CAPÍTULO 5. ATRACTABILIDAD Y PALATABILIDAD DE INGREDIENTES EN LANGOSTINOS Macrobrachium Tenellum

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La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos que posteriormente quiera darle a la misma.

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Centro Universitario de la Costa

Calidad de ingredientes proteínicos y actividad enzimática digestiva en Macrobrachium tenellum

Tesis que para obtener el grado de

Doctora en Ciencias en Biosistemática, Ecología y Manejo de Recursos Naturales y Agrícolas

Presenta Cynthia Eugenia Montoya Martínez

Puerto Vallarta, Jalisco 6 de noviembre de 2018

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Centro Universitario de la Costa

Calidad de ingredientes proteínicos y actividad enzimática digestiva en Macrobrachium tenellum

Tesis que para obtener el grado de

Doctora en Ciencias en Biosistemática, Ecología y Manejo de Recursos Naturales y Agrícolas

Presenta Cynthia Eugenia Montoya Martínez

DIRECTOR Fernando Vega Villasante

CODIRECTOR Héctor Nolasco Soria

Puerto Vallarta, Jalisco 6 de noviembre de 2018

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Centro Universitario de la Costa

Doctorado en Ciencias en Biosistemática, Ecología y Manejo de Recursos Naturales y Agrícolas

Calidad de ingredientes proteínicos y actividad enzimática digestiva en Macrobrachium tenellum

Por Cynthia Eugenia Montoya Martínez

Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de:

Doctora en Ciencias en Biosistemática, Ecología y Manejo de Recursos Naturales y Agrícolas

Aprobado por:

______15 de octubre del 2018 Dr. Fernando Vega Villasante Fecha Director de Tesis e integrante del Jurado

______15 de octubre del 2018 Dr. Héctor Nolasco Soria Fecha Co-director de Tesis e integrante del Jurado

______15 de octubre del 2018 Dr. Carlos Alfonso Álvarez González Fecha Asesor del Comité Particular e integrante del Jurado

______15 de octubre del 2018 Dr. Daniel Badillo Zapata Fecha Integrante del Jurado

______15 de octubre del 2018 Dr. Adrián Tinto Gómez Fecha Integrante del Jurado

______15 de octubre del 2018 Dra. Alma Paola Rodríguez Troncoso Fecha Coordinadora de la Orientación en Investigaciones Costeras

DEDICATORIA

A los todos los que han iluminado mi camino y me han mostrado lo importante en la vida

AGRADECIMIENTOS Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo otorgado (Registro No. 554124) y al Centro Universitario de la Costa (CUCOSTA) de la Universidad de Guadalajara por ayudar a la realización de esta investigación y a mi formación profesional a lo largo de mis estudios.

A la coordinación del doctorado en ciencias BEMARENA, Dra. Laura Guzmán, Dr. Luis Manuel Martínez, Dr. Pedro Medina, Dra. Paola Rodríguez y a Citlalit Ávalos por hacer magia para que todos los trámites fluyeran sin contratiempos. A todos los profesores, técnicos y alumnos del CIBNOR, La Paz, B.C.S., en especial a los compañeros del laboratorio de Fisiología Comparada y Genómica Funcional y a la Biol. Patricia Hinojosa que me brindaron su tiempo, conocimiento y compañía en las extenuantes jornadas de laboratorio. A mis compañeros y amigos del laboratorio de Calidad de Agua y Acuicultura Experimental del CUCOSTA por su apoyo, motivación, alegría y todas las vivencias compartidas en esta aventura académica.

Mi más sincero agradecimiento a los doctores que gentilmente aceptaron ser parte de mi comité: Dr. Héctor Nolasco, Dra. Olimpia Carrillo, Dr. Alfonso Álvarez, Dr. Roberto Civera, por su invaluable ayuda, conocimiento, guía, orientación y valiosas contribuciones que enriquecieron este trabajo. Muy en especial a mi director el Dr. Fernando Vega por su voto de confianza, su ejemplo, paciencia, apoyo; pero, sobre todo, por su amistad y esa visión en donde el conocimiento, el trabajo arduo y la pasión por cambiar la realidad de nuestro país son el motor para hacer ciencia.

A la fuerza creadora por la vida y la fortaleza. A todos mis hermanos por alentarme a nunca dejar de ser mejor persona, aquellos que me ofrecieron su amistad enriqueciendo mi vida a lo largo de este camino rojo.

A mi familia por su apoyo incondicional. A mis hijos y esposo por apoyarme y aguantarme en los momentos difíciles, pero sobre todo por exhortarme a continuar cuando pensaba que ya no era posible, este logro es de ustedes.

Sin ustedes esto no se hubiera podido concretar, mil gracias.

ÍNDICE DE FIGURAS ...... vi

ÍNDICE DE TABLAS ...... viii

RESUMEN ...... x

ABSTRACT ...... xii

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN ...... 1

1.1 Los camarones de agua dulce del género Macrobrachium ...... 2

1.2 Aspectos ecológicos de Macrobrachium ...... 2

1.3 Nutrición ...... 4

1.4 Importancia de la composición química de los alimentos y su digestibilidad ...... 6

1.5 Enzimas digestivas descritas en el género ...... 7

1.5.1 Estudios de caracterización y purificación de enzimas ...... 8

1.5.2 Estudios descriptivos sobre el tipo y actividad enzimática ...... 8

1.5.3 Influencia de algunos factores en las enzimas digestivas ...... 10

1.6 Condiciones de digestión en los langostinos ...... 12

1.7 Digestibilidad aparente de proteínas, lípidos y polisacáridos y métodos alternativos 14

1.8 Digestibilidad in vitro de proteínas, lípidos y polisacáridos en langostinos ...... 16

1.9 Estimulantes alimenticios ...... 17

1.10 Hipótesis ...... 18

1.11 Objetivo general ...... 18

1.12 Objetivos específicos ...... 18

1.13 Estructura del documento ...... 19

CAPÍTULO 2. CÓMPUTO QUÍMICO DE DIFERENTES FUENTES PROTEÍNICAS PARA Macrobrachium tenellum ...... 22

ABSTRACT ...... 23

RESUMEN ...... 24

iii

INTRODUCTION ...... 24

MATERIALS AND METHODS ...... 26

RESULTS ...... 27

DISCUSSION ...... 27

REFERENCES ...... 31

CAPÍTULO 3. DIGESTIBILIDAD PROTEICA in vitro DE INGREDIENTES DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL PARA Macrobrachium tenellum ...... 43

ABSTRACT ...... 44

RESUMEN ...... 45

INTRODUCTION ...... 45

MATERIALS AND METHODS ...... 46

RESULTS ...... 49

DISCUSSION ...... 49

REFERENCES ...... 53

CAPÍTULO 4. EFICIENCIA DE SISTEMAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ATRACTABILIDAD DE ALIMENTOS E INGREDIENTES EN Macrobrachium tenellum ...... 60

ABSTRACT ...... 61

RESUMEN ...... 62

REFERENCES ...... 68

CAPÍTULO 5. ATRACTABILIDAD Y PALATABILIDAD DE INGREDIENTES EN LANGOSTINOS Macrobrachium tenellum ...... 73

ABSTRACT ...... 74

RESUMEN ...... 75

REFERENCES ...... 81

CAPÍTULO 6. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE PROTEASAS, AMILASAS Y LIPASAS DE Macrobrachium tenellum ...... 86

RESUMEN ...... 87

INTRODUCCIÓN ...... 88

MATERIALES Y MÉTODOS ...... 89

RESULTADOS ...... 93

DISCUSIÓN ...... 93

REFERENCIAS ...... 97

CAPÍTULO 7. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES GENERALES ...... 108

LITERATURA CITADA ...... 115

ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Capítulo 1 20 Figura 1. Anatomía de un reproductor macho de Macrobrachium americanum. Modificado de Hernández-Valencia (2010). 20 Figura 2. Macho adulto de Macrobrachium tenellum. Capítulo 3 59 Figura 1. Relative digestibility of ingredients for M. tenellum. The digestibility of Casein Hammerstein type was considered as 100% (0.0068 µmol of peptide bonds hydrolyzed per min). Bars represent ± SEM. Columns with differing letters are significantly different (P< 0.05). Capítulo 4 71 Figura 1. a) Y type maze system with the representation of the hit, b) barriers used in the experiment (from left to right): mesh with entrance, acrylic with entrance, and acrylic without entrance. 71 Figura 2. Rectangular type maze systems used in the third and fourth bioassay. a) According to Jaime-Ceballos et al. (2006), to start the test, the feed is randomly placed in right or left section, b) according to Suresh et al. (2011), to start test, feed is placed in section A, then the gate between R and N sections is removed. Capítulo 5 84 Figura 1. Y type maze system used in the evaluation of attractability by ingredient chemodetection. 85 Figura 2. Attractability phase in the second bioassay. a) Time required for the first prawn to enter A or B region. b) Total of prawns which entered the area where the ingredient was present. Different letters on the bars, indicate significant differences (P < 0.05). 85 Figura 3. Palatability phase in the second bioassay. a) Time for the first prawn to have contact with the ingredient. b) Total of prawns which have contact with the ingredient. c) Time prawns feed (for 15 min). Different letters on the bars indicate significant differences (P < 0.05).

Capítulo 6 107 Figura 1. Electroforesis de proteínas y actividad proteasa, amilasa y lipasa en geles de poliacrilamida en gradiente (4-20%) en condiciones nativas de extractos enzimáticos de tres adultos M. tenellum. Marcador molecular (M) en kDa; Estómagos (E); Glándulas (G). Las líneas horizontales destacan el lugar de acción de la enzima.

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ÍNDICE DE TABLAS Capítulo 1 21 Tabla 1. Enzimas digestivas encontradas con diferentes sustratos específicos y/o inhibidores en especies de Macrobrachium. Capítulo 2 36 Tabla 1. Profile of essential amino acid (EAA) of protein ingredients used (g amino acids per 100 g protein). *I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V; II García- Galano et al. (2007); III USDA; IV García-Ortega et al. (1998). 37 Tabla 2. First and second limiting EAA of each protein ingredients evaluated for Macrobrachium species. *1 first limiting EAA, 2 second limiting EAA. - not limiting EAA. 38 Tabla 3. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. amazonicum postlarvae muscle (Portella et al., 2013) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007). 39 Table 4. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. rosenbergii larvae muscle (Roustaian et al., 2000) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V; II García-Galano et al. (2007). 40 Tabla 5. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. rosenbergii juvenile muscle (Tidwell et al., 1998) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V; II García-Galano et al. (2007). 41 Tabla 6. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. americanum juvenile muscle (Yamasaki, 2012) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V; II García-Galano et al. (2007). 42 Tabla 7. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. tenellum adults muscle (Espinosa et al., 2013) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V; II García-Galano et al. (2007).

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Capítulo 3 58 Tabla 1. Proximal composition of ingredients. 58 Tabla 2. Digestive enzyme activity (average ± SE) in M. tenellum. Capítulo 4 72 Tabla 1. Comparation of attractability values (Average ± SE) between tested maze systems. Capítulo 5 84 Tabla 1. Proximal composition of ingredients. Capítulo 6 104 Tabla 1. Peso del cuerpo y de las partes del tracto digestivo (g) e índice hepatosomático (%) de los langostinos M. tenellum. 105 Tabla 2. Concentración de proteína y actividad enzimática digestiva en el estómago, glándula digestiva e intestino de M. tenellum de diferentes pesos.

RESUMEN La producción de alimentos para la acuicultura requiere de la búsqueda de otras fuentes o ingredientes proteínicos como alternativas potenciales en la formulación de piensos para la acuicultura, debido a la escasez y el alto precio de las fuentes de proteínas que se utilizan con mayor frecuencia. El objetivo de esta investigación fue evaluar la calidad de diversos ingredientes con diferentes porcentajes de proteína cruda utilizados en la elaboración de alimentos para crustáceos, mediante el cómputo químico, la estimación in vitro de la digestibilidad alcalina usando extractos multienzimáticos mediante el método pH stat y evaluación de su atractabilidad y palatabilidad en langostinos Macrobrachium tenellum, además de determinar la actividad enzimática digestiva del estómago, glándula digestiva e intestino de langostinos de diferentes pesos. En la evaluación de ingredientes proteínicos con la estimación del cómputo químico, los aminoácidos lisina, treonina y metionina se presentan como los primeros aminoácidos limitantes de la calidad de la proteína en la mayoría de las fuentes evaluadas en M. tenellum. Las mayores digestibilidades relativas de proteína la presentaron: la harina de Spirulina, harina de cerdo y la harina de pluma, las más bajas digestibilidades se encontraron en harina de soya, harina de garbanzo y la harina de pescado. Para la evaluación de la atractabilidad en el acuario tipo laberinto Y, es necesario si se van a usar barreras elaborarlas con un material opaco (provocando un comportamiento normal menos perturbador), otra opción es no usar barreras, pero utilizar algún contenedor para el alimento que permita la dispersión de los compuestos químicos atrayentes. En la evaluación de la atractabilidad y palatabilidad en el acuario tipo laberinto Y, se encontraron diferencias significativas, evidenciando que la harina de cerdo, pescado, pluma y camarón presentan mayor atractabilidad por el número de langostinos que atrajeron, además los resultados muestran diferencias significativas en la palatabilidad, la harina de pescado, harina de camarón y harina de cerdo estimularon la alimentación de un mayor número de organismos y además, promovieron un mayor tiempo de consumo. Los resultados de las actividades enzimáticas digestivas muestran que la actividad específica y la actividad total amilasa, proteasa y lipasa en la GD muestran variaciones, en donde las actividades (U de enzima por mg de proteína y U de enzima por órgano) fueron significativamente mayores en los langostinos más grandes (grupo 7) en comparación de los

más pequeños (grupo 1). El porcentaje de la actividad total de proteasas y amilasas mostró diferencias significativas solo en el intestino de los langostinos de diferentes pesos. La combinación de estudios de la calidad proteica por medio del cómputo químico, las pruebas de digestibilidad in vitro, la atractabilidad y palatabilidad de ingredientes, junto con los estudios de actividad enzimática, pueden contribuir al diseño de formulaciones adecuadas para el cultivo intensivo de M. tenellum.

ABSTRACT Feed production for aquaculture requires finding other protein sources or ingredients as potential alternatives in the formulation of aquaculture feeds, due to the shortage and high price of protein sources that are most commonly used. The objective of this research was to evaluate the quality of protein ingredients with different percentages of crude protein used in the elaboration of diets for crustaceans, by means of the chemical score, the estimation of in vitro digestibility using the pH stat method from digestive multienzymatic extracts and evaluation of its attractability and palatability in Macrobrachium tenellum, in addition to determining the digestive enzymatic activity of the stomach, hepatopancreas and intestine of prawns of different weights. In the evaluation of protein ingredients with the estimation of the chemical score, the amino acids lysine, threonine and methionine are presented as the first amino acids limiting the quality of the protein in most of the ingredients evaluated in M. tenellum. The highest relative digestibility was found in: Spirulina meal, following by pork meal, and feather poultry meal, the lowest digestibilities were found in soybean meal, chickpea meal, and fish meal. For the evaluation of atractability in a Y type maze system, if barriers are to be used, is necesary elaborating it with an opaque material (causing normal behavior less disturbing), another option is not to use barriers, however, to use a container for feed which allows the dispersion of attractive chemical compounds. In the evaluation of the atractability and palatability in the Y type maze system, significant differences were found, showing that pork meal, fish meal, feather meal and shrimp meal have greater attractability due to the number of prawns attracted, results also show significant differences in palatability, where fishmeal, shrimp meal and pork meal stimulating a higher number of organisms and promoting a longer consumption time. The results of the digestive enzymatic activities show that the specific activity and the total activity of amylase, protease and lipase in the GD show variations, where the activities (U enzyme per mg protein and U enzyme per organ) were significantly higher in the larger prawns (group 7) compared to the smaller ones (group 1). The percentage of the total activity of proteases and amylases showed significant differences only in the intestine of prawns of different weights. The combination of enzymatic characterization studies, with the evaluation of the protein quality by means of the chemical score, in vitro digestibility assays, the attraction and

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palatability are an important tool for selection of ingredients that can be used for the manufacture of an artificial diet for the culture of this species.

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CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

Adaptado de:

y de:

Estudios sobre enzimas digestivas y digestibilidad de alimentos en langostinos del género Macrobrachium Montoya-Martínez C., Vega-Villasante F., Nolasco-Soria H., Álvarez- González, C.A., Carrillo-Farnés, O. & Civera-Cerecedo, R.

1.1 Los camarones de agua dulce del género Macrobrachium El suborden Caridea se compone de aproximadamente 2,500 especies distribuidas en 21 familias que habitan prácticamente en todos los cuerpos acuáticos del planeta (De Grave et al., 2008). En particular, los langostinos de la familia Palaemonidae son los crustáceos más diversos dentro del orden Decápoda (Hernández-Sandoval, 2008). Después de los Atydae, los Palaemonidae más abundantes pertenecen a la subfamilia Palaemoninae, siendo el género más diverso Macrobrachium (De Grave et al., 2008), coloquialmente llamados langostinos, camarones, acamayas, cauques o gambas, dependiendo de la región. Este género lo integran al menos 238 especies que se distribuyen en la franja tropical y subtropical de todo el mundo (De Grave et al., 2009 en Bauer, 2011). De los camarones de agua dulce nativos de América existen 26 cuya distribución comprende desde Baja California, hasta el Perú, incluidos Brasil y Argentina. En México, se han identificado 17 especies y cinco son de importancia económica: M. carcinus, M. olfersi y M. achantarus en la costa del Atlántico, y M. tenellum y M. americanum en la costa del Pacífico (Vega-Villasante et al., 2011a). Algunas de estas especies tienen alto valor económico y alimenticio dado por su sabor, alto contenido en proteínas y atractivo visual (Kent, 1995). A nivel mundial este mercado es abastecido principalmente por Macrobrachium rosenbergii, especie asiática que se produce en países como la India, China y Tailandia y desde donde se distribuye principalmente a Europa, Asia y Norteamérica (New, 2009). En torno a la acuicultura de estas especies, después de la disminución y cierre de proyectos del cultivo del langostino malayo M. rosenbergii, se ha contemplado la posibilidad de intensificar los estudios orientados a la domesticación y producción en estanques de las especies de langostino nativas (Ponce-Palafox et al., 2002).

1.2 Aspectos ecológicos de Macrobrachium El género Macrobrachium se distingue de otros palemónidos por los siguientes rasgos: tiene el cuerpo dividido en tres secciones principales: la cabeza, el tórax y abdomen (Figura 1). La cabeza y el tórax se unen para formar un cefalotórax, que contiene el rostro, los ojos, las mandíbulas, flagelos, además de 5 pares de patas caminadoras (pereiópodos), donde el segundo par de pereiópodos se modifican en quelas. El abdomen tiene seis segmentos corporales, cinco pares de patas nadadoras o pleópodos, dos pares de urópodos y un telson.

Una característica definida de Macrobrachium es que el segundo par de pereiópodos (quelas) es más desarrollado que el resto de los apéndices torácicos (Holthuis, 1952). Si entre estos hay igualdad en el tamaño y la forma, se dice que la especie presenta «isoquelas» (Cabrera, 1983), y cuando difieren significativamente se llaman «heteroquelas» (Mossolin & Bueno, 2003). Un ejemplo de esto sería M. tenellum, que presentan isoquelas (Figuras 2). Los langostinos del género Macrobrachium son organismos muy adaptables a diferentes ambientes, pueden localizarse tanto en ríos, arroyos, estuarios, pantanos, así como en lagunas costeras (New & Singholka, 1984; Valencia & Campos, 2007) con temperaturas mínimas anuales de 16 °C y máximas de 32 °C (Arroyo-Rentería & Magaña-Ríos, 2001). Los langostinos son bentónicos (excepto sus etapas larvarias) y suelen habitar sobre fondos arenosos, limosos, cerca de los manglares, cuevas, resquicios bajo piedras y raíces sumergidas, donde se refugian y consiguen alimento (Montoya, 2003). Se ha reportado que M. tenellum habita sobre fondos arenosos, limosos, y limo-arcillosos, debajo de hojas y palos en descomposición, en aguas con abundante detritus y materia en diferentes grados de descomposición (Román-Contreras, 1979). Las especies del género Macrobrachium son omnívoras y carroñeras, consumen detritos, algas, restos de animales muertos y además son depredadoras de macroinvertebrados acuáticos y peces (García-Guerrero et al., 2013). Rojas- Sahagún et al. (2012) comentan que M. tenellum tiene hábitos alimenticios omnívoros y puede consumir desde alimento balanceado hasta larvas de culícidos (mosquitos). También se ha demostrado que M. tenellum llega a tener conductas de canibalismo. Vega-Villasante et al. (2011a) sugieren que este tipo de conducta corresponde a aspectos etológicos del género Macrobrachium descrito y definido como «efecto toro» (Jayachandran, 2001). En el cual existe un macho dominante y machos subordinados los cuales al mudar son devorados por el macho alfa. Estos organismos detectan el alimento por el «olfato», que junto con el tacto juegan un papel importante para la aceptación del alimento. Por otra parte, también suelen ser presas de vertebrados, como peces, aves y reptiles, o mamíferos como mapaches y nutrias. Pueden ser activos tanto en el día como en la noche, aunque se ha establecido que son preferentemente nocturnos (Espinosa-Chaurand et al., 2011).

1.3 Nutrición Los langostinos en su primera etapa larval no se alimentan del exterior, ya que tienen reservas de vitelo, mientras que en la segunda etapa larval el fitoplancton y el zooplancton constituyen su alimento (Vega-Villasante et al., 2011a). Los nauplios de Artemia recién eclosionados son generalmente la dieta de elección para el cultivo larval, ya que contienen comparativamente altos niveles de proteína y lípidos (55 y 21%, respectivamente), por lo que son adecuados para suministrar los requerimientos de las larvas; las dietas diseñadas para larvas solo son útiles a partir de que comienza a funcionar la glándula digestiva, durante las etapas VI o VII de vida (D’Ambramo & New, 2000). Se ha observado que en cautiverio aceptan cladóceros y larvas de culícidos (Ponce-Palafox et al., 2002). Yamasaki-Granados (2012) reporta que a la mayor supervivencia de larvas de M. americanum se registra cuando son alimentadas con nauplios de Artemia salina, mantenidas a una densidad de 50 larvas L–1. En los cultivos de langostino el alimento constituye del 40 al 60% de los costos de producción, por lo cual parte del éxito depende de la necesidad de desarrollar dietas artificiales de bajo costo, que permitan un buen crecimiento, supervivencia y eficiencia alimenticia, y contribuyan a reducir la contaminación ambiental (Espinosa-Chaurand, 2013). Por lo cual, el tipo de alimento y la estrategia de alimentación representan factores de vital importancia en el aporte de la energía y nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo y crecimiento de organismos acuáticos (Espinosa-Chaurand et al., 2012). La mayoría de los estudios de requerimientos nutricionales que se han enfocado en langostinos del género Macrobrachium han sido diseñados para la especie M. rosenbergii. En general, son pocos los estudios que se han realizado de los langostinos nativos de México, que a pesar de su talla y potencial de aprovechamiento, se carece de programas de cultivo o manejo de estas especies. El primer factor a considerar para la alimentación de los langostinos y para la aproximación a sus requerimientos nutricionales, es la proteína. La proteína constituye el más importante nutriente, el mayor componente y usualmente el más caro ingrediente en las dietas artificiales (Espinosa-Chaurand, 2013). El nivel de proteína en los alimentos comerciales es generalmente el parámetro más importante a tomar en cuenta en la alimentación de los diferentes estadios de los langostinos que permiten al organismo desarrollarse al máximo. A medida que el langostino crece, el porcentaje de proteína en los alimentos balanceados tiende a disminuir. El requerimiento de proteína es mayor en las etapas larvarias y juveniles. Pese a

los esfuerzos realizados hasta la fecha con relación al estudio de la nutrición de M. tenellum, aún no se conocen de manera exacta los requerimientos para cada una de sus etapas (Espinosa- Chaurand et al., 2011); sin embargo, Guzmán-Arroyo (1987), comenta que en cautiverio aceptan el alimento artificial y sugiere que las necesidades nutricionales de esta especie son de 29% de proteína, 37% de carbohidratos, 28% de grasas y 5% de vitaminas y que el requerimiento de proteína es mayor en las etapas larvarias y juveniles, llegando a esta conclusión a través de sus observaciones y no debido a bioensayos concretos de nutrición. Espinosa-Chaurand et al. (2012) comprobaron que langostinos juveniles alimentados con niveles altos de proteína (40%) han logrado crecimientos favorables. Pero para preadultos, De la Torre-Álvarez (2013) reporta que en sus bioensayos la inclusión creciente de proteína cruda en la dieta (20, 25, 30, 35 y 40%) no tiene efecto en el crecimiento y sobrevivencia. En general, los crustáceos se alimentan para satisfacer sus necesidades energéticas, para ello la cantidad de proteína del alimento debe estar balanceada con la cantidad adecuada de energía, para que de esta manera se logre alcanzar una ingestión proteica óptima y una buena tasa de conversión alimenticia (Antimo-Pérez, 2000; Luna-Mendoza, 2000). Los camarones parecen utilizar los carbohidratos y los lípidos como principal fuente de energía (Lovell, 1998), lo cual es económicamente más rentable, ya que estos nutrientes son más baratos que las proteínas (Antimo-Pérez, 2000; Luna-Mendoza, 2000). El uso de un balance proteína/energía adecuado es esencial para formular un alimento eficiente (Luna-Mendoza, 2000). La inclusión de una cantidad adecuada de carbohidratos y lípidos en la dieta disminuye el requerimiento de proteína sin reducir el crecimiento (Lovell, 1998). En M. tenellum García- Ulloa et al. (2008) encontraron que es posible sustituir totalmente la harina de pescado por harina de soya en alimentos experimentales sin afectar el crecimiento de los organismos. La ración diaria de alimento puede ajustarse desde 10% hasta 3% del peso corporal en la etapa de engorde (Ponce-Palafox et al., 2002). La cantidad total de carbohidratos dietarios que se puede utilizar eficientemente para langostinos generalmente depende de la capacidad digestiva (nivel de actividad enzimática digestiva) y puede exceder la de especies de camarón marino, donde se incorporan frecuentemente en un 20 a 45% en alimentos en forma de almidones de arroz, de trigo, de maíz, de papa, de soya, etc. Por lo tanto, parece lógico tratar de conseguir un ahorro de proteínas mediente la parcial sustitución por almidón en la alimentación de los langostinos, aunque aún la utilización metabólica de la glucosa no ha sido precisada en estos organismos,

debido a la dificultad que tienen para regular la glucemia (Guillaume et al., 2004). Con buenas fuentes de proteínas en la dieta, los niveles de lípidos dietéticos que contengan los niveles adecuados de ácidos grasos esenciales pueden ser bajos, alrededor del 2% (Guillaume et al., 2004). Uno de los aspectos en los que se debe tener mayor cuidado en la nutrición de langostinos es el requerimiento de colesterol, ya que este es un componente primordial de las lipoproteínas circulantes y de membrana, y sirve de sustrato para la síntesis de diversos compuestos entre los que se encuentra la hormona de la muda. Aunque los crustáceos sean incapaces de sintetizar el núcleo esterol, sí pueden convertir ciertos fitoesteroles en colesterol (D’Ambramo & New, 2000).

