяются мно-

136

гочисленные геморрагические кровоизлияния и периваскулярный отек (рисунок 6.5.Б). Сердце группы №1 На гистологических срезах данной группы миокардиоциты расположены продольными параллельными пластами. Между волокнами кардиоцитов име- ются многочисленные анастамозы. Цитоплазма клеток гомогенно окрашена. Ядра миокардиоцитов имеют овальную форму, ориентированы вдоль продоль- ной оси волокон и занимают центральное положение, поверхность, поверхность гладкая, окраска гомогенная. Между мышечными волокнами и параллельно им располагаются прослойки рыхлой соединительной ткани, имеющих на срезах веретенообразную форму. Сердце группы №2 В препаратах представлено на поперечном срезе сердце с правым и левым желудочком. В углублениях между трабекулярными мышцами встречаются очажковые скопления эритроцитов. Кардиомиоциты равномерной толщины. Ядра клеток расположены латерально, они гиперхромные. Сосуды свободны от содержимого, стенки обычного строения. Волокна миокарда расположены рых- ло, в определенных участках встречаются участки фрагментации миокардиоци- тов (рисунок 6.5.В). Легкие группы №1 В данной группе животных на гистологических срезах просветы респира- торных бронхиол в большинстве свободны от содержимого, отдельные содер- жат умеренное количество слизи. Однослойный кубический эпителий бронхиол расположен равномерным пластом, хорошо и равномерно прокрашены базо- фильные ядра. Просвет альвеол зияет, свободен от содержимого по всем иссле- дуемым полям. Межальвеолярные перегородки не растянуты, не утолщены, признаков лимфоцитарной инфильтрации нет. Сосуды легких содержат не- большое количество эритроцитов. Признаков воспалительных, дистрофических, некротических и других патологических изменений в легких не обнаружено.

137

Легкие группы №2 На гистологических срезах легких данной группы животных наблюдается резкое переполнение кровью капилляров, мелких вен и артериол с признаками стаза в них. Определяется интерстициальный отек, очаги ателектаза, лимфоци- тарная инфильтрация тканей. Наблюдается также диапедез эритроцитов в про- светы альвеол и периваскулярные пространства, скопление отечной жидкости в альвеолах, респираторных ходах и в мелких бронхах (рисунок 6.5.Г). Надпочечники группы №1 На гистологических срезах данной группы хорошо различимы капсула надпочечников, клубочковая, пучковая и сетчатая зона коры, хромафинные клетки мозгового вещества. Окраска зон равномерная по всем полям. Капсула плотно прилегает к клубочковой зоне по всей поверхности. Клетки клубочковой зоны формируют округлые скопления. В клетках содержится небольшое коли- чество липидов. Клетки пучковой и сетчатой зоны более крупные, плотно при- легают друг к другу, располагаются радиальными пучками от цента к перифе- рии. В цитоплазме клеток большое количество липидов. Тяжи клеток переме- жаются с капиллярами и тонкими веретенообразными эндотелиоцитами. Моз- говое вещество представлено крупными клетками округлой формы, между ко- торыми располагаются сосуды. Полости сосудов содержат эритроциты. Цито- плазма клеток мозгового вещества заполнена плотными мелкими гранулами. Различаются светлые и темные клетки. Ядра округлой формы расположены в центральной зоне цитоплазмы. Надпочечники группы №2 В группе опытных животных в адренокортикоцитах клубочковой и пуч- ковой зон надпочечников заметно уменьшено содержание липидных включе- ний. Выявлено выраженное полнокровие синусоидов коркового и особенно мозгового вещества, отек. Эти изменения обусловили увеличение доли стро- мального компонента как в корковом, так и мозговом веществе надпочечников и являются важным морфологическим критерием усиленной функциональной нагрузки надпочечников (рисунок 6.5.Д)

138

Желудок группы №1 Поверхность слизистой покрыта однослойным призматическим эпителием по всей поверхности, включая ямки. Собственная пластинка слизистой пред- ставлена трубчатыми железами желудка, между которыми лежат тонкие про- слойки соединительной рыхлой волокнистой ткани. Отчётливо просматривают- ся секреторные отделы желез и выводные протоки с узким просветом, свобод- ные от содержимого. Клетки тела и дна желез окрашены базофильно более ин- тенсивно, чем выводные протоки. Клетки желез размещены в виде непрерыв- ных прямых тяжей, плотно прилегают друг к другу, имеют гранулярную цито- плазму. Расположение ядер в клетках центральное. Ядра округлой формы с гладкой поверхностью. В собственном слое также видно множество лимфоид- ных клеток и рыхлая волокнистая соединительная ткань с большим количест- вом ретикулиновых волокон. Желудок группы №2 Структура тканей сохранена. Слизистая оболочка покрыта призматиче- ским эпителием по всей поверхности. Складчатость слизистой сохранена. Желе- зы имеют правильную трубчатую форму. Секреторные клетки желез плотно прилегают друг к другу, их цитоплазма содержит базофильную грануляцию, яр- че выраженную в области тела и дна желез. Между железами расположены тон- кие соединительнотканные прослойки и лимфоидные клетки. Ядра секреторных клеток имеют обычную округлую форму, расположены в центральной зоне ци- топлазмы. Вместе с тем кровеносные сосуды подслизистой основы желудка резко гиперемированы (рисунок 6.5.Е), наблюдается утолщение их стенок за счет отека. Таким образом, под влиянием токсических доз золотарника кавказского (10000 мг/кг массы животных) во всех исследуемых органах наблюдалась рез- кая гиперемия сосудов с интерстициальным отеком и диапедезными кровоиз- лияниями. В тканях печени, почек, легких и надпочечников участки дистрофи- ческих и некротических изменений. Причиной смерти являлось нарушение ге-

139

модинамики в результате системного тромбообразования и кровоизлияния в жизненно важные органы.

А. Печень: 1 – некротические из- Б. Почки: 1 – геморрагические менения гепатоцитов, кровоизлияния 2 – гемолиз эритроцитов

В. Сердце: 1 – сосуды свободны от Г. Легкие: содержимого 1 – переполнение кровью сосудов

Д. Надпочечники: Е. Желудок: 1 – гиперемия 1 – полнокровие синусоидов подслизистой основы желудка

Рисунок 6.5 – Патоморфологические изменения в органах, вызванные введением экстракта золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг

140

Таким образом, под влиянием токсических доз золотарника кавказского (10000 мг/кг массы животных) во всех исследуемых органах наблюдалась рез- кая гиперемия сосудов с интерстициальным отеком и диапедезными кровоиз- лияниями. В тканях печени, почек легких и надпочечников участки дистрофи- ческих и некротических изменений. Причиной смерти являлось нарушение ге- модинамики в результате системного тромбообразования и кровоизлияния в жизненно важные органы [37].

