UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE FARMÁCIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS QUÍMICA E FARMACOLOGIA DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS E MEDICAMENTOS
ESTÊVÃO AUGUSTO MAIA AMÂNCIO
ESTUDO FITOQUÍMICO DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE ESPÉCIES DO GÊNERO JACARANDA (BIGNONIACEAE) OCORRENTES NO ESTADO DE MINAS GERAIS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA.
OURO PRETO - MG 2019 ESTÊVÃO AUGUSTO MAIA AMÂNCIO
ESTUDO FITOQUÍMICO DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE ESPÉCIES DO GÊNERO JACARANDA (BIGNONIACEAE) OCORRENTES NO ESTADO DE MINAS GERAIS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas CIPHARMA da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Célio Brandão
OURO PRETO - MG 2019 A484e Amâncio, Estêvão Augusto Maia. Estudo fitoquímico de extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda (Bignoniaceae) ocorrentes no Estado de Minas Gerais e avaliação da atividade citotóxica. [manuscrito] / Estêvão Augusto Maia Amâncio. - 2019. 162f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Célio Brandão.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Departamento de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos.
1. Flavonoides. 2. Citotoxicidade. 3. Compostos fenólicos. 4. Jacaranda. I. Brandão, Geraldo Célio. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Titulo.
CDU: 615.3
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
Dedico este trabalho aos familiares em especial meus pais, Gisele, Samuel e aos amigos que sempre me incentivaram nesta caminhada.
AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente a meus pais por terem investido em minha educação e este é o legado mais importante que podemos deixar para nossos descendentes. Muito obrigado a todos os familiares sejam os de sangue ou escolhidos por opção, em especial a minha esposa Gisele que, diante das dificuldades enfrentadas devido a minhas escolhas, sempre deu o suporte necessário para mais esta conquista pessoal; muitas vezes a minha ausência é unicamente pensando no futuro do nosso maior tesouro chamado Samuel, um dia espero ser compreendido por todos vocês. Ao orientador desta pesquisa o Prof. Dr. Geraldo Célio Brandão, pela orientação prestada, pelas correções, incentivo, disponibilidade e apoio que sempre demonstrou e principalmente por entender minhas ausências justificadas pelo trabalho e família. Um salve a todos os amigos e que de uma forma direta ou indireta, contribuíram, ou auxiliaram na elaboração do presente estudo. Sejam os amigos do Laboratório de Química Medicinal e Bioensaios por ajudarem a dividir o fardo de pesquisar no Brasil com recursos mínimos e improvisações, aliado as boas risadas do convívio diário. Aos colegas da Firma (PRF) pelas trocas de plantão para que eu conseguisse assistir as aulas e realizar os experimentos. Aos amigos e companheiros de corrida conquistados nos últimos anos por serem minha válvula de escape realizando uma atividade física e conseguindo manter um pouco de sanidade nessa vida louca. Por fim aos amigos de infância e de boteco por compreenderem minha ausência, especialmente nesses últimos 2 anos. Agradecimento especial as agências de fomento FAPEMIG, CAPES, CNPq, PROPP- UFOP pelo aporte financeiro e ao CIPHARMA/UFOP pela oportunidade de qualificação profissional. Por último e não menos importante que os demais, agradeço a Deus por ser minha fonte de apego quando tudo parecia perdido. Uma pessoa que tem fé e acredita em algo superior consegue suportar melhor os percalços da vida. Enfim, quero demonstrar o meu agradecimento, a todos aqueles que, de um modo ou de outro, tornaram possível a realização da presente dissertação. Com vocês, queridos, divido a alegria desta experiência, deixando o meu sincero e profundo muito obrigado!
“Navegar é preciso se não a rotina te cansa…” (O Rappa)
RESUMO
Extratos de plantas são matrizes complexas compostas por diferentes tipos de metabólitos bioativos, dos quais se destacam os agentes anticancerígenos. O gênero Jacaranda é bem conhecido por seu uso na indústria madeireira e como plantas ornamentais. Além disso, na medicina, espécies de Jacaranda têm sido tradicionalmente utilizadas no tratamento de afecções da pele, doenças venéreas, leishmanioses, resfriados, reumatismo e também são utilizadas no tratamento de diversos tipos de câncer. Oito espécies do gênero Jacaranda (J. brasiliana, J. caroba, J. cuspidifolia, J. macrantha, J. micrantha, J. mimosifolia, J. paucifoliata e J. puberula), colhidas no estado de Minas Gerais – Brasil, tiveram suas partes anatômicas utilizadas na preparação de extratos brutos e analisadas em triagem fitoquímica preliminar por cromatografia de camada delgada (CCD). Os extratos etanólicos foram caracterizados por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e Cromatografia de ultra eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLUE-EM) com técnica de ionização por eletropulverização (ESI). Além disso, a citotoxicidade dos extratos etanólicos foi avaliada nas linhagens celulares MRC-5, HeLa, Hep G2 e TOV-21G pelo método colorimétrico do MTT. A técnica CLUE/DAD/ESI/EM resultou na identificação de oito feniletanoides como verbascosídeo e derivados, além de quatorze flavonoides, como quercetina, naringenina, luteolina, apigenina, bem como seus derivados glicosilados. Dos quinze extratos etanólicos testados, oito apresentaram atividade citotóxica (CC50) significativa nas linhagens celulares testadas. Também foi detectada uma redução moderada da viabilidade das células tumorais testadas em comparação à linhagem celular normal (MRC-5), especialmente para as linhagens HeLa, HepG2 e TOV-21G. Em conclusão, os dados sugerem que alguns dos extratos etanólicos estudados de espécies de Jacaranda podem ser potenciais fontes de substâncias com atividade antineoplásicas. Estudos futuros envolvendo o fracionamento desses extratos e isolamento de substâncias ativas, bem como ensaios in vivo e testes clínicos, poderão prover informações para a elucidação dos mecanismos de ação e emprego dos mesmos como fármacos anticancerígenos.
Palavras chave: feniletanoides, flavonoides, CLAE-DAD-ESI/EMn, citotoxicidade, MTT, Jacaranda.
ABSTRACT
Plant extracts are complex matrices composed by different types of bioactive metabolites, especially anticancer agents. The genus Jacaranda is well known for its use in the timber industry and as an ornamental plant. Furthermore, in medicine, Jacaranda species have been traditionally used in the treatment of skin infections, venereal diseases, common colds, leishmaniasis, rheumatism, besides several types of cancer. Eight species of the genus Jacaranda (J. brasiliana, J. caroba, J. cuspidifolia, J. macrantha, J. micrantha, J. mimosifolia, J. paucifoliata and J. puberula), were collected in the State of Minas Gerais - Brazil, They had their anatomical parts used in the preparation of crude extracts and analyzed in preliminary phytochemical screening by thin layer chromatography (TLC). The ethanolic extracts were characterized by high performance liquid chromatography coupled with detector diode array (HPLC-DAD) and ultra high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS) with electrospray ionization (ESI) technique. In addition, the cytotoxicity of the ethanolic extracts was evaluated in MRC-5, HeLa, Hep G2 and TOV-21G cell lines through the MTT colorimetric assay. The technique UPLC/DAD/ESI/MS resulted in the identification of eight phenylethanoids as verbascoside and derivatives, as well fourteen flavonoids, such as quercetin, naringenin, luteolin, apigenin and glycosylated derivatives. Eight ethanolic extracts tested, presented significant cytotoxic activity (CC50) in the cell lines. A moderate reduction in viability of the tumor cells tested compared to the normal cell line (MRC-5) was also detected, especially for tumor cells lines HeLa, HepG2 and TOV-21G. In conclusion, the data suggest that some ethanolic extracts studied of Jacaranda species can be potential sources of substances with antineoplastic activities. Additional studies involving the fractionation of these extracts and isolation of active substances, as well as in vivo and clinical assays, will be able to provide information towards the elucidation of their mechanism of action and usage as anticancer drugs.
Keywords: Phenylethanoids, flavonoids, UPLC-DAD-ESI/MS, cytotoxicity, MTT, Jacaranda.
LISTA DEFIGURAS
Figura 1: Jacaranona e verbascosídeo ...... 14 Figura 2: Triterpenos isolados de J. mimosifolia...... 15 Figura 3: Flavonoides encontrados em J. decurrens ...... 15 Figura 4: Triterpenos isolados de J. decurrens ...... 16 Figura 5: Todos os novos medicamentos aprovados no período de 1981-2014 ...... 16 Figura 6: O que é o câncer? ...... 19 Figura 7: Características do câncer revisadas ...... 20 Figura 8: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma ...... 21 Figura 9: Jacaranda caroba – A. ramo com flores e frutos; B. detalhe do foliólulo terminal; C. detalhe do indumento da face abaxial; D. inflorescência; E. flor; F. detalhe do cálice; G. detalhe do gineceu; H. estames e estaminódio; I. Semente...... 22 Figura 10: Características essenciais das folhas de Jacaranda copaia ...... 23 Figura 11: Inflorescências de Jacaranda copaia ...... 23 Figura 12: Partes reprodutivas, frutos e semente Jacaranda copaia ...... 24 Figura 13: J. brasiliana detalhando (A) tronco (B) inflorescências (C) ramos e folhas e (D) semente...... 25 Figura 14: J. caroba detalhando (A) inflorescências (B) exsicata e (D) galhos com folhas e sementes ...... 26 Figura 15: Ramo de J. cuspidifolia com inflorescências e semente ...... 27 Figura 16: J. macrantha com inflorescências e sementes em destaque ...... 28 Figura 17: Ramo de J. micrantha com inflorescências características do gênero...... 29 Figura 18: J. mimosifolia em detalhe frutos, folhas e inflorescências ...... 30 Figura 19: J. paucifoliata detalhando (A) inflorescências (B) exsicata e (D) galhos com folhas e sementes ...... 30 Figura 20: Ramo de J. puberula com inflorescências características do gênero...... 31 Figura 21: Sistemas de absorção em UV-VIS do núcleo aromático dos flavonoides ... 33 Figura 22: Estrutura química básica das principais classes de flavonoides ...... 33 Figura 23: Estrutura básica dos feniletanoides ...... 34 Figura 24: Aspecto da monocamada células MRC-5, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes ...... 36 Figura 25: Aspecto da monocamada células Hela, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes ...... 37 Figura 26: Aspecto da monocamada células HepG2, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes ...... 38 Figura 27: Aspecto da monocamada células TOV 21G, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes ...... 38
Figura 28: Princípio do ensaio de MTT ...... 39 Figura 29: Representação esquemática da placa de 96 poços utilizada para atividade citotóxica pelo método colorimétrico do MTT...... 53 Figura 30: Aspecto da cultura de células HeLa tratada com MTT...... 54 Figura 31: Perfil em CCD da pesquisa de geninas flavônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda...... 59 Figura 32: Perfil em CCD da pesquisa de geninas flavônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda...... 59 Figura 33: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos flavônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 60 Figura 34: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos flavônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 60 Figura 35: Perfil em CCD da pesquisa de geninas antraquinônicas e naftoquinônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 61 Figura 36: Perfil em CCD da pesquisa de geninas antraquinônicas e naftoquinônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 61 Figura 37: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos antracênicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 62 Figura 38: Perfis em CCD da pesquisa de heterosídeos antracênicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 62 Figura 39: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 63 Figura 40: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 63 Figura 41: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 63 Figura 42: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 64 Figura 43: Perfil em CCD da pesquisa de cumarinas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda...... 64 Figura 44: Perfil em CCD da pesquisa de saponinas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 65 Figura 45: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos cardiotônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 65 Figura 46: Perfil em CCD da pesquisa de alcaloides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda ...... 66 Figura 47: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. caroba (A), destacando as bandas de absorção UV dos picos mais intensos ...... 67 Figura 48: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia (B), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos ...... 68
Figura 49: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia (C), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos ...... 69 Figura 50: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule e folhas de J. macrantha (D), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos...... 70 Figura 51: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. micrantha (E), em destaque a banda de absorção UV do pico mais intenso...... 70 Figura 52: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. micrantha (F), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos ...... 71 Figura 53: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico dos frutos de J. micrantha (G), em destaque as bandas de absorção máxima UV dos picos mais intensos ...... 72 Figura 54: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de caule de J. mimosifolia (H) em destaque as absorções UV dos picos mais intensos ...... 72 Figura 55: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. mimosifolia (I), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos...... 73 Figura 56: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. puberula (J), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos ...... 74 Figura 57: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. puberula, em destaque a banda de absorção UV do pico mais intenso ...... 74 Figura 58: Perfil cromatográfico por CLUE dos extratos etanólicos de caule (A) e folhas (B) de J. brasiliana, folhas de J. caroba (C) e caule (D) e folhas (E) de J. cuspidifolia 76 Figura 59: Perfil cromatográfico por CLUE dos extratos etanólicos de caule (F), folhas (G) e frutos (H) de J. micrantha; caule (I) e folhas (J) de J. mimosifolia ...... 77 Figura 60: Perfis cromatográficos por CLUE dos extratos etanólicos de caule e folhas (K) de J. macrantha, caule (L) e folhas (M) de J. paucifoliata e caule (N) e folhas (O) de J. puberula ...... 78 Figura 61: Comparação dos cromatogramas CLAE (vermelho) e CLUE (verde) para extratos de folha de J. caroba (A) e caule de J. cuspidifolia (B) ...... 79 Figura 62: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia destacando as bandas de absorção UV nos picos com tR 2,57 e 2,81 min ...... 80
Figura 63: Espectro de massas no modo negativo tR 2,57 min apresentando pico m/z principal 623 Da...... 80 Figura 64: Espectro EM/EM m/z 623 do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as principais fragmentações ...... 81 Figura 65: Proposta de fragmentação do verbascosídeo ...... 82 Figura 66: Estrutura do isoverbascosídeo (A) e verbascosídeo (B) ...... 82 Figura 67: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV nos picos de tR 2.28, 3.05, 3.25 e 3.40 min ...... 84 Figura 68: Espectro EM/EM, m/z 639, do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, em destaque principais fragmentações no tR 2,29 min ...... 85 Figura 69: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 640 Da ...... 85
Figura 70: Estrutura do feniletanoide de massa molar 640 Da (β-hidroxiverbascosídeo) ...... 86 Figura 71: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. brasiliana, destacando a banda de absorção UV no pico de tR 2.86 min e espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 667 ...... 86 Figura 72: Fragmentações EM/EM, m/z 667 do extrato etanólico de caule de J. paucifoliata, destacando as fragmentações no tR 2.86 min...... 87 Figura 73: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 668 Da ...... 87 Figura 74: Estrutura do feniletanoide de massa molar 668 Da (Beta-etil-hidroxi- verbascosídeo) ...... 88 Figura 75: Espectro EM/EM m/z 637 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações ...... 89 Figura 76: Proposta de fragmentação do feniletanoide de 638 Da ...... 90 Figura 77: Estrutura do feniletanoide de massa molar 638 Da (leucosceptosídeo A)... 90 Figura 78: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando a banda de absorção UV no pico de tR 3.13 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 779 ...... 91 Figura 79: : Espectro EM/EM m/z 779 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações ...... 92 Figura 80: Proposta de fragmentação do feniletanoide 780 Da ...... 92 Figura 81: Estrutura do feniletanoide de massa molar 780 Da ...... 93 Figura 82: Espectro EM/EM, m/z 665, do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, em destaque no tR 3.25 min ...... 94 Figura 83: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 666 Da ...... 94 Figura 84: Estrutura do feniletanoide de massa molar 666 Da (2´-acetil-verbascosídeo) ...... 95 Figura 85: Espectro EM/EM, m/z 651, do extrato etanólico das folhas de J. puberula, no tR 3.40 min ...... 96 Figura 86: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 652 Da ...... 96 Figura 87: Estrutura do feniletanoide de massa molar 652 Da (Martinosídeo) ...... 97 Figura 88: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 2.82 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 463 ...... 98 Figura 89: Espectro EM sequencial m/z 463 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as principais fragmentações do tR 2.82 min ...... 99 Figura 90: Proposta geral de fragmentação da isoquercitrina ...... 99 Figura 91: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 2.72 min característico de flavonoides ...... 100 Figura 92: Espectro de massas, modo positivo (A), destacando pico m/z 611 e, modo negativo (B), destacando pico m/z 609 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, no tR 2.72 min ...... 100
Figura 93: Espectro de massas sequencial m/z 609 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as principais fragmentações do tR 2.72 min...... 101 Figura 94: Via de fragmentação proposta para rutina ...... 101 Figura 95: Estrutura da rutina ...... 102 Figura 96: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando o espectro de massas, no modo negativo, referente ao pico de tR 3.13 min com m/z 477 ...... 103 Figura 97: Espectro de massas sequencial m/z 477 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações do tR 3.13 min...... 103 Figura 98: Proposta de fragmentação da isoramnetina glicosídeo ...... 104 Figura 99: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 4.14 min, detalhando o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 271...... 105 Figura 100: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule de J. cuspidifolia e a via de fragmentação geradora dos principais picos para naringenina ...... 105 Figura 101: Estrutura da naringenina ...... 106 Figura 102: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 3.85 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 285 ...... 106 Figura 103: Espectro EM/EM de extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia e a via de fragmentação geradora dos principais picos para luteolina ...... 107 Figura 104: Proposta de fragmentação da luteolina ...... 107 Figura 105: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule mais folha de J. macrantha para fragmentação sequencial de m/z 447 destacando-se a perda da molécula de glicose ...... 108 Figura 106: Estrutura da luteolina 6-C-glicose (isorientina) ...... 108 Figura 107: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 4.36 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 299 ...... 109 Figura 108: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 299 ...... 110 Figura 109: Proposta de fragmentação da metoxiluteolina ...... 110 Figura 110: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 461, em destaque a banda de absorção de UV e principais fragmentações ...... 111 Figura 111: Estruturas proposta para flavona de massa molar 462 Da (A) Luteolina-5- metil-eter-7-O-glicosídeo e (B) Luteolina-7-metil-eter-5-O-glicosídeo ...... 112 Figura 112: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV nos picos com tR 3.17, 3.22 e 4.49 min ...... 112 Figura 113: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 269 destacando-se a fragmentação retro Diels Alder 113
Figura 114: Proposta de fragmentação da apigenina com a fragmentação Retro Diels Alder ...... 114 Figura 115: Estruturas da apigenina (A) e da genisteína (B) ...... 114 Figura 116: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 445 e 431, em destaque fragmentação com perda de glucoronídeo e glicose, respectivamente ...... 115
Figura 117: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule de J. brasiliana no tR 2,07 min. No detalhe o espectro de massas no modo negativo e positivo referentes aos picos m/z 445 (vermelho) e 447 (verde) ...... 116
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Espécies identificadas e selecionadas para perfil o fitoquímico comparativo e triagem de atividade citotóxica...... 43 Tabela 2: Gradiente de eluição empregado nas análises dos extratos por CLAE-FR-DAD...... 49 Tabela 3: Gradiente de eluição empregado nas análises dos extratos por CLUE-FR-EM...... 49 Tabela 4: Linhagens celulares utilizadas nos ensaios in vitro...... 51 Tabela 5: Rendimento da extração etanólica do material vegetal das espécies do gênero Jacaranda ...... 56 Tabela 6: Resultado da prospecção fitoquímica (CCD) dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda...... 58 Tabela 7: Feniletanoides encontrados nas espécies de Jacaranda...... 117 Tabela 8: Flavonoides encontrados nas espécies de Jacaranda...... 118 Tabela 9: Compostos fenólicos identificados nos extratos de caules, folhas e frutos de espécies do gênero Jacaranda...... 119 Tabela 10: Compostos fenólicos caracterizados nas espécies de Jacaranda pesquisadas...... 127
Tabela 11: Atividade citotóxica (CC50) in vitro dos extratos etanólicos brutos das espécies de Jacaranda e respectivos desvios padrão (n = 3) e índice de seletividade (IS) pelo ensaio colorimétrico do MTT...... 130
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila AS Anidrido Sulfúrico ATCC American Type Cell Culture