1.4 Importancia de la composición química de los alimentos y su digestibilidad La evaluación de los ingredientes utilizados en la formulación de alimentos es crucial para la investigación nutricional y el mejoramiento de alimentos balanceados para las especies acuícolas (Glencross et al., 2007). Los alimentos para camarón son formulados para contener un alto nivel de proteína, debido a que este macronutriente constituye uno de los componentes nutricionales de mayor importancia y de más alto precio, el uso óptimo del alimento, así como su formulación con fuentes alternativas menos costosas que las convencionales, resulta conveniente desde el punto de vista económico y ambiental (Terrazas et al., 2010; Espinosa- Chaurand, 2013). En la nutrición, el valor biológico de una proteína depende de su composición de aminoácidos esenciales (AAE). Conociendo esta composición, es posible predecir, con ciertos límites, su rendimiento en el organismo animal (Suárez-López et al., 2006). El conocimiento del perfil de aminoácidos del músculo de los langostinos tanto para M. rosenbergii (Bhavan et al., 2010; Roustaian et al., 2000; Tidwell et al., 1998) como para especies nativas de América M. americanum (Yamasaki, 2012), M. amazonicum (Portella et al., 2013) y M. tenellum (Espinosa-Chaurand et al., 2013), ha permitido realizar algunas investigaciones para predecir el requerimiento de proteína en su alimentación (Espinosa-Chaurand et al., 2013; Montoya- Martínez et al., 2016) y de esta manera, disponer de información de las fuentes proteicas que pueden ajustarse a los requerimientos de AAE y con esta información tener la posibilidad de formular alimentos adecuados para estas especies.

El aprovechamiento de los nutrientes de un ingrediente o alimento dependerá de la capacidad de las enzimas digestivas del organismo para poder digerirlo, por lo tanto, el conocimiento de las propiedades y condiciones óptimas de las enzimas digestivas es esencial para la comprensión del mecanismo de la digestión y el conocimiento de las necesidades nutricionales (Chisty et al., 2009). Además para la evaluación de los ingredientes también es necesario tener en cuenta la biodisponibilidad de los AA o la presencia de factores antinutricionales, por lo tanto la formulación de alimentos debe ser apoyada con pruebas de digestibilidad, que es esencial no sólo en la investigación de requerimientos nutricionales, sino también es útil para la formulación de dietas a bajo costo, la evaluación de la calidad de ingredientes para su selección con valor nutritivo potencial y formulación de alimentos que minimicen la contaminación del agua (Cruz-Suárez, 2002).

1.5 Enzimas digestivas descritas en el género En los crustáceos la digestión comienza al acercar el alimento a la boca, continua por el estómago, pasando a la glándula digestiva o hepatopáncreas, donde la digestión se hace más activa, debido a que en el hepatopáncreas se sintetizan, secretan y actúan las enzimas digestivas, que ayudan a digerir el alimento para que los nutrientes puedan ser absorbidos (Cruz-Suárez, 1996). La identificación y caracterización de las enzimas digestivas en los langostinos son importantes para entender su fisiología digestiva, ya que los tipos, propiedades y la regulación de las enzimas digestivas está relacionado con los hábitos de alimentación y definen las capacidades digestivas del organismo y, por lo tanto, sirven como herramienta en la búsqueda de los ingredientes apropiados para su alimentación (Carrillo et al., 2007). El número de trabajos realizados con este objetivo son escasos, dentro de los realizados, la especie más estudiada es M. rosenbergii. En general, los estudios sobre la caracterización y detección de las enzimas se han realizado a partir de extractos crudos tisulares de diverso origen, pero destaca la escasez de estudios que se hayan realizado con la purificación de enzimas o utilizando extractos escasamente purificados. La mayoría de ellos se han realizado con extractos crudos utilizando sustratos sintéticos e inhibidores específicos para cada enzima, dando mayor importancia a la actividad tipo proteasa.

1.5.1 Estudios de caracterización y purificación de enzimas La caracterización de las proteasas digestivas mediante técnicas electroforéticas de postlarvas de M. rosenbergii reveló la presencia de seis bandas caseinolíticas con pesos moleculares entre 15 y 136 kDa (Chisty et al., 2009), para M. lanchesteri se reportan siete bandas con actividad caseinolítica entre 15 y 36 kDa (Pongsetkul et al., 2016) en todo el cuerpo. Mientras que en especies nativas de América, para M. carcinus se reportan ocho bandas en el extracto de hepatopáncreas con pesos moleculares entre 17.8 a 94.0 kDa (Manríquez-Santos et al., 2018); en el caso de los diferentes morfotipos de M. amazonicus presentaron un total de catorce a quince bandas en todo el cuerpo con PM de 21 a 205 kDa en organismos cultivados y 15 bandas en organismos salvajes con PM de 6 a 116 kDa y en extractos del hepatopáncreas, los organismos cultivados mostraron seis bandas y los salvajes solo dos bandas (Da Silva-Santos et al., 2014). En el caso de purificación, solo la tripsina de hepatopáncreas ha sido purificada por cromatografía mostrando una sola banda en M. rosenbergii, con un PM de 17 kDa (Sriket et al., 2012) y para M. malcolmsonii de 19 kDa (Asaikkutti et al., 2017). Por lo tanto, el identificar cada una de las enzimas y sus isoformas que participan en la digestión es crucial para una mejor comprensión de la misma, para poder utilizar esta información en la realización de formulaciones adecuadas, ya que los estudios sobre la fisiología digestiva pueden proporcionar un enfoque más lógico y eficaz de los requerimientos nutricionales para la acuicultura de cada especie de Macrobrachium.

1.5.2 Estudios descriptivos sobre el tipo y actividad enzimática La respuesta de las proteasas a diferentes inhibidores, en extractos enzimáticos demuestran la presencia de serina proteasas y metalo proteasas en el hepatopáncreas de los langostinos. En poslarvas de M. rosenbergii se confirmó la presencia de proteasas digestivas alcalinas, tripsina, quimotripsina y metalo proteasas, con la probabilidad de que la tripsina desempeñe un importante papel en la digestión de proteínas en el tracto digestivo (Chisty et al., 2009). Al igual que en M. amazonicum donde se confirma la presencia de tripsina y quimotripsina (Da Silva-Santos et al., 2014). Coincidiendo con lo reportado para adultos de M. carcinus en el estudio con inhibidores tanto in vitro como a través de zimogramas, que muestran la presencia de serina proteasas y metalo proteasas, en donde además se observa que el uso de inhibidores proteolíticos generales, tales como inhibidor de tripsina de soya (SBT1)

y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) tienen una alta inhibición sobre las serina proteasas, evidenciando que el uso de ingredientes vegetales dentro de la dieta de este tipo de organismos podría tener efectos directos en la actividad enzimática digestiva y por lo tanto en el proceso de crecimiento en cultivo (Manríquez-Santos et al., 2018). En la tabla 1 se muestran las enzimas de las que se han encontrado o no actividades con sustratos específicos e inhibidores. Lee et al. (1980) para M. rosenbergii dentro de las actividades que reportaron encontraron actividad pepsina, pero para esta misma especie, Baranowski et al. (1984) reportan que ellos no encontraron actividad pepsinolítica, y que encontraron ligeras actividades de tripsina y α-quimotripsina. Por otra parte, Lee et al. (1980) comentan que para M. dayanam se reportaron (Tyagi & Prakash, 1967) altas actividades específicas para varias carbohidrasas, incluyendo la amilasa. Además, Lee et al. (1980) y Palanisamy & Pillai (1993), señalan que Murthy (1977), utilizando M. lamarrei, no detectaron actividad de quimotripsina. Por lo tanto, la ausencia de quimotripsina en M. larnarrei y su presencia en M. rosenbergii y en M. idella, plantea la posibilidad de que exista diferencia en la composición enzimática dentro del género Macrobrachium. Por lo tanto, los estudios de descripción cuantitativa de las enzimas que utilizan los grupos taxonómicos más estrechamente relacionados han puesto de manifiesto las diferencias en la actividad de las enzimas que pueden estar relacionados con los hábitos de alimentación y/o la morfología. Por lo tanto, la actividad proteolítica del hepatopáncreas de los organismos del género Macrobrachium contiene proteasas con diferentes especificidades de sustrato, por lo que en conjunto logran una degradación eficiente de proteínas complejas. Además, las altas actividades específicas de varias carbohidrasas, incluyendo la amilasa, indica que el almidón se hidroliza fácilmente, probablemente jugando un papel importante en el metabolismo energético. Asimismo, Lee et al. (1980) propusieron que las esterasas en lugar de las lipasas, son las principales responsables de la hidrólisis de grasas, al menos en M. rosenbergii. Además, se ha reportado que las actividades de tripsina y quimotripsina (Tsai et al., 1986), así como actividades proteolíticas (Roy et al, 2018) son bajas en las diferentes partes de los tractos digestivos en M. rosenbergii en comparación con otras especies de camarón (Penaeus monodon, P. japonicus, P. penicillatus, P. indicus y Metapenaeus monoceros), encontrando mayor actividad proteasa en el hepatopáncreas, al contrario de la actividad α- amilasa, en donde M. rosenbergii tuvo la actividad más alta, con elevada actividad en el

intestino en comparación con el hepatopáncreas, demostrando que el intestino podría tener un papel importante en el proceso digestivo de los carbohidratos en langostinos.

1.5.3 Influencia de algunos factores en las enzimas digestivas La actividad de las enzimas digestivas, presentes en el hepatopáncreas, varía por factores como: ayuno, edad y tamaño de los animales, cantidad y frecuencia de alimentación, fuentes y nivel de proteína del alimento, estimulantes alimenticios, estadio de muda y ritmo circadiano (Molina et al., 2000). En M. rosenbergii, se han encontrado variaciones en la actividad de enzimas digestivas (pepsina, tripsina, lipasa, amilasa y celulasa) relacionadas con los acontecimientos morfogénicos durante el desarrollo embrionario de los huevos (Yao et al., 2006), las actividades de lipasa fueron disminuyendo mientras que las actividades de la pepsina, tripsina, amilasa y celulasa exhibieron un patrón de “alto-bajo-alto”, mostrando actividades altas en las primeras etapas, obteniendo la menor actividad en la etapa IV (gástrula) y aumentando en las siguientes etapas, alcanzando el nivel más alto durante la etapa VIII (zoea). Además se encontró que las actividades enzimáticas digestivas en el desarrollo larval coincide con el desarrollo del hepatopáncreas, al realizar un estudio para determinar los cambios ontogénicos en tripsina, esterasa no específica y amilasas, los resultados mostraron un pico máximo de actividad total de tripsina en la etapa V-VI, disminuyendo en las siguientes etapas para después subir en torno a la etapa X-XI; la actividad total de esterasa aumenta con las etapas de desarrollo, mostrando un pico máximo la etapa X-XI; la actividad amilasa se mantuvo baja hasta las etapas VI-VII indicando que en la fase inicial las larvas son exclusivamente carnívoras, obteniendo el pico más alto en la etapa X-XI (Kamarudin et al., 1994). Con relación a la influencia de la alimentación evaluada en postlarvas de M. rosenbergii, se ha investigado el impacto del reemplazo de harina de pescado por microalga (Arthrospira platensis) en la actividad enzimática digestiva, encontrando mayor actividad proteasa y amilasa en las dietas con sustitución entre el 25 y 75% de harina de microalga, pero la actividad lipasa fue decreciendo cuando la sustitución con la microalga aumenta, sugiriendo que los alimentos suplementados con microalgas pueden inducir la producción de enzimas digestivas (Radhakrishnan et al., 2016). También se han evaluado diferentes promotores de crecimiento, hierbas medicinales y estimulantes alimenticios como el zinc dietético, hojas de curry (Murraya koenigii), hojas de cilantro (Coriandrum sativum), hojas de menta (Menthe

arvensis), Alteranthera sessilis, Eclipta alba y Cissus quadrangularis (Bhavan et al., 2012, Radhakrishnan et al., 2014b, Muralisankar et al., 2015), que tienen la capacidad de inducir la secreción de proteasa, amilasa y lipasa, así como diferentes especies de pimienta y jengibre que además se observó que mejoran la síntesis proteica al encontrar un mayor número de bandas en geles de SDS-PAGE de extractos del músculo (Bhavan et al., 2013). De igual forma, se ha estudiado en postlavas el efecto de probióticos como Lactobacillus sporogenes, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae (Seenivasan et al., 2014), así como Clostridium butyricum en juveniles (Sumon et al., 2018) confirmando que su suplementación tiene influencia positiva sobre la secreción de las enzimas digestivas (proteasa, amilasa y lipasa). Incluso el efecto de la contaminación por cobre en el agua del estanque sobre la actividad enzimática (pepsina, amilasa, triptasa, celulasa) ha sido informada para evaluar su utilidad potencial como indicadores de contaminación (Li et al., 2008). Asimismo, en organismos juveniles, Sagar et al. en el año 2009 realizaron un ensayo para estudiar el efecto de diferentes niveles de proteína en la actividad enzimática digestiva, utilizando tres poblaciones silvestres, las actividades de proteasa, amilasa y lipasa fueron similares en todos los grupos, pero mostraron diferencias para la fosfatasa ácida y alcalina entre las diferentes poblaciones. También se ha experimentado con el tiempo de respuesta de secreción de enzimas digestivas durante las primeras horas después de la alimentación (Paulose, 1996), donde parece que los ciclos de actividad enzimática digestiva son inducidos por la ingesta de alimento, encontrando la actividad enzimática máxima entre las 5 y 6 horas después de la alimentación; además, evaluaron la variación de la actividad enzimática con el uso de diferentes concentraciones y fuentes de proteína, mostrando que utilizando alimentos con un nivel de 35% de proteína de origen animal se obtiene una mayor actividad que cuando son utilizados alimentos con fuentes de proteína vegetal. Igualmente, en postlavas de M. malcolmsonii el uso de diferentes niveles de vitamina C y de plantas medicinales (Alteranthera sessilis, Eclipta alba y Cissus quadrangularis), han comprobado que potencian la secreción de enzimas digestivas (proteasa, amilasa y lipasa) (Radhakrishnan et al., 2014a; Asaikkutti et al., 2016). De igual forma, en juveniles de esta misma especie se probaron semillas de plantas medicinales (Syzygium cumini, Phylanthus emblica, Azadirachta indica y Ricinus communis) incorporadas en la alimentación mejoraron

significativamente las actividades de las enzimas digestivas (proteasa, amilasa y lipasa) (Bhavan et al., 2014). En el caso de especies nativas de América, el hepatopáncreas de M. carcinus mostró actividades de proteasas alcalinas, leucina aminopeptidasa, tripsina, quimotripsina y carboxipeptidasa A, no encontrando diferencias significativas en la actividad de proteasas alcalinas entre hembras y machos (Manríquez-Santos et al., 2018). En machos de M. amazonicum, Da Silva-Santos et al. (2014) reporta la presencia de tripsina, quimotripsina y leucina aminopeptidasa en extracto de hepatopáncreas, encontrando diferencias significativas de la actividad proteolítica entre diferentes morfotipos y entre organismos cultivados y salvajes. En M. americanum se evaluó el efecto de la ración de proteína-energía dietaria (Méndez-Martínez et al., 2018). En M. tenellum (Espinosa-Chaurand, 2013; Espinosa- Chaurand et al., 2017) se evaluó como la actividad de las enzimas digestivas (proteasas, tripsina, quimotripsina, amilasas y lipasas) es afectada por el fotoperiodo, ciclo de muda, los niveles de proteína en la dieta y los horarios de alimentación; también De los Santos-Romero et al. (2017a, 2017b) evaluaron un alimento adicionado con quitina y su efecto en el fotoperiodo y la temperatura sobre la actividad enzimática digestiva, mostrando que este tipo de alimento afecta la actividad enzimática durante la digestión, encontrando que las temperaturas de 26 y 30ºC en combinación con 14 horas de luz parecen ser óptimas para el crecimiento en M. tenellum.

1.6 Condiciones de digestión en los langostinos La caracterización de las proteasas digestivas de postlarvas M. rosenbergii mostró que la actividad proteolítica ácida presenta un primer pico a pH 3, con una alta actividad a pH 6, la actividad digestiva alcalina máxima se presenta a pH 9, proporcionando a esta especie una gran capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos de proteínas (Chisty et al., 2009), coincidiendo con lo reportado por Sriket et al. (2011), encontrando que las enzimas proteolíticas se encuentran activas en un amplio rango de pH, obteniendo la actividad máxima a pH 7.0 en esta misma especie. La actividad enzimática para M. lanchesteri muestra una mayor actividad proteolítica en pH alcalino con un pH óptimo entre 8 y 8.5 (Pongsetkul et al. 2016). Para M. lamarrei la actividad de tripsina es óptima a pH de 7.5 (Murphy & Saxena, 1979). En el caso de especies nativas de América, las proteasas digestivas de adultos de M.

carcinus tiene la máxima actividad a pH de 8 (Manríquez-Santos et al., 2018), mostrando similitud con M. amazonicum donde se determinó que la mayor actividad de tripsina estaba entre pH 8 y 8.5 (Da Silva-Santos et al., 2014). Los resultados sugieren que la digestión de proteínas en el tracto digestivo de M. rosenbergii se inicia por una proteasa ácida seguida de una combinación de la acción de las proteasas alcalinas: tripsina, quimotripsina y metaloproteasas (Chisty et al., 2009), mostrando que predominan las proteasas alcalinas como enzimas dominantes. La temperatura óptima de la actividad en las proteasas digestivas de M. rosenbergii (Sriket et al., 2011) y M. lanchesteri fue a los 60ºC (Pongsetkul et al., 2016), coincidiendo con lo reportado para M. amazonicum que tiene una temperatura óptima para la actividad tripsina de 65ºC, mostrando buena estabilidad térmica hasta 75°C. (Da Silva-Santos et al., 2014). A diferencia con M. lamarrei que reporta una actividad óptima de tripsina a 45ºC (Murphy & Saxena, 1979), coincidiendo con M. carcinus que obtuvo la mayor actividad proteasa a 45ºC, (Manríquez-Santos et al., 2018), permitiéndole maximizar la capacidad de hidrolizar y asimilar los nutrientes dentro del hepatopáncreas, ya que los langostinos pasan mucho tiempo moliendo y digiriendo el alimento durante su alimentación (Ceccaldi, 1997; Sacristan et al., 2014), pero al parecer para M. lamarrei y M. carcinus la capacidad de la hidrólisis de la proteína es más limitada, debido a la menor resistencia a los cambios de temperatura. En el caso de la esterasa en M. lamarrei su actividad óptima es a 40ºC y pH de 7.4 ((Murphy & Saxena, 1980). Los resultados in vitro muestran la capacidad de las enzimas a los cambios de pH y temperatura, la temperatura óptima que se reporta es la temperatura en la que la enzima obtiene la máxima actividad. La temperatura corporal de los langostinos depende de la temperatura ambiental y como la temperatura del cuerpo interviene en los procesos fisiológicos, el metabolismo y la alimentación, esta será un factor limitante de la velocidad de las reacciones químicas dentro del organismo. Por lo tanto el conocimiento de las condiciones de temperatura bajo las cuales se lleva a cabo la hidrolisis de los nutrientes proporcionará información sobre la eficiencia de la digestión, mostrando efectos sobre el crecimiento. Razón por la cual, la mayoría de las especies de langostinos como se reporta para M. tenellum, durante el otoño-invierno presentan un crecimiento lento con temperaturas promedio de 27ºC y durante la primavera-verano un mayor crecimiento con el aumento de la temperatura del

agua cercana a los 30ºC (Vega-Villasante et al., 2011b), pero este rápido crecimiento con el aumento de la temperatura sucede hasta cierto punto, que dependerá de la temperatura óptima de la especie; ya que si se sobrepasa esta temperatura, generalmente, el crecimiento desciende y aumenta la mortalidad, resultando contraproducentes las altas temperaturas (Rodríguez- Aguilera & García-Araya, 1992), los juveniles de M. tenellum muestran una preferencia térmica entre 30 y 33ºC, soportando variaciones desde 8.1 hasta 43.5ºC con altas superviviencias, exibiendo su capacidad de tolerancia y adaptación térmica (Rodríguez et al., 2012).

1.7 Digestibilidad aparente de proteínas, lípidos y polisacáridos y métodos alternativos Algunos de los problemas para determinar la digestibilidad de alimentos para organismos acuáticos están relacionados con el medio ambiente en donde viven, a diferencia de los animales terrestres, la determinación directa de coeficientes de digestibilidad para camarón por gravimetría es muy problemática, ya que se requiere cuantificar el alimento ingerido y las heces excretadas con cierto nivel de precisión. Por esta razón se han desarrollado los métodos indirectos en los que se determinan diferencias de concentración de un marcador inerte entre el alimento y las heces. Para determinar la digestibilidad aparente de nutrientes en camarón, la mayoría de los estudios siguen utilizando la metodología in vivo y en particular, el método indirecto de óxido de cromo, debido a la facilidad de producir resultados consistentes (Fox & Lawrence, 2008). Los pocos estudios que han sido desarrollados sobre la digestibilidad aparente se han enfocado en M. rosenbergii para determinar el efecto de la dieta. En la evaluación de la digestibilidad de diferentes ingredientes mezclados en la dieta de referencia para adultos, Gomes et al. (1997) determinaron la digestibilidad aparente de yuca (Manihot esculenta) deshidratada o asada, demostrando que el tratamiento térmico no mejoró significativamente la digestibilidad de la proteína y la energía bruta de la yuca, pero comentan que la digestibilidad fue inversamente proporcional al contenido de carbohidratos en el alimento, siendo la dieta de referencia la que alcanzó mayor digestibilidad. Ashmore et al. (1985) llevaron a cabo un ensayo para evaluar la digestibilidad de dietas adicionadas con diferentes cereales (maíz, sorgo, trigo y cebada) y un segundo ensayo con el objetivo de evaluar el efecto de diferentes niveles de proteína (20, 30 o 40%), como resultado en los dos ensayos la digestibilidad

aparente de la proteína no obtuvo diferencias significativas, concluyendo que debido a que todos los alimentos obtuvieron una alta digestibilidad proteica, parece que M. rosenbergii es capaz de asimilar eficazmente diversas proteínas, pero se encontraron diferencias en la energía digestible aparente y en los resultados del consumo de alimento, contribuyendo a la respuesta del crecimiento en los dos ensayos, por lo tanto la dieta con un 30% de proteínas adicionada con cebada fue la utilizada más eficientemente. Taechanuruk & Stickney (1982) demostraron que la tasa y la frecuencia de alimentación no afectan la digestibilidad de la proteína en adultos de M. rosenbergii, al utilizar una dieta preparada con harina de pescado (lacha, 30% de proteínas) y 0.3% de óxido de cromo. Realizaron una serie de 4 experimentos, se alimentó 1, 2 o 3 veces al día con tazas de alimentación de 1.25 y 2.5% de peso vivo, obteniendo que la digestibilidad osciló entre 83.3% a 87.7%. Se ha encontrado que la edad también produce variaciones en la digestibilidad, Chin (1988) evaluó la digestibilidad proteica en juveniles, adultos y hembras en tres etapas de maduración gonadal con diferentes ingredientes y proporción de proteína. Los resultados indican que los langostinos adultos fueron capaces de digerir los nutrientes de los ingredientes mejor que los juveniles, además la etapa de maduración de las gónadas de las hembras no tiene ningún efecto significativo sobre la digestibilidad. Además, en los alimentos probados la pasta de coco, la harina de trigo y la harina de soya fueron digeridas mejor que la harina de pescado y la harina de camarón, tanto en juveniles como en adultos, indicando que estas harinas son una buena fuente alternativa de nutrientes para M. rosenbergii. También se ha descrito un método de recolección fecal total (Ellis et al., 1987) para evaluar la digestibilidad de alimentos comerciales en M. rosenbergii, utilizando un saco de plástico para evitar la pérdida de nutrientes por lixiviación. Las fuentes de proteínas utilizadas parecen ser digeridas de manera eficiente por los langostinos, comentando que el método puede ser particularmente útil en la evaluación de las digestibilidades de pequeños componentes de peso molecular solubles de las dietas, aunque para los langostinos el sistema de recolección producía tensión por lo que trataban de quitarse el saco, afectando la ingesta de alimento. Pero se desconocen los efectos de factores ambientales, estresantes y sobre todo de la especie, a pesar de que se ha sugerido la existencia de diferencias en digestibilidad entre

crustáceos, inclusive de especies cercanas, exponiendo la necesidad de realizar estudios extensos de digestibilidad para cada especie que sea considerada (Fox & Lawrence, 2008).