6.4.3 Изучение диуретической активности «Золотарника кавказского травы экстракта сухого»

Диуретическую активность сухого экстракта золотарника кавказского определяли по методике, изложенной в п. 2.2.7. Результаты представлены в таб- лице 6.11. Таблица 6.11 – Влияние сухого экстракта золотарника кавказского на диурез Исследуемые группы, доза Показатель Интактные Экстракт з. Экстракт з. Экстракт з. кавказского, кавказского, кавказского, 100 мг/кг 300 мг/кг 500 мг/кг Объем мочи за 2,74±0,278* 2,33±0,204* 1,67±0,198 1,86±0,193 2 часа, мл/200 г +64% +40%

Примечание * – достоверно (Р<0,05 ) по отношению к интактной группе жи- вотных

В ходе исследования было установлено, что введение сухого экстракта золотарника кавказского в дозах 300 и 500 мг/кг приводит к достоверному уве- личению диуреза на 64% и 40% соответственно по сравнению с интактными животными [24].

141

6.4.4 Изучение антибактериального действия «Золотарника кавказского травы экстракта сухого»

Изучение антибактериального действия экстракта травы золотарника кав- казского проводили под руководством к. биол. н., ст. преп. кафедры биологиче- ской химии и микробиологии Пятигорского медико–фармацевтического инсти- тута – филиала ВолгГМУ Минздрава России Постниковой Надежды Васильев- ны. Для определения антибактериального действия были приготовлены вод- ные растворы сухого экстракта золотарника кавказского в концентрациях 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%. Антибактериальное действие полученных растворов изучали способом «колодцев». Способ основан на диффузии испытуемых веществ из «колодцев» в питательный агар, засеянный различными тест–культурами. Этот принцип диффузии положен в основу фармакопейного метода определения антимикроб- ной активности антибиотиков [14]. При выполнении метода толстый слой агара в чашках Петри засевали 2 мл 100–млн взвесей суточных тест–культур, излишек взвесей удаляли, чашки под- сушивали; сверлом диаметром 6 мм пробуравливали отверстия («колодцы») на расстоянии 2,5 см от центра и на одинаковом расстоянии друг от друга. Колод- цы заполняли исследуемыми растворами экстракта. Через 16–18 часов инкуба- ции в термостате измеряли диаметры зон отсутствия и угнетения роста. Использовали следующие критерии антибактериального действия: отсут- ствие зоны задержки роста – испытуемая культура не чувствительна к экстракту золотарника кавказского; диаметр задержки роста 10 мм – умеренная чувстви- тельность культуры; диаметр задержки роста более 10 мм – высокая чувстви- тельность культуры. Проведенные исследования (таблица 6.12) выявили достаточно высокое антибактериальное действие по отношению как к грамположительным бактери-

142

ям: стафилококкам (тест–культуры №№ 1–3) и бациллам (тест–культуры №№ 5–6), так и к грамотрицательным бактериям: протею (тест–культура №8), ки- шечной палочке Е. coli M–17 (тест–культура №9), синегнойной палочке (тест– культура №11).

Таблица 6.12 – Антибактериальное действие экстракта золотарника кавказского Объекты Тест–культуры

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Диаметры зон задержки роста в мм

1 15 17 19 – 12 12 9 19 15 – 18

2 15 15 18 – 9 11 8 19 14 – 18

3 8 7 11 – 8 9 – – 10 – 18

4 8 7 8 – – 8 – – 7 – 16

5 – 7 – – – 7 – – – – –

Объекты: 1 – экстракта водный раствор 20%; 2 – экстракта водный раствор 10%; 3 – экстракта водный раствор 5%; 4 – экстракта водный раствор 2,5%; 5– экстракта водный раствор 1%. Тест–культуры: 1 – Staphylococcus aureus (Макаров); 2 – S. aureus Type; 3 – S. epidermidis Wood–46; 4–Escherichia coli 0–55; 5 – Bacillus subtilis L2; 6 – Вас. anthracoides–96; 7 – Вас. anthracoides–1; 8 – Proteus vulgaris; 9 – E. coli M–17; 10 – E. coli 675; 11– Pseudomonas aeruginosa

Отмечена зависимость спектра антибактериального действия и степени его выраженности от концентрации экстракта в растворе. Так, спектр антибактериального действия экстракта золотарника кавказ- ского водных растворов 5%, 2,5%, 1% включал соответственно 7, 6 и 2 тест–

143

культуры (из 11 –и), тогда как у водных растворов 20% и 10% он был заметно шире (и одинаков): 9 из 11–и тест–культур. Степень выраженности антибактериального действия у экстракта золо- тарника кавказского водного раствора 2,5% и особенно 1% раствора была низ- кой; диаметр зоны задержки (отсутствия) роста составлял 7–8 мм (за исключе- нием диаметра зоны задержки роста 16 мм по отношению к №11 тест– культуре). Несколько выше была выраженность антибактериального действия у рас- твора 5%: диаметр зон задержки роста колебался от 7 до 11 мм по отношению к стафилококкам (тест–культуры №№1–3) и бациллам (тест–культуры №№5,6) и 10 мм, 18 мм по отношению к эшерихиям (тест–культура №9) и синегнойной палочке (тест–культура №11) соответственно. Существенно выше была выраженность антибактериального действия у раствора 20%: по отношению к стафилококкам, энтеробактериям (протею и эшерихиям) и синегнойной палочке диаметр зоны задержки роста колебался от 15 до 19 мм и от 9 до 12 мм – по отношению к бациллам. Степень выраженности антибактериального действия у раствора 10% по отношению к стафилококкам (тест–культуры №№1–3) и грамотрицательным бактериям (№№8, 9, 11) существенно не отличалось от антибактериального действия раствора 20%, будучи несколько слабее по отношению к бациллам (№№5–7) [66].

144

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ

1. Предложена возможная технологическая схема промышленного произ- водства сухого экстракта травы золотарника кавказского методом дроб- ной мацерации. 2. В сухом экстракте золотарника кавказского методом ВЭЖХ впервые вы- явлено наличие флавоноидов (рутин, виценин, гесперидин), кумаринов (умбеллиферон, эскулетин), фенолкарбоновых кислот (галловая, цико- риевая, хлорогеновая и кофейная). Количественное содержание в пересче- те на сухой экстракт флавоноидов составляет 3,03±0,02%; фенолкарбоно- вых кислот – 1,72±0,04%. 3. Разработаны методики стандартизации сухого экстракта, необходимые для объективной и достоверной оценки его подлинности и доброкачест- венности. Основным показателем доброкачественности является содер- жание флавоноидов (не менее 2,5%). 4. В результате определения «острой» токсичности травы золотарника

кавказского была установлена ЛД50 = 4173±900,7 мг/кг, что позволяет отнести ее спиртовое извлечение к малотоксичным веществам. При введении извлечения из золотарника кавказского в токсической дозе 10000 мг/кг причиной смерти являлось нарушение гемодинамики в результате системного тромбообразования и кровоизлияния в жизненно важные органы. 5. Сухой экстракт золотарника кавказского в дозе 300 мг/кг увеличивает диурез на 64% по сравнению с интактными животными. Проведенные исследования выявили антибактериальное действие по отношению как к грамположительным бактериям: стафилококкам и бациллам, так и к грамотрицательным бактериям: протею и синегнойной палочке.

