STENIO EDER VITTORAZZI CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MOLECULAR DO DNAr 5S E SUA FORMA VARIANTE DE DNA SATÉLITE EM ESPÉCIES DO GRUPO DE Physalaemus cuvieri (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) CYTOGENETIC AND MOLECULAR ANALYSIS OF THE 5S rDNA AND ITS VARIANT FORM OF SATELLITE DNA IN Physalaemus cuvieri SPECIES GROUP (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) Campinas, 2014 ii iii iv v vi Dedico esse trabalho aos meus pais, Jonas e Lourdes. vii viii Agradecimentos Aos meus pais, Jonas José Vittorazzi e Lourdes Primcka Vittorazzi, que por uma vida de dedicação, amor e trabalho sempre me possibilitaram a oportunidade de realizar sonhos e conquistas. À Professora Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel, por sua orientação e confiança na minha trajetória acadêmica, fundamentalmente por acreditar no meu potencial. À minha coorientadora Professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço, por toda sua dedicação, profissionalismo e competência ao guiar minha formação acadêmica. Sinto-me imensamente privilegiado em ter sido seu aluno. Ao meu irmão, Stony Eduardo Vittorazzi, minha cunhada Carla Mariane Yamamoto e minha adorável sobrinha Lavinia Yamamoto Vittorazzi. À minha querida tia Maria Dolores Aragão Primcka, por todo seu carinho, dedicação e conselhos. A todos meus amigos que estiveram presentes em algum momento da minha morada em Campinas. Em especial, agradeço ao Marco Antônio Garcia por sua paciência, conselhos e risadas que foram essencialmente importantes para mim. À minha amiga Gisele Orlandi Introíni e sua mãe D. Maria do Carmo, pelos seus conselhos e pela amizade da forma mais simples e doce. Aos amigos que fiz dentro do Laboratório de Estudos Cromossômicos, Ana Cristina, Alessandra Costa, Cíntia Targueta, Daniel Bruschi, Débora Rodrigues, Juliana Nascimento, Júlio Sergio, Kaleb Gatto, Karin Seger e William Costa. Em especial, aos grandes, queridos e conselheiros, Maurício Papa de Arruda, Maria Madalena Rodrigues e Lenita de Freitas Tallarico. Aos Professores Dr. Diogo C. Cabral-de-Mello, Dra. Ana Cristina P. Veiga- Menoncello e Dra. Ana Paula Z. S. de Pietri, por terem participado do meu exame de qualificação e contribuído para melhoria da minha tese. Pelo apoio financeiro das Instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e à Extensão – Faepex. À todos meu muito obrigado! ix x SUMÁRIO I. Resumo.........................................................................................................................vii II. Abstract.......................................................................................................................xiv III. Introdução....................................................................................................................01 IV. Referencial Teórico.....................................................................................................03 1. DNAs ribossomais.........................................................................................................03 1.2 DNA ribossomal 5S......................................................................................................04 2. DNA satélite..................................................................................................................07 3. Relação do DNA satélite com DNA ribossomal...........................................................10 4. Posição taxonômica e citogenética do grupo de Physalaemus cuvieri............................................................................................................................11 V. Objetivos......................................................................................................................15 VI. Referências Bibliográficas..........................................................................................16 VII. Capítulo I Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs...............................................................................................................................23 1. Abstract.........................................................................................................................25 2. Background...................................................................................................................26 3. Methods.........................................................................................................................29 4. Results...........................................................................................................................34 5. Discussion.....................................................................................................................38 6. Conclusion.....................................................................................................................43 7. References.....................................................................................................................44 VIII. Capítulo II Diversidade do DNAr 5S em Leiuperinae (Anura).......................................................59 1. Resumo..........................................................................................................................61 2. Introdução......................................................................................................................62 3. Material e Métodos........................................................................................................65 4. Resultados.....................................................................................................................69 5. Discussão.......................................................................................................................73 6. Conclusão......................................................................................................................77 7. Referências....................................................................................................................78 IX. Capítulo III Cariótipos e Mapeamento de DNA satélite em Physalaemus kroyeri e P. cicada (Anura, Leptodactylidae)..............................................................................................93 1. Resumo..........................................................................................................................94 2. Introdução......................................................................................................................95 3. Material e Métodos........................................................................................................97 4. Resultados...................................................................................................................101 5. Discussão.....................................................................................................................103 6. Conclusão....................................................................................................................107 7. Referências..................................................................................................................108 X. Considerações Finais.................................................................................................111 XI. Apêndice.....................................................................................................................119 xi xii I. RESUMO Os genomas dos eucariotos são ricos em sequências repetitivas, as quais compreendem sequências dispersas e em tandem. Entre as sequências em tandem, incluem-se os DNA satélites, os DNA ribossomais e cópias parálogas. Os DNA satélites são os principais constituintes da heterocromatina constitutiva e os genes ribossomais transcrevem os RNAr para compor os ribossomos, que dividem-se em duas famílias, DNAr 45S e 5S. Em um mesmo organismo, diferentes tipos de DNAr 5S já foram reconhecidos, mostrando a existência de uma diversidade quanto a esse tipo de sequência. No anuro Physalaemus cuvieri, uma forma de DNA satélite denominada PcP190 foi caracterizada e teve sua origem atribuída a uma derivação do DNAr 5S em uma espécie ancestral. Em diferentes populações de P. cuvieri estudadas previamente com as ferramentas da citogenética convencional, uma acentuada variação interpopulacional nos cromossomos portadores da NOR pôde ser observada, e nas demais espécies do grupo de P. cuvieri, peculiaridades interespecíficas foram evidenciadas, porém, os cariótipos entre essas espécies são muito semelhantes. O objetivo nessa tese foi ampliar o estudo citogenético de espécies do grupo de P. cuvieri que possuíam carência na descrição cromossômica, como P. kroyeri e P. cicada. Objetivou-se também analisar o DNA satélite PcP190 em nível cromossômico e molecular, assim como estudar a organização molecular e a diversidade de sequências do DNAr 5S no genoma das espécies de Physalaemus e espécies de gêneros relacionados. Com os resultados da pesquisa, três capítulos são apresentados, sendo eles: (i) “Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs”, o qual mostra que o DNA satélite PcP190 é amplamente conservado e pode ser reconhecido em representantes de duas famílias de anuros, Leptodactylidae e Hylodidae; além disso, mostra também que essas sequências são altamente dinâmicas nos cromossomos das espécies do grupo de P. cuvieri. (ii) “Diversidade do DNAr 5S