1.8 Digestibilidad in vitro de proteínas, lípidos y polisacáridos en langostinos La digestión es un proceso altamente complejo que proporciona a los animales la energía y los nutrientes necesarios para su mantenimiento y crecimiento. Por esta razón, muchos investigadores se han interesado en el modelado total o parcial del proceso de digestión usando una variedad de diferentes metodologías in vitro (Moyano et al., 2014) Lee & Lawrence (1997) consideraron que el método analítico más interesante que se ha propuesto para la evaluación de la digestibilidad de piensos acuáticos es la técnica in vitro de digestión enzimática, ya que ofrece la posibilidad de reducir significativamente el tiempo y los gastos para evaluar la digestibilidad de un alimento, pero que este método nunca reemplazará el ensayo de digestibilidad aparente, como resultado, muchos estudios se han enfocado en comparar los métodos in vivo e in vitro (Nieto et al. 2005), sugiriendo también que los ensayos in vitro podrían ser utilizados con crustáceos. La mayoría de la investigación sobre digestibilidad in vitro se ha llevado a cabo ya sea con el método de caída del pH o con el de pH stat. El método de pH stat, como lo describen Ezquerra et al. (1997), evalúa el grado de hidrólisis de fuentes de proteínas dietarias por extractos de enzimas intestinales o las mezclas de enzimas y está basada en investigaciones realizadas por Hsu et al. (1977). Con este método Manríquez-Santos et al. (2011) evaluaron la digestibilidad in vitro de 10 ingredientes de origen animal y vegetal, utilizando extractos multienzimáticos de adultos de M. carcinus, la mayoría de los ingredientes fueron altamente digestibles, estos resultados muestran la alta capacidad que tiene M. carcinus para hidrolizar ingredientes de origen animal como de origen vegetal, obteniendo la harina de sangre de res la digestibilidad más alta y la harina de pescado una de las digestibilidades más bajas. Del mismo modo, Montoya-Martínez et al. (2018) estimaron la digestibilidad de ingredientes de origen animal, vegetal y microbiano pero en M. tenellum en donde las mayores digestibilidades relativas de proteína la presentaron la harina de Spirulina, harina de cerdo, harina de pluma; y las más bajas la harina de soya, harina de garbanzo y la harina de pescado.

La mayoría de los estudios sobre la capacidad digestiva que se han enfocado en langostinos del género Macrobrachium han sido diseñados para la especie M. rosenbergii, para las especies nativas de América se tienen pocos antecedentes de este tipo de estudios, a pesar de que hay especies con características ideales para su cultivo, existiendo un vacío considerable de información sobre la digestión de dichas especies. Para cubrir la citada ausencia cognoscitiva se requiere un esfuerzo investigativo que permita desarrollar dietas específicas para su adecuado aprovechamiento.

1.9 Estimulantes alimenticios Dentro de los alimentos para organismos acuáticos, el dirigido a langostinos es uno de los alimentos más caros debido al alto nivel de proteína que debe contener y uno de los más difíciles de fabricar por la alta estabilidad en el agua requerida para resistir sin perder su valor nutricional (Muñoz, 2004). Los langostinos tienen la capacidad de localizar el alimento a distancia (olfato), detectando (quimiorecepción) su presencia, sentiendose atraídos (búsqueda) y reconociendo el alimento, mediante los receptores antenales, y una vez localizado, por contacto, lo degusta con los receptores sensitivos presentes en sus pereiopodos y apéndices bucales (que funcionan como el sentido del gusto), dando como respuesta la aceptación o el rechazo del alimento (Suresh et al., 2011). Los quimioreceptores son capaces de percibir moléculas de bajo peso molecular (aminoácidos, compuestos cuaternarios de amonio, trimetilamina, betaína, nucleótidos, aminas biogénicas y ácidos orgánicos) disueltas en el agua que son liberadas de los alimentos. De hecho, muchas de estas sustancias son liberadas por los organismos cuando se mueren por descomposición de las proteínas, siendo uno de los mecanismos como un detritívoro identifica a su presa (Cruz-Suárez, 1996). Un alimento nutricionalmente balanceado pierde valor nutritivo si la especie cultivada no lo consume en tiempo (rápida detección y ubicación) y forma (rápida ingesta), por lo que elaborar alimentos balanceados que sean atractivos y palatables es cruciales para el éxito del alimento en los cultivos acuícolas (Jaime-Ceballos et al., 2007; Tantikitti et al., 2014). Ya que estos alimentos, permiten minimizar el tiempo de búsqueda y maximizar la proporción de alimento ingerido y con ello reducir los costos, favorecer las tazas de conversión alimenticias, reduciendo el desperdicio de alimento, ya que la acumulación de materia orgánica originada

por alimento no consumido es causa de contaminación en el agua de los estanques de producción y acuíferos circundantes (Cruz-Suárez, 2002; Tantikitti et al., 2014). Para ello, es importante evaluar la atractabilidad y palatabilidad de los ingredientes utilizados en los alimentos, con la finalidad de incrementar eficiencia y calidad del alimento, imprescindible para una acuicultura rentable.

1.10 Hipótesis El empleo de métodos químicos para la evaluación de ingredientes y de sus características de atractabilidad y palatabilidad para Macrobrachium tenellum, así como la determinación de la capacidad digestiva de macronutrientes en esta especie, permitirá brindar datos que pueden utilizarse en la formulación de alimentos con el empleo de sustitutos de la harina de pescado y otros ingredientes de alto costo.

1.11 Objetivo general Evaluar diversos ingredientes proteínicos a través de su computo químico, digestibilidad in vitro de proteínas, atractabilidad y palatabilidad en Macrobrachium tenellum, así como la actividad enzimática digestiva en langostinos de diferentes pesos.

1.12 Objetivos específicos 1.12.1 Evaluar diferentes fuentes proteínicas de origen animal y vegetal a través del cómputo químico en M. tenellum. 1.12.2 Determinar la digestibilidad in vitro utilizando el sistema pH-stat, de ingredientes animales y vegetales utilizando extractos multienzimáticos de adultos de M. tenellum. 1.12.3 Evaluación de la eficiencia del sistema de laberinto Y para la determinación de la atractabilidad de alimentos en M. tenellum. 1.12.4 Determinar la atractabilidad y palatabilidad que ejercen diferentes ingredientes proteíncos de origen animal en M. tenellum. 1.12.5 Evaluar la actividad enzimática de proteasas, amilasas y lipasas de M. tenellum de diferentes pesos.

1.13 Estructura del documento La tesis consta de siete capítulos. El primer capítulo es una adaptación de: Capítulo 13 del libro “Temas de Investigaciones Costeras”: Los camarones de agua dulce del género Macrobrachium: biología, ecología y explotación., y del artículo (en preparación): Estudios sobre enzimas digestivas y digestibilidad de alimentos en langostinos del género Macrobrachium; el segundo capítulo por artículo: Chemical score of different protein sources to four Macrobrachium species (publicado); el tercer capítulo por el artículo (en preparación): Actividad enzimática digestiva de machos silvestres de Macrobrachium tenellum; el cuarto capítulo por el artículo: In vitro protein digestibility of animal, vegetal and microbial feed ingredients by Macrobrachium tenellum (publicado); el quinto capítulo por el artículo: Evaluation of different maze systems for the determination of feed attractability for longarm river prawn Macrobrachium tenellum (publicado); el sexto capítulo por el artículo: Attractability and palatability of ingredients in Macrobrachium tenellum feed (publicado). En cada capítulo se incluyen las citas bibliográficas que constituyen las fuentes referenciales. Al final el séptimo capítulo en donde se exponen las conclusiones finales relacionadas con la discusión de los resultados.

Figura. 1. Anatomía de un reproductor macho de Macrobrachium americanum. Modificado de Hernández-Valencia (2010).

Figura 2. Macho adulto de Macrobrachium tenellum.

Tabla 1. Enzimas digestivas encontradas con diferentes sustratos específicos y/o inhibidores en especies de Macrobrachium.

M. rosenbergii M. idella M. lamarrei M. carcinus M. amazonicum M. tenellum M. americanum

embriones adultos adultos juveniles juveniles Manríquez- Espinosa- Méndez- Lee et al. Baranowski Yao et al. Palanisamy & Murthy Da Silva-Santos De los Santos- Santos et al. Chaurand Martínez et al., (1980) et al. (1984) (2006) Pillai (1993) (1977) et al. (2014) Romero et al. (2018) (2013) 2018 (2017a, b) Proteasas alcalinas  

Tripsina          Quimotripsina           Pepsina    

Carboxipeptidasa A   

Carboxipeptidasa B  

Leucina     aminopeptidasa

Amino peptidasa     Amino tripeptidasa   

Glicil-L-Leucina  dipeptidasa  

Amilasa     

Colagenasa   Quitinasa     α y β glucosidasa 

α y β galactosidasa 

Celulasa   Esterasa 

Lipasa     

CAPÍTULO 2. CÓMPUTO QUÍMICO DE DIFERENTES FUENTES PROTEÍNICAS PARA Macrobrachium tenellum

Publicado en:

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Chemical score of different protein sources to four Macrobrachium species

Cynthia Montoya-Martínez1, Héctor Nolasco-Soria2, Olimpia Carrillo-Farnés3, Roberto Civera-Cerecedo2, Carlos Álvarez-González4 & Fernando Vega-Villasante1 1Laboratorio de Calidad de Agua y Acuicultura Experimental, Centro de Investigaciones Costeras, Universidad de Guadalajara, Puerto Vallarta, Jalisco, México 2Programa de Acuacultura, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C., La Paz, B.C.S., México 3Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba 4Laboratorio de Acuicultura Tropical, División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México Corresponding author: Fernando Vega ([email protected])

ABSTRACT Food production for aquaculture requires finding other protein sources or ingredients as potential alternatives in the formulation of aquaculture feeds, due to the shortage and high price of protein sources that are most commonly used. The aim of this analysis was to evaluate the relationship between the essential amino acids in 13 types of proteins available in the market with the essential amino acids found in the muscle of four of the most important farmed prawn species of the genus Macrobrachium (M. amazonicum, M. rosenbergii, M. americanum and M. tenellum). The results obtained showed the limiting amino acids of each ingredient for each species, thereby allowing for formulation of commercial foods that meet the nutritional needs to support optimal growth of these prawns in culture. In conclusion, there is a difference in the amino acids most often present as first limiting between sources of animal and plant origin. Thereby, it is possible evaluate complementarities between these sources to achieve an amino acids profile close to that of Macrobrachium species. Keywords: Macrobrachium, prawns, crustacean, amino acid, protein, nutrition.

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Índice de aminoácidos esenciales de diferentes fuentes proteicas para cuatro especies de Macrobrachium RESUMEN La producción de alimentos para la acuicultura requiere la búsqueda de otras fuentes o ingredientes proteínicos como alternativas potenciales en la formulación de piensos para la acuicultura, debido a la escasez y alto precio de las fuentes de proteínas utilizadas con mayor frecuencia. El objetivo de este análisis fue evaluar la relación entre los aminoácidos esenciales de 13 tipos de proteínas disponibles en el mercado con aminoácidos esenciales presentes en el músculo de cuatro de las más importantes especies de langostinos cultivadas del género Macrobrachium (M. amazonicum, M. rosenbergii, M. americanum y M. tenellum). Los resultados obtenidos muestran los aminoácidos limitantes de cada ingrediente para cada especie, lo que permite la formulación de alimentos comerciales que satisfagan las necesidades nutricionales para apoyar el crecimiento óptimo de estos langostinos en cultivo. En conclusión, existe una diferencia entre los aminoácidos que con más frecuencia se presentan como primer limitante entre las fuentes de origen animal y vegetal. De este modo, es posible evaluar complementaciones entre estas fuentes para lograr un perfil de aminoácidos cercano al de las especies de Macrobrachium. Palabras clave: Macrobrachium, langostinos, crustáceos, aminoácidos, proteínas, nutrición.

INTRODUCTION In recent decades, there has been an emphasis on using native species in aquaculture (Portella et al., 2013); however, the commercial production of freshwater prawns remains an opportunity that has not been exploited in most countries of Latin America. Within native American species with aquaculture potential, the highlight is the genus Macrobrachium. Feeding is vital for profitable prawn farming, as this may constitute 40 to 60% of production costs. The protein level in commercial feeds is one of the most important nutritional parameters (Vega-Villasante et al., 2011), and its optimal use allows proper feed utilization by cultured species and minimizes nutrient losses to the environment. Good handling of feeds prevents them from becoming a source of contaminants with adverse effects on the aquatic environment (Terrazas et al., 2010).

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

In nutrition, the biological value of a protein depends mainly on its composition of essential amino acids (EAA) (Espinosa-Chaurand et al., 2013), knowing this composition, it is possible to predict, within certain limits, its performance in the animal organism (Suárez et al., 2006). Several studies have been performed using the amino acid profile of the muscle from animals to predict the animal’s protein requirements (Guilherme et al., 2007; Yamasaki, 2012; Portella et al., 2013). Studies have shown that crustaceans generally require the same 10 EAA: arginine (Arg), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), phenylalanine (Phe), threonine (Thr), tryptophan (Trp) and valine (Val). However, virtually no research has been conducted on the essential amino acid requirements of prawn species of the genus Macrobrachium, except for M. rosenbergii (Roustaian et al., 2000). As a result, diets designed for native species of the entire genus Macrobrachium have been adapted based on M. rosenbergii or penaeid shrimp diets, with little empirical evidence in place. To date, the formulated feed industry has not thoroughly relied on advances in biological/physiological aquaculture studies, have not been adopted by the formulated feed industries; this has promoted the use of empirical formulas that lack basic requirements to meet the demands of the cultured organisms (Ramírez et al., 2010). The source of animal protein commonly used in the feed industry is fish meal, therefore its high demand, low availability and high cost (Glencross et al., 2007; Guilherme et al., 2007; Espinosa-Chaurand et al., 2013). Alternative sources for proteins have been used widely for mammals and poultry feedstuffs, but few data are available on their use for aquaculture species, data are lacking on the inclusion levels of these ingredients in feed, their impact on cost and their biochemical quality. Consequently, researches are needed to understand and evaluate the alternative sources of protein derived from agro industrial by-products or other organisms potential that will substitute fully or partially for fish meal (García-Galano et al., 2007; Glencross et al., 2007). It is accepted that the amino acid profile of food proteins provides an important perspective of nutritional value, but imprecise and uncertain accuracy of analytical procedures and the hydrolysis method used can give variations in amino acid data for the regulation of protein quality. Also, because the information gap regarding the nutritional requirements of

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium the prawn species of the genus Macrobrachium (except for M. rosenbergii), this review documents used the values reported in different studies published on the amino acid composition of four species of Macrobrachium, of different sizes obtained with different experimental circumstances, but were not compared. Therefore, the objective of this work was to analyze the proportion the composition of amino acids in the muscle of four species of prawn of the genus Macrobrachium with the amino acid content of ingredients that are used in formulated feeds. The three-fold purpose was to evaluate their amino acids scores, to establish the amino acids that limit the quality of these sources in feeds, and to suggest the possibility of complementation among protein sources.

MATERIALS AND METHODS To conduct this analysis, four species of the genus Macrobrachium with known information about the amino acid composition of abdominal muscle were selected. The following amino acid compositions were used: M. amazonicum postlarvae reported by Portella et al. (2013) (obtained with an ion exchange amino acid analyzer); M. rosenbergii larvae (Roustaian et al., 2000) (obtained by high resolution liquid chromato-graphy in reverse phase); juveniles of M. rosenbergii (Tidwell et al., 1998) and M. americanum (Yamasaki, 2012), and adults of M. tenellum (Espinosa et al., 2013) (obtained by high resolution liquid chromatography with fluorescence detection). Thirteen protein sources (animal, vegetable and unicellular origin) were selected that are commonly used in the feed industry, or that could be considered as partial substitutes for ingredients normally used. Data from plant-based ingredients and egg were obtained from USDA food composition tables (2014). Protein sources were: sorghum meal (nutrient key number 20648), wheat meal (nutrient key number 20080), soybean meal (nutrient key number 16419), Spirulina (nutrient key number 11667), baking yeast (nutrient key number 18375) and whole egg dried (nutrient key number 1173). The data of ingredients of animal origin were obtained from data sheets published by the company Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V. (http://www.protmagro.com/productos.htm): squid meal, shrimp meal, fish meal (I), standard poultry meal, pork meal and hydrolyzed feather meal. The composition of fish meal (II) was obtained from García-Galano et al. (2007), and the composition of Artemia nauplii from García-Ortega et al. (1998).

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Chemical score (CS) calculations of protein were performed according to Block & Mitchell (1946) by dividing the content of EAA of the tested protein, between the amino acid content in the reference protein, using the amino acid composition of prawns muscles as reference protein. The lower ratio indicates the limiting amino acid of the protein source, and therefore its CS. Values less than 1 show the limiting amino acids, the lowest CS value is the first amino acid limiting of protein source.

RESULTS The EAA compositions of the used ingredients are in Table 1. The estimated CS of the protein ingredients, taken as reference to the amino acid profile of M. amazonicum postlarvae (Tables 2, 3) shows that tryptophan is most frequently presented as the first and second limiting amino acid in the studied sources, followed by lysine; may be considered as the limiting amino acids of the protein quality of the evaluated ingredients for feeding this species. For ingredients evaluated for larvae of M. rosenbergii, the limiting essential amino acids are aromatic amino acids (Trp and Phe) and histidine (Tables 2, 4). In juveniles of M. rosenbergii and M. americanum (Tables 2, 5, 6) it is noted that basic amino acids (Arg, His and Lys) are most frequently presented as the first or second limiting amino acids of protein from any source, followed by methionine. Same as in M. tenellum (Tables 2, 7) basic amino acids, threonine and methionine are also presented as a first limiting amino acid in most evaluated sources.

DISCUSSION For crustaceans, protein is essential for growth and development as it provides energy and is needed for the production of hormones, antibodies, enzymes and tissues (Bhavan et al., 2010). Whole egg, Artemia and Spirulina show a closer profile to the amino acid requirements of M. amazonicum postlarvae (Table 3). In animal protein sources, the highlight is shrimp meal, which is consistent with that reported by García-Galano et al. (2007), who mentioned that the integration of shrimp meal to food for penaeid shrimp has a positive effect on growth due to its excellent profile of amino acids, in addition to its attractant power.

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Of the ingredients evaluated for larvae of M. rosenbergii (Table 4), the only ingredient that covers all requirements of amino acids is the whole egg, followed by Spirulina and Artemia, which support their use in larval production. As noted earlier, massive larval rearing of aquatic organisms, particularly shrimp, still depends on live food (microalgae and Artemia nauplii), but the high production costs, contamination risks in farms and variations of its nutritional value of live foods motivate a search for alternative artificial foods (including the use of dried seaweed, microparticulate diets, micro-encapsulated, yeast and different species of non-pathogenic bacteria) to replace partially or totally natural food (Jaime-Ceballos, 2006). In this sense, Santos-Gutiérrez et al. (2011) evaluated a semi wet product as a food supplement, formulated with chicken egg and fresh squid as protein sources and found that this experimental food can be used as a partial supplement of Artemia nauplii in the production of M. rosenbergii larvae. Also, Bhavan et al. (2010) determined the growth yield of M. rosenbergii postlarvae fed with enriched Artemia with Spirulina and yeast and found that the two ingredients produced favorable results, but Spirulina produced higher growth than yeast; therefore, both Spirulina and yeast can be used as supplements in feed management practices. For juveniles of M. rosenbergii (Table 5), Spirulina, yeast and soybean meal resulted in the best quality for the species. Considering this, Prasad et al. (2013) suggested that foods added with 0.5% Saccharomyces cerevisiae yeast are suitable to promote growth of M. rosenbergii postlarvae. Similarly, Parmar et al. (2012) demonstrated that the incorporation of 1% brewer's yeast in the diet improve the immune response and control white muscle disease in M. rosenbergii. Also for this species, it is observed that the amino acid profiles of soybean meal fit better than fishmeal, which coincides with Hasanuzzaman et al. (2009), who reported higher weights and better protein efficiency ratio and feed conversion when 80% of fish meal was replaced by soybean meal in the diet of juveniles. Regarding the squid meal that showed low values of CS, our results are differ from those reported by Naik et al. (2001), who explained that squid meal could completely replace fishmeal without affecting growth for M. rosenbergii postlarvae. The results for M. americanum juveniles (Table 6) show the similarity of the amino acid profile of this species with fish meal II, coinciding with EAA requirements for Litopenaeus schmiti, reported by Álvarez et al. (2004) and Fraga-Castro & Jaime-Ceballos

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(2011). These authors show that fishmeal in diets cover all EAA except arginine, meanwhile soybean meal satisfies more than half of the EAA, with methionine as first limiting. This suggests that soybean meal is an excellent protein for M. americanum, but it needs to be complemented with some meal of animal origin such as fish or shrimp to offset its amino acid deficiencies. It remains, necessary to establish an optimal level of inclusion. In the case of M. tenellum (Table 7), soybean meal contains fewer EAA that do not fit the pattern of the muscle species, corresponding to the reported by García-Ulloa et al. (2008) in juvenile M. tenellum growth is not affected by replacing fishmeal by soybean meal up to 80%. For this reason, threonine is presented as first limiting and its incorporation is very important for diet design. This coincide with Espinosa-Chaurand et al. (2013) for this species, where fish meal presented threonine as the first limiting amino acid, and soybean meal presented methionine as first limiting. But our results differ from that reported for squid meal, which also found threonine as first limiting amino acid, meanwhile Espinosa-Chaurand et al. (2013) reported histidine as the first AA limited. Note that, they obtained values higher of CS for squid meal probably because, as discussed by Seligson & Mackey (1984), the calculation of CS and the prediction of the first limiting amino acid for a protein often differ because of the choice of data source and the reference pattern and may contradict data previously validated by bioassay. Contrarily, fish meal provides high quality protein with a balance of amino acids and fatty acids suitable for the rapid growth of marine organisms (especially carnivores). The use of substitutes has not been as successful in aquatic animals as in land animals, so the availability and quality of fish meal are decisive for the manufacture of aquafeed quality (Cruz-Suárez et al., 2000). Although, fish meal is the main source of protein in aquaculture feed, its quality can vary greatly due to manufacture methods and the species of fish used as raw material, among other variables that may affect the content and quality of fish meal (García-Galano et al., 2007). Probably, these variables affecting the quality of the same type of ingredient, can be the reason for the differences in CS found between the fish meal I (sardine fishmeal, <60% crude protein, CP) and fish meal II (tuna fishmeal, >60% CP); similarly, the result of low CS for squid meal may have occurred based on its manufacture and source quality even though squid meal is considered an excellent source of protein that competes with fish meal in its applications for feed manufacturing.

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Although poultry by-product meals evaluated in the present work showed low values of CS, these meals are considered a good source of amino acids. Additionally, their cholesterol content is important in the formulation of shrimp feed (Cruz-Suárez et al., 2007). In this aspect, Yang et al. (2004) studied the potential use of renderers’ meals (poultry, and meat and bone) as alternative sources of dietary protein, and they found that both could replace up to 50% protein fish meal in diets for M. nipponense. According to our results obtained with the vegetable meals, soybean meal satisfies more than half of the EAA in juvenile prawns of M. rosenbergii, M. americanum and M. tenellum. Additionally, methionine appears as first limiting, coinciding as the limiting amino acid, which has been reported for Litopenaeus schmitti by Álvarez et al. (2004). According to those authors, soybean meal should only be included in diets in low quantities, due to the deficiency in amino acids, the high presence of antinutrients, low digestibility and it induces poor atractability and palatability of feed, which together resulted in lower growth for some species. Previous information does not agree with those reported for juveniles of M. rosenbergii, for which it is possible to replace 80% of fishmeal by soybean meal (Hasanuzzaman et al., 2009). Despite these good results with soybean meal, there are other waste and by-products from agriculture, livestock and industries that have good nutritional value, low cost and can be easily processed and recycled as aquaculture feed ingredients. One better alternative for feeding prawns is the use of earthworm meal substituting fish and soybean meals as tested by Langer et al. (2011), in M. dayanum. On the other hand, among other alternative protein sources are those obtained from unicellular origin such as yeast that presents methionine and arginine as the first limiting amino acids for M. rosenbergii juveniles and M. americanum, however this meal cover more than half its limiting amino acids. This source is considered an excellent source for shrimp nutrition as it is a good source of protein, essential amino acids, vitamin B complex, folic acid, and a suitable composition of minerals. Additionally, the high content of nucleic acids make them an important source of nucleotide, and β-glucans of the cell wall, and have proven immunostimulatory effects on aquatic species (García-Galano et al., 2007). These nutritional proper-ties make it an alternative source of protein to replace fish meal (Bhavan et al., 2010), and it has been licensed for use as probiotics in animal feed.

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Likewise, Spirulina covers more than half of the limiting amino acids for the species studied and presented lysine as the limiting amino acid in all of them. Spirulina is considered a rich source of protein, vitamins, minerals, amino acids, fatty acids and antioxidant pigments (Bhavan et al., 2010). Thus Jaime-Ceballos (2006), reported that Spirulina meal possesses suitable nutritional features for use in aquatic animal feed, and improved attractability. Based on results of this work, it is possible to suggest for M. amazonicum postlarvae and M. rosenbergii larvae a feed formulation that includes the use of Artemia enriched with Spirulina and supplemente with some product, which includes whole egg. In the case of M. rosenbergii and M. americanum juveniles, and M. tenellum adults, a feed is suggested that contains soybean meal, fish meal of high quality, shrimp meal, with a supplementary content of Spirulina and yeast. There is a difference in the amino acids most often present as first limiting between sources of animal and plant origin. Based on these differences, it is possible to evaluate complementarities between these sources to achieve an amino acids profile close to that of Macrobrachium species. However, CS of a protein only reflects the content ratio between EAA in the evaluated protein and the amino acid content in the reference protein, without taking in account other quality parameters such as digestibility. Therefore, the use of protein digestibility in a corrected amino acid score (PDCAAS), which includes the digestibility of amino acids, would be a more complete approach to the nutritional value of these sources.

ACNOWLEDGEMENTS This work was carried out thanks to a doctoral fellowship from the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) from México, awarded to the first author of this manuscript, and Dra. Karen Englander, for her valuable contribution in English language reviewing.

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Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 1. Profile of essential amino acid (EAA) of protein ingredients used (g of amino acids per 100g of protein). *I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007); III USDA; IV García-Ortega et al. (1998).

Squid Shrimp Fish Fish Poultry Feather Egg Artemia Sorghum Wheat Soy Spirulina EAA Yeast III meal I meal I meal I meal II meal I meal I dried III IV meal III meal III meal III dried III Arg 4.66 6.80 3.73 6.5 5.83 6.51 40.48 6.80 3.91 4.91 7.09 7.22 5.02 His 1.43 2.30 1.53 3.3 2.17 1.70 16.79 2.50 1.98 2.70 2.46 1.89 2.25 Ile 2.60 6.30 3.64 4.5 1.29 4.12 42.03 4.70 3.67 3.35 4.43 5.58 4.67 Leu 4.77 6.80 4.69 7.2 3.80 7.12 62.73 6.50 12.87 6.80 7.44 8.61 7.22 Lys 4.42 9.30 5.17 7.2 5.61 2.10 50.60 7.30 2.06 2.72 6.08 5.26 8.11 Met 1.80 1.70 1.72 2.7 1.13 0.53 25.60 2.30 1.72 1.73 1.23 2.00 1.46 Phe 2.37 4.70 2.68 4.1 2.07 4.30 43.45 3.90 5.23 5.16 4.77 4.83 4.33 Thr 2.63 4.30 2.49 4.3 2.25 4.15 33.81 4.30 3.70 2.78 3.97 5.17 4.92 Trp 0.60 0.67 1 0.30 9.17 1.20 1.26 1.32 1.33 1.62 1.34

Val 2.83 6.90 3.26 5.3 2.01 5.50 47.38 4.90 4.59 4.27 4.56 6.11 5.71 % PC 73-75 49 58-60 61 60-64 80 81 56 8 15 47 57 40

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 2. First and second limiting EAA of each protein ingredients evaluated for Macrobrachium species. *1 first limiting EAA; 2 second limiting EAA; - not limiting EAA.

Sources Specie animal origin vegetal origin unicellular Shrimp Fish meal Fish Poultry Feather Egg Sorghum Wheat Soy Spirulina Squid meal Artemia Yeast meal I meal II meal meal dried meal meal meal dried 0.47 0.15 0.16 0.24 0.28 0.07 0.28 0.29 0.22 0.29 0.32 0.39 0.33 1 postlarvae (Lys) (Trp) (Trp) (Trp) (Ile) (Trp) (Trp) (Trp) (Lys) (Lys) (Trp) (Trp) (Trp) M. 0.57 0.82 0.46 0.76 0.45 0.22 0.73 0,77 0.31 0.32 0.64 0.55 0.62 2 amazonicum (His, Ile, Leu) (Leu) (Arg) (Lys) (Val) (Lys) (Arg) (Lys) (Trp) (Trp) (Lys) (Lys) (Arg) 0.22 0.40 0.25 0.39 0.20 0.20 0.37 0.26 0.35 0.45 0.46 0.41 1 - larvae (Phe) (Trp) (Phe) (Phe) (Phe) (Trp) (Phe) (Lys) (Lys) (Phe) (Phe) (Phe) M. rosenbergii 0.41 0.44 0.44 0.67 0.26 0.24 0.71 0.49 0.49 0.56 0.54 0.64 2 - (His) (Phe) (His) (Trp) (Ile) (Met) (His) (Phe) (Phe) (Met) (His) (His) 0.38 0.61 0.41 0.82 0.30 0.20 0.26 0.35 0.46 0.50 0.55 1 juvenile (His) (His) (His) (Arg) (Ile) (Met) (Lys) (Lys) (Met) (His) (Met) M. rosenbergii 0.55 0.64 0.47 0.88 0.42 0.27 0.50 0.62 0.66 0.67 0.60 2 (Phe) (Met) (Arg) (His) (Met) (Lys) (Arg) (Arg) (His) (Lys) (His) 0.55 0.72 0.44 0.77 0.33 0.22 0.30 0.39 0.52 0.75 0.60 1 juvenile (Arg) (Met) (Arg) (Arg) (Ile) (Met) (Lys) (Lys) (Met) (Lys) (Arg) M. 0.63 0.81 0.73 0.48 0.3 0.47 0.58 0.84 0.85 0.62 americanum 2 (Leu, - (Lys) (Arg) Met) (Met) (Lys) (Arg) (Arg) (Arg) (Met) (Met) 0.44 0.59 0.41 0.71 0.32 0.18 0.22 0.28 0.43 0.55 0.51 1 adults (Thr) (Met) (Thr) (Thr) (Ile) (Met) (Lys) (Lys) (Met) (Lys) (Met) M. tenellum 0.46 0.71 0.52 0.75 0.37 0.22 0.55 0.46 0.63 0.69 0.71 2 (Lys) (Thr) (Arg) (Lys) (Thr) (Lys) (Arg) (Thr) (Lys) (Met) (Arg)

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 3. Protein profile EAA (amino acid per 100 g protein) of M. amazonicum postlarvae muscle (Portella et al., 2013) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007).

Chemical score M. amazonicum Squid Shrimp Fish Fish Poultry Feather Egg Sorghum Wheat Soy Spirulina Artemia Yeast meal meal meal I meal II meal meal dried meal meal meal dried

Arg 8.10 0.58*3 0.84*3 0.46*2 0.80*3 0.72 0.80 0.73*2 0.84 0.48*3 0.61*3 0.87*3 0.89 0.62*2

His 2.50 0.57*2 0.92 0.61 1.32 0.87 0.68 1.06 1.00 0.79 1.08 0.99 0.76*3 0.90

Ile 4.60 0.57*2 1.37 0.79 0.98 0.28*1 0.90 1.32 1.02 0.80 0.73 0.96 1.21 1.02

Leu 8.30 0.57*2 0.82*2 0.57 0.87 0.46*3 0.86 1.12 0.78*3 1.55 0.82 0.90 1.04 0.87

Lys 9.50 0.47*1 0.98 0.54*3 0.76*2 059 0.22*2 0.78*3 0.77*2 0.22*1 0.29*1 0.64*2 0.55*2 0.85*3

Met 1.00 1.80 1.70 1.72 2.70 1.13 0.53*3 3.66 2.30 1.72 1.73 1.23 2.00 1.46

Phe 3.90 0.61 1.21 0.69 1.05 0.53 1.10 1.61 1.00 1.34 1.32 1.22 1.24 1.11

Thr 4.10 0.64 1.05 0.61 1.05 0.55 1.01 1.00 1.05 0.90 0.68 * 0.97 1.26 1.20

Trp 1.20 0.15*1 0.16*1 0.24*1 0.07*1 0.28*1 0.29*1 0.31*2 0.32*2 0.32*1 0.39*1 0.33*1

Val 4.50 0.63 1.53 0.72 1.18 0.45*2 1.22 1.65 1.09 102 0.95 1.01 1.36 1.27

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 4. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. rosenbergii larvae muscle (Roustaian et al., 2000) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007).

Chemical score M. rosenbergii Squid Shrimp Fish Fish Poultry Feather Egg Sorghum Wheat Spirulina Artemia Soy meal Yeast meal meal meal I meal II meal meal dried meal meal dried

Arg 7.50 0.62 0.91 0.50 0.87 0.78 0.87 5.40 0.91 0.52*3 0.65 0.94 0.96 0.67

His 3.50 0.41*2 0.66*3 0.44*2 0.94 0.62 0.49 4.80 0.71*2 0.57 0.77 0.70*3 0.54*2 0.64*2

Ile 4.90 0.53*3 1.29 0.74 0.92 0.26*2 0.84 8.58 0.96 0.75 0.68 0.90 1.14 0.95

Leu 8.70 0.55 0.78 0.54 0.83*3 0.44 0.82 7.21 0.75*3 1.48 0.78 0.86 0.99 0.83

Lys 7.80 0.57 1.19 0.66 0.92 0.72 0.27*3 6.49 0.94 0.26*1 0.35*1 0.78 0.67*3 1.04

Met 2.20 0.82 0.77 0.78 1.23 0.51 0.24*2 11.63 1.05 0.78 0.78 0.56*2 0.91 0.66*3

Phe 10.60 0.22*1 0.44*2 0.25*1 0.39*1 0.20*1 0.41 4.10 0.37*1 0.49*2 0.49*2 0.45*1 0.46*1 0.41*1

Thr 4.70 0.56 0.91 0.53 0.91 0.48 0.88 7.19 0.91 0.79 0.59*3 0.84 1.10 1.05

Trp 1.50 0.40*1 0.45*3 0.67*2 0.20*1 6.11 0.80 0.84 0.88 0.88 1.08 0.89

Val 4.70 0.60 1.47 0.69 1.13 0.43*3 1.17 10.08 1.04 0.98 0.91 0.97 1.30 1.22

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 5. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. rosenbergii juvenile muscle (Tidwell et al., 1998) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007).

Chemical score M. rosenbergii Squid Shrimp Poultry Feather Sorghum Wheat Soy Spirulina Fish meal I Fish meal II Yeast meal meal meal meal meal meal meal dried Arg 7.89 0.59*3 0.86 0.47*2 0.82*1 0.74 0.83 0.50*2 0.62*2 0.90 0.91 0.64*3

His 3.76 0.38*1 0.61*1 0.41*1 0.88*2 0.58 0.45 0.53*3 0.72 0.66*2 0.50* 1 0.60*2

Ile 4.32 0.61 1.46 0.84 1.04 0.30*1 0.95 0.85 0.78 1.03 1.29 1.08

Leu 7.77 0.61 0.88 0.60*3 0.93 0.49 0.92 1.66 0.87 0.96 1.11 0.93

Lys 7.82 0.57 1.19 0.66 0.92 0.72 0.27*2 0.26*1 0.35*1 0.78*3 0.67* 2 1.04

Met 2.66 0.68 0.64*2 0.65 1.02 0.42*2 0.20*1 0.65 0.65*3 0.46*1 0.75*3 0.55*1

Phe 4.32 0.55*2 1.09 0.62 0.95 0.48 1.00 1.21 1.20 1.10 1.12 1.00

Thr 3.98 0.66 1.08 0.63 1.08 0.57 1.04 0.93 0.70 1.00 1.30 1.24

Trp 0.93 0.65*3 0.72 1.08 0.32*3 1.35 1.42 1.43 1.74 1.44

Val 4.58 0.62 1.51 0.71 1.16 0.44*3 1.20 1.00 0.93 1.00 1.33 1.25

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 6. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. americanum juvenile muscle (Yamasaki, 2012) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007).

Chemical score M. americanum Squid Shrimp I II Poultry Feather Sorghum Wheat Soy Spirulina Fish meal Fish meal Yeast meal meal meal meal meal meal meal dried

Arg 8.40 0.55*1 0.81*2 0.44*1 0.77*1 0.69 0.78*3 0.47*2 0.58*2 0.84*2 0.86*3 0.60*1

His 2.03 0.70 1.13 0.75 1.63 1.07 0.84 0.98 1.33 1.21 0.93 1.11

Ile 3.87 0.67 1.63 0.94 1.16 0.33*1 1.06 0.95 0.87 1.14 1.44 1.21

Leu 6.45 0.74 1.05 0.73*2 1.12 0.59 1.10 2.00 1.05 1.15 1.33 1.12

Lys 6.99 0.63*2 1.33 0.74*3 1.03 0.80 0.30*2 0.30*1 0.39*1 0.87*3 0.75*1 1.16

Met 2.36 0.76 0.72*1 0.73*2 1.14 0.48*2 0.22*1 073*3 0.73*3 0.52*1 0.85*2 0.62*2

Phe 3.47 0.68*3 1.35 0.77 1.18 0.60 1.24 1.51 1.49 1.37 1.39 1.25

Thr 3.17 0.83 1.36 0.78 1.36 0.71 1.31 1.17 0.88 1.25 1.63 1.55

Val 4.07 0.70 1.70 0.80 1.30 0.49*3 1.35 1.13 1.05 1.12 1.50 1.40

Evaluation of biological value of proteins for Macrobrachium

Table 7. Protein profile EAA (g amino acid per 100 g protein) of M. tenellum adults muscle (Espinosa et al., 2013) and chemical score of protein ingredients. *Limiting amino acid; 1 first limiting; 2 second limiting; 3 third limiting. I Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; II García-Galano et al. (2007).

Chemical score M. tenellum Squid Shrimp Poultry Feather Sorghum Wheat Soy Spirulina Fish meal I Fish meal II Yeast meal meal meal meal meal meal meal dried

Arg 7.11 0.66 0.96 0.52*2 0.91 0.82 0.92 0.55*2 0.69 1.00 1.01 0.71*2

His 2.52 0.57 0.91 0.61 1.31 0.86 0.67 0.79 1.07 0.98 0.75*3 0.89

Ile 4.04 0.64 1.56 0.90 1.11 0.32*1 1.02 0.91 0.83 1.10 1.38 1.16

Leu 8.08 0.59 0.84*3 0.58 0.89*3 0.47 0.88 1.59 0.84 0.92 1.07 0.89

Lys 9.60 0.46*2 0.97 0.54*3 0.75*2 0.58 0.22*2 0.22*1 0.28*1 0.63*2 0.55*1 0.84

Met 2.88 0.63 0.59*1 0.60 0.94 0.39*3 0.18*1 0.60*3 0.60*3 0.43*1 0.69*2 0.51*1

Phe 4.39 0.54*3 1.07 0.61 0.93 0.47 0.98 1.19 1.18 1.09 1.10 0.99

Thr 6.03 0.44*1 0.71*2 0.41*1 0.71*1 0.37*2 0.69 0.61 0.46*2 0.66*3 0.86 0.82*3

Trp 0.47 1.28 1.43 2.13 0.64*3 2.68 2.80 2.82 3.44 2.84

Val 3.94 0.72 1.75 0.83 1.35 0.51 1.40 1.17 1.08 1.16 1.55 1.45

CAPÍTULO 3. DIGESTIBILIDAD PROTEICA in vitro DE INGREDIENTES DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL PARA Macrobrachium tenellum

Publicado en:

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

In vitro protein digestibility of animal, vegetal and microbial feed ingredients by Macrobrachium tenellum

Cynthia Montoya-Martínez1, Héctor Nolasco-Soria2, Fernando Vega-Villasante1, Olimpia Carrillo-Farnés3, Alfonso Álvarez-González4, Roberto Civera-Cerecedo2 1Laboratorio de Calidad de Agua y Acuicultura Experimental. Centro de Investigaciones Costeras. Universidad de Guadalajara, Jalisco, México. 2 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C., La Paz, B.C.S., México. 3 Facultad de Biología. Universidad de La Habana, Cuba. 4 Laboratorio de Acuicultura Tropical. División Académica de Ciencias Biológicas. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México. Corresponding author: Héctor Nolasco ([email protected])

ABSTRACT Due to the cost of raw materials, the need to formulate balanced feeds with highly digestible ingredients is indispensable for the aquaculture feed industry. For this reason, the protein in vitro digestibility, assessed by the pH-stat method, of ingredients with potential of using them on the balanced feed for Macrobrachium tenellum, were evaluated. The relative protein digestibility was assessed in twelve feed ingredients, including animal (pork meal, feather poultry meal, prime poultry meal, turkey meal, fish meal, shrimp meal), vegetal (coconut paste, chickpea meal, soybean meal, wheat gluten) and microbial (yeast and Spirulina meal); casein (Hammerstein grade) was used as the reference protein. The highest relative protein digestibility was found in: Spirulina meal (52.6%); following by pork meal (45.6%), and feather poultry meal (39.6%). The lowest digestibilities were found in soybean meal (15.9%), chickpea meal (12.1%), and fish meal (11.6%). The protein digestibility value should be considered for selecting potential ingredients for the formulation of balanced feeds for M. tenellum. Keywords: Macrobrachium tenellum, prawns, nutrition, protein, enzyme activity, digestibility, aquaculture.

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

Digestibilidad proteica in vitro de ingredientes animales, vegetales y microbianos para Macrobrachium tenellum RESUMEN Debido al costo de las materias primas, la necesidad de formular alimentos balanceados con ingredientes altamente digestibles es indispensable para la industria de los alimentos acuícolas. Por esta razón, fue evaluada la digestibilidad in vitro de proteína, por el método pH-stat, de ingredientes con potencial de ser utilizados en alimentos balanceados para Macrobrachium tenellum. La digestibilidad relativa de proteína se evaluó en doce ingredientes alimenticios, incluyendo de origen animal (harina de cerdo, harina de ave prime, harina de pluma, harina de pavo, harina de pescado, harina de camarón), vegetal (pasta de coco, harina de garbanzo, harina de soya, gluten de trigo) y microbiano (levadura y harina de Spirulina); la caseína (grado Hammerstein) se utilizó como proteína de referencia. Las mayores digestibilidades relativas de proteína la presentaron: la harina de Spirulina (52.6%); seguida por la harina de cerdo (45.6%), harina de pluma (39.6%). Las digestibilidades más bajas se encontraron en harina de soya (15.9%), harina de garbanzo (12.1%) y harina de pescado (11.6%). La digestibilidad proteica debe ser considerada para la selección de ingredientes potenciales para la formulación de alimentos balanceados para M. tenellum. Palabras clave: Macrobrachium tenellum, langostinos, nutrición, proteína, actividad enzimática, digestibilidad, acuicultura.

INTRODUCTION The production of the aquaculture feed is one of the fastest growing sectors of animal feed worldwide (Rust et al., 2012). In aquaculture, feeding represents one of the highest production costs, according protein content and source, therefore the protein quality on the commercial feeds, is one of the most important nutritional parameters, as influence the prawns growth and the body composition (Chisty et al., 2009). The feed digestibility and assimilation are also very important to reduce its conversion into a source of water pollutants, with negative effects on the ecosystem (Terrazas et al., 2010b). An efficient feeding depends on the nutritional characteristics of the feed, its digestibility, and feeding strategy since they are essential elements in providing nutrients and energy needed for efficient growth of cultivated species (Carrillo-Farnés et al., 2007; Chisty et al., 2009).

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

The digestive capacity of the aquaculture species is sustained by the activity of digestive enzymes present in their digestive tract (Ali et al., 2009). The study of the digestive enzymes and nutrient digestibility is essential for understanding the mechanisms of digestion, and for being useful for selection of ingredients and feeds with higher nutritional value, for each species (Cruz-Suárez et al., 2002). Since the in vivo digestibility methods are lengthy and expensive, it has been necessary to apply in vitro methods, that are fast and reliable, for assessing protein digestibility, using the digestive enzymes of the species of interest (Nolasco et al., 2006). The pH-stat in vitro method has been widely used in the evaluation of the nutritional quality of raw materials and processed feeds, because it is simple, fast, and with high reproducibility (Moyano et al. 2014). The use of pH-stat system has proved to be suitable for checking the quality of the protein sources, for marine shrimp feed formulation (Ezquerra et al., 1998; Lemos et al., 2004, 2009). Although M. rosenbergii production has been profitable in some countries, just few studies have been performed on ingredient and feed digestibility (in vivo methods: Taechanuruk & Stickney, 1982; Ashmore et al., 1985; Ellis et al., 1987; Chin, 1988; Gomes & Peña, 1997). In general, information about native American species is limited (in vitro method: Manríquez-Santos et al., 2011). This research contributes to the knowledge of the protein in vitro digestibility, by using the pH-stat method, of protein from animal, vegetal and microbial origin, with actual or potential for inclusion in feeds for M. tenellum.

MATERIALS AND METHODS Preparation of enzyme reagent Twenty-six pre-adults prawns (4-10 g) of M. tenellum, at intermolt stage, randomly collected from an artificial pond located at the Centro Universitario de la Costa (CUCOSTA), Universidad de Guadalajara, in Puerto Vallarta, Jalisco, Mexico, were used. The prawns were weighed (0.01 g precision, Ohaus, NJ, USA) and then were sacrificed by immersion in ice water, and subsequent freezing (-20ºC). Stomach and digestive gland of M. tenellum were dissected and weighed. One single pool of organs was homogenized, adding distilled water (1:4 w/v) in cold bath, with a homogenizer (Pro Scientific, Pro 200, OC, USA). The enzymatic extract (EE) was clarified by

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum centrifugation (20,800 x g, 8 min, 10°C), the lipid fraction was removed and the supernatant was recovered. The EE was immediately stored at -20°C until use for protein content and enzymatic activity. The enzymatic reactive (ER) for determining in vitro protein digestibility of feed ingredients, was prepared as follows: the enzymatic extract was homogenized (homogenizer Pro Scientific) pH was adjusted to pH 8.0, with sodium hydroxide (NaOH 1M). The ER was stored at -20ºC until use. All assays were performed by triplicate.

Determination of protein and enzyme activity in enzymatic extract (EE) The EE concentration for soluble protein was determined by the Bradford method (1976), by using bovine serum albumin (A4503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) as a standard. The activity of total proteases was determined according Vega-Villasante et al. (1995) using azocasein (2% in Tris-HCl 50 mM, pH 7.5) as substrate. The specific activity of general protease was expressed in U protease /mg protein (a unit of protease is defined as the amount of the enzyme required to increase 0.01 U absorbance by min, at 440 nm). The chymotrypsin activity was determined according Delmar et al. (1979), and trypsin activity by the modified micromethod based on Erlanger et al. (1961), using SAAPNA (No. S7388, SIGMA, St. Louis, MO, USA), and BAPNA (No. B3133, SIGMA, St. Louis, MO, USA) (9.6 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO)), as a substrate, respectively. The specific activity of trypsin and chymotrypsin was expressed as U /mg protein (a unit of trypsin and chymotripsin is defined as the amount of enzyme required to release 1 µMol of p-nitroanilide /min). The amylase activity was determined to Vega-Villasante et al. (1993), using a starch solution (1% in Tris-HCl, 50 mM pH 8.0) as substrate. The specific activity of amylase was expressed U amylase /mg protein (a unit of amylase is defined as the amount of enzyme required to release 1 µMol maltose /min). The lipase activity was determined according to Versaw et al. (1989), using ß- naphthylcaprilate as substrate. The specific activity of lipase expressed in U lipase /mg protein (a unit of lipase is defined as the amount of the enzyme required to release 1 µMol of β- naphthol /min).

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

In vitro protein digestibility The twelve ingredients used were: pork meal (meat and bones, USA); poultry meal (poultry products prime, USA); hydrolyzed feather meal (USA); turkey meal (60% turkey and 40% poultry products, USA); fish meal (sardine, Mexico); shrimp meal (Mexico), all animal meal were supplied by Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.; coconut paste hydrolyzate by Copreros Unidos por Tabasco S. de P.R. de R.L. (Mexico); chickpea meal elaborated in the Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-IPN unidad Sinaloa, Mexico); soybean meal by Procesadora de ingredientes, S.A. de C.V. (Mexico); wheat gluten by Arancia Ingredientes Especiales (Mexico); Spirulina meal by Producción y Comercialización de Microalgas y sus Derivados GENIX (Cuba); Bakers' yeast (Saccharomyces cerevisiae) by SAFMEX, S.A. de C.V./FERMEX, S.A. de C.V.(Mexico) and Hammerstein grade bovine casein (No. 101289, MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA). The chemical composition is presented in Table 1. All the ingredients were ground, in a coffee grinder, and sieved to 250 µm. The in vitro protein digestibility was performed by the pH-stat method (Nolasco, 2008). Adding the corresponding amount of ingredient to have 6.25 mg of protein mL-1, the pH was adjusted 8.0, with sodium hydroxide (NaOH 1M). To start the digestion 10 U protease of the ER of M. tenellum, were added, with an initial reaction volume of 5 mL, and incubated in the pH-stat (Metrohom 842 Titrando, Herisau, Switzerland) at pH 8, for 30 min at 25°C, under stirring (120 rpm). The consumption NaOH (0.02M) required to maintain the pH at 8.0 was recorded, and the number of moles of NaOH /min was calculated, using casein as reference protein. All tests were performed in triplicate. For the controls, of each ingredient, the procedure was performed in the same way, but using denatured (heat treatment at boiling water bath, for 10 min) ER. The relative digestibility (RD) was expressed according to the following formula:

Consumption of NaOH / min by the hydrolysis of the problem sample RD (%) = x 100 Consumption of NaOH / min by the hydrolysis of the reference protein

The correlation coefficient between the percentage of crude protein (CP) of the ingredients and RD was evaluated, with the purpose to determine if these data could be used to predict the digestibility of ingredients in prawn.

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

A test for normality Kolmogorov-Smirnov (α=0.05) and homogeneity of variance Bartlett (α=0.05) before the variance analysis (ANOVA) of a track, was applied. Statistically significant differences (P < 0.05) between treatment means were determined by the method of multiple comparisons of Tukey. All tests were performed using the statistical software versión11.0 SigmaPlot (Systat Software, Inc. Chicago, IL, USA). The values of the concentration of CP ingredients were correlated with the results of RD and statistically analyzed to determine their correlation coefficient.

RESULTS The enzyme activity in the enzymatic extract (EE) is shown in Table 2. The finding significant differences (P < 0.05) of RD, of ingredients used in this study is shown in Fig. 1. Spirulina meal showed the highest digestibility (52.6%), followed by the pork meal (45.6%); and the lowest digestibility was found in chickpea meal (12.1%), and fish meal (11.6%). The correlation between the CP concentration of the ingredients and the RD, was not significant, with a correlation coefficient of r2 =0.25, with P > 0.05.

DISCUSSION The search for new sources of available, nutritious and cheaper protein has been a constant need in the development of aquaculture feed (García-Galano et al., 2007). The digestibility of an ingredient depends not only on its protein content, as show the results of correlation between the CP concentration and RD, obtained in this study. This depends on many other factors such as the physical properties (i.e. particle size, solubility, etc.), and chemical properties (i.e. amino acid content); but also biological characteristics of the animal; the architecture of the digestive tract, and physiology will affect protein digestibility, and also environmental conditions are important (pH, temperature, salinity, ions); all these aspect should be considered for the determination of in vitro protein digestibility of ingredients or feed (Cruz-Suárez, 1996; Ezquerra et al., 1998; Carrillo-Farnés et al., 2007). However, most of the new protein ingredients have not been assessed from the digestibility point of view (Álvarez-González, 2003). The digestibility results of the different protein sources, as potential ingredients for M. tenellum in this research, confirms that M. tenellum is omnivorous; and that the species is able

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum to efficiently digest a variety of ingredients of microbial, animal and plant origin. Bhavan et al. (2010), in M. rosenbergii postlarvae fed enriched Artemia with Spirulina or yeast, found that both produced favorable growth, but Spirulina produced higher growing effect than yeast. This is probably due not only to the quality of its nutrients but also to its digestibility, the highest recorded in the present study. In this context, Zhao et al. (2015) proved that shrimp feed in which fish meal was replaced by yeast extract, showed a higher apparent protein digestibility (APD) than control treatment in Penaeus vannamei, stating that approximately 45% of fish meal can be replaced by the yeast extract, in the presence of fish oil, phosphorus and calcium. For M. rosenbergii postlarvae, Prasad et al. (2013) suggest that feeds containing 0.5% S. cerevisiae yeast, are suitable to promote growth, although Seenivasan et al. (2014) reported that yeast inclusion levels at 4%, improved growth, enzyme activity, and amino acid production. Similarly, Parmar et al. (2012) demonstrated that 1% yeast inclusion in the diet improve the immune response, and control of white muscle disease. Therefore, Spirulina meal and yeast could be used as feed supplements for Macrobrachium species. Related to the in vitro protein digestibility evaluations on different protein sources, Lemos et al. (2004) by pH-stat method and using digestive proteases of Farfantepenaeus paulensis juveniles, reported that Brazilian fish meal, meat meal and wheat meal presented the highest values of protein hydrolysis; in contrast the less digestible ingredients were soybean meal, Mexican fish meal, and blood meal; particularly, soybean meal showed high inhibitory effects (38%) on shrimp proteases. Manríquez-Santos et al. (2011) evaluated the protein in vitro digestibility of nine ingredients by the pH-stat method, using a multienzyme extract of M. carcinus, and using casein as reference protein. They found the highest values on yeast, beef blood meal, and pork meal; in contrast, the lowest digestibility values were found on soybean paste, fish meal, and fish hydrolyzate. In general, relative digestibility and protein hydrolysis values were higher (88.3-189.0% and 27.8-59.5%, respectively), than those reported in other studies (Ezquerra et al. 1998; Lemos et al., 2004; Nieto et al., 2005). Our the results are in agreement with Manríquez-Santos et al. (2011) with M. carcinus, and Lemos et al. (2004) with F. paulensis, suggesting that pork meal, and poultry meal are a good alternative to be used in the feed formulation for prawns. In this regard Cruz-Suárez et al. (2007), reported that poultry meals are a good amino acids and cholesterol source for P.

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum vannamei; moreover, according digestibility coefficients, fish meal protein can be replaced up to 80% with poultry meal. Yu (2006) considers that 60% fish meal replacement as the maximum, in order to do not affect the growth, due to a low essential amino acids (EAA) ingestion by reducing high digestible (84%) fish meal. In the case of Macrobrachium, Yang et al. (2004) evaluated the potential use of poultry by product meal and meat and bones meal as alternative dietary protein sources, finding that both could replace up to 50% protein fish meal in diets for M. nipponense. Hossain & Islam (2007) considers that the meat and bone meal could be replacing 14% the fish meal in diet of M. rosenbergii postlarvae. The low digestibility of soybean meal, obtained in this investigation, coincide with values reported for F. paulensis (Lemos et al., 2004) and M. carcinus (Manríquez-Santos et al., 2011). Campaña-Torres et al. (2005) reported that APD of plant origin ingredients was higher than those of animal origin; the highest digestibility was found on soybean meal, in Cherax quadricarinatus juveniles. Also, Chin (1988), evaluated APD in juvenile, adults and females of M. rosenbergii, reporting that coconut paste, wheat flour, and soybean meal were better digested than fish, and shrimp meal (by juvenile and adults); although soybean meal digestibility results do not coincide with our study, but match about the low digestibility of shrimp meal, and fish meal. Hasanuzzaman et al. (2009), in feeding trials with soybean meal, obtained a higher weight, protein efficiency ratio and feed conversion, in M. rosenbergii juveniles with diets with 80% of fish meal replacement by soybean meal. García-Ulloa et al. (2008), in M. tenellum juveniles, compared the growth of prawns fed isoproteic diets (40% CP), replacing fish meal by soybean meal (20, 40, 60, 80 and 100% (w/w) of substitution), finding no significant differences in any of the evaluated growth parameters. This could be due to that reported in present study, where no significant differences on protein digestibility between fish meal and soybean meal was found. Besides Montoya et al. (2016) when comparing the essential amino acids (EAA) profile, of different ingredients, with M. tenellum muscle, found that fish meal (CP> 60%), and soybean meal (47% CP), both only have three limiting amino acids (threonine, lysine, leucine and methionine, lysine, threonine, respectively). The relative low digestibility of fish meal, obtained in the present study, is according with Campaña-Torres et al. (2005) who found low digestibility of fish meal by C. quadricarinatus juveniles. Lemos et al. (2004) concluded that the differences in protein

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum digestibility of fish meals may be related to the freshness of the raw material used in its production, exhibiting higher digestibility less fresh fish meals, possibly due to hydrolysis during decomposition of the raw material. In this respect, García-Galano et al. (2007) indicate that fish meal used in aquaculture feeds, may vary its quality according fish species used as raw materials, methods of manufacture, cooking and drying temperature, used during processing; also fish meal quality affects the availability of nutrients (Terrazas-Fierro et al., 2010b). Our study is according with the results obtained by Nieto et al. (2005), who found significant differences between degree of hydrolysis (DH) (21.6 to 39.6%) of 15 different fish meals, by in vitro digestibility in pH-stat system using P. vannamei enzymes, these authors consider that the pH-stat method works better on fish meal with high level of protein and low level of ash. Therefore, the low digestibility, found for fish meal in this study may due to low quality (low protein content, <60% CP and high ash content, >18%), according to the classification used by Nieto et al. (2005). In addition, when comparing the EAA profile, according M. tenellum muscle profile (Montoya et al., 2016), the amino acid composition of sardine fish meal (used in our experiment) was adjusted to a lesser extent if compared with to tuna fish meal (with the highest protein content), also according to its amino acid content according to Terrazas et al. (2010a), who proposed that amino acid profile of the tissue of aquaculture animal, must be considered for selecting ingredient for feed formulation, for any species. In conclusion, the best digestible ingredient for M. tenellum was the Spirulina meal, followed by pork meal, and poultry meal, with high potential be used to formulate diets for prawns, particularly to Macrobrachium species. However, future research work include in vivo digestibility test and feeding trials with diets with the best ingredients, selected by in vitro protein digestibility test, to determine the optimal inclusion level of these ingredients.

ACKNOWLEDGMENTS We want to thank to Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V. for donating the animal meals used in this research. To Patricia Hinojosa Baltazar, for technical support in the Laboratory of Comparative Physiology and Functional Genomics CIBNOR. To Dr. Ernesto Goytortua Bores, for technical support in the Laboratory of Animal Nutrition and Food Plant at CIBNOR.

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

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Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

Table 1. Proximal composition of ingredients.

Ingredients Protein Lipids Ash Pork meal 57% 10% 28% Poultry meal 66% 16% 14% Feather meal 77% 3% 1% Turkey meal 57% 14% 26% Fish meal 59% 16% 15% Shrimp meal 48% 12% 26% Soybean meal 46% 1% 8% Coconut paste 21% 2% 10% Chickpea meal 20% 7% 4% Wheat gluten 83% 1% 1% Spirulina meal 65% 6% 12% Yeast 44% 6% 10%

Table 2. Digestive enzyme activity (average ± SE) in M. tenellum. Enzyme U/mg protein General proteases 1.254 ± 0.31 Trypsin 0.018 ± 0.01 Chymotrypsin 0.004 ± 0.0005 Amylases 0.634 ± 0.47 Lipases 0.746 ± 0.23

Digestibility of ingredients for Macrobrachium tenellum

Figure 1. Relative protein digestibility (RD) of ingredients for M. tenellum. The digestibility of Casein Hammerstein type was considered as 100% (0.0068 µmol of peptide bonds hydrolyzed per min). Bars represent RD ± SE (standard error). Columns with differing letters are significantly different (P < 0.05).

CAPÍTULO 4. EFICIENCIA DE SISTEMAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ATRACTABILIDAD DE ALIMENTOS E INGREDIENTES EN Macrobrachium tenellum

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Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Evaluation of different maze systems for the determination of feed

attractability for longarm river prawn Macrobrachium tenellum

Cynthia E. Montoya-Martínez1, Cristian D. Carrillo-Pérez1, Héctor Nolasco-Soria2, Alfonso Álvarez-González3, Olimpia Carrillo-Farnés4, Roberto Civera-Cerecedo2 & Fernando Vega-Villasante1 1Laboratorio de Acuicultura Experimental, Centro de Investigaciones Costeras Universidad de Guadalajara, Jalisco, México. 2Programa de Acuacultura, Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C. La Paz, B.C.S., México 3Laboratorio de Acuicultura Tropical, División Académica de Ciencias Biológicas Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, Tabasco, México 4Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba Corresponding author: Fernando Vega-Villasante ([email protected])

ABSTRACT Previous studies have shown that crustacean feed attractability has an enormous importance, because the consumption, quality and feed conversion rate can be improved, by reducing the time of residence pre-ingestion and the leaching of nutrients. For this reason, different protocols and methods has been developed to measure feed attractability. This study evaluated the use of maze type Y, and rectangular systems to determine the attractant power of a commercial feed on longarm river prawn Macrobrachium tenellum. The Y type maze system without barriers, and with three different types of barriers (with or without access to the area where a commercial feed) was evaluated. Ten prawns were placed in the acclimation chamber of the system at 28°C for 60 min before the start of the experiment. To start the test, commercial feed (20% of prawn biomass) was placed into the system feeding area, then the acclimation chamber was open to allow for the free prawn movement, evaluating the feed attractability by measuring the time for the first “hit”, total number of hits, and the number of prawns which entrances to the feeding area during 15 min. Similar tests were performed with a rectangular type maze system, comparing the atractability results obtained in both systems. The results presented here highlight the importance of the genus behavior and the selection of

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum protocols and systems, as well as the materials used in its maze system construction, for attractability testing in M. tenellum. Keywords: Macrobrachium tenellum, prawn, feed formulation, attractants, feeding behavior, Y type maze.

Evaluación de diferentes sistemas de laberintos para la determinación de la atractabilidad de alimentos para el langostino de río longarm Macrobrachium tenellum

RESUMEN Estudios previos han demostrado que la atractabilidad de los alimentos para crustáceos tiene una enorme importancia, ya que el consumo, la calidad y la tasa de conversión alimenticia pueden mejorarse, al reducir el tiempo de residencia antes de la ingesta y la lixiviación de nutrientes. Por esta razón, se han desarrollado diferentes protocolos y métodos para medir la atractabilidad del alimento. Este estudio evaluó el uso de laberinto tipo Y, y sistemas rectangulares para determinar el poder atrayente de un alimento comercial en langostino de río Macrobrachium tenellum. Se realizaron pruebas con el sistema de laberinto tipo Y sin barreras, y con tres diferentes tipos de barreras (con o sin acceso al área donde se encuentra el alimento comercial). Diez langostinos fueron colocados en la cámara de aclimatación del sistema a 28 °C durante 60 minutos antes del inicio del experimento. Para comenzar la prueba, se colocó el alimento comercial (20% de la biomasa de los langostinos) en el área de alimentación del sistema, luego se abrió la cámara de aclimatación para permitir el libre movimiento de los langostinos, evaluando la atractabilidad del alimento midiendo el tiempo para el primer "hit", número total de hits, y el número de langostinos que ingresan al área de alimentación durante 15 minutos. Se realizaron pruebas similares con un sistema de laberinto de tipo rectangular, comparando los resultados de atractabilidad obtenidos en ambos sistemas. Los resultados presentados aquí resaltan la importancia del comportamiento del género y la selección de protocolos y sistemas, así como los materiales utilizados en la construcción de los sistemas de laberinto para la evaluación de atractabilidad en M. tenellum. Palabras clave: Macrobrachium tenellum, langostino, formulación de alimento, atrayentes, comportamiento alimenicio, laberinto tipo Y.

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

The elaboration of attractive animal feed for species in aquaculture, allows to minimize searching time and maximize the proportion of ingested feed and thereby reduce costs, to promote feed conversion rates, and to reduce feed waste (Nunes et al., 2006; Tantikitti, 2014). The evaluation of the feed attractability is basic to improved feed ingestion under low visibility conditions in cultivation ponds. Freshwater prawns of the genus Macrobrachium have the chemosensory systems for feed location and intake (Harpaz et al., 1987; Suresh et al., 2011). The study of feed chemoattractability in crustaceans has shown different results that can be due specific species behavior, but also could be attributed to the experimental methodological inconsistencies (Sánchez et al., 2005). There are different maze aquariums systems where organism behavior under one or several attractant stimuli has been tested (Ali et al., 2007; Montemayor-Leal et al., 2005; Suresh et al., 2011; Sacristán et al., 2014), including Y type and rectangular type maze systems. All types of systems (static or with water flow, with or without barriers, with free feed or into a container) are used to observe the attractant preference of organisms towards a particular feed, ingredient or specific type of chemical compounds (commercial attractants, animal and plant extracts, amino acids, nucleotides, amines, pheromones, etc.). In general, the responses are quantified by animal behavior reactions and/or the number of organisms that arrive at the source of chemical stimuli in a certain time. Most of the studies on this subject have been directed to penaeidae shrimp (marine); however, on Macrobrachium genus the evaluation of feed attractants is limited. Because M. tenellum is one of the most economically important native species in Mexico (Pérez- Velázquez et al., 2011), this work aims to evaluate different attractability systems to establish a proper methodology for studies of chemoattraction of feed and feed ingredients in prawns. To date, there are no studies that evaluate systems of feed attractability in prawn of the genus Macrobrachium and take into account the behavior of the genus in the obtained results. Attractability tests were held at the facilities of the Laboratorio de Calidad de Agua y Acuicultura Experimental de la Universidad de Guadalajara, in Puerto Vallarta, Jalisco, Mexico. Juvenile organisms of longarm river prawn M. tenellum were used (1 to 2 g of weight) collected in the stream El Zarco, in Puerto Vallarta. The prawns (70) were acclimated for 15 days in glass aquariums of 40 L capacity, with waterfall filters (Elite®) and temperature of 28°C, with a feeding regimen of commercial shrimp feed (Camaronina®, Purina®, 35%

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum protein, humidity 12%, fat 8%, crude fiber 5%, ash 10%, nitrogen free extract 30%) on a fixed feeding schedule of 10:00 to 13:00 h. Prawns in intermolt phase were selected to avoid any possible interference of this phenomenon on the process of perception, as it is noted by Montemayor-Leal et al. (2005). The prawns were fasted for 24 h prior to attractability bioassays in order to emphasize the response (Nunes et al., 2006; Jaime-Ceballos et al., 2007) in all experiments, water was kept at 28ºC, and with a 100% water exchange in every trial. For the first chemoattractability bioassay, a Y type maze system was used (Fig. 1a). The aquarium Y type maze system has an acclimatization section (R), in which prawns are placed before starting tests. The R area has a retainer gate that can be removed to give to the pawns access to the neutral zone (N), after that there are two arms (sections A and B) with or without a dividing walls (DW) as a barrier, forming at the end of the arm the feed chamber (C), in where the feed materials to be tested are placed. In this bioassay, no DWs were used, in order to give free access to the prawns to sections A and B. Ten prawns were placed in the section R in the Y type maze system, to carry out its acclimatization (constant aeration and temperature of 28°C) for one hour prior to the beginning of the experiment. A camera (GoPro® Hero 3) was placed to register prawn behavior. The commercial feed was placed as attractive material (20% of the total biomass of organisms) in section C, using an aeration stone attached to a pump to promote the dispersion of the soluble molecules of the feed along the Y maze for 10 min. After removing the retainer gate of section R, the video recording was held for 15 min. Each test was performed in triplicate. The videos were subsequently analyzed with Quick Time Player (version 10.1). The videotaping was conducted to quantify the number of prawns accessing to section C for 15 min. The second bioassay was performed to assess the effectiveness of three different DW in the Y type maze system (Fig. 1b): Each DW were rectangular (15×19 cm) with the following designs and materials: a) mesh with a conical shape plastic (PET) access port (6 cm in diameter for input and 2 cm of diameter for output), so the prawns would have access to the tested feed; b) acrylic with small holes (3 cm in diameter) to allow the water flow, and with truncated pyramid-shaped acrylic access port (5×4 cm of entrance and 3×2 cm for the exit) that allows, to the prawns access to feed; c) acrylic with small holes (3 cm in diameter), but without entrance, with no access to feed. The feed attractability was evaluated through the analysis of the videos, recording the total number of "hits" (contact of the prawn with their

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum legs or rostrum with the DW during the 15 min of testing) (Fig. 1a). Also, it was established the time required for the first "hit". Additionally, the number of prawns accessing to section C for 15 min (only for the DW that have access entrance) was recorded. Another test was performed with a conventional rectangular type maze system (Jaime- Ceballos et al., 2007) divided by two internal barriers (forming three compartments), which have an opening at the top (Fig. 2a). Ten prawns were placed in the central part of the maze system, having access to the other two sections through the openings. The feed was deposited randomly in one of the two feed areas of the aquarium (20% of the prawn total biomass). The videotaping was conducted to quantify the prawns that moved to each of the areas during 15 min. The fourth test was conducted with rectangular type maze system used by Suresh et al. (2011) with a DW (opaque) between the A and N, as allow the prawns access to feed (Fig. 2b). A video camera (GoPro®) was placed at the front of the aquarium to register the prawn behavior. Ten prawns were placed in the R section for acclimatization at 28°C for 60 min, prior to the beginning of the trial. To start, the commercial feed (20% of the biomass of prawns) was placed at the end of the region A. After 5 min the gate of R section was removed, to allow access to the prawns to A section for 15 min. The videotaping was observed to record the total number of hits, the time required for the first hit, and the number of prawns which entered in section A, at the end of the 15 min trial. The evaluation of the attractability was repeated six times. The attractability results obtained in the rectangular type maze system were compared with attractability data obtained with Y type maze system with acrylic barrier and entrance; also the results of the use of barriers in the Y type maze system were analyzed statistically using one way variance (ANOVA) previous normality test (Shapiro-Wilk;  = 0.05) homoscedasticity (Bartlett;  = 0.05). The differences were considered statistically significant when P < 0.05. The data were analyzed with the statistical program Sigma plot 11.0. In the evaluation of the Y type maze system, with any of the barriers, no significant differences of attractability were found (P > 0.05) by evaluating the total number of hits, time required for the first hit and the number of prawns which entered through the barriers to feed section (C) (Table 1). In the comparison of the Y type maze system (with acrylic barrier and entrance) and the rectangular type maze system with a single barrier, significant differences

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum were found in the number of prawns which entered into the feeding section, of each of the systems (Table 1). The response of crustaceans to the food effectors have been studied due to its relevance in the understanding of feeding behavior and their applications in aquaculture (Sánchez et al., 2005; Smith et al., 2005; Nunes et al., 2006; Grey et al., 2009; Tolomei et al., 2013; Sacristan et al., 2014). It is necessary to emphasize that the literature about feed stimulants for prawns of the genus Macrobrachium is limited, compared to works that have been made about marine shrimp or other crustaceans. For attractability experiments carried out with M. rosenbergii a simple rectangular type aquariums, have been used; where the feed (stimulus) is placed at one end, while the organism is placed in the opposite extreme. Authors found significant differences among the treatments (evaluating attractants such as free amino acids, nucleotides and biogenic amines and pheromones) (Harpaz et al., 1987; Mendoza et al., 1997). Lee & Meyers (1996) highlighted some of the limitations of the used methodologies, commenting that there is a need to perform several tests under different conditions and type of aquariums to avoid misinterpretation and to improve the methodology to select the best ingredients to develop a stimulating useful feed. The first bioassay to validate the use of the Y type maze system was carried out according the methodology used by Nunes et al. (2006) who evaluated attractability of commercial ingredients in Penaeus vannamei, placing the ingredient freely at the end of each of the arms without using any kind of DW, allowing the entry of the prawn into the feeding area. However, based on what was observed in the present study, the agonistic behavior of the longarm river prawn M. tenellum must be considered, since they are territorial animals and the confluence of several specimens near the feed, causes aggressive behavior and the escape of some of them, without accessing C or otherwise taking a piece of food and withdrawing immediately (which causes that the source of stimulus is also displaced). For this reason, the feed attractability evaluation in M. tenellum, was tested using a maze systems with a DW. In the second bioassay where different types of DW in the Y type maze were evaluated, it was noted that the longarm river prawn, tend to move around the aquarium, regardless of where the food was located. Coinciding with Sacristan et al. (2014), who finding no significant differences by incorporating, in different percentages, squid meal in feed for