145

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный анализ литературных данных показал, что виды рода Золо- тарник уже успешно используются в мировой медицинской практике, не имеют широкого применения в отечественной фармации и являются перспективными в изучении. В работе представлены первые результаты исследования ранее неизучен- ного эндемичного вида Кавказа – золотарника кавказского. В процессе исследования изучены ресурсы травы золотарника кавказского и рассмотрена перспектива его культивирования. Для установления подлинности сырья золотарника кавказского приведены характерные для него морфологические и анатомо–диагностичекие признаки, позволяющие установить его подлинность. В траве золотарника кавказского установлено наличие целого ряда биоло- гически активных соединений, который включает фенольные соединения (фла- воноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, дубильные вещества), тритер- пеновые гликозиды, органические кислоты, углеводы, аминокислоты. В корне- вищах с корнями золотарника кавказского обнаружены фенолкарбоновые ки- слоты, дубильные вещества, полиацетиленовые соединениия, тритерпеновые гликозиды, углеводы и аминокислоты. Предложена возможная технологическая схема промышленного произ- водства сухого экстракта травы золотарника кавказского. Изучено диуретическое и антибактериальное действие полученного эстракта, что подтверждает перспективу использования золотарника кавказского для лечения заболеваний мочевыделительной системы. Разработанные методики стандартизации «Золотарника кавказского тра- вы», а также экстракта на её основе, вошли в проекты фармакопейных статей предприятия. В итоге были сделаны следующие выводы:

146

1. В результате анализа литературных данных были обобщены и систематизированы сведения о видах рода Золотарник, произрастающих на территории Российской Федерации. 2. Ресурсные обследования флоры Кабардино–Балкарской и Карачаево– Черкесской Республик выявили отдельные места произрастания золотар- ника кавказского и позволили оценить его эксплуатационные запасы. При изучении возможности введения золотарника кавказского в культуру бы- ло установлено, что наиболее эффективным является размножение отрез- ками корневищ. 3. Морфологические и анатомо–диагностические исследования позволили определить характерные для травы и корневищ с корнями золотарника кавказского признаки для установления подлинности. 4. Проведенное фитохимическое изучение выявило наличие в траве золотарника кавказского флавоноидов (рутин, виценин, гесперидин), кумаринов (умбеллиферон, эскулетин, дигидрокумарин), фенолкарбоновых кислот (галловая кислота, цикориевая кислота, хлорогеновая кислота и кофейная кислота), органических кислот (лимонная, яблочная, янтарная), тритерпеновых гликозидов – производных олеаноловой кислоты; жирных кислот (дигидроксипропионовая, тригидроксимасляная, гидроксимасляная, пальмитиновая, линолевая, линоленовая, стеариновая кислоты); многоатомных спиртов и их производных (глицерин, ксилит, рибит, инозит, мио–инозит, глюцитол, сцило–инозит), 15 аминокислот (9 являются незаменимыми) 5 макроэлементов и 16 микроэлементов. В корневищах с корнями золотарника кавказского обнаружены фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, полиацетиленовые соединения, тритерпеновые гликозиды, углеводы и аминокислоты. Разработана методика количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин в траве золотарника кавказского. Методика валидирована и включена в проект ФСП «Золотарника кавказского трава».

147

Количественно определено содержание в пересчете на воздушно-сухое сырье флавоноидов (1,57-1,95%); фенолкарбоновых соединений в пересчете на кофейную кислоту (в траве – 0,88±0,03%; в корневищах с корнями – 1,35±0,05%); дубильных веществ (в траве – 9,50±0,20%; в корневищах с корнями – 7,27±0,13%); органических кислот (в траве – 1,31±0,03%); агликонов тритерпеновых гликозидов (в траве – 1,01±0,03%); углеводов (в траве – 15,93%). 5. Установлено, что трава золотарника кавказского является малотоксичной. Экспериментально подтверждено диуретическое и антибактериальное действие экстракта травы золотарника кавказского. 6. Разработаны нормы качества на траву золотарника кавказского и сухой экстракт на её основе, которые вошли в проекты ФСП «Золотарника кавказского трава» и ФСП «Золотарника кавказского травы экстракт сухой». Предложен проект Инструкции по заготовке и сушке травы золотарника кавказского.

148

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аналитическая хроматография / К.И. Сакодынский [и др.] – М.: Химия, 1993. – 446 с. 2. Анненковъ, Н.И. Ботаническій словарь. Справочная книга для ботаниковъ, сельскихъ хозяевъ, садоводовъ, лесоводовъ, фармацевтовъ, врачей, дроги- стовъ, путешественниковъ по Россіи и вообще сельскихъ жителей / Н.И. Анненковъ. — СПб.: Изд-во типографія Императорской АН, 1878. — 335 с. 3. Астрологова, Л.Е. Медоносное значение Chamaeneron angustifolium (L.) Scop. и Solidago virgaurea L. в Архангельской области / Л.Е. Астрологова // Раст. ресурсы. – 1978. – № 3. – С. 418 — 420. 4. Бандюкова, В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды / В.А. Бандюкова // Химия природ. соединений. – 1983. – № 3. – С. 263–273. 5. Барковский, В.Ф. Дифференциальный спектрофотометрический анализ / В.Ф. Барковский, В.И. Ганопольский. – М.: Химия, 1969. – 168 с. 6. Батюк, В.С. Флавоноиды Solidago virgaurea L. и S. canadensis L. и их фармакологические свойства / В.С. Батюк, Е.А. Васильченко, С.Н. Ковалева // Раст. ресурсы. – 1988. – Вып 1. – С. 92 — 99. 7. Батюк, В.С. Флавоноиды Solidago сanadensis и S. virgaurea / В.С. Батюк, С.Н. Ковалева // Раст. ресурсы. – 1985. – № 4. – С. 92 – 99. 8. Беликов, В.В. Избирательный метод анализа флавоноидов в фитохимиче- ских препаратах / В.В. Беликов, Т.В. Точкова, Н.Т. Колесник // Проблема стандартизации и контроля лекарственных средств: тез. докл. науч. конф. – М., 1991. – С.1516. 9. Беликов, В.Г. Дифференциальная фотометрия / В.Г. Беликов – Ставрополь, 1970. – 136с. 10. Борисова, Н.А. Методические указания по учету запасов и составлению карт распространения лекарственных растений / Н.А. Борисова. – Л., 1961. – 42 с.