CC50 Concentração inibitória mínima (citotóxica a 50%) CCD Cromatografia em camada delgada de sílica gel CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência CLUE Cromatografia líquida de ultra eficiência DAD Arranjo de diodos DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DMF Dimetilformamida DMSO Dimetil sulfóxido EM Espectrometria de massas EM2 Espectrometria de massas sequencial ESI Electrospray ionization EtOH Etanol FDA Food and Drug Administration FR Fase reversa
H2O/MeOH Hidrometanólica Hep G2 Linhagem celular de carcinoma hepatocelular MTT Brometo de 3-(4’,5’-dimetiltiazol-21-ila)-2,5-difeniltetrazol INCA Instituto Nacional de Câncer IS Índice de seletividade LB Liebermann-Buchard MeOH Metanol MRC-5 Células derivadas de fibroblastos de pulmão fetal humano NA Não avaliado NCI National Cancer Institute – Instituto Nacional do Câncer Americano NP-PEG Produto natural – polietilenoglicol OMS Organização Mundial da Saúde PBS Solução salina fosfato tamponada RDA Retro-Diels-Alder RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
SFB Soro Fetal Bovino TOV-21G Linhagem celular de adenocarcinoma ovariano tR Tempo de retenção UV ultravioleta WHO World Health Organization
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 19 2.1 Câncer ...... 19 2.2 Família Bignoniaceae ...... 21 2.3 Gênero Jacaranda ...... 21 2.3.1 Caracterizações botânicas ...... 22 Jacaranda brasiliana (Lam.) Pers...... 24 Jacaranda caroba (Vell.) A. DC...... 25 Jacaranda cuspidifolia MART ...... 26 Jacaranda macrantha Cham...... 27 Jacaranda micrantha Cham...... 28 Jacaranda mimosifolia D. Don ...... 29 Jacaranda paucifoliata (Mart.) ex DC...... 30 Jacaranda puberula Cham ...... 30 2.4 Compostos Fenólicos ...... 31 2.4.1 Flavonoides ...... 32 2.4.2 Feniletanoides ...... 34 2.5 Cromatografia líquida de alta ou ultra eficiência acoplada à detecção de arranjo de diodos e espectro de massas ...... 34 2.6 Linhagens Celulares ...... 36 2.6.1 Células MRC-5 ...... 36 2.6.2 Células HeLa ...... 37 2.6.3 Células HepG2 ...... 37 2.6.4 Células TOV 21G ...... 38 2.7 Método Colorimétrico do MTT ...... 39 3 JUSTIFICATIVA ...... 40 4 OBJETIVOS ...... 41 4.1 Objetivo Geral ...... 41 4.2 Objetivos específicos ...... 41 5 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 42 5.1 Materiais ...... 42 5.2 Métodos ...... 42 5.2.1 Coleta e identificação do material vegetal ...... 42 5.2.2 Preparo dos extratos ...... 43
5.2.3 Prospecção fitoquímica...... 43 5.3 Perfis cromatográficos ...... 47 5.3.1 Preparo das amostras ...... 47 5.3.2 Parâmetros cromatográficos por CLAE-FR-DAD ...... 48 5.3.3 Parâmetros cromatográficos por CLUE-FR-DAD-EM ...... 49 5.4 ENSAIOS BIOLÓGICOS ...... 51 5.4.1 Linhagens celulares ...... 51 5.4.2 Expansão e criopreservação das linhagens tumorais humanas ...... 51 5.4.3 Viabilidade Celular ...... 52 5.5 Análise estatística dos dados ...... 54 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 56 6.1 Sazonalidade na coleta ...... 56 6.2 Obtenção dos extratos de caules e folhas de espécies do gênero Jacaranda. 56 6.3 Perfis cromatográficos dos extratos etanólicos brutos das espécies do gênero Jacaranda...... 57 6.3.1 Prospecção fitoquímica dos extratos etanólicos por CCD...... 57 6.4 Perfis cromatográficos dos extratos das espécies do gênero Jacaranda por CLAE/DAD...... 66 Extratos etanólicos ...... 66 6.5 Perfis cromatográficos dos extratos das espécies do gênero Jacaranda por CLUE/DAD/EM e EM2 ...... 75 6.6 Comparação entre as técnicas CLAE e CLUE ...... 78 6.7 Estruturas propostas para as substâncias detectadas nas análises por CLUE-DAD-EM ...... 80 6.7.1 Feniletanoides encontrados nos extratos das espécies de Jacaranda ...... 80 6.7.2 Flavonóis encontrados nos extratos das espécies de Jacaranda: ...... 97 6.7.3 Flavanonas encontradas nos extratos das espécies de Jacaranda ...... 104 6.7.4 Flavonas encontradas nos extratos das espécies de Jacaranda ...... 106 6.8 ENSAIOS BIOLÓGICOS ...... 129 6.8.1 Concentração ideal de células a serem semeadas para cada linhagem ... 129
6.8.2 Determinação da concentração citotóxica 50 % (CC50) ...... 129 7 CONCLUSÃO ...... 134 8 REFERÊNCIAS ...... 135
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1 INTRODUÇÃO
Estudo fitoquímico de plantas medicinais constitui uma alternativa estratégica na busca de novos agentes terapêuticos. Levantamento bibliográfico e o conhecimento popular servem como base para identificar as possíveis atividades farmacológicas de plantas medicinais (SARAIVA et al., 2015). A importância da demanda por componentes do metabolismo secundário de plantas tem aumentado e estimulado pesquisas em plantas com atividades biológicas (SAMANTA; DAS; DAS, 2011). No caso de indisponibilidade de estudos químicos sobre a espécie de interesse, a análise fitoquímica preliminar pode indicar os grupos de metabólitos secundários relevantes na mesma (SIMÕES et al., 2016). A química de produtos naturais de vegetais - fitoquímica, como é concebida atualmente, se dedica principalmente à caracterização estrutural, avaliação de propriedades e investigações biossintéticas de substâncias naturais produzidas pelo metabolismo secundário de plantas (KERRIGAN, 1999). O isolamento e caracterização de metabólitos secundários, com valor biológico, obtidos de plantas, ainda é uma área de grande relevância e interesse para identificar moléculas com potencial antimicrobiano, antioxidante, anti-inflamatório e antitumoral (YUAN et al., 2017; SEPÚLVEDA-ARIAS et al., 2018). A biodiversidade de plantas e seus derivados é potencialmente utilizada para o tratamento de várias enfermidades devido os metabólitos secundários apresentarem uma grande diversidade em termos de estruturas químicas e propriedades farmacológicas. Vários fármacos antitumorais importantes foram isoladas de plantas (WARDIHAN et al., 2013; ATANASOV et al., 2015). A atividade antitumoral de compostos citotóxicos tem sido descrita para plantas do gênero Jacaranda (YAMASAKI et al., 2013), como J. decurrens, popularmente utilizada no tratamento de vários tipos de câncer (CASAGRANDE et al., 2014). A família Bignoniaceae Juss (Dicotyledonae) pertence à ordem Lamiales e subclasse Euasteridae, reúne cerca de 120 gêneros, com aproximadamente 800 espécies arbóreas, arbustivas, trepadeiras e raramente ervas, geralmente ocorrem em regiões tropicais das Américas, África, Ásia e Oceania (LOHMANN, 2015; CHASE et al., 2016). A importância econômica desta família está associada, principalmente, ao potencial madeireiro, para a fabricação de móveis, construção civil e artesanatos (ARAÚJO, 2008; 13
MOSTAFA et al., 2016), muitos representantes desta família são usadas mundialmente como plantas ornamentais, devido a beleza de suas flores (SILVEIRA et al., 2012; MOSTAFA; ELDAHSHAN; SINGAB, 2014). Os gêneros mais importantes da família, com ampla distribuição nas regiões tropicais, são Tabebuia e Jacaranda (MARTINS; CASTRO; CAVALHEIRO, 2008; ZAPPI et al., 2015). No Brasil, estão catalogadas 36 espécies do gênero Jacaranda sendo que deste montante, 16 espécies ocorrem em Minas Gerais (ARAÚJO, 2008; ZAPPI et al., 2015). Entre os constituintes químicos reconhecidos na família Bignoniaceae são naftoquinonas do tipo lapachol, monoterpenos (principalmente iridoides), triterpenos, alcaloides monoterpênicos, flavonoides, taninos e lignanas (OLIVEIRA et al., 1990; GACHET; SCHÜHLY, 2009). O gênero Jacaranda é bem conhecido devido às propriedades biológicas e composição química. Diferentes classes de substâncias foram identificadas em espécies de Jacaranda e os principais metabólitos descritos são esteróis, triterpenos, flavonoides, fenilpropanoides, feniletanoides e quinonas (MOSTAFA; ELDAHSHAN; SINGAB, 2014; DREBES; ETHUR; AVANCINI, 2018). Em um estudo recente com extratos de folhas de J. caroba identificaram-se treze compostos fenólicos (FERRERES et al., 2013), enquanto quatro triterpenos foram isolados de folhas de J. puberula (ALMEIDA et al., 2014). Triagem fitoquímica de extratos de J. caroba e J. decurrens mostraram a presença de saponinas, flavonoides, taninos e antraquinonas (somente para J. decurrens) e negativos para alcaloides e óleos voláteis (HERNANDES et al., 2014). De acordo com a medicina popular, o chá da raiz de carobinha do campo (J. ulei Bur. e Schum.) é utilizado como depurativo do sangue e cicatrizante de feridas uterinas e dos ovários, as folhas são utilizadas nos problemas de reumatismo (NUNES et al., 2003; SANGALLI et al., 2012; MIRANDA et al., 2013). Esta espécie é utilizada na medicina popular brasileira para blenorragia, úlceras cutâneas, anti-sífilis e anti-gonorréia (PRAKASH; GARG, 1980). O extrato de J. puberula apresentou atividade antioxidante sendo usado como depurativo sanguíneo na medicina popular (SANTOS et al., 2010). A avaliação farmacológica revelou que diferentes espécies de Jacaranda possuem propriedades antitumorais, citotóxicas, anti-helmínticas, antibacterianas e anti- hipertensivas (OGURA; CORDELL; FARNSWORTH, 1977; WENIGER et al., 2001; NICASIO; MECKES, 2005; ZATTA et al., 2009).O composto jacaranona (Figura 1), é 14
um dos responsáveis pela atividade citotóxica e antitumoral relatados na literatura para as espécies J. caucana (OGURA; CORDELL; FARNSWORTH, 1977); J. ovalifolia (GOUDA et al., 2002), J. mimosifolia (RANA; BHANGALIA; SINGH, 2013) e J. oxyphylla (PEREIRA et al., 2016a) Figura 1: Jacaranona e verbascosídeo
Estudos comprovam que o verbascosídeo (Figura 1) presente nos extratos metanólicos das cascas e folhas de J. cuspidifolia é responsável pela ação antimicobacteriana desse extrato (ARRUDA et al., 2012). Os extratos de J. copaia apresentaram atividades citotóxicas nas linhagens celulares tumorais de mama (MDA- MB231 e SKBR3), pâncreas (PANC-1) e cólon (HT-29 e CACO-2) (TAYLOR et al., 2006). Foram isolados e identificados fenilpropanoides, esteroides e triterpenos na casca e caule de J. mimosaefolia destacando-se lupeol, betulinaldeído, ácido termínico, ácido betulínico, ácido 2,3-di-hidroxiolean-12-en-28-óico (ácido maslínico) e β-sitosterol (ZAGHLOULAB, et al., 2011), conforme estruturas da Figura 2. 15
Figura 2: Triterpenos isolados de J. mimosifolia
Fonte: Adaptado de Zaghloulab e colaboradores (2011)
Antunes e colaboradores (2016) isolaram de J. decurrens os flavonoides quercetina, luteolina, kaempferol e derivados glicosilados Figura 3. Figura 3: Flavonoides encontrados em J. decurrens
Foram isolados de J. caucana os feniletanoides glicosilados verbascosídeo, jionosídeo D, isoverbascosídeo e martinosídeo (MARTIN et al., 2009), enquanto compostos fenólicos como derivados de quercetina, kaempferol e isoramnetina foram isolados de J. caroba (FERRERES et al., 2013). Resultados obtidos por Arruda e colaboradores (2011) corroboram o uso popular de J. cuspidifolia Mart. para o tratamento de doenças microbianas, incluindo gonorréia, sendo ariletanoides a principal classe de compostos presente em extrato dessa espécie. Também foi comprovada atividade antioxidante de extratos hidroalcoólicos de folhas de J. decurrens, relacionada à presença 16
dos triterpenos ácidos ursólico e oleanóico (Figura 4) e também flavonoides glicosilados (CARVALHO et al., 2009). Figura 4: Triterpenos isolados de J. decurrens
Fonte: Adaptado de Carvalho e colaboradores (2009) Por fim, estudos mostram que o extrato hidroetanólico de folhas de J. decurrens, além de atividade antioxidante in vitro e in vivo, apresentou atividade citotóxica contra células eritroleucêmicas (K-562) induzidas tanto por apoptose tardia quanto por necrose, permitindo novas perspectivas sobre seu uso em situações envolvendo estresse oxidativo e proliferação celular (CASAGRANDE et al., 2014). De acordo com alguns autores (CRAGG; NEWMAN, 2013; NEWMAN; CRAGG, 2016; THORNBURG et al., 2018) os fármacos podem ser classificados de acordo com a sua origem em diferentes grupos conforme destacados na legenda da Figura 5. Figura 5: Todos os novos medicamentos aprovados no período de 1981-2014
Fonte: Adaptado de Newman e Cragg (2016).
As macromoléculas biológicas (B) são geralmente moléculas compostas por péptido ou proteína isolada de um organismo/linha celular ou produzida com recursos a meios biotecnológicos num hospedeiro substituto. Os fármacos pertencentes ao grupo N são produtos naturais inalterados, enquanto os fármacos NB são misturas botânicas 17
reconhecidas pela FDA (do inglês, Food and Drug Administration) e outras entidades relacionadas com o medicamento (CRAGG; NEWMAN, 2013). Os compostos ND são derivados de uma fonte de produtos naturais, isto é, são de origem semissintéticos. Os compostos classificados como S são fármacos obtidos por síntese química e os fármacos S* são de fonte sintética, mas originalmente modelados de um produto natural, ou seja, o farmacóforo deste composto é obtido a partir de um produto natural. Os produtos naturais mimetizados (NM) incluem fármacos sob ambas as subdivisões principais S* e S que, embora totalmente sintéticos, são modelados num inibidor do produto natural do alvo molecular de interesse ou inibem competitivamente o substrato endógeno de um local ativo, como a ATP (adenosina trifosfato, do inglês adenosine triphosphate), aminas adrenérgicas e endotelinas. Os fármacos V referem-se a vacinas. É possível concluir que, apesar dos fármacos desenvolvidos com base em produtos naturais não representarem o grupo com maior percentagem de aprovações, ainda detêm uma percentagem de 40% (relativa aos fármacos N; NB; ND; S* e S*/NM). Entre o período de 1981 a 2014, nos Estados Unidos, 1562 novos fármacos (174 antitumorais) foram aprovados e comercializados (Figura 5), destes, 4% eram de origem natural; 21% eram produtos naturais semissintéticos; 1% produtos naturais botânicos e 4% produtos sintéticos cujo farmacóforo modelo foi obtido de um produto natural (NEWMAN; CRAGG, 2016). A indústria farmacêutica já desenvolveu diversos quimioterápicos a partir de substâncias isoladas de plantas como a vimblastina (Velban) e vincristina (Oncovin) de Catharanthus roseus, o etoposídeo (Vepeside) e teniposídeo (Vumon) derivados semissintéticos de Podophyllum peltatum (L), taxol (Paclitaxel) extraído de Taxus brevifolia, topotecan semissintético derivado de Camptotheca acuminatae homoharringtonina de Cephalolaxus harringtonia entre outros, confirmando que espécies vegetais são importantes fontes potenciais para o descobrimento de novos fármacos anticâncer (BRANDÃO et al., 2010; BRAZ FILHO, 2010; FERLAY et al., 2015; NEWMAN; CRAGG, 2016; FDA, 2018). O câncer continua sendo um ônus global, apesar do avanço de várias melhorias tecnológicas e farmacêuticas nas últimas duas décadas. Os métodos para o tratamento do câncer incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, além de outras técnicas especializadas (KHAN et al., 2018). As plantas medicinais são uma rica fonte de 18
metabólitos secundários que incluem alcaloides, flavonoides, compostos fenólicos, carotenoides. Estes fitocompostos vegetais podem prevenir a iniciação, promoção e progresso do câncer, exercendo efeitos anti-oxidantes que medeiam pela integração das vias de sinalização de NF-κB, Nrf2 e AP-1 (IQBAL et al., 2017; TIEZZI; KARPIŃSKI, 2017; SECA; PINTO, 2018). A importância de plantas como fontes de novos fármacos é universalmente reconhecida e não faltam resultados promissores quanto ao potencial citotóxico de extratos e plantas. O espaço para pesquisas com plantas como novos agentes antineoplásicos e de extratos para o desenvolvimento de fitoterápicos é praticamente infinito. Além disso, as metodologias de ensaios biológicos desenvolvidas nas duas últimas décadas aceleraram a triagem de atividades biológicas provenientes de plantas (ALTEMIMI et al., 2017). A presente pesquisa propõe analisar o perfil fitoquímico de extratos de espécies do gênero Jacaranda (Bignoniaceae) presentes em Minas Gerais e o estudo da atividade citotóxica in vitro destes extratos em linhagens de células tumorais. 19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Câncer
Câncer é um termo genérico para um grande grupo de doenças que podem afetar qualquer parte do corpo. Outros termos utilizados são tumores malignos e neoplasias. Uma característica definidora do câncer é a rápida criação de células anormais que crescem além de seus limites habituais (Figura 6), e que podem então invadir partes adjacentes do corpo e se espalhar para outros órgãos, o último processo é conhecido como metástase sendo uma das principais causas de morte por câncer (WHO, 2019). As alterações genéticas que causam o câncer podem ter várias causas. Em geral, elas estão associadas a fatores ambientais ou hereditários (INCA, 2018).
Figura 6: O que é o câncer?
Fonte: INCA (2018) Alguns genes têm instruções para controlar o crescimento e a divisão de células. Os genes que promovem a divisão celular são chamados de oncogenes. Os genes que retardam a divisão celular ou levam as células à morte no momento certo são denominados genes supressores do tumor. Os cânceres podem ser causados por alteração no DNA que se transformam em oncogenes ou por desativação dos genes supressores do tumor (WILLIANS; STOEBER, 2011; AMERICAN CANCER SOCIETY, 2019). Fouad e Aanei (2017) descreveram as sete principais características das células tumorais (Figura 7) como sendo: crescimento seletivo e vantagem proliferativa manipulando fatores promotores e supressores de crescimento, resposta ao estresse alterada favorecendo a sobrevida global de células que exibam melhor adaptação, vascularização (angiogênese), invasão e metástase, reprogramação metabólica, modulação imunológica e um microambiente favorável. 20
Figura 7: Características do câncer revisadas
Adaptado de Fouad e Aanei (2017)
Em 2016, houve 17,2 milhões de casos de câncer no mundo e 8,9 milhões de mortes. Os casos de câncer aumentaram em 28% entre 2006 e 2016. Globalmente, o envelhecimento da população contribuiu com 17%; crescimento populacional, 12%; e mudanças nas taxas específicas por idade, decréscimo de 1% a esta mudança (FITZMAURICE et al., 2018). O Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva INCA, estima, para o Brasil, no biênio 2018-2019, a ocorrência de 600 mil casos novos de câncer, para cada ano. Excetuando-se o câncer de pele não melanoma (cerca de 170 mil casos novos), ocorrerão 420 mil casos novos de câncer. O cálculo global corrigido para o sub-registro, segundo Mathers e colaboradores (2003), aponta a ocorrência de 640 mil casos novos. Essas estimativas refletem o perfil de um país que possui os cânceres de próstata (68.000), mama feminina (60.000), cólon e reto (17.000) e pulmão (19.000) entre os mais incidentes, entretanto ainda apresenta altas taxas para os cânceres do colo do útero (17.000), estômago (13.500) e esôfago (8.200). (Figura 8)
21
Figura 8: Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2018 por sexo, exceto pele não melanoma
Fonte: INCA (2018) Segundo Siegel; Miller e Jemal (2018), durante a última década, nos EUA, a taxa de incidência de câncer (2005-2014) foi estável em mulheres e declinou em aproximadamente 2% ao ano em homens, enquanto a taxa de mortalidade por câncer (2006-2015) diminuiu cerca de 1,5% ao ano em homens e mulheres e a taxa combinada de mortalidade por câncer caiu continuamente de 1991 a 2015 em um total de 26%.
2.2 Família Bignoniaceae As plantas da família Bignoniaceae, são de modo geral, plantas lenhosas, arbustivas, arbóreas ou trepadeiras, frequentemente com gavinhas foliares, possuem folhas opostas, compostas, raramente simples. De acordo com Gentry (1992), a família está entre as dez que apresentam maior diversidade de plantas lenhosas das florestas úmidas da região Neotropical, sendo a segunda família com maior número de espécies, após a família Fabaceae.
2.3 Gênero Jacaranda Jacaranda Juss. é um gênero neotropical com espécies ocorrendo desde a América Central, onde ocorre a espécie tipo Jacaranda caerulea (L.) J, St.-Hil, até o norte da Argentina. As espécies do gênero estão distribuídas em duas seções com base no número de lobos das anteras, Seção Jacaranda (= Monolobos) com uma teca reduzida e, Seção Dilobos com as duas tecas desenvolvidas (CORDEIRO et al., 2016). Atualmente são aceitas 48 espécies, sendo que 36 destas ocorrem no Brasil. Duas espécies extra brasileiras são amplamente cultivadas pela beleza das árvores quando em flor, J. acutifolia Bonpl. e J. mimosifolia D. Don. Estas duas espécies estão posicionadas 22
na Seção Jacaranda e morfologicamente são parecidas com J. brasiliana (Lam.) Pers. e J. cuspidifolia Mart. (LOHMANN, 2015).
2.3.1 Caracterizações botânicas Árvores, arbustos ou subarbustos com xilopódio. Folhas bipinadas, pinadas, raro simples, foliólulos inteiros a denteados. Inflorescência terminal ou lateral, tirso; cálice campanulado a cupular, 5-denticulado a profundamente lobado; corola tubular campanulada a infundibuliforme com a parte interna do tubo às vezes branca, tubo estreito próximo à base, externamente glabra ou pubérula, cor azul, lilás, roxa, magenta, raro branca; estames inclusos ou não, anteras glabras, podendo ter uma das tecas reduzida (seção Jacaranda) ou não (seção Dilobos); estaminódio longo excedendo as anteras em tamanho, geralmente piloso glandular no ápice e com outros tipos de tricomas nos 2/3 superiores; disco nectarífero pulvinado a anular; ovário cilíndrico, comprimido, variavelmente pubérulo, 6-10-séries de óvulos por lóculo. Cápsula loculicida, elíptica, oblonga a orbicular, fortemente comprimida perpendicularmente ao septo, coriácea a lenhosa, valvas onduladas ou não quando da deiscência; sementes achatadas, delgadas, aladas, hialinas, conforme detalhes na Figura 9. (CORDEIRO et al., 2016; GENTRY, 1992; LOHMANN, 2015; ZAPPI et al., 2015).
Figura 9: Jacaranda caroba – A. ramo com flores e frutos; B. detalhe do foliólulo terminal; C. detalhe do indumento da face abaxial; D. inflorescência; E. flor; F. detalhe do cálice; G. detalhe do gineceu; H. estames e estaminódio; I. Semente.
Fonte: Adaptado de Pereira e Mansano (2008) 23
As espécies de Jacaranda podem ser identificadas pela disposição do folhas, o tipo de inflorescência e as características dos frutos, conforme descrito abaixo: Folhas: opostas, bipinadas e raramente pinadas ou simples (Figura 10).
Figura 10: Características essenciais das folhas de Jacaranda copaia
Fonte: adaptado de EMBRAPA (2018).
Inflorescência: terminal, axilar ou cauliflorosa, paniculada, contendo poucas para muitas flores com um campanulado de cálice para cupular (Figura 11). A corola é azul a vermelha, raramente branca, geralmente 5 denticulada, 5-lobos, estames com 1 ou 2 tecas frequentemente 1; ovário bilocular; pólen grãos 3-colpate. Figura 11: Inflorescências de Jacaranda copaia
Fonte: EMBRAPA (2018) 24
Frutas: Cápsula oblonga achatada perpendicularmente ao septo, as válvulas variadamente glabras ou lepidotas; sementes numerosas, finas, alado; as asas membranáceas, hialinas ou acastanhadas (Figura 12).