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Cherax quadricarinatus, and proposed the hypothesis that freshwater decapods mainly find feed due to the time spent roaming in the aquarium. In the third bioassay, it was used the rectangular type maze aquarium described by Jaime-Ceballos et al. (2007), who evaluated Spirulina platensis meal as an attractant for P. schmitti finding that 68% of shrimps moved to the Spirulina feed chamber, and kept eating the feed, while the rest moved to the control feed chamber. In our study was observed shows that the residence time of the prawns in the acclimation area was very brief, moving immediately to any of the two chambers (even when the feed had not been placed in the system). Therefore the use of this rectangular type maze aquarium was not considered suitable for the feed attractability evaluation for M. tenellum. The fourth bioassay was conducted with a rectangular maze system with a single feeding chamber and having a DW with open access used by Suresh et al. (2011) to evaluate the attractability of different types of protein ingredients in P. stylirostris. In the comparison of the Suresh et al. (2011) system with the Y type maze system, just considering the number of entries into the feed chamber, is likely that used DW material interferes with the chemical signs perceived by the prawns, or the area of acclimation of the Y type maze system is very large. Because it is observed that when the prawns come to the DW their receptors play a fundamental role, since as soon as they detect the presence of it (both by tactile stimuli or light reflections generated by the acrylic barriers) most of the time go backward or move away (usual behavior demonstrated in the face of threat), this can be observed in the difference of the amount of prawns that enter the area C when the maze is used without DW. In addition, prawns preferably tend to stay in the R zone, which apparently is considered as a safe area than the Y arms areas, even if there is a higher concentration of chemical compounds of feed in arm areas. It is possible that the results obtained in the present study could be related with the behavior of the longarm river prawn that is quite different from the marine shrimp. It is suggested that the process of adaptation of prawns from fresh water has resulted in many different adaptations due to competition, predation, habitat complexity, biotic interactions and events of disturbance (Covich et al., 2015) provoking, in our point of view, not only speciation, but suggesting the evolution of an elaborated agonistic feeding behavior. According to Crowl & Covich (1994), freshwater decapod crustaceans have a high capacity to

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum receive and interpret feed chemical and physical (tactile) stimuli and react with aggressiveness against others including its congeners in a way that confers an adaptive advantage to getting feed. In this sense the acceptance of the prawns to attractive molecules are not only influenced by the intensity of such chemical signals, but also by the environment in which animals are maintained (changes in the intensity and quality of light, the hydrodynamics or direct stimulation), and relationships between them. In the evaluation by the hit as attractability indicator, due that no significant differences were found in Y type maze system with any of the three tested of DW, or in its comparison with the rectangular system, any could be used to determine the attractability of feed for M. tenellum. For evaluate attractability by the number of pawns that enter into the feeding chamber, it is recommended to use an opaque material in the DW (provoking less disturbing of normal behavior). Another option is not use DW, however it would be necessary to use some feed container, which allow dispersion of attractant chemical compounds. The results presented here highlight the importance of the genus behavior and the selection of protocols and systems, as well as the materials used in its maze system construction, for attractability testing in M. tenellum, to the search for adequate responses related to prawns feeding behavior.

REFERENCES Ali, S.A., C. Gopal & J.V. Ramana. 2007. Attractant and growth promoting properties of some feed materials and chemicals incorporated in the diets for Penaeus monodon (Fabricius). Indian J. Fish, 54(1): 67-73. Covich, A.P. 2015. Freshwater crustaceans: adaptations to complex inland habitats and species interactions. In: M. Thiel & L. Watling (eds.). Natural history of Crustacea: life styles and feeding biology of the Crustacea. Oxford University Press, New York, 2: 337-378. Crowl, T.A. & A.P. Covich. 1994. Responses of a freshwater shrimp to chemical and tactile stimuli from a large decapod predator. J. N. Am. Benthol. Soc., 13(2): 291-298. Grey, M., I. Forster, W. Dominy, H. Ako & A.F. Giesen. 2009. Validation of a feeding stimulant bioassay using fish hydrolysates for the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. J. World Aquacult. Soc., 40(4): 547-555.

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Harpaz, S., D. Kahan, R. Galun & I. Moore. 1987. Responses of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, to chemical attractants. J. Chem. Ecol., 13(9): 1957-1965. Jaime-Ceballos, B., R. Civera-Cerecedo, H. Villarreal, J. Galindo-López & L. Pérez-Jar. 2007. Uso de la harina de Spirulina platensis como atrayente en el alimento para el camarón Litopenaeus schmitti. Hidrobiológica, 17(2): 113-117. Lee, P.G., & S.P. Meyers. 1996. Chemoattraction and feeding stimulation in crustaceans. Aquacult. Nutr., 2(3): 157-164. Mendoza, R., J. Montemayor & J. Verde. 1997. Biogenic amines and pheromones as feed attractants for the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Aquacult. Nutr., 3(3): 167-173. Montemayor-Leal, J., R. Mendoza-Alfaro, C. Aguilera-González & G. Rodríguez-Almaraz. 2005. Moléculas sintéticas y extractos animales y vegetales como atractantes alimenticios para el camarón blanco Litopenaeus vannamei. Rev. AquaTIC, 22: 1-10. Nunes, A.J., M.V. Sá, F.F. Andriola-Neto & D. Lemos. 2006. Behavioral response to selected feed attractants and stimulants in Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Aquaculture, 260: 244-254. Pérez-Velázquez, P.A., S. Hernández-Ventura, P. Ulloa-Ramírez, J.L. Patiño-Valencia & J. Tovar-Ávila. 2011. La pesca del langostino (Macrobrachium tenellum) en la Laguna de Mexcaltitán, Nayarit, una alternativa económica regional. Cienc. Pesq., 19(1): 13-20. Sacristán, H.J., H. Nolasco-Soria & L.S.L Greco. 2014. Effect of attractant stimuli, starvation period and food availability on digestive enzymes in the redclaw crayfish Cherax quadricarinatus (Parastacidae). Aquat. Biol., 23: 87-99. Sanchez, D.R., J.M. Fox, A.L. Lawrence, F.L. Castille & B. Dunsford. 2005. A methodology for evaluation of dietary feeding stimulants for the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. J. World Aquacult. Soc., 36(1): 14-23. Smith, D.M., S.J. Tabrett, M.C. Barclay & S.J. Irvin. 2005. The efficacy of ingredients included in shrimp feeds to stimulate intake. Aquacult. Nutr., 11: 263-272. Suresh, A.V., K.P. Kumaraguru & S. Nates. 2011. Attractability and palatability of protein ingredients of aquatic and terrestrial animal origin, and their practical value for blue shrimp, Litopenaeus stylirostris fed diets formulated with high levels of poultry byproduct meal. Aquaculture, 319: 132-140.

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Tantikitti, C. 2014. Feed palatability and the alternative protein sources in shrimp feed. Songklanakarin J. Sci. Technol., 36(1): 51-55. Tolomei, A., B. Crear & D. Johnston. 2003. Diet immersion time: effects on growth, survival and feeding behaviour of juvenile southern rock lobster, Jasus edwardsii. Aquaculture, 219: 303-316.

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Figure 1. a) Y type maze system with the representation of the hit, b) barriers used in the experiment (from left to right): mesh with entrance, acrylic with entrance, and acrylic without entrance.

Figure 2. Rectangular type maze systems used in the third and fourth bioassay. a) According to Jaime-Ceballos et al. (2006), to start the test, the feed is randomly placed in right or left section, b) according to Suresh et al. (2011), to start test, feed is placed in section A, then the gate between R and N sections is removed.

Attractability of feed in Macrobrachium tenellum

Table 1. Comparation of attractability values (Average ± SE) between tested maze systems.

Number of Time for the first Number of Systems or aquarium Total hits observations hit (seconds) entrances

Maze Y without barriers 3 - - 23.20 ± 6.26 mesh 6 126.67 ± 115.20 17.67 ± 4.32 0.60 ± 0.89 Maze Y Acrylic with entrance 6 53.50 ± 35.54 22.67 ± 13.32 2.40 ± 1.67b Acrylic without entrance 6 74.67 ± 33.25 24.67 ± 6.56 - Rectangular system (Suresh et al., 2011) 6 108.00 ± 89.91 25.20 ± 12.56 9.80 ± 5.17a The different superscripts indicate significant statistical differences (P < 0.05).

CAPÍTULO 5. ATRACTABILIDAD Y PALATABILIDAD DE INGREDIENTES EN LANGOSTINOS Macrobrachium tenellum

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Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

Attractability and palatability of ingredients in longarm river prawn Macrobrachium tenellum feed

Cynthia Montoya-Martínez1, Héctor Nolasco-Soria2, Fernando Vega-Villasante1, Olimpia Carrillo-Farnés3, Alfonso Álvarez-González4 & Roberto Civera-Cerecedo2 1Laboratory of Experimental Aquaculture. University Center of the Coast. University of Guadalajara. 2Aquaculture Program. Center for Biologic Research of the Northeast S.C., La Paz, B.C.S., México. 3Faculty of Biology. University of La Habana, Cuba. 4Laboratory of Tropical Aquaculture. Academic Division of Biologic Sciences. Juarez Autonomous University of Tabasco, México. Corresponding Author: Fernando Vega-Villasante ([email protected])

ABSTRACT The present work evaluates the attractant and palatable potential of six ingredients of animal origin in longarm river prawn Macrobrachium tenellum juveniles in a Y type maze system. Ingredients were pelletized for the first bioassay and included in neutral gelatin (in wet base) in the second bioassay. The ingredient to evaluate was placed in one of the Y-maze arms, allowing the free movement of prawn for 15 min. On both bioassays, attractability was evaluated by quantifying the time required for the first prawn to enter the region where the feed was found and the total of prawns which entered that region. In the second bioassay, also evaluated the palatability quantifying the time for the first prawn to have contact with the ingredient, the total of prawns which had contact with it and the time they remained feeding. No significant differences were obtained between treatments in the first bioassay. Significant differences were found in the second bioassay showing that pork meal, fish meal, feather meal and shrimp meal have greater attractability due to the number of prawns attracted, results also show significant differences in palatability, where fishmeal, shrimp meal and pork meal stimulating a higher number of organisms and promoting a longer consumption time. Keywords: Macrobrachium tenellum, chemoattraction, Y type maze, prawn, feeding, aquaculture.

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

Atractabilidad y palatabilidad de ingredientes alimenticios en langostino de río longarm Macrobrachium tenellum

RESUMEN El presente trabajo evalúa la atractabilidad y palatabilidad de seis ingredientes de origen animal en juveniles de langostinos de río longarm Macrobrachium tenellum en un sistema de laberinto tipo “Y”. Los ingredientes fueron peletizados para el primer bioensayo e incluidos en gelatina neutra (base húmeda) en el segundo bioensayo. El ingrediente a evaluar se colocó en uno de los brazos del laberinto Y, permitiendo el movimiento libre de los langostinos durante 15 min. En ambos bioensayos, se evaluó la atractabilidad cuantificando el tiempo requerido para que el primer langostino ingrese en la región en donde se encontraba el ingrediente y el total de langostinos que ingresaron a esta región. En el segundo bioensayo también se evaluó la palatabilidad cuantificando el tiempo en que el primer langostino tuvo contacto con el ingrediente, el total de langostinos que tuvieron contacto con él y el tiempo que permanecieron alimentándose. No se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos del primer bioensayo. En el segundo bioensayo se encontraron diferencias significativas, evidenciando que la harina de cerdo, harina de pescado, harina de pluma y harina de camarón presentan mayor atractabilidad debido al número de langostinos que atrajeron, los resultados también muestran diferencias significativas en la palatabilidad, donde la harina de pescado, harina de camarón y harina de cerdo estimularon la alimentación de un mayor número de organismos y promovieron un mayor tiempo de consumo. Palabras clave: Macrobrachium tenellum, quimioattracción, laberinto tipo Y, langostino, alimentación, acuicultura.

The increase on the demand for aquaculture feeds is directly related with aquaculture growth worldwide. Among the most important issues feeding is among the most relevant factors since determines the productive and economic results of commercial culture (Montemayor-Leal et al., 2005). In relation with prawn feeding, feed is the most expensive issue due to the high cost of protein ingredients. It also has a costly manufacture procedure because of the stability required to maintain its nutritional value (Muñoz, 2004). To formulate diets that meet prawn nutritional require-ments at low cost, it is necessary to perform studies about protein

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum alternative sources with good attractability and palatability, this might improve its efficiency for culture purposes (Montemayor-Leal, et al., 2005; Sacristán et al., 2014). Prawn are capable of detecting feed at certain distance through antennal receptors and once located by contact, it is tastesd with the sensitive receptors located in its first pair of legs and in the mouth, with feed acceptance or rejection as response (Suresh et al., 2011). A nutritionally balanced feed loses its nutritional value if the cultured species do not consume it soon, so attractability and palatability are essential for an efficient feeding in aquatic cultures (García-Galano et al., 2007; Jaime-Ceballos et al., 2007; Tantikitti et al., 2014). The aim of this work was to evaluate the attractability and palatability of six ingredients in M. tenellum juveniles prawn. The assays were carried out at the Laboratory de Calidad de Agua y Acuicultura Experimental of the Universidad de Guadalajara in Puerto Vallarta, Jalisco, Mexico. Six ingredients were used: pork meal (meat and bones), prime poultry meal, hydrolyzed feather meal, turkey poultry meal, fish meal (sardine), shrimp meal (from Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V.). The chemical composition is presented in Table 1. Meals were grinded and screened with a 250 μm mesh. Two bioassays were carried out. Bioassay I: each ingredient was mixed with 4% of gelatin as agglutinant in a beater (KitchenAid, St Joseph, MI, USA). Water was added gradually until full homogenization was obtained. The resulting mix was pelletized with a meat grinder (Torrey®, Mod. M-12-FS, Monterrey, NL, México) using a sieve with perforations of 4.8 mm in diameter. The extruded pellets were dried in an oven at 40°C for 12 h. Then, feed were kept under refrigeration at 4°C. Bioassay II: for each ingredient, 15 g of the same meals were mixed with 5 g of gelatin dissolved in 80 mL of water. After that, they were homogenized with a manual blender; 5 mm were poured in Petri dishes (6 cm diameter) and then, refrigerated at 4ºC for its gelation. M. tenellum juveniles of 0.5 to 1.0 g were used for the first bioassay and of 1.0 to 2.0 g for the second bioassay, captured in the artificial pond at Centro Universitario de la Costa, Universidad de Guadalajara, Puerto Vallarta. The longarm river prawns (200 juveniles) were distributed in eight glass (40 L) aquariums provided with cascade filters (Elite Hush®) and under controlled temperature conditions at 28°C (Sunny® heaters with thermostat). Prawns were acclimatized first during 20 days prior to the start of the bioassay during which they were fed with commercial shrimp feed pellets (Camaronina® Purina®, 35% protein, humidity 12%,

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum fat 8%, crude fiber 5%, ash 10%, nitrogen free extract 30%). Feeding time and frequency were established a priori between 10:00-11:00 h AM as a single daily feeding ad libitum. Surplus food were daily removed. Once acclimation period ended, only intermolt stage prawns were selected to carry out the bioassays in agreement with Reyes & Luján (2003) and in order to avoid any possible interference with this phenomenon on perception, as stated by Montemayor-Leal et al. (2005). Prawns were kept at 28ºC and no food was given for 24 h previous to the beginning of the trial in order to avoid any kind of interference that might affect results feeding preferences (Montemayor, 1995; Jaime-Ceballos et al., 2007). The experimental device consisted of a Y type maze system (Fig. 1). This system has a retainer gate which could be inserted between the N zone and the R region. A video camera (GoPro®) was placed in the front part of the maze to record the prawns movements. A total of 10 prawns were located in region R of the device for final acclimation. An hour later, the ingredient was randomly placed in the end of one of the arms of the device (A or B). The ingredient to evaluate in the first bioassay was placed at a ratio of 20% the prawns biomass inside an organdy bag. For the second bioassay, the gelled ingredient was placed without the Petri dish. Ten min after placing the ingredient, the retainer gate on R region was removed and video recording started for 15 min. To diminish the possible influence of feeds located in zones A or B, four repetitions were made randomly changing the position of the ingredient. Observations were performed with the same feeding schedule and the tests were performed under twilight conditions (only enough light to distinguish and determine responses). Observations recordings were performed (through video recording analysis) and the time required for the first prawn to enter region A or B was measured from time zero (once the gate was removed) until all prawns enter to one of the zones (attractability) for both bioassays. Additionally, the time in which the first prawn had contact with the ingredient was quantified, as well as the time at which all prawns (adding the individual time of feed consumption), had contact with the ingredient. The time they remained feeding for 15 min (palatability) were quantified only for the second bioassay. Results from the experiment were analyzed first with Kolmogorov-Smirnov test to determine its normality and then a one-way variance analysis was applied (ANOVA). When significant differences were found a Tukey analysis of multiple variance compa-rison was

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum applied. All tests were performed with the SigmaPlot version 11.0 statistical (Systat Software, Inc. Chicago, IL, USA). No statistically significant differences were found at all in the first bioassay (P > 0.05). The experimental conditions used in the second bioassay are shown (Fig. 2). The attractive power of the ingredients on prawns response had no statistically significant differences. However, the statistical analysis showed significant differences (P < 0.05) between the number of prawns which entered the area where the test ingredient was located for the 15 min of the bioassay, suggesting that the fish meal (18 ± 4.90), pork meal (16.25 ± 1.71), feather meal (15.40 ± 4.12) and shrimp meal (13.00 ± 6.8) attracted statistically more prawns than the turkey meal (6.75 ± 1.26). Palatability results are shown in Fig. 3. During the time required for the first prawn to have contact with the feed no statistically significant differences were found among treatments. Results show significant differences in ingredient palatability (intake time, in min). Turkey meal (6.25 ± 2.75) and poultry meal (6.75 ± 2.99) showed lower palatability (those less inciting feeding) while fish meal, shrimp meal and pork meal presented the highest palatability since those attracted significantly more prawns (19.50 ± 4.20, 14.75 ± 7.04, 14.25 ± 2.50, respectively) and they also promoting a longer consumption time (min) (87.61 ± 28.47, 101.29 ± 67.44, 56.24 ± 30.05 respectively). Nevertheless, the progress in the study of nutrition and feeding of the Macrobrachium prawns are done mostly with M. rosenbergii species as observed in previous research (Harpaz et al., 1987; Mendoza et al., 1997). However, research in the topic is scarce. Responses to feeding effectors (term suggested by Smith et al. (2005), for chemoattractants, starters and stimulators) either natural, purified or synthetic compounds have been widely studied on marine shrimp because of its relevance in the understanding of feeding behavior of these crustaceans (Huang et al., 2005; Sánchez et al., 2005; Smith et al., 2005; Nunes et al., 2006; Ali et al., 2007; Grey et al., 2009). Chemoreceptors in crustaceans in general are sensitive to low molecular weight water soluble chemicals such as: aminoacids, ammonia quaternary compounds, nucleotides and biogenic amines (Lee & Meyers, 1996; Nunes et al., 2006). It is known that ingredients of aquatic animal origin (such as soluble meals of mollusks and crustaceans), are rich in these compounds and therefore, they act as excellent attractants (Smith et al., 2005; Ali et al., 2007). In the other hand, non-aquatic

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum animal sub-product meals such as: poultry sub-products meals and blood meal show lower levels of those compounds. Because of this, the attractability and palatability of non-aquatic animal products is lower; however few studies are designed to demonstrate such observations (Suresh et al., 2011). This work is the first to show the efficiency of commercially available protein ingredients as feed effectors in Macrobrachium prawns. In this context, Nunes et al. (2006) using the Y type maze system for Penaeus vannamei shrimps, demons-trated that blood meal was among the less stimulating ingredients and that meat and bone meal were similar to the fish solubles but inferior to fish and squid meals. This does not agree with present results, since pork meal did not show any significant differences regarding fish meal, in terms of attractability and palatability. In the other hand, Suresh et al., (2011) conclude that attractability and palatability evaluations are consistent with the biochemical profile of the ingredients, finding that for P. stylirostris, poultry sub-products meals were the most attractant, and hydrolyzed feather meal caused the lowest response, while the most palatable ingredient was krill meal followed by the squid liver meal, both poultry sub-product meals, fish hydrolisate and hydrolyzed feather meal; which is contrary to our results where the hydrolyzed feather meal had a better response and the turkey meal and poultry meal had the lowest attractability and palatability responses. The fact of finding no statistical differences from the first bioassay results with pelletized ingredients could be because the chemoattractant efficiency is related to its diffusion coefficient and its water solubility as stated by Lee & Meyers (1996). Those authors stated that this could be affected by the use of the organdy bag as an ingredient pellet container, reducing the lixiviation. Unfortunately, the ingredients could not be placed freely due to the observations from previous assays (Montoya-Martínez et al., in press) in where agonistic behavior among M. tenellum prawns causes some prawns to take the feed and move away with it, taking the stimulation source to other parts in the system. According to our results in two bioassays regarding ingredient detection time, it was observed that prawns wander around in the maze regardless the location of the ingredient. This was preciously observed by Sacristán et al. (2014) who, considering feeding habits, propose the hypothesis that freshwater decapod Cherax quadricarinatus find its feed mainly due to the time they invest in roaming the environment since detection of chemical signals are strongly affected by flow dynamics. Therefore, feed detection should also be studied in water flow

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum systems. Herearter and considering that feeding habits in M. tenellum are carried out in hydrographic basins with slow currents (Espinosa-Chaurand et al., 2011), these flows must affect the chemical signal detection abilities. However, Pittet (1996) notes that the main disadvantage of aquariums with water flow is that chemical stimulation can start the movement, but the unidirectional current perpetuates it in such a way, that the animal can respond mainly to rheotaxis. In this context, Montemayor (1995) observed that M. rosenbergii prawns reacted to the rheostatic stimulation of water flow and for that reason, a water flow system was not used in present work. Even when most assays on crustaceans feeding behavior have been performed with groups of organisms due to the experimental convenience, conditions would be closer to the culture conditions. Some possible disadvantages are the fact that a specimen would respond to the stimulation from the movement of other members of the group or might react intimi-dated by other more active or aggressive members of the group, as observed in present work, due to the territorial behavior for these species (Harpaz et al., 1987). This behavior may cause a bias when counting the feeding time due to the agonistic behavior, which dissuades some individuals from approaching the feed. In this sense, Lee & Meyers (1996) highlights some of the methodological limitations of feed chemoreception, suggesting that is required to make several bioassays in different conditions and aquariums to avoid an erroneous interpretation and improve the opportunity for the development of useful alimentary stimulants. Therefore it is necessary, as Pittet (1996) states, perform a hierarchical test protocol, consisting in a method of sequential process, from a quick selection of a big number of materials as potential stimulants through more discriminating procedures that might help to evaluate chemotaxis. Then, a final evaluation of the more powerful chemostimulants with laboratory feeding assays is required in order to obtain a better assessment of compounds or mixes as feeding attractants. In this study, it was found that pork meal and feather meal have remarkable feeding stimulator properties for prawns, only slightly lower than fish meal and shrimp meal in terms of attractability and palatability, therefore they should be considered for its replacement. Finally, is necessary to state that is important to carry out experiments with the ingredients that may produce strong attractant responses in order to find more effective feeding stimulators and find their optimum inclusions in the diet. It is also necessary to carry out feeding trials

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum with a wide variety of ingredients that are compatible with those attractants, favoring the design of a balanced feed that is cheap, easy to handle and promptly consumed.

ACNOWLEDGEMENTS We thank the National Council for Science and Technology of Mexico by the doctoral scholarship to the first author of this paper and to Proteínas Marinas y Agropecuarias, S.A. de C.V. for donating the animal meals used in this research.

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Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

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Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

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Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

Table 1. Proximal composition of ingredients.

Ingredients Protein (%) Lipids (%) Ash (%) Pork meal 57 10 28 Poultry meal 66 16 14 Feather meal 77 3 1 Turkey meal 57 14 26 Fish meal 59 16 15 Shrimp meal 48 12 26

Figure 1. Y type maze system used in the evaluation of attractability by ingredient chemodetection.