149

11. Бузина, Г.В. Титрометрический метод количественной и качественной ха- рактеристики пектиновых веществ / Г.В. Бузина, О.Ф. Иванова, Л.Б. Со- сновский // Хлебопекарная и кондитерская пром-сть. – 1965. – № 4. – С. 15-18. 12. Всемирная организация здравоохранения [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.who.int/about/ru/. – Загл. с экрана. 13. Галушко, А.И. Флора Северного Кавказа. Определитель: в 3 т. / А.И. Галушко. – Изд-во Ростов. ун-та, 1978. – Т. 3. – 328 с. 14. Государственная фармакопея Российской Федерации. – 12–е изд. – М.: На- уч. центр экспертизы средств мед. применения, 2008. – Ч. 1. – 704 с. 15. Государственная фармакопея СССР. – Вып. 1: Общие методы анализа / МЗ СССР. – 11–е изд. – М.: Медицина, 1987. – 336 с. 16. Государственная фармакопея СССР. – Вып. 2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11–е изд. – М.: Медицина, 1990. – 400 с. 17. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. – 2014. – Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/GRLS.aspx. – Загл. с экра- на. 18. Дикорастущие лекарственные растения / под ред. Г. Штайнбаха [и др.]. – М.: АСТ: Астрель, 2005. – 200 с. 19. Дикорастущие полезные растения России / под ред. А.Л. Буданцева, Е.Е. Лесиовской. – СПб.: Изд–во СПХФА, 2001. – 663 с. 20. Жбанков, Р.Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов / Р.Г. Жбанков. – Минск: Наука и техника, 1972. – 456 с. 21. Зависимость колориметрической реакции галактуроновой кислоты и ней- тральных моносахаридов с карбазолом от условий ее проведения / М.П. Филиппов [и др.] // Изв. АН МССР: Сер. биол. и хим. наук. – 1976. – № 1. – С. 75-86.

150

22. Зайцева, Т.А. Рост и развитие Solidago virgaurea L. при разной продолжительности фотопериода / Т.А. Зайцева // Раст. ресурсы. – 1988. – Т. 24, вып. 2. – С. 207 — 212. 23. Иванчева, С. Флавоноиды в Solidago virgaurea L. / С. Иванчева, А. Виткова // Фармация (болг.). – 1997. – Т. 44, № 4. – С. 17 – 19. 24. Изучение диуретической активности экстракта золотарника кавказского / В.В. Федотова [и др.] // Современные тенденции в образовании и науке: сб. науч. тр. по материалам Междун. науч.-практ. конф. 31 окт. 2013 г.: в 26 ч. – Тамбов: Бизнес-Наука-Общество, 2013. – Ч. 6. – С. 133-134. 25. Ильма, Деста. Изучение процесса гидролиза сапонинов Aralia mandchurica / Ильма Деста, Э.Т. Оганесян, В.Д. Пономарев // Химия природ. соедине- ний. – 1978. – №5. – С. 590. 26. Ильма, Деста. Спектрофотометрическое определение аралозидов в настой- ке аралии маньчжурской / Ильма Деста // Фармация. – 1980. – №5. – С. 47. 27. Калинкина, Г.И. Антимикробные свойства эфирного масла золотарника обыкновенного / Г.И. Калинкина, Л.А. Зарубина // 3–я укр. конф. по мед. ботанике: в 2ч. – Киев, 1992. – Ч. 1. – С. 66. 28. Клышев, Л.К. Флавоноиды растений / Л.К. Клышев, В.А. Бандюкова, Л.С. Алюкина. – Алма–Ата: Изд–во Наука Каз. ССР, 1978. – 220 с. 29. Косман, В.М. Информационное обкспечение для идентификации фенольных соединений в обращено–фазовой ВЭЖХ. Флавоны, флавонолы и их гликозиды / В.М. Косман, И.Г. Зинкевич // Раст. ресурсы. – 1997. – Т. 33, вып. 2. – С. 14–26. 30. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных природных соединений / Н.И. Кочетков. – М.: Химия, 1970. – 378 с. 31. Крылова, И.Л. Методические указания по изучению запасов дикорасту- щих лекарственных растений / И.Л. Крылова, А.И. Шретер. – М., 1971. – 31 с. 32. Лурье, А.А. Хроматографические материалы / А.А. Лурье. –М.: Химия, 1978. – 434 с.

151

33. Максимов, О.Б. Полифенолы дальневосточных растений / О.Б. Максимов, Н.И. Кулеш, П.Г. Горовой. – Владивосток: Дальнаука, 2002. – 332 с. 34. Методика определения запасов лекарственных растений / А.И. Шретер [и др.]. – М., 1986. – 51 с. 35. Методы анализа лекарств / Н.П. Максютина [и др.] – Киев: Здоров’я, 1984. – 224 с. 36. Оганесян, Э.Т. О механизме реакции тритерпеноидов с серной кислотой / Э.Т. Оганесян // Химия природ. соединений. – 1980. – №4. – С. 647–651. 37. Определение «острой» токсичности сухого экстракта золотарника кавказ- ского. Патоморфологические изменения в органах, вызванные введением экстракта золотарника кавказского в дозе 10000 мг/кг [Электронный ре- сурс] / В.В. Федотова [и др.] // Современные проблемы науки и образова- ния. – 2014. – № 1. – Режим доступа: http://www.science-education.ru/115- 11846. – Загл. с экрана. 38. ОФС 42–0013–03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб» // Фармация. – 2003. – № 6. – С. 3–8. 39. Пат. 2069564 Германия, A61K35/78. Фитодолор / С. Н. Окпании, М. Аренс– Корелл (Германия). – № 4895031/14; заявл. 09.07.90; опубл. 27.11.96. – 5 с. 40. Пещанская Е.В. Особенности размножения золотарника канадского зеле- ными черенками / Е.В. Пещанская, А.Н. Цицилин // Агро XXI. – 2009. - № 1-3. – С. 82-83. 41. Пыченкова, П.А. Влияние хлорхолинхлорида и микроэлементов на накопление полисахаридов в Solidago virgaurea L. / П.А. Пыченкова, Е.А. Строев, Е.Г. Мартынов // Химия природ. соединений. – 1986. – № 3. – С.368 — 369. 42. Пыченкова, П.А. Динамика содержания и характеристика полисахаридов Solidago virgaurea L. / П.А. Пыченкова // Химия природ. соединений. – 1987. – №2. – С. 291 — 292.