Figura 12: Partes reprodutivas, frutos e semente Jacaranda copaia
Fonte: Nascimento e colaboradores (2016)
Ocorrências de espécies de Jacaranda catalogadas e presentes neste estudo: Jacaranda brasiliana (Lam.) Pers. Ocorrências confirmadas: Norte: (PA e TO), Nordeste (AL, BA, CE, MA, PB, PE, PI, RN e SE), Centro Oeste (DF, GO e MT) e Sudeste (MG). Nomes populares: caroba, jacarandá-boca-de-sapo, boca-de-sapo. Domínios Fitogeográficos: Amazônia e Cerrado. Características: Árvore de 4 a 10 metros de altura, de tronco cilíndrico, de 20 a 30 cm de diâmetro. Ramos lenticelados e claros. Folhas bipinadas, com 17 a 31 pinas, cada pina com 30 a 50 folíolos sésseis de extremidade obtusa, de 1,4 cm de comprimento. Inflorescências em panículas abertas, em flores de cálice com 5 lobos profundos (Figura 13). 25
Figura 13: J. brasiliana detalhando (A) tronco (B) inflorescências (C) ramos e folhas e (D) semente
Fonte: Royal Botanic Gardens (2018)
Jacaranda caroba (Vell.) A. DC. Ocorrências confirmadas: Nordeste (BA), Centro Oeste (DF e GO) e Sudeste (MG, RJ e SP). Nomes populares: Caroba, carobinha Domínios Fitogeográficos: Cerrado e Mata Atlântica Características: Arvoreta ou arbusto, 3 m alt.; ramos estriados, glabros, com lenticelas. Folhas bipinadas, com 8–10 pinas, 7–15 foliólulos por pina; raque canaliculada, 7,2–10,5 cm, glabra, pecíolos 4, 5,8 cm, canaliculados, levemente tomentosos; peciólulo reduzido; foliólulos simétricos 2,2–4,8 × 0,8–1,6 cm, com distinção entre os foliólulos da base e do ápice, sendo os da base obovados e os do ápice oblanceolados, densamente tomentosos somente nas nervuras da face adaxial, ápice obtuso a agudo, base cuneada, margem inteira. Inflorescência tirsóide, terminal ou axilar, eixo 9,7–13,6 cm, cilíndrico, pubescente; brácteas e bractéolas caducas; pedicelo 0,3–0,5 cm. Cálice vináceo, 0,8 × 0,4 cm, cupular, pubescente; corola tubular-campanulada, arroxeada, tubo 2,6–4,8 × 1,1–1,6 cm, pubescente, lobos 0,7–0,9 cm, pubescentes; filetes 0,8–2,1 cm, anteras ditecas, 0,1– 0,3 cm; estaminódio 2,4–4 cm, glandular-tomentoso; ovário 0,3 × 0,2 cm, glabro, estilete 1,6–2,9 cm, estigma 0,1 cm larg. Cápsula 4,6–3,2 × 5,9–3,6 cm, aplanado elíptica, glabra, com margem plana ou levemente ondulada; sementes 1,4–1,6 × 0,3– 0,4 cm, aladas (PEREIRA; MANSANO, 2008), conforme Figura 14. 26
Figura 14: J. caroba detalhando (A) inflorescências (B) exsicata e (D) galhos com folhas e sementes
Fonte: Royal Botanic Gardens (2018)
Jacaranda cuspidifolia MART Ocorrências confirmadas: Centro Oeste (DF, GO, MT e MS) e Sudeste (MG e SP). Domínios Fitogeográficos: Cerrado, Mata Atlântica e Pantanal. Nomes populares: Jacarandá-de-minas, jacarandá, caiuá, jacarandá branco, caroba branca, pau-de-colher, pau-santo, carobeira, jacarandá preto, mulher-pobre. Características morfológicas: Altura de 5-10 m, com tronco de 30·40 cm de diâmetro. Folhas compostas bipinadas de 20-50 cm de comprimento, com 8-10 jugas (pares de pinas); pinas com 10-15 pares de folíolos glabros (Figura 15) Utilidade: A madeira é própria para marcenaria. A árvore é extremamente ornamental, principalmente quando em flor; pode ser empregada com sucesso no paisagismo em geral o que já vem sendo feito em muitas cidades de Minas Gerais (LORENZI, 2016). 27
Figura 15: Ramo de J. cuspidifolia com inflorescências e semente
Fonte: Melo (2018)
Jacaranda macrantha Cham. Ocorrências confirmadas: Sudeste (ES, MG, RJ e SP). Domínios Fitogeográficos: Cerrado e Mata Atlântica. Nomes populares: Caroba, carobão. Características morfológicas: Altura de 8-12 m. com tronco ereto de 20-30 cm de diâmetro. Folhas compostas bipinadas, longo-pecioladas de 40-50 cm de comprimento, com 9-11 jugas; folíolos peciolados, com nervuras pubescentes e fortemente impressas na página superior (Figura 16). Utilidade: A madeira pode ser empregada em obras internas em construção civil, como forro e divisórias, para estrutura de móveis, instrumentos musicais, cepas de tamancos, marcenaria e carpintaria em geral. A árvore é extremamente ornamental tanto pelo seu exuberante florescimento como pela forma quase colunar da copa (LORENZI, 2016). 28
Figura 16: J. macrantha com inflorescências e sementes em destaque
Fonte: Melo (2018)
Jacaranda micrantha Cham. Ocorrências confirmadas: Sudeste (MG, RJ e SP) e Sul (PR, RS e SC). Domínios Fitogeográficos: Mata Atlântica. Nomes populares: Caroba, carobão, paraparaí. Características morfológicas: Altura de 10-25 m. com tronco de 40-60 cm de diâmetro. Folhas grandes (60-70 cm de comprimento), opostas imparibipinadas, com 4-8 pares de pinas de 20-25 cm de comprimento; folíolos em número de 4-10 pares de 4-7 cm de comprimento (Figura 17). Utilidade: A madeira é utilizada para estrutura de móveis, instrumentos musicais, obras internas, cepa de tamancos, marcenaria, carpintaria, para confecção de forros, pasta celulósica e caixas para embalagens. A árvore é extremamente ornamental quando em flor, além da forma da copa bastante colunar e decorativa. 29
Figura 17: Ramo de J. micrantha com inflorescências características do gênero
Fonte: Saueressig (2018)
Jacaranda mimosifolia D. Don Ocorrências confirmadas: Sudeste (MG e SP). Domínios Fitogeográficos: Formações florestais do complexo atlântico. Nomes populares: Jacarandá-mimoso, carobaguaçu, jacarandá Características: Árvore de até 15 m de altura, com casca fina e acinzentada. Folhas opostas, compostas bipinada, de 10 a 25 cm de comprimento, com folíolos pequenos, glabros e de bordo serreado. Flores com coloração azulado-lilás, arranjadas em inflorescências piramidais densas. Os frutos são cápsulas lenhosas, muito duras e contendo numerosas sementes aladas, popularmente conhecida como jacarandá mimoso é uma espécie florestal considerada nativa da Argentina. Sua madeira é própria para marcenaria, porém seu uso predominante é para o paisagismo em geral, em virtude das características morfológicas das suas flores (LORENZI, 2016) conforme Figura 18. 30
Figura 18: J. mimosifolia em detalhe frutos, folhas e inflorescências
Fonte: Lopes, Viegas e Fernandes (2001).
Jacaranda paucifoliata (Mart.) ex DC. Ocorrências confirmadas: Centro Oeste (DF, GO, MS e MT) e Sudeste (MG, RJ, SP e ES). Domínios Fitogeográficos: Cerrado. Características: Planta nativa do Brasil com poucos estudos relatados na literatura (Figura 19).
Figura 19: J. paucifoliata detalhando (A) inflorescências (B) exsicata e (D) galhos com folhas e sementes
Fonte: Royal Botanic Gardens (2018)
Jacaranda puberula Cham Ocorrências confirmadas: Sudeste (ES, MG, RJ e SP). 31
Domínios Fitogeográficos: Cerrado e Mata Atlântica. Características: Arvoreta de 3 m até árvores de 10 m de altura; ramos estriados, pubescentes, com lenticelas. Folhas bipinadas, 9–15 pinas, 4–17 foliólulos por pina; raque canaliculada, 12–22,5 cm, tomentosa, pecíolos 4–7,8 cm, canaliculados, pubescentes; peciólulo 0,4–0,7 cm, canaliculado; foliólulos simétricos, 1,2–3,2 × 0,4–1,4 cm, elípticos, glabrosa face adaxial e esparsamente pubescentes e com tricomas glandulares na face abaxial, ápice agudo a obtuso, base cuneada a obtusa, margem denteada. Inflorescência tirsóide terminal, eixo 9,5 cm, canaliculado, pubescente; brácteas 0,4–0,6 × 0,1 cm; bractéolas 0,3 × 0,1 cm; pedicelo 0,2–0,3 cm. Cálice vináceo, 1,1 × 0,7 cm, cupular, tomentoso; tubo 1,9–3 cm; corola campanulada, tubo 3,9–4,9 × 1,2–1,9, tomentoso e com tricomas glandulares, lobos 3–6 × 1–3 mm; filetes 1,5–2,3 × 0,1 cm; anteras ditecas, ca. 3 mm; estaminódio 3,2 cm, gladuloso-pubescente; ovário 0,3 × 0,2cm, glabro, estilete 2,7 cm, estigma 0,1 cm larg. Cápsula 2,8–4,9 × 1,8–3 cm, aplanado-elíptica, glabra, margem plana; sementes não observadas (PEREIRA; MANSANO, 2008) (Figura 20).
Figura 20: Ramo de J. puberula com inflorescências características do gênero
. Fonte: Saueressig (2018)
2.4 Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são substâncias que possuem uma, ou mais hidroxilas ligadas a um anel benzênico e, embora contenha um grupo característico de álcoois, esta classe de compostos possui propriedades especiais, são compostos mais ácidos que os álcoois sendo oxidados com maior facilidade. Os fenóis incluem os compostos que possuam apenas um anel aromático ligado a um ou mais grupamentos hidroxílicos. Os 32
polifenóis compreendem aqueles compostos fenólicos que possuam múltiplos anéis fenólicos em sua estrutura e podem ser divididos em classes de acordo com o número de anéis fenólicos e os elementos estruturais que ligam estes (DALL´ANTONIA; ARCHELA, 2013).
2.4.1 Flavonoides
Os flavonoides são pigmentos quase universais das plantas. Eles também são responsáveis pela coloração de flores, frutas e às vezes folhas. Já foram caracterizados mais de 4000 flavonoides, e a lista está em constante expansão e ocorrem principalmente em plantas como O-, C-glicosídeos e como agliconas livres (LAUNAY, 2017). Flavonoides pertence a um grupo de substâncias naturais com estruturas fenólicas variáveis, encontrados em frutas, folhas, grãos, casca, raízes, caules, flores possuindo efeitos benéficos sobre a saúde e são considerados componentes indispensáveis a uma variedade de aplicações nutracêuticas, farmacêuticas, medicinais e cosméticas. Isto é atribuído às suas propriedades antioxidativas, anti-inflamatórias, anti-mutagênicas e anti- carcinogênicas (PANCHE; DIWAN; CHANDRA, 2016). A espectroscopia no UV/VIS de flavonoides dissolvidos em metanol, é um método de escolha na determinação estrutural. Segundo Mabry (1970) o UV de flavonas e flavonóis apresentam duas bandas de maior absorção na região de 240-400 nm. Essas duas bandas são designadas comumente como banda I (usualmente de 300-380 nm) e banda II (usualmente em 240-280 nm). A banda I está associada com a absorção devida ao sistema cinamoíla do anel B, e a banda II com a absorção envolvendo o sistema benzoíla do anel A (Figura 21). Flavonas e flavonóis oxigenados no anel A, mas não no B, tendem a ter a banda II mais pronunciada que a I. Em moléculas que também possuem o anel B oxigenado, o UV apresenta a banda I mais pronunciada, a qual aparece em comprimentos de onda não muito distantes. O UV em metanol, particularmente a posição da Banda I, fornece informações sobre o tipo de flavonoide assim como o seu padrão de oxidação (MARKHAM, 1982). A banda I das flavonas ocorre na faixa de 304-350 nm, enquanto que a dos flavonóis aparece em 352-385 nm. Entretanto os flavonóis com o grupo 3-hidroxil substituído (metilado ou glicosilado) possuem a banda I em 328-357 nm, e em geral suas bandas de absorção são próximas a das flavonas. 33
Figura 21: Sistemas de absorção em UV-VIS do núcleo aromático dos flavonoides
Fonte: Adaptado de Markham (1982).
A estrutura química básica dos flavonoides é apresentada na Figura 22 a seguir para facilitar a elucidação das estruturas propostas (DALL´ANTONIA; ARCHELA, 2013).
Figura 22: Estrutura química básica das principais classes de flavonoides
Fonte: Adaptado de Dall’Antonia e Archela (2013)
34
2.4.2 Feniletanoides
Feniletanoides pertencem a uma classe de compostos encontrados em raízes, caules, folhas, flores, frutos e sementes de plantas das ordens Lamiales, Oleales, Asterales, dentre outras. Como seu nome sugere, são caracterizados por uma fração de
álcool fenílico (C6-C2) ligada a uma β-glicopiranose/β-alopiranose através de uma ligação glicosídica. As estruturas centrais são frequentemente compostas por ácidos aromáticos como, ácido caféico, ácido cumárico, ácido cinâmico, ácido ferúlico ou ácido isoferúlico e vários sacarídeos como, ramnose, xilose, apiose, glicose, lixose, alose e arabinose através de ligações éster ou glicosídicas, respectivamente (JIMÉNEZ; RIGUERA, 1994; YANG; XUE; YANG, 2016), conforme Figura 23. Gálvez, Martín-Cordero e Ayuso (2006) afirmam que este grupo de compostos também são chamados de fenilpropanoides ou cafeoil glicosídeos.
Figura 23: Estrutura básica dos feniletanoides
Fonte: Adaptado de Yang e colaboradores (2016) .
2.5 Cromatografia líquida de alta ou ultra eficiência acoplada à detecção de arranjo de diodos e espectro de massas
Extratos de plantas são matrizes complexas compostas por diferentes tipos de metabólitos. Portanto, sua identificação é uma tarefa difícil e geralmente requer a combinação de mais de uma técnica analítica, como é o caso da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e/ou espectrometria de massas (CLAE-EM) ou EM sequencial (CLAE-EMn) (FERRERES et 35
al., 2013). Comumente, colunas C18 de fase reversa e um sistema de solventes binários incluindo água e um solvente orgânico polar (acetonitrila ou metanol) e DAD para detectar a absorção nas regiões UV-Vis são utilizados (KUPPUSAMY et al., 2018). Essa técnica emprega colunas fechadas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída a altas pressões, apresentando a capacidade de realizar separações de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. Além de permitir excelente separação, esta técnica possibilita simultaneamente separar, identificar e quantificar metabólitos secundários sem requerer purificação excessiva dos extratos (ESCRIBANO-BAILÓN; SANTOS-BUELGA; RIVAS-GONZALO, 2004). A combinação com espectrometria de massas permite uma caracterização mais detalhada, fornecendo informações úteis sobre a massa molecular e características estruturais de cada composto (FERRERES et al., 2013). Nos últimos anos, várias misturas de compostos fenólicos foram analisadas com equipamentos avançados de CLAE-EM (GANZERA; STURM, 2018). CLAE–DAD–ESI-EMn representa uma ferramenta poderosa para a análise de metabólitos secundários de plantas. A caracterização estrutural dos flavonoides glicosilados através de espectrometria de massas foi baseada na dissociação induzida por colisão (CID) de espécies moleculares, tais como moléculas protonadas [M+H]+ e moléculas desprotonadas [M-H]-. O experimento CID pode ser usado de maneira branda (soft), como ESI-EM/EM ou ionização intensa (hard), porque é dependente apenas do analisador (Q-TOF, ion-trap e outros) e do gás de colisão (LEO et al., 2010; TAO et al., 2011; NEGRI; DE SANTI; TABACH, 2012). A técnica de ionização por electrospray (ESI) revolucionou a maneira como as moléculas são ionizadas e transferidas para espectrômetros de massa para análise estrutural e de massa. Assim, uma grande aplicabilidade da espectrometria de massas ocorreu devido à sua capacidade para analisar moléculas pequenas e grandes de várias polaridades em mistura complexas de amostras biológicas (PEREIRA et al., 2015). Outra característica é que as amostras a serem analisadas devem ser introduzidas em solução, o que faz com que seja possível o acoplamento com uma técnica de separação (CLAE) e, por último, ESI é uma técnica de ionização suave, provocando pouca (ou nenhuma) 36
fragmentação dos analitos estudados, facilitando a identificação (BANERJEE; MAZUMDAR, 2012). Muitas técnicas modernas têm sido empregadas para caracterizar e identificar flavonoides em extratos vegetais. Segundo Zhang e colaboradores (2005) embora o detector de UV tenha sido comumente utilizado para tal finalidade seu limite de detecção ainda é insatisfatório levando a necessidade de hifenização de cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) com espectrometria de massas (EM). Até agora, diferentes tipos de métodos de ionização foram desenvolvidos, entre os quais, a ionização por electrospray (ESI) tem sido amplamente utilizada para a análise de extratos vegetais em modo de íons positivos ou negativos (PEREIRA et al., 2015).
2.6 Linhagens Celulares
2.6.1 Células MRC-5
Células MRC-5 são constituídas por uma população de células fibroblastóides e foi estabelecida a partir do tecido pulmonar de um feto masculino humano normal (ATCC® CCL-117TM), de 14 semanas de gestação, removido de uma mulher de vinte sete anos. A partir da cultura seriada desse tecido formou-se um banco celular com 481 ampolas mantidas em nitrogênio líquido (JACOBS; JONES; BAILLE, 1970) (JACOBS, 1976). Aspectos morfológicos das células MRC-5 em cultivo podem ser observados na Figura 24.
Figura 24: Aspecto da monocamada células MRC-5, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes
Fonte: www.atcc.org/~/media/Attachments/Micrographs/Cell/CCL-171.ashx 37
A célula MRC-5 foi usada com o intuito de se calcular o índice de seletividade (IS), que mede o quanto um composto é citotóxico contra a linhagem tumoral sem causar danos à viabilidade das células de mamíferos. Para calcular o IS, é necessário, antes, conhecer o CC50, que corresponde à dose necessária para reduzir em 50% a viabilidade das células. O IS é obtido, então, dividindo-se a CC50 da MRC pela CC50 da célula tumoral. Quanto maior esta razão, mais seletiva é a droga sobre a citotoxicidade da célula tumoral e, consequentemente, menor efeito ela tem sobre a célula hospedeira de mamífero (SITI SYARIFAH et al., 2011).
2.6.2 Células HeLa
São células derivadas de carcinoma epitelial humano HeLa (ATCC® CCL-2TM) sendo derivada de células obtidas de um câncer cervical coletadas em 8 de fevereiro de 1951 de Henrietta Lacks (origem do nome), essas células formam o que se chama de linhagem celular contínua, dividindo-se indefinidamente, por isso são chamadas de imortais sendo utilizada como modelo de tumor epitelial (RANSCOMBE, 2013). Aspectos morfológicos das células HeLa em cultivo podem ser observados na Figura 25.
Figura 25: Aspecto da monocamada células Hela, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes
Fonte: https://www.atcc.org/~/media/Attachments/Micrographs/Cell/CCL-2.ashx
2.6.3 Células HepG2
São células derivadas de um carcinoma hepatocelular hepático de um homem caucasiano de 15 anos de idade e apresenta alta correlação com neoplasias retiradas de pacientes em relação a expressão genética apresentando funções celulares semelhantes a grande parte dos hepatócitos normais além de um alto grau de diferenciação morfológica (CHEN et 38
al., 2015; XIA et al., 2013). Aspectos morfológicos das células Hep G2 (ATCC® HB-
8065TM) em cultivo podem ser observados na Figura 26. Figura 26: Aspecto da monocamada células HepG2, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes
Fonte: https://www.atcc.org/~/media/Attachments/Micrographs/Cell/HB-8065%20Low%20High.ashx
2.6.4 Células TOV 21G
São células de adenocarcinoma ovariano derivada de um tumor de grau 3 (estágio 3) obtida de paciente feminina de 61 anos de idade (PROVENCHER et al., 2000). Aspectos morfológicos das células TOV 21G (ATCC® CRL-11730TM) em cultivo podem ser observados na Figura 27. Figura 27: Aspecto da monocamada células TOV 21G, onde se caracteriza a morfologia celular assumida em culturas confluentes
Fonte: atcc.org/~/media/Attachments/Micrographs/Cell/CRL-11730.ashx 39
2.7 Método Colorimétrico do MTT
O ensaio de MTT é baseado na capacidade das desidrogenases mitocondriais em clivarem os anéis tetrazólio do corante MTT através de enzimas oxidoredutases dependentes de NAD(P)-H, resultando na formação de cristais azuis. Estes cristais de formazana são impermeáveis a membrana plasmática e, desta forma, se acumulam no interior de células viáveis (Figura 28). A adição de solvente (DMSO) solubiliza as células, resultando na liberação dos cristais e, consequentemente, na coloração azul. O número de células viáveis é diretamente proporcional aos níveis de cristais azuis formados, sendo que a coloração pode ser medida por espectrofotometria (MOSMANN, 1983; TADA et al., 1986). Figura 28: Princípio do ensaio de MTT
Fonte: o autor (2019)
40
3 JUSTIFICATIVA As plantas são importantes recursos naturais e mundialmente conhecidas como fontes de moléculas bioativas. Diversas espécies vegetais são utilizadas na medicina popular e/ou na produção de fármacos. Apesar de possuir um grande número de grupos de pesquisas e a maior reserva de biodiversidade do mundo, o Brasil não tem uma forte atuação no mercado mundial de fitoterápicos, perdendo até para países tecnologicamente menos desenvolvidos (MORAES; ALONSO; OLIVEIRA-FILHO, 2011). Alguns estudos tem revelado o potencial citotóxico de extratos derivados de plantas da espécie Jacaranda. Casagrande e colaboradores (2014) utilizando o extrato hidroetanólico de folhas de J. decurrens, demonstrou citotoxicidade contra células K-562 (eritroleucêmicas) induzindo tanto apoptose tardia quanto necrose. Atividade antitumoral e citotóxica foi relatada em galhos de J. obtusifolia em linhagens tumorais KB (carcinoma epidermóide da cavidade oral), MCF-7 (adenocarcinoma da mama) e NCI-H 187 (carcinoma pulmonar de pequenas células (KHAMSAN et al., 2012). Estes resultados recentes, mesmo que ainda preliminares, mostram que extratos de espécies do gênero Jacaranda são potenciais fontes de substâncias citotóxicas o que torna importante o conhecimento do perfil químico dos extratos das diferentes espécies deste gênero. O conhecimento obtido deste estudo contribuirá para futuras pesquisas na busca e isolamento de substâncias citotóxicas. Nesse contexto, a presente pesquisa propôs realizar o perfil fitoquímico de espécies do gênero Jacaranda, seguindo-se a avaliação in vitro de seus extratos etanólicos para atividade citotóxica em linhagens celulares tumorais. 41
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
- Estudo fitoquímico de extratos etanólicos de caules e folhas das espécies Jacaranda brasiliana, Jacaranda caroba, Jacaranda cuspidifolia, Jacaranda macrantha, Jacaranda micrantha, Jacaranda mimosifolia, Jacaranda paucifoliata e Jacaranda puberula.
