Modèle in Vitro Pour L'étude De L'expression D'insl3 En Présence

Home , Eicosanoid receptor

Modèle in vitro pour l’étude de l’expression d’INSL3

en présence de perturbateurs endocriniens

Thèse

Eric Laguë

Doctorat en médecine moléculaire

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

Résumé

Plusieurs études ont démontré l’existence d’une corrélation directe entre l’exposition fœtale à des contaminants environnementaux (comme le DEHP ou les estrogènes) et la perturbation de la différenciation sexuelle chez les fœtus mâles.

Ces études ont notamment mis en évidence l’existence d’une fenêtre de susceptibilité; une période pendant laquelle l’exposition des cellules de Leydig aux contaminants perturbe leurs activités et entraine une diminution de leurs sécrétions des hormones testostérone (T) et Insulin-like 3 (INSL3).

Ces hormones sécrétées par les cellules de Leydig sont requises pour la différenciation sexuelle du fœtus mâle, l’adoption des caractéristiques masculines primaires et secondaires (revue de Robert Courrier, 1962).

Ces hormones influencent aussi la formation des spermatozoïdes et le comportement sexuel. Les études démontrent qu’une production insuffisante de ces hormones est corrélée avec une fertilité réduite (de modérée à très grave), une sous-masculinisation, la non-descente des testicules dans le scrotum (cryptorchidie) et parfois même une féminisation des organes sexuels primaires. Selon plusieurs spécialistes, ces symptômes seraient le résultat d’une perturbation de l’ontogenèse des testicules durant le développement fœtal. Syndrome de dysgénésie testiculaire est le nom qui a été donné à cette théorie.

La cryptorchidie congénitale découlerait donc d’une insuffisance d’activités hormonales et révélerait par le fait même un problème de dysgénésie testiculaire. Bien que la prévalence varie à travers le monde, il semblerait, qu’en moyenne, au moins 4 % des nouveau-nés naissent avec cette condition. La localisation des testicules cryptorchides peut être corrigée chirurgicalement par orchiopexie (orchidopexie). Néanmoins, la correction chirurgicale ne semble pas être suffisante puisque les individus cryptorchides à la naissance demeurent plus à risque de développer un cancer

iii du testicule et de souffrir de problèmes reliés à la fertilité, et ce, même après correction chirurgicale.

Bien que les preuves provenant des études épidémiologiques et animales soient de plus en plus explicites, les preuves moléculaires demeurent partielles ou peu concluantes. Des preuves de nature moléculaire pourraient permettre de mieux définir le risque réel que représente le DEHP pour la santé humaine et la fertilité masculine.

Le principal objectif des recherches effectuées était d’identifier et de valider un modèle in vitro permettant l’étude de composés potentiellement toxiques en minimisant le sacrifice d’animaux.

À travers ces travaux, nous démontrons que la testostérone (T) augmente les niveaux d’ARNm d’Insl3 dans une lignée de cellules de Leydig et dans des cellules de Leydig primaires. Nous démontrons aussi que la testostérone induit l’activité des promoteurs d’Insl3 de différentes espèces. De plus, nous mettons en évidence que l’effet inducteur de la T sur l’activité transcriptionnelle et l’ARNm d’Insl3 nécessite le récepteur aux androgènes (AR). Nous avons localisé l’élément de réponse à la T sur le promoteur proximal d’INSL3. Cette région est toutefois dépourvue d’un élément de réponse aux androgènes consensus, ce qui suggère un mécanisme d’action indirect. Enfin, nous démontrons que le mono-(2-éthylhexyl) phtalate, le métabolite actif du perturbateur endocrinien DEHP, réprime aussi la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig en antagonisant l’action de la dyade T/AR.

Nous démontrons que l’estradiol (E2) réduit le niveau d’ARNm d’Insl3 dans les cellules de Leydig MA-10. Nos résultats démontrent qu’E2 réduit l’activité des promoteurs humain et murin d’Insl3/INSL3. Nous avons circonscrit la région répondant

à l’E2 sur le promoteur proximal du promoteur humain d’INSL3. Cette région ne contient pas d’élément consensus de réponse aux estrogènes. Ceci indique que le mécanisme de répression est indirect. Conformément à cela, nous avons noté que la réponse à l’E2 est perdue lorsqu’une mutation est introduite au niveau des sites de

iv liaisons des récepteurs nucléaires NUR77 et SF1. Enfin, nous démontrons que l’effet de l’exposition à l’E2 peut être renversé par un traitement conjoint avec de la testostérone, un activateur de la transcription d’Insl3.

Malheureusement, les travaux n’ont pu être complétés dans le cadre de la présente thèse puisque la lignée cellulaire utilisée comme modèle, la lignée MA-10, a cessé de répondre aux divers stimuli.

Néanmoins, les données présentées procurent d’importantes nouvelles perspectives sur la régulation de la transcription d’Insl3/INSL3 dans les cellules de Leydig, sur le mode d’action des phtalates et suggèrent des pistes de recherche à venir. La présente thèse contribue ainsi à la somme des savoirs qui permettra de comprendre comment le DEHP vient inhiber la sécrétion de T et d’INSL3.

v Table des matières

Résumé ...... iii

Table des matières ...... vi

Liste des tableaux ...... xv

Chapitre 1 ...... xv

Liste des figures ...... xv

Chapitre 1 ...... xv

Chapitre 2 ...... xv

Chapitre 3 ...... xv

Chapitre 4 ...... xv

Chapitre 5 ...... xv

Liste des abréviations ...... xvi

Épigraphe ...... xxiv

Remerciements ...... xxv

Avant-propos ...... xxvii

Chapitre I ...... 1

1.1 Structure du testicule ...... 1

1.1.1 Tubules séminifères ...... 1

1.1.2 Espace interstitiel ...... 2

1.2 Principales fonctions du testicule ...... 3

1.2.1 Fonctions du testicule durant la différenciation sexuelle ...... 4

1.2.2 Fonctions du testicule à partir de la puberté ...... 4

1.2.3 Soutien de la spermatogenèse ...... 5

1.2.4 Maintien des caractéristiques sexuelles secondaires ...... 9

1.3 Rôles des cellules du testicule ...... 10

vi 1.3.1 Les cellules péritubulaires myéloïdes ...... 10

1.3.2 Cellules de Sertoli ...... 10

1.3.3 Macrophages ...... 12

1.3.4 Cellules de Leydig ...... 13

1.3.4.1 Introduction à la maturation des cellules de Leydig ...... 13

1.3.4.2 Les cellules de Leydig au stade souche (SLC) ...... 16

1.3.4.3 Les cellules de Leydig fœtal au stade précurseur/progéniteur (PFLC) ...... 18

1.3.4.4 Les cellules de Leydig fœtal au stade immature (IFLC) ...... 19

1.3.4.5 Les cellules de Leydig fœtal au stade mature (MFLC) ...... 20

1.3.4.6 Extinction des FLC ...... 21

1.3.4.7 Introduction à la maturation des cellules de Leydig de la population adulte ...... 21

1.3.4.8 Les cellules de Leydig adultes (ALC) au stade souche (SLC) ...... 22

1.3.4.9 Les cellules de Leydig adulte au stade précurseur/progéniteur (PALC) .... 24

1.3.4.10 Les cellules de Leydig adulte au stade immature (IALC) ...... 26

1.3.4.11 Les cellules de Leydig adulte au stade mature (MALC) ...... 27

1.3.4.12 Potentiel de régénération des ALC ...... 28

1.3.4.13 Les cellules de Leydig chez l’homme ...... 29

1.3.4.14 Les cellules de Leydig infantiles (InLC) ...... 30

1.3.5 Contacts cellule-cellule ...... 30

1.4 Le processus de différenciation sexuelle chez le mâle ...... 31

1.4.1 Ontogénie du testicule ...... 32

1.4.2 L’adoption des caractéristiques sexuelles primaires chez le mâle ...... 33

1.5 Expression d’Insl3/INSL3 ...... 34

1.5.1 Expression d’Insl3 chez le mâle ...... 34

vii 1.5.2 Expression d’Insl3 chez la femelle ...... 35

1.5.3 Insulin-like 3 au niveau moléculaire ...... 35

1.5.3.1 Structure de l’Insl3 murin ...... 37

1.5.3.2 Structure de l’Insl3 chez le rat ...... 38

1.5.3.3 Structure de l’INSL3 humain...... 39

1.6 Identification des gènes essentiels à la descente testiculaire ...... 40

1.6.1 Les souris féminisées ...... 40

1.6.2 Les souris Insl3 invalidées (Insl3-/-) ...... 42

1.6.3 Les souris doublement invalidées (Insl3-/- et Ar-/Y) ...... 42

1.6.4 Les souris crsp ...... 43

1.7 Détails de la descente testiculaire ...... 44

1.7.1 Détails de la première phase : la phase transabdominale ...... 44

1.7.2 Détails de la seconde phase : la phase inguino-scrotale ...... 45

1.7.3 Régulation de la descente testiculaire ...... 45

1.8 Autres rôles d’INSL3 ...... 46

1.9 La cryptorchidie congénitale ...... 46

1.9.1 Prévalence de la cryptorchidie congénitale ...... 47

1.9.2 Cryptorchidie congénitale complète ou intermédiaire ...... 47

1.9.4 Conséquences de la cryptorchidie congénitale ...... 49

1.9.5 Syndrome de dysgénésie testiculaire (TDS) ...... 49

1.9.6 Facteurs de risque...... 50

1.9.6.1 Facteurs génétiques ...... 50

1.9.6.2 Facteurs comportementaux ...... 51

1.9.6.3 Facteurs environnementaux ...... 53

1.10 Le di-(2-éthylhexyl)-phtalate ...... 55

viii 1.10.1 Phénotype de l’exposition in utero au DEHP ...... 55

1.10.2 Exposition au DEHP ...... 56

1.10.3 Mode d’action du DEHP et de son métabolite ...... 57

1.11 Les estrogènes ...... 59

1.12 Modèles d’études utilisés dans la compréhension de l’action des phtalates . 61

1.12.1 Les modèles animaux ...... 61

1.12.1.1 Variabilité interespèces et susceptibilité génétique ...... 61

1.12.1.2 Le rat comme modèle ...... 62

1.12.1.3 La souris comme modèle ...... 63

1.12.1.4 Les autres mammifères communs comme modèle ...... 63

1.12.2 Les lignées de cellules de Leydig ...... 64

1.12.2.1 La lignée MA-10 ...... 64

1.12.2.2 La lignée MLTC-1 ...... 65

1.12.2.3 La lignée BLTK1 ...... 66

1.13 Mécanismes de régulation de l’expression génique ...... 67

1.13.1 Régulation de l’expression génique par l’épigénétique ...... 68

1.13.2 Régulation de l’expression génique par l’ARN polymérase ...... 70

1.13.3 Régulation de l’expression génique via la régulation de la traduction ...... 73

1.13.4 Régulation de l’expression génique non classique ...... 74

1.13.4.1 Modifications post-traductionnelles des facteurs de transcription ...... 74

1.13.4.1.1 L’acétylation ...... 75

1.13.4.1.2 La glycosylation et la glycation ...... 75

1.13.4.1.3 L’hydroxylation ...... 76

1.13.4.1.4 La méthylation ...... 76

1.13.4.1.5 La phosphorylation ...... 76

ix 1.13.4.1.6 L’ubiquitination ...... 77

1.13.4.1.7 La SUMOylation ...... 78

1.14 Problématique, hypothèse et objectifs ...... 78

1.14.1 Problématique ...... 78

1.14.2 Hypothèse...... 79

1.14.3 Objectif général ...... 79

1.14.4 Objectifs spécifiques ...... 80

Préambule au chapitre II ...... 83

Chapitre II ...... 85

2.1 RÉSUMÉ ...... 87

2.2 ABSTRACT ...... 88

2.3 INTRODUCTION ...... 89

2.4 MATERIALS AND METHODS ...... 91

2.4.1 Plasmids ...... 91

2.4.2 Cell culture and transfections ...... 92

2.4.3 Isolation of primary Leydig cells ...... 93

2.4.4 RNA isolation, reverse transcription, and quantitative real time PCR...... 93

2.4.5 Statistical analysis ...... 93

2.5 RESULTS ...... 94

2.5.1 Testosterone increases Insl3 mRNA levels in Leydig cells ...... 94

2.5.2 Testosterone stimulates Insl3 promoter activity from different species ..... 94

2.5.3 Testosterone acts in an AR-dependent manner to increase in Insl3 transcription ...... 94

2.5.4 Mapping of the testosterone-responsive element in the INSL3 promoter ... 95

2.5.5 MEHP antagonizes testosterone-induced Insl3 expression ...... 96

x 2.6 DISCUSSION ...... 97

2.6.1 Expression of Insl3 in Leydig cells ...... 97

2.6.2 Mechanism of androgen action on Insl3 transcription ...... 97

2.6.3 Androgen-MEHP antagonism in Insl3 transcription ...... 98

2.7 ACKNOWLEDGEMENTS ...... 100

2.8 REFERENCES ...... 101

2.9 FIGURE LEGENDS ...... 108

Préambule au chapitre III ...... 119

Chapitre III ...... 121

3.1 RÉSUMÉ ...... 123

3.2 ABSTRACT ...... 123

3.3 INTRODUCTION ...... 125

3.4 MATERIALS AND METHODS ...... 127

3.4.1 Plasmids ...... 127

3.4.2 Cell culture and transfections ...... 127

3.4.3 Drugs and cells treatments ...... 128

3.4.4 Statistical analysis ...... 128

3.5 RESULTS ...... 129

3.5.1 Dihydrotestosterone does not increase Insl3 transcription in MA-10 Leydig cells ...... 129

3.5.2 The GPRC6A membrane-bound receptor is not a major contributor to testosterone-induced INSL3 promoter activity ...... 129

3.5.3 Pertussis toxin does not modified testosterone or T-BSA induced INSL3 transcription...... 130

3.5.4 Kinase pathways in basal and testosterone-induced INSL3 transcription ... 130

3.6 DISCUSSION ...... 132

xi 3.7 ACKNOWLEDGEMENTS ...... 134

3.8 REFERENCES ...... 135

3.9 FIGURE LEGENDS ...... 139

Préambule au chapitre IV ...... 145

Chapitre IV ...... 147

4.1 RÉSUMÉ ...... 149

4.2 ABSTRACT ...... 151

4.3 INTRODUCTION ...... 153

4.4 MATERIALS AND METHODS ...... 155

4.4.1 Plasmids ...... 155

4.4.2 Cell culture and transfections ...... 155

4.4.3 Statistical analysis ...... 156

4.5 RESULTS ...... 157

4.6 DISCUSSION ...... 158

4.7 ACKNOWLEDGEMENTS ...... 160

4.8 CONFLICT OF INTEREST STATEMENT ...... 160

4.9 FUNDING ...... 160

4.10 REFERENCES ...... 161

4.11 FIGURE LEGENDS ...... 164

Préambule au chapitre V...... 167

Chapitre V ...... 169

5.1 RÉSUMÉ ...... 171

5.2 ABSTRACT ...... 173

5.3 INTRODUCTION ...... 175

5.4 MATERIALS AND METHODS ...... 177

xii 5.4.1 Plasmids ...... 177

5.4.2 RNA isolation and real time PCR ...... 177

5.4.3 Cell culture and transfections ...... 178

5.4.4 Statistical Analysis ...... 179

5.5 RESULTS ...... 180

5.5.1 E2 represses Insl3 expression in MA-10 Leydig cells ...... 180

5.5.2 E2 represses the activity of the human and mouse Insl3 promoter ...... 180

5.5.3 Localization of the E2 responsive region in the human INSL3 promoter ... 180

5.5.4 Testosterone prevents E2 repressive effect on the INSL3 promoter ...... 181

5.6 DISCUSSION ...... 182

5.6.1 E2 represses Insl3 transcription ...... 182

5.6.2 Mechanisms of E2 action ...... 182

5.7 ACKNOWLEDGEMENTS ...... 185

5.8 CONFLICT OF INTEREST STATEMENT ...... 185

5.9 FUNDING ...... 185

5.10 REFERENCES ...... 186

5.11 FIGURE LEGENDS ...... 190

Chapitre VI ...... 199

DISCUSSION ...... 199

6.1 Mode d’action de t/ar dans la régulation de l’expression d’insl3 ...... 200

6.1.1 Pertinence des résultats obtenus ...... 200

6.1.2 Identification du rôle du récepteur aux androgènes ...... 203

6.1.3 Activation de la signalisation intracellulaire par le récepteur aux androgènes ...... 204

6.1.4 Modulation de la transcription par interaction protéine-protéine non liée à des voies de signalisation intracellulaire ...... 208

xiii 6.2 Mode d’action des estrogènes dans la répression d’insl3 ...... 211

6.3 Validation du modèle et importance de l’insuline ...... 213

6.4 Les phtalates, les estrogènes et la santé reproductive masculine chez l’humain : mythe ou réalité ...... 218

6.5 Sommaire des limites et contributions ...... 223

6.5.1 Limites ...... 223

6.5.2 Contributions ...... 223

Bibliographie ...... 227

xiv Liste des tableaux Chapitre 1 Tableau 1.1 : Hypothèses testées ...... 80

Liste des figures Chapitre 1 Figure 1.1 : Structure du gène Insl3 murin...... 36 Figure 1.2 : Schéma de la descente des testicules ...... 48

Chapitre 2 Figure 2.1 : Testosterone stimulates Insl3 expression in Leydig cells...... 111 Figure 2.2 : The INSL3 promoter from different species is activated by testosterone...... 112 Figure 2.3 : Testosterone-dependent activation of Insl3 transcription requires the androgen receptor...... 113 Figure 2.4 : The testosterone-responsive area is located in the proximal INSL3 promoter...... 114 Figure 2.5 : Fine mapping of the testosterone-responsive element in the human INSL3 promoter...... 115 Figure 2.6 : MEHP inhibits the testosterone-induced Insl3 expression...... 116 Figure 2.7 : Testosterone-mediated induction of INSL3 promoter activity is repressed by MEHP...... 117

Chapitre 3 Figure 3.1 : Inhibition of 5 α-reductase does not impair testosterone-dependent activation of the INSL3 promoter...... 141 Figure 3.2 : T-BSA has minor effects on INSL3 transcriptional activity...... 142 Figure 3.3 : Pertussis toxin does not impair testosterone-induced INSL3 transcription...... 143 Figure 3.4 : Testosterone induction of INSL3 transcription does not require classical kinases activity...... 144

Chapitre 4 Figure 4.1 : Serum concentration in media does not influence INSL3 transcription pattern...... 165 Figure 4.2 : Insulin induces INSL3 transcription in MA-10 cells...... 166

Chapitre 5 Figure 5.1 : E2 represses Insl3 expression in Leydig cells...... 192 Figure 5.2 : The human and mouse INSL3 promoter is repressed by E2...... 193 Figure 5.3 : The E2-responsive region is located in the proximal INSL3 promoter. 194 Figure 5.4 : Repression of the INSL3 promoter by E2 requires a nuclear receptor ½ site...... 195 Figure 5.5 : Testosterone prevents E2-mediated repression of INSL3 promoter activity...... 196

xv Liste des abréviations

°C: degré Celsius

3 α-HSD : 3 alpha-hydroxystéroïde déshydrogénase

3β-HSD : 3 bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase

3β-HSD type 6 : 3 bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase type 6

8Br-cAMP : 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate

17,20-lyase : activité 17,20-lyase du cytochrome P450 17A1; (17α-hydroxylase/17,20- lyase)

17β-HSD type 3 : 17 bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase type 3

25HC : 25-hydroxycholesterol (25-hydroxycholestérol)

αGSU : alpha-glycoprotein subunit a.a. : acides aminés

ACTH : adrenocorticotrophic hormone

ADN : acide désoxyribonucléique

AINS : anti-inflammatoire non stéroïdien

AKT : autre dénomination de PKB

ALC : adult Leydig cells (cellules de Leydig adultes/matures )

AMH : anti-mullerian hormone (hormone antimüllérienne)

AMPc : adénosine monophosphate cyclique

ANP : atrial natriuretic peptide (peptide atrionatriurétique)

AR : androgen receptor (récepteur aux androgènes ; NR3C4)

ARE : androgen response element (élément de réponse aux androgènes)

ARN : acide ribonucléique

ARNm : ARN messager

xvi ATG : codon d’initiation de la traduction

B3GNT3 : UDP-GlcNAc:betaGal béta-1,3-N-acéetylglucosaminyltransferase 3 bp : base pair (paire de base)

BSA : bovine albumin serum (albumine sérique bovine)

C/EBPβ : CCAAT enhancer-binding protein β

CAIS : complete androgen insensibility syndrome

CaMK : Ca2+/calmodulin-dependant protein kinase cDNA : complementary DNA (acide désoxyribonucléique (ADN) complémentaire)

Ch25H : cholestérol 25-hydroxylase (EC 1.14.99.38)

ChIP : chromatin immunoprecipitation (immunoprécipitation de la chromatine)

CHUQ : centre hospitalier universitaire de Québec

CIHR : Canadian institutes of health research c-kit : Stem cell factor (SCF) receptor cM : centimorgan

CpG : C-phosphate-G crsp : cryptorchidism with white spotting

CSL : cranial suspensory ligament

Cyp11A1 : cytochrome P450, family 11, subfamily A, polypeptide 1 also known as P450SCC

Cyp19a1 : cytochrome P450, family 19, subfamily a, polypeptide 1 also known as aromatase

DAX1 : dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1 (NR0B1)

DBP : di-butyl phtalate (Cas. No: 84-74-2)

DEHP : di-(2-éthyl-hexyl) phtalate (Cas. No: 117-81-7)

xvii DES : diéthylstilbestrol

DHEA : déhydroépiandrostérone

DHH : desert hedgehog

DHT : dihydrotestostérone

DINP : di-isononyle phtalate (Cas. No : 28553-12-0)

DMSO : diméthylsulfoxyde

DNA : deoxyribonucleic acid (ADN en français)

DR3 : direct repeat space by 3 nucleotides

E2 : 17-bêta-estradiol

EGF : epidermal growth factor

ER : récepteur aux estrogènes

ERE : estrogen response element (élément de réponse aux estrogènes)

ERK : extra-cellular signal-regulated kinase

ERα : estrogen receptor α (récepteur aux estrogènes α : ESR1, NR3A1)

FLC : Fœtal Leydig cells (cellules de Leydig fœtales)

FSH : follicle-stimulating hormone (hormone folliculo-stimulante)

FSHβ : follicle stimulating hormone (FSH) beta subunit

GnRH : gonadotropin releasing hormone (gonadolibérine)

Gnrh1 : autre dénomination de LHRH

GPER : G-protein-coupled estrogen receptor (récepteur aux estrogènes couplé à une protéine G; aussi connu comme GPR30)

GPR30 : G-protein-coupled receptor 30 (voir GPER)

GPRC6A : G protein-coupled receptor family C group 6 member A

GR : glucocorticoid receptor (récepteur aux glucorticoïdes)

GREAT : autre dénomination de LGR8 et de RXFP2 (RXFP2 est le nom officiel) xviii h : heures hCG : human chorionic gonadotropin (hormone chorionique gonadotrope)

HMG-CoA réductase: 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase

HO-F : hydroxyflutamide

HPG : axe hypothalamo-hypophyso-gonadique hpg : hypogonadisme hypogonadotrope

HSL : homonosensitive lipase (lipase hormonosensible)

IFLC : immature fœtal Leydig cells (cellules de Leydig fœtales au stade immature)

IGF-I : insulin-like growth factor 1

IGF1R : insulin-like growth factor 1 receptor

IGFR : insulin-like growth factor receptor

IL-1 : interleukine 1

IALC : immature adult Leydig cells (cellules de Leydig adultes au stade immature)

InLC : infantile Leydig cells (cellules de Leydig infantiles)

INSL3 : insulin-like factor 3

IR : récepteur à l’insuline

IR3 : inverted repeat spaced by 3 nucleotides

Irr : insulin-related receptor

Jak3 : Janus kinase 3

JNK : c-Jun N-terminal kinase jpc : jour post-coïtal kDa : kilo Dalton

LBD : ligand binding domain (domaine de liaison du ligand)

LGR8 : autre dénomination de GREAT et de RXFP2 (RXFP2 est le nom officiel)

xix LH : luteinizing hormone (hormone lutéinisante)

LHCGR : luteinizing hormone and choriogonadotropin receptor (récepteur pour hormone lutéinisante)

LHRH : luteinizing hormone releasing hormone

Lif-R : leukemia inhibitory factor receptor

LRR : leucine rich repeats (répétions riches en résidu leucine)

LSD1 : lysine-specific demethylase 1

MALC : mature adult Leydig cells (cellules de Leydig adultes au stade mature)

MAPK : MAP kinase

MBP : mono-n-butyl phtalate (Cas. No: 131-70-4) (mono-ester actif du DBP)

MEHP : mono-(2-éthylhexyl) phtalate (Cas. No : 4376-20-9) (mono-ester actif du DEHP)

MFLC : mature fœtal Leydig cells (cellules de Leydig fœtales au stade mature)

MR : mineralocorticoid receptor (récepteur aux minéralocorticoïdes) mRNA : messenger RNA (ARN messager (ARNm))

NK : natural killer lymphocyte

NO : nitric oxide

NR : nuclear receptor

NR4A1 : nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 (also known as Nur77)

NR5A1 : nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1 (also known as SF1)

NTCP : sodium taurocholate cotransporting polypeptide

P.M. : poids moléculaire

PAIS : partial androgen insensibility syndrome

PALC : progenitor adult Leydig cells (cellules de Leydig adultes au stade précurseur/progéniteur)

xx pb : paire de bases (voir : bp : base pair en anglais)

PBR : peripheral-type benzodiazepine receptor

PCB : polychlorinated biphenyl

PCR : polymerase chain reaction (réaction de polymérisation en chaine)

PDGFA : platelet-derived growth factor alpha

PDGFRA : platelet-derived growth factor receptor alpha

PFLC : progenitor fœtal Leydig cells (cellules de Leydig fœtales au stade précurseur/progéniteur) phRL-TK : high copy number Renilla luciferase thymidine kinase promoter

PKA : protéine kinase A

PKB : protéine kinase B (aussi connu comme AKT)

PLC : progenitor Leydig cells (cellules de Leydig progénitrices)

PMA : phorbol-12-myristate-13-acetate pn : postnataux

PND : postnatal day (jours postnataux en français)

PPARα : peroxisome proliferator receptor alpha (récepteur aux proliférateurs de peroxysomes alpha)

PPARγ : peroxisome proliferator receptor gamma (récepteur aux proliférateurs de peroxysomes gamma)

PPRE : peroxisome proliferator response element (élément de réponse aux proliférateurs de peroxysomes)

PR : progesterone receptor (récepteur aux progestagènes)

PTC : peritubular cell (cellules péritubulaires)

PVC : Polyvinyl chloride (chlorure de polyvinyle)

RNA : ribonucleic acid (voir ARN en français)

xxi Rpl19 : ribosomal protein L19

RXFP1 : relaxin family peptide receptor 1

RXFP2 : relaxin family peptide receptor 2 (aussi connu sous l’appellation LGR8 ou GREAT)

RXR : retinoid X receptor

SEM : standard error of means

SHBG : sex hormone binding globulin siRNA : small interfering RNA

SLC : stem Leydig cells (cellules de Leydig souches)

SNP : single-nucleotide polymorphism

SOX9 : SRY (sex determining region Y)-containing gene 9

Sp1 : specificity protein 1

SRY : sex determining region Y protein

Star : steroidogenic acute regulatory protein

SUMO : small ubiquitin-like modifier

SV40 : simian virus 40

T : testostérone

TDS : testicular dysgenesis syndrome (syndrome de dysgénésie testiculaire)

TF : transcription factor (facteur de transcription)

TFIID : transcription factor IID

Tfm : testicular feminized mouse

TGFβ : transforming growth factor beta

TNFα : tumor necrosis factor alpha

TSHβ : thyroid stimulating hormone, beta subunit

Txnip : thioredoxin interacting protein xxii UTR : untranslated region

WNT4 : wingless-related MMTV integration site 4 yr : year

xxiii Épigraphe

“I’ve been studying the art of war for 40 odd years . . . a surgeon who decides in the course of an operation to change its objective is not making a snap decision but one based on knowledge, experience, and training. So am I.” George S. Patton Jr.

xxiv Remerciements

J'aimerais en premier lieu remercier mon directeur de recherche, Dr Jacques J. Tremblay pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Cela a été un privilège de travailler avec ce chercheur déterminé et perfectionniste.

Je voudrais aussi remercier mes collègues du centre de recherche en biologie de la reproduction (CRBR) et du centre hospitalier universitaire de Québec (CHUQ) qui ont tous contribué à ce que je suis devenu et à l’aboutissement de ce projet.

Je tiens à remercier les différentes organisations dont la participation s’est révélée indispensable à mon cheminement : les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et le fond de recherche du Québec – Santé (FRQS), les membres du « Quebec training network in perinatal research (QTNPR) » et mes collègues étudiants gradués de la faculté des sciences de l’administration (FSA) de l’université Laval.

Je tiens tout particulièrement à remercier deux femmes extraordinaires : Madeline Tyre et Marie Eve Bergeron. Elles ont contribué, chacune à leur façon, à la complétion du parcours. Vous garderez toujours une place importante dans mon cœur. Merci.

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Avant-propos

Eric Laguë a effectué l’ensemble des expériences, a interprété les résultats, et rédigé la première version des articles. Dr Jacques J. Tremblay a participé à l’interprétation des données et a complété la rédaction des articles.

Les articles présentés aux chapitres 2 et 5, respectivement intitulés : « Antagonistic effects of testosterone and the endocrine disruptor MEHP on Insl3 transcription in Leydig cells » et « Estradiol represses Insulin-like 3 expression and promoter activity in MA-10 Leydig cells », sont respectivement publiés dans Endocrinology (2008) et Toxicology (2009).

Les articles présentés aux chapitres 3 et 4, respectivement intitulés : « Insight into testosterone-induced INSL3 transcription in MA-10 Leydig cells » et « Insulin induces INSL3 transcription in MA-10 leydig cells », sont des articles en préparation pour soumission, formaté pour le journal Endocrinology.

Aucune modification n’a été apportée aux articles et figures déjà publiés.

xxvii

Chapitre I

INTRODUCTION

1.1 Structure du testicule

Le testicule est un organe complexe et segmenté. Les testicules sont recouverts d’une paroi épaisse appelée l'albuginée. Cette dernière divise l’intérieur du testicule en plusieurs compartiments, chacun regroupant plusieurs tubules extrêmement minces et enroulés. Il s’agit de tubules séminifères, lieu de la production des spermatozoïdes. La portion distale des tubules séminifères est dite contournée et est reliée au tubule séminifère droit, qui lui est rattaché au rete testis, un réseau de canaux à partir duquel les spermatozoïdes quittent le testicule pour rejoindre l’épididyme. Les tubules séminifères et les cellules de Leydig de l’espace interstitiel forment les principales unités fonctionnelles. Leurs rôles et activités sont intimement liés. En coupe transversale, on peut voir que les tubules séminifères sont délimités par les cellules de Sertoli et les cellules péritubulaires myéloïdes. La jonction entre les différents tubules forme l’espace interstitiel. On y retrouve les cellules de Leydig, des macrophages et des vaisseaux sanguins. L’espace interstitiel lie le testicule au système circulatoire et donc au reste de l’organisme [1].

1.1.1 Tubules séminifères

Les tubules séminifères représentent près de 80 % du volume des testicules [2]. Les tubules séminifères sont composés de divers types cellulaires organisés de manière concentrique de la périphérie vers la lumière. Il y a d’abord les cellules péritubulaires myéloïdes en périphérie (de la membrane basale), les cellules de Sertoli, les cellules germinales qui deviendront successivement des spermatogonies, des spermatocytes, des spermatides et puis des spermatozoïdes [3]. L’organisation des cellules de Sertoli et des cellules péritubulaires myéloïdes constitue un des éléments importants de la barrière hématotesticulaire chez l’adulte [4]. La lame basale des capillaires sanguins, l’endothélium et les nombreuses jonctions serrées entre les cellules sont d’autres

1 composantes importantes de cette barrière hématotesticulaire. La barrière hématotesticulaire crée deux espaces distincts (un espace luminal et un espace interstitiel) et permet le contrôle des échanges entre ces deux espaces. De plus, la ségrégation entrainée par cette barrière permet aux spermatocytes de se développer à l’intérieur de l’espace luminal sans entrainer de réponse immunitaire [3, 4].

1.1.2 Espace interstitiel On retrouve dans cet espace une variété de cellules telles que des macrophages, des fibroblastes, des cellules myéloïdes, des lymphocytes et des cellules de Leydig en grand nombre. Cet espace est aussi traversé par des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Le volume qu’occupe cet espace varie en fonction de l’espèce et de l’activité stéroïdogénique du testicule. Chez le rat adulte, la population de cellules de Leydig par testicule est estimée à environ 30 millions et couvre environ 49 % de l’espace interstitiel [5, 6].

C’est en effectuant des comparaisons histologiques des testicules que Franz Leydig (1850) identifie pour la première fois ces cellules particulières dans l’espace interstitiel. Ces cellules portent désormais son nom : cellules de Leydig [7]. Puis en 1903, Pol Bouin et Paul Ancel ont présenté les premières données sur les cellules de Leydig démontrant leurs implications directes dans le contrôle des caractères sexuels secondaires mâles [8, 9].

Encore 50 ans ont été nécessaires avant que l’on obtienne des preuves histochimiques et biochimiques qui lient directement les cellules de Leydig au rôle endocrinien qui leur a été attribué. En 1958, Wattenberg et al ont réussi à localiser l’enzyme stéroïdogénique 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (HSD3B) dans l’interstice des testicules de lapin en utilisant la procédure de localisation histochimique avec des sels de tétrazolium [10]. Christensen et Mason (1965) ont, quant à eux, présenté la première preuve biochimique en cultivant séparément les tubules séminifères et le tissu interstitiel avec de la progestérone, un précurseur distant de la testostérone, marqué radioactivement. Ils ont démontré que l’activité enzymatique de conversion de la

2 progestérone en testostérone était effectuée dans l’espace interstitiel et non dans les tubules séminifères [11].

1.2 Principales fonctions du testicule

Il a fallu attendre cinquante ans, suivant les travaux Pol Bouin et Paul Ancel, avant qu’un chercheur, le Dr Jost, ne parvienne à identifier l’hormone responsable de la masculinité, la testostérone [12]. Une fois de plus, une grande période de temps s’est écoulée avant qu’une autre découverte majeure soit faite. En 1994, Burkhardt et al découvre que les cellules de Leydig sécrètent aussi, en grande quantité, l’hormone peptidique Insulin-like 3 (INSL3) mais ils ne parviennent pas à identifier son rôle. Celui-ci demeure inconnu jusqu’en 1999, moment où l’on démontre qu’INSL3 est essentielle à la descente testiculaire qui a lieu durant le développement fœtal [13-16].

Durant le développement fœtal, les hormones produites par le testicule vont permettre la différenciation sexuelle mâle, c’est-à-dire la formation/maturation des organes génitaux primaires et secondaires mâles et le positionnement adéquat des testicules dans le scrotum [9, 13, 17].

Les cellules du testicule deviendront plus ou moins quiescentes suite à la naissance et le demeureront jusqu’à la puberté. Lors de cette dernière, les cellules matures des testicules sécréteront d’importantes quantités d’hormones qui provoqueront l’acquisition des phénotypes secondaires masculins et induiront la spermatogenèse [9].

Après la puberté, les niveaux relatifs d’hormones issues du testicule demeureront importants tout au long de la vie adulte de l’individu [18]. Durant cette période, ces hormones contribueront à maintenir les phénotypes secondaires et la fertilité de l’individu.

Bien que plusieurs hormones soient sécrétées par le testicule, la majorité de celles-ci ne seront pas discutées dans le présent document, car elles ne sont pas pertinentes à mon travail de doctorat. Seules la testostérone et INSL3 seront présentées étant donné

3 qu’elles semblent être des cibles de choix pour les perturbateurs endocriniens à l’étude dans le cadre de ma thèse.

1.2.1 Fonctions du testicule durant la différenciation sexuelle

La différenciation sexuelle mâle est dirigée par la production et l’action coordonnée de trois hormones produites par le testicule foetal. Les cellules de Sertoli produisent l’hormone anti-Müllerienne (AMH). Tel que préalablement mentionné, cette hormone inhibe le développement des canaux de Müller en oviductes et autres tissus de l’appareil reproducteur féminin [19]. Parallèlement, les cellules de Leydig produisent la testostérone et l’INSL3. La testostérone produite va entrainer la virilisation des tissus du système urogénital : le développement des canaux de Wolff qui deviendront les structures fonctionnelles que sont les épididymes, les spermiductes et les vésicules séminales; la formation de la prostate à partir du sinus urogénital; ainsi que le développement des organes génitaux externes. De plus, sous l’action de la testostérone le tubercule génital formera le gland du pénis, les replis urétraux se joindront pour former le corps du pénis et les gonflements labioscrotaux évolueront pour devenir le scrotum [1].

1.2.2 Fonctions du testicule à partir de la puberté

À partir de la puberté, les principales cellules du testicule deviennent réactives aux hormones sécrétées par l’hypophyse. Au moment de la puberté, l’hypothalamus se met à sécréter de la gonadolibérine (GnRH) à une fréquence et à une concentration plus élevées. La gonadolibérine induit la production et la sécrétion des hormones folliculo- stimulante (FSH) et lutéinisante (LH) par les cellules de l’adénohypophyse. La LH et la FSH produites entrent en circulation et rejoignent les cellules du testicule. La FSH active la prolifération des cellules de Sertoli et leur production d’inhibine B, alors que la LH active la production de la testostérone par les cellules de Leydig. La testostérone et l’inhibine B sécrétées auront divers effets sur les organes et les systèmes qui leur sont sensibles. Ces hormones auront un effet notable sur l’hypothalamus : leur augmentation entrainera une diminution de la sécrétion de gonadolibérine par

4 l’hypothalamus et donc une diminution de la sécrétion de LH et FSH. À partir de ce moment, les cellules de Leydig, de Sertoli et de l’hypothalamus entrent dans une boucle de régulation positive/négative connue sous le nom d’axe de régulation HPG (revue par Jin (2014)[20]. La production/sécrétion d’INSL3 s’accroit aussi à partir de la puberté. Toutefois, la régulation de son expression semble être indépendante des concentrations circulantes de LH/FSH. Les changements hormonaux survenant à la puberté enclenchent le système de production des spermatozoïdes (la spermatogenèse) jusque-là demeuré en latence.

1.2.3 Soutien de la spermatogenèse

À la puberté, il y a activation de la seconde fonction du testicule et activation de divers mécanismes qui permettront la génération de spermatozoïdes. Les cellules de Sertoli jouent un important rôle dans le processus de formation et de maturation des spermatocytes en devenir. Les cellules de Sertoli forment alors une couche stratifiée s’étendant de la membrane basale jusqu’à la lumière des tubules [21]. Elles forment un nid à l’intérieur duquel les cellules germinales vont effectuer plusieurs épisodes de divisions mitotiques, puis méiotiques, qui conduiront à la formation des spermatocytes, précurseurs des spermatides. Les cellules germinales constituent l’ensemble des cellules qui vont mener à la formation des cellules haploïdes directement impliquées dans la reproduction sexuée. Les cellules originelles (spermatogonies) créent et maintiennent un bassin de cellules originelles par division mitotique. Ainsi une partie des spermatogonies demeureront des cellules originelles et une autre entrera éventuellement en méiose et produiront des spermatocytes [22]. Les générations de cellules germinales plus jeunes sont plus près de la membrane basale alors que les plus matures sont plus près de la lumière.

Chez l’homme, les spermatogonies de type A sombres (adult dark (Ad)) sont considérées comme des cellules souches. Des cellules de réserve qui, par mitose, produiront une nouvelle cellule souche (Ad) ou une paire de spermatogonies de type A pâle (Ap). Les spermatogonies Ap seraient un peu plus différenciées et seraient la source des spermatogonies de type B [23, 24].

Les spermatogonies de type B sont très semblables aux spermatogonies de type Ap bien que plus petites et ayant moins de contact avec la membrane basale [25]. Tout au long de leur différenciation, les spermatogonies issues d’une même génération de spermatogonies Ap restent connectées par des ponts intercellulaires après leurs divisions [23, 26].

Les spermatogonies de type B vont subir trois mitoses successives. L’ensemble de ces mitoses requiert un total de 16 jours chez l’homme et mène à la formation des spermatocytes de type 1 (ou spermatocytes primaires) [26, 27].

Les spermatocytes de type 1 sont facilement reconnaissables. Ce sont de grandes cellules ovalaires au noyau arrondi, contenant plusieurs nucléoles. Ces cellules contiennent une grande quantité d’ADN et sont prêtes à entrer dans les phases de divisions méiotiques. Les cellules de ce stade sont en phase S (phase de synthèse d’ADN). C’est leur stade de différenciation / maturation dénommée “préleptotène”.

Chez l’homme, les différentes phases de méiose durent un peu plus de 24 jours. La première phase du premier événement méiotique est la prophase. La prophase méiotique regroupe cinq stades successifs d’activités cellulaires des spermatocytes de type 1 : le stade leptotène, le stade zygotène, le stade pachytène, le stade diplotène, le stade de diacinèse (lzpd2). Chaque stade est caractérisé par la présence dans le noyau de chromosomes appariés à diverses étapes du processus de spiralisation [23].

Au stade leptotène, il y a condensation des chromosomes; au stade zygotène, la reconnaissance des chromosomes homologues (aussi appelée la synapse chromosomique); au stade pachytène, il a complétion de la synapse et échange de matériel chromosomique / recombinaison du matériel génétique hérité du père et de la mère (aussi nommé « crossing-over »); au stade diplotène, c’est la désynapse, ou le dépairage des chromosomes tout de même encore liés par le chiasmata; au stade de

6 diacinèse, les chromosomes se détachent de la membrane nucléaire et chaque chromosome est composé de deux chromatides [25].

La diacinèse est rapidement suivie de la dissolution de la membrane nucléaire, étape menant à la métaphase (phase M du cycle cellulaire où les cellules diploïdes (2N) avec 4 chromatides soeurs (4C) orientent leurs centromères pour préparer la division des noyaux et du matériel génétique).

La métaphase est suivie de l’anaphase. Phase où les cellules diploïdes (2N) avec 4 chromatides soeurs (4C) vont séparer les chromatides sœurs en faisant migrer les centromères en sens opposé vers les centrioles. Ce qui conduira éventuellement à la formation de paire de chromosomes homologues (même type de chromosome provenant de chacun des parents). C’est les débuts de la cytodiérèse (séparation des cytoplasmes).

L’anaphase est suivie de la télophase. À la télophase, il y a formation d‘une enveloppe nucléaire aux deux extrémités de la cellule, autour des chromosomes. La cytodiérèse se conclut et les chromosomes homologues se retrouvent respectivement dans une des deux cellules filles. Les cellules diploïdes (2N) avec 2 chromatides sœurs ou chromosomes homologues (2C). Les différentes organelles sont divisées en quantités égales. Chaque spermatocyte primaire donne deux spermatocytes secondaires (spermatocytes de type 2). Il est a noter que la cytocinèse est incomplète et les spermatocytes secondaires restent liés par des ponts intercellulaires [25].

Dans d’autres types cellulaires, une telle méiose conduirait les cellules au retour en interphase (phase G1) ou en quiescence (phase G0). Les cellules profiteraient de ce moment (l'interphase) pour se recharger ou pour effectuer ce pour quoi elles sont programmées (ex. synthèse d’hormones pour les cellules de Leydig). Toutefois, les spermatocytes secondaires n’en font rien et subissent rapidement une seconde division méiotique. Comme il n'y a ni duplication d'ADN ni recombinaison du matériel héréditaire, la deuxième division progresse rapidement [21] et aboutit à la répartition

7 des chromatides de chaque chromosome homologue dans des cellules haploïdes séparées. On appelle ces cellules haploïdes des spermatides. Les spermatides ont une demi-copie du génome (1N) et donc un seul chromosome de chaque type (1C) [23]. Cette seconde division méiotique ne dure que 5 heures en moyenne [23].

Les spermatides sont (avec les spermatozoïdes) les plus petites cellules de l'épithélium germinal. Elles encore étroitment liées aux cellules de Sertoli. Les spermatides générées vont entreprendre un long processus de différenciation (quelques semaines) au cours duquel elles vont progressivement devenir des spermatozoïdes. Ce processus est appelé spermiogenèse.

Les spermatides, des cellules rondes avec un noyau rond, vont se différencier pour devenir des cellules profilées ayant des régions possédant des activités spécifiques nécessaires à divers processus requis pour atteindre et féconder un ovule. Le spermatozoïde aura : une tête enlignée contenant le noyau condensé ainsi qu’une région acrosomale permettant la pénétration de la zone pellucide de l’ovule, une pièce intermédiaire qui regroupe fonctionnellement une série d’organelles, et enfin, une queue mobile qui assurera la motilité du spermatozoïde [27].

Les modifications morphologiques subies par le spermatocyte secondaire ont été divisées en différents stades successifs dont le nombre varie selon les espèces. On reconnait 8 stades chez l’homme et 19 chez le rat [27].

Malgré ce grand écart, on s’entend généralement pour différencier trois stades principaux communs à toutes les espèces. Ces stades sont la réorganisation du noyau, le développement du système acrosomique et l’assemblage des structures du flagelle [23], mais nous ne nous y attarderons pas dans ce document, car cela n’est pas pertinent dans le cadre de cette thèse. Les spermatozoïdes seront relâchés par les cellules de Sertoli lorsqu’ils auront achevé leur différenciation.

8 Il semblerait que la durée du cycle de l’épithélium séminal, ou de la spermatogenèse, soit une constante biologique indépendante de toute action hormonale et est déterminée par l’intervalle de temps qui rythme l’entrée des spermatogonies dans la spermatogenèse. Bien que l’on observe des variations individuelles considérables de la durée de ce processus, le cycle de vie moyen est de 16 à 18 jours pour les spermatogonies de type Ap, de 7.5 à 9 jours pour les spermatogonies de type B, de 23 jours pour les spermatocytes primaires, de 1 jour pour les spermatocytes secondaires et de 22.5 à 23 jours pour les spermatides [23]. Ainsi, pour passer à travers tous les cycles, la spermatogenèse requiert de 64 à 74 jours [24].

Environ 100 millions de spermatozoïdes sont produits par jour et, en moyenne, 50 à 200 millions de spermatozoïdes sont libérés par éjaculation [21]. Rappelons que l’Organisation mondiale de la santé considère qu’un homme fertile doit éjaculer au moins 40 millions de spermatozoïdes par éjaculat [21].

1.2.4 Maintien des caractéristiques sexuelles secondaires

Au moment de la puberté, la modification de la balance hormonale entraine le développement des caractéristiques sexuelles secondaires. Chez le mâle, la concentration accrue de testostérone entraine la virilisation. Celle-ci est perceptible via une poussée de croissance, l’augmentation de la taille des testicules, l’apparition des poils pubiens et faciaux, la modification du cartilage et des muscles du larynx, l’augmentation de la densité osseuse, l’accroissement de la masse musculaire et des changements comportementaux. Après la puberté, les androgènes sont particulièrement nécessaires afin de maintenir le volume des testicules, la densité osseuse et la masse musculaire [28].

Des données récentes évoquent la possibilité qu’INSL3 contribue à certains de ces mêmes rôles, notamment au maintien de la densité osseuse. INSL3 pourrait ainsi jouer d’autres rôles physiologiques à l’âge adulte, mais ceux-ci ne seront pas exposés dans

9 le présent document. Le lecteur est invité à consulter les références ci-jointes pour plus de détails [29-32].

1.3 Rôles des cellules du testicule

1.3.1 Les cellules péritubulaires myéloïdes

Le rôle apparent des cellules péritubulaires myéloïdes (PTC) est de propulser les fluides testiculaires contenant les spermatozoïdes immobiles vers le rete testis [33] et de produire différentes composantes de la membrane basale. Les PTC jouent aussi un rôle essentiel dans le développement et la différenciation des testicules ainsi que dans le maintien de la spermatogenèse [34].

L’organisation des cellules péritubulaires myéloïdes est spécifique à chaque espèce. Chez les petits rongeurs (souris, rat et hamster), les PTC forment une monocouche autour des cellules de Sertoli et de la lame basale alors que chez l’homme, elles forment plusieurs couches périphériques [35, 36].

Les PTC sont morphologiquement semblables aux fibroblastes. Cependant, elles expriment à la fois des marqueurs de cellules fibroblastiques et des marqueurs de cellules musculaires lisses [37]. Les PTC expriment, entre autres, le récepteur aux androgènes [38], comme le font également les cellules de Sertoli, les cellules de Leydig [38]. Les dernières données confirment que les cellules germinales n’expriment pas le récepteur aux androgènes [39-41].

1.3.2 Cellules de Sertoli

Lors du développement embryonnaire et avant la formation des testicules foetaux (jpc 11 chez la souris et jpc 10 chez le rat) il est possible d’observer des cellules souches mésenchymateuses non stéroïdogéniques dans le primordium gonadique [42]. De ces cellules, émerge une population de cellules SF1-positives indifférenciées qui donnera naissance, entre autres aux cellules de Sertoli [43]. Les cellules de Sertoli sont les premières cellules reconnaissables du testicule en développement [42]. Les cellules de

10 Sertoli sont de grandes cellules pyramidales qui s’étendent radialement de la membrane basale vers la lumière du tubule séminifère. Chaque cellule de Sertoli est connectée aux cellules de Sertoli adjacentes par des jonctions serrées [44]. Ces jonctions serrées sont une composante de la barrière hématotesticulaire qui isole les cellules germinales en développement du reste du corps [4, 21].

Au cours du développement fœtal, les cellules de Sertoli organisent la formation des cordons testiculaires (qui évolueront et deviendront des tubules séminifères) et le maintien des cellules germinales. À la même période, les cellules de Sertoli stimulent la différenciation des cellules de Leydig et des PTC via la sécrétion de différentes hormones (voir les sections sur ces types cellulaires pour plus de détails) [45].

De plus, durant cette même période, tel que mentionné précédemment, les cellules de Sertoli contribuent aussi à la masculinisation des organes génitaux primaires en sécrétant, entre autres, l’AMH qui induit la régression des canaux de Müller [45, 46].

Contrairement aux cellules de Leydig, la population de cellules de Sertoli active à la puberté est la même que celle observée durant le développement fœtal. Ce qui implique que cette dernière est, contrairement aux cellules de Leydig, maintenue tout au long de l’enfance (voir section 1.3.4 sur les Leydig).

Seules les cellules de Sertoli immatures prolifèrent et donc le nombre final de ces cellules est déterminé avant la puberté [47]. Le nombre de cellules de Sertoli déterminera le nombre de spermatozoïdes que peut produire le testicule puisque chaque cellule de Sertoli peut supporter un nombre fini de cellules germinales à travers leur développement en spermatozoïdes [48].

À partir de la puberté, les cellules de Sertoli contribuent au bon fonctionnement de la spermatogenèse en développant la barrière hématotesticulaire et en régulant les échanges entre le système vasculaire et la lumière des tubules séminifères [48]. Elles ont, à ce moment, perdu leur capacité à proliférer.

Les cellules de Sertoli produiront, dès lors, diverses hormones telles que l’hormone anti-Müllerian (AMH), l’inhibine et l’activine, la protéine liant les androgènes (androgen binding protein (ABP)) ainsi que de l’estradiol pour orchestrer et appuyer la spermatogenèse. Ces hormones agiront localement ou en périphérie afin de contrôler, entre autres, la spermatogenèse. Ces hormones agiront de concert avec des hormones produites par les Leydig et contribueront à maintenir la communication entre les gonades (testicules), l’hypothalamus et l’hypophyse [49].

Le rôle des cellules de Sertoli ne sera pas discuté davantage, car aucun de mes résultats ne m’a permis de mettre en évidence un rôle direct ou indirect des cellules de Sertoli dans l’étiologie de la perturbation de l’expression d’Insl3/INSL3 induite par certains perturbateurs endocriniens à l’étude.

1.3.3 Macrophages

Les macrophages (et/ou monocytes) sont présents dans le testicule fœtal en développement [50]. Leur apparition semble concorder avec celles des cellules de Leydig. De plus, la population de macrophages augmente au même rythme et dans les mêmes proportions que celle des cellules de Leydig, ce qui évoque la possibilité d’un appariement fonctionnel entre ces deux types cellulaires [50, 51]. Cette hypothèse est d’autant plus plausible lorsqu’on considère que la population de macrophages croit juste avant la puberté [52], comme le fait la population des cellules de Leydig. À l’âge adulte, les macrophages occupent 15 à 20 % de l’espace interstitiel [52].

De plus, les macrophages semblent moduler l’activité des cellules de Leydig via de nombreux contacts directs avec ces dernières. Les travaux de Miller (1983) et Hutson (1992) menés chez le rat ont démontré l’existence d’excroissances de macrophages permettant un contact cellule-cellule avec les cellules de Leydig [53, 54]. Ces excroissances apparaissent de 20 à 30 jours après la naissance, soit juste avant le pic de testostérone survenant à la puberté [54]. De plus, les travaux combinés de Nes (2000) et de Yee et Hutson (1985) semblent indiquer que les macrophages sont capables de

12 stimuler la production de testostérone en produisant du 25-hydroxycholestérol (25HC) et en transférant celui-ci aux cellules de Leydig [55, 56]. Le 25HC sécrété est capable de pénétrer les mitochondries des cellules de Leydig sans avoir recours à la machinerie de transport du cholestérol. Or, le transport du cholestérol à la membrane interne de la mitochondrie est considérée comme l’étape limitante de la synthèse de testostérone par les cellules de Leydig [57]. La diffusion du 25HC permet donc d’éviter cet étau et d’activer directement P450SCC (CYP11A1). Cette activité cholestérol 25-hydroxylase (Ch25H) n’a été décrite qu’au niveau des macrophages présents dans le testicule [58]. De plus, la production de testostérone par les cellules de Leydig inhibe la production de 25HC par les macrophages testiculaires ce qui semble démontrer une boucle de rétroaction négative [50]. Cependant, les autres activités paracrines des macrophages des testicules (oxyde nitrique (NO), TNFα et l’interleukine 1 (IL-1)) ont des effets inhibiteurs sur la production de testostérone par les cellules de Leydig [59, 60].

L’auteur rapporte que l’on observe les macrophages au niveau de l’interstice seulement quand le testicule de rat est dit sain ou normal [61]. Les résultats de Gaytan et al (1994) confirment cette observation en démontrant que les macrophages au niveau des testicules du rat sont nécessaires au développement des cellules de Leydig et à la réponse des cellules de Leydig à LH durant la période de maturation postnatale [62]. Ils démontrent qu’en absence de macrophages (suite à leur élimination) les cellules de Leydig ne repeuplent pas le testicule alors qu’en présence de macrophages les cellules de Leydig ne tardent pas à repeupler le testicule [62].

1.3.4 Cellules de Leydig

1.3.4.1 Introduction à la maturation des cellules de Leydig

Tel que mentionné auparavant à la section 1.2, les cellules de Leydig sont essentielles à l’acquisition des phénotypes masculins; durant le développement fœtal, les cellules de Leydig jouent un rôle central dans la différenciation et l’acquisition des phénotypes masculins primaires; durant la puberté leurs activités mènent à l’adoption des caractéristiques secondaires masculines et à l’induction de la spermatogenèse.

Les cellules de Leydig présentes à partir de la puberté ne sont pas les cellules de Leydig présentes durant le développement fœtal, et ce, en dépit de plusieurs caractéristiques observées (localisation, apparence similaire, fonction hormonale et expression génique similaire) parce que la majorité de la population de cellules de Leydig observée à l’âge fœtal meurt peu après la naissance de l’individu. Ainsi, on distingue la population de cellules de Leydig observée durant le stade fœtal de la population de celle observée à partir de la puberté. Les cellules observées durant le développement fœtal portent le nom de population fœtale ou cellules de Leydig fœtales (FLC) et celles observées à partir de la puberté portent le nom de population adulte ou cellules de Leydig adultes (ALC).

À l’intérieur même de ces populations, il est possible d’observer des cellules aux phénotypes différents. Ces différents phénotypes sont dus à la présence de cellules n’ayant pas complété leur différenciation/maturation. Ainsi, il est possible de distinguer les cellules de Leydig de la population fœtale dites immatures (IFLC) des cellules dites matures (MFLC). De même, il est possible de distinguer les cellules de Leydig de la population adulte dites immatures (IALC) des cellules dites matures (MALC). Les cellules des différents stades ne coexistent pas tout au long de leur vie, la présence des différents stades de maturation est davantage liée à l’apparition et à la différenciation progressive de cellules de Leydig dites souches (SLC).

De manière générale, les cellules de Leydig matures des populations adultes et fœtales sont très similaires. Les cellules de Leydig matures de ces deux populations présentent des caractéristiques typiques aux cellules stéroïdogéniques telles qu’un appareil de Golgi développé, un réticulum endoplasmique lisse développé, des mitochondries de type tubulovésiculaire et de nombreuses gouttelettes lipidiques [63]. L’appareil de Golgi des FLC est toutefois un peu moins développé que celui des ALC.

Les principales différences entre les cellules de Leydig matures de la population fœtale par rapport à celle de la population adulte sont d’une part leur capacité stéroïdogénique

14 et d’autre part le principal produit de leur stéroïdogenèse, l'androstènedione étant celui des FLC alors que la testostérone est celui des ALC.

C’est donc dire que les FLC ne produisent initialement pas de testostérone puisque’elles n’expriment pas la 17β-Hsd type 3/Hsd17b3 (enzyme nécessaire à la conversion de l'androstènedione en testostérone) (voir section 1.3.4.5). À ce moment, la testostérone provient de la conversion l'androstènedione par les cellules de Sertoli qui elles expriment la Hsd17b3 [64].

La différenciation de la population foetale de cellules de Leydig (FLC) est complexe et séquentielle. Cette différenciation serait dirigée à la fois par l’action paracrine des cellules de Sertoli et par l’action paracrine/autocrine des cellules de Leydig. La plupart des observations faites sur la différenciation des cellules de Leydig proviennent d’études menées chez le rat, et plus souvent sur le rat adulte. Quelques observations plus précises découlent d’observations menées chez la souris mais celles-ci sont moins nombreuses.

On peut observer au moins trois populations de cellules de Leydig (cellules stéroïdogéniquement actives) durant le développement fœtal. Ces différentes populations correspondent en fait à différents stades de différenciation des mêmes cellules. Ainsi, des cellules souches sans capacité stéroïdogénique se différencieraient en cellules de Leydig progénitrices/précurseures, qui elles, évolueraient vers des cellules immatures avant d’acquérir leur maturité puis de sombrer et de disparaitre par apoptose ou involution [65].

Les paragraphes suivants serviront à décrire la maturation des cellules de Leydig de chacune des populations. Les données seront présentées de sorte à mettre en évidence la période durant laquelle ce type de cellules est observable, leur phénotype morphologique, leur phénotype immunohistochimique, leur sécrétion/production caractéristique et leur réponse à certains stimuli.

15 1.3.4.2 Les cellules de Leydig au stade souche (SLC)

L’origine des cellules de Leydig fœtales (FLC) est encore un peu incertaine. Toutefois, de plus en plus d’auteurs suggèrent que les cellules de Leydig fœtales résultent de la différenciation de cellules souches provenant du mésenchyme, plus précisément de l’épithélium coelomique et/ou du mésonéphros [65]. Il semblerait que les cellules donnant naissance aux cellules de Leydig fœtales accompagnent les cellules donnant naissance aux cellules de Sertoli [66-69].

Lors du développement embryonnaire et avant la formation des testicules foetaux (jpc 11 chez la souris et jpc 10 chez le rat) il est possible d’observer des cellules souches mésenchymateuses non-stéroïdogéniques dans le primordium gonadique [70]. Parmi ces cellules on retrouve aussi des cellules germinales primordiales provenant de l’intestin et des cellules somatiques progénitrices non caractérisées qui proviennent, entre autres, de l’épithélium coelomique [71-73]. C’est de ces cellules qu’émergeront les cellules souches qui donneront naissance aux futures FLC.

La différenciation des cellules de Leydig dites souches s’enclencherait suite à la différenciation des cellules de Sertoli puisque près de 24 heures après l’apparition des cellules de Sertoli, on peut observer des FLC stéroïdogéniquement actives dans l’interstitium du testicule [65, 74, 75] et qu’il a été démontré que certaines hormones produites par les cellules de Sertoli sont essentielles à l’émergence et à la différenciation des cellules de Leydig du stade fœtal [63, 76, 77]. Ce mélange de cellules somatiques du primordium gonadique exprimerait divers facteurs de transcription dont le facteur stéroïdogénique 1 (SF1, ou NR5A1), le facteur tumeur de Wilms 1 (WT1), le facteur de transcription GATA4 et le facteur Lim homéobox 9 (LHX9) [78-80].

À ce stade, ces cellules SF1-positives ne possèdent aucune activité stéroïdogénique. De ce mélange de cellules SF1-positives émergeraient d’abord les cellules de Sertoli puis les cellules de Leydig foetales [43]. Ainsi, les cellules de Sertoli se différencient et entrainent la différenciation subséquente des cellules de Leydig via la sécrétion de deux

16 molécules de signalisation, les protéines issues du gène « desert hedgehog » (DHH) [75] et du gène « platelet-derived growth factor a » (PDGFA) [76].

Certaines cellules SF1-positives commises à devenir des Leydig répondraient à la présence de DHH via le produit du gène Patched-1, le récepteur PTCH1, exprimé à leur surface. L’activation du récepteur PTCH1 par DHH entraine les cellules dans leur premier stade de différenciation pour devenir des cellules progénitrices/précurseures des Leydig fœtales [75]. En contrepartie, certaines cellules SF1-positives commises à devenir des Leydig demeuraient des cellules souches en activant la voie de signalisation NOTCH qui inhibe l’action de DHH et maintient les cellules au stade de cellules souches [43, 81].

Les souris transgéniques créées par Yao et al (2002) et Barsoum et al (2009) ont confirmé que c’est la signalisation induite par DHH à travers l’activation de PTCH1 qui induit la différenciation de cellules SF1-positives en cellules de Leydig précurseurs/progénitrices. Ils ont démontré que l’activation de cette voie dans l'ovaire foetal induit la transformation des cellules somatiques SF1-positives en FLC fonctionnelles. Cette voie est normalement inerte dans l’ovaire fœtal en raison de l’absence de ligand DHH. Les FLC ainsi générées produisent des androgènes et l’hormone INSL3, et causent la descente partielle des ovaires ainsi qu’une virilisation des embryons femelles, et ce, sans la présence de cellules de Sertoli ou de cellules germinales [75, 77, 82-84].

De plus, il a été démontré que les souris déficientes en DHH (activité ou expression) ont un problème de différenciation des FLC qui mène à une diminution de la production d’androgènes. Cette diminution peut aller jusqu’à causer un pseudohermaphrodisme ainsi qu’une dysgénésie gonadique [85, 86].

Toutefois, les données obtenues par Yao et al (2002) suggèrent aussi la présence d’une seconde voie de signalisation qui permet la différenciation de cellules SF1-positives en cellules de Leydig précurseurs/progénitrices en absence de DHH [75].

Pdgfa et Pdgfra (platelet-derived growth factor receptor a) sont fortement exprimées dans les gonades XY et beaucoup moins dans les gonades XX [76]. Les souris mâles Pdgfra-/- présente un problème de formation des cordons testiculaires et de l’espace interstitiel. L’étude plus poussée du phénotype des cellules de Leydig des souris mâles Pdgfra-/- démontre que l’absence de PDGFRA réduit l’expression de Ptch1 et ainsi réduit donc ainsi significativement la prolifération de cellules de Leydig durant le développement fœtal [76]. Il est intéressant de mentionner que la population de cellules de Leydig adulte est, elle aussi, sensible à l’activité de PDGFA/PDGFRA. Toutefois, la prolifération des cellules de Leydig adultes seraient davantage influencée par l’activité du ligand (PDGFA) que celle de son récepteur (PDGFRA) [76].

1.3.4.3 Les cellules de Leydig fœtal au stade précurseur/progéniteur (PFLC)

Chez la majorité des mammifères, les FLC commencent à apparaître dans le mésenchyme du testicule en développement immédiatement après la formation des cordons testiculaires (jour post-coïtal (jpc) 12.5 chez la souris, 14.5 chez le rat et de sept à huit semaines de gestation chez l’homme) [87-89].

D’un point de vue morphologique, les cellules souches donnant naissance aux cellules du premier stade de différenciation des FLC se transforment. Les cellules souches (SLC) passent d’une forme fusiforme à une forme ronde ou ovoïde possédant un noyau rond bien visible. Leurs caractéristiques de cellules stéroïdogéniques (réticulum endoplasmique lisse abondant, mitochondries tubulovésiculaire et nombreuses gouttelettes lipidiques) croient en volume et en importance [88].

D’un point de vue biochimique/histochimique, l’expression de la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (3β-HSD) par les cellules de Leydig fœtales marque l’arrivée des cellules au stade de cellules de Leydig précurseures/progénitrices [90].

Les données in vivo démontrent que cette différenciation initiale est indépendante des gonadotrophines, puisque la synthèse de LH débute au jour 16.5 post-coïtum chez la

18 souris [91]. D’autres données ont permis de démontrer que l’ACTH (adrenocorticotrophic hormone) n’est également pas nécessaire à la différenciation initiale des cellules de Leydig durant le développement fœtal chez la souris [91, 92].

1.3.4.4 Les cellules de Leydig fœtal au stade immature (IFLC)

Tel que mentionné ci-haut, quelques 24 heures après la différenciation des cellules de Sertoli, il est possible d’observer les premières FLC stéroïdogéniquement actives du testicule dans l’espace interstitiel [65, 75, 84].

Le nombre de FLC au stade immature augmente considérablement entre jpc 12.5 et jpc 15.5 (souris), et ce, en absence de division mitotique [93]. Ceci suggère que l’expansion de la population de FLC proviendrait de la différenciation de cellules SF1-positives et/ou de l’incorporation des nouvelles cellules progénitrices provenant du mésonéphros [68] et/ou de l’épithélium coelomique [67, 94]. Les FLC immatures sont essentiellement fusiformes.

Les FLC immatures et les cellules progénitrices expriment deux gènes qui sont essentiels pour la communication avec les cellules de Sertoli et la différenciation subséquente des cellules FLC immatures. Les FLC immatures expriment le gène Ptch1, qui code pour le récepteur au DHH, et le gène Pdgfra, qui code pour le récepteur au PDGFA [75, 76, 84]. L’expression de ces gènes permettra aux FLC immatures de répondre/communiquer avec les cellules de Sertoli via ces deux peptides produits par ces dernières.

Les FLC immatures sont positives pour la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (3β- HSD) mais négatives pour la 17β-HSD type 3 / HSD17B3 (enzyme nécessaire à la conversion de l'androstènedione en testostérone) [95, 96]. Il en résulte donc une production stéroïdogénique se limitant à l’androstènedione [64]. À ce stade, les FLC produisent aussi de l’INSL3 [97].

19 Tel que mentionné auparavant, les cellules progénitrices des FLC se différencient en absence de LH; les FLC immatures fonctionnelles apparaissent au moins 48 heures avant même de voir l’expression de LHCGR dans les cellules interstitielles [92, 98].

Il semble en être de même pour les FLC immatures (autant celles humaines que celles de rongeurs), du moins initialement, puisque la production de testostérone est normale en l’absence de LH et/ou de son récepteur ainsi qu’en l’absence de l’hormone ACTH et/ou de son récepteur [91, 92].

Néanmoins, les données in vivo démontrent qu’au cours de leur maturation les FLC acquerront une sensibilité à ces hormones puisque l’absence d’hypophyse induit une diminution marquée de la production de testostérone en fin de gestation [91].

1.3.4.5 Les cellules de Leydig fœtal au stade mature (MFLC)

Les FLC matures sont observables à partir du jour post-coïtal (jpc) 14.5 chez le rat et la différenciation complète des cellules est considérée comme terminée au 16e jpc [90].

Dans les derniers jours de développement fœtal (du jpc 16.5 au jpc 21.0), la population de FLC explose et passe de 25 000 cellules par testicule à 1,2 million de cellules par testicule [70]. Rappelons que les FLC matures n’ont pas d’activité mitotique [90] et que par conséquent cette augmentation est principalement due à la différenciation de cellules progénitrices.

Le passage des FLC immatures vers le stade de FLC mature est caractérisé par la production d’INSL3, l’expression du récepteur Lhcgr ainsi que par l’expression accrue de Nr5a1 à partir du jpc 15.5 [63].

Le nombre grandissant de FLC matures combiné à leur activité stéroïdogénique accrue résulte en une production de testostérone qui atteint son apogée au jpc 18.5 chez le rat, avant même que la LH ne devienne détectable dans le plasma (au jpc 19.5). Un second

20 maximum de production de testostérone est observé au jpc 21.5 [70], après que l’activité stéroïdogénique des FLC soit devenue dépendante de la LH [90, 99].

À ce moment, les FLC des rongeurs commencent à exprimer LHCGR et leur stéroïdogenèse devient sensible à l’induction par la LH. La sensibilisation est progressive et peu avant la naissance, la synthèse des stéroïdes par les FLC est devenue dépendante de l’induction par la LH [100, 101]. La production d’hormones stéroïdiennes par les FLC est désormais assujettie à la LH et modulée par l’ACTH alors que les FLC leur étaient initialement insensibles. Le lien direct est facilement observable en absence d’hypophyse. Cette condition induit une diminution marquée de la production de testostérone en fin de gestation [100, 102, 103].

1.3.4.6 Extinction des FLC

Les observations faites chez le rat démontrent que le nombre de cellules de Leydig fœtales croit du moment de leur apparition dans l’espace interstitiel jusqu’à la naissance de l’individu [65, 99]. Peu après la naissance (environ 14 jours chez le rat), les FLC subissent une dédifférenciation puis meurt par apoptose, la présence de FLC dans le testicule s’estompe rapidement [99, 104] jusqu’à ne plus être perceptible. Les FLC sont essentiellement absentes du testicule adulte; celles qui persistent ne sont plus capables de synthétiser de stéroïdes et ne se transformeront pas en cellules de Leydig de type adulte [105].

1.3.4.7 Introduction à la maturation des cellules de Leydig de la population adulte

La différenciation de la population adulte de cellules de Leydig (ALC) est complexe et séquentielle, tout autant que peut l’être la différenciation de la population fœtale de cellules de Leydig (FLC). La différenciation de la population adulte de cellules de Leydig serait dirigée, elle aussi, à la fois par l’action paracrine des cellules de Sertoli et par l’action paracrine/autocrine des cellules de Leydig. La plupart des observations

21 faites sur la différenciation des cellules de Leydig adultes proviennent d’études menées chez le rat adulte.

Les cellules de Leydig pleinement fonctionnelles ou matures découlent de l’évolution et de la différenciation séquentielle de cellules spécialisées. Les futures cellules de Leydig matures proviennent de la différenciation initiale des cellules de Leydig dites souches (SLC), qui, elles-mêmes, seraient issues de la différenciation de cellules de type fibroblastique (ou cellules mésenchymateuses) principalement localisées en périphérie des tubules du testicule chez l’humain et la souris. Les données semblent démontrer que les mammifères partagent tous les étapes de différenciation séquentielle menant à la formation des cellules de Leydig adultes [106, 107].

Une partie de ces cellules souches évoluerait pour se différencier en cellules de Leydig dites précurseures/progénitrices, qui elles-mêmes, passeraient par un stade immature avant de devenir les cellules de Leydig matures pleinement fonctionnelles. Les cellules de chaque stade de différenciation sont reconnaissables à l’expression de gènes spécifiques.

La population adulte de cellules de Leydig (ALC) se différencie immédiatement avant la puberté [104, 107] en quatre étapes [108] bien définies (revue par Chen et al (2010)) [109].

1.3.4.8 Les cellules de Leydig adultes (ALC) au stade souche (SLC)

Certaines évidences tendent à démontrer que des cellules mésenchymateuses indifférenciées, du même type que durant le développement fœtal, pourraient aussi servir de cellules de Leydig souches et donner naissance aux précurseures des ALC à la puberté [106]. Cette idée d’une ontogénie partagée pour les deux populations émerge des similitudes au niveau de la régulation de la différenciation des cellules souches de ces deux populations durant leur développement respectif et découle des observations faites lors des études sur l’impact de l’invalidation de l’expression des gènes Dhh et Pdgfa ou de leur récepteur réciproque (Patched1 et Pdgfra) chez la souris.

22 L’invalidation de ces gènes prévient autant la formation des FLC que celle des ALC et induit un phénotype de pseudohermaphrodisme avec des organes génitaux externes féminisés [76, 77, 110]. Un phénotype similaire est observé chez les hommes 46 XY exprimant un gène DHH muté [86]. Toutefois, la population de cellules de Leydig souches postnatale ne dérive ni des quelques FLC qui sont demeurées dans le testicule après la naissance, ni de la différenciation cellules mésenchymateuses indifférenciées. En fait, les données récentes obtenues par Kilcoyne et al (2014) démontrent que les SLC donnant naissance aux ALC sont présentes dans le testicule au côté des FLC sous formes de cellules souches exprimant à la fois le récepteur nucléaire COUP- TFII/NR2F2 (COUP transcription factor 2 / nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2) et le récepteur aux androgènes, deux récepteurs nucléaires exprimés par les cellules de Leydig adultes et importants à leur métabolisme. Ces cellules ont été identifiées dans plusieurs espèces de mammifères étudiés dont l’homme, le ouistiti et les rongeurs) [111].

Chez le rat, les SLC sont facilement observables entre les jours postnataux (pn) 7 à 13 [90, 112]. Durant cette période, la population de SLC croit principalement par division mitotique [70]. Les SLC sont filiformes et collées aux parois des tubules [112].

Les SLC sont des cellules très peu différenciées capables de s'autorenouveler indéfiniment ou de se différencier vers des cellules stéroïdogéniques [108, 111]. Lors de cette différenciation initiale, l’expansion du réticulum endoplasmique lisse (SER) et des mitochondries s’amorce dans un pôle de la cellule puis se répand rapidement à l’ensemble de la cellule [113].

Les cellules qui choisiront la voie de la différenciation subséquente donneront naissance aux cellules de Leydig dites précurseures/progénitrices (PLC) qui prolifèreront et continueront leur différenciation vers le stade de cellules de Leydig immature (ILC). Les autres maintiendront une population de SLC indifférenciée [111, 114, 115].

23 Au stade de SLC, les cellules n’expriment aucun marqueur spécifique de cellules de Leydig; elles sont négatives pour la 3β-HSD et le récepteur LHCGR [112]. Toutefois, elles sont positives pour PDGFRA, c-kit (Stem cell factor (SCF) receptor), « leukemia inhibitory factor receptor » (LIF-R) [114, 115], AR et COUP-TFII [111], ainsi que le marqueur de pluripotence (POU domain class 5 transcription factor 1 (POU5F1) (octamer binding transcription factor involved in regulation of pluripotency 3/4) [106] et le facteur de transcription GATA4 qui est impliqué dans le développement des cellules de Leydig [112]. Les SLC ne sécrètent aucune hormone typique des cellules de Leydig.

1.3.4.9 Les cellules de Leydig adulte au stade précurseur/progéniteur (PALC)

Il semblerait que les SLC nécessitent un apport en androgène pour entreprendre leur différenciation en cellules de Leydig précurseures/progénitrices (PALC) [116]. En effet, l’absence d’un récepteur aux androgènes fonctionnel chez les Leydig entraine une réduction du nombre de cellules de Leydig observables à l’âge adulte. Il a été suggéré que cette « dose » initiale d’androgènes soit sécrétée par des FLC demeurant dans le testicule après la dégénérescence qui suit la parturition [90] ou par des cellules PTC PDGFRA-positives exprimant très faiblement des gènes codant pour des enzymes stéroïdogéniques et produisant de la progestérone comme produit final [117]. L’activité stéroïdogénique de ces PTC PDGFRA-positives répond à l’AMPc de la même manière que des ALC matures, donc répondent potentiellement à la LH [117]. Les récents résultats de Landreh et al (2014) confirment cette hypothèse puisque les SLC isolées de testicules humains répondent à « platelet-derived growth factor (PDGF)-BB » (un agoniste de PDGFRA) en induisant la transcription de NR5A1, STAR, P450SCC/CYP11A1 et 3β-HSD, et que ces mêmes cellules produisent de la progestérone en présence de forskolin, un activateur des adénylate cyclases [106]. Ces résultats ne sont pas en contradiction à ceux de Kilcoyne et al (2014) qui suggèrent que les cellules « originelles » de la population adulte de Leydig sont présentes durant le développement fœtal et demeurent dans le testicule sous forme de cellules progénitrices en latence [111].

24 Chez le rat, le jour postnatal 14 voit l’émergence des PALC; les SLC qui un jour auparavant n’exprimaient aucun marqueur de gènes liés aux cellules de Leydig, expriment maintenant la 3β-Hsd. Cette transformation indique que ces cellules se sont engagées dans la lignée des cellules de Leydig donnant l’origine aux PALC [108]. Les PALC demeurent observables entre les jours postnataux 14 à 28 [104]. Les PALC sont initialement des cellules fusiformes indiscernables des SLC. On doit avoir recours à l’immunohistochimie pour les discerner.

Les PALC conservent leur capacité de proliférer par mitose [118, 119]. Cela pourrait être lié à l’expression de certains gènes exprimés aussi par les SLC (Pdgfra, Lifr, c-kit) lesquels pourraient être nécessaires à la prolifération [118].

À mesure que leur différenciation progresse, les PALC modifient graduellement leur morphologie; elles deviennent plus grosses, plus rondes et perdent leur capacité à proliférer [107]. Les PALC quittent leur position péritubulaire et s’établissent plus profondément dans l'interstice du testicule [104].

Le passage des SLC au stade de PALC est marqué par l’expression de gènes caractéristiques de la lignée cellulaire des Leydig. Au stade de PALC, les cellules se mettent à exprimer des gènes codant pour certaines enzymes stéroïdogéniques dont la 3β-Hsd, la P450scc/Cyp11a1 et la P450c17. Elles commencent aussi à produire des vésicules lipidiques [90].

Les PLC sont capables de produire des androgènes en très faible, voire négligeable quantité [90]. Toutefois, en absence de HSD17B3, elles ne produisent pas de testostérone mais son métabolite intermédiaire, l’androstènedione, qui est lui-même converti en androstérone (DHEA) par les enzymes 5α-réductase et HSD-3α [64, 120].

Cette production d’androgènes est indépendante de la stimulation par la LH puisque les PALC expriment une forme non fonctionnelle du récepteur LHCGR. Ce dernier est composé uniquement du domaine extracellulaire [121, 122]. De plus, l’invalidation du

25 gène codant pour ce récepteur chez la souris n’affecte pas la différenciation des cellules de Leydig au stade de PALC [92].

Les PALC demeurent capables de proliférer par mitose. Toutefois, il a été démontré que leur prolifération est altérée par la présence d’AMH ou d’estradiol [104, 123, 124].

1.3.4.10 Les cellules de Leydig adulte au stade immature (IALC)

Chez le rat, les IALC sont observables des jours postnataux 28 à 56 [107]. La différenciation des PALC en IALC requiert l’activité d’androgènes et de LH [90].

Lors de leur passage au stade d’IALC, les cellules accroissent considérablement leur cytoplasme, leurs réticulums endoplasmiques lisses, leurs nombres de mitochondries et leurs nombres de gouttelettes lipidiques de grandes tailles [105, 107]. Les IALC conserveraient la capacité de se diviser une dernière fois entre les jours 28 et 56 pn [70].

Les IALC sont positives pour l’enzyme Hsd11b1. L’expression de cette enzyme permet de les distinguer des cellules des stades précédents qui pourraient subsister puisque ces autres cellules (SLC et PALC) n’expriment pas cette enzyme. Il en est de même pour les quelques FLC matures qui pourraient subsister [105, 125, 126]. Les IALC expriment aussi davantage les gènes codant pour les enzymes 5α-Réductase et HSD- 3α. Cette expression élevée est un autre élément les distinguant IALC des cellules d’autres stades présentes et des ALC matures (MALC) [63, 123].

De plus, les niveaux d’expression des gènes codant pour les enzymes P450SCC/CYP11A1, P450C17/CYP17A1, HSD3B1 et ceux des récepteurs AR et LHCGR sont plus élevés dans les IALC. Il en résulte une augmentation de la stéroïdogenèse (revue par Teerds et Huhtaniemi (2015))[63, 123].

Cependant, la testostérone n’est pas le principal stéroïde produit par les IALC puisque l’enzyme HSD17B3 n’augmente pas proportionnellement aux autres enzymes et que

26 les enzymes 5α-réductase et HSD-3α sont, elles, fortement exprimées [63]. La testostérone produite est donc convertie en 5α-androstane-3α-17β-diol (3αDIOL) et en androstènediol. Ces deux androgènes sont les principaux produits des IALC, et ce, jusqu’au 36e jour postnatal, moment où l’expression de l’enzyme HSD17B3 augmente à son tour [63].

1.3.4.11 Les cellules de Leydig adulte au stade mature (MALC)

La dernière étape de la différenciation des ALC est la transformation des IALC en MALC. Les IALC subissent une dernière division avant que les caractéristiques des MALC ne commencent à apparaitre autour du jour postnatal 56 chez le rat [70].

À ce moment, la taille moyenne des cellules croit encore [105]. L’expansion de volume est accompagnée ou engendrée par une expansion du volume du réticulum endoplasmique lisse (SER) [107] et une diminution dans la taille et le nombre de gouttelettes lipidiques [127].

Les cellules de Leydig adultes matures ne se divisent plus [63]. À ce stade, autour du jour postnatal 56, on compte près de 25 millions de MALC par testicule chez le rat [128].

Le niveau d’expression de Hds17b3 augmente lors de la transition de IALC à MALC alors que les niveaux des enzymes SRD5A (5α-réductase) et HSD-3α (HSD3A) diminuent [63, 123].

L’activité stéroïdogénique des MALC est accrue. L’augmentation du volume du SER et le changement de niveau d’expression des enzymes HSD17B3, 5α-réductase et HSD-3α provoquent une modification de l’équilibre dynamique globale de la stéroïdogenèse chez les MALC; alors que les IALC sécrètent majoritairement du 5α- androstane-3α-17β-diol (3αDIOL) et de l’androstènediol, les MALC, elles, sécrètent de la testostérone [63, 123].

27 Les niveaux de récepteur LHCGR augmentent dans les cellules au stade MALC autour du jour 56e jour postnatal chez le rat [129]. Cette augmentation rend les cellules plus sensibles à la LH. En comparaison, la production de testostérone par les MALC âgées de 90 jours est 5 fois supérieure à celle des IALC âgées de 35 jours et 150 fois supérieure à celle des PALC âgées de 21 jours [130].

Il a été démontré que les cellules de Leydig AR-/y adulte (-/y représente ici une invalidation génique conditionnelle) [131] ne semblent pas capables de compléter le processus de maturation. Chez les souris adultes au génotype Leydig AR-/y, le taux de testostérone circulant atteint difficilement 10 % des niveaux mesurés chez les individus de type sauvage et le niveau de LH est fortement augmenté [39, 132]. De plus, le profil génique des cellules de Leydig AR-/y adulte démontre une réduction de l’expression de la 17β-Hsd, de la 17,20-lyase et d’Insl3. Ainsi, il semble que la maturation complète des cellules de Leydig et l’obtention de la pleine capacité stéroïdogénique soient dépendantes du bon fonctionnement (expression adéquate et activité normale) du récepteur aux androgènes et à l’hormone lutéinisante.

1.3.4.12 Potentiel de régénération des ALC

Une grande partie des études qui ont permis de mieux comprendre le processus de différenciation/maturation des cellules de Leydig adulte a été réalisée à l’aide du sulphonate d’éthylène de diméthyle (EDS), un réactif toxique chez le rat affectant spécifiquement les cellules de Leydig stéroïdogéniques mais pas les cellules précurseures mésenchymateuses [133]. L’exposition des rats à l’EDS cause la dégénérescence des cellules de Leydig adultes en trois jours.

En l’absence de cellules de Leydig, la concentration circulante de testostérone diminue et les concentrations de FSH et de LH augmentent. De plus, on observe une perte de fertilité ainsi qu’une diminution marquée de la taille des testicules, des épididymes, des vésicules séminales et de la prostate [134].

28 Après une longue absence de 21 jours, une nouvelle population de cellules de Leydig émerge. Cette nouvelle population de cellules de Leydig adulte semble se différencier à partir de cellules PDGFRA-positives [111, 117].

Selon les données de Jackson (1986), la différenciation de ces cellules en cellules de Leydig adultes matures requiert un minimum de 28 jours chez le rat. Les cellules passent par tous les stades de maturation précédemment mentionnés (SLC, PALC, IALC et MALC) [135]. La maturation de ces cellules entraine progressivement l’augmentation des niveaux circulant de testostérone jusqu’au retour aux niveaux normaux de T, de FSH et de LH [136]. Ainsi, la population d’ALC est complètement régénérée sept semaines après leur éradication par l’EDS [137].

Il est à noter que la différenciation / l’émergence d’une nouvelle population de cellules de Leydig adulte est favorisée par l’action de l’hormone chorionique humaine (hCG) et de la LH exogène [63] et que la présence/activité des macrophages testiculaires est requise (du moins chez le rat) puisque la régénération de la population d’ALC n’a pas lieu si les macrophages testiculaires sont éliminés [50].

1.3.4.13 Les cellules de Leydig chez l’homme

Chez l’homme, les étapes de différenciation semblent être sensiblement les mêmes (autant la population fœtale que celle adulte) et correspondent au niveau de développement de l’individu (les marqueurs temporels sont légèrement différents) [43, 99]. Chez l’homme, les cellules précurseures de FLC deviennent identifiables durant la 8e semaine de gestation, alors que la testostérone est détectée chez le foetus entre la 6e et la 7e semaine de gestation [70]. Ainsi, comme chez le rat, la LH ne régule pas la différenciation initiale des cellules de Leydig puisque la stéroïdogenèse en précède la production par l’hypophyse [70, 90]. La gonadotrophine chorionique humaine (hCG) n’est pas nécessaire non plus à ce stade initial de différenciation. Cependant, la LH est requise à partir de la 10e semaine, pour générer une production suffisante de testostérone pour induire la masculinisation de l’appareil génital externe [70]. De la 14e à la 18e semaine de gestation, il y a environ 48 millions de FLC et cette population

29 demeure stable jusqu’à la 24e semaine, avant de régresser progressivement entre les 24e et 28e semaines [70].

1.3.4.14 Les cellules de Leydig infantiles (InLC)

Les stades de développement postnatal des cellules de Leydig sont moins bien connus chez l’homme que chez les rongeurs. Néanmoins, une population de cellules de Leydig semble être particulière aux primates. Cette population serait présente durant la période néonatale de développement (1re année de vie). Durant cette période, les nouveau-nés produisent un pic de testostérone à l’âge de trois mois [70]. Ce pic a été qualifié de «mini-puberté» [138]. Ce pic hormonal résulte d’une croissance du nombre de cellules de Leydig après la naissance [70] alors que les FLC ont déjà commencé à se dédifférencier. On en connait encore peu sur ces InLC, mais ces cellules semblent capables de synthétiser beaucoup de testostérone [70], ainsi que de maintenir un niveau d’INSL3 comparable à celui observé à la naissance [139].

1.3.5 Contacts cellule-cellule

Les structures fonctionnelles du testicule sont divisées de manière à permettre et soutenir la formation des spermatozoïdes ainsi qu’empêcher ces derniers d’engendrer une réponse immunitaire [4]. C’est à la fois l’agencement des cellules ainsi que les nombreux points de contacts cellule-cellule qui permettent le passage sélectif des molécules d’un milieu à l’autre [4]. Toutefois, la coordination des activités des différents types de cellules du testicule nécessite un système de communication actif [96]. Ainsi, bien que certaines informations semblent acheminées via des sécrétions paracrines, une certaine proportion de ces informations semble être transmise par contact direct entre les cellules via des jonctions intercellulaires, les jonctions communicantes (gap junctions) [96]. Celles-ci sont formées par des canaux protéiques permettant seulement le passage aux molécules de faibles poids moléculaires (inférieur à 1000 Da). Ces canaux permettent aux molécules comme les ions et l’AMPc de circuler librement d’une cellule à l’autre [140]. On retrouve ces jonctions dans les cellules de Leydig, les macrophages et les cellules de Sertoli du testicule [60, 140, 141].

30 Toutefois, les jonctions semblent apparaitre qu’à partir du 30e jour pn (chez le rat) ce qui concorde avec l’augmentation de la production de testostérone survenant juste avant la puberté [50]. La perturbation de ce mode de communication intercellulaire pourrait jouer un rôle dans l’ampleur du phénotype observée à la suite de l’exposition fœtale au DEHP puisqu’il a été démontré que l’exposition au DEHP modifie l’organisation et le nombre de jonctions entre ces cellules [142].

1.4 Le processus de différenciation sexuelle chez le mâle

Chez les mammifères, le développement sexuel d’un individu est caractérisé par trois processus fondamentaux : premièrement, la détermination du sexe à la conception; en second lieu, la différenciation sexuelle durant le développement fœtal; enfin l’acquisition des phénotypes secondaires au cours de la croissance [1, 143].

Ainsi, la première étape consiste à acquérir un chromosome spécifique porteur de gènes permettant la différenciation sexuelle [144]. Chez l’humain et les rongeurs, c’est le gène « Sex-determining Region of Y chromosome » (SRY), normalement retrouvé sur le chromosome Y (complément du chromosome X), qui est responsable de l’induction de la différenciation sexuelle mâle. L’expression de SRY par les cellules des « gonades » bipotentes aiguillera ces cellules vers la formation de cellules de Sertoli et de cellules de Leydig. Le chromosome Y et Sry sont ainsi les marqueurs masculins du sexe génétique reçu à la conception [144, 145].

Le second processus, la différenciation sexuelle, est le moment où s’enclenche une série d’événements (biologiques et moléculaires) qui conduiront à l’adoption des caractéristiques sexuelles primaires du fœtus. Au cours de la différenciation sexuelle mâle, les gonades bipotentes se différencient en testicules (voir section Ontogénie du testicule ci-dessous). Sous l’action des différentes hormones produites par les cellules des testicules, il y a formation et positionnement des organes primaires internes et externes, c’est-à-dire formation des épididymes, des spermiductes, des vésicules séminales, de la prostate, du pénis, descente des testicules dans le scrotum et régression des canaux de Müller [1].

Le troisième processus est l’acquisition des phénotypes secondaires. Durant l’enfance, les différentes cellules des testicules sont relativement peu actives. Le regain d’activité des cellules de Leydig à la puberté entraine l’augmentation de la production des hormones stéroïdiennes sexuelles [1, 28]. Les concentrations plus élevés de stéroïdes sexuels induisent une réponse physiologique menant à l’acquisition des caractéristiques sexuelles secondaires et à la production des spermatozoïdes [1, 28]. Ainsi, tel que mentionné plus tôt, la concentration accrue de testostérone entraine une poussée de croissance, l’augmentation de la taille des testicules (due à la spermatogenèse), l’apparition des poils pubiens et faciaux, la modification du cartilage, des muscles, du larynx, l’augmentation de la densité osseuse, l’accroissement de la masse musculaire et des changements comportementaux [28].

1.4.1 Ontogénie du testicule

Tel que mentionné ci-haut, la différenciation des cellules SF1-postives en cellules de Sertoli et de Leydig est une étape essentielle du processus de la différenciation sexuelle chez les mâles. La différenciation de ces cellules et leur organisation subséquente induira la formation des testicules. Plus précisément, la crête urogénitale est la structure qui donne naissance aux gonades indifférenciées/bipotentielles à partir du mésoderme intermédiaire et de la paroi dorsale de la cavité abdominale. À partir de la 4e semaine de grossesse chez l’humain (jpc 10.0 chez la souris), il est possible d’observer le primordium gonadique indifférencié. Ce dernier est localisé sur la surface ventrale du rein primitif, le mésonéphros.

Dans des conditions dites « normales » et en présence du chromosome Y non altéré, les gonades indifférenciées se développeront en testicules [146]. L’expression du gène SRY/Sry induira une cascade d’événements qui mènera à l’expression et/ou la répression de différents gènes et commettra les différentes cellules de la gonade indifférenciée vers le phénotype masculin [183, 184], tout en contrôlant la balance des rapports entre SOX9 (Sex Determining Region Y)-Box 9) , DAX1 (Dosage-Sensitive Sex Reversal/ Nuclear Receptor Subfamily 0, Group B, Member 1) et WNT4 (Wingless-

32 Type MMTV Integration Site Family, Member 4). SOX9, DAX1 et WNT4 sont des récepteurs nucléaires et facteurs de transcription importants à la régulation de la formation du testicule (le rôle de ces gènes/protéines ne sera pas discuté davantage dans le présent document) [147-151]. Chez l’embryon humain, c’est à partir de la 7e semaine que les premières ébauches de tissu testiculaire sont reconnaissables [152]. On y voit alors des cordons testiculaires qui abritent des cellules de grandes tailles (les cellules germinales). Ces cellules se divisent toujours activement sans entrer en méiose [153]. L’individualisation des tubules séminifères et la sécrétion de l’AMH par les cellules de Sertoli précèdent la différenciation des cellules de Leydig fœtales (FLC) initiée au cours de la 7e à la 8e semaine de développement chez l’humain [70]. Les FLC se répandent alors progressivement dans l’espace intertubulaire et commencent à sécréter des androgènes, puis INSL3.

L’action de ces hormones induit la migration des testicules fœtaux qui, originellement adjacents aux reins fœtaux, se déplacent vers le scrotum sous l’action, entre autres, du gubernaculum à partir de la 12e semaine de développement fœtal (jpc 13.5 chez la souris) [16]. Le positionnement des testicules dans le scrotum s’effectue en deux phases : la phase transabdominale puis la phase inguino-scotale. Vous trouverez le détail des deux phases à la section (voir section 1.7).

1.4.2 L’adoption des caractéristiques sexuelles primaires chez le mâle

Les testicules pleinement formés sécrètent des quantités importantes de trois hormones essentielles à l’adoption des caractéristiques sexuelles primaires chez le mâle, la testostérone, INSL3 et l’hormone anti-Müllerienne (AMH). Ainsi, la différenciation des tissus spécifiques de l’appareil reproducteur masculin est orchestrée par deux hormones sécrétées par les cellules de Leydig (T et INSL3) et une hormone sécrétée par les cellules de Sertoli, l’AMH. Cette dernière inhibe le développement des canaux de Müller qui, sans AMH, se développeraient pour devenir des oviductes (et leurs pavillons), et donneraient (par fusion de la portion intermédiaire et basse des canaux) naissance à l’utérus et à la partie supérieure du vagin (la partie inférieure dérive du sinus urogénital) [19]. Parallèlement, les cellules de Leydig produisent la testostérone

33 (T) et l’Insulin-like 3 (INSL3) dont l’action conjointe permet de compléter adéquatement le processus de différenciation sexuelle chez le mâle. Ainsi, l’action de la T entraine la transformation des canaux de Wolff qui deviendront les épididymes, spermiductes, vésicules séminales [154] et induit la seconde phase de la descente des testicules dans le scrotum, alors qu’INSL3 induit la première phase de la descente des testicules. Le processus (en deux phases) de descente des testicules devrait conduire ces derniers de leur position initiale (près des reins fœtaux) jusqu’à leur position finale dans le scrotum [154]. La dihydrotestostérone (un métabolite de la T) induit, elle, le développement de la prostate à partir du sinus urogénital et la formation des organes externes [19]. Durant cette période de grands changements, les interactions entre les types cellulaires ainsi que la signalisation moléculaire sont particulièrement importantes. Cette période représente donc un moment où le fœtus mâle est particulièrement vulnérable et susceptible à l’action endocrine des contaminants environnementaux. Cette signalisation endocrine peut devenir suffisamment importante pour être en mesure de perturber les interactions moléculaires normales et causer des malformations [155, 156].

L’AMH, la T et l’INSL3 sont cruciales durant le développement fœtal. Leurs actions conjointes mènent à la complétion du processus de différenciation sexuelle chez le mâle. Bien que l’action de chacune d’entre elles pourrait être affectée par des perturbateurs endocriniens tels que celui étudié dans les présents travaux, le DEHP, je concentrerai le reste du présent document sur l’hormone peptidique INSL3 puisque cette dernière est au cœur de mes travaux de recherche. Les mentions concernant la testostérone et l’AMH seront brèves et éparses dans le reste du document.

1.5 Expression d’Insl3/INSL3

1.5.1 Expression d’Insl3 chez le mâle

INSL3 est une des principales sécrétions des cellules de Leydig, tant au stade prénatal que postnatal {Anand-Ivell, 2009 #2308;Ivell, 2009 #2899;Ivell, 2013 #2301. Au niveau moléculaire, l’ARNm d’Insl3 est détecté dans les testicules fœtaux de souris à

34 partir du jpc 13.5, ce qui est similaire à la période de détection de la protéine lors du développement du fœtus humain (identifiée à partir de la 15e semaine gestationnelle).

La concentration circulante d’INSL3 semble maximale lors de l’initiation de la descente testiculaire (voir section 1.7.3), puis il diminue jusqu’à ce qu’il atteigne le niveau observé durant l’enfance. À partir de la puberté, ce même niveau augmente de façon significative pour atteindre la concentration sérique moyenne mesurée à l’âge adulte chez l’homme, soit environ 2 ng/ml {Bay, 2011 #2307}[157].

1.5.2 Expression d’Insl3 chez la femelle

Contrairement au mâle, l’ARNm d’Insl3 ne semble pas produit par les tissus fœtaux des femelles. Bien que ces transcrits soient détectés dans les cellules de la thèque de l’ovaire post-natal lors du développement folliculaire, les niveaux globaux d’INSL3 sécrétés sont significativement inférieurs à ceux observés chez les mâles puisqu’ils oscillent autour de 80 pg/ml [157, 158]. La production d’INSL3 a aussi été observée dans le corps jaune [159, 160] et le placenta [161] au niveau des cellules du trophoblaste [159, 162].

1.5.3 Insulin-like 3 au niveau moléculaire

Le gène Insl3 a tout d’abord été identifié à partir de l’homologie de séquence entre ce dernier et les différents membres de la famille des relaxines chez la souris [163]. Le prépropeptide d’INSL3 est composé de 122 acides aminés chez la souris alors que chez l’humain il est composé de 131 acides aminés [157]. Tout comme les autres membres des relaxines, le prépropeptide est composé d’un peptide signal suivi d’un peptide correspondant au domaine B, un peptide de connexion (région C) et d’un peptide correspondant au domaine A [164]. Sur gel de polyacrylamide dénaturant, la protéine de souris est scindée en deux unités soient une chaine A (domaine A), d’une longueur de 26 a.a. et d’un poids moléculaire de 6,3 kDa, et d’une chaine B (domaine B), d’une longueur de 31 a.a. et d’un poids moléculaire de 3,5 kDa.

35 Insl3 a été identifié dans une grande variété d’espèces. Tel que mentionné à la section précédente, l’analyse de l’expression d’Insl3 chez les mammifères démontre qu’Insl3 est exprimée selon un dimorphisme sexuel.

Les données démontrent que les fonctions de la dyade INSL3-RXFP2 (récepteur d’INSL3) sont sensiblement conservées à travers les espèces et que chez l’ensemble de ces espèces étudiées, la principale fonction d’INSL3 semble être l’induction et le contrôle de la descente testiculaire via la stimulation de la croissance du gubernaculum [157, 163-165].

Il est intéressant de noter qu’en circonstances pathologiques, l’expression d’Insl3 a été constatée dans les cellules tumorales et cancéreuses de la prostate et de la thyroïde. Ces cellules tumorales expriment à la fois Insl3 et son récepteur Rxfp2, sur lequel il est possible de détecter une activation par INSL3. Ceci suggère que le couple INSL3- RXFP2 joue probablement un rôle actif dans ces cellules [166].

fin exon 23 exon 1 exon 2 de Jak3 promoteur intron 1 3’UTR Insl3 murin

région riche en CpG

Figure 1.1 : Structure du gène Insl3 murin. Représentation de la structure du gène Insl3 chez l’humain, la souris et le rat (similaire entre ces espèces). La ligne fine représente la séquence d’ADN que l’on retrouve sur le chromosome 8 de la souris. À cette séquence a été superposée l’ARNm non épissé produit (barre grise pâle) sur lequel a été superposé à son tour les exons (barres grises foncées) codant pour le prépropeptide. Le début du promoteur d’Insl3 (+1) est localisé à l’intérieur d’un des introns du gène Jak3. Le promoteur d’Insl3 fait, en moyenne, 1 kb de longueur avant d’entrer dans la séquence codant pour l’ARNm. L’ARNm sera épissé afin d’éliminer l’intron qui sépare

36 les deux exons codants tout en conservant le 3’UTR. L’association de l’exon 1 et de l’exon 2 permettra la traduction du prépropeptide. La région promotrice est responsable de la majorité de l’activité transcriptionnelle associée au gène Insl3. À ce jour, aucune donnée ne permet d’associer une fonction de régulation de la transcription à l’intron 1.

1.5.3.1 Structure de l’Insl3 murin

L’analyse détaillée d’Insl3 a permis de localiser le gène sur le chromosome 8 en position B3.3; 8 34.43 cM. Il a été établi que le dernier exon d’Insl3 coïncide avec le dernier exon du gène Janus kinase 3 (Jak3). L’étude menée par le groupe de Koskimies (1997) a démontré que le gène Insl3 est intégralement localisé à l’intérieur des bornes délimitées par les exons substitutifs numéro 23 du gène Jak3. Le dernier exon d’Insl3 chevauche/recoupe l’exon 23 B de Jak3 [167]. Le début de l’exon d’Insl3 et celui de l’exon de Jak3 coïncident parfaitement.

La séquence entre les exons 23A et 23B de Jak3 murin constitue un intron dont la longueur est de 2,2 kilobases (kb). C’est à l’intérieur de cet intron que l’on retrouve à la fois la séquence promotrice du gène Insl3 et le premier intron de celui-ci [167].

Bien que la longueur de la séquence entre la fin de l’exon 23A de Jak3 et le début du 5’UTR (untranslated region) d’Insl3 soit de 940 nucléotides (promoteur pleine longueur potentielle), un promoteur de souris de 700 paires de base (pb) semble suffisant pour obtenir à la fois une réponse maximale en transfection transitoire et une réponse spécifique à cette cellule. C’est-à-dire qu’à l’exception des cellules de Leydig, l’ensemble des autres types cellulaires étudiés par le groupe de Richard Ivell (1997) démontre une méthylation importante au niveau de cette région de 700 nucléotides [167].

Les premières 175 pb de l’exon 1 encodent pour le peptide signal, le peptide B ainsi que les 7 premiers acides aminés du domaine C. L’exon 2 encode pour le reste du domaine C, le peptide A (250 pb) et une portion du 3’UTR.

37 L’analyse des quelque 1500 pb en amont du codon d’initiation de la traduction révèle la présence d’une très courte séquence 5’UTR et du promoteur putatif d’Insl3. Le groupe de Zimmerman (1997) a identifié plusieurs éléments de régulation importants dont une boîte TATA en position -36 nucléotides, un site de liaison pour le facteur de transcription Sp1 en position -51 nucléotides ainsi que de potentiels sites de liaison pour le facteur de transcription NR5A1/SF1 en position -64, -144 et -479 pb. Par la suite, Zimmermann a démontré (1998) que ces trois sites de liaisons NR5A1 sont nécessaires à l’activité normale du promoteur dans les cellules de Leydig et que la mutation d’un de ceux-ci affecte grandement l’activité promotrice [157, 168]. Le promoteur d’Insl3 abrite aussi un élément de réponse théorique pour le facteur de transcription SRY (sex determining region Y transcription factor) en position -211 mais ce facteur de transcription n’est pas exprimé dans les cellules de Leydig [169]. Depuis ce jour, au moins deux autres éléments de réponses fonctionnels ont été identifiés. Un élément NBRE (AAA AGG TCA) qui est un élément de réponse à NR4A1 (NUR77/NGFI-B) en position -100 pb [170]. On retrouve également deux éléments de réponse à COUP-TFII : un élément DR3 (séquence répétée directement avec un espacement de 3 nucléotides)(AGG ACT TCA AGG TCC) à -143 pb et un élément DR0-like (GAG CCT CGA CCT ) localisé à -97 pb [171].

1.5.3.2 Structure de l’Insl3 chez le rat

Les travaux effectués sur le gène Insl3 de souris ont pavé la voie menant à l’identification et la compréhension de la régulation du même gène chez les autres espèces.

C’est à l’aide de la séquence en acides aminés d’INSL3 murin et de la colocalisation putative d’Insl3 et de Jak3 que le promoteur d’Insl3 de rat a été décrit. Le gène Insl3 de rat se trouve sur le chromosome 16 en position 14. L’homologie entre le prépropeptide INSL3 de rat et de souris est de 99,5 % (si l’on ne tient pas compte d’une séquence de 6 a.a. dans le domaine C du rat qui est absente chez la souris [172].

38 Lorsque les séquences prépropeptidiques humaines et de rat sont comparées, l’homologie est bien plus faible. Elle varie alors entre 60 et 72 %. Toutefois, les séquences peptidiques actives démontrent une homologie presque parfaite entre ces trois espèces (88 % pour le peptide signal; 99 % pour le peptide B; 100 % pour le peptide A et seulement 55 % pour le domaine C [173].

La structure du gène est toutefois quelque peu différente chez le rat. Contrairement à la souris, le gène Insl3 n’est pas inclus à l’intérieur de deux exons alternatifs de Jak3. Chez le rat, un peu moins de 1 kb sépare l’exon terminal de Jak3 et le premier exon d’Insl3. Les éléments de réponse clé identifiés chez la souris sont présents dans le promoteur putatif du rat. Ainsi, on retrouve une boîte TATA, un site de liaison Sp1, trois éléments de réponse NR5A1, un élément de réponse SRY théorique comme chez la souris [172, 173], ainsi que les éléments de réponse NBRE et COUP-TFII mentionnés précédemment [170, 171].

1.5.3.3 Structure de l’INSL3 humain

La forte homologie de séquence peptidique a permis de localiser le gène INSL3 humain sur le petit bras du chromosome 19 en position 13.2 à 12 [174]. C’est par homologie de séquence entre les différents promoteurs (souris, rat et humain) que le promoteur pleine longueur (1137 pb) humain a été déduit. On y retrouve les éléments de régulation NR5A1, SRY, Sp1, NBRE et COUP-TFII mentionnés précédemment.

L’étude de la régulation de l’expression d’INSL3 chez l’humain a révélé la présence d’un variant résultant d’un épissage alternatif de l’ARNm. La traduction de ce variant produit une protéine tronquée et non fonctionnelle. Cet épissage alternatif de l’ARNm a aussi été mis en évidence chez le rat et la souris [175]. À ce jour, aucun lien entre cet épissage alternatif et l’étiologie d’une pathologie telle la cryptorchidie a été mise en évidence.

39 1.6 Identification des gènes essentiels à la descente testiculaire

Chez les mammifères, les testicules sont situés à l’extérieur du corps. Contrairement aux gonades femelles, qui elles sont en position périrénale, les gonades mâles doivent migrer dans le scrotum où la température est inférieure (33°C) à celle du corps. Cet environnement permet le développement des cellules germinales et donc la spermatogenèse et la fertilité [176, 177]. La migration des testicules en position scrotale (aussi appelée descente testiculaire) est initiée durant le développement fœtal. Selon les espèces, la migration se terminera avant ou après la naissance de l’individu.

L’invalidation génique (knock out) est une technique où l’on retire du génome un gène spécifique. Cette technique facilite l’analyse fonctionnelle du produit des gènes, soit les protéines. Grâce à cette technique, il est devenu plus facile d’apprécier l’importance fonctionnelle d’un gène au niveau développemental. L’évolution de la technique permet maintenant d’invalider un gène en contrôlant le moment de l’invalidation si on le désire [38]. Cette technique est devenue un incontournable de la biologie moléculaire, comme sa technique soeur, l’insertion (knock in). L’utilisation de l’invalidation génique a permis de bien comprendre comment les testicules se retrouvent à l’intérieur du scrotum et surtout d’identifier différentes portions du mécanisme de migration.

Les paragraphes suivants résument les observations faites sur différentes souris dont un ou deux gènes ont été spécifiquement invalidés. Les observations faites sur ces souris knock out ont mené à l’élaboration d’une théorie par Adham et al (2000) (voir section 1.7), théorie qui est, de nos jours, largement acceptée.

1.6.1 Les souris féminisées

Il existe différentes lignées de souris où les mâles sont systématiquement féminisés. Les souris de ces lignées sont féminisées pour différentes raisons. Soit le récepteur aux androgènes est aboli comme dans le cas des souris Ar négative (Ar-/-) et Tfm (testicular feminized mouse) soit la production de testostérone est abolie due à certaines

40 déficiences enzymatiques [116, 178, 179]. Le phénotype de ces souris est souvent comparé aux syndromes humains d’insensibilité partielle ou complète aux androgènes « Complete Androgen Insensibility Syndrome» (CAIS) et « Partial Androgen Insensibility Syndrome » (PAIS). Chez ces souris Ar-/Y, les mâles ont un phénotype similaire aux femelles de type sauvage de la naissance à la puberté [180].

Au niveau interne, les mâles homozygotes négatifs pour Ar ont de très petits testicules en position postérieure dans l’abdomen parmi des tissus graisseux. L’analyse histologique des testicules démontre la présence de cellules de Sertoli, de cellules de Leydig et de spermatogonies [181]. Toutefois, la spermatogenèse est arrêtée à un stade précoce. Chez ces mâles, les spermiductes, les vésicules séminales et les épididymes sont absents tout comme le sont les organes internes de type féminin, outre la présence de la fente vaginale. Les souris Ar-/Y mâles démontrent une croissance/persistance du ligament cranial suspensatoire (CSL) fœtal, un gubernaculum (aussi appelé ligament caudal) sous développé et des testicules en position abdominale basse ou intermédiaire [182]. Le phénotype observé est le même que celui des mâles exposés à des anti- androgènes durant le développement fœtal [183, 184]. Comparativement à leurs homologues de type sauvage, les souris Tfm présentent des concentrations de testostérone fortement réduites (1,8 ± 0,3 vs. 9,3 ± 2,0 nmol/litre; P = 0.05) [230] et des concentrations de LH augmentées [116, 185].

Une analyse plus détaillée des cellules de Leydig des souris Tfm adultes démontre que l’expression des gènes 17,20-lyase (P450c17) et Insl3 est fortement réduite alors que celle des gènes 17β-HSD 3, 3β-HSD 6 et de différentes prostaglandines synthases est quasi absente [40]. Ce profil d’expression génique suggère que les cellules de Leydig adultes de souris Tfm entreprennent leur différenciation mais que celle-ci est interrompue. Les cellules de Leydig n’atteignent donc jamais la pleine maturité [40, 186].

Les souris PAIS (Partial Androgen Insensibility Syndrome) mâles souffrent d’une forme moins sévère d’insensibilité aux androgènes et ont un phénotype très différent.

41 Ces dernières semblent avoir subi une certaine virilisation des organes génitaux externes. De plus, il est possible de distinguer les spermiductes et les épididymes [187].

1.6.2 Les souris Insl3 invalidées (Insl3-/-)

Les souris Insl3-/- mâles produites par Zimmermann démontrent une importante réduction du développement du gubernaculum et ont les deux testicules en position abdominale haute, près des reins, contrairement à leurs congénères de type sauvage. De plus, les testicules et les voies génitales sont mobiles à l’intérieur de la cavité abdominale, ce qui suggère à la fois l’inhibition du développement du gubernaculum et la régression du CSL. En contrepartie, les souris Insl3 invalidées femelles produites par Zimmermann ne présentent aucune altération du phénotype ou de la fertilité [15, 16].

Ce même type de souris (Insl3-/-) a été produite par un autre groupe, Nef et Parada (1999), les souris mâles ont le même phénotype, mais Nef et Parada ont noté que les souris femelles ont une fertilité réduite associée à une dégénérescence accélérée des cellules lutéales et des follicules ovariens [15, 158].

L’invalidation d’Insl3 chez ces souris (mâles ou femelles) n’affecte pas la différenciation des canaux de Wolff et des canaux de Müller. Il en est de même pour les organes génitaux externes qui sont correctement formés.

1.6.3 Les souris doublement invalidées (Insl3-/- et Ar-/Y)

Les souris mâles invalidées pour Insl3 et Ar confirment que ces deux gènes sont essentiels ou du moins contribuent fortement au positionnement scrotal des testicules. Lors de leur absence, les testicules sont localisés en position abdominale haute (périrénale), où ils sont solidement liés aux parois abdominales, soit dans la même position et de la même manière que les ovaires des souris femelles de type sauvage. Le phénotype observé est tout à fait cohérent avec leurs actions suspectées sur le développement du gubernaculum et du CSL durant le développement fœtal [13]. Il

42 résulte de la somme des caractéristiques propres à chacune des invalidations chez les souris mâles. La différence observée dans les phénotypes de ces trois souris mâles invalidées (Insl3-/-, Ar-/Y, combinaison Insl3-/- et Ar-/Y) suggère fortement que les mécanismes de positionnement des testicules sont fortement régulés à la fois par l’action d’AR et d’INSL3 et que l’action de ceux-ci est complémentaire et non substitutive.

1.6.4 Les souris crsp

Les souris crsp (cryptorchid and spotted) ont aussi contribué à développer la compréhension du processus de la descente testiculaire. Chez les souris crsp, une insertion mutationnelle résulte en l’invalidation du gène relaxin/insulin-like family peptide receptor 2 (Rxfp2), aussi connu sous divers acronymes dont leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 8 (Lgr8) et G-protein-coupled receptor affecting testicular descent (Great). Les souris mâles Great+/- ont un phénotype de positionnement normal des testicules [188] alors que les souris mâles Great-/- ont un phénotype de cryptorchidie identique à celui des souris Insl3-/- [15, 16, 188-190]. Toutefois, en plus d’avoir des taches blanches au niveau de l’épiderme, ces souris homozygotes ont un développement réduit du sac scrotal, des testicules et des épididymes. Overbeek et al (2001) rapportent que les structures primaires mâles et les niveaux circulant de testostérone semblent normaux. Néanmoins, le développement du gubernaculum est altéré et les souris sont stériles. Cette stérilité peut être corrigée par la translocation chirurgicale des testicules dans le scrotum, réactivant ainsi la spermatogenèse [188] et confirmant par le fait même que l’invalidation de Great ne bloque pas le développement des cellules germinales. La reprise de la spermatogenèse après la chirurgie suggère que la stérilité est causée par l’exposition des testicules à la température intra-abdominale plus élevée [191]. Cette dernière hypothèse est appuyée par les observations sur les souris femelles invalidées Great-/- qui, elles aussi, ont un phénotype normal avec une fertilité comparable aux femelles de type sauvage [188]. Le gène Great ne semble donc pas jouer un rôle de premier plan dans la fertilité de la souris.

43 1.7 Détails de la descente testiculaire

Dans leur article publié en 2000, Adham et al ont bien identifié les principaux éléments qui ont permis de conclure que la descente testiculaire se produit en deux étapes. Ils suggèrent que la position des gonades est le fruit des tractions exercées par les deux ligaments attachés aux gonades : le gubernaculum et le ligament cranial suspensatoire (CSL). Ainsi le gubernaculum (ou ligament caudal génital) exercerait une traction vers le bas (abdomen/scrotum) et le CSL exercerait une traction vers le haut (position périrénale) [13]. Le positionnement des gonades résulte essentiellement de la croissance de l’un et de la dégénérescence de l’autre. Selon leur théorie, chez les mammifères, la migration des testicules s’effectue en, au moins, deux étapes distinctes. Ces étapes sont caractérisées à la fois par le positionnement des testicules et par les molécules impliquées dans le processus [192]. La première phase de la migration est dite transabdominale et la seconde est dite inguino-scrotale. Les deux phases sont orchestrées par différentes hormones produites par les testicules [193]. Les paragraphes suivants décrivent le détail des deux phases.

1.7.1 Détails de la première phase : la phase transabdominale

Durant cette phase, les testicules migrent de leur position originale (adjacente aux reins fœtaux) pour se retrouver à la base de la paroi abdominale. Les organes responsables de cette migration sont le gubernaculum (aussi appelé ligament génital caudal) et le CSL. Ces deux structures sont positionnées de part et d'autre du testicule. Elles jouent des rôles opposés dans le positionnement des gonades et réagissent différemment à la signalisation hormonale [193]. INSL3 est l’hormone responsable de l’induction et du bon déroulement de cette phase. L’action de la testostérone/DHT est toutefois nécessaire et appuie celle d’INSL3. Ainsi, INSL3 active le récepteur RXFP2 présent sur le gubernaculum. L’activation de RXFP2 induit le développement du gubernaculum, ce qui a pour effet de tirer le testicule vers la paroi abdominale au niveau de l’anneau inguinal [194]. De l’autre côté, la testostérone active le récepteur aux androgènes présent sur le CSL, ce qui induit la régression de ce dernier. La régression

44 du CSL facilite l’action du gubernaculum puisque ceux-ci ont des rôles antagonistes en ce qui a trait au positionnement des gonades [194].

Le développement de la portion caudale du gubernaculum se poursuit au niveau de l’anneau inguinal de la paroi abdominale. Les cellules de cette portion du gubernaculum commencent à gonfler sous l’effet de l’accumulation d’eau [195, 196]. Ceci a pour effet d’élargir le canal inguinal et ainsi créer un passage d’une dimension suffisante pour permettre la migration du testicule hors de l’abdomen lors de la seconde phase [165, 194, 195].

1.7.2 Détails de la seconde phase : la phase inguino-scrotale

Cette étape de la migration testiculaire est fortement dépendante des niveaux d’androgènes et de l’activité du récepteur aux androgènes (AR). Il a été démontré que l’exposition prénatale au flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes, inhibe à la fois les processus associés à la phase inguino-scrotale et la régression du CSL [197- 200]. Conséquemment, le flutamide induit un positionnement des testicules similaire à celui des ovaires [200, 201]. Au cours de cette phase, le canal inguinal proprement élargi permet le passage du testicule vers le scrotum. La migration à travers le canal inguinal semble être induite par l’involution du gubernaculum et la pression intra- abdominale [194].

1.7.3 Régulation de la descente testiculaire

Bien que le processus et les intervenants soient les mêmes chez les différentes espèces de mammifères, certaines variations sont observées quant au déroulement temporel des activités [192]. Ainsi, la première phase de la descente testiculaire se produit vers la fin du premier trimestre chez l’humain [192], alors que celle-ci s’effectue du jpc 13 à 17 chez les rongeurs [16, 192]. Chez l’humain, il y a une pause de plusieurs semaines entre la première phase et la seconde, tandis que ces étapes sont subséquentes (sans pause) chez les rongeurs. De plus, chez l’humain, la seconde phase de la descente des testicules débute généralement autour de la 25e semaine et s’étend jusqu’à la naissance.

45 Chez les rongeurs, cette même étape débute autour de la parturition et s’échelonne sur quelques jours [193].

1.8 Autres rôles d’INSL3

L’action d’INSL3 est indispensable lors la descente testiculaire, mais son rôle ne se limite pas à celui-ci. D’une part, un regain de l’expression d’Insl3/INSL3 est observé à partir de la puberté, autant chez le mâle que chez la femelle [18, 157, 159, 160, 162, 202]. D’autre part, le récepteur RXFP2 est exprimé dans plusieurs tissus à l’intérieur et hors du système reproducteur. Ce récepteur a été observé au niveau des épididymes [203], des canaux déférents [32], des vésicules séminales [32], de la prostate [166] et des cellules germinales [32, 204]. De plus, ce récepteur a aussi été observé à l’extérieur du système reproducteur mâle : au niveau des glandes mammaires [205], de l’endomètre [206], de la thyroïde [207, 208], du cerveau (dans le thalamus) [209-211], du placenta [203, 212], des reins [213], des glandes lacrymales et des yeux [214]. Ces données ont soulevé de l’intérêt et évoquent la possibilité que l’action d’INSL3 s’étende au-delà du système reproducteur. Il est toutefois important de mentionner qu’in vitro certaines relaxines (molécules cousines d’INSL3) sont capables d’activer RXFP2 toutefois une telle activation n’a jamais été confirmée in vivo [215].

1.9 La cryptorchidie congénitale

La cryptorchidie congénitale est le diagnostic clinique qui observe l’absence d’un ou des deux testicules dans le scrotum à la naissance. Il est important de mentionner que le testicule (ou les testicules) semble avoir subi un arrêt de migration durant sa descente le long de son parcours naturel vers le scrotum. La nuance est importante afin de dissocier ce phénotype de ceux de l’ectopie testiculaire (testicule mal positionné), l’agénésie testiculaire (testicule non formé) et la cryptorchidie acquise (remontée du testicule hors du scrotum).

46 1.9.1 Prévalence de la cryptorchidie congénitale

La cryptorchidie congénitale est le désordre pédiatrique le plus fréquent chez les garçons [155, 193, 216-218]. Sa prévalence moyenne est de 2 à 4 % chez les nouveau- nés à terme et avoisine les 30 % chez les prématurés. Ce taux élevé chez les prématurés peut s’expliquer par l’impossibilité pour ces derniers de combler un retard de descente testiculaire accumulé plus tôt durant le développement fœtal et par le fait que la deuxième phase de descente débute généralement autour de la 25e semaine et s’étend jusqu’à la naissance. Le testicule serait alors en position inguinale et non scrotale [155, 193, 216-220].

Dans la majorité des cas (70 %), seulement un des deux testicules est atteint (cryptorchidie unilatérale); les autres cas sont dits bilatéraux (deux testicules) [218, 219].

Les cas de cryptorchidie congénitale humaine en relation avec des mutations causatives sont rares [220], c’est-à-dire que la majorité des cas de cryptorchidie congénitale (environ 90 %) sont considérés idiopathiques et/ou multifactoriels [139, 221, 222].

1.9.2 Cryptorchidie congénitale complète ou intermédiaire

La cryptorchidie est dite complète ou sévère lorsque les testicules sont retenus au niveau abdominal. Pour sa part, la cryptorchidie intermédiaire ou légère est observée lorsque le testicule a atteint et traversé l’anneau inguinal, mais sans compléter sa descente jusqu’au scrotum. Le testicule est alors en position inguino-scrotale [223].

Figure 1.2 : Schéma de la descente des testicules. Représentation graphique des différentes positions que le testicule occupe durant sa migration vers le scrotum. Dans les cas de cryptorchidie, la migration d’un (ou des) testicule(s) peut être bloquée et le testicule demeure donc à l’une des positions transitoires présentées.

Les données animales suggèrent que la cryptorchidie complète est généralement associée à des mutations non fonctionnelles d’INSL3 ou de son récepteur RXFP2, alors que la cryptorchidie intermédiaire ou partielle est, quant à elle, davantage associée à différents syndromes de résistance aux androgènes [154].

1.9.3 Traitement de la cryptorchidie congénitale

Dans la majorité des cas, les testicules cryptorchides sont relocalisés par orchidopexie, une chirurgie qui permet de physiquement relocaliser les testicules dans le scrotum. Les avancements dans la compréhension du processus de maturation des cellules germinales combinés à la puissance des études épidémiologiques ont démontré qu’il est favorable d’effectuer cette correction au cours de la première année de vie du

48 nouveau-né, préférablement autour de six mois d’âge afin de minimiser les impacts négatifs et délétères (voir section suivante) qu’engendre la cryptorchidie sur la santé reproductive [193, 224, 225].

L’orchidopexie est à ce jour le traitement le plus efficace, toutefois certains cas de cryptorchidie légère sont encore traités avec un cocktail d’hormones (T, hCG, GnRH, LHRH) afin de stimuler la complétion de la descente [226, 227].

1.9.4 Conséquences de la cryptorchidie congénitale

Il a été démontré que la cryptorchidie congénitale affecte la fertilité de l’homme et sa sensibilité à développer un cancer des testicules. Lorsque la cryptorchidie est non corrigée ou corrigée après la puberté, les hommes sont stériles ou ont d’importants problèmes de fertilité [228]. Les données sur l’influence du type de cryptorchidie et de l’âge de la correction démontrent que la cryptorchidie congénitale augmente significativement les risques de développer un cancer des testicules. Les auteurs s’entendent pour dire de manière générale que les risques semblent augmentés par un facteur de cinq à dix. Toutefois, il semblerait que les risques soient plus élevés lorsque la correction est tardive [228-230].

Lorsque la cryptorchidie est corrigée avant la puberté, le risque de développer un cancer des testicules est 3 fois plus élevé que chez la population contrôle, et ce, indépendamment de l’âge où la correction a été réalisée [218, 229, 231]. C’est donc le statut de cryptorchidie congénitale qui augmente les risques [232, 233].

1.9.5 Syndrome de dysgénésie testiculaire (TDS)

Malgré la correction chirurgicale, les études ont démontré que l’incidence de troubles liés aux fonctions reproductives mâles est plus grande chez les garçons souffrant de cryptorchidie congénitale. Ces mâles souffrant de cryptorchidie congénitale souffrent aussi d’une incidence plus élevée d’hypospadie, de troubles de fertilité et ont un risque accru (2.90x à 4.8x) de développer un cancer des testicules [234]. L’ensemble de ces

49 symptômes a été regroupé sous l’appellation « syndrome de dysgénésie testiculaire » (TDS). Ce syndrome pourrait être comparé à une erreur de programmation des cellules du testicule qui rendrait ces dernières plus vulnérables [111, 193, 218, 226, 229, 231, 234-236].

1.9.6 Facteurs de risque

Plusieurs facteurs semblent contribuer à l’étiologie de la cryptorchidie, ou du moins influencer la pénétrance du phénotype. Parmi les différents facteurs de risque identifiés, certains sont de nature génétique alors que d’autres semblent davantage comportementaux et/ou environnementaux.

1.9.6.1 Facteurs génétiques

Chez certains individus, les séquences des gènes peuvent contenir des polymorphismes ou des mutations qui peuvent soit influencer l’activité du gène (mutations causatives), soit influencer la sensibilité du gène à divers facteurs (variants).

Ainsi, certaines mutations ont été mises en évidence par des études menées chez les rongeurs. Ces études ont permis de mettre en évidence l’importance de trois gènes (Insl3, Rxfp2 et Ar) impliqués dans la descente testiculaire et la masculinisation primaire des mâles génétiques. Ces études ont notamment démontré qu’en absence d’expression adéquate d’un de ces gènes la différenciation masculine est significativement perturbée [15, 16, 188, 193, 237, 238]. Les mutations génétiques de type non fonctionnel sont passées de génération en génération. Ces cas dont la phylogénie est facilement établie à travers l’historique familial et le génotypage ne représentent qu’une très faible portion des cas de cryptorchidie répertoriés chez l’humain [239, 240].

Au cours de la dernière décennie, plusieurs variants génétiques des gènes INSL3 et RXFP2 ont été répertoriés chez l’humain. Ces variants génétiques pourraient induire des mutations sensibilisantes. Toutefois, il n’y a pour le moment, aucune étude sur

50 l’influence de ces variants. Il se pourrait que certains de ces variants aient une importance fonctionnelle plus subtile que de rendre le gène non fonctionnel et qu’ils contribuent ainsi à sensibiliser le gène à d’autres facteurs. Les données démontrent qu’INSL3 est sujet à de nombreuses variations (SNP) dans les régions des exons (codantes et non codantes) [154, 241].

Dans son article de 2007, Ferlin et al font un bref rappel des mutations des gènes INSL3 et RXFP2 (mutations causatives) répertoriées chez l’humain [239]. Ils mentionnent que plusieurs mutations du gène INSL3 et/ou de son récepteur RXFP2 ont la capacité de rendre caduque INSL3. Toutefois, chez les humains, ces mutations causatives ainsi que les variants génétiques ne sont retrouvés que dans une très faible proportion des cas de cryptorchidie répertoriés. Ces données suggèrent que des facteurs de nature non génétique sont aussi à considérer. Ainsi, la recherche s’est orientée vers l’analyse de l’implication des facteurs de nature comportementale et environnementale.

1.9.6.2 Facteurs comportementaux

La plupart des données épidémiologiques démontrent que certains comportements de la mère pendant la grossesse influencent les risques du fœtus de développer la cryptorchidie et/ou le TDS. Ainsi, le tabagisme maternel, la consommation régulière ou excessive d’alcool, la prise d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, la prise d’estrogènes et même le régime alimentaire de la mère sont tous des facteurs de nature comportementale qui pourraient moduler les concentrations de T et d’INSL3 produites par le fœtus et ainsi causer la cryptorchidie congénitale.

Les garçons dont la mère fume la cigarette lorsqu’enceinte (10 cigarettes et plus quotidiennement) ont un risque plus élevé de développer la forme la plus sévère de la cryptorchidie comparativement aux garçons non exposés au tabac durant leur développement fœtal. Les garçons exposés ont aussi une diminution plus importante du nombre de gonocytes et de spermatogonies en réponse au tabagisme maternel [242, 243].

51 La consommation régulière ou excessive d’alcool durant le développement fœtal est un autre facteur comportemental maternel qui semble pouvoir augmenter les risques de développer une cryptorchidie congénitale [244-246].

La prise de médicaments antalgiques comme le paracétamol / acétaminophène (Tylénol) ou anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels l’acide acétylsalicylique (Aspirine) et l’ibuprofène (Motrin et Advil) durant la fin du premier trimestre ainsi que durant le second trimestre de la grossesse augmente les risques de cryptorchidie congénitale chez le nouveau-né [247]. L’augmentation des risques est corrélée à la fois avec les doses consommées et la fréquence de consommation [295]. Ainsi, la combinaison d’antalgiques (ou d’anti-inflammatoires) augmente grandement les risques (jusqu’à 7 fois) [247]. Il en est de même lorsque la durée totale de consommation dépasse 14 jours durant le premier trimestre et le début du second trimestre [247]}[248, 249].

La prise d’estrogènes tels que l’estradiol, l’estrone ou le diéthylstilbestrol par une femme enceinte mènerait à une exposition relativement trop élevée du fœtus mâle aux estrogènes durant le développement in utero. Dans leur méta-analyses quantitatives, Gill (1979) et Stillman (1982) confirment que l’exposition in utero au DES est positivement corrélée aux trois différentes issues étudiées soient la cryptorchidie, l’hypospadie et le cancer des testicules [250, 251]. En contrepartie, les données quant à l’influence des estrogènes naturels, demeurent peu concluantes [252]. Néanmoins, l’étude d’Hadziselimovic et al publiée en 2000 appuie l’hypothèse que l’exposition in utero à des concentrations trop élevées d’estrogènes naturels (non issus de synthèse chimique) peut induire la cryptorchidie congénitale. Cette étude démontre que les syncytiotrophoblastes des placentas d’enfants cryptorchides sécrètent relativement plus de 17β-estradiol que ceux des placentas des enfants du groupe contrôle [253].

Le régime alimentaire de la mère pendant la grossesse pourrait aussi avoir un impact sur le risque de développer la cryptorchidie congénitale chez le fœtus mâle. Le groupe de Todaka et al (2005) a démontré que les estrogènes de provenance végétale

52 (phytoestrogènes) sont non seulement transférés de la mère au fœtus, mais que ceux-ci sont davantage concentrés dans le sang ombilical. Cette différence de capacité d’élimination, combinée avec l’hypothèse de la capacité des estrogènes naturels à induire ou à favoriser la cryptorchidie congénitale, soulève des inquiétudes et des interrogations quant à la contribution des estrogènes de source alimentaire à l’étiologie de la cryptorchidie congénitale [254].

Les données épidémiologiques démontrent aussi que les mères atteintes de diabète (production insuffisante d’insuline ou problème de signalisation) donnent plus fréquemment naissance à des garçons souffrant de cryptorchidie congénitale [243, 255].

1.9.6.3 Facteurs environnementaux

Les contaminants environnementaux proviennent de l’utilisation industrielle de certains composés qui semblent démontrer des capacités tératogènes non répertoriées. Les pesticides, les retardateurs de flammes (diphényles polybrominés) et les plastifiants sont les principaux agents identifiés à ce jour.

Plusieurs études épidémiologiques ont démontré le risque que représente l’exposition aux pesticides. Les garçons dont la mère ou les deux parents ont été exposés à des pesticides dans le cadre de leur travail durant la période de développement fœtal produisent moins de testostérone et souffrent davantage d’anomalies congénitales touchant les organes reproducteurs mâles [256-260] [304-308]. Les données provenant de ces études soulèvent beaucoup de questions et soutiennent que l’exposition in utero aux estrogènes est peut être néfaste puisque plusieurs de ces pesticides sont considérés comme des xénoestrogènes.

Les diphényles polybrominés utilisés comme retardateur de flammes dans les tissus et différents appareils électroniques agissent à titre d’antagonistes du récepteur aux androgènes (AR) et induisent une diminution significative de l’expression des gènes

53 dépendants d’AR [261]. Cela suggère que l’expression d’INSL3 pourrait être affectée par l’exposition aux diphényles polybrominés (voir chapitre 2 pour plus de détails).

Les phtalates (ou esters de phtalates) sont un groupe de produits chimiques organiques utilisés principalement comme plastifiants (ils procurent flexibilité et résistance aux matières plastiques) et dans la fabrication d'une variété de produits. On les retrouve dans plusieurs produits de consommation et surtout dans les produits cosmétiques, les vernis à ongles, les parfums, les équipements médicaux (comme les sacs et les tubulures en PVC pour perfusion intraveineuse), les produits pharmaceutiques et les matériaux de construction. Ils sont aussi utilisés dans d'autres produits tels que les jouets (et autres produits destinés aux enfants), où leur utilisation est davantage contrôlé et limité dans de plusieurs pays. Les humains sont exposés aux pthalates à la fois de façon indirecte, car les phtalates sont des contaminants omniprésents dans l'environnement, et de façon directe, car on leur est exposé via les produits de soins personnels, certains médicaments et les différents appareils et mobiliers contenant ou fait de chlorure de polyvinyle (PVC) tels que les meubles de jardin, les tableaux de bord des voitures et les rideaux de douche [262]. Les propriétés physico-chimiques des phtalates font que ces composés diffusent à travers la matière organique et inorganique. Les échanges s’effectuent donc par absorption cutanée, ingestion ou inhalation [263, 264]. Des études épidémiologiques récentes confirment que l’incidence et/ou l’intensité de la sous-masculinisation sont corrélées avec l’exposition à des perturbateurs endocriniens, notamment aux phtalates [233, 265-267]. Un rapide tour de la littérature suggère que les phtalates ont une activité anti-androgénique [268]. Ce constat semble juste étant donné que l’exposition à ces composés durant le développement fœtal induit une diminution suffisante de la production de testostérone et d’INSL3 pour perturber la différenciation sexuelle chez les mâles et modifier l’activité ovarienne chez les femelles [269, 270].

Bien que des études épidémiologiques aient fourni les premières pistes d’analyse via la mise en évidence des corrélations chez l’humain, c’est grâce aux modèles animaux qu’il a été possible d’établir les liens de causalité tangibles entre l’exposition aux

54 perturbateurs endocriniens et les différents symptômes associés au syndrome de dysgénésie testiculaire.

Dans le cadre de mon doctorat, un des phtalates les plus répandus, le DEHP (di-éthyl- hexyl phtalate) a été employé. Celui-ci sera abordé plus en détail à la section suivante.

1.10 Le di-(2-éthylhexyl)-phtalate

Le di-(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP) (Cas. No: 117-81-7) est un liquide incolore qui est utilisé dans l’industrie comme agent plastifiant, car il procure à la fois flexibilité et résilience aux plastiques de chlorure de polyvinyle (PVC) [271]. Les données présentées par Kavlock et al (2006) démontrent que le DEHP est un des plastifiants les plus utilisés dans le monde ; il représente, à lui seul, près de 25 % des plastifiants produits [271]. Tel que mentionné précédemment, le DEHP est utilisé dans une variété de produits. Il est utilisé dans les produits de beauté, les jouets, certains revêtements de plancher, des adhésifs et colles, des détergents, des huiles (personnelles et autres), des solvants, des composantes de véhicules en plastique, certains tissus de vêtements, des savons, des shampooings, des déodorants, des parfums, des fixatifs capillaires, des vernis à ongles, etc. [272]. Le DEHP entre aussi dans la composition de matériels médicaux comme les poches sanguines et les tubulures à intraveineuse. C’est notamment dans ces deux produits que l’on retrouve les plus hautes concentrations de phtalates [273], une composante indispensable de ces produits, où le DEHP peut représenter près de 40 % du poids total du produit final [263].

1.10.1 Phénotype de l’exposition in utero au DEHP

Des études (cas-contrôles ou rétrospectives) ont mis en évidence diverses corrélations dont la diminution de la qualité du sperme, l’augmentation de la prévalence de cryptorchidie, d’hypospadie et de cancer testiculaire chez des patients exposés au DEHP durant leur développement fœtal [233, 267, 274, 275].

55 1.10.2 Exposition au DEHP

Le DEHP n’est pas lié de façon covalente aux différents produits auxquels il est associé, il est simplement intégré à la matrice. Le DEHP est donc capable de diffuser et d’être absorbé par la peau, par ingestion ou par inhalation [276]. Le DEHP est un composé hydrophobe qui pénètre les membranes cellulaires et est métabolisé par les lipases et les estérases, particulièrement celles de l’intestin. Le produit de la première hydrolysation est le mono-(2-éthylhexyl) phtalate (MEHP) [276, 277]. Il s’agit du catabolite possédant la plus haute bioactivité. En effet, ce dernier se révèle dix fois plus puissant que le DEHP in vitro [278]. Les études menées chez des humains volontaires et des rongeurs ont démontré que le MEHP produit plus d’une quinzaine de métabolites durant le processus d’élimination [279-281].

Plusieurs méthodes ont été développées pour mesurer la présence des divers métabolites dans les tissus et sécrétions. Ces méthodes ont permis de vérifier la présence du DEHP et de ces divers métabolites dans de nombreux fluides corporels, dont l’urine, le lait maternel, le liquide amniotique, la salive, le sperme, le méconium, le foie, le placenta, le cordon ombilical et les tissus graisseux [280, 282-287]. Ces études ont permis d’évaluer l’exposition humaine au DEHP comme étant entre 3 à 52,1 µg/kg/jour [279, 288-290]. Elles ont aussi démontré que la demi-vie du DEHP est 13,49 heures et que celle du MEHP est de 5,99 heures [288]. Suite à l’ingestion, le MEHP est le métabolite sérique le plus abondant avec une concentration moyenne mesurée à 5,0 μg/mL (18 µmol/L) [287].

Les études de Silva et al (2004) et de Buser et al (2014) soulignent l’importance des variations des concentrations urinaires mesurées de MEHP dans différents sous- groupes de la population. L’étude suggère que les concentrations liées à l’exposition décroissent significativement avec l’âge. Ainsi l’exposition serait plus élevée chez les enfants que chez les adolescents qui, eux-même, le seraient plus que chez les adultes. De plus, les concentrations de MEHP sont aussi toujours plus élevées chez les individus de sexe féminin que celles des individus de sexes masculins [291, 292].

56 Selon les auteurs les différences de concentration mesurées découlent de la différence d’exposition aux phtalates. Ainsi, les femmes seraient plus exposées en raison de leur consommation de produits de soins personnels tels les produits coiffants, les cosmétiques et parfums. Les concentrations plus élevées chez les enfants pourraient être dues à leurs nombreux contacts avec des produits de vinyle (plancher, siège de voiture, jouets, etc.) mais ils seraient fort probablement davantage liés à leur exposition accrue à travers la nourriture et l’inhalation. Chez les enfants, les concentrations seraient notamment plus élevées en raison de leur plus faible masse corporelle [291]. À ma connaissance, aucun auteur n’a rapporté de statistique sur les différences métabolites réelles entre les hommes, les femmes et les enfants en ce qui a trait à l’élimination des phtalates.

1.10.3 Mode d’action du DEHP et de son métabolite

Les résultats obtenus par Hurst et Waxman (2003) démontrent que le MEHP, MBzP ainsi que la MBuP activent à la fois le récepteur aux proliférateurs de peroxysomes alpha et le gamma (PPARα et PPARγ). In vitro, des concentrations de 500 nM à 30 µM sont suffisantes pour activer la transcription au niveau d’un élément de réponse aux proliférateurs de peroxysomes (PPRE) transfecté dans des cellules COS-1. Les données de ces auteurs sont particulièrement importantes puisqu’elles démontrent que les récepteurs humains sont aussi sensibles à l’activation par le MEHP que le sont les récepteurs murins [293, 294].

Afin de démontrer le rôle fonctionnel de PPARα dans l’étiologie des perturbations liées à l’exposition au DEHP, le groupe de Ward (1998) a comparé l’impact de l’exposition des souris Pparα invalidées (Pparα-/-) (souche SV/129) à celle de l’exposition des souris de type sauvage (souche SV/129). Ward et ses collègues (1998) ont noté que les souris mâles de type sauvage exposées au DEHP sont jusqu’à 30% plus petites (en terme de poids) que les souris mâles invalidées pour Pparα, qui elles-mêmes ont un poids similaire aux souris de type sauvage non exposées. De plus, ils ont noté que les souris de type sauvage exposées au DEHP (12 000 ppm) développent des anomalies au niveau du foie, des reins et des testicules [295]. Chez les souris de type sauvage

57 exposées au DEHP, la masse du foie croit rapidement (hépatocytomégalie, hépatocytes cytoplasmiques granulaires éosinophiles et cellules de Kupffer pigmentées) de manière continue jusqu’à doubler de volume, alors que les foies des souris Pparα invalidées ne sont que légèrement affectés [295]. Les souris de type sauvage exposées au DEHP développent également de sévères néphropathies (atrophie, dégénérescence tubulaire focale, hyperplasie tubulaire régénérative et importants kystes des tubules rénaux, particulièrement dans la partie droite des tubules proximaux) contrairement aux souris non exposées qui, elles, n’ont aucun problème rénal. Les souris Pparα invalidées exposées développent, elles aussi, des néphropathies. Néanmoins, leurs néphropathies sont bien moins sévères et progressent beaucoup plus lentement [295]. Les testicules des souris de type sauvage exposées au DEHP présentaient des lésions au niveau des tubules séminifères et aucun signe de spermatogenèse [295].

Les mêmes auteurs rapportent que tous les animaux exposés au DEHP ont des testicules de plus faibles poids et qu’ils ont tous développé des lésions au niveau des tubules séminifères. Ainsi autant les souris de type sauvage exposées que les souris Pparα invalidées exposées avaient la spermatogenèse arrêtée. Cet article démontre que PPARα est impliqué dans le développement précoce des complications associées à l’exposition au DEHP, mais qu’il n’est pas le seul médiateur puisque les pathologies se développent tout de même en son absence [295].

Les données recueillies à ce jour démontrent clairement que l’exposition au DEHP (et à ses métabolites) induit une diminution de la virilisation, dont la contrepartie est une induction de féminisation (cryptorchidie, rétention des mamelons, mauvais positionnement du méat urinaire, plus faible poids, etc.). Afin de déterminer si l’effet du DEHP est de nature anti-androgénique ou pro-estrogénique, des essais in vitro ont été effectués par différents laboratoires [296-298]. Ils sont tous arrivés aux mêmes conclusions ; l’effet du DEHP est de nature anti-androgénique puisque que le DEHP, comme la plupart des phtalates, n’est ni capable de lier ou d’activer le récepteur aux estrogènes alpha ou bêta, ni capable d’induire une quelconque réponse dans des cellules sensibles aux estrogènes [296-298].

58 1.11 Les estrogènes

Cela fait bien des années qu’a été émise l’hypothèse d’un lien entre l’exposition in utero aux estrogènes et les anomalies des fonctions reproductrices masculines. Ce lien a été proposé pour la première fois dans le cadre de la discussion de l’article de Henderson et al (1979) [299] puis repris par Depue et al en 1983 et 1984 [300, 301]. Dix ans plus tard, Niels Skakkebaek et Richard M. Sharpe remettent l’hypothèse au goût du jour [302]. C’est à ce moment que l’«hypothèse des estrogènes» a été popularisée. Leur hypothèse proposait que l’exposition des fœtus en développement aux estrogènes puisse être la cause des anomalies observées (cancer des cellules germinales, cryptorchidie, hypospadie et faible compte des spermatozoïdes ou infertilité).

Richard M. Sharpe revisite les dernières données et soulignent l’importance du travail de ses prédécesseurs dans son article de revue de 2003 [303]. Il fait le tour des évidences des dix dernières années et met en relief les différentes avancées faites. Son analyse fait ressortir que l’équilibre hormonal entre les actions respectives des androgènes et des estrogènes semble essentiel à la différenciation des fœtus et au développement néonatal de ces derniers, autant garçons que filles. Ainsi, tout élément capable de perturber la balance entre les estrogènes actifs et les androgènes actifs (ou leurs activités respectives) sont capables de causer des malformations et les symptômes de la dysgénésie testiculaire (TDS) [303].

Dans cet article, Dr Sharpe souligne plusieurs points essentiels et présente les conclusions les plus significatives. Il souligne qu’il se pourrait qu’il y ait une composante génétique, mais cet argument est contesté et redirigé vers l’environnement du fœtus à l’intérieur du placenta. Il rapporte que plusieurs études démontrent que l’exposition humaine à des estrogènes synthétiques induit les symptômes du TDS, mais souligne qu’aucune donnée ne permette de soutenir qu’un estradiol non synthétique induit les mêmes symptômes à faible concentration. Il rapporte aussi que dans l’hypothèse originale, ils suggéraient deux mécanismes d’action qui seraient potentiellement la cause de la cryptorchidie associée à l’exposition in utero à des

59 estrogènes. La première hypothèse originale était la suppression de la production de gonadotrophine (surtout FSH) par l'intermédiaire de la rétroaction négative induite par les niveaux plus élevés d’estrogènes. La seconde hypothèse originale était l’altération du développement des cellules de Leydig conduisant à la production inadéquate de testostérone [302]. En 2003, Dr Sharpe ajoute à ces hypothèses : 1) la suppression de la production d'androgènes, 2) la suppression de l’expression du récepteur aux androgènes (Ar/AR) et 3) la suppression de la sécrétion de l'insuline-like facteur-3 (INSL3) par les cellules de Leydig fœtales [303].

Collectivement, l’ensemble des nouveaux résultats pointe vers un impact significatif des estrogènes puissants comme étant anti-androgènes et des inhibiteurs du développement normal des organes reproducteurs masculins [303].

Je ne désire pas aller dans les détails de son article puisque les estrogènes ne sont pas le principal élément de mes recherches, mais je suggère fortement de lire cet article qui est encore d’actualité dix ans plus tard.

Toutefois, j’aimerais attirer votre attention sur un autre élément important mis en valeur par le groupe de Delbès, Habert et al. Le groupe évoque la possibilité d’une «fenêtre chronologique» de sensibilité aux estrogènes. Cette fenêtre de sensibilité serait en lien avec la sensibilité des gonocytes et des cellules de Leydig aux estrogènes. La sensibilité de ces deux types cellulaires aux estrogènes varie en cours de développement; le testicule foetal et néonatal étant très sensible aux estrogènes. Il est intéressant de mentionner que les auteurs suggèrent que cette variation de susceptibilité serait en lien avec la capacité du testicule à synthétiser ses propres estrogènes [304, 305]. Ainsi, la fenêtre de sensibilité accrue au DES chez l’humain s’étendrait ainsi de la conception jusqu’à la 11ème semaine de gestation [305].

Ce concept de fenêtre de sensibilité accrue est étrangement similaire à celui proposé pour le mode d’action du DEHP/MEHP sur les cellules de Leydig [306].

60 Il est important de mentionner que chaque élément proposé est soutenu par une série d’études épidémiologiques et animales.

1.12 Modèles d’études utilisés dans la compréhension de l’action des phtalates

1.12.1 Les modèles animaux

Dans le domaine de la toxicologie, l’utilisation des animaux de laboratoire est malheureusement incontournable. L’utilisation d’animaux permet de recréer l’ensemble des interactions entre les différents systèmes et d’ainsi évaluer les possibilités et probabilités de l’occurrence d’événements similaires chez l’humain.

À ce jour, les rongeurs ont été utilisés comme organisme mammifère modèle pour la recherche sur la génétique et les interactions systémiques. Plusieurs autres espèces de mammifères sont comparables aux humains sur le plan génique et physiologique (plus de 95 % d’homologie). La commodité reliée à l’utilisation des souris a rapidement fait d’elles le modèle de prédilection des scientifiques. En effet, celles-ci ont un génome similaire à celui des humains dans son code et sa structure; leur développement, leur maturation et leurs processus physiologiques sont semblables; elles développent naturellement des maladies et pathologies retrouvées chez l’humain ou peuvent être facilement génétiquement manipulées pour devenir susceptibles à d’autres pathologies humaines, c’est-à-dire humanisées. De plus, les coûts liés à l’entretien et aux manipulations des souris sont relativement peu élevés dans le contexte de la recherche biomédicale et la souris est une espèce qui se reproduit rapidement et en grand nombre [307].

1.12.1.1 Variabilité interespèces et susceptibilité génétique

De récentes études ont souligné l’importance des différences inter- et intraespèces en ce qui a trait à la susceptibilité à l’exposition au DEHP. Dans leur revue de littérature, Johnson et al soulignent bien les tensions qui émergent au sein de la communauté scientifique [308]. Les données expérimentales suggèrent que les rats (toutes souches confondues) sont l’espèce la plus sensible aux perturbations par les phtalates et autres

61 perturbateurs endocriniens [309]. Chez ceux-ci, l’exposition aux phtalates induit une diminution de la production de testostérone et d’hormones stéroïdiennes surrénaliennes. Cette diminution est attribuée à la diminution de l’expression génique d’enzymes impliquées dans la synthèse d’hormones stéroïdiennes [306, 310].

1.12.1.2 Le rat comme modèle

Les données obtenues sur les rats de souche Sprague-Dawley sont sans équivoque. L’exposition in utero à divers phtalates (dont le DEHP) induit une panoplie de phénotypes indésirables chez les fœtus mâles [306]. À pénétrance maximale (exposition non létale de 500 mg/kg/jour), les mâles souffrent de perturbations du développement des canaux de Wolff, d’une distance anogénitale réduite, de la rétention des mamelons, de cryptorchidie et d’hypospadie. L’étendue des dommages engendrés par les phtalates suggère que les fonctions des cellules de Leydig fœtales sont perturbées, notamment la production d’INSL3 et de la testostérone [311-313].

Plusieurs principes importants ont été démontrés via le modèle de rat. Premièrement, il a été démontré par Howdeshell et al (2007) que l’exposition simultanée à divers phtalates provoque, le plus souvent, des effets additifs [314]. Ces effets peuvent être plus qu’additifs lorsque les phtalates sont combinés à d’autres types de contaminants environnementaux [315]. Deuxièmement, Mylchreest et al (2000) ont démontré que la pénétrance des perturbations sur le phénotype est dose-dépendante [316]. Enfin, les résultats publiés tendent à suggérer que la susceptibilité est souche spécifique puisque les rats Sprague Dawley sont moins susceptibles que les rats Wistar (même pénétrance à plus faible exposition) [317-320]. Toutefois, lorsque les niveaux de testostérone sont utilisés comme marqueur, les deux souches de rats démontrent une courbe dose- réponse similaire, ce qui porte à croire que la susceptibilité accrue des rats Wistar pourrait être davantage le résultat d’une différence d’action/de signalisation des androgènes sur les tissus cibles [321].

62 1.12.1.3 La souris comme modèle

Bien que la souris soit un modèle d’étude de prédilection, celle-ci n’a que très peu été utilisée dans l’étude de l’exposition in utero aux phtalates. Les récents travaux sur les souches de souris de laboratoire populaires exposées aux phtalates suggèrent que les souris sont résistantes aux effets délétères sur le testicule fœtal, du moins sur les cellules de Leydig fœtales. Contrairement au rat, les niveaux de testostérone et d’enzymes stéroïdogéniques ne sont pas altérés par l’exposition in utero aux phtalates [322, 323]. La distance anogénitale est elle aussi inaltérée [324]. Toutefois, ce constat est peut-être imprécis puisque les souris de souche C57BL/6 seraient, elles aussi, sensibles de manière dose-dépendante à l’exposition in utero (diminution de AGD et induction de l’hypospadie) [325] et que l’exposition in utero aux phtalates induit une diminution des concentrations circulantes de testostérone et d’INSL3 chez les souris de souche Kunming [326].

1.12.1.4 Les autres mammifères communs comme modèle

D’autres espèces mammifères ont été utilisées comme modèles pour les recherches de toxicologie sur les phtalates. Chez les lapins, l’exposition in utero des fœtus au DEHP induit chez ces derniers la cryptorchidie [327]. Il y a eu aussi une étude sur le ouistiti, la seule espèce de primate sur laquelle a été testée l’exposition in utero aux phtalates [328]. Malheureusement, cette étude n’a pas été conduite de manière adéquate. Bien que l’administration (dose simple de 500 mg/kg) de MBP (métabolite actif du DBP) induit une chute drastique de la concentration sanguine de T en moins de 5 heures dans leur étude (ils ont utilisé le métabolite actif, car il a été démontré que les jeunes ouistitis n’ont pas encore la capacité de métaboliser le DBP), leurs données ne permettent pas de conclure sur la toxicité induite par une exposition prolongée puisque leur système manquait de sensibilité et qu’ils n’ont pas été en mesure de reproduire les observatiosns faites par différents laboratoires dont les résultats sont reconnus (Gray, 2000 #2343). Ils n’ont, entre autres, pas pu reproduire le phénotype observé chez le rat. Les observations faites par ce groupe ont donc eu peu d’impact.

63 1.12.2 Les lignées de cellules de Leydig

Différentes lignées de cellules de Leydig transformées ont aussi servi dans le cadre de l’étude sur les perturbations engendrées par les phtalates [329, 330]. Il n’y a pas, pour le moment, de modèle/lignée de cellules de Leydig humaines. Nous utilisons donc des lignées de cellules de Leydig isolées de petits rongeurs. Celles-ci sont présentées ci- dessous.

1.12.2.1 La lignée MA-10

Les cellules de Leydig de souris MA-10 ont les caractéristiques des cellules de Leydig au stade adulte immature. Elles produisent toutefois peu de testostérone due à une mutation dans le gène Cyp17a1 qui rend l’enzyme moins fonctionnelle [331].

Balvers et al (1998) ont quant à eux stimulé les cellules de Leydig de souris MA-10 avec 0,2 et 0,4 µg/ml (345 et 690 µM) de testostérone en absence de sérum. Ils n’ont observé aucun effet sur la production d’INSL3 [202]. Ces résultats sont différents des miens. Je vous invite à lire la discussion où j’expose les raisons, qui selon-moi, expliquent cette différence.

Le groupe de Sadeghian (2005) a démontré que la lignée de cellules MA-10 et les cellules R2C (lignée de Leydig de rat) sécrètent INSL3 dans le milieu de culture. Puis, ils ont stimulé sans succès l’expression d’INSL3 à l’aide de différents modulateurs reconnus de la stéroïdogenèse (l’hCG, l’ANP, le PMA, le TGFβ, le 8Br-cAMP, l’IGF1, le TNFα, l’estradiol ou le dexaméthasone), et ce, en réponse précoce (4h) ou tardive (24h et 48h). Il est à noter qu’ils ont utilisé une technique moins sensible, la réaction en chaine par polymérase (PCR), cette technique n’est plus utilisée de nos jours pour faire ce genre d’analyse [175] ceci pourrait expliquer en partie l’absence de modulation de l’expression d’Insl3 observée. De plus, ils n’ont pas effectué leurs différentes stimulations dans un milieu minimal ou sans testostérone, ce qui, à mon avis, ne permet pas d’apprécier la réponse observée.

64 Le groupe d’Anand-Ivell (2009) confirme que la lignée de cellules MA-10 sécrète INSL3 dans le milieu de culture tel que le font les cellules de rat isolées (culture primaire) [332, 333]. Ils rapportent aussi que la production d’INSL3 n’est pas régulée de manière aiguë par différents modulateurs de la sécrétion de testostérone comme l’hCG, le peptide atrionatriurétique (ANP) ou l’acétate de phorbole myristate (PMA) [332] ce qui vient renforcir les données du groupe de Sadeghian [175].

Les MA-10 ont aussi été utilisées comme modèle de cellule de Leydig afin de comprendre, au niveau moléculaire, comment les mono-esters de phtalates (tel que le MEHP) interfèrent avec la production de testostérone. Dans son article de 2010, Clewell confirme une fois de plus que les MA-10 sont sensibles à l’exposition aux phtalates. Les MA-10 exposées à une dose de MEHP supérieure à 30 µM ont une diminution de 30 % de leur production de progestérone. À cette exposition, aucune autre fonction mesurée des cellules de Leydig n’est affectée [334]. Le groupe de Dees (2001) va plus loin en démontrant que l’exposition des cellules MA-10 à différentes doses de MEHP modifie la capacité subséquente des cellules à répondre à l’hCG (mesurée en production de progestérone) [335]. Avec l’avancée des différentes techniques d’analyse, des résultats similaires ont été observés à des expositions de 1 µM de MEHP [336].

Ainsi, la plupart des auteurs ont conclu que l’expression d’Insl3 par les cellules de Leydig est constitutive.

1.12.2.2 La lignée MLTC-1

Tout comme la lignée MA-10, les cellules de Leydig de souris MLTC-1 dérivent d'une tumeur des cellules de Leydig transplantable des souris C57BL/6. Ces cellules ont les caractéristiques des cellules de Leydig au stade adulte mature et produisent de la testostérone [337].

La lignée MLTC-1 a elle aussi servi à maintes reprises en tant que modèle cellulaire in vitro pour tester l’impact de l’exposition aux phtalates. Dans son article de 2008,

65 Gunnarsson a exposé des MLTC-1 à différentes concentrations de MEHP allant de 10 à 100 µM [338]. En absence de stimulus autre que le MEHP, il observe une augmentation de la production de progestérone et de testostérone. Selon cette expérimentation, le MEHP induirait une augmentation de la production de progestérone sans engendrer une augmentation de l’AMPc. Cette augmentation pourrait être attribuable à une disponibilité accrue des substrats puisqu’en présence de MEHP seulement, la lipase hormonosensible (HSL) et la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) réductase sont augmentées, elles aussi, de manière dose- dépendante. Ces résultats sont plutôt étonnants puisque Gunnarsson montre aussi une diminution de StAR, P450scc et de P450c17 en réponse à 100 µM de MEHP. D’un autre côté, lorsque la stéroïdogenèse est stimulée par l’hCG, l’effet global du MEHP est similaire à celui observé chez la lignée MA-10 et chez les cellules de Leydig isolées de testicules de rats [338].

Curieusement, Wang a publié deux articles coup sur coup (2006 et 2007) où il déclarait avoir observé des réactions opposées des MLTC-1 à l’exposition au MBP (mono-ester actif du DBP). Selon ces articles, le mono-ester agirait sur la voie de signalisation intracellulaire activée par l’hormone chorionique gonadotrope (hCG). L’effet du mono-ester se produirait en aval de l’activation de la protéine kinase A (PKA). Bien que contre-intuitives, ces données appuient les observations faites par divers groupes. Ceux-ci ont démontré que l’exposition à différents mono-ester de phtalates induit une réponse biphasique, c’est-à-dire une réponse en fonction de la dose qui n’est pas linéaire (activation à faible dose et répression à forte dose) [339, 340].

1.12.2.3 La lignée BLTK1

À ma connaissance, c’est la première fois que la lignée de cellules de Leydig de souris BLTK1 est utilisée pour faire des analyses toxicologiques in vitro.

Les cellules de Leydig de souris BLTK1 ont les caractéristiques des cellules de Leydig au stade adulte mature et produisent de la testostérone [341].

66 La lignée BLTK1 est isolée de souris transgéniques exprimant l’antigène T du virus simien 40 (SV40) sous le contrôle du promoteur de l’inhibine A [342, 343]. Toutes les enzymes nécessaires à la synthèse des hormones stéroïdiennes seraient exprimées et fonctionnelles dans cette lignée. De plus, ces cellules répondraient de façon normale à la stéroïdogenèse induite par l’activation de LHCGR. Les résultats du groupe de Forgacs (2012) démontrent qu’en présence de 100 µM de MEHP, la production de testostérone est induite 1,5 fois par rapport au niveau basal alors que la stimulation par hCG (3 ng/ml) induit la production de testostérone par un facteur de 4. Toutefois, lorsqu’ils combinent ces facteurs (100 µM MEHP et hCG), ils observent une inhibition de l’induction de la production de testostérone de l’ordre de 20 à 25 % par rapport à la production induite par la hCG. Ces cellules exhibent une diminution des hormones stéroïdogéniques et une réponse biphasique à la présence du MEHP [341]. Ceci suggère que ces cellules se conduisent comme tous les autres modèles in vitro. De surcroit, leur modèle appuie les différentes observations dans la littérature et les résultats présentés dans ce document, puisque la réponse à un inducteur de l’activité métabolique des cellules de Leydig est partiellement inhibée par l’exposition simultanée au MEHP.

1.13 Mécanismes de régulation de l’expression génique

Dans cette section, je m’efforcerai de vous présenter brièvement divers types de mécanismes moléculaires qui pourraient être impliqués ou avoir une importance significative dans la compréhension de l’induction de la transcription des gènes murin (Insl3) et humain (INSL3) ou encore dans l'étiologie des perturbations causées par l’exposition des cellules de Leydig au MEHP.

La régulation de l'expression génique est dépendante d’une panoplie de mécanismes dont l’activité croisée entrainera l’augmentation ou la diminution de la transcription ou de la traduction. La régulation de l'expression génique est particulièrement importante chez les organismes multicellulaires, car elle permet, à partir d’un code génétique unique, l’expression différentielle de gènes qui entraineront une spécialisation cellulaire et donc permettront le développement d’organismes plus complexes.

67 De façon générale, n'importe quelle étape menant à l'expression d’un gène peut être modulée. L'expression génique peut être régulée à plusieurs niveaux : au niveau de la chromatine (qui contrôle l’accès à l’ADN et donc aux gènes), au niveau de la transcription, au niveau de la stabilité des ARNm, au niveau de la traduction et au niveau des modifications post-traductionnelles.

1.13.1 Régulation de l’expression génique par l’épigénétique

L’épigénétique est un mécanisme qui permet d’imposer et de maintenir des changements durables à l’expression génique. Lorsqu’on décrit l’épigénétique, on fait généralement référence aux protéines et domaines enzymatiques qui modifient de façon covalente l’ADN et les histones (protéines qui régulent la conformation de l’ADN et par le fait même son accessibilité) afin de moduler l’activité des molécules régulatrices de la transcription génique [344]. Les différentes modifications peuvent être temporaires (ex. phosphorylation) ou plus permanentes (méthylation ou acétylation). Quelques-unes de ces modifications sont transmissibles d’une cellule à l’autre lors de la division cellulaire et à travers les cellules germinales. L’épigénétique est particulièrement intéressante en ce qui a trait à la programmation et la reprogrammation des cellules. La programmation des cellules pourrait être impliquée dans le syndrome de dysgénésie testiculaire observé à l’âge adulte chez les fœtus exposés in utero au DEHP. Les principaux mécanismes épigénétiques modulant l’expression sont les modifications de l’ADN, les modifications post-traductionnelles des histones et la modulation par les ARN non codants [345, 346].

En ce qui touche la modification l’ADN par des procédés d’épigénétique, la plus fréquente modification de la séquence d’acide déoxyribonucléique (ADN) est la méthylation du résidu cytosine par des méthyltransférases. Environ 1 % des résidus cytosine sont méthylés. De ce 1 %, environ 30 % des groupements méthyles sont sur des dinucléotides CA, CT et CC, et 70 % sont retrouvés sur des dinucléotides CG communément appelés îlots CpG (C-phosphate-G). L’ADN fortement méthylé réduit l’accès des facteurs de transcription aux éléments de réponse, ce qui réduit la transcription génique [347, 348].

Les mécanismes d’épigénétique interviennent aussi au niveau des modifications post- traductionnelles des protéines et des histones. Les histones sont sujettes à une panoplie de modifications post-traductionnelles qui entrainent des changements de conformations de la chaine d’ADN et modulent ainsi l’accès des facteurs de transcription aux éléments de réponse. Les histones peuvent être acétylées, méthylées, ubiquitinées, phosphorylées, crotonylées, butyrylées et palmitoylées. À ce jour, les modifications des histones les mieux caractérisées sont la méthylation et l’acétylation des résidus lysines des histones.

Alors que la méthylation est catalysée par des méthyltransférases, l’acétylation, elle, est catalysée par des histone-acétyltransférases (HAT). L’ajout du groupement acétyle (COCH3), aux résidus lysine des queues N-terminales des histones, par les HAT neutralise la charge positive des résidus lysine et modifie la taille de la chaine latérale du résidu. Cette modification induit à la fois un changement de conformation et le interaction avec l’ADN qui est chargé négativement. La réduction de polarité entre histones et ADN favorise le relâchement de la chromatine ce qui a pour effet de faciliter l’accès de l’ARN polymérase II et des facteurs de transcription aux différentes régions régulatrices modulant l’expression du gène. L’acétylation des histones est une modification réversible, où l’acétylation favorise la transcription alors que la désacétylation (catalysée par des désacétylases) inhibe la transcription [349].

En résumé, l’acétylation du résidu lysine relâche la structure du complexe histones- ADN et permet la transcription des gènes. La méthylation des résidus, tant à elle, peut avoir des effets activateurs ou répresseurs en fonction du nombre de groupement et du type d’histones. Les modifications de nature épigénétique impliquent l’activité des DNA méthyltransférases, histones déméthylases, histones acétyltransférases et histones désacétylases [350].

La plupart des eucaryotes utilisent de petits ARN interférents non codants, des micro- ARN ou des siRNA (pour small interfering RNA) pour inhiber l’expression de gènes

69 spécifiques. Ces petits ARN interférents sont capables de reconnaître et de se lier spécifiquement à des séquences d’ARN messagers. La formation de ce dimère d’ARN provoquera soit le clivage de ces ARNm, soit le blocage de la traduction (voir la référence suivante pour plus de détails) [351].

1.13.2 Régulation de l’expression génique par l’ARN polymérase

Chez les eucaryotes la transcription de l’ADN en ARNm fonctionnel a lieu dans le noyau et implique trois étapes successives soient l’initiation, l’élongation (synthèse du brin complémentaire) et la terminaison [352]. L’initiation est l’étape la plus régulée de la transcription. Lors de la terminaison, le transcrit primaire d’ARNm subit des modifications post-transcriptionnelles comme la polyadénylation (addition d’une queue de polyA) à son extrémité 3’ et l’addition d’une guanosine méthylée en position N7 du premier nucléotide de l’extrémité 5’ par une liaison 5’-5’ triphosphate (structure connue comme la coiffe).

L’initiation de la transcription chez les eucaryotes est contrôlée par la liaison de différentes protéines au niveau de séquences régulatrices spécifiques connues sous le nom de promoteurs. En général, ces séquences promotrices se trouvent en amont des régions codantes des gènes. Ces protéines qui permettent la liaison de l’ARN polymérase II à l’ADN et qui modulent son activité sont appelées facteurs de transcriptions généraux TFIIX (facteur général de transcription pour l’ARN polymérase II où X représente la consonne qui les identifie). La liaison de ces facteurs de transcription à l’ADN permettra le recrutement/l’association de l’ARN polymérase II non phosphorylée [353] et la formation du complexe d’initiation de la transcription [352, 354]. La phosphorylation subséquente de l’ARN polymérase induira le début de l’élongation de la transcription qui conduira à la production d’un ARNm [355].

Les facteurs généraux de transcription sont des complexes protéiques qui modulent l’activité de base du promoteur d’un gène activé. Leur structure en doigt de zinc leur permet de se lier à l’ADN sur des séquences consensus au niveau des promoteurs des gènes. La plupart des facteurs généraux de transcription reconnaissent ce qu’on appelle

70 la « boîte TATA ». Cette « boîte » est en fait une séquence AT-riche dont la séquence consensus TATAA est située à 30 paires de base en amont du site d’initiation de la transcription (+1) [356]. Cette boîte TATA est retrouvée dans la plupart des gènes. Elle est toutefois quelques fois absente. C’est notamment le cas dans les gènes dont l’expression est constitutive [357]. Ces gènes disposeraient d’une séquence initiatrice qui semble agir comme un promoteur capable d’induire un niveau basal de transcription [358, 359].

Le recrutement du complexe TFIID (constitutivement exprimé) au niveau de la boîte TATA se fait dans un ordre précis. Tout d’abord, la sous-unité TBP (TATA binding protein) se lie [358, 359] puis les autres sous-unités de TFIID, les TAF (TATA- associated factors), viennent s’ajouter au complexe et agissent en tant que coactivateurs en réponse aux inductions par des activateurs de la transcription [360].

L’activité de plusieurs sous-unités viendra améliorer la stabilité du complexe et permettre la transcription. C’est notamment le cas de TAFII250 dont l’activité histone acétyltransférase contribuera au relâchement de la chromatine [361] et le cas de TFIIA dont la liaison au complexe et à l’ADN empêchera l’inhibition de TFIID par les facteurs DR1 et DR2 qui, en temps normal, séquestrent ce dernier [353]. Par la suite, TFIIB va venir, à son tour se fixer sur le côté de TBP et se lier simultanément avec l’ADN de chaque côté de la boîte TATA [362, 363]. Cette liaison est essentielle à la formation du complexe d’initiation puisque le facteur TFIIB est responsable du recrutement du complexe TFIIF/ARN polymérase II préalablement formé [364]. Il est important de mentionner que TFIIF a une double fonction. Premièrement, il empêche l’interaction de l’ARN polymérase II avec une séquence non-promotrice de l’ADN et deuxièmement il permet et stabilise l’interaction de l’ARN polymérase II avec le complexe TFIIB/TBP/ADN. TFIIF a aussi une fonction hélicase ATP-dépendante qui permettra de dissocier les brins d’ADN et permettra l’élongation de la transcription. Enfin, trois autres facteurs sont recrutés au complexe, TFIIE, TFIIH et TFIIJ [365]. TFIIH possède, lui aussi, une activité hélicase. TFIIH phosphoryle le domaine C- terminal de l’ARN polymérase [366] et induit ainsi son activation et l’activation de la

71 transcription. TFIIH a aussi une activité de correction des erreurs (proof reading) permettant d’éviter des possibles erreurs de transcription [367, 368]. Une fois que tous les facteurs sont en place et que le complexe est bien formé, l’ARN polymérase démarre la transcription en restant associée à TFIIF tout au long de l’élongation alors que TFIIA et TFIID restent associés au promoteur et sont ainsi capables de se lier à une autre ARN polymérase pour répéter un autre cycle d’initiation.

Il est important de mentionner que ce complexe « rudimentaire » d’initiation de la transcription a une faible processivité. D’autres facteurs doivent s’ajouter au complexe pour augmenter l’activité transcriptionnelle à partir du promoteur. Pour n’en nommer que quelques-uns, il y a le facteur de transcription CTF (CCAAT box-binding transcription factor ou nuclear factor I, NFI) et les facteurs C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) qui reconnaissent et se lient à une boîte CAAT, une séquence nucléotidique située à 70 paires de base en amont du site d’initiation de la transcription [369, 370]. Il y a aussi le facteur SP1 qui module et augmente la transcription en se liant aux séquences riches en nucléotides GC (boîtes GC) sur les promoteurs des gènes qui les contiennent [371].

L’expression de gènes spécifiques à un type cellulaire ou à un tissu est dirigé par des facteurs de transcription spécifiquement exprimés ou activés dans ce type cellulaire. Ces facteurs de transcription se lient au niveau de l’ADN à des séquences spécifiques appelées « éléments de réponse ». La liaison de tels facteurs de transcription spécifiques à l’ADN entraine une modification de l’activité transcriptionnelle induite au niveau du promoteur. Dans le cas de facteurs de transcription dits « activateurs », il y a formation d’une interaction entre le facteur de transcription et TFIID. La formation de cette interaction stabilise le complexe TFIID et augmente la processivité de celui-ci (le recrutement de l’ARN polymérase). La processivité accrue résulte en une production accrue d’ARNm codant pour le gène d’intérêt. Inversement, les facteurs de transcription dits « répresseurs » déstabilisent le complexe transcriptionnel et diminuent ou inhibent la transcription génique [372, 373]. Les facteurs de transcription exercent cette fonction de contrôle soit seuls, soit en compagnie d’autres protéines

72 (appelés des coactivateurs ou des corépresseurs selon le cas) ou soit en formant des complexes protéiques qui favorisent ou empêchent le recrutement de l’ARN polymérase II à des gènes spécifiques [374-376].

Les éléments de réponse d’un gène sont généralement situés en périphérie de la séquence codante. La majorité des éléments de réponse sont dans la région du promoteur proximal (en amont du +1). Toutefois, on retrouve souvent des éléments de réponse dans les régions du promoteur distal (plus de quelques centaines de paires de base), dans les régions dites amplificatrices ou silencieuses, dans le 5’UTR et dans le 3’UTR, UTR étant le terme anglophone pour région non traduite que l’on retrouve sur le brin d’ARNm [360, 373, 377]. Ces différents éléments de réponse peuvent se trouver en amont, en aval ou même à l’intérieur d’une région transcrite. De plus, leur activité est indépendante de leur orientation par rapport au site d’initiation de la transcription du gène d’intérêt.

Un gène peut posséder plusieurs types d’éléments de réponse. L’expression génique du gène dépendra alors de l’équilibre dynamique créé par les actions positives et négatives des facteurs de transcription. C’est cet équilibre qui déterminera le taux de transcription de ce gène dans des conditions spécifiques [378].

Il ne faut pas oublier que les facteurs de transcription sont le produit de la transcription génique et de la traduction subséquente de ces ARNm. L’expression des facteurs de transcription constitue donc elle-même un mécanisme de contrôle de l’expression des gènes. L’expression protéique des facteurs de transcription est donc une étape obligatoire à l’expression des gènes en aval [373].

1.13.3 Régulation de l’expression génique via la régulation de la traduction

La régulation de l’expression génique peut aussi se faire au niveau de la traduction de l’ARNm en protéine qui se déroule dans le cytoplasme de la cellule. La plupart des mécanismes qui affectent la traduction de l’ARNm agissent sur l’initiation de la traduction par le ribosome ou sur les facteurs nécessaires à l’initiation. La régulation

73 de la traduction est générée par la modification post-traductionnelle de ces facteurs d’initiation (eIFs), dont plusieurs sont des phosphoprotéines (par exemple eIF4E et eIF2) [379]. Le contrôle individuel de la traduction des ARNm dépend aussi du transcrit lui-même et de ses caractéristiques structurales (structures secondaires) qui en découlent. Selon sa séquence, l’ARNm peut avoir des structures dans sa région 5’UTR qui inhibent l’initiation soit directement, en empêchant la sous-unité 40S de se lier ou de scanner l’ARNm, soit indirectement, en agissant comme des récepteurs pour des protéines de liaison à l’ARNm [379]. Il est important de noter que les structures secondaires formées peuvent être affectées dans certaines conditions, telles que la température ou la présence d’un ligand. La régulation de la traduction peut également être modulée par la stabilité de l’ARNm, qui dépend de la longueur de sa queue de poly A et aussi par son emmagasinage dans le cytoplasme [1].

1.13.4 Régulation de l’expression génique non classique

1.13.4.1 Modifications post-traductionnelles des facteurs de transcription

La modification post-traductionnelle est l’ajout de petites molécules (ou groupements) à la chaine peptidique de la protéine. Les modifications post-traductionnelles viennent modifier les capacités de liaison, d’interactions et/ou la conformation de la protéine, et influencent ainsi son activité enzymatique, sa localisation cellulaire, ses interactions protéine-protéine, son action dans les cascades de signalisation intracellulaire, sa stabilité et son renouvellement.

Les modifications post-traductionnelles les plus fréquemment répertoriées sont 1) l’acétylation des résidus lysine, 2) la glycosylation et la glycation, 3) l’hydroxylation, 4) la méthylation, 5) la phosphorylation des résidus sérine ou thréonine, 6) l’ubiquitination et 7) la SUMOylation.

La modification post-traductionnelle des facteurs de transcription (TF) est probablement la façon la plus énergétiquement efficace de contrôler l’activité

74 cellulaire, car elle permet une forte réactivité à un faible coût énergétique (il n’y a ni transcription ni traduction à faire; toutes les protéines sont déjà présentes).

1.13.4.1.1 L’acétylation

L’acétylation est une réaction qui introduit un groupe fonctionnel acétyle COCH3 dans un composé organique par substitution d’un atome d’hydrogène. L’acétylation des résidus lysine est effectuée par des domaines à activité N-terminal acétyltransférase [380, 381]. C’est une modification post-traductionnelle réversible grâce au clivage du groupe acétyle par l’action des enzymes désacétylases. L’acétylation à lieu au niveau d’un motif d’acides aminés KLKK. Ce motif est conservé et reconnu par toutes les espèces. Il est notamment présent dans la région charnière du récepteur aux androgènes (AR). Dans cette région, la présence d’un groupement acétate est requise pour l’activation subséquente par la testostérone [382].

1.13.4.1.2 La glycosylation et la glycation

La glycosylation et la glycation sont des modifications co-traductionnelles ainsi que post-traductionnelles qui consistent en l’ajout d’un fragment de sucre à des protéines, des lipides, ou d’autres molécules organiques que celles se retrouvant à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule. La LH, FSH, hCG et TSH sont des exemples d’hormones glycosylées. La glycosylation implique une réaction enzymatique réversible. Cette réaction enzymatique dépend étroitement du site de glycosylation et du substrat de glycosylation. La glycation résulte d’une modification covalente et d’une réaction chimique aléatoire. Les produits de la glycation sont souvent non fonctionnels. La glycosylation joue un rôle prépondérant dans la localisation des protéines, les interactions protéine-protéine, la stabilité structurelle de la cellule, les réponses immunitaires et la modulation de la signalisation cellulaire [383, 384]. La glycosylation rend les polypeptides plus résistants à la protéolyse. La production d’une glycoprotéine dysfonctionnelle peut donc occasionner différentes maladies comme le cancer, la cirrhose hépatique, le diabète, le VIH et les infections exacerbées [385, 386].

75 1.13.4.1.3 L’hydroxylation

L’hydroxylation est un processus d’oxydation qui introduit un groupe hydroxyle (-OH) dans un composé organique. L’hydroxylation est souvent facilitée par des enzymes appelées hydroxylases. L’acide aminé qui est le plus souvent hydroxylé dans les protéines est la proline, mais d’autres acides aminés comme la lysine, la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane peuvent également être hydroxylés [387]. L’hydroxylation est importante pour la détoxication cellulaire puisqu’elle convertit des composés hydrophobes en produits solubles hydrophiles [388].

1.13.4.1.4 La méthylation

La méthylation est catalysée par des méthyltransférases et consiste en la substitution d’un atome d’hydrogène ou d’une autre molécule par un groupe méthyle (CH3) ou l’addition de ce dernier groupe à un substrat. La méthylation est impliquée dans divers processus, dont la modification de métaux lourds, la régulation de l’expression génique, la régulation de la fonction des protéines et la modification des ARNm. La méthylation de protéines est prépondérante tout au long de la vie d’un individu, du développement embryonnaire jusqu’au développement postnatal, et est en lien avec l’apparition de différentes maladies telles que le cancer et certaines maladies neurodégénératives [389-391]. Les acides aminés les plus méthylés sont l’arginine et la lysine [392]. La méthylation affecte (avec l’acétylation) les histones et donc contrôle l’expression génique. La méthylation affecte aussi la synthèse des ARN et leur dégradation ainsi que la stabilité des protéines [392].

1.13.4.1.5 La phosphorylation

Chez les eucaryotes, la phosphorylation des résidus sérine, thréonine, tyrosine ou histidine est sans doute la modification post-traductionnelle la plus fréquente. L’ajout ou le retrait des groupements phosphate (PO3-2) est effectué par des protéines à activité kinase, alors que l’inverse est effectué par des protéines à activité phosphatase. La phosphorylation se produit souvent sur plusieurs acides aminés d’une même protéine [387]. Lors de la perception d’un signal extracellulaire comme à une hormone, une

76 cytokine, un facteur de croissance ou à une variation du niveau de calcium intracellulaire [393], de nombreuses protéines, enzymes et récepteurs nucléaires son activés ou inactivés par une ou plusieurs réactions de phosphorylation ou de déphosphorylation qui modifient principalement leur stabilité conformationnelle et leur localisation intracellulaire. La modulation par phosphorylation est particulièrement présente dans les voies de signalisation intracellulaire (ex. les MAPK) [394], notamment dans la voie de signalisation ERK/MAPK [387].

1.13.4.1.6 L’ubiquitination

L’ubiquitination est l’ajout d'une petite protéine appelée ubiquitine qui se trouve dans presque tous les tissus (ubiquitaire) des organismes eucaryotes (d’où son nom). Il s’agit d’une petite molécule (76 acides aminés; 8.5 kDa) présente dans les cellules eucaryotes. L’ubiquitination est effectuée en trois étapes : l’étape d’activation de l’ubiquitine réalisée par les enzymes ubiquitine-activatrices (E1s), l’étape de conjugaison réalisée par les enzymes de conjugaison (E2s) et enfin l’étape de liaison par les enzymes ubiquitine-ligases (E3s). L’ubiquitine est liée de façon covalente sur un résidu lysine de la protéine cible. La fonction la plus connue de l’ubiquitination est l’identification des cibles qui seront détruites par protéolyse (via le protéasome et le lysosome) [395]. Toutefois, l’ubiquitination peut aussi moduler la localisation cellulaire de la protéine, son activité enzymatique et ses interactions protéine-protéine [396-398]. Les effets observés de l’ubiquitination dépendent du nombre d’ubiquitination généré sur la protéine cible. L’addition d’une seule molécule d’ubiquitine (mono-ubiquitination) affecte le trafic membranaire, l’endocytose et la réplication virale [399, 400], alors que l’addition de plusieurs molécules d’ubiquitine (poly-ubiquitination) [401] affecte principalement la dégradation des protéines, mais peut aussi coontribuer à l’endocytose, au processus d’inflammation, à la réparation de l’ADN et à la traduction de protéines [400]. L’ubiquitine peut être clivée grâce à l’action des enzymes de dé- ubiquitination étant des cystéines protéases. Ces dernières coupent la liaison entre les deux protéines [402].

77 1.13.4.1.7 La SUMOylation

La SUMOylation est l’ajout d'une protéine appelée “small ubiquitin-like modifier” (100 acides aminés; 12 kDa) par liaison covalente sur un résidu lysine. La sumoylation s’effectue parfois sur les mêmes résidus que l’ubiquitination et implique un autre groupe d’enzymes qui procèdent de la même manière que les enzymes de l’ubiquitination (E1-E2-E3) [403]. Contrairement à cette dernière, la sumoylation peut soit augmenter la stabilité des protéines cibles, soit agir en tant que signal de localisation intracellulaire [395, 404, 405], mais n’influence pas la dégradation des protéines. Comme pour l’ubiquitination, la sumoylation est un processus réversible puisque la protéine SUMO peut être clivée par des membres de la famille des Sentrin protéases.

1.14 Problématique, hypothèse et objectifs

1.14.1 Problématique

Un modèle in vitro complet permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre les cellules du testicule serait idéal pour étudier les mécanismes moléculaires de la toxicité des composés durant le développement fœtal précoce. Toutefois, un tel modèle ne semble pas exister pour l’instant. Toutes les données recueillies découlent d’études épidémiologiques, dans lesquelles il est difficile d’isoler les facteurs d’induction, ou d’études toxicologiques menées chez les animaux. Les parallèles entre les données obtenues chez les animaux et les données épidémiologiques sont souvent contestés. La définition précise du mécanisme d’action du DEHP/MEHP menant à la diminution marquée de la production hormonale par les cellules de Leydig faciliterait grandement l’extrapolation des données entre les espèces et permettrait ainsi de conclure une fois pour toutes sur les risques que le DEHP/MEHP représente pour la santé des mammifères. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro adéquat pour réaliser les analyses permettant d’obtenir le niveau de détails requis. Ainsi, il n’existe que très peu de données et de comparables sur lesquels se baser. Nous devons donc identifier ou développer un modèle cellulaire permettant l’étude des mécanismes moléculaires de la répression de l’expression du gène Insl3 (produit des cellules de

78 Leydig) par les perturbateurs endocriniens, qui serait, si possible, assez représentatif pour réduire ou éviter le sacrifice d’animaux.

Parmi les avantages reconnus, on peut parler d’accélération de la recherche, d’une diminution des coûts, de la réduction du nombre de sacrifices d’animaux et de la possibilité d’effectuer des analyses plus complexes en plus grand nombre. Toutefois, nous devons être vigilants afin de ne pas générer des artéfacts qui pourraient affecter la pertinence du modèle.

1.14.2 Hypothèse

Mon hypothèse générale repose sur deux observations. Premièrement, les cellules de Leydig produisent à la fois la testostérone et INSL3. Deuxièmement, les niveaux sériques de testostérone et d’INSL3 mesurés sont positivement corrélés. Ces deux constats me permettent de croire qu’il existe un lien entre leur production qui serait intrinsèque à la cellule de Leydig. La production d’une hormone pourrait affecter/induire la production de l’autre. En outre, il est possible que le MEHP compromette la production (via l’expression génique) ou signalisation d’une de ces hormones.

1.14.3 Objectif général

Définir les conditions expérimentales permettant de reproduire le phénotype de diminution de l’expression d’Insl3 / INSL3 en présence d’un perturbateur endocrinien dans une lignée de cellules de Leydig transformées.

Répondre à une série d’hypothèses spécifiques permettra de répondre à l’hypothèse générale et d’ainsi produire des données qui permettront de répondre à la problématique énoncée. Fondamentalement, j’ai segmenté les hypothèses et les expérimentations en deux, soit l’investigation de l’induction de la transcription d’Insl3/INSL3 et l’investigation de la répression de la transcription d’Insl3/INSL3. Les données obtenues et l’évolution de la littérature ont généré de nouvelles hypothèses pour lesquelles il n’a malheureusement pas été possible de conclure pour les raisons expliquées à la section

79 discussion de la thèse. Les hypothèses spécifiques testées sont résumées au tableau intitulé Tableau 1.1 : Hypothèses testées.

Tableau 1.1 : Hypothèses testées Hypothèses résolues 1. L’exposition des cellules de Leydig à la T induit la transcription d’Insl3/INSL3. 2. L’exposition des Leydig au MEHP réduit la transcription d’Insl3/INSL3. 3. L’exposition simultanée des Leydig à la T et au MEHP cause une réduction de l’induction de la transcription d’Insl3/INSL3. 4. L’exposition des Leydig au E2 réduit la transcription d’Insl3/INSL3. 5. L’exposition des Leydig à la T annule l’effet de E2 sur la transcription d’Insl3/INSL3.

Nouvelles hypothèses de recherche générées et non résolues 6. La T est l’androgène qui induit la transcription d’Insl3/INSL3. 7. Le récepteur aux androgènes est directement impliqué dans la transcription d’Insl3/INSL3 induite par la T. 8. Un « récepteur aux androgènes » présent à la surface externe des cellules de Leydig est directement impliqué dans la transcription d’Insl3/INSL3 induite par la T.

1.14.4 Objectifs spécifiques

Par conséquent, l’objectif général a été divisé en huit objectifs spécifiques soient : 1) confirmation de l’expression d’Insl3 par différentes lignées de cellules de Leydig et sélection du meilleur modèle, 2) confirmation que la lignée cellulaire choisie permet l’expression de gènes rapporteurs transfectés, 3) transfection d’un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur d’Insl3 et tests de la modulation de son expression, 4) essais de modulation hormonale de l’expression d’Insl3 (transcription et ARNm) par des hormones normalement présentes dans le voisinage des cellules de Leydig, 5) essais de modulation de l’expression d’Insl3 par des perturbateurs endocriniens (DEHP/MEHP ou E2), 6) contrôle de la conformité des réponses observées entre les cellules de Leydig isolées et les cellules de Leydig du modèle cellulaire sélectionné, 7) identification de la région du promoteur permettant la réponse aux activateurs et/ou répresseurs de la transcription identifiés, 8) identification des sentiers de signalisation intracellulaire et des composantes essentielles via l’utilisation de différents inhibiteurs.

Préambule au chapitre II

L’une des premières étapes du projet était de confirmer que la lignée de cellules transformées MA-10 pouvaient être utilisées comme modèle cellulaire dans l’étude de l’inhibition de l’expression d’Insl3/INSL3 par le MEHP.

Le chapitre 2 sert à démontrer/confirmer que les cellules MA-10 peuvent être utilisées comme modèle cellulaire pour l’étude moléculaire de l’expression d’Insl3/INSL3 et de la répression causée par le MEHP.

Les résultats présentés dans ce chapitre démontrent entre autres que, contrairement à la croyance de l’époque, l’expression d’Insl3/INSL3 est stimulée par la testostérone, ce qui remet en question la nature constitutive de l’expression d’Insl3/INSL3.

Chapitre II

ANTAGONISTIC EFFECTS OF TESTOSTERONE AND THE ENDOCRINE DISRUPTOR MEHP ON INSL3 TRANSCRIPTION IN LEYDIG CELLS

Short Title: MEHP inhibits testosterone-induced Insl3 expression

Éric Laguë1 and Jacques J. Tremblay1,2 *

1 Reproduction, perinatal and child health, CHUQ Research Centre, Quebec City, Quebec, Canada G1V 4G2 2 Centre for Research in Biology of Reproduction, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Université Laval, Quebec City, Québec, Canada G1V 0A6

*Corresponding author:

Dr. Jacques J. Tremblay Reproduction, perinatal and child health CHUQ Research Centre, CHUL Room T1-49 2705 Laurier Blvd. Quebec City, Quebec CANADA G1V 4G2 Tel: 418-525-4444 x46254 Fax: 418-654-2765 E-mail: [email protected]

Disclosure Statement: EL and JJT have nothing to declare.

Keywords: Insulin-like 3, Transcription, Phthalate, Androgen, Androgen receptor, Steroidogenic cells, Testis, Cryptorchidism

2.1 RÉSUMÉ

L’INSL3 (Insulin-like 3) est un petit peptide produit par les cellules de Leydig des testicules durant le développement fœtal et la vie postnatale, ainsi que par les cellules de la thèque et lutéales de l’ovaire adulte. Durant la vie fœtale, INSL3 régule la descente des testicules chez les mâles alors que chez les adultes, il agit en tant que facteur de survie dans les cellules germinales mâles et comme facteur de sélection et de survie chez les femelles. Malgré son importance dans le système reproducteur, les mécanismes de régulation de l’expression d’Insl3 sont peu connus. Il y a de plus en plus de preuves qui suggèrent que les androgènes régulent l’expression d’Insl3 dans les cellules de Leydig. Toutefois, il n’y a pas encore eu de données transcriptionnelles à l’appui. Nous démontrons que la testostérone (T) augmente les niveaux d’ARNm d’Insl3 dans une lignée de cellules de Leydig et dans des cellules primaires. Nous démontrons aussi que la testostérone induit l’activité transcriptionnelle des promoteurs d’Insl3 de différentes espèces. De plus, nous avons noté que l’effet inducteur de la T sur l’activité transcriptionnelle et l’ARNm d’Insl3 nécessite le récepteur aux androgènes (AR). Nous avons localisé l’élément de réponse à la T sur le promoteur proximal d’Insl3. Cette région est toutefois dépourvue d’un élément de réponse aux androgènes consensus, ce qui suggère un mécanisme d’action indirect. Finalement, nous démontrons que le mono-(2-éthylhexyl) phtalate, un perturbateur endocrinien répandu aux effets anti-androgéniques réprimant l’expression d’Insl3 in vivo, réprime aussi la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig en antagonisant l’action de la dyade T/AR. Ces données procurent d’importantes nouvelles perspectives sur la régulation de la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig et sur le mode d’action des phtalates.

87 2.2 ABSTRACT

Insulin-like 3 (INSL3) is a small peptide produced by testicular Leydig cells throughout embryonic and postnatal life and by theca and luteal cells of the adult ovary. During fetal life, INSL3 regulates testicular descent in males while in adults, it acts as an anti- apoptotic factor for germ cells in males and as a follicle selection and survival factor in females. Despite its considerable roles in the reproductive system, the mechanisms that regulate Insl3 expression remain poorly understood. There is accumulating evidence suggesting that androgens might regulate Insl3 expression in Leydig cells but transcriptional data are still lacking. We now report that testosterone does increase Insl3 mRNA levels in a Leydig cell line and in primary Leydig cells. We also show that testosterone activates the activity of the Insl3 promoter from different species. In addition, the testosterone-stimulating effects on Insl3 mRNA levels and promoter activity require the androgen receptor. We have mapped the testosterone-responsive element to the proximal Insl3 promoter region. This region, however, lacks a consensus androgen response element suggesting an indirect mechanism of action. Finally we show that mono-(2-ethylhexyl) phthalate, a widely distributed endocrine disruptor with anti-androgenic activity previously shown to inhibit Insl3 expression in vivo, represses Insl3 transcription, at least in part, by antagonizing testosterone/androgen receptor action. All together our data provide important new insights into the regulation of Insl3 transcription in Leydig cells and into the mode of action of phthalates.

2.3 INTRODUCTION

Insulin-like 3 (INSL3), also known as relaxin-like factor (RLF), is a member of the insulin-IGF-relaxin family of growth factors and hormones (1, 2). This hormone is almost exclusively expressed in the gonads. During fetal life, INSL3 is produced by maturing Leydig cells of the male gonad while in adults it is secreted by both the testis (Leydig cells) and the ovary (theca and luteal cells) (1-4). Consistent with its sexually dimorphic expression pattern during fetal life, INSL3 was found to be a master regulator of gonadal descent, an essential step of the male sex differentiation process. Insl3-/- null mice have bilateral cryptorchid testes located high in the abdominal cavity close to the kidneys (5, 6). Further support for INSL3 as a regulator of testicular descent came from elegant transgenic experiments where INSL3 was overexpressed in pancreatic β-cells of Insl3 null mice (7). In these animals, normal testis descent was restored. Even more convincing was the generation of female transgenic mice overexpressing INSL3 which led to descended ovaries (7, 8). In adults, INSL3 acts as a germ cell survival factor (9) and would also be involved in follicle selection and survival (10, 11).

Despite its important roles in reproductive development and function, surprisingly very little is known regarding the mechanisms regulating Insl3 expression in gonadal cells. At the molecular level, so far only two transcription factors have been shown to regulate INSL3 promoter activity in Leydig cells: the nuclear receptors SF1 (Ad4BP/NR5A1) and NUR77 (NGFI-B/NR4A1) (12-16). At the hormonal level, Insl3 expression was found to require the pituitary luteinizing hormone (LH) in post-natal Leydig cells (3, 9, 17). This, however, is believed to be associated with the differentiation status of Leydig cells, which is dependent on LH, rather than the result of an acute response to LH as for steroidogenesis (3, 18). In addition to LH, there is mounting evidence that Insl3 expression would be regulated by androgens in several species. In testicular feminized (Tfm) mice, which harbor a mutation in the androgen receptor (AR) gene causing complete androgen insensitivity (19-21), Insl3 expression is severely decreased (22). In an AR hypomorphic mice model where AR levels are reduced (23), Insl3 expression was down-regulated nearly 10 fold (24). In these mice,

89 LH and testosterone levels were dramatically increased consistent with normally differentiated and functioning pituitary gonadotrope and testicular Leydig cells (24). In adult rats, GnRH antagonists (chemical castration) down-regulate Insl3 expression (9). Treatment with hCG restored Insl3 mRNA levels in GnRH antagonist-treated animals (9) and in hpg mice (3) which have a deletion of the Gnrh1 gene (25, 26). In humans, INSL3 and testosterone concentrations are significantly correlated (17, 18). Finally, endocrine disruptors exhibiting anti-androgenic activity, such as the widely distributed plasticizer phthalate, repress Insl3 expression in Leydig cells (27-29). The exact mechanisms of action of androgens on Insl3 expression, however, remain completely obscure.

In the present study, we provide evidence that testosterone regulates Insl3 transcription in Leydig cells in an AR-dependent manner. We have also mapped an androgen- responsive region in the human INSL3 promoter. Finally, we found that mono-(2- ethylhexyl) phthalate (MEHP) represses Insl3 transcription, at least in part, by antagonizing the testosterone stimulating effects.

2.4 MATERIALS AND METHODS

2.4.1 Plasmids

The -1137, -920, and -656 to +11 bp human INSL3 promoter fragment have been previously described (15). Additional deletion constructs to -132 and -85 bp were generated by PCR using the -1137 bp construct as template along with a common reverse primer containing a Kpn I cloning site (underlined) 5’-GGG GTA CCG GTG GGT GGC GCC GGG GCC AAG C-3’ and the following forward primers that contain Bam HI cloning sites (underlined): -132 bp, 5’-CGG GAT CCC AGA AAG GCT CTG GCA C-3’ and -85 bp, 5’-CGG GAT CCT GAA GAA TGT TCT G-3’. The -31 to +11 bp reporter construct was obtained by subcloning a double-stranded oligonucleotide: sense oligo 5’-CGG TGG GTG GCG CCG GGG CCA AGC GGG GAC CCC CTT TAT AGG CG-3’ and antisense 5’-GAT CCG CCT ATA AAG GGG GAC CCC GCT TGG CCC CGG CGC CAC CCA CCG GTA C-3’. Various trinucleotide mutant constructs in the context of the -1137 bp and -132 bp reporters were generated using the QuickChange XL mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) along with the following oligonucleotides (only the sense oligonucleotides is shown) where the mutations are in lowercase: M1 5’-AAG GCC CTG GCC CTG GCC CTG GAA tcc AGG CTC CTC TGG CAC TAA CCC C-3’, M2 5’-CCC TGG CCC TGG GAG AAA tta TCT GGC ACT AAC CCC ACC C-3’, M3 GCC CTG GGA GAA AGG CTa gtG CAC TAA CCC CAC CCT TGA C-3’, M4 5’-CCT GGG AGA AAG GCT CTG Gac aTA ACC CCA CCC TTG ACC-3’, M5 5’-AAG GCT CTG GCA CTA ACC aac CCC TTG ACC TTT TTC CTG GGC G-3’, M6 5’-CTC TGG CAC TAA CCC CAC aag TGA CCT TTT TCC TGG GCG-3’, M7 5’-GGC ACT AAC CCC ACC TTt caC TTT TTC CTG GGC GGT CC-3’, M8 5’-CTA ACC CCA CCC TGA CCg ggT TCC TGG GCG GGT CCT GAA G-3’, M9 5’-CCC CAC CCT GAC CTT TTg aaT GGG CGG GTC CTG AAG AAT G-3’, M10 5’-CCA CCC TGA CCT TTT TCC Ttt tCG GGT CCT GAA GAA TGT TCT GTC C-3’. The -978 to +5 bp mouse Insl3 promoter fragment was isolated by PCR using mouse genomic DNA and the following primers: forward, 5'-GCG GAT CCG AAT GGG GAT ATT AAA TAT GTG-3’ (BamHI cloning site is underlined) and reverse, 5'-GGG GTA CCG TGG CAG GAG GCA GTG GGC AG-3' (KpnI cloning site is underlined). A similar PCR-based approach

91 using rat genomic DNA was used to isolate the -508 to +5 bp of the rat Insl3 promoter along with the following primers: forward, 5’-CTG GAT CCG GGC AGA GGC AGT GC-3’ (BamHI cloning site is underlined) and reverse, 5’-GGG GTA CCC GGA GGC AGC GGG TAA GGA C-3’ (KpnI cloning site is underlined). All reporter constructs were subcloned in a modified pXP1 Luciferase reporter construct (30) and subsequently verified by sequencing (Centre de génomique de Québec, CHUQ Research Centre, Quebec City, Canada).

2.4.2 Cell culture and transfections

The mouse Leydig cell line MA-10 (31) was provided by Dr. Mario Ascoli (University of Iowa, Iowa City, IA). Cells were grown in Waymouth’s media supplemented with 12 % horse serum and 50 mg/L of gentamicin and streptomycin sulfate, at 37°C in 5%

CO2. Cells were plated in a 24-well plate at a density of 90,000 cells per well in Waymouth’s supplemented with 12 % charcoal-treated horse serum and allowed to recover for 16-24 h before transfection. Twenty pmol of Insl3 Firefly luciferase reporter construct along with 8 ng of phRL-TK Renilla luciferase reporter, used as internal control for transfection efficiency, were transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen Canada, Burlington, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s recommendations. Four hours later, media was replaced and cells were treated with either testosterone (concentrations indicated in the figure legends) with or without 30 μM DEHP or MEHP (TCI America, Portland, OR) for 24-36 h. Cells were then lysed and luciferase activities measured using the Dual Luciferase Assay System (Promega Corp, Madison, WI) and the EG&G Berthold LB 9507 luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Transfections were performed at least four times in duplicate using different preparations of plasmid DNA.

2.4.3 Isolation of primary Leydig cells

Primary Leydig cells were isolated as described previously (32) from 35-day old Sprague-Dawley rats obtained on site. Serum free-Medium 199 with Earle's salts (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario), L-glutamine, 1.5 mM HEPES 2.5 g/L

NaHCO3, and antibiotics (50 U/mI penicillin and 50 µg/ml streptomycin) was used during preparation and culturing. After 2 days in culture, the purity of the Leydig cell preparation was evaluated to be about 95% enriched as assessed by histochemical -hydroxysteroid dehydrogenase activity (33). All experiments were conducted according to the Canadian Council for Animal Care and have been approved by the Animal Care and Ethics Committee of Laval University (protocol # 2005-184).

2.4.4 RNA isolation, reverse transcription, and quantitative real time PCR.

Total RNA was isolated using the RNeasy Plus mini kit (Qiagen Canada, Mississauga, Ontario, Canada). First strand cDNAs were synthesized from a 5 µg aliquot of the various RNAs using the Superscript III Reverse Transcriptase System (Invitrogen Canada, Burlington, ON). Quantitative real time PCR for Insl3 and Rpl19 were performed as previously described (15, 34). Each amplification was performed in duplicate using at least three different preparations of cDNAs for each of the three different RNA extractions.

2.4.5 Statistical analysis

Statistical analyses were done using One-way Anova or Anova on ranks (when parameters were not met) followed by a Student-Newman-Keuls post-test. For all statistical analyses, P < 0.05 was considered significant. All statistical analyses were done using the SigmaStat software package (Systat Software Inc, San Jose, CA).

93 2.5 RESULTS

2.5.1 Testosterone increases Insl3 mRNA levels in Leydig cells

To assess whether androgens could regulate Insl3 expression, we first treated MA-10 cells, a Leydig cell line known to express AR (35), with increasing doses of testosterone, doses that are within the physiological range found within the rodent testis (200-350 nM) (36, 37). As shown in Fig. 2.1A, Insl3 mRNA levels were significantly increased in response to testosterone as determined by quantitative real time PCR. An even stronger response was observed when primary Leydig cell cultures were used (Fig. 2.1B). These results indicate that Insl3 expression is regulated by androgens in Leydig cells and that the MA-10 Leydig cell line constitutes an appropriate model to study the underlying mechanisms of androgen action.

2.5.2 Testosterone stimulates Insl3 promoter activity from different species

Next, we ought to determine whether the effects of testosterone could be due to an increase in Insl3 gene transcription. As shown in Fig. 2.2A, treatment of MA-10 Leydig cells with increasing doses of testosterone led to a dose-dependent activation of a -1137 bp human INSL3 reporter construct. Similar results were obtained with the rat and mouse Insl3 promoters (Fig. 2.2B). Thus, testosterone can activate the Insl3 promoter from different species.

2.5.3 Testosterone acts in an AR-dependent manner to increase in Insl3 transcription

Although testosterone is known to act mainly through AR, some AR-independent responses to androgens have been reported (reviewed in Ref. 38). The involvement of AR in testosterone-induced Insl3 transcription was assessed by treating MA-10 Leydig cells with testosterone in the presence or absence of hydroxyflutamide, the biologically active form of flutamide and a potent AR antagonist. Testosterone-mediated increase in INSL3 promoter activity (Fig. 2.3A) and endogenous mRNA levels (Fig. 2.3B) were abolished in the presence of the antagonist. The AR antagonist had no effect when used

alone (Fig. 2.3). All together, these results establish the requirement of AR for testosterone-dependent stimulation of Insl3 transcription.

2.5.4 Mapping of the testosterone-responsive element in the INSL3 promoter

To locate the testosterone-responsive element in the human INSL3 promoter, a series of 5’ progressive deletion constructs were generated and transfected in MA-10 Leydig cells which were then treated with 15 nM testosterone. As shown in Fig. 2.4, deletion from -1137 to -132 bp had no effect on testosterone responsiveness (nearly 3 fold). Further deletion to -85 bp severely blunted the testosterone-responsiveness of the INSL3 promoter to 1.4 fold. The testosterone-activating effects were specific since a - 31 bp minimal INSL3 promoter construct was no longer responsive (Fig. 2.4). These data indicate that the main testosterone-responsive element(s) are located between -132 and -85 bp. A survey of the 47 bp promoter sequence between -132 and -85 bp did not reveal the presence of a consensus androgen response element (ARE: GGTACAnnnTGTTCT). The 47 bp region, however, contains a ½ site for the binding of nuclear receptors (AGGTCA) which we previously described as a binding site for the nuclear receptors NUR77 and SF1 (15, 16). To better define the element within the 47 bp region, a series of mutant constructs were generated in the context of the -1137 bp (Fig. 2.5A) and the -132 bp (Fig. 2.5B) INSL3 promoter. In the context of the -1137 bp promoter construct, mutations M1-M3 had no impact on the testosterone- responsiveness of the INSL3 promoter whereas mutations M4-M7 caused a small but significant reduction in the testosterone-dependent activation (Fig. 2.5A). Mutations M8, M9, and M10, sequentially changing each of the underlined triplet in the sequence GACCTTTTTCC, had the most dramatic effects, decreasing testosterone- responsiveness to the level observed with the -85 bp construct (from nearly 3 fold to 1.4 fold) (Fig. 2.5A). Interestingly, this sequence contains the NUR77/SF1 nuclear receptor binding site. Similar results were obtained in the context of the -132 bp reporter construct with mutation M9 eliminating the testosterone-responsiveness of the INSL3 promoter (Fig. 2.5B).

95 2.5.5 MEHP antagonizes testosterone-induced Insl3 expression

MEHP, the active metabolite of a widely used plasticizer, is known to repress Insl3 expression in vivo in Leydig cells (29). Although the exact molecular mechanisms remain unidentified, it is known that MEHP cannot bind to AR but nonetheless acts as an anti-androgen (39-41). Since we have shown that androgens activate Insl3 transcription we tested whether MEHP could modulate testosterone action on Insl3 transcription. As shown in Fig. 2.6, 30 M of MEHP significantly inhibited the testosterone-mediated increase in Insl3 mRNA in primary Leydig cells while having no effect in unstimulated cells. Similarly, MEHP, but not its inactive precursor DEHP, significantly reduced the testosterone-dependent activation of the human INSL3 promoter (Fig. 2.7). Thus, MEHP represses Insl3 expression, at least in part, by antagonizing testosterone action.

2.6 DISCUSSION

INSL3, a small peptide of gonadal origin, plays important roles in reproductive function (42). In addition, its expression in males is highly correlated with the functional status of testicular Leydig cells and to circulating testosterone levels (17, 18, 43-45). In the present study, we found that androgens activate Insl3 transcription in Leydig cells and that this is partly antagonized by MEHP, a widely distributed endocrine disruptor with anti-androgenic activity.

2.6.1 Expression of Insl3 in Leydig cells

Although the Insl3 gene is located within the last intron of the Jak3 gene, the two genes have very divergent expression profile. Jak3 is restricted to lymphoid and hematopoietic cells (46, 47) whereas Insl3 is found exclusively in the gonads, mainly in testicular Leydig cells (1-4). Jak3 and Insl3 are therefore not likely to share regulatory elements despite their close genomic association. Because of this atypical organization, it is believed that the regulatory motifs driving Insl3 expression in Leydig cells are located within a relatively short 5’ flanking sequence. In agreement with this, the first 200 bp upstream of the transcription start site were found to be sufficient to confer activity to the mouse (12, 13), rat (14), and human (our data) Insl3 promoter in MA-10 Leydig cells. Within this fragment are found binding sites for the transcription factors SF1 and NUR77 (12-16). Consistent with an in vivo role for SF1, Insl3 expression was reduced in a Leydig cell-specific Sf1 knockout mouse model (48).

2.6.2 Mechanism of androgen action on Insl3 transcription

In addition to these two transcription factors, we found that testosterone also activates Insl3 expression in a mouse Leydig cell line and in primary Leydig cells from rats. These data are supported by evidence from the literature whereby modulation of androgen production or action in animal models was shown to cause a concomitant alteration in Insl3 mRNA levels (3, 9, 17, 18, 22, 24, 49).

97 We found that testosterone directly regulates the activity of the Insl3 promoter from various species. This indicates that the mechanism of androgen action on Insl3 expression has been evolutionarily conserved despite the poor sequence conservation between the human and rodent Insl3 promoter. Testosterone action on Insl3 transcription was found to be AR-dependent. The AR-responsive region that we have mapped in the human INSL3 promoter, however, does not contain an ARE suggesting that androgen-activated AR acts in a DNA binding-independent manner. AR has been shown to modulate gene expression and cell function without directly binding to DNA through non-classical pathways (reviewed in Refs. 50, 51).

2.6.3 Androgen-MEHP antagonism in Insl3 transcription

Phthalates are chemicals used to impart flexibility and durability to polyvinyl chloride (PVC) and comprise up to 40% of the plastic volume. Phthalates are ubiquitous contaminants of the environment and humans and animals are inevitably exposed to these chemicals (52-58). The primary targets of phthalates are testicular Leydig cells (59).

In the present study, we found that MEHP, a biologically active phthalate with endocrine disrupting activity, partly inhibited testosterone action on Insl3 expression in a Leydig cell line (MA-10) and in primary cultures of rat Leydig cells. Our data confirm that MA-10 cells are an appropriate model to study phthalate-mediated effects which is in agreement with a previous study by Dees et al (60). It is known that in utero exposure to phthalates, including MEHP, causes several detrimental reproductive defects, including undescended testis, hypospadias, and decreased testosterone production, in males in various animal models (reviewed in Ref. 61). They are believed to have adverse effects on human reproductive health as well (reviewed in Ref. 62). Phthalate exposure results in decreased expression of Insl3 and of genes involved in testosterone biosynthesis in Leydig cells (reviewed in Refs. 63, 64). Although phthalates have anti-androgenic effects, they cannot interact with AR (39-41). Phthalate repressive effects in Leydig cells are believed to be mediated, at least in part, through activation of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) (65, 66).

In the testis of PPARα deficient mice exposed to phthalates, expression of the peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR), which is involved in cholesterol transport, was no longer repressed (67) and the overall testis structure was found to be predominantly normal (68). Activated PPAR can repress gene expression in a DNA- binding independent manner through the recruitment of co-repressors or by interfering with other DNA-associated transcription factors (65, 66). Recently, phthalates were also reported to act by decreasing recruitment of the transcription factor C/EBPβ to DNA while having no effect on SF1 (69). Although the exact mechanism remains to be identified, we found that the phthalate MEHP antagonizes AR action through a region of the Insl3 promoter known to bind transcriptional activators which suggests that disruption of transcription factor interactions might be involved.

99 2.7 ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Dr. Mario Ascoli (University of Iowa) for providing the MA- 10 cell line. We are also indebted to Sylvain Gauthier, Shankar Singh, and Robert Sullivan (CHUQ Research Centre, Quebec City, Canada) for providing hydroxyflutamide and testosterone. We would also like to thank Stéphanie Fiola and Luc Martin for technical assistance. JJT holds a New Investigator Scholarship from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). This work was supported by CIHR grant MOP-77575 to JJT.

100

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107 2.9 FIGURE LEGENDS

Figure 2.1 : Testosterone stimulates Insl3 expression in Leydig cells. (A) MA-10 Leydig cells were treated with either 1500 nM DMSO (open bar) or increasing doses of testosterone (T) (black triangle: 0.15, 1.5, 15, 150 and 1500 nM) for 36 hours. (B) MA-10 and primary cultures of Leydig cells from rats were treated with 15 nM DMSO (open bars) or testosterone (T) (black bars) for 36 hours. Total RNA was next isolated and used in quantitative real time PCR using primers specific for Insl3 cDNA as described in Materials and Methods. Results were corrected with the Rpl19 cDNA. Results are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from control.

Figure 2.2 : The INSL3 promoter from different species is activated by testosterone. (A) MA-10 cells were transfected with a -1137 bp human INSL3 promoter construct and treated with either 1500 nM DMSO (open bar) or increasing doses of testosterone (T) (black triangle: 0.15, 1.5, 15, 150 and 1500 nM) for 36 hours. A different letter indicates a statistically significant difference. (B) MA-10 cells were transfected with a -1137 to +11 bp human INSL3 promoter, -978 to +5 bp mouse Insl3 promoter, and - 508 to +5 bp rat Insl3 promoter and treated with 15 nM DMSO (open bars) or testosterone (T) (black bars) for 36 hours. An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control. Results are shown as fold activation over control (± SEM).

Figure 2.3 : Testosterone-dependent activation of Insl3 transcription requires the androgen receptor. (A) MA-10 Leydig cells were transfected with a -1137 bp human INSL3 promoter construct and pre-treated with 50 M DMSO (open bars) or increasing doses of hydroxyflutamide (HF) (black triangle: 50 nM, 250 nM, 500 nM, 5 µM, 25 µM, and 50 µM) for 1 h followed by addition of vehicle (-) or 15 nM testosterone (T, +) for 36 h. An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control. Results are shown as fold activation over control (± SEM). (B) MA- 10 cells were treated with either DMSO (open bar), 15 nM testosterone (T) (black bar), 5 µM hydroxyflutamide (HF) (grey bar), or a combination of hydroxyflutamide and

108

testosterone (hatched bar). Total RNA was isolated and Insl3 expression was determined by quantitative real time PCR. Results were corrected with the Rpl19 cDNA. Results are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from control.

Figure 2.4 : The testosterone-responsive area is located in the proximal INSL3 promoter. MA-10 cells were transfected with various 5’ deletion constructs of the human INSL3 promoter (the 5’-end point of each construct is indicated on the left of the graph) and treated with DMSO (open bars) or 15 nM testosterone (T) (black bars). An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control.

Figure 2.5 : Fine mapping of the testosterone-responsive element in the human INSL3 promoter. MA-10 Leydig cells were transfected with either a wild type or a series of human INSL3 promoter constructs containing tri-nucleotide mutations in the testosterone-responsive region either in the context of the -1137 bp (A) or -132 bp (B) reporter. The wild type INSL3 promoter sequence is shown on top and the corresponding mutated nucleotides are shown underneath in lowercase. MA-10 cells were treated with either DMSO (open bars) or 15 nM testosterone (T) (black bars). A different letter indicates a statistically significant difference. Results are shown as fold activation over control (± SEM).

Figure 2.6 : MEHP inhibits the testosterone-induced Insl3 expression. Rat primary Leydig cells were treated with vehicle or 30 µM MEHP in the absence (open bars) or presence of 15 nM testosterone (T) (black bars) for 36 hours. Total RNA was isolated and Insl3 expression was determined by quantitative real time PCR. Results were corrected with the Rpl19 cDNA. Results are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). A different letter indicates a statistically significant difference.

109 Figure 2.7 : Testosterone-mediated induction of INSL3 promoter activity is repressed by MEHP. MA-10 Leydig cells were transfected with a -1137 bp human INSL3 reporter construct and treated with vehicle, 30 µM DEHP or MEHP in the absence (open bars) or presence of 15 nM testosterone (T) (black bars) for 36 hours. A different letter indicates a statistically significant difference. Results are shown as fold activation over control (± SEM).

110

Laguë and Tremblay Figure 2.1

A 3 MA-10 (n=3) * * *

2 *

Rpl19 / /

Insl3 Relative mRNARelative

0 T -

B MA-10 Primary Leydig 4 (n=3) *

3 Rpl19

/ / 2 * Insl3

Relative mRNARelative 1

0 T - + - +

111 Laguë and Tremblay Figure 2.2

A Human INSL3 promoter Luc

-1137 bp +11 bp

5 MA-10 c (n=3) d 4

3 b

2 a

1 Fold Activation Fold

0 T - B 4 MA-10 (n=4) *

3 * 2 *

FoldActivation 1

0 T - + - + - + Human Mouse Rat

112

Laguë and Tremblay Figure 2.3

A Human INSL3 promoter Luc

-1137 bp +11 bp 2 * * MA-10 * (n=3) *

1 FoldActivation

0 T - + - + - + - + - + - + - + HF -

2 *

MA-10 (n=3)

Rpl19 1

/ /

Insl3 Relative mRNARelative

0 T - + - + HF - - + +

113 Laguë and Tremblay Figure 2.4

T - Human INSL3 promoter Luc + -1137 bp +11 bp * - + -920 bp * - -656 bp + * - + -132 bp * - + -85 bp * - MA-10 (n=6) -31 bp + 0 1 2 3 Fold Activation

114

Laguë and Tremblay Figure 2.5

4 MA-10 (n=8) a a 3 a a b b b b 2 c c c c

FoldActivation 1

0 T - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + WT GAA A GGC T CTG G CAC T AAC C CCA C CCT T GAC C TTT T TCC -85 min

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 tcc A tta T agt G aca T cca C aac C aag T tca C ggg T gaa

-1137 +11 human INSL3 promoter -124 -86

B MA-10 (n=6) a a 2 b a a c e d

1 FoldActivation

0 T - + - + - + - + - + - + - + - + - + WT AAC C CCA C CCT T GAC C TTT T TCC -85 min

M5 M6 M7 M8 M9 M10 cca C aac C aag T tca C ggg T gaa

-132 +11 -108 -86

115 Laguë and Tremblay Figure 2.6

4 Primary b Leydig (n=3)

3 c Rpl19

/ / 2

Insl3 a Relative mRNARelative 1

0 - MEHP - MEHP T

116

Laguë and Tremblay Figure 2.7

Human INSL3 promoter Luc

-1137 bp +11 bp 3 MA-10 (n=4) b

2 c

1 FoldActivation

- -

DEHP DEHP MEHP MEHP T

117

Préambule au chapitre III

Le chapitre 2 a servi à démontrer/confirmer que les cellules MA-10 pouvaient être utilisées comme modèle cellulaire pour l’étude des mécanismes moléculaires de l’expression d’Insl3/INSL3 et de la répression causée par le MEHP.

Le chapitre 3 présente des pistes de réponses à diverses questions soulevées par les résultats présentés au chapitre précédent, notamment en ce qui a trait au récepteur aux androgènes impliqué dans l’activation de la transcription d’INSL3 par la testostérone et l’implication relative de différentes voies de signalisation dans l’induction de cette transcription.

Il n’a pas été possible de conclure avec certitude puisque le modèle cellulaire, les cellules MA-10, a cessé de répondre à l’exposition à la T.

119

Chapitre III

INSIGHT INTO TESTOSTERONE-INDUCED INSL3 TRANSCRIPTION IN MA-10 LEYDIG CELLS

Short Title: T-induced Insl3 transcriptional activation

Éric Laguë1 and Jacques J. Tremblay1,2 *

1 Reproduction, Mother and Child Health, Centre de recherche du CHU de Québec, Québec City, Québec, Canada G1V 4G2

2 Centre for Research in Biology of Reproduction, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproduction, Faculty of Medicine, Université Laval, Quebec City, Québec, Canada G1V 0A6

*Corresponding author:

Dr. Jacques J. Tremblay Reproduction, Mother and Child Health CHUQ Research Centre, CHUL Room T3-67 2705 Laurier Blvd. Quebec City, Quebec CANADA G1V 4G2 Tel: 418-525-4444 x46254 Fax: 418-654-2765 E-mail: [email protected]

Manuscript Categories: Original article

Disclosure Statement: EL and JJT have nothing to declare.

Keywords: Insulin-like 3, Transcription, Androgen, Androgen receptor, Leydig

121

3.1 RÉSUMÉ

L’INSL3 (Insulin-like 3) est un petit peptide produit par les cellules de Leydig des testicules durant le développement fœtal et la vie postnatale. Il a été démontré qu’INSL3 déclenche et dirige la première étape de la descente des testicules durant le développement fœtal. Les concentrations d’INSL3 et de testostérone (T) circulantes sont fortement positivement corrélées. Subséquemment, il a été démontré que l’exposition des cellules de Leydig à des concentrations physiologiques de T induit la transcription d’Insl3/INSL3 par l’activation du récepteur aux androgènes (AR). À ce jour, on ne connait toujours pas le mécanisme menant à l’expression d’INSL3 en réaction à l’activation d’AR par la T. À l’aide de différentes études menées in vitro, nous démontrons que la transcription d’INSL3 induite par la T ne requiert pas l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G sensible à la toxine pertussique. Ceci implique que l’action d’AR sur la transcription d’INSL3 est de nature génomique. Néanmoins, nos résultats suggèrent que certaines voies de signalisation contribuent également à la transcription d’INSL3.

3.2 ABSTRACT

Insulin-like 3 (INSL3) is a small peptide produced by testicular Leydig cells throughout embryonic and postnatal life. INSL3 has been shown to trigger and foster the first step of testis descent occurring during fetal development. INSL3 circulating levels are highly correlated with testosterone concentration. Accordingly, INSL3 transcription has been shown to be induced by physiological levels of testosterone in an AR- dependent manner. It remains unknown, however, whether AR acts via a genomic and/or non-genomic pathway to stimulate INSL3 transcription. Using complementary in vitro analyses, here we demonstrate that T-induced INSL3 transcription does not require a pertussis toxin-sensitive G protein-coupled receptor. This would be consistent with a direct genomic action of AR in INSL3 transcription. However, our results suggest that some intracellular pathways also contribute to INSL3 transcription.

123

3.3 INTRODUCTION

Insulin-like 3 (INSL3), also known as relaxin-like factor (RLF), is a member of the insulin-IGF-relaxin family of growth factors and hormones [1, 2]. This hormone is almost exclusively expressed in the gonads. During fetal life, INSL3 is produced by maturing Leydig cells of the male gonad while in adults it is secreted by both the testis (Leydig cells) and the ovary (theca and luteal cells) [1-4]. INSL3 has first been identified as an important regulator of testis descent. Circulating levels of INSL3 have been correlated with LH and testosterone levels [5]. Consistent with this, our laboratory has reported that testosterone increases INSL3 transcription in an androgen receptor (AR)-dependent manner in MA-10 Leydig cells [6]. The androgen responsive element has been located within -132 to -85 bp from the INSL3 transcriptional start, a region that is devoid of consensus androgen receptor response element/binding site [6]. The mechanisms by which testosterone activates INSL3 promoter activity remain unknown. It is also unknown whether this effect is exclusive to testosterone or if dihydrotestosterone, a more potent androgen, can also stimulate INSL3 transcription.

Furthermore, GPRC6A, a recently identified membrane anchored G-protein that show specificity for testosterone binding and also responds to high levels of extracellular Ca2+ [7, 8], has been shown to be highly expressed in Leydig cells, Sertoli cells, spermatogonia and spermatids [9]. GPRC6A is also expressed in the kidney (both proximal and distal tubules) [9] and osteoblasts [8, 10], as well as in several other tissues including the lung, liver, spleen, heart, blood vessels, skeletal muscle, testis, brain [11-15]. GPRC6A has been shown to interact with a variety of G-protein-coupled receptors [16] and to signal through the ERK signaling pathway [7]. Whether the newly identified GPRC6A testosterone receptor is implicated in testosterone-induced INSL3 transcription in Leydig cells is currently unknown.

In vivo studies have shown that INSL3 expression is sensitive to the presence of environmental contaminant such as DEHP [17]. Leydig cells exposed to that contaminant metabolite (MEHP) have significantly reduced INSL3 expression [17].

125 Our previous work has confirmed that Leydig cells INSL3 expression is sensitive to MEHP and, although the molecular mechanism remains elusive, that MEHP interferes with testosterone-induced INSL3 transcription [6]. MEHP has been shown to activate peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARA) in liver cells [18]. The Leydig cells also express PPARA [19] and PPARA knockout mice are less prone to develop the complications associated with DEHP/MEHP exposure [20]. Currently, only the nuclear receptors NR5A1/SF1 and NR4A1/NUR77 are known to stimulate expression of INSL3 by directly binding to the promoter region [21, 22].

To better understand the dynamic involved in the T-induced INSL3 transcription and the mechanisms of MEHP-mediated repression, in the present study we assessed the contribution of several signaling pathways and receptors.

126

3.4 MATERIALS AND METHODS

3.4.1 Plasmids

The -1137 to +11 bp human INSL3 promoter fragment has been previously described [22]. All reporter constructs were subcloned in a modified pXP1 Luciferase reporter construct [23] and subsequently verified by sequencing (Centre de génomique de Québec, CHUQ Research Centre, Quebec City, Canada).

3.4.2 Cell culture and transfections

The mouse Leydig cell line MA-10 [24] was provided by Dr. Mario Ascoli (University of Iowa, Iowa City, IA). Cells were grown in Waymouth’s media supplemented with 12% horse serum and 50 mg/L of gentamicin and streptomycin sulfate, at 37°C in 5%

CO2. Cells were plated in a 24-well plate at a density of 100,000 cells per well in Waymouth’s supplemented with 12% charcoal-treated horse serum and allowed to recover for 16-24 h before transfection. Twenty pmol of INSL3 Firefly luciferase reporter construct along with 8 ng of phRL-TK Renilla luciferase reporter, used as internal control for transfection efficiency, were transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s recommendations. Four hours later, media was replaced and cells were treated with either testosterone (concentrations indicated in the figure legends) with or without 30 μM DEHP or MEHP (TCI America, Portland, OR) for 24-36 h. Cells were then lysed and luciferase activities measured using the Dual Luciferase Assay System (Promega Corp, Madison, WI) and the EG&G Berthold LB 9507 luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Transfections were performed at least four times in duplicate using different preparations of plasmid DNA.

127 3.4.3 Drugs and cells treatments

The 5 alpha reductase inhibitor (Finasteride) was rendered metabolically active from commercially available finasteride (Sigma-Aldrich Canada Co. Oakville, Ontario). Chemical reactions, purification and quality analysis were performed on site (CRCHUQ). After transfection of reporter genes and controls (for 4 hours), media was replaced with fresh media and treated with 10 µM of activated finasteride or vehicle (DMSO) for 30 minutes prior to treatment with either testosterone or DMSO (control) for 24 hours before lysis. Highly purified Testosterone-3-(o-carboxymethyl)oxime- BSA (T-BSA) was purchased from Cedarlane Labs (Burlington, Ontario, Canada). Cell culture and transfections were performed as described above. Treatments with testosterone and MEHP were also carried as described. Stimulation with T-BSA were carried out using 35 nM of testosterone equivalent. Bordetella pertussis toxin was purchased from EMD Millipore/Calbiochem (Etobicoke, Ontario, Canada, catalog number 516,560). Cells were cultured and transfected as described above. Four hours later, cells were incubated in the presence of Bordetella pertussis toxin (100 ng/mL) for 12 h before cells were further treated with testosterone, T-BSA or vehicle for an additional 24 hours before lysis. Protein kinase inhibitors (Map Kinase Set II, Serine/Threonine Kinase and KN-93, CaMK inhibitors) were purchased from EMD Millipore/Calbiochem (Etobicoke, Ontario, Canada, catalog 444190). After transfection of reporter genes and controls (for 4 hours), media was replaced with fresh media and cells were treated with KN-93 (5 µM), H-89 (5 µM), SB 203580 (5 µM), SP 600125 (1 µM), PD 98059 (50 µM) or vehicle (DMSO) for 30 minutes prior to treatment with either testosterone or DMSO (control) for 24 h before lysis.

3.4.4 Statistical analysis

Statistical analyses were done using One-way Anova or Anova on ranks (when parameters were not met) followed by a Student-Newman-Keuls post-hoc test. For all statistical analyses, P < 0.05 was considered significant. All statistical analyses were done using the SigmaStat software package (Systat Software Inc, San Jose, CA).

128

3.5 RESULTS

3.5.1 Dihydrotestosterone does not increase Insl3 transcription in MA-10 Leydig cells

MA-10 Leydig cells have been shown to express the 5α-reductase enzyme [25] and thus have the capacity to reduce testosterone into dihydrotestosterone (DHT). To assess whether testosterone and/or its 5α-reduced metabolite is responsible for androgen- induced INSL3 expression, MA-10 Leydig cells, which express AR [26], were treated with 10 µM of activated finasteride, a 5α-reductase inhibitor, for 30 minutes prior to testosterone stimulation. A concentration of 10 µM is sufficient to inhibit both type of

5α-reductase enzymes (5α-R1 IC50 of 360 nM and 5α-R2 IC50 of 69 nM)[27, 28]. As shown in Figure 3.1, activated finasteride did not impair testosterone-dependent activation of the INSL3 promoter. This indicates that testosterone itself, and not its 5α- reduced metabolite, is responsible for the activation of INSL3 promoter activity.

3.5.2 The GPRC6A membrane-bound receptor is not a major contributor to testosterone-induced INSL3 promoter activity

The G protein-coupled receptor GPRC6A was recently identified in urogenital tissues [7, 9]. This membrane-bound receptor was shown to convey androgen receptor activity to the nucleus via the MAPK signaling pathway [7]. As GPRC6A was identified in Leydig cells as well, we sought to assess whether GPRC6A is implicated into testosterone-induced INSL3 transcriptional activation. Contrary to free testosterone, testosterone-3-(o-carboxymethyl)oxime-BSA (T-BSA) cannot penetrate/diffuse through the plasma membrane to activate the classic intracellular androgen receptor [29-32]. T-BSA can therefore only bind to receptors present on the plasma membrane. As shown in Figure 3.2, free testosterone induces INSL3 promoter activity about 3.5 fold. However, incubation with T-BSA led to a weak but statistically significant 1.7 fold activation (Fig. 3.2). In the presence of MEHP, a known anti-androgen and repressor of Insl3 expression [6], both T- and T-BSA-induced INSL3 promoter activity were reduced by about 20 percent (Fig. 3.2).

129 3.5.3 Pertussis toxin does not modified testosterone or T-BSA induced INSL3 transcription.

In non-activated state, the βγ-complex is associated with the α-subunit (guanosine diphosphate (GDP)-bound subunit) of the G protein. Interaction of an activated receptor with a G protein triggers the dissociation of GDP from the α subunit of the heterotrimeric G protein. GDP is then replaced by GTP that induces a conformational change, which in turn leads to the dissociation of the α subunit from the βγ-complex [33]. The pertussis toxin from Bordetella pertussis, once activated, catalyzes the adenosine diphosphate (ADP)-ribosylation of some G proteins resulting in uncoupling of the receptor and the G protein [33-35]. As shown in Figure 3.3, exposure of MA-10 Leydig cells to pertussis toxin did not affect the testosterone- or T-BSA-induced INSL3 promoter activity. These results indicate that a G protein-coupled receptor is likely not involved in androgen-dependent activation of the INSL3 promoter.

3.5.4 Kinase pathways in basal and testosterone-induced INSL3 transcription

We have previously reported that the testosterone-responsive element(s) are located between -132 and -85 bp of the human INSL3 promoter [6]. However, this region does not harbor a consensus androgen response element (GGTACAnnnTGTTCT). This 47 bp region, however, contains half-sites for the binding of nuclear receptors (AGGTCA), which we previously identified as binding sites for the nuclear receptors NR4A1/NUR77 and NR5A1/SF1 [11, 22, 36]. To determine whether the testosterone- mediated activation of the INSL3 promoter involves an intracellular signaling cascade activated by the classic AR, we performed transient transfections assays in MA-10 Leydig cells in the presence of several classical MAP kinase inhibitors. As expected, INSL3 promoter activity was increased by 3.2 fold in presence of testosterone (Fig. 3.4). In the presence of hydroxyflutamide (a nonsteroidal antagonist of the androgen receptor), basal INSL3 promoter activity remained unchanged but the testosterone- induced activation was abrogated indicating a strict requirement of AR as we have reported previously [6]. In presence of the anti-androgen MEHP, basal activity was

130

unaffected but the testosterone-induced transcriptional activation is reduced to 2.6 fold (Fig. 3.4), which translates in a 20% decrease in testosterone-induced INSL3 transcriptional activation as we have shown [6].

In presence of the CaMK inhibitor KN-93 (5 µM), basal activity was reduced by about 30% whereas the testosterone-induced INSL3 activation was reduced from 3.2 to 2.6 fold (Fig. 3.4). Thus the CAMK pathway appears to be important for basal INSL3 promoter activity while also having some implication in testosterone-mediated activation. Next, we tested the PKA inhibitor H-89 (5 µM). As shown in Figure 3.4, basal activity is reduced by about 30% while testosterone-induced was unchanged or slightly increased (from 3.2 to 3.6 fold). Thus PKA is involved in basal INSL3 transcription while having no effect on testosterone stimulatory effects. When the p38 MAPK inhibitor SB 203580 (5 µM) was used, there was no effect on basal activity but there was an apparent decrease in testosterone-induced INSL3 transcriptional to 2.8 fold (Fig. 3.4), which was not statistically significant indicating that this kinase does not contribute either basal or testosterone responsiveness. We next tested the JNK MAKP inhibitor, SP 600125 (1 µM), and found that it had no effect on basal and testosterone-induced INSL3 promoter activity (Fig. 3.4). Finally, we analyzed the effect of the ERK1/2 inhibitor PD 98059 (50 µM). Basal activity was significantly reduced to 20% of control indicating that the ERK1/2 is essential for INSL3 promoter activity in Leydig cells (Fig. 3.4). However, testosterone-mediated activation of the INSL3 promoter was not significantly affected in the presence of PD 98059 (Fig. 3.4).

131 3.6 DISCUSSION

In males, INSL3 levels are strongly correlated with the functional status of testicular Leydig cells and to circulating testosterone levels [5, 37-39]. However, very limited information is available regarding the mechanisms regulating expression of the INSL3 gene. We reported that testosterone upregulates INSL3 gene expression in Leydig cells [6] but the exact mechanisms of testosterone action remained unknown.

Because MA-10 Leydig cells express 5α-reductase [25], we could not exclude the possibility that testosterone metabolites were responsible for INSL3 stimulation and not testosterone itself. Here we have addressed this issue and found that testosterone, and not dihydrotestosterone, activates INSL3 promoter activity in MA-10 Leydig cells. However, we cannot formally exclude the possibility that other androgens, such as dehydroepiandrostenedione (DHEA), could be involved in the testosterone stimulation of INSL3 expression. This is however unlikely since DHEA has a low affinity for the androgen receptor and our data shown a strict requirement for this receptor ([6], and the present work).

Another possibility to explain the mechanism of testosterone action is via the plasma membrane receptor GPRC6A known to be activated by androgens [7]. However, using a form of testosterone that cannot freely enter the cell (T-BSA), we found that only free testosterone and not T-BSA could strongly activate the INSL3 promoter. Although some activation was observed with T-BSA, we cannot exclude the possibility that this could be due to some free testosterone that could have dissociated from BSA. Nevertheless, if genuine, activation via the GPRC6A receptor is not a major route for testosterone-mediated action on INSL3 transcription.

Further supporting this is the fact that testosterone-dependent activation of the INSL3 promoter does not require a pertussis toxin-sensitive G protein-coupled receptor. On the other hand, it is important to point that not all G protein-coupled receptors are

132

sensitive to pertussis toxin [33, 40, 41]. Studies using cholera toxin [33, 42] would provide additional key information since this toxin is known to maintain activation of a select portion of G protein-coupled receptor [33, 43] and in presence of cholera toxin, signaling by G protein cannot be deactivated.

Since testosterone has been reported to sometimes act via intracellular signaling pathways [44], we tested the impact of a series of classical kinase inhibitors. We found that the three main MAPK pathways (p38, JNK and ERK1/2) are not required for testosterone-induced INSL3 transcription. However, inhibition of ERK1/2 dramatically reduced basal INSL3 promoter activity supporting a role for this kinase in INSL3 transcription. Inhibition of the CAMK and PKA pathways had no effect on testosterone-induced INSL3 promoter activity but reduced basal activity. Taken together, these results indicate that testosterone action on INSL3 gene expression does not involve an intracellular signaling pathway, which would be consistent with a genomic action of AR. However, several kinases are essential for maximal INSL3 basal promoter activity. Furthermore, the transcription factors downstream of these kinases remain to be characterized.

Our data are consistent with a recent hypothesis that proposes that Leydig cell function undergoes sequential activation to reach the needed secretion capabilities. As proposed by Pathirana et al, Leydig cells produce both the INSL3 peptide and its receptor RXFP2 [45]. In their experiment, RXFP2 activation by INSL3 on isolated Leydig cells led to enhanced testosterone and cAMP production [45]. Their data also demonstrated that the INSL3-induced testosterone production (1.5 to 2.0 fold increase) could be blocked by an adenylate cyclase inhibitor, SQ 22536 or by an INSL3 antagonist [45]. The data obtained by Pathirana et al could explain some of our current data. It is known that cAMP is produced in response to LH stimulation of LHCGR. It is also known that cAMP upregulation triggers PKA and CAMK activation in Leydig cells [46, 47]. In our experiment, PKA inhibition reduced basal INSL3 transcription, which suggests that PKA-dependent phosphorylation is an important contributor to INSL3 production.

133 3.7 ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Dr. Mario Ascoli (University of Iowa) for providing the MA- 10 Leydig cell line. We would also like to thank Dr. François Marceau and Dr. Yves Tremblay for providing useful inhibitors.

JJT held a New Investigator Scholarship from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and now holds a Chercheur-Boursier Sénior Scholarship from the Fonds de recherche du Québec – Santé. This work was supported by grants from CIHR (funding reference numbers MOP-77575 and MOP-81387) to JJT. EL holds a doctoral studentships from Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS) and was supported by Quebec Training Network in Perinatal Research (QTNPR).

134

3.8 REFERENCES

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138

3.9 FIGURE LEGENDS

Figure 3.1 : Inhibition of 5α-reductase does not impair testosterone-dependent activation of the INSL3 promoter. MA-10 Leydig cells were transiently transfected a human INSL3 promoter (-1137 to +11 bp). Cells were then exposed to (from left to right) vehicle (DMSO) or activated finasteride (10 µM) respectively. After exposure, cells were stimulated with 35 nM of testosterone for 36 hours. Results are shown as fold activation over control.

Figure 3.2 : T-BSA has minor effects on INSL3 promoter activity. MA-10 Leydig cells were transiently transfected with a human INSL3 promoter (-1137 to +11 bp). Cells were then stimulated with/exposed to (from left to right) vehicle (DMSO), MEHP (30 µM), testosterone (T) (35 nM), testosterone coupled to BSA (T-BSA) (35 nM equivalent), or to a combination of T (35 nM) and MEHP (30 µM), or a combination of T-BSA (35 nM equivalent) and MEHP (30 µM). Results are shown as fold activation and are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). Different letters indicate a statistically significant difference (P<0.005).

Figure 3.3 : Pertussis toxin does not impair testosterone-induced INSL3 promoter activity. MA-10 Leydig cells were transiently transfected with a human INSL3 promoter (-1137 to +11 bp). Cells were then stimulated with/exposed to (from left to right) vehicle (DMSO), testosterone (T) (35 nM) or testosterone coupled to BSA (T- BSA) (35 nM equivalent) as indicated, in presence or absence of pertussis toxin (100ng / mL, 12 hours pre-treatment). Results are presented as fold activation over control and are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). Different letters indicate a statistically significant difference (P<0.005).

139 Figure 3.4 : Testosterone-induced INSL3 promoter activity does not require classical kinases. MA-10 Leydig cells were transiently transfected a human INSL3 promoter (- 1137 to +11 bp). Cells were then stimulated with/exposed to (from left to right) vehicle (DMSO) or testosterone (T) (35 nM) for 24 hours in absence of presence of various inhibitors: KN-93 (5 µM); H89 (5 µM); Hydroxyflutamide (HO-F) (5 µM); SB 203580 (5 µM); SP 600125 (1 µM); PD 98059 (50 µM). Results are shown as relative activity and are the mean of three individual experiments performed in duplicate (±SEM). Different letters indicate a statistically significant difference (P<0.005). The hashtag (#) indicates a statistically significant difference in the fold stimulation by testosterone.

140

Laguë and Tremblay Figure 3.1

MA-10 n=2 Human INSL3 promoter Luc 3.0 -1137 bp +11 bp

2.5 2.0 1.5 1.0

FoldActivation 0.5 0 Vehicle T 35 nM Vehicle T 35 nM Finasteride Treatment

141 Laguë and Tremblay Figure 3.2

MA-10 Human INSL3 promoter Luc n=3 -1137 bp +11 bp 4 d

3 c

2 b a a a

1 FoldActivation

0 Veh MEHP T T-BSA T T-BSA MEHP Treatment

142

Laguë and Tremblay Figure 3.3

MA-10 Human INSL3 promoter Luc n=3 -1137 bp +11 bp 4 c c 3

b 2 b

Activation a a

1 Fold

0 Veh T T-BSA Veh T T-BSA Pertussis toxin Treatment

143 Laguë and Tremblay Figure 3.4

3.2 x # 1.0 x # 2.6 x 2.6 x 3.6 x # 2.8 x 3.0 x 2.8 x 4 h g h

f 3 f

e 2

a a corrected Fold Activation corrected a a

- a a

1 b b

d Renilla c

0 T - + - + - + - + - + - + - + - + Veh HO-F MEHP KN-93 H-89 SB SP PD 203580 600125 98059 Treatment

144

Préambule au chapitre IV

Les différentes données accumulées m’ont permis de constater que les variations d’intensité de la réponse aux androgènes semblaient liées au milieu de culture utilisé.

J’ai donc parcouru la littérature afin d’identifier différents facteurs qui pourraient moduler l’activité des cellules de Leydig. La plupart des facteurs identifiés n’ont eu aucun effet sur la transcription d’INSL3 dans les cellules de Leydig MA-10. Toutefois, deux études épidémiologiques ont démontré que le nombre de nouveau-nés cryptorchides était plus élevé chez les femmes enceintes souffrant de diabète durant la grossesse. Ainsi, il semblerait qu’il y ait un lien entre l’activité de l’insuline et la descente des testicules.

J’ai donc investiguer un lien potentiel direct entre l’insuline et la production d’INSL3, hormone essentielle à la descente testiculaire.

Les données sont préliminaires et non statistiquement significatives. Néanmoins, elles sont claires et non-équivoque, et démontrent que l’insuline induit la transcription d’INSL3.

145

Chapitre IV

INSULIN INDUCES INSL3 TRANSCRIPTION IN MA-10 LEYDIG CELLS

Éric Laguë1 and Jacques J. Tremblay1,2 *

1 Reproduction, Mother and Child Health, CHUQ Research Centre, Quebec City, Quebec, Canada G1V 4G2

2 Centre for Research in Biology of Reproduction, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproduction, Faculty of Medicine, Université Laval, Quebec City, Québec, Canada G1V 0A6

*Corresponding author:

Dr. Jacques J. Tremblay Reproduction, perinatal and child health CHUQ Research Centre, CHUL Room T3-67 2705 Laurier Blvd. Quebec City, Quebec CANADA G1V 4G2 Tel: 418-525-4444 x46254 Fax: 418-654-2783 E-mail: [email protected]

Manuscript Categories: Original article Disclosure Statement: EL and JJT have nothing to declare. Keywords: Insulin-like 3, Insulin, Transcription, Androgen

147

4.1 RÉSUMÉ

Insulin-like 3 (INSL3) est un petit peptide produit par les cellules de Leydig des testicules. Il a été démontré qu’INSL3 est essentiel à la descente du testicule pendant le développement fœtal mâle. Le manque d'activité d’INSL3 sur le gubernaculum provoque la cryptorchidie (rétention des testicules) qui, à son tour, est corrélée avec une sous masculinisation, une fécondité réduite et un risque plus élevé de développer un cancer des testicules. Il a été démontré que les perturbateurs endocriniens et les composés estrogéniques peuvent réduire l'expression d’Insl3/INSL3 chez de nombreux mammifères (inluant les humains) en ciblant directement les activités des cellules de Leydig. De même, il a été démontré qu’une activité insuffisante de l’insuline (diabète) chez la mère enceinte augmente le risque de cryptorchidie des fœtus mâles, nous avons donc cherché à évaluer le rôle de l'insuline sur l’activité du promoteur INSL3 humain dans les cellules de Leydig. Nous montrons que l'insuline augmente l’activité du promoteur INSL3 humain dans la lignée de cellules de Leydig MA-10. Ceci suggère que le diabète gestationnel pourrait réduire l'expression d’INSL3 et ainsi contribuer à la prévalence plus élevée de la cryptorchidie chez les garçons nés de mères diabétiques.

149

4.2 ABSTRACT

Insulin-like 3 (INSL3) is a small peptide produced by testicular Leydig cells. INSL3 has been shown to be essential for testis descent during male fetal development. Deficient INSL3 activity on the gubernaculum causes cryptorchidism (retention of the testes) which is, in turn, correlated with under masculinization, lower fertility and higher risk of developing testicular cancer. Endocrine disrupting chemicals (EDCs) and estrogenic compounds have been shown to reduce INSL3 expression in many mammals (including humans) by directly targeting Leydig cell activities. As gestational diabetes increases the risk of cryptorchidism in male fetuses, we sought to assess the role of insulin on INSL3 transcription in Leydig cells. We found that insulin increases the activity of the human INSL3 promoter in MA-10 Leydig cells. This suggests that gestational diabetes could reduce INSL3 expression and thus contribute to the higher prevalence of cryptorchidism in newborn boys from diabetic mothers.

151

4.3 INTRODUCTION

Insulin-like 3 (INSL3), also known as relaxin-like factor (RLF), is a member of the insulin-IGF-relaxin family of growth factors and hormones [1, 2]. This hormone is, in non-pathological condition, exclusively expressed in the gonads. During fetal life, INSL3 is produced by maturing Leydig cells of the male gonad whereas it is secreted by both the testis (Leydig cells) and the ovary (theca and luteal cells) in adults [1-4]. INSL3 was found to be essential to initiate and maintain the first step of testis descent during male sex differentiation. Insl3-/- null mice have bilateral cryptorchid testes located high in the abdominal cavity close to the kidneys [5, 6]. It has been observed that diabetic pregnant mothers more frequently give birth to boys with congenital cryptorchidism (retention of the testes). Even mild gestational diabetes mellitus (GDM) is correlated to diabetes-associated cryptorchidism [7, 8]. GDM is defined as any degree of glucose intolerance with onset or first recognition during pregnancy [9]; it affects 7 % to 18 % of pregnancies each year [10, 11]. The American diabetes association reports that GDM represents nearly 90% of all pregnancies complicated by diabetes [9]. It has been reported that 16.3% of all cases of GDM were diagnosed within 16 weeks of pregnancy using cutoff of greater than or equal to 140 mg/dL 2 hours after a 75-g oral glucose challenge [11]. The high prevalence of GDM in the first trimester is considered an important issue [12].

Gestational diabetes and impaired glucose tolerance have been associated with higher than normal levels of insulin in umbilical cord blood, indicating fetal hyperinsulinemia [13, 14] which is a risk factor of preterm delivery [15, 16] and cryptorchidism independent of preterm delivery [17]. This type of diabetes results from deficient insulin action; either from inadequate insulin secretion and/or diminished tissue response to insulin [9, 12]. Data from Grewal et al (2012) show that GDM-afflicted mothers have both higher serum insulin and oral glucose tolerance test (OGTT) value indicative of insulin resistance [12, 18].

153 Since it has been demonstrated that exposure of Leydig cells to testosterone can induce INSL3 transcription [19] and that testosterone production is known to be modulated by insulin in Leydig cells [20], it is of interest to assess the effect of insulin on INSL3 transcription to better understand the mechanisms of INSL3 expression in Leydig cells.

154

4.4 MATERIALS AND METHODS

4.4.1 Plasmids

The -1137 to +11 bp human INSL3 promoter fragment has been previously described [21]. All reporter constructs were subcloned in a modified pXP1 Luciferase reporter construct [22] and subsequently verified by sequencing (Centre de génomique de Québec, CHUQ Research Centre, Quebec City, Canada).

4.4.2 Cell culture and transfections

The mouse Leydig cell line MA-10 [23] was provided by Dr. Mario Ascoli (University of Iowa, Iowa City, IA). Cells were grown in Waymouth’s media supplemented with 12% horse serum and 50 mg/L of gentamicin and streptomycin sulfate, at 37°C in 5%

CO2. Cells were plated in a 24-well plate at a density of 90,000 cells per well in Waymouth’s media supplemented with 12% charcoal-treated horse serum and allowed to recover for 16-24 h before transfection. Twenty pmol of INSL3 Firefly luciferase reporter construct along with 8 ng of phRL-TK Renilla luciferase reporter, used as internal control for transfection efficiency, were transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s recommendations. In the first experiment, four hours later, media was replaced and cells were incubated in either minimal medium containing 0.2 % Bovine Serum Albumin - Fatty Acid Free (BSA-FAF) to maintain oncotic pressure or medium containing 12 % charcoal treated horse serum, and then exposed to T and/or MEHP as indicated in Lague and Tremblay (2008) [19]. BSA-FAF was purchased from Sigma- Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). In the second experiment, four hours later, media was replaced and cells were incubated in medium containing 12 % charcoal treated horse serum, and then exposed to T and/or MEHP as indicated in Lague and Tremblay (2008) [19] with 6 nM of human biosynthetic insulin (Novolin GE, Toronto) or vehicle equivalent (v/v) of DMSO (control) for 24 h before lysis. Cells were lysed and luciferase activities measured using the Dual Luciferase Assay System (Promega Corp, Madison, WI) and the EG&G Berthold LB 9507 luminometer (Berthold Technologies,

155 Oak Ridge, TN). Transfections were performed at least three times in duplicate using different preparations of plasmid DNA.

4.4.3 Statistical analysis

Statistical analyses of data presented in Figure 4.1 and Figure 4.2 were done using One- way Anova or Kruskal-Wallis test (when parameters were not met) followed by a Dunn's post-hoc test. For all statistical analyses, P < 0.05 was considered significant.

Data presented in Figure 4.2 were subsequently analyzed using unpaired t test. Variances among pair were not significantly different except for particular pairs. In those cases, unpaired t test with Welch’s correction was used. For all statistical analyses, P < 0.05 was considered significant.

All statistical analyses were done using the SigmaStat software package (Systat Software Inc, San Jose, CA).

156

4.5 RESULTS

Figure 4.1 shows that the serum concentration has no major impact on INSL3 transcription as increasing serum concentration does not increase INSL3 promoter activity. When cells were treated with insulin however, a significant increase in INSL3 promoter activity was observed (Figure 4.2). In basal condition, insulin increases INSL3 promoter activity by 2.90 fold which is similar to the activation observed in the presence of testosterone 1.86 fold. When both hormones were combined, an additive activation of about 4.68 fold was observed (Fig. 4.2).

Since the endocrine disruptor MEHP is known to repress the testosterone-induced INSL3 promoter activity [19], we next tested whether MEHP had any effect on the insulin-mediated effects. Unexpectedly, combining MEHP with insulin led to a further increase in INSL3 promoter activity. Insulin alone increases INSL3 promoter activity by 2.90 fold and MEHP alone had no effect. Whereas, the combination of insulin and MEHP resulted in a 4.68 fold increase. When all three molecules were combined (MEHP, testosterone and insulin), INSL3 promoter activity was increased about 5.45 fold. These data suggest that insulin is not only an activator of INSL3 transcription but also that it can prevent the deleterious effects of the MEHP endocrine disruptor.

157 4.6 DISCUSSION

INSL3, a small peptide of gonadal origin, plays important roles in reproductive function [24]. Circulating levels of INSL3 were shown to be positively correlated with both testosterone and LH blood levels [25]. We previously reported that testosterone induces Insl3 expression in the MA-10 Leydig cell line and in primary Leydig cells in culture [19] through a yet unknown mechanism. We showed that Insl3 expression is induced by three fold when exposed to physiological concentration of T, in an AR dependent manner [19]. We also demonstrated that the induction by T is blunted in the presence of MEHP [19], a known anti-androgenic DEHP metabolite which is now considered an environmental contaminant [26]. MEHP repressed T induction by roughly 30 % [19]. Taken together, the data suggested that cryptorchism and later testis dysgenesis syndrome were probably caused, at least in part, by the effects of endocrine disrupting chemicals (EDCs), including MEHP, on Leydig cell function. These data provided the first evidence confirming that Insl3 gene expression was not constitutive but could be hormonally-regulated.

Epidemiologic studies have showed that cryptorchidism could result from in utero exposure to DEHP/MEHP through reduction of both T and INSL3 expression/activity. Furthermore, the impact of DEHP/MEHP exposure leading to a reduction of T and INSL3 can be replicated in vitro. Furthermore, diabetes-afflicted pregnant mothers have a higher risk of having cryptorchid boys. During the pregnancy, the fetuses of diabetes-afflicted pregnant mothers are exposed to higher than normal serum insulin levels (as indicated by umbilical cord blood insulin) and higher serum glucose (fetal hyperinsulinemia) [13, 14]. Diabetes-related cryptorchidism could be the result of lower insulin signaling activity not compensated by higher serum insulin level.

Consistent with this, we show here that insulin stimulates human INSL3 promoter activity by 2.9 fold. Furthermore, the combination of insulin and testosterone lead to additive effects (2.9 fold for insulin alone, 1.88 fold for testosterone and 4.68 fold when both were combined). This suggests the existence of parallel pathways or effectors that are involved in maximal INSL3 promoter activity in response to these stimuli.

158

Contrary to its repressive effects on testosterone-dependent INSL3 expression [19], MEHP does not reduce insulin-induced INSL3 promoter activity. Combining both MEHP and insulin rather stimulates INSL3 promoter activity. These data suggest that insulin action on Leydig cells could prevent some repressive effects by certain endocrine disrupting chemicals. More work is required to validate this hypothesis.

In conclusion, our current results provide novel insights into the mechanisms responsible for the increased incidence of cryptorchidism in boys born to mother suffering from gestational diabetes. Further work is needed to clearly understand the role and mechanism of action of insulin in induction of Insl3 transcription.

159 4.7 ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Dr. Mario Ascoli (University of Iowa) for providing the MA- 10 Leydig cell line.

4.8 CONFLICT OF INTEREST STATEMENT

The authors have nothing to declare.

4.9 FUNDING

JJT holds a Chercheur-boursier sénior Scholarship from the Fonds de recherche du Québec—Santé. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (MOP-77575 and MOP-81387) to JJT.

160

4.10 REFERENCES

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163 4.11 FIGURE LEGENDS

Figure 4.1: Serum concentration in media does not influence INSL3 transcription pattern. MA-10 Leydig cells were transfected with the human INSL3 promoter (-1137 to +11 bp) and treated for 24 h with either vehicle (DMSO), testosterone (T) (35 nM), MEHP (30 µM) or T + MEHP (30 µM) under 0.2 % BSA-FAF medium (gray bars) or 12 % charcoal treated horse serum medium (black bars) as indicated. Results are shown as fold activation over control and are the average of three separate experiments performed in duplicate (± SEM). There is no meaningful statistically relevant difference according to Kruskal-Wallis test followed by a Dunn's post-hoc test at P < 0.05.

Figure 4.2: Insulin induces INSL3 transcription in MA-10 cells. MA-10 Leydig cells were transfected with the human INSL3 promoter (-1137 to +11 bp) and treated for 24 h (in 12 % serum medium) with either vehicle (DMSO), testosterone (T) (35 nM), MEHP (30 µM) or T + MEHP (30 µM) in the absence (gray bars) or presence (black bars) of 6 nM of insulin as indicated. Results are shown as fold activation over control and are the average of three separate experiments performed in duplicate (± SEM). Asterisks (* and ***) represent statistically significant differences of mean at P<0.05 and P<0.01 respectively using unpaired t test. A different letter indicates a statistically significant difference.

164

Laguë and Tremblay Figure 4.1

Human INSL3 promoter Luc MA-10 8.00 n = 3 -1137 bp +11 bp

6.00

4.00 activation

2.00 Fold

0.00

T35nM

Vehicle MEHP MEHP +

T35nM

Vehicle MEHP MEHP +

T T

BSA-FAF 12 % Serum

165 Laguë and Tremblay Figure 4.2

Human INSL3 promoter Luc MA-10 8.00 n = 3 -1137 bp +11 bp *** *** e 6.00 *** d,e * d 4.00

c activation

b 2.00 a,b Fold a a

0.00 Insulin - + - + - + - + Vehicle T MEHP MEHP + T

166

Préambule au chapitre V

Tel que mentionné à la section 1.9.6, l’exposition in utero au diéthylstilbestrol (DES) ou à l’estradiol cause différents symptômes du TDS dont la cryptorchidie. La cryptorchidie est alors principalement due à l’absence de développement du gubernaculum. Ce qui a pour effet de maintenir le testicule en position abdominale.

Plusieurs éléments sont à considérer. Premièrement, les données présentes dans la littérature démontrent que le DES et l’estradiol causent une diminution de la production de testostérone et d’INSL3. En second lieu, j’ai démontré que la testostérone induit l’expression d’Insl3/INSL3. En troisième lieu, j’ai démontré que le MEHP cause une inhibition de l’action de la testostérone sur l’expression d’Insl3/INSL3. De plus, il a été démontré in vivo que les effets délétères de l’action du DES et de l’estradiol pouvaient être contrecarrés par l’action de la testostérone.

Considérant l’ensemble de ces données et mes résultats précédents, j’ai émis l’hypothèse que mon modèle cellulaire (cellules transformées MA-10) pouvait permettre l’étude de l’inhibition de l’expression d’Insl3/INSL3 par les estrogènes.

Les résultats présentés dans ce chapitre démontrent et confirment que l’exposition des cellules de Leydig aux estrogènes inhibe la transcription d’Insl3/INSL3 et que les cellules de Leydig MA-10 peuvent être utilisées comme modèle cellulaire pour l’étude moléculaire de la répression de l’expression d’Insl3/INSL3 causée par les estrogènes.

De plus, mes résultats démontrent entre autres que, comme c’est le cas pour l’effet du MEHP sur l’expression d’Insl3/INSL3, l’estradiol (à des niveaux physiologiques) réprime directement l’expression d’Insl3/INSL3 en diminuant l’activité basale du promoteur. Ces résultats permettent d’expliquer l’effet de compensation observé en présence de testostérone.

167

Chapitre V

Estradiol represses Insulin-like 3 expression and promoter activity in MA-10 Leydig cells

Éric Laguë1 and Jacques J. Tremblay1,2*

1 Reproduction, perinatal and child health, CHUQ Research Centre, Quebec City, Quebec, Canada, G1V 4G2

2 Centre for Research in Biology of Reproduction, Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada, G1V 0A6

Keywords: INSL3, Transcription, Estradiol, Reproduction, Nuclear receptors, MA-10 Leydig cells

Disclosure statement: The authors have nothing to declare.

*Corresponding author:

Dr. Jacques J. Tremblay Reproduction, perinatal and child health CHUQ Research Centre, CHUL Room T1-49 2705 Laurier Blvd. Quebec City (Quebec) CANADA G1V 4G2 Phone: 418-525-4444 x46254 Fax: 418-654-2765 E-mail: [email protected]

169

5.1 RÉSUMÉ

Il y a de plus en plus de rapports démontrant les effets délétères sur le développement et les fonctions du système reproducteur mâle exposé à divers perturbateurs endocriniens. La cryptorchidie ou la non-descente des testicules, en est un bon exemple. Celle-ci peut être causée par l’exposition à un excès d’estrogènes. En effet, l’activation du récepteur aux estrogènes alpha (ERα) cause une réduction de l’expression du gène INSL3 (insulin-like 3) dont le petit peptide produit par les cellules de Leydig est essentiel à la descente testiculaire lors du développement fœtal. Le mécanisme moléculaire menant à la réduction de l’expression Insl3 par la dyade ERα/estrogène demeure inconnu. Dans le présent article, nous démontrons que l’estradiol (E2) réduit le niveau d’ARNm d’Insl3 dans les cellules MA-10, une lignée de cellule de Leydig utilisée comme modèle. Nos résultats démontrent qu’E2 réduit l’activité transcriptionnelle des promoteurs humain et murin d’Insl3. Nous avons circonscrit la région répondant à l’E2 sur le promoteur proximal du promoteur humain d’INSL3. Cette région ne contient pas d’élément consensus de réponse aux estrogènes. Ceci indique que le mécanisme de répression est indirect. Conformément à cela, nous avons noté que la réponse à l’E2 est perdue lorsque nous mutons les sites de liaisons pour les récepteurs nucléaires NUR77 et SF1. Finalement, nous démontrons que l’effet de l’exposition à l’E2 peut être renversé par un traitement conjoint avec de la testostérone, un activateur de la transcription d’Insl3. Dans l’ensemble, nos données procurent de nouvelles perspectives sur le mécanisme d’action des estrogènes sur la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig.

171

5.2 ABSTRACT

There is increasing evidence in the literature reporting the detrimental effects of endocrine disruptors on the development and function of the male reproductive system. One example is cryptorchidism, or undescended testis, caused by exposure to excessive estrogens. Estrogens, acting through the estrogen receptor α (ERα), have been shown to repress expression of the gene encoding insulin-like 3 (INSL3), a small peptide produced by testicular Leydig cells that is essential for normal testis descent. The molecular mechanism of estrogen/ER action on Insl3 expression, however, remains poorly understood. Here we report estradiol (E2) represses Insl3 mRNA levels in MA-

10 cells, a Leydig cell line model. We also found that E2 represses the activity of the human and mouse Insl3 promoter in these cells. The E2-responsive region of the human INSL3 promoter was located to the proximal INSL3 promoter. This region does not contain a consensus estrogen response element indicating an indirect mechanism of action. In agreement with this, we found that E2-responsiveness was lost when two previously characterized binding sites for the nuclear receptors NUR77 and SF1 were mutated. Finally we show that the E2 repressive effect could be overcome by cotreatment with testosterone, a positive regulator of Insl3 transcription. Collectively our data provide important new insights into the molecular mechanism of estrogen action in Insl3 transcription in Leydig cells.

173

5.3 INTRODUCTION

Proper migration of the testes, from their original position adjacent to the kidneys to their final location within the scrotum, constitutes a normal and obligatory step of the male sex differentiation process. Testicular descent occurs in two distinct and sequential phases: the intra-abdominal phase where the testis migrates to the base of the abdomen, and the inguino-scrotal phase where the testis goes through the inguinal canal into the scrotum (Foresta et al, 2008). Each of these two phases is regulated by a specific hormone secreted by testicular Leydig cells: insulin-like 3 (INSL3) regulates the intra-abdominal phase while testosterone controls the inguino-scrotal phase. Several epidemiological studies have demonstrated a significant increase in the past 50 years in the incidence of cryptorchidism or undescended testis in various industrialized countries (Foresta et al, 2008). Cryptorchidism is currently the most common pediatric disorder in newborn males with a frequency of 2-4% in full-term newborn males (Barthold, 2008). Spontaneous descent has been reported, especially in preterm babies, so that the overall incidence by the age of 1 yr is around 1-2%. The two main complications associated with cryptorchidism are testicular cancer and decreased fertility (Foresta et al, 2008).

Cryptorchidism exists in phenotypes ranging from milder forms (unilateral cryptorchidism, testis positioned high in the scrotum) to more severe cases (bilateral cryptorchidism, testes high in the abdomen). Although the etiology of cryptorchidism is multifactorial, epidemiological studies have revealed the predominance of some factors. For instance, the overall risk of cryptorchidism is 3.6-fold higher than the general population when a family member is affected which suggests a genetic component to the disease (Barthold, 2008). Environmental xenoestrogens (herbicides, pesticides, PCBs, plasticizers, and polystyrenes) that mimic estrogens can also cause undermasculinization of the male fetus. Indeed, exposure of the male embryo to excessive estrogen levels constitutes another risk factor for cryptorchidism. This was first demonstrated with the synthetic estrogen diethylstilbestrol (DES) prescribed between the late 1940s until the early 1970s to prevent miscarriage. The practice was abandoned because of the high rates of cryptorchidism (Gill et al, 1979). Different

175 studies have also revealed that estradiol levels were very high in the placenta of mothers who gave birth to cryptorchid boys (Hadziselimovic et al, 2000). The impact of estrogens on cryptorchidism has been confirmed using animal models where treatment of pregnant mice or rats with estrogens or DES leads to a failure of testicular descent in the male offspring (Emmen et al, 2000; Grocock et al, 1988; Nef et al, 2000). A similar phenotype is observed in transgenic male mice overexpressing the Cyp19a1 gene that encodes the aromatase enzyme that converts androgens into estrogens (Li et al, 2001). Because adipose tissue is an important source of estrogens, maternal obesity has also been associated with increased risk for cryptorchidism (Berkowitz et al, 1995).

The mechanisms of estrogen-induced cryptorchidism are still poorly understood. Using mouse and rat models, several groups reported that in utero exposure to estrogens (estradiol, DES, 4-octylphenol) leads to a dramatic reduction of insulin-like 3 (INSL3) and testosterone production by Leydig cells caused by decreased expression of the genes encoding Insl3 and several enzymes involved in testosterone biosynthesis (Cederroth et al, 2007; Delbes et al, 2005; Emmen et al, 2000; Nef et al, 2000). Further studies revealed that estrogen-induced cryptorchidism and repression of Insl3 and steroidogenic enzyme-encoding genes was mediated through the estrogen receptor α (ERα) expressed in Leydig cells (Cederroth et al, 2007; Couse and Korach, 2004; Delbes et al, 2005). The exact molecular mechanisms by which estrogen/ERα causes a decrease in Insl3 expression, however, remain unknown. In the present study, we report that estradiol (E2) represses Insl3 mRNA levels in MA-10 Leydig cells. In addition, we show that E2 represses the activity of the human and mouse Insl3 promoter and that this repression involves two binding sites for the nuclear receptors NUR77 and SF1. Finally, we provide evidence that estradiol repressive effect can be prevented by testosterone.

176

5.4 MATERIALS AND METHODS

5.4.1 Plasmids

The -1137, -920, -656, -322, -132, -85 and -31 bp human INSL3 promoter and the -978 bp mouse Insl3 promoter constructs fused to the Firefly luciferase reporter have been described previously (Laguë and Tremblay, 2008). The -1137 bp human INSL3 promoter harboring a mutation in the -100 bp nuclear receptor binding site was reported elsewhere (Robert et al, 2006). The mutation in the -65 bp nuclear receptor binding site in the context of the -1137 and -85 bp INSL3 reporter was introduced using the QuikChange XL mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) along with the following oligonucleotides where the mutations are in lowercase: sense, 5’-AAT GTT CTG TCC CTT CTC CAA ttC CCC CAG CTG GGA CGG CCC-3’; antisense, 5’-GGG CCG TCC CAG CTG GGG Gaa TTG GAG AAG GGA CAG AAC ATT-3’.

5.4.2 RNA isolation and real time PCR

Preparation of total RNA from MA-10 Leydig cells and real time PCR were performed as previously described (Laguë and Tremblay, 2008; Robert et al, 2006). Briefly, total RNA was isolated using the RNeasy Plus mini kit (Qiagen Canada, Mississauga, Ontario, Canada) and first strand cDNAs were synthesized from a 5 µg aliquot of RNA using the Superscript III Reverse Transcriptase System (Invitrogen Canada, Burlington, ON). The real time PCR were carried out using a LightCycler 1.5 instrument and the LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit from Roche Diagnostics (Laval, Canada) according to the manufacturer’s recommendations. The primers for Insl3 were as follows: forward, 5’-CAT GCG CGC GCC GCT GCT AC- 3’ and reverse, 5’-TCA GTG GGG ACA CAG ACC C-3’. As an internal control, the ribosomal protein L19 (Rpl19) mRNA was amplified using the following primers: forward, 5’-CTG AAG GTC AAA GGG AAT GTG-3’ and reverse, 5’-GGA CAG AGT CTT GAT GAT CTC-3’. The PCRs were performed using the following conditions: 10 min at 95oC followed by 35 cycles of denaturation (5 s at 95oC), annealing (5 s at 62oC for Rpl19 and at 64oC for Insl3), and extension (20 s at 72oC) with single acquisition of fluorescence at the end of extension step. After amplification,

177 the samples were slowly heated at 0.2oC/sec from 75-95oC with continuous reading of fluorescence to obtain a melting curve. The specificity of each PCR product was then determined by using the melting curve analysis program of the LightCycler software and confirmed by agarose gel electrophoresis. The Insl3 and Rpl19 PCR products showed a single peak in the analysis. Quantification of gene expression was performed using the Relative Quantification Software (Roche Diagnostics, Laval, Canada) and is expressed as a ratio of Insl3 to Rpl19 mRNA levels. Each amplification was performed in duplicate using three different preparations of first-strand cDNAs for each of the three different RNA extractions.

5.4.3 Cell culture and transfections

The mouse Leydig cell line MA-10 (Ascoli, 1981) was provided by Dr. Mario Ascoli (University of Iowa, Iowa City, IA). Cells were grown in Waymouth’s media supplemented with 12 % horse serum and 50 mg/L of gentamicin and streptomycin sulfate, at 37°C in 5% CO2. Cells were plated in a 24-well plate at a density of 90,000 cells per well in Waymouth’s supplemented with 12 % charcoal-treated horse serum and allowed to recover for 16-24 h before transfection. Twenty pmol of INSL3 Firefly luciferase reporter construct along with 8 ng of phRL-TK Renilla luciferase reporter, used as internal control for transfection efficiency, were transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen Canada, Burlington, Ontario, Canada). Four h later, media was replaced and cells were treated with or without 10 nM 17β-estradiol

(E2) and/or 20 nM testosterone for 24 h. To prepare the working E2 solution, a 100 mM stock solution was initially prepared by resuspending 0.0267 g of E2 (Sigma-Aldrich Canada) in 0.980 mL of DMSO (Sigma-Aldrich Canada) in a brown siliconized 1.5 ml polypropylene tube. The solution was stirred at high speed for several minutes until complete resuspension. A 1:10,000 dilution (10 µM E2) was then prepared by adding

2 µL of the 100 mM E2 stock to 20,000 μL of culture media in a borosilicate glass vial.

A subsequent 1:1,000 dilution (10 nM E2) was prepared by adding 20 μL of the 10 µM

E2 dilution in 20,000 μL of culture media. This final E2 solution (10 nM) was directly applied onto the cells. The final DMSO concentration was 0.00001%. A 0.00001% DMSO solution was used as vehicle control. Cells were then lysed and luciferase

178

activities measured using the Dual Luciferase Assay System (Promega Corp, Madison, WI) and the Luminoskan Ascent luminometer (Thermo Scientific, Milford, MA). Transfections were performed at least three times in duplicate using different preparations of plasmid DNA.

5.4.4 Statistical Analysis

Statistical analyses were done using One-way Anova or Anova on ranks (when parameters were not met) followed by a Student-Newman-Keuls post-test. For all statistical analyses, P < 0.05 was considered significant. All statistical analyses were done using the GraphPad Prism software package (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA).

179 5.5 RESULTS

5.5.1 E2 represses Insl3 expression in MA-10 Leydig cells

To determine whether estradiol (E2) directly represses Insl3 expression, we treated MA-10 cells, a Leydig cell line known to express ERα (Ree et al, 1990), with a physiologically relevant dose of E2 (10 nM) (Pentikainen et al, 2000). As shown in Fig.

5.1, Insl3 mRNA levels were significantly decreased in the presence of E2 as determined by quantitative real time PCR.

5.5.2 E2 represses the activity of the human and mouse Insl3 promoter

Next, to test whether the repressive effect of E2 are due to a decrease in Insl3 gene transcription, MA-10 cells were transfected with a -1137 bp human INSL3 reporter construct and treated with DMSO or 10 nM E2. As shown in Fig. 5.2, E2 caused a 40% decrease in human INSL3 promoter activity. Similar results were obtained with a -978 bp mouse Insl3 promoter (Fig. 5.2). Thus, E2 represses the activity of the Insl3 promoter from different species.

5.5.3 Localization of the E2 responsive region in the human INSL3 promoter

To locate the E2-responsive element(s) in the human INSL3 promoter, a series of 5’ progressive deletion constructs of the human INSL3 promoter were transfected in MA-

10 Leydig cells which were then treated with 10 nM E2. As shown in Fig. 5.3, promoter constructs harboring deletions between -1137 and -132 bp were still repressed by E2.

Deletion from -132 to -85 bp partly relieved the E2 repressive effect while the -31 bp reporter construct was no longer affected by E2 (Fig. 5.3). These data indicate that the

INSL3 promoter contains two E2-responsive regions located between -132 and -85 bp and between -85 and -31 bp. Sequence analysis of both regions, however, failed to identify a consensus estrogen response element (ERE: GGTCAnnnTGACC) but revealed the presence of two ½ sites for the binding of nuclear receptors (AGGTCA): one within the -132/-85 bp region (AAAAGGTCA at -100 bp) and the other in the - 85/-31 bp region (CCAAGGCCC at -65 bp). These sites are binding sites for the

180

nuclear receptors NUR77 and SF1 (Koskimies et al, 2002; Robert et al, 2006; Sadeghian et al, 2005; Tremblay and Robert, 2005; Zimmermann et al, 1998).

To directly address the involvement of these ½ sites in E2-responsiveness, mutations known to prevent binding of NUR77 and SF1 were introduced in each element in the context of the -1137 bp promoter. As shown in Fig. 5.4, INSL3 promoter constructs harboring a mutation in the -100 bp or in the -65 bp element were still significantly repressed by E2. Simultaneously mutation of both elements, however, abrogated the E2 repressive effect (Fig. 5.4). Similarly, a -85 bp INSL3 promoter construct that no longer contains the -100 bp site but retains the -65 bp site was still repressed by E2 (Fig. 5.4). The -85 bp INSL3 reporter with a mutation in the -65 bp site was no longer repressed by E2 (Fig. 5.4). These results indicate that the presence of only one intact ½ site (-100 or -65 bp) is sufficient to confer E2-responsiveness.

5.5.4 Testosterone prevents E2 repressive effect on the INSL3 promoter

Testosterone was reported to prevent the detrimental effects of estrogen on the male reproductive tract in rats (Rivas et al, 2002; 2003). Since we recently demonstrated that Insl3 expression and promoter activity in Leydig cells were stimulated by testosterone (Laguë and Tremblay, 2008), we tested the effects of both testosterone and estradiol on INSL3 promoter activity. As shown in Fig. 5.5, treatment of MA-10 cells with a physiologically relevant dose (20 nM) of testosterone (Turner et al, 1984) led to a 3.3 fold activation of the -1137 bp human INSL3 reporter in agreement with our previous data (Laguë and Tremblay, 2008), while 10 nM E2 alone repressed promoter activity by 40%. Combination of testosterone and E2 resulted in a 2.4 fold activation of the - 1137 bp INSL3 promoter, indicating that testosterone did indeed prevent some of the transcriptional repression caused by E2 (Fig. 5.5). All these effects were specific since a -31 bp INSL3 reporter construct was not affected by testosterone or E2.

181 5.6 DISCUSSION

5.6.1 E2 represses Insl3 transcription

The Insl3 gene, expressed specifically in Leydig cells, encodes a small peptide essential for proper positioning of the male gonad and insufficient INSL3 levels causes cryptorchidism (Foresta et al, 2008). Numerous studies have reported that maternal exposure to estrogenic compounds during pregnancy causes a decrease in Insl3 expression in Leydig cells leading to cryptorchidism in the male newborns but the underlying mechanisms remained unknown (Emmen et al, 2000; Gill et al, 1979; Grocock et al, 1988; Hadziselimovic et al, 2000; Li et al, 2001; Nef et al, 2000).

Consistent with this, we found that treatment of MA-10 Leydig cells with estradiol (E2) caused a significant decrease in endogenous Insl3 mRNA levels. This demonstrates the appropriateness of this cell line model to study the mechanism of estrogen action in Insl3 repression despite the fact that MA-10 cells do not correspond to fetal Leydig cells but rather to immature Leydig cells of the adult Leydig cell population. It is important to point out that Leydig cells from post-natal animals are also sensitive to estrogenic compounds (Akingbemi et al, 2003; Kim et al, 2007; Sakaue et al, 2002).

Using MA-10 cells, we also found that E2 repressed the activity of the human and mouse INSL3 promoter, indicating that E2 acts through an evolutionarily conserved mechanism. Thus, our data indicate that E2 inhibits Insl3 expression, at least in part, at the transcriptional level by repressing the activity of the Insl3 promoter.

5.6.2 Mechanisms of E2 action

The exact molecular mechanism of estrogen action in Insl3 expression remains largely unknown. A recent study by Cederroth et al have provided important insights by showing that the estrogen-repressive effect on Insl3 expression was mediated through ERα as revealed by the normal Insl3 levels in estrogen-treated Erα null mice (Cederroth et al, 2007). The INSL3 promoter region that we have identified as responsive to E2, however, does not contain an ERE, which points to an indirect mechanism of action. There are different possibilities, that are not mutually exclusive, by which ER can indirectly repress gene expression. For instance, activated-ER can repress gene

182

expression by physically interacting with other transcription factors sequestering them into a transcriptionally inactive complex. This mechanism has been implicated in the repression of several genes by E2/ER including αGSU, FSHβ and TSHβ in the pituitary (Keri et al, 1991; Miller and Miller, 1996; Nagayama et al, 2008), GnRH in hypothalamic cells (Chen et al, 1999; Roy et al, 1999), TNFα in monocytic cells (An et al, 1999), and ntcp in hepatocytes (Cao et al, 2004). Consistent with this, we have mapped the regulatory elements of the INSL3 promoter targeted by E2 to two ½ sites for the binding of nuclear receptors (AGGTCA), one within the -132/-85 bp region (AAAAGGTCA at -100 bp) and the other in the -85/-31 bp region (CCAAGGCCC at -65 bp). Consistent with our promoter deletion data, we found that mutation of both elements is required to abrogate the E2 repressive effect. These two elements are binding sites for the nuclear receptors NUR77 and SF1 (Koskimies et al, 2002; Robert et al, 2006; Sadeghian et al, 2005; Tremblay and Robert, 2005; Zimmermann et al, 1998). It is therefore possible that activated-ER might interact with these nuclear receptors preventing them from activating INSL3 transcription. In addition, activated- ER could also negatively modulate expression of Sf1 or Nur77. The effects of estrogens on Sf1 expression have been studied but the data are conflicting. Three studies found no effects (Cederroth et al, 2007; Emmen et al, 2000; Nef et al, 2000) while two reported that Sf1 levels were decreased in the testis of E2-treated animals (Ikeda et al,

2008; Majdic et al, 1997). Another mechanism for the E2 repressive effect could involve co-activators, most of which have histone acetylase activity, and protein modifications such as acetylation. Supporting this is the fact that the repression of the

Txnip gene by E2 was blocked by treatment with the histone deacetylase inhibitor, trichostatin A, suggesting that repression by E2 may involve regulation of protein acetylation (Deroo et al, 2004). Furthermore, we have recently observed that protein acetylation dramatically increases SF1- and NUR77-dependent activation of the INSL3 promoter in Leydig cells (our unpublished data), consistent with the fact that SF1 DNA binding affinity and transactivation potential are increased by direct acetylation (Jacob et al, 2001). It is therefore possible that E2 might disrupt the acetylation status of transcription factors involved in INSL3 transcription.

183 Excess E2 might also disturb the balance between androgen and estrogen levels during male reproductive development as suggested by the fact that coadministration of testosterone and DES in rats prevents most reproductive tract abnormalities caused by DES (Rivas et al, 2002; 2003). We recently reported that Insl3 expression is positively regulated by testosterone in an androgen receptor (AR)-dependent manner (Laguë and Tremblay, 2008). In the present study, we demonstrated that testosterone alleviates part of the E2 repressive effect. Antagonism between AR and ER has been reported previously and found to be mediated by physical interaction between AR and ERα in vivo (Panet-Raymond et al, 2000). Testis descent is also regulated by androgens and insufficient testosterone levels have been associated with cryptorchidism. E2 has been shown to repress expression of several genes encoding enzymes involved in testosterone biosynthesis leading to decreased testosterone levels (Cederroth et al, 2007; Delbes et al, 2005). Since Insl3 expression is upregulated by testosterone (Laguë and Tremblay, 2008), it is therefore possible that the E2 repressive effect on Insl3 transcription could be secondary to a decrease in testosterone production. Although this interesting possibility should not be excluded, our data in MA-10 Leydig cells support a direct involvement of E2 in repressing Insl3 transcription since MA-10 cells do not produce testosterone (Ascoli, 1981). While our current findings add to our knowledge on the molecular mechanisms of estrogen action in repressing Insl3 expression in Leydig cells, it is clear that more work needs to be done in order to fully understand its intricacy.

184

5.7 ACKNOWLEDGEMENTS

We would like to thank Dr. Mario Ascoli for generously providing the MA-10 Leydig cell line used in this study. The technical assistance of Stéphanie Fiola, Catherine Brousseau, and Amélie Tétu was greatly appreciated.

5.8 CONFLICT OF INTEREST STATEMENT

The authors have nothing to declare.

5.9 FUNDING

JJT holds a New Investigator Scholarship from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR). This work was supported by CHIR grant MOP-77575 to JJT.

185 5.10 REFERENCES

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189 5.11 FIGURE LEGENDS

Figure 5.1 : E2 represses Insl3 expression in Leydig cells. MA-10 Leydig cells were treated with either DMSO (open bar) or 10 nM E2 (black bar) for 24 h. Total RNA was then isolated and used in quantitative real time PCR using primers specific for Insl3 cDNA. Results were corrected with the Rpl19 cDNA. Results are the mean of five individual experiments each performed in duplicate (± SEM) and presented relative to the expression of Insl3/Rpl19 in the absence of E2 treatment (which was arbitrarily set to 1). An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from control.

Figure 5.2 : The human and mouse INSL3 promoter is repressed by E2. MA-10 cells were transfected with a -1137 to +8 bp human INSL3 promoter and a -978 to +5 bp mouse Insl3 promoter and treated with DMSO (open bars) or 10 nM E2 (black bars) for 24 h. An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control. Results are shown as % activity (± SEM) relative to the activity of the reporter in the absence of E2 treatment (which was arbitrarily set at 100%).

Figure 5.3 : The E2-responsive region is located in the proximal INSL3 promoter. MA- 10 cells were transfected with various 5’ deletion constructs of the human INSL3 promoter (the 5’-end point of each construct is indicated on the left of the graph) and treated with DMSO (open bars) or 10 nM E2 (black bars) for 24 h. An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control.

Figure 5.4 : Repression of the INSL3 promoter by E2 requires a nuclear receptor ½ site. MA-10 cells were transfected with either a wild type or a series of human INSL3 promoter constructs containing mutations in nuclear receptor (NR) ½ site at -100 bp (NR1) and/or at -65 bp (NR2) either in the context of the -1137 bp or -85 bp reporter. The mutation is depicted by a large X. A minimal -31 bp INSL3 reporter construct was used as control. Transfected cells were then treated with DMSO (open bars) or 10 nM

E2 (black bars) for 24 h. An asterisk (*) indicates a statistically significant difference from the respective control.

190

Figure 5.5 : Testosterone prevents E2-mediated repression of INSL3 promoter activity. MA-10 Leydig cells were transfected with a -1137 bp human INSL3 reporter construct and treated for 24 h with DMSO (open bars), 20 nM testosterone (T; grey bars), 10 nM

E2 (hatched bars), or both (black bars). A different letter indicates a statistically significant difference. Results are shown as fold activation over control (± SEM).

191 Laguë and Tremblay Figure 5.1

1.0 MA-10 (n=5)

0.8 *

Rpl19 0.5 / /

Insl3 0.3 Relative expression Relative

DMSO E2

192

Laguë and Tremblay Figure 5.2

MA-10 (n=4) 100

75 * *

50 (% of control) (%of

25 Relative Activity Relative

0 E2 - + - + Human Mouse

193 Laguë and Tremblay Figure 5.3

E2 - Human INSL3 promoter Luc + -1137 bp +8 bp * - + -920 bp * - + * -656 bp - + -322 bp * - + -132 bp * - + -85 bp * - MA-10 + (n=6) -31 bp 0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 Relative Activity (% of control)

194

Laguë and Tremblay Figure 5.4

E2 NR2 NR1 - Luc + -1137 bp -100 -65 +8 bp * - X + * - X + * - XX + - + -85 bp * - X + - + MA-10 -31 bp (n=5) 0 0.25 0.50 0.75 1.00 Relative Activity (% of control)

195 Laguë and Tremblay Figure 5.5

T E2 a + b Human INSL3 promoter Luc + c -1137 bp +8 bp + + d

+ + a -31 bp MA-10 + + (n=4)

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Fold Activation

196

Préambule au chapitre VI

Les chapitres 2 à 5 ont servi à démontrer/confirmer que les cellules de Leydig MA-10 pouvaient être utilisées comme modèle cellulaire pour l’étude des mécanismes moléculaires de l’expression d’Insl3/INSL3 et de la répression causée par différents perturbateurs endocriniens, en plus d’apporter divers éléments très intéressants et complémentaires les uns aux autres.

La présente section introduit des pistes de réflexion à diverses questions soulevées par les résultats présentés aux chapitres précédents.

Il n’a pas été possible de compléter la série d’expérimentation permettant de répondre à certaines interrogations soulevées puisque le modèle cellulaire, les cellules MA-10, a cessé de répondre à l’exposition à la testostérone. Dans cette section, je présente différentes hypothèses que j’ai développé qui auraient pu expliquer ce phénomène.

197

Chapitre VI

DISCUSSION

Les controverses entourant la toxicité du DEHP sont bien présentes. On peut comprendre que la toxicité présumée du DEHP est un enjeu de société important puisque le DEHP a une grande importance commerciale, est omniprésent dans plusieurs produits de consommation, est difficilement remplaçable, mais, en contrepartie, on le suspecte d’affecter la fertilité des individus et de favoriser l’émergence de certains cancers, deux fléaux qui affectent les sociétés développées et moins développées. Les données des études épidémiologiques ne suffisent pas à démontrer le lien de causalité et les études animales sont contestées pour différentes raisons, dont les fortes concentrations d’exposition et les différences au niveau de l’expression génique et du métabolisme. Néanmoins, ces études ont démontré que l’exposition in utero au DEHP ou à E2 induit une diminution marquée de la production de T et d’INSL3 par les cellules de Leydig et que les concentrations sanguines de ces mêmes hormones sont toujours négativement corrélées avec la concentration de DEHP (et de ses métabolites), et ce dernier point, chez toutes les espèces étudiées.

Différentes études ont étudié le lien fonctionnel entre la diminution de T observée et l’exposition au DEHP; toutefois aucune n’a permis de démontrer un lien clair et direct entre ces deux composés. De même, aucune n’étude n’avait été capable de comprendre le lien qui unit l’expression d’Insl3 et la T. D’autant plus qu’Insl3 est constitutivement exprimé (selon les données de littérature de l’époque). S’agirait-il d’une modification de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique? S’agirait-il d’un blocage de la signalisation des hormones? S’agirait-il d’un blocage de la maturation des cellules de Leydig? Et si c’est le cas, les humains sont-ils sensibles à cette perturbation, qu’elle est la dose critique? Aucune donnée présente dans la littérature ne permet de répondre à ces questions d’importance fondamentales. Seules des données de nature moléculaire pourraient permettre de répondre à des questions aussi pointues. Toutefois, l’utilisation d’animaux de laboratoire à ses limites (quantité de matériel et type d’expérimentation

199 réalisable) et pour des raisons éthiques évidentes on ne peut faire appel à des volontaires (qui devraient être des fœtus humains). Ainsi, la définition précise du mécanisme d’action du DEHP/MEHP et d’E2 menant à la diminution marquée de la production hormonale des cellules de Leydig faciliterait grandement l’extrapolation des données entre les espèces, et ainsi, permettrait de conclure une fois pour toutes sur les risques que les perturbateurs endocriniens DEHP et E2 représentent pour la santé reproductive des mammifères. Cependant, tel que mentionné auparavant, il n’existait pas, à cette époque, de modèle in vitro permettant de faire les manipulations qui permettraient d’obtenir le niveau de détails requis. C’est pourquoi j’ai développé et confirmé un modèle in vitro permettant de répondre, en partie, à différentes interrogations soulevées. De plus, mon modèle et mes données ont permis de mettre en évidence la relation directe qui unit la T et INSL3. Mes travaux sont les premiers à expliquer, au niveau moléculaire, différentes observations faites in vivo, autant chez l’homme que chez l’animal, et font, par le fait même, avancer autant les sciences biologiques et médicales, que les questions de santé publique et santé des populations.

L’objectif général, qui a été atteint en majeure partie, était de définir les conditions expérimentales permettant de reproduire le phénotype de diminution de l’expression d’Insl3/INSL3 en présence d’un perturbateur endocrinien dans une lignée de cellules de Leydig transformées, puis comprendre, de manière exhaustive, le mécanisme qui cause une diminution de l’expression d’Insl3/INSL3 par le DEHP ou les estrogènes.

6.1 Mode d’action de t/ar dans la régulation de l’expression d’insl3

6.1.1 Pertinence des résultats obtenus

Mes résultats démontrent que l’expression d’Insl3/INSL3 est fortement sensible à de faibles concentrations de T et démontrent aussi que la T testostérone induit une stimulation autocrine chez les Leydig. Ce résultat est d’une importance capitale, car personne n’avait jusque-là démontré cette relation directe; on ne connaissait aucun facteur affectant l’expression d’Insl3/INSL3 in vivo et in vitro. Cette découverte a généré une série d’interrogations et d’hypothèses qui ont mené à la définition et à

200

réalisation des deux objectifs suivants. D’une part, puisque l’expression d’Insl3 est induite par des hormones normalement présentes dans le voisinage des cellules de Leydig serait-il possible que d’autres hormones aient aussi un impact sur l’expression d’Insl3? D’autre part, serait-il possible que la présence de DEHP bloque l’expression d’Insl3 induite par la T?

Les données épidémiologiques et animales (voir section 1.11) démontrent que l’exposition in utero au diéthylstilbestrol (DES) (un estrogène synthétique) cause une diminution de l’expression d’Insl3 et la cryptorchidie. J’ai donc testé parallèlement l’expression d’Insl3 en présence d’estradiol ou d’estradiol et de T à partir d’un milieu appauvri en hormones stéroïdiennes. Ceci m’a permis de démontrer qu’en présence d’estradiol (10 nM), l’expression d’Insl3 est réduite de 40% et que l’exposition simultanée à la T sauvegarde (rescues) artificiellement le phénotype en maintenant le niveau d’expression d’Insl3 à un niveau supérieur à celui observé en présence d’estradiol seulement [406, 407]. Ceci est particulièrement important puisqu’il avait été proposé qu’un bolus de T pourrait contrecarrer l’effet de l’estrogène et prévenir l’apparition de la cryptorchidie chez le fœtus mâle [407]. Mes résultats sont donc conformes avec la littérature et par le fait même physiologiquement significatifs.

Les données obtenues démontrent la présence de deux régions sensibles dans le promoteur proximal d’INSL3 en 5’ en présence de T et d’estradiol et un élément sensible en présence de T et de MEHP. Dans les deux cas, la région de -132 pb (paire de base) à -85 pb semble jouer un rôle important. La région de 85 pb à -31 pb semble, elle, jouer un rôle seulement lors de l’exposition simultanée à l’estradiol.

Somme-toutes, j’ai atteint le principal objectif de cette thèse qui était de « définir les conditions expérimentales permettant de reproduire le phénotype de diminution de l’expression d’Insl3/INSL3 en présence d’un perturbateur endocrinien dans une lignée de cellules de Leydig transformées ».

201 Avant mes travaux, l’expression d’Insl3 était considérée comme constitutive, stable et ne répondant à aucune stimulation [175]. J’ai non seulement démontré que son expression est non constitutive, j’ai aussi identifié quelques-uns de ses régulateurs positifs et négatifs, ainsi qu’entamé la compréhension des mécanismes moléculaires menant à la compréhension de l’étiologie de la cryptorchidie induite par ces mêmes perturbateurs.

En tenant compte de l’article de Foster (2006) [306] et des résultats expérimentaux présentés au chapitre 2, je peux conclure que l’exposition des cellules de Leydig au MEHP a un double effet inhibiteur sur l’expression d’Insl3/INSL3. D’une part, le MEHP cause une diminution de l’expression des gènes responsables de la formation des stéroïdes, ce qui entraine une production moins élevée de T, qui, à son tour, induira une transcription d’Insl3/INSL3 moins élevée puisque la réponse est dose dépendante. D’autre part, le MEHP diminue directement l’activité transcriptionnelle induite par la T par un facteur d’au moins 30 % en présence de 30 µM de MEHP. Le tout résulte en une double inhibition de l’expression d’Insl3/INSL3. D’un point de vue mathématique, il est facile de percevoir comment une inhibition relative de 30 % peut avoir de sérieuses répercussions. Ainsi, une concentration plus faible de T (70 %) multipliée par une activité transcriptionnelle T-dépendante plus faible (70 %) égale à 49 % de la réponse normalement induite. L’activité réduite d’INSL3 sur le gubernaculum pourrait donc expliquer la pénétrance ou l’effet observé in vivo. Une activité transcriptionnelle réduite de 50% pourrait être comparée à de l’hétérozygotie. Chez les souris hétérozygotes (Insl3-/+), le phénotype de positionnement des testicules semble normal [408]. Néanmoins, chez l’humain une mutation non-sens du gène INSL3 sur un seul allèle (qui induit une hétérozygotie) cause la cryptorchidie [85]. De plus, les données présentées par Paul M.D. Foster en 2006 démontrent que, chez les rats et souris exposés in utero au DEHP, les concentrations moyennes de T n’atteignent que 10% de celles observées chez les ratons et souriceaux non exposés [306]. Les données que je présente démontrent que le MEHP inhibe la transcription d’Insl3/INSL3 induite par la testostérone sans affecter le niveau basal de transcription. Étant donné la dépendance de l’expression d’Insl3/INSL3 à la T, une réduction (de près de 90%) de la

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concentration de T cause forcément une réduction de l’expression d’Insl3/INSL3. Ces données viennent donc renforcer la pertinence du modèle expérimental (explique la pénétrance observée in vivo) puisqu’elles permettent de comprendre une importante partie de l’étiologie de la perturbation de la descente liée à l’expression d’Insl3.

6.1.2 Identification du rôle du récepteur aux androgènes

Le récepteur aux androgènes est principalement considéré comme un facteur de transcription de type récepteur nucléaire de classe 1 (hormones stéroïdiennes - IR3, c’est-à-dire « inverted repeat space by 3 nucleotides » ou séquence répétée invertie séparée par 3 nucléotides). Chaque molécule d’AR (chaque récepteur) est synthétisée puis phosphorylée en S81 et S650. La phosphorylation à ces sites induit un changement de conformation qui permet à AR de rejoindre le cytoplasme et de s’y associer à des protéines chaperones, les « heat shock proteins » [409]. Comme les autres récepteurs nucléaires membres de cette famille (le récepteur aux glucocorticoïdes (GR), le récepteur aux progestagènes (PR) et le récepteur aux minéralocorticoïdes (MR)), AR homodimérisé reconnait et se lie aux éléments de réponse similaires au motif de l’élément de réponse aux androgènes (ARE) classique, soit la séquence 5’-AGAACA NNN TGTTCT-3’, une séquence de type IR3 (« inverted repeat space by 3 nucleotides ») [410], où chacun des domaines de liaison à l’ADN de l’homodimère reconnait et se lie à un demi-site de liaison, un hexamère de nucléotides. Il a été démontré que des dérivés imparfaits de cette séquence ARE classique sont des éléments de réponse fonctionnels et qu’ainsi la composition des hexamères de nucléotides peut fortement différer. Un autre élément de réponse aux androgènes est plus sélectif et ne permet ni la liaison du GR ni celle du MR. Cet élément est composé de deux répétitions directes de l’hexamère 5’-AGAACA NNN AGAACA-3’ (élément de type DR3) [411]. La lignée de cancer de la prostate LNCaP a permis d’identifier plusieurs variants de cet élément de réponse. Des études ont démontré que AR dimérisé semble être capable de se lier à plusieurs variants de l’ARE classique et de l’ARE sélectif. Ces variations impliquent des longueurs variables de l’espaceur entre les deux hexamères allant d’aucune à 8 paires de base. Il semblerait même que certains sites ne soient composés que d’un seul hexamère [412, 413]. Denayer et al (2010) ont utilisé l’immuno-

203 précipitation de la chromatine pour déterminer les probabilités de retrouver un acide nucléique précis à chacune des positions dans l’un des hexamères d’ARE répertoriés. Ils ont établi que seuls les nucléotides xGxACx retrouvés dans le premier hexamère des ARE sont indispensables et que les autres nucléotides de cette séquence ont plus de 80 % de probabilité d’être des adénines. La composition du second hexamère ne semble pas démontrer autant de spécificité [414]. Ainsi, selon les résultats présentés au chapitre 2, les transversions (substitutions d’un résidu purine vers un résidu pyrimidine, et vice-versa) des nucléotides GAC  TCA (M8), TTT  AAA (M9) ou TCC  GAA (M10) viennent effectivement affecter la formation des liens essentiels entre le récepteur aux androgènes et la séquence d’ADN (selon les données de Denayer et al (2010)) de la première partie de la séquence de liaison de l’ADN (GGAACT). Ceci pourrait expliquer la diminution d’activité transcriptionnelle. Néanmoins cela suppose que l’action du récepteur aux androgènes soit directe sur le gène INSL3 sans toutefois être directement lié à l’ADN puisque la séquence de réponse à la T sur le promoteur d’INSL3 est tout de même assez loin de la séquence classique d’élément de réponse aux androgènes [415]. Dans ce scénario, on pourrait penser que AR soit recruté au promoteur en interagissant avec d’autres facteurs de transcription qui eux sont lié à l’ADN. D’un autre côté, il se pourrait que l’action d’AR sur INSL3 soit indirecte. Ainsi, AR activerait une autre protéine (ex. kinase ou facteur de transcription) afin que celle- ci vienne accroître l’activité transcriptionnelle au niveau de la séquence de réponse à la T. Par exemple, AR activerait la transcription de Nr4a1/Nur77, un récepteur nucléaire qui est capable de se lier à l’ADN (en monomère) au niveau d’une séquence AAAGGTCA (NBRE) [170]. Cette séquence correspond à la séquence de réponse à la T. Dans ces conditions, NR4A1/NUR77 pourrait être l’effecteur terminal menant à l’activation de la transcription induite par la T via AR.

6.1.3 Activation de la signalisation intracellulaire par le récepteur aux androgènes

Ayant déterminé que l’action de la T sur l’induction de la transcription d’INSL3 observée n’implique pas un récepteur à la surface de membrane externe mais bien un récepteur classique intracellulaire, je devais ensuite vérifier si AR activé pouvait agir

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en activant des voies de signalisation intracellulaire puisqu’il est connu que AR activé est capable d’interagir avec différents types de protéines et capable d’induire des voies de signalisation intracellulaire. La littérature fait mention de deux mécanismes d’action impliquant à la fois la T, des récepteurs et des voies de signalisation intracellulaire.

Le premier mécanisme implique le récepteur aux androgènes activé par un androgène. AR activé est capable d’interagir et d’activer la tyrosine kinase c-Src [416] et que cette dernière induit par la suite l’activation de Raf-1 et ERK-2 en moins de cinq minutes [417]. L’activation des MAPK initiée par c-Src est impliquée dans plusieurs processus cellulaires tels que la migration, la prolifération et la différenciation [418]. Des études ont démontré que l’activation de cette voie de signalisation intracellulaire c- Src/Raf/ERK induite par les androgènes est vulnérable à la fois aux inhibiteurs de c- Src et aux inhibiteurs d’AR [416, 417].

Le second mécanisme implique les androgènes, mais pas le récepteur aux androgènes. C’est-à-dire que ces derniers sont capables d’activer des voies de signalisation intracellulaire indépendamment de leur interaction avec le récepteur aux androgènes. En effet, des études ont démontré que les androgènes peuvent se fixer à la globuline liant les hormones sexuelles « sex hormone binding globulin (SHBG) » qui à son tour interagira avec son récepteur spécifique « SHBG receptor » présent sur plusieurs types cellulaires, dont les cellules de la prostate, des testicules, des glandes mammaires et du foie [419-421]. La liaison du complexe SHBG à son récepteur active la voie de signalisation intracellulaire AMPc/PKA. Il a été démontré que l’activation de cette voie de signalisation intracellulaire accroit l’activité du récepteur aux androgènes [422-424] sans pour autant modifier la phosphorylation de ce dernier. Ceci suggère que PKA agirait sur des corégulateurs de l’activité d’AR, c’est-à-dire sur des molécules (essentiellement des protéines) dont l’interaction avec AR viendrait changer sa conformation et donc son affinité pour diverses molécules, ce qui dans le cas présent augmenterait son activité. Les corégulateurs peuvent être des co-activateurs ou des co- inhibiteurs.

205 Donc, pour déterminer si une voie de signalisation est impliquée dans l’induction de la transcription, j’ai induit la transcription d’INSL3 avec de la T en présence de divers inhibiteurs ciblant les principales voies de signalisation intracellulaire (les voies classiques). Aucun des inhibiteurs n’a eu un impact significatif sur l’activation dépendante de T/AR. Cela suggère que l’action de AR activé n’impliquerait pas les voies de signalisation que j’ai étudiées.

J’ai utilisé des concentrations d’inhibiteurs correspondant à dix fois l’IC50 afin de bloquer la quasi-totalité de l’activité en minimisant la toxicité. Pour PD 98059, une concentration de 50 µM a été utilisée, soit une concentration correspondant à deux fois la concentration du IC50. Les concentrations utilisées dans la littérature sont généralement plus élevées que 50 µM mais je voulais minimiser les risques de toxicité ou de manque de spécificité. À cette concentration, environ 60 % de l’activité de ERK1 et environ 20 % de l’activité de ERK2 sont inhibées [425]. Il se pourrait que la concentration de PD 98059 utilisée soit toxique ou vienne interférer de manière importante avec le métabolisme des cellules de Leydig, mais rien ne permet de l’affirmer puisque la morphologie des cellules était inchangée. Il se pourrait que la transcription d’INSL3 soit tout simplement plus dépendante de la signalisation à travers les ERK et que l’activation d’AR par la testostérone vienne activer la tyrosine kinase c-Src et induire la voie Raf-1/ERK-2 telle que suggérée par la littérature [479, 480]. Afin d’en être certain, il faudrait effectuer une série d’immunobuvardages de type Western à l’aide d’anticorps dirigés contre les différentes formes de ERK et vérifier si ces formes de ERK varient en fonction des différents traitements (MEHP, T, T+MEHP). Il serait peut-être aussi possible de transfecter des dominants-négatifs ou des small interfering RNA (siRNA) afin d’éliminer la réponse induite par cette voie de signalisation. Néanmoins, bien qu’une telle activation de la transcription d’INSL3 semble possible lorsque l’on considère mes résultats, j’émets des réserves quant à cette hypothèse puisque la présence de l’inhibiteur bloque le niveau basal de transcription d’INSL3 et non l’activation induite par la T.

206

Les résultats de la transcription en présence de H89 (inhibiteur reconnu de la voie PKA) et ceux en présence de KN-93 (inhibiteur de CaMK) sont très intéressants. Pour bien saisir l’importance de ces données, il faut porter une attention particulière au niveau d’induction relative et au niveau basal de transcription. D’une part, le niveau de transcription basal réduit d’environ 30 % en présence de H89 ou de KN-93, ce qui suggère la possibilité d’un effecteur commun/un point d’intersection à la transcription d’INSL3. Cette hypothèse est renforcée par le fait qu’il a été démontré que PKA et CaMKI font partie de la même voie de signalisation intracellulaire dans les cellules de Leydig [426, 427]. Ainsi, en considérant l’ensemble des données obtenues jusque-là, il est possible d’hypothétiser que NR4A1/NUR77 soit cet effecteur commun puisque d’une part son expression dépend d’autant de PKA que de CaMKI [426, 427], et d’autre part, nous avons identifié l’élément de réponse à l’induction de la transcription d’Insl3/INSL3 par la T. Cet élément de réponse (NBRE; AAAGGTCA) permet la liaison de NR4A1/NUR77 en monomère et induit la transcription du gène cible, dans le cas présent INSL3 [170].

Toutefois, les résultats démontrent aussi que l’induction relative de la transcription par la T est plus forte en présence de H89 qu’elle ne l’est en présence de KN-93 ou du véhicule (DMSO). Ces résultats suggèrent qu’en absence de l’activité d’une molécule sensible à H89, l’induction relative par la T est plus élevée. Cela suggère que le H89 favorise l’induction de la transcription en inhibant un répresseur (ou réducteur) de l’induction. De plus, les différences observées entre les conditions basales et les conditions stimulées à la T en présence de ces inhibiteurs suggèrent aussi que les molécules impliquées ne sont pas toutes les mêmes. Ainsi, en considérant ces deux derniers éléments et l’ensemble des résultats obtenus. J’ai formulé l’hypothèse qu’AKT/PKB soit cette molécule sensible à H89 dont la répression favorise l’induction de la transcription d’Insl3/INSL3 par la T. Cette hypothèse est appuyéee par une analyse détaillée de la littérature qui révèle que H89 n’inhibe pas seulement PKA mais inhibe aussi près de 50 % de l’activité de AKT/PKB à la concentration utilisée (IC50 = 2,6 µM)1. Il se pourrait donc qu’AKT soit impliquée dans la répression de la transcription

1 Product information, H-89, Cayman Chemical

207 d’INSL3 induite par la T. Afin d’étayer rapidement cette hypothèse, il aurait été intéressant d’utiliser une concentration plus élevée de H89 afin d’inhiber AKT de manière plus efficace. De plus, il aurait été essentiel d’utiliser un inhibiteur spécifique à AKT, mais cette confirmation n’a pas été obtenue à temps, car les cellules de Leydig MA-10 (utilisées comme modèle) ont cessé de répondre à la présence de la T. Je crois que la perte de réponse à la T est due à l’absence d’un élément que je qualifie de « permissif ». Je présente plus en détail mon hypothèse plus loin dans la discussion.

Il me semble important de mentionner que contrairement à plusieurs auteurs dans la littérature, j’ai utilisé les concentrations minimales effectives afin de réduire les risques de faux positifs et d’effets toxiques. En général, j’ai utilisé dix fois l’IC50 relative à l’enzyme cible. À cette concentration, l’activité de l’enzyme est inhibée (en théorie) à 98 % [425, 428, 429]. D’autres méthodes de contrôle de l’efficacité des inhibiteurs n’ont pas été utilisées puisque ces derniers sont bien connus dans la littérature. Somme toute, les concentrations d’inhibiteurs utilisées étaient adéquates et respectaient les recommandations pour obtenir une réponse spécifique à la cible. L’utilisation de plusieurs concentrations et de concentrations plus élevées d’inhibiteurs aurait pu permettre d’obtenir plus d’informations en nous permettant d’établir des courbes de compétitivité. Toutefois, l’utilisation d’inhibiteurs à concentration élevée peut induire de faux-positifs et ainsi mener à des conclusions erronées. Il aurait été intéressant d’utiliser l’ensemble des inhibiteurs en présence de MEHP, mais ce volet du projet n’a pas pu être poursuivi, car les cellules de Leydig MA-10 ont cessé de répondre à la présence de la T. De plus, certains contrôles supplémentaires auraient pu ajouter beaucoup de force aux données, notamment les contrôles d’efficacité des inhibiteurs et une confirmation des résultats par PCR quantitatif.

6.1.4 Modulation de la transcription par interaction protéine-protéine non liée à des voies de signalisation intracellulaire

Le groupe de Cai (2011) a démontré que des cellules cancéreuses prostatiques sont capables de moduler l’activité d’AR en induisant diverses modifications de l’épigénome. AR participerait lui-même à sa propre régulation en interagissant avec la

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déméthylase spécifique à la lysine 1 (lysine-specific demethylase 1 (LSD1)) et en induisant la déméthylation de la 4e lysine de la sous-unité histone H3 (H3K4me1,2). Ceci aurait pour effet de modifier la structure de l’ADN et d’ainsi modifier l’accessibilité des facteurs de transcription à cette région de l’ADN nécessaire à l’expression génique [430]. Toutefois, nos analyses des ARNm des cellules de Leydig démontrent que Lsd1 (lysine-specific demethylase 1) n’est pas exprimé dans les cellules de Leydig alors que la stimulation de la transcription d’INSL3 par la T et son inhibition par la MEHP sont observées. D’un autre côté, il a aussi été démontré que AR forme des complexes avec des lysines histones déméthylases (KDM) afin de réguler l’expression génique dans les cas de cancer. Ces lysines histones déméthylases sont aussi exprimées par le placenta lors du premier trimestre chez l’humain. Dans le placenta, les complexes AR-KDM sont impliqués dans la différenciation du trophoblaste et le développement du placenta, où ils réduisent la méthylation de l’ADN et augmentent l’expression d’AR et des gènes impliqués dans la régulation épigénétique, l’angiogenèse et la croissance. Ainsi, une signalisation aberrante d’AR pourrait nuire à la déméthylation de l’ADN et perturber le développement [431]. Ce mécanisme est particulièrement intéressant et pourrait expliquer une partie des effets du syndrome de dysgénésie testiculaire observés à la puberté et à l’âge adulte puisqu’il a été démontré que l’exposition in utero au DEHP augmente de plus de 10% la méthylation globale de l’ADN des cellules des testicules ainsi que l’expression des ADN méthyltransférases [432]. Bien que LSD1 ne soit exprimée dans les cellules de Leydig, un mécanisme similaire (modification épigénique) semble être impliqué et très important dans l’étiologie de la dysgénésie testiculaire induite par le DEHP.

En effet, le groupe de Kilcoyne et al (2014) ont démontré plusieurs éléments importants dans leur article de 2014 [111]. Ils ont démontré que les cellules de Leydig souches donnant naissance à la population de cellules de Leydig adultes sont présentes lors du développement fœtal et donc soumises/exposées directement aux perturbateurs endocriniens qui affectent les cellules de Leydig fœtales et leurs données suggèrent que la signalisation par AR activé est importante au développement adéquat des cellules de Leydig souches du stade adulte.

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Ainsi, l’exposition des cellules souches de Leydig adultes à des concentrations anormalement faibles de testostérone (30 à 50% par rapport à la normale), causée par l’exposition in utero au dibutyle phtalate (DBP), crée un déficit de 40% en cellules souches de Leydig adultes. Ce déficit en nombre de cellules de Leydig est compensé durant la maturation des cellules de Leydig adultes et le testicule adulte présente un ratio normal de cellules de Leydig adultes matures. Le phénotype observé chez les souris ArKO est similaire avec une population de cellules souches de Leydig adultes réduite de 40%, mais le testicule adulte présente une réduction maintenue du nombre de cellules de Leydig adultes matures (40%). Ces résultats démontrent que les androgènes affectent positivement la prolifération des cellules souches de Leydig adultes.

Bien que le ratio de cellules de Leydig adultes matures soit normal dans le testicule exposé in utero au DBP, les concentrations circulantes de testostérone sont faibles et les concentrations de LH sont élevées. Ce ratio « altéré » est indicatif d’une compensation induite par une défaillance des cellules de Leydig matures adultes. Les auteurs rapportent que, dans la compensation, les niveaux observés de testostérone sont causés, du moins, en partie, par une réduction de l’expression du gène Star et 3β-Hsd. Cette réduction de l’expression de Star est significative étant donné le rôle crucial que joue STAR dans le transport du cholestérol dans la mitochondrie, l’étape limitante de la stéroïdogenèse [433, 434]. Leurs résultats démontrent que cette réduction de l’expresion de Star est causée par une modification de l’épigénome au niveau du promoteur proximal de Star. Les cellules de Leydig adultes matures présentent une méthylation au niveau du promoteur proximal 1 conservé entre les espèces [435]. Cette méthylation d’une lysine d’histone correspond à la région localisée à -85 pb du +1 du gène Star. Cette méthylation H3K27me3 est répressive et inhibe l’expression de Star [436]. Les histones H3K27me3-méthylées sont présentes seulement dans les cellules de Leydig où l’activité des androgènes est compromise (exposées au DBP ou AR- négatives). Ce qui suggère que cette méthylation (H3K27me3) résulte de l’activité déficiente des androgènes. Les auteurs ont remonté la piste de H3K27me3 à travers les

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origines des cellules de Leydig adultes matures et ont noté la présence de H3K27me3 dans les cellules souches de Leydig adultes. Ainsi, une insuffisance en activité androgénique durant le développement foetal causerait l’apparition des H3K27me3 dans les cellules souches de Leydig adultes qui perdurerait à travers toutes les cellules filles et causerait une réduction soutenue de l’expression de Star, et donc de la production de testostérone par les cellules de Leydig adultes matures [111].

L’ensemble de ces données sont particulièrement intéressantes et expliquent, en partie, la genèse de la dysgénésie testiculaire suite à une réduction de l’activité des androgènes. Ces données recoupent mes données et suggèrent une autre approche puisqu’une telle méthylation des histones H3K27 est vraisemblablement possible dans mon modèle in vitro suite à l’exposition au MEHP. Rappelons que la présence de MEHP inhibe une partie de l’activité de la testostérone sur le récepteur aux androgènes. C’est une piste à investiguer rapidement.

6.2 Mode d’action des estrogènes dans la répression d’insl3

Les études rétrospectives sur l’utilisation du diéthylstilbestrol (DES) chez la femme enceinte ont démontré que l’exposition des fœtus mâles au DES augmente leur risque (plus de 4 fois) de développer différents troubles du système reproducteur semblables à ceux du syndrome TDS [250, 251]. Les effets tératogènes de l’exposition au DES in utero ont été confirmées par des études animales [437]. C’est ainsi que Nef et al (2000) ont démontré que l’exposition in utero des cellules de Leydig à divers estrogènes cause une réduction marquée de l’expression d’Insl3, et subséquemment, une cryptorchidie congénitale due à la croissance réduite du gubernaculum [438].

Le modèle d’étude développé à travers mes travaux permet aussi d’investiguer les mécanismes d’actions de la répression de l’expression d’Insl3/INSL3 causée par l’exposition des cellules de Leydig à l’estradiol (et possiblement d’autres estrogènes). Dans le modèle, l’expression d’Insl3/INSL3 est conforme à ce que l’on retrouve dans la littérature puisque l’exposition des cellules MA-10 à l’estradiol cause une réduction

211 de l’expression du gène nécessaire à la descente testiculaire (Insl3/INSL3) et que cette réduction d’expression peut être compensée par l’apport de testostérone exogène [406, 407].

Les données présentées au chapitre 5 démontrent que l’exposition des cellules de

Leydig à l’estradiol (E2) réduit l’expression d’Insl3/INSL3 en diminuant le niveau de transcription de base (niveau basal) à partir du promoteur alors que la T maintien son facteur précis d’augmentation de la transcription en fonction de l’apport exogène de testostérone. Ces données permettent donc d’obtenir une précision importante et suggèrent que leur mécanisme d’action sur l’expression d’INSL3 est différent.

Parallèlement, l’analyse séquentielle du promoteur démontre qu’une des régions du promoteur sensible à la présence d’E2 est la même que la région du promoteur que celle sensible à la T. Cela suggère la présence d’un effecteur commun à la signalisation des deux hormones stéroïdiennes. En d’autres mots, que l’induction par la T et la répression par E2 agiraient sur un même acteur moléculaire qui de toutes évidences doit être NR4A1/NUR77. Cette hypothèse est confirmée par les résultats de Lee et al (2012) qui démontrent, dans les cellules de Leydig MA-10, que l’exposition à l’estradiol supprime l’activation de la transcription des gènes codant pour les enzymes stéroïdogéniques induite normalement par l’AMPc et NUR77 [439]. La suppression de l’activation de la transcription est due à l’abolition de la transactivation de NUR77 qui est prisonnier de son interaction avec ERα activé ou non activé, car cette interaction est aussi observée lors de la surexpression de ERα en absence d’estrogènes. Cette interaction empêche NUR77 de se lier à l’ADN. De plus, l’activation de ERα par l’estradiol cause une diminution de NUR77. Ce mécanisme explique, en partie, pourquoi les niveaux de testostérone sont plus élevés chez les souris où ERα est invalidé dans les Leydig (Leydig cell-specific ERα knock-out mice) [439].

Les estrogènes sont des hormones stéroïdiennes similaires aux androgènes. Comme eux, les estrogènes utilisent les mêmes types de mécanismes d’activation de la transcription génique. Ils peuvent activer un mécanisme dit classique où l’estrogène

212

interagit avec un récepteur nucléaire, soit ERα ou ERβ, et induit une réponse génomique, ils peuvent activer un récepteur lié à la membrane plasmique (GPR30/GPER dans les Leydig) et d’induire une réponse dite non génomique ou encore activer/moduler une voie de signalisation interne par l’un ou l’autre des récepteurs. Le mécanisme exact d’action de E2 demeure a être élucidé. Il est toutefois impératif de confirmer la présence de ERα, ERβ et de GPER dans les cellules du modèle de Leydig MA-10 répondant à E2. Ceci aurait permis d’éliminer rapidement diverses possibilités. Ceci est particulièrement important puisqu’il a été rapporté que les souris Er alpha négatives sont résistantes à l’exposition in utero au DES [440] et qu’il a été rapporté chez les humains, qu’ERα n’est pas exprimée par les cellules de Leydig durant le développement fœtal [441, 442]. En l’absence de données supplémentaires, l’énumération des hypothèses sur le mécanisme d’action de l’estradiol sur la transcription d’INSL3 est fastidieuse.

6.3 Validation du modèle et importance de l’insuline

L’expression de certains gènes importants (p. ex. Ar) dans l’induction de la transcription d’Insl3/INSL3 n’a pas été contrôlée de manière systématique. Toutefois, l’expression adéquate (sans stimulation) d’Ar, d’Insl3 et de Ppar α (gène codant pour le récepteur qui serait nécessaire à l’effet causé par le MEHP en interagissant avec ce dernier) dans le modèle cellulaire a ponctuellement été testée par PCR quantitatif et aucune variation n’a été constatée dans l’expression des gènes pendant mes travaux. Par la suite, la principale méthode de contrôle interne était l’expression induite par la T et l’inhibition causée par le MEHP. Ainsi, la reproductibilité et la constance des résultats indiquaient l’absence de variation dans le système. Compte tenu des différentes erreurs relatives, l’inhibition causée par le MEHP était et devait se maintenir entre 25 et 30 % d’inhibition de l’induction de la transcription engendrée par 35 nM de T. De plus, une attention particulière a été portée à l’utilisation de cellules morphologiquement similaires et entre les passages 8 à 22. Dans cet intervalle de passages, aucune variation de la réponse aux divers stimuli n’a été observée.

213 Ainsi, durant l’ensemble des expérimentations, le seul élément qu’il ait été impossible de contrôler (et de corriger) était la composition du sérum. Afin de pallier à ceci, diverses approches ont été tentées dont l’utilisation de différentes concentrations de sérum allant de 0 % à 12 %. La variation de la concentration de sérum ne modifiait pas le profil de réponse des cellules à la T et au MEHP, mais modifiaient grandement le niveau d’expression basal d’Insl3/INSL3. Les variations de la réponse des cellules aux stimuli étaient corrélées aux changements de lots de sérum. Il n’y avait pas de variations à l’intérieur du même lot. Le tout suggère que la réponse des cellules aux stimuli ne dépend pas de la concentration de sérum, mais dépend plutôt de la composition de celui-ci.

J’ai alors cherché à comprendre l’impact que certains facteurs pouvaient avoir sur le comportement des cellules MA-10. Cette approche a permis de confirmer que le sérum est le facteur responsable de la variabilité de la réponse cellulaire aux stimuli, ce qui explique qu’un lot de sérum sur trois ne permettait pas l’induction de l’expression d’INSL3. Cette dernière observation a été confirmée (de manière indépendante) par les expérimentations de collègues.

Ainsi, par une déduction soutenue par la littérature, j’en suis venu à considérer que quelques facteurs importants (principalement de nature hormonale) contribuaient ou étaient nécessaires afin de sensibiliser les cellules de Leydig MA-10 à la présence de la T et du MEHP.

L’addition de certains facteurs (comme EGF, IGF et certains eicosanoïdes) aux conditions de culture n’a pas permis de restaurer la réponse à la T et au MEHP sur l’expression d’INSL3, et ce, en dépit de leurs activités sur la stéroïdogenèse au niveau des cellules de Leydig et des MA-10 [443-445]. Ceux-ci n’avaient donc pas l’effet de sensibilisation recherché et ne constituaient donc pas le facteur permissif dont j’ai parlé plus tôt.

214

Plusieurs indices m’ont incité à orienter mes recherches vers l’insuline. Cependant, l’indice le plus direct d’une relation de causalité est le taux plus élevé de cryptorchidie congénitale chez les nouveau-nés issus de mères souffrant de léger diabète gestationnel ou ayant une réponse anormale au test oral de tolérance au glucose (résultant d’une production insuffisante d’insuline ou d’une réponse insuffisante à celle-ci). Le taux d’enfants cryptorchides est de 2 à 3 fois plus élevé chez les mères souffrant de diabète durant la grossesse que chez celles n’ayant pas souffert de cette condition [302, 525]. Cette hypothèse est confirmée par les données des études animales qui démontrent que l’induction de ce type de diabète chez les modèles animaux perturbe les fonctions des cellules de Leydig et réduit leur production de testostérone tout en diminuant la réponse à la LH [446, 447]. De plus, le groupe de Nef et al (2003) a démontré à quel point la famille des récepteurs à l’insuline de type tyrosine kinase est cruciale pour la formation et la différenciation des gonades mâles. Les souris XY triplement invalidées (Ir-/-, Igf1r- /- et Irr-/-) ont une expression réduite de Sry et Sox9. En conséquence, elles développent des ovaires et présentent un phénotype complètement femelle [448].

Il a été démontré que dans les cellules de Leydig adultes porcines isolées, les récepteurs à l’insuline (IR) et à l’IGF (IFGR) sont présents, distincts et stimulés par leur agoniste respectif. La stimulation de ces récepteurs induit une augmentation du nombre de récepteurs LHCGR présents à la surface ainsi que les niveaux d’AMPc en réponse à la LH. Cette stimulation se traduit par une augmentation de plusieurs enzymes impliqués dans la synthèse des stéroïdes et mène à l’augmentation du niveau de production de la T (autant basal que stimulé par la LH). Il semblerait qu’à faible concentration l’insuline et l’IGF-1 (via leur récepteur respectif) peuvent avoir un effet additif sur l’augmentation de l’expression de LHCGR. Je n’ai pas observé un tel effet additif dans mes expérimentations. Néanmoins, une telle synergie suggèrerait qu’une portion du mécanisme d’induction est commune [449-452]. Quelques années plus tard, le groupe de Syed et al (1991) a confirmé qu’en l’absence de LH, IGF-I n’induit pas une augmentation de la production de T et que l’effet observé d’IGF-I sur la T passe par l’augmentation du nombre de récepteurs LHCGR. Leurs résultats démontrent aussi

215 qu’EGF induit une augmentation du niveau basal de T après 24h d’incubation sans toutefois synergiser avec la LH [453].

L’article de revue de Grizard publié en 1994 appuie, lui aussi, ma démarche et mes conclusions. Premièrement, chez les rats adultes, les concentrations d’IGF-I dans les fluides interstitiels et la présence des récepteurs IGFR sur les cellules de Leydig sont fortement réprimées par le jeûne. Deuxièmement, IGF-1 induit l’expression de LHCGR par les cellules de Leydig et leur réponse stéroïdogénique à l’hCG, et ce, autant in vivo qu’in vitro [454].

Je n’ai pas eu l’occasion de vérifier l’expression du récepteur à l’insuline (IR), ni par immunobuvardage, ni par PCR. Les résultats ont seulement été observés par luminescence étant donné l’efficience de la technique développée. De plus, le projet n’en était qu’à ses débuts. Néanmoins, mes résultats suggèrent que le récepteur à l’insuline est exprimé par les cellules MA-10 [455, 456] et qu’il joue un rôle fonctionnel dans l’expression d’Insl3/INSL3 (voir Chapitre 4). Cependant, on ne peut pas exclure la possibilité que les résultats observés dans mes expérimentations découlent de divers changements métaboliques causés par la transformation et l’immortalisation des cellules MA-10 [457].

Ainsi, dans mes conditions in vitro, l’exposition des cellules de Leydig MA-10 à une concentration physiologique d’insuline induit une augmentation de la transcription d’INSL3. De plus, l’effet de l’insuline sur la transcription d’INSL3 semble accru par l’exposition simultanée à une concentration physiologique de glucose (résultat non présenté). L’effet de l’insuline sur l’expression d’INSL3 laisse poindre une explication moléculaire plausible au taux de cryptorchidie plus élevé chez les nouveau-nés issus d’une mère diabétique.

La présence d’insuline dans le sérum pourrait donc être considérée comme un élément essentiel à l’expression d’INSL3 et être ajoutée à la liste des conditions essentielles/permissives permettant l’étude in vitro de l’expression d’INSL3 induite par

216

la T. Rappelons qu’il est nécessaire de retirer les hormones stéroïdiennes du sérum afin de percevoir une réponse à la T. Il serait donc aussi nécessaire de moduler la concentration d’insuline dans le sérum. Ainsi, l’insuline devrait être considérée et avoir la même importance que la T dans le modèle in vitro.

217 6.4 Les phtalates, les estrogènes et la santé reproductive masculine chez l’humain : mythe ou réalité

Au cours des dernières années, il y a eu une intensification de la remise en question de la pertinence de l’étude sur la toxicité des phtalates. Il a été jusqu’ici difficile, voire impossible, d’obtenir un consensus de la communauté scientifique sur ce sujet. Les différentes équipes de chercheurs à travers le monde sont arrivées à une panoplie de conclusions déclarant aussi souvent les deux positions contraires sur l’exposition in utero aux phtalates (pas d’effets et effets sévères).

Les articles d’Heger et al (2012) et de Mitchell et al (2012) sont importants puisque ceux-ci déclarent que le phtalate de dibutyle (DBP) n’a pas d’impact sur la santé humaine [324, 458]. Dans le contexte présent, une revue de ces articles est nécessaire et justifiée.

Les groupes d’Heger et al (2012) et de Mitchell et al (2012) ont utilisé la même technique : la xénogreffe. Celle-ci est une technique de « transfert des cellules, des tissus ou des organes vivants, d'une espèce animale à une autre » [459]. Ces équipes ont greffé des portions de testicules fœtaux (provenant de souris, de rat et d’humain) à des rats castrés et immunodéficients. Les rats greffés ont par la suite été gavés avec différentes doses de DBP (un autre phtalate considéré tératogène) pendant quelques jours dans le but de mesurer l’activité stéroïdogénique des greffons et d’analyser leur morphologie.

L’utilisation de greffons permet, entre autres, d’effectuer des expérimentations en conservant la spécificité des espèces en ce qui a trait aux différentes interactions entre le génotype, l’épigénétique et les contacts cellules-cellules. De plus, cette technique permet de conserver une portion des interactions systémiques difficiles à reproduire in vitro. Cependant, contrairement aux données moléculaires provenant de modèles cellulaires, les données moléculaires provenant de greffons sont moins précises et sont plus difficiles à contre-vérifier par plusieurs approches. Sans oublier, que comme toutes

218

techniques, il peut y avoir création d’artéfacts causés par les différentes interventions comme les auteurs de cet article le rapportent [458].

Les articles de Heger (2012) et Mitchell (2012) concluent que l’exposition de testicules fœtaux au DBP et ses métabolites n’ont pas d’effets négatifs sur la stéroïdogenèse des testicules humains. Ainsi, les testicules fœtaux humains et de souris ne seraient pas sensibles aux DBP, mais ceux de rats le seraient [324, 458].

Les résultats présentés par ces deux groupes sont intéressants quoiqu’incohérents avec leurs conclusions. Celles-ci vont plus loin que ce que leurs résultats permettent de démontrer hors de tout doute, à cause des différences au niveau du stade de développement des testicules utilisés, de l’expression génique, de la méthodologie et du temps de récupération entre la greffe et l’exposition au DBP. En effet, bien que le groupe de Heger (2012) ait porté une attention particulière à leur méthodologie, ils ont tout de même dû composer avec des éléments hors de leur contrôle. Lors de leurs expérimentations, ils ont comparé des testicules fœtaux humains âgés de 10 à 24 semaines (la moyenne était 18,6 semaines) à des testicules de rongeurs âgés de 15 jours. Les expériences ne semblent pas avoir été réalisées dans les mêmes conditions, puisque même le nombre de répliques (replica) et les écarts-types sont très différents d’une espèce à l’autre. Le temps entre la greffe et l’exposition au DBP est lui aussi différent entre les testicules utilisés, puisque ceux humains ont un temps de récupération entre la greffe et l’exposition de trois semaines, alors que ceux de rongeurs sont immédiatement exposés au phtalate.

Les données présentées dans l’article de Mitchell et al (2012) ont sensiblement la même orientation et souffrent de lacunes similaires. Ils ont utilisé des testicules fœtaux humains âgés de 14 à 20 semaines, les ont greffés, puis ont attendu au moins trois semaines avant de les exposer au DBP. Ils ont par la suite comparé les données obtenues de cette procédure aux données obtenues des testicules fœtaux de rats (jpc 17.5) greffés et exposés, sans délai, au DBP. Néanmoins, leurs résultats démontrent que le greffon humain a une diminution de la production de T d’au moins 30 %

219 (considérée non significative) suite à l’exposition au phtalate de monobutyle (MBP) (ils ont aussi testé le métabolite), mais l’écart-type moyen est de plus de 25 % (n=3). Ils comparent ce résultat à ceux des greffons de rats dont l’exposition au DBP cause une réduction significative de la production de T d’environ 16 % dont l’écart-type est de 8 % à n=6. De plus, le groupe de Mitchell doit stimuler la production de T à l’aide de 20 UI d’hCG pour maintenir la stéroïdogenèse (il aurait été intéressant de voir une courbe dose-réponse) alors que Heger n’en a pas besoin.

Leurs conclusions sont fondées sur des observations obtenues à partir de testicules fœtaux humains possiblement trop âgés (testicules ayant complété la première phase de la descente testiculaire) et sur des comparaisons statistiques de données avec d’importants écarts de variance. Ils comparent des données manifestement différentes et en tirent des conclusions.

Sommes toutes, les conclusions de ces deux groupes souffrent de la méthodologie expérimentale et de la méthode d’analyse discutables. Les omissions au niveau des méthodologies se reflètent principalement dans les écarts-types des valeurs obtenues [324, 325, 458, 460-462]. De plus, les études de Heger (2012) et Mitchell (2012) utilisent principalement la sécrétion de testostérone comme marqueur de la santé testiculaire et leurs résultats sont appuyés par la mesure de l’expression (ARNm) de certains gènes liés à la stéroïdogenèse [324, 458]. Toutefois, la littérature récente suggère fortement que la testostérone ne doit plus être considérée comme le marqueur le plus représentatif de la santé testiculaire puisque l’expression d’Insl3/INSL3 est considérée un marqueur plus sensible et plus représentatif de la santé des testicules et des cellules de Leydig [463, 464]. Ceci est d’autant plus important puisque l’article utilisant des xénogreffes démontre que l’expression d’INSL3 humain est fortement réprimée par l’exposition des testicules humains à une faible concentration de DEHP, et ce, en dépit des valeurs observées de T. Ainsi, l’exposition des testicules en développement aux DEHP causerait une diminution de l’expression d’INSL3 qui explique la cryptorchidie congénitale [324].

220

L’ensemble des résultats de ces études démontre que l’expression d’INSL3 n’est pas exclusivement tributaire des niveaux de testostérone, et ce, bien que le niveau d’INSL3 soit corrélé avec celui de la T chez l’adulte [464].

Les données présentées dans les articles utilisant les xénogreffes suggèrent fortement que c’est durant la première phase de la descente testiculaire que les testicules fœtaux sont sensibles à l’exposition aux phtalates, et non pas lors de la deuxième. Dans ces conditions, il serait pertinent de considérer d’autres modèles animaux avant de dire que ces plastifiants n’ont pas d’effets chez les humains et qu’il n’est pas important de continuer la recherche sur leur toxicité. En utilisant d’autres modèles animaux, il pourrait être possible de préciser durant quelle phase les cellules sont plus ou moins sensibles aux phtalates. Dans cet ordre d’idées, l’utilisation des chiens (ou des chats) pourrait permettre de répondre à cette question puisque chez les chiens, les chats et les humains, l’occurrence de la cryptorchidie à la naissance est similaire [154, 465-467]. En plus, tout comme chez l’humain, les chiens et les chats ont deux phases distinctes de descente testiculaire (et de différenciation des cellules de Leydig) alors que les souris et les rats ont deux phases successives très rapprochées sans période de repos ou de correction [192].

Mitchell et al (2013) ont utilisé la même technique de xénogreffe pour vérifier l’impact de l’exposition des testicules fœtaux aux estrogènes. Leurs résultats confirment que chez les rongeurs, l'exposition in utero à des estrogènes exogènes (y compris le diéthylstilbestrol (DES)) entraîne la suppression de la production de T dans les testicules fœtaux (réduit de 89%). Toutefois, leurs résultats infirment que l’exposition (des testicules foetaux humains) au DES cause une diminution de la production de testostérone chez le fœtus humain. En fait, selon leurs données, l’exposition des testicules humains au DES entrainerait une augmentation de la production de T et une augmentation du volume des vésicules séminales (un organe androgéno-dépendant) [468].

221 Ils expliquent cela par la différence d’expression du gène Esr1/ESR1 qui code pour le récepteur nucléaire ER alpha (estrogen receptor alpha). Ce récepteur serait nécessaire à l’action répressive des estrogènes sur la différenciation masculine comme démontré par l’exposition de souris Esr1-/- (ErKO) au DES [440]. En effet, ERα ne semble pas exprimé dans les cellules de Leydig fœtales humaines, mais est exprimé dans les cellules de Leydig fœtales des rongeurs (rats et souris). Cette différence d’expression expliquerait la différence de sensibilité observée (entre les rongeurs et les humains). Ils concluent donc que l'exposition des testicules fœtaux humains au DES ne porte pas atteinte à la production de testostérone comme il le fait chez le rat parce que ESR1 n’est pas exprimée chez l'homme.

Du point de vue méthodologique, ces expérimentations souffrent essentiellement des mêmes lacunes que celles réalisées pour mesurer l’effet du DEHP sur la production de T des testicules humains [468]. De plus, les auteurs rapportent que ERα, bien que responsable de la plus grande partie des effets du DES observés chez les rongeurs, n’est pas responsable de la totalité des effets (Couse et al, 2001) et que même si ERα n’est pas exprimé par les cellules de Leydig fœtales humaines, l’exposition in utero des fœtus humains mâles au DES entraine la cryptorchidie et d’autres symptômes de sous- masculinisation [440]. Ainsi, il se pourrait que chez l’humain, pendant le premier trimestre, un autre récepteur soit responsable de la réponse causée par le DES, ou encore, qu’un autre organe soit responsable de l’effet observé sur le testicule (ex. l’hypothalamus) [468]. Les résultats de Mitchell et al (2012) confirment donc la pertinence de poursuivre les recherches sur le mécanisme d’action du DES sur la différenciation masculine et la pertinence des études sur le rôle potentiel de NR0B2/SHP (nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2), un récepteur nucléaire atypique dépourvu de domaine de liaison à l’ADN qui module l’Expression génique en interagissant avec d’autres récepteurs nucléaires ou des co-activateurs [469].

222

6.5 Sommaire des limites et contributions

Le présent projet de recherche s’inscrit dans une initiative visant à améliorer la santé reproductive mâle. Il a pour objectif d’apporter un supplément de preuves de nature moléculaire aux données cliniques et animales. Ces preuves « moléculaires » sont plus facilement transposables à travers les espèces et pourraient fortement contribuer à résoudre les interrogations qui persistent quant au pouvoir tératotoxique du DEHP sur la santé humaine.

6.5.1 Limites

Le présent travail a deux importantes limites. Premièrement, les conclusions sont tirées d’un système isolé où les interactions avec les différents systèmes sont limitées, tant dans l’étendue des réponses que dans leur synchronicité. Deuxièmement, le modèle développé, bien qu’intéressant et efficace, ne permet pas de répondre adéquatement aux questions liées à l’étiologie de la cryptorchidie congénitale induite par l’exposition in utero au DEHP et à ses métabolites de même qu’à l’estradiol. En effet, l’utilisation de la lignée de cellules de Leydig MA-10 pourrait créer des artéfacts en raison de leur stade de différenciation quelque peu différent des cellules de Leydig fœtales et de leur état transformé [470]. Ainsi, certaines extrapolations pourraient être erronées.

6.5.2 Contributions

J’ai démontré que l’expression et la transcription d’Insl3/INSL3 sont sensibles à des concentrations physiologiquement significatives de T et d’E2.

De plus, j’ai démontré que la régulation de la transcription par la T et par E2 fait intervenir un élément de régulation localisé entre le -108 et -86 pb du promoteur d’INSL3.

J’ai par la suite démontré que la transcription d’INSL3 nécessite l’activation d’AR et que l’activation du récepteur membranaire GPRC6A n’est pas essentielle à l’induction de la transcription d’INSL3.

223

Enfin, j’ai démontré que la transcription d’INSL3 est induite par l’insuline et par le fait même que le récepteur à l’insuline (IR) est présent et fonctionnel sur les cellules de Leydig MA-10 car il a été démontré que l’insuline ne signale qu’à travers son propre récepteur (elle n’active pas d’autre récepteur ex. IGFR) [455, 456]. Mes données suggèrent que l’insuline pourrait agir comme facteur de sensibilisation à la T dans ce modèle.

D’un point de vue méthodologique, mes résultats suggèrent qu’il est particulièrement important de faire attention aux concentrations utilisées lors d’expérimentations avec des inhibiteurs. Selon mon analyse, il est facilement possible d’occasionner de faux- positifs et d’en tirer des conclusions erronées. Ma démarche confirme la nécessité d’effectuer de multiples contrôles.

Dans le présent document, j’ai confirmé qu’il est possible d’étudier in vitro la toxicité de certains composés et qu’utiliser cette technique a certains avantages. Je crois que mon protocole utilisant les cellules de Leydig MA-10 comme modèle offre la possibilité de faire une meilleure caractérisation des cellules de Leydig et de divers mécanismes de régulation de l’expression génique. De surcroit, je considère que les cellules de Leydig MA-10 sont le meilleur modèle présentement disponible pour l’étude de l’induction génique par la T et de la répression causée par le MEHP puisqu’elles ne produisent pas de T endogène en raison d’une mutation dans le gène Cyp17a1 qui rend l’enzyme peu fonctionnelle [331] mais demeurent inductibles par l’apport de T exogène [460].

Ultimement, cette étude démontre deux concepts importants. Premièrement, elle démontre que le MEHP inhibe l’induction de la transcription induite par la T via AR. Ceci suggère que l’activité de plusieurs autres types cellulaires androgéno-sensibles pourrait être affectée par le MEHP. Deuxièmement, elle démontre que la transcription d’INSL3 est régulée par différentes hormones à des concentrations physiologiquement pertinentes. La régulation hormonale de la transcription d’Insl3/INSL3 contredit le

224

dogme selon lequel l’expression d’Insl3/INSL3 est constitutive et permet de suggérer que l’expression d’Insl3/INSL3 résulte de l’exposition continue des cellules de Leydig à diverses hormones.

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