152

43. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae (Compositae) / под ред. П.Д. Соколова. – СПб: Наука, 1993. – 352 с. 44. Реестр продукции, прошедшей государственную регистрацию [Электрон- ный ресурс]. – 2014. – Режим доступа: http://fp.crc.ru/gosregfr/?type=max. – Загл. с экрана. 45. Род золотарник – перспективный источник биологически активных веществ / С.Н. Ковалева [и др.] // Респ. конф. по мед. Ботанике (2; Киев, 1988). – Киев, 1988. – 257 с. 46. Розен, Б.Я. Накопление и распределение брома и йода в растениях / Б.Я. Розен // Раст. ресурсы. – 1969. – Т. 5, вып. 1. – С.122. 47. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» // Фармация. – 2008. – № 4. – С. 3–10. 48. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П. Фисенко. – М.: Ремедиум, 2000. – С. 114–119. 49. СанПиН 2.3.2. 1078–01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. – М., 2001. – 180 с. 50. Семенихин, В.И. Оптимизация агротехнологии получения промышленных плантаций золотарника канадского при совместных посевах с однолетни- ми сельскохозяйственными культурами и ромашкой аптечной в условиях Московской области / В.И. Семенихин, И.Д. Семенихин // Сельскохозяйст- венная биология. – 2009. – № 1. – С. 99-105. 51. Сернов, Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. – М.: Медицина, 2000. – 352 с. 52. Скальный, А.В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И.А. Рудаков. – М.: Оникс 21 век; Мир, 2004. – 276 с. 53. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Моносахариды) / Б.Н. Степаненко. – М.: Высш. шк., 1977. – 222 с.

153

54. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (Полисахариды) / Б.Н. Сте- паненко. – М.: Высш. шк., 1978. – 256 с. 55. Тахтаджян, А. Л. Система магнолиофитов / А. Л. Тахтаджян. – Л.: Наука, 1987. – 439 с. 56. Федотова, В.В. Аминокислотный и минеральный состав травы золотарни- ка кавказского (Solidago caucasica Kem.–Nath.) / Федотова В.В., Челом- битько В.А. // Кластерные подходы фармацевтического союза: образова- ние, наука и бизнес: сб. материалов II Междунар. науч.–практ. конф. 26 апр. 2012 г. – Белгород: БелГУ, 2012 . – С. 184–187. 57. Федотова, В.В. Анатомо–диагностическое изучение золотарника кавказ- ского (Solidago caucasica Kem.–Nath.) флоры Северного Кавказа / Федото- ва В.В., Челомбитько В.А. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2012. – вып. 67. – С. 128–131. 58. Федотова, В.В. Виды рода золотарник (Solidago): значение для медицин- ской практики, перспективы изучения / В.В. Федотова, В.А. Челомбитько // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. – 2012. – № 16 (135), вып. 19. – С. 136–145. 59. Федотова, В.В. Изучение фенольных соединений золотарника кавказско- го (Solidago caucasica Kem.–Nath.) / В.В. Федотова, В.А. Челомбитько // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. – 2012. – № 10 (129), вып. 18. – С. 175–177. 60. Федотова, В.В. Изучение органических кислот золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.–Nath.) и черноголовника многобрачного (Рoterium polygamum Waldst. & Kit.) / В.В.Федотова, А.В.Охремчук, В.А. Челомбить- ко // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина, Фармация. – 2012. – №16 (135), вып. 19. – С. 173–175. 61. Федотова, В.В. Изучение углеводов травы Solidago caucasica / В.В. Федо- това, В.А. Челомбитько, М.Х. Маликова // Химия природ. соединений. – 2013. – №4. – С. 621–622.

154

62. Федотова, В.В. Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин в сухом экстракте золотарника кавказского / В.В. Федотова, Д.А. Коновалов // Проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. по материалам 4 Межрегион. науч.-практ. конф. с междунар. участием 30- 31 мая 2014 г. – Владикавказ, 2014.– С. 22-25. 63. Федотова, В.В. Морфологическое и анатомо–диагностическое изучение корневищ с корнями золотарника кавказского [Электронный ресурс] / В.В. Федотова, Л.М. Елисеева, Д.А. Коновалов // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 3. – Режим доступа: http://www.science- education.ru/117-13292. – Загл. с экрана. 64. Федотова, В.В. Определение флавоноидов в золотарника кавказского траве / В.В. Федотова, Д.А. Коновалов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2014. – вып. 69. – С. 85-88. 65. Федотова, В.В. Товароведческие показатели золотарника кавказского тра- вы (Solidago caucasica Kem.–Nath.) и получение сухого экстракта / В.В. Федотова, В.А. Челомбитько // Разработка, исследование и маркетинг но- вой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2013. – вып. 68. – С. 113–114. 66. Федотова, В.В. Фенольные соединения и антибактериальное действие сухого экстракта золотарника кавказского (Solidago caucasica Kem.–Nath.) / Федотова В.В., Челомбитько В.А., Постникова Н.В. // Медицинский альманах. – 2013. – № 1 (25). – С. 185–188. 67. Флора российского Дальнего Востока: Дополнения и изменения к изданию «Сосудистые растения советского Дальнего Востока». Т. 1 – 8 (1985 – 1996) / под ред. А.Е. Кожевникова, Н.С. Пробатовой. – Владивосток: Дальнаука, 2006. – 456 с. 68. Флора СССР: в 30 т. / под ред. В.Л. Комарова. – М. – Л.: Изд–во АН СССР, 1961. – Т. 25. – 630 с.

155

69. ФС 42-2777-91. Трава золотарника канадского / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 09.07.91. – М., 1991. – 6 с. 70. Фурст, Г.Г. Методы анатомо–гистохимического исследования растительных тканей / Г.Г. Фурст. – М.:Наука, 1979. – 155 с. 71. Химический анализ лекарственных растений/ под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. – М.: Высш.шк., 1983. – 145 с. 72. Химический анализ лекарственных растений / Ладыгина Е.Я. [и др.]. – М.: Высш. шк., 1983. – 176 с. 73. Черепанов, С. К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР) / С. К. Черепанов. – СПб.: Мир и семья, 1995. – 992 с. 74. Шаламова, Г.Г. Неуглеводная часть полисахаридного комплекса Solidago virgaurea L. / Г.Г. Шаламова, П.А. Пыченкова // Химия природ. соединений. – 1982. – №3. – С. 284 — 286. 75. Шаршунова, М.А. Тонкослойная хроматография в фармации и клиниче- ской биохимии / М.А. Шаршунова, В.В. Шварц, Ч.П. Михалец. – М.: Мир, 1980. – Т.2. – 535 с. 76. Шуклин, Ю.И. Рост и развитие золотарника канадского при возделывании в нечерноземной зоне России / Ю.И. Шуклин // Достижения науки и агро- техники. – 2008. – № 3. – С. 25 – 27. 77. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения / под ред. Г. П. Яковлева, К. Ф. Блиновой. — СПб.: СпецЛит, 2002. — 410 с. 78. Яковлев, А.И. Полисахариды Solidago virgaurea / А.И. Яковлев, П.А. Пыченкова // Химия природ. соединений. – 1981. – № 6. – С. 790 – 791. 79. A new kaempferol trioside from Solidago altissima L. / J. Haili [et al.] // J. of Natural Medicines. – 2007. – Vol. 61, № 3. – Р. 351–354. 80. Absolute structure of eremophilenolide from Solidago dahurica / K. Kojima [et al.] // Chem. and Pharm. – 1997. – Vol. 45, № 11. – P. 1875 – 1876.

156

81. Amino acid analysis by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Automatic precolumn derivatization which activated carbamate reagent / K. Iwaki [et al.] // J. Chromatogr. – 1987. – Vol. 407, N 2. – P. 273-279. 82. Anthonsen, T. The constitution of diterpenoids from Solidago elongata Nutt / Т. Anthonsen , R. Mclrindle // Acta Chem Scand. – 1969. – Vol. 23, № 3. – Р. 1068–1070. 83. Antineoplastic activity of Solidago virgaurea on prostatic tumor cells in an SCID mouse model / S. C. Gross [et al.] // Nutr. Cancer. – 2002. – Vol. 43. – P. 76–81. 84. Aubel, M. T. Effects of pretreatment on the enantioselectivity of silicabound proteins used as HPLC stationary phases / M. T. Aubel, L. B. Rogers // J. Chromatogr. – 1987. – Vol. 408, N 3. – P. 9-13. 85. Bader, G. Virgaureasaponin 3, А, 3, 28–bisdesmosidic triterpenoid saponin from Solidago virgaurea / G. Bader, V. Wray, K. Hiller // Phytochemistry. – 1992. – Vol. 31, № 2. – Р. 621–623. 86. Bayogenin – ein Saponin in Solidago canadensis L./ M. Murach [et al.] // Pharmazie. – 1975. – Vol. 30, № 9. – S. 619 – 620. 87. Bjorkman, O. Polyphenols and polyphenoloxidases in leaves of Solidago virgaurea L. / O. Bjorkman, P. Holmgren // Physiol. plant. – 1960. – Vol. 13. – P. 582 – 594. 88. Bohlmann, F. Aromatic esters from Solidago drcurrens / F. Bohlmann, Z.L. Chen, A. Schuster // Phytochemistry. – 1981. – Vol. 20, №11. – Р. 2601–2602. 89. Bopp, M. Die amerikanischen Goldruten Solidago canadensis L. und S. gigantea Ait. als Neophyten in Mitteleuropa: Besiedlung durch Insekten / М. Bopp // Gottinger Naturkundl. Schriften. – 1997. – № 4. – S. 181–206. 90. British Pharmacopoeia [Электронный ресурс]. – 2009. – Режим доступа: ttp://www.pharmacopoeia.co.uk/2009/. – Загл. с экрана.

157

91. Capek, M. The possibility of biological control of imported weeds of the genus Solidago L. in Europe / М. Capek // Acta Institutionalis Forestalis Zvolensis. – 1971. – № 9. – Р. 429–441. 92. Characterization of acetylenes and terpenoids isolated from Solidago altissima L. / A. Sawabe [et. al.] // Bull. Inst. Compr. Arg. Sci. Kinki Univ. – 2000. – № 8. – Р. 81 – 88. 93. Chemical composition and antimicrobial activity of Solidago canadensis L. root essential oil / D. Mishra [et al.] // J. of Basic and Clinical Pharmacy. – 2010. – Vol. 1, № 3. – Р. 187–190. 94. Chemical composition, analgesic and antimicrobial activity of Solidago canadensis essential oil from India / D. Mishra [et al.] // J. of Pharmacy Recearch. – 2011. – Vol. 4, № 1. – Р. 63–66. 95. Choi, S.Z. Phytochemical constituents of the aerial parts from Solidago virgaurea var. gigantean / S.Z. Choi, S.U. Choi, K.R. Lee // Arch Pharm Res. – 2004. – Vol. 27, № 2. – Р. 164–168. 96. Clerodans from Solidago virgaurea L. / A. Goswami [et al.]. // Phytochemistry. – 1984. – № 4. – P. 834 – 841. 97. Composition and antifungal activity of the essential oil of Solidago chilensis / R . Vila [et al.] // Planta Med. – 2002. – Vol. 68, № 2. – Р. 164–167. 98. Constituents of the essential oil of Solidago gigantea Ait. (giantgoldenrod) / D. Kalemba [et al.] // Flavour Fragrance J. – 2001. – Vol. 16, № 1. – Р. 19–26. 99. Cytotoxic constituents from Solidago virga–aurea var. gigantea MIQ / J.H. Sung [et al.] // Arch Pharmacal Res. – 1999. – Vol. 22, № 6. – Р. 633–637. 100. Cytotoxicity of triterpenoid saponins. Part 1: Activities against tumor cells in vitro and hemolytical index / B. Plohmann [et al.] // Pharmazie. – 1996. – Vol. 51, № 6. – Р. 414–417. 101. Demir, H. Antioxidant and antimicrobial activities of Solidago virgaurea extracts / H. Demir [et al.] // African J. of Biotechnology. – 2009. – Vol. 8, № 2. – Р. 274–279.

158

102. Diterpenes from Solidago rugosa / T. Lu [et al.] // Phytochemistry. – 1995. – Vol. 38, № 2. – Р. 451–456. 103. Duarte, J. Vasodilatory effects of flavonoids in rat aortric smooth muscle. Struc- ture–activity relationship / J. Duarte // Gen. Pharmac. – 1993. – Vol. 24. – P. 857–862. 104. Effect of weather conditions on the growth of Solidago gigantea / Z. Botta– Dukat [et al.] // Plant Invasions: Species Ecology and Ecosystem Management. – 2001. – Р. 185–197. 105. Enzymatic hydrolysis of the cytotoxic triterpenoid glycoside virgaureasaponin 1. / G. Bader [et al.] // Phytochemistry. – 1998. – Vol. 49. – P. 153–156. 106. Epi–Cubebanes from Solidago Canadensis / Kasali [et al.] // Photochemistry. – 2002. – Vol. 59, № 8. – Р. 805–810. 107. Ethnomedicinally selected plants as sources of potential analgesic compounds: indication of in vitro biological activity in receptor binding assays / J.H. Sampson [et al.] // Phytothe. Re. – 2000. – Vol. 14. – P. 24–29.

