Epigenetické Procesy Během Reparace DNA

Home , Succinylation

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Epigenetické procesy během

reparace DNA

Disertační práce

ALENA SVOBODOVÁ KOVAŘÍKOVÁ

Vedoucí práce: doc. Bártová Eva, RNDr., Ph.D., DSc.

ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV, AKADEMIE VĚD ČESKÉ REPUBLIKY Oddělení molekulární cytologie a cytometrie

Brno 2019

Bibliografický záznam

Autor: Mgr. Alena Svobodová Kovaříková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Epigenetické procesy během reparace DNA

Studijní program: PřF D-MBBG Molekulární a buněčná biologie a genetika

Studijní obor: PřF MBBG Molekulární a buněčná biologie a genetika

Vedoucí práce: doc. Bártová Eva, RNDr., Ph.D., DSc.

Akademický rok: 2018/2019

Počet stran: 123

Klíčová slova: Oprava DNA; epigenetika; chromatin; histony; metyltransferázy; Suv39h1/h2; H4K20me3; H3K9me3; HP1β; Dnmt1; m6A; 5mC; 5hmC; 5caC; METTL3; METTL14

Bibliographic Entry

Author: Mgr. Alena Svobodová Kovaříková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Epigenetic Processes during DNA repair

Degree programme: PřF D-MBBG Molecular and Cell Biology and Genetics

Field of Study: PřF MBBG Molecular and Cell Biology and Genetics

Supervisor: doc. Bártová Eva, RNDr., Ph.D., DSc.

Academic Year: 2018/2019

Number of Pages: 123 Keywords: DNA repair; epigenetics; chromatin; histones; methyltransferases; Suv39h1/h2; H4K20me3; H3K9me3; Dnmt1; HP1β, m6A; 5mC; 5hmC; 5caC; METTL3; METTL14

Abstrakt

Schopnost buňky rozpoznat a odstranit chyby v sekvenci DNA je jednou ze základních podmínek přežití každého organizmu. Během evoluce se vyvinuly různě složité a přísně řízené mechanismy opravy DNA, které buňky využívají ve stresových situacích. Narušení některého kroku z těchto fyziologických dějů může vést k rozvoji celé řady onemocnění. Nejen mnohé opravné proteiny, ale i epigenetické značky navázané na histonech, DNA a RNA regulují tyto složité procesy, souhrnně označené jako odpověď na poškození DNA (DDR). Význam epigenetiky pro tuto oblast výzkumu je obrovský, avšak konkrétní funkce epigenetických modifikací nejsou zcela objasněny, protože chromatin podléhá četným úpravám. Tato závěrečná práce přispívá k pochopení změn na úrovni chromatinu, ke kterým dochází při poškození DNA a při následné opravě. První část experimentální práce se věnuje histonovým modifikacím, především H3K9 trimetylaci a H4K20 trimetylaci, a jejich úloze v opravné dráze nehomologního spojování konců, NHEJ. V našich experimentech jsme prokázali vzájemnou interakci těchto histonových značek a stěžejního proteinu 53BP1. Navíc jsme pozorovali inhibiční vliv delece genu pro histonové metyltransferázy Suv39h1/h2 na utváření reparačních ohnisek proteinu 53BP1. Další část předkládané práce je zaměřená na rozdíly v metylaci DNA v souvislosti s disfunkcí enzymů Suv39h1/h2 a při poškození chromatinu. Ukázali jsme, že stres může v zasažené oblasti buněčného jádra vyvolat aktivní demetylaci DNA, doprovázenou tvorbou 5hmC a 5caC. Poslední část experimentální práce se zabývá distribucí vybraných posttranskripčních 6 1 modifikací RNA (m A, m A, m3G/TMG) a jejich přítomností v místě poškození DNA. Zjistili jsme pozitivní korelaci mezi množstvím hypermetylovaného 6-adeninu v RNA a správnou funkcí metyltransferáz Suv39h1/h2 v místech lokálních lézí DNA. Navíc velice rychlá akumulace m6A

RNA je během opravy DNA následována redukcí hladiny m3G/TMG v poškozeném chromatinu.

Abstract The ability to recognize and eliminate errors in the DNA sequence is one of the basic preconditions for the survival of each organism. In stress situations, cells take advantage of many complex and strictly regulated mechanisms developed during evolution. Malfunction of any step in these physiological processes may lead to a number of diseases. Not just proteins, but also epigenetic markers bound to proteins, DNA, and RNA, regulate these complex processes, collectively called DNA-damage response (DDR). The epigenetic impact on this research topic is huge. However, the impacts of specific epigenetic modifications are not yet clear because chromatin is subject to many modifications. This thesis contributes to our understanding of chromatin modifications appearing after DNA damage and its consequent repair. The first part of my experimental work is focused on histone modifications, especially H3K9 trimethylation and H4K20 trimethylation, and their role in nonhomologous end-joining (NHEJ) repair pathway. In our experiments, we provided evidence for a mutual interaction between these histone marks and the 53BP1 oncoprotein. Furthermore, the influence of the Suv39h1/h2 (major histone H3K9 methyltransferases) depletion on the formation of repair foci consisting of 53BP1 was observed in Suv39h1/h2 knock out cells. The second part of this thesis is focused on the relationship between DNA methylation at cytosine residues and dysfunction of Suv39h1/h2 enzymes. We have shown that stress may cause active DNA demethylation, accompanied by increased levels of 5hmC and 5caC in the cell nucleus. The last part of the experimental work deals with the role of certain posttranscriptional modifications of 6 1 RNA (m A, m A, m3G/TMG) in DNA repair processes. We observed a reduction of m6A (position 6 of a purine cycle of adenine) RNA levels in local DNA lesions in Suv39h1/h2 deficient cells. Finally, we also observed that fast accumulation of m6A RNA during DNA repair processes was followed by depletion of m3G/TMG level in damaged chromatin

Poděkování

Na tomto místě bych ráda poděkovala své školitelce doc. RNDr. Evě Bártové, Ph.D., DSc. za odborné vedení, cenné připomínky a čas, který mi během mého doktorského studia věnovala. Velice si také cením toho, že mi umožnila pracovat na Biofyzikálním ústavě AVČR, v. v. i., kde jsem získala nové zkušenosti v oblasti buněčné biologie a epigenetiky. Dále bych chtěla poděkovat kolegům z Oddělení molekulární cytologie a cytometrie, zejména Mgr. Denise Komůrkové, Ph.D., Mgr. Lence Stixové, Ph.D. a Mgr. Soni Legartové, Ph.D. za jejich rady a pomoc při řešení technických problémů. Velké poděkování patři také mojí rodině, především manželovi, kteří mě po celou dobu podporovali a v závěru studia věnovali svůj čas čtení i úpravám této práce.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji disertační práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 30. srpna 2019 ……………………………… Jméno Příjmení: Alena Svobodová Kovaříková

Použité publikace:

Svobodova Kovarikova, A., Legartova, S., Krejci, J., and Bartova, E. (2018). H3K9me3 and H4K20me3 represent the epigenetic landscape for 53BP1 binding to DNA lesions. Aging 10, 2585-2605.

Plná verze: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6224238/

IF: 5.515 Prohlášení: Prohlašuji, že můj podíl na publikaci činí 70 % (příprava designu studie, kultivace buněčných linií, transfekce buněk plazmidovou DNA, konfokální mikroskopie, indukce poškození UVA a γ-zářením, imunofluorescenční barvení, imunodetekce pomocí westernového přenosu, analýza dat, psaní některých částí textu).

Svobodova Kovarikova, A., Stixova, L., Kovarik, A., Komurkova, D., Legartova, S., and Bartova, E. (2019). Pronounced methylation of N6-adenosine in RNAs and reduced level of m3G/TMG in small RNAs appear before the active DNA demethylation at UV-induced DNA lesions. Plná verze: odesláno v odborném periodiku

Prohlášení: Prohlašuji, že můj podíl na publikaci činí 65 % (příprava designu studie, kultivace buněčných linií, transfekce buněk plazmidovou DNA, konfokální mikroskopie, indukce poškození UVA a γ-zářením, imunofluorescenční barvení, imunodetekce pomocí westernového přenosu, analýza dat, psaní některých částí textu).

OBSAH

1 ÚVOD ...... 16

2 TEORETICKÁ ČÁST ...... 17

2.1 Metylace DNA ...... 17

2.1.1 Metylace cytosinu u savců ...... 19

2.1.2 Savčí DNA metyltransferázy (Dnmt) ...... 19

2.1.3 Metyl-CpG vázající proteiny ...... 25

2.2 Demetylace 5mC a jeho deriváty ...... 25

2.3 Metylace adeninu 6mA v DNA ...... 27

2.4 Metylace RNA...... 28

2.5 Histonové modifikace a jejich funkční význam ...... 30

2.5.1 Acetylace histonů ...... 31

2.5.2 Metylace histonů a její funkční význam ...... 32

2.6 Význam epigenetiky pro opravné mechanismy poškozené DNA ...... 36

2.6.1 Jednořetězcové zlomy (SSB) v DNA a jejich opravné mechanismy ...... 37

2.6.2 Dvouřetězcové zlomy a mechanismy jejich opravy ...... 40

2.6.3 Nukleotidové excizní opravy (NER) ...... 44

2.6.4 Epigenetické modifikace zapojené do opravy poškozené DNA ...... 46

3 CÍLE ...... 52

4 MATERIÁL A METODY ...... 53

4.1 Kultivace použitých buněčných linií ...... 53

4.1.1 Myší embryonální buňky ...... 54

4.1.2 Lidské adherentní linie ...... 54

4.2 Příprava a transfekce plazmidu ...... 55 4.2.1 Transformace a výsev a namnožení bakterií ...... 56

4.2.2 Izolace plazmidů pro eukaryotickou transfekci ...... 57

4.2.3 Transfekce eukaryotických buněk plazmidovou DNA ...... 58

4.3 Použité inhibitory ...... 58

4.4 Imunofluorescenční barvení ...... 59

4.4.1 Imunofluorescenční barvení proteinů a histonových modifikací ...... 59

4.4.2 Vizualizace CPD aduktů a nukleotidových derivátů na DNA ...... 60

4.5 Westernový přenos ...... 64

4.5.1 Příprava lyzátů pro detekci protein ...... 64

4.5.2 SDS - PAGE a přenos na membránu ...... 65

4.6 Imunoprecipitace proteinů...... 67

4.7 Analýza buněčného cyklu ...... 68

4.8 Konfokální mikroskopie a její využití ...... 69

4.8.1 Technické vybavení ...... 69

4.8.2 Indukce lokálního poškození DNA UVA lasery ...... 71

4.8.3 Plošné ozáření UV lampou ...... 72

4.8.4 Stanovení počtu reparační ohnisek po indukci poškození γ-zářením ...... 72

4.9 Statistika a normalizace dat ...... 73

5 VÝSLEDKY ...... 74

5.1 Detekce vybraných histonových modifikací a reparačních proteinů u myších fibroblastů a u buněk s delecemi v genech pro SUV39H1 a SUV39H2 metyltransferázy ...... 74

5.1.1 Úplná delece genů SUV39H1/H2 snižuje kromě H3K9me3 také hladinu dalších modifikací histonů H3, H4 a reparačních markérů ...... 74

5.1.2 Funkce 53BP1 a γH2AX při opravě DNA závisí na Suv39h1/h2 ...... metyltransferázách ...... 77

5.1.3 H4K20me3 interaguje s 53BP1 a při poškození DNA se účastní dráhy NHEJ ...... 80 5.1.4 Hladina H4K20me3 v místě poškození DNA závisí na fázích buněčného cyklu... 84

5.2 Analýza metylace cytosinu v DNA a jeho derivátů (5hmC a 5caC) u buněk Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn ...... 86

5.2.1 Delece genů SUV39hH1/H2 omezuje retenci Dnmt1 metyltransferázy v místě opravy poškozené DNA ...... 86

5.2.2 V lokální DNA lézi indukované UVA laserem se u myších fibroblastů nemění metylační stav DNA, ale UVC záření vyvolá globální změny v metylaci DNA ...... 88

5.2.3 V nádorových buňkách HeLa dochází po lokálním poškození UVA zářením ke zvýšení hladiny 5hmC a 5caC ...... 91

5.3 Studium změny metylace RNA v důsledku poškození DNA u vybraných buněčných linií...... 93

5.3.1 UV záření indukuje hypermetylaci 6N adeninu na RNA (m6A), která nepřímo závisí na funkci a hladině Suv39h1/h2 metyltransferáz ...... 93

5.3.2 Inhibitory RNA polymeráz neovlivňují akumulaci m6A RNA v DNA lézi ...... 97

5.3.3 Intenzita hypermetylace m6A RNA indukovaná UVA zářením se různí mezi tkáňovými typy ...... 98

6 DISKUZE...... 100

6.1 Chování histonových značek po radiačním poškození a v průběhu oprav DNA ...... 100

6.2 Změny v modifikaci nukleotidových bází v postradiačním poškození a průběhu oprav DNA ...... 104

7 ZÁVĚR...... 109

8 SEZNAM LITERATURY ...... 110

SEZNAM ZKRATEK

53BP1 p53-binding protein

5mC 5 metylcytosin

5hmC 5 hydroxymetylcytosin

5caC 5 carboxycytosin

5fC 5 formylcytosin

6mA N6 metyladenin v DNA

ALKBH1 Nucleic acid dioxygenase 1

AK Aminokyselina aNEHJ alternative non-homologous endjoining Alternativní nehmologní spojování volných konců

APLF Aprataxin and Polynucleotide Kinase-like Factor

APE1/2 DNA apurinic or apyrimidinic site lyase 1/2

APS Amonium persulfát

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated (kináza účastnící se odpovědi na poškození DNA)

ATR Ataxia Telangiectasia and Rad3-Related Protein

BC Buněčný cyklus

BER base excision repair (bázová excizní oprava)

BRCA1/2 Breast Cancer 1/2 (Gen predisponující ke vzniku karcinomu prsu a ovarií)

BrdU 5-Bromo-2'-deoxyuridine (5-bromo-2'-deoxyuridin)

BSA Bovine Serum Albumine (bovinní sérový albumin)

CAK CDK-Activating Kinase (CDK aktivační kináza)

CETN2 Centrin 2 (Centrin 2)

CK casein kinase

CPD Cyclobutane Pyrimidine Dimers (cyklobutan-pyrimidinový dimery) CSA Cockayne Syndrome Factor A (faktor Cockayne syndromu A)

CSB Cockayne Syndrome Factor B (faktor Cockayne syndromu B)

CtIP CtBP-interacting protein

CUL4A/B cullin 4A/B

DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole

DDB Damage DNA Binding Protein

DDR DNA Damage Response (komplexní mechanizmy odpovědi na poškození DNA)

D-MEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DNA/RNA deoxy/ribonucleic acid (deoxyribonukleová/ ribonukleová kyselina)

DNA2 DNA replication helicase/nuclease 2

DNA-PKc DNA Dependent Protein Kinase Cytalytic Subunit (katalytická podjednotka DNAdependentní proteinkinázy) dn Double-Null (dvojitá delece genů)

Dnmt1/2/3 DNA methyltransferase 1/2/3 (Cytosin DNA metyltransferáza)

DSB Double Strand Break in DNA (dvouřetězcový zlom v DNA)

E3 ubiquitin ligase

ES Embryonální kmenové buňky

Exo1 exonuclease 1

FBS Fetal Bovine Serum (fetální bovinní sérum)

FEN1 Flap Endonuclease 1

FTO Fat mass and obesity-associated protein (protein tukové hmoty asociované s obezitou)

GFP Green Fluorescent Protein (zelený fluorescenční protein)

GG-NER Global Genome Nucleotide Excision Repair (globální nukleotidová excisní oprava)

HaCat human aneuploid immortal keratinocyte cell (imortalizované lidské keranocyty)

HAT Histone acetyltransferases (histon acetyltransferáza) HDAC Histone deacetylase (histon deacetyláza)

HJ Holliday junction (Holidayův spoj)

HMT histon metyltransferázy

HP Heterochromatin protein 1 (Heterochromatinový protein 1)

HRR Homologous Recombination Repair (oprava homologní rekombinací)

IP Protein Immunoprecipitation (proteinová imunoprecipitace)

IRIF γ-irradiation-induced foci (ohniska navozené ionizujícím zářením)

KMT lysinové meytyltrasferázy

Ku70/80 ATP-dependent DNA helicase 2 subunit 70/80

LFS Li-Fraumeni syndrome (Li-Fraumeniho syndrom)

Lig I/III DNA Ligase I/III (DNA ligáza I/III) m6A N 6 -metyladenosin RNA m3G/TMG 2,2,7-metylguanosin RNA

MBD1-4 Methyl-CpG Binding Domain Protein 1-4

MDC1 Mediator of DNA Damage Checkpoint Protein 1

MDM2 Mouse Double Minute 2 Homolog

MeCP2 methyl-CpG binding protein 2

MEF mouse embryonic fibroblasts (myší embryonální fybroblasty)

METTL3/14 N6-adenosine-methyltransferases 3/14

MHC major histocompatibility complex (hlavní histokompatibilitní komplex) miRNA microRNA (krátké nekódující molekuly RNA)

MRN komplex proteinů Mre11, RAD50 a NBS1

NBS1 Nibrin

NER Nucleotide Excision Repair (nukleotidová excizní oprava)

NHEJ Nonhomologous End Joining (mechanismus nehomologního spojování konců) NM normální mléko

NLS Nuclear Localization Signal (jaderný lokalizační signál)

PARP1 Poly(ADP-Ribose) Polymerase-1 (poly(ADP-ribóza)polymerázy 1)

PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen (proliferační antigen buněčného jádra)

PRMT argininové metyltransferázy

PNK/P Bifunctional polynukleotide kinase/phosphatase (polynukleotidová kináza)

Pol β/δ/ε Polymerase β/δ/ε (polymeráza β/δ/ε)

RAD51 recombinase (rekombináza)

RFP Red Fluorescent Protein (červený fluorescenční protein)

RIF Telomere-associated protein (Protein asociovaný s telomerou)

RING1 ring finger protein 1

RNF8/126/168 E3 ubiquitin-protein ligase 8/126/168

ROI Region of Interest (oblast zájmu)

RPA Replication Protein A (replikační protein A)

SAM S-adenosylmethionin snRNA small nuclear RNA (malá jaderná RNA)

SSB Single Strand Break Repair (oprava jednořetězcového zlomu)

Suv39h1/h2 Suppressor of Variegation 3–9 Homologue 1/2, (histon lysin metyltransferáza 1/2)

TC-NER Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (nukleotidová excisní oprava

spřažená s transkripcí)

TET1/2/3 Ten-Eleven-Translocation enzymes 1/2/3

TEMED N; N; N’; N’- tetramethylethylenediamine

TFIIH Transcription Factor II H (transkripční faktor II H)

TGD thymin-DNAglykosyláza

TdT terminálnídeoxynukleotidyltransferáza TP53 Tumor Protein p53

Tip60 Histone acetyltransferase (histon acetyltransferáza)

U2OS Human bone osteosarcoma epithelial cells (buňky odvozené z lidského osteosarkomu)

UBF Upstream binding factor (“upstream” vazebný faktor)

UDR Ubiquitin-Dependent Recruitment

UHRF1 ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1

UTR untraslated regions (nepřekládaná oblast)

WLL White light laser; bílý laser

WRN Werner syndrome ATP-dependent helicase

XP Xeroderma pigmentosum

XRCC1 X-Ray Repair Cross-Complementing Protein 1

ZBTB4/38 Zinc finger and BTB domain 4/3

1 ÚVOD

Epigenetika je poměrně mladým, dynamicky se rozvíjejícím odvětvím molekulární biologie. Zanedlouho tomu bude již 100 let, kdy vývojový biolog Conrad Waddington, zakladatel tohoto vědního směru, použil ve své práci termín epigenetika (Waddington, 2011; Weinhold, 2006). Jeho výzkum byl zaměřen na molekulární procesy, které vedou ke změnám v průběhu vývoje organizmu. Zavedl dnes již velice známé pojmy jako epigenetická (Waddingtonova) krajina a genetická asimilace. Jeho myšlenky v průběhu druhé poloviny 20. století upadly téměř do zapomnění. Avšak poté, co na začátku 90. let umožnily pokročilé molekulární techniky velký posun v oblasti genetiky, probudily nově vyvstalé otázky o epigenetiku opět zájem. Objevy metylace DNA, remodelace chromatinu a především detekce nekódujících RNA prokázaly, že epigenetické vlivy regulují genovou expresi. Epigenetické značky mohou být navázány na nukleové kyselině (DNA, RNA) i na zbytcích aminokyselin v proteinech (Kouzarides, 2007). Epigenetický profil jedince se reverzibilně mění v důsledku působení vnitřních i vnějších faktorů a může se přenášet do další generace (Snustad, 2017). Ovlivňují tak veškeré biologické děje v organizmech, včetně opravy poškozené DNA, aniž by muselo dojít k mutaci v nukleotidové sekvenci (Portela a Esteller, 2010; Snustad, 2017). Narušení sekvence DNA vyvolá v buňce sled reakcí souhrnně označených jako odpověď na poškození DNA (DDR). Organizmy si vyvinuly různé mechanismy opravy DNA, aby byly chráněny před negativními vlivy vnitřního i vnějšího prostředí. Selhání těchto mechanismů má za následek hromadění chyb v genomu organizmu, což může vést až k jeho zániku. Výběr konkrétní opravné dráhy závisí jednak na příčině, rozsahu a typu poškození, ale také na fázi buněčného cyklu (BC), ve které se zasažené buňky nachází (Ciccia a Elledge, 2010; Zhou a Elledge, 2000). Pro fyziologické procesy opravy DNA je kromě řady proteinů také důležitá funkční epigenetická krajina. Jelikož mnohé patologické stavy souvisí s poruchou signalizace při opravě DNA, je zapotřebí důkladně zmapovat jednotlivé kroky těchto drah. Tato závěrečná práce pojednává o změnách ve struktuře chromatinu navozených právě poškozením DNA.

2 TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Metylace DNA

Metylaci nukleových kyselin zprostředkovávají enzymy metyltransferázy, které přenášejí metylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu (SAM) na DNA a RNA. Tato kovalentní modifikace se v genomu vyskytuje u organizmů napříč všemi taxonomickými říšemi, včetně nebuněčných virů. V rámci disertační práci se zaměřím především na metylační vzorec u savců, avšak v úvodu ve stručnosti popíši epigenetické mechanismy i u ostatních organizmů. V bakteriálním genomu se objevují tři typy modifikací DNA bází: 5-metylcytosin (Dcm metyltransferáza), 6-metyladenin (Dcm metyltransferáza) a 4-metylcytosin, které hrají důležitou roli v replikaci a při vzniku nových kmenů (Couturier a Lindås, 2018; McIntyre et al., 2019). U prokaryot jsou epigenetické procesy také stěžejní pro imunitní odpověď a rezistenci patogenů, restrikčně modifikační sytém (RHS) a CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (McIntyre et al., 2019; Turek-Plewa a Jagodzinski, 2005). U eukaryot epigenetické značky nacházíme od jednobuněčných (kvasinky) přes jednoduché mnohobuněčné (hlístice, plísně) až po nejsložitější organizmy (obratlovce). Nejčastěji bývá metylován cytosin v poloze 5 (5mC) v palindromatických úsecích DNA, v tzv. CpG dinukleotidech. Obecně jsou metylace v genomech heterogenně rozložené. Nejvyšší koncentraci vykazují repetitivní sekvence heterochromatinu, naopak nejnižší nacházíme v promotorech exprimovaných genů (Guseinov A et al., 1975; Kim et al., 2009). Přítomnost 5mC způsobí v dané oblasti DNA inaktivaci genů a heterochromatinizaci (Hermann et al., 2004a; Zhu a Yao, 2009). Nedávné studie však naznačují, že některé transkripční faktory (např. KLF4) rozpoznávají metylový zbytek na DNA jako svoje vazebné místo a tím aktivují expresi genu (Rothbart a Strahl, 2014). Podle některých studií přítomnost 5mC v savčí DNA primárně poskytuje hostiteli obranný mechanismus proti parazitické DNA prostřednictvím represivních účinků 5mC na genovou expresi a následnou akumulaci mutací, způsobenou spontánní deaminací 5mC na thymin (Bestor, 2000). S rozvojem sekvenačních technik došlo také k objevu N6-metyladeninu (6mA) na DNA eukaryot. Tato modifikace byla do té doby výlučně spojována s doménou prokaryot a virů (Fu et al., 2015; Gujar et al., 2019).

V rostlinné říši se setkáváme s velice rozmanitými epigenetickými mechanismy, přičemž některé z nich nemají svoje obdoby u ostatních eukaryot (Feng a Jacobsen, 2011). U rostlin se za účelem RNA interference pravděpodobně vyvinuly speciální DNA dependentní RNA polymerázy IV a V, vedoucí ke vzniku krátkých dvouvláknových molekul RNA (siRNA), které indukují nesymetrickou metylaci (Snustad, 2017). Dalším specifickým rysem vyšších rostlin a některých plísní je schopnost metylace trinukleotidových sekvencí CNG, kde N představuje jakoukoli bázi (Gruenbaum et al., 1981). Metylační stav DNA udržuje enzym MET1, který z funkčního hlediska odpovídá metyltransferáze Dnmt1 vyšších obratlovců, a chromometyláza 3 (CMT3), typická pouze pro rostlinnou říši (Cao et al., 2003). Metylaci de novo zde zajišťují zejména DDR metyltransferázy, které jsou řízeny krátkými nekódujícími molekulami RNA (siRNA a PIWI- interagující RNA). Tyto jaderné regulátory vyvolávají umlčení přednostně v repetitivních úsecích DNA (Edwards et al., 2017; Ku a Lin, 2014). PIWI-interagující RNA byly také prokázány u hub a některých metazoí, včetně člověka (Clark a Lau, 2014; Ozata et al., 2019). Velice zajímavou skupinou jsou z pohledu epigenetiky plísně. N. crassa se považuje za první nižší eukaryotický organizmus, u kterého byl vyvinut mechanismus metylace cytosinu. Ačkoliv modifikační enzymy zde mají vysokou homologii s metyltransferázami vyšších eukaryot, globální demetylace pro plísně není letální (Kouzminova a Selker, 2001). U živočichů se v každém řádu nachází modelový organizmus pro studium epigenetiky, přičemž jejich metylační vzorce jsou značně odlišné. Srovnávací analýzy ukázaly, že živočichy můžeme rozdělit podle zastoupení 5mC v celogenomové DNA do tří hlavních skupin: všude přítomný 5mC (Mus musculus), ojedinělý (Apis mellifera) a chybějící metylační vzor (Ceanorhabditis elegans a Drosophilla melanogaster) (Lister et al., 2008). V současnosti díky vysoce citlivým metodám, založeným na kapalinové chromatografii a hmotnostní spektrometrii (LCMS) pro kvantifikaci hladiny 5-metylcytosinu, se metylomy jednotlivých druhů neustále zpřesňují. V roce 2018 byl těmito technikami odhalen 5mC i u členů rodu Drosophila, přičemž jeho hladina se mezi podrody liší (Deshmukh et al., 2018). V posledních letech přibývá studií zabývajících se zastoupením N6-metyladeninu (6mA) v genomu metazoí. Dříve se předpokládalo, že přítomnost 6mA v DNA je pouze výsadou prokaryot a jednoduchých eukaryot. Dnes detekujeme 6mA v DNA mnohých živočichů včetně člověka, dokonce i u těch, které nedisponují 5mC. V souvislosti s tímto zjištěním se objevily také hypotézy, že v daných organismech 6mA nahrazuje v DNA funkci 5mC. Navíc existuje negativní korelace mezi N6-metyladeninem v DNA

18 a aktivační histonovou značkou dimetylací histonu H3 v pozici lysinu 4 (H3K4me2) (Greer et al., 2015; Ji et al., 2018).

2.1.1 Metylace cytosinu u savců Také v savčích buňkách dochází především k metylaci CpG dinukleotidů, i když v embryonálních buňkách (ES), oocytech a neuronech byly objeveny metylové zbytky na CpA, CpC, nebo na CpT dinukleotidech (Patil et al., 2014). Metylované CpG dinukleotidy jsou v savčích genomech nerovnoměrně rozptýleny, ale nejčastěji se nacházejí v centromerách, v repetitivních sekvencích a transpozonech (Cheng a Blumenthal, 2008). Na druhou stranu sekvence DNA dlouhé 0,5-2 kb bohaté na CpG zpravidla vůbec 5-metylcytozin neobsahují. Tyto úseky, nazvané CpG ostrovy, se vyskytují v promotorových oblastech provozních genů, což souvisí s jejich neustálou expresí (Bird, 1997; Gujar et al., 2019). Experimentálně bylo zjištěno, že k těmto úsekům DNA se váže stěžejní transkripční faktor Sp1 (Macleod et al., 1994). Navíc CpG ostrovy chrání vlastní promotory před de novo metylací a zároveň udržují sousední promotory transkripčně aktivní (Antequera, 2003). Metylační stav organizmu však není stálý a vlivem vnitřního či vnějšího prostředí se mění, čímž zásadně ovlivňuje vývoj jedince. Během embryogeneze hladina 5mC cyklicky vzrůstá nebo klesá a ve stárnoucích buňkách se úroveň metylace zvyšuje (Fraga et al., 2005; Zeng a Chen, 2019). Mechanismus metylace DNA se zřejmě primárně vyvinul za účelem obrany hostitele proti parazitickým transpozonům a retroelementům. Navázání metylové skupiny má silný represivní účinek a deaminace mC→ T způsobí trvalou inaktivaci mobilních elementů. Tento druh regulace navozuje v organizmu poziční efekt, kompenzaci dávky a genový imprinting, řídí diferenciaci buněk a hraje roli při rozvoji řady onemocnění (Bird, 2002; Zeng a Chen, 2019). Ektopická de novo metylace nádorových supresorových genů může také přispět k onkogenezi. Rozbití globálních metylačních struktur má vždy negativní vliv na prenatální i postnatální vývoj jedince (Bestor, 2000).

2.1.2 Savčí DNA metyltransferázy (Dnmt) U obratlovců existuje několik členů proteinové rodiny Dnmt, lišících se strukturou a funkcí. Geny pro tyto enzymy jsou u savců vysoce konzervovány. Savčí metyltrasnsferázy dělíme do dvou

19 funkčních skupin podle toho, jaký stav DNA rozeznávají. Do první skupiny enzymů patří Dnmt1 a Dnmt2, které při replikaci rozpoznávají metylovou skupinu na mateřském vlákně, aby následně metylovaly vlákno dceřiné (Bestor, 2000). Druhým typem jsou metyltransferázy Dnmt3a a Dnmt3b, které mají schopnost de novo metylace DNA. K této skupině řadíme také protein Dnmt3L, který nedisponuje katalytickou schopností, ale kooperuje s Dnmt3a/b při navázání na DNA (Deplus et al., 2002; Qin et al., 2011). Během buněčného cyklu se hladiny metyltransferázy dramaticky mění, nejvyšší úrovně dosahují v S fázi, a to jak v somatických, tak i embryonálních buňkách (Gujar et al., 2019). Kromě Dnmt2 všechny savčí DNA metyltransferázy obsahují tři strukturní regiony (obr. 1). Regulační N-terminální doména má velice proměnlivou velikost a zodpovídá za lokalizaci proteinů v jádře. Centrální úsek, bohatý na glycin a lysin, plní funkci linkeru. C-terminální část realizuje vlastní enzymatickou reakci. Tvoří ji 6 konzervativních motivů, které jsou nezbytné pro přenos metylové skupiny z S-adenosylmethioninu (obr.1) (Qin et al., 2011; Turek-Plewa a Jagodzinski, 2005).

Obrázek 1: Struktura savčích DNA metyltransferáz. Schématické znázornění jednotlivých domén a molekulové hmotnosti lidských enzymů Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b a Dnmt2. Použité zkratky: DMAPD - DNA metyltransferáza asociovaná doména, PBD - PCNA vazebná doména, NLS - jaderný lokalizační signál, RFTD – cíleně zaměřená replikační doména, CXXC - CXXC doména, BAH1 a BAH2 - brom-homologické domény 1 a 2, (GK)n – glycinové a lysinové repetice, PWWP - PWWP doména, ADD (ATRX-DNMT3-DNMT3L) – cystein-zinkové motivy pro interakci s histonem H3. Převzato a upraveno Jeltsch a Jurkowska 2016 (Jeltsch a Jurkowska, 2016).

20 2.1.2.1 DNA metyltransferáza 1 (Dnmt1) Bioinformatické analýzy odhalily, že gen pro enzym Dnmt1, lokalizovaný na lidském chromozomu 19, vznikl spojením tří prapůvodních genů. Tento cca 180 kDa velký protein existuje u savců v několika izoformách, které jsou složeny z funkčních domén. Rozsáhlá N-terminální doména obsahuje několik subdomén (obr. 1): proliferační (PBD), jadernou lokalizační (NLS) doménu, replikační doménu (RFTS), vazebný motiv zinkového prstu (CXXC) a dvě bromo- homologické domény (BAH1/2). U eukaryot tyto subdomény vykonávají rozmanité specializované funkce včetně jaderného transportu, koordinace replikace a metylace během S-fáze buněčného cyklu. Hlavní úlohou Dnmt1 je udržovat metylační vzorec v organizmu. Nachází se přímo v replikační vidlici, kde díky své katalytické doméně na C-konci metyluje nově syntetizované vlákno. To umožňuje jeho vazebný partner UHRF1 (E3 ubiquitin-protein ligase), který navádí Dnmt1 přímo k hemimetylované DNA (Edwards et al., 2017). Experimentálně bylo prokázáno, že tento enzym má schopnost metylace de novo, avšak jeho aktivita je 5 až 40-krát vyšší v hemimetylovaném stavu (Hermann et al., 2004b). De novo enzymatickou aktivitu in vivo totiž inhibuje přemostění subdomény BAH a CXXC (Song et al., 2011b). Pomocí RFTS domény se vytváří vazba mezi chromatinem a Dnmt1, přednostně s konstitutivním heterochromatinem (Easwaran et al., 2004). Regulační N-terminální oblast interaguje s řadou proteinů, které se významně podílejí na zásadních buněčných procesech jako replikace, remodelace chromatinu, řízení buněčného cyklu a nádorová transformace. Mezi interakční partnery Dnmt1 patří např. histon deacetylázy (HDAC1/3), polymerační jaderný antigen (PCNA), metyl vázající proteiny (MBD1, MBD2, MBD3 a MeCP2), heterochromatinový protein 1 (HP1) a chromatin remodelující protein SNF2 (Sucrose Non-Fermentable). In vitro cílené mutace embryonálních buněk v genu pro DNMT1 vedly k postupné ztrátě diferenciačního potenciálu a následně vyvolaly apoptózu. Z toho vyplývá, že funkční gen DNMT1 je nezbytný pro správný růst a vývoj většiny organizmů a jeho delece má letální charakter. Demetylace v embryonálních buňkách návodí zvýšenou frekvenci delecí a mutací, pravděpodobně kvůli vyšší rychlosti homologní rekombinace mezi demetylovanými repetitivními sekvencemi (Bestor, 2000; Fuks et al., 2003). Kvantita a lokalizace proteinu uvnitř jádra se v průběhu buněčného cyklu mění. V G1 fázi buněčného cyklu má Dnmt1 rovnoměrné rozložení v nukleoplazmě. Na začátku S fáze hladina enzymu vzrůstá a vytváří se agregáty kolem γ-satelitní DNA v jádrech myších fibroblastů (obr. 2), kde se v pozdní S fázi DNA především replikuje. V replikační vidlici PCNA interaguje s PBD doménou Dnmt1, což

21 v embryonálních kmenových buňkách zvyšuje účinnost metylace. Výskyt Dnmt1 ložisek charakterizuje střední a pozdní S fázi, avšak dobře patrné jsou i na začátku G2 fáze buněčného cyklu. Funkce Dnmt1 v pozdně se replikujících chromocentrech nezávisí na metyltransferázách Suv39h1, Suv39h2 a na proteinu heterochromatinu HP1. V průběhu G2 fáze Dnmt1 postupně difunduje zpět do nukleoplazmy. V mitóze doména RFTS u enzymu Dnmt1 zůstává i nadále asociována s chromatinem a pravděpodobně tak napomáhá udržení metylačního stavu i při dělení buněk (obr.2) (Easwaran et al., 2004). PRMT6 metyltransferáza dimetyluje arginin R2 histonu H3 (H3R2me2) a tato modifikace znemožní vytvoření utvoření komplexu UHRF1-Dnmt1 (Gujar et al., 2019). Nedávno bylo prokázáno, že Dnmt1 také reguluje aktivitu MHCI sytému (hlavní histokompatibilní komplex) v neuronech, proto by mohl tento enzym hrát důležitou úlohu i ve vývoji neurodegenerativních onemocnění (Gustafsson et al., 2018). Exprese genů UHFR a DNMT1 bývá také často deregulována v různých typech nádorů. Genomy maligních tkání se vyznačují globální hypometylací, výjimku však tvoří hypermetylované promotory supresorových genů (Horii a Hatada, 2016). Pohlavní buňky exprimují dvě speciální varianty enzymu Dnmt1, v oocytech Dnmt1o a v pachytenních spermatocytech se vyskytuje Dnmt1p. Tyto varianty vznikají alternativním sestřihem prvního exonu a jejich ztráta je pro vyvíjející se plod letální (Gujar et al., 2019; Turek-Plewa a Jagodzinski, 2005). V roce 2011 byla objevena varianta Dnmt1, obsahující signální oblast specifickou pro mitochondrie (Shock et al., 2011). V metylačním vzorci mitochondriálního genomu se nacházejí CNG a CHH motivy, stejně jako u rostlin (Bellizzi et al., 2013)

22 Obrázek 2: Distribuce enzymu Dnmt1v různých fázích buněčného cyklu. Rozdělení fází buněčného cyklu u živých myších buněk na základě exprese fúzních proteinů RFP-Ligáza (červená) a GFP-Dnmt1 (zelená). Uprostřed schematicky znázorněny jednotlivé fáze buněčného cyklu (G1, S, G2 fáze a Mitóza). V G1 fázi jsou oba proteiny rozprostřeny rovnoměrně v cytoplazmě. Typická distribuce RFP-Ligázy umožňuje identifikovat buňky v progresi fáze S. Kolokalizace výrazných ložisek RFP-ligasy a GFP-Dnmt1 charakterizuje pozdní S fázi. V počátku G2 jsou patrná pouze ložiska GFP-Dnmt1. Převzato a upraveno (Easwaran et al., 2005)

2.1.2.2 Asymetrická metylace zprostředkovaná metyltransferázou Dnmt3 Podrodina Dnmt3 zahrnuje varianty Dnmt3a a Dnmt3b, které vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie, avšak jejich funkce nejsou totožné. Obě tyto metyltransferázy mají afinitu k nemetylovaným CpG nukleotidům a hrají důležitou úlohu během embryogeneze a gametogeneze. Jejich de novo metylační schopnost je v dospělých somatických tkáních redukována, ačkoliv izoforma Dnmt3a1 se nachází v heterochromatinových oblastech diferencovaných buněk (Okano

23 et al., 1999). Hlavní varianta Dnmt3a2 přednostně zodpovídá za vytvoření metylačních vzorců v prenatálním vývoji mužských pohlavních buněk, na druhou stranu Dnmt3b disponuje de novo metylační aktivitou i ve zralých mužských gonádách (spermatocytech) (Chen et al., 2002; Kelly a Trasler, 2004). Gen pro DNMT3b podléhá alternativnímu sestřihu, proto existuje více než 30 izoforem tohoto proteinu a některé z nich nemají enzymatickou aktivitu. Jejich exprese se odvíjí od stádia vývoje. Zatímco Dnmt3b1 převažuje v embryonální fázi, Dnmt3b3 byla prokázána i v somatických buňkách. Také v nádorových tkáních nacházíme specifické formy této metyltransferázy (Gujar et al., 2019). Kofaktor Dnmt3L rozeznává nemetylovaný histon H3K4 a zvyšuje enzymatickou aktivitu Dnmt3a/b, přičemž tetrapeptidová PWWP doména zodpovídá za jeho vazbu ke chromatinu (Chédin et al., 2002). Podobně jako Dnmt1, má také podrodina Dnmt3 řadu interakčních partnerů. Patří mezi ně mnohé transkripční represory, jako na příklad RP58, HP1 a Sin3a. Společně s Dnmt1 aktivují HDAC1 a tím opět přispívají k represi transkripce. V ojedinělých případech Dnmt3a zavádí metylcytosin i do CpA a CpT dinukleotidů. Byly též popsány choroby spojené s mutacemi v genech pro DNMT3. Příkladem zde uvádím imunodeficientní onemocnění ICF syndrom, asociované s celkovou genomovou nestabilitou (Gowher et al., 2005). V roce 2016 byl objeven nový gen pro metyltransferázu DNMT3c, který vznikl z duplikace genu DNMT3b. Enzym Dnmt3c metyluje de novo promotory evolučně mladých retrotranspozonů v mužské zárodečné linii. Fertilita a správný vývoj savců závisí také na jeho aktivitě (Barau et al., 2016; Jain et al., 2017).

2.1.2.3 DNA metyltransferáza 2 (Dnmt2) Dnmt2 je nejvíce konzervovanou cytosinovou metyltransferázou v eukaryotech. Tento enzym disponuje pouze C-katalytickou doménou (obr. 1), vykazující velmi slabou enzymatickou aktivitu vůči DNA, ovšem vysokou afinitu k RNA. Dnmt2 specificky metyluje tRNA (tRNA prok kyselinu asparagovou) a pravděpodobně kooperuje s dalšími RNA metyltransferázami (Goll et al., 2006; Rai et al., 2007). Předpokládá se, že podobně jako ostatní metyltransferázy má i Dnmt2 mnohé další biologické funkce a ovlivňuje stěžejní procesy včetně proliferace a imunitní odpovědi. V posledních letech také přibývá informací o důležité úloze Dnmt2 v senescenci a dlouhověkosti. Lewinska et al. (2018) zjistili, že myší fibroblasty s delecí v genu pro DNMT2 byly citlivější k oxidativnímu stresu a častěji vstupovaly do apoptózy. Dnmt2 se pravděpodobně podílí na

24 zpracování a ochraně molekul RNA před degradací během buněčného stresu (Thiagarajan et al., 2011). Existuje negativní korelace mezi biogenezí miRNA, podporujících proliferaci, a aktivitou Dnmt2, proto by se potenciálně manipulace s hladinami Dnmt2 mohla stát užitečným protirakovinným přístupem (Lewinska et al., 2018).

2.1.3 Metyl-CpG vázající proteiny Modifikovanou DNA rozpoznávají členové proteinových rodin MBD a KAISO (Bogdanović a Veenstra, 2009). Do skupiny MBD patří proteiny MeCP2 (methyl-CpG binding protein 2) a MBD1-4 (Methyl-CpG Binding Domain Protein 1-4), které se vyznačují typickou metyl-CpG vazebnou doménou (MBD) (Meehan et al., 1989). MBD1 obsahuje také tři motivy zinkového prstu CxxC, prostřednictvím kterých může vytvářet vazbu s nemetylovanou DNA (Fujita et al., 2000). Všechny proteiny z této rodiny preferují metylovaný stav s výjimkou MBD3, jehož MBD doména obsahuje inzerci, která mu znemožňuje rozpoznat metylovou skupinu (Bogdanović a Veenstra, 2009). Prvním popsaným členem byl MeCP2, jehož gen se nachází na lidském chromozomu X a mutace v tomto genu způsobuje neurovegetativní retardaci označenou jako Rettův syndrom. MeCP2 se váže pouze na metylované CG dinukleotidy a jeho TDR oblast je součástí represivního komplexu (Bogdanović a Veenstra, 2009; Nan et al., 1997). Doposud byly popsáni tři členové lidské proteinové rodiny KAISO: Kaiso, ZBTB4 a ZBTB38 (Zinc finger and BTB domain 4/38). Tyto transkripční regulátory sice neobsahují MBD doménu, ale prostřednictvím svých 3 zinkových prstů na C-konci rozeznávají metylovanou DNA (Kasiso pouze na motiv CGCG, ostatní i CpG) a společně s histondeacetylázami potlačují expresi některých cílových genů. Tyto proteiny jsou v literatuře označené jako transkripční faktory s dvojí specifitou, protože za určitých podmínek fungují také jako aktivátory. Navíc bývají často deregulovány v nádorové tkáni, což patrně souvisí s regulací Wnt signalizace (Filion et al., 2006).

2.2 Demetylace 5mC a jeho deriváty

Metylcytosin v DNA bývá odbouráván buď pasivně prostřednícím inhibice metyltransferáz, nebo v důsledku jejich snížené aktivity, ke které dochází během S fáze buněčného cyklu. Další možností je aktivní demetylace DNA pomocí rodiny enzymů TET (Ten-Eleven-Translocation

25 enzymes) (Guo et al., 2014). Dlouho se o existenci těchto enzymů nevědělo a mechanismus vzniku oxidativních derivátů cytosinu byl pouze hypotetický. Obě dráhy se vzájemně nevylučují a během replikace k nim dochází současně, avšak v pre-replikativní fázi probíhá pouze aktivní způsob (Wossidlo et al., 2011). Aktivní demetylace je reverzibilní vícestupňový proces, který zahrnuje několik meziproduktů (oxidované C5-methylcytosinové báze): 5-hydroxymetylcytosiny (5hmC), formylcytosiny (5fC) a 5-carboxylcytosiny (5caC). Za konverzi 5mC na 5hmC, 5fC a 5caC zodpovídají TET enzymy (TET1, TET2, TET3), které katalyzují přenos molekuly kyslíku na dusík metylcytosinu. Vysoká exprese TET genů byla zaznamenána v embryonálních buňkách, kdy také velice kolísá celková metylační hladina (Guo et al., 2014; Koh et al., 2011). Dnes 5-hydroxymetylcytosin spíše považujeme za stabilní šestou bázi DNA, hojně zastoupenou například v buňkách mozku (Kriaucionis a Heintz, 2009). Přítomnost 5hmC v promotorových oblastech stimuluje transkripci určitých genů, avšak některé studie naznačují, že stejně jako 5mC má i represivní charakter. Existence 5hmC v zesilovačích, 3 'UTR a intergenových oblastech ukazuje na jeho důležitou funkci v organizmu. Podílí se na alternativním sestřihu, diferenciaci, formuje nová vazebná místa na DNA a společně s histonovými modifikacemi remodeluje chromatin (Pastor et al., 2011; Rasmussen a Helin, 2016). Experimenty potvrzují roli 5hmC při tumorgenezi a metastazování. U agresivních nádorů se špatnou prognózou byla zjištěna ztráta funkce TET proteinů a snížená hladina této epigenetické značky (An et al., 2015). TET proteiny dále oxidují 5hmC na 5fC a reakce může pokračovat až na 5caC. Derivát 5caC v DNA živočichů přednostně rozpoznává terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT) nebo thymin-DNA glykosyláza (TDG), které modifikovanou bázi odstraní za vzniku abazického místa. Thymidin-DNA glykosyláza spojuje aktivní demetylaci a opravu DNA mechanismem bázové exicize (BER). O funkcích 5fC a 5caC máme stále málo informací, nejspíše ale snižují substrátovou specifitu a aktivitu RNA polymerázy II. Aktivní demetylace DNA probíhá především v embryonálním vývoji a v mozkové tkáni (Pastor et al., 2011; Song et al., 2011a; Tan a Shi, 2012). V neposlední řadě aktivní demetylace souvisí s tvorbou DSB a s aktivací proteinů, které se účastní opravy DNA. Globální metylace není daná pouze poměrem metylace a demetylace, ale za výslednou hladinu 5mC v DNA zodpovídá řada dalších regulačních molekul, včetně micro RNA (miRNA). Tyto krátké RNA velmi často cílí právě metyltransferázy a omezují jejich expresi. Například

26 miR-148a, miR-152 a miR-29b svým účinkem snižuje hladinu enzymu Dnmt1 v buňce (Garzon et al., 2009)

2.3 Metylace adeninu 6mA v DNA

Dlouho se přepokládalo, že se 6mA v DNA nachází pouze u nižších organizmů, avšak nové detekční přístupy s vyšší citlivostí (6mdA-IP-seq, SMRT-seq) odhalily tuto modifikaci i u vyšších eukaryot, včetně člověka. Distribuce této značky je velice proměnlivá a liší se druh od druhu. Nejvyšší úroveň metylace adeninu v DNA vykazují genomy hub (až 2,8%) a její hladina nepřímo úměrně koreluje se složitostí eukaryotických organizmů. U rostlin byla tato epigenetická modifikace prokázána také v mitochondriální a plastidové (amyloplasty) DNA (Ngernprasirtsiri et al., 1988; Vanyushin et al., 1988). I když není tato oblast podrobně prostudována, vše nasvědčuje tomu, že 6mA v DNA reguluje expresi genů, lokalizaci nukleozomů a embrygonezi (Parashar et al., 2018). Hypoteticky mají oblasti DNA bohaté na 6mA nižší stabilitu, což usnadňuje odvíjení a následně i přepis DNA. Avšak proces závisí na mnohých proteinech vysoce afinitních k této značce, které pak iniciují či umlčují transkripci, a proto 6mA nejspíše označuje jak transkripčně aktivní úseky na DNA, tak i oblasti chudé na geny. U vyšších eukaryot v průběhu vývoje dochází k výrazné změně v množství metylovaného adeninu v DNA. Nejvyšší hladina 6mA byla detekována v embryích, přičemž v diferenciovaných tkáních nastává její výrazný pokles. Mimo to její funkce závisí i na tkáňové specifitě daného organizmu. Například v myších embryonálních buňkách je distribuována v intergenových oblastech a kolem histonových variant H2A (H2A.X, H2A.Z), což naznačuje význam této modifikace při remodelaci chromatinu. Na druhou stranu bylo také zjištěno, že přítomnost 6mA v DNA navodí destabilizaci duplexu v daném lokusu, a to má za následek zvýšení transkripce některých genů překládaných RNA polymerázou II (Ji et al., 2018; Wang et al., 2017; Xiao et al., 2018). Co se lidského genomu týče, studie z roku 2018 uvádí, že v lidském genomu se nachází přibližně 881 000 metylovaných adeninů v poloze N6 (6mA). Dle bioinfromatických analýz je tato modifikace zastoupena především v kódujících oblastech, což by mohlo souviset s transkripční aktivitou těchto genů. Za metylaci N6 adeninu v DNA zodpovídá lidská metyltransferáza N6AMT, jejíž účinek inhibuje demetyláza ALKBH1 (Nucleic acid dioxygenase). Autoři téže práce také hledali souvislost mezi tumorgenezí a množstvím 6mA v DNA. Bylo prokázáno, že u nádorů nízká

27 hladina N6AMT koreluje s globálním poklesem metylace N6 adeninu na DNA. Potenciální inhibitory demetylázy ALKBH1 by se daly využít jako léčebné medikamenty (Ji et al., 2018; Xiao et al., 2018). Dále byla snížená hladina 6mA v DNA detekována u diabetických pacientů, což pravděpodobně souvisí s expresí genu FTO (fat mass and obesity-associated protein), jehož produkt působí jako demetyláza (Parashar et al., 2018). Začátkem roku 2019 vyšla práce, která pojednává o existenci nové modifikace N6hydroxymethyl-2'-deoxyadenosinu (hm6dA) v savčí DNA. Autoři zde zjistili, že metylová skupina z adeninu bývá odbourána, obdobně jako u cytosinu (5mC), pomocí TET proteinů. Na přeměně 6mA na h6mA se také podílí enzym ALKBH1 (Xiong et al., 2019).

2.4 Metylace RNA

Nukleové báze v RNA mohou být velice rozmanitě modifikovány, a to především v tRNA nebo rRNA. Pseudouridin, 5-metylcytidin (m5C), 1,2′-O-dimethylguanosine (m1Gm), 5- hydroxymetylcytidin (hm5C) 17, N4-acetylcytidine (ac4C), N6,2′-O-dimethyladenosine (m6Am), N 1-metyladenosin (m1A) a N 6 -metyladenosin (m6A) jsou příklady modifikací přítomných v molekulách RNA, ale identifikovaných jich bylo více než 160 (Wang a He, 2014). Databáze MODOMICS poskytuje veškeré známé informace o struktuře, chemických úpravách a biosyntetických drahách ribonukleových kyselin. Takzvaný epitranskriptom eukaryot je dnes velice intenzivně studován a ukazuje se, že modifikované mRNA a nekódující RNA hrají klíčovou roli při regulaci exprese genů (Machnicka et al., 2013). Dále se v rešerši budu věnovat m6A v RNA. Metoda MeRIP-Seq umožnila relativně dobré zmapování této modifikace v transkriptomu. m6A byla hojně nalezena v dlouhých exonech, sekvenčních motivech GAC nebo AAC, v 3 'UTR regulační oblasti mRNA a nedaleko stop kodonů, ale také na rRNA, tRNA a na více než 300 nekódujících RNA (Ji et al., 2018; Meyer et al., 2012). Metylaci N6 adeninu na RNA zprostředkovává komplex enzymů METLL3 a MTLL14 (N6- adenosine-methyltransferases). Hlavní enzymatickou aktivitou disponuje METTL3, naproti tomu METTL14 celý komplex stabilizuje a umožnňuje interakci s RNA. Katalytická funkce závisí také na WTAP proteinu (Pre-mRNA-splicing regulator) a dalších regulátorech (Bokar et al., 1997; Wang et al., 2016a; Wang et al., 2016b). Metylovaný adenin v RNA ovlivňuje v závislosti na podmínkách široké spektrum biologických funkcí na molekulární i fenotypové úrovni (Ji et al.,

2018). Kromě METTL3 má i METTL16 schopnost metylovat RNA, konkrétně se jedná o U6 snRNA, zapojenou do tvorby spliceozomu (Pendleton et al., 2017). Všechny tyto enzymy mohou přenášet metylovou skupinu z S-adenosyl-L-methioninu na 6N adenin v různých typech RNA. Modifikace koordinuje transport i translaci mRNA, mění její stabilitu a řídí alternativní sestřih. Funkce m6A v mRNA závisí na lokalizaci v genomu a na jejich vazebných partnerech (čtenáři). Účinnost translace determinují zejména cytoplazmatické proteiny, vázající se na m6A RNA. Zatímco interakce metylované mRNA s YTHDF2 (YTH domain-containing family protein 2) podporuje její rozklad, YTHDF1 (YTH domain-containing family protein 1) naopak stimuluje překlad mRNA tím, že kooperuje s iniciačním faktorem eIF3. Jejich homolog YTHDF3 interaguje jak s YTHDF1, tak i s YTHDF2, a proto také hraje důležitou roli při regulaci translace (Hong, 2018; Pan et al., 2018). Ve stresových podmínkách může YTHDF2 navázaný na m6A mRNA stimulovat translaci nezávislou na CAP (Meyer et al., 2015). Metylace adeninu na RNA podněcuje vazbu mnohých dalších proteinů, jako například jaderných inzulinových faktorů IGF2BP 1-3 (Insulin-like Growth Factor-2 mRNA-binding proteins), které stabilizují mRNA a zefektivňují její translaci (Huang et al., 2018a). Bylo též prokázané, že přítomnost m6A v pri-miRNA je nezbytná pro zahájení kanonické cesty biogeneze microRNA. Metyltransferáza METTL3 označí nematurovanou pri-miRNA, až poté ji rozpoznává člen mikroprocesorového komplexu DGCR8. Po vytvoření kompletního multiproteinového komplexu dochází ke štěpení pri-miRNA na pre-miRNA (Alarcon et al., 2015). I v dlouhých nekódujících RNA nacházíme velké množství metyladenosinu. Přítomnost m6A na lnc-XIST podporuje transkripční represi chromozomu X, tak zvanou inaktivaci chromosomu X v samičím genomu (Patil et al., 2016). Modifikace m6A RNA významně zasahuje do embryogeneze tím, že snižuje potenciál sebeobnovy a její hladina kolísá v průběhu diferenciace. Metabolizmus metylace RNA bývá často narušen u patologických poruch, jako například u vývojových retardací, diabetes mellitus 2. typu a u mnohých rakovin (Hong, 2018). V mRNA může N6 adenin vázat dva metylové zbytky za vzniku N6,2′O dimetyladenosinu (m6Am). Analýza transkriptomů ukázala, že m6Am podporuje translaci mRNA, což patrně souvisí s jeho výskytem v 5 ´ UTR oblasti v těsné blízkosti CAP 7-metylguanosinové čepičky (5'M 7GpppAm). Navíc cap- specifická adenosin metyltransferáza (CAPAM) zodpovídá za tuto modifikaci (Akichika et al., 2019). Metylový zbytek z 6-adeninu na RNA odstraňují enzymy ALKBH5 (RNA demethylase) a FTO. Deregulace těchto enzymů byla popsána u mnoha onemocnění (Ji et al., 2018).

2.5 Histonové modifikace a jejich funkční význam

Strukturu a funkci chromatinu regulují především posttranslační modifikace histonů (PTM) a komplexy remodelující chromatin. Histony jsou malé bazické bílkoviny s velkým obsahem aminokyselin Lysinu a Argininu (20-30%). Přítomnost –NH3+ skupiny těmto aminokyselinám uděluje kladný náboj, a proto mohou histony interagovat se záporně nabitou DNA za tvorby tzv. nukleozomu (Finch a Klug, 1976). Nukleozom je základní jednotka chromatinu, skládající se z histonového jádra ovinutého DNA o velikosti 146 párů bází. Čtyři typy histonů (H2A, H2B, H3 a H4) vytváří oktamer, na který se navíjí DNA. Úseky DNA spojující jednotlivé nukleozomy osidluje histon H1 (umístěn v tzv. linkerové oblasti). Kromě těchto hlavních typů rozlišujeme mnohé histonové varianty, např. CENP-A, H3.3, H2A.Z, macroH2A a další. Histony také podporují vazbu jiných proteinů k DNA a tím se aktivně podílí na remodelaci chromatinu a replikaci (Bradbury, 1978; Rothbart a Strahl, 2014). Tyto bílkoviny velmi ochotně podléhají různorodým chemickým modifikacím, které souhrnně nazýváme histonový kód. Ve většině případů specifické enzymy posttranslačně modifikují (PMT) volné –NH3+ na N´konci, ale v některých případech úpravám podléhají i C´konce a středové části histonu (Rothbart a Strahl, 2014). Velmi důležitou funkci má linkerový histon H1, který sám o sobě nese mnohé epigenetické značky a zároveň napomáhá metylaci DNA a histonu H3 (Yang et al., 2013). Posttranslační modifikace histonů hrají významnou roli při formování euchromatinu nebo heterochromatinu, a tak přímo korigují genovou expresi. Podle jejich účinku je můžeme rozdělit na stimulující nebo potlačující epigenetické znaky (Kouzarides, 2007). V závislosti na stádiu vývoje a umístění v genomu mohou některé PMT rozvolňovat nebo i kondenzovat chromatin. Například metylace H3K36 v kódující sekvenci značí transkripčně aktivní chromatin, naopak v promotoru navozuje represi daného genu (Vakoc et al., 2006). V poslední době se ukazuje, že histonové značky a enzymy za ně zodpovídající ovlivňují téměř všechny děje v buňce, včetně opravy DNA a onkogenze (Kim et al., 2019). Nejčastěji podléhá změnám lyzin, avšak epigenetické značky mohou nést i aminokyseliny jako je serin, theronin, tyrosin a histidin. Přehled základních modifikací histonů a jejich projevů shrnuje tabulka 1.

Obrázek 3: Schéma modifikací histonových aminokyselin. Nejčastěji podléhá modifikaci aminokyselina lysin (K), dochází zde k acetylaci, metylaci, ubikvitinaci, sumoylaci, ADP-ribosylaci, formylaci, propionylaci, butyrylaci, malonylaci, krotonylaci, sukcinylaci, glutarylaci, hydroxy-izobutyrylaci a β-hydroxybutyrylaci , Na arginin (R) byly prokázány: acetylace, citrulinace, metylace, na threoninu (T): fosforylace, acetylace, glykosylace, na tyrosin (Y): fosforylace, acetylace, hydroxylace, na serinu (S): fosforylace, acetylace, glykosylace, na histidinu (H): fosforylace. Převzato a upraveno (Carlberg a Molnár, 2018)

2.5.1 Acetylace histonů První kovalentní modifikaci histonů popsal již v roce 1964 Allfrey a jeho tým, kteří acetylaci spojily s transkripcí (Wang et al., 1998). Histon acetyltransferázy (HAT) přenášejí acetylovou skupinu z acetylkoenzymu A na epsilon-aminoskupinu konzervovaných lyzinů, a tím neutralizují kladný náboj bílkoviny (Kouzarides, 2007; Kuo et al., 1998). Následkem toho dochází

31 k rozvolnění chromatinu, DNA se stává přístupnější pro transkripční faktory a řadu dalších proteinů (Brownell et al., 1996). HAT enzymy nacházíme jak v cytoplazmě (HAT1), tak i v buněčném jádře (p300/CBP). Jaderné HAT charakterizuje přítomnost bromodomény a schopnost acetylovat také jaderné proteiny nehistonové povahy (Sterner a Berger, 2000). Cytoplazmatické HAT neobsahují bromodoménu a acetylují nově syntetizované histony před tím, než vstoupí do jádra (Roth et al., 2001). Nejvíce acetylovaných reziduí nesou lysiny histonu H3 (např. K9, K14, K27, K56) a lysiny histonu H4 (např. K8, K12, K16, K20). Enzymy, které omezují působení HAT, označujeme jako deacetylázy (HDAC). Deacetylační procesy většinou podporují heterochromatizaci a aktivují histon metyltransferázy (HMT). Existuje mnoho typů HDAC. Některé z nich jsou výhradně lokalizovány v cytoplazmě nebo v jádře, zatímco jiné mají tendenci opakovaně migrovat přes jaderné póry. Kromě toho, že odstraňují acetylovou skupinu z histonů, interagují hojně s dalšími proteiny, včetně transkripčních faktorů (TF). Vytvářejí velké multiproteinové komplexy remodelující chromatin (Choudhary et al., 2009).

2.5.2 Metylace histonů a její funkční význam Metylace histonů má za následek jak aktivaci, tak i represi transkripce. Záleží na pozici, kde k metylaci dochází, a na okolních interakčních partnerech (Kouzarides, 2007; Santoro a Grummt, 2005). Navíc malá molekulová hmotnost metylové skupiny nezpůsobí změnu kladného náboje, ale spíše vytvoří nové vazebné místo pro regulační proteiny. Na rozdíl od acetylace, metylaci podléhá také arginin. PRMT1 a CARM patří mezi argininové metyltransferázy, které stimulují transkripci. Na druhou stranu PRMT5 je asociována s neaktivním chromatinem (Fabbrizio et al., 2002). Častěji však lysinové metyltransferázy (KMT) přenášejí -CH3- skupinu z SAM na lysin, který může obsahovat až tři metylové zbytky. Tyto úpravy úzce souvisí s transkripční aktivitou. Rozvolněný euchromatin charakterizují metylace H3K4me3, zatímco kondenzovaný heterochromatin se vyznačuje metylací H3K9 (ve formě mono-, di-, nebo trimetylace; me1, me2 a me3) a H3K27me3. Poslední zmíněná je stejně jako H4K20me1 typická pro inaktivní chromozom X (Kohlmaier et al., 2004; Kouzarides, 2007). Histonové metyltransferázy vykazují vysokou substrátovou specifitu vůči konkrétní aminokyselině a histonu (PRMT1) (Kouzarides, 2007), ale některé mají schopnost metylovat více substrátů a také participují v jiných buněčných procesech. K takovým enzymům náleží i metyltransferáza Suv39h1 (Suppressor of Variegation 3–9 Homologue 1), která hraje důležitou

32 roli v buněčném cyklu, diferenciaci, při opravě DNA a VDJ rekombinaci. Metyltransferáza Suv39h1 zodpovídá za trimetylaci histonu H3 v pozici lysinu 9 (H3K9me3) a společně s proteiny rodiny HP1 vytváří pericentromerický heterochromatin. Enzym se skládá z vazebné chromo domény na N-konci a SET katalytické domény na C-konci (obr. 4) (Melcher et al., 2000).

Obrázek 4: Struktura metyltransferázy Suv39h1. Velikost proteinu 412 AK, molekulová hmotnost 47 kDa, N-koncová chromo doména obsahuje vazebné míso pro heterochmatinový protein (HP) a mnohé další proteiny, plní funkci regulační. C-koncová doména (SET) zodpovědná za enzymatickou aktivitu (H3K9me3). Převzato a upraveno (Melcher et al., 2000)

KMT mají obecně velice konzervovanou SET doménu, podle které se dále dělí do podskupin (Suv39, Ezh2, Set1, Set2, PRDM a SMYD). Katalytická aktivita Suv39h1 není omezena pouze na histon H3, podmiňuje také metylaci lysinu 20 histonu H4 (Svobodva Kovarikova et al., 2018). V in vitro podmínkách slabě modifikuje i histon H1. Tato metyltransferáza interaguje přibližně se 40 proteiny, a proto má nezbytný význam pro správný vývoj. To potvrzuje i její velice konzervovaná sekvence genu, vyskytující se napříč genomy organizmů (Rao et al., 2017). K trimetylaci H3K9 také přispívá metyltransferáza Suv39h2, která má vyšší aktivitu v embryonálním vývoji, především ve varlatech (O'Carroll et al., 2000). Experimenty na myších modelech prokázaly, že jedinci s úplnou delecí v genech pro SUV39H1H/2 byli menšího vzrůstu a často trpěli nádory. Ztráta těchto genů indukovala celkovou genomovou nestabilitu, což může souviset se zhoršenou schopností segregace chromozomů v mitóze (Peters et al., 2001). Metyltranferáza Suv39h1 se podílí na řízení buněčného cyklu, protože během G1 fáze BC interaguje s Rb1 (Retinoblastoma-associated protein) a společně brání buňce v přechodu přes hlavní kontrolní bod. Děje se tak prostřednictvím represe genů pro cykliny, jejichž promotory nesou H3K9me3 (Rao et al., 2017). Tento enzym také potlačuje adipogenezi a myogenní diferenciaci stimulovanou MyoD (Tao et al., 2011; Zhang et al., 2014).

Metylová rezidua mohou být z lysinů histonů odstraněny dvěma skupinami demetyláz: aminooxidázová homologová lysinová demetyláza 1 (KDM1) a histon demetylázy, obsahující doménu JmjC. Například JHDM2A zodpovídá za H3K9 demetylaci, zatímco JHDM1 ruší H3K36 dimetylaci (Pedersen a Helin, 2010). Míra metylace histonů může být v organizmu také řízena pomocí epigenetických regulátorů molekul miRNA. Ty korigují hladiny histonových metyltransferáz vazbou na mRNA. Například miRNA-125b brání translaci mRNA pro Suv39h1(Fan et al., 2013).

Tabulka 1: Histonové modifikace jejich funkce v organizmu.

Substr. Modifikace Funkce Enzym Příklad histonu Reference AMK modifikace

Metylace Regulace genové Histon lysin H3K9me1/2/3, (Kouzarides, (mono, di, tri) exprese, oprava metyltransferázy H4K20me1/2/3, 2007; Romani et al., 2018; DNA, replikace, (HMT): Dot1,Ezh2, H3K4me3, Svobodova heterochromatizace, Suv39h1/2, H3K27me3 Kovarikova et onkogeneze, Suv4h20 al., 2018) diferenciace a vývoj, (Sueoka et al., 2018) závislost na drogách

(Choudhary et Acetylace Regulace genové Histon H3K9ac, H4K16ac, exprese, zánět, acetyltransferázy H3K56ac al., 2009; Sabari et al., 2017; remodelace (HAT): GNAT, Sueoka et al., chromatinu, MYST, CBP/p300 2018) onkogeneze Formylace Oxidativní stres, HAT H2BK116 (Jiang et al., zánět 2007) (Sueoka et al., 2018) Proprionylace Aktivita transkripce, HAT: CBP/p300, H4K8pro, H4K12pro, (Chen et al., karcinogeneze, GNAT, MYST H4K16pro, 2007; Liu et al., 2009; Sabari et metabolizmus, H3K23pro al., 2017) diferenciace Butyrylace Aktivace transkripce, HAT: CBP/p300 H4K5bu, H3K115bu, (Lu et al., 2018; Lyzin (K) spermatogeneze, H3K14bu,H4K12bu, Simithy et al., 2017) diferenciace, H2BK42bu, metabolizmus H2BK134bu Malonylace Regulace genové HAT: GNAT H2AK119mal, (Xie et al., exprese, H3K56mal, 2012) metabolizmus Krotonylace Aktivita transkripce, HAT: CBP/p300 H3K9cr, H3K18cr, (Lu et al., 2018; spermatogeneze, H3K23cr, H4K8cr, Sabari et al., 2017) stres, inaktivace X H4K12cr Sukcinylace Aktivace transkripce, HAT: CBP/p300 H3K56Succ, (Smestad et al., metabolizmus, DNA H4K31Succ 2018; Xie et al., 2012) opravy, onkogeneze Glutarylace Regulace genové HAT H2BK5glu, (Tan et al., exprese H2BK116glu, 2014) H2BK120glu

2- Hydroxy- Aktivita transkripce, HAT: CBP/p300 H4K8hib, H3K9bhb (Sabari et al., izobutyrylace + spermatogeneze, 2017) ketogeneze, β-hydroxybutyrylaca metabolizmus, oxidativní stres Ubikvitinace Regulace genové Ubikvitin ligázy: H2AK119ub, (Sueoka et al., exprese, oprava Bmi/Ring1A, H2AK15ub 2018) DNA, RNF8, RNF168 heterochromatizace Sumoylace Regulace genové SUMO1/3+ H4K12su, H2BK6su, (Dhall et al., exprese, oprava DNA UBC9,UBE2I H2AK126su, 2014), (Steinacher et H2A.Zsu al., 2019) ADP-ribosylace Regulace genové ADP-ribóza H2BK30ar, (Messner et al., exprese, oprava transferáza H3K27ar, H4K16ar 2010) DNA, replikace (MART), ADP- ribóza polymeráza (PARP) Metylace Regulace genové PRMT1, CARM, H4R3me2,H3R17me, (Fabbrizio et exprese, oprava DNA PRMT5 H2AR3me2, al., 2002; Prohaska et al., H4R3me2 2010; Slade et Arginin al., 2014; Song (R) Citrulinace Regulace genové PAD enzym H2AR3cit, H3R8cit, a Yu, 2019; exprese, imunita, H4R3cit, H1R54cit, Vadnais et al., embryogeneze H3R26cit 2018)

Fosforylace Mitóza, oxidativní Kináza: H3S10phos, (Britton et al., sters, aktivita MSK1/2,CKII H4S1phos, H3S28ph, 2013; Gagnon et al., 2015; transkripce, opravy Khan et al., DNA, apoptóza 2017; Moraes et al., 2015; Serin Prohaska et al., Acetylace BC, embryogeneze YopJ H3S10ac, H3S22ac, 2010; Singh a (S) H3S28ac, Gunjan, 2011; Zhang et al., Glykosylace Regulace genové O-GlcNAc H3S10glc, 2011) exprese, onkogeneze transferáza (OGT) H2BS112glcNAc

Fosforylace BC, meióza, oprava Kinázy: Mek1, H3T11ph, H3T3ph, (Fong et al., DNA Haspin H4T80ph 2012; Kniewel et al., 2017; Threonin Acetylace ? ? H3T3ac, H3T22ac, Millan- (T) Zambrano et al., Glykosylace Stabilita nukleazomu O-GlcNAc H3T32glc 2018; Moraes et transferáza al., 2015; Wang et al., 2010) Fosforylace Mitóza, oprava DNA, kináza JAK2 H3Y41ph, H3T45ph, (Brehove et al., apoptózu, H2AXT39ph 2015; Liu et al., 2016; Moraes et Tyrosin hematopoéza, H2AXY142ph al., 2015; Singh (Y) onkogenze a Gunjan, 2011) Acetylace ? ? H3Y41ac , H3Y54ac

Histidin Fosforylace Regulace genové kináza H4H18ph, H4H75ph (Kee et al., (H) exprese 2010; Prohaska et al., 2010)

2.6 Význam epigenetiky pro opravné mechanismy poškozené DNA

Každý den vzniká v důsledku endogenních (hydrolytické, oxidativní reakce) a exogenních (chemických, fyzikálních) vlivů 107 poškozených míst v sekvenci DNA. Takové množství mutací by vážně narušilo fyziologické procesy v organizmu, a proto každá buňka disponuje složitými mechanismy, které chyby opravují (Ciccia a Elledge, 2010). Již v průběhu replikace dochází k validaci genetické stability. Hlavní prokaryotická a eukaryotická DNA polymeráza (III a δ) disponuje 3’-5’ korektorskou aktivitu, díky které jsou schopny vyštěpit chybně zařazený nukleotid v nově rostoucím řetězci DNA (Fidalgo da Silva a Reha-Krantz, 2007). Ovšem to by samo o sobě nestačilo ke zdárnému vývoji jedince, a tak se u organizmů vyvinuly různě komplikované reparační dráhy, souhrnně označeny jako DDR (DNA Damage Response;). Systém DDR kontroluje strukturu chromozomu a odstraňuje jak spontánní, tak i indukované mutace. Bezprostředně po setkání s toxickým agens buňka zapíná tzv. kontrolní bod po poškození DNA (DDC), který vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu a k další signalizaci DDR (Ciccia a Elledge, 2010; Zhou a Elledge, 2000). Široké spektrum chemických (alkylační činidla) a fyzikálních (UV záření, gama záření) mutagenů vyvolává značné defekty v sekvenci nukleových kyselin. Podle míry účinku rozlišujeme opravy DNA bází a nukleotidů, jednořetězcových nebo dvouřetězcových zlomů. Přítomnost DNA léze navodí zástavu buněčného cyklu (Zhou a Elledge, 2000), reorganizaci chromatinu a naopak spouští transkripci potřebných genů, kódujících reparační faktory (Lebeaupin et al., 2017; Polo a Jackson, 2011; Zhou a Elledge, 2000). Selhání těchto mechanismů může mít pro organizmus až fatální následky, ovšem v ojedinělých případech poskytují změny v DNA danému jedinci evoluční výhodu, a proto jsou v populaci fixovány. Tyto události představují hlavní zdroj genetické variability a také stojí za zrodem nových druhů (Alberts, 1998).

2.6.1 Jednořetězcové zlomy (SSB) v DNA a jejich opravné mechanismy Nejčastějším typem poškození v savčích buňkách jsou jednořetězcové zlomy (SSB), ke kterým dochází s četností vyšší než 10 000 denně (Hossain et al., 2018). Jednořetězcové zlomy vznikají v důsledku narušení cukrfosfátové kostry DNA při oxidativním stresu, působením γ-záření nebo nepřímo jako meziprodukt při bázové excisní opravě (Demple a DeMott, 2002). Tento rychlý a efektivní proces zahrnuje několik kroků: detekci SSB, zpracování konců, vyplnění mezery a ligaci DNA. Navázání a aktivace polymerázy PARP1 (Poly(ADP-Ribose) Polymerase- 1) do místa zlomu spouští sled reakcí, které modifikují jednak jeho cílové proteiny, ale také sama sebe přidáním polyADP-ribózy (D'Amours et al., 1999). Po úplné ribosylaci pak PARP1 disociuje z DNA. Následně se do místa poškození váží protein XRCC1 (X-Ray Repair Cross-Complementing Protein 1), nukleázy APE1/2 (apurinic or apyrimidinic site lyase 1/2) a PNKP (Bifunctional polynucleotide phosphatase/kinase), zodpovídající za opracování volných konců ve směru 3'-5 ', a TDP2 (Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2), APTX (Aprataxin) ve směru 5′-3′. Resekce má za následek buď hydroxylaci obou konců (jednoduchý SSB), nebo utváří chemicky heterogenní struktury 3'-fosfát, 3'- fosfoglykolát, 5'-adenylát (AMP),5-aldehyd a 5-deoxyriboza fosfát (SSB s komplexními konci). Podle rozsahu vzniklé mezery rozlišujeme krátký (1nt) a dlouhý (2-15 nt) způsob opravy. Působením helikázy RECQ1, endonukleázy ERCC1-XPF a proteinu RPA (Replication protein A) se utváří mezera, determinující dlouhou cestu (Hossain et al., 2018; Woodrick et al., 2017). Výběr konkrétní dráhy však nezávisí pouze na míře poškození, ale také na jeho příčině. Tento krok reguluje proliferační faktor PCNA, který interaguje s APE2 a řídí jeho exonukleázovou aktivitu. V případě krátké dráhy je chybějící vlákno syntetizováno polymerázou β, zatímco dlouhá dráha využívá k zacelení mezery komplex polymeráz δ/ε. Terminační fáze ligace závisí na vazebných partnerech polymeráz. Spojení polymerázy β a proteinu XRCC1 podmiňuje navázání ligázy III, naproti tomu endonukleáza FEN1 (Flap Endonuclease 1) společně s PCNA podněcuje vazbu ligázy I. Ligace cukrfosfátové kostry a vyvázání všech opravných faktorů ukončuje opravu SSB. Někteří autoři považují kanonický způsob SSB opravy za specializovaný sekundární proces bázové excizní opravy (BER). Nedávné důkazy naznačují, že SSB mohou být také vyřešeny buď homologní rekombinací (HRR), nebo alternativní dráhou SSB, závislou jednak na APE2, ale

37 především na aktivaci ATR-Chk1. Alternativní způsob SSB buňka pravděpodobně využívá při silném poškození, avšak tento mechanismu není zatím zcela prostudován (Hossain et al., 2018). Nejsou-li tyto defekty včas opraveny, mohou přecházet v mnohem závažnější dvouřetězcové zlomy (DSB) (Snustad, 2017). DSB odvozené od SSB mají za následek přelomení chromozomů, což může vést k jejich translokaci a těžké nestabilitě genomu. (Bétermier et al., 2014; Hossain et al., 2018). DDR zahrnuje kaskádu reakcí, které společně kooperují tak, aby následky poškození byly co nejmenší.

Obrázek 5: Opravný mechanismus jednořetězcových zlomů (SSB). Více cest vzniku jednořetězcovýého zlomu: při odstranění abazického místa mechanismem bázové excisní opravy (neřízené), při přerušení cukrfosfátové kostry topoizomerázou Top I. (řízené). a) Rozpoznání místa zlomů nukleázou APE1 (neřízené) nebo polymerázou PARP. b) Opracování konců zlomu příslušnými enzymy. c) Vytvoření intermediátu a zaplnění mezery. Přítomnost proteinu APE2 a PCNA rozhoduje, zda oprava bude pokračovat krátkou, nebo dlouho cestou. Vazba dalších reparačních proteinů nutná pro následující krok konkrétní reparační dráhy. d) Ligace DNA a ukončení opravy: Krátká

39 reparační dráha (inzerce jednoho nukleotidu) využívá polymerázu β, faktor XRCC1 a ligázu III. Dlouhá reparační dráha je zakončena komplexem polymerázy Pol δ/ε, FEN1, PCNA a ligázy Lig I. Převzato a upraveno (Caldecott, 2003).

2.6.2 Dvouřetězcové zlomy a mechanismy jejich opravy Dvouřetězcové zlomy mohou být indukovány kyslíkovými radikály, uvolněnými z ionizujícího záření, nebo pokud replikovaná DNA obsahuje již některé jiné typy poškození. Existuje několik cest, které odstraňují tyto léze z DNA. Jedná se o homologní rekombinaci (HR), nehomologní spojování konců (cNHEJ) a alternativní spojování nehomolgních konců (aNHEJ), kombinující více mechanismů. Bylo zjištěno, že buňka preferuje spíše dráhu NHEJ, která je rychlejší, i když její korekce není tak přesná. Tento rozpor bývá obvykle vysvětlován tím, že včasná oprava udrží strukturní integritu chromatinu, což je pro mnohobuněčné organismy podstatnější, než zachování přesné sekvence DNA (Kinner et al., 2008). Ve většině případů opravu DSB zahajuje komplex MRN, (Mre11, RAD50 a NBS1) a kináza ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Tyto proteiny společně rozpoznávají místo zlomu v DNA a přispívají jednak k šíření signálu, ale také k udržení volných konců v těsné blízkosti (D'Amours a Jackson, 2002). Dvouřetězcové zlomy ovšem nepůsobí pouze patologicky, ale jsou nezbytnou součástí fyziologických procesů v buňce, jako například crossing-overu v meióze, V(D)J rekombinace při zrání lymfocytů, během přeměny pohlavního typu kvasinek, v průběhu apoptózy nebo při retrovirové integraci do hostitelského genomu (Jackson a Bartek, 2009; Polo a Jackson, 2011).

2.6.2.1 Opravy zlomů v DNA pomocí Homologní Rekombinace (HRR) Dráhu HRR buňka využívá pouze v pozdní S a v G2 fázi buněčného cyklu, protože vyžaduje přítomnost homologního templátu (většinou sesterská chromatida) (Moynahan a Jasin, 2010). Poté, co NBS1(Nibrin) aktivuje ATM kinázu, dochází k fosforylaci histonu H2AX (γH2AX). S touto histonovou variantou asociuje další mediátorový protein MDC1 (Mediator of DNA Damage Checkpoint Protein 1), který násobí činnost ATM a zároveň slouží jako lešení pro další reparační faktory. Funkce MDC1 závisí na jeho fosforylaci prostřednictvím kasein kinázy 2 (CK2) a kohezinový komplex udržuje uvolněné konce DNA ve stálé blízkosti sesterské chromatidy (Potts et al., 2006). Následně komplex MRN, společně s proteinem CtIP (CtBP- interacting protein), odstraní část 5´-konce vlákna DNA za vzniku jednořetězcového přesahu (Makharashvili a Paull, 2015; Zhou a Elledge, 2000). Tento stěžejní krok závisí na přítomnosti 40 proteinu BRCA1 (Breast Cancer 1), který slouží jako značka pro zahájení resekce. Mimo to BRCA1 interaguje s nukleázou CtIP a vyvazuje protein 53BP1, bránící v G1 fázi resekci. Na odbourání vlákna se podílí také enzymy DNA2 (DNA replication helicase/nuclease 2), Exo1 (exonuclease 1) ve spolupráci s BLM helikázou (Aparicio et al., 2016; Greenberg, 2008; Nimonkar et al., 2011). K jednořetězcovému přesahu DNA mají velkou afinitu molekuly RPA, rozmotávající sekundární struktury (dsDNA) (Chen et al., 2015). Ty rozeznává ústřední rekombináza RAD51, navozující vlastní výměnu řetězců DNA. Nejprve se však musí monomery proteinu RAD51 seskupit v nukleoproteinová vlákna kolem fosforylovaného proteinu RPA. Toto uspořádání, tzv. presynaptické filamentum, stabilizuje protein BRCA2 (Pellegrini et al., 2002). Jednořetězcová (ssDNA) DNA pokrytá rekombinázami RAD51 vyhledává homologní sekvence a poté, co narazí na sesterskou chromatidu, nastává samotná rekombinace. Meziproduktem je struktura zvaná D-smyčka, umožňující párování ssDNA s neporušeným odpovídajícím vláknem homologní chromatidy (Adimoolam et al., 2007). Následně se z triplexu formuje tak zvaný Holiday spoj (HJ) a po dosyntetizování chybějícího úseku polymerázou η podle odpovídajícího templátu spojí DNA ligáza I cukrfosfátovou kostru. DNA helikáza a resolváza rozštěpí HJ a tím je oprava DNA završena. Celý proces tvorby HJ regulují proteiny RAD51, RAD54, XRCC3, RECQ4 a RECQ5 helikázy (Bianco et al., 1998; Johnson a Jasin, 2000; Mazón et al., 2010).

2.6.2.2 Nehomologní spojování konců (NHEJ) Opravný mechanismus NHEJ probíhá v každé fázi buněčného cyklu a můžeme ho rozdělit na několik subtypů. Klasický průběh zobrazuje obr. 6A. Během několika sekund heterodimer Ku70/80 (ATP-dependent DNA helicase 2 subunit) označí volné konce dvojřetězcového zlomu a po navázání proteinu 53BP1 společně iniciují spojení mezi podjednotkou DNA-dependentní proteinkinázy (DNA-PKc) a DNA, což vede k její aktivaci (Gottlieb a Jackson, 1993; Lieber, 2008). Protein 53BP1 hraje klíčovou úlohu při výběru reparační dráhy, protože antagonizuje působení BRCA1 při DNA resekci, nezbytné pro HRR, ne však pro NHEJ mechanismus opravy DNA. Protein RIF1 (Telomere-associated protein) rozeznává kinázou ATM fosforylovaný 53BP a poté se komplex může navázat do DSB (Drane et al., 2017). Kromě toho protein 53BP1 interaguje s dalšími faktory zapojenými do NHEJ a umocňuje aktivitu samotné ATM kinázy, pozastavující buněčný cyklus (Mochan et al., 2004; Ward et al., 2003). Heterodimer Ku70/80

41 stimuluje k vazbě na DNA další dvě molekuly DNA-PKc, a tím se utvoří most mezi oběma narušenými vlákny DNA. Holoenzym DNA-PKc fosforylovaný ATM rozpoznává a aktivuje cílové substráty Ku70/80, XRCC4, XLF a exonukleázu Artemis. Kromě toho DNA-PKc má schopnost autofosforylace (Hartlerode a Scully, 2009; Jiang et al., 2015; Yaneva et al., 1997). Následně dochází k enzymatickému zpracovávání obou konců nukleázou Artemis, polynukleotidovou kinázou PNKP a faktorem APLF (Aprataxin and Polynucleotide Kinase-like Factor). Vzniklé mezery v DNA zacelí enzymy z rodiny DNA polymeráz X (Pol λ a Pol μ) a opravená vlákna spojí komplex X4-L4, obsahující XRCC4, DNA ligázu IV, XLF a PAXX (Grawunder et al., 1997; Xing et al., 2015). Kanonický NHEJ opravný mechanismus (cNHEJ) občas doprovází drobné inzerce nebo delece bází v novém řetězci (Bétermier et al., 2014). Multifunkční protein WRN (Werner syndrome ATP-dependent helicase) interaguje s mnohými faktory cNHEJ a pravděpodobně upřednostňuje výběr klasické cesty nad alternativním způsobem opravy (aNHEJ) (Shamanna et al., 2016).

2.6.2.3 Alternativní dráha Nehomologního spojování konců (aNHEJ) Alternativní cesta, tzv. mikrohomologiemi řízené spojování konců, může být spuštěna také v průběhu celého buněčného cyklu, ale častěji ji buňka preferuje v S/G2 fázi. Rozlišuje dvě varianty nekanonické dráhy B-NHEJ a MMEJ, jejichž aktivace nezávisí na základních opravných faktorech cNHEJ (Ku70/80). Oba typy v sobě sdružují prvky cNHEJ i HRR, ale v porovnání s klasickým způsobem NHEJ jsou složitější a pomalejší (Bétermier et al., 2014; Hartlerode a Scully, 2009). V případě B-NHEJ nejprve protein PARP označí místo DSB a poté pokračují oba mechanismy podobně jako u HRR resekcí konců nukleázou MRE a CtIP + BRAC1. Po resekci přečnívající úseky podléhají dalšímu opracovaní nukleázou FEN1, exonukleázou Exo1 a v případě B-NHEJ enzymem WRN (Gelot et al., 2015). Výsledné komplementární přesahy o délce 2-20 pb dále slouží jako templát (primer) pro nasednutí DNA polymerázy θ, jejíž helikázová aktivita mimo jiné brání zahájení HRR (Mateos-Gomez et al., 2017). Důležitou roli zde sehrává histon H1, který jednak přemostí řetězce a zároveň stimuluje funkci PARP1 i ligázy III. Dráhu ukončuje XRCC1, ligáza I a III (Rosidi et al., 2008). aNHEJ utváří rozsáhlejší delece, občasně inzerce nebo translokace, a tím zvyšuje celkovou genomovou nestabilitu. Vše nasvědčuje tomu, že se tyto

42 mechanismy v organizmu uplatňují tehdy, když správně nefungují klasické reparační dráhy (cNHEJ a HRR) (Bétermier et al., 2014).

B C

Obrázek 6: Opravné mechanismy dvouřetězcových zlomů (DSB). A) Kanonický způsob opravy nehomologním spojováním konců cNHEJ. A1) Vzniklý dvouřetězcový zlom rozpoznává heterodimer Ku70/80 a proteiny 53BP1 a RIF1. A2) Vazba katalytických podjednotek DNA-dependentní proteinkinázy DNA-PKc, opracování volných konců nukleázou Artemis a navázání DNA polymerázy. A3) Spojení konců zlomu pomocí enzymů XLF, XRCC4 a ligázy Lig IV. A4) Ukončení opravy dvouřetězcového zlomu. B) Alternativní cesta opravy nehomologním spojováním konců aNHEJ. B1) Vzniklý DSB označí molekuly PARP1. B2) Vazba MRN a opracování konců CtIP. B3) Dvě možnosti syntézy chybějícího úseku. B4) Zacelení mezery ligázou I nebo III a ukončení opravy DSB. C) Mechanismus opravy homologní rekombinací HRR. C1) Vznik dvouřetězcového zlomu a vazba komplexu MRN. C2) Opracování konců zlomu proteinovým komplexem CtIP, Exo1,WRN a dalšími. C3) Pokrytí jednořetězcových přesahů DNA molekulami RPA proteinu a vazba proteinů BRCA1, BRCA2, RAD51.

Vznik presynaptického filamenta. Vytvoření D-smyčky na dsDNA, syntéza chybějícího úseku DNA, spojení cukrfosfátové kostry a rozštěpení intermediátu. C4) Ukončení opravy DSB. Převzato a upraveno z Gelot 2015 (Gelot et al., 2015)

2.6.3 Nukleotidové excizní opravy (NER) DNA léze navozené UV zářením se přednostně odstraňují nukleotidovou excizní opravou. Tato reparační dráha velice účinně zbavuje DNA cyklobutan-pyrimidinových dimerů (CPD) a (6- 4) fotoproduktů (Schärer, 2013). Zmíněné defekty pozměňují standardní párování bází v DNA, což vede k prostorové reorganizaci a destabilizaci sekundární strukturu nukleové kyseliny (Hess et al., 1997; Yeo et al., 2012). Rozlišujeme dva podtypy, které se liší svou iniciací a načasováním v buňce. Globální genomová NER (Global Genome NER; GG-NER) funguje kdekoliv v genomu, zatímco NER spřaženou s transkripcí (TC-NER) determinuje elongační aktivita (Schärer, 2013). První fázi u GC-NER řídí proteinový komplex složený z XPC (Xeroderma Pigmentosum, Complementation Group C), RAD23B a centrinu 2 (Centrin 2; CETN2) (Masutani et al., 1994). Tento celek prozkoumává genom a v případě, že narazí na chybnou sekvenci, naváže se k DNA společně s proteinem DDB1/DDB2 (Damage DNA Binding Protein). Poté co RAD23B opustí komplex, k DNA přistupují další faktory opravy (Keeney et al., 1994; Schärer, 2013). Naproti tomu TC-NER využívá k zahájení RNA polymerázu II, která má schopnost přechodně interagovat s proteiny UVSSA (UV-Stimulated Scaffold Protein A), USP7 (Ubikvitin-Specific-Processing Protease 7) a CSB (Cockayne Syndrome B factor), což také omezí její pohyb (Fousteri et al., 2006). Interakční partneři CSA a CSB způsobí posun RNA pol II o pár nukleotidů proti směru transkripce. To zpřístupní místo defektu vlastním reparačním proteinům. Další kroky mají obě dráhy společné. Po navázání helikázy XPB a XPD k bazálnímu transkripčnímu faktoru TFIIH, dojde k rozmotání dsDNA a k formování útvaru podobnému bublině. Ten stabilizují XPA a RPA (Schärer, 2013). Molekuly RPA k sobě přitahují endonukleázu XPF-ERCC1 (Xeroderma Pigmentosum, Complementation Group F – Excision Repair, Cross Complementation Group 1) štěpící 5´-konec poškozeného řetězce. Na druhé straně 3´-konec vlákna upravuje endonukleáza XPG (O'Donovan et al., 1994). Vzniklou mezeru 24-32 bp zacelí soubor replikačních proteinů Pol δ/ε, PCNA, RFC a DNA ligázy I nebo DNA ligázy III (Schärer, 2013).

Obrázek 7: Nukleotidové excizní opravy. 1) Vznik aduktu. 2) Rozpoznání poškození a navázání faktorů, které umožňují opravu DNA. V případě GG-NER: XPC, RAD23B, centrinem 2 a DDB1/DDB2, v případě TC-NER: RNA polymerázou II, CSA, CSB a UVSSA. Další krok je pro oba mechanismy stejný. 3) Vazba transkripčního faktoru TFIIH, molekul replikačního proteinu RPA, helikáz XPB, XPD a endonukleázy XPG. 4) Vytvoření zlomu na 5´-konci poškozeného vlákna endonukleázou XPF-ERCC1 a na 3´-konci pomocí endonukleázy XPG, vznik mezery přibližně o délce 22–30 nukleotidů. 7) Syntéza chybějícího úseku polymerázami a spojení cukrfosfátové kostry DNA ligázou. Převzato z (Fousteri a Mullenders, 2008)

2.6.4 Epigenetické modifikace zapojené do opravy poškozené DNA O tom, že epigenetické děje významně zasahují do reparačních drah, svědčí fakt, že v posledních letech přibývá výzkumných prací zabývajících se touto problematikou. Ačkoliv k regulaci dochází na všech epigenetických úrovních (miRNA, lncRNA), v této kapitole se zaměřím na změny v modifikacích DNA, RNA a především v histonech, vyvolané genotoxickým stresem. Enzymy modifikující histony, ale i proteiny remodelující chromatin, jsou nutné pro zdárný průběh DDR (O'Hagan, 2014). Některé epigenetické úpravy charakterizují specifický reparační mechanismus, zatímco jiné participují ve více opravných drahách a jejich funkce se vzájemně doplňují. Spolupráce všech opravných faktorů vytváří účinnou a kompaktní odpověď na vzniklé poškození, čímž se udržuje buněčná integrita. Na obnovení původního stavu se podílí celá řada epigenetických modifikací, vybrané jsou uvedeny v tabulce 2.

2.6.4.1 Histonové modifikace důležité pro opravu dvouřetězcových zlomů (DSB) Jednou z nejdůležitějších a nejznámějších histonových značek je již výše zmíněná fosforylace serinu 139 histonové varianty H2AX, označena jako γ-H2AX. K této události dochází velice brzy po vytvoření DSB, a proto γ-H2AX považujeme za včasný marker DDR. Fosforylaci serinu iniciují aktivované kinázy ATM u mechanismu HRR, případně DNA-PKc u dráhy cNHEJ. Aby mohla tato situace nastat, musí nejprve dojít k defosforylaci tyrosinu 142 na histonu H2AX (Y142) (Brown et al., 2012; Kinner et al., 2008). Po úspěšné opravě fosfatázy PP4, PP2A a WIP1(wild-type p53-induced phosphatase 1) odstraní fosfátovou skupinu ze serinu 139 a nastává klidový stav. Fosforylace γ-H2AX má při opravě DSB několik zásadních funkcí: usnadňuje rozvolnění chromatinu, navádí a zejména udržuje reparační faktory v oblasti zlomu. Fosforylovaný protein MDC1 zesiluje aktivitu dalších molekul ATM a to způsobí obousměrné šíření γ-H2AX do vzdálenosti až 1 Mb od místa vzniku (Kinner et al., 2008; Van a Santos, 2018). S proteinem MDC1 po poškození interagují histon-glykosil-N-metyltransferázy 1/2 (EHMT1, EHMT2), které umožnují akumulaci dalších faktorů DDR, např. 53BP1 a RAP80 do oblasti zlomu (Watanabe et al., 2018). Po započetí dráhy NHEJ dochází k metylaci histonů H3 a H4 a následné lokalizaci proteinu 53BP1 do léze v DNA. Prostřednictvím své Tudor domény 53BP1 interaguje s H3K79me2

46 a H4K20me2, což způsobuje tvorbu reparačních ohnisek (Botuyan et al., 2006; Huyen et al., 2004). Tento proces koordinuje ubikvitinace histonu H2A v pozici lysinu 15 (H2AK15ub), kterou po poškození genomu zprostředkovává ubikvitin ligáza RNF168 (E3 ubiquitin-protein ligase). Zvýšení hladiny RNF168 v DSB a funkce této ligázy závisí nejen na proteinu MDC1, ale také na interakčních partnerech ubikvitin ligázách RNF8 a RNF126. RNF8 podporuje vazbu mezi H2AK15ub a UDR motivem proteinu 53BP1, naopak RNF126 tomuto spojení brání (Lee et al., 2018). Mimo jiné i RNF126, stejně jako RNF8 a RNF168, se kumuluje do oblastí lokálně ozářených UVA laserem (Zhang et al., 2018). H2AK15 může být acetylován pomocí Tip60 (histone acetyltransferase KAT5), což také inhibuje jeho ubikvitinaci, naopak H2AK15 ubikvitinace inhibuje funkci acetyltransferázy. Tip60 zejména acetyluje H4 (H4K16ac), který negativně reguluje tvorbu reparačních ohnisek proteinu 53BP1, protože naruší jeho vazbu s H4K20me2. Zároveň podporuje navázání opravných faktorů, účastnících se výhradně HHR (Jacquet et al., 2016; Tang et al., 2013). Někteří autoři se domnívají, že Tip60 funguje jako klíčový regulátor při výběru reparační dráhy DSB (Jacquet et al., 2016). Toto tvrzení podporuje studie z roku 2018, která uvádí, že fosforylace Tip60 na serinu 86 a 90 brání retenci proteinu 53BP1 do DSB, čímž také tato acetyltransferáza stimuluje mechanismus HRR (Li et al., 2019). Tip60 může dále acetylovat i histon H3 nebo H2AX, a tím podporovat remodelaci chromatinu a usnadnit opravu heterochromatických úseků. Acetyltransferáza mimo jiné interaguje i s histonovou modifikací H3K9me3 a předpokládá se, že k této události dochází na počátku opravných mechanismů rozpoznávajících DSB. Ztráta nebo snížení hladiny H3K9me3 koreluje s nižší kinázovou aktivitou acetyltransferázy Tip60 a s narušením signální funkce ATM kinázy (Jacquet et al., 2016; Sun et al., 2010). Po zahájení vlastní opravy musí být pravděpodobně trimetylace odstraněna, aby se DNA zpřístupnila reparačním faktorům. Autoři Ayrapetov et al. (2014) popsali, že lysin-specifická metyltransferáza (KMT) Suv39h1 (zodpovědná za H3K9me3) se vyskytuje velice brzy v dvouřetězcových zlomech, přispívá k aktivaci ATM kinázy a účastní se opravy heterochromatinu. Enzymy Suv39h1/Suv39h2 v malé míře také metylují histon H2A.X na lysinu 134 v blízkosti DSB, čímž usnadňují fosforylaci serinu 139 na histonu H2A.X (γH2A.X) (Ayrapetov et al., 2014; Sone et al., 2014). V prvotní fázi procesu NHEJ vzrůstá také dimetylace H3K36, která stimuluje tento mechanismus prostřednictvím vazby s proteiny NBS1 a heterodimerem Ku70/80 (Fnu et al.,

2011). Velice důležitou modifikací pro DDR proces je H3K36me3. Trimetylaci H3K36 rozpoznávají proteiny opravné dráhy NHEJ, včetně Ku70/80 a PHF1 (Musselman et al., 2013). Kromě toho H3K36me3 zprostředkovává i resekci při HRR a účastní se MMR (Skucha et al., 2019). Iniciaci obou reparačních drah (HRR i NHEJ), indukovaných ionizujícím zářením, podmiňuje přítomnost acetyltransferázy MOF. MOF zprostředkovává H4K16ac, nutnou pro aktivaci ATM (Sharma et al., 2010). Nedávno bylo prokázáno, že i další ubikvitin ligázy sehrávají důležitou roli jak při HRR, tak v NHEJ. RNF20/RNF40 zodpovídá za H2K120Bub, která se nachází v oblastech DBS a pravděpodobně spouští další kroky signalizace DDR (So et al., 2019). V poslední době se ukazuje, že zdárný průběh HRR závisí na metylaci histonu H3K79 (především H3K79me3), zprostředkovanou metyltransferázou Dot1L. Buňky s potlačenou expresí nebo s delecí v genu DOT1L, vykazovaly zhoršenou reakci na poškození DNA, což také korelovalo se snížením fosforylace H2AX. Na druhou stranu inhibice a delece DOT1L zvýšila citlivost ke γ-záření a chemoterapeutickým látkám, doprovázenou globálně sníženou schopností opravy DSB (Kari et al., 2019). V průběhu homologní rekombinace proteiny BARD1 a BRCA1 vyžadují pro svou retenci do DSB také dimetylaci H3K9 (Wu et al., 2015). S dráhou cNHEJ úzce souvisí také monometylace H4K20, protože tento metylační stav rozeznává metyltransferáza Suv4-20, zodpovědná za H4K20me2 a H4K20me3 (Tuzon et al., 2014). V naší práci jsme ukázali, že i trimetylace H4K20 patří do dráhy NHEJ (Svobodova Kovarikova et al., 2018). Tyto opravné mašinérie navodí represi genů spojených s progresí buněčného cyklu. To doprovází defosforylace threoninu 11 (H3-T11), mírná deacetylace H3K9 a změny v acetylačním stavu H3K56 (Shimada a Nakanishi, 2008). Při korekci DSB probíhá jak acetylace, tak i deacetylace H3K56, přičemž obnovení původní hladiny iniciuje návrat do buněčného cyklu a jeho progresi (Sharma a Hendzel, 2019). Buněčný cyklus během reparace koordinuje fosforylace threoninu 8 (H4T8ph) inaktivací kontrolního bodu (Millan-Zambrano et al., 2018).

2.6.4.2 Ostatní histonové změny doprovázející opravy poškozené DNA Již dříve zmiňovaná varianta histonu H2AX podléhá dalším četným modifikacím. Kromě fosforylace serinu 139 vyvolává ionizující záření i fosforylaci treoninu 101 (T101), ale také

48 acetylaci v lysinu 5 (H2AXK5ac) a lysinu 36 (H2AXK36ac) (Jiang et al., 2010). Enzym RNF168 navíc ubikvitinuje i lysin 27 na histonu H2A (H2AK27ub) a BMI1 katalyzuje monoubikvitinaci 119 histonů H2A a H2AX (H2AXK119ub). Tyto ubikvitinační události na histonech H2A/H2AX vedou k retenci 53BP1 a BRCA1 do léze v DNA. Přítomnost DSB doprovází i rychlá fosforylace histonu H2B. Bylo prokázáno, že fosforylovaný serin 14 (S14) histonu H2B utváří ohniska navozená ionizujícím zářením (IRIF). V případě neúspěšné opravy poškozené DNA však bývá tato epigenetická značka spojována spíše s apoptózou. Fosforylace serinu 1 histonu H4 může usnadnit opětovné spojení DNA, monoubikvitinovaný histon H4 na lysinu 91 pak přispívá k odpovědí genomu na poškození (Van a Santos, 2018)

2.6.4.3 Změny v histonovém kódu doprovázející excizní opravy Počáteční fáze nukleotidové excizní dráhy (GC-NER) zahrnuje několik epigenetických faktorů, včetně CUL4A/B UV-DDB-ubikvitin ligázy. Tento multimerní komplex rozpoznává v DNA lézi proteinové senzory DDB1/2 a XPC, které využívá jako svůj substrát. Polyubikvitinace stabilizuje XPC a zvyšuje jeho afinitu k poškozené DNA, zatímco autoubikvitinace DDB1/2 jeho afinitu redukuje, což nakonec vede k jejich degradaci (Fei et al., 2011; Sugasawa et al., 2005). Během GC-NER také dochází k monoubikvitinaci lysinu 119 histonu H2A komplexