Stenio Eder Vittorazzi

STENIO EDER VITTORAZZI

CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA E MOLECULAR DO DNAr 5S E SUA FORMA VARIANTE DE DNA SATÉLITE EM ESPÉCIES DO GRUPO DE Physalaemus cuvieri (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)

CYTOGENETIC AND MOLECULAR ANALYSIS OF THE 5S rDNA AND ITS VARIANT FORM OF SATELLITE DNA IN Physalaemus cuvieri SPECIES GROUP (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)

Campinas, 2014

iii

Dedico esse trabalho aos meus pais, Jonas e Lourdes.

vii

viii

Agradecimentos Aos meus pais, Jonas José Vittorazzi e Lourdes Primcka Vittorazzi, que por uma vida de dedicação, amor e trabalho sempre me possibilitaram a oportunidade de realizar sonhos e conquistas. À Professora Dra. Shirlei Maria Recco-Pimentel, por sua orientação e confiança na minha trajetória acadêmica, fundamentalmente por acreditar no meu potencial. À minha coorientadora Professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço, por toda sua dedicação, profissionalismo e competência ao guiar minha formação acadêmica. Sinto-me imensamente privilegiado em ter sido seu aluno. Ao meu irmão, Stony Eduardo Vittorazzi, minha cunhada Carla Mariane Yamamoto e minha adorável sobrinha Lavinia Yamamoto Vittorazzi. À minha querida tia Maria Dolores Aragão Primcka, por todo seu carinho, dedicação e conselhos. A todos meus amigos que estiveram presentes em algum momento da minha morada em Campinas. Em especial, agradeço ao Marco Antônio Garcia por sua paciência, conselhos e risadas que foram essencialmente importantes para mim. À minha amiga Gisele Orlandi Introíni e sua mãe D. Maria do Carmo, pelos seus conselhos e pela amizade da forma mais simples e doce. Aos amigos que fiz dentro do Laboratório de Estudos Cromossômicos, Ana Cristina, Alessandra Costa, Cíntia Targueta, Daniel Bruschi, Débora Rodrigues, Juliana Nascimento, Júlio Sergio, Kaleb Gatto, Karin Seger e William Costa. Em especial, aos grandes, queridos e conselheiros, Maurício Papa de Arruda, Maria Madalena Rodrigues e Lenita de Freitas Tallarico. Aos Professores Dr. Diogo C. Cabral-de-Mello, Dra. Ana Cristina P. Veiga- Menoncello e Dra. Ana Paula Z. S. de Pietri, por terem participado do meu exame de qualificação e contribuído para melhoria da minha tese. Pelo apoio financeiro das Instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP e ao Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e à Extensão – Faepex. À todos meu muito obrigado!

SUMÁRIO

I. Resumo...... vii II. Abstract...... xiv III. Introdução...... 01 IV. Referencial Teórico...... 03 1. DNAs ribossomais...... 03 1.2 DNA ribossomal 5S...... 04 2. DNA satélite...... 07 3. Relação do DNA satélite com DNA ribossomal...... 10 4. Posição taxonômica e citogenética do grupo de Physalaemus cuvieri...... 11 V. Objetivos...... 15 VI. Referências Bibliográficas...... 16 VII. Capítulo I Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs...... 23 1. Abstract...... 25 2. Background...... 26 3. Methods...... 29 4. Results...... 34 5. Discussion...... 38 6. Conclusion...... 43 7. References...... 44 VIII. Capítulo II Diversidade do DNAr 5S em Leiuperinae (Anura)...... 59 1. Resumo...... 61 2. Introdução...... 62 3. Material e Métodos...... 65 4. Resultados...... 69 5. Discussão...... 73 6. Conclusão...... 77 7. Referências...... 78 IX. Capítulo III Cariótipos e Mapeamento de DNA satélite em Physalaemus kroyeri e P. cicada (Anura, Leptodactylidae)...... 93 1. Resumo...... 94 2. Introdução...... 95 3. Material e Métodos...... 97 4. Resultados...... 101 5. Discussão...... 103 6. Conclusão...... 107 7. Referências...... 108 X. Considerações Finais...... 111 XI. Apêndice...... 119

xii

I. RESUMO Os genomas dos eucariotos são ricos em sequências repetitivas, as quais compreendem sequências dispersas e em tandem. Entre as sequências em tandem, incluem-se os DNA satélites, os DNA ribossomais e cópias parálogas. Os DNA satélites são os principais constituintes da heterocromatina constitutiva e os genes ribossomais transcrevem os RNAr para compor os ribossomos, que dividem-se em duas famílias, DNAr 45S e 5S. Em um mesmo organismo, diferentes tipos de DNAr 5S já foram reconhecidos, mostrando a existência de uma diversidade quanto a esse tipo de sequência. No anuro Physalaemus cuvieri, uma forma de DNA satélite denominada PcP190 foi caracterizada e teve sua origem atribuída a uma derivação do DNAr 5S em uma espécie ancestral. Em diferentes populações de P. cuvieri estudadas previamente com as ferramentas da citogenética convencional, uma acentuada variação interpopulacional nos cromossomos portadores da NOR pôde ser observada, e nas demais espécies do grupo de P. cuvieri, peculiaridades interespecíficas foram evidenciadas, porém, os cariótipos entre essas espécies são muito semelhantes. O objetivo nessa tese foi ampliar o estudo citogenético de espécies do grupo de P. cuvieri que possuíam carência na descrição cromossômica, como P. kroyeri e P. cicada. Objetivou-se também analisar o DNA satélite PcP190 em nível cromossômico e molecular, assim como estudar a organização molecular e a diversidade de sequências do DNAr 5S no genoma das espécies de Physalaemus e espécies de gêneros relacionados. Com os resultados da pesquisa, três capítulos são apresentados, sendo eles: (i) “Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs”, o qual mostra que o DNA satélite PcP190 é amplamente conservado e pode ser reconhecido em representantes de duas famílias de anuros, Leptodactylidae e Hylodidae; além disso, mostra também que essas sequências são altamente dinâmicas nos cromossomos das espécies do grupo de P. cuvieri. (ii) “Diversidade do DNAr 5S em Leiuperinae (Anura)”, os resultados mostram que no genoma desses anuros existe uma diversidade dessa classe de família multigênica maior do que proposto até então, e que essas sequências do DNAr 5S permanecem conservadas desde a divergência evolutiva entre os Actinopterigio e Sarcopterigio. (iii) “Cariótipo e mapeamento de DNA repetitivo em Physalaemus kroyeri e P. cicada (Anura Leptodactylidae)”, onde é apresentado que a banda 5p de P. kroyeri tem se mostrado um bom marcador cromossômico para as espécies do grupo de P. cuvieri, o que indica se tratar de uma sinapomorfia cromossômica. Contrariamente, a

xiii ausência dessa banda 5p em P. cicada não fornece evidência para a inclusão de P. cicada no grupo de P. cuvieri ou em qualquer outro grupo de espécies.

xiv

II. ABSTRACT The genomes of eukaryotic organisms are rich in repetitive DNA sequences, which can be dispersed or arrayed in tandem. The tandem repeat sequences include the satellite DNA, the ribosomal DNA, and paralogous copies. Satellite DNA is the main component of constitutive heterochromatin, while the ribosomal genes encode the rRNAs that make up the ribosomes; they are divided into two families, the 45S and 5S rRNA. Different types of 5S rDNA have been identified in a single organism, proving that there is diversity in this type of DNA sequence. In the anuran Physalaemus cuvieri, a satellite DNA family called PcP190 has been identified, which is thought to have derived from the 5S rDNA of an ancestor species. In different populations of P. cuvieri that were previously studied with conventional cytogenetic tools, an accentuated interpopulational variation among chromosomes harboring the NOR was observed, while in other species of the P. cuvieri group, interspecific traits were found. However, the karyotypes in these species are very similar. The aim of this thesis was to expand the cytogenetic studies on P. cuvieri species that needed further chromosomal description, such as P. kroyeri and P. cicada. Another objective was to analyze the PcP190 satellite DNA at the chromosomal and molecular level, as well as to study the molecular organization and the diversity of 5S rDNA sequences in the genomes of the Physalaemus species and other species of related genera. We present three chapters as a result of this research: (i) “Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in frogs,” which demonstrates that the PcP190 satellite DNA is widely conserved and was recognized in representatives of two anurans families, Leptodactylidae and Hylodidae. Moreover, it also demonstrates that these sequences are highly dynamic within the chromosomes of the P. cuvieri species group. (ii) “5S rDNA in Leiuperinae (Anura): new insights on its evolution.” The results show that in the genomes of these anurans there is wider diversity among this multigenic family than previously assumed and that these 5S rDNA sequences have remained conserved since the evolutionary divergence of Actinopterygii and Sarcopterygii. (iii) “Karyotype and repetitive DNA mapping of the Physalaemus kroyeri and P. cicada (Anura Leptodactylidae),” which demonstrates that the 5p chromosomal band of P. kroyeri is a good chromosomal marker for species from the P. cuvieri group, indicating that it is a chromosomal synapomorphy. Conversely, the absence of this 5p band in P. cicada does not

xv provide evidence for the inclusion of this species in the P. cuvieri group or any other species group.

xvi

III. INTRODUÇÃO Historicamente, análises dos sistemas biológicos têm sido realizadas em diversas áreas. Mais recentemente, a revolução genômica junto aos aparatos biotecnológicos lançou a biologia molecular em uma esfera de aplicações que podem e são associadas com diferentes linhas de pesquisa, e de tal forma contribuem potencializando os avanços no campo das ciências biológicas. Como uma dessas áreas, a citogenética, que tem como foco o estudo evolutivo, citotaxonômico, clínico, dentre outros, obteve um significativo avanço impulsionado por sua associação à biologia molecular. Essa associação ocorreu pela primeira vez em 1969, quando Gall e Pardue hibridaram in situ DNA–RNA para localizar os genes que codificam o RNA ribossomal, mas só atualmente ela tem se manifestado de maneira expressiva, o que justifica o momento atual ser referido como a era da citogenética molecular (Speicher e Carter, 2005) ou, com mesmo sentido, a era da citogenômica, que constitui uma encruzilhada científica que conta com uma abordagem combinada de ferramentas convencionais (bandamentos cromossômicos) e moleculares (pintura cromossômica, mapeamento gênico e sequenciamento) (Dobigny e Yang, 2008). Assim, com o desenvolvimento dessas técnicas moleculares, tem ocorrido uma revolução nos conhecimentos acerca da complexa estrutura do material genético, originando rapidamente muitos novos conceitos relativos à sequências repetitivas nos genomas eucariotos (Watson et al., 2009) que são formados por uma grande quantidade de DNA que vai além do necessário para codificar proteínas (Slamovits e Rossi, 2002). Uma quantidade substancial de DNA nesses genomas é garantida pela presença de DNA repetitivo, que inclui sequências altamente repetitivas (DNA satélite) e as moderadamente repetitivas (minissatélite, microssatélite e elementos transponíveis) (Charlesworth et al., 1994). Além dessas, outra forma de DNA repetitivo que também contribui no volume de DNA nesses organismos são as famílias multigênicas, como as dos genes que codificam histonas, hemoglobinas, actinas, RNA transportadores e RNA ribossomais (Nei e Rooney, 2005). Estudos com anfíbios envolvendo a abordagem supracitada são escassos na literatura e, com o intuito de contribuir nesse contexto, temos realizado a investigação citogenômica de anuros pertencentes ao gênero Physalaemus, com foco principalmente naquelas pertencentes ao grupo de P. cuvieri. As espécies desse grupo mostram-se como um modelo interessante para

1 estudos citogenéticos por serem morfologicamente muito semelhantes, o que dificulta a identificação taxonômica (ver Apêndice 1). E ainda, apresentam os cariótipos bastante conservados em número e morfologia cromossômica, mas com uma variação acentuada em relação aos cromossomos portadores das Regiões Organizadoras de Nucléolo - NOR (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009; Nascimento et al., 2010; Vittorazzi et al., 2014). Além disso, as espécies P. cicada e P. kroyeri possuem apenas informação quanto ao número e morfologia cromossômica (De Lucca et al., 1974), e P. erikae e P. fischeri não se tem nenhum dado citogenético. Assim, essas espécies tornam-se interessantes alvos para análise citogenética clássica e a aplicação de ferramentas moleculares no âmbito da citogenética, nessas e em outras espécies do grupo, poderá contribuir no entendimento dos mecanismos de evolução cariotípica no gênero Physalaemus. Recentemente, foram isoladas e detectadas in situ nos cromossomos de P. cuvieri dois tipos de DNA ribossomal (DNAr) 5S, além de um DNA satélite derivado do DNAr 5S (Vittorazzi et al., 2011). A análise comparativa dessas sequências e a detecção cromossômica nas demais espécies do grupo de P. cuvieri poderá fornecer informações importantes sobre os mecanismos de evolução cariotípica nesse grupo de espécies.

IV. REFERENCIAL TEÓRICO 1. DNAs ribossomais O ribossomo é um complexo ribonucleoproteico que participa da síntese proteica em todas as células, o qual trabalha juntamente com um RNA mensageiro (RNAm) e RNAs transportadores (RNAt), entre outros componentes, na produção de polipeptídios. O ribossomo é formado por duas subunidades, as quais possuem distintas funções, sendo a menor o sítio de interação entre RNAm e RNAt e a maior o sítio catalítico de formação do peptídeo (Garrett, 1999). Essas subunidades se diferenciam quanto a sua composição estrutural, sendo 50S e 30S em organismos procarióticos e 60S e 40S nos organismos eucarióticos. Esses números são definidos pelo coeficiente de sedimentação da estrutura em um soluto, caracterizados por unidades de Svedberg (para referências, ver revisões de Schmeing e Ramakrishnan, 2009; Garrett, 1999). Duas classes de DNAr podem ser reconhecidas nos eucariotos, uma que transcreve RNAr 45S (ou 40S), e outra transcreve o RNAr 5S. Na maioria dos eucariotos superiores, a unidade de transcrição do DNAr 45S (ou 40S) é formada por subunidades 18S, 5,8S e 28S, intercalados por dois segmentos transcritos (ITS: internal transcribed spacers), e ainda uma sequência externa transcrita (ETS: external transcribed spacer) que antecede o gene 18S. Sequências espaçadoras não transcritas separam as unidades repetitivas 45S (ou 40S) e são denominadas IGS (intergenic spacer). O RNAr 18S após processado faz parte da subunidade menor do ribossomo. Já os RNAr 28S e 5,8S fazem parte da subunidade maior do ribossomo, juntamente com o RNAr 5S, que é transcrito pelo DNAr 5S (para referências, ver revisões de Long e Dawid, 1980; Kupriyanova, 2000; Torres-Machorro et al., 2010). Em eucariotos superiores, os DNAr 5S podem ocupar regiões adjacentes às NORs ou não, mas também se organizam de maneira repetitiva em tandem e as regiões codificadoras são separadas por espaçadores não transcritos (NTS) (revisões de Long e Dawid, 1980; Kupriyanova, 2000). No entanto, isso não é uma regra geral para eucariotos superiores, pois há relatos da ligação do 5S na mesma unidade de transcrição dos demais DNAr, como é visto em alguns nematóides e artrópodes, como também pode estar ligado a outras famílias multigênicas, como nos trans-spliced de nematóides e genes de histonas de crustáceos (revisões de Drowin e Sá, 1995; e Vierna et al, 2013). De qualquer maneira, o distanciamento entre os DNAr 45S (ou 40S) e o DNAr 5S está relacionado ao fato de que o promotor de

3 transcrição do primeiro é reconhecido pela RNA polimerase I, enquanto o promotor de transcrição do gene 5S, pela RNA polimerase III, implicando assim uma independência transcricional (Drouin e Sá, 1995). Os genes ribossomais são repetitivos em praticamente todos os eucariotos estudados até então, entretanto é consideravelmente variável o número de cópias existentes em cada organismo. O DNAr 45S, em alguns protozoários, por exemplo, está presente em quatro cópias, como no Plasmodium berghei e em cerca de 9.000 em Tetrahymena thermophila, e o DNAr 5S possui seis cópias em Cryptosporidium parvium e cerca de um milhão de cópias em Euplotes eurystomus. Também é interessante relatar que os DNAr 45S e 5S podem ou não apresentar equivalência quanto ao número de cópias. Em Taxoplasma gondii há cerca de 110 para ambos os tipos de DNAr, já em Trypanosoma brucei esse número é bem discrepante, ocorrendo cerca de 56 cópias do DNAr 45S e 1500 do DNAr 5S. Essa considerável variabilidade dos DNAr em diferentes espécies sugere que exista um mecanismo peculiar de regulação para a manutenção homeostática na biossíntese dos ribossomos (revisão de Torres-Machorro et al., 2010). Em muitos organismos o número de cópias de DNAr não está diretamente relacionado à síntese de RNAr, uma vez que nem todo ele é transcrito, e assim propõe-se que seu papel vai além de sua transcrição, como a manutenção da estrutura nucleolar e estabilidade do DNAr (Raska et al., 2004). As regiões cromossômicas portadoras de genes ribossomais 45S (NORs) e 5S têm sido amplamente usadas como marcadores citogenéticos em estudos de diferentes grupos de animais e de plantas, auxiliando em análises evolutivas e comparações filogenéticas, entre outras (Busin et al., 2000; Lourenço et al., 2003; Ferreira et al., 2007; Lourenço et al., 2008; Torres- Machorro et al., 2009; Cabral-de-Mello et al., 2011; Roa e Guerra 2012; Rodrigues et al., 2012; Rebordinos et al., 2013). No entanto, as sequências de DNAr 5S têm sido pouco estudadas em anuros e raramente são utilizadas como marcadores cromossômicos.

1.2 DNA ribossomal 5S A RNA polimerase III transcreve uma variedade de genes os quais possuem características comuns entre si, sendo RNAs estruturais ou catalíticos e em regra menores que 400 pares de bases (Schramm e Hernandez, 2002). A região gênica codificadora do RNAr 5S possui ~120 pares de bases altamente conservadas até mesmo em táxons distantes

4 evolutivamente (Long e Dawid, 1980; Schramm e Hernandez, 2002; Martins e Galetti, 2001a,b; Torres-Machorro et al., 2010). A região promotora da transcrição dos DNAr 5S pode ser localizada downstream e/ou upstream do gene. Em alguns organismos, como no anfíbio Xenopus laevis, essa região é apenas intragênica, e consiste de um box A, um elemento intermediário (IE) e um box C atuando juntos no controle da transcrição (Pieler et al., 1985). Essas regiões são conservadas em diferentes espécies (revisões de Schramm e Hernandez, 2002; Torres-Machorro et al., 2010). Nos vertebrados, tem sido descrita a existência de diferentes tipos de DNAr 5S, os quais se diferenciam principalmente pela detecção em cromossomos distintos e pelo tamanho do NTS, o qual possui duas formas mais comuns, o maior com algumas centenas de bases e o NTS menor com cerca de 80 pb (Martins e Galetti, 2001a,b; Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012; Merlo et al., 2013), entretanto, em peixes já se observou a presença de NTS com ~60 pares de bases (Martins e Galetti, 2001b; Fujiwara et al., 2009) sendo esse número, aparentemente, o mínimo de bases para sua organização e atividade (Martins e Galetti, 2001b). A dinâmica e a variabilidade das sequências de genes ribossomais 5S têm sido baseadas em dois mecanismos evolutivos. Um deles é o chamado concerted evolution, pelo qual as cópias gênicas evoluem conjuntamente sofrendo homogeneização, e o segundo é o birth-and- death evolution, em que novas cópias são criadas por eventos de duplicação, sendo que algumas cópias são mantidas e outras são eliminadas ou tornam-se não funcionais. Esse modelo prevê, portanto, o surgimento de cópias parálogas, que contribuem no aumento da diversidade intragenômica de genes ribossomais (Nei e Roney, 2005). Contudo, tem sido proposto que, tanto concerted evolution quanto birth-and-death evolution podem atuar conjuntamente na diversidade genética da família multigênica de DNAr 5S (Freire et al., 2010; Eirín-López et al., 2012). Em anfíbios, pouca informação acerca dos genes ribossomais 5S está disponível. Em espécies de Xenopus, duas subclasses de DNAr 5S foram detectadas, designadas como tipo somático para aqueles expressos em células somáticas e oócitos, e o tipo oocítico expresso apenas em oócitos. Além disso, há variação no tamanho dessas sequências e também apresentaram distinta localização cromossômica (Brown e Sugimoto, 1973; Harper et al., 1983).

Em outros anuros, utilizando hibridação in situ com detecção radioativa, Vitelli et al. (1982) localizaram os genes 5S nos cromossomos das espécies Ascaphus truei, Alytes obstetricans, Nyctixalus pictus (antes denominado Disclogossus pictus), Bombina variegata, Rana temporaria (antes denominada Rana esculenta), Rana kobai (antes denominada Rana castebeiana), Rana graeca e Rana temporaria. Os autores verificaram que nessas espécies o número de lócus de DNAr 5S varia de 1 a 6, podendo estar em posições intercalares, proximal aos telômeros e/ou centrômeros. Assim, juntamente com outros dados levantados, puderam propor a origem dos cromossomos metacêntricos grandes através de fusão cêntrica seguida de inversão pericêntrica ou fusões adicionais com cromossomos acrocêntricos (Vitelli et al., 1982). Schmid et al. (1987), analisando algumas das espécies analisadas por Vitelli et al. (1982), sendo elas, Ascaphus truei, Alytes obstetricans, Bombina variegata e Nyctixalus pictus, puderam chegar à mesma conclusão apresentada previamente pelos outros autores, a qual consiste em que nessas espécies os lócus da NOR é restrito a apenas um par de homólogos, já o DNAr 5S está presente de forma mais ampla, variando entre 1 a 6 lócus (Vitelli et al., 1982; Schmid et al., 1987). Em outra análise, LiYan et al. (2013) detectaram sítios de DNAr 5S em cariótipos de diferentes populações de Quasipaa boulengeri (Ranidae), onde foi possível constatar uma variação interpopulacional que consiste na detecção do par 1 todas as populações estudadas, porém, em duas delas, o par 5 também foi evidenciado com sinal fraco de hibridação. Os autores sugeriram com esses dados que provavelmente o par 1 seja a condição ancestral desse DNAr 5S, enquanto o par 5 seja a condição derivada (LiYan et al., 2013). Nos anuros da família Leptodactylidae, foram detectados em Physalaemus cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), Engystomops petersi e Engystomops freibergi (Rodrigues et al., 2012) dois tipos de DNAr 5S (I e II), os quais foram detectados em cromossomos distintos nos mesmos cariótipos e ambos os tipos estão presentes em cromossomos homeólogos nas três espécies. Além disso, não estão em sintenia com os cromossomos portadores da NOR. Na análise comparativa das sequências do DNAr 5S, foi verificado que cada tipo possui maior similaridade entre si, mesmo entre as três espécies, do que entre tipos diferentes da mesma espécie (Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012).