4.2 Objetivos específicos
- Obter os extratos etanólicos de folhas e caules das espécies Jacaranda spp.
- Realizar análises cromatográficas dos extratos etanólicos de folhas e caules de Jacaranda spp.
- Identificar os constituintes presentes nos extratos etanólicos de folhas e caules de Jacaranda spp por CLAE-FR-DAD-EM.
- Realizar análises comparativas do perfil químico dos metabólitos secundários presentes nos extratos obtidos das espécies em estudo.
- Avaliar a toxidade celular (CC50) dos extratos etanólicos de Jacaranda spp. empregando o método colorimétrico do MTT nas linhagens celulares MRC-5, HeLA, HepG2 e TOV 21G.
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5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Materiais
Os materiais utilizados, a especificação dos equipamentos, bem como, a descrição dos reagentes e de seus fabricantes estão descritos nos métodos e também no apêndice A.
5.2 Métodos
5.2.1 Coleta e identificação do material vegetal
As espécies vegetais foram coletadas em diferentes regiões do estado de Minas Gerais (Tabela 1). As determinações taxonômicas foram realizadas pelo botânico Prof. Dr. João Renato Stehmann (Departamento de Botânica do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG), bióloga Ludmila Von Randow Pandolpho, doutoranda em solos e nutrição de plantas pela Universidade Federal de Viçosa e pela ecóloga Bruna Rossi graduanda em Ciências Biológicas pela UFOP. As exsicatas foram depositadas nos Herbários do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Minas Gerais (BHCB), Universidade Federal de Viçosa (VIC) e Universidade Federal de Ouro Preto (OPR). Após a coleta, o material foi imediatamente seco em estufa de ar circulante (T 40 ºC), sendo, posteriormente, pulverizado em moinho de facas e submetido à extração por percolação.
43
Tabela 1: Espécies identificadas e selecionadas para perfil o fitoquímico comparativo e triagem de atividade citotóxica. Espécies Local da coleta Material Herbário No da exsicata vegetal
1 Jacaranda caroba (Vell) DC Belo Horizonte Folhas BHCB-UFMG BHCB 22472
2 Jacaranda cuspidifolia Mart Santana de Pirapama Caule, folhas BHCB-UFMG BHCB 161997
3 Jacaranda macrantha Cham. Belo Horizonte Caule/folhas BHCB-UFMG BHCB 142442
4 Jacaranda micrantha Cham São Brás do Suaçuí Caule, folhas e UFV VIC7683 frutos
5 Jacaranda mimosifolia D. Don Belo Horizonte Caule, folhas BHCB-UFMG BHCB 21532
6 Jacaranda puberula Cham. Belo Horizonte Caule, folhas BHCB-UFMG BHCB 53951
7 Jacaranda brasiliana Lam. Santana de Pirapama Caule, folhas BHCB-UFMG -
8 Jacaranda paucifoliata Mart. Santana de Pirapama Caule, folhas OUPR-UFOP OUPR30317
5.2.2 Preparo dos extratos As diferentes partes das plantas (folhas e caules) foram separadas e secas em estufa ventilada, a 40 ºC. Após secagem do material vegetal, foi realizada a moagem em moinho de facas para pulverização do material sendo então acondicionados, os pós, em frascos de vidro. O pó dos diferentes órgãos da planta foi submetido à extração exaustiva, percolação a frio, com etanol 92,8° INPM. Os extratos etanólicos obtidos foram concentrados por destilação do solvente em evaporador rotatório sob pressão reduzida a 45 ºC (BRANDÃO et al., 2017). Para completa remoção do solvente os extratos concentrados foram transferidos para frascos previamente pesados e secos em estufa, com temperatura controlada, sendo então pesados os extratos de caules e folhas secos das espécies de Jacaranda para cálculo do rendimento. O rendimento está apresentado na Tabela 5 em Resultados (pág. 56).
5.2.3 Prospecção fitoquímica A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica muito eficaz para a separação de constituintes químicos de um extrato e para sua identificação. A CCD é uma 44
importante ferramenta analítica na separação, identificação e estimativa de diferentes classes de metabólitos secundários. Nesta técnica, utilizando-se a sílica gel, os diferentes componentes são separados pela migração diferencial do soluto entre duas fases sendo uma fase estacionária e uma fase móvel. O princípio da separação é a adsorção e a fase estacionária atua como um adsorvente (WAGNER; BLADT, 1996). Realizou-se uma prospecção fitoquímica dos extratos das diferentes espécies de Jacaranda e suas partes para comparação entre elas através de cromatografia em camada delgada (CCD), sendo utilizadas placas analíticas (10 x 10 cm) manufaturadas com sílica gel, Kieselgel 60 G (Merck) como fase estacionária, preparadas com 0,5 mm de espessura sendo realizada no Laboratório de Química Medicinal e Bioensaios da Escola de Farmácia na Universidade Federal de Ouro Preto.
5.2.3.1 Detecção de geninas flavônicas Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: clorofórmio - acetato de etila (60:40)
Revelação: observar a placa à luz UV365 e UV254, após revelação com NP/PEG e aquecimento a 100 ºC, por 5 min. Geninas flavônicas: bandas de cor amarela (visível) e fluorescências amarelo- esverdeadas (UV365 e UV254). Amostras de referência: acacetina e quercetina
5.2.3.2 Detecção de heterosídeos flavônicos Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético – água (100:11:11:27)
Revelação: observar a placa à luz UV365 e UV254, após revelação com NP/PEG e aquecimento a 100 ºC, por 5 min. Flavonoides: banda de cor amarela (visível) e fluorescências amarelo-esverdeadas
(UV365 e UV254). Amostras de referência: rutina.
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5.2.3.3 Detecção de geninas antraquinônicas e naftoquinônicas Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: tolueno – acetona – clorofórmio (40:5:35)
Revelação: observar a placa à luz UV365 e UV254, após revelação com hidróxido de potássio a 5%, em metanol, e aquecimento a 100 ºC, por 5 min. Antraquinonas e naftoquinonas: bandas de cor laranja a vermelho (vis) e fluorescências de coloração do alaranjado ao vermelho (UV365 e UV254). Antronas e antranóis: bandas amarelas (visível) e fluorescências de coloração do alaranjado (UV365 e UV254). Amostras de referência: 1,8-di-hidróxi-antraquinona e lapachol.
5.2.3.4 Detecção de heterosídeos antracênicos Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: acetato de etila – metanol – água (81:11:8)
Revelação: observar a placa à luz UV365 e UV254, após revelação com hidróxido de potássio a 5%, em metanol, e aquecimento a 100 ºC, por 5 min. Antraquinonas: bandas de coloração laranja ao vermelho (visível) e fluorescências laranja ao vermelho (UV365 e UV254). Antronas, antranóis: bandas amarelas (visível) e fluorescências de coloração do alaranjado ao vermelho (UV365 e UV254). Amostra de referência: aloína.
5.2.3.5 Detecção de triterpenos e esteroides Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: hexano – acetato de etila (40:20) Revelação: Uma placa revelada com reagente de Liebermann-Burchard; observar a placa, imediatamente, à luz visível, ou após aquecimento a 100 ºC, por 10 min e outra placa revelada com Anisaldeído Sulfúrico. 46
Triterpenos e esteroides: bandas marrons ou acinzentadas (visível) e fluorescências do alaranjado ao vermelho (UV365 e UV254). Amostras de referência: ácido oleanóico (triterpeno) e -sitosterol (esteroide).
5.2.3.6 Detecção de cumarinas Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: tolueno – éter saturado com 5 gotas de ácido acético (80:20)
Revelação: observar a placa à luz UV366 e UV254, após revelação com hidróxido de potássio a 5%, em metanol, e aquecimento a 100 ºC, por 5 min.
Cumarinas: bandas de cor verde azulada sob UV365 e UV254; coloração intensificada após tratamento com hidróxido de potássio; a cumarina não substituída apresenta fluorescência amarelo-esverdeada apenas após o tratamento com hidróxido de potássio. Amostras de referência: cumarina e escopoletina.
5.2.3.7 Detecção de saponinas Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: clorofórmio – ácido acético glacial - metanol – água (15:8:3:2) Revelação: observar a placa à luz visível após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento a 100 ºC, por 5 min. Saponinas: bandas de coloração azul ou azul-violeta e zonas amarelas (visível). Amostra de referência: digitonina.
5.2.3.8 Detecção de heterosídeos cardiotônicos Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: acetato de etila – metanol – água (81:11:8) Revelação: observar a placa a luz visível após revelação com o reativo de Kedde (preparo vide apêndice A). Cardenolídeos: apresentam imediatamente, bandas de coloração rosa ou azul-violácea (visível). 47
Amostras de referência: digitoxina e lanatosídeo C.
5.2.3.9 Detecção de alcaloides Sistema cromatográfico Fase estacionária: sílica gel 60 G, sobre placa de vidro (10 x 10) Fase eluente: acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético - água – etilmetilcetona (50:7:3:10:30) Revelação: observar a placa após revelação com o reagente de Dragendorff (visível). Alcaloides: bandas de cor marrom ou alaranjada (visível). Amostras de referência: atropina e estricnina. Observação: Os resultados das CCD´s estão apresentados em Resultados (pág. 54 a 62).
5.3 Perfis cromatográficos
Perfis cromatográficos foram obtidos por meio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa acoplada a UV com arranjos de diodos (CLAE-FR-DAD) e cromatografia líquida de ultra eficiência em fase reversa acoplada a espectrometria de massas (CLUE-FR-EM) para os extratos etanólicos de caules e folhas das espécies de Jacaranda. As condições cromatográficas foram otimizadas conforme Tabelas 2 e 3, visando obter resolução adequada para constituintes de diferentes polaridades. Estes perfis constituíram a “impressão digital” dos extratos, servindo como padrão de comparação no caso de coletas futuras e para escolha entre espécies a serem trabalhadas para fins medicinais.
5.3.1 Preparo das amostras Amostras foram preparadas pesando-se 10 mg de cada extrato diretamente em frascos de micro centrífuga (Eppendorf), sendo acrescentado 1 mL de metanol ultrapuro (grau CLAE – Merck), sendo realizada completa dissolução por sonicação em ultrassom, seguindo-se de centrifugação a 10.000 rpm, por 5 min. Em cada caso, o sobrenadante foi filtrado em filtros PVDF (fluoreto de polivinilideno) poro de 0,22 μm e transferidos para vials para então serem empregados nas análises por CLAE-FR. 48
5.3.2 Parâmetros cromatográficos por CLAE-FR-DAD Os perfis cromatográficos foram realizados empregando-se a técnica CLAE-FR- DAD, sendo realizada no Laboratório Multiusuário do Cipharma na Universidade Federal de Ouro Preto nas condições descritas a seguir.
O equipamento utilizado foi cromatógrafo líquido de alta eficiência modelo: Waters Varian 210, detector de arranjo de diodos (DAD), com varredura entre 220-400 nm. Coluna de fase reversa LiChrospher 100 RP-18 (partículas de 5 m, 250 por 4 mm d.i.) e pré-coluna (2,5 cm por 3 mm) de mesma fase estacionária. O tempo de análise foi de 70 minutos, para que houvesse a separação do maior número possível de constituintes, objetivando a obtenção de perfil cromatográfico e o conhecimento da polaridade dos componentes. A vazão de fluxo da bomba de 1 mL/min e volume injetado de 20 L, sendo mantido o forno da coluna a 40 0C. Em função da complexidade da matriz oriunda de extratos vegetais, empregou-se um gradiente de H2O (0,1% ácido fórmico) e ACN (0,1% ácido fórmico). Foi empregada a eluição em gradiente de acetonitrila (ACN) e água, na qual a concentração de ACN variou, linearmente de 5 a 95%, em 65 min. Seguiu-se com uma etapa de eluição isocrática, por 5 min, com 95% de ACN com objetivo de se realizar uma completa eluição dos componentes pouco polares, eventualmente presentes nos extratos. Essas substâncias poderiam ficar retidas na coluna e serem eluídas nas análises subsequentes, comprometendo a confiabilidade das análises e a vida útil da coluna conforme Tabela 2. Antes de iniciar nova corrida com injeção de nova amostra foi mantido por 15 min um gradiente H2O/ACN (95:5) para equilíbrio da coluna. Nas análises foi acoplado um detector de arranjo de diodos (DAD), com uma varredura na faixa de 200 a 400 nm, sendo que os cromatogramas foram extraídos nos comprimentos de onda de 220, 280 e 350 nm. Em todas as etapas, foram empregados solventes grau CLAE (Tedia Brasil) e água ultrapura, filtrada em sistema Milli-Q.
49
Tabela 2: Gradiente de eluição empregado nas análises dos extratos por CLAE-FR-DAD.
TEMPO (min) H2O (%) ACN (%) 0 95 5 65 5 95 70 5 95 75 95 5
5.3.3 Parâmetros cromatográficos por CLUE-FR-DAD-EM Perfis cromatográficos também foram realizados empregando-se cromatografia líquida de ultra eficiência em fase reversa (CLUE-FR) acoplada a detector de arranjos de diodo e a espectrômetro de massas (EM), sendo realizado no Laboratório de Fitoquímica da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais em colaboração com a Profa. Alaíde Braga de Oliveira. O equipamento utilizado foi o UPLC ACQUITY® Waters acoplado ao detector DAD – varredura de 220-400 nm e detector de espectrometria de massas (EM) de captura de íons (Waters ACQUITY TQD Triple Quadrupole UPLC/MS/MS System). A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna ACQUITY UPLC
HSS C18 (partículas de 0,3 µm, 50 x 3 mm d.i.) acoplada a uma pré-coluna ACQUITY VanGard®. Foi empregado um fluxo de 0,3 mL/min e o volume de injeção da amostra foi de 4,0 μL, mantendo o forno da coluna a 40º C. As fases móveis consistiram em água acidificada 0,1% ácido fórmico (solvente A) e acetonitrila acidificada 0,1% ácido fórmico (solvente B). O protocolo de eluição compreendeu um período de eluição de 0 a 11 min, em gradiente linear de 5% a 95% de B seguido de um curto período de eluição isocrática (95% de ACN por 1 min), retornando à eluição inicial aos 11 a 13 min (5% ACN) conforme Tabela 3.
Tabela 3: Gradiente de eluição empregado nas análises dos extratos por CLUE-FR-EM.
TEMPO (min) H2O (%) ACN (%) 0 95 5 10 5 95 11 5 95 13 95 5
50
A espectrometria de massa foi realizada em um instrumento triplo quadrupolo equipado com uma fonte de eletropulverização (Electrospray ionization - ESI), operado nas seguintes condições: modo de íons positivo e negativo, temperatura capilar 250º C, voltagem no pulverizador ajustada em 3,5 kV, voltagem capilar +3 e -47 V, para as polaridades positiva e negativa, e deslocamento da lente do tubo de 0 e -25 V, para polaridade positiva e negativa, respectivamente. Utilizou-se argônio como gás de colisão. A análise de massa foi realizada em modo de varredura total de 100 a 1.500 Da. Em todas as etapas, foram empregados solventes grau CLAE (Tedia Brasil®) e água destilada, filtrada em sistema Milli-Q.
51
5.4 ENSAIOS BIOLÓGICOS
5.4.1 Linhagens celulares
A linhagem celular MRC-5 e as linhagens tumorais HeLa, HepG2 e TOV-21G empregadas nesse estudo foram adquiridas em parceria com Laboratório de Biologia e Tecnologia de Microorganismos (LBTM), pertencente ao departamento de Biologia da UFOP, e são originadas da ATCC (American Type Culture Colection) conforme Tabela 4. As linhagens estão mantidas criopreservadas no banco de células do Laboratório de Química Medicinal e Bioensaios do Cipharma (LQMB). Preparo dos meios de cultura e demais reagentes utilizados estão descritos no Apêndice A. Tabela 4: Linhagens celulares utilizadas nos ensaios in vitro. Linhagem Origem Histológica ATCC Concentração de plaqueamento (Células/poço)
MRC-5 Fibroblastos de pulmão CCL-117 TM 2 x 104
HeLa Célula de carcinoma epitelial humano CCL-2 TM 1 x 104
HepG2 Carcinoma hepatocelular humano HB-8065 TM 2 x 104
TOV-21G Adenocarcinoma ovariano CRL-11730 ™ 5 x 104
5.4.2 Expansão e criopreservação das linhagens tumorais humanas
5.4.2.1 Cultivo de linhagens celulares
Foi montado um painel tumoral com diferentes linhagens celulares humanas (Tabela 4). As linhagens utilizadas foram adquiridas do Laboratório de Biologia e Tecnologia de Microorganismos (LBTM) pertencente ao Departamento de Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto As linhagens foram mantidas congeladas em criotubos com 5% de DMSO e meio de cultura específico (RPMI-1640 com 10% de SFB para MRC-5 e HELA; DMEM High Glicose com 10% de SFB para HepG2 e TOV 21G. Os criotubos foram mantidos em nitrogênio líquido no banco de criopreservação (CryoPlus 7405 / Thermo Scientific, EUA). 52
5.4.2.2 Descongelamento
No procedimento de descongelamento das linhagens de células tumorais humanas (Tabela 4), a ampola contendo as células foi rapidamente descongelada em banho-maria a 37 °C e as células foram submetidas à centrifugação de 3000 rpm durante dois minutos. O sobrenadante foi descartado e a massa celular presente no fundo do tubo foi ressuspendida em 6 mL de meio específico suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB), 100 U/ml de penicilina e 10 μg/ml de estreptomicina, 5 µg/mL de anfotericina B, pré-aquecido a 37 °C e transferida para garrafas de cultura com 25 cm² de superfície de crescimento (T25) (TPP). A garrafa foi incubada em estufa a 37 °C com saturação de 5% de CO2. Após 24 horas de incubação, o meio de cultura foi substituído para remoção das células não aderidas e dos resíduos do crioprotetor DMSO. Para a manutenção da linhagem, após a adesão celular, o meio de cultura foi substituído a cada 48 horas para garantir a renovação dos nutrientes. Contaminações, morfologia celular e formação da monocamada foram observadas ao microscópio invertido em aumento de 100x. No momento em que a cultura apresentou formação de monocamada com boa confluência (em torno de 80%), fez-se um repique utilizando a enzima tripsina para remover células aderidas no fundo da garrafa por aproximadamente 1 minuto. As células soltas foram ressuspendidas em 5 mL de meio específico suplementado com 15 % de SFB e transferidas para garrafas plásticas de cultivo celular de volume 250 ml, T 75 (75 cm2) e mantidas em estufa a 37°C com atmosfera úmida de 5% de CO2. As células eram repicadas em novas garrafas numa proporção de 1:2 ou 1:3. Essa expansão se fez necessária para a obtenção de quantidade de célula suficiente para o congelamento e realização dos experimentos (BRANDÃO et al., 2013).
5.4.2.3 Criopreservação (congelamento)
Atingida a quantidade necessária de células, as mesmas foram criopreservadas em meio específico suplementado com 20% de SFB e 10% de DMSO e incubadas em freezer -80 °C por 24 a 72 horas sendo, em seguida, estocadas em nitrogênio líquido para armazenamento em longo prazo.
5.4.3 Viabilidade Celular Para o ensaio da viabilidade celular, as suspensões de células foram distribuídas em microplacas de 96 cavidades, seguindo o plaqueamento ilustrado na Figura 29 53
contendo quantidade de células pré-determinadas conforme Tabela 4 (pág. 51), garantindo 90% de confluência. Essas microplacas continham meio de cultura suplementado com 1 % de SFB. As placas foram incubadas em atmosfera úmida, a 5% de CO2, a 37 °C por 24 horas (MOSMANN, 1983; TWENTYMAN; LUSCOMBE, 1987). Figura 29: Representação esquemática da placa de 96 poços utilizada para atividade citotóxica pelo método colorimétrico do MTT
Colunas 1, 11 e 12: Controle de células; Colunas 2 a 4 extrato etanólico bruto de Jacaranda em triplicata diluição seriada de A a H; Colunas 5 a 7 extrato etanólico bruto de Jacaranda em triplicata diluição seriada de A a H e Colunas 8 a 10 extrato etanólico bruto de Jacaranda em triplicata diluição seriada de A a H Para o ensaio de proliferação, as células foram descongeladas e expandidas conforme descrito no tópico 5.4.2 seguindo um esquema de plaqueamento ilustrado na Figura 29. As células foram plaqueadas em meio de cultivo celular (RPMI ou DMEM HG) contendo 5% de SFB, 100 U/ml de penicilina e 10 μg/ml de estreptomicina, 5 µg/mL de anfotericina B e incubadas em estufa a 37 °C. Os extratos etanólicos brutos das espécies de Jacaranda foram solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e diluídos seriadamente em escala 1:2 em meio de cultura suplementado (RPMI/DMEM) com 1% de SFB em oito concentrações (400 μg/mL; 200 μg/mL; 100 μg/mL; 50 μg/mL; 25 μg/mL, 12.5 μg/mL, 6.250 μg/mL e 3.125 μg/mL). Após a formação da monocamada celular na superfície das cavidades, o meio de cultura foi descartado e 100 μL das soluções diluídas das amostras e 100 μL de meio de cultura específico 1% SFB foram adicionados e as placas incubadas sob a mesma condição atmosférica (MOSMANN, 1983; TWENTYMAN; LUSCOMBE, 1987). Após 48/72 horas da adição das amostras, 90% de confluência analisada no microscópio ótico invertido, o meio de cultura foi removido, sendo adicionado 28 μL da solução de MTT (2,0 mg/mL em tampão fosfato salino) e as placas novamente incubadas, por 120 minutos. Então, foram adicionados 132 μL de DMSO em todas as cavidades sendo as placas homogeneizadas em agitador de placas por 15 minutos para que a 54
formazana formada fosse solubilizada e gerasse a coloração azul arroxeada conforme Figura 30 (MOSMANN, 1983; TWENTYMAN; LUSCOMBE, 1987).