108. European Pharmacopoeia [Электронный ресурс]. – 2008. – 6th ed. – Режим доступа: http://www.edgm.eu. – Загл. с экрана. 109. Evaluation of an extract of Brazilian arnica (Solidago chilensis Meyen, Asteraceae) in treating lumbago / A.G. Silva [et al.] // Phytother Res. – 2010. – Vol. 24, № 2. – Р. 283–287. 110. Evaluation of antimicrobial and antiplatelet aggregation effects of Solidago chilensis Meyen / Liz Rafael [et al.] // International J. of Green Pharmacy. – 2009. – Vol. 3, № 1. – Р. 35–39. 111. Evaluation of gastroprotective activity and acute toxicity of Solidago chilensis Meyen (Asteraceae) / А. Bucciarelli [et al.] // Pharm Biol. – 2010. – Vol. 48, № 9. – Р. 1025–1030. 112. Flora Europaea / T.G. Tutin [et al.] // Cambridge University Press. – 1964. –№ 4. – Р. 215 – 220.

159

113. Gerlach, H. Uber einige Inhaltsstoffe aus verschiedenen Solilago–Arten / H. Gerlach. // Herba pol. – 1972. – Vol. 18. – S. 155 – 159. 114. Hiller, K. Flavonoids of Solidago virgaurea L. var. leicarpa (Benth) A.Gray / К. Hiller, R. Gil–Rjong, А. Otto // Pharmazie. – 1979. – Vol. 34, № 9. – Р. 571– 572. 115. Hiller, K. A saponin from Solidago decurrens / К. Hiller, R. Gil–Rjong, P. Franke // Pharmazie. – 1979. – Vol. 34, № 5–6. – Р. 360–361. 116. Hiller, K. Isolierung von Bayogenin–Glycosiden aus Solidago canadensis L. / K. Hiller, C. Hein, P. Franke // Pharmazie. – 1983. – Vol. 38, № 1. – S. 73. 117. Hiller, K. Virgaureasaponin, ein neues bisdesmosidisches Triterpensaponin aus Solidago virgaures L. / K. Hiller, G. Bader, Schulten H.–R. // Pharmazie. – 1987. – Vol. 42, № 8. – S. 795–796. 118. Hiller, K. Virgaureosid A – a new bisdesmosidic phenol glycoside from Solidago virgaurea L. / K. Hiller, G. Dube, D. Ziegan // Pharmazie.– 1985. – Vol. 40, № 11. – S. 795 – 796. 119. Hiller, K. Zur qantitativen Verteilung der Phenolglecoside Virgaureosid A und Leiocarposid in Solidago virgaurea L. / K. Hiller, G. Fotsch // Pharmazie.– 1986. – Vol. 42, № 6. – S. 415 – 416. 120. Huneck, S. Inhaltsstoffe weitere Compositen aus der Mongolei / S.Huneck, H. Knapp // Pharmazie. – 1986. – № 9. – S. 673. 121. Immunomodulatorische und antitumorale Aktivitat von Triterpensaponined aus Solidago virgaurea L. / B. Plohmann [et al.] // Drogenreport. – 1999. – № 12. – Р. 29–30. 122. Immunomodulatory and antitumoral effects of triterpenoid saponins / B. Plohmann [et al.] // Pharmazie. – 1997. – №12. – Р. 953 – 957. 123. Infuence of the crude aqueous extract of Solidago microglossa DC on the in vitro dissolution of rat blood clots / A.S.C. Borges [et al.] // Asian J. of Tradi- tional Medicines. – 2008. – Vol. 3, № 6. – Р. 238 – 243.

160

124. Isolation and structure elucidation of further saponins from Solidago Canadensis / G. Reznicek [et al.] // Planta Med. – 1992. – Vol. 58, № 1. – Р. 94–98. 125. Jacker, H.J. Zum antiexsudativen Verhalten einiger Triterpensaponine / H.J. Jacker, G. Voigt, K. Hiller // Pharmazie. – 1981. –Vol. 37. – S. 380–382. 126. Jakobs, G. Introduced plants of the invasive perennial Solidago gigantea are larger and grow denser than conspecifics in the native range / G. Jakobs, Е. Weber, P.J. Edwards // Diversity Distributions. – 2004. – № 10. – Р. 10–19. 127. Kasprzyk, Z. Distribution of sterols and triterpenic alcohols in plants of the Compositae family / Z. Kasprzyk, T. Kozierowska // Bull. Acad. pol. sci. boil. – 1966. – Vol 14, № 9. – P. 645 – 649. 128. Kolodziej, B. Antibacterial and antimutagenic activity of extracts aboveground parts of three Solidago species: Solidago virgaurea L., Solidago canadensis L. and Solidago gigantea Ait. / B. Kolodziej, R. Kowalski, B. Kedzia // J. of Me- dicinal Plants Research. – 2011. – Vol. 5, № 31. – Р. 6770–6779. 129. Lam, J. Polyacetylenes of Solidago virgaurea: their seasonal variation and NMR long-range spin coupling constants / J. Lam // Phytochemistry. – 1973. – Vol. 10, № 3. – P. 647 – 653. 130. Lendl, А. Two New Saponins from Solidago gigantea / А. Lendl, G. Reznicek // Scientia Pharmaceutica . – 2007. – № 75. – Р. 111–120. 131. Melzig, M.F. Neue Aspekte zum Verständnis des Wirkungsmechanismus der aquaretischen Wirkung von Birkenblättern und Golrutenkraut / M.F. Melzig, H. Major // Z. Phytother. – 2000. – T. 21. – S. 193–196. 132. Metzner, J. Antiphlogistic and analgesic effects of leiocarposide, a phenolic bisglucoside of Solidago virgaurea L. / J. Metzner, R. Hirschelmann, K. Hiller // Pharmazie. – 1984. – Vol. 39, № 12. – Р. 869–870. 133. Meyer, A.H. Experimental demography of rhizome populations of establishing clones of Solidago altissima / А.Н. Meyer, В. Schmid // J. Ecol. – 1987. – Vol. 15. – Р. 42–54.