Feeding stimulators in Macrobrachium tenellum

ab 300 a 25 a a abc abc b 250 a a 20 a 200 a a 15 150 bc 10 c Time (sec) Time 100

Number of prawns of Number 5 50

0 0 Pork meal Poultry Feather Fish meal Shrimp Turkey Pork meal Poultry Feather Fish meal Shrimp Turkey meal meal meal meal meal meal meal meal Ingredients Ingredients

Figure 2. Attractability phase in the second bioassay. a) Time required for the first prawn to enter A or B region. b) Total of prawns which entered the area where the ingredient was present. Different letters on the bars, indicate significant differences (P < 0.05).

350 a a a 25 ab b 300 20 a a 250 a a ab 200 a 15 b 150 b a Time (sec) Time 10 100

50 prawns of Number 5

0 0 Pork meal Poultry Feather Fish meal Shrimp Turkey Pork meal Poultry Feather Fish meal Shrimp Turkey meal meal meal meal meal meal meal meal Ingredients Ingredients

180 a 160 c 140 ab 120 100 abc 80

Time (sec) Time 60 abc bc 40 20 c 0 Pork meal Poultry Feather Fish meal Shrimp Turkey meal meal meal meal Ingredients

Figure 3. Palatability phase in the second bioassay. a) Time for the first prawn to have contact with the ingredient, b) total of prawns which have contact with the ingredient, c) time prawns feed (for 15 min). Different letters on the bars indicate significant differences (P < 0.05).

CAPÍTULO 6. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE PROTEASAS, AMILASAS Y LIPASAS DE Macrobrachium tenellum

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DIGESTIVA DE MACHOS Macrobrachium tenellum SILVESTRES

Montoya-Martínez, C.1, Nolasco-Soria, H.2, Álvarez- González, C.A.3, Carrillo-Farnés, O.4, Vega-Villasante, F.1 & Civera-Cerecedo, R.2

1 Laboratorio de Acuicultura Experimental. Centro de Investigaciones Costeras. Universidad de Guadalajara. Av. Universidad No. 203, Puerto Vallarta, Jalisco, México. 2 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. 3 Laboratorio de Acuicultura Tropical. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. 4 Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Corresponding author: Héctor Nolasco ([email protected])

RESUMEN La relación entre el tamaño (7 pesos diferentes entre 2-21 g) y la actividad enzimática digestiva en el hepatopáncreas, estómago e intestino de langostinos silvestres longarm river prawn (M. tenellum) fue evaluada. Se cuantificó la actividad de proteasas, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa. La mayoría de las actividades de proteasas, amilasa y lipasa en el estómago, glándula digestiva e intestino mostraron diferencias significativas entre los langostinos de diferentes pesos. La actividad específica y la actividad total de amilasa, proteasa y lipasa en la GD muestran variaciones, en donde las actividades fueron significativamente mayores en los langostinos más grandes (grupo 7) en comparación de los más pequeños (grupo 1). El porcentaje de la actividad total de proteasas y amilasas mostraron diferencias significativas solo en el intestino de los langostinos de diferentes pesos. La realización de zimogramas permitió identificar las distintas isoenzimas presentes en el estómago y glándula digestiva del langostino, con sustratos específicos, encontrando cinco isoenzimas con actividad de proteasas alcalinas con pesos moleculares que oscilan entre 8 y 38 kDa, tres isoenzimas con actividad amilasa de 32.8, 62.8 y 94.5 kDa y dos isoenzimas con actividad lipasa de 6.35 y 29.5 kDa. Palabras clave: Enzimas digestivas; hepatopáncreas; langostinos; M. tenellum; electroforesis

INTRODUCCIÓN Entre las especies nativas de América, las especies de camarones de agua dulce del género Macrobrachium ofrecen un gran potencial acuícola, ya que algunas especies tienen un importante valor económico y alimenticio atribuido por su sabor, alto contenido proteico y atractivo visual (Vega-Villasante et al., 2014). En las últimas décadas, se han intensificado los estudios orientados a desarrollar la tecnología para la producción de las especies de langostinos nativos (Ponce-Palafox et al., 2002; Moraes-Valenti & Valenti, 2010; Vega- Villasante et al, 2011). Dentro de estas especies destaca M. tenellum, que ha sido considerado un buen candidato para cultivo, debido a que soporta altas densidades y tolera un amplio y fluctuante intervalo de temperatura, salinidades y concentraciones de oxígeno (Espinosa et al., 2011). Por otra parte, uno de los factores determinantes en la industria acuícola es el elevado costo de la alimentación, por lo que el conocimiento de la capacidad digestiva es esencial para comprender el mecanismo de hidrólisis de las biomoléculas provenientes de los alimentos y en consecuencia, entender mejor las necesidades nutricionales de cada especie, además permite proporcionar información aplicable para el diseño de formulaciones apropiadas a la capacidad digestiva de la especie de interés (Gamboa-Delgado et al., 2003; Carrillo-Farnés et al., 2007). Las enzimas digestivas en langostinos del género Macrobracium son reguladas por el tipo de alimentación (Paulose, 1996; Sagar et al., 2009; Bhavan et al., 2013; Seenivasan et al., 2014; Muralisankar et al., 2015; Asaikkutti et al., 2016; Sumon et al., 2016; Méndez-Martínez et al., 2018), los cambios ontogénicos (Yao et al., 2006; Kamarudin et al., 1994), e incluso se ha evaluado su utilidad como indicadores de la contaminación por cobre en el agua, al obtener la máxima inhibición la amilasa resultó el biomarcador más adecuado (Li et al., 2008). En M. tenellum, se han encontrado variaciones en la actividad de proteasas, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa relacionadas con el fotoperiodo, los ritmos circadianos, el estadio de muda, los niveles de proteína en la dieta y los horarios de alimentación (Espinosa-Chaurand, 2013). También se han evaluado alimentos adicionados con quitina y el efecto del fotoperiodo y la temperatura sobre la actividad enzimática digestiva (tripsina, quimotripsina, lipasa, amilasa y quitinasa) (De los Santos-Romero et al., 2017a, 2017b). Además, debe considerarse que la regulación de la síntesis de enzimas y la actividad enzimática son específicas de cada especie, no es posible extrapolar estas características de una especie a otra (Buarque et al., 2010).

Por lo tanto, el estudio de la actividad de las enzimas digestivas durante el crecimiento del langostino M. tenellum es vital para la comprensión de los mecanismos de digestión para potencial aplicación en la optimización de los alimentos y la estrategia de alimentación en su cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS Organismos Los langostinos M. tenellum fueron capturados usando trampas artesanales en un estanque artificial localizado en el Centro Universitario de la Costa, Universidad de Guadalajara en Puerto Vallarta, Jalisco, México, con pesos entre 1-22 g (5.7–11.5 cm). Se seleccionaron los langostinos en estadio de intermuda, de acuerdo con Reyes & Luján (2003). Los langostinos fueron separados por peso y seleccionados al azar para los análisis. Estos fueron sacrificados por inmersión en agua con hielo a las 8:00 h y congelación inmediata a - 80oC, en concordancia con el ciclo circadiano de enzimas digestivas (Nolasco & Vega- Villasante, 2000), que corresponde a uno de los picos de mayor actividad basal de proteasas generales y lipasas en M. tenellum (Espinosa-Chaurand et al., 2017). Los langostinos congelados disponibles se clasificaron en siete intervalos de pesos diferentes, utilizando 5 langostinos de cada peso.

Extractos enzimáticos Se prepararon reactivos enzimáticos para cada uno de los langsotinos de los 7 grupos de diferentes pesos. Cada uno de los langostinos se disectó para la obtención individual de cada uno de los segmentos del tracto digestivo (estómago, EST; glándula digestiva, GD; e intestino, INT), para tener su peso (húmedo) por separado. El peso de la GD de cada uno de los langostinos se utilizó para estimar el índice hepatosomático (IH = peso de la GD/ peso corporal total x 100). Para preparar el reactivo enzimático por segmento de tracto digestivo se realizó un pool de 5 intestinos (por cada grupo de tamaño), para el caso de los estómagos y glándulas digestivas se prepararon los reactivos enzimáticos individualmente, en un homogenizador FastPrep-24 (MP biomedicals Europe, Illkirch, France) adicionando agua destilada fría, en proporción 1:10 (p/v) para los EST, 1:4 (p/v) para GD y cada pool de INT fue ajustado a 1 mL. Los 77 reactivos preparados se centrifugaron (20,800 x g, 10 min, 4°C), y

el sobrenadante se almacenó a -80°C hasta su uso. Esta fracción fue considerada como el extracto enzimático (EE). Los EEs se analizaron para determinar su concentración de proteínas y la actividad enzimática digestiva.

Determinación de proteína y actividad enzimática La determinación de proteína se realizó por el micrométodo de Bradford (1976), utilizando albúmina bovina (A4503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) como estándar. La actividad de las proteasas generales fue determinada de acuerdo a Vega-Villasante et al. (1995) usando como sustrato 500 μL azocaseína (A2765, Sigma, St. Louis, MO, USA) al 2% (en Tris-HCl 50 mM, pH 7.5) incubado con 230 μL de tampón Tris-HCl (50 mM, pH 7.5) y 20 μL de EE por 30 min a temperatura ambiente, se añadieron 500 μL de TCA (ácido tricloroacético) al 20% para detener la reacción, la mezcla se clarificó por centrifugación (10,600 x g durante 5 min), se midió la absorbancia del sobrenadante a 440 nm. El blanco se preparó de forma similar, pero se agregó el EE después de detener la reacción con el TCA. Una unidad de proteasa se definió como la cantidad de la enzima necesaria para incrementar 0.01 U de absorbancia por min. La actividad enzimática de tripsina se determinó por el método de Erlanger et al. (1961) y la actividad de quimotripsina por el método de DelMar et al. (1979), modificados para micrométodo, utilizando BAPNA (No. B4875, Sigma) y SAAPNA (No. S7388, SIGMA, St. Louis, MO, USA) como sustrato, respectivamente. La mezcla de reacción se preparó con 10 μL de sustrato (9.6 mM en DMSO (dimetil sulfóxido)), 170 μL tampón Tris-HCl (60 mM, pH 8), 10 μL CaCl2 (192 mM en Tris-HCl), y 10 μL de EE, la absorbancia se leyó a 405 nm cada 30 seg durante 30 min. El control se preparó de forma similar, pero se agregó agua destilada en lugar del EE. Se calculó un coeficiente lineal para determinar el aumento de la absorbancia por segundo. La actividad de la enzima se calculó utilizando el coeficiente de extinción molar de p-nitroanilina (8800). Una U de tripsina o quimotripsina se definió como la cantidad de la enzima requerida para liberar 1 µMol de p-nitroanilina por min. La determinación de la actividad de amilasa se realizó de acuerdo con Vega-Villasante et al. (1993), utilizando como sustrato una solución de almidón. La mezcla de reacción consistió en 20 μL de almidón soluble (1% en Tris-HCl, 100 mM, pH 8), 25 μL de tampón Tris-HCl (50 mM, pH 8) y 10 μL de EE, que se incubó 10 min a temperatura ambiente, para

detener la reacción se agregaron 20 μL de carbonato de sodio (1M) y 20 μL de DNS (ácido dinitrosalicílico). La mezcla fue colocada a baño de agua a 90ºC durante 15 minutos; la absorbancia se leyó a 550 nm. El control fue preparado de manera similar, pero se agregó el EE después del DNS. Una unidad de amilasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µMol equivalente de maltosa por min. La actividad lipasa fue determinada por el método de Versaw et al. (1989), usando como sustrato ß-naftil caprilato (N8875, Sigma, St. Louis, MO, USA), utilizando β-naftil caprilato como sustrato tampón Tris-HCl (50 mM, pH 8), taurocolato de sodio (9.6 mM) y 10 μL de EE., con un tiempo de incubación de 10 min. La absorbancia se leyó a 540 nm. El control se preparó de manera similar, agregando el EE después del TCA. Unidad de lipasa fue definida como la cantidad de la enzima requerida para liberar 1 µMol de β-naftol por min. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. Las actividades enzimáticas se reportaron como % actividad total.

Caracterización enzimática digestiva por análisis electroforético en geles de poliacrilamida en gradiente Para la caracterización electroforética de las isoenzimas de proteasas alcalinas, amilasas y lipasas de los EE de estómago y glándula digestiva, se utilizaron tres organismos del grupo de mayor peso. La electroforesis de los EE se llevó a cabo en un sistema Mini PROTEAN II (BioRad Laboratories, Hercules, CA), con geles de poliacrilamida (8.6x6.7x0.1 cm) en gradiente del 4 al 20%. La cantidad de proteína soluble aplicada fue de 100 μg en todos los casos y se agregaron 10 µL de azul de bromofenol al 0.04% con glicerol al 20%. Se aplicaron 10 μL de marcador de peso molecular (M) Amersham High Molecular Weight Native Marker kit (Código 17-0445-01, Reino Unido) en cada gel. La electroforesis se llevó a cabo a 80 V por 4 horas. Para evidenciar las bandas de proteínas, después de la electroforesis, el gel se sumergió en una solución de tinción, compuesta de azul brillante de Coomassie al 0.1% en metanol: ácido acético: agua (40:10:50) por 6 horas, posteriormente se destiñó por 12 horas utilizando una solución de metanol: ácido acético: agua (40:10:50) y se colocó en agua destilada para su hidratación.

Para detectar actividad proteasa alcalina, se sumergió el gel en una solución de caseína Hammerstein (No. 101289, MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA) al 3% durante 30 minutos a 4ºC, posteriormente se incubó en una solución igual a 37ºC por 4 horas. Finalmente, el gel se lavó con agua destilada y se fijó en ácido tricloroacético (TCA) al 12% durante 5 min. Para la tinción, el gel permaneció a temperatura ambiente por 12 horas en una solución de azul brillante de Coomassie al 0.1% en metanol: ácido acético: agua destilada (40:10:50). Para desteñir el gel se utilizó una solución de metanol: ácido acético: agua destilada (40:10:50). Finalmente, el gel se colocó en agua destilada para su hidratación. Las bandas de actividad de proteasa se observan como bandas claras en un fondo azul (Lemos, 2000). La actividad lipasa se evidenció sumergiendo el gel en una solución de β-naftil caprilato (200 mM), tauracolato de sodio (10mM) y Tris-HCl 1.5 M a pH 8.8 por 25 horas a 37ºC. Para el revelado de los geles se agregó una solución de fast blue (100 mM) por 30 min hasta observar las bandas de actividad lipasa. Para detectar actividad amilasa, se sumergió el gel en una solución de sustrato DQ starch (EnzChek®, Life Technologies Japan, Tokyo), durante 30 minutos a 4ºC, posteriormente se incubaron en una solución igual a 37ºC por 30 min. Para la obtención de las imágenes se utilizó un analizador de imágenes GelDoc XR (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA).

Análisis estadístico A todos los datos del peso total del cuerpo, peso de los segmentos del tracto digestivo, IH y actividades enzimáticas digestivas, se les determinó la distribución y la homogeneidad de varianzas normales por pruebas Kolmogorov-Smirnov y Bartlett, respectivamente. Los datos se compararon entre sí por un análisis de varianza. En caso de diferencias significativas, se realizaron comparaciones múltiples mediante una prueba de Tukey. Los datos que carecían de normalidad y/o homocedasticidad fueron analizados por una Prueba de Kruskal-Wallis en la prueba de rangos y comparaciones múltiples por el procedimiento de Tukey. La estadística se realizó con el software SigmaPlot versión11.0 (Systat Software, Inc. Chicago, IL, USA) y el nivel de significancia utilizado fue de 0,05.

RESULTADOS Los promedios del peso corporal, del EST, INT y GD de cada grupo de tamaño y el índice hepatosomático se muestran en la Tabla 1. El peso del cuerpo, del EST, INT y GD mostraron diferencias estadísticas entre los grupos con diferentes pesos totales. Los índices hepatosomáticos no mostraron diferencias significativas entre los diferentes grupos. Las concentraciones de proteína y las actividades de proteasas, amilasas y lipasas en EST, GD e INT se muestran en la Tabla 2. La mayoría de las actividades de las enzimas ensayadas en cada uno de los segmentos del tracto digestivo mostraron diferencias significativas en los diferentes pesos. La actividad específica y la actividad total de amilasa, proteasa y lipasa en la GD muestran variaciones, en donde las actividades fueron significativamente mayores en los langostinos más grandes (grupo 7) en comparación de los más pequeños (grupo 1). El porcentaje de la actividad total de proteasas y amilasas mostraron diferencias significativas solo en el intestino de los langostinos de diferentes pesos. El zimograma de proteínas muestra 15 bandas que permanecieron relativamente constantes en los 3 estómagos y las 3 glándulas. Se encontró una banda solo en E31 y E33 con PM = 55 kDa (Fig. 1). Se obtuvieron zimogramas de la actividad amilasa, proteasa y lipasa. El zimograma basado en los pesos moleculares de las proteasas digestivas reveló la presencia de cinco bandas de actividad de proteasas alcalinas tanto en el estómago como en la glándula digestiva, con pesos moleculares que oscilan entre 9 y 56 kDa (Fig. 2). El gel de amilasa reveló tres bandas de actividad tanto en el estómago como en la glándula digestiva, con pesos moleculares de 37.5, 62.7 y 91.2kDa (Fig. 3). El gel de lipasas reveló dos bandas de actividad tanto en el estómago como en la glándula digestiva, con pesos moleculares de 5.4 y 28.6 kDa (Fig. 4).

DISCUSIÓN La GD es el órgano digestivo más importante, representando alrededor de 3% (p/p) del peso corporal total de los langostinos (0.8% el EST y 0.1% el INT), coincidiendo con lo reportado por Roy et al. (2018) para diferentes especies de camarones y el langostino Malayo M. rosenbergii. Todos los grupos de los diferentes tamaños del langostino M. tenellum, exhibieron actividades de lipasa, amilasa, proteasa, tripsina y quimotripsina en la GD, EST e INT, similar

a lo reportado por otros estudios llevados a cabo con langostinos del mismo género (Lee et al., 1980; Palanisamy & Pillai, 1993; Kamarudin et al., 1994; Manríquez-Santos et al., 2018; Espinosa et al., 2017). Se ha reportado que la actividad amilolítica es alta y las actividades proteolíticas (U por mg proteína) (Roy et al, 2018), incluyendo tripsina y quimotripsina (Tsai et al., 1986a) son bajas en los diferentes segmentos del tracto digestivo en M. rosenbergii en comparación con otras especies de camarón (Penaeus monodon, P. japonicus, P. penicillatus, P. indicus y Metapenaeus monoceros), concordando con las bajas actividades de tripsina y quimotripsina encontradas en este estudio. Además, la tripsina y quimotripsina, bajo las condiciones experimentales establecidas mostraron actividades aún más bajas en algunos de los EE del EST, GD e INT, la cantidad de EE no se pudo aumentar debido a su limitada disponibilidad. Esta alta variabilidad entre los EE de cada individuo del mismo grupo en las actividades de tripsina y quimotripsina, así como de proteasas generales, amilasa y lipasa encontradas en este estudio es similar a lo reportado por Lee et al. (1980) en M. rosenbergii para tripsina, quimotripsina, pepsina, amilasa, carboxipeptidasa A y B, aminopeptidasa de leucina, lipasa, esterasa, sin encontrar ninguna relación directa entre esta variabilidad individual con el tamaño y el sexo. De acuerdo con Moyano (2006) la alta variabilidad enzimática puede estar relacionada con el historial alimenticio de los animales analizados; en este sentido, los organismos colectados eran silvestres y se desconoce dicho historial, concordando con la variabilidad encontrada en el IH entre individuos del mismo grupo, ya que el IH es considerado como indicador del estado nutricional de los langostinos, debido a que la GD es el principal órgano de almacenamiento y transferencia de proteínas y lípidos (Álvarez- Sánchez et al., 2017). Por lo anterior, la probabilidad de colectar organismos silvestres con similares estados fisiológicos y alimenticios es baja, considerando que los langostinos M. tenellum son omnívoros y carroñeros y recorren diferentes hábitats desde sus primeros estadios de vida en condiciones salobres, hasta su reclutamiento en aguas preferentemente dulces. Lo anterior infiere cambios en sus requerimientos nutricionales y dietas disponibles, teniendo efecto sobre la actividad de las enzimas digestivas, debido a que la actividad enzimática también depende de los regímenes dietéticos y las condiciones fisiológicas (De los Santos-Romero et al., 2017b). Además, la actividad de enzimas proteolíticas digestivas puede verse afectada por el estrés alimentario, que incluye el consumo de alimentos de baja calidad o

alimentos que contienen factores antinutricionales (Muhila-Almazán et al., 2003), en este sentido se ha reportado (Da Silva-Santos et al., 2014) que las actividades proteolíticas observadas en langostinos M. amazonicum salvajes pueden ser de 2 a 5 veces menores que en langostinos cultivados y también pueden ser afectadas por estrés fisiológico ocasionado por las jerarquías sociales, al encontrar diferencias en las actividades proteolíticas de los diferentes morfotipos masculinos. De acuerdo con estudios previos en langostinos M. rosenbergii, la actividad de las enzimas digestivas puede cambiar de acuerdo a los acontecimientos morfogénicos durante el desarrollo embrionario, las actividades de pepsina, tripsina, amilasa y celulasa (U huevo-1) aumentaron durante las etapas tempranas y embrionarias, pero disminuyeron durante las etapas intermedias, alcanzando el máximo nivel durante la etapa de zoea; la actividad lipasa después de la etapa de gástrula fue disminuyendo (Yao et al., 2006). Durante el desarrollo larval la actividad total de tripsina disminuyó en las primeras etapas (II y III) aumentando hasta un pico en la etapa V-VI, la actividad total de esterasa fue aumentando con pequeñas variaciones durante las etapas de desarrollo y la actividad total de amilasa se mantuvo baja hasta que las larvas alcanzaron la etapa VI-VIII, las tres enzimas obtuvieron la máxima actividad en la etapa XI (Kamarudin et al., 1994). Gamboa et al. (2003) en Litopenaeus vannamei encontró variaciones en la actividad enzimática digestiva (U por mg proteína) en la GD de camarones cultivados de 2 a 12g, en donde los mayores cambios se observan después de que los camarones llegan a los 6g, mostrando descenso en la actividad de proteasas totales y aumento en la actividad lipasa y amilasa. A diferencia de lo encontrado en nuestro estudio en donde las actividades (U por mg proteína) de amilasa, proteasa y lipasa en la GD fueron variables en los langostinos de diferentes pesos, pero obtuvieron actividades mayores en los langostinos de mayor peso (grupo 7) en comparación de los de peso más pequeño (grupo 1). Se ha reportado que la actividad específica de la amilasa en M. rosenbergii fue más alta en el INT en comparación de la GD (Roy et al., 2018) y que la GD es el órgano con la mayor actividad específica de proteasas en comparación con el EST o el INT (Roy et al., 2018, Tsai et al., 1986a) a diferencia de lo que se encontró en este estudio. En nuestro estudio obtuvimos el menor % de actividad total de amilasa en el INT y el mayor % de actividad de proteasas en la GD y EST. Esta alta actividad de proteasas (actividad específica, actividad total y % de actividad total) en el EST con relación a la actividad de la GD observada en este estudio,

podría estar relacionada con la presencia de enzimas digestivas sintetizadas y secretadas en la GD que se regurgitan al estómago para facilitar el proceso de reducción de partículas alimenticias en el estómago cardiaco, lo anterior se sustenta en los zimogramas en donde se encontraron las mismas enzimas en el estómago que en la glándula digestiva. No debe descartarse que en parte esta actividad enzimática, como lo propone Baranowski et al. (1984), puede ser también por la liberación de enzimas digestivas del hepatopáncreas al ocurrir la muerte del camarón. Pero es necesario realizar de nuevo, en otra investigación, todos los análisis que se hicieron en este estudio para confirmar los hallazgos encontrados. La composición de isoenzimas de proteasas, amilasas y lipasas en GD y EST fueron idénticas, tomando como referencia los geles de electroforesis nativa. En este estudio se encontraron cinco bandas con actividad proteolítica en M. tenellum salvajes, mayor a lo reportado en el caso de los diferentes morfotipos de M. amazonicum salvajes (solo dos bandas), pero menor a las seis bandas encontradas en extractos de GD de la misma especie en cultivo, así como lo reportado para M. carcinus (ocho bandas) en GD y en todo el cuerpo para M. amazonicum (14 a 15 bandas), en postlarvas de M. rosenbergii (seis bandas) y M. lanchesteri (siete bandas). Además, las bandas detectadas en M. tenellum presentan un rango de pesos moleculares (PM) que van desde 8 a 38 kDa, lo que discrepa con los amplios rangos de pesos moleculares reportados en M. rosenbergii (rangos de 15 a 136 kDa) y M. carcinus (entre 18 y 94 kDa), aunque presenta un rango un poco más amplio que lo reportado para M. lanchesteri (entre 15 y 36 kDa) (Chisty et al., 2009; Manríquez-Santos et al., 2018; Da Silva- Santos et al., 2014; Pongsetkul et al., 2016). Encontrando que las proteasas encontradas en este estudio tienen PM en el intervalo de tripsina y quimotripsina. Chisty et al. (2009) reportó que la tripsina produjo dos bandas de tripsina de 13,48 y 36,4 kDa y tres bandas de quimotripsina en el intervalo de 23.0-73.4 kDa en M. rosenbergii. La tripsina de GD purificada mostró una sola banda con PM de 17 kDa en M. rosenbergii (Sriket et al., 2012) y de 19 KDa en M. malcolmsonii (Asaikkutti et al, 2017). La quimotripsina purificada mostró dos bandas de PM de 26 y 27 KDa para Penaeus monodon (Tsai et al., 1986b), una sola banda de 33.2 KDa en P. vannamei (Hernandez-Cortés et al., 1997) y de 35.7 KDa para P. californiensis (Navarrete-del Toro et al., 2015). Los resultados de este estudio sobre las enzimas digestivas de los langostinos M. tenellum son importantes para el entendimiento de la fisiología digestiva de esta especie. Se

encontró actividad proteasa, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa en los diferentes segmentos del tracto digestivo (GD, EST e INT) de M. tenellum en organismos de diferentes pesos, revelando la capacidad de utilizar proteínas, carbohidratos y lípidos. Los cambios en la actividad de las enzimas digestivas en organismos salvajes pueden ayudar a conocer el efecto de su adaptación a los cambios en la alimentación en condiciones de domesticación y de cultivo, contribuyendo a mejorar las formulaciones de los alimentos para langostino en diferentes etapas de crecimiento. Además, hay una falta de información básica sobre la fisiología digestiva de las especies nativas de langostinos. Además, es necesaria una investigación adicional dirigida a la caracterización de las enzimas digestiva utilizando inhibidores específicos. Lo anterior es de interés en dos vertientes, en el aspecto básico de conocer las capacidades digestivas de la especie en comparación con otras especies y el de obtener conocimiento aplicable para su alimentación, determinando cualitativa y cuantitativamente las enzimas presentes en la especie y los factores que influyen en su producción y condicionan su actividad.