2. DNA satélite A maioria dos organismos eucariotos possuem longas matrizes ininterruptas nas regiões heterocromáticas formadas por sequências de DNA repetitivas em tandem (Charlesworth et al., 1994; Ugarkovic e Plohl, 2002; Slamovits e Rossi, 2002). Essas sequências são divididas em três classes distintas, caracterizadas pelo comprimento e pelo número das repetições presentes nessas matrizes. Repetições de 1 a 5 pares de bases caracterizam os microssatélites e de até 100 pares de bases, os minissatélites. Em ambas as classes, as repetições ocorrem entre 10 e 100 vezes. Já os DNA satélites possuem sequências que se repetem milhares de vezes no genoma e que variam em tamanho, apresentando de centenas a milhares de nucleotídeos (Slamovits e Rossi, 2002). Embora presentes em praticamente todos os organismos eucariotos, as sequências de DNA satélite não são conservadas, sendo muitas vezes específicas para algumas espécies, sugerindo assim que os DNA satélites originaram-se a partir de diferentes sequências de DNA (Slamovits e Rossi, 2002; Tsoumani et al., 2013). No entanto, a mesma sequência também pode estar presente em espécies evolutivamente próximas (Singer, 1982; Slamovits e Rossi, 2002; Martinsen et al., 2009; Cazaux et al., 2013). Uma vez originados, os DNA satélites estão constantemente num processo evolutivo dinâmico que ocorre em nível molecular e que acarreta mudanças de dois parâmetros, o número de cópias e a composição nucleotídica. Essas mudanças podem afetar sequências individuais ou conjuntos de sequências e podem levar à origem de perfis de DNA satélite espécie-específicos. Em alguns casos, essas mudanças podem ser correlacionadas com a evolução cromossômica e possivelmente influenciar na evolução das espécies (Ugarkovic e Plohl, 2002). A quantidade de DNA satélite pode variar entre espécies, chegando até a 60% em alguns organismos (Rouleux-Bonnin et al., 1996). Em um mesmo organismo podem coexistir diferentes tipos de DNA satélite, mas isso não lhes dá um padrão semelhante na composição das sequências, comprimento dos monômeros, complexidade e taxa evolucionária, pois além de originarem-se por diferentes formas, podem estar também em diferentes estágios evolucionários em sua história (Slamovits e Rossi, 2002; Plohl 2010). Um mesmo tipo de DNA satélite pode ser encontrado tanto em cromossomos homólogos como em cromossomos não homólogos (Canapa et al., 2002; Abel et al., 2006; Martins et al., 2006). A explicação para tal fato é que essas sequências repetitivas passam por um processo de recombinação entre

7 cromossomos não homólogos, o que acarreta a homogeneização de tais sequências no genoma, processo conhecido como concerted evolution (Dover, 1986). O princípio de concerted evolution baseia-se em diferentes mecanismos de transferência não recíproca intra e inter cromossômica, tais como o crossing over desigual, conversão gênica, transposição replicativa (Dover, 1982, 1986, 2002). Contudo, os mecanismos evolutivos das sequências de DNA satélites são conduzidos por processos estocásticos, os quais dependem da estrutura genética da população que se encontram (Caraballo et al., 2010). Entretanto, para alguns casos é proposta a existência de pressão seletiva nas sequências de DNA satélite (Plohl et al., 1990; Ugarkovic et al., 1996; Mravinac et al., 2005; Meštrović et al., 2006). As sequências de DNA satélites possuem uma contínua origem, amplificação, eliminação e substituição em suas famílias, sendo os eventos mais comuns associados a elas são as substituições de bases, já deleções e inserções são mais raras (Ugarkovic e Plohl, 2002). Essas substituições de bases causam variação intraespecífica na mesma família de DNA satélite. A taxa de variação nucleotídica entre os diferentes monômeros de um determinado DNA satélite varia de um organismo para outro, mas geralmente está em torno de 15%, mas em raros casos, como o alpha-satélite (presente em Primatas), pode ser de cerca de 30% (revisão de Plohl et al., 2008). A variabilidade das sequências de uma mesma família de DNA satélite pode estar relacionada também à sua posição no genoma, pois como relatado em humano, em um mesmo organismo há evidências de maior variação de sequências satélites presentes em regiões pericentroméricas quando comparadas às de regiões centroméricas. Esse fato é explicado pela baixa taxa de homogeneização nas regiões pericentroméricas, o que leva ao acúmulo de diferenças entre as sequências satélites da mesma família. Embora possam ocorrer mutações na mesma frequência para ambas às regiões, nos centrômeros elas se homogeneízam mais rapidamente propagando as modificações ocorridas nas demais sequências dessa mesma região (Bassi et al., 2000). Outra interessante característica da dinâmica evolutiva dos DNA satélites é a presença de higher-order repeats (HOR), o qual consiste de uma sequência com subunidades do mesmo DNA satélite, mas cada um com características que os distinguem entre si. Portanto, comparando duas HOR da mesma família de DNA satélite é possível ter alto nível de

8 identidade, porém, comparações entre subunidades da mesma HOR se nota maior divergência (Revisão de Plohl et al., 2008). Como exemplo, podemos citar o alpha-satélite humano, que apresenta cerca de 100% de identidade entre as HOR, enquanto a similaridade entre as subunidades dentro da mesma HOR ficam em torno de 70% (Roizes, 2006). Outro exemplo, Drosophila serido apresenta uma média de 90% de identidade entre três monômeros da mesma HOR, e entre as HOR essa identidade é em média 92% (Kuhn et al., 2009). Em anfíbios, os estudos com DNA satélite são muito escassos e seu uso como marcador citogenético é mais raro ainda. Dentre esses estudos, Barsacchi e Gall (1972) localizaram sequências repetitivas em cromossomos de Triturus viridescens (Urodela), por meio de hibridação in situ, nas regiões centroméricas heterocromáticas, tanto em cromossomos somáticos como plumosos. Murakami et al. (2007) isolaram sequências de DNA satélite de outro gênero de Urodela, Cynops, e puderam reconhecer que algumas sequências estão bem conservadas em regiões pericentroméricas entre diferentes espécies, enquanto algumas sequências centroméricas são espécie-específicas. Dentre os anuros, já foram isoladas sequências de DNA satélite de Lithobates castesbeiaus (espécie antes denominada Rana catesbeiana) (Wu et al., 1986), de Discoglossus pictus (Odierna et al., 1999) e de Bufotes viridis (espécie antes denominada Bufo viridis) (Odierna et al., 2004). Em L. catesbeiana foi isolada uma sequência denominada DNAsat(TaqI), com aproximadamente 360 pares de bases, distribuída ao longo de todos os cromossomos, que se mostrou presente também no cariótipo de outras quatro espécies de Rana, mas ausente no cariótipo de Xenopus, Bombina e Acris (Wu et al., 1986). Outro DNA satélite, denominado pBv, isolado de Bufotes viridis, mostrou-se presente no genoma de diferentes espécies desse gênero e também em Werneria e Wolterstorffina, consideradas filogeneticamente distantes de Bufotes. Embora a única informação a respeito da localização cromossômica dessa sequência esteja restrita a B. viridis, os autores concluíram que esse alto grau de conservação pode ser uma peculiaridade desse grupo de anuros, já que essas espécies apresentam também outras características citogenéticas idênticas entre si, como número e morfologia dos cromossomos, padrão de localização de NORs, de bandas heterocromáticas reveladas pelo bandamento C, padrão de bandas de replicação tardia, e localização de regiões positivas ao DAPI e à CMA3 (Odierna et al., 2004).

DNA satélite de Rana temporaria foi utilizado para investigação do modelo de evolução dessas sequências em diferentes populações. Nesse estudo foi verificada uma extensa variação entre as unidades repetitivas e, com os resultados, foi possível inferir a ocorrência de eventos de amplificação em círculo e descartar a influência de eventos de crossing-over desigual e conversão gênica (Feliciello et al., 2005). No gênero Physalaemus, uma família de DNA satélite denominada PcP190 foi caracterizada e teve sua origem atribuída à uma derivação do DNAr 5S devido a alta similaridade apresentada entre as sequências dessa família multigênica e o DNA satélite. Esse DNA satélite apresentava localização centromérica em pelo menos 5 pares de cromossomos na população de P. cuvieri estudada, além disso, mostrava co-localização no par 3 com o sítio de DNAr 5S (Vittorazzi et al., 2011).

3. Relações DNA satélite e DNA ribossomal Pouco é mencionado na literatura sobre a origem de DNA satélites a partir de famílias multigênicas. No entanto, alguns trabalhos tem dado esse direcionamento, mostrando semelhanças de DNAr com sequências de DNA repetitivos. Em plantas, esse fato tem sido reportado com mais frequência, como visto em Vigna radiata (Unfried et al., 1991), Phaseolus vulgaris (Flaquet et al.,1997), Vicia sativa (Macas et al., 2003) e Solanum lycopersicum (Jo et al., 2009), os quais apresentaram sequências de DNA satélite com porções semelhantes aos espaçadores intergênicos (IGS) do DNAr 45S de suas respectivas NORs. Nos animais também existem relatos de sequências repetitivas independentes dos cístrons de DNAr (encontradas fora dos locos de DNAr) com partes semelhantes ao mesmo. Martins et al. (2006), por exemplo, observaram no peixe Hoplias malabaricus uma forma variante do DNAr 5S, o qual foi definido como um DNA satélite e denominado de 5SHindIII satélite. Através de hibridação in situ os autores detectaram esse DNA satélite nas regiões centroméricas de vários cromossomos, sugerindo uma possível função genômica, mas não como uma sequência codificadora de RNAr 5S. No anfíbio Triturus vulgaris, Lucchini et al. (1997) detectaram uma porção do segmento espaçador intergênico do DNAr 45S em sítios cromossômicos diferentes das NORs e sugeriram que este DNAr extra-ribossomal é sub-produto de mecanismo de recombinação.

Mais recentemente, foi isolada do anfíbio Physalaemus cuvieri uma sequência de DNA satélite denominada PcP190, que apresentou similaridade com o DNAr 5S e, por isso, teve sua origem atribuída a eventos evolutivos que envolveram essa classe de DNA ribossomal (Vittorazzi et al., 2011) Nessas diferentes análises de segmentos homólogos a DNAr encontrados em locos independentes daqueles ocupados pelos genes ribossomais 5S ou pelas NORs, é possível perceber que essa família multigênica possui habilidade de recombinação em diferentes regiões do genoma. No entanto, ainda há muito a se estudar em relação aos mecanismos moleculares comuns a esses eventos de dispersão de sequências repetitivas.

4. Posição taxonômica e citogenética do grupo de Physalaemus cuvieri A classe Amphibia possui atualmente 7.259 espécies descritas e estão distribuídas em três ordens, Caudata, Gymnophiona e Anura. Esta última é a maior delas, contando com 88% das espécies descritas, enquanto Caudata possui 9% e Gymnophiona, apenas 3% (Frost, 2014). Entre as 55 famílias de Anura existentes, encontra-se a família Leptodactylidae, composta por 201 espécies neotropicais que estão distribuídas em 3 subfamílias, Leptodactylinae, Paratelmatobinae e Leiuperinae. Nesta última estão inclusas 90 espécies que compõem 5 gêneros, sendo eles, Edalorhina com 2 espécies, Engystomops com 9 espécies, Pleurodema com 15 espécies, Pseudopaludicola com 18 espécies e o maior deles, o gênero Physalaemus, composto por 46 espécies (Frost, 2014). A distribuição geográfica das espécies do gênero Physalaemus ocorre por quase toda extensão do continente sul-americano: norte e centro da Argentina, leste da Bolívia, Paraguai, Uruguai, Brasil, Guianas, planícies do sul da Venezuela, sudeste da Colômbia e oeste do Equador (Frost, 2014). Nascimento et al. (2005), com base em estudos de morfologia externa e osteologia, propuseram sete grupos para o gênero Physalaemus: cuvieri, signifer, albifrons, deimaticus, gracilis, henselii, e olfersii. O grupo de Physalaemus cuvieri é o maior deles, composto por nove espécies, sendo elas, P. cuvieri, P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. cuqui, P. ephippifer, P. erikae, P. fischeri e P kroyeri. Entretanto, inferindo-se a evolução das espécies do gênero Physalaemus com dados de genes mitocondriais e nucleares, foi possível fazer uma nova proposta para os agrupamentos, tendo sido reconhecidos dois grandes clados, o Clado P. signifer e o Clado P. cuvieri. O Clado P. cuvieri engloba os grupos P. cuvieri, P. biligonigerus,

P. henselii, P. gracilis e P. olfersii, além das espécies P. aguirrei, e P. cicada, cujos relacionamentos interespecíficos permanecem não esclarecidos (Lourenço et al., em preparação). Os cariótipos de P. cuvieri (Beçak et al., 1970; Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009), P. centralis (Denaro, 1972; Vittorazzi et al., 2014), P. ephippifer (Nascimento et al., 2010), P. albonotatus e P. cuqui (Vittorazzi et al., 2014) já foram descritos com base em colorações convencionais com Giemsa, bandamento C e impregnação por prata para detecção de NORs. Informações relativas ao número e à morfologia dos cromossomos do complemento diploide de P. cicada e P. kroyeri (De Lucca et al., 1974) também estão disponíveis na literatura. Apenas duas espécies do grupo de P. cuvieri, P. erikae e P. fischeri, não apresentam nenhuma informação acerca de seu cariótipo. Comparações entre os cariótipos disponíveis para espécies do grupo de P. cuvieri permitiram identificar grande semelhança com relação à morfologia dos sete primeiros pares cromossômicos. Além disso, uma banda intersticial é encontrada em 5p em todas as espécies do grupo. Já os pares cromossômicos 8-11 apresentam-se mais variáveis, o que dificulta o reconhecimento de homeologias entre os menores cromossomos desses cariótipos. Justamente nesses menores pares estão localizadas as NORs principais desses cariótipos (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009; Nascimento et al., 2010; Vittorazzi et al., 2014). Dessa forma, os dados disponíveis até momento não permitem o reconhecimento dos possíveis rearranjos responsáveis pelas diferenças interespecíficas em relação aos cromossomos portadores de NORs nas espécies do grupo de P. cuvieri. Mesmo dentre as diferentes populações de P. cuvieri, a correta identificação das homeologias dos pares cromossômicos 8-11 mostrou-se difícil em alguns casos, já que grande variação foi notada principalmente em relação aos cromossomos portadores da NOR. O cariótipo encontrado em espécimes de três populações do nordeste brasileiro, por exemplo, permitiu reuni-los em um grupo, enquanto os cariótipos encontrados em várias outras populações do Brasil e também da Argentina não apresentaram correspondências inequívocas dos diferentes pares cromossômicos. Já o cariótipo encontrado em espécimes de P. cuvieri provenientes de Porto Nacional (TO) diferiu de todos os demais descritos para essa espécie, visto que apresentou NORs nos cromossomos 1, 3, 4, 5 e 10 e várias regiões pericentroméricas reveladas pelo bandamento C (Quinderé et al., 2009).

5. Justificativa Diante do exposto quanto à falta de informações sobre os DNA satélite e DNAr 5S em anuros, e ainda algumas lacunas nos estudos cariotípicos entre as espécies relacionadas à P. cuvieri, esse grupo de organismos torna-se interessante alvo para análise citogenética juntamente com a aplicação de ferramentas moleculares nesse contexto, as quais poderão contribuir no entendimento da evolução e diversidade dessas famílias de DNA repetitivo, além de contribuir também no estabelecimento das relações citogenéticas entre os Physalaemus.

V. OBJETIVOS

Geral Objetivou-se nessa tese ampliar o estudo citogenético de espécies do grupo de Physalaemus cuvieri. Objetivou-se também analisar o DNA satélite PcP190 em nível cromossômico e molecular, assim como estudar a organização molecular e a diversidade de sequências do DNAr 5S no genoma das espécies de Physalaemus.

Específicos

 Analisar as sequências e a localização cromossômica do DNA satélite PcP190 em diferentes populações de P. cuvieri e nas espécies P. albifrons, P. albonotatus, P. centralis e P. ephippifer, assim como verificar sua ocorrência em espécies com distante relação filogenética ao grupo de P. cuvieri.

 Analisar as sequências do DNAr 5S de diferentes populações de P. cuvieri e das espécies P. albifrons, P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. ephippifer, P. kroyeri, P. nattereri e Pleurodema diplolister com o propósito de conhecer a diversidade dessas sequências no genoma desses anuros e inferir acerca de sua evolução.

 Caracterizar citogeneticamente as espécies P. cicada e P kroyeri para que essas informações contribuam no panorama da citogenética dentro das relações filogenéticas já reconhecidas para as espécies de Physalaemus. Ainda analisar as sequências e a localização cromossômica do DNA satélite PcP190 nessas espécies.

VI. Referências Bibliográficas Abel LDS, Mantovani M, Moreira-Filho O (2006). Chromosomal distribution of the As51 satellite DNA in two species complexes of the genus Astyanax (Pisces, Characidae). Genetics and Molecular Biology 29: 448-452.

Barsacchi G, Gall J (1972). Chromosomal localization of repetitive DNA in the newt Triturus. Journal of Cell Biology 54: 580-591.

Bassi C, Magnani I, Sacchi N, Saccone S, Ventura A, Rocchi M, Marozzi A, Ginelli E, Meneveri R (2000). Molecular structure and evolution of DNA sequences located at the alpha satellite boundary of chromosome 20. Gene 256: 43-50.

Beçak ML, Denaro L, Beçak W (1970). Polyploidy and mechanisms of karyotypic diversification in Amphibia. Cytogenetics 9: 225-238.

Brown DD, Sugimoto K (1973). 5S DNAs of Xenopus laevis and Xenopus mulleri: Evolution of a gene family. Journal of Molecular Biology 78: 397 – 415.

Busin CS, Vinciprova G, Recco-Pimentel, SM (2001). Chromosomal rearrangements as the source of variation in the number of chromosomes in Pseudis (Amphibia, Anura). Genetica 110: 131-141.

Cabral-de-Mello DC, Cabrero J, López-León MD, Camacho JPM (2011). Evolutionary dynamics of 5S rDNA location in acridid grasshoppers and its relationship with H3 histone gene and 45S rDNA location. Genetica 139: 921-931.

Canapa A, Cerioni NP, Barucca M, Olmo E, Caputo V (2002). A centromeric satellite DNA may be involved in heterochromatin compactness in gobid fishes. Chromosome Research 10: 297-304.

Caraballo DA, Belluscio PM, Rossi MS (2010). The library model for satellite DNA: a case study with the rodents of the genus Ctenomys (Octodontidae) from the Ibera marsh, Argentina. Genetica 138: 1201-1210.

Cazaux B, Catalan J, Justy F, Escudé C, Desmarais E, Britton-Davidian J (2013). Evolution of the structure and composition of house mouse satellite DNA sequences in the subgenus Mus (Rodentia: Muridea): a cytogenomic approach. Chromosoma 122: 209-220.

Charlesworth B, Sniegowski P, Stephan W (1994). The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature 371: 215-220.

De Lucca EJ, Jim J, Foresti F (1974). Chromosomal studies in twelve species of Leptodactylidae and one Brachycephalidae. Caryologia 27: 183-191.

Denaro L (1972). Karyotypes of Leptodactylidae anurans. Journal of Herpetology 6: 71-74.

Dobingy G, Yang F (2008). Comparative cytogenetics in the genomics era: cytogenomics comes of age. Chromosome Research 16: 1-4.

Dover GA (1986). Molecular drive in multigene families: how biological novelties arise, spread and are assimilated. Trends in Genetics 2: 159-165.

Dover GA (2002). Molecular drive. Trends in Genetics 18: 587-589.

Drouin G, Sá MN (1995). The concerted evolution of 5S ribosomal genes linked to the repeats units of others multigenes families. Molecular Biology and Evolution 12: 481-493.

Eirín-López JM, Rebordinos L, Rooney AP, Rozas J (2012). The Birth- and- Death Evolution of Multigene Families Revisited. In: Repetitive DNA. Garrido-Ramos (ed). Karger, vol 7: 170-196.

Ferreira IA, Bertollo LAC, Martins C (2007). Comparative chromosome mapping of 5S rDNA and 5SHindIII repetitive sequences in Erythrinidae fish (Characiformes) with emphasis on Hoplias malabaricus species complex. Cytogenetics and Genome Research 118: 78-837.

Flaquet J, Creusot F, Drone M (1997). Molecular analysis of Phaseolus vulgaris rDNA units and characterization of a satellite DNA homologous to IGS repeats. Plant Physiology and Biochemistry 35: 611-622.

Feliciello I, Picariello O, Chinali G (2005). The first characterization of the overall variability of repetitive units in a species reveals unexpected features of satellite DNA. Gene 349: 153-164.

Freire R, Arias A, Ínsua AM, Mendez J, Eirín-López JM (2010). Evolutionary Dynamics of the 5S rDNA Gene Family in the Mussel Mytilus: Mixed Effects of Birth and-Death and Concerted Evolution. Journal of Molecular Evolution 70: 413 – 426.

Frost, Darrel R. 2014. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 6.0 (04/06/2014). Electronic Database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html. American Museum of Natural History, New York, USA.

Fujiwara M, Inafuku J, Takeda A, Watanabe A (2009). Molecular organization of 5S rDNA in bitterlings (Cyprinidae). Genetica 135: 355-365.

Garrett R (1999). Mechanics of the ribosome. Nature 400: 811-812.

Harper ME, Price J, Korn LJ (1983). Chromosonal mapping of Xenopus 5S genes: somatic type versus oocyte-type. Nucleic Acids Research 11: 2313 – 2323.

Jo S, Koo D, Kim JF, Hur C, Lee S, Yang T, Kwon S, Choi D (2009). Evolution of ribosomal DNA-derived satellite repeat in tomato genome. BMC Plant Biology 9: 1-14.

Kuhn GCS, Teo CH, Schwarzacher T, Heslop-Harrison JS (2009). Evolutionary dynamics and sites of illegitimate recombination revealed in the interspersion and sequence junctions of two nonhomologous satellite DNAs in cactophilic Drosophila species. Heredity 102: 453-464.

Kupriyanova NS (2000). Conservation and variation of ribosomal DNA in eukaryotes. Molecular Biology 5: 637-647.

LiYan Q, Yun X, YuChi Z, XiaoMao Z (2013). FISH of 5S rDNA and telomeric (TTAGGG)n repeats in normal and translocated populations of the frog Quasipaa boulengeri (Anura, Ranidae). Chinese Science Bulletin 58: 2168 – 2173.

Long EO, Dawid IB (1980). Repeated genes in eukaryotes. Annual Review of Biochemistry, 49: 727-764.

Lourenço LB, Bacci-Jr MB, Martins VG, Recco-Pimentel SM, Haddad CFB (2008). Molecular phylogeny and karyotypic differentiation in Paratelmatobius and Scythrophrys (Anura, Leptodactylidae). Genetica 132: 255-266.

Lourenço LB, Garcia PC, Recco-Pimentel SM (2003). Cytogenetics of a new species of the Paratelmatobius cardosoi group (Anura, Leptodactylidae) with the description of an apparent case of pericentric inversion. Amphibia-Reptilia 24: 47-55.

Lucchini SD, Andronico F, Nardi I (1997). Molecular structure of the rDNA intergenic spacer (IGS) in Triturus: implications for the hypervariability of rDNA loci. Chromosoma 106: 315-326.

Macas J, Navratilova A, Meszaros T (2003). Sequences subfamilies of satellites repeats related to rDNA intergenic spacer are differentially amplified on Vicia sativa chromosomes. Chromosoma 112: 152-158.

Martins C, Ferreira IA, Oliveira C, Foresti F, Galetti PMG (2006). A tandemly repetitive centromeric DNA sequence of the fish Hoplias malabaricus (Characiformers: Erythrinidae) is derived from 5S rDNA. Genetica 127: 133-141.

Martins C, Galetti-Jr PM (2001a). Chromosomal localization of 5S rDNA genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Genome 44: 903-910.

Martins C, Galetti-Jr PM (2001b). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is it a general rule for fishes? Genetica 111: 439-446.

Martinsen L, Venanzetti F, Johnsen A, Sbordoni V, Bachmann L (2009): Molecular evolution of the pDo500 satellite DNA family in Dolichopoda cave crickets (Rhaphidophoridae). BMC Evolutionary Biology 9: 301-314.

Merlo MA, Cross I, Manchado M, Cárdenas S, Rebordinos L (2013). The 5S rDNA High Dynamism in Diplodus sargus is a Transposon-Mediated Mechanism. Comparison with Other Multigene Families and Sparidae Species. Journal of Molecular Evolution 76: 83 – 97.

Meštrović N, Castagnone-Sereno P, Plohl M (2006). High conservation of the differentially amplified MPA2 satellite family in parthenogenetic root-knot nematodes. Gene 376: 260-267.

Morescalchi MA, Liguori I, Rocco L, Archimandritis A, Stingo V (2008). Karyotypic characterization and genomic organization of the 5S rDNA in Polypterus senegalus (Osteichthyes, Polypteridae). Genetica 132: 179-186.

Mravinac B, Plohl M, Ugarkovic D (2005). Preservation and high sequence conservation of satellite DNAs suggest functional constraints. Journal of Molecular Evolution 61: 542-540. 18

Murakami T, Maki N, Nishida-Umehara C, Matsuda Y, Agata K (2007). Establishment of high- resolution FISH mapping system and its application for molecular cytogenetic characterization of chromosomes in newt, Cynops pyrrhogaster (Urodela, Amphibia). Chromosome Research 15: 471- 478.

Nascimento BN, Caramashi U, Cruz CAG (2005). Taxonomic review of the species groups of the genus Physalaemus Fitzinger, 1826 with revalidation of the genera Engystomops Jiménez-De-La- Espada, 1872 and Eupemphix Steindachner, 1863 (Amphibia, Anura, Leptodactylidae). Arquivos do Museu Nacional do Rio de Janeiro 63: 297-320.

Nascimento J, Quinderé YRSD, Recco-Pimentel SM, Lima JRF, Lourenço LB (2010). Heteromorphic Z and W sex chromosomes in Physalaemus ephippifer (Steindachner, 1864) (Anura, Leiuperidae). Genetica 138: 1127-1132.

Nei M, Rooney AP (2005). Concerted and birth-and-death evolution of multigene families. Annual Review of Genetics 39: 121-152.

Odierna G, Aprea G, Capriglione T, Castellano S, Balletto E (2004). Evidence for chromosome Pst I satellite DNA family evolutionary stasis in the Bufo viridis group (Amphibia, Anura). Chromosome Research 12: 671-681.

Odierna G, Aprea G, Capriglione T (1999). Chromosomal and molecular analysis of some repeated families in Discoglossus Otth, 1837 (Anura, Discoglossidae): taxonomic and phylogenetic implications. Italian Journal of Zoology 66: 275-283.

Pieler T, Oei SL, Hamm J, Engelke U, Erdmann VA (1985). Functional domains of the Xenopus laevis 5S gene promoter. The EMBO Journal 4: 3751-3756.

Quinderé YRSD, Lourenço LB, Andrade GV, Tomatis C, Baldo D, Recco-Pimentel SM (2009). Polytypic and polymorphic cytogenetic variations in the widespread anuran Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae) with emphasis on nucleolar organizing regions. Biological Research 42: 79- 92.

Raska I, Koberna K, Malinsky J, Fidlerová H, Masata M (2004). The nucleolus and transcription of ribosomal genes. Biology of the Cell 96: 579-594.

Roa F, Guerra M (2012). Distribution of 45S rDNA sites in chromosomes of plants: Structural and evolutionary implications. BMC Evolutionary Biology 12: 1-13.

Rebordinos L, Cross I, Merlo A (2013). High Evolutionary Dynamism in 5S rDNA of Fish: State of the Art. Cytogenetic and Genome Research 141: 1-11.

Rodrigues DS, Rivera M, Lourenço LB (2012). Molecular organization and chromosomal localization of 5S rDNA in Amazonian Engystomops (Anura, Leiuperidae). BMC Genetics 13: 1- 17.

Roizes G (2006). Human centromere alphoid domains are periodically homogenized so that they vary substantially between homologous. Mechanism and implications for centromere functioning. Nucleic Acids Research 34: 1912-1924.

Rouleux-Bonnin F, Renault S, Bigot Y, Periquet G (1996). Transcription of four satellite DNA subfamilies in Diprion pini (Hymenoptera, Symphyta, Diprionidae). European Journal of Biochemistry 238: 752-759.

Pieler T, Oei SL, Hamm J, Engelke U, Erdmann VA (1985). Functional domains of the Xenopus laevis 5S gene promoter. The EMBO Journal 4: 3751-3756.

Plohl M, Borsnik B, Ugarkovik D, Gamulin V (1990). Sequence-induced curvature of Tenebrio molitor satellite DNA . Biochimie 72: 665-670.

Plohl M, Luchetti A, Meštrović N, Mantovani B (2008). Satellites DNAs between selfishness and functionality: structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin. Gene 409: 72-82.

Plohl M (2010). Those mysterious sequences of satellite DNAs. Periodicum Biologorum 112: 403- 410.

Schmid M, Vitelli L, Batistoni R (1987). Chromosome banding in amphibia. XI: Constitutive heterochromatin, nucleolus organizers, 18S+28S and 5S ribosomal genes in Ascaphidae, Pipidae, Discoclossidae and Pelobatidae. Chromosoma 95: 271-284.

Schmeing TM, Ramakrishnan V (2009). What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 00: 1-9.

Schramm L, Hernandez N (2002). Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes & Development 16: 2593-2620.

Silva APZ, Haddad CFB, Kasahara S (1999). Nucleolus organizer regions in Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae), with evidence of a unique case of Ag-NOR variability. Hereditas 131: 135-141.

Singer MF (1982). Highly repeated sequences in mammalian genomes. International Review of Cytology 76: 67-112.

Slamovits HC, Rossi MS (2002). Satellite DNA: agent of chromosomal evolution in mammals. Mastozoología Neotropical 9: 297-308.

Speicher MR, Carter NP (2005). The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nature 6: 782-792.

Torres-Machorro AL, Hernández R, Cevallos AM, Lópes-Villaseñor I (2010). Ribosomal RNA genes in eukaryotic microorganisms: witnesses of phylogeny? Microbiology Reviews 34: 59-86.

Tsoumani KT, Drosopoulou E, Mavragani-Tsipidou P, Mathiopoulos KD (2013). Molecular Characterization and Chromosomal Distribution of a Species-Specific Transcribed Centromeric Satellite Repeat from the Olive Fruit Fly, Bactrocera oleae. PLOS One 8: 1-11.

Ugarkovic D, Plohl M (2002). Variation in satellite DNA profiles – causes and effects. EMBO Journal 21: 5955-5959.

Ugarkovic D, Podnar M, Plohl M (1996). Satellite DNA of the red flour beetle Tribolium castaneum – comparative study of satellites from the genus Tribolium. Molecular Biology and Evolution 13: 1059-1066.

Unfried K, Schiebel K, Hemleben V (1991). Subrepeats of rDNA intergenic spacer present as proeminent independent satellite DNA in Vigna radiate but not in Vigna angularis. Gene 99: 63-68.

Vierna J, Wehner S, Honer zu Siederdissen C, Martínez-Lage A, Marz M (2013). Systematic analysis and evolution of 5S ribosomal DNA in metazoans. Heredity 111: 410 – 421.

Vitelli L, Batistoni R, Andronico F, Nardi I, Barsacchi-Pilone G (1982). Chromosomal localization of 18S+28S and 5S ribosomal RNA genes in evolutionary diverse amphibians. Chromosoma 84: 475-491.

Vittorazzi SE, Lourenço LB, Del-Grande ML, Recco-Pimentel SM (2011). Satellite DNA derived from 5S rDNA in Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae). Cytogenetics and Genome Research 134: 101-107.

Vittorazzi SE, Quinderé YRSD, Recco-Pimentel SM, Tomatis C, Baldo D, Lima JRF, Ferro JM, Lima JD, Lourenço LB (2014). Comparative cytogenetics of Physalaemus albifrons and Physalaemus cuvieri species groups (Anura, Leptodactylidae). Comparative Cytogenetics 8: 103- 123.

Wasko AP, Martins C, Wright JM, Galetti PM (2001). Molecular organization of 5S rDNA in fishes of the genus Brycon. Genome 44: 893-902.

Watson Jd, Myers RM, Caudy A, Witkowski JA (2009). DNA Recombinante: Genes e Genoma. Artmed 3 ed.

Wu Z, Murphy C, Gall JG (1986). A transcribed satellite DNA from the bullfrog Rana catesbeiana. Chromosoma 93: 291-297.

VII. Capítulo 1

Long-time evolution and highly dynamic satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs

Stenio Eder Vittorazzi1, Luciana Bolsoni Lourenço1, Shirlei Maria Recco-Pimentel1

1Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, 13083-863 Campinas, São Paulo, Brazil

Keywords

Satellite DNA, chromosomes, Physalaemus, Amphibia

Abstract Background Satellite DNA sequences are the most abundant components of heterochromatin and are repeated in tandem hundreds to thousands of times in the genome. However, the number of repeats of a specific satellite family can vary even between the genomes of related species or populations. The PcP190 satellite DNA family was identified in the genome of the leptodactylid frog Physalaemus cuvieri, which shown to be derived most likely from the 5S rDNA in an ancestral species. In this study, we investigate the presence of the PcP190 satellite DNA in several Physalaemus cuvieri populations and in four closely related species at the chromosomal and molecular level. Furthermore, we investigate the occurrence of this satellite DNA in the genomes of Physalaemus marmoratus and Physalaemus nattereri, which are more distantly related to Physalaemus cuvieri, in representative species of two other leptodactylid genera, Pleurodema and Leptodactylus, and in a genus of the hylodid family, Crossodactylus, all with the aim of investigating the dispersion of the PcP190 satellite DNA in these organisms.

Results The PcP190 satellite DNA was detected in all the analyzed species. Some of them exhibited individual sequence differences, allowing the identification of species-specific groups of sequences, but in other species, the sequences were more conserved. However, in a general analysis, conserved and variable domains have been recognized within the PcP190 monomer. The chromosomal analysis performed on Physalaemus cuvieri populations and closely related species revealed high variability of the satellite DNA amount and its chromosomal location, which has always been coincident with regions of centromeric and pericentromeric heterochromatin.

Conclusion The PcP190 satellite DNA was found in representatives of two families, Leptodactylidae and Hylodidae, indicating that these sequences are widely distributed and conserved in these frogs. There is a pattern of non-random variation within the repeating units, indicating interplay between stochastic events and selective pressure along the PcP190 sequences. Karyotypic differences involving the PcP190 satellite DNA prove to be highly dynamic on the chromosomes of the Physalaemus and its differential accumulation has contributed to the differentiation process of the ZW sex chromosomes in Physalaemus ephippifer.

Background

Repetitive DNA sequences have been detected in the genomes of almost all eukaryotes, and a wide variety of characteristics distinguish them into different classes, including satellite DNA, minisatellite, microsatellite, transposable elements and some multigene families. The satellite DNA sequences, which are repeated in tandem hundreds to thousands of times in the genome, are found predominantly in the centromeric, pericentromeric and telomeric regions and are main components of constitutive heterochromatin [1,2].

Families of satellite DNA are distinguished by nucleotide composition, sequence complexity, the size of the repeating unit and the number of copies, and they share the ability to form arrays of long sequences arranged in tandem to form heterochromatic regions [3]. Importantly, distinct families of satellite DNA sequences can also differ in evolutionary rates. While some satellite DNA families are species-specific [4,5], others are more conserved, and similar sequences may be recognized in closely related species [6-9].

The dynamic evolutionary processes that affect satellite DNA may also result in changes in its chromosomal location and distribution. In some cases, these changes can correlate with chromosomal evolution and possibly influence species evolution [10-14]. The same type of satellite DNA can be found in both homologous and non-homologous chromosomal regions [5,9,15], and all the satellite DNA clusters in a genome can evolve in concert, which leads to the homogenization of the satellite DNA families in the genome [2,16-18].

The principle of concerted evolution of repetitive sequences is based on different mechanisms of non-reciprocal transfer occurring within or between chromosomes, such as unequal crossover, gene conversion and replicative transposition. In addition, the model of concerted evolution also takes into account the fixation of specific satellite DNA sequences in populations/species that is driven by sexual reproduction. Also based on this model, the members of a satellite DNA family in a given species are expected to be more similar to each other than with those of related species [17, 18].

In the frog Physalaemus cuvieri, a family of satellite DNA named PcP190 was characterized and shown to be derived most likely from the 5S rDNA in an ancestral species. The clusters of

26 satellite DNA are present in the centromeric/pericentromeric regions of at least five chromosome pairs in the population from Palmeiras, Bahia (BA) State, Brazil. However, the occurrence and chromosomal distribution of the PcP190 satellite DNA family in other species of Physalaemus is not known [19].

The genus Physalaemus belongs to the Leptodactylidae family and is currently composed of 46 species [21], nine of which are found in South America and belong to the Physalaemus cuvieri group: Physalaemus albonotatus, Physalaemus centralis, Physalaemus cicada, Physalaemus cuqui, P cuvieri, Physalaemus ephippifer, Physalaemus erikae, Physalaemus fischeri and Physalaemus kroyeri [20, 21]. Physalaemus albifrons was previously classified in the Physalaemus cuvieri group [22], but based on phenetic analysis it was reclassified to form the Physalaemus albifrons group along with Physalaemus biligonigerus, Physalaemus marmoratus, Physalaemus santafecinus and Physalaemus riograndensis [21], however, none synapomorphy was clearly recognized for this species group, but Vittorazzi et al. [23] proposed to maintain Physalaemus albifrons in Physalaemus cuvieri group based on chromosomal data.

Except for Physalaemus erikae and Physalaemus fischeri, all the species of the Physalaemus cuvieri group have already been studied cytogenetically, and they have a conservative karyotype with a diploid number of 22 chromosomes [23-29]. Despite this conserved karyotype, differences at the chromosomal positions of the nucleolus organizing regions (NORs) were detected among these species and even among different populations of Physalaemus cuvieri. In addition, one of the Physalaemus cuvieri populations, Porto Nacional, Tocantins State (TO), Brazil, exhibited a distinct C-band pattern compared with other populations of the same species [28]. Therefore, the genus Physalaemus is an interesting group for cytogenetic studies and for evaluating the wider applicability of new chromosomal markers.

Because different families of satellite DNA have relevant amplification and deletion ability in many organisms [30-33], we aimed in this work to investigate the presence of the PcP190 satellite DNA in chromosomal and molecular level in Physalaemus cuvieri populations and in four closely related species (Physalaemus albifrons, Physalaemus albonotatus, Physalaemus centralis and Physalaemus ephippifer) [21, 23]. Moreover, to investigate the distribution of PcP190 satellite DNA in less related species, we searched for these sequences in the Physalaemus marmoratus, which belongs to another group of Physalaemus [23]; Physalaemus 27 nattereri, species that was recently reallocated from Eupemphix to Physalaemus [23, 34]; as well as in representatives species of three others genera, Pleurodema, Leptodactylus (family Leptodactylidae) and Crossodactylus (family Hylodidae), which have intergeneric relationships recognized [34-36].

Our analysis allowed to recognize the PcP190 satellite DNA in all the studied species and indicated these sequences are conserved in these frogs. Karyotypic differences involving the PcP190 satellite DNA in Physalaemus cuvieri related species prove to be highly dynamic on the chromosomes of these species and its differential accumulation has contributed to the distinction of the ZW sex chromosomes in Physalaemus ephippifer.

Methods

Specimens

All the individuals belonging to ten species included in our analysis were deposited in the Museum of Zoology "Professor Adão José Cardoso” of the Universidade Estadual de Campinas (ZUEC). We analyzed ten individuals of Physalaemus cuvieri from five Brazilian localities [Uberlândia, Minas Gerais State (MG; ZUEC 13367); Passo Fundo, Rio Grande do Sul State (RS; ZUEC 14650); Porto Nacional, Tocantins State (TO; ZUEC 14691, ZUEC 14692, ZUEC 14694, ZUEC 14695, ZUEC 14699 and ZUEC 14702); Araruna, Paraíba State (PB; ZUEC 17899); and Três Lagoas, Mato Grosso do Sul State (MS; ZUEC 17548)], two individuals of Physalaemus centralis [Palestina, São Paulo State (SP; ZUEC 13689 and ZUEC 13692)], two individuals of Physalaemus albonotatus [Lambari D´Oeste, Mato Grosso State (MT; ZUEC 16418 and ZUEC 16419)], five individuals of Physalaemus ephippifer [Belém, Pará State (PA; ZUEC 17729♀, ZUEC 17737♀, ZUEC 13739♀, ZUEC 13741♀ and ZUEC 13734♂)] and two individuals of Physalaemus albifrons [one from Barreirinhas, Maranhão State (MA; ZUEC 17925) for the cytogenetic analysis and one from Alagoinhas, Bahia State (BA; ZUEC 17902) for dot-blotting and sequence analyses].

The molecular analyses also included specimens of two species of Physalaemus that are phylogenetically more distantly related to Physalaemus cuvieri, Physalaemus marmoratus [Itirapina, São Paulo State (SP; ZUEC 17515)] and Physalaemus nattereri [(Lambari D´Oeste, Mato Grosso State (MT; ZUEC 20927)], as well as exemplars of species of two other genera belonging to the family Leptodactylidae, Pleurodema diplolister [Limoeiro, Pernambuco State (PE; ZUEC 17915)] and Leptodactylus latrans [Bertioga, São Paulo State (SP; ZUEC 12875)]. One individual of Crossodactylus gaudichaudii [Rio de Janeiro, Rio de Janeiro State (RJ; ZUEC 17570)], which belongs to the family Hylodidae, was also included in this analysis.

The collection localities of all the specimens analyzed are shown in Figure 1. The animals were collected with permission of the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA/SISBIO – Process number 10678-2, 20336-1 and 33133-1). For the subsequent techniques, all samples were extracted from euthanized specimens using anesthetic application to the skin (5% Lidocaine) to minimize animal suffering, according to 29 recommendations of the Herpetological Animal Care and Use Committee (HACC) of the American Society of Ichthyologists and Herpetologists (available in http//www.asih.org), and approved by SISBIO/Institute Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade as a condition for the concession license.

Extraction of genomic DNA

The genomic DNA was extracted from liver or muscle samples maintained at -80°C. Tissue fragments were lysed in TNES (50 mM Tris pH 7.5, 400 mM NaCl, 20 mM EDTA and 0.5% SDS) supplemented with proteinase K (100 μg/mL) at 56o C for approximately 3 hours. After lysis, the samples were treated with RNAse (50 μg/mL) and proteins were precipitated in NaCl (1.6 M). The DNA was precipitated in isopropyl alcohol, washed in ethanol (70%) and rehydrated in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). For quality control and to quantify the genomic DNA, the samples were subjected to electrophoresis in a 0.8% agarose gel and spectrophotometry.

Isolation, cloning and sequencing of the PcP190 satellite DNA

To isolate the satellite DNA of each species, DNA samples were subjected to PCR using specific primers: P190F (AGA CTG GCT GGG AAT CCC AG) and P190R (AGC TGC TGC GAT CTG ACA AGG) [20]. Subsequently, the DNA fragments were inserted into the pGEM- T Easy Vector (Promega, Madison, Wisconsin, USA). The recombinant vectors were transformed into JM109 E. coli with the TransformAid™ Bacterial Transformation Kit (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s protocol.

The bacterial suspensions were plated on solid LB containing ampicillin (100 µg/mL), X-gal (2% in dimethylformamide) and IPTG (50 mM) and were incubated overnight at 37°C. The white colonies were cultivated at 37°C for approximately 16 hours on a new plate containing solid LB medium supplemented with ampicillin. A sample of each colony was subjected to PCR using the T7 and SP6 primers to confirm the presence of the insert. The rest of each

30 colony was suspended in liquid LB medium supplemented with ampicillin (100 µg/mL). After two hours, the liquid cultures were used for plasmid DNA extraction following the method described by Sambrook et al. [37]. A sample of each liquid culture was stored at -80°C with glycerol (30% v/v).

Samples of the PCR amplified fragments were subjected to sequencing reactions with the BigDye Terminator kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) and purified by DNA precipitation. The samples were dried, suspended in loading dye [Blue-Dextran- EDTA/Formamide (1:5)], denatured for 3 minutes at 94°C and applied to an automatic sequencer (ABI 3730XL DNA Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, California, USA).

Sequences analysis

The nucleotide sequences were edited using the BioEdit program v. 7.0.9 [38], aligned using Clustal W [39]. The intraindividual similarities among the sequences and with those from Physalaemus cuvieri [19] were conducted by pairwise analysis and the average was presented in percentage. Furthermore, the sequences were compared using the Maximum Likelihood criterion based on the Kimura 2-parameter model [40] using MEGA v5 [41]. Initial trees for the heuristic search were obtained automatically. The inferred arrangements were evaluated by bootstrap analysis using 1000 replicates.

The most sequences obtained in this work were used to estimate the nucleotide diversity (Pi) using the DnaSP program v.5.10 [42]. The more and less conserved regions in the sequences were defined by sliding window analysis with a window length of 10 bp and a step size of 2 bp. The sequences that had regions nonaligned were excluded from the analysis, in this case, Physalaemus nattereri, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii.

The diagonal plot method was applied to verify the presence of internal repeats, inversions and palindromic sequence using the Dotlet program v1.5 [43].

Dot-blot analysis

To compare the abundance of the PcP190 satellite in the genomes of Physalaemus albifrons, Physalaemus albonotatus, Physalaemus centralis, Physalaemus ephippifer and Physalaemus cuvieri, 100 ng, 250 ng and 500 ng of genomic DNA from each species were blotted onto a positive nylon membrane. The membrane was treated with NaOH (1 M) and baked at 80°C for 2 hours to denature the DNA. The membrane was then neutralized in NaCl (1.5 M), Tris-HCL (0.5 M) pH 7.5 for 30 minutes. The PcP190 satellite DNA isolated from Physalaemus cuvieri [19] was labeled with digoxigenin by PCR and used as a probe to hybridize to the membrane overnight at 65°C. The membrane washing was made first at room temperature in SSC (2X) and SDS (0,1%) by 5 minutes and the second at 65°C in SSC (0,1X) and SDS (0,1%) by 15 minutes. The probe was detected using the DIG Nucleic Acid Detection kit (Roche, Penzberg, Bavaria, Germany) according to the manufacturer’s instructions. To estimate the percentage in each genome, PCR sample of PcP190 were blotted onto a positive nylon membrane in the same concentrations above mentioned, thus considering that each one of them has 100% of the hybridization signal, the intensity of them were measured by densitometry using the ImageJ program [44] and proportions were established.

Chromosome preparations, fluorescence in situ hybridization (FISH) and the Ag-NOR method

Mitotic metaphases were obtained from cell suspensions of intestinal epithelium from the individuals previously treated with colchicine [45, 46, with modifications]. To obtain the FISH probes, cloned fragments were PCR amplified in the presence of digoxigenin-dUTP (Roche, Penzberg, Bavaria, Germany). The probes were mixed with salmon DNA (1 ng/µL of probe) and precipitated with ethanol. All the resulting DNAs were dissolved in a hybridization buffer at pH 7 that was composed of deionized formamide (50%), 2x SSC, phosphate buffer (40 mM), Denhardt’s solution, SDS (1%) and dextran sulfate (10%). The in situ hybridization technique followed Viegas-Péquignot [47] with modifications for the detection of digoxigenin-labeled probes with anti-DIG-Rhodamine (Roche, Penzberg, Bavaria, Germany).

Images of the hybridized metaphase chromosomes were captured with an Olympus BX-60 (Tokyo, Japan) microscope and edited with the Image-Pro Plus program (Media Cybernetics, Rockville, Maryland, USA). The chromosome pairing of all species followed Vittorazzi et al. [23], Quinderé et al. [28], Nascimento et al. [29]. The nucleolus organizer regions (NOR) in the karyotype of Physalaemus ephippifer were detected by the Ag-NOR method following Howell and Black [44].

Results

PcP190 Satellite DNA sequences

For all the analyzed species, the PCR using the P190F and P190R primers amplified multiple DNA band, that is characteristic for satellite DNA. The majority (62%) of the cloned sequences included partial PcP190 monomers, but inserts with dimers (23%), trimers (12%) and tetramers (2%) were also obtained. Although all the cloned fragments were sequenced, we used only the complete PcP190 monomers in the comparative analyses; thus, partial sequences resulting from the amplification of a single PcP190 monomer were not included. However, it is worth noting that these partial units showed no relevant difference in their nucleotide composition in relation to the complete sequences.

A total of 54 full monomers were obtained: 11 from the different populations of Physalaemus cuvieri, 5 from Physalaemus centralis, 5 from Physalaemus albonotatus, 5 from Physalaemus albifrons, 2 from Physalaemus ephippifer, 6 from Physalaemus marmoratus, 4 from Physalaemus nattereri, 7 from Pleurodema diplolister, 7 from Leptodactylus latrans and 2 from Crossodactylus gaudichaudii (exceptionally, one incomplete sequence from this last species was included due to the low number of complete sequences isolated from this species) (Figure 2). When compared with the other sequences available in GenBank, the sequences isolated here were similar to the PcP190 sequences previously isolated from Physalaemus cuvieri (Palmeiras, Bahia State, in Brazil) [19] (Figure 2 and Table 1), suggesting that all of them belong to the same satellite DNA family. Some differences were noted among the isolated sequences, but these differences were not enough to mischaracterize the family of the PcP190 satellite DNA (Figure 2). The main feature of this satellite DNA family is the presence of nucleotide substitutions, with a transition frequency of 11.29% and a transversion frequency of 6.86%. Most of the sequences are 190 bp long and contain 52% A/T nucleotide content.

The PcP190 monomers of Physalaemus albonotatus are 183 bp long and differ from the sequences obtained from Physalaemus cuvieri and closely related species mainly by the absence of seven bp consecutive. In the pairwise analysis, the sequences of Physalaemus albonotatus were very similar to each other (95% similarity), but exhibited 88% similarity with Physalaemus cuvieri (BA) from GenBank, which was the lowest similarity value observed 34 among the sequences isolated from Physalaemus cuvieri and other closely related species (see Table 1 and Figure 2).

Among the species of Physalaemus more distantly related to the Physalaemus cuvieri species group, Physalaemus nattereri had the most divergent PcP190 sequences. The PcP190 monomers isolated from this species were 204 bp long, with a region of approximately 40 bp that differed greatly from the other sequences (Table 1 and Figure 2). Likewise, the corresponding regions of the sequences obtained from Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii were also very different, although the sequences from Leptodactylus latrans were 191-192 bp long like the majority of the PcP190 sequences (Figure 2).

In the maximum likelihood analysis, some species-specific patterns could also be recognized among the species of Physalaemus, as in the case of Physalaemus albifrons, Physalaemus albonotatus, Physalaemus marmoratus and Physalaemus nattereri (Figure 3). The distinctive pattern of the Physalaemus albonotatus sequences was caused mainly by the above-mentioned 7 bp indels. In contrast, the sequences isolated from Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis and Physalaemus ephippifer were not species-specific and grouped together in the same group that also included the sequences obtained from Pleurodema diplolister (Figure 3).

In the nucleotide diversity (Pi) analysis, which included sequences isolated from Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis, Physalaemus albonotatus, Physalaemus albifrons, Physalaemus ephippifer, Physalaemus marmoratus and Pleurodema diplolister, the Pi average was 0.09. However, some specific regions of these sequences were more conserved than others, so two regions were recognizable: more conserved (MC) and less conserved (LC), which had Pi averages of 0.06 and 0.16, respectively (Figure 4). In this analysis, the sequences from Physalaemus nattereri, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii were not included because there is in the same region for these tree species a variable segment.

The amounts of the PcP190 sequences inferred by the dot-blot experiments varied among the genomes of Physalaemus cuvieri and the other closely related species. The lowest abundance value (1.6% of the genome) was estimated for Physalaemus albonotatus, and the largest

35 abundance (6.5% of the genome) was observed in Physalaemus cuvieri from Três Lagoas (MS) (Table 2).

Mapping of the PcP190 sequences in the karyotypes of Physalaemus cuvieri and closely related species

In the karyotypes of Physalaemus cuvieri, Physalaemus albifrons, Physalaemus albonotatus, Physalaemus centralis and Physalaemus ephippifer, the fluorescence in situ hybridization detected some chromosomal regions harboring the PcP190 satellite DNA that were regions of centromeric and pericentromeric constitutive heterochromatin.

In Physalaemus albifrons and Physalaemus albonotatus, the PcP190 probe hybridized to the centromeric and pericentromeric regions of chromosome pair 3 (Figure 5a, b). In the Physalaemus centralis karyotype, PcP190 hybridized to the centromeric regions of chromosome pairs 1 through 5, 8 and 10 (Figure 5c). In four females of Physalaemus ephippifer, in addition to the centromeric and pericentromeric regions of chromosome pair 3, the PcP190 probe also detected the pericentromeric C-band in the long arm of the Z and W sex chromosomes. The signal on chromosome W was notably stronger than the signal on chromosome Z in 10 of the analyzed metaphases and was undetectable on chromosome Z in four of the analyzed metaphases (Figure 5d).

The karyotypes of the individuals of Physalaemus cuvieri from distinct populations exhibited conspicuous differences in the hybridization pattern of the PcP190 satellite DNA. In the karyotypes of the specimens from Uberlândia (MG) and Três Lagoas (MS), the Pcp190 probe hybridized to the centromeric regions of all the chromosomes, except those of chromosome pair 8 (Figure 6a and b, respectively). In the karyotypes of individuals from Passo Fundo (RS), the PcP190 probe hybridized to the centromeres of chromosome pairs 1 through 5 and weakly to some of the smaller chromosomes of the complement (Figure 6c). In the karyotypes of Physalaemus cuvieri from Araruna (PB), PcP190 chromosomal sites were detected in all the chromosomes at centromeric (chromosome pairs 1, 2, 4 to 11) or pericentromeric regions (chromosome pair 3) (Figure 6d). In specimens from Porto Nacional (TO), the PcP190 probe

36 hybridized to the centromeric regions of chromosome pairs 1 through 7, 9 and 10 and to the pericentromeric regions of pairs 2, 3, 5 and 7 (Figure 6e).

Discussion

Wide dispersion of PcP190 satellite DNA in leptodactylid and hylodid frogs

Satellite DNA sequences are present in most eukaryotic organisms, and they are often species- specific [5,10] or present in closely related species [6-9]. The latter was observed in the present study upon the identification of PcP190 sequences in Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis, Physalaemus albonotatus, Physalaemus albifrons, Physalaemus ephippifer, however, has also been identified in phylogenetically more distant species such as Physalaemus marmoratus, Physalaemus nattereri, Pleurodema diplolister, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii. These species are representative of two families of Anura: Leptodactylidae and Hylodidae, and the intergeneric relationships for both have been recognized phylogenetically [35, 36]. These anuran families are included in the Hyloidea superfamily and shared a common ancestor approximately 70 million years ago [36]. Therefore, it is likely that the PcP190 satellite DNA was originated and, at least in these analyzed species it remained conserved across evolutionary time in these frogs.

Despite the low variability observed among the PcP190 sequences, species-specific groups of sequences were identified (sequences from Physalaemus albifrons, Physalaemus albonotatus, Physalaemus marmoratus, Physalaemus nattereri, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii), although sequence clusters belonging to different species, such as Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis, Physalaemus ephippifer, Physalaemus albonotatus and Pleurodema diplolister, were also discovered. In special, the variable segments in the sequences from Physalaemus nattereri, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii strongly contributed to their distinction from the others. This result may arise from the fact that different evolutionary rates may have affected the PcP190 family in different species. However, because we could not sample a vast number of sequences, we cannot exclude the possibility that our samples do not represent the full diversity of sequences in the genome of each species.

Based on the alignment of all the sequences, we can conclude that insertions and deletions are not very frequent in the PcP190 sequences, which is a common characteristic of a number of satellite DNA families [3, 49, 50]. The sequences of the PcP190 satellite DNA isolated from Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis, Physalaemus albonotatus, Physalaemus 38 albifrons, Physalaemus ephippifer, Physalaemus marmoratus, Pleurodema diplolister and Leptodactylus latrans are conserved in size, which was approximately 190 bp in the vast majority of the sequences. This size is very common in centromeric satellite DNA sequences, as example, the α-satellite DNA of primates [51], the ATOC180 satellite in Drosophila obscura, Drosophila ambigua and Drosophila tristis [52], and the ATCON satellite in Arabidopsis [53], among others. Although there is no universal characteristic among the different types of centromeric satellite DNA, it has been proposed that the size of the satellite DNA monomers are directly related to the required size of a DNA strand to form a centromeric nucleosome [54, 55]. This apparent consistency in the size of centromeric satellite DNA sequences may suggest the length required for a proper interaction with specialized histones that form the centromere; in this case, the satellite repetitions would ensure proper separation between these specialized histones during chromatin packaging [55].

Regarding the nucleotide composition, two regions with different diversity levels could be identified in the PcP190 sequences: more conserved (MC) and less conserved (LC). The presence of conserved domains within the PcP190 sequences may suggest that some regions of the repeating unit are under higher selective pressure than others. Similarly, alternating conserved and variable regions in satellite DNA sequences have been reported in several studies. In one segment of the MARJA and MPA1 satellite DNA of the Meloidogyne nematodes, domains of high and low variability were detected that were conserved both within and between monomer variants in different related species [56,57]. Likewise, the 178-bp satellite from Arabidopsis thaliana and the human α-satellite have conserved and variable regions, suggesting that this pattern of non-random variation within the repeating units may be related to centromeric protein binding sites [58].

In all the Physalaemus species analyzed here, the PcP190 satellite DNA was detected in centromeric and pericentromeric regions of constitutive heterochromatin, which was previously detected by C-banding [23, 28, 29]. Therefore, it is possible that the PcP190 satellite DNA family plays a role in the centromeric chromatin of these anurans, and further studies are necessary to better address this open question.

Differential amounts of PcP190 sequences in Physalaemus species

The results of chromosomal and membrane hybridization experiments were consistent and showed differential amounts of PcP190 sequences in the Physalaemus species studied here. The species with lower amounts of PcP190 in their genomes based on the dot-blot analysis were the same as those with fewer chromosomal sites detected by FISH, for example Physalaemus albonotatus. Likewise, the highest abundance genomic PcP190 sequences were detected by dot-blot in the same specimens in which several chromosomal sites were detected by in situ hybridization, for example Physalaemus cuvieri from Araruna (PB).

Another observation from the FISH experiments was the strong hybridization signal of the PcP190 probe on the pericentromeric region of the short arm of chromosome 3 in Physalaemus cuvieri, Physalaemus centralis and Physalaemus ephippifer. In the karyotypes of Physalaemus cuvieri from Palmeiras (BA) [19] and Physalaemus ephippifer [29], this pericentromeric region on chromosome 3 is the same region that bears the type I 5S rDNA. Because the PcP190 satellite DNA and the 5S gene share 70% similarity [19], we presume that this strong signal resulted from the cross-hybridization of the PcP190 probe with the 5S rDNA. However, it is important to mention that hybridization with a type I 5S rDNA probe did not detect any PcP190 satellite regions outside of chromosome 3[19].

In species that are phylogenetically closely related, deletions and amplifications leading to changes in specific satellite DNA families have been linked to chromosomal evolution [9, 31, 59]. In the case of the RPCS satellite DNA found in Ctenomys species, two evolutionary patterns were detected [9], one of them consisted of a variable number of RPCS copies in species of the same phylogenetic clade with high karyotypic variability, whereas the other pattern, which was also observed in species of the same phylogenetic clade, consisted of a stable number of RPCS copies and stable karyotypes. Based on these data, Slamovits et al. [9] suggested that amplification, deletion and intragenomic rearrangements can promote chromosomal evolution. Conversely, although the amounts of PcP190 satellite DNA varied among the analyzed species of Physalaemus, relevant changes in their karyotypes have not been observed in any of them [19, 28, 29]. However, we cannot rule out the possibility that the differences in the PcP190 clusters in the chromosomes of these Physalaemus, as well as the interpopulational differences in Physalaemus cuvieri, may play or have played an important 40 role in the evolutionary history of these species. An example of such role has already been suggested for Drosophila, in which the 359-bp satellite DNA apparently affects or has affected chromosomal segregation in hybrids and, consequently, led to post-zygotic reproductive isolation [60].

Among the Physalaemus cuvieri populations studied here, only those from Passo Fundo (RS) and Três Lagoas (MS) have not been previously analyzed by classical cytogenetic techniques. Among the other populations, high interpopulational variation in NOR-bearing chromosomes was observed [28]. In individuals from Porto Nacional (TO), for example, in addition to NORs that were dispersed on several chromosomes, a unique C-band pattern was also detected that was mainly characterized by the presence of large pericentromeric blocks on most of the chromosomes [28]. Furthermore, the Physalaemus cuvieri from Porto Nacional (TO) also has a distinct genetic structure that can be observed using microsatellite markers, suggesting that some of individuals analyzed most likely belong to other species [61].

The majority of the Physalaemus cuvieri karyotypes analyzed here showed conspicuous differences in the PcP190 hybridization patterns, especially those from individuals from Porto Nacional (TO). The karyotype of these individuals had pericentromeric regions of several chromosomes that hybridized to the PcP190 probe, all of which corresponded to C-bands reported by Quinderé et al. [28]. On the other hand, the same pattern of PcP190 hybridization was seen in the karyotypes of individuals from Uberlândia (MG) and Três Lagoas (MS).

PcP190 Satellite DNA in the sex chromosomes of Physalaemus ephippifer

Interesting cytogenetic characteristics of Physalaemus ephippifer include the heteromorphic sex chromosomes Z and W, which are differentiated mainly by the presence of an additional region containing a NOR and a C-band on the terminal region of the short arm of the W chromosome, despite these differences, the chromosomes have similar sizes [29]. Additionally, the classical cytogenetic techniques (Giemsa staining, C-banding and the Ag-NOR method) revealed no differences between the long arms of these sex chromosomes, which have a pericentromeric C-band and a terminal NOR [29]. In the present study, however, we detected

41 hybridization of the PcP190 probe to the pericentromeric region of the long arm of the W chromosome that was noticeably stronger than that observed on the long arm of the Z chromosome. The NOR on the long arm of the W chromosome from the female analyzed here was also larger than the NOR on the long arm of the Z chromosome.

Based on these results, we suggest that not only the short arms but also the long arms of the Z and W chromosomes are different. However, the analysis of a larger sample of individuals with several males and females is needed to confirm that the larger PcP190 cluster is exclusively found on the W chromosome.

The accumulation of satellite DNA during sex chromosome differentiation is a common feature of eukaryotes and becomes more apparent when recombination is paused [62, 63]. Although this accumulation is intensified on either of the sex chromosomes, it is likely that homologous (or pseudo-homologous) regions contain the same family of satellite DNA, but with different copy numbers and/or arrangements of the clusters (e.g., 64, 65).

Conclusions

The PcP190 satellite DNA, which was originally found in Physalaemus cuvieri, was identified in representatives of two families of frogs, Leptodactylidae and Hylodidae, showing that these sequences are widely distributed and have been conserved in these frogs for at least 70 million years. Based on the pattern of non-random variation within the repeating units, we speculate that interplay between stochastic events and selective pressure along of the PcP190 satellite DNA sequences has occurred.

Differences in the chromosomal clusters of the PcP190 satellite DNA are evident among Physalaemus cuvieri populations and related species, suggesting highly dynamic amplification/deletion events. PcP190 satellite DNA appears to accumulate on the W chromosome of Physalaemus ephippifer, which may contribute to the differentiation process of the Z and W sex chromosomes in this species.

Competing interests

The authors declare no competing interests.

Authors' contributions

SEV designed the study, carried out the analyses and drafted the manuscript. SMRP and LBL coordinated the study and revised the manuscript. All authors read and approved the final version of the present study.

Authors' information

SEV, LBL and SMRP are from the Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, São Paulo, Brazil.

Acknowledgements

For the collection of specimens, the authors gratefully acknowledge the Denise de Cerqueira Rossa-Feres, Gilda Vasconcellos de Andrade, Janaína Ferreira Lima, Luis Felipe Toledo, Luiz Norberto Weber, Sérgio Siqueira, Carmen Busin, Daniel Pacheco Bruschi, Mauricio Papa de Arruda and Jonas José Vittorazzi. We thank Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES-PROAP), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, grant 2010/11300-7 and 2011/09239-0) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, grant 620163/2008- 9) for financial support and the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, protocol 02010.002895/03-84) for permission to collect animal samples.

References 1. Charlesworth B, Sniegowski P, Stephan W: The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature 1994, 371: 215-220.

2. López-Flores I, Ramos-Garrido MA: The Repetitive DNA Content of Eukaryotic Genomes. In Repetitive DNA. Volume 7. Edited by López-Flores I. Granada: Karger; 2012: 1–28.

3. Plohl M, Meštrović N, Mravinac B: Satellite DNA Evolution. In Repetitive DNA. Volume 7. Edited by López-Flores I. Granada: Karger; 2012: 126–152.

4. Kopecna O, Kubickova S, Cernohorska H, Cabelova K, Vahala J, Rubes J: Isolation and comparison of tribe-specific centromeric repeats within Bovidae. Journal of Applied Genetics 2012, 53: 193-202.

5. Tsoumani KT, Drosopoulou E, Mavragani-Tsipidou P, Mathiopoulos KD: Molecular Characterization and Chromosomal Distribution of a Species-Specific Transcribed Centromeric Satellite Repeat from the Olive Fruit Fly, Bactrocera oleae. PLOS One 2013, 8: 1-11.

6. Singer MF: Highly repeated sequences in mammalian genomes. International Review of Cytology 1982, 76: 67-112.

7. Picariello O, Feliciello I, Bellinello R, Chinali G: S1 satellite as a taxonomic marker in brown frogs: molecular evidence that Rana graeca graeca and Rana graeca italica are different species. Genome 2002, 45: 63-70.

8. Martinsen L, Venanzetti F, Johnsen A, Sbordoni V, Bachmann L: Molecular evolution of the pDo500 satellite DNA family in Dolichopoda cave crickets (Rhaphidophoridae). BMC Evolutionary Biology 2009, 9: 301-314.

9. Cazaux B, Catalan J, Justy F, Escudé C, Desmarais E, Britton-Davidian J: Evolution of the structure and composition of house mouse satellite DNA sequences in the subgenus Mus (Rodentia: Muridea): a cytogenomic approach. Chromosoma 2013, 122: 209-220.

10. Slamovits HC, Rossi MS: Satellite DNA: agent of chromosomal evolution in mammals. Mastozoología Neotropical 2002, 9: 297-308.

11. Kogan GL, Gvozdev VA: Molecular evolution of tandem heterochromatic repeats involving a switch of their function in the genome of Drosophila melanogaster. Russian Journal of Genetics 2002, 38: 586–593.

12. Ugarković D, Plohl M: Variation in satellite DNA profiles – causes and effects. EMBO Journal 2002, 21: 5955-5959.

13. Plohl M, Luchetti A, Meštrović N, Mantovani B: Satellite DNAs between selfishness and functionality: Structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin. Gene 2008, 409: 72-82.

14. Ferree PM, Prasad M: How can satellite DNA divergence cause reproductive isolation? Let us count the chromosomal ways. Genetics Research International 2012, 2012: 1-11.

15. Martins C, Ferreira IA, Oliveira C, Foresti F, Galetti PMG: A tandemly repetitive centromeric DNA sequence of the fish Hoplias malabaricus (Characiformers: Erythrinidae) is derived from 5S rDNA. Genetica 2006, 127: 133-141.

16. Plohl M: Those mysterious sequences of satellite DNAs. Periodicum Biologorum 2010, 112: 403-10.

17. Dover GA: Molecular drive in multigene families: how biological novelties arise, spread and are assimilated. Trends in Genetics 1986, 122: 159–165.

18. Dover GA: Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature 1982, 299: 111- 117.

19. Vittorazzi SE, Lourenço LB, Del-Grande ML, Recco-Pimentel SM: Satellite DNA derived from 5S rDNA in Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae). Cytogenetic and Genome Research 2011, 134: 101-107.

20. Frost DR (2014): Amphibian species of the world: an online reference. Version 6.0 (10 March 2014). [http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html]. American Museum of Natural History, New York, USA.

21. Nascimento BN, Caramashi U, Cruz CAG: Taxonomic review of the species groups of the genus Physalaemus Fitzinger, 1826 with revalidation of the genera Engystomops Jiménez- De-La-Espada, 1872 and Eupemphix Steindachner, 1863 (Amphibia, Anura, Leptodactylidae). Arquivos do Museu Nacional do Rio de Janeiro 2005, 63: 297-320.

22. Lynch JD: Systematic status of the american leptodactylid frog genera Engystomops, Eupemphix, and Physalaemus. Copeia 1970, 1970: 488-496.

23. Vittorazzi SE, Quinderé YRSD, Recco-PimentelSM, Tomatis C, Baldo D, Lima JRF, Ferro JM, Lima JD, Lourenço LB: Comparative cytogenetics of Physalaemus albifrons and Physalaemus cuvieri species groups (Anura, Leptodactylidae). Comparative Cytogenetics 2014, 8: 103-123.

24. Beçak ML, Denaro L, Beçak W: Polyploidy and mechanisms of karyotypic diversification in Amphibia. Cytogenetics 1970, 9: 225-238.

25. Denaro L: Karyotypes of Leptodactylidae anurans. Journal of Herpetology 1972, 6: 71- 74.

26. De Lucca EJ, Jim J, Foresti F: Chromosomal studies in twelve species of Leptodactylidae and one Brachycephalidae. Caryology 1974, 27: 183-191.

27. Silva APZ, Haddad CFB, Kasahara S: Nucleolus organizer regions in Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae), with evidence of a unique case of Ag-NOR variability. Hereditas 1999, 131: 135-141.

28. Quinderé YRSD, Lourenço LB, Andrade GV, Tomatis C, Baldo D, Recco-Pimentel SM: Additional cytogenetics analyses of the widespread anuran Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae) with emphasis on NOR variability. Biology Research 2009, 42: 79-92.

29. Nascimento J, Quinderé YRSD, Recco-Pimentel SM, Lima JRF, Lourenço LB: Heteromorphic Z and W sex chromosomes in Physalaemus ephippifer (Steindachner, 1864) (Anura, Leiuperidae). Genetica 2010, 138: 1127-1132.

30. Meštrović N, Plohl M, Mravinac B, Ugarković ĐÐ: Evolution of satellite DNAs from the genus Palorus - experimental evidence for the ‘library’ hypothesis. Molecular and Biology Evolution 1998, 15: 1062–1068.

31. Slamovits CH, Cook JA, Lessa EP, Rossi MS: Recurrent amplifications and deletions of satellite DNA accompanied chromosomal diversification in South American Tuco-tucos (Genus Ctenomys, Rodentia: Octodontidae): a phylogenetic approach. Molecular and Biology Evolution 2001, 18: 1708-1719.

32. Bruvo-Madaric B, Plohl M: Wide distribution of related satellite DNA families within the genus Pimelia (Tenebrionidae). Genetica 2007, 130: 35-42.

33. Caraballo DA, Belluscio PM, Rossi MA: The library model for satellite DNA evolution: a case study with the rodents of the genus Ctenomys (Octodontidae) from the Ibera marsh, Argentina. Genetica 2010, 138: 1201–1210.

34. Faivovich J, Ferraro DP, Basso NG, Haddad CFB, Rodrigues MT, Wheeler WC, Lavilla EO: A phylogenetic analysis of Pleurodema (Anura: Leptodactylidae: Leiuperinae) based on mitochondrial and nuclear gene sequences, with comments on the evolution of anuran foam nests. Cladistics 2012, 28: 460 – 482.

35. Pyron RA, Wiens JJ: A large-scale phylogeny of Amphibia including over 2,800 species, and a revised classification of extant frogs, salamanders, and caecilians. Molecular Phylogenetics and Evolution 2011, 61:543-583.

36. Fouquet A, Blotto BL, Maronna MM, Verdade VK, Juncá FA, de Sá R, Rodrigues MT: Unexpected phylogenetic positions of the genera Rupirana and Crossodactylodes reveal insights into the biogeography and reproductive evolution of leptodactylid frogs. Molecular Phylogenetics and Evolution 2013, 67: 445 – 457.

37. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

38. Hall TA: BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 1999, 41: 95-98.

39. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG: The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 1997, 25: 4876-4882.

40. Kimura M: A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 1980, 16: 111-120.

41. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S: MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 2011, 28: 2731-2739.

42. Librado P, Rozas J: DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 2009, 25: 1451-1452.

43. Junier T, Pagni M: Dotlet: diagonal plots in a web browser. Bioinformatics Application Notes 2000, 16: 178-179.

44. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW: NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012, 9: 671-675.

45. King M, Rofe R: Karyotypic variation in the Australian gecko Phyllodactylus marmoratus (Gray) (Gekkonidae: Reptilia). Chromosoma 1976, 54: 75-87.

46. Schmid M: Chromosome banding in Amphibia. I. Constitutive heterochromatin and nucleolus organizer regions in Bufo and Hyla. Chromosoma 1978, 66: 361-388.

47. Viegas-Pequignot E: In situ hybridization to chromosomes with biotinylated probes. In In situ hybridization: a practical approach. Edited by Willernson D. Oxford: Oxford University Press-IRL Press; 1992: 137-158.

48. Howell WM, Black DA: Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 1980, 36: 1014–1015.

49. Mehrotra S, Goel S, Raina SN, Rajpal, VR: Significance of Satellite DNA Revealed by Conservation of a Widespread Repeat DNA Sequence Among Angiosperms. Applied Biochemistry and Biotechnology 2014: 1-12.

50. Teruel M, Ruíz-Ruano FJ, Marchal JA, Sánchez A, Cabrero J, Camacho JPM, Perfectti F: Disparate molecular evolution of two types of repetitive DNAs in the genome of the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Heredity 2014, 112: 531-542.

51. Choo KH, Vissel B, Nagy A, Earle E, Kalitsis P: A survey of the genomic distribution of alpha satellite DNA on all the human chromosomes, and derivation of a new consensus sequence. Nucleic Acids Research 1991, 19: 1179-1182.

52. Bachmann L, Sperlich D: Gradual Evolution of a Specific Satellite DNA Family in Drosophila ambigua, D. tristis, and D. obscura. Molecular Biology and Evolution 1993, 10: 647-659.

53. Heslop-Harrison JS, Murata M, Ogura Y, Schwarzacher T, Motoyoshi F: Polymorphisms and Genomic Organization of Repetitive DNA from Centromeric Regions of Arabidopsis Chromosomes. The Plant Cell 1999, 11: 31-42.

54. Henikoff S, Ahmad K, Malik HS: The Centromere Paradox: Stable Inheritance with Rapidly Evolving DNA. Science 2001, 293: 1098-1102.

55. Zhang T, Talbert PB, Zhang W, Wu Y, Yang Z, Henikoff JG, Henikoff S, Jiang J: The CentO satellite confers translational and rotational phasing on cenH3 nucleosomes in rice centromeres. Proceedings of the National Academy of Sciences 2013, 110: 4875-4883.

56. Meštrović N, Randig O, Abad P, Plohl M, Castagnone-Sereno F: Conserved and variable domains in satellite DNAs of mitotic parthenogenetic root-knot nematode species. Gene 2005, 362: 44-50.

57. Meštrović N, Castagnone-Sereno P, Plohl M: High conservation of the differentially amplified MPA2 satellite DNA family in parthenogenetic root-knot nematodes. Gene 2006, 376: 260-267.

58. Hall SE, Kettler G, Preuss D: Centromere Satellites From Arabidopsis Populations: Maintenance of Conserved and Variable Domains. Genome Research 2003, 13: 195-205.

59. Ellingsen A, Slamovits CH, Rossi MS: Sequence evolution of the major satellite DNA of the genus Ctenomys (Octodontidae, Rodentia). Gene 2007, 392: 283–290.

60. Ferree PM, Barbash DA: Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology 2009, 7: 1–13.

61. Conte M, Zucchi MI, Andrade GV, Souza AP, Recco-Pimentel SM: Study of closely related species within the Physalaemus cuvieri group (Anura): contribution of microsatellite markers. Genetics and Molecular Research 2011, 10: 1434-1444

62. Singh L, Purdom IF, Jones KW: Satellite DNA and Evolution of Sex Chromosomes. Chromosoma 1976, 59: 43-62.

63. Charlesworth D, Charlesworth B, Marais G: Steps in the evolution of heteromorphic sex chromosomes. Heredity 2005, 95: 118-128.

64. Schemberger MO, Bellafronte E, Nogaroto V, Almeida MC, Schuhli GS, Artoni RF, Moreira-Filho O, Vicari MR: Differentiation of repetitive DNA sites and sex chromosome systems reveal closely related group in Parodontidae (Actinopterygii: Characiformes). Genetica 2011, 139: 1499-1508.

65. Steflova P, Tokan V, Vogel I, Lexa M, Macas J, Novak P, Hobza H, Vyskot B, Kejnovsky E: Contrasting Patterns of Transposable Element and Satellite Distribution on Sex Chromosomes (XY1Y2) in the Dioecious Plant Rumex acetosa. Genome Biology and Evolution 2013, 5: 769-782.

Tables

Table 1 – Analysis of the similarity among the PcP190 satellite DNA. Similarity compared to Physalaemus cuvieri (BA) sequences from GenBank (JF281121, JF281117, JF281109, JF281124 and JF281119; Vittorazzi et al. 2011).

Species Number of Average similarity Average similarity (%) sequences (%) intraindividual with P. cuvieri (BA) Physalaemus cuvieri (BA) 5 92 - Physalaemus cuvieri (MG) 2 93 93 Physalaemus cuvieri (RS) 1 - 95 Physalaemus cuvieri (TO) 5 90 93 Physalaemus cuvieri (PB) 3 91 92 Physalaemus centralis 5 95 92 Physalaemus albonotatus 5 95 88 Physalaemus albifrons 5 90 89 Physalaemus ephippifer 2 96 94 Physalaemus marmoratus 6 96 87 Physalaemus nattereri 5 87 67 Pleurodema diplolister 7 95 92 Leptodactylus latrans 8 91 68 Crossodactylus gaudichaudii 2 92 59

Table 2 – Percentage estimation of dot-blot hybridization of PcP190 satellite DNA.

Figures

Figure 1 – The geographic locations of the analyzed specimens.

Figure 2 – Alignment of 59 PcP190 satellite DNA monomers. The sequences are indicated by the name of the species, followed by number of the clone. In Physalaemus cuvieri, the two capital letters indicate the locality (see Figure 1). Colors indicate disagreement to the site with the majority at the same position and gaps indicate indels. Sequences with asterisk were extracted from GenBank. (JF281121, JF281117, JF281109, JF281124 and JF281119) and the accession number of the other are KM 361673 – KM361726. Figure created in Geneious 7.1 (Biomatters).

Figure 3 – Maximum likelihood analysis of PcP190 satellite DNA. Dendrogram of the evolutionary relationships of the PcP190 satellite DNA sequences isolated from Physalaemus species, Pleurodema diplolister, Leptodactylus latrans and Crossodactylus gaudichaudii. The species are differentiated by symbols and colors. The Physalaemus cuvieri populations are differentiated by red symbols. *Sequences from GenBank, JF281121, JF281117, JF281109, JF281124 and JF281119; Vittorazzi et al. 2011). The numbers indicate bootstrap values. Bootstrap values lower than 50 were omitted.

Figure 4 – PcP190 satellite DNA nucleotide diversity (Pi). Internal variation in the diversity rate of the PcP190 satellite DNA inferred from the analysis of 46 sequences. Two regions were recognizable, more conserved (MC) and less conserved (LC). The dotted line indicates the average Pi value of each region.

Figure 5 – Karyotypes of Physalaemus species hybridized with PcP190 satellite DNA probe. Karyotypes of the Physalaemus albifrons (a), Physalaemus albonotatus (b), Physalaemus centralis (c) and Physalaemus ephippifer (d). In the Physalaemus ephippifer, the inset shows the stronger detection on the W chromosome and the weaker detection on the Z chromosome, as well as the distinction between the PcP190 regions and the NOR regions detected by the Ag- NOR method (the signal was artificially converted to green in the merged image inside the inset).

Figure 6 – Karyotypes of specimens of Physalaemus cuvieri from different localities hybridized with PcP190 satellite DNA probe. Physalaemus cuvieri population from Uberlândia (MG) (a), Três Lagoas (MS) (b), Passo Fundo (RS) (c), Araruna (PB) (d) and Porto Nacional (TO) (e). The insets in e show with more details the signals on pairs 5 and 7.

VIII. Capítulo 2

Diversidade do DNAr 5S em Leiuperinae (Anura)

Stenio E. Vittorazzi1; Luciana B. Lourenço1; Shirlei M. Recco-Pimentel1

1Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, 13083-863 Campinas, São Paulo, Brasil

Palavras-chave: Anuros, Leiuperinae, DNAr 5S

Resumo Nos eucariotos existem duas classes de genes ribossomais, o 45S (ou 40S) e o 5S. Os genes 5S são compostos por 120 pares de bases conservados até mesmo em táxons distantes evolutivamente. A estrutura do DNAr 5S também é formada pelos espaçadores não transcritores (NTS), que geralmente apresentam composição de bases bastante variável entre espécies próximas e são até mesmo não reconhecidos entre táxons distantes. O objetivo do presente trabalho foi analisar as sequências do DNAr 5S de espécies pertencentes à subfamília Leiuperinae com o propósito de verificar a diversidade dessas sequências no genoma desses anuros. Quatro sequências distintas do DNAr 5S foram isoladas dos organismos em análise. Os DNAr 5S I e II foram detectados nas oito espécies de Physalaemus analisadas e em Pleurodema diplolister. O tipo I, além de ser o mesmo encontrado em Engystomops, gênero irmão de Physalaemus, é também compartilhado com quatro espécies do peixe Leporinus. O DNAr 5S II, até o momento, é exclusivo nos Leiuperinae. O DNAr 5S III, isolado de P. diplolister, é compartilhado com Gastrotheca riobambae; e o DNAr 5S IV isolado de P. cuvieri e P. kroyeri, é compartilhado com três espécies de salmão. Esses resultados mostram que no genoma desses anuros há sequências do DNAr 5S que permanecem conservadas desde a divergência evolutiva entre os Actinopterigio e Sarcopterigio. Os dados ainda sugerem uma grande diversidade de sequências de DNAr 5S no genoma dos anuros.

Introdução Os RNA ribossomais (RNAr) compõem os ribossomos, organelas ribonucleoproteicas que atuam na síntese de proteínas em todas as células. Duas classes de genes ribossomais podem ser reconhecidas nos eucariotos, uma que transcreve RNAr 45S (ou 40S), e outra que transcreve o RNAr 5S. Na maioria dos eucariotos superiores, a unidade de transcrição do DNA ribossomal (DNAr) 45S (ou 40S) é formada pelos genes 18S, 5,8S e 28S. O RNAr 18S após processado faz parte da subunidade menor do ribossomo. Já os RNAr 28S e 5,8S fazem parte da subunidade maior, juntamente com o RNAr 5S, que é transcrito pelo DNAr 5S (para referências, ver revisões de Long e Dawid, 1980; Kupriyanova, 2000; Torres-Machorro et al., 2010). Os genes ribossomais são consideravelmente variáveis quanto ao número de cópias existentes em cada organismo. Esse número variável de DNAr em diferentes espécies sugere que exista um mecanismo peculiar de regulação para a manutenção homeostática na biossíntese dos ribossomos (Torres-Machorro et al., 2010). A região gênica que transcreve RNAr 5S possui 120 pares de bases (pb) e é altamente conservada até mesmo em táxons distantes evolutivamente. A estrutura do DNAr 5S também é formada pelos espaçadores não transcritores (NTS), que geralmente apresentam composição de bases bastante variável entre espécies próximas e são até mesmo não reconhecidos entre táxons distantes (Long e Dawid, 1980; Schramm e Hernandez, 2002; Martins e Galetti, 2001a,b; Torres-Machorro et al., 2010). Muitos estudos com vertebrados que focam na organização e evolução molecular do DNAr 5S descrevem a presença de pelo menos dois tipos de sequências (Brown e Sugimoto, 1973; Harper et al., 1983, Daniels e Delany, 2003; Frederiksen et al., 1997; Jensen e Frederiksen 2000; Lazar et al., 1983; Leah et al., 1990; Martins e Galetti, 2001a,b; Pinhal et al., 2011; Vittorazzi et al., 2011; Merlo et al., 2012; Rodrigues et al., 2012; Merlo et al., 2013). A principal diferença entre essas sequências é dada pelo tamanho dos NTS, sugerindo que cada um deles evolui independentemente. Embora os primeiros estudos com DNAr 5S tenham sido realizados no anuro Xenopus laevis (Brown et al., 1971; Ford e Southern, 1973), há poucas informações sobre a evolução e diversidade dessa família multigênica nos anfíbios em geral. Em espécies de Xenopus, duas subclasses de DNAr 5S foram detectadas, designadas como tipo somático para aqueles expressos em células somáticas e oócitos, e o tipo oocítico expresso apenas em oócitos. Além

62 dessa diferença, há variação no tamanho dessas sequências e também apresentaram distinta localização cromossômica (Brown e Sugimoto, 1973; Harper et al., 1983). Em outros anfíbios, utilizando hibridação in situ, os genes 5S foram localizados nos cromossomos das espécies Ascaphus truei, Alytes obstetricans, Nyctixalus pictus (antes denominado Disclogossus pictus), Bombina variegata, Rana temporaria (antes denominada Rana esculenta), Rana kobai (antes denominada Rana castebeiana), Rana graeca e Rana temporaria. Os autores verificaram que nessas espécies o número de lócus de DNAr 5S varia de 1 a 6, podendo estar em posições intercalares, proximal aos telômeros e/ou centrômeros. Em outra análise, LiYan et al. (2013) detectaram sítios de DNAr 5S em cariótipos de diferentes populações de Quasipaa boulengeri (Ranidae), onde foi possível constatar uma variação interpopulacional que consiste na detecção do par 1 todas as populações estudadas, porém, em duas delas, o par 5 também foi evidenciado com sinal fraco de hibridação. Os autores sugeriram com esses dados que provavelmente o par 1 seja a condição ancestral desse DNAr 5S, enquanto o par 5 seja a condição derivada (LiYan et al., 2013). Nos anuros da subfamília Leiuperinae (família Leptodactylidae) foram detectados dois tipos de DNAr 5S, denominados tipos I e II (5S I e 5S II) em Physalaemus cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), Engystomops petersi e Engystomops freibergi (Rodrigues et al., 2012). Essas sequências foram detectadas em cromossomos distintos e ambas estão presentes em cromossomos homeólogos nas três espécies. Na análise comparativa das sequências do DNAr 5S foi verificado que as sequências classificadas como de mesmo tipo (I ou II) apresentam maior similaridade entre si, mesmo entre as três espécies, do que com as sequências de tipos diferentes da mesma espécie (Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012). A dinâmica e a variabilidade das sequências de genes ribossomais 5S têm sido baseadas em dois mecanismos evolutivos. Um deles é o chamado concerted evolution, pelo qual as cópias gênicas evoluem conjuntamente sofrendo homogeneização, e o segundo é o birth-and- death evolution, em que novas cópias são criadas por eventos de duplicação, sendo que algumas cópias são mantidas e outras são eliminadas ou tornam-se não funcionais. Esse modelo prevê, portanto, o surgimento de cópias parálogas, que contribuem no aumento da diversidade intragenômica de genes ribossomais (Nei e Roney, 2005). Contudo, tem sido proposto que, tanto concerted evolution quanto birth-and-death evolution podem atuar

63 conjuntamente na diversidade genética da família multigênica de DNAr 5S (Freire et al., 2010; Eirín-López et al., 2012). Nesse trabalho descrevemos sequências de DNAr 5S presente no genoma de algumas espécies da subfamília Leiuperinae, Physalaemus albifrons, P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. cuvieri, P. ephippifer, P. kroyeri, P. nattereri e Pleurodema diplolister. Novas sequências que se assemelham às de espécies distantes evolutivamente, como de outra família de anuros e até mesmo de peixes são comparadas e fornecem novas perspectivas sobre a evolução e a diversidade dessa família multigênica no genoma dos anuros.

Material e Métodos Animais Foram utilizadas amostras de espécimes de Physalaemus cuvieri (provenientes de três localidades), P. centralis, P. albonotatus, P. albifrons, P. ephippifer, P. cicada, P. kroyeri, P. nattereri e Pleurodema diplolistris (ver Tabela 1). O material biológico extraído desses animais está depositado no Banco de Células e Tecidos do Laboratório de Estudos Cromossômicos do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Unicamp. Os espécimes estão depositados no Museu de Zoologia “Adão José Cardoso” (ZUEC) da Universidade Estadual de Campinas ou no Museu Nacional do Rio de Janeiro (MNRJ) da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Extração de DNA genômico O DNA genômico foi extraído de amostras de fígado e/ou músculo estocadas a -80°C. Para tanto, os fragmentos dos tecidos foram macerados em TNES (Tris 0,05M pH7,5; NaCl 0,4M; EDTA 0,1M; e SDS 0,5%), suplementado com proteinase K (0,1 mg/mL) e mantidas a 55oC por cerca de 3 horas. Para degradação dos RNA, foi adicionado RNAse (0,05 mg/mL) nas amostras e mantidas a 37°C por 30 minutos. As proteínas foram removidas depois de precipitadas com NaCl (1,25 M). O DNA foi precipitado em isopropanol, lavado em etanol (70%) e, por fim, hidratado em tampão TE pH 8 (Tris-HCL 0,01M e EDTA 0,001M). Para análise qualitativa e quantitativa do DNA genômico obtido, amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose (0,8%) e comparadas com o marcador de massa molecular com concentração conhecida. E para verificar a pureza das amostras, assim como uma melhor precisão quantitativa, as amostras foram submetidas à espectrofotometria (NanoDrop ND- 1000).

Isolamento do DNAr 5S Amostras de DNA genômico foram submetidas à reação de PCR com os primers 5S-A (TACG CCCG ATCTC GTCC GATC) e 5S-B (CAGG CTGG TATG GCCG TAAGC) desenvolvidos para isolar DNAr 5S de Salmo trutta (Pendás et al., 1994) (Figura 1). A reação era constituída por cerca de 100 ng de DNA genômico, 0,6 pmol/µl de cada primer, 0,4 mM de dNTP, 6 mM de MgCl2, tampão e 1 unidade de Taq polimerase. A reação

65 começava com a temperatura de desnaturação de 94°C por 10 minutos seguidos por 39 ciclos de 94°C por 30 segundos, 63°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto, e para extensão final 72°C por 6 minutos. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% e posteriormente purificados utilizando o kit GFX PCR and Gel Band DNA Purification (GE Healthcare, Chalfont, Buckinghamshire, UK), conforme as instruções do fabricante.

Clonagem e sequenciamento As sequências resultantes da PCR foram ligadas ao vetor pGEM-T Easy Vector (Promega, USA). Os vetores recombinantes foram utilizados para a transformação de bactérias E. coli da linhagem JM109, com o auxílio do TransformAid™ Bacterial Transformation Kit (Fermentas, Burlington, Ontario, Canadá), seguindo orientação do fabricante. Seguindo o método proposto por Sambrook et al. (1989), as suspensões bacterianas foram plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina (100 µg/mL), X-gal (2% em dimetilformamida) e IPTG (50 mM) e incubadas overnight a 37° C no escuro. As colônias brancas foram retiradas com uma ponteira e cultivadas a 37o C por cerca de 16 horas em nova placa contendo meio LB sólido com ampicilina (100 µg/mL). Uma amostra de cada colônia foi submetida à reação de PCR com os primers T7 e SP6 para verificar a presença do inserto. Após confirmação da presença do inserto, o restante de cada colônia foi ressuspendido em meio LB líquido suplementado com ampicilina (100 µg/mL). Depois de algumas horas, parte das culturas líquidas foi utilizada para a extração de DNA plasmidial, seguindo o método de mini-prep descrito por Sambrook et al. (1989). Uma amostra de cada cultura líquida foi estocada a -80°C com glicerol (30% v/v). As amostras do DNA plasmidial foram utilizadas em reações de PCR com os primers T7 e SP6 e posteriormente submetidas à eletroforese em gel de agarose para a estimativa do tamanho do fragmento clonado em cada caso. Para o sequenciamento desses fragmentos, amostras dos produtos amplificados por PCR foram submetidas a reações de sequenciamento, com o auxílio do kit BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, USA). Os produtos das reações de sequenciamento foram purificados através da precipitação do DNA com etanol (80%), seguida de centrifugação a 4.680 rpm por 30 minutos, e depois lavados em etanol (70%) e novamente submetidos à centrifugação por 10 minutos. Depois de

66 secos, os produtos obtidos foram ressuspensos em loading dye (Blue-Dextran- EDTA/Formamida (1:5), desnaturados por 3 minutos a 94°C e aplicados em um sequenciador automático (ABI 3730XL DNA Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, California, USA).

Análise das sequências Todas as sequências obtidas foram editadas com o auxílio do software Bioedit (Hall, 1999) e comparadas com sequências depositadas no GenBank, utilizando a ferramenta BLASTn. Para análises mais detalhadas, as sequências obtidas e aquelas recuperadas do GenBank foram alinhadas usando o aplicativo ClustalW (Thompson et al., 1994). Agrupamentos dos genes 5S, assim como das sequências completas do DNAr 5S do tipo II foram inferidos usando o critério de máxima verossimilhança (Maximum Likelihood) e o modelo de Tamura e Nei (1993), com o auxílio do software MEGA6 (Tamura et al., 2013). A análise conjunta dos genes do DNAr 5S envolveu 76 caracteres e foi conduzida com 34 sequências de representantes de todas as espécies envolvidas nesse trabalho, assim como àquelas de táxons distantes utilizados nas comparações e inferências. Já a análise do DNAr 5S do tipo II envolveu 28 sequências e um total de 766 caracteres.

Hibridação in situ fluorescente Com base em uma sequência obtida de Pleurodema diplolister, um par de primers foi desenhado para amplificar apenas sua região NTS (denominada de NTS III): NTS-Pd-F2 ATT TCA ACC AGC AGG GGT CA e NTS-Pd-R2 AAC AGT CTG TGC TGG TGT GG. A marcação da sonda do NTS III de P. diplolister foi feita pela amplificação por PCR na presença dUTP-digoxigenina com o PCR DIG Probe Synthesis (Roche, Penzberg, Bavaria, Germany) e dos primers NTS-Pd-F2 e NTS-Pd-R2. Após essa reação, a sonda foi misturada a DNA de salmão sonicado (100 µg), acetado de sódio (0,3 M) e precipitada com etanol. Todo o DNA resultante foi ressuspendido em meio de hibridação (pH 7,0), que é composto por formamida deionizada (50%), SSC (2X), tampão fosfato (40 mM), solução de Denhardt, SDS (1%) e dextran sulfato (10%). O método de hibridação utilizado é o descrito por Viegas-Péquignot (1992) com adaptações para detecção de dUTP-digoxigenina por anticorpo anti-digoxigenina conjugado a rodamina (Roche, Penzberg, Bavaria, Germany).

As metáfases com sinais de hibridação evidentes foram capturadas no microscópio Olympus BX-60 e fotografadas com auxílio do software Q-Capture. As metáfases foram editadas com auxílio do software Adobe Photoshop CS4.

Resultados A PCR a partir de amostras genômicas de representantes da subfamília Leiuperinae mostrou amplificação predominante de duas bandas, sendo uma delas correspondente a fragmentos com aproximadamente 200 pb e outra de fragmentos com cerca de 700 pb. Após a clonagem e sequenciamento desses fragmentos, foi possível constatar que parte desses produtos se tratava de sequências pertencentes às subclasses do DNAr 5S do tipo I e do tipo II identificadas previamente por Vittorazzi et al. (2011) e Rodrigues et al. (2012). Entretanto, nem todas as sequências do gene 5S foram reconhecidas como pertencentes aos tipos I e II. Essas foram denominadas 5S tipo III e tipo IV (5S III e 5S IV). Todas as sequências obtidas estão apresentadas a seguir.

DNAr 5S do tipo I Foram obtidas de P. cuvieri (TO e PB), P. albifrons, P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. ephippifer, P. kroyeri, P. nattereri e P. diplolister sequências de DNAr 5S cujo o inserto era composto por 201 pb e altamente similares a sequências de DNAr 5S do tipo I de outros leiuperines (Figura 2, Tabela 1). Os segmentos em questão possuem também grande similaridade (98%) com sequências do DNAr 5S de algumas espécies de peixes Characiformes (Leporinus obtusidens, L. elongatus, L. cf. elongatus e L. macrocephalus; número de acesso ao GenBank AF284728 - AF284742, AF284747, DQ009524 - DQ009526). As duas regiões típicas do DNAr 5S, o gene e o NTS, foram identificadas. A região gênica é portadora de 120 pb e se mostrou conservada nas nove espécies analisadas (Figura 2). Desconsiderando as regiões correspondentes aos primers utilizados para a obtenção das sequências em questão, apenas 12 sítios da região presumivelmente transcritora foram polimórficos, sendo a frequência média de transição de 19,79 e de transversão, 2,60. A distância genética média entre as sequências foi de 0,030. Foram também reconhecidas as possíveis regiões de controle interno (ICR) em todos leiuperines estudados baseando-se em Pieler et al. (1985) (Figura 2). A região do NTS é portadora de 83 pb. Na sua porção inicial há nove resíduos de timina, possivelmente correspondente à região denominada de terminador poli-T, identificada originalmente por Korn e Brown (1978) em DNAr 5S de Xenopus. Outros dois domínios regulatórios da transcrição puderam ainda ser reconhecidos nesse NTS, um TATA-like e um

TATA-box (Figura 2). A análise comparativa do NTS de P. albifrons (P.albifrons-c2) contra o NTS de uma das sequências de Leporinus supracitadas (AF284742) mostrou que elas possuem 97% de similaridade.

DNAr 5S do tipo II Foram obtidas sequências de DNAr 5S com tamanhos variados para as espécies P. albifrons, P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. cuvieri, P. ephippifer, P. nattereri e P. diplolister, que se mostraram similares a sequências de DNAr 5S do tipo II de P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), E. petersi e E. freibergi (Rodrigues et al., 2012) (Figura 3, Tabela 1). Foi possível reconhecer duas regiões principais em todas as sequências dessa subclasse: o gene, portador de 120 pb, sendo que dentre os 76 nucleotídeos dessa região analisados, 18 sítios foram polimórficos (Figura 3), a frequência média de transição de 12,60, a de transversão de 6,20, e a distância genética média entre elas de 0,059. Foi possível reconhecer as ICR nas oito espécies baseando-se em Pieler et al. (1985). Já a outra região, o NTS, apresentou tamanho variável entre as espécies, sendo o menor deles com 491 pb, encontrado em P. diplolister, e o maior com 647 pb, encontrado em P. nattereri (Tabela 2). A variabilidade da região correspondente ao NTS possibilitou que na análise de máxima verossimilhança as sequências fossem agrupadas de acordo com a espécie de origem, mostrando que apresentam sinal filogenético (Figura 4).

DNAr 5S do tipo III Uma sequência de 478 pb isolada de P. diplolister (Figura 5) apresentou grande semelhança com a região gênica do DNAr 5S, entretanto, seu NTS não apresentou qualquer semelhança com os NTSs dos DNAr 5S do tipo I e do tipo II dos demais leiuperines (Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012, presente trabalho). A busca por sequências semelhantes no GenBank, utilizando a ferramenta BLASTn, mostrou que a região presumivelmente transcritora dessa sequência apresenta alta similaridade com sequências de DNAr 5S de várias espécies. Entretanto, considerando apenas o NTS nessa busca, essa sequência assemelhou-se com maior proeminência a uma parte do DNAr 5S de Gastrotheca riobambae (Anura, Hemiphractidae) (del Pino et al., 1992; GenBank M74438.1), e em menor grau com o DNAr 5S de oócitos de Xenopus tropicalis

(Anura, Pipidae) (Nietfeld et al., 1988; GenBank X12624.1 ). O alinhamento dessas sequências é mostrado na Figura 5. A sequência de G. riobambae possui 1052 pb, onde se encontra um gene 5S com 120 pb, um pseudogene do DNAr 5S com 79 pb e intercalando essas duas regiões há uma porção correspondente ao NTS (del Pino et al., 1992). O NTS do 5S III de P. diplolister mostrou similaridade de 88,8% com uma região de 135 pb da sequência que intercala o gene e pseudogene de G. riobambae (Figura 5). A sequência de X. tropicalis pertencente ao tipo oocítico de DNAr 5S possui 264 pb, dos quais 120 pb pertencem ao gene e estão intercalados por sequências correspondentes ao NTS (Nietfeld et al., 1988). O NTS do 5S do tipo III de P. diplolister apresentou similaridade (69,1%) com uma região de 83 pb do NTS dessa sequência de Xenopus (Figura 5). A sonda produzida com os primers desenhados para amplificar o NTS III de P. diplolister possibilitou a detecção dessa sequência na região intersticial do braço longo do cromossomo 5 dessa espécie (Figura 6).

DNAr 5S do tipo IV Três sequências, sendo duas de P. cuvieri (324 e 317 pb) e uma de P. kroyeri (317 pb), apresentaram peculiaridades que permitiram denomina-las como DNAr 5S do tipo IV. As três sequências possuem uma região correspondente ao gene 5S e uma região correspondente ao NTS, uma com 248 pb e outras duas com 241 pb (Figura 7). A comparação dessas sequências com aquelas disponíveis no GenBank mostrou semelhanças entre as sequências de DNAr 5S do tipo IV encontradas em Physalaemus com inúmeros outros genes 5S de diferentes espécies. Entretanto, nessa análise, as comparações com três espécies de salmão [Salmo salar (S73106.1; Pendás et al., 1994), Salmo trutta (HQ681118.1; Tognoli et al., 2011) e Oncorhynchus kisutch (DQ534549.1; Lam e Iturra, não publicado)] nos chamaram mais atenção, pois, além da similaridade entre as regiões gênicas, mostraram também semelhança entre os NTSs (Figura 7). A similaridade das sequências de DNAr do tipo IV de P. cuvieri e P. kroyeri com aquelas das espécies S. trutta e O. kisutch se estende por toda a sequência, com algumas inserções/deleções ao longo das regiões de NTS (Figura 7). Já em relação à sequência de S.

71 salar, apenas parte do NTS pode ser alinhada com aquelas de DNAr do tipo IV de P. cuvieri e P. kroyeri (Figura 7).

Análise integrada dos genes 5S A análise de máxima verossimilhança integrando as sequências gênicas dos DNAr 5S dos tipos I, II, III, IV, oocítico e somático de X. tropicalis e X. laevis, sequências de G. riobambae e das três espécies de salmão, S. salar, S. trutta e O. kisutch, mostrou a formação de dois grandes grupos, sendo um deles constituído pelas sequências do tipo II e o outro constituído por todas as demais sequências da análise (Figura 8). Entretanto, uma exceção pode ser observada, a sequência de P. cuvieri (P.cuvieriTO-c1), a qual é caracterizada como sendo do tipo I, agrupou-se com as sequências do tipo II, isso se deve ao fato de que na primeira metade da região gênica sua composição é mais similar à porção pertencente ao gene 5S II (Figura 9).

Discussão DNAr 5S dos tipos I e II Em inúmeros estudos realizados com vertebrados têm sido detectadas formas variantes do DNAr 5S, predominantemente em diversas espécies de peixes (Pendás et al., 1995; Martins e Galletti 2001a,b; Alves-Costa et al., 2006; Pinhal et al., 2009; Merlo et al., 2012), mas também em aves (Lazar et al., 1983; Daniels e Delany, 2003), mamíferos (Leah et al., 1990; Frederiksen et al., 1997, Jensen e Frederiksen 2000) e até em anuros (Wegnez et al., 1972; Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012). Os primeiros estudos com DNAr 5S de anuros foram realizados com pipídeos do gênero Xenopus e datam da década de 1970 (Brown et al., 1971; Wegnez et al., 1972; Brown e Sugimoto 1973; Ford e Southern 1973; Korn e Brown 1978, entre outros). Foi verificada a existência de duas subclasses de sequências, que apresentaram expressão diferencial. Em uma dessas subclasses, denominada DNAr 5S do tipo somático, o gene 5S é expresso tanto em células somáticas quanto em oócitos; já a outra subclasse, denominada DNAr 5S do tipo oocítico, se expressa apenas nos oócitos (Wegnez et al., 1972; Wormington e Brown 1983). Além disso, essas sequências foram caracterizadas por sua distinção no tamanho, composição nucleotídica, e número de repetições no genoma (Brown e Sugimoto, 1973; Peterson et al., 1980). Mais recentemente, dois tipos de sequências de DNAr 5S foram encontrados em três espécies de anuros da subfamília Leiuperinae de Leptodactylidae, a saber Physalaemus cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), Engystomops petersi e Engystomops freibergi (Rodrigues et al., 2012). Essas sequências, denominadas DNAr 5S do tipo I e do tipo II, se distinguem em vários aspectos, mas principalmente em relação ao tamanho e à composição do NTS. É também interessante destacar que essas subclasses de sequências se encontram preferencialmente agrupadas cromossomos distintos nas três espécies estudadas (Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012). No presente trabalho, sequências de DNAr 5S do tipo I e do tipo II foram detectadas em outras populações de P. cuvieri e em outras oito espécies de leiuperine. Embora nossa análise não tenha propósito filogenético, ao comparar a topologia gerada com o DNAr 5S II com a proposta filogenética baseada em genes mitocondriais e nuclear (Lourenço et al., em preparação), foi possível notar sinal filogenético nos agrupamentos.

Ao analisar por máxima verossimilhança as sequências do gene 5S de Xenopus, tanto o tipo somático quanto oocítico com as sequências aqui descritas, observou-se que essas se agrupam com o 5S do tipo I dos leiuperines. No entanto, no presente trabalho não foi possível reconhecer nenhuma região dos NTS das sequências dos leiuperines que fosse similar ao NTS das sequências de Xenopus, corroborando o que foi verificado por Vittorazzi et al. (2011) e Rodrigues et al. (2012). A funcionalidade do DNAr 5S dos tipos I e II nos leiuperines é outra questão que permanece aberta. Foi possível detectar as regiões muito similares àquelas que controlam a ativação da transcrição do gene 5S em outros organismos, a qual foi inicialmente caracterizada em Xenopus borealis (Sakonju et al., 1980; Bogenhagen et al., 1980) e posteriormente denominada de ICR, constituída de três regiões, Box A, IE e Box C (Pieler et al., 1985). Além disso, uma região rica em T, denominada Poli-T, encontrado na porção 3´ ao gene 5S em Xenopus (Korn e Brown, 1978), também pode ser reconhecida nas sequências dos Leiuperines. Assim, tomando essas características em conjunto, a funcionalidade dos DNAr 5S tipo I e II se tornam prováveis. Mesmo que o gene 5S seja conservado nos eucariotos, foi possível notar certo polimorfismo nas sequências aqui estudadas, dentro de cada tipo (I e II) e até mesmo no nível intraindividual, como observado em P. albonotatus e P. ephippifer. Essa é uma característica comum em famílias multigênicas (Nei e Rooney 2005; Alves-Costa et al., 2008; Freire et al., 2010; Pinhal et al., 2009). Entretanto, diferenças mais pronunciadas não são esperadas devido à ocorrência de concerted evolution, que envolve eventos como conversão gênica, crossing over desigual e transposição replicativa (Dover 1986, 2002). Contudo, a velocidade com que os tipos variantes das sequências tornam-se homogeneizados está relacionada a fatores tais como o número de unidades repetitivas no cluster genômico, a ação da seleção natural e o tamanho efetivo da população (Ohta e Dover 1984; Dover 1986, 2002; Schlotterer e Tautz 1994). É importante apontar aqui que a distinção observada entre os tipos de DNAr 5S no genoma dos anuros sugere que os processos de homogeneização entre essas subclasses de sequências sejam restritos. Notou-se, por outro lado, que uma sequência de P. cuvieri (P.cuvieriTO-c1) que possui o NTS do DNAr 5S do tipo I apresenta a região gênica mais similar à do gene do DNAr 5S do tipo II na sua porção inicial, indicando assim uma provável

74 recombinação entre esses dois tipos de sequências. Entretanto, devido ao baixo número de nucleotídeos para essa inferência, não é descartada a possibilidade que paralelismo tenha ocorrido. A alta similaridade entre os NTS do DNAr 5S tipo I dos leiuperines (Vittorazzi et al., 2011; Rodrigues et al., 2012; presente trabalho) com sequências de algumas espécies de peixes Characiformes do gênero Leporinus (Ferreira et al., 2007), possibilita a inferência de que o DNAr 5S I tenha tido sua origem pelo menos em um ancestral comum entre Actinopterigio (onde se aloca a ordem Characiformes) e Sarcopterigio (onde se aloca a ordem Anura) (Maisey 1986; Mabee 2000; Amores et al., 2011), indicando assim que essa sequência sofre forte pressão seletiva por se manter conservada ao longo de pelo menos 440 milhões de anos (Hedges 2009; Amores et al., 2011).

Novas variantes de DNAr 5S em anuros Além dos dois tipos de DNAr 5S apresentados, baseado no NTS, outras duas distintas sequências puderam ser reconhecidas em alguns dos representantes estudados, as quais foram denominadas de DNAr tipo III e IV. É importante salientar aqui que essas sequências não apresentaram nenhuma similaridade (com exceção entre as regiões gênicas) com as sequências de DNAr 5S dos tipos I e II. A sequência de DNAr 5S do tipo III isolada de P. diplolister (Leptodactylidae) apresentou características que se assemelham, em parte, às sequências dos DNAr 5S de Gastrotheca riobambae (Hemiphractidae) e Xenopus tropicalis (Pepidae). Essas semelhanças mostram que essa sequência, referente à porção inicial do NTS, esteve presente em um ancestral comum entre essas espécies, sendo que, a divergência evolutiva entre as linhagens que deu origem às famílias Hemiphractidae e Leptodactylidae se deu há cerca de 80 milhões de anos no período Cretáceo (Fouquet et al., 2013) e Pepidae e Leptodactylidae se deu há cerca de 200 milhões de anos no período Triássico (Bossuyt e Roelants 2009). Assim, é possível inferir que essa região conservada do NTS do DNAr 5S do tipo III encontrado nessas três espécies provavelmente sofre forte pressão seletiva, e como ela está na porção 3´ do gene 5S, talvez sua função esteja relacionada ao controle da transcrição. A semelhança desses DNAr 5S nessas três espécies, P. diplolister, G. riobambae e X. tropicalis levanta uma questão interessante, a qual consiste que DNAr 5S do tipo oocítico

75 possui sua ocorrência mais ampla do que apenas nas espécies de Xenopus, indicando que a expressão gênica desse tipo especial de 5S durante a ovogênese e embriogênese possa ser uma característica mais ampla do que se propunha até então. A localização do NTS do DNAr 5S do tipo III em um par cromossômico de P. diplolister mostra que essa sequência está organizada em um cluster relativamente grande, sugerindo, assim, um número expressivo de cópias no genoma. O DNAr 5S do tipo IV encontrado nos leiuperines P. cuvieri e P. kroyeri se assemelha à sequência do NTS de três espécies de peixe da família Salmonidae, S. salar, S. trutta e O. kisutch. Essa informação nos remete mais uma vez a um NTS conservado evolutivamente, e que provavelmente a forte pressão seletiva vem atuando por pelo menos 440 milhões de anos, tempo de divergência entre os Actinopterigio e Sarcopterigio (Maisey, 1986; Mabee, 2000; Amores et al., 2011). A proposta de que essas sequências de DNAr 5S sejam conservadas evolutivamente nessas espécies com distante relação filogenética, seja dentro dos anuros ou, principalmente, entre anuros e peixes, é possível ser contrariada uma vez que as similaridades observadas podem se tratar apenas de homoplasia.

Conclusão Os DNAr 5S I e IV estão presentes nos Leiuperinae e se mantiveram conservados, por pelo menos, desde divergência evolutiva entre Actinopterygii e Sarcopterygii. Até o momento, o DNAr 5S II é exclusivo em Leiuperinae, já o DNAr 5S III possui um segmento do NTS conservado entre os anuros, o que indica pressão seletiva atuando nessa parte da região não transcritora. Além da condição conservada dos genes 5S e NTS (ou parte deles), ainda não temos evidências da funcionalidade de cada uma dessas sequências, se elas atuam conjuntamente ou em estágios diferentes do desenvolvimento. Assim, experimentos que verifiquem a expressão dos diferentes genes 5S em um mesmo organismo, assim como nas diferentes fases do desenvolvimento, devem ser averiguados. No entanto, o isolamento dessas sequências nos sugere uma grande diversidade de sequências de DNAr 5S no genoma dos anuros.

Agradecimentos Nós agradecemos pela coleta de espécimes à Gilda Vasconcellos de Andrade, Janaina Ferreira Lima, Mirco Solé, Thiago Alves de Oliveira, Décio Tadeu Correa Filho, Carmen Busin, Daniel Pacheco Bruschi, Sérgio Siqueira Junior e Jonas José Vittorazzi. Agradecemos a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES-PROAP), a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, grant 2010/11300-7) e o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, protocol 620163/2008-9) pelo apoio financeiro; e o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, protocol 02010.002895/03-84) pela autorização às coletas de anuros.

Referências Alves-Costa FA, Martins C, Matos FDC, Foresti F, Oliveira C, Wasko AP (2008). 5S rDNA characterization in twelve Sciaenidae fish species (Teleostei, Perciformes): Depicting gene diversity and molecular markers. Genetics and Molecular Biology 31: 303 – 307.

Amores A, Catchen J, Ferrara A, Fontenot Q, Postlethwait JH (2011). Genome Evolution and meiotic maps by massively parallel DNA sequencing: spotted gar, an outgroup for the teleost genome duplication. Genetics 188: 799 – 808.

Bogenhagen DF, Sakonju S, Brown DD (1980). A control region in the center of the 5s RNA gene directs specific initiation of transcription: ii. the 3’ border of the region. Cell 19: 27 – 35.

Bossuyt F, Roelants K (2009). Anura. Hedges SB, Kumar S eds. The timetree of life: 357 – 364. New York, USA, Oxford University Press.

Brown DD, Sugimoto K (1973). 5S DNAs of Xenopus laevis and Xenopus mulleri: Evolution of a gene family. Journal of Molecular Biology 78: 397 – 415.

Brown DD, Wensink PC, Jordan E (1971). Purification and some characteristics of 5S DNA from Xenopus laevis. Proceedings of the National Academy of Sciences 68: 3175 – 3179.

Daniels LM, Delany ME (2003). Molecular and cytogenetic organization of the 5S ribosomal DNA array in chicken (Gallus gallus). Chromosome Research 11: 305 – 317. del Pino EM, Murphy C, Masson PH, Gall JG (1992). 5S rRNA-encoding genes of the marsupial frog Gastrotheca riobambae. Gene 111: 235 – 238.

Dover GA (1986). Molecular drive in multigene families: how biological novelties arise, spread and are assimilated. Trends in Genetics 2: 159 – 165.

Dover G (2002). Molecular Drive. Trends in Genetics 18: 587 – 589.

Eirín-López JM, Rebordinos L, Rooney AP, Rozas J (2012). The Birth- and- Death Evolution of Multigene Families Revisited. In: Repetitive DNA. Garrido-Ramos (ed). Karger, vol 7: 170-196.

Ferreira IA, Oliveira C, Venere PC, Galetti PM, Martins C (2007). 5S rDNA variation and its phylogenetic inference in the genus Leporinus (Characiformes: Anostomidae). Genetica 129: 253 – 257.

Freire R, Arias A, Ínsua AM, Mendez J, Eirín-López JM (2010). Evolutionary Dynamics of the 5S rDNA Gene Family in the Mussel Mytilus: Mixed Effects of Birth-and-Death and Concerted Evolution. Journal of Molecular Evolution 70: 413 – 426.

Ford PJ, Southern EM (1973). Different sequences for 5S RNA in kidney cells and ovaries of Xenopus laevis. Nature New Biology 241: 7 – 12.

Fouquet A, Blotto BL, Maronna MM, Verdade VK, Juncá FA, de Sá R, Rodrigues MT (2013) Unexpected phylogenetic positions of the genera Rupirana and Crossodactylodes reveal insights into the biogeography and reproductive evolution of leptodactylid frogs. Molecular Phylogenetics and Evolution 67: 445 – 457.

Frederiksen S, Cao H, Lomholt B, Levan G, Hallemberg C (1997). The rat 5S rRNA bona fide gene repeat maps to chromosome 19q12→qter and the pseudogene repeat maps to 12q12. Cytogenetic and Cell Genetics 76:101 – 106.

Hall TA (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95 – 98.

Harper ME, Price J, Korn LJ (1983). Chromosonal mapping of Xenopus 5S genes: somatic type versus oocyte-type. Nucleic Acids Research 11: 2313 – 2323.

Hedges SB. Vertebrates (Vertebrata). Pg 309-314 in The Timetree of Life, Hedges SB, Kumar S. Eds (Oxford University Press, 2009).

Jensen LR, Frederiksen S (2000). The 5S rRNA genes in Macaca fascicularis are organized in two large tandem repeats. Biochimica et Biophysica Acta 1492: 537 – 542.

Korn LJ, Brown DD (1978). Nucleotide sequence of Xenopus borealis oocyte 5S DNA: comparison of sequences that flank several related eucaryotic genes. Cell 15: 1145 – 1156.

Kupriyanova NS (2000). Conservation and variation of ribosomal DNA in eukaryotes. Molecular Biology 5: 637 – 647.

Lazar E, Haendler B, Jacob M (1983). Two 5S genes are expressed in chicken somatic cells. Nucleic Acids Research 11: 7735 – 7741.

Leah R, Frederiksen S, Engberg J, Sorensen PD (1990). Nucleotide sequence of a mouse 5S rRNA variant gene. Nucleic Acids Research 18: 7441.

Long EO, Dawid IB (1980). Repeated genes in eukaryotes. Annual Review of Biochemistry 49: 727 – 764.

Mabee PM (2000). Developmental data and phylogenetic systematics: evolution of the vertebrate limb. American Zoologist 40: 789 – 800.

Maisey JG (1986). Heads and tails: a chordate phylogeny. Cladistics 2: 201 – 256.

Martins C, Galletti-Jr PM (2001a). Chromosomal localization of 5S rDNA genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Genome 44: 903 – 910.

Martins C, GallettiI-JR PM (2001b). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is it a general rule for fishes? Genetica 111: 439 – 446.

Merlo MA, Pacchiarini T, Portela-Bens S, Cross I, Manchado M, Rebordinos L (2012). Genetic characterization of Plectorhinchus mediterraneus yields important clues about genome organization and evolution of multigene families. BMC Genetics 13: 1-13.

Nei M, Rooney AP (2005). Concerted and birth-and-death evolution of multigene families. Annual Review of Genetics 39: 121 – 152.

Nietfeld W, Digweedt M, Mentzel H, Meyerhof W, Köster M, Knöchel W, Erdmannt VA, Pieler T (1988). Oocyte and somatic 5S ribosomal RNA and 5S RNA encoding genes in Xenopus tropicalis. Nucleic Acids Research 16: 8803 – 8815.

Ohta T, Dover G (1984). The Cohesive Population Genetics of Molecular Drive. Genetics 108: 501 – 521.

Pendás AM, Moran P, Freije JP, Garcia-Vazquez E: Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenetic and Cell Genetic 1994, 67: 31 – 36.

Peterson RC, Doering JL, Brown DD (1980). Characterization of Two Xenopus Somatic 5s DNAs and One Minor Oocyte Specific 5s DNA. Cell 20: 131 – 141.

Pieler T, Oei SL, Hamm J, Engelke U, Erdmann VA (1985). Functional domains of the Xenopus laevis 5S gene promoter. EMBO Journal. 1985 13: 3751 – 3756.

Pinhal D, Yoshimura TS, Araki CS, Martins C (2011). The 5S rDNA family evolves through concerted and birth-and-death evolution in fish genomes: an example from freshwater stingrays. BMC Evolutionary Biology 11: 1 – 14.

Rodrigues DS, Rivera M, Lourenço LB (2012). Molecular organization and chromosomal localization of 5S rDNA in Amazonian Engystomops (Anura, Leiuperidae). BMC Genetics 13: 17.

Sakonju S, Bogenhagen DF, Brown DD (1980). A control region in the center of the 5s RNA gene directs specific initiation of transcription: i. the 5’ border of the region. Cell 19: 13 – 25.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schlotterer C, Tautz D (1994). Chromosomal homogeneity of Drosophila ribosomal DNA arrays suggests intrachromosomal exchanges drive concerted evolution. Current Biology 4: 777 – 783.

Schramm L, Hernandez N (2002). Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Development 16: 2593 – 2620.

Tamura K, Nei M (1993). Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10: 512 – 526.

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013). MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725 – 2729.

Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673 – 4680.

Tognoli C, Saroglia M, Terova G, Gornati R, Bernardini G (2011). Identification of fish species by 5S rRNA gene amplification. Food Chemistry 129: 1860 – 1864.

Torres-Machorro AL, Hernández R, Cevallos AM, Lópes-Villaseñor I (2010). Ribosomal RNA genes in eukaryotic microorganisms: witnesses of phylogeny? Microbiology Review 34: 59 – 86.

Viegas-Péquignot E: In situ Hybridization to chromosomes biotinylated probes. In situ Hybridization: A practical approach. Edited by: Wilkinson DG. The Practical Approaches Series; 1992:137 – 157.

Vittorazzi SE, Lourenço LB, Del-Grande ML, Recco-Pimentel SM (2011). Satellite DNA derived from 5S rDNA in Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae). Cytogenetics and Genome Research 134: 101 – 107.

Vitelli L, Batistoni R, Andronico F, Nardi I, Barsacchi-Pilone G (1982). Chromosomal localization of 18S+28S and 5S ribosomal RNA genes in evolutionary diverse amphibians. Chromosoma 84: 475 – 491.

Wegnez M, Denis H (1973). Biochemical research on cogenesis. 6. Properties of 5S RNA present in the different cellular compartments of Xenopus laevis oocytes. Biochimie 55: 1129 - 35.

Wormington WM, Brown DD (1983). Onset of 5S RNA Gene Regulation during Xenopus Embryogenesis. Developmental Biology 99: 248 – 257.

Tabela 1. Espécies e populações analisadas com seus respectivos números de identificação e localidade. Os sinais positivos indicam a quantidade de cada sequência do DNAr 5S e os sinais negativos indicam sequência não extraída. Museu de Zoologia “Prof. Adão José Cardoso” (ZUEC) e Museu Nacional do Rio de Janeiro (MNRJ).

Espécie Voucher Localidade 5SI 5SII 5SIII 5SIV Museu P. cuvieri ZUEC Passo Fundo, Rio - + - - 14649 Grande do Sul (RS), Brasil

P. cuvieri ZUEC Porto Nacional, + + + - + + 14699 Tocantins (TO), Brasil

P. cuvieri ZUEC Araruna, + - - - 17899 Paraíba (PB), Brasil

P. centralis ZUEC Luís Antônio, + + + - - 16414 São Paulo (SP), Brasil

P. albonotatus ZUEC Lambari do Oeste, + + + + + - - 16420 Mato Grosso (MT), Brasil

P. albifrons MNRJ Barreirinhas, + + + - - 24210 Maranhão (MA), Brasil

P. albifrons ZUEC Alagoinhas, - + + - - 17902 Bahia (BA), Brasil

P. ephippifer ZUEC Belém, + + + - - 13735 Pará (PA), Brasil

P. cicada ZUEC Limoeiro, + + + + + - - 17914 Pernambuco (PE), + Brasil

P. kroyeri ZUEC Ilhéus, + - - + 17480 Bahia (BA), Brasil

P. nattereri ZUEC Lambari do Oeste, + + + - - 13393 Mato Grosso (MT), Brasil

Pleurodema ZUEC Limoeiro, + + + + - diplolister 17915 Pernambuco (PE), Brasil

Tabela 2. Sequências de NTS tipo II. Espécie Tamanho do NTS (pb) P. albifrons 557, 572 e 589 P. albonotatus 567 P. centralis 590 e 593 P. cicada 625, 625, 625, 610 e 622 P. cuvieri (RS) 621 P. cuvieri (TO) 590 e 607 P. ephippifer 608 P. nattereri 645 e 647 P. diplolister 491 e 491

Figura 1. Representação das regiões de anelamento dos primers 5S A e B (setas pretas) (Pendás et al., 1994). As regiões em vermelho correspondem ao gene 5S, as regiões em azul correspondem ao espaçador não transcritor (NTS) e os insets estriados indicam o tamanho variável dos NTS.

Figura 2. Alinhamento das sequências do DNAr 5S do tipo I das espécies P. cuvieri, P. centralis, P. ephippifer, P. albonotatus, P. kroyeri P. albifrons, P. cicada, P. nattereri, E. petersi, E. freibergi, e P. diplolister. Na caixa cinza está inserida a região transcritora e cinza escuro indica as regiões de controle interno (ICR), TATA-like e TATA-box. Regiões em cores mostra discordância do sítio com a maioria das sequências (A: vermelho; C: azul; G: amarelo; T: verde). Stas mostram a região de anelamento dos primers. *Sequências extraídas do GenBank (números de acesso JF281129 - JF281131, JF325865 - JF325870). Figura criada no software Geneious 7.1 (Biomatters).

Figura 3. Alinhamento das sequências do DNAr 5S do tipo II das espécies de P. cuvieri, P. ephippifer, P. centralis, P. albonotatus, P. albifrons, P. cicada, P. nattereri, E. petersi, E. freibergi e P. diplolister. Partes em cinza indicam bases iguais com a maioria dos sítios, e cinza escuro indica a região transcritora do gene 5S. Regiões em cores mostram discordância dos sítios com a maioria das sequências (A: vermelho; C: azul; G: amarelo; T: verde). Linhas indicam indel e setas mostram a região de anelamento dos primers. *Sequências extraídas do GenBank, JF281132 - JF281134, JF325848 - JF325850, JF325843 - JF325845. Figura criada no software Geneious 7.1 (Biomatters).

Figura 4. Máxima Verossimilhança das sequências do DNAr 5S do tipo II das espécies P. cuvieri, P. ephippifer P. centralis, P. albonotatus, P. albifrons, P. cicada, P. nattereri, E. petersi, E. freibergi e P. diplolister. Nota-se o agrupamento espécie-específico das sequências nos ramos, exceto P. cuvieri e P. ephippifer. *Sequências extraídas do GenBank, (P. cuvieri JF281132-JF281134, E. petersi JF325848-JF325850 e E. freibergi JF325843-JF325845). Os valores de suporte são indicados nas bases dos ramos.

Figura 5. Representação esquemática do alinhamento do (a) DNAr 5S do tipo III de P. diplolister com as sequências de (b) G. riobambae (GenBank M74438.1) e (c) X. tropicalis (GenBank X12624.1). As regiões em vermelho referem-se ao gene 5S e em azul ao espaçador não transcritor (NTS). Setas pretas indicam as regiões de anelamento dos primers. A caixa cinza sobreposta no NTS em a, b e c indica a região de similaridade dessas sequências, detalhada em d.

Figura 6. Hibridação in situ fluorescente com sonda do NTS do DNAr 5S do tipo III em metáfase de P. diplolister. A região intersticial do braço longo do cromossomo 5 é evidenciada. Barra = 5µm.

Figura 7. Alinhamento do DNAr 5S do tipo IV de P. cuvieri (c7 e c3) e P. kroyeri (c7) com sequências encontradas nos peixes Oncorhynchus kisutch (DQ534549.1), Salmo trutta (HQ681118.1) e Salmo salar (S73106.1). (a) As regiões em vermelho referem-se ao gene 5S e em azul ao espaçador não transcritor (NTS). A caixa cinza mostra as regiões de similaridade entre as seis sequências e que pode ser visto com detalhes em b.

Figura 8. Máxima Verossimilhança dos genes 5S: tipos I (vermelho), II (verde), III (amarelo), IV (azul), do tipo somático e oocítico de X. tropicalis e X. laevis, G. riobambae e dos peixes S. salar, S. truta e O. kisutch. Os valores de bootstrap abaixo de 50% foram omitidos. *Sequências extraídas do GenBank.

Figura 9. Alinhamento das sequências gênicas do DNAr 5S. Salmo salar, S. trutta O. kisutch e tipo IV de P. cuvieri e P. kroyeri (inseridas na caixa azul); G. riobambae e tipo III de P. diplolister (inseridas na caixa amarela); tipos somáticos e oocítico de X. tropicalis e X. laevis (inseridas na caixa cinza); e os tipos I (inseridas na caixa vermelha) e II (inseridas na caixa verde) de leiuperine. A sequência de 5S I P.cuvieri(TO)-c1 destaca-se devido à presença de nucleotídeos na sua porção inicial que remetem ao 5S II. *Sequências extraídas do GenBank.

IX. Capítulo 3

Cariótipos e Mapeamento de DNA satélite em Physalaemus kroyeri e P. cicada (Anura, Leptodactylidae)

Stenio Eder Vittorazzi1, Luciana Bolsoni Lourenço1, Mirco Solé2, Renato Gomes Faria3, Shirlei Maria Recco-Pimentel1

1Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, 13083-863 Campinas, São Paulo, Brazil 2Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, 45662-000, Ilhéus, Bahia, Brazil 3Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Sergipe, 49100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil

Keywords Palavras-chave: Physalaemus kroyeri, P. cicada, NOR, Banda C, DNAsat PcP190

Resumo Todas as espécies de Physalaemus estudadas citogeneticamente até o momento possuem 2n = 22. As espécies do grupo de P. cuvieri estudadas por bandamento C possuem um bloco na região intersticial do braço curto do par 5, assim como P. albifrons, espécie que foi retirada do grupo de P. cuvieri, mas recentemente foi realocada de volta. Physalaemus cicada já foi considerada uma espécie do grupo de P. cuvieri, mas suas relações filogenéticas interespecíficas permanecem desconhecidas. A maioria das espécies do grupo de P. cuvieri possui o DNA satélite PcP190 mapeado em seus cromossomos. Para as espécies P. cicada e P. kroyeri, no entanto, apenas o número e morfologia cromossômica são conhecidos. Sendo assim, o objetivo da análise foi levantar dados cromossômicos das espécies P. cicada e P. kroyeri, principalmente com bandamento C e mapeamento do PcP190, possibilitando que essas informações contribuam no panorama da citogenética dentro das relações filogenéticas já reconhecidas para as espécies de Physalaemus. Os resultados mostraram que tanto P. kroyeri quanto P. cicada possuem cariótipos semelhantes entre si, assim como em relação às demais espécies de Physalaemus já cariotipadas. Nas duas espécies, as NORs estão localizadas no braço longo do par 8, e através do bandamento C foi possível verificar que, entre outras bandas, P. kroyeri possui a banda intersticial em 5p, ausente em P. cicada. Entretanto, nessa última, várias bandas teloméricas foram evidenciadas. O mapeamento do DNA satélite PcP190 mostrou marcação na região centromérica nos cromossomos do par 1 nas duas espécies, porém, em P. kroyeri, heteromorfismo no par 3 também foi evidenciado. Os dados citogenéticos não fornecem evidências para a inclusão de P. cicada no grupo de P. cuvieri ou em qualquer outro grupo de espécies. Já para P. kroyeri, sua banda 5p é congruente com a proposta de que essa seja uma sinapomorfia citogenética para o grupo de espécies de P. cuvieri.

Introdução A família Leptodactylidae é constituída de três subfamílias, Leptodactylinae, Paratelmatobiinae e Leiuperinae (Pyron e Wiens, 2011, Fouquet et al., 2013; Frost, 2014). Essa última é constituída de 90 espécies divididas em cinco gêneros, Edalorhina, Engystomops, Physalaemus, Pleurodema e Pseudopaludicola (Frost, 2014). O gênero Physalaemus possui atualmente 46 espécies (Frost, 2014), e previamente havia sido dividido em sete grupos com base em análise fenética, sendo eles: P. cuvieri, P. signifer, P. albifrons, P. deimaticus, P. gracilis, P. henselii e P. olfersii (Nascimento et al., 2005). Porém, inferindo-se a evolução dessas espécies com dados mitocondriais e nucleares, foi possível fazer uma nova proposta para os agrupamentos, tendo sido reconhecidos dois grandes clados, o Clado P. signifer e o Clado P. cuvieri. O Clado P. cuvieri engloba os grupos P. cuvieri, P. biligonigerus, P. henselii, P. gracilis e P. olfersii, além das espécies P. aguirrei, e P. cicada, cujos relacionamentos interespecíficos permanecem não esclarecidos (Lourenço et al., em preparação). O grupo de P. cuvieri é o maior do Clado P. cuvieri, sendo composto por nove espécies: P. cuvieri, P. albonotatus, P. centralis, P. cuqui, P. ephippifer, P. erikae, P. fischeri, P. kroyeri e P. albifrons. Todas as espécies do gênero Physalaemus cariotipadas até o momento possuem 2n = 22 (Beçak et al., 1970; Denaro, 1972; De Lucca et al., 1974; Silva et al., 1999; Silva et al., 2000; Amaral et al., 2000; Lourenço et al., 2006; Ananias et al., 2007; Tomatis et al., 2009; Milani et al., 2010; Nascimento et al., 2010; Provete et al., 2012; Vittorazzi et al., 2014). As espécies do grupo de P. cuvieri estudadas por bandamento C (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009; Nascimento et al., 2010; Vittorazzi et al., 2014) apresentam em comum um bloco na região intersticial do braço curto do par 5. Assim, propõe-se que essa banda intersticial no cromossomo 5 seja um possível marcador citogenético para o grupo de P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2014; Lourenço et al., em preparação). Entre as espécies de Physalaemus, a localização cromossômica do DNA satélite PcP190 é conhecida para as espécies P. cuvieri, P. centralis, P. albonotatus, P. albifrons e P. ephippifer (Vittorazzi et al., 2011; Vittorazzi et al., em preparação). Para as espécies P. cicada e P. kroyeri há informações apenas para número e morfologia cromossômica (De Lucca et al., 1974). Sendo assim, o objetivo da análise foi levantar dados cromossômicos dessas duas espécies, como as regiões organizadoras de

95 nucléolo (NOR), regiões heterocromáticas e sítios do DNA satélite PcP190, possibilitando que essas informações contribuam no panorama da citogenética dentro das relações filogenéticas reconhecidas para as espécies de Physalaemus.

Material e Métodos Animais O material biológico extraído dos animais utilizados nesse trabalho foi depositado no Banco de Células e Tecidos do Laboratório de Estudos Cromossômicos do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, do Instituto de Biologia, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), São Paulo, Brasil. Os vouchers foram depositados no Museu de Zoologia “Prof. Adão José Cardoso” da Universidade Estadual de Campinas (ZUEC). Para as análises cariotípicas, foram analisados 13 indivíduos de P. kroyeri (ZUEC 17480 – ZUEC 17490, ZUEC 17492 e ZUEC 17493) provenientes do município de Ilhéus (Bahia, BA, Brasil) e 14 indivíduos de P. cicada, sendo um proveniente de Limoeiro (Pernambuco, PE, Brasil; ZUEC 17914) e os demais provenientes de Poço Redondo (Sergipe, SE, Brasil; ZUEC 20407 – ZUEC 20411, ZUEC 20413, ZUEC 20415, ZUEC 20417 – ZUEC 20422).

Obtenção de preparações cromossômicas As células mitóticas foram obtidas de animais tratados com colchicina (0,02 mL de colchicina a 2% por grama do peso do animal), por quatro horas. Logo após, os animais foram anestesiados com lidocaína (5%) e necropsiados por meio de incisão na região ventral para remoção por completo do intestino e testículos. No intestino, fez-se um corte longitudinal para uma breve lavagem e exposição do epitélio e, em seguida, o órgão foi exposto a uma solução hipotônica de citrato de sódio (0,9%) por 40 minutos. O epitélio intestinal foi raspado em solução fixadora de metanol-ácido acético (3:1), a suspensão celular resultante foi homogeneizada durante 2 minutos e, depois de 10 minutos, centrifugada a 800 rpm por 5 minutos. Os testículos foram tratados em água gelada por 15 minutos e fragmentados com o auxílio de uma tesoura, a suspensão obtida foi transferida para solução fixadora de metanol- ácido acético (3:1) e centrifugada a 800 rpm por 5 minutos. Tanto no caso da suspensão de células intestinais como no de testículo, o fixador foi substituído por um novo. Esse procedimento se repetiu mais uma vez. As suspensões celulares obtidas foram armazenadas a - 20oC até serem gotejadas em lâminas limpas para a obtenção das preparações cromossômicas.

Coloração com Giemsa Para obtenção do número e morfologia cromossômica, as preparações foram submetidas à coloração convencional com Giemsa pH 6,8 a 10%.

Ag-NOR Para localização das regiões organizadoras de nucléolo (NOR), as lâminas foram submetidas à técnica de impregnação pela prata (Ag-NOR) de Howell e Black (1980), a qual consiste no tratamento conjunto com duas soluções, sendo uma gelatinosa (2%) com ácido fórmico (1%) e outra com nitrato de prata (50%). Essas soluções foram aplicadas nas lâminas na proporção 1:2, respectivamente, homogeneizadas com uma lamínula, incubadas a 60°C por cerca de 5 minutos e posteriormente lavadas em água destilada.

Bandamento C Para detecção das regiões de heterocromatina constitutiva foi adotada a técnica de bandamento C (King, 1980) com modificações de Siqueira et al. (2008). O método consiste no tratamento prévio das lâminas em ácido acético (50%) e ácido clorídrico (0,2 N) por 30 minutos cada banho. Após uma rápida secagem das lâminas, foram incubadas em solução de hidróxido de bário (5%) por cerca de 30 segundos (tempo variável entre espécies) a 60°C, posteriormente incubadas em solução salina de citrato de sódio (2xSSC) por 30 minutos. Após secagem, as lâminas foram coradas com Giemsa como descrito anteriormente.

Coloração com 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) As metáfases previamente submetidas ao bandamento C foram coradas com 4’-6- diamidino-2-phenylindole (DAPI). O tratamento consistiu em incubar as lâminas em tampão de McIlvaine [ácido cítrico (100 mM) e fosfato de sódio bibásico (200 mM)] por 1 minuto e posteriormente incubá-las em DAPI (0,5 µg/mL) por 15 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente por aproximadamente 1 minuto, incubadas novamente em tampão de McIlvaine durante 1 minuto, e montadas em VectaShield (Vector, Burlingame, Califórnia, EUA).

Coloração Mitramicina (MM) Algumas metáfases submetidas ao bandamento C também foram coradas com Mitramicina (MM). O procedimento consistiu em tratar as lâminas com Distamicina A (DA, 0,3 mg/mL) por 15 minutos, posteriormente lavá-las rapidamente em água destilada e deixar em tampão de McIlvaine por cerca de 1 minuto. Após uma rápida secagem, foi adicionada a solução de Mitramicina (0,5 mg/mL), sobre a lâmina se colocou uma lamínula. Após 60 minutos no escuro, as lâminas foram lavadas em água corrente por alguns segundos e posteriormente incubadas em tampão de McIlvaine por 1 minuto. Por fim, após rápida secagem, foram montadas em VectaShield (Vector, Burlingame, Califórnia, EUA). Todas as metáfases foram capturadas no microscópio Olympus BX-60 (Tóquio, Japão) e fotografadas com auxílio do software Q-Capture. Os cariótipos foram montados manualmente com auxílio do software Adobe Photoshop CS4. Para o levantamento das informações morfométricas do cariótipo de cada espécie, foram adotados os parâmetros estabelecidos por Green e Sessions (1991). Para tanto, foram medidos os cromossomos de 10 cariótipos corados com Giemsa para cada espécie com auxílio do software MicroMeasure 3.3 (Reeves e Tear, 2000).

Extração de DNA genômico O DNA genômico de P. kroyeri e P. cicada foi extraído de amostras de fígado estocadas a -80°C. Para tanto, elas foram maceradas em TNES (Tris 0,05M pH 7,5; NaCl 0,4M; EDTA 0,02M; e SDS 0,5%), suplementado com proteinase K (0,1 mg/mL) e mantidas a 56oC por cerca de 3 horas. Para degradação dos RNA foi adicionado RNAse (0,05 mg/mL) nas amostras e mantidas a 37°C por 30 minutos. As proteínas foram removidas depois de precipitadas com NaCl (1,25 M). O DNA foi precipitado em isopropanol, lavado em etanol (70%) e, por fim, hidratado em tampão TE pH 8 (Tris-HCL 0,01M e EDTA 0,001M). Para análise qualitativa e quantitativa do DNA genômico obtido, amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose (0,8%) e comparadas com o marcador de massa molecular com concentração conhecida. E para verificar a pureza das amostras, assim como uma melhor precisão quantitativa, as amostras foram submetidas à espectrofotometria (NanoDrop ND- 1000).

Isolamento do DNA satélite PcP190, clonagem e sequenciamento Amostras do DNA genômico de P. cicada e P. kroyeri foram submetidas à reação de PCR com os primers P190F (AGA CTG GCT GGG AAT CCC AG) e P190R (AGC TGC TGC GAT CTG ACA AGG) (Vittorazzi et al., 2011) para isolamento do DNA satélite PcP190. As sequências resultantes foram purificadas e ligadas ao vetor pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, Wisconsin, EUA). Os vetores recombinantes foram utilizados para a transformação de bactérias E. coli da linhagem JM109, com o auxílio do TransformAid™ Bacterial Transformation Kit (Fermentas, Burlington, Ontario, Canadá), seguindo orientação do fabricante. O método para seleção dos clones recombinantes e extração do DNA plasmidial foi seguido como proposto por Sambrook et al. (1989). Para o sequenciamento desses fragmentos, amostras dos produtos amplificados por PCR foram submetidas à reação com o auxílio do kit BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA). Após a precipitação e secagem, os produtos obtidos foram ressuspensos em loading dye (Blue-Dextran-EDTA/Formamida 1:5), desnaturados por 3 minutos a 94°C e aplicados em um sequenciador automático ABI 3730XL DNA Analyzer.

Hibridação in situ fluorescente (FISH) A marcação das sondas de DNA satélite PcP190 isoladas nesse trabalho foi feita pela amplificação por PCR na presença dUTP-digoxigenina com o PCR DIG Probe Synthesis (Roche, Pensberg, Bavaria, Alemanha). Após essa reação, a sonda foi misturada a DNA de salmão sonicado (1ng/µL), acetado de sódio (0,3 M) e precipitada com etanol. Todo o DNA resultante foi ressuspendido em meio de hibridação (pH 7,0), que é composto por formamida deionizada (50%), SSC (2X), tampão fosfato (40 mM), solução de Denhardt, SDS (1%) e Dextran sulfato (10%). O método de hibridação utilizado é o descrito por Viegas-Péquignot (1992) com adaptações para detecção do dUTP-digoxigenina, feita com anticorpo anti-digoxigenina conjugado a rodamina (Roche, Pensberg, Bavaria, Alemanha).

100

Resultados Physalaemus kroyeri O número diploide de P. kroyeri é 2n = 22, sendo os pares 1, 2, 5, 6, 9, e 11 classificados como metacêntricos, os pares 4, 7, 8 e 10 submetacêntricos e o par 3 subtelocêntrico (Figura 1a; Tabela 1). Uma constrição secundária foi visualizada no braço longo do par 8 (Figura 1a) e foi coincidente com a NOR. Nos indivíduos ZUEC 17480, ZUEC 17481 e ZUEC 17483 a NOR pode ser observada em condição heteromórfica em relação ao tamanho (Figura 1b). Regiões de heterocromatina foi detectada nas regiões centroméricas de todos os cromossomos, na região intersticial do braço 5p1, pericentromérica no braço longo do par 6 e adjacente à NOR no par 8 (Figura 1c,d). Também foi possível visualizar uma banda positiva para Mitramicina coincidente com a NOR (Figura 1d).

Physalaemus cicada O número diploide de P. cicada é 2n = 22, sendo os pares 1, 2, 5, 6, 9, 10 e 11 classificados como metacêntricos, os pares 4, 7 e 8 submetacêntricos e o par 3 subtelocêntrico (Figura 2a; Tabela 1). Uma grande constrição secundária pode ser observada no braço longo do par 8, coincidente com a NOR (Figura 2a, inset). Regiões de heterocromatina constitutiva foi detectada nos centrômeros de todos os cromossomos, na região proximal do braço longo do par 2, pericentromérica no braço longo do par 4, nas regiões teloméricas de ambos os braços nos pares 1, 2, 5, 6 e 7 e da mesma maneira, mas apenas no braços longos, nos pares 3, 4, 9, 10 e 11 (Figura 2b,c). Um grande bloco heterocromático foi visualizado no braço longo do par 8, que é coincidente com a NOR, porém, nessa mesma região, com o emprego da técnica de bandamento C seguida por DAPI, foi visualizada apenas uma banda adjacente à NOR, e no emprego de bandamento C seguido por coloração com MM, essa banda foi evidenciada fortemente (Figura 2b,c, inset).

1 Embora o par 5 seja metacêntrico, a banda C intersticial está localizada no braço que é aparentemente maior, mas para uma comparação seguindo o critério de parcimônia, essa banda foi mantida na mesma posição que nas demais espécies.