161

134. Michael, J. Constituents of the essential oil of Solidago odora Ait. / J. Michael // Economic Botany. – 1999. – Vol. 53, № 3. – Р. 281–283. 135. Miyase, T. Studies on the Constituents of Solidago virgaurea L. Ⅲ. Structures of Solidago saponins XXI–XXIX / Т. Miyase, Y. Inose, А. Ueno // Chem Pharm Bull. – 1994. – Vol. 42, № 3. – Р. 617–624. 136. New lupane triterpenoids from Solidago canadensis that inhibit the lyase activity of DNA polymerase–beta / V.S. Chaturvedula [et al.] // Bioorg Med Chem. – 2004. – Vol. 12, № 23. – Р. 6271–6275. 137. Okpanyi, S.N. Antiinflammatory, analgesic and antipyretic activities of dried extract op Populus tremula, Solidago virgaurea and Flaxinus excelsior / S.N. Okpanyi, M. Arens–Correl // Eur. J. Pharmacol. – 1990. – Vol. 183, № 6. – P. 2276 – 2277. 138. Okpanyi, S.N. Antiphlogistische, analgetische und antipyretische Wirkung un- terschiedlicher Pflanzenextrakte und deren Kombination im Tiermodell / S.N. Okpanyi, R. Schirpke–von Panczensky, D. Dickson // Arzneim–Forsch/Drug Res. – 1989. – Vol. 39. – S. 698–703. 139. Pepeljnjak, S. Investigation of the antimycotic activity of Solidago virgaurea and Solidago gigantea extracts / S. Pepeljnjak, D. Kustrak, I. Vukusic // Pharm. Pharmacol. Lett. – 1998. – Vol. 8. – P. 85–86. 140. Polyacetylenes and diterpenes from Solidago canadensis / L. Tiansheng [et al.] // Phytochemistry. – 1993. – Vol. 32, № 6. – Р. 1483-1488. 141. Quantitative determination of leiocarposide in Solidago virgaurea L. / G. Bader [et al.] // Pharmazie. – 1990. – Vol. 45, № 5. – Р. 380–381. 142. Radikal–scavenging properties of the antirheumatic phytomedicine STW 1 and its components / I. Germann [et al.] // Naunyn–Schmiedeberg’s Arch Pharmacol. – 2005. – № 371. – Р. 26. 143. Ravichandiran, V. In vitro anti–cancer activity of Solidago canadensis L. / V. Ravichandiran, N. Deepa // International J. of Research in Pharmaceutical Sci- ences. – 2012. – Vol.3, №1. – P. 158 – 162.

162

144. Reznicek, G. Four major saponins from Solidago Canadensis / G. Reznicek, J. Jurenitsch, M. Plasun // Phytochemistry. – 1991. – Vol. 30, № 5. – Р. 1629– 1633. 145. Schilcher, H. Uber das Vorkommen von Flavonoiden und Hydroxyzimtsauren in Solidago virgaurea L. und S. serotina Ait. / H. Schilcher // Naturwissenschaften. – 1964. – Vol. 51. – S. 636. 146. Schilcher, H. Nachweis der aquaretischen Wirkung von Birkenblätter und Gold- rutenauszügen im Tierversuch / H. Schilcher, H. Rau // Urologe. – 1988. – Vol. 28. – S. 274–280. 147. Schmeda–Hirschmann, G. Gastroprotective activity of the diterpene solidagenone and its derivatives on experimentally induced gastric lesions in mice / G. Schmeda–Hirschmann, J. Rodrigueez, L. Astudillo // J. Ethnopharmacol. – 2002. – Vol. 81. – P. 111–115. 148. Sinner, M. The chromatographic behavior of polysaccharides / M. Sinner, J.J. Puls // J. Chromatogr. – 1978. – Vol. 156, № 1. – Р. 194–204. 149. Skrzypczakowa, L. Flawonoidy w nawloci pospolitej – Solidago virgaurea L. / L. Skrzypczakowa // Acta pol. pharm. – 1969. – Vol. 19, № 6. – S. 481 – 490. 150. Strehl, E. Inhibition of dihydrofolate reductase activity by alcoholic extracts from Fraxinus excelsior, Populus tremula and Solidago virgaurea / E. Strehl, W. Schneider, E.F. Elstner // Arzneimittelforschung. – 1995. – Vol. 45, № 2. – Р. 172–173. 151. Studies Related to Naturally Occurring Acetylene Compounds. IX. The Occur- rence of Methyl des-8cis-en4:6-diynoate (=α,β-Dihydro-Matricaria Ester) and 2-cis; 8-trans-Matricaria Ester in Nature / K. S. Baalsrud [et al.] // Acta Chemica Scandinavica. – 1956. – N 6. – P. 883-892. 152. Tamas, M. Saponins from species of Solidago growing in Romania / М. Tamas, М. Rosea // Pharmazie. – 1988. – Vol. 36, № 3. – Р.167–171. 153. Tao, J.I.A.N.G. A survey of chemical and pharmacological studies on Solidago / J.I.A.N.G. Tao, H.U.A.N.G. Bao–Kang, Q.I.N. Lu–Ping // J. of Chinese Integrative Medicine. – 2004. – Vol. 4, № 4. – Р. 430–435.

163

154. The anti–inflammatory modulatory role of Solidago chilensis Meyen in the mu- rine model of the air pouch / R. Liz [et al.] // Pharm Pharmacol. – 2008. – Vol. 60, № 4. – Р. 515–542. 155. Thiem, B. Phenolic compounds in two Solidago L. species from in vitro culture / В. Thiem, М. Wesolowska // Acta Poloniae Pharmaceutica. – 2001. – Vol. 58, № 4. – Р. 277–281. 156. Wagener, H.H. Zur Pharmakologie eines Solidago–Extrakt–haltigen Venenmit- tels / H.H. Wagener // Arzneimittelforschung. – 1966. – Vol. 16. – S. 859–866. 157. Wagenitz, G. Solidago L. / G. Wagenitz, G. Hegi // Illustrierte Flora von Mitteleuropa. – München, 1979. – Р. 16–29. 158. Weber, E. Current and potential ranges of three exotic goldenrods (Solidago) in Europe / Е. Weber // Conserv. Biol. – 2001. – № 15. – Р. 122–128. 159. Weber, E. Biological flora of central Europe: Solidago gigantean Aiton. / E. Weber, G. Jacobs // Flora. – 2005. – Vol. 200, №2. – Р. 109–118. 160. Weber, E. Latitudinal population differentiation in two species of Solidago (Asteraceae) introduced into Europe / E. Weber, B. Schmid // American J. of Botany. – 1998. – Vol. 85, №8. – Р. 1110–1121. 161. Werner, P. The biology of Canadian weeds: Solidago canadensis L. / Р. Werner, J. Bradbury, R. Gross // Canadian J. of Plant Sciences. – 1980. – № 60 – Р. 1393–1409. 162. Werner, P.A. Ecological relationships of cooccurring goldenrods (Solidago – Compositae) / Р.А. Werner, W.J. Platt // Am. Nat. – 1976. – № 110. – Р. 959– 971. 163. Xia, W.X. The constituents of the essential oil from Solidago Canadensis / W.X. Xia, W. He, G.Y. Wen // Chin Bull Bot. – 1999. – Vol. 16, № 2. – Р. 178– 180. 164. Zur Kenntnis der Saponine der Gattung Solidago / K. Hiller [et al.] // Pharmazie. – 1975. – Vol. 30, № 3. – S. 188 – 189.