Graciete Mary Dos Santos

GRACIETE MARY DOS SANTOS

EFEITO DA VINHAÇA NA PRODUÇÃO BIOLÓGICA DE ÁLCOOIS E ÁCIDOS ORGÂNICOS VOLÁTEIS POR MEIO DE CONSÓRCIO MICROBIANO

CAMPINAS 2015

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia Agrícola

GRACIETE MARY DOS SANTOS

EFEITO DA VINHAÇA NA PRODUÇÃO BIOLÓGICA DE ÁLCOOIS E ÁCIDOS ORGÂNICOS VOLÁTEIS POR MEIO DE CONSÓRCIO MICROBIANO

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Engenharia Agrícola da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Engenharia Agrícola, na Área de Concentração de Água e Solo.

Orientador: Prof. Dr. ARIOVALDO JOSÉ DA SILVA Co-Orientadora: Dra. BRUNA DE SOUZA MORAES

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA GRACIETE MARY DOS SANTOS, ORIENTADA PELO PROF. DR. ARIOVALDO JOSÉ DA SILVA.

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CAMPINAS 2015

RESUMO

No Brasil, o efluente industrial produzido em maior quantidade é a vinhaça, caracterizada por altos níveis de ácidos orgânicos, fósforo, cálcio, potássio e magnésio. O reaproveitamento energético da vinhaça mostra-se como uma alternativa interessante para produção de biocombustíveis ou subprodutos. Este trabalho avaliou o potencial da vinhaça como fonte de substrato e nutrientes para produção de álcoois e ácidos orgânicos voláteis (AOV) por meio fermentação em batelada utilizando consórcio anaeróbio (lodo de bovinocultura) pré-tratados com choque térmico (TT) e choque ácido- térmico (AT). Foram utilizados dois meios diferentes, de sacarose (S) e de vinhaça (V), sendo a sacarose a principal fonte de carbono. A vinhaça provou ser uma excelente fonte de nutrientes para os microrganismos envolvidos na fermentação butírica, uma vez que a adição de vinhaça melhora significativamente a produção de ácido butírico em comparação com meio de cultura sintético. As máximas concentrações de ácido butírico, iso-butírico e acético foram de 14,13 ± 0,77 g L-1 na amostra ATV B3; 10,34 ± 0,43 g L-1na amostra ATV B2 e; 4,13 ± 0,06 g L-1na amostra TTV B3, respectivamente. O rendimento dos AOV acético, iso-butírico e butírico e de etanol foi mais elevado nas amostras ATV B3 e TTV B3, atingindo valores máximos de 0,14; 0,28; 0,69 e; 0,26 g g-1 carboidratos totais, respectivamente. Não foram encontradas diferenças significativas entre métodos de pré-tratamento e enriquecimento de inóculo, AT e TT no que diz respeito a produção de ácido butírico e etanol. Em escala maior, operando em reator de 1,5 L, a fermentação de vinhaça bruta e melado de cana por consórcio microbiano AU mostrou potencial para produção de solventes como o butanol, uma vez que concentrações elevadas de ácido butírico foram produzidas, com concentração máxima, rendimento e produtividade de 13,85 g L-1; 0,64 g g-1 e; 199,98 mg L h-1, respectivamente. A caracterização microbiológica, pirosequenciamento, revelou a ocorrência em maior abundância de bactérias do gênero Clostridium, principalmente no consórcio AU e Lactobacillus mais abundante nos consórcios TT e AT. Foi identificada uma espécie conhecida pela produção de butanol, o C. pasteurianum no consórcio AU. Contudo, o presente trabalho representa um passo importante no desenvolvimento de um processo industrial para reutilização da vinhaça. A exploração de novos microrganismos e estudo dos fatores que interferem no processo de fermentação como pH, temperatura, nutrientes, densidade da cultura, cargas aplicadas e características do substrato, são fundamentais para o entendimento dos efeitos sinérgicos e antagônicos da associação de culturas.

Palavras-chave: cultura mista de microrganismos; ácido butírico; etanol, fermentação em batelada.

ABSTRACT

In Brazil, industrial waste produced in the greatest amount is vinasse, characterized by high levels of organic acids, phosphorus, calcium, potassium and magnesium. The energy reuse of vinasse shows up as an interesting alternative for the production of biofuels or byproducts. This study evaluated the potential of vinasse as a source of substrate and nutrients for the production of alcohols and volatile fatty acids (VFA) through fermentation batch using anaerobic consortium (cattle sludge) pre-treated with heat shock (TT) and acid-shock thermal (AT). We used two different media, sucrose (S) and vinasse (V), with sucrose being the main source of carbon. The vinasse proved to be an excellent source of nutrients for microorganisms involved in the butyric fermentation, since the addition of vinasse significantly improves the production of butyric acid as compared to synthetic culture medium. The maximum concentrations of butyric acid, iso-butyric and acetic acid were 14.13 ± 0.77 g L-1 in the sample ATV B3; 10.34 ± 0.43 g L-1 in ATV B2 and 4.13 ± 0.06 g L-1 in TTV B3, respectively. The yield of acetate, iso-butyric acid, butyrate and ethanol was higher in ATV B3 and TTV B3 samples, reaching maximum values of 0.14; 0.28; And 0.69; 0.26 g g-1 total carbohydrates, respectively. There were no significant differences between pretreatment and enrichment methods inoculum, TA and TT as regards the production of butyric acid and ethanol. On a larger scale, operating at 1.5 L reactor, crude fermentation vinasse and molasses of sugar cane from AU microbial consortium showed potential for producing butanol as the solvent, since high concentrations of butyric acid was produced, with maximum concentration, yield and productivity of 13.85 g L-1 0.64 g g-1 and 199.98 mg h L-1, respectively. Microbiological characterization, pyrosequencing, revealed the occurrence in greater abundance of the genus Clostridium bacteria, particularly the AU and most abundant Lactobacillus in consortium TT and AT consortia. C. pasteurianum, known for the production of butanol was identified in AU consortium. However, this study represents an important step in the development of an industrial process for reuse of vinasse. The exploration of new microorganisms and study of the factors that interfere in fermentation process such as pH, temperature, nutrients, cultures, applied loads and characteristics of the substrate are critical for understanding the synergistic and antagonistic effects of culture association.

Key Word: mixed culture; butyric acid, ethanol, bath fermentation.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 29

1.1 Justificativa ...... 31

1.2 Objetivos ...... 32 1.2.1 Objetivo Geral ...... 32 1.2.2 Objetivos Específicos ...... 32

2. REVISÃO DA LITERATURA ...... 35

2.1 Rotas Metabólicas da Fermentação ABE ...... 35

2.2 Culturas ...... 38 2.2.1 Clostrídium sp ...... 38 2.2.2 Consórcio microbiano ...... 40 2.2.3 Métodos de pré-tratamento de culturas ...... 42 2.2.4 Técnicas de biologia molecular para identificação da população microbiana ...... 44

2.3 Perspectivas da Produção de Biocombustíveis via Fermentação ...... 46 2.3.1 Ácido butírico ...... 46 2.3.2 Butanol ...... 48 2.3.1 Etanol ...... 52

2.4 Fatores que afetam a solventogênese ...... 52 2.4.1 pH ...... 53 2.4.2 Temperatura ...... 54 2.4.3 Pressão Parcial de gases ...... 55 2.4.4 Concentração da carga orgânica ...... 56 2.4.5 Nutrientes no meio de cultura ...... 57 2.4.6 Toxicidade dos metabólitos ...... 59

2.5 Características da vinhaça ...... 60

3. METODOLOGIA ...... 64

3.1 Caracterização da vinhaça ...... 64

3.2 Etapa 1: Influência do pré-tratamento do inóculo e da suplementação de vinhaça para produção de álcoois e AOV ...... 65 3.2.1 Montagem experimental ...... 65 3.2.2 Pré-Tratamento do inóculo e enriquecimento da cultura ...... 66 3.2.3 Ensaio de Fermentação: Vinhaça como fonte de substrato ...... 68 3.2.4 Ensaio de Fermentação: Vinhaça como meio nutriente ...... 71

3.3 Etapa 2: Efeito da suplementação de vinhaça com melado de cana-de-açúcar para produção de álcoois e AOV ...... 74 3.3.1 Montagem experimental ...... 74 3.3.2 Pré-Tratamento e enriquecimento do inóculo ...... 75 3.3.3 Ensaio de Fermentação...... 76

3.4 Acompanhamento analítico ...... 77 3.4.1 Metodologia CLAE ...... 78 3.4.2 Limitação do método ...... 80

3.5 Caracterização microbiológica da biomassa ...... 82 3.5.1 Pirosequenciamento ...... 83

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...... 85

4.1 Composição da vinhaça ...... 85

4.2 Etapa 1: Efeito da suplementação de vinhaça e influência dos métodos de pré- tratamento do inóculo em meio de cultivo de sacarose para produção de álcoois e AOV .... 87 4.2.1 Vinhaça como substrato ...... 87 4.2.2 Vinhaça como meio nutriente ...... 91 4.2.3 Teste de comparação de médias ...... 98

4.3 Etapa 2: Produção de álcoois e AOV em meio de vinhaça suplementado com melado de cana-de-açúcar...... 103

4.4 Caracterização microbiológica do consórcio microbiano ...... 107

4.4.1 Morfologia ...... 107 4.4.2 Pirosequenciamento ...... 109 4.4.3 Caracterização da diversidade microbiana ...... 109 4.4.4 Filo ...... 111 4.4.5 Gênero ...... 113

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 117

6. CONCLUSÃO ...... 119

REFERÊNCIAS ...... 121

ANEXO ...... 133

Validação da Metodologia CLAE ...... 133

Aos meus queridos filhos Heitor e Aurea.

AGRADECIMENTOS

Com muita satisfação que expresso meus agradecimentos:

Ao meu orientador Ariovaldo José da Silva pela paciência e orientação;

A minha co-orientadora Bruna de Souza Moraes;

Aos membros da Banca de Qualificação, Prof Dr. Marcelo Zaiat e Prof Dr. Claudio Luiz Messias pelas valiosas contribuições e críticas ao trabalho;

Ao Prof Dr. José Roberto Guimarães (Tuca), pelas conversas produtivas e amizade;

Ao Professor Claudio Messias pelo empréstimo de reagentes;

Ao técnico Giovani e alunos do Laboratório de Saneamento da Feagri, principalmente aos colegas de trabalho Douglas e Camila;

Aos técnicos do Laboratório de Pós-Colheita Rosa Helena e Rosália pelo carinho e disposição para o empréstimo de reagentes e vidrarias;

Aos funcionários da Oficina Mecânica da Feagri pelo auxílio na preparação do aparato experimental;

Aos funcionários da manutenção e funcionárias da limpeza pela simpatia e manutenção do ambiente de trabalho;

Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação pela enorme paciência;

Ao técnico do Laboratório Paulo Gustavo Krejci Nunes pela disposição e amizade;

Aos técnicos e alunos do Laboratório de Processos Biológicos da Escola de Engenharia de São Carlos, especialmente ao Lucas pelo auxílio na coleta de vinhaça e a Janja pelas orientações da metodologia CLAE;

A Mariane e a Professora DJanira de Franceschi de Angelis da UNESP Rio Claro, pelo auxílio com a caracterização microbiológica e pela coleta de resíduo da fermentação;

A Marianne Akemi do Laboratório de Microbiologia Ambiental do Departamento de Biologia da Universidade Federal de São Carlos, campus Sorocaba;

Ao meu querido amigo Mauro pela paciência e fundamental auxílio na compreensão da análise estatística;

A todos os meus amigos de perto e de longe que contribuíram direta ou indiretamente com este trabalho;

Aos eternos amigos do Grupo Urucungos Puítas e Quijengues, em especial a Viviane, Sinhá, Maria Lucia e Ana Miranda;

A todas as minhas amigas mães estudantes, sintam o meu abraço fraterno, em especial a Aneci, Isabela e Jaqueline. Ser mãe, dona de casa, acadêmica e mulher não é nada fácil, mas a união e o apoio de vocês me fizeram mais forte!

A minha querida mãe pela presença, carinho e auxílio fundamental;

Aos meus irmãos Mariete e Felipe e toda minha família que mesmo de longe estão vibrando positivamente;

Ao meu companheiro José Roberto (Baiá) que conheci logo no início do projeto. Não tenho palavras para expressar o quanto você foi fundamental nesta etapa da minha vida!

Aos meus queridos filhos Aurea e Heitor pelo carinho e pela paciência... que por vezes estiveram esperando no carro enquanto eu terminava análises no laboratório;

A Capes pela bolsa concedida;

A Fapesp pelo auxílio financeiro no projeto.

Muito Obrigada!!

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Rotas bioquímicas do metabolismo da glicose por Clostridium acetobutylicum...... 36

Figura 2 - Fases de crescimento e desenvolvimentos dos clostridios...... 39

Figura 3 – Frasco reator com adaptação de dispositivo para entrada e saída de gases...... 66 Figura 4 – Fluxograma esquemático do processo de pre-tratamento e incubação do lodo, utilizado como inóculo neste trabalho...... 68 Figura 5 – Fluxograma do ensaio de fermentação. As letras a,b e c representam as repetições de cada tratamento...... 69 Figura 6 – Fluxograma do ensaio de fermentação com doses suplementares de vinhaça. As letras a,b e c representam as repetições de cada tratamento...... 72 Figura 7 - Reator utilizado no processo de fermentação de meio com vinhaça com melaço de cana-de- açúcar...... 75

Figura 8– Fluxograma esquemático do ensaio de fermentação da etapa 2...... 76 Figura 9- Cromatograma típico da determinação de ácidos por CLAE com detector de UV e arranjo de diodos...... 80 Figura 10 - Cromatograma típico da determinação de carboidratos e álcoois por CLAE com detector de índice de refração...... 80 Figura 11 - Cromatograma com detector de índice de refração. Picos de sacarose, glicose e frutose em amostra padrão de sacarose 800 mg L-1...... 82 Figura 12 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V...... 90 Figura 13 pH e densidade ótica em função do tempo de fermentação. Setas apontam para o ponto em que foi feita a correção do pH ...... 92 Figura 14 - Curvas de produção dos principais AOV dos tratamentos ATS, ATV, TTS e TTV em função dos três ensaios de fermentação em batelada (B1, B2 e B3)...... 94 Figura 15 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B1, onde houve suplementação de 1/3 de vinhaça no MCS...... 97 Figura 16 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B2, onde houve suplementação de 1/2 de vinhaça no MCS...... 97 Figura 17 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B3, onde houve suplementação de 2/3 de vinhaça no MCS...... 98 Figura 18 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Tratamento, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol...... 100 Figura 19 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Meio de Cultura, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol...... 101

Figura 20 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Batelada, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol...... 101 Figura 21 - Distribuição empírica das variáveis resposta ácido butírico e etanol, com interação de 3 fatores: meio de cultura ‘S’ e ‘V’, tratamento TT e AT e batelada B1, B2 e B3...... 102 Figura 22 - Produção de AOV e álcoois, consumo de carboidratos totais e pH em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 65 % de vinhaça...... 103 Figura 23 - Produção de AOV e etanol e consumo de carboidratos totais em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 75 % de vinhaça...... 104 Figura 24 - Produção de AOV e etanol e consumo de carboidratos totais em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 85 % de vinhaça...... 104 Figura 25 - Diagrama de Venn das famílias classificadas entres as comunidades bacterianas presentes nas amostras AT, TT e AU...... 112 Figura 26 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de família ...... 112 Figura 27 - Diagrama de Venn dos gêneros classificadas entres as comunidades bacterianas presentes nas amostras AT, TT e AU...... 115 Figura 28 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de gênero ...... 115 Figura 29 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de espécie...... 116

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Rendimento e produtividade de butanol ou solvente ABE por fermentação de diversos tipos de substratos...... 50 Tabela 2 - Média e variação (amplitude de valores) dos parâmetros físico-químicos que caracterizam a vinhaça...... 63

Tabela 3- Métodos analíticos para caracterização da vinhaça...... 65

Tabela 4 - Composição do RMC...... 67

Tabela 5 - Composição do MCS...... 70 Tabela 6 – Alíquotas para preparação do MCS suplementado com vinhaça e com açúcar demerara, utilizado no ensaio de fermentação...... 70 Tabela 7– Alíquotas para preparação do MCS suplementado com vinhaça e com açúcar demerara, utilizado no ensaio de fermentação...... 73 Tabela 8– Alíquotas para preparação do meio de cultivo utilizado nos ensaios de fermentação da etapa 2...... 77

Tabela 9 – Parâmetros para correção da concentração de sacarose ...... 81 Tabela 10- Parâmetros de validação do modelo de regressão linear da curva de calibração dos analitos avaliados, para significância de 95%...... 133 Tabela 11- Equações de regressão linear e teste de eficiência de correlação dos parâmetros da curva de calibração dos analitos avaliados ...... 134 Tabela 12- Avaliação dos limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) e da precisão do método CLAE para dos analitos avaliados...... 135

Tabela 13 – Parâmetros de caracterização da vinhaça...... 86 Tabela 14 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V...... 87 Tabela 15 - Rendimento e produtividade médios de ácido acético, ácido butírico e etanol entre as amostras AT S, TT S, AT V e TT V...... 89 Tabela 16 - Média de produção dos principais AOV no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3...... 93 Tabela 17 - Média de produção de etanol e metanol no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre as bateladas B1, B2 e B3...... 95 Tabela 18 - Rendimento médio dos principais dos produtos da fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3...... 96 Tabela 19 - Produtividade média dos principais dos produtos da fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3...... 96

Tabela 20 - Verificação da hipótese de homogeneidade das variâncias: Teste de Levene’s...... 98

Tabela 21 - Resultado do teste Anova interação dos fatores Tratamento, Meio de Cultura e Batelada para variável resposta concentração de ácido butírico...... 99 Tabela 22 - Resultado teste Anova interação dos fatores Tratamento, Meio de Cultura e Batelada para variável resposta concentração de etanol...... 99 Tabela 23 - Principais produtos da fermentação de melado de cana suplementado com vinhaça nos ensaios B1, B2 e B3...... 105 Tabela 24 - Produtividade e rendimento máximos dos principais metabólitos da fermentação de melado de cana suplementado com vinhaça nos ensaios B1, B2 e B3...... 106 Tabela 25 – Morfologias observadas entre as etapas do pré-tratamento e enriquecimento de inóculo...... 108

Tabela 26 - Número total de reads antes e após a filtragem ...... 109 Tabela 27 - Distribuição do número e porcentagem relativa* de UTOs de acordo com a similaridade e tratamento do inóculo ...... 110 Tabela 28 - Número de OTUs distribuída entre os filos classificados de acordo com o tratamento do inóculo ...... 111

Tabela 29 – Características do gêneros identificados...... 114

LISTA DE ABREVIATURAS

ABE Acetona, butanol e etanol AOV Ácidos orgânicos voláteis AT Ácido Térmico ATPase Adenosina Trifosfato enzima AU Autoclavado B Batelada CLAE Cromatografia Líquida e Alta Eficiência CV Coeficiente de Variação DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio DDGS Dried Distillers Grains Solubles DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DIR Detector por índice de refração DNA Ácido Desoxirribonucleico DNAr Ácido Desoxirribonucleico Ribossomal DQO Demanda Química de Oxigênio

EC50 Concentração Efetiva mediana I Inóculo LD Limite de Detecção LQ Limite de Quantificação MCS Meio de Cultura Sintético MCS Meio de cultura sintético NADH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Hidreto OD Densidade Ótica OTU Unidade Taxonômica Operacional pb Pares de bases PCR Reação de Polimerização em Cadeia pH Potencial Hidrogeniônico RMC Reinforced Medium Clostridium RNAr Ácido Ribonucleico Ribossomal S Sacarose

SF Sólidos Fixos SSV Sólidos Suspensos Voláteis ST Sólidos Totais SV Sólidos Voláteis TDH Tempo de Detenção Hidráulico TR Tempo de Retenção UASB Digestor Anaeróbio de Fluxo Ascendente UV-DAD Ultraviolet Diode Array Detection V Vinhaça

LISTA DE SIGLAS

EESC Escola de Engenharia de São Carlos ESALQ Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz FEAGRI Faculdade de Engenharia Agrícola LPB Laboratório de Processos Biológicos PPG-SHS Programa de Pós-Graduação em Engenharia Hidráulica e Saneamento RDP Ribosomal Database Project UFSCar Universidade Federal de São Carlos UNESP Universidade do Estado de São Paulo UNICAMP Universidade de Campinas USP Universidade de São Paulo

LISTA DE SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

Atm atmosfera Ca cálcio cm2 centímetro quadrado

CO2 gás carbônico Cu cobre Fe ferro

FeSO4 7H2O sulfato de ferro heptahidratado g grama

H2 gás hidrogênio

H2SO4 ácido sulfúrico K potássio

K2HPO4 fosfato de potássio dibásico kgf quilograma força

KH2PO4 monofosfato de potássio L litro m metro m3 metro cúbico mg miligrama MJ Mega Joule mL microlitro mm milimetro

MnSO4 7H2O sulfato de manganês heptahidratado MPa Mega Pascal N2 gás nitrogênio Na sódio NaCl cloreto de sódio NaOH hidróxido de sódio

(NH4)2SO4 sulfato de amônio

O2 gás oxigênio P fósforo rpm rotação por minuto v/v volume por volume Zn zinco μm micrometro ® marca registrada

1. INTRODUÇÃO

A matriz energética brasileira, que se destaca pela grande incidência de fontes renováveis, passou por transformações que a colocaram entre as mais limpas do mundo. O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, matéria-prima para produção de etanol. O País produz mais de 490 milhões de toneladas de cana-de-açúcar por ano (safra 2011/2012), sendo o 2º Produtor Mundial de Etanol, responsável por 20% da produção mundial e 20% das exportações (NEVES; TROMBIN; CONSOLI, 2010). Somente no Brasil 23,23 bilhões de litros de etanol (anidro e hidratado) foram produzidos na safra 2012/2013 (UNICA, 2013).

O aumento na produção de derivados da cana-de-açúcar coincide com o aumento de resíduos provenientes da industrialização desta matéria-prima. A vinhaça é o produto de calda na destilação do licor de fermentação do álcool. Esse líquido residual é também conhecido, regionalmente, por restilo e vinhoto. Assumindo uma taxa média de 13 litros de vinhaça por litro de etanol (WILKIE; RIEDESEL; OWENS, 2000), considerando a produção brasileira de etanol na safra de 2012/2013, a quantidade potencial de vinhaça produzida foi aproximadamente de 302 bilhões de litros. Independentemente da matéria-prima, este resíduo contém altas concentrações de material orgânico, de potássio e sulfatos, bem como características ácidas e corrosivas. No início do Programa Proálcool, a vinhaça era lançada diretamente nos rios, com graves problemas ambientais, atenuados com o uso das bacias de infiltração e sistemas de fertirrigação (CGEE E BNDES, 2008).

Como resultado da busca constante para encontrar uso ou tratamento adequado para vinhaça, tem-se desenvolvido algumas alternativas, como por exemplo, a reciclagem de vinhaça em processos fermentativos, fertirrigação, concentração por evaporação, produção de leveduras e na produção de matéria-prima para fabricação de ração para gado e aves. Cada um dos processos tem de ser avaliado com bastante critério, observando-se as implicações ambientais e econômicas e a viabilidade técnica.