Figura 30: Aspecto da cultura de células HeLa tratada com MTT
As células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 1% de SFB, antibióticos e anfotericina B em estufa 37 °C e 5% de CO2. Quando 90% de confluência nos controles colunas 1, 11 e 12, ao meio de cultura foi adicionado o MTT (3 mg/ml). A fotografia mostra a aparência da cultura 2 h após a incubação na presença do MTT. Os cristais de formazana aparecem corados em azul arroxeada no interior das células sendo sua quantidade diretamente proporcional ao número de células viáveis na cultura A absorbância por poço foi medida a um comprimento de onda de 492 nm utilizando o leitor de placas Thermo Plate ®. Os dados foram analisados a partir de três experimentos independentes. Cada concentração também foi repetida em triplicata em cada experimento realizado. Essa quantificação da formazana obtida pela redução do sal de tetrazólio nas células viáveis foi comparada com controle celular
A dose que inibiu 50% do crescimento das células (CC50) na presença dos extratos brutos de Jacaranda foi determinada em comparação com células cultivadas sem a presença de compostos (considerada 100% de viabilidade). A inibição do crescimento de 50% das linhagens celulares foi obtida por meio de uma curva dose resposta, em função da regressão não linear. Foi utilizado o software GraphPad Prism 5.0 (San Diego, USA) para confecção das curvas de CC50 (LIMA et al., 2012). A toxidade celular foi expressa em termos de concentração citotóxica a 50%
(CC50), sendo calculada como CC50 = [(A-B) /A] x100, onde A e B são as densidades
óticas a 492 nm (DO492) das cavidades onde estão presentes células não tratadas (A) e tratadas (B), respectivamente (BRANDÃO et al., 2013).
5.5 Análise estatística dos dados Os dados dos ensaios de citotoxicidade foram avaliados segundo suas médias e desvio padrão. A concentração citotóxica a 50% foi determinada em comparação com 55
controle, através de regressão não linear a partir das concentrações em triplicata, utilizando o software GraphPad Prism 5.0 (San Diego, USA).
56
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Sazonalidade na coleta As espécies foram coletadas na época de floração, período este que se estende por toda a primavera e início do verão (de agosto a novembro) para as Jacarandas. Isto se deve a necessidade de identificação das espécies onde a flores, folhas, galhos e se possível os frutos facilitam essa sistemática vegetal, portanto pode haver uma certa sazonalidade entre as espécies impactando em diferenças na composição destas espécies. 6.2 Obtenção dos extratos de caules e folhas de espécies do gênero Jacaranda. Os rendimentos extrativos dos extratos etanólicos obtidos por percolação a frio com etanol (92,8 GL) estão representados na Tabela 5.
Tabela 5: Rendimento da extração etanólica do material vegetal das espécies do gênero Jacaranda No Espécie Parte utilizada Massa do material Massa do Rendimento vegetal seco (g) extrato (g) % (m/m)
1 J. caroba Folhas 17,4 3,12 17,93
2 J. cuspidifolia Caule 115,00 9,72 8,45
3 Folha 129,11 16,42 12,72
4 J. macrantha Caule / folhas 85,9 10,13 11,79
5 J. micrantha Caule 38,00 3,47 9,13
6 Folhas 270,85 35,87 13,24
7 Frutos 64,55 5,01 7,76
8 J. mimosifolia Caule 858,4 94,38 13,24
9 Folhas 435,1 91,37 20,99
10 J. puberula Caule 106,9 9,62 8,99
11 Folhas 364,8 62,47 17,12
12 J. brasiliana Caule 156,14 11,40 7,30
13 Folhas 68,81 20,23 29,40
14 J. paucifoliata Caule 104,23 11,06 10,61
15 Folhas 86,72 26,50 30,55
16 Frutos 23,11 4.32 18,67 57
6.3 Perfis cromatográficos dos extratos etanólicos brutos das espécies do gênero Jacaranda. A determinação de perfis cromatográficos de extratos vegetais, em condições padronizadas, constitui a “impressão digital” do extrato, servindo como padrão de comparação no caso de coletas futuras, permitindo também determinar as relações botânicas entre diferentes espécies da mesma família, através da comparação cromatográfica de sua composição química (CIEŚLA, 2012; TISTAERT; DEJAEGHER; HEYDEN, 2011).
6.3.1 Prospecção fitoquímica dos extratos etanólicos por CCD Foram avaliadas a presença de cumarinas, saponinas, heterosídeos flavônicos, agliconas flavônicas, heterosídeos antraquinônicos, agliconas antraquinônicas, triterpenos ou esteroides e alcaloides. Diferentes sistemas de eluentes e reveladores seletivos para cada classe de produto natural foram utilizados nas análises (WAGNER; BLADT, 1996). As bandas foram visualizadas por exposição das placas cromatográficas sob a luz ultravioleta (Cienlab UV 254/365 nm) ou por adição de reveladores específicos para metabólitos secundários conforme Apêndice A (WAGNER; BLADT, 1996). Na Tabela 6 é apresentado um resumo dos resultados da prospecção fitoquímica, por CCD, realizada com os extratos etanólicos das espécies de Jacaranda sendo as placas reveladas apresentadas na sequência (Figuras 28 a 43)
58
Tabela 6: Resultado da prospecção fitoquímica (CCD) dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda. No Espécie Parte Al Sp Cu TE GA GF HC HA HF
1 J. caroba Folha - - - + - - - - +
2 J. cuspidifolia Caule - - - + - + - + -
3 Folha - - - + - + - + +
4 J. macrantha Caule / - + - + - + - + + folhas
5 J. micrantha Caule - - - + - - - + +
6 Folhas - + - + - - - - +
7 Frutos - - - + - + - - -
8 J. mimosifolia Caule - - - + - - - + -
9 Folhas - + - + - + - - +
10 J. puberula Caule - - - + - + - + -
11 Folhas - - - + - - - - - Legenda: Al = alcaloide Sp = saponina, Cu = cumarina TE = triterpenos e esteroides GA = geninas antraquinônicas GF = geninas flavônicas HC= heterosídeos cardiotônicos HA = heterosídeos antraquinônicos HF = heterosídeos flavônicos (-) não revelado (+) presença
Os resultados das CCDs foram condizentes com dados da literatura sendo confirmada a presença de flavonoides (FERRERES et al., 2013; MARTINS; CASTRO; CAVALHEIRO, 2008; MOSTAFA; ELDAHSHAN; SINGAB, 2014); antraquinonas (ARRUDA et al., 2011), saponinas (ARRUDA et al., 2011; PEREIRA et al., 2016a) e terpenos (ALMEIDA et al., 2014; MOSTAFA; ELDAHSHAN; SINGAB, 2014; PILATTI et al., 2018). A ausência de heterosídeos cardiotônicos já era esperada por não ser encontrado em Bignoniaceae (MORSY, 2017). Há relatos de alcaloides do tipo monoterpênicos em Jacaranda (ARRUDA et al., 2011), porém na maioria dos estudos não foi relatada esta presença (HERNANDES, 2015; PEREIRA et al., 2016a; PILATTI et al., 2018). Realizando uma comparação intra espécie verifica-se diferença na composição dos metabólitos secundários entre os extratos de caules e folhas e também entre as espécies. 59
6.3.1.1 Flavonoides
Analisando a placa de CCD para geninas flavônicas (Figuras 31 e 32) e heterosídeos flavônicos (Figuras 33 e 34), há a presença de manchas reveladas e com diferentes fatores de retenção (Rf) para J. cuspidifolia caule (2) e folha (3). Na J. micrantha caule (5), folha (6) e fruto (7) também reproduz essa diferença bem como em J. mimosifolia caule (8) e folha (9) e em J. puberula caule (10) e folha (11) destacando- se a presença de maior número de manchas referentes a flavonoides aglicona ou glicosilados nas folhas destas plantas. Figura 31: Perfil em CCD da pesquisa de geninas flavônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda.
Eluente: clorofórmio - acetato de etila (60:40), Revelador NP/PEG. AC = acacetina; QU = quercetina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
Figura 32: Perfil em CCD da pesquisa de geninas flavônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda.
Eluente: clorofórmio - acetato de etila (60:40), Revelador NP/PEG. AC = acacetina; QU = quercetina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm 60
Figura 33: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos flavônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético – água (100:11:11:27), Revelador NP/PEG. RU = rutina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
Figura 34: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos flavônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético – água (100:11:11:27), Revelador NP/PEG. RU = rutina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm
6.3.1.2 Antraquinonas
Geninas antraquinônicas (Figuras 35 e 36) não foram reveladas por CCD, já nas análises para heterosídeos antracênicos (Figuras 37 e 38) os resultados foram positivos nos extratos de caule (2) e folhas (3) de J. cuspidifolia, e caules de J. micrantha (5), J. mimosifolia (8) e J. puberula (10). 61
Figura 35: Perfil em CCD da pesquisa de geninas antraquinônicas e naftoquinônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: tolueno – acetona – clorofórmio (40:5:35), Revelador KOH 5%. AN= 1,8-di-hidróxi- antraquinona e LP = lapachol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
Figura 36: Perfil em CCD da pesquisa de geninas antraquinônicas e naftoquinônicas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: tolueno – acetona – clorofórmio (40:5:35), Revelador KOH 5%. AN= 1,8-di-hidróxi- antraquinona e LP = lapachol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm 62
Figura 37: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos antracênicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – metanol – água (81:11:8), Revelador KOH 5%. AL= aloína, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
Figura 38: Perfis em CCD da pesquisa de heterosídeos antracênicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – metanol – água (81:11:8), Revelador KOH 5%. AL= aloína, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm
6.3.1.3 Triterpenos e esteroides
A presença de triterpenos e esteroides foi similar em caule e folhas intra espécies, inclusive utilizando reveladores diferentes Liebermann-Burchard (Figuras 39 e 40) e anisaldeído sulfúrico, (Figuras 41 e 42). 63
Figura 39: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: hexano – acetato de etila (40:20), Revelador LB. AO = ácido oleanóico e BS = -sitosterol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
Figura 40: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: hexano – acetato de etila (40:20), Revelador LB. AO = ácido oleanóico e BS = -sitosterol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm
Figura 41: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: hexano – acetato de etila (40:20), Revelador AS. AO = ácido oleanóico e BS = -sitosterol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível 64
Figura 42: Perfil em CCD da pesquisa de triterpenos e esteroides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: hexano – acetato de etila (40:20), Revelador AS. AO = ácido oleanóico e BS = -sitosterol, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm 6.3.1.4 Cumarinas e Saponinas
Apesar de Arruda e colaboradores (2011) terem relatado a presença de cumarinas e saponinas em extratos metanólicos e clorofórmicos de J. cuspidifolia, não foi visualizada a presença de cumarinas nos extratos etanólicos do presente estudo e saponina presente apenas em J. macrantha, (4) e folhas de J. micrantha (6) e J. mimosifolia (9), (Figuras 43 e 44) respectivamente. Saponina também foi relatada em folhas e galhos de J. oxyphylla (PEREIRA et al., 2016b)
Figura 43: Perfil em CCD da pesquisa de cumarinas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda.
Eluente: tolueno – éter saturado com 5 gotas de ácido acético (80:20), Revelador KOH 5%. CU = cumarina e EC = escopoletina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). UV365 nm 65
Figura 44: Perfil em CCD da pesquisa de saponinas dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: clorofórmio – ácido acético glacial - metanol – água (15:8:3:2), Revelador AS. DI = digitonina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
6.3.1.5 Heterosídeos Cardiotônicos e Alcaloides
Não foi detectada a presença de heterosídeos cardiotônicos, tampouco alcaloides nas espécies estudadas, Figuras 45 e 46, respectivamente.
Figura 45: Perfil em CCD da pesquisa de heterosídeos cardiotônicos dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – metanol – água (81:11:8), Revelador Kedde. DT = digitoxina e LC = lanatosídeo C, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível 66
Figura 46: Perfil em CCD da pesquisa de alcaloides dos extratos etanólicos de espécies do gênero Jacaranda
Eluente: acetato de etila – ácido fórmico – ácido acético - água – etilmetilcetona (50:7:3:10:30), Revelador Dragendorff. AT = atropina e ES = estricnina, os números correspondem aos extratos (Tabela 6). Visível
6.4 Perfis cromatográficos dos extratos das espécies do gênero Jacaranda por CLAE/DAD.
Extratos etanólicos Foram obtidos perfis cromatográficos para os extratos etanólicos brutos, e os cromatogramas dos extratos das espécies de Jacaranda do presente estudo apresentados nas Figuras 47 a 57, destacando-se as bandas de absorção máxima UV dos picos mais intensos. Segundo Ashour (2012) absorção UV na região de 330 nm é característico de feniletanoides e segundo Mabry (1970) o UV de flavonoides apresentam duas bandas de maior absorção na região de 240-400 nm, sendo a banda I (300-380 nm) e banda II (240- 280 nm). O cromatograma A obtido do extrato etanólico de folhas de J. caroba, registrado em 254 nm, apresenta vários picos bem resolvidos entre si (Figura 47), eluídos entre 12 e 19 minutos, destacando-se as bandas de absorção UV dos maiores picos no tR 13.86 min. apresentando 59% da área e 330 nm característicos dos feniletanoides e no tR 14.50 min 254 e 355 nm característico de flavonoides (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970). 67
Figura 47: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. caroba (A), destacando as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma B obtido do extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia, registrado em 254 nm, apresentou vários picos bem resolvidos entre si (Figura 48), porém sobrepostos a um pico muito largo eluído entre 10 e 30 minutos que pode ser atribuído à presença de taninos (MARTINS; CASTRO; CAVALHEIRO, 2008) podendo comprometer a qualidade da análise no UV obtidos principalmente para os picos nos tR
14.29 min, tR 16.27 min e tR 23.14 min como destacado suas bandas de absorção máximas UV. Estes tempos de retenções podem ser atribuídos a flavonoides em função das absorções em 252.8 e 345.7 nm; 264.7 e 337.3 nm e 264.7 e 337.3 nm, respectivamente.
68
Figura 48: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia (B), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma C (Figura 49) obtido do extrato etanólico de caule de J. cuspidifolia, registrado em 254 nm, não apresentou picos bem resolvidos além de estarem sobrepostos a um pico muito largo eluído entre 10 e 30 minutos que pode ser atribuído à presença de taninos (MARTINS; CASTRO; CAVALHEIRO, 2008). Os três maiores picos apresentaram tR muito próximos 13.86 , 14.88 e 15.10 min apresentando UV sugestivo de flavonoide para Tr 14.88 min com 282.5 e 327.8 nm. 69
Figura 49: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia (C), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma D obtido do extrato etanólico de caule mais folhas de J. macrantha, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 50), eluídos entre 12 e 18 minutos, destacando-se as bandas de absorção UV dos maiores picos no tR 13.84 apresentando 38% da área e 329 nm característicos dos feniletanoides
(ASHOUR, 2012) e nos tR 14.23 min (12% da área) 254.0 e 352.9 nm e tR 14.47 min (8 % da área) 254.0 e 354.1 nm característicos de flavonoides (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970). 70
Figura 50: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule e folhas de J. macrantha (D), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma E obtido do extrato etanólico de caule J. micrantha, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 51), eluídos entre 10 e 20 minutos, destacando-se o a banda de absorção máxima UV do maior pico no tR 13.86 apresentando 33% da área e 329 nm característico dos feniletanoides (ASHOUR, 2012).
Figura 51: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. micrantha (E), em destaque a banda de absorção UV do pico mais intenso.
71
O cromatograma F (Figura 52) obtido do extrato etanólico de folhas de J. micrantha, registrado em 254 nm, não apresentou picos bem resolvidos além de estarem sobrepostos a um pico muito largo eluído entre 10 e 34 minutos que pode ser atribuído à presença de taninos (MARTINS; CASTRO; CAVALHEIRO, 2008). Os maiores picos apresentaram tR muito próximos 13.88 , 14.27, 14.51 e 14.90 min.; destes, 14.27 e 14.51 apresentaram UV 254.0 e 354.1 característicos de flavonoides (MABRY; MARKHAM;
THOMAS, 1970) e tR 14.90 min sugestivo de feniletanoides
Figura 52: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. micrantha (F), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma G obtido do extrato etanólico de fruto J. micrantha, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 53), eluídos entre 10 e 20 minutos, destacando-se as bandas de absorção de UV dos maiores picos nos tR 13.89 (28
% da área) e tR 14.90 (14% da área) respectivamente e 327.8 característicos dos feniletanoides. Algumas substâncias mais apolares não foram bem separadas sendo arrastadas no final da eluição (60 a 70 minutos). 72
Figura 53: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico dos frutos de J. micrantha (G), em destaque as bandas de absorção máxima UV dos picos mais intensos
O cromatograma H obtido do extrato etanólico de caule J. mimosifolia, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 54), eluídos entre 13 e 19 minutos, destacando-se as bandas de absorção UV dos maiores picos nos tR 13.84 min (45
% da área) e tR 15.10 min (29% da área) e 329.0 e 326.6 nm, respectivamente, característicos dos feniletanoides. Figura 54: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de caule de J. mimosifolia (H) em destaque as absorções UV dos picos mais intensos
73
O cromatograma I obtido do extrato etanólico de folha de J. mimosifolia, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 55), eluídos entre 14 e 19 minutos, destacando-se as bandas de absorção UV do maior pico no tR 13.86 apresentando 65% da área e 329 nm característicos dos feniletanoides. Vale destacar que o pico com tR 14.30 (1,5% da área) apresentou segundo Mabry et al (1970) absorção característica de flavonoides 255.2 e 350.5 nm.
Figura 55: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. mimosifolia (I), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma J obtido do extrato etanólico de folhas de J. puberula, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 56), eluídos entre 13 e 19 minutos, destacando-se as bandas de absorção UV dos maiores picos no tR 13.84 e 13.85 min apresentando 13% e 65% da área e 329 nm característicos dos feniletanoides (ASHOUR, 2012). 74
Figura 56: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico de folhas de J. puberula (J), em destaque as bandas de absorção UV dos picos mais intensos
O cromatograma K obtido do extrato etanólico de caule de J. puberula, registrado em 254 nm, apresentou picos bem resolvidos entre si (Figura 57), eluídos entre 13 e 19 minutos, destacando-se a banda de absorção máxima UV do maior pico no tR 13.85 minutos apresentando 55% da área e 329 nm característico dos feniletanoides.
Figura 57: Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico do caule de J. puberula, em destaque a banda de absorção UV do pico mais intenso
75
6.5 Perfis cromatográficos dos extratos das espécies do gênero Jacaranda por CLUE/DAD/EM e EM2
Compostos fenólicos foram identificados com base na absorção típica de UV para cada classe fenólica analisada, além de seus padrões típicos de fragmentação obtidos por espectrometria de massas e espectrometria de massas sequencial comparando-se os tR da CLUE e os padrões de fragmentação com os dados da literatura e compostos de referência. Desta forma foi possível identificar feniletanoides glicosilados e flavonoides como constituintes presentes nos extratos de folhas, caules e frutos, sendo os perfis cromatográficos CLUE, dispostos nas Figuras 58 a 60 e o resultado da espectrometria de massas dos principais picos identificados nos tópicos seguintes. 76
Figura 58: Perfil cromatográfico por CLUE dos extratos etanólicos de caule (A) e folhas (B) de J. brasiliana, folhas de J. caroba (C) e caule (D) e folhas (E) de J. cuspidifolia
77
Figura 59: Perfil cromatográfico por CLUE dos extratos etanólicos de caule (F), folhas (G) e frutos (H) de J. micrantha; caule (I) e folhas (J) de J. mimosifolia
78
Figura 60: Perfis cromatográficos por CLUE dos extratos etanólicos de caule e folhas (K) de J. macrantha, caule (L) e folhas (M) de J. paucifoliata e caule (N) e folhas (O) de J. puberula
6.6 Comparação entre as técnicas CLAE e CLUE
Para efeito de comparação foram mantidas propositalmente tanto na CLAE quanto a CLUE o mesmo gradiente de eluição (porcentagens de água e acetonitrila) e, analisando-se os resultados verifica-se que os perfis cromatográficos ficaram bem semelhantes nos dois equipamentos conforme Figura 61. 79
Segundo Porto (2014) a técnica CLUE tem como vantagens permitir o uso de colunas com um comprimento mais reduzido, assim como das partículas que compõem a fase estacionária, a aplicação de pressões mais elevadas, o consumo de solvente relativamente inferior e o fluxo aplicado para a passagem das amostras pela fase estacionária pode ser mais elevado. Além disso, o cromatograma apresenta uma maior resolução (grau de separação entre os picos) e uma maior sensibilidade de detecção dos compostos presentes nas amostras. Todas estas vantagens vieram contribuir para uma redução do tempo de análise, uma das principais dificuldades aplicadas à cromatografia líquida de alta pressão (CLAE). Desta forma pode-se afirmar que a CLUE, quando disponível, seria uma alternativa muito mais eficiente por ser reduzir o tempo de análise e gerar economia de reagentes e equipamentos.
Figura 61: Comparação dos cromatogramas CLAE (vermelho) e CLUE (verde) para extratos de folha de J. caroba (A) e caule de J. cuspidifolia (B)
Partindo-se dos principais picos dos perfis cromatográficos obtidos da CLUE (Figuras 58 a 60) foram analisadas as bandas de absorção UV (Tabela 9, pág. 119) e em seguida avaliados os espectros de massas e espectro sequencial para sugerir as possíveis substâncias presentes nos extratos etanólicos de Jacaranda conforme próximo tópico. Estes compostos foram comparados com dados da literatura e quando disponíveis, padrões como referência. 80
6.7 Estruturas propostas para as substâncias detectadas nas análises por CLUE- DAD-EM 6.7.1 Feniletanoides encontrados nos extratos das espécies de Jacaranda Isoverbascosídeo e verbascosídeo foram os principais feniletanoides identificados em praticamente todas as espécies de Jacaranda (Tabela 9, pág. 119 e Tabela 10, pág. 127). Os cromatogramas dos extratos etanólicos apresentaram nos tempos de retenção
(tR) 2,57 min e 2,81 min, absorção UV na região de 330 nm (Figura 62). Figura 62: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia destacando as bandas de absorção UV nos picos com tR 2,57 e 2,81 min
No espectro de massas, modo negativo, destes dois tempos de retenção, foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de pico (m/z) 623 Da (Figura 63), indicando massa molecular de 624 Da.
Figura 63: Espectro de massas no modo negativo tR 2,57 min apresentando pico m/z principal 623 Da.
81
Fragmentação de segunda ordem (EM2) do íon m/z 623 [M–H]- gerou o sinal de m/z 461, devido à perda neutra da porção cafeoil [M–162–H]-; a fragmentação do íon m/z 461 gerou 3 íons principais: m/z 315, 161 e 135 (Figura 64). O íon m/z 315 resultou da perda neutra do resíduo de ramnose [(M-162) –146–H]-, do íon m/z 461, que é um resíduo de açúcar na cadeia de dissacarídeos. O íon m/z 161 foi produzido através da mesma via do íon m/z 315 sofrendo apenas uma perda adicional da aglicona [M-H-162-146-162]-. Já o íon m/z 135 foi produzido a partir da desidratação da aglicona [M-H-162-146-162-18]- conforme proposta de fragmentação do verbascosídeo (Figura 65). Figura 64: Espectro EM/EM m/z 623 do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as principais fragmentações
A molécula desprotonada e os padrões de fragmentação foram consistentes com os dados da literatura sobre verbascosídeo (composto 3) no tR 2,81 min e o isoverbascosídeo (composto 2) no tR 2,57 min (GONDA et al., 2014; MITRESKI et al., 2014; GÖGER et al., 2015). Com base nos dados EM (Figura 63 e Tabela 9, pág. 119) e CLAE, aliados as análises de substâncias de referência dos dois compostos, foi possível caracterizar o isoverbascosídeo e verbascosídeo (Figuras 66) como constituintes presentes na maioria dos extratos das espécies de Jacaranda estudadas, conforme resumo apresentado na Tabela 10, pág. 127.
82
Figura 65: Proposta de fragmentação do verbascosídeo
Fonte: Adaptado de Li e colaboradores (2008). / Figura 66: Estrutura do isoverbascosídeo (A) e verbascosídeo (B)
83
Verbascosídeo (SANTOS et al., 2010; ARRUDA et al., 2011; PEREIRA et al., 2016b) e isoverbascosídeo (MARTIN et al., 2009; RAHMATULLAH et al., 2010; ZAGHLOULAB, et al., 2011) já haviam sido identificados em espécies do gênero Jacaranda.
Outros feniletanoides glicosilados foram detectados (bandas de absorção máxima no UV semelhantes ao verbascosídeo) e parcialmente identificados, por apresentarem estruturas semelhantes (fragmentos compatíveis na espectrometria de massas). Para melhor caracterizar as estruturas destes compostos, foi realizada espectrometria de massas em segunda ordem (EM2) e os resultados são mostrados na Tabela 9 (pág. 119) e sua distribuição nos extratos etanólicos resumidas na Tabela 10 (pág. 127). A seguir, segue uma descrição dos principais pontos da caracterização destas substâncias.
Os cromatogramas dos extratos etanólicos dos caules de J. cuspidifolia, J. paucifoliata, J. puberula e J. mimosifolia; folhas de J. brasiliana, J. micrantha, J. mimosifolia, J. paucifoliata e J. puberula, e fruto de J. micrantha (Tabela 10, pág. 127) no tR de 2,28 min, apresentou uma banda de UV com absorção máxima em 328 nm (Figura 67), sugestivo de feniletanoides (ASHOUR, 2012). No espectro de massas, modo negativo, foi observado um pico (m/z) 639 Da indicando uma substância com massa molecular de 640 Da (composto 1). 84
Figura 67: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV nos picos de tR 2.28, 3.05, 3.25 e 3.40 min
A fragmentação sequencial (EM2), Figura 68, do íon m/z 639 [M–H]- geraram os sinais característicos com os picos m/z 621 e 459 Da. O íon m/z 621 Da esta relacionada a desidratação da molécula [M-18]- e o íon m/z 459 Da corresponde a perda neutra de um resíduo da porção cafeoil [M-162-18-H]- da molécula desidratada. Também foram gerados os sinais m/z 179 e 161. Fragmentos de alta abundância em m/z 179 e 161 sugeriram a presença de uma porção cafeoil (LI et al., 2014). Portanto este padrão de fragmentação e a proposta de fragmentação apresentada na Figura 69 é condizente com a substância β-hidroxiverbascosídeo (ERSÖZ et al., 2002; INNOCENTI et al., 2006; SANZ et al., 2012) (Figura 70). Wu e colaboradores (2016) já relataram essa substância em Incarvilinea compacta pertencente à família Bignoniaceae.
85
Figura 68: Espectro EM/EM, m/z 639, do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, em destaque principais fragmentações no tR 2,29 min
Figura 69: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 640 Da
.
86
Figura 70: Estrutura do feniletanoide de massa molar 640 Da (β-hidroxiverbascosídeo)
Nos cromatogramas dos extratos etanólicos dos caules de J. brasiliana e J. paucifoliata, no tR de 2,86 min verificou-se uma banda de absorção UV máx. 336 nm (Figura 71). No espectro de massas modo negativo foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de m/z 667 Da (Figura 71), portanto, sugere-se uma substância com massa molecular de 668 Da (composto 4), sendo proposta a fórmula molecular
C31H40O16 Figura 71: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. brasiliana, destacando a banda de absorção UV no pico de tR 2.86 min e espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 667
A fragmentação sequencial (EM2) (Figura 72) gerou alta abundância dos picos m/z 179 e 161 sugerindo a presença de uma porção cafeoil (LI et al., 2014). Foi então 87
proposto a fragmentação do composto conforme Figura 73 sugerindo-se o feniletanoide beta-etil-hidroxi-verbascosídeo (Figura 74) que foi isolado anteriormente em Lagotis brevituba (LI et al., 2014). Figura 72: Fragmentações EM/EM, m/z 667 do extrato etanólico de caule de J. paucifoliata, destacando as fragmentações no tR 2.86 min.
Figura 73: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 668 Da
88
Figura 74: Estrutura do feniletanoide de massa molar 668 Da (Beta-etil-hidroxi-verbascosídeo)
Nos cromatogramas dos extratos etanólicos dos caules de J. brasiliana, J. micrantha, J. paucifoliata, J. puberula; folhas de J. caroba, J. micrantha, e J. puberula e no extrato de caule mais folha de J. macrantha (Tabela 10, pág. 127) no tR de 3,05 min verificou-se banda de absorção máxima UV máx. 330 nm. (Figura 67, pág. 84). No espectro de massas modo negativo foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de m/z 637, sugerindo-se uma substância com massa molecular de 638 Da (composto 5). Fragmentação sequencial (EM2), Figura 75, do íon m/z 637 gerou o fragmento m/z 461 sugerindo a perda neutra de um resíduo de ácido ferúlico ou isoferúlico [M–176– H]-. Pode-se observar o fragmento m/z 491 Da referente a perda de um resíduo de ramnose [M-146-H]-. Outros fragmentos secundários também foram observados como relatados na Tabela 9. O íon m/z 315 indicou a perda do resíduo de ramnose do íon 461 [M–146– H]-(MITRESKI et al., 2014). Os fragmentos 193 e 175 (Figura75) confirmam a existência de uma porção feruloil (LI et al., 2014). O fragmento 135 corresponde a perda de feruloil, ramnose, hexose e água [M–176–146–162–18–H]-. A proposta de fragmentação desse composto foi sugerida conforme Figura 76. 89
Figura 75: Espectro EM/EM m/z 637 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações
Baseando-se nos comportamentos das fragmentações apresentadas e dados da literatura (KIRMIZIBEKMEZ et al., 2005; AREVALO et al., 2011; LI et al., 2014) sugere-se a presença do feniletanoide leucosceptosídeo A (Figura 77). Arevalo e colaboradores (2011) relataram a presença de leucosceptosídeo A em Bignoniaceae. 90
Figura 76: Proposta de fragmentação do feniletanoide de 638 Da
Figura 77: Estrutura do feniletanoide de massa molar 638 Da (leucosceptosídeo A)
Outro feniletanoide foi verificado na maioria dos extratos de Jacaranda (Tabela 9, pág. 119) apresentando massa molecular 780 Da (composto 6). Os cromatogramas obtidos por CLUE apresentaram no tR de 3,13 min uma banda de absorção UV na região de 330 nm e no espectro de massas no modo negativo foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de (m/z) 779 Da, (Figura 78) indicando massa molecular de 780 Da. 91
Figura 78: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando a banda de absorção UV no pico de tR 3.13 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 779
Fragmentação de segunda ordem (EM2), Figura 79, gerou o íon m/z 665 [M–H- 115]- proveniente da perda da porção ciclohexano-1,4-diol do feniletanoide. Demais fragmentos geraram os sinais m/z 623 [M–H-146]- devido a perda do substituinte adicional a molécula do verbascosídeo C8H12O3; sinal 461 devido à perda neutra da porção cafeoil [M–162–H]-, (Tabela 9). A fragmentação do íon m/z 461 gerou 3 íons principais: m/z 315, 161 e 135. O íon m/z 315 resultou da perda neutra do resíduo de ramnose [M–146–H]-, do íon m/z 461, que é uma unidade externa de açúcar na cadeia de dissacarídeos. O íon a m/z 161 foi produzido através da mesma via do íon m/z 315 sofrendo apenas uma perda adicional da aglicona [(M-162)–146-154–H]-. Já o íon m/z 135 foi produzido a partir da desidratação da aglicona [(154)-18-H]-. Proposta de fragmentação para este feniletanoide está apresentada na Figura 80. 92
Figura 79: : Espectro EM/EM m/z 779 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações
A espécie desprotonada e os padrões de fragmentação foram consistentes com os dados da literatura da substância β-D-Glucopiranosídeo,2-(3,4-dihidroxifenil)-etil-3-O- (6-desoxi-α-L-manopiranosil)-6-(cis-1,4-dihidroxiciclohexaneacetato)-4-[(2E)-3-(3,4- dihidroxifenil)-2-propenoato] caracterizada por Martin e colaboradores (2009) em J. caucana e relatada pela primeira vez na literatura para os extratos deste estudo (Figura 81; Tabela 10, pág. 127).
Figura 80: Proposta de fragmentação do feniletanoide 780 Da
93
Figura 81: Estrutura do feniletanoide de massa molar 780 Da
Fonte: Adaptado de Martin (2009).
No cromatograma do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia no tempo de retenção de 3,25 min, foi verificada uma banda de absorção máxima UV máx. 329 nm. (Figura 67, pág. 84 ). No espectro de massas modo negativo foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de m/z 665 Da, sugerindo-se tratar-se de uma substância com massa molecular de 666 Da (composto 7). Fragmentação sequencial (EM2) do íon m/z 665 [M– H]- (Figura 82) gerou o íon de m/z 623 Da relacionado a perda de um resíduo acetil [M- 42-H]- (CAO et al., 2012; WANG et al., 2017). O fragmento m/z 503 Da esta relacionado a perda da porção cafeoil [M-162-H]-. Outros fragmentos secundários também foram observados m/z 461, 315 e 161 Da. A porposta de fragmentação sugerida foi apresentada na Figura 83. Estes dados espectrais são compatíveis com a estrutura do 2´ acetil- verbascosídeo (Figura 84) isolado anteriormente de outras espécies vegetais da mesma família das Jacaranda spp como a Incarvillea younghusbandii, Bignoniaceae nativa da China (WU et al., 2012). 94
Figura 82: Espectro EM/EM, m/z 665, do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, em destaque no tR 3.25 min
Figura 83: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 666 Da
95
Figura 84: Estrutura do feniletanoide de massa molar 666 Da (2´-acetil-verbascosídeo)
Nos cromatogramas dos extratos etanólicos dos caules de J. brasiliana, J. cuspidifolia, J. paucifoliata e J. puberula e folhas de J. puberula, no tR de 3,40 min, verificou-se uma banda de absorção máxima UV máx. 329 nm. (Figura 67, pág. 84). No espectro de massas modo negativo foram observadas espécies desprotonadas [M-H]- de m/z 651 Da, sugerindo-se tratar-se de uma substância com massa molecular de 652 Da
(composto 8), compatível com a fórmula molecular C31H40O15. Foi observado o fragmento m/z 475, atribuido a perda da porção feruloil [M–176–H]-. Outros fragmentos detectados foram m/z 193 Da e 175 Da correspondendo ao íon fragmento do ácido ferúlico e a um íon do ácido ferúlico/isoferúlico desidratado, respectivamente (Figura 85 e Tabela 9 pág. 119), corroborando com a fragmentação proposta por Amessis- Ouchemoukh e colaboradores (2014) apresentada na Figura 86. Feniletanoides com esta massa molar e características químicas semelhantes foram isolados anteriormente de espécies de Bignoniaceae tais como: martinosídeo (Figura 87) (Incarvillea younghusbandii), isomartinosídeo (Incarvillea compacta) (YU, 2010; WU et al., 2016). 96
Figura 85: Espectro EM/EM, m/z 651, do extrato etanólico das folhas de J. puberula, no tR 3.40 min
Figura 86: Proposta de fragmentação do feniletanoide de massa 652 Da
97
Figura 87: Estrutura do feniletanoide de massa molar 652 Da (Martinosídeo)
6.7.2 Flavonóis encontrados nos extratos das espécies de Jacaranda:
Analisando-se os cromatogramas, CLUE, dos extratos etanólicos das folhas de J. caroba, J. cuspidifolia, J. micrantha, J. mimosifolia e J. paucifoliata e caule de J. paucifoliata, J. micrantha (Tabela 10 pág. 127) o pico com tR de 2,82 min apresentou banda de absorção máxima UV característica de flavonol sendo a banda I, máx. em 351 nm e banda II 255 nm (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970), indicando a presença de grupo 3-OH substituído (Figura 88). 98
Figura 88: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 2.82 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 463
Espectro de massas no modo negativo do tR 2.82 min apresentou como pico principal a espécie desprotonada [M-H]- m/z 463 Da, composto 11 (Figura 88). Análises de EM2 sequencial foram realizadas para averiguar as fragmentações deste pico de m/z 463 para obter informações estruturais detalhadas. A fragmentação sequencial do íon [M- H]- m/z 463, modo negativo, gerou o íon de m/z 301. Fragmento correspondente a espécies de aglicona desprotonadas, [A-H]-, formadas devido à perda da unidade de açúcar [M-H- 162]-. Demais fragmentações dos anéis A e B (Figura 89 e Tabela 9) estão de acordo com o proposto por Xiao e colaboradores (2017). Via rearranjo retro Diels Alder foram gerados os picos de m/z 179 (X-) e m/z 151 (íons X- - CO) devido a eliminação do fragmento neutro Y (m/z 122), seguida pela perda de CO (m/z 28), sugerindo-se, portanto, a presença da quercetina ligada a uma unidade de hexose.
99
Figura 89: Espectro EM sequencial m/z 463 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as principais fragmentações do tR 2.82 min
Baseado em dados da literatura, e utilizando a isoquercitrina como referência, foi identificado este flavonol como o responsável por esse padrão de fragmentação
(Figura 90) no tR analisado estando presente nos extratos conforme resumo apresentado na Tabela 10, pág. 127). Figura 90: Proposta geral de fragmentação da isoquercitrina
Esse resultado é compatível com a proposta da isoquercitrina (quercetina-3-O-β- D-glicopiranosídeo). Isoquercitrina já foi relatada em outras espécies de Bignoniaceae (BLATT; SANTOS; SALATINO, 1998; DUARTE et al., 2000).
100
No cromatograma dos extratos das folhas de J. caroba, J. micrantha e J. mimosifolia observou-se no tR em 2,72 min um pico de um composto com bandas de absorção característicos de flavonoide máx. 253 e 342 nm (Figura 91). Figura 91: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 2.72 min característico de flavonoides
O espectro de massas deste pico com tR 2,72 min no modo positivo, apresentou sinal da molécula protonada [M–H]+ em m/z 611 (Figura 92A). Já o modo negativo, apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 609 (Figura 92B), sugerindo- se, portanto, tratar de um composto com massa molecular de 610 Da, composto 9. Figura 92: Espectro de massas, modo positivo (A), destacando pico m/z 611 e, modo negativo (B), destacando pico m/z 609 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, no tR 2.72 min
A fragmentação de segunda ordem (EM2), no modo negativo do pico m/z 609, gerou o sinal de m/z 301 Da. Essa fragmentação pode ser atribuída perda de unidades de açúcar pentose e hexose [M–146–162 H]-. Demais fragmentações dos anéis A e B 101
(Figura 93) estão de acordo com o proposto por Dubber e colaboradores (2005). Via rearranjo retro Diels Alder foram gerados os picos de m/z 179 (X-) e m/z 151 (íons X- - CO) devido a eliminação do fragmento neutro Y (m/z 122), seguida pela perda de CO (m/z 28). Figura 93: Espectro de massas sequencial m/z 609 do extrato etanólico das folhas de J. caroba, destacando as principais fragmentações do tR 2.72 min
Estas perda foram propostas sugerindo-se a fragmentação do flavonoide rutina sendo perdida uma ramnose seguida da perda de uma glicose (Figura 94), portanto, a presença da quercetina ligada a unidade do dissacarídeo rutinose (quercetin-3-O- rutinoside). Essa proposição foi confirmada após co-injeção de amostra de referência.
Figura 94: Via de fragmentação proposta para rutina
Fonte: Adaptado de Dubber e colaboradores (2005). 102
Ferreres e colaboradores (2013) haviam identificado a presença de rutina (Figura 95) em folhas de J. caroba. Figura 95: Estrutura da rutina
No extrato de caule mais folha de J. macrantha e folhas de J. brasiliana no tR 3.13, foi identificada um provável flavonoide porém o UV não forneceu dados conclusivos, no entanto, analisando-se o espectro de massas que apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 477 Da (Figura 96) sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 478 Da, composto 14. 103
Figura 96: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando o espectro de massas, no modo negativo, referente ao pico de tR 3.13 min com m/z 477
O padrão de fragmentação sequencial (Figura 97) foi compatível com o proposto por Schieber e colaboradores (2002) gerando os sinais m/z 315, característico da aglicona isoramnetina [M–162–H]- devido à perda de uma hexose. O íon m/z 299 foi gerado pela perda do grupo metila. Demais picos foram gerados pela fragmentação característica de flavonóis (FABRE et al., 2001). Figura 97: Espectro de massas sequencial m/z 477 do extrato etanólico das folhas de J. macrantha, destacando as principais fragmentações do tR 3.13 min
Esse resultado é compatível com a proposta de fragmentação da isoramnetina- 3-O-glicose (Figura 98). Ferreres e colaboradores (2013) através de análise por LC-EM constataram a presença de glicosídeos da isoramnetina na espécie J. caroba, sendo o 104
primeiro relato desta substância nas espécies J. macrantha e J. brasiliana. (Tabela 10, pág. 127).
Figura 98: Proposta de fragmentação da isoramnetina glicosídeo
6.7.3 Flavanonas encontradas nos extratos das espécies de Jacaranda
O cromatograma do caule de J. cuspidifolia apresentou um provável flavonoide no tR 4,14 min (Tabela 9, pág. 119) com uma banda de absorção máxima UV em 287 nm. O espectro de massas, modo negativo, apresentou sinal da molécula desprotonada [M– H]- em m/z 271 (Figura 99), sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 272 Da, composto 20, sendo compatível com a fórmula molecular C15H12O5. 105
Figura 99: Cromatograma CLUE do extrato etanólico do caule de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 4.14 min, detalhando o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 271
Seguindo-se o padrão de fragmentação sugerido por Sarju e colaboradores (2012), a remoção do C2H2O do íon original forneceu o íon a m/z 226, enquanto uma fragmentação retro Diels-Alder forneceu os picos m/z 151 e 119, no modo negativo (Figura 100). Figura 100: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule de J. cuspidifolia e a via de fragmentação geradora dos principais picos para naringenina
Este padrão de fragmentação e o uso de composto referência, levou a identificação da flavanona naringenina (Figura 101) como presente neste extrato. Hendra, Willis e Keller (2018) identificaram glicosídeos da naringenina em flores de J. mimosifolia, 106
porém, relatada pela primeira vez na literatura para J. cuspidifolia., conforme Tabela 10, pág. 127) Figura 101: Estrutura da naringenina
6.7.4 Flavonas encontradas nos extratos das espécies de Jacaranda
O cromatograma das folhas de J. cuspidifolia apresentou um flavonoide no tR 3,85 min com bandas de absorção máxima UV em 266 e 342 nm. O espectro de massas, modo negativo, apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 285 (Figura 102), sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 286 Da composto 18. Figura 102: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 3.85 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 285
A fragmentação de segunda ordem (EM2) gerou o sinal de m/z 257 [M-28-H]-, atribuída a perda de um CO. Demais fragmentações dos anéis A e B (Figuras 103), - resultaram na formação de m/z 243 [M-42-H] atribuída a perda de um C2H2O. O íon m/z - - 217 [M-68-H] atribuída a perda de um C3O2. A fragmentação de m/z 243 [M-44-H] atribuída a perda de outra molécula de CO2 gerou o pico m/z 199. Por fim uma 107
fragmentação retro Diels-Alder (RDA) forneceu os principais radicais m/z 151 e 133 (CHERUVU et al., 2018). Figura 103: Espectro EM/EM de extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia e a via de fragmentação geradora dos principais picos para luteolina
A proposta de fragmentação, Figura 104, juntamente com os dados obtidos da análise de uma amostra de referência permitiram sugerir tratar-se flavona aglicona luteolina já relatada em espécies de J. decurrens. (BLATT; SANTOS; SALATINO, 1998; HASHEM et al., 2011; ANTUNES et al., 2016).
Figura 104: Proposta de fragmentação da luteolina
Fonte: Adaptado de Fabre e colaboradores (2001) 108
Os cromatogramas dos extratos de caule de J. paucifoliata e caule/folha de J. macrantha apresentaram um provável flavonoide no tR 3,10 min (Tabela 9). O espectro de massas apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 447 (Figura 105), sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 448 Da (composto 13). As análises de segunda ordem (EM2) gerou o sinal de m/z 285 [M-162-H]-, atribuída a perda de uma hexose. Demais fragmentações dos anéis A e B seguiram o proposto por Li e colaboradores (2016) podendo se tratar da flavona isorientina (luteolina 6-C-β-D-glicose) (Figura 106). A presença dessa flavona em espécies da família Bignoniaceae, inclusive Jacaranda já foi relatada na literatura (MOHARRAM; MARZOUK, 2007; HASHEM et al., 2011; ALMEIDA et al., 2014). Figura 105: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule mais folha de J. macrantha para fragmentação sequencial de m/z 447 destacando-se a perda da molécula de glicose
Figura 106: Estrutura da luteolina 6-C-glicose (isorientina)
109
O cromatograma das folhas de J. cuspidifolia apresentou um provável flavonoide no tR 4,40 min (Tabela 9, pág. 119) com bandas de absorção UV máx. 266 e 336 nm, sugestivos de flavona (MABRY, 1970) e o espectro de massas apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 299, conforme (Figura 107), tratando-se de uma molécula com massa molecular de 300 Da (composto 12). Figura 107: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV no pico de tR 4.36 min e o espectro de massas, modo negativo, referente ao pico m/z 299
A fragmentação sequencial gerou o sinal de m/z 284 [M-15-H]-, atribuída a perda de uma metila (CH3). Demais fragmentações dos anéis A e B, resultaram na formação de - - m/z 256 [M-43-H] atribuída a perda de (CH3 + CO) e m/z 255 [M-44-H] atribuída a perda de CO2. A fragmentação do anel B gerou m/z 176 (Figura 108). 110
Figura 108: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 299
Tal fragmentação foi proposta conforme Figura 109 sendo compatível com luteolina metil éter (metoxiluteolina) já relatada por Moharram e Marzouk (2007) em folhas de J. mimosifolia.
Figura 109: Proposta de fragmentação da metoxiluteolina
Fonte: Adaptado de Abubakar e Majinda (2015) 111
O cromatograma das folhas de J. cuspidifolia apresentaram no tR 2,81 min bandas de absorção UV máx. 253 e 343 nm, (Figura 110 ) característico de flavona (MABRY, 1970). O espectro de massas apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 461. (Figura 110), sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 462 Da, composto 12. A fragmentação sequencial gerou o sinal de m/z 299 [M-162-H]-, atribuída a perda de uma hexose. Outro sinal gerado, m/z 285 [M-15-H]-, atribuída a perda adicional de uma metila (CH3). Figura 110: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 461, em destaque a banda de absorção de UV e principais fragmentações
Estas fragmentações sugerem se tratar de uma metoxiluteolina glicosilada (Luteolina metil eter glicosídeo) conforme Figura 111, sendo necessário o uso de padrão 112
para confirmar a proposta da estrutura. Moharram e Marzouk (2007) já relataram flavonoides semelhantes em J. mimosifolia.
Figura 111: Estruturas proposta para flavona de massa molar 462 Da (A) Luteolina-5-metil-eter-7-O- glicosídeo e (B) Luteolina-7-metil-eter-5-O-glicosídeo
Os cromatogramas dos extratos de folhas de J. cuspidifolia e caule de J. puberula apresentaram no tR de 4,49 min bandas de absorção UV máx. 266 e 336 nm um provável flavonoide. O espectro de massas, modo negativo, apresentou sinal da molécula desprotonada [M–H]- em m/z 269 (Figura 112), sugerindo tratar-se de uma molécula com massa molecular de 270 Da, composto 20, sendo compatível com a fórmula molecular
C15H10O5. Figura 112: Cromatograma CLUE do extrato etanólico das folhas de J. cuspidifolia, destacando as bandas de absorção UV nos picos com tR 3.17, 3.22 e 4.49 min
113
A fragmentação sequencial (EM2) gerou os picos a m/z 269, 241, 225, 201, 181, - - - 151, 149 e 117, correspondentes às espécies [M-H] , [M-H-CO] , [M-H-CO2] , [M-H- - - 1,3 - 1,4 - 1,3 - C3O2] , [M-H-2CO2] , A , B -H2 e B respectivamente (Figura 113). De acordo com Fabre e colaboradores (2001) este padrão de fragmentação é típico da flavona apigenina (composto 21). Figura 113: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 269 destacando-se a fragmentação retro Diels Alder
As abundâncias relativas dos fragmentos de íons obtidas na presente pesquisa conforme proposta de fragmentação apresentada na Figura 114, sendo a fragmentação retro Diels Alder responsável pelos principais picos, juntamente com o uso de composto de referência, foi possível confirmar a presença desta flavona nos extratos das folhas de J. cuspidifolia e no caule de J. puberula. 114
Figura 114: Proposta de fragmentação da apigenina com a fragmentação Retro Diels Alder
A diferenciação entre apigenina e genisteína, que são isômeros, conforme Figura 15, foi possível com uso de composto referência para apigenina e também devido a formação do íon1,3A-, m/z 151 (Figura 113), fragmento este que não ocorre em genisteína. Já na apigenina, tal íon possui ainda vários íons produtos, o que permite a distinção dos dois isômeros (FABRE et al., 2001), confirmando mais uma vez se tratar de apigenina no extratos analisados (Tabela 10). Figura 115: Estruturas da apigenina (A) e da genisteína (B)
O cromatograma das folhas de J. cuspidifolia apresentaram picos referentes a flavonoides, no tR 3,17 min e 3,22 min, sendo que para ambos foi observada bandas de absorção máxima UV máx. 265 e 336 nm, (Figura 112, acima) característico de flavonas (MABRY, 1970). O espectro de massas apresentou sinais das moléculas desprotonadas [M–H]- em m/z 445 Da (composto 15, Tabela 8) e 431 Da (composto 16, Tabela 8) respectivamente. (Tabela 9, pág. 119), sugerindo tratar-se de molécula com massa molecular de 446 Da e 432 Da. A fragmentação sequencial (EM2)gerou, em ambos o 115
sinal de m/z 269 (sugestivo de apigenina) devido à perda de ácido glicurônico [M-176- H]- e a perda de uma hexose [M-162-H]-, conforme Figura 116. Demais fragmentações foram características de flavona apigenina. Portanto, sugere-se tratar de apigenina 7-O- glucoronídeo no tR 3,17 min e apigenina-7-glicosídeo no tR 3,22 min, sendo necessário o uso de padrão para confirmar as estruturas propostas. Derivados glicosilados da apigenina foram encontrados em Bignoniaceae (GONTIJO et al., 2017). Moharram e Marzouk (2007) já relataram flavonoides semelhantes em J. mimosifolia, porém relatados pela primeira vez em J. cuspidifolia (Tabela 10, pág. 127). Figura 116: Espectro EM/EM de extrato etanólico de folhas de J. cuspidifolia fragmentação sequencial de m/z 445 e 431, em destaque fragmentação com perda de glucoronídeo e glicose, respectivamente
O composto 17 (Tabela 8, pág. 118), com tR 2.07 min, apresentou espectro de massas no modo positivo o pico m/z 447 [M-H]+ e no modo negativo m/z 445 [M-H]- 116
(Figura 117). No espectro de massas sequencial foi gerado fragmentos m/z 283 devido a - - perda de uma hexose [M-H-162-Glucose] e m/z 269 [M-H-162-15-CH3] . Demais picos característicos da fragmentação de apigenina, sendo então sugerido a flavona apigenina metil glicose sendo relatado no extrato etanólico bruto de Jacaranda brasiliana.
Figura 117: Espectro EM/EM de extrato etanólico de caule de J. brasiliana no tR 2,07 min. No detalhe o espectro de massas no modo negativo e positivo referentes aos picos m/z 445 (vermelho) e 447 (verde)
Nas Tabelas 7 e 8 está um resumo dos feniletanoides e flavonoides encontrados nas espécies de Jacaranda deste estudo:
117
Tabela 7: Feniletanoides encontrados nas espécies de Jacaranda.
Feniletanoide R1 R2 R3 R4 R5
1 β-hidroxi-verbascosídeo H Cafeoil H H OH
2 Isoverbascosídeo H H Cafeoil H H
3 Verbascosídeo H Cafeoil H H H
4 β-etil-hidroxi-verbascosídeo H Cafeoil H H C2H2OH
5 Leucosceptosídeo A H Feruloil H H H
6 Feniletanoide 780 Da C8H12O3 H H H H
7 2´-acetil-verbascosídeo H H H Acetil H
8 Martinosídeo CH3 Feruloil CH3 H H
118
Tabela 8: Flavonoides encontrados nas espécies de Jacaranda.
Flavonoide R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
9 Rutina OH H OH OH Rut H - - -
10 Quercetina glicose pentose OH H OGlu-Pen OH H H - - -
11 Isoquercitrina OGlu H OH OH H H - - -
12 Luteolina metil glicose H H OH OH CH3 Glu - - -
13 Luteolina glicose H H OH OH H Glu - - -
14 Isoramnetina glicose OH H OCH3 OH H H - - -
15 Apigenina glucoronídeo H H H OH Glc H - - -
16 Apigenina glicose H H H OH Glu H - - -
17 Apigenina metil glicose H H H OH CH3 Glu - - -
18 Luteolina H H OH OH H H - - -
19 Quercetina OH H OH OH H H - - -
20 Naringenina ------OH H OH
21 Apigenina H H H OH H H - - -
22 Hidroxi apigenina glicose H OH H OH OH Glu - - -
A Tabela 9 abaixo resume os compostos fenólicos identificados nos extratos de caules, folhas e frutos de espécies do gênero Jacaranda destacando o tempo de retenção
(TR), bandas de absorção máxima UV em nm de cada composto, pico principal no espectro de massas no modo positivo e modo negativo e principais fragmentos na espectrometria de massas sequencial. 119
Tabela 9: Compostos fenólicos identificados nos extratos de caules, folhas e frutos de espécies do gênero Jacaranda.
+ - Sustâncias tR UV nm [M-H] [M-H] Fragmentos (m/z) no modo (min) (m/z) (m/z) negativo
J. brasiliana (caule)
Metilapigenina 2,07 267; 334 447,36 445,34 445,49; 283,45; 269,17; glicose 225,42; 160,68; 150,54; 148,63; 116,80
β-hidroxi- 2,35 329,46 640,29 639,17 639,45; 477,00; 458,80; verbascosídeo 325,06; 178,78; 160,67; 151,33
Isoverbascosídeo 2,66 329,46 625,39 623,36 623,35; 461,30; 314,75; 178,60; 160,71; 134,77
Verbascosídeo 2,96 327,46 623,36 622,83; 461,11; 315,26; 178,85; 160,64; 135.22
Beta-etil-hidroxi 2,86 336,46 667,27 667,42; 486.97; 469,33; verbascosídeo 459,50; 179,11; 161,65; 150,956
Feniletanoide 3,06 330,46 637 637,35; 461,93; 174,99; glicosídeo 161,53
Feniletanoide 3,16 331,46 779 779,07; 461,47 glicosídeo
Feniletanoide 3,52 330,46 651 650,33; 192,88; 174,64 glicosídeo
J. brasiliana (folhas)
Isoverbascosídeo 2,65 327,46 623,30 461,50; 315,26; 161,09
Quercetina 2,76 477,22 301,13 glucoronídeo
Luteolina glicosídeo 3,22 267,46 333,46 447,17 337,37; 285,43; 255,24; 150,97
Isoramnetina 4,35 286,46 328,46 479,18 477,22 315,15; 299,21; 256,59; glicosídeo 150,98
J. caroba (folhas)
Isoverbascosídeo 2,61 330,13 625,62 623,40 623,44; 461,12; 314,90; 160,99; 134,99
Rutina 2,72 253,13; 611,18 609,42 609,42; 301,05; 179,04; 343,13 162,54; 150,89 120
Verbascosídeo 2,79 329,13 623,46 623,06; 461,24; 314,58; 161,05
Isoquercitrina 2,82 255,13; 465,29 463,33 463,14; 301,46; 271,11; 351,13 178,93; 151,17
Feniletanoide 2,97 286,13; 623,40 623,44; 461,18; 315,22; glicosídeo 331,13 161,18
Feniletanoide 3,05 330,13 637,15 637,13; 461,82; 315,23; glicosídeo 193,20; 175,27 160,72; 135,12
Feniletanoide 3,10 330,46 779,68 779,50; 665,47; 623,37; glicosídeo 503,44; 461,91; 314,56; 298,32; 160,89; 135,85
J. cuspidifolia (caule)
β-hidroxi- 2,28 329,46 639,11 639,25; 621,18; 518,21; verbascosídeo 459,57; 477,13 469,51; 325,12; 179,06; 161,17; 151,37
Isoverbascosídeo 2,62 330,46 625,26 623,23 623,19; 461,31; 315,22; 297,36; 160,86
Verbascosídeo 2,86 328,46 623,30 623,44; 461,18; 315,03; 296,91; 160,99
Feniletanoide 3,05 330,46 781,34 779,34 779,69; 665,15; 623,31; glicosídeo 503,05; 461,14 314,68; 299,28; 160,89; 134,50
Feniletanoide 3,25 329,46 665,24 665,38; 623,28; 503,26; glicosídeo 461,40; 315,06; 179,20; 160,97; 135,07
Feniletanoide 3,40 329,46 651,32 651,08; 475,42; 457,65; glicosídeo 329,16; 193,10; 175,07
Naringenina 4,14 286,46; 273,01 271,24 270,79; 244,15; 187,30; 328,46 176,98; 150,65; 119,26
J. cuspidifolia (folhas)
Isoverbascosídeo 2,54 282,46; 623,23 622,93; 461,12; 315,16; 336,46 297,17; 161,12
Isoquercitrina 2,81 267,46; 465,20 463,04 463,52; 301,33; 271,43; 343,46 179,00; 150,92
Metoxiluteolina 2,86 253,46; 463,11 461,21 461,12; 299,06; 285,31; glicosídeo 344,46 255,40; 175,02; 121,07 121
Feniletanoide 3,05 330,46 781,34 779,23 779,14; 665,15; 503,05; glicosídeo 461,14 314,68; 299,28; 160,89
Apigenina glucoronil 3,19 266,46; 444,95 445,49; 268,98; 225,42; 336,46 160,68; 148,69; 116,80
Apigenina glicosídeo 3,22 265,46; 431,36 430,70; 310,68; 268,98; 336,46 247,17; 160,68; 133,23; 116,04
Luteolina 3,85 266,46 342,46 287,05 285,09 285,05; 256,76; 243,09; 241,32; 217,07; 199,35; 174,92; 150,99; 132,95
Apigenina 4,36 267,46 336,46 271 269,09 269,43; 241,48; 225,22; 201,19; 150,85; 149,26; 116,94
Metoxiluteolina 4,49 266,46 336,46 299,07 299,03; 284,14; 256,55; 255,18; 176,10; 149,13; 121,29
J. macrantha (caule mais folhas)
Isoverbascosídeo 2,65 218,46; 623,23 623,25; 460,99; 315,03; 330,46 297,17; 160,92
Isoquercitrina 2,78 255,46; 465,13 463,17 463,14; 301,33; 271,05; 347,46 178,87; 150,79
Verbascosídeo 2,81 329,46 623,17 623,43; 461,12;
Feniletanoide 3,06 331,46 781,27 779,31 779,37; 665,34; 503,31; glicosídeo 461,21 315,26; 161,08; 135,02
Feniletanoide 3,01 329,46 637,28 637,39; 461,05; 315,96; glicosídeo 193,09; 174,83; 161,24; 135,21
Luteolina glicosídeo 3,10 331,46 449,26 447,04 447,71; 327,47; 284,50; 266,52; 255,35; 175,09; 151,30
Isoramnetina 3,13 331,46 479,74 477,15 476,68; 315,07; 299,22; glicosídeo 270,80; 256,96; 150,98
J. micrantha (caule)
β-hidroxi- 2,48 329,46 639,04 639,70; 621,88; 459,57; verbascosídeo 323,46; 178,86; 160,85; 151,11 122
Isoverbascosídeo 2,65 330,46 623,23 623,25; 461,50; 315,22; 297,17; 160,80
Feniletanoide 2,83 329,46 621,14 621,62; 458,92; 179,12; glicosídeo 161,30
Isoquercitrina 2,89 285,46 465,07 463,04 462,82; 301,27; 270,92; 178,93; 151,23
Feniletanoide 3,05 330,46 637,21 636,81; 461,50; 315,70; glicosídeo 192,77; 175,34; 160,98; 135,60
Feniletanoide 3,10 329,46 781,60 779,44 779,50; 665,34; 503,63; glicosídeo 460,50; 160,76; 135,98
J. micrantha (folhas)
β-hidroxi- 2,28 329,46 639,11 639,25; 621,18; 518,21; verbascosídeo 459,57; 477,13 469,51; 325,12; 179,06; 161,17; 151,37
Verbascosídeo 2,65 332,46 623,10 623,51; 461,18; 315,10; 161,05
Rutina 2,75 252,13; 610,87 609,37 609,42; 301,55; 179,20; 345,13 151,02
Feniletanoide 2,83 336,46 621,13 621,68; 459,48; 178,62; glicosídeo 161,30
Isoquercitrina 2,87 255,46; 465,00 463,30 463,39; 301,01; 270,98; 350,46 178,49; 151,17
Feniletanoide 3,01 329,46 637,21 637,84; 475,08; 462,91; glicosídeo 315,45; 192,07; 174,89; 160,79; 135,92
J. micrantha (frutos)
β-hidroxi- 2,37 328,46 639,46 639,05; 621,31; 518,08; verbascosídeo 469,18; 324,80; 178,99; 161,04; 150,98
Isoverbascosídeo 2,66 329,46 623,30 623,31; 461,24; 315,10; 160;92
Feniletanoide 2,82 330,46 621,58 621,08; 459,20; 179,20; glicosídeo 161,04
Verbascosídeo 2,91 623,46 623,31; 461,24; 314,78; 161,05 123
Feniletanoide 3,10 329,46 781,60 779,44 779,82; 664,89; 502,99; glicosídeo 461,14; 300,11; 160,76
J. mimosifolia (caule)
β-hidroxi- 2,37 328,46 639,46 639,05; 621,31; 518,08; verbascosídeo 469,18; 324,80; 178,99; 161,04; 150,98
Isoverbascosídeo 2,71 329,46 623,30 623,12; 461,24; 315,10; 160,92
Verbascosídeo 2,94 327,46 623,46 623,38; 461,05; 315,22; 161,12
Feniletanoide 3,10 330,46 779,51 779,31; 665,02; 623,57; glicosídeo 503,24; 461,79; 324,89; 178,86; 161,86; 135,08
J. mimosifolia (folhas)
β-hidroxi- 2,71 327,46 639,30 639,20; 621,63; 518,27; verbascosídeo 469,18; 325,57; 179,18; 160,85; 151,11
Rutina 2,76 253,13; 611,08 609,19 608,98; 301,24; 180,17; 345,13 162,92; 151,14
Isoverbascosídeo 2,65 328,46 623,30 623,25; 461,05; 315,35; 160,92
Feniletanoide 3,14 327,46 779,38 779,50; 665,09; 462,94; glicosídeo 332,78; 181,11; 163,01; 134,89
J. paucifoliata (caule)
β-hidroxi- 2,35 330,46 639,11 639,38; 476,89; 458,27; verbascosídeo 324,95; 178,91; 160,67; 151,14
Isoverbascosídeo 2,65 330,46 623,36 623,73; 461,47; 178,66; 161,03
Beta-etil-hidroxi 2,82 330,46 667 667,67; 489,90; 469,08; verbascosídeo 179(82); 161,15; 149,07
Verbascosídeo 2,90 328,46 623,23 622,77; 461,50; 314,94; 178,92; 161,03
Isoquercitrina 2,91 Não 465,07 463,11 463,41; 301,20; 299,99; característico 271,03; 179,88; 150,78 124
Feniletanoide 3,02 330,13 637,15 637,84; 475,08; 462,91; glicosídeo 315,45; 192,07; 174,89; 160,79; 135,92
Feniletanoide 3,09 328,46 779,44 779,14; 461,14 314,68; glicosídeo 299,28; 160,89
Luteolina glicose 3,21 447,17 447,69; 327,16; 285,00; 266,45; 175,16; 151,29
Feniletanoide 3,44 328,46 651 651,03; 475,02; 457,04; glicosídeo 329,04; 192,63; 174,77; 160,88
J. paucifoliata (folhas)
β-hidroxi- 2,35 329,46 639,43 639,13; 477,66; 458,27; verbascosídeo 325,00; 179,10; 161,19
Isoverbascosídeo 2,65 330,46 623,36 622,77; 461,30; 314,88; 179,50; 161,09; 135,29
Quercetin-3-O- 2,73 254,46 350,46 597,29 595,20 595,40; 463,26; 301,17; glucosyl-pentoside 300,03; 178,92; 150,39
Verbascosídeo 2,90 328,46 623,36 623,35; 461,18; 314,75; 179,56; 161,54; 134,97
Isoquercitrina 2,88 255,46 354,46 465,00 463,24 463,14; 301,26; 299,99; 271,47; 150,97
Hidroxi-apigenina 3,09 285,46 333,46 447,17 447,07; 326,91; 284,87; glicosídeo 254,80; 175,10; 151,79; 112,56
Isoramnetina 3,21 285,46 331,46 479,11 477,22 475,08; 315,08; 299,85; glicosídeo 285,20; 243,02; 151,74
Quercetina 3,98 303,12 301,36 301,05; 270,10; 178,68; 150,99
J. puberula (caule)
β-hidroxi- 2,30 285,46 639,17 639,37; 620,79; 518,21; verbascosídeo 459,86; 477,13; 325,12; 160,79; 152,13
Isoverbascosídeo 2,66 323,46 625,26 623,23 622,93; 461,12; 315,16; 297,17; 161,12
Verbascosídeo 2,86 326,43 625,32 623,30 623,51; 461,18; 315,10; 161;05 125
Feniletanoide 3,05 329,46 637,21 637,84; 461,82; 314,81; glicosídeo 192,20; 175,27; 160,72; 135,21
Feniletanoide 3,05 330,46 781,34 779,31 778,92; 665,41; 461,91; glicosídeo 329,32; 161,14; 135,14
Feniletanoide 3,42 329,46 651,26 650,90; 475,43; 456,00; glicosídeo 329,41; 193,22; 174,86
Apigenina 4,38 267,46; 269,09 268,66; 241,13; 224,61; 330,46 201,19; 150,55; 149,34; 116,11
J. puberula (folhas)
β-hidroxi- 2,30 285,46 639,17 638,93; 621,31; 518,33; verbascosídeo 477,00; 458,80; 325,06; 178,99,06; 161,17; 150,87
Isoverbascosídeo 2,60 330,46 623,36 623,12; 461,37; 315,03; 161,12; 135,12
Verbascosídeo 2,86 329,46 623,23 623,19; 461,31; 314,78; 161,12; 135,06
Feniletanoide 3,10 329,46 779,38 779,43; 665,02; 623,25; glicosídeo 461,34; 315,20; 161,08; 134,82
Feniletanoide 3,05 329,46 637,21 637,45; 461,05; 315,25; glicosídeo 193,35; 175,08; 161,24; 135,47
Feniletanoide 3,42 328,46 651,32 651,41; 475,30; 457,52; glicosídeo 328,97; 192,96; 175,05
Conforme dados da Tabela 9, acima, os flavonoides, rutina e isoquercitrina e derivados do ácido cafeoil com massa molar de 624 Da já haviam sido relatados em folhas de J. Caroba (FERRERES et al., 2013; HERNANDES et al., 2014), porém, os feniletanoides de massa 638 Da e 780 Da foram relatados pela primeira vez nesta espécie. Não foi encontrado estudos fitoquímicos das espécies J. brasiliana e J. paucifoliata. Comparando-se o extrato etanólico de caule e folha de J. cuspidifolia verificou-se a presença de maior variedade de flavonoides nas folhas que nos caules mostrando ser esta classe de metabólito secundário mais presente na folhas neste gênero. Verbascosídeo e seus derivados foram encontrados no extrato metanólicos de caule e folhas desta espécie por Arruda e colaboradores (2012). Ribeiro e colaboradores (2014) confirmaram a 126
presença de flavonoides em caules e folhas de extratos metanólicos de J. cuspidifolia. Foram relatados pela primeira vez em J. cuspidifolia os flavonoides naringenina no extrato etanólico do caule, além de apigenina e derivados glicosilados, isoquercitrina, luteolina, metoxiluteolina e derivado glicosilado no extrato etanólico das folhas. Santos e colaboradores (1999) relataram a presença dos triterpenos estigmasterol e sistosterol e do fitoquinoide jacaranona em extrato etanólico bruto do caule de J. macrantha, portanto os flavonoides glicosilados luteolina e isoramnetina, além de isoquercitrina, encontrados no nosso estudo, foram relatados pela primeira vez na espécie J. macrantha. Comparando-se os extratos etanólicos de caule, folhas e frutos de J. micrantha nenhum flavonoide foi identificado nos frutos, estando presente nestes apenas derivados do feniletanoide verbascosídeo. Pilatti e colaboradores (2018) confirmaram a presença de flavonoides em folhas de J. micrantha. Isoquercitrina foi relatada pela primeira vez nos extratos de caule e folhas de J. micrantha, e rutina no extrato etanólico das folhas desta espécie. Vários flavonoides, além de verbascosídeo e isoverbascosídeo foram relatados nas folhas de J. mimosifolia (MOHARRAM; MARZOUK, 2007; SIDJUI et al., 2014; HENDRA; WILLIS; KELLER, 2018), porém, o flavonoide rutina foi relatado pela primeira vez nesta espécie. Santos e colaboradores (2010) já haviam relatado a presença de verbascosídeo em folhas de J. puberula, além de triterpenos (ALMEIDA et al., 2014), porém o flavonoide apigenina foi relatado pela primeira vez em J. puberula. Uma revisão sobre composição química e atividades bioativas do gênero Jacaranda podem ser vistas em Gachet e Schühly (2009) onde foi observado que as espécies do gênero possuem grupos químicos em comum, mas nem sempre a mesma composição química, e que espécies diferentes promovem atividades biológicas também diferentes (DREBES; ETHUR; AVANCINI, 2018). A Tabela 10 resume os compostos fenólicos caracterizados em nosso estudo com ênfase (*) para os compostos relatados pela primeira vez na literatura para estas espécies.
127
Tabela 10: Compostos fenólicos caracterizados nas espécies de Jacaranda pesquisadas.
Compostos J. brasiliana J. caroba J. cuspidifolia J. macrantha J. micrantha J. mimosifolia J. paucifoliata J. puberula
Caule Folha Folha Caule Folhas Caule/folhas Caule Folha Fruto Caule Folhas Caule Folha Caule Folha
1 β-hidroxi- - + - + - - - + + + + + + + + verbascosídeo
2 Isoverbascosídeo + + + + + + + - + + + + + + +
3 Verbascosídeo + + + - + - + + + - + + + +
4 β-etil-hidroxi- + ------+ - - - verbascosídeo
5 Leucosceptosídeo + - - - - + + + - - - + - + + A
6 Feniletanoide 780 + * - + * + * + * + * + * - + * + * + * + * - + * + * Da
7 2´-acetil- + * - - - + * ------+ * - - - verbascosídeo
8 Martinosídeo + - - + ------+ - + +
9 Rutina - - + - - - + - - - + - - - -
10 Quercetina glicose ------+ * - - pentose
11 Isoquercitrina - - + - + - + + - - + + + - - 128
12 Luteolina metil - - - - + ------glicose
13 Luteolina glicose - - - - - + - - - - - + - - -
14 Isoramnetina - + * - - - + * ------glicose
15 Apigenina - - - - + * ------glucoronídeo
16 Apigenina glicose - - - - + * ------
17 Apigenina metil + * ------glicose
18 Luteolina - - - - + ------
19 Quercetina ------+ - -
20 Naringenina - - - + * ------
21 Apigenina - - - + ------+ -
22 Hidroxi apigenina ------+ * - - glicose (+) caracterizados (-) não caracterizados (*) relatados pela primeira vez na literatura nessas espécies vegetais. 129
6.8 ENSAIOS BIOLÓGICOS
6.8.1 Concentração ideal de células a serem semeadas para cada linhagem Determinou-se que a concentração ideal de células para cada poço em placa de 96 posições seria conforme se segue: 1 x 104 células para HeLa, 2 x 104 células para MRC- 5 e Hep G2, 5 x 104 células para TOV-21G conforme Tabela 4 da pág. 51. Ao final de 72h (duração do tratamento com os extratos brutos de Jacaranda), essas quantidades permitiriam que células não-tratadas alcancem aproximadamente 80-90% de confluência em cultivo. Os valores obtidos para concentração ideal de células semeadas para essas linhagens equivale ao que já foi reportado na literatura (ANDRADE et al., 2018; VLASCEANU et al., 2018; BRANDÃO et al., 2013).
6.8.2 Determinação da concentração citotóxica 50 % (CC50)
Para a determinação das respectivas CC50, os quinze extratos etanólicos brutos de Jacaranda foram solubilizadas em DMSO sendo testadas oito concentrações de cada, que variaram de 400 a 3.125 μg/mL. A citotoxicidade das substâncias foi avaliada por meio do ensaio colorimétrico do MTT utilizando três linhagens celulares tumorais de humanos, HeLa (carcinoma epitelial), Hep G-2 (carcinoma hepático) e TOV-21G (adenocarcinoma de ovário), além de uma linhagem celular de origem não tumoral, sendo derivada de fibroblastos humanos (MRC-5). Os resultados das concentrações citotóxicas a 50%
(CC50) estão apresentados na Tabela 11, a seguir.
130
Tabela 11: Atividade citotóxica (CC50) in vitro dos extratos etanólicos brutos das espécies de Jacaranda e respectivos desvios padrão (n = 3) e índice de seletividade (IS) pelo ensaio colorimétrico do MTT.
CC50 µg/mL (µM) Extrato MRC-5 Hela IS* HepG2 IS* TOV 21G IS*
J. brasiliana Caule > 400,0 188,20 ± 2,10 2,10 173,70 ± 1,60 2,30 169,60 ± 2,20 2,40 Folhas 130,80 ± 1,40 308,50 ± 3,0 0,40 114,80 ± 1,50 1,10 181,70 ± 1,60 0,70
J. caroba Folhas > 400,00 90,91 ± 2,04 4,40 188,10 ± 1,58 2,13 74,01 ± 1,45 5,40
J. cuspidifolia Caule > 400,00 > 400,00 1,00 185,50 ± 1,34 2,16 183,50 ± 1,85 2,18 Folhas 384,60 ± 2,77 80,34 ± 1,97 4,79 97,26 ± 1,46 3,95 59,87 ± 1,42 6,42
J. macrantha Caule/Folhas 95,06 ± 1,45 180,30 ± 2,08 0,53 105,00 ± 1,49 0,91 104,70 ± 1,38 0,91
J. micrantha Caule 188,10 ± 1,37 302,40 ± 1,25 0,62 188,00 ± 1,97 1,00 102,00 ± 1,58 1,84 Folhas 87,05 ± 1,30 67,70 ± 2,54 1,29 193,40 ± 1,53 0,45 72,73 ± 1,45 1,41 Frutos 286,80 ± 1,60 350,10 ± 2,00 0,82 198,80 ± 1,47 1,35 98,50 ± 2,32 2,91
J. mimosifolia Caule 216,40 ± 2,17 193,30 ± 2,07 1,12 90,06 ± 1,65 2,39 193,40 ± 1,68 1,12 Folhas 83,12 ± 1,55 178,20 ± 2,67 0,47 63,47 ± 1,27 1,31 152,60 ± 1,48 0,54
J. paucifoliata Caule > 400,00 395,10 ± 2,26 1,01 154,70 ± 1,45 2,59 302,80 ± 1,22 1,32 Folhas 383,60 ± 2,88 296,60 ± 1,51 1,29 108,86 ± 1,56 3,52 188,40 ± 1,35 2,04
J. puberula Caule > 400,00 361,60 ± 2,11 1,11 139,10 ± 1,53 2,88 154,20 ± 1,66 2,59 Folhas 249,00 ± 1,54 151,50 ± 2,02 1,64 89,66 ± 1,57 2,78 116,30 ± 1,72 2,14
* O índice de seletividade (IS) foi calculado dividindo o valor de CC50 da linhagem celular normal MRC-5 pelo valor de CC50 das linhagens celulares tumorais (HeLa, HepG2 e TOV 21G)
O efeito citotóxico dos extratos etanólicos das espécies de Jacaranda foram avaliados frente a linhagens de células tumorais utilizando o método colorimétrico MTT. Todas as células foram expostas a oito concentrações, variando de 400, 200, 100, 50, 25,
12.5, 6.250 e 3.125 μg/mL dos extratos etanólicos, sendo os resultados de CC50 determinados a partir dos valores obtidos em experimentos distintos por regressão não linear utilizando o software GraphPad prism 5.0 (Statistica). Em alguns extratos de
Jacaranda, os valores obtidos do CC50 mostraram uma diminuição na viabilidade celular 131
mais acentuada quando comparado com os resultados para a linhagem de célula não tumoral. Suffness e Pezzuto (1990) estabelecem que extratos brutos mostrando uma CC50 ≤ 100 µg/mL podem ser considerados citotóxicos e selecionados para estudos futuros como purificação ou isolamento. Entre os 15 extratos testados, sete deles apresentaram pouco efeito citotóxico contra as células utilizadas. Por outro lado, oito extratos etanólicos (folhas de J. caroba, folhas de J. cuspidifolia, caule/folhas de J. macrantha, folhas e frutos de J. micrantha, caule e folhas de J. mimosifilia e folhas de J. puberula) revelaram uma diminuição a viabilidade celular nas linhagens celulares tumorais testadas abaixo de 100 µg/mL (Tabela 11). Como foram testadas 3 linhagens celulares tumorais, um total de 45 testes de citotoxicidade foram realizados com 11 extratos (24%) apresentando citotoxicidade menor que 100 CC50 µg/mL. Embora seja recomendado que o mesmo tipo de célula (tumoral e não tumoral) seja utilizada na determinação do índice de seletividade (IS) isto se torna difícil, no caso de uma triagem inicial, pois seria necessário a utilização de um grande número de linhagens celulares. Além disso, nem todos os tipos de tecidos tem linhagens de células normais disponíveis para cultivos in vitro. Sendo assim, no presente estudo foi utilizada a linhagem celular MRC-5 para determinar o efeito citotóxico in vitro de uma célula normal, bem como estabelecer o índice de seletividade do extratos como uma estimativa de sua janela terapêutica (SITI SYARIFAH et al., 2011). O valor de IS indica a seletividade das amostras em relação às linhas celulares testadas. No presente estudo, o grau de seletividade do composto foi expresso como: Índice de seletividade (IS) = CC50 do extrato de Jacaranda na linhagem celular normal (MRC-5) / CC50 do extrato de Jacaranda nas linhagens celulares de câncer (Tabela 11). Este valor indicou a especificidade dos extratos para as células cancerígenas. Um valor de 2 ou mais indicou alta especificidade (ALZEUS; TANTENGCO; JACINTO, 2015). Um valor de IS inferior a 2,0 indica a toxicidade geral do composto. Valor de IS ≤ 1 não seletivo, entre 1 < IS < 5 moderadamente seletivo e IS acima de 5 considerado seletivo (SITI SYARIFAH et al., 2011), portanto 25 extratos (55%) foram pouco ou não seletivos, e 20 extratos (45%) considerados seletivos e destes apenas 2 (4,5%) específicos com SI superior a 5, extrato de folhas de J. caroba e extrato de folha de J. cuspidifolia. Ribeiro e colaboradores (2014) avaliaram a citotoxicidade de extrato etanólico de folhas de J. caroba e J. cuspidifolia contra macrófagos murinos não apresentando 132
citotoxicidade. Extrato etanólico de folhas de J. caroba não apresentaram toxicidade aguda oral in vivo em ratos Wistar (HERNANDES et al., 2014). Já Endringer e colaboradores (2010) realizaram experimentos com extratos de partes aéreas de J. caroba quanto a potencial atividade quimiopreventiva em bioensaios in vitro, correlacionando essa atividade a presença da mistura dos triterpenos ácido oleanóico e ácido ursólico. Não foi encontrado estudos relacionando J. cuspidifolia e atividade citotóxica em linhagens de células tumorais, apenas estudos relacionando a sua atividade antileishmania e antimicrobiana (ARRUDA et al., 2011; YUAN et al., 2017; AZMAN et al., 2018). Correlacionando os principais compostos fenólicos caracterizados nos extratos de folhas de J. caroba e J. cuspidifolia com atividades antitumorais observou-se que já há estudos recentes relacionando a atividade citotóxica dos compostos encontrados nessas espécies. Verbascosídeo e isoverbascosídeo mostraram ser potencialmente citotóxicos para várias linhagens de células tumorais (YANG; XUE; YANG, 2016; CHEIMONIDI et al., 2018). He e colaboradores (2011) sugeriram que os substituintes cafeoil no anel de glicose da estrutura destes feniletanoides, além do grupo ramnose, são cruciais para a citotoxicidade destes compostos. Na revisão realizada por Panche, Diwan e Chandra (2016) foi mencionado possíveis mecanismos de ação dos flavonoides na prevenção do câncer, incluindo atividade antioxidante e eliminação de radicais livres. Modulação do metabolismo carcinogênico, regulação da expressão gênica em oncogenes e genes supressores de tumor na proliferação celular. Diferenciação, indução de parada e apoptose do ciclo celular. Modulação das atividades enzimáticas na desintoxicação, oxidação e redução. Propriedades anti-inflamatórias, além de ação sobre outros possíveis alvos. Os flavonóis rutina (CELLS, 2018; IRITI et al., 2017) e isoquercitrina (AMADO et al., 2014; WU et al., 2017) e as flavonas apigenina (SHUKLA; GUPTA, 2010; YAN et al., 2017) e luteolina (LOPEZ-LAZARO, 2009; COOK, 2018) também apresentaram propriedades antitumorais podendo contribuir para essa atividade citotóxica apresentada pelos extratos do nosso estudo. Hashem e colaboradores (2011) relataram atividade citotóxica em várias linhagens celulares no extrato etanólico de Mayodendron igneum (pertencente à família Bignoniaceae) e coincidentemente foram isolados os flavonoides luteolina, apigenina, luteolina-7-O-glicose e apigenina-7-O-glicose sendo estes também 133
caracterizados no extrato de J. cuspidifolia do nosso estudo, conforme Tabela 10, pág. 127.
134
7 CONCLUSÃO
Através desta triagem fitoquímica preliminar comparativa em espécies do gênero Jacaranda ocorrentes no estado de Minas Gerais foi possível caracterizar os compostos fenólicos como metabólitos secundários presentes em todos os extratos, sendo que os feniletanoides verbascosídeo, isoverbascosídeo e o derivado do verbascosídeo de massa 780 Da; os flavonoides: quercetina, luteolina e apigenina com seus derivados glicosilados foram as substâncias mais detectadas nos diferentes extratos pela técnica de CLUE-FR- DAD-EM. Os constituintes não fenólicos também estão presentes nos diferentes extratos e alguns deles foram caracterizados pela técnica de CCD como sendo triterpenos, esteroides e saponinas, principalmente. A análise comparativa dos resultados cromatográficos obtidos para os diferentes extratos das espécies em estudo permitiu verificar que apesar de estarem presentes as mesmas classes de metabólitos secundários nestes extratos, os compostos fenólicos caracterizados apresentaram diferenças estruturais, entre e intra espécies, o que provavelmente impactou nas diferenças dos efeitos citotóxicos observados para os diferentes extratos. Mais estudos são necessários para comprovar o potencial antineoplásicos dos extratos de espécies do gênero Jacaranda e, como perspectiva futura, um fracionamento destes extratos etanólicos através da partição líquido-líquido por solventes orgânicos de polaridade crescente e isolamento de substâncias ativas pode ser o caminho a ser seguido. Os resultados obtidos, até o momento, sugerem que algumas espécies podem ser potenciais fontes de moléculas citotóxicas.
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151
APÊNDICE A
Equipamentos Autoclave (Stermax®) Balança eletrônica analítica (Shimadzu®, modelo AY220) Balança eletrônica analítica (Shimadzu®, modelo UX620H) Banho-maria (Fisotom®) Bomba a vácuo (Spellglass®) Bomba a vácuo (Biomec®) Botijão criogênico – Dewar (ABS Pecplan®) Cabine de segurança biológica - Câmara de fluxo de ar laminar estéril (Hipperquímica®) Cabine de segurança biológica - Câmara de fluxo de ar laminar estéril (SP1011-24®) Cabine de segurança biológica - Câmara de fluxo de ar laminar estéril (SP 5400117®) Câmara escura UV (Cienlab® Equipamentos Científicos, modelo CE-850) Capela de exaustão (Oxicamp®) Centrífuga refrigerada (HT®) Cromatógrafo líquido de alta eficiência, modalidade analítica, Waters®, equipado com injetor automático, mod. 2695; detector de arranjos de diodos (DAD), mod. 2996; bomba mod. L-6200A; integrador, mod. C-R4A. Cromatógrafo líquido de ultra eficiência, modalidade analítica, Waters®, acoplado ao detector DAD – varredura de 220-400 nm e detector de espectrometria de massas (EM) de captura de íons (Waters ACQUITY TQD Triple Quadrupole UPLC/MS/MS System). Deionizador de água Mili-Q (Merck® modelo Advantage A10) Microcentrífuga (HT®) Microondas (Philco®) Microscópio invertido (Motic® modelo AE 2000) Moinho de facas (MR®) Estufa para secagem de material (Deleo®) Estufa retilínea (Fanem Ltda®) ® Estufa incubadora com atmosfera de CO2 (Inco 2 Memmert ) Estufa ventilada (Nova Ética®) Evaporador rotatório R-205 (Buchi Brasil®) Freezer (Brastemp®) 152
Geladeira (Consul®) Lavadora ultrassônica (Unique®) Leitor de microplacas (Thermo Plate®) Pipetas automáticas (Eppendorf®) Soprador térmico (Skil®) Ultrassom (Mini-som Hornton Inpec®) Tubo de microcentrífuga (Eppendorf®)
Reagentes/Solventes Ácido acético glacial (Vetec®) Ácido fórmico (Vetec®) Ácido sulfúrico (Vetec®) Acetato de etila (Vetec®) Acetona (Proquímios®) Álcool etílico hidratado 92,8 GL (Emfal Ltda®) Clorofórmio (Cromato®) Diclorometano (Cromato®) Dimetilsufóxido (Dinâmica®) Hexano (Cromato®) Metanol (Dinâmica®) Sílica Gel 60 (Merck)
153
Soluções Reveladoras
➢Anisaldeído sulfúrico (AS)
Misturar 0,5 mL de anisaldeído com 10 mL de ácido acético glacial, seguido por 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado, nesta ordem. O reagente tem estabilidade limitada e não recomenda utilizá-lo se a coloração ficar vermelho/violeta. Borrifar aproximadamente 10 mL e aquecer a placa a 100º C por 5-10 min, então avaliar no visível e a UV365 nm.
➢Hidróxido de Potássio 10% (KOH – Reação de Bornträger)
Dissolver 10g de hidróxido de potássio PA em 100 mL de álcool etílico. Borrifar
10 mL na placa e avaliar no visível e em UV365 nm, com ou sem aquecimento.
Antraquinona gera cor vermelha, antrona amarela (UV365) e cumarina azul (UV365)
➢Produto Natural (NP) /Polietilenoglicol (PEG)
A placa é borrifada com 10 mL do revelador NP (preparado solubilizando 100 mg de ácido difenilbórico/ester etanolamina - difenilboriloxietilamina 98% - em 10 ml de metanol) seguida de 8,0 mL de PEG (preparado utilizando 40 mg de polietilenoglicol- 4000 em 8 mL de etanol). Intensa fluorescência é produzida imediatamente em UV 365 nm. PEG aumenta a sensibilidade.
➢Reagente de Dragendorff (DRG)
Dissolve-se 0,85 g de nitrato de bismuto (III) – Bi(NO3)3 – em 40 mL de água destilada. Adiciona-se 10 mL de ácido acético glacial, seguida pela adição de 8g de iodeto de potássio – KI – dissolvido em 20mL de água.
➢Reagente de Kedde (SBF, 2018) http://www.sbfgnosia.org.br/Ensino/drogas_cardioativas.html
Misturar 4 mL de solução metanólica de ácido 3,5-dinitrobenzóico a 2% (solução recente) a 6 mL de solução metanólica de KOH 1N. (Preparar na hora). Borrifar de 5-8 mL na placa e avaliar no visível e observar a coloração. Positivo se apresentar uma cor de castanho avermelhado a vermelho violeta.
154
➢Reagente de Liebermann-Buchard (LB)
5,0 mL de anidrido acético e 5,0 mL de ácido sulfúrico concentrado são adicionados cuidadosamente em 50 mL de etanol absoluto, sendo resfriado em banho de gelo. O reagente deve ser preparado fresco. Após borrifar na placa aquecer por 5-10 min e então avaliar em UV365 nm.
Meio de cultura celular Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 (Sigma Chemical Company) em água ultrapura Para cada 1,0 L de meio: 10,40 g de meio RPMI
2,0 g de NaHCO3 - bicarbonato de sódio (Grupo Química Indústria Ltda) 20 mL de penicilina 5000 Unidades/mL (Gibco) 20 mL de estreptomicina 5000 µg/mL (Gibco) 1 mL de Anfotericina B (União Química) Esterilizado por filtração através de membranas de 0,22 μm de porosidade, pressão positiva (Micro Filtration Systems).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose (Gibco) em água ultrapura Para cada 1,0 L de meio: 13,4 g de meio DMEM HG
3,7 g de NaHCO3 - bicarbonato de sódio (Grupo Química Indústria Ltda) 20 mL de penicilina 5000 Unidades/mL (Gibco) 20 mL de estreptomicina 5000 µg/mL (Gibco) 1 mL de Anfotericina B (União Química) Esterilizado por filtração através de membranas de 0,22 μm de porosidade, pressão positiva (Micro Filtration Systems).
Soro Fetal Bovino (SFB) (Vitrocell) Inativado a 56 °C por 30 minutos e esterilizado por filtração através de membranas de 0,22 μm de porosidade (Micro Filtration Systems). 155
Tampão fosfato (PBS) em água ultrapura Para cada 1,0 L de solução:
1,44 g de fosfato de sódio dibásico PA. (Na2HPO4) (Synth)
0,24 g de fosfato de potássio monobásico PA. (KH2PO4) (Synth) 8,0 g de Cloreto de Sódio PA (NaCl) (Synth) 0,2 g de Cloreto de Potássio PA (KCl) (Synth) Esterilizado em autoclave, a 121 °C, por 20 minutos.
Outros reagentes - Solução de Tripsina EDTA a 0,250 % v/v (Sigma Aldrich)
- Solução do sal de tetrazólio MTT (Brometo de 3-(4’,5’-dimetiltiazol-2’-ila)-2,5- difeniltetrazol) (Sigma Chemical Company).