101

DNA satélite PcP190 Após a clonagem, sequenciamento e a busca por outras sequências similares usando a ferramenta BLASTn no GenBank, foi possível reconhecer que as sequências obtidas com os primers P190F e P190R pertencem à família do DNA satélite PcP190, caracterizado inicialmente em P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2011). Foi possível clonar três fragmentos do DNA satélite PcP190 de P. kroyeri, todos contendo uma unidade de repetição desse DNA satélite, composta de 190 pb (Figura 3). A similaridade média entre esses fragmentos foi de 95% e, quando comparado com aquelas sequências de PcP190 de P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), a similaridade é de 93%. Em P. cicada foram obtidos 5 sequências do PcP190, sendo um deles com 189 pb, dois com 192 pb, e outros dois com 200 pb. A diferença de tamanho nas sequências de P. cicada é resultado de uma região polimórfica com 20 pb que envolve substituição e inserção/deleção (Figura 3). A similaridade média entre as sequências de P. cicada foi de 88% e, comparado com as sequências de P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2011), esse número cai para 78% . As sequências obtidas de P. kroyeri e P. cicada apresentam, em média, 79% de similaridade entre si. No cariótipo de P. kroyeri, o DNA satellite PcP190 foi detectado na região centromérica do par 1. Além desse par, em dois dos três indivíduos em análise, o PcP190 foi detectado também na região centromérica de um cromossomo do par 3 (Figura 4a). Em P. cicada, o PcP190 foi detectado na região centromérica do par 1 tanto no indivíduo proveniente de Limoeiro (PE) quanto nos indivíduos provenientes de Poço Redondo (SE) (Figura 4b).

102

Discussão O número e a morfologia cromossômica presente nas espécies P. kroyeri e P. cicada é o mesmo encontrado na análise prévia de De Lucca et al. (1974). O número 2n = 22 também está de acordo com todas as demais espécies de Physalaemus já cariotipadas (Beçak et al., 1970; Denaro, 1972; De Lucca et al., 1974; Silva et al., 1999; Silva et al., 2000; Amaral et al., 2000; Lourenço et al., 2006; Ananias et al., 2007; Quinderé et al., 2009; Tomatis et al., 2009; Milani et al., 2010; Nascimento et al., 2010; Provete et al., 2012; Vittorazzi et al., 2014). A condição conservada desse número cromossômico se estende também para outras espécies evolutivamente próximas ao gênero Physalaemus, como exemplo, Pleurodema diplolister (Lourenço et al., 2006), Edalorhina perezi (Lourenço et al., 2000), Engystomops petersi e E. freibergi (Lourenço et al., 1999; Targueta et al., 2010). No gênero Physalaemus há cariótipos descritos com NF = 42 e 44. Physalaemus kroyeri e P. cicada apresentaram NF = 44, que é característico para a maioria das espécies de Physalaemus analisadas citogeneticamente, como exemplo P. cuvieri (Beçak et al., 1970; Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009), P. soaresi (De Lucca et al., 1974) P. marmoratus (Beçak et al., 1970; Amaral et al., 2000), P. biligonigerus (Amaral et al., 2000; Silva et al., 2000), P. henselii, P. riograndensis (Tomatis et al., 2009), P. olfersii (De Lucca et al., 1974; Silva et al., 2000; Milani et al., 2011), P. ephippifer (Nascimento et al., 2010), P. barrioi (Provete et al., 2012), P. albifrons, P. centralis (Denaro, 1972; Vittorazzi et al., 2014) P. albonotatus, P. cuqui, P. santafecinus (Vittorazzi et al., 2014). Já as espécies com NF = 42 é devido à presença de um par telocêntrico arranjado na posição 11, que consiste em uma sinapomorfia do Clado P. signifer, que é grupo irmão daquele que reúne as espécies com FN = 44 (ver Lourenço et al., em preparação). Tanto para P. kroyeri quanto P. cicada, juntamente com todas as demais espécies de Physalaemus com cariótipos descritos, é possível inferir homeologias para a maioria dos pares cromossômicos. Isso porque, os pares cromossômicos 1 a 7 apresentam morfologia muito similar entre os cariótipos em análise, mesmo variando de tamanho em alguns casos (e.g. P. albonotatus em Vittorazzi et al., 2014). Contudo, algumas inferências equivocadas são possíveis, já que alguns cromossomos são parecidos entre si, como é o caso dos pares 3 e 4, e dos pares 5 e 6.

103

Nos Physalaemus é difícil reconhecer homeologias dos pares 8 a 11, pois esses cromossomos são pequenos e com morfologia muito semelhante entre si, exceto no caso do par de cromossomos telocêntrico classificado como 11 nas espécies do Clado P. signifer (ver Lourenço et al., em preparação). A presença da NOR nos pares cromossômicos pequenos é uma característica observada na maioria das espécies de Physalaemus estudadas citogeneticamente, tais como P. cuvieri (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009), P. biligonigerus (Amaral et al., 2000; Silva et al., 2000) P. marmoratus e Physalaemus sp. aff. biligonigerus (Amaral et al., 2000), P. crombiei, P. spiniger (Silva et al., 2000), P. nattereri (Lourenço et al., 2006; Ananias et al., 2007), P. fernandezae, P. riograndensis (Tomatis et al., 2009), P. ephippifer (Nascimento et al., 2010), P. barrioi (Provete et al., 2012), P. albifrons, P. albonotatus, P. centralis, P. cuqui e P. santafecinus (Vittorazzi et al., 2014). É interessante ressaltar que, mesmo estando presentes nos pares pequenos, as NORs se apresentam com certas peculiaridades para algumas dessas espécies, possibilitando assim o seu uso como um adequado marcador citotaxonômico para distingui-las, como exemplo, P. albonotatus e P. centralis (Vittorazzi et al., 2014). A NOR localizada no par 8 do cariótipo de P. kroyeri é idêntica àquela do par 8 de P. albifrons (Vittorazzi et al., 2014), e essas duas espécies são consideradas irmãs pela proposta filogenética de Lourenço et al. (em preparação). Com os dados desse trabalho, essas espécies podem ser diferenciadas pela presença de bandas heterocromáticas intersticiais nos braços longos dos pares 6 e 8 em P. kroyeri, ausentes em P. albifrons (Vittorazzi et al., 2014), e a banda intersticial presente no braço curto do par 8 de P. albifrons, ausente em P. kroyeri. Outra diferença citogenética entre essas duas espécies pode ser observada no par de cromossomos 1, onde o DNA satélite PcP190 está presente em P. kroyeri e ausente em P. albifrons (Vittorazzi et al., em preparação). Nos agrupamentos propostos por Lynch (1970) para espécies de Leptodactylidae, P. albifrons foi alocado no grupo de P. cuvieri, entretanto, na análise fenética de Nascimento et al. (2005), essa espécie foi alocada com P. biligonigerus, P. marmoratus e P. santafecinus, formando o grupo de P. albifrons. É interessante mencionar que na análise citogenética de P. albifrons e de outras espécies do grupo de P. cuvieri (Silva et al., 1999; Quinderé et al., 2009; Nascimento et al., 2010; Vittorazzi et al., 2014), bem como de outras três espécies, P. biligonigerus, P. marmoratus (Amaral et al., 2000) e P. santafecinus (Vittorazzi et al., 2014),

104 nenhuma sinapomorfia cromossômica pode ser reconhecida para corroborar o agrupamento de P. albifrons proposto por Nascimento et al. (2005). Contudo, a banda-C em 5p presente em todas as espécies do grupo de P. cuvieri analisadas até o momento permitiu que Vittorazzi et al. (2014) propusessem essa banda como um potencial marcador citogenético para o grupo de P. cuvieri, o que foi confirmado pela análise filogenética de Lourenço et al. (em preparação). Os dados do presente trabalho mostram que esse marcador citogenético também está presente em P. kroyeri, outra espécie do grupo de P. cuvieri. Embora o par 5 de P. kroyeri seja morfometricamente caracterizado como metacêntrico, o braço portador da banda intersticial foi ligeiramente maior, porém, o mesmo foi arranjado como 5p para manter a parcimônia quanto à posição da banda heterocromática com as demais espécies do grupo. Com relação a P. cicada, dúvidas ainda existem quanto ao seu relacionamento interespecífico. Com base em similaridades morfológicas, essa espécie já foi considerada pertencente ao grupo de P. cuvieri (Lynch 1970; Nascimento et al., 2005), no entanto ainda não há evidências filogenéticas que deem suporte a essa proposta (Lourenço et al., em preparação). A ausência, em P. cicada, da banda heterocromática intersticial do cromossomo 5, considerada uma sinapomorfia do grupo de P. cuvieri (Vittorazzi et al., 2014; Lourenço et al., em preparação), continua deixando em aberto essa questão.

DNA satélite PcP190 Tanto em P. kroyeri quanto P. cicada foi possível reconhecer o DNA satélite PcP190, o qual já foi previamente caracterizado em várias espécies de Physalaemus, tais como P. cuvieri, P. centralis, P. albonotatus, P. albifrons, P. ephippifer, P. marmoratus e P. nattereri, assim como para espécies de outros gêneros, como Pleurodema diplolister, Leptodactylus latrans e Crossodactylus gaudichaudii. Essa sequência se mostra bem conservada e teve sua origem remota nesses anuros (Vittorazzi et al., em preparação). Em P. cicada, tanto as sequências quanto a localização cromossômica do PcP190 fornecem informações interessantes sobre essa espécie quando comparada às demais espécies do grupo de P. cuvieri sobre essa análise. A similaridade média observada entre todas as sequências de PcP190 das espécies desse grupo foi de 90% (Vittorazzi et al., em preparação), porém, a similaridade das sequências de P. cicada contra aquelas de P. cuvieri, esse número se mostrou bem reduzida (78%). Para os dados cromossômicos, com exceção a P. cicada, a

105 localização do PcP190 no par 3 é comum em todas as espécies do grupo de P. cuvieri que possuem essa análise (Vittorazzi et at., 2011; Vittorazzi et al., em preparação). Essas informações, juntamente com os dados de baixo suporte estatístico para o posicionamento filogenético de P. cicada (Lourenço et al., em preparação), contribuem para a construção do cenário que mostra uma distante relação dessa espécie com as demais do grupo de P. cuvieri. Entre espécies evolutivamente próximas, é possível que uma mesma família de DNA satélite possua número de repetições diferenciado, uma vez que a dinâmica evolutiva dessas sequências repetitivas favorece a amplificação e deleção contínua no genoma dos organismos. Isso é bem explicado na proposta de biblioteca de DNA satélite (Fry e Salser, 1977; Meštrović et al., 1998), segundo a qual diferentes famílias de DNA satélite coexistem em um mesmo genoma, em que novas famílias podem surgir continuamente reestruturando a distribuição e quantidade das sequências mais antigas. Quando se propõe a utilização de sequências de DNA satélite como marcador para o estudo de evolução cromossômica, é imprescindível o conhecimento da natureza e comportamento dessas sequências, tão como conhecer a história filogenética do grupo em questão. Com os resultados de FISH apresentados nesse trabalho, seria razoável pensar que P. kroyeri e P. cicada possuem cariótipos similares quanto à disposição do DNA satélite PcP190, pois em ambas as espécies a região centromérica do par de cromossomos 1 é enriquecida nesse tipo de sequência. Entretanto, com base nas informações da dinâmica evolutiva dessa família de DNA satélite (Vittorazzi et al., em preparação), juntamente com a informação da história filogenética desse grupo inferida com base em genes mitocondriais e nuclear (Lourenço et al., em preparação), é possível que a semelhança cariotípica quanto à localização de clusters de sequências PcP190 observada para essas duas espécies se trate de homoplasia.

106

Conclusão Foi encontrado em P. kroyeri a banda heterocromática em 5p, considerada uma sinapomorfia citogenética para o grupo de espécies de P. cuvieri. Já em P. cicada, antes pertencente ao grupo de P. cuvieri (Lynch 1970; Nascimento et al., 2005), essa banda marcadora é ausente. Dessa forma, os dados citogenéticos não fornecem evidências para a inclusão de P. cicada no grupo de P. cuvieri ou em qualquer outro grupo de espécies.

Contribuição dos autores SEV elaborou o estudo, coletou P. kroyeri e P. cicada, conduziu as analises e escreveu o manuscrito. MS coletou P. kroyeri e RGF coletou P. cicada. SMRP e LBL coordenaram o estudo e revisaram o manuscrito.

Agradecimentos Nós agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES-PROAP), à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 2010/11300-7) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 620163/2008-9) pelo suporte financeiro. Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, protocolo 02010.002895/03-84) e à Secretaria de Estado do Meio Ambiente e Recursos Hídricos de Sergipe pela permissão de coleta dos animais amostrados.

107

Referências Amaral MJLV, Cardoso AJ, Recco-Pimentel SM (2000). Cytogenetic analysis of three Physalaemus species (Amphibia, Anura). Caryologia 53: 283–288.

Ananias F, Bombeiro AL, Silva CDB, Silva APZ, Haddad CFB, Kasahara S (2007). Cytogenetics of Eupemphix nattereri Steindachner, 1863 (Anura: Leiuperidae) and karyotypic similarity with species of related genera: taxonomic implications. Acta Zoologica Sinica 53: 285–293.

Beçak ML, Denaro L, Beçak W (1970). Polyploidy and mechanisms of karyotypic diversification in Amphibia. Cytogenetics 9: 225–238.

De Lucca EJ, Jim J, Foresti F (1974). Chromosomal studies in twelve species of Leptodactylidae and one Brachycephalidae. Caryologia 27: 183–191.

Denaro L (1972). Karyotypes of Leptodactylidae Anurans. J. Herpetol. 6: 71–74.

Frost DR (2014). Amphibians species of the world: an online reference. Version 6.0 (15 march 2014). Electronic Database accessible http://research.amnh.org/vz/herpetology/amphibia/. American Museum of Natural History, New York, USA.

Fry K, Salser W (1977). Nucleotide sequences of HS-α satellite DNA from kangaroo rat Dipodomys ordii and characterization of similar sequences in other rodents. Cell 12: 1069- 1084.

Green DM, Sessions SK (1991). Nomenclature for Chromosomes. In: Amphibian cytogenetics and evolution. Academic Press, San Diego, 431 – 432.

Fouquet A, Blotto BL, Maronna MM, Verdade VK, Juncá FA, de Sá R, Rodrigues MT (2013). Unexpected phylogenetic positions of the genera Rupirana and Crossodactylodes reveal insights into the biogeography and reproductive evolution of leptodactylid frogs. Molecular Phylogenetics and Evolution 67: 445–457.

Howell WM, Black DA (1980). Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: 1014–1015.

King M (1980). C-banding studies on Australian hylid frogs: secondary constriction structure and the concept of euchromatin transformation. Chromosoma 80: 191–217.

Lourenço LB, Cardoso AJ, Recco-Pimentel SM (2000). Cytogenetics of Edalorhina perezi (Anura, Leptodactylidae). Cytologia 65: 359 – 363.

Lourenço LB, Nascimento JAA, Andrade GV, Rossa-Feres DC, Recco-Pimentel SM (2006). Chromosomal analyses of the leptodactylids Pleurodema diplolistris and Physalaemus nattereri (Amphibia, Anura). Amphibia-Reptilia 27: 481–489.

108

Lourenço LB, Recco-Pimentel SM, Cardoso AJ (1999). Two Karyotypes and heteromorphic sex chromosomes in Physalaemus petersi (Anura, Leptodactylidae). Canadian Journal of Zoology 77:624–631

Lynch JD (1970). Systematic status of the American leptodactylid frog genera Engystomops, Eupemphix, and Physalaemus. Copeia 1970: 488–496.

Meštrović N, Plohl M, Mravinac B, Ugarković ĐÐ (1998). Evolution of satellite DNAs from the genus Palorus - experimental evidence for the ‘library’ hypothesis. Molecular and Biology Evolution 15: 1062–1068.

Milani M, Cassini CS, Recco-Pimentel SM, Lourenço LB (2010). Karyotypic data detect interpopulational variation in Physalaemus olfersii and the first case of a supernumerary chromosome in the genus. Animal Biology Journal 2: 21–28.

Nascimento LB, Caramaschi U, Cruz CAG (2005). Taxonomic review of the species groups of the genus Physalaemus Fitzinger, 1826 with revalidation of the genera Engystomops Jiménez- de-La-Espada, 1872 and Eupemphix Steindachner, 1863 (Amphibia, Anura, Leptodactylidae). Arq. Mus. Nac. Rio de Janeiro 63: 297–320.

Nascimento J, Quinderé YRSD, Recco-Pimentel SM, Lima JRF, Lourenço, LB (2010). Heteromorphic Z and W sex chromosomes in Physalaemus ephippifer (Steindachner,1864) (Anura, Leiuperidae). Genetica 138: 1127–1132.

Quinderé YR.D, Lourenço LB, Andrade GV, Tomatis C, Baldo D, Recco-Pimentel SM (2009). Polytypic and polymorphic NOR variations in the widespread anuran Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae). Biological Research. Res. 42: 79–92.

Provete DB, Garey MV, Toledo LF, Nascimento J, Lourenço LB, Rossa-Feres DC, Haddad CFB (2012). Redescription of Physalaemus barrioi (Anura: Leiuperidae). Copeia 2012: 507- 518.

Pyron RA, Wiens JJ (2011). A large-scale phylogeny of Amphibia including over 2,800 species, and a revised classification of extant frogs, salamanders, and caecilians. Molecular Phylogenetics and Evolution 61: 543–583.

Reeves A, Tear J (2000). MicroMeasure for Windows, version 3.3. Free program distributed by the authors over the Internet from http://www.colostate.edu/Depts/Biology/MicroMeasure/.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Silva APZ, Haddad CFB, Kasahara S (1999). Nucleolus organizer regions in Physalaemus cuvieri (Anura, Leptodactylidae), with evidence of a unique case of Ag-NOR variability. Hereditas 131: 135–141.

109

Silva APZ, Baldissera-Jr FA, Haddad CFB, Kasahara S (2000). Karyotypes and nucleolus organizer regions of the genus Physalaemus (Anura, Leptodactylidae). Iheringia, Série Zoológica 88: 159–164.

Siqueira S, Aguiar OJ, Strussmann C, Del-Grande ML, Recco-Pimentel SM (2008). Chromosomal analysis of three Brazilian ‘‘eleutherodactyline’’ frogs (Anura: Terrarana), with suggestion of a new species. Zootaxa 1860:51–59.

Targueta CP, Rivera M, Souza MB, Recco-Pimentel SM, Lourenço LB (2010). Cytogenetic contributions for the study of the Amazonian Engystomops (Anura, Leiuperidae) assessed in the light of phylogenetics relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution 54:709–725.

Tomatis CG, Baldo D, Kolenc F, Borteiro C (2009). Chromosomal variation in the species of the Physalaemus henselii group (Anura, Leiuperidae). Journal of Herpetology 43: 555–560.

Viegas-Pequignot E (1992): In situ hybridization to chromosomes with biotinylated probes. In In situ hybridization: a practical approach. Edited by Willernson D. Oxford: Oxford University Press-IRL Press; 1992: 137-158.

Vittorazzi SE, Lourenço LB, Del-Grande ML, Recco-Pimentel SM (2011). Satellite DNA derived from 5S rDNA in Physalaemus cuvieri (Anura, Leiuperidae). Cytogenetic and Genome Research 134: 101-107.

110

Tabela 1. Morformetria dos cariótipos de Physalaemus kroyeri e Physalaemus cicada. NC: número dos cromossomos; IC: índice centromérico; RB: razão de braço; CC: classificação cromossômica (Green e Session, 1991). Foram analisados 10 cariótipos de cada espécie.

P. kroyeri NC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 IC 0,45 0,39 0,24 0,26 0,47 0,44 0,32 0,32 0,42 0,34 0,42 RB 1,15 1,5 3,11 2,8 1,11 1,22 2,09 2,01 1,33 1,94 1,34 CC M M ST SM M M SM SM M SM M P. cicada NC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 IC 0,45 0,39 0,23 0,27 0,44 0,43 0,3 0,29 0,42 0,37 0,4 RB 1,19 1,51 3,13 2,8 1,23 1,27 2,28 2,43 1,37 1,62 1,48 CC M M ST SM M M SM SM M M M

111

Figura 1. (a) Cariótipo de Physalaemus kroyeri corado com Giemsa, cabeça de seta indica a constrição secundária. (b) Par 8 portador da NOR detectado pelo método de Ag-NOR, as formas homozigota (8a) e heterozigota (8b) são apresentadas. (c) Cariótipo submetido ao bandamento C corado com Giemsa e (d) submetido ao bandamento C e corado com DAPI. No destaque em (d), o par 8 corado com mitramicina. Em c e d, setas indicam bandas heterocromáticas intersticiais. Barra = 5 µm.

112

Figura 2. (a) Cariótipo de Physalaemus cicada corado com Giemsa, cabeça de seta indica a constrição secundária no par 8 e em destaque a NOR no par 8. (b) Cariótipo submetido ao bandamento C e no destaque banda C proximal no par 2. (c) Cariótipo submetido ao bandamento C seguido por coloração com DAPI, no destaque o par 8 corado com mitramicina. Em b e c, setas indicam bandas heterocromáticas intersticiais e pericentroméricas. Barra = 5µm.

113

Figura 3. Alinhamento das sequências de DNA satélite PcP190 das espécies Physalaemus kroyeri, Physalaemus cicada e P. cuvieri disponíveis no GenBank* (JF281121, JF281117, JF281109 e JF281124).

114

Figura 4. Cariótipo de (a) Physalaemus kroyeri e de (b) Physalaemus cicada hibridados com sonda do DNA satélite PcP190. Note os sinais de hibridação da sonda na região centromérica do par 1 em (a) e (b) e em um dos cromossomos do par 3 em (a). Barra = 5µ.

115

116

X. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O DNA satellite PcP190 foi encontrado em representantes de duas famílias de anuros, Leptodactylidae e Hylodidae, mostrando que essas sequências estão amplamente distribuídas e conservadas nesses anuros por no mínimo 70 milhões de anos.

Especula-se que exista nos monômeros do DNA satélite PcP190 tanto processos estocásticos como, provavelmente, efeito de pressão seletiva devido ao padrão não- randômico de variação ao longo das sequências.

Diferenças cariotípicas relacionadas ao DNA satélite PcP190 foram evidenciadas em populações de P. cuvieri assim como em espécies evolutivamente próximas, mostrando que essa família de DNA satélite é altamente dinâmica nesses anuros.

O acúmulo diferencial do DNA satellite PcP190 mostra que ele pode ter contribuído no processo de diferenciação dos cromossomos sexuais Z e W de P. ephippifer.

Os DNAr 5S I e IV estão presentes nos Leiuperinae e se mantiveram conservados, por pelo menos, desde divergência evolutiva entre Actinopterygii e Sarcopterygii. Até o momento, o DNAr 5S II é exclusivo em Leiuperinae, já o DNAr 5S III possui um segmento do NTS conservado entre os anuros, o que indica pressão seletiva atuando nessa parte da região não transcritora.

Além da condição conservada dos genes 5S e NTS (ou parte deles), ainda não temos evidências da funcionalidade de cada uma dessas sequências, se elas atuam conjuntamente ou em estágios diferentes do desenvolvimento. Assim, experimentos que verifiquem a expressão dos diferentes genes 5S em um mesmo organismo, assim como nas diferentes fases do desenvolvimento, devem ser averiguados. No entanto, o isolamento dessas sequências nos sugere uma grande diversidade de sequências de DNAr 5S no genoma dos anuros.

117

Foi encontrado em P. kroyeri a banda heterocromática em 5p, considerada uma sinapomorfia citogenética para o grupo de espécies de P. cuvieri. Já em P. cicada, antes pertencente ao grupo de P. cuvieri (Lynch 1970; Nascimento et al., 2005), essa banda marcadora é ausente. Dessa forma, os dados citogenéticos não fornecem evidências para a inclusão de P. cicada no grupo de P. cuvieri ou em qualquer outro grupo de espécies.

118

XI. APÊNDICE

Apêndice 1. Espécies de anuros estudadas nesse trabalho. Fotos obtidas na homepage http://herpeto.org/anfibios.

119