Atualmente quase todo o volume de vinhaça gerada em usinas brasileiras é direcionado para a fertirrigação de canaviais, devido ao seu caráter fertilizante. No entanto, o potencial poluidor da vinhaça pode resultar em implicações para o solo, considerando os impactos negativos prováveis na estrutura do solo e dos recursos hídricos em caso de doses

excessivas. Segundo levantamento realizado por Fuess e Garcia, (2014), os principais obstáculos para reutilizar vinhaça in natura no solo incluem riscos de salinização do solo; redução dos poros, redução na atividade microbiana e o esgotamento significativo de concentrações de oxigênio dissolvido em corpos d'água; contaminação por nitratos e eutrofização; desestabilização da estrutura do solo devido a altas concentrações de potássio e de sódio; e, possível acidificação do solo e recursos hídricos, considerando o baixo pH da vinhaça (aproximadamente 4,5). Neste contexto, é de extrema importância o estudo de tecnologias renováveis que possibilitem um destino adequado para vinhaça.

A crescente demanda por fontes de energia limpa tem direcionado esforços e interesse na pesquisa e desenvolvimento de biocombustíveis. Modernas biorefinarias utilizam biomassa proveniente de resíduos como fonte de substrato no processo de obtenção de biocombustíveis, entre eles destacam-se os álcoois etanol e butanol. O biobutanol é uma alternativa promissora como combustível veicular para substituir a gasolina no futuro, oferecendo também diversas vantagens em relação ao etanol, principalmente no que diz respeito a maior energia na combustão, podendo substituir a gasolina em motores de combustão interna sem quaisquer modificações mecânicas.

O processo de fermentação com microrganismos da classe clostridia envolve duas fases distintas: acidogênese e solventogênese. Na fase acidogênica, os principais metabólitos são o ácido acético, ácido lático e ácido butírico. A acumulação dos ácidos orgânicos voláteis (AOV) resulta na diminuição do pH, fato este que favorece a mudança da rota metabólica para a fase solventogênica, na qual os microrganismos com a ação de enzimas específicas sintetizam os solventes acetona, butanol e etanol. Estudos tem mostrado que a concentração do ácido butírico é essencial para síntese de butanol (MONOT; ENGASSER; PETITDEMANGE, 1984; TASHIRO et al., 2004).

A escolha adequada do(s) microrganismo(s) e do substrato é crucial no desenvolvimento de uma tecnologia de produção viável de biosolventes. As culturas puras (naturais e mutantes) são as mais utilizadas em diversos trabalhos científicos, por apresentarem uma taxa de conversão de glicose em solventes dentro dos máximos limites de tolerância, devido a inibição dos microrganismos envolvidos causada pelos solventes (LIU; QURESHI, 2009). No entanto, quando são usados substratos complexos, culturas mistas apresentam algumas vantagens. Além de serem menos suscetíveis ao oxigênio ou de

contaminação por outros microrganismos, a presença de diferentes microrganismos geralmente favorece a degradação do substrato, devido a formação de comunidades integradas, nas quais algumas espécies atuam de forma equilibrada, ou mesmo de uma forma simbiótica.

Neste trabalho foi avaliado o potencial da vinhaça como substrato e meio nutriente para produção de álcoois e AOV por meio de fermentação em batelada utilizando uma cultura mista de microrganismos anaeróbios, além de avaliar a influência de dois métodos de pré- tratamento de inóculo na produção de ácidos orgânicos e álcoois.

1.1 Justificativa

Dentre os resíduos agroindustriais, a vinhaça tem despertado grandes preocupações por parte da comunidade científica, principalmente após a expansão do setor sucroalcooleiro no Brasil. O aumento na produção de derivados da cana-de-açúcar coincide com o aumento de resíduos provenientes da industrialização desta matéria-prima. A vinhaça é caracterizada como resíduo com alto poder poluente, cerca de cem vezes maior que a carga orgânico do esgoto doméstico, e alto valor fertilizante. O reaproveitamento de resíduos agroindustriais, produzidos em grande volume e com alto poder poluente, para produção potencial de biocombustíveis, aliada aos baixos custos de investimento e manutenção em sistemas fermentativos, torna-se uma alternativa viável e atraente para o controle da poluição ambiental e agregação de valor aos resíduos de atividade agroindustrial.

Uma alternativa para a reciclagem da vinhaça é sua utilização em processos anaeróbios e fermentativos para produção de biocombustíveis como hidrogênio e metano. A maioria dos trabalhos científicos que avaliaram a utilização de consorcio microbiano em processo fermentativo de resíduos agroindustriais investigaram a produção de hidrogênio e AOV, existindo poucos dados de produção de álcoois como etanol e butanol. A falta de estudos focando a síntese de álcoois por meio fermentação com cultura mista motivou os autores deste trabalho na escolha do tema. Devido a elevada DQO, resultado principalmente da presença de AOV; ao baixo pH e a presença de macro e micro nutrientes, principalmente potássio, cálcio, sódio, nitrogênio, magnésio, ferro e manganês, na vinhaça, acredita-se que este resíduo atue como fonte de nutrientes e substâncias que favoreçam a formação biológica de AOV e álcoois.

O principal desafio está relacionado a cultura envolvida no processo, pois além da toxicidade inerente dos solventes, é sabido que para produção a níveis significativos de ácido butírico, butanol e etanol, existem espécies distintas e específicas (DÜRRE, 2008a).

No entanto, o processo de fermentação com inóculo pré-tratado, conduzido em meio de cultura suplementado com vinhaça e condições ambientais adequadas ao desenvolvimento de microrganismos do gênero Clostridium pode revelar espécies mais adaptadas as características intrínsecas do resíduo de vinhaça e produzir metabólitos como ácido butírico, essencial para síntese de butanol.

Em face ao problema relacionado com a disposição correta do grande e crescente volume produzido de vinhaça, ao aumento da demanda dos biocombustíveis, acredita-se que este estudo resultará em dados que elucidarão a viabilidade técnica da fermentação com culturas mistas, subsidiando outros estudos que visam criar alternativas para o tratamento e aproveitamento da vinhaça.

1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivo Geral

Este trabalho tem como objetivo avaliar a influência da suplementação de vinhaça para produção de AOV e álcoois por meio de fermentação em batelada com inóculo de lodo anaeróbio pré-tratado por processos térmico e ácido-térmico.

1.2.2 Objetivos Específicos

- Enriquecimento da cultura por meio da utilização de dois métodos de pré-tratamento de inóculo (lodo bovinocultura): tratamento térmico (TT) e ácido térmico (AT);

- Avaliar o efeito da vinhaça, como fonte de substrato, para produção biológica de álcoois e AOV em processo fermentativo em batelada utilizando como inóculo lodo de reator anaeróbico pré-tratado por dois processos distintos, AT e TT;

- Avaliar o efeito da suplementação de vinhaça ao meio de cultura em proporções de 1/3, ½ e 2/3 como fonte de nutriente para produção biológica de álcoois e AOV pelas culturas pré-tratadas AT e TT;

- Avaliar a produção, rendimento e produtividade de álcoois e AOV em reator fermentativo operando em batelada, alimentado com doses crescentes de vinhaça (65, 75 e 85 %) e carga fixa de melado de cana com inóculo pré-tratado por processo térmico, autoclavagem (AU).

- Caracterizar morfologicamente e filogeneticamente os microrganismos predominantes nos inóculos pré-tratados AT, TT e AU.

2. REVISÃO DA LITERATURA

Na revisão de literatura procurou-se abordar assuntos relacionados ao tema do trabalho, principalmente os que dão subsídio a tomada de decisão na adoção da metodologia de trabalho.

No item 2.1 apresenta-se, de forma simplificada, a principal rota metabólica da fermentação ABE, que leva a formação de acetona, butanol e etanol, relacionando a importância dos metabólicos e como estes influenciam na mudança da fase acidogênica para a fase solventogênica.

No item 2.2 apresentam-se as principais culturas responsáveis pela produção de biosolventes, puras e consórcios microbianos, como também os métodos de pré-tratamento de inóculo, onde predominam bactérias anaeróbias formadoras de esporos. No item 2.2.4, são apresentadas as principais técnicas de biologia molecular para a determinação filogenética de microrganismos, com ênfase para a técnica de pirosequenciamento.

No item 2.3, é mostrado de forma resumida as principais desafios e recentes avanços da produção biológica de álcoois e AOV, com ênfase para etanol, butanol e ácido butírico, metabólitos de grande relevância comercial, bem como a sua importância para o mercado de biocombustíveis.

No item 2.4 aborda-se os principais fatores que influenciam na produção de solventes, sendo eles: pH, temperatura, pressão parcial dos gases, nutrientes do meio de cultura, concentração da carga orgânica e toxicidade dos metabólitos.

Finalmente, no item 2.5 apresentam-se as principais características da vinhaça, fundamental para sua utilização como fonte de substrato e nutrientes.

2.1 Rotas Metabólicas da Fermentação ABE

Uma característica típica da produção biológica dos solventes acetona, butanol e etanol (ABE) é uma fermentação bifásica, uma fase acidogênica e outra solventogênica.

Durante a fase de acidogênica, os clostrídios crescem e produzem principalmente CO2, H2 e ácidos acético e butírico, diminuindo o pH do meio. Nesta fase, quando se produz hidrogênio, pode-se considerar que boa parte dos elétrons e energia gastos, de outro modo poderiam ser

utilizados na fase solventogênica, no balanço das reações de oxido-redução (GARCÍA et al., 2011).

Na Figura 1 está apresentado um esquema que ilustra a rota metabólica do C. acetobutylicum, onde as bactérias primeiro seguem o percurso típico de síntese do ácido butírico a partir de glicose, com acetato, butirato, hidrogênio e dióxido de carbono sendo os principais metabólitos.

Figura 1 – Rotas bioquímicas do metabolismo da glicose por Clostridium acetobutylicum.

Fonte: Adaptado de (LEVIN et al., 2011).

Tipicamente, a taxa de produção dos solventes ABE são 3:6:1 de acetona, butanol e etanol, respectivamente (YERUSHALMI, 1985).

O balanço típico da fermentação de glicose por C. acetobutylicum está descrito na equação (1) (DÜRRE, 2008a):

- 1 C6H12O6  0,6 C4H10O + 0,14 C3H6O + 0,07 C2H6O + 0,04 [C3H7COO] + 0,2 - [CH3COO] + 2,2 CO2 + 1,4 H2 (1)

Long, Jones e Woods (1984), em estudo que visou relacionar as fases do metabolismo celular do Clostridium acetobutylicum P262 até formação de solventes, relataram que a mudança para a fase solventogênica estava ligada tanto à cessação da divisão celular quanto ao desencadeamento de várias alterações fisiológicas e morfológicas nos clostrídios. A divisão celular do C. acetobutylicum P262 foi inibida quando na presença de 4 a 5 g L-1 de ácidos resultantes do metabolismo, acetato e butirato, evidenciando que as bactérias anaeróbias são fortemente inibidas em concentrações relativamente baixas de metabólitos. O envolvimento do acetato e butirato no desencadeamento da produção de solvente é associado ao início do processo de esporulação.

A concentração do ácido butírico não dissociado parece provocar a mudança de fase acidogênica para a fase solventogênica. Richter et al. (2010) relatou que a fase solventogênica pode ser induzida mesmo em pH de 6 ou superior, se a concentração de ácido butírico não dissociado for suficientemente elevada. Isto porque os ácidos atuam como indutores de enzimas essenciais para o biossíntese de butanol.

A diminuição do pH pode representar uma ameaça para as bactérias anaeróbias. Elas são, em geral, incapazes de manter um pH interno constante, mas podem manter o gradiente de pH transmembranar constante. Isto também é válido para C. acetobutylicum. Como consequência, o pH citoplasmático será aproximadamente 1 unidade de pH mais alcalino. Em um pH externo de 4,5 a 4, o butirato e acetato anteriormente produzidos irão estar presentes como ácidos dissociados e, assim, ser capazes de passar através da membrana citoplasmática por difusão. Dentro da célula, no entanto, eles irão dissociar-se em sais e prótons devido ao pH mais elevado. Desta forma, o gradiente de prótons através da membrana é destruído, ocasionando lise celular (DÜRRE, 2005).

A solventogênese permite combater este efeito deletério, pois nesta fase há conversão de ácido acético e ácido butírico em acetona e butanol, conduzindo a um aumento do pH (DÜRRE, 2005). No entanto, a presença de butanol em baixas concentrações é tóxico para as bactérias, podendo promover a supressão do gradiente de pH através da membrana, a inibição de ATPase, a libertação de metabolitos intracelulares e a inibição da absorção de açúcar.

Assim, a solventogênese permite que os micro-organismos ganhem tempo para completar a formação de endósporos e, com isso, garantir a sobrevivência a longo prazo (BOWLES; ELLEFSON, 1985).

2.2 Culturas

Os solventes acetona, butanol e 2-propanol (isopropanol) são compostos naturalmente formados por processo fermentativo de microrganismos, entre eles, bactérias do gênero Clostridium: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, e C.- saccharoperbutylacetonicum, C. aurantibutyricum, C. butyricum, C. cadaveris, C. pasteurianum, C. puniceum, C. sporogenes, C. tetanomorphum e C. thermosaccharolyticum e C. felsineum (DÜRRE, 2005).

Estas espécies são reconhecidas com base na proporção e tipo de solventes produzidos, sendo que: Clostridium butyricum produz mais isopropanol que acetona; C. aurantibutyricum produz os solventes isopropanol, acetona e butanol; Clostridium tetanomorphum produz proporções iguais de etanol e butanol, sem produzir qualquer quantidade de acetona ou isopropanol (QURESHI; BLASCHEK, 2005).

Embora bactérias do gênero Clostridium sejam as principais produtoras de butanol, também foi relatado que outras espécies gram-positivas que produzem butanol, como Butyribacterium methylotrophicum. Butyrivibrio fibrisolvens, Bacillus butylicus e, dentro da família das Archaea, Hyperthermus butylicus (DÜRRE, 2008b; LEE et al., 2008).

2.2.1 Clostrídium sp

As bactérias do gênero Clostridium foram descobertas por Prazmowshi em 1880. São quatro os critérios que classificam um organismo como sendo do gênero Clostridium: (1) a habilidade de formar endosporos; (2) metabolismo estritamente anaeróbio; (3) a incapacidade de realizar redução de sulfato; e (4) parede celular Gram-positivas que pode reagir como Gram-negativas (ANDREESEN; BAHL; GOTTSCHALK, 1989).

Pelo menos sessenta espécies de bactérias pertencem ao gênero Clostridium, membros da classe clostridia e família Clostridiaceae (DO, 2009; HUSEMANN; SAN, 1989). No entanto, a produção de butanol é mais restrita a poucos membros deste gênero: C.

acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. aurantibutyricum, C. pasteurianum, C. sporogenes, and C. tetanomorphum (KUMAR; GAYEN, 2011). Entre essas espécies, C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharoacetobutylicum, e C. saccaroperbutylacetonicum são as produtoras primárias que possuem melhor rendimento de butanol. A cultura mutante C. beijerinckii BA101 pode chegar a produzir acima de 20 g L-1 de butanol e 33 g L-1 do total de solventes em processo de fermentação e batelada (LEE et al., 2008).

A fermentação de açúcares por clostrídios normalmente se realiza em três diferentes fases de crescimento celular: (1) crescimento exponencial e formação de ácidos, principalmente acético e butírico; (2) transição para a fase estacionária de crescimento com reassimilação de ácidos e formação concomitante de solventes (acetona, butanol, etanol, isopropanol); e (3) formação de endosporos (LÜTKE-EVERSLOH; BAHL, 2011). Na Figura 2 estão ilustradas as fases de crescimento e desenvolvimento dos clostridios.

Figura 2 - Fases de crescimento e desenvolvimentos dos clostridios.

Adaptado de Lütke-Eversloh e Bahl (2011)

Depois de entrar na fase estacionária, as células começam a sintetizar grânulos, que são armazenados no interior da célula. Neste estágio do desenvolvimento dos clostridios, as células podem ser microscopicamente distintas das células vegetativas. No entanto, os

mecanismos de regulação da formação e reutilização de grânulos não são conhecidos. Posteriormente, o processo de esporulação é iniciado e os grânulos presumivelmente servem como fonte de energia e de carbono para a formação do endósporo (JONES et al., 1982). Os esporos são muito resistentes e por isso são capazes de sobreviver durante um longo período de tempo, germinando sob condições ambientais adequadas.

O C. acetobutylicum pode utilizar uma variedade de carboidratos, incluindo pentoses, hexoses, oligossacarídeos e polissacarídeos para o seu metabolismo, com exceção da celulose, embora o gene celulossoma esteja presente no seu DNA (LÜTKE-EVERSLOH; BAHL, 2011).

2.2.2 Consórcio microbiano

Consórcio microbiano pode ser obtido de ambientes naturais ou de atividades agroindustriais. Trata-se de um conjunto de microrganismos adaptados a um processo ou as interações ecológicas do ambiente natural. Lodo anaeróbio é frequentemente usado como inóculo para produção de hidrogênio utilizando resíduos orgânicos como substrato (CHU; TUNG; LIN, 2013; GUO et al., 2010; SEARMSIRIMONGKOL et al., 2011; WONG; WU; JUAN, 2014; XIAO; LIU, 2009a). Entretanto, na literatura foram encontrados apenas quatro trabalhos que focam a utilização de consórcio microbiano oriundo de lodo para produção de álcoois (CHENG et al., 2012; LIU et al., 2014; SINGLA et al., 2014; STEINBUSCH; HAMELERS; BUISMAN, 2008).

A fermentação utilizando cultura mista de microrganismos é potencialmente interessante para geração de produtos específicos. Os produtos que podem ser potencialmente obtidos incluem misturas de AOV que podem servir como blocos de construção em outros processos. Em comparação com cultura pura, baseado na biotecnologia industrial, as vantagens específicas de cultura mista incluem a não necessidade de esterilização, a capacidade de adaptação, devido à diversidade microbiana e a capacidade de utilizar substratos mistos, (RODRÍGUEZ et al., 2006).

Para Elsharnouby et al. (2013), a motivação pelo uso de culturas mistas ou co-culturas em vez de culturas puras é puramente econômico ou técnico. Do ponto de vista econômico, culturas mistas podem ajudar a manter condições anaeróbias para produções altas de hidrogênio, eliminando a necessidade de um agente redutor dispendioso, como a L-cisteína.

Do ponto de vista técnico, culturas mistas podem melhorar a hidrólise de açúcares complexos e da biomassa, podendo também produzir hidrogênio em uma ampla faixa de pH.

Elsharnoby et al. (2013), afirmam haver um efeito de sinergia no consórcio microbiano. No caso da coexistência de microrganismos anaeróbios restritos e facultativos, a capacidade de produção de H2 pelos microrganismos anaeróbios obrigatórios, que são extremamente sensíveis a O2, é inibida ou prejudicada pela existência de O2 no meio. Neste caso, a existência de bactérias anaeróbias facultativas eliminaria o problema consumindo o O2 presente no meio, de modo que condições anaeróbias são prontamente alcançadas sem a necessidade de um agente redutor. Portanto, anaeróbios restritos, tais como Clostridium sp. e anaeróbios facultativos, tais como Enterobacter sp, coexistem no mesmo reator oferecendo condições estáveis para a produção de H2.

Hallenbeck e Ghosh (2009), afirmaram que futuras produções comerciais de biohidrogênio terão que ser realizadas sob condições não estéreis e usando matéria-prima prontamente disponível. Isto só será possível utilizando culturas mais resistentes, o que envolve estudos de engenharia genética, ou então utilizando culturas mistas, pois as comunidades microbianas são potencialmente mais tolerantes a mudanças nas condições operacionais. Por outro lado, a consciência dos efeitos dos parâmetros operacionais e estrutura da comunidade sobre as taxas de produção e rendimento de hidrogênio e outros metabólitos, durante a fermentação, pode oferecer informações úteis para a otimização da geração de hidrogênio e solventes.

Tran et al. (2010), utilizou uma co-cultura de Bacillus subtilis TISTR 1032 (aeróbia) e C. butylicum WD 161 (anaeróbia), levou a uma melhoria substancial da produção dos solventes ABE, utilizando amido de mandioca solúvel como substrato. Este rendimento foi superior devido a atividade de amilase superior durante o processo de dessacarificação na presença de aeróbios B. subtilis. O sistema de co-cultura de organismos aeróbios e anaeróbios evitou a utilização de agentes redutores utilizados para a manutenção de condições anaeróbias na fermentação, tornando a fermentação anaeróbia mais econômica e rentável. Contudo, sistemas como este podem contribuir bastante para o desenvolvimento da produção industrializada ABE.

2.2.3 Métodos de pré-tratamento de culturas

A utilização de culturas puras naturais e mutantes, em processos de fermentação para obtenção de solventes e hidrogênio, tem mostrado elevada taxa de rendimento, variando entre 0,33 a 0,41 g de solventes por g de DQO consumida (DUSSÉAUX et al., 2013; HOU et al., -1 -1 2013; LEHMANN; LÜTKE-EVERSLOH, 2011; YU et al., 2011) e de 6,4 a 7,2 L H2 L dia (CAI et al., 2013; JIANG et al., 2013; JO et al., 2008). Entretanto, a aplicação de culturas puras quando se trata da utilização de substratos oriundos de resíduos agroindustriais, o processo fermentativo se torna inviável, uma vez que o custo para esterilização do resíduo é muito alto. Para facilitar tecnicamente o processo utilizam-se culturas mistas obtidas de fontes naturais, não havendo necessidade de esterilizar a matéria-prima utilizada como substrato. Entretanto, um dos obstáculos é a competição entre microrganismos que coexistem na microflora, que podem levar a produção de compostos não desejados no processo, como por exemplo, as bactérias redutoras de sulfato, as arquéias metanogênicas e as bactérias acetogênicas (BAGHCHEHSARAEE, 2009).

A fim de criar ambiente propício para o desenvolvimento específico de algumas espécies de microrganismos dentro de uma cultura mista, entre estes, bactérias do gênero Clostridium, foram desenvolvidos métodos de pré-tratamento para o enriquecimento de culturas. Os mais comuns são: tratamento térmico, tratamento ácido, tratamento alcalino e tratamento com inibidores químicos (BAGHCHEHSARAEE, 2009).

O tratamento térmico é a técnica mais comum empregada para o enriquecimento de bactérias produtoras de hidrogênio e alguns autores citam que este método apresenta vantagens por ser um método simples e rápido, que elimina bactérias não formadoras de esporos que consomem hidrogênio, tal como as arquéias metanogênicas, fazendo prevalecer as bactérias do gênero Clostridium (MOHAMMADI et al., 2011).

Sendo os microrganismos produtores de hidrogênio potenciais formadores de solventes (dependendo das condições ambientais e de nutrientes que favorecem a mudança de fase acidogênica para solventogênica), cabe ressaltar os resultados de pesquisas que conduzem a formação de hidrogênio por meio do enriquecimento de culturas mistas, já que existem poucos trabalhos que relacionam o uso de culturas mistas para produção de butanol.

Baghchehsaraee (2009) comparou o efeito do pré-tratamento térmico (65, 80 e 90°C por 30 minutos) no enriquecimento de uma cultura de lodos ativados e de uma cultura de lodo anaeróbio alimentada com substrato de glicose. Os resultados da pesquisa demonstraram que o rendimento e a taxa de produção de hidrogênio foi mais alta com o tratamento térmico a -1 -1 65°C, tanto para cultura de lodo ativado (1,6 mols de H2 mol de glicose e 19,3 mL h ) como -1 -1 para cultura de lodo anaeróbio (2,3 mols de H2 mol de glicose e 26,3 mL h ). Já o pré- tratamento a temperatura de 95°C com lodo anaeróbio, resultou numa menor produção de hidrogênio, mas em compensação, aumentou a taxa de concentração de butirato e acetato. Análise do consórcio microbiológico do lodo demonstrou que os tratamentos com temperaturas mais altas diminuem a diversidade de espécies.

Chang e Lin (2004), avaliaram a produção de hidrogênio a partir de sacarose (20 g DQO L-1) em um reator UASB, alimentado com lodo anaeróbio filtrado (2,35 mm) e tratado termicamente a 100°C por 45 minutos. A taxa de produção de H2, num TDH de 8 horas, foi -1 de 53,5 mmol H2 g de lodo dia, com teor de H2 igual a 42,4% (v/v). Os principais metabólitos da fermentação foram o ácido butírico e ácido acético.

O tratamento térmico alcança bons resultados no enriquecimento de culturas também para o tratamento de resíduos alimentícios. Nos estudos de Han et al. (2005), foram alcançadas eficiências na remoção de sólidos voláteis e de produção de hidrogênio de 70,9% e 3,55 m3 m-3 dia-1, respectivamente, em reator de leito fixo operando em condição acidogênica no primeiro estágio, alimentado com lodo tratado a 100°C por 15 minutos, tendo como fonte de substrato o efluente de restaurante (DQO solúvel de 3,1 mg L-1).

Outro tipo de pré-tratamento térmico é a autoclavagem ou esterilização. Xiao e Liu (2009), utilizaram lodo esterilizado, proveniente de estação municipal de tratamento de esgoto em Beijing (China), para produzir hidrogênio por fermentação anaeróbia espontânea, sem adição extra de substratos ou semente de lodo. O rendimento de hidrogênio do lodo esterilizado foi de 16.26 mL g-1 de sólidos voláteis. O metano não foi detectado no biogás. O principal ácido volátil sintetizado foi o acetato, seguido pelo butirato. O processo de esterilização do lodo, além de favorecer a germinação de esporos e por consequência o desenvolvimento de microrganismos formadores de H2, promoveu a hidrólise de materiais insolúveis, de forma que a degradação de hidratos de carbono desempenhou um papel importante na produção de hidrogênio no lodo esterilizado.

Tratamentos ácidos ou básicos também têm sido utilizados por pesquisadores para melhoramento da produção de hidrogênio e inibição da atividade metanogênica. Goud e Mohan (2012), avaliaram os métodos de enriquecimento ácido (pH 3; ácido ortofosfórico; 24 h) e básico (pH 11; hidróxido de sódio; 24 h), operando em três reatores anaeróbios de batelada idênticos por um longo período (520 dias), com TDH de 48 h. Foi observada uma produção relativamente maior de H2 no reator inoculado com cultura mista pré-tratada com ácido (15,78 mol kg-1 de DQO removida) sobre a pré-tratada com solução alcalina (9,8 mol kg-1 de DQO removida) e o controle (3,31 mol kg-1 de DQO removida). Por outro lado, a degradação do substrato foi maior no reator controle (com cultura mista não tratada), devido à presença de bactérias metanogênicas. A análise das populações microbianas por DGGE, indica o enriquecimento seletivo de Clostridium sp e Bacilus sp nas culturas pré-tratada.

Lee, Song e Hwang (2009), avaliaram o efeito de três ácidos no pré-tratamento de culturas mistas, HCl, HNO3 e H2SO4. Os estudos determinaram que o HCl foi o ácido mais adequado para o enriquecimento de culturas produtoras de hidrogênio no processo de fermentação, com destaque para espécies de Clostridium. O volume de H2 produzido quando a cultura mista foi tratada com HCl foi 3,2 vezes maior do que a cultura mista sem pré- tratamento ácido.

Há também estudos que integram métodos de pré-tratamento. Mohan et al. (2007), submeteram uma cultura mista a repetidos pré-tratamentos, alternando quatro vezes entre tratamento térmico (100°C por 2 h) e tratamento ácido (pH 3, ácido ortofosfórico, 24 h). A cultura ainda foi seletivamente enriquecida com adição de antibiótico (kanamycin 10 mg L-1) incubado a 30°C por 24 h por 5 vezes, com a finalidade de isolar algumas espécies de bactérias (produtoras de H2) tornando-as mais resistentes. Os resultados com tratamento de efluentes industriais em reator anaeróbio operado em bateladas sequenciais foi bastante satisfatório, sendo que a produção específica de H2 quase dobrou em relação ao controle -1 (0,297 a 0,483 mol H2 kg DQO removida).

2.2.4 Técnicas de biologia molecular para identificação da população microbiana

Técnicas de biologia molecular tem possibilitado o estudo da diversidade e ecologia de microrganismos em ambientes naturais e em reatores anaeróbios, alcançando-se novas

oportunidades para a análise da estrutura e da composição de espécies de comunidades microbianas nos mais diversos ecossistemas, diferente das técnicas convencionais, como a microscopia ótica, que oferece limitações quanto a identificação de microrganismos.

O sequenciamento de DNA pode ser considerado como uma das mais importantes ferramentas de estudo dos sistemas biológicos (RONAGHI, 2001). Este método é cada vez mais empregado para a análise de bibliotecas de fragmentos de DNA obtidos diretamente do ambiente e utilizados para determinação da diversidade e da função de comunidades microbianas. A estratégia metagenômica constitui em uma derivação da genômica microbiana convencional, pois não há necessidade de se obter culturas puras para sequenciamento, revelando, portanto, os genomas contidos na comunidade e não em populações isoladas. Como resultado constitui uma importante ferramenta para determinação de hipóteses a respeito das inter-relações dos membros da comunidade.

Segundo Head, Saunders e Pickup (1998), a principal limitação dos métodos moleculares é a quantidade de ácidos nucleicos recuperada das amostras ambientais, sendo difícil assegurar uma eficiente recuperação por qualquer técnica de extração. Há sempre perdas de ácidos nucléicos durante o processo e, além disso, alguns microrganismos apresentam estrutura celular difícil de ser rompida (esporos, células Gram-positivas, por exemplo). Para minimizar tais problemas é necessário utilizar um método de extração de DNA eficiente para todos os tipos de células presentes na amostra, bem como realizar várias extrações de uma mesma amostra para garantir a homogeneidade do DNA extraído. Segundo Abreu (2007), por questões de manipulação laboratorial, trabalha-se mais frequentemente com a sequência do DNA que codifica a região 16S do RNAr (DNAr 16S). Isto porque o DNA é uma molécula mais estável e mais fácil de se manipular do que o RNA. A amplificação e análise do gene DNAr, portanto, têm sido utilizadas comumente para investigar a biodiversidade e a estrutura da comunidade microbiana de diversos ambientes, inclusive de reatores anaeróbios.

A aplicação da técnica de pirosequenciamento constitui-se em uma das mais avançadas ferramentas para caracterização da diversidade presente em ecossistemas complexos (YOUSSEF et al., 2009). A necessidade atual pela redução no custo do par de bases sequenciado, juntamente com a demanda de um maior número de dados em curto espaço de tempo propiciaram o desenvolvimento de novas técnicas capazes de suprir parcialmente tais exigências. Apesar da grande evolução na técnica de Sanger originalmente proposta há mais de

30 anos, ainda há limitações no custo e velocidade de sequenciamento de DNA, tornando- se cada vez menos compatível às atuais necessidades. A partir do exposto, surgem diferentes técnicas como sequenciamento por hibridização (GENTALEN; CHEE, 1999), técnicas de detecção de uma única molécula, ressonância molecular de sequenciamento, enzima- dependente, etc., mas até o presente momento apenas a técnica de pirosequenciamento (RONAGHI et al., 1996) foi realmente empregada em maior escala para a análise da diversidade microbiana de diferentes ambientes. Este fato deve-se à capacidade de montar em um único chip centenas de milhares de reações ao mesmo tempo.

Pode-se resumir a tecnologia de Pirosequenciamento como técnica que se baseia no método de sequenciamento por detecção do pirofosfato luminométrico produzido pela incorporação de nucleotídeos na reação (RONAGHI; UHLEN; NYREN 1998). A maior vantagem do pirosequenciamento em relação a Sanger é devido ao fato de não ser necessária a clonagem do fragmento a ser sequenciado, reduzindo uma etapa dispendiosa de tempo e recursos financeiros, uma vez que a técnica tem como vantagens a precisão, flexibilidade, processamento paralelo e pode ser facilmente automatizada. Além disso, há outras vantagens como a não necessidade de primers rotulados, nucleotídeos marcados e eletroforese em gel (RONAGHI, 2001).

2.3 Perspectivas da Produção de Biocombustíveis via Fermentação

2.3.1 Ácido butírico

Ácido butírico ou ácido butanoico é um ácido monocarboxílico saturado, produzido em escala industrial principalmente por meio de síntese química. Isto envolve a oxidação de butiraldeído, o qual é obtido a partir de propileno derivados de óleo bruto por oxossíntese. Outro método de produção é a extração a partir de manteiga rançosa, sendo este processo mais dispendioso em relação a síntese química (ZIGOVÁ; STURDÍK, 2000). A terceira maneira é via fermentava, processo que tem atraído maior interesse da indústria.

O ácido butírico tem muitos usos em diferentes indústrias e, atualmente, há um grande interesse em usá-lo como um percursor para produção de biocombustíveis. Além disso, o ácido butírico pode ser usado para produzir o butirato de etila e butirato de butila, ambos os quais tem potencial para serem utilizados como combustíveis (WU et al., 2010). A produção fermentativa de biobutanol enfrenta um grande desafio, devido à toxicidade deste álcool para

microrganismos da classe Clostridia. Se por um lado Zymomonas mobilis tolera até 180 g L-1 de etanol, cepas mutantes de Clostridium toleram no máximo 20 g L-1 de butanol (LIU; QURESHI, 2009). O baixo rendimento de butanol eleva os custos de recuperação desde biocombustível.

Uma estratégia que vem sendo investigada para melhorar o rendimento de álcoois a partir de ácidos carboxílicos ou AOV é a pós-conversão por processamento químico. Por exemplo, um sistema tem resíduos convertidos em AOV por uma cultura mista de microrganismos, seguido pela conversão eletroquímica em ésteres e uma mistura de alcanos e álcoois (LEVY et al., 1981). Um outro sistema, patente denominada MixAlco, foi testado com muitas matérias-primas diferentes (HOLTZAPPLE et al., 1999). Os estudos de fermentação com substratos a base de resíduos sólidos urbanos pré-tratados e bagaço de cana alcançaram de 69% e 60%, na conversão de biomassa em ácidos carboxílicos, atingindo produção máxima de 20,5 g L-1 e 18,7 g L-1, respectivamente (CHAN; HOLTZAPPLE, 2003; THANAKOSES; BLACK; HOLTZAPPLE, 2003). O sistema MixAlco concentra os carboxilatos por secagem e precipitação de cálcio. A mistura de carboxilato é decomposta termicamente para cetonas, e as cetonas são cataliticamente hidrogenada a uma mistura de álcoois.

Sob condições anaeróbias, ácido butírico é um metabólito comum produzido por cepas de bactérias de vários gêneros. No entanto, para uso industrial, as cepas de Clostridium são preferidas devido à sua maior produtividade. As cepas mais importantes de Clostridium estudadas para as produções à escala industrial de ácido butírico são C. butyricum (HE et al., 2005; ZIGOVÁ et al., 1999), C. tyrobutyricum (JIANG et al., 2010; JO et al., 2009), e C. thermobutyricum (CANGANELLA; WIEGEL, 2000). Atualmente, o microrganismo mais promissor utilizado para a bioprodução de ácido butírico é C. tyrobutyricum. Cepas mutantes desta espécie são capazes de produzir ácido butírico com elevada concentração, de 34 até 43 g L-1 (DWIDAR et al., 2013; LIU; YANG, 2005; LIU; ZHU; YANG, 2006) sem que haja inibição devido a toxicidade deste composto. No entanto, tal espécie só pode fermentar poucos hidratos de carbono, incluindo a glucose, xilose, frutose, e lactato. Por outro lado, C. butyricum pode fermentar muitas fontes de carbono incluindo hexoses, pentoses, glicerol, lignocelulose, melaço, amido de batata, e o permeado de soro de queijo (HE et al., 2005), com rendimentos de butirato mais baixos em comparação com C. tyrobutyricum. Para C. thermobutyricum, a gama de açúcares fermentáveis é elevada, uma vez que consome a

glicose, frutose, maltose, xilose, ribose, e celobiose, e alguns açúcares oligoméricos e poliméricos, mas não de sacarose ou amido (WIEGEL; KUK; KOHRING, 1989).

2.3.2 Butanol

O butanol é um álcool que é utilizado principalmente como solvente e combustível. Apresenta-se como líquido incolor, de odor sufocante, inflamável e pouco solúvel em água.

Sua estrutura molecular (formula molecular C4H9OH) lhe confere maior capacidade de liberação de energia em comparação ao etanol, devido aos quatro átomos de carbono ligados (LEVIN et al., 2011). A molécula de butanol apresenta quatro estruturas isoméricas: n- butanol, sec-butanol, iso-butanol e terc-butanol. Cada isômero possui uma dada característica físico-química e a maioria deles pode ser sintetizada nas reações bioquímicas de fermentação de biomassa, com exceção do terc-butanol (MACHADO, 2010).

Devido as suas características intrínsecas, tem se dado atenção a utilização de biobutanol como aditivo de combustível ou como um substituto direto da gasolina. O biobutanol apresenta diversas vantagens na sua utilização como combustível em relação ao etanol e metanol:

a) Possui conteúdo energético 30% maior (29,2 MJ L-1) em relação ao etanol (19,6 MJ L-1) c; b) Pode ser misturado a uma proporção variada com gasolina ou diesel diretamente na refinaria sem qualquer infraestrutura adicional; c) Facilidade no transporte e menor corrosão através de gasodutos devido à baixa pressão de vapor; d) A proporção ar:combustível é próxima ao da gasolina. No entanto, a substituição completa da gasolina por butanol exigiria um aperfeiçoamento na proporção de ar:combustível, mas combinando-se até 20% de butanol com gasolina não há necessidade nenhuma de modificação nos atuais motores de combustão; e) O calor de vaporização de butanol é ligeiramente maior ao da gasolina, facilitando o arranque a frio; f) (e) A baixa solubilidade do butanol em água reduz o potencial de contaminação das águas subterrâneas (BANKAR et al., 2013).

Os Estados Unidos representam cerca de dois terços do mercado global de butanol, estimado em aproximadamente 370 milhões de litros por ano tendendo a crescer ainda mais (SYNTEC BIOFUEL, 2014). Em outubro de 2013, a ASTM emite uma norma que especifica a mistura de butanol com gasolina, 1 a 12,5 %, para uso em motores de ignição automotivos. A especificação abrange três isómeros butanol: 1-butanol, sec-butanol, e iso-butanol (ASTM INTERNATIONAL, 2013). Contudo, a crescente demanda por biobutanol, principalmente como combustível, tende a adaptação de usinas produtoras de bioetanol com sistemas de separação avançados que lhes permitam produzir biobutanol, já que este biocombustível tem inerentemente maior valor agregado que o bioetanol.

A pesquisa sobre a produção de butanol por fermentação centrou-se principalmente na área da compreensão dos princípios fisiológicos da produção desse solvente e na área de engenharia metabólica. Poucas espécies de clostrídios naturais (incluindo os mutantes das espécies mais conhecidas) têm sido estudadas recentemente. Isto pode ser explicado pelo fato das melhores cepas já converterem glicose em butanol dentro limite de tolerância, devido à toxicidade deste composto. Processos de fermentação clostridiana convencionais com as melhores variedades naturais produzem butanol em concentrações de. 20 g L-1, que é muitas vezes indicado como o limite superior tolerado. A investigação de novas cepas tolerantes ao butanol (em termos de engenharia metabólica) é naturalmente um dos temas ou abordagens em pesquisa mais inovadores no processo de fermentação (GARCÍA et al., 2011).

Outro foco de recentes pesquisas visa investigar a viabilidade econômica de baixo custo da utilização de materiais lignocelulósicos como matéria-prima no processo de fermentação. A eficácia de várias espécies de clostridios produtoras de butanol foi analisada com base na utilização de matérias-primas provenientes de resíduos agroindustriais ou de materiais lignocelulósicos. Na Tabela 2, estão apresentados alguns resultados em termos do rendimento e produtividade de butanol por fermentação de diversos tipos de substratos.

Tabela 1 - Rendimento e produtividade de butanol ou solvente ABE por fermentação de diversos tipos de substratos.

Rendimento de Butanol Tempo de -1 Butanol ou (g g ) Produtividade Microorganismo Cepa fermentação Substrato ou açúcar consumido Referência (ABE) (g L-1) Açúcar (g L-1 h-1) (h) Substrato Total 80 g L-1 de melaço de soja seco e (QURESHI; LOLAS; C. beijerinckii BA101 96 pulverizado (34,7 g L-1 de açúcar) 8,0 (10,7) 0,23 0,1 0,08 BLASCHEK, 2001)

C. acetobutylicum P262 75 60 g L-1 de amido de sagu 16,0 (18,0) 0,24 0,21 (MADIHAH et al., 2001) Amido de milho liquefeito sacarificado (45,7 g L-1 de (EZEJI; QURESHI; C. beijerinckii BA101 78 glicose) 13,4 (18,2) 0,29 0,17 BLASCHEK, 2007) C. saccharoper- (THANG; KANDA; butylacetonicum N1-4 48 48,5 g L-1 de amido de mandioca 16,9 (21,0) 0,33 0,35 0,35 KOBAYASHI, 2010) 10% de lixo orgânico doméstico (LÓPEZ-CONTRERAS et C. acetobutylicum ATCC 824 48 seco e hidrolizado 4,2 (6,1) 0,09 al., 2000) 86 g L-1 de palha de trigo hidrolisada (60,2 g L-1 de açúcar (QURESHI; SAHA; C. beijerinckii P260 42 total) 12,0 (25,0) 0,2 0,14 0,29 COTTA, 2007) Resíduo de destilaria de grãos (DDGS) diluídos e pré-tratados (EZEJI; BLASCHEK, C. saccharobutylicum 262 120 com ácido 7,3 (12,1) 0,21 0,06 2008) bagaço de mandioca (44,8 g L-1 C. acetobutylicum JB200 40 de glicose) 9,7 (15,4) 0,22 0,24 (LU et al., 2012) palha de cevada tratada com cal C. beijerinckii P260 68 (63,4 g L-1 de açúcar total) 18,0 (26,6) 0,29 0,26 (QURESHI et al., 2010a) palha de milho hidrolizada (37,3 g C. beijerinckii P260 96 L-1 de açúcar total) 10,4 (16,0) 0,28 0,11 (QURESHI et al., 2010b) ATCC mistura de 13 g L-1 de glicerol e (ANDRADE; C. acetobutylicum 4259 20 30 g L-1 de glicose 8,6 (9,2) 0,2 0,42 VASCONCELOS, 2003) (MALAVIYA; JANG; LEE, C. pasteurianum MBEL GLY2 82 g L-1 de glicerol 17,8 (27,0)b 0,3 0,43 2012) Continuação…

Rendimento de Butanol Tempo de Butanol ou (g g-1) Produtividade Microorganismo Cepa fermentação Substrato ou açúcar consumido Referência (ABE) (g L-1) Açúcar (g L-1 h-1) (h) Substrato Total Clostridium 75 g L-1 de resíduo fruto de acetobutylicum ATCC palma em meio enriquecido com 824 e Bacillus subtilis extrato de levedura e nitrato de (ABD-ALLA; ELSADEK DSM 4451 72 amônio 21,7 (31,7) 0,59 0,44 EL-ENANY, 2012)

2.3.1 Etanol

Etanol é produzido em escala industrial por processo fermentativo. Certas espécies de levedura (Saccharomyces cerevisiae) ou bactérias (Zymomonas mobilis) metabolizam açúcares em condições quase anóxicas produzindo etanol e dióxido de carbono. A S. cerevisiae, levedura anaeróbia facultativa, e Z. mobilis, bactéria gram negativa, são comumente utilizadas na conversão de hexoses, açucares com 6 carbonos – C6, de primeira e segunda geração e pentoses (segunda geração) a taxas elevadas de etanol. No entanto, tais microrganismos são incapazes de fermentar pentoses, açúcares com 5 carbonos, C5.

Outras leveduras e bactérias estão sendo investigadas para fermentar a xilose e outras pentoses em etanol, como Candida shehatae e a levedura Pichia stiplis. A pesar destas culturas oferecerem um bom potencial para produção de etanol, apresentam baixa tolerância ao etanol, resultando em um baixo rendimento de etanol, além da inatividade em pH baixo. Pachysolen tannophilus e Escherichia coli, ambas bactérias gram-negativas, são capazes de fermentar pentoses e hexoses. Kluveromyces marxianus, uma levedura termófila, é capaz de crescer a uma temperatura acima de 52 °C; e é capaz de fermentar um amplo espectro de açúcares. O excesso de açúcares afeta o seu rendimento de álcool. Ele tem, no entanto uma baixa tolerância a etanol e pobre rendimento de fermentação da xilose. Bactérias termofílicas, por exemplo, Thermoanaerobacterium Sacchaarolyticum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Clostridium teramocellum, são bactérias anaeróbias, resistentes a uma temperatura extremamente alta de 70 °C. Estas bactérias podem fermentar uma variedade de açúcares, exibir atividade celulolítica, mas exibem uma baixa tolerância (BAEYENS et al., 2015).

2.4 Fatores que afetam a solventogênese

Vários são os fatores que afetam a produção e o rendimento de solventes por micro- organismos solventogênicos. Entre os fatores ambientais e físico-químicos mais comuns estão o pH, a temperatura da fermentação, a presença de macro e micronutrientes no meio, a concentração de substrato e a toxicidade de metabólitos ou mesmo do próprio substrato.

2.4.1 pH

Um parâmetro regulador essencial no metabolismo celular é o pH do meio. Segundo Monot, Engasser e Petitdemange (1984), o metabolismo celular é regulado por concentrações intracelulares, sendo que a atividade metabólica de C. acetobutylicum está associada à concentração intracelular de ácido butírico não dissociado em vez da concentração no meio. Como a concentração de ácido no citoplasma da célula é diferente da concentração medida no meio de cultura, uma vez que os ácidos são produzidos e excretados pelas células, certamente haverá um gradiente de concentração através da membrana celular. Além disso, com o crescimento de Clostridium, o pH interno é maior do que o pH externo, devido a um processo de translocação de prótons catalisada por uma membrana ligada ATPase. Isto resulta numa modificação na dissociação de equilíbrio dentro da célula. Em consequência, a redução do pH intracelular por inibição da ATPase, ligada à membrana, aumentando assim a concentração de ácido não dissociado no interior da célula, que por sua vez tem uma influência favorável sobre a produção de acetona e butanol. Contudo, o ácido butírico não dissociado tem papel essencial na indução da produção de solvente em C. acetobutylicum.

Entretanto, segundo Ezeji, Qureshi e Blaschek (2005), as culturas mantidas a pH relativamente elevado (maior de 6,5), produzem mais ácidos e menos solventes do que as culturas mantidas a um pH baixo. Holt, Stephens e Morris (1984), demonstraram que C. beijerinckii é capaz de produzir acetona-butanol em um meio em que o pH é mantido neutro ao longo da fermentação, com suplementação de acetato e butirato nas concentrações de 10mM. De fato as concentrações elevadas de acetato e butirato são necessárias para desencadear a solventogênese a pH 7, de forma que chama a atenção para os efeitos das formas não dissociadas destes ácidos sobre a cultura celular. Vários parâmetros relacionados, tais como o pH ácido, as concentrações elevadas de ácidos fracos, e densidades celulares elevadas parecem estar envolvidos no desencadeamento da produção de solvente (GEORGE; CHEN, 1983).

Em meios de cultura mal tamponados, o pH pode diminuir para menos de 4,5 durante a o final da acidogênese, levando a súbita cessação da solventogênese, e um fenômeno conhecido como "crash acid" pode ocorrer. Tal fenômeno está associado a uma terminação rápida da solventogênese quando a concentração combinada dos ácidos acético e butírico não dissociadas excedem um valor de limiar crítico no meio de fermentação (MADDOX et al.,

2000). Com base nesta informação, o aumento da capacidade de tamponamento do meio de crescimento pode ser um método simples para obter uma concentração elevada do íon butirato, menos tóxico que as formas não dissociadas do ácido butírico, minimizando os efeitos deletérios no crescimento celular microbiano (BRYANT; BLASCHEK, 1988). Além disso, a elevada concentração de butirato no meio pode favorecer o aumento no rendimento de butanol.

2.4.2 Temperatura

A temperatura é outro fator que afeta os processos biológicos, uma vez que, influencia o metabolismo dos microrganismos produtores de solventes e, por conseguinte, o rendimento do processo e a distribuição dos metabólitos produzidos.

A maioria dos trabalhos recentes com fermentação direcionada para produção de álcoois utiliza, no processo, a faixa de temperatura mesófila (35 a 40°C) (CHEN et al., 2013; EZEJI; QURESHI; BLASCHEK, 2013, 2007; OUEPHANIT et al., 2011), havendo também uma ampla faixa de trabalhos que avaliaram a fermentação em condições termófilas (55 a 65 °C) (BAGHCHEHSARAEE, 2009; CRESPO et al., 2012; YU; FANG, 2001), porém estes estão mais relacionados com as particularidades dos microrganismos em estudo, sendo que algumas espécies só se desenvolvem em temperaturas termófilas.

Existem muito mais estudos que investigam estritamente a influência da temperatura de fermentação na produção de hidrogênio do que na produção de álcoois. Isto se deve ao fato de que a maior parte dos estudos de fermentação ABE utiliza microrganismos modificados geneticamente, sendo estes desenvolvidos sob condições operacionais específicas. No entanto, é válido associar os estudos de produção de hidrogênio com a produção de álcoois, pois as bactérias responsáveis pela produção destes potenciais combustíveis são as mesmas, sendo a maioria do gênero Clostridium.

A fermentação acidogênica em elevadas temperaturas apresenta vantagens, tais como, maior biodisponibilidade dos substratos devido a maior solubilidade dos mesmos e menor risco de contaminação por microrganismos metanogênicos. Todavia, ainda que em condição termófila, o rendimento e a taxa de produção específica sejam maiores do que em condição mesófila, a taxa de produção volumétrica de hidrogênio pode ser inferior, já que culturas termófilas em meio líquido não atingem elevadas densidades celulares (RAY et al., 2008).

Lazaro (2012), avaliou a influência da temperatura na produção biológica de hidrogênio a partir de vinhaça de cana-de-açúcar como única fonte de carbono, utilizando cultura mista de micro-organismos enriquecida. Os melhores resultados de produção e rendimento de hidrogênio foram alcançados dentro da condição mesófila (37°C). A autora também constatou que as culturas mesófilas possuíam maior diversidade de espécies.

2.4.3 Pressão Parcial de gases

Existem diferentes opiniões sobre o papel da pressão parcial dos gases na fermentação. Van Andel et al. (1985) constatou que a pressão parcial de hidrogênio influencia na concentração de acetato e butirato, quando no cultivo de C. butyricum em meio com limitação de glicose e com aditivo redutor da tensão superficial, sob uma pressão parcial de H2 de 0,68 atm e de CO2 de 0,32 atm, sem adição de N2. A tensão superficial reduzida favorece a dissolução dos gases no meio de cultivo e a trocas entre o meio líquido e gasoso. Com estes resultados, observa-se que a presença de hidrogênio dissolvido no meio de fermentação é o fator que influencia no aumento da concentração de sais de ácidos orgânicos, principalmente acetato e butirato.

Yerushalmi, Volesky e Szczesny (1985) relataram que a concentração de butanol e etanol, a partir da fermentação de uma cultura pura de C. acetobutylicum, aumentou a medida que as pressões parciais de H2 aumentava, e que a produção total de hidrogênio caiu em 30%.

Lamed, Lobos e Su (1988), verificaram que o aumento da pressão parcial de H2 (2,5 atm) no volume de headspace de uma cultura de C. thermocellum deslocou o processo para a produção de etanol.

Segundo Clark, Zhang e Upadhyaya (2012), reações para formação biológica de hidrogênio são termodinamicamente favoráveis quando sob baixas pressões parciais de hidrogênio não favorecendo a mudança de fase para produção de solventes. No entanto, este mesmo autor, verificou que a concentração de butirato aumentou (de 628 para 703 mg L-1, cerca de 12 %) em reatores com baixa pressão e sem agitação, comparando com reatores sob agitação, onde a formação de hidrogênio gasoso era facilitada.

Segundo Jones e Greenfield (1982), o efeito dos gases dissolvidos na produção microbiana e o crescimento de células sugere que o potencial para otimizar a produção de solventes de base biológica está na manipulação da concentração dos gases de dissolvidos

oriundos do processo fermentativo ou na adição de gases, variando-se a pressão total do sistema. Níveis elevados de gases dissolvidos, principalmente CO2 e H2, pode ser resultado de atividade de fermentação e podem ser amplificados pelo aumento das pressões hidrostática (0,1 MPa por metro de profundidade de água) na base de fermentadores de grande escala (MCINTYRE; MCNEIL, 1998).

Doremus et al (1985) constatou em seus estudos que a agitação e a pressão são parâmetros que afetam o nível de gás hidrogênio dissolvido, que por sua vez afeta significantemente a produção de butanol. No sistema não pressurizado, a agitação afetou significativamente a produção de butanol, sendo a concentração de butanol inversamente proporcional a agitação. No entanto, num sistema com pressão de 1 bar, a agitação não promoveu mudanças significativas no rendimento de butanol, quanto maior a agitação, menor o rendimento de butanol. Maior rendimento de butanol foi alcançado em sistema não pressurizado, a 25 rpm, sendo 6,1 g L-1.

Ballongue et al. (1987) avaliou o efeito inibitório de produtos do metabolismo de C. acetobutylicum. Os pesquisadores concluíram que os gases produzidos durante a fermentação,

H2 e CO2 na forma dissolvida, tinham um efeito tóxico para as bactérias, comparado ao efeito de 5 g L-1 de ácido butírico. Os experimentos foram realizados em fermentadores submetidos ao vácuo e borbulhados continuamente com N2.

Contudo, a despeito das opiniões divergentes sobre os efeitos da pressão parcial de gases na fermentação ABE, é preciso estudar a viabilidade econômica do emprego de técnicas de modificação de atmosfera visando o aumento da produção de solventes. Ao contrário da produção de hidrogênio, para produção de solventes é interessante manter os gases dissolvidos no meio de fermentação até o ponto que estes não inibam o crescimento das bactérias.

2.4.4 Concentração da carga orgânica

Inibição do crescimento de bactérias devido a concentração e origem do substrato é um problema frequente em fermentações de solventes. Inibição de C. beijerinckii BA101 devido a alta concentração de açúcar (160 g L-1) foi verificada no trabalho de Ezeji, Qureshi e Blaschek (2003). C. beijerinckii BA101 difere em tolerância a concentração de glicose quando comparado com a cepa industrial de C. acetobutylicum P262, que é capaz de tolerar

mais do que 250 g L-1 de lactose presente no soro de leite. Qureshi e Blaschek (2001), durante a avaliação do efeito de diferentes concentrações de açúcar inicial no crescimento de C. beijerinckii BA101, demonstraram que a concentração máxima de células (1,74 g L-1 de peso seco) foi alcançada numa concentração de glicose de 60-102 g L-1. O crescimento celular foi severamente inibido quando a glicose estava a níveis superiores a 158 g L-1, enquanto as fases de latência para o crescimento das células em concentrações de glucose de 60 e 158 g L-1 foram de 6 e 23 h, respectivamente.

O efeito de uma elevada concentração de açúcar inicial, dentro dos limites toleráveis, faz o microrganismo permanecer por mais tempo na fase de latência, prejudicando a produção de solventes. Depois de ter sobrevivido a elevada pressão osmótica inicial, as células parecem ser capazes de continuar com o metabolismo normal e produzir os solventes ABE (EZEJI; QURESHI; BLASCHEK, 2005).

No entanto, segundo Ezeji, Qureshi e Blaschek (2007), a experiência com a fermentação de amido liquefeito industrial tem mostrado que os efeitos da concentração inicial de açúcar sobre a produção de butanol durante o processo de fermentação varia com a composição e presença de inibidores no meio. A presença de inibidores reduz o nível de tolerância de C. beijerinckii BA101 ao açúcar. Portanto, durante a operação dos processos de fermentação, deve-se prestar atenção à concentração de inibidores que estejam presentes no meio, a fim de determinar a concentração de açúcar inicial adequada a ser empregada.

2.4.5 Nutrientes no meio de cultura

O valor nutritivo do meio de cultura também pode ter um grande efeito sobre a produtividade e a concentração final de butirato. Normalmente, a produção de ácido butírico é reforçada em meio rico em nutrientes. Para C. tyrobutyricum, a produção de ácido butírico em meio de cultura enriquecido com extrato de levedura e triptona foi mais alta em comparação com o meio de crescimento de clostridia (MCC), cujos componentes são descritos por Dusséaux et al. (2013). Nos estudos realizados por Canganella et al. (2002), verificou-se que o crescimento de C. thermobutyricum e assimilação da glicose é dependente da concentração do extrato de levedura. Além disso, a peptona ou triptona em solução com 5% de glicose não mostrou-se adequada para substituir a extrato de levedura, provocando um forte aumento na frequência de esporulação.

Estes efeitos do extrato de levedura são comuns em outras espécies de Clostridium e não surpreendem, uma vez que o extrato de levedura é uma fonte nutricional complexa consistindo de aminoácidos, vitaminas e outros fatores de crescimento desconhecidos utilizados por muitos microrganismos (Geng et al., 2010).

Oligoelementos foram mencionados na literatura por afetar a produção de butirato, especialmente ferro e fosfato. Na fermentação de glicerol por C. butyricum, verificou-se que a limitação de fosfato causou um aumento no rendimento de butirato e uma diminuição no rendimento de acetato, enquanto a limitação de ferro fez o inverso (Reimann, Biebl e Deckwer, 1996). Curiosamente, no entanto, ambos resultaram numa melhoria significativa na produção de 1,3-propanodiol e de um decréscimo na relação H2/CO2. Os autores assumem que a enzima hidrogenase (enzima responsável pela liberação de hidrogênio a partir de ferredoxina reduzida) de C. butyricum contém ferro, e que por isso é bastante afetada por limitações de ferro. Eles alegaram que a limitação de ferro e fosfato resultam em maior disponibilidade de redutores equivalentes (NADH2) favorecendo a produção de produtos dependentes de NADH, principalmente 1,3 propanodiol e, em menor proporção, etanol e butirato. No entanto, no que diz respeito com a rota metabólica de butirato, uma limitação de ferro resulta provavelmente em uma reduzida atividade de quinase butirato e, assim, a inibição da produção de butirato.

Dabrock, Bahl e Gottschalk (1992) determinaram que sob limitação de fosfato no processo de fermentação de glicose por Clostridium pasteurianum, os metabólitos foram, quase exclusivamente, acetato e butirato, independente do pH e taxa de crescimento celular. A limitação de ferro ocasionou a produção de lactato (0,38 mol/mol de glicose) em reatores contínuos e de batelada. Em 15% (v/v) de monóxido de carbono na atmosfera (headspace), a glicose foi fermentada a etanol (0,24 mol/mol), lactato (0,32 mol/mol), butanol (0,36 mol/mol), acetato (0,38 mol/mol) e butirato (0,17 mol/mol). Tais resultados demonstraram a flexibilidade de C. pasteurianum a mudanças nas condições do meio, evidenciando que a concentração de nutrientes do meio de cultura exerce influência nas rotas metabólicas da fermentação, principalmente quando se trata de compostos essenciais para a formação de enzimas.

2.4.6 Toxicidade dos metabólitos

Um dos problemas mais críticos em fermentação ABE é toxicidade dos solventes. O metabolismo celular de espécies de Clostridium cessa na presença de 20 g L-1 (LEE; SONG; HWANG, 2009). Isto limita a concentração do substrato de carbono que pode ser utilizado para a fermentação, resultando em baixa concentração final do solvente e da produtividade. O butanol é mais tóxico do que os outros, pois é responsável pelo rompimento dos componentes de fosfolípidos da membrana celular, causando um aumento na fluidez da membrana (BOWLES; ELLEFSON, 1985). Moreira, Ulmer e Linden (1981), tentaram elucidar o mecanismo de toxicidade do butanol em C. acetobutylicum. Eles descobriram que butanol na concentração de 0,1 a 0,15 M causou 50% de inibição do crescimento celular.

Aumento da fluidez da membrana provoca a desestabilização da membrana e perturbação de funções associadas à membrana, tais como vários processos de transporte e a captação de glicose (BOWLES; ELLEFSON, 1985). É sabido que a concentração efetiva de butanol que causa 50% de inibição do crescimento microbiano (EC50) encontra-se na faixa de -1 -1 7-13 g L , enquanto que a EC50 do etanol e acetona é superior a 40 g L (LEE et al., 2008).

Chen et al. (2012) avaliaram quantitativamente as correlações entre a tolerância ao butanol por um consórcio bacteriano (predominantemente clostridios) ou cultura mista e o desempenho da produção fermentativa de butanol. A concentração máxima de butanol tolerada, a produção de butanol e de consumo de glucose foram 16 g L-1, 10,6 ± 0,6 g L-1 e -1 -1 55,0 ± 1,9 g L , respectivamente. A EC50 da cultura mista foi de 9,52 g L . Os resultados deste estudo sugerem que consórcios microbianos, onde haja predominância de Clostridium spp, toleram e produzem butanol em concentrações próximas a cepas puras.

A engenharia biotecnológica tem se voltado para produção de cepas resistentes a toxicidade de solventes por meio da mutagênese aleatória e otimização de processos. O desenvolvimento de C. beijerinckii BA101, que é uma cepa mais tolerante a solvente derivada de C. beijerinckii NCIMB 8052 por mutagênese aleatória, é um exemplo (QURESHI; BLASCHEK, 2001). Além disso, a integração de um processo de recuperação in situ de solvente no processo de fermentação tem sido utilizado como um meio para contornar o problema de toxicidade.

2.5 Características da vinhaça

A vinhaça é caracterizada como efluente de destilarias com alto poder poluente e alto valor fertilizante. O poder poluente, cerca de cem vezes maior que o do esgoto doméstico, decorre da sua riqueza em matéria orgânica, baixo pH, elevada corrosividade e altos índices de demanda bioquímica de oxigênio (DBO) (variando de 20 a 35 g L-1), além de elevada temperatura na saída dos destiladores (85 a 90 °C). É considerada altamente nociva à fauna, flora, microfauna e microflora das águas doces, além de afugentar a fauna marinha que vem às costas brasileiras para procriação (FREIRE; CORTEZ, 2000).

Quando depositada no solo, a vinhaça pode promover melhoria em sua fertilidade; todavia, quando usada para este fim, as quantidades não devem ultrapassar sua capacidade de retenção de íons, isto é, as dosagens devem ser mensuradas de acordo com as características de cada solo, uma vez que este possui quantidades desbalanceadas de elementos minerais e orgânicos, podendo ocorrer a lixiviação de vários desses íons, sobretudo do nitrato e do potássio (SILVA; GRIEBELER; BORGES, 2007).

Em dezembro de 2006 a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (Cetesb) publicou a norma P4.231 “Vinhaça: critérios e procedimentos para aplicação no solo agrícola” no Estado de São Paulo. A norma restringe a aplicação de vinhaça em áreas onde o solo se encontra saturado, principalmente de íons potássio (K+). Dessa forma, torna-se necessário o desenvolvimento de tecnologias para o tratamento e disposição deste resíduo de forma a reduzir os impactos ambientais (CETESB, 2006).

Segundo Baez-Smith (2006), a produção média de vinhaça em destilarias de cana-de- açúcar é de aproximadamente 12 galões de vinhaça para cada galão de etanol produzido, representando um enorme volume de resíduo. As características da vinhaça dependem principalmente da matéria-prima utilizada na produção. O etanol pode ser produzido a partir de quatro matérias-primas principais: sacarose, amido, celulose e inulina (polissacarídeo da frutose). Sacarose é o mais comum, uma vez que os açúcares são encontrados numa forma simples de carboidratos fermentáveis. Estes são encontrados em culturas como cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), beterraba (Betavulgaris L.), uva (Vitis vinifera L.) e sorgo sacarino (Sorgo bicolor (L.) Moench) (ESPAÑA-GAMBOA et al., 2011).

No Brasil, tanto o açúcar bruto como o etanol são produzidos principalmente a partir do sumo da cana-de-açúcar. No processo de produção do açúcar, tem-se como subproduto o melaço, resultado da concentração do sumo e da precipitação de açúcar e de algumas impurezas presentes no sumo, que são separados pela adição de reagentes químicos, tais como cal e enxofre (ENSINAS et al., 2009). Devido ao processo de cristalização, o melaço tem altas concentrações de potássio, fosfatos, sulfatos, cálcio, ferro, sódio, cloretos, fonte de carbono e de outros oligoelementos do que suco de cana-de-açúcar (WILKIE; RIEDESEL; OWENS, 2000).

O melaço é também utilizado para a produção de etanol, uma vez que este contém açúcares fermentáveis, como dissacarídeos e monossacarídeos. O teor destes açúcares no melaço varia inversamente ao teor de pureza do açúcar bruto (GOPAL; KAMMEN, 2009). No Brasil, é muito comum a integração entre produção de açúcar e destilação de etanol, de forma que o etanol pode ser produzido conjuntamente a partir do melaço e do sumo de cana- de-açúcar, gerando, desta forma, um resíduo de vinhaça com característica bastante variável.

O melaço é usualmente caracterizado como resíduo com alto potencial de degradabilidade e alto conteúdo de sulfato. Embora o alto teor de sulfato leve a complicações no processo de fermentação anaeróbio, inúmeros processos de biotratamento e fermentativos (BAGHCHEHSARAEE, 2009). Segundo Qureshi e Blaschek (2005), o melaço contém aproximadamente 50% de sacarose, que pode ser hidrolisada por culturas solventogênicas durante a fermentação para a produção de butanol.

Na Tabela 3 estão apresentados os principais parâmetros que definem a composição química da vinhaça obtida na produção de açúcar e etanol de cana-de-açúcar. A informação disponível na literatura indica que a vinhaça de melaço de cana e vinhaça mista possui concentrações mais elevadas de DQO, DBO, ST, NT, Ca P, K, Mg, sulfatos e açúcares, sugerindo um potencial poluidor maior para este efluente, se comparado com a vinhaça oriunda da produção de açúcar. As variações na concentração dos parâmetros químicos, entre diferentes tipos de vinhaça de cana, são bastante elevadas, aumentando em cerca de 14 vezes a concentração de DQO de vinhaça mista entre os estudos de Kannan e Upreti (2008) e Acharya, Mohana e Madamwar (2008).

De acordo com Costa et al. (1986), muitas usinas de açúcar e destilarias de etanol operam de modo diferente durante o ano. Esta variação no modo de produção ocasiona

grandes flutuações na composição da vinhaça. Além disso, as condições edafoclimáticas, variedade da cana e tipo de solo podem contribuir nestas flutuações (SÁNCHEZ RIERA; CÓRDOBA; SIÑERIZ, 1985).

Tabela 2 - Média e variação (amplitude de valores) dos parâmetros físico-químicos que caracterizam a vinhaça.

Parâmetros / Tipo de Média Variação Média Variação Média Variação efluente Vinhaça de melaço de cana [1] Vinhaça de sumo da cana-de-açúcar [2] Vinhaça mista [3] pH 4,3 3,4 5,7 4,1 3,5 4,6 4,9 3,0 7,7 DBO (g/L) 41,29 7,00 95,00 16,09 6,00 27,00 32,25 7,75 60,00 DQO (g/L) 94,24 15,00 176,00 31,97 15,00 65,80 78,14 13,82 190,00 ST (g/L) 84,11 21,00 140,00 46,60 23,70 70,80 86,33 21,44 190,00 SV (g/L) 66,50 40,00 100,00 18,45 16,90 20,00 71,43 40,00 120,00 N total (g/L) 1,71 0,38 8,90 0,72 0,10 1,40 1,70 0,37 7,00 P (mg/L) 464 26 1500 174 10 320 559 2 2700 K (g/L) 7,81 1,92 22,59 2,82 1,20 6,70 8,89 1,30 20,00 Ca (g/L) 2,58 0,45 6,70 0,68 0,11 2,20 1,85 0,90 4,57 Mg (g/L) 1,16 0,42 2,35 0,37 0,10 1,10 0,95 0,58 1,65 Fe (mg/L) 52,0 1,0 120,0 50,3 15,0 120,0 9,2 9,2 9,2 Cu (mg/L) 17,0 4,0 30,0 64,5 4,0 125,0 1,0 0,3 1,7 Zn (mg/L) 84,6 1,8 225,0 18,0 1,0 35,0 1,3 1,3 1,3 Na (mg/L) 628,0 130,0 2510,0 255,1 0,2 510,0 1360,0 480,0 2500,0 Sulfato (g/L) 4,14 0,07 6,80 1,53 0,40 4,80 3,98 0,07 9,00 Cloretos (g/L) 4,84 0,68 8,00 n.a n.a n.a 5,94 1,30 8,50 Fenóis (mg/L) n.a n.a n.a n.a n.a n.a 6011 34 10000 Ácido acético (g/L) 2,51 0,70 5,50 n.a n.a n.a 2,24 2,24 2,24 Ácido Propriônico (g/L) 0,09 0,09 0,09 n.a n.a n.a 4,30 4,30 4,30 Ácido Butírico (g/L) 0,29 0,29 0,29 n.a n.a n.a n.a n.a n.a Açucares (g/L) 29,50 14,00 45,00 9,59 4,17 15,00 5,50 1,00 10,00 Referencias: [1] (BORIES; RAYNAL; BAZILE, 1988; COSTA et al., 1986; ESPAÑA-GAMBOA et al., 2011; HARADA et al., 1996; YEOH, 1997); [2] (COSTA et al., 1986; ESPAÑA-GAMBOA et al., 2011; FREIRE; CORTEZ, 2000; LÓPEZ; BORZACCONI, 2011); [3] (ACHARYA; MOHANA; MADAMWAR, 2008; CHIDANKUMAR; CHANDRAJU; NAGENDRASWAMY, 1999; COSTA et al., 1986; DE BAZÚA; CABRERO; POGGI, 1991)

3. METODOLOGIA

Os passos da metodologia utilizadas no desenvolvimento deste trabalho estão detalhados nos itens 3.1 a 3.5. O trabalho se divide em 2 etapas principais, que estão detalhadas nos itens 3.2 e 3.3.

3.1 Caracterização da vinhaça

A vinhaça utilizada neste trabalho é proveniente da Usina São Martinho, localizada no município de Pradópolis, SP. Este resíduo corresponde a produção de uma usina mista, ou seja, que produz tanto açúcar como etanol do suco da cana-de-açúcar. A coleta de vinhaça é realizada periodicamente por equipe técnica do Laboratório de Processos Biológicos do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Hidráulica e Saneamento da Universidade de São Paulo, campus São Carlos (LPB PPG-SHS USP/São Carlos), com armazenamento em bombonas de 5 L em freezer a -15 °C. Foram utilizados dois lotes de vinhaça, o primeiro utilizado na Etapa 1 do trabalho, coletado em 28/07/2013, e o segundo na Etapa 2, coletado em 22/10/2013.

Para facilitar a utilização do resíduo, o mesmo foi descongelado e transferido para frascos de 250 mL e novamente armazenado e freezer até o momento dos ensaios. Na Etapa 1 a vinhaça bruta foi centrifugada a 6000 rpm por 5 minutos em tubos Falcon de 50 mL, utilizando uma centrifuga, para retirada da maior parte dos sólidos suspensos e diminuição da turbidez do resíduo e assim atenuar a interferência nas medições de densidade ótica para acompanhamento do crescimento microbiano no meio de cultura suplementado com vinhaça. Na Etapa 2, utilizou-se a vinhaça bruta.

Parte das análises de caracterização da vinhaça foram realizadas no Laboratório de Saneamento da Faculdade de Engenharia Agrícola, da Universidade Estadual de Campinas (FEAGRI/UNICAMP) e outra parte no LPB PPG-SHS USP/São Carlos. Na Tabela 6 está mencionado o método, a referência e local de cada análise.

Tabela 3- Métodos analíticos para caracterização da vinhaça.

Local: Laboratório de Saneamento - FEAGRI/UNICAMP Análise Símbolo Método Referência Demanda Química de DQO Bruta 5220 D - Método Colorimétrico (APHA, 2005) Oxigênio Potencial Hidrogeniônico pH 4500 B - Método eletrométrico ST, SV, SF (APHA, 2005) Série de Sólidos 2540 B-E SSV (PENTEADO; Álcoois, Açúcares e Ácidos - Método Cromatográfico (HPLC) ADORNO; Voláteis ZAIAT, 2012) Local: LPB PPG-SHS USP/São Carlos Demando Bioquímica de DBO Bruta 5210 B – Teste DBO 5 dias Oxigênio

Nitrogênio Amoniacal NH3 4500 C – Método Titulométrico - Nitrito NO2 4500 B – Método Colorimétrico - Nitrato NO3 4500 – Método Espectrofotométrico

Nitrogênio Total Kjeldahl Norg 4500 B – Método Macro-Kjeldahl

Sulfato SO4 4500 E – Método Turbidimétrico Sulfeto S2- 4500 Zinco Zn Chumbo Pb Cadmio Cd (APHA, 2005) Níquel Ni Ferro Fe Manganês Mn 3110 – Espectrometria de Absorção Atômica Cobre Cu Cromo Total Cr Cálcio Ca Magnésio Mg Sódio Na Potássio P

3.2 Etapa 1: Influência do pré-tratamento do inóculo e da suplementação de vinhaça para produção de álcoois e AOV

3.2.1 Montagem experimental

Nesta etapa da fermentação foram utilizados frascos de Duran de 500 mL adaptados para entrada e saída de gases e para amostragem por meio de seringa, como está apresentado

na Figura 3. Esta adaptação foi realizada com intuito de facilitar a purga de gás N2 nos frascos como também diminuir o contato com a atmosfera externa por meio da amostragem com seringa.

Figura 3 – Frasco reator com adaptação de dispositivo para entrada e saída de gases.

3.2.2 Pré-Tratamento do inóculo e enriquecimento da cultura

O inóculo utilizado neste trabalho é proveniente um reator anaeróbio compartimentado (03 câmaras) de fluxos ascendente e descendente, localizado na estação de tratamento de bovinocultura de leite do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais. A estação de tratamento foi implantada em tamanho real, para tratar um volume de resíduos líquidos em torno de 4 m3 dia-1.

O lodo coletado em 16 de junho de 2014 dos três compartimentos do reator (1 L cada frasco) foi misturado e armazenado sob refrigeração até o início dos ensaios.

O inóculo passou por dois processos de pré-tratamento, objetivando o favorecimento da prevalência dos microrganismos formadores de esporos (espécies solventogênicas como Clostridium sp). A seguir estão descritos os processos que foram baseados nos trabalhos de Baghchehsaraee (2009) e Wang et al. (2011).

i. Tratamento Térmico (TT): Uma alíquota de 300 mL do inóculo, previamente filtrado em peneira de nylon para remoção dos sólidos maiores, foi submetida ao aquecimento até ebulição por 30 minutos Após a fervura, resfriou-se em banho de gelo e armazenou-se em refrigerador a 4°C por 24 horas.

ii. Choque Ácido/Térmico (AT): Uma alíquota de 300 mL do inóculo, previamente filtrado em peneira de nylon, foi submetida ao aquecimento em banho-maria a 80°C por 30 minutos Em seguida, resfriou-se em banho de gelo e o pH foi corrigido para 3 com a adição de HCl 0,1. O inóculo tratado foi armazenado em refrigerador a 4°C por 24 horas.

Após 24 horas, 20 mL (10% v/v) de cada inóculo tratado foi adicionado, separadamente, em 180 mL de meio de cultura (autoclavado 120° C por 30 min) próprio para o crescimento de clostridios, Reinforced Medium Clostridium (RMC), com pH do meio ajustado para 6,8.

A composição do RMC foi adaptada de Ni, Wang e Sun (2012) e está descrita na Tabela 4.

Tabela 4 - Composição do RMC.

Ingrediente Concentração (g L-1)

KH2PO4 1,0

K2HPO4 1,0 NaCl 5,0

MnSO4 7H2O 0,02

MgSO4 7H2O 0,5

FeSO4 7H2O 0,05 Acetato de amônio 1,1 Ácido p-aminobenzóico 0,0001 L-cisteina 0,5 Amido solúvel 1,0 Ágar 0,5 Peptona 10,0 Extrato de levedura 3,0 Extrato de carne 10,0 Glicose 10,0

Para garantir as condições de anaerobiose, gás nitrogênio, N2 (100 %), foi fluxionado no meio líquido e no headspace por 5 minutos. Para enriquecimento das culturas os inóculos, resultantes dos pré-tratamentos AT e TT, foram incubados em estufa shaker a 35° C por 24 horas sem agitação. Após 24 horas, 20 mL de cada inóculo foi reinoculado em 180 mL de meio fresco seguindo o mesmo procedimento, que foi repetido por três vezes, resultando em 3 gerações (I1, I2 e I3). Diariamente foram coletadas amostras para monitoramento do pH e

densidade ótica (OD). O fluxograma apresentado na Figura 4 esquematiza o procedimento adotado.

Figura 4 – Fluxograma esquemático do processo de pre-tratamento e incubação do lodo, utilizado como inóculo neste trabalho.

Os inóculos resultantes dos dois tratamentos foram armazenados em refrigerador. Quando do início dos ensaios de fermentação, eles foram ressuspendidos por aquecimento em banho-maria a 80° C por 10 minutos

3.2.3 Ensaio de Fermentação: Vinhaça como fonte de substrato

Neste ensaio foi utilizada a vinhaça (V) e a sacarose (S) como fontes de substrato em dois meios de cultura distintos. Foram testados os inóculos AT e TT, resultantes da terceira geração, I3. Cada tratamento foi realizado em triplicata, totalizando 12 amostras. Na Figura 5 está apresentado um fluxograma esquemático do experimento.

Figura 5 – Fluxograma do ensaio de fermentação. As letras a,b e c representam as repetições de cada tratamento.

A composição do meio de cultura sintético (MCS) utilizado no processo de fermentação foi preparado pela adição de alíquotas de 5 soluções concentradas de micronutrientes, macronutrientes, vitaminas, tampão e pela adição de agente redutor. Este meio foi utilizado no trabalho de Monot et al., (1982) e foi modificado neste trabalho com intuito de favorecer o crescimento e manutenção um consórcio de microrganismos da classe clostridia. A composição de cada solução está descrita na Tabela 5. As fontes de carboidrato ou substrato do meio de cultivo são o resíduo de vinhaça e o açúcar demerara, açúcar proveniente da cana-de-açúcar que não é tratado quimicamente. A composição nutricional deste açúcar é de aproximadamente (mg100 g-1): 85 de cálcio, 29 de magnésio, 22 de fósforo e 346 de potássio, segundo informações na embalagem do produto.

Tabela 5 - Composição das soluções estoque.

Solução Ingrediente Concentração (g L-1)

MgSO4 7H2O 2,0

1 - Micronutrientes FeSO4 7H2O 0,5

MnSO4 0,2

KH2PO4 10,0 K HPO 10,0 2 - Macronutrientes 2 4 Acetato de Amônio 11,0

(NH4) 2SO4 25,0 Extrato de levedura 30,0 ácido nicotínico 0,01 piridoxina 0,02 3 - Vitaminas riboflavina 0,01 tiamina 0,01 ácido p-aminobenzóico 0,001 4 – Agente Redutor l-cisteína 40,0 5 - Tampão bicarbonato de sódio 30,0

As soluções 3 e 4 foram armazenadas em freezer a -20º C. As demais soluções foram armazenadas em refrigerador por não mais que 15 dias.

As alíquotas de cada solução adicionadas a cada amostra, perfazendo 300 mL de meio de cultivo estão descritas na Tabela 6. O pH de cada amostra foi ajustado para 6,9 +- 0,05 com 1 N de HCl.

Tabela 6 – Alíquotas para preparação do MCS suplementado com vinhaça e com açúcar demerara, utilizado no ensaio de fermentação.

Tratamento/Amostras Solução/Compostos AT V AT S TT V TT S Açúcar - 3 g - 3 g Micronutrientes 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Macronutrientes 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Vitaminas 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Tampão 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Agente Redutor 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL Vinhaça 50 mL - 50 mL - Inóculo 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL Água 120 mL 170 mL 120 mL 170 mL

N2 foi fluxionado no meio líquido e no headspace por 5 minutos. Em seguida as amostras foram incubadas em shaker sob temperatura controlada de 37 °C a uma rotação de 60 rpm. O ensaio de fermentação teve duração de 6 dias.

Para acompanhamento do pH, foram coletadas amostras a cada dois dias. Para análise dos AOV, carboidratos e álcoois, foram coletadas amostras no tempo inicial e final do ensaio.

Todo o efluente resultante da fermentação, retirado a cada três dias, foi armazenado em um galão destinado a pesquisa de doutorado que tem por objetivo caracterizar e propor formas de tratamento para o resíduo resultante dos processos de fermentação.

3.2.4 Ensaio de Fermentação: Vinhaça como meio nutriente

Neste ensaio, a vinhaça (V) foi utilizada como meio nutriente, em substituição aos macro e micro nutrientes do MCS. O açúcar demerara foi utilizado como principal fonte de substrato. Foram testados os inóculos AT e TT, resultantes da terceira geração em dois meios distintos, um com vinhaça (V) como meio nutriente e outro com solução sintética de macro e micro nutrientes (S). Cada tratamento (AT e TT) foi realizado em triplicata, totalizando 12 amostras em cada ensaio. Foram realizados 3 ensaios em regime de batelada com ciclos de aproximadamente 170 horas, variando-se a suplementação de vinhaça nos meio V e nenhuma mudança no meio S, que serviu de controle. Neste trabalho denominamos com B1, B2 e B3 correspondendo a doses de 1/3, 1/2 e 2/3 de vinhaça, respectivamente. Na Figura 6 está apresentado um fluxograma esquemático do experimento.

Figura 6 – Fluxograma do ensaio de fermentação com doses suplementares de vinhaça. As letras a,b e c representam as repetições de cada tratamento.

No fluxograma, as setas apontando para direita representam a fonte de alimentação, ou seja, no primeiro ensaio (B1) foi utilizado o inóculo proveniente da terceira geração após tratamentos AT e TT, já no segundo ensaio (B2), o inóculo utilizado é proveniente do último dia de fermentação do ensaio anterior (B1) e assim sucessivamente. Tal estratégia foi utilizada visando a adaptação dos microrganismos as doses crescentes de vinhaça.

As soluções e substâncias que compõem o meio de cultivo de cada amostra dos 3 ensaios está descrita na Tabela 7. O pH inicial de cada amostra foi ajustado para 6,9 ± 0,05 com 1 N de HCl. A composição das soluções (vitaminas, macronutrientes, micronutrientes, tampão e agente redutor) foi apresentada na Tabela 5.

Tabela 7– Alíquotas para preparação do MCS suplementado com vinhaça e com açúcar demerara, utilizado no ensaio de fermentação.

Ensaio B1 Tratamento/Amostras Solução/Compostos AT V AT S TT V TT S Açúcar 5,74 g 6,0 g 5,74 g 6,0 g Micronutrientes - 30 mL - 30 mL Macronutrientes - 30 mL - 30 mL Vitaminas 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Tampão 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Agente Redutor 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL Vinhaça 100 mL - 100 mL - Inóculo 15 mL 15 mL 15 mL 15 mL Água 125 mL 165 mL 125 mL 165 mL Ensaio B2 Açúcar 5,61 g 6,0 g 5,61 g 6,0 g Micronutrientes - 30 mL - 30 mL Macronutrientes - 30 mL - 30 mL Vitaminas 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Tampão 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Agente Redutor 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL Vinhaça 150 mL - 150 mL - Inóculo 15 mL 15 mL 15 mL 15 mL Água 75 mL 165 mL 75 mL 165 mL Ensaio B3 Açúcar 5,48 g 6,0 g 5,48 g 6,0 g Micronutrientes - 30 mL - 30 mL Macronutrientes - 30 mL - 30 mL Vitaminas 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Tampão 30 mL 30 mL 30 mL 30 mL Agente Redutor 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL 0,75 mL Vinhaça 150 mL - 150 mL - Inóculo 15 mL 15 mL 15 mL 15 mL Água 25 mL 165 mL 25 mL 165 mL

A determinação anterior do conteúdo de sacarose, glicose e frutose na vinhaça possibilitou o cálculo da dosagem de açúcar nos meios que continham vinhaça, com propósito de manter uma concentração inicial de 20 g L-1 de carboidrato (sacarose, glicose e frutose) em

todos os ensaios.

O gás N2 foi fluxionado no meio líquido e no headspace por 5 minutos. Em seguida as amostras foram incubadas em shaker sob temperatura controlada de 37 °C a uma rotação de 60 rpm. O ensaio de fermentação teve duração de 7 dias.

No terceiro dia de fermentação, o pH foi ajustado para 6,5 ± 0,1 com NaOH 1 N no primeiro ensaio (B1). Devido à instabilidade na manutenção do pH, no segundo e terceiro ensaio (B2 e B3) foi utilizado para correção do pH solução saturada de bicarbonato de sódio. Também no terceiro dia, foi cessada a agitação no shaker, com objetivo de manter parte do gás hidrogênio produzido na forma dissolvida no caldo de fermentação, favorecendo o aumento da concentração de butirato e acetato (VAN ANDEL et al., 1985). A correção do pH teve como objetivo aumentar a concentração de butirato ou ácido butírico não dissociado, favorecendo assim a mudança para fase solventogênica evitando a queda no pH para valores inferiores a 4,5 (BRYANT; BLASCHEK, 1988)

Para acompanhamento do pH e densidade ótica (OD), foram coletadas amostras a cada dois dias. Para análise dos AOV, carboidratos e álcoois, foram coletadas amostras no tempo inicial e final do ensaio.

3.3 Etapa 2: Efeito da suplementação de vinhaça com melado de cana-de-açúcar para produção de álcoois e AOV

3.3.1 Montagem experimental

Nesta etapa do processo de fermentação foi utilizado como reator um frasco de vidro âmbar de 2,5 L, com volume reacional de 1,5 L, adaptado com válvula para entrada e saída de gases e com tubo capilar acoplado a uma de seringa para retirada de amostras, como está apresentado na Figura 7. Esta adaptação foi realizada com intuito de facilitar a purga de gás

N2 no frasco como também diminuir o contato com a atmosfera externa por meio da amostragem com seringa. Na válvula de saída de gás foi acoplado um medidor de vazão de gás (Ritter) por meio de uma mangueira de silicone.

Figura 7 - Reator utilizado no processo de fermentação de meio com vinhaça com melaço de cana-de-açúcar.

3.3.2 Pré-Tratamento e enriquecimento do inóculo

O lodo proveniente da estação de tratamento de bovinocultura de leite do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas Gerais, passou por novo processo de pré-tratamento antes da sua utilização como inóculo.

Neste processo, 30 mL de lodo previamente filtrado em peneira de nylon foi misturado a 200 mL de vinhaça bruta, 12 g de sacarose e 30 mL de solução de vitaminas em frasco de duran, completando-se o volume, 300 mL, com água destilada. O inóculo foi autoclavado a 120° C por 10 min, a pressão de 1 kgf/cm2.

Em seguida, após resfriamento, foi adicionado ao inóculo 0,75 mL de solução de l- cisteína e o pH foi corrigido para 6,5 com solução saturada de bicarbonato de sódio.

Fluxionou-se das N2 por 10 min. O frasco com inóculo foi colocado na incubadora shaker a 37° C com agitação de 60 rpm por 16 horas. E seguida cessou-se a agitação e o inóculo permaneceu na incubadora por mais 5 dias.

3.3.3 Ensaio de Fermentação

Neste ensaio, a vinhaça foi utilizada na forma bruta, ou seja, sem passar por nenhum tratamento ou filtragem. O melado de cana foi utilizado como principal fonte de substrato, com carga fixa de aproximadamente 25 g L-1. O inóculo resultante do processo de autoclavagem, denominado como AU, foi utilizado na alimentação do primeiro ensaio de fermentação. Foram realizados 3 ensaios em regime de batelada com duração de 12 dias, variando-se a suplementação de vinhaça, correspondendo a doses de 65, 75 e 85 % de vinhaça, respectivamente. Na Figura 8 está apresentado um fluxograma esquemático do experimento.

Figura 8– Fluxograma esquemático do ensaio de fermentação da etapa 2.

Da mesma forma que o experimento anterior, a alimentação foi realizada de B1 para B2 para B3, para adaptação dos microrganismos ao crescente aumento na concentração de vinhaça. As soluções utilizadas para composição do meio fermentativo estão descritas na Tabela 8.

Tabela 8– Alíquotas para preparação do meio de cultivo utilizado nos ensaios de fermentação da etapa 2.

Amostra/Ensaio Solução/Compostos AU-B1 AU-B2 AU-B3 Melado 60 g 60 g 60 g Vitaminas* 30 mL 30 mL 30 mL Bicarbonato de sódio 10 g 10 g 10 g Agente Redutor 3,75 mL 3,75 mL 3,75 mL Vinhaça bruta 975 mL 1125 mL 1275 mL Inóculo 150 mL 150 mL 150 mL Água 295 mL 145 mL - *Solução de vitaminas foi concentrada 5 vezes e relação a composição apresentada na Tabela 5.

O gás N2 foi fluxionado no meio líquido e no headspace por 10 minutos. Em seguida o frasco reator foi colocado na incubadora shaker sob temperatura controlada de 37 °C a uma rotação de 60 rpm. O ensaio de fermentação teve duração média de 12 dias.

Nos primeiros 3 dias de ensaio, as coletas para análise cromatográfica e acompanhamento do pH foram diárias. Após o terceiro dia, as coletas foram feitas a cada 48 horas. O pH foi corrigido para 6,5 ± 0,1 nos primeiros dias de coleta com solução saturada de bicarbonato de sódio. Também no terceiro dia, foi cessada a agitação no shaker, coincidindo com a redução no volume do gás produzido que foi acompanhado por meio da leitura de medidor de vazão.

3.4 Acompanhamento analítico

Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Saneamento da Faculdade de Engenharia Agrícola, da Universidade Estadual de Campinas, sob acompanhamento do técnico responsável pelo laboratório.

Para acompanhamento do ensaio de fermentação, amostras foram coletadas para análise de pH, OD e para determinação de AOV, carboidratos e álcoois utilizando método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). A medida de pH e OD foi realizada imediatamente após a coleta. A análise de OD consiste na leitura da amostra diluída 1:1 com

água destilada em espectrofotômetro a 600 nm (BEGOT et al., 1996). O aumento da turbidez da amostra indica o aumento do crescimento bacteriano e aumenta o sinal de absorbância.

Para determinação dos AOV, carboidratos e álcoois, as amostras foram pré-tratadas e armazenadas. O procedimento de pré-tratamento consistiu em misturar uma alíquota de 4 mL de cada amostra a 0,5 mL de uma solução saturada de BaOH2 e 0,5 mL de uma solução 5 % de

ZnSO4 em tubo Falcon de 15 mL, centrifugando a 3200 rpm por 10 min. O sobrenadante foi armazenado em freezer (-20° C) para análise posterior. Tal tratamento foi utilizado por Sydney (2013) para retirada dos sólidos em suspensão.

3.4.1 Metodologia CLAE

O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) utilizado neste trabalho foi desenvolvido no LPB PPG-SHS USP/São Carlos e consiste em determinar álcoois, AOV e carboidratos em uma única corrida, com coluna Aminex HPX-87H e detectores de UV/DAD e IRD em série (PENTEADO; ADORNO; ZAIAT, 2012).

Foi utilizado equipamento SHIMADZU® equipado com bomba LC-10ADVP, amostrador automático SIL-20A HT, forno CT-20A, dois detectores ligados em série: um detector de ultravioleta com arranjo de diodos (UV-DAD) do modelo SDP-M10 AVP e um detector por índice de refração RID-10A (DIR), além do controlador SCL-10AVP. Usou-se a coluna AMINEX® HPX-87H (300 mm x 7,8 mm; BioRad) e o software LC Solution (SHIMADZU®) para analisar os resultados.

Para curva de calibração, foram utilizados 2 carboidratos, 3 álcoois e 12 AOV. Os carboidratos utilizados foram frutose e glicose, os álcoois metanol, etanol e n-butanol e os ácidos cítrico, málico, succínico, lático, fórmico, acético, propiônico, iso-butírico, butírico, iso- valérico, valérico e capróico. Tanto os álcoois como os ácidos são os principais metabólitos possivelmente encontrados na produção de bioenergia a partir de efluente sintético à base de sacarose, da vinhaça da cana-de-açúcar e do hidrolisado do bagaço da cana-de-açúcar (HAWKES et al., 2002).

Os ácidos foram detectados pelo detector SDP-M10 AVP e os carboidratos e álcoois pelo detector RID-10A. Como fase móvel usou-se solução de ácido sulfúrico 0,005 M. As

condições operacionais foram: temperatura da coluna: 43ºC e fluxo do eluente, 0,5 ml.min-1.

Usou-se padrões cromatográficos para os ácidos e os álcoois com 99% de pureza, obtidos da Sigma-Aldrich®. Os padrões dos carboidratos (frutose e glicose) têm 99% de pureza e são da Synth®. O ácido sulfúrico foi obtido da JT Baker® com 99% de pureza e a água foi ultrapurificada em sistema Millipore Mili-Q®.

A preparação das amostras para injeção consistiu na filtração de pequena alíquota (1 mL) em membrana de acetato de celulose com poro de 0,2 μm, com auxílio de uma seringa plástica. O filtrado foi adicionado aos vessels juntamente com a adição de 40 μL de solução de ácido sulfúrico 1 N (pre filtrada em membrana de acetato de celulose) para reduzir o pH da amostra a 2, já que esta é a faixa de pH é ideal para separação dos analitos na coluna utilizada (PECINA et al., 1984). O volume de amostra injetado foi 100 μL. A concentração dos analitos na curva de calibração foi de 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 e 900 mg L-1. Nas Figuras 9 e 10 são apresentados os cromatogramas obtidos a partir dos detectores de ultravioleta e índice de refração, respectivamente.

Figura 9- Cromatograma típico da determinação de ácidos por CLAE com detector de UV e arranjo de diodos.

Figura 10 - Cromatograma típico da determinação de carboidratos e álcoois por CLAE com detector de índice de refração.

3.4.2 Limitação do método

Uma limitação encontrada neste método se deve a presença de sacarose nas amostras. A sacarose é um dissacarídeo formado por uma fração equimolar de glicose e frutose. A Inversão da sacarose ocorre quando a ligação glicosídica é hidrolisada, libertando as unidades de

monossacárido, glicose e frutose. Esta reação é dependente do pH da solução, temperatura, concentração de sacarose, e reagente de hidrólise. Wienen e Shallenberger (1988) avaliaram a influência do pH e da temperatura na cinética de reação de hidrólise da sacarose. Constataram que uma solução de concentração 2 g L-1 de sacarose em pH 1,2 a temperatura de 30°C leva 200 h para completa reação de inversão.

A adição de ácido sulfúrico 1 N para redução de pH e separação dos analitos não é suficiente para hidrolisar completamente a sacarose presente nas amostras. Por outro lado, se as amostras fossem expostas a elevada temperatura e por período mais longo isso poderia provocar alteração na concentração dos outros analitos avaliados. Desta forma, foi feita uma curva de padronização separadamente com solução de sacarose (padrão analítico) nas concentrações de 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg L-1. Durante a corrida, no detector RID- 10A, foram registrados 3 picos, como mostrado na Figura 11. O primeiro pico corresponde a sacarose (TR = 8,95 min), seguido pela glicose e frutose. Isto ocorre devido a adição de ácido na amostra, que causa hidrólise parcial da sacarose. Para correção do cálculo da concentração de sacarose, subtraiu-se a concentração teórica de sacarose da concentração de glicose e frutose detectada em cada corrida. As concentrações teóricas e determinadas estão mostradas na Tabela 9.

Tabela 9 – Parâmetros para correção da concentração de sacarose

Sacarose Teórica Glicose Frutose Sacarose corrigida Área pico mg L-1 50 9,3 4,1 36,6 26916 100 23,3 6,2 70,5 62649 200 74,9 16,7 108,4 138139 400 154,2 34,5 211,2 267778 600 247,0 56,3 296,6 406752 800 337,1 80,9 382,0 534249

Figura 11 - Cromatograma com detector de índice de refração. Picos de sacarose, glicose e frutose em amostra padrão de sacarose 800 mg L-1.

A duas variáveis, concentração de sacarose corrigida e área do pico, possuem forte correlação e linearidade. Testes posteriores foram realizados verificar a concordância entre o valor real do analito na amostra e o estimado pela interpolação da área do pico na curva de calibração. Em 6 amostras analisadas de concentração iguais ao da curva padrão a diferença não foi superior a 6,5 %. Com a verificação da linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação e de detecção do método, julgou-se adequada sua utilização para determinação da concentração de sacarose nas amostras.

3.5 Caracterização microbiológica da biomassa

Toda a caracterização microbiológica das amostras foi realizada em laboratórios especializados externos a UNICAMP. A análise de coloração Gram e morfologia celular foi realizada no Laboratório de Microbiologia Ambiental do Departamento de Biologia da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), campus Sorocaba e no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (UNESP), campus Rio Claro. Após etapa de pré-tratamento dos inóculos, foram realizados exames microscópicos das amostras correspondentes aos tratamentos AT e TT, compreendendo todas as gerações, ou seja, de I0 até I3. A microscopia foi realizada em luz comum, contraste de fase e fluorescência usando microscópio Leica acoplada a câmera Optronics e software Image Pro-Plus. A coloração de Gram foi realizada segundo Scientific Services of Cultures Collections da Alemanha (DSM, 1991).

3.5.1 Pirosequenciamento

As amostras coletadas para análise de pirosequenciamento foram os referentes aos tratamentos AT e TT resultantes da fermentação com maior dosagem de vinhaça, ou seja, ATV B3 e TTV B3. Uma terceira amostra foi coletada após incubação do inóculo pré-tratado com processo de autoclavagem, que neste trabalho foi designado como AU I. Todas as amostras foram lavadas sucessivamente em tampão fosfato e centrifugadas. Os pellets foram armazenados a -20°C.

A extração do DNA dos pellets, realizada no LPB PPG-SHS USP/São Carlos, foi baseada em protocolo de Griffiths et al. (2000) modificado, usando fenol tamponado com Tris e clorofórmio. O DNA extraído (1 μL) foi quantificado em espectrofotômetro Nanodrop 2000. A integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarose 0,8% em TAE 1X. As amostras foram enviadas em concentração de no mínimo 10 ng/μL e pureza OD260/280 de no mínimo 1,8. Além disso, foi verificada a amplificação do DNA utilizando os iniciadores 27f e 1100r (LANE, 1991; TURNER et al., 1999). A PCR foi realizada em termociclador Eppendorf Mastercycler (Eppendorf AG - 22331 Hamburg).

O DNA extraído foi desidratado em etanol 95% e enviado ao Laboratório de Genética de Microrganismos, da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo (ESALQ/USP) para análise de pirosequenciamento em equipamento Miseq - Illumina, 2x250 ciclos. O gene 16S rRNA, região V3 e V4, foram selecionados como o par de iniciadores bacterianos mais promissor (KLINDWORTH et al., 2013). A ampliação do gene foi realizada utilizando os primers: forward 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG CCTACGGGNGGCWGCAG 16S e ampliação PCR reverse primer 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAA TCC, correspondendo as sequencias em negrito aos primers específicos para o domínio da bactéria.

A etapa de obtenção dos dados brutos foi feita pelo software CASAVA 1.8.2 fornecido pela Illumina, que transforma a base dos dados brutos em reads no formato fastq acompanhados dos pontos de qualidade phred. Os reads foram visualizados utilizando o programa FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/).

A filtragem dos reads de baixa qualidade, sequências de adaptadores e vetores foi realizada pelo programa Seqyclean (https://bitbucket.org/izhbannikov/seqyclean), utilizando como cutoff bases com qualidade inferior a 24 pontos (QScore). A bases de dados de contaminantes usada foi a Univec (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html). Após filtragem, reads com tamanho inferior a 65pb foram removidos.

Para a análise de metagenômica foi utilizada a base de dados RDP (Ribosomal Database Project), que possui mais de 33.082 sequências do gene 16S rRNA do domínio Archaea e 643.916 do domínio Bacteria (Cole). O pipeline usado foi o do pacote QIIME v 1.9 (Caporaso et al 2010) em 3 etapas:

1) Concatenação dos reads pareados;

2) Filtragem, procura e identificação de OTUs. Nessa etapa o programa também realiza uma nova montagem dos reads que não tiveram hit com a base de dados e procura hit contra todas as bases disponíveis;

3) Análises de rarefação, alfa e beta diversidade. Para essas análises é levado em consideração a profundidade de cobertura da amostra com menos reads para utilizar o parâmetro sampling_depth de forma adequada.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Composição da vinhaça

Foram encontrados, por meio das determinações analíticas, minerais importantes para a produção de solventes, tais como o manganês, ferro, magnésio e potássio. Além disso, observou-se a presença de concentrações elevadas de AOV, particularmente málico, láctico e succínico. Por outro lado, os carboidratos glicose, frutose e sacarose estão em concentração insuficiente produção de metabolitos em quantidades significativas.

Das substâncias analisadas em metodologia CLAE, não foram detectados os seguintes AOV: cítrico, fórmico, propiônico, iso-valérico e valérico. Além destes ácidos, não foram detectados os álcoois metanol e n-butanol e o carboidrato frutose. A composição da vinhaça é apresentada na Tabela 13. Comparando os lotes 1 e 2, nota-se um decréscimo na concentração dos parâmetros avaliados no lote 2. Tal fato evidencia a variabilidade sazonal na concentração deste resíduo na Usina, apesar do curto período que compreende uma coleta e outra. Outro aspecto relevante a se considerar é o fato de se tratar de uma usina mista, ou seja, tanto o sumo ou melaço da cana-de-açúcar são fermentados. Desta forma, as características físico- quimicas deste resíduo são dependentes da matéria-prima utilizada na fermentação (ESPAÑA-GAMBOA et al., 2011).

Comparando com os dados da literatura (Tabela 2), observa-se que os valores de DQO e DBO nos lotes 1 e 2 estão próximos do limite inferior da variação de vinhaça mista, de forma que considera-se a vinhaça utilizada nos ensaios menos concentrada em termos de matéria orgânica. Esta tendência segue para todos os outros compostos avaliados. O que chama atenção na caracterização da vinhaça é a concentração de AOV, entre eles o ácido málico, lático, succínico, iso-butírico e acético. As somas dos AOV totalizam 28,55 e 18,43 g L-1 nos lotes 1 e 2, respectivamente.

A concentração de nitrogênio determinada em ambos lotes foi inferior a 1 g L-1. A baixa concentração de nitrogênio na vinhaça sugere a necessidade de suplementação deste composto para condição favorável ao crescimento dos microrganismos envolvidos no processo de fermentação bifásica.

A concentração de carboidratos na vinhaça (1,69 e 1,52 g L-1 no lote 1 e 2, respectivamente) também evidencia a necessidade de suplementação de carboidratos para melhores rendimentos de AOV e álcoois.

Tabela 10 – Parâmetros de caracterização da vinhaça.

Lote 1 Lote 2 Parâmetros g L-1 Ácido Málico 10,46 ±0,61 5,70 Ácido Succínico 3,72 ±0,45 4,04 Ácido Lático 10,13 ±0,27 6,75 Ácido Acético 0,22 ±0,03 0,08 Ácido Iso-butírico 3,41 0,19 1,59 Ácido Butírico 0,61 ±0,25 0,27 Glicose 0,41 ±0,08 0,26 Sacarose 1,28 ±0,10 0,99 Carboidratos Totais 1,69 ±0,53 1,52 Etanol 0,25 0,05 0,18 DQO 28,39 ±0,17 21,75 DBO 15,14 17,50 Sólidos Totais 26,63 27,75 Sólidos Totais Voláteis 18,95 17,72 Sólidos Totais Fixos 7,69 10,03 Sólidos Suspensos Voláteis 5,35 4,18 Nitrogênio Total 0,84 0,87 Nitrogênio Amoniacal 0,058 0,12 Nitrito 0,00001 - Nitrato 0,46 0,38 Sulfato 0,9 1,43 Sulfeto 0,0069 0,0031 Ferro 0,0096 0,010 Manganês 0,0024 0,0027 Cálcio 0,51 0,67 Magnésio 0,26 0,24 Sódio 0,048 0,037 Potássio 2,65 2,60 Zinco 0,00036 0,00031 Chumbo 0,00025 0,00030 Cadmio 0,000088 0,000079 Cobre 0,00033 0,00028 Cromo Total 0,000041 0,000087 Níquel 0,00015 0,00018

4.2 Etapa 1: Efeito da suplementação de vinhaça e influência dos métodos de pré- tratamento do inóculo em meio de cultivo de sacarose para produção de álcoois e AOV

4.2.1 Vinhaça como substrato

Para avaliar a influência da vinhaça como substrato em meio de cultivo (MCS), comparou-se a produção, rendimento e produtividade de álcoois e AOV com o MCS alimentado com sacarose. Além disso, comparou-se os métodos de pré-tratamento de inóculo, ou seja, qual comportamento metabólico do consórcio microbiano formado após pré- tratamentos, quando cultivados em meios com substratos distintos.

Na Tabela 14 estão apresentados os resultados de produção dos principais AOV e álcoois determinados pelo método CLAE. Os resultados estão expressos em termos das amostras AT e TT, que representam os pré-tratamentos do inóculo de lodo, cultivadas em MCS, utilizando a vinhaça (V) e sacarose (S) como fonte de substrato. Não foram detectados os ácidos cítrico, fórmico e valérico. As concentrações dos ácidos málico, succínico e propiônico não foram consideradas, pois os picos registrados não apresentaram boa resolução.

Tabela 11 - Média de produção dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V.

Amostras* Analitos ATS TTS ATV TTV g L-1 Ac. Lático 8,78± 0,22 6,20± 0,17 -1,34± 0,06 -1,89± 0,68 Ac. Acético 0,34± 0,02 0,78± 0,11 1,34± 0,03 1,31± 0,34 Ac. Isobutírico -0,01± 0,01 -0,16± 0,01 6,37± 2,76 5,80± 0,46 Ac. Butírico 0,28± 0,02 1,60± 0,05 6,37± 0,33 5,94± 0,23 Ac. Isovalérico 0,05± 0,01 0,04± 0,02 0,40± 0,04 0,66± 0,07 Carboidratos Totais 9,92± 0,04 9,61± 0,25 1,34± 0,11 1,38± 0,01 Metanol nd** nd nd nd Etanol 0,50± 0,02 1,13± 0,07 1,20± 0,03 1,21± 0,01 n-Butanol nd nd nd nd Ácidos Totais 9,45± 0,27 8,62± 0,35 14,48± 3,16 13,71± 1,10 Álcoois Totais 0,50± 0,02 1,13± 0,07 1,20± 0,03 1,21± 0,01 *resultados negativos indicam que houve consumo no processo, pois é feita a subtração entre a concentração final e a inicial de todos os compostos avaliados; ** não identificado

Em relação a concentração total de AOV entre os meios S e V, a produção foi superior em até 59% nas culturas cultivadas em meio com vinhaça, não variando significativamente entre os tratamentos ATV e TTV (14,5 ± 3,2 e 13,7 ± 1,1, respectivamente). Tal aumento poderia estar associado ao fato da vinhaça conter elevada concentração inicial de AOV, ou seja, os ácidos não necessariamente foram produzidos, mas já faziam parte da composição do meio de cultura. No entanto, quando avalia-se a concentração dos ácidos separadamente, observa-se que a concentração de ácido lático, abundante na amostra de vinhaça, após a fermentação, o saldo deste ácido é negativo, ou seja, este foi consumido no processo de metabolismo microbiano. Já em relação ao meio com sacarose, a ácido lático foi o produto com maior concentração, sendo 8,8 ± 0,2 e 6,2 ± 0,2 g L-1 nas amostras ATS e TTS, respectivamente.

Em relação a produção de ácido iso-butírico, contrariamente ao ácido lático, este foi consumido nas culturas cultivadas com meio de sacarose e amplamente produzidos quando o substrato é vinhaça (6,4 ± 2,8 e 5,8 ± 0,5 g L-1 nas amostras ATV e TTV, respectivamente). Caso similar ocorre com a produção de ácido butírico, com baixa produção entre as culturas cultivadas com sacarose (0,28 ± 0,02 e 1,60 ± 0,05 g L-1 nas amostras ATS e TTS, respectivamente) em relação as culturas cultivadas em meio com vinhaça (6,4 ± 0,3 e 5,9 ± 0,2 g L-1 nas amostras ATV e TTV, respectivamente).

A concentração de etanol foi similar entre as amostras TTS, ATV e TTV, não variando significativamente entre elas (1,13 ± 0,07; 1,20 ± 0,03 e; 1,21 ± 0,01 g L-1, respectivamente), no entanto a amostra ATS apresentou redução de 58% na produção de etanol (0,50 ± 0,02 g L- 1) em relação à média de produção de TTS, ATV e TTV. Neste caso, o método de pré- tratamento influencia significativamente na produção de etanol, porém comparando ATS com ATV, observa-se que a presença de vinhaça também afeta a produção de etanol.

Em nenhuma das amostras foi observada a formação de n-butanol e metanol. Considerando que a amostra foi diluída 30 vezes, como parte do requisito para análise a fim de evitar danificação na coluna do aparelho de CLAE, e ainda considerando que o limite de detecção de n-butanol e metanol do método é de 20,5 e 6,5 mg L-1 (Tabela 12), respectivamente, a concentração mínima de butanol e metanol que o aparelho consegue identificar é de 616 e 196 mg L-1, respectivamente. Desta forma não podemos afirmar que não foi produzido metanol nem butanol no processo, mas certamente se houve produção foi

inferior aos limites de detecção. Contudo, o método utilizado para determinação dos álcoois e AOV, apesar do elevado índice de precisão e exatidão, não é o mais adequado para análise de amostras com elevado teor de pigmentos e outras substâncias que possam causar danos a coluna de separação (AMINEX® HPX-87H).

Apesar da vinhaça representar uma fonte de substrato mais desprovida de carboidratos, sendo, neste caso, 86% inferior a concentração de carboidratos no meio com sacarose, a produção de etanol e AOV foi superior. Tal ocorrência evidencia que outras substâncias orgânicas presentes na vinhaça foram sintetizadas no processo de metabolismo do consórcio microbiano. Como houve consumo de ácido lático nos meios ATV e TTV, sendo este o AOV mais abundante na vinhaça, dentre os determinados pela metodologia CLAE, acredita-se que a concentração de ácido lático foi determinante na produção de etanol.

Analisando as amostras ATV e TTV, não houve variações significativas entre os compostos produzidos, indicando que o método de pré-tratamento de inóculo não afetou diretamente o metabolismo do consorcio microbiano. No entanto, comparando as amostras ATS e TTS, observa-se diferenças na concentração de ácido acético, ácido butírico e etanol, sendo mais elevadas em TTS, e ácido lático, superior em ATS. Desta forma, conclui-se que o método de pré-tratamento do inóculo exerceu influência na formação de etanol e AOV quando cultivado em MCS com sacarose.

Na Tabela 15 estão apresentados o rendimento e a produtividade dos principais AOV e álcoois produzidos durante a primeira etapa do processo de fermentação.

Tabela 12 - Rendimento e produtividade médios de ácido acético, ácido butírico e etanol entre as amostras AT S, TT S, AT V e TT V.

Rendimento g g -1 Produtividade mg L h-1 Amostras Ac. Acético Ac. Butírico Etanol Ac. Acético Ac. Butírico Etanol ATS 0,023± 0,020 0,019± 0,016 0,051± 0,002 2,38± 0,17 1,95± 0,14 3,49± 0,13 TTS 0,081± 0,013 0,111± 0,097 0,117± 0,010 5,39± 0,77 11,11± 0,33 7,82± 0,50 ATV 0,638± 0,055 4,93± 0,73 0,900± 0,084 9,29± 0,24 44,23± 2,29 8,31± 0,22 TTV 0,946± 0,024 4,31± 0,15 0,875± 0,006 9,07± 2,35 41,26± 1,57 8,38± 0,07

Os rendimentos foram calculados com relação a concentração inicial de carboidratos totais (glicose, frutose e sacarose). Comparando os métodos de pré-tratamento, entre as

amostras ATV e TTV, os tratamentos, observa-se diferenças no rendimento de ácido acético, onde houve um aumento percentual de 32,5% de ATV para TTV. Relacionando ATS com TTS, nota-se que houve aumento no rendimento de ácido acético, ácido butírico e etanol (71,6; 82,9 e; 56,4 %, respectivamente) de ATS para TTS.

O rendimento de ácido butírico nas amostras ATV e TTV foi superior 4 g do ácido por g de carboidrato total. Certamente que neste caso os carboidratos determinados pelo método não foi a única fonte de carbono utilizada no metabolismo celular do consorcio microbiano.

Produtividade mais alta de ácido butírico e ácido acético ocorreu de na amostra ATV (44,2 ± 2,3 e 9,3 ± 0,2 mg L h-1, respectivamente) e de etanol na amostra TTV (8,4 ± 0,1 mg L h-1). No entanto, não foram encontradas diferenças significantes de produtividade entre ATV e TTV. Produtividade muito semelhante foi encontrada no trabalho de (AI et al., 2014), onde foi fermentado palha de arroz hidrolisada (NaOH 1%, 50°C por 72 horas) com cultura mista de microrganismos enriquecida e pré-tratada por processo térmico (115°C por 20 minutos). A produtividade máxima alcançada foi de 42,4± 2,1 e 9,0± 1,4 mg L h-1de ácido butírico e ácido acético, respectivamente.

Na Figura 12 está apresentado o gráfico comparando a produção média dos AOV e álcoois metabolizados no processo de fermentação. Valores negativos representam que houve consumo do metabólito. A barra de erro representa o desvio padrão da média de três amostras.

Figura 12 – Balanço global dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V.

4.2.2 Vinhaça como meio nutriente

Para avaliar a influência da vinhaça como meio nutriente foram realizados 3 ensaios aumentando a concentração de vinhaça a cada ensaio. Foi avaliada a resposta dos consórcios microbianos submetidos aos pré-tratamentos AT e TT quando submetidos a doses crescentes de vinhaça. Para diferenciar a influência dos pré-tratamentos de inóculo da concentração de vinhaça, as amostras foram cultivadas também em MCS. Foi utilizada sacarose como fonte de substrato em todos os tratamentos.

Na Figura 13 são apresentadas as representações gráficas do pH e densidade ótica (OD) em função do tempo de fermentação nos três ensaios (B1, B2 e B3). Observa-se que o ponto máximo de crescimento bacteriano ocorre em 72 horas após início da fermentação, evidenciado pela medida de densidade ótica, que é parâmetro para avaliar crescimento bacteriano. Desta forma, após o pico, tem-se o fim da fase exponencial e início da fase estacionária de crescimento. O pH é inversamente proporcional ao aumento da densidade ótica até o pico de crescimento. Após este ponto, nota-se uma tendência a estabilização com leve aumento do pH. No entanto, no primeiro ensaio (B1), quando o pH foi ajustado com NaOH, o pH voltou a cair, de forma que foi necessária a substituição do NaOH por uma base com efeito de tamponamento. Contudo, foi utilizada solução de bicarbonato de sódio que é uma base fraca que não se dissocia por completo mantendo o pH estável. O bicarbonato foi utilizado por outros pesquisadores para controle do pH em sistemas de digestão anaeróbia (DÖLL; FORESTI, 2010; HARADA et al., 1996).

Figura 13 pH e densidade ótica em função do tempo de fermentação. Setas apontam para o ponto em que foi feita a correção do pH

B1 B2

Os resultados da produção, rendimento e produtividade dos AOV foram expressos apenas para as substancias de maior relevância ou abundância, que foram os ácidos butírico, iso-butírico, acético e lático e álcoois etanol e metanol. Não foram detectados os ácidos cítrico, fórmico, valérico e iso-valérico. O n-butanol foi registrado em algumas amostras do ensaio B3, mas levemente abaixo do limite de detecção, de forma que o pico se confunde com o ruído da linha base. Devido à falta de certeza, os picos de n-butanol não foram considerados nas determinações analíticas.

Na Tabela 16 estão apresentados os resultados de produção média (n=3) dos AOV butírico, iso-butírico, acético e lático detectados pelo método CLAE. Os resultados estão expressos em termos das amostras AT e TT, que representam os pré-tratamentos do inóculo de lodo, cultivadas em meio de cultivo sintético (S) e meio de cultivo com vinhaça (V),

compreendendo as bateladas B1, B2 e B3, referentes as doses crescentes de vinhaça de 1/3, 1/2 e 2/3, respectivamente.

Tabela 13 - Média de produção dos principais AOV no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3.

Ensaio Amostra Ac. Lático Ac. Acético Ac. Isobutirico Ac. Butirico g L-1 ATS 8,79± 1,24 1,07± 0,14 1,62± 1,04 3,50± 0,33 TTS 8,10 - 2,03± 0,07 1,15± 0,15 5,09± 0,95 B1 ATV 6,59± 1,60 0,45± 0,02 3,76± 0,22 6,55± 0,93 TTV 8,79± 2,33 1,23± 0,60 3,73± 0,15 6,40± 1,23 ATS 5,94± 1,48 0,46± 0,35 2,55± 1,04 5,15± 0,49 TTS 6,39± 0,61 0,81± 0,27 4,98± 0,28 4,83± 0,64 B2 ATV 5,81± 0,95 0,07± 0,02 10,34± 0,43 10,60± 0,62 TTV 6,15± 0,89 0,87± 0,07 6,84± 0,56 8,41± 0,62 ATS -0,10± 0,04 0,51± 0,03 4,11± 0,82 7,50± 0,72 TTS -0,22± 0,03 0,60± 0,28 3,12± 0,30 8,29± 0,05 B3 ATV -2,84± 0,46 2,19± 1,01 8,63± 1,31 14,13± 0,77 TTV -4,17± 0,37 4,13± 0,06 7,61± 0,89 13,21± 0,60

Verificou-se que a concentração dos ácidos butírico e iso-butírico aumentou da primeira para terceira batelada em ATS, TTS, ATV, TTV. A concentração de ácido lático, por sua vez, diminuiu de B1 para B3, chegando a valores negativos, indicando que houve consumo de ácido lático. A concentração de ácido acético diminuiu de B1 para B3 nos tratamentos ATS e TTS e aumentou nos tratamentos ATV e TTV. Na Figura 14 são apresentados os gráficos da concentração média dos AOV em função das bateladas, compreendendo todos os tratamentos.

Nota-se que o consumo de ácido lático ocorreu somente em B3, indicando mudança no metabolismo do consórcio microbiano. Segundo Da Cunha e Foster (1992), o lactato pode ser catabolizado via ação da enzima lactato desidrogenase (LDH) NAD+-independente por algumas espécies de lactobacilos, tais como Lb. brevis, Lb. buchneri e Lb. plantarum. Nestes lactobacilos, o catabolismo anaeróbio do lactato ocorre com a conversão do lactato a piruvato com posterior formação de acetato mais dióxido de carbono ou então acetato mais formiato. Os produtos de degradação formados a partir do piruvato são dependentes da presença de enzima(s) específica(s): piruvato oxidase ou piruvato-formiato liase.

Não podemos atribuir o aumento gradual de ácido butírico de B1 para B3 as doses suplementares de vinhaça, pois este aumento gradual ocorre também no meio sintético que não sofreu alterações na composição entre as bateladas. As mudanças na concentração dos AOV, em ambos tratamentos, sugerem que houve adaptação da microflora bacteriana em cada ensaio, sendo notadamente mais significativa em B3. Tal evidência pode ser comprovada com a análise filogenética a fim de verificar as variações na abundância de espécies responsáveis pela fermentação.

As máximas concentrações de ácido butírico, iso-butírico e acético foram de 14,13 ± 0,77 g L-1 na amostra ATV B3; 10,34 ± 0,43 g L-1na amostra ATV B2 e; 4,13 ± 0,06 g L-1na amostra TTV B3, respectivamente.

Figura 14 - Curvas de produção dos principais AOV dos tratamentos ATS, ATV, TTS e TTV em função dos três ensaios de fermentação em batelada (B1, B2 e B3).

Na Tabela 17 estão apresentados os resultados de produção média (n=3) dos principais álcoois detectados pelo método CLAE, metanol e etanol. Os resultados estão expressos em termos das amostras ATS. ATV, TTS e TTV, compreendendo as bateladas B1, B2 e B3.

Tabela 14 - Média de produção de etanol e metanol no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre as bateladas B1, B2 e B3.

Ensaio Amostra Metanol Etanol g L-1 ATS nd 2,72± 0,19 TTS nd 3,63± 0,58 B1 ATV nd 3,42± 0,38 TTV nd 3,04± 0,41 ATS nd 3,37± 0,37 TTS nd 3,00± 0,34 B2 ATV nd 3,85± 0,16 TTV 0,35± 0,03 2,94± 0,27 ATS nd 4,66± 0,23 TTS nd 4,75± 0,59 B3 ATV 0,60 0,20 5,16± 0,57 TTV 1,00± 0,16 5,10± 0,38

O metanol só foi detectado na amostra TTV, nos ensaios B2 e B3 e na amostra ATV, no ensaio B3. De B2 para B3 ocorreu aumento percentual de 185% de metanol. O etanol foi registrado em todas as leituras e com aumento gradual de B1 para B3, sendo maior de B2 para B3 nas amostras ATV e TTV (aumento percentual de 34 e 73 %, respectivamente) que de B1 para B2. Entre os tratamentos, não houve diferenças significativas. As máximas concentrações de etanol e metanol registradas foram de 5,16 ± 0,57 g L-1 na amostra ATV B3 e 1,00 ± 0,16 g L-1na amostra TTV B3, respectivamente.

Na Tabela 18 e 19 estão apresentados o rendimento médio e a produtividade média, respectivamente, dos principais produtos da fermentação. Os resultados estão expressos em termos das amostras ATS. ATV, TTS e TTV, compreendendo os ensaios de bateladas B1, B2 e B3.

O rendimento de etanol e dos AOV butírico, acético e iso-butírico (g do composto por g de carboidratos totais) foi mais elevado nas amostras ATV B3 e TTV B3, atingindo valores máximos de 0,14; 0,28; 0,69 e; 0,26 g g-1 de ácido acético, ácido iso-butírico, ácido butírico e etanol, respectivamente. Trabalho semelhante foi realizado por Sydney et al. (2014), que avaliaram o potencial da vinhaça como fonte de nutrientes para produção de hidrogênio e AOV por consórcio microbiano originário de lagoa de estabilização de bovinocultura de leite. Vinhaça bruta (sem diluição) foi fermentada com sumo de cana-de-açúcar (10 g L-1) em

sistema de batelada sob condições mesófilas (37°C) a pH 7. O rendimento máximo de ácido acético, butírico foi de 0,13 e 0,70 g g-1, valores muito próximos aos obtidos neste trabalho. No entanto, não foi detectado etanol.

Tabela 15 - Rendimento médio dos principais dos produtos da fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3.

Ac. Acético Ac. Isobutírico Ac. Butírico Etanol Ensaio Amostra g g-1 ATS 0,05 0,05 0,16 0,13 TTS 0,07 0,06 0,25 0,18 ATV 0,01 0,18 0,32 0,11 B1 TTV 0,06 0,12 0,32 0,10 ATS 0,01 0,13 0,25 0,17 TTS 0,04 0,17 0,25 0,15 ATV 0,00 0,35 0,54 0,20 B2 TTV 0,03 0,24 0,44 0,15 ATS 0,02 0,13 0,37 0,23 TTS 0,02 0,16 0,29 0,25 ATV 0,11 0,28 0,69 0,25 B3 TTV 0,14 0,26 0,68 0,26

Tabela 16 - Produtividade média dos principais dos produtos da fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V entre os ensaios B1, B2 e B3.

Ac. Acético Ac. Isobutírico Ac. Butírico Etanol Ensaio Amostra mg L h-1 ATS 6,51 9,81 21,20 16,50 TTS 12,30 6,97 30,86 22,02 ATV 2,71 22,78 39,70 20,70 B1 TTV 7,46 22,59 38,78 18,45 ATS 2,80 15,66 31,58 20,66 TTS 4,94 30,53 29,65 18,41 ATV 0,41 63,46 65,01 23,62 B2 TTV 5,31 41,93 51,60 18,04 ATS 2,98 24,01 43,83 27,26 TTS 3,49 18,25 48,50 27,77 ATV 12,79 50,45 82,66 30,17 B3 TTV 24,16 44,51 77,25 29,85

Nas Figuras 15, 16 e 17 estão apresentados graficamente a média e desvio padrão dos principais produtos da fermentação nos ensaios de batelada B1, B2 e B3, respectivamente.

Figura 15 - Balanço global dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B1, onde houve suplementação de 1/3 de vinhaça no MCS.

Figura 16 - Balanço global dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B2, onde houve suplementação de 1/2 de vinhaça no MCS.

Figura 17 - Balanço global dos principais metabólitos no processo de fermentação das amostras AT S, TT S, AT V e TT V no ensaio B3, onde houve suplementação de 2/3 de vinhaça no MCS.

4.2.3 Teste de comparação de médias

O teste de comparação de médias, teste de Tukey, foi realizado apenas para as variáveis resposta concentração de ácido butírico e concentração de etanol, com interação de 3 fatores: meio de cultura ‘S’ e ‘V’, tratamento TT e AT e batelada B1, B2 e B3. Toda análise estatística foi realizada em programa RStudio Desktop 0.99.441.

Para aplicação da Análise de Variância ANOVA, primeiramente foi verificado pelo teste de Levene a homogeneidade das variâncias da interação entre as categorias Batelada, Tratamento e Meio de Cultura, premissa necessária para utilização da ANOVA. Na Tabela 20 esta apresentado o resultado do Teste de Levene.

Tabela 17 - Verificação da hipótese de homogeneidade das variâncias: Teste de Levene’s.

Variável Resposta gL F p valor [ ] Etanol 11 0,4328 0,9255 [ ] Ácido Butírico 11 0,2662 0,9869

Neste caso, conclui-se que as variâncias são iguais nos dois grupos de variável resposta, uma vez que a significância associada ao teste é superior a 0,05 (nível de significância = 5%). Desta forma, assume-se a homogeneidade das variâncias e portanto a validação na aplicação da ANOVA.

O teste da ANOVA foi realizado pela interação de 3 fatores Batelada, Tratamento e Meio de Cultura, a fim de verificar se há diferenças significativas ou variâncias entre os grupos e dentro dos grupos ao nível de significância de 5%. Nas Tabelas 21 e 22 estão apresentados os resultados do teste para as variáveis resposta ácido butírico e etanol, respectivamente.

Tabela 18 - Resultado do teste Anova interação dos fatores Tratamento, Meio de Cultura e Batelada para variável resposta concentração de ácido butírico.

Resposta: Ácido Butírico gl SQ MQ F p valor Tratamento 1 0,783 0,783 1,287 0,267857 Meio de Cultura 1 162,9 162,9 267,7 <0,0000001 Batelada 2 170,2 85,09 139,8 <0,0000001 Tratamento:Meio de Cultura 1 5,649 5,649 9,281 0,005547 Tratamento:Batelada 2 5,842 2,921 4,801 0,017633 Meio de Cultura:Batelada 2 23,02 11,51 18,92 0,000012 Tratamento:Meio de Cultura:Batelada 2 0,231 0,116 0,190 0,828272 Resíduos 24 14,603 0,608

Tabela 19 - Resultado teste Anova interação dos fatores Tratamento, Meio de Cultura e Batelada para variável resposta concentração de etanol.

Resposta: Etanol gl SQ MQ F p valor Tratamento 1 0,111 0,111 0,513 0,48053 Meio de Cultura 1 0,096 0,096 0,445 0,51126 Batelada 2 25,42 12,71 58,60 <0,0000001 Tratamento:Meio de Cultura 1 0,932 0,932 4,297 0,04908 Tratamento:Batelada 2 1,359 0,679 3,133 0,06180 Meio de Cultura:Batelada 2 0,905 0,452 2,085 0,14629 Tratamento:Meio de Cultura:Batelada 2 0,468 0,234 1,078 0,35616 Resíduos 24 5,207 0,217

A análise dos resultados permite concluir que há diferenças significativas nas médias de concentração de ácido butírico nos fatores Meio de Cultura e Batelada (p < 0,05),

100

significando que os meios utilizados (S e V) e a adaptação dos microrganismos a variações na concentração de vinhaça interferem na concentração deste ácido. Para variável concentração de etanol, há diferenças significativas apenas no fator Batelada.

Para determinar quais grupos são significativamente diferentes entre si, foi realizada a Análise de Post-Hokey, teste de Tukey. Nas Figuras 18, 19 e 20 são apresentados os gráficos que ilustram o resultado do teste de Tukey para as variáveis ácido butírico e etanol. Os pares de médias considerados iguais são os que o intervalo de confiança corta o eixo em zero. Quão mais distante de zero, maior é a diferença entre as médias.

Figura 18 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Tratamento, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol.

101

Figura 19 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Meio de Cultura, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol.

Figura 20 - Intervalo de confiança (95%) das diferenças entre as médias a nível do fator Batelada, para as variáveis resposta ácido butírico e etanol.

A nível do fator Tratamento, sem alterações no meio de cultura e dentro da mesma batelada, não foram encontradas diferenças entre as médias para nenhuma das variáveis resposta. Já no fator Meio de Cultura, foram encontradas diferenças entre as médias ATS e ATV nas 3 bateladas e entre TTS e TTV nas bateladas B2 e B3 para a variável resposta ácido butírico. A diferença encontrada evidencia que nas mesmas condições de ensaio e para o mesmo consórcio microbiano, a composição do meio foi determinante na concentração final de ácido butírico.

102

A nível do fator Batelada e variável ácido butírico, foram encontradas diferenças a maior parte dos pares de médias, com exceção dos pares: TTV B2-TTV B1, TTS B2-TTS B1 e ATS B2-ATS B1. No mesmo fator para a variável etanol, foram encontradas diferenças entre os pares: TTV B3-TTV B2, TTV B3-TTV B1, ATV B3-ATV B2, ATV B3-ATV B1, ATS B3-ATS B1.

Na Figura 21 está apresentada graficamente, gráfico de caixas, a variação e distribuição de ácido butírico e etanol na interação dos três fatores avaliados. Observa-se menor variabilidade e tendência crescente na concentração de ácido butírico e etanol de B1 para B3 no tratamento AT.

Figura 21 - Distribuição empírica das variáveis resposta ácido butírico e etanol, com interação de 3 fatores: meio de cultura ‘S’ e ‘V’, tratamento TT e AT e batelada B1, B2 e B3.

103

4.3 Etapa 2: Produção de álcoois e AOV em meio de vinhaça suplementado com melado de cana-de-açúcar

Nesta etapa do trabalho, as determinações analíticas foram realizadas diariamente até o terceiro dia de fermentação e a cada 2 dias após o terceiro dia até completar 12 dias. Nas Figuras 22, 23 e 24 são apresentados os gráficos da produção de AOV e etanol e consumo de carboidratos totais em função do tempo de fermentação, incluindo as curvas de pH e volume de gás.

A análise das curvas produção de AOV e álcoois e de consumo de carboidratos, nos ensaios B1, B2 e B3, permite identificar a transição da fase exponencial de crescimento para a fase estacionária. Esta transição ocorre ao terceiro dia (72 horas) de fermentação. A fase exponencial foi caracterizada por elevada taxa de consumo de carboidratos (sacarose, glicose e frutose), produção de etanol AOV, principalmente butirato e acetato, diminuição do pH e produção de biogás. A concentração de ácido lático variou de forma crescente até o segundo dia de fermentação, decrescendo até concentrações inferiores a concentração inicial no tempo zero, indicando que houve reassimilação deste ácido.

Figura 22 - Produção de AOV e álcoois, consumo de carboidratos totais e pH em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 65 % de vinhaça.

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Figura 23 - Produção de AOV e etanol e consumo de carboidratos totais em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 75 % de vinhaça.

Figura 24 - Produção de AOV e etanol e consumo de carboidratos totais em função do tempo de fermentação do ensaio 1, que corresponde a suplementação de 85 % de vinhaça.

No último ensaio, com suplementação de 87% de vinhaça, o tempo de fermentação foi extendido até 22 dias. Houve aumento do pH (de 6,3 para 6,8), mas não foram verificadas alterações nas concentrações de AOV e álcoois.

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Na Tabela 23 estão apresentados a produção máxima e o tempo de fermentação correspondente dos principais metabólitos dos ensaios denominados como B1, B2 e B3, que correspondem a suplementação de 65, 75 e 85 % de vinhaça, respectivamente.

Tabela 20 - Principais produtos da fermentação de melado de cana suplementado com vinhaça nos ensaios B1, B2 e B3.

Ensaios B1 B2 B3 Produtos g L-1 h g L-1 h g L-1 h Ac. Lático 2,22 22 1,31 23 3,48 47 Ac. Acético 8,28 287 6,56 286 7,49 209 Ac. Butírico 12,22 215 11,61 218 13,85 69 Metanol 0,34 287 0,48 286 0,42 284 Etanol 7,82 120 7,37 218 7,44 116

A concentração de ácido lático, em B1 e B2, foi máxima no primeiro dia da fermentação (2,22 e 1,31 g L-1, respectivamente). Em B3, o pico máximo de ácido lático ocorreu transcorridas 48 horas na fermentação (3,48 g L-1). O pico máximo de produção de ácido acético ocorreu somente no último dia do ensaio de fermentação em B1 e B2 (8,28 e 6,56 g L-1). No entanto, após o nono dia, a produção de ácido acético varia pouco nas bateladas sendo máxima em B3 (7,49 g L-1). Comparando com o valor máximo ocorrido da primeira etapa, a produção de ácido acético foi superior em 100% no valor da concentração na segunda etapa.

Assim como na primeira etapa, o ácido butírico foi o principal produto da fermentação, alcançando pico máximo de concentração no nono dia da fermentação (12,22 e 11,61 g L-1em B1 e B2, respectivamente). Comparando entre as bateladas, a máxima produção ocorre em B3 (13,85 g L-1) transcorridos 3 dias de fermentação.

A produção de etanol foi homogênea entre as bateladas (7,82; 7,37 e; 7,44 g L-1em B1, B2 e B3, respectivamente), sendo máxima em B1 transcorridos 5 dias de fermentação. O metanol foi detectado somente após o quinto dia de fermentação, com concentração máxima em B2 (0,48 g L-1) após 12 dias de fermentação.

Na Tabela 24 estão apresentados os resultados de rendimento e produtividade máximos no tempo de fermentação correspondente dos principais metabólitos dos ensaios B1,

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B2 e B3. O rendimento foi calculado em termos da concentração de carboidratos totais (sacarose, glicose e frutose) consumido no tempo correspondente.

Tabela 21 - Produtividade e rendimento máximos dos principais metabólitos da fermentação de melado de cana suplementado com vinhaça nos ensaios B1, B2 e B3.

Ensaio Parâmetros Ac. Acético Ac. Butírico Etanol mg L h-1* 125,81 151,76 103,77 h 22 46 46 B1 g g-1 0,338 0,498 0,319 h 287 215 120 mg L h-1 75,03 171,59 114,12 h 23 48 48 B2 g g-1 0,256 0,453 0,290 h 286 218 120 mg L h-1 82,74 199,98 104,93 h 24 69 69 B3 g g-1 0,291 0,556 0,295 h 209 69 116

Os rendimentos de ácido acético e etanol foram maiores e B1 (0,34 e 0,32 g g-1) e de ácido butírico maior em B3. Com relação a produtividade, esta foi maior em B1 para ácido acético (125,81 mg L h-1 no primeiro dia) em B2 para etanol (114,12 mg L h-1 no segundo dia) e em B3 para ácido butírico (199,98 mg L h-1 no terceiro dia). Dados similares foram encontrados no trabalho de Sydney et al. (2014), com fermentação, em reator de batelada de 2,5 L com duração de 6 dias, de vinhaça bruta suplementada com melaço de cana-de-açúcar. O rendimento de ácido acético e butírico foram de 0,38 e 0,64 g g-1 de substrato.

Estes dados revelam que o tempo ótimo para fermentação, quando se deseja produzir AOV, principalmente ácido butírico, é caracterizado pelo final da fase exponencial de crescimento, que neste trabalho foi de 72 horas.

Com relação aos solventes, é necessário estudo mais aprofundado na área de bioquímica e engenharia metabólica, a fim de determinar os fatores interferentes no processo de biodigestão de resíduos como a vinhaça, quando na associação de duas ou mais culturas para obtenção de melhores rendimentos e produtividade dos solventes.

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4.4 Caracterização microbiológica do consórcio microbiano

4.4.1 Morfologia

Durante a fase de pré-tratamento e enriquecimento do inóculo, foi realizada análise de morfologia celular e coloração Gram, com objetivo de verificar as transformações ocorridas na morfologia celular das células vegetativas a cada estapa do pré-tratamento. Um indicativo positivo é a presença de microrganismos Gram positivos e a presença de esporos, pois podem indicar presença de microrganismos do gênero Clostridium.

Na Tabela 25 são apresentadas as morfologias observadas em amostras dos inóculos resultantes do pré-tratamento (AT e TT - I0) e das gerações posteriores, com processo de enriquecimento (I1, I2 e I3).

Não houve grandes variações nas morfologias observadas entre tratamentos nem entre gerações. As formas predoinantes foram bacilos e cocos, nos arranjos diplobacilos, estreptobacilos, diplococos, estreptococos e estafilococos. A coloração Gram predominante é a positiva e a ocorrência de esporos foi observadas até a primeira geração (I1). Os esporos são estruturas resistentes a elevadas temperaturas e condições desfavoráveis a sobrevivência de uma célula vegetativa, mas sob condições ambientais adequadas, os esporos germinam (LÜTKE-EVERSLOH; BAHL, 2011). Devido ausência de esporos a partir da segunda geração (I2), acredita-se que os esporos que resistiram as condições ambientais extremas dos pré-tratamentos, germinaram sob a condição do processo de incubação (meio RMC, 37°C).

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Tabela 22 – Morfologias observadas entre as etapas do pré-tratamento e enriquecimento de inóculo.

Lâmina Morfologias Esporos Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram negativos e gram positivos; estreptobacilos gram negativos; AT –I0 Presente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos e gram negativos; estafilococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram negativos e gram positivos; estreptobacilos gram negativos; TT – I0 Presente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos e gram negativos; estafilococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram negativos e gram positivos; estreptobacilos gram positivos; AT – I1 Presente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos; estafilococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram negativos e gram positivos; TT – I1 Presente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; estreptobacilos gram positivos; AT –I2 Ausente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; estreptobacilos gram positivos; TT – I2 Ausente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram positivos; AT – I3 estreptobacilos gram positivos; Ausente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos. Bacilos gram negativos e gram positivos; diplobacilos gram positivos; TT – I3 estreptobacilos gram positivos; Ausente cocos gram positivos e gram negativos; estreptococos gram positivos.

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4.4.2 Pirosequenciamento

A técnica de pirosequenciamento gerou 929.044 sequências no total, entretanto, nem todas apresentaram qualidade e tamanho necessários para serem empregados nas análises taxonômicas e ecológicas, sendo utilizadas após os métodos de filtragem aproximadamente 852.156 sequências (91,07%). As sequencias descartadas não possuíam critérios mínimos como qualidade inferior a 24 pontos reads, tamanho inferior a 65pb e sequências com menos de 80% de similaridade aos primers. Na Tabela 26 são apresentados os reads antes e após a filtradas em cada uma das amostras sequenciadas.

Tabela 23 - Número total de reads antes e após a filtragem

Tratamentos reads total reads após filtragem % reads mapeados AU 73.748 65.886 89,3 TT 413.212 380.178 92,0 AT 442.044 406.092 91,9

4.4.3 Caracterização da diversidade microbiana

A análise de distribuição das 852.156 sequências obtidas após a filtragem gerou até 273.971 UTOs (Unidades Taxonômicas Operacionais), desta qual 20.666, 123.266 e 130.039 OTUs corresponde aos tratamentos AU, TT e AT, respectivamente. A similaridade mínima desta classificação foi de 85%, no nível de ordem, ou seja, as sequencias foram classificadas no mínimo ao nível de ordem taxonômica. Na Tabela 27 são apresentados os números e porcentagem de OTUs de acordo com a similaridade entre os três tratamentos. Para a caracterização da diversidade microbiana, só foram consideradas as sequencias com número de OTU superior a 0,5% do total de OTUs de cada amostra. Sendo assim, 87,6; 92,8 e; 90,7 % do número de OTUs dos tratamentos AU, TT e AT, respectivamente, foram considerados para análise da distribuição taxonômica.

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Tabela 24 - Distribuição do número e porcentagem relativa* de UTOs de acordo com a similaridade e tratamento do inóculo

Nível Similaridad Taxonomic e o AU TT AT (11,1% (37,5% (11,2% 100% Espécie 2.040 ) 42.922 ) 13.186 ) (75,4% (43,6% (33,9% 97% Gênero 13.810 ) 49.882 ) 40.049 ) (13,5% (19,0% (55,0% 95% Família 2.473 ) 21.730 ) 64.971 ) *Porcentagem relativa ao número total de UTO de cada amostra individualmente

A observação dos tratamentos revelou que os tratamentos TT e AT geraram número maior de UTO's em relação ao tratamento AU, sendo similares entre si. O número menor encontrado em AU pode estar ligado ao número amostral de sequencias, indicando que a amostragem não foi suficiente. Dos pré-tratamentos de lodo utilizados neste trabalho, a autoclavagem é o método mais eficiente no que diz respeito a diminuição da diversidade e quantidade populacional de microrganismos. Tal fato explica o número menor de sequencias nesta amostra em relação as amostras pré-tratadas pelos métodos TT e AT.

Nos tratamentos AU e TT, maior número de sequencias foram agrupadas com 97% similaridade (75,4 e 43,6 %, respectivamente), sendo que em AT, o número maior de sequencias (55%) foi agrupado a 95% de similaridade. Já a nível de classificação em espécie, ou seja, com 100% de similaridade, um número maior se sequencias foi observador para o tratamento TT (37,5%) e menor para os tratamentos AU e AT (11,1 e 11,2 %, respectivamente).

No todo, verificou-se menor parcela de UTOs classificadas em espécie (23,2%) seguido por família (35,5%) e gênero (41,3%). Foram identificados 14 gêneros entre as sequencias com OTU maior que 0,5% do total de cada amostra, compreendendo 103.741 UTOs, e apenas 6 espécies, compreendendo 58.148 OTUs. A o número pequeno de gêneros classificados em relação a quantidade de sequencias mapeadas indica a eficiência dos pré- tratamentos no que diz respeito a redução da diversidade microbiana do lodo anaeróbio.

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4.4.4 Filo

O Filo Firmicutes foi predominante em todas amostras, representando 87,2; 94,5 e 100 % de abundancia relativa entre os tratamentos AU, TT e AT, respectivamente. Na Tabela 28 está apresentado o número de OTUs em função dos filos e tratamentos. No filo Firmicutes, a classe predominante foi a Clostridia (59,6 %) seguida pela Bacilli (37,0%). A classe Clostridia aparece em todos os tratamentos.

O filo Euryarchaeota, pertencente ao Reino das Archeas, aparece apenas na amostra TT. O Euryarchaeota, um dos quatro entretanto reinos (ou filos) do domínio de archaea, consiste em os metanógenos anaeróbicas estritas, as halófilos extremas Embora não seja .., este filo é representado com pouco abundância, com 2,5% das sequencias.

Tabela 25 - Número de OTUs distribuída entre os filos classificados de acordo com o tratamento do inóculo

Filo AU TT AT Actinobacteria 2.136 - - Bacteroidetes 206 - - Euryarchaeota - 6.251 - Firmicutes 15.981 108.283 118.206

Os resultados da análise da distribuição entre família no diagrama de Venn (Figura 25) demonstra que os ocorre compartilhamento entre as famílias Closdridiaceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae e Ruminococcaceae nas amostras TT, AT e AU. A família Bacillaceae aparece nas amostras AT e TT. Todas estas famílias pertencem ao Filo Firmicutes e foram as que apareceram com maior abundância ou maior número de sequencias entre as famílias classificadas. Outras famílias classificadas aparecem isoladamente em cada amostra, com menor abundância relativa.

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Figura 25 - Diagrama de Venn das famílias classificadas entres as comunidades bacterianas presentes nas amostras AT, TT e AU.

Na Figura 26 está apresentado o gráfico com a frequência em que aparecem as famílias por amostra

Figura 26 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de família

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A família Clostridiaceae foi a que apresentou maior abundância entre os consórcios microbianos pré-tratados, sendo maior em AT, seguida por AU e TT. Já no consorcio presente em TT houve maior abundância da família Lactobacillaceae, seguida por AU e AT.

Os microrganismos pertencentes as famílias Bacillaceae e Clostridiaceae foram definidos taxonomicamente como bactérias formadoras de esporos, em forma de bastonete, parece celular Gram-positiva (maioria), produtoras de ácidos a partir de glicose e não redutoras de sulfato (DOORES, 2014).

4.4.5 Gênero

Dentre os 14 gêneros classificados, 7 estão relacionados a condição anaeróbia restrita, 3 a anaeróbia facultativa, 4 a aeróbia facultativa (Tabela 29). Possuem parece celular Gram positiva 11 dos gêneros classificados, estando entres estes os de maior abundância. São formadores de endoesporos 8 gêneros, entres eles Clostridium e Bacillus como os mais abundantes. Tal evidência comprova a eficiência dos métodos de pré-tratamento na manutenção de microrganismos formadores de esporos. No entanto, também demonstra que células vegetativas também são capazes de resistir a condições de elevada temperatura e baixo pH, como as bactérias do gênero Lactobacillus que não formam esporos. Células vegetativas de Sporolactobacillus podem sobreviver a condições de extrema acidez (pH 2,0 – 4,0) e concentrações salinas de 0.1–0.4% (DOORES, 2014).

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Tabela 26 – Características do gêneros identificados.

Formação Gênero Morfologia Condição Gram Referência esporos Clostridium sim Bacilos Anaerobio restrito (+) (DÜRRE, 2008a) (WIEGEL; TANNER; Lactobacillus não Bacilos Anaerobia facultativa (+) RAINEY, 2006) (ETTOUMI et al., Bacillus sim Bacilos Aerobia facultativa (+) 2009) (HOLDEMAN; Ruminococcus não Diplococos Anaerobio restrito (+) MOORE, 1974) Mhethanosaeta não _ Anaerobio restrito n.c. (KÖNIG, 1993) (VAISHAMPAYAN Rummeliibacillus sim Bacilos Aerobia facultativa (+) et al., 2009) (HOLDEMAN; Coprococcus não Diplococos Anaerobio restrito (+) MOORE, 1974) Bacilos curvos Alkaliphilus sim com flagelos Anaerobio restrito (+) (TAKAI et al., 2001) Bacilos com Pelosinus sim flagelo Anaerobio restrito (-) (MOE et al., 2012) Bacilos com Sporolactobacillus sim flagelo Aerobia facultativa (+) (DOORES, 2014) (HOFSTAD et al., Dysgonomonas não Coco bacilos Anaeróbia facultativa (-) 2000) Bacilos com Ethanoligenens não flagelo Anaerobio restrito (+) (XING et al., 2006) (OLSEN; BROCKMANN; Leuconostoc sim Bacilos Anaerobia facultativa (+) MOLIN, 2007) Bacilos com (HEYNDRICKX et Virgibacillus sim flagelo Aerobia facultativa (+) al., 1998)

Os resultados da análise da distribuição entre gêneros no diagrama de Venn (Figura 27) demonstra que os ocorre compartilhamento entre os gêneros Clostridium e Lactobacillus nas amostras TT, AT e AU. Estes gêneros são os que aparecem com maior abundância relativa (Figura 28). Os gêneros Bacillus e Coprococus aparecem nas amostras AT e TT. Outros gêneros classificados aparecem isoladamente em cada amostra, com menor abundância relativa.

Os gêneros dominantes entre as bactérias produtoras de hidrogênio via rota metabólica do butirato são o Clostridium e Bacillus, enquanto que a rota via propianato está associada aos gêneros Bacteroides, Peptostreptococcus, Ruminococcus (MOAT; FOSTER; SPECTOR, 2002). Embora não haja um consenso sobre o gênero dominante para produção de etanol entre as bactérias produtoras de hidrogênio, alguns autores citam a ocorrência principalmente dos

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gêneros Ethanoligenens, Acetanaerobacterium, Clostridum e Rhodopseudomona (CHEN; DONG, 2004; JUNG et al., 1999; XING et al., 2006)).

O trabalho de sequenciamento de Coprococcus sp. L2-50 (PRYDE et al., 2002) revelou que esta cepa processa o gene responsável pela formação da enzima butiril-CoA de acetil-CoA. A formação de butirato está intimamente ligada a formação desta enzima.

Figura 27 - Diagrama de Venn dos gêneros classificadas entres as comunidades bacterianas presentes nas amostras AT, TT e AU

Figura 28 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de gênero

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Dentre as 6 espécies identificadas, a que aparece com maior abundância relativa é a Lactobacillus zeae, seguida de Clostridium pasteurianum, Clostridium intestinale e Bacillus firmus (Figura 29).

Figura 29 - Classificação taxonômica de consorcio microbiano presentes nas amostras AU, TT e AT em nível de espécie.

C. pasteurianum é uma espécie utilizada para produção de butanol (DABROCK; BAHL; GOTTSCHALK, 1992; KAO et al., 2013; SABRA et al., 2014). No entanto, alguns parâmetros podem afetar a produção de solvente por esta cultura, como pH, potencial redox e limitação de fosfato e ferro (DABROCK; BAHL; GOTTSCHALK, 1992), elementos fundamentais para síntese de enzimas importante no metabolismo celular.

Apesar da abundância desta espécie no consorcio AU, não foi detectado n-butanol em nenhum dos ensaios de fermentação incubados com esta cultura. Como trata-se de um consórcio microbiano, não basta ter espécies capazes de produzir butanol, é preciso investigar os efeitos sinérgicos e antagônicos da coexistência das culturas envolvidas no processo e como elas reagem a mudanças nas condições ambientais.

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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Tão importante quanto o tratamento de resíduos é o seu reaproveitamento energético. A vinhaça é um resíduo produzido em larga escala pela indústria sucroalcooleira com grande potencial devido a elevada concentração de macro e micro nutrientes e substâncias orgânicas como os AOV.

O presente trabalho abre a possibilidade para inúmeros estudos, representando um passo importante no desenvolvimento de um processo industrial para reutilização da vinhaça. A exploração de novos microrganismos e estudo dos fatores que interferem no processo de fermentação como pH, temperatura, nutrientes, densidade da cultura, cargas aplicadas e características do substrato, são fundamentais para o entendimento dos efeitos sinérgicos e antagônicos da associação de culturas e determinação das rotas metabólicas envolvidas no processo.

Uma alternativa promissora, pela capacidade e viabilidade econômica, é a fermentação acidogênica da vinhaça concomitante a outro resíduo oriundo da indústria sucroalcooleira, como o bagaço da cana-de-açúcar que, se hidrolisado, atua como uma fonte de substrato para produção de AOV e hidrogênio. Em um outro processo integrado, o caldo da fermentação, rico em ácido butírico, pode ser convertido em álcoois, como o butanol, por processamento químico. O efluente da fermentação também pode ser avaliado para utilização como fertilizante na produção de cana-de-açúcar. No entanto, deve-se levar em consideração a toxicidade deste efluente quando descartado no solo e na água. Testes de toxicidade aguda com o microcrustáceo Daphnia similis realizado na UNESP campus Rio Claro, com resíduo dos ensaios de fermentação deste trabalho, revelaram alto potencial poluente, uma vez que as amostras apresentaram toxicidade aguda CE(50) < 0,5.

Salientamos ainda a importância da investigação e seleção de espécies em ambientes naturais para produção de AOV e álcoois. Mutações ocorrem naturalmente nos ambientes naturais, de forma que a biodiversidade de espécies no ambiente se apresenta como uma fonte inesgotável com grande potencial para produção de subprodutos para indústria energética.

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6. CONCLUSÃO

Apesar da vinhaça representar uma fonte de substrato mais desprovida de carboidratos, outras substâncias orgânicas presentes na vinhaça foram sintetizadas no processo de metabolismo do consórcio microbiano, indicando que houve consumo de ácido lático, uma vez que o balanço global deste composto foi negativo. A estratégia de utilizar como inóculo o resíduo da fermentação em batelada ocasionou mudanças no metabolismo microbiano culminando com a assimilação de ácido lático e aumento da produção dos ácidos butírico e acético e etanol.

A adição de vinhaça melhora significativamente a produção de ácido butírico em comparação com meio de cultura sintético, o que a torna uma excelente fonte de nutrientes para os microrganismos envolvidos na fermentação butírica.

Não foram encontradas diferenças significativas entre métodos de pré-tratamento e enriquecimento de inóculo, AT e TT no que diz respeito a produção de ácido butírico e etanol. No entanto, os produtos da fermentação no consórcio AT apresentaram menor coeficiente de variação, caracterizando este consórcio como mais estável.

A caracterização microbiológica por meio da análise filogenética, pirosequenciamento, forneceu informações importantes, revelando a ocorrência em maior abundância de bactérias do gênero Clostridium, principalmente no consórcio AU e Lactobacillus mais abundante nos consórcios TT e AT. Foi identificada uma espécie conhecida pela produção de butanol, o C. pasteurianum. No entanto, não foi detectado, pelo método CLAE utilizado, o solvente n- butanol.

Apesar da ocorrência de Lactobacillus, bactérias formadoras de ácido lático, como uma das mais abundantes nos consórcios, houve consumo ou reassimilação de ácido lático no processo metabólico, principalmente nas ultimas bateladas. Acredita-se que a elevada concentração de ácido lático na composição vinhaça tenha provocado a inversão no metabolismo.

Em escala maior, operando em reator de 1,5 L de volume reacional, o processo de fermentação de vinhaça bruta e melado de cana por consórcio microbiano AU mostrou

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potencial para produção de solventes como o butanol, uma vez que concentrações elevadas de ácido butírico foram produzidas, sendo este o principal produto da fermentação.

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133

ANEXO

Validação da Metodologia CLAE

O método foi validado pela determinação de sua linearidade, precisão e limites de detecção e de quantificação de acordo com Duarte et al. (2006).

A linearidade dos sinais aferidos e das concentrações das substâncias analisadas foram avaliadas por meio da regressão linear. A validação dos pressupostos do modelo linear foi avaliada por meio da Análise de Variância ANOVA, com o teste de validade de regressão, Tabela 10, e o teste de eficiência da regressão, Tabela 11, de cada um dos analitos avaliados.

Tabela 27- Parâmetros de validação do modelo de regressão linear da curva de calibração dos analitos avaliados, para significância de 95%.

Analitos p valor F calculado F critico n Ácido Cítrico 8,2E-17 6,1E+04 8,2E-17 10 Ácido Málico 1,8E-17 8,8E+04 1,8E-17 10 Ácido Succínico 3,3E-17 7,6E+04 3,3E-17 10 Ácido Lático 1,9E-17 8,7E+04 1,9E-17 10 Ácido Fórmico 3,1E-15 2,5E+04 3,1E-15 10 Ácido Acético 4,5E-19 2,2E+05 4,5E-19 10 Ácido Propiônico 3,5E-18 1,3E+05 3,5E-18 10 Ácido Iso-butírico 8,2E-18 1,1E+05 8,2E-18 10 Ácido Butírico 1,9E-17 8,7E+04 1,9E-17 10 Ácido Iso-valérico 2,8E-17 7,9E+04 2,8E-17 10 Ácido Valérico 3,6E-14 1,3E+04 3,6E-14 10 Ácido Capróico 6,8E-18 1,1E+05 6,8E-18 10 Sacarose 1,2E-06 2,2E+03 1,2E-06 6 Glicose 5,2E-17 6,8E+04 5,2E-17 10 Frutose 3,6E-17 7,5E+04 3,6E-17 10 Metanol 4,8E-16 3,9E+04 4,8E-16 10 Etanol 5,7E-16 3,7E+04 5,7E-16 10 n-Butanol 4,6E-12 4,0E+03 4,6E-12 10

Segundo Chui, Zucchini e Lichtig (2001), para verificar o teste de validade de uma regressão linear, compara-se F calculado pela razão MQR/MQE com o valor de F crítico, tabelado, no nível de confiança selecionado. Se F calculado ≥ F crítico, aceita-se, no nível de confiança selecionado, que a inclinação da reta da regressão é diferente de zero. De acordo com dados da Tabela 10, os valores de F calculado, para todos os analitos, são muito maiores

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que o valor de F crítico, indicando que a regressão é significativa. Aceitando a validade da regressão, calculou-se a sua eficiência pelo índice de correlação quadrático, R2 (Tabela 11).

Tabela 28- Equações de regressão linear e teste de eficiência de correlação dos parâmetros da curva de calibração dos analitos avaliados

Analitos Equação R2 R n Cítrico f(x) = 13309x - 14278 0,99987 0,99993 10 Málico f(x) = 10622x - 16142 0,99991 0,99995 10 Succínico f(x) = 8908x - 12878 0,99990 0,99995 10 Lático f(x) = 6020x - 4065 0,99991 0,99995 10 Fórmico f(x) = 9513x + 29401 0,99967 0,99984 10 Acético f(x) = 7465x + 3096 0,99996 0,99998 10 Propiônico f(x) = 6784x - 7210 0,99994 0,99997 10 Iso-butírico f(x) = 8644x + 33619 0,99993 0,99996 10 Butírico f(x) = 6593x - 10645 0,99991 0,99995 10 Iso-valérico f(x) = 6793x - 15506 0,99990 0,99995 10 Valérico f(x) = 5996x + 98359 0,99940 0,99970 10 Capróico f(x) = 5427x + 22931 0,99993 0,99996 10 Sacarose f(x) = 1474x - 32135 0,99820 0,99910 6 Glicose f(x) = 1797x - 7684 0,99988 0,99994 10 Frutose f(x) = 3236x - 9679 0,99989 0,99995 10 Metanol f(x) = 1146x - 11641 0,99979 0,99990 10 Etanol f(x) = 1884x - 11421 0,99979 0,99989 10 n-Butanol f(x) = 1102x - 16524 0,99798 0,99899 10

As curvas de calibração possuem linearidade satisfatória na faixa de concentração investigada, entre 50 e 800 mg L-1 para sacarose e entre 10 e 900 mg L-1 para os demais analitos. De acordo com os valores de R2 obtidos pode-se afirmar que a correlação é fortíssima (R2 > 0,99) (WOOD, 1999).

A precisão foi avaliada pelo coeficiente de variação (CV %) dos tempos de retenção de cada padrão nas diferentes concentrações dos pontos da curva de calibração. O limite de detecção (LD) representa a menor quantidade de substância que pode ser detectada pelo método. O limite de quantificação (LQ) representa a menor quantidade de substância que pode ser medida pelo método (RIBANI et al., 2004). Há três maneiras diferentes de calcular esses critérios: método visual, método de relação sinal-ruído e o método baseado em parâmetros da curva analítica. Neste trabalho utilizou-se os parâmetros da curva analítica. O resultado da avaliação da precisão e as equações utilizadas são apresentadas na Tabela 12.

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Tabela 29- Avaliação dos limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) e da precisão do método CLAE para dos analitos avaliados.

Tempo de retenção LD LQ Coeficiente Analitos (min) de variação n mg L-1 Média +- DP (%) Cítrico 5,24 15,71 9,274 0,004 0,04 10 Málico 4,34 13,03 11,008 0,002 0,02 10 Succínico 4,67 14,02 13,536 0,005 0,04 10 Lático 4,37 13,12 14,535 0,003 0,02 10 Fórmico 8,25 24,75 16,028 0,004 0,03 10 Acético 2,73 8,20 17,473 0,008 0,05 10 Propiônico 3,54 10,61 20,590 0,016 0,08 10 Iso-butírico 3,93 11,79 23,170 0,030 0,13 10 Butírico 4,37 13,11 25,269 0,041 0,16 10 Iso-valérico 4,59 13,77 29,049 0,062 0,21 10 Valérico 11,20 33,60 35,469 0,095 0,27 10 Capróico 3,84 11,51 53,313 0,272 0,51 10 Sacarose 14,17 42,50 8,950 0,002 0,03 6 Glicose 4,95 14,86 10,543 0,003 0,03 10 Frutose 4,73 14,19 11,382 0,002 0,02 10 Metanol 6,54 19,62 23,516 0,052 0,22 10 Etanol 6,68 20,03 25,540 0,034 0,13 10 n-Butanol 20,54 61,62 44,088 0,085 0,19 10

De acordo com Wood (1999), o limite do CV aceitável para a faixa de concentração utilizada é de 2,8%. Nas condições empregadas o CV para a precisão do método variou de 0,02 a 0,51%. Os valores de CV obtidos foram semelhantes aos obtidos por Penteado, Adorno e Zaiat (2012), que foram de 0,014 a 0,310 % para a precisão do método de determinação de AOV e álcoois. Embora as condições experimentais, metodologia e equipamentos utilizados tenham sido os mesmos que os utilizados pelos autores citados, os tempos de retenção dos AOV obtidos neste trabalho foram inferiores em aproximadamente 1 minuto.

Os limites de detecção e de quantificação foram inferiores a 10 e 25 mg L-1, respectivamente para a maioria dos AOV, com exceção do ácido valérico. Dos álcoois, o n- butanol foi o que apresentou maior LQ, de forma que diluição de amostras pode limitar o uso desta metodologia, uma vez que concentrações baixas deste analito não serão detectadas pelo método.