AGRADECIMIENTOS Se agradece a Patricia Hinojosa Baltazar, por su asesoramiento técnico en el Laboratorio de Fisiología Comparada y Genómica Funcional del CIBNOR.

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Tabla 1. Peso del cuerpo y de las partes del tracto digestivo (g) e índice hepatosomático (%) de los langostinos M. tenellum

Grupo Peso corporal Estómago Intestino Glándula digestiva IH

1 2.85 ± 0.56g 0.01 ± 0.00b 0.004 ± 0.002b 0.08 ± 0.05c 2.78 ± 1.82 2 5.21 ± 0.99f 0.05 ± 0.02ab 0.004 ± 0.002b 0.18 ± 0.05bc 3.55 ± 1.14 3 7.59 ± 0.52e 0.05 ± 0.03ab 0.008 ± 0.004ab 0.29 ± 0.07abc 3.82 ± 0.73 4 11.21 ± 1.05d 0.09 ± 0.03ab 0.012 ± 0.003ab 0.40 ± 0.10abc 3.51 ± 0.61 5 14.23 ± 0.84c 0.10 ± 0.03ab 0.023 ± 0.017a 0.46 ± 0.18ab 3.27 ± 1.30 6 17.49 ± 0.95b 0.21 ± 0.14a 0.033 ± 0.032a 0.53 ± 0.36ab 3.01 ± 2.07 7 19.36 ± 0.52a 0.17 ± 0.05a 0.017 ± 0.012ab 0.56 ± 0.18a 2.88 ± 0.91 Los diferentes superíndices indican diferencias estadísticas significativas (P< 0.05) entre los diferentes grupos.

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Tabla 2. Concentración de proteína y actividad enzimática digestiva en el estómago, glándula digestiva e intestino de M. tenellum de diferentes pesos.

Proteína (mg por mL) Grupo Estómago Glándula Intestino 1 4.85±2.44 4.85±2.45 4.85±2.46 2 8.13±3.12 8.13±3.13 8.13±3.14 3 6.78±2.33 6.78±2.34 6.78±2.35 4 7.83±1.72 4.85±2.47 4.85±2.47 5 7.95±2.21 4.85±2.48 4.85±2.48 6 9.76±2.73 4.85±2.49 4.85±2.49 7 6.61±2.22 4.85±2.50 4.85±2.50

Proteasa Actividad Específica (U por mg proteína) Actividad Total (U por órgano) % Actividad total por langostino Grupo Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino 1 4.50±3.06ac 0.93±0.72bc 0.04±0.02 2.82±1.39cd 4.99±3.72c 0.018±0.008 44.13±18.33 55.55±18.50 0.322±0.197a 2 2.74±0.723ac 1.27±0.51ab 0.06±0.02 12.48±10.47abc 13.56±5.07bc 0.002±0.001 44.19±19.95 55.80±19.95 0.008±0.005ab 3 2.51±1.20ac 1.09±0.14b 0.07±0.06 8.11±3.56bcd 22.51±5.97abc 0.003±0.002 27.44±13.66 72.56±13.66 0.009±0.002ab 4 0.81±0.56b 0.66±0.19c 0.08±0.02 7.01±6.49c 20.56±11.20bc 0.004±0.001 21.50±5.82 78.48±5.82 0.020±0.012ab 5 2.51±0.83c 1.67±1.06ab 0.05±0.04 19.56±8.84ab 65.05±53.86ab 0.004±0.003 33.75±23.71 66.25±23.71 0.009±0.008b 6 1.85±1.36bc 0.98±0.50bc 0.06±0.04 42.08±36.14ab 29.47±28.81bc 0.004±0.002 52.29±23.14 47.69±23.12 0.017±0.021ab 7 1.23±0.52b 2.91±1.26a 0.06±0.04 24.78±11.66a 72.69±28.31a 0.004±0.003 26.19±10.58 73.80±10.58 0.005±0.002b

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Amilasa Actividad Específica (U por mg proteína) Actividad Total (U por órgano) % Actividad total por langostino Grupo Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino 1 0.33±0.25abc 0.04±0.32c 0.008±0.005b 0.04±0.08b 1.23±2.27b 0.0036±0.0022a 13.22±25.25 85.64±25.24 1.140±0.682a 2 0.62±055ab 0.67±0.36a 0.024±0.007ab 0.11±0.11abc 6.55±3.86a 0.001±0.0000b 2.80±3.51 97.20±3.51 0.003±0,002b 3 0.23±0.13abcd 0.40±0.16abc 0.038±0.004ab 0.03±0.02bc 7.87±3.37a 0.003±0.0000ab 0.40±0.18 99.60±0.18 0.004±0.002b 4 0.16±0.10bcd 0.23±0.17bc 0.070±0.018ab 0.05±0,02abc 7.50±6.36a 0.0007±0.0002ab 1.20±1.14 98.78±1.16 0.019±0.017ab 5 0.55±0.35a 0.45±0.47abc 0.105±0.030 a 0.12±0.08a 14.11±12.96a 0.0016±0.0003a 4.15±5.60 95.80±5.67 0.049±0.066ab 6 0.10±0.09d 0.34±0.29abc 0.103±0.030 a 0.07±0.05abc 10.22±12.96a 0.0012±0.0004ab 3.85±5.88 95.70±5.90 0.458±0.826ab 7 0.16±0.14c 0.42±0.21ab 0.077±0.008ab 0.15±0.14ac 10.40±4.53a 0.0012±0.0001ab 1.80±2.12 98.19±2.12 0.013±0.005ab

Lipasa Actividad Específica (U por mg proteína) Actividad Total (U por órgano) % Actividad total por langostino Grupo Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino Estómago Glándula Intestino 1 1.34±1.10ab 0.68±0.57b 0.052±0.035b 0.81±0.47d 4.96±5.09bc 0.023±0.015 24.31±19.46 74.47±19.84 1.222±1.279 2 0.90±0.47ab 1.08±0.56ab 0.289±0.062ab 4.50±3.51abc 11.16±5.49bc 0.170±0.037 28.70±23.37 70.17±23.46 1.127±0.266 3 0.60±0.32abc 0.28±0.23c 0.213±0.068ab 1.84±1.25bcd 6.23±6.28abc 0.160±0.051 48.27±40.23 47.34±43.94 4.389±3.940 4 0.53±0.51bc 0.60±0.30abc 0.524±0.226a 4.75±5.64bd 18.94±14.54bc 0.547±0.236 16.23±6.35 80.33±5.35 3.439±1.881 5 1.38±0.67a 0.61±0.27abc 0.554±0.270a 14.33±9.14ac 20.42±16.34ab 0.831±0.405 21.16±19.06 73.26±14.02 5.586±5.338 6 0.27±0.29c 0.66±0.27ab 0.366±0.085ab 6.21±9.14ac 19.62±16.34bc 0.438±0.102 21.66±9.84 74.53±8.51 3.808±3.071 7 0.50±0.22abc 0.95±0.27ac 0.294±0.028ab 9.92±4.34a 25.22±7.97a 0.455±0.044 27.95±13.66 70.72±13.83 1.339±0.320 Los diferentes superíndices indican diferencias estadísticas significativas (P< 0.05) entre los diferentes grupo.

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Figura 1. a) Electroforesis de proteínas de extractos enzimáticos de tres adultos M. tenellum en condiciones nativas en gel de acrilamida 4%-20% a 80V durante 4 hrs. La cantidad de proteína aplicada en cada pocillo es de 100 µg. Electroforesis de actividad b) proteasa, c) amilasa y d) lipasa en geles de poliacrilamida en gradiente (4-20%) en condiciones nativas de extractos enzimáticos de tres adultos M. tenellum. Marcador molecular (M) en kDa; Estómagos (E); Glándulas (G). Las líneas horizontales destacan el lugar de acción de la enzima.

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CAPÍTULO 7. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES GENERALES

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DISCUSIONES Y CONCLUSIONES La harina de pescado proporciona proteínas de alta calidad con un balance de aminoácidos y ácidos grasos adecuados para el rápido crecimiento de los organismos, por lo que la disponibilidad y la calidad de la harina de pescado es determinante para la fabricación de alimentos acuícolas (Cruz-Suárez, et al., 2000). La búsqueda de nuevas fuentes de proteína disponibles, nutritivas y más económicas ha sido una necesidad constante en el desarrollo de los alimentos acuícolas (García-Galano et al. 2007). La calidad de un ingrediente puede variar, debido a los métodos de fabricación, las especies utilizadas como materia prima, temperatura de cocción y secado utilizados durante el procesamiento, entre otras (García-Galano et al., 2007). Estas variables que afectan la calidad del mismo tipo de ingrediente podrían ser la causa de las diferencias en los resultados del computo químico (CQ) encontrados en este estudio entre las dos harinas de pescado evaluadas (harina de sardina y harina de atún), así como la diferencia en los valores de CQ obtenidos para la harina de calamar con lo reportado por Espinosa-Chaurand et al. (2013). Probablemente también estas diferencias podrían deberse a lo que mencionan Seligson & Mackey et al. (1984), que tanto el cálculo del CQ como el primer aminoácido limitante para una proteína puede diferir debido a la fuente de datos y el patrón de referencia utilizados, con respecto al método analítico utilizado para la determinación de la composición de aminoácidos de las proteínas. Con base en los resultados de esta investigación puede concluirse que existe una diferencia entre los aminoácidos que con mayor frecuencia se presentan como los primeros limitantes de la calidad entre las fuentes de origen animal, vegetal y unicelular. Con base en estas diferencias, es posible estimar que ingredientes pueden utilizarse para lograr un perfil de aminoácidos cercano al requerido por esta especie. Sin embargo, el CQ de una proteína solo refleja la relación del contenido de aminoácidos esenciales de la proteína a evaluar y el contenido del aminoácido de la proteína de referencia, sin tomar en cuenta la biodisponibilidad de los aminoácidos o la presencia de factores antinutricionales, por lo tanto para la evaluación de la calidad de un ingrediente es necesario realizar pruebas de digestibilidad, que además de ser esenciales en la investigación de requerimientos nutricionales, son útiles para la selección de ingredientes con valor

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nutriticional potencial, la formulación de dietas a bajo costo y formulación de alimentos que minimicen la contaminación del agua (Cruz-Suárez, 2002). La digestibilidad de un ingrediente no depende solamente de su contenido de proteína, como muestran los resultados de la correlación entre la concentración de proteína cruda y digestibilidad relativa, obtenidos en este estudio. Esta depende de muchos otros factores, como las propiedades físicas (es decir, el tamaño de las partículas, la solubilidad, etc.) y químicas (es decir, el contenido de aminoácidos) del ingrediente, las características biológicas del animal (la arquitectura del tracto digestivo y la fisiología) y también las condiciones ambientales son importantes (pH, temperatura, salinidad, iones); todos estos aspectos deben considerarse para la determinación de la digestibilidad de proteínas in vitro de ingredientes o alimentos (Cruz- Suárez, 1996; Ezquerra et al., 1998; Carrillo-Farnés et al., 2007). Sin embargo, la mayoría de los nuevos ingredientes proteicos no han sido evaluados desde el punto de vista de su digestibilidad (Álvarez-González, 2003). Si bien la harina de pescado es la principal fuente de proteínas de los alimentos para acuicultura, la digestibilidad relativamente baja para esta harina obtenida en el presente estudio, concuerda con Campaña-Torres et al. (2005) que encontraron una baja digestibilidad aparente de la harina de pescado para juveniles de Cherax quadricarinatus. Nuestro estudio está de acuerdo con los resultados obtenidos por Nieto-López et al. (2005), quienes encontraron diferencias significativas entre el grado de hidrólisis (GH) (21.6 a 39.6%) de 15 diferentes harinas de pescado, evaluadas por digestibilidad in vitro en el sistema de pH-stat utilizando enzimas de Litopenaeus vannamei, estos autores consideran que el método pH-stat funciona mejor en la harina de pescado con alto nivel de proteína y bajo nivel de ceniza. Por lo tanto, la baja digestibilidad encontrada para la harina de pescado en este estudio puede deberse a una baja calidad (bajo contenido de proteínas, <60% PC y alto contenido de cenizas,> 18%), según la clasificación utilizada por Nieto et al. (2005). Aunque, Lemos et al. (2004) utilizando el mismo método, concluyeron que las diferencias en la digestibilidad de proteínas (medida por el GH) de las harinas de pescado pueden estar relacionadas con la frescura de la materia prima utilizada en su producción, mostrando una digestibilidad más alta las harinas de pescado menos fresco en Farfantepenaeus paulensis, posiblemente debido a la hidrólisis durante la descomposición de la materia prima.

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En la evaluación de la digestibilidad in vitro de las diferentes fuentes proteínicas como ingredientes potenciales para M. tenellum en esta investigación los resultados confirman que M. tenellum es omnívoro, capaz de digerir ingredientes de origen animal, vegetal y unicelular, de manera eficiente. Pero un alimento nutricionalmente balanceado y digestible pierde su valor si no es consumido en tiempo (rápida detección y ubicación) y forma (rápida ingesta), por lo que la evaluación de su atractabilidad y palatabilidad es crucial para el éxito de los alimentos en los cultivos acuícolas (Jaime-Ceballos et al., 2007; Tantikitti et al., 2014). La respuesta de los crustáceos a los efectores alimenticios se han estudiado debido a su relevancia en la comprensión de la conducta alimenticia y sus aplicaciones en la acuicultura (Tolomei et al., 2003; Sánchez et al., 2005; Smith et al., 2005; Nunes et al., 2006; Grey et al., 2009; Sacristan et al., 2014). Es necesario acentuar que la literatura sobre estimulantes alimenticios para langostinos del género Macrobrachium es escasa. Hasta la fecha, no existen estudios que evalúen los sistemas para determinar la capacidad de atracción y palatabilidad de ingredientes o alimentos en el género Macrobrachium y tengan en cuenta el comportamiento del género en los resultados obtenidos. En la evaluacíon de los diferentes sitemas para la determinación de la atractabilidad, se utilizó un acuario del tipo rectangular descrito por Jaime-Ceballos et al. (2007), en el que se observó que el tiempo de residencia de los langostinos en el área de aclimatación fue muy breve, y se desplazaban inmediatamente a cualquiera de las dos cámaras (incluso cuando el alimento no se había colocado en el sistema). Por lo tanto, el uso de este acuario no se consideró adecuado para la evaluación de la atractabilidad del alimento para M. tenellum. Aunque la mayoría de los estudios sobre el comportamiento de alimentación de crustáceos se han llevado a cabo con grupos de organismos, debido a la conveniencia experimental, además de que las condiciones se acercarían más a las condiciones de cultivo. En la evaluación del sistema utilizado por Nunes et al. (2006), laberinto tipo Y sin barreras, se observó la posibilidad de que los langostinos respondan a la estimulación por el movimiento de otros miembros del grupo, pero también se observó que pueden ser intimidados por otros miembros del grupo más activos o agresivos, debido al comportamiento territorial ampliamente descrito para esta especie (Harpaz, 1987). La confluencia de varios especímenes cerca del alimento, causa un comportamiento agresivo y la huida de algunos de ellos, sin

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acceder a la cámara de alimentación o en su defecto, tomar un pedazo de comida y retirarse inmediatamente (lo que provoca que la fuente de estímulo también se desplace). Este último comportamiento también provoca un sesgo en el momento de contabilizar el tiempo de alimentación, debido al comportamiento agonístico que disuade a algunos individuos a acercarse o a alejarlos del alimento. Además, se observó que los langostinos tienden a explorar por el laberinto, independientemente de la ubicación del alimento, coincidiendo con lo observado por Sacristan et al. (2014) en C. quadricarinatus, quienes proponen la hipótesis de que los decápodos de agua dulce encuentran alimento principalmente debido al tiempo que pasan vagando en el acuario. Al comparar los resultados de la evaluación del sistema de laberinto Y utilizando tres diferentes tipos de barreras y el sistema de laberinto rectangular con una sola cámara de alimentación con una barrera con acceso abierto utilizado por Suresh et al. (2011), considerando el número de entradas en la cámara de alimentación, es probable que el material utilizado en la barrera interfiriera con las señales químicas percibidas por los langostinos. Porque se observa que cuando los langostinos se acercan a la barrera, sus receptores juegan un papel fundamental, ya que tan pronto como detectan su presencia (tanto por estímulos táctiles como por reflejos de luz generados por las barreras acrílicas), la mayoría de las veces retroceden o se alejan (comportamiento habitual demostrado ante la amenaza), esto se puede observar en la diferencia de la cantidad de langostinos que entran en el área de alimentación cuando el laberinto Y se usa sin barreras. Además, los langostinos tienden preferiblemente a permanecer en la zona de aclimatación, que aparentemente se considera un área segura que las áreas de los brazos Y, incluso si hay una mayor concentración de compuestos químicos de alimentación en las áreas del brazo. Los resultados presentados en este estudio resaltan la importancia del comportamiento del género y la selección de protocolos y sistemas, así como los materiales utilizados en la construcción de su sistema de laberinto, para pruebas de la capacidad de atracción en M. tenellum, en la búsqueda de respuestas adecuadas relacionadas con el comportamiento de alimentación de los langostinos. En la evaluación de la atractabilidad y palatabilidad de ingredientes, el hecho de no encontrar diferencias estadísticas con respecto a los resultados del primer bioensayo con ingredientes peletizados podría deberse a que la eficiencia del quimioatrayente se relaciona

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con su coeficiente de difusión y su solubilidad en agua según lo declarado por Lee & Meyers (1996), estos pudieron verse afectado por el uso de la bolsa de organdí utilizada en este estudio como contenedor de pellets de los ingredientes, lo que pudo reducir la lixiviación. Al respecto de la calidad de los ingredientes alternativos que fueron evaluados en este estudio, entre las fuentes de proteínas alternativas se encuentran las de origen unicelular, como la Spirulina y la levadura, en este estudio obtuvimos que cubren más de la mitad de los aminoácidos escenciales para M. tenellum, Bhavan et al. (2010) en postlarvas de M. rosembergii alimentadas con Artemia enriquecida con Spirulina o levadura, se encontró que ambas produjeron un crecimiento favorable, pero la Spirulina produjo un mayor efecto de crecimiento que la levadura. Esto probablemente se debe no solo a la calidad de sus nutrientes sino también a su digestibilidad, la más alta registrada en el presente estudio. En este contexto, para postlarvas de M. rosenbergii, Prasad et al. (2013) sugieren que los alimentos que contienen un 0,5% de levadura S. cerevisiae, son adecuados para promover el crecimiento, aunque Seenivasan et al. (2014) informaron que los niveles de inclusión de levadura al 4% mejoraron el crecimiento, la actividad enzimática y la producción de aminoácidos. Del mismo modo, Parmar et al. (2012) demostraron que la inclusión de 1% de levadura en la dieta mejora la respuesta inmune y el control de la enfermedad del músculo blanco. Por lo tanto, la harina de Spirulina y la levadura podrían incluirse en la formulación de alimentos para M. tenellum. De las harinas de origen vegetal, la harina de soya según nuestros resultados como primer limitante tiene a la metionina y satisface más de la mitad de los AAE en M. tenellum, pero presentó una baja digestibilidad relativa, coincidiendo con los valores reportados para F. paulensis (Lemos et al., 2004) y M. carcinus (Manríquez-Santos et al., 2011). Pero comparando la digestibilidad de los ingredientes, Campaña-Torres et al. (2005) informaron que la DPA de los ingredientes de origen vegetal fue mayor que la de origen animal; la digestibilidad más alta se encontró en la harina de soya, en juveniles de Cherax quadricarinatus. Además, Chin (1988) evaluó la DPA en juveniles, adultos y hembras de M. rosenbergii, informando que la pasta de coco, la harina de trigo y la harina de soya fueron digeridas mejor que la harina de pescado y harina de camarón (por juveniles y adultos); comprobando estos resultados con las pruebas de alimentación realizadas en juveniles de M. rosenbergii por Hasanuzzaman et al. (2009) que obtuvieron que es posible sustituir el 80% de harina de pescado por harina de soya. Pero nuestros resultados en langostinos M. tenellum no

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coinciden con lo anterior, los ingredientes de origen animal y vegetal obtuvieron tanto altas como bajas digestibilidades relativas y no se encontraron diferencias significativas en la digestibilidad in vitro de proteínas entre la harina de camarón, la harina de pescado y la harina de soya. Esta razón podría ser la causante de lo reportado en pruebas de alimentación por García-Ulloa et al. (2008) al no encontrar diferencias significativas en ninguno de los parámetros de crecimiento evaluados sustituyendo hasta el 100% de la harina de pescado por harina de soya. A pesar de estos buenos resultados con la harina de soya para la sustitución de la harina de pescado, hay muchos residuos y subproductos procedentes de la agricultura, la ganadería y las industrias que tienen un buen valor nutricional, bajo costo y que pueden ser procesados y reciclados en forma de ingredientes para alimentos acuícolas, y que además su uso no compite con el de la alimentación humana. Se ha comprobado con pruebas de alimentación que la harina de subproductos de aves y la harina de carne y huesos pueden ser buenas fuentes alternarivas para la sustitución hasta del 50% de la harina de pescado en alimentos para M. nipponense (Yang et al., 2004). A pesar de que algunos de estos subproductos evaluados en nuestro estudio mostraron valores bajos de CQ, algunos presentaron alta digestibilidad y buenas propiedades estimuladoras de alimentación. Los mejores porcentajes de digestibilidad relativa fueron obtenidos por la harina de Spirulina, seguida por la harina de cerdo y harinas de subproductos de ave, pasta de coco y levadura, mejores que la harina de camarón y harina de pescado. Se encontró que la harina de cerdo y la harina de plumas tienen notables propiedades estimulantes de alimentación para este langostino, solo ligeramente inferiores que la harina de pescado y harina de camarón en términos de atractabilidad y palatabilidad, por lo tanto, estos ingredientes tienen un alto potencial para ser usados en la sustitución parcial de la harina de pescado en la formulación de alimentos para esta especie. Además, los resultados de este estudio sobre la actividad de las enzimas digestivas de M. tenellum son importantes para el entendimiento de la fisiología digestiva de esta especie. Se encontró actividad proteasa, tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa en los diferentes segmentos del tracto digestivo (glándula digestiva, estómago e intestino) en organismos de diferentes pesos, revelando la capacidad de utilizar proteínas, carbohidratos y lípidos. Pero es

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necesario realizar de nuevo, en otra investigación, todos los análisis que se hicieron en este estudio para confirmar los hallazgos encontrados. La combinación de estudios de actividad enzimática digestiva, con la evaluación de la calidad proteica por medio del cómputo químico, las pruebas de digestibilidad in vitro, la atractabilidad y palatabilidad de ingredientes pueden contribuir al diseño de formulaciones alimenticias adecuadas, eficientes y de bajo costo para el cultivo intensivo de M. tenellum.

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