Modelos Animais De Disfunção Colinérgica: Papel Da Acetilcolina Na Cognição
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Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Pós-Graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular Modelos animais de disfunção colinérgica: papel da acetilcolina na cognição Xavier De Jaeger Belo Horizonte Novembro 2010 Xavier De Jaeger Modelos animais de disfunção colinérgica: papel da acetilcolina na cognição Tese de doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em Ciências. Orientador: Marco Antônio Máximo Prado Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG 2010 Esse trabalho foi realizado no Laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de Farmacologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, com auxílio das seguintes instituições: - Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) - Pronex-MG - NIH-Forgaty - Instituto do milênio Alem disso, apoio financeiro foi recebido para a realização desse trabalho do Canadian Institutes of Health Research e University of Western Ontario. “Discovery consists of seeing what everybody has seen and thinking what nobody has thought.” Albert Szent-Gyorgyi “If something goes wrong at the plant, blame the guy who can't speak English.” Homer Simpson Agradecimentos Gostaria de agradecer ao Marco Prado por aceitar ter sido meu diretor de tese e pelos conselhos. Gostaria de agradecer ao Ivan Izquierdo, sem o qual nada teria acontecido, por ter me apresentado ao Marco Prado e ao Martin Cammarota pela colaboração. Vania Prado pela oportunidade do aprendizado e pela orientação. À professora Grace pela grande ajuda, apoio, discussão e simpatia. Ao professor Márcio Flávio, pelas sugestões. Ao professor Marcus Vinícius Gomez, pelo exemplo e as conversas em francês. Gostaria de agradecer Pauline pelo apoio e ”ses coups de pied au cul” que me ajudaram muito para a realização desse trabalho. A todos amigos e colegas dos laboratórios de Neurofarmacologia e Neurobiologia molecular com quem eu convivi durante esse 4 anos. Aos vizinhos e amigos Eneas, Ricardo, Eder, Diogo para o sal, açúcar e a cachaça quando faltava em casa. Aos amigos Lucimar, Luciene, Fabíola, Danuza ,Bruno, Cristiane, Cristina, Rita, Alessandra, Patrícia, Magda, Nancy, Ana Cristina pelo convívio sempre agradável. Aos amigos, Flavio (Vava) pelas correções e os churrascos, Iaci (Saci) pelas correções e o convívio, Ivana (Juruna) pelas correções e o corte fabuloso, Fabiana (Fabilanga), Andre (Januário) quando ele para de falar, Juan (Raul) pelos erros, Ash (kiko) pelas leções de ingles, Mônica, Mathew (Darth Vader), Amro (Avatar) pela simpatia e convívio e suporte científico. Aos amigos Célio e Bráulio, pela ajuda, alegria e os carnavais. Abstract The release of the neurotransmitter acetylcholine (ACh) depends on the vesicular loading by the vesicular acetylcholine transporter (VAChT). ACh is important for different cognitive functions such as learning, memory and attention. We have generated mice with distinct expression levels of VAChT and consequently ACh release to probe for functional roles of synaptic vesicle filling in cholinergic activity and cognitive function. We provided evidence that the reduction of ACh release or injection of muscarinic receptor antagonist blocked object recognition long term memory (LTM) without affecting remote memory. Using a second mouse line in which we selectively eliminated VAChT in the basal forebrain with the cre-loxP method, we suggest that the cholinergic projections of the basal forebrain neurons are crucial for LTM. The introduction of a Tk-Neo resistance cassette added approximately 1.5 kb downstream from the VAChT stop codon caused a major reduction of VAChT expression in the brain, but relatively preserved peripheral function. We studied the consequence of the reduction of VAChT with two different strains of mice, and observed an increase of locomotor activity without changes in anxiety. We also demonstrated that genetic removal of the Neomycin resistance cassette rescues VAChT expression and the hyperactivity phenotype. Striatal activity plays important roles in controlling motor functions and reward- related behaviours and it is the major brain region affected in several motor diseases such as Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Dopamine-acetylcholine balance in the striatum is believed to be critical for proper motor function and behaviour. To understand the specific contribution of the cholinergic neurons in the striatum, we also developed a mouse line in which we selectively eliminated VAChT in the striatum. We found surprisingly that this mice do not show changes in motor performance and motor learning. However, decreased cholinergic function in the striatum seems to specifically improve the response of mice in the forced-swimming task, suggesting that striatal VAChT might be a novel target for treatment of depression associated with Parkinson’s disease. Resumo A liberação do neurotransmissor acetilcolina (Ach) depende do transporte vesicular pelo transportador vesicular de acetilcolina (VAChT). A acetilcolina é importante para funções cognitivas diferentes como aprendizado, memória e atenção. Nós geramos camundongos com diferentes níveis de expressão de VAChT e, conseqüentemente, liberação de acetilcolina, para buscar os papéis funcionais do transporte de ACh em vesículas sinápticas nas atividades colinérgicas e funções cognitivas. Nós demonstramos que a redução de liberação de ACh ou injeções de antagonistas do receptor muscarínico bloquearam a memória de longo prazo (LTM) de reconhecimento de objetos sem afetar a memória remota. Usando uma linhagem diferente de camundongos, em que eliminamos o VAChT seletivamente do prosencéfalo basal com o método cre-loxP, sugerimos que as projeções colinérgicas dos neurônios do prosencéfalo basal são essenciais para a LTM. A introdução do cassete de resistência a neomicina, adicionado aproximadamente 1.5 kb anteriormente ao “stop codon” do gene para o VAChT, causou uma redução da proteína principalmente no cérebro, com a expressão desse transportador preservada na periferia. Nós estudamos a conseqüência da redução de VAChT utilizando duas linhagens diferentes de camundongos, e observamos que a diminuição do VAChT promove um aumento na atividade locomotora sem afetar a ansiedade. Nós também demonstramos que a remoção genética do cassete de resistência à neomicina restaura a expressão de VAChT e o fenótipo de hiperatividade. A atividade do estriado tem um papel importante no controle das funções motoras e do comportamento associado à recompensa. Essa é a principal região do cérebro afetada em diversas doenças motoras como as doenças de Parkinson e Huntington. Acredita- se que o balanço dopamina-acetilcolina no estriado seja essencial para a função motora e o comportamento. Para entender a contribuição específica dos neurônios colinérgicos do estriado, desenvolvemos uma linhagem de camundongos que tem uma deleção seletiva de VAChT nos neurônios do estriado. Nós observamos que esses camundongos não apresentam alteração no desempenho motor e aprendizagem motora. Porém, a diminuição colinérgica no estriado parece melhorar a resposta dos camundongos no teste de nado forçado, sugerindo que o VAChT no estriado poderia ser um novo alvo para o tratamento de depressão associada a doença de Parkinson. Sumário Introdução...................................................................................................................................2 I- Acetilcolina ..................................................................................................................2 a) Descoberta................................................................................................................2 b) Sinapse colinérgica...................................................................................................3 c) Distribuição dos neurônios colinérgicos. .................................................................6 III- Papel da acetilcolina na cognição.................................................................................8 a) Memória ...................................................................................................................8 b) Atividade Locomotora (Campo aberto) .................................................................14 c) Ansiedade...............................................................................................................16 d) Depressão ...............................................................................................................17 IV- Modelos de animais de hipofunção colinérgica .........................................................18 a) VAChT KD mice ...................................................................................................19 b) VAChT del/del ............................................................................................................19 Objetivos...................................................................................................................................21 I- Objetivos específicos..................................................................................................21 II- Lista de publicações ...................................................................................................21 Discussão................................................................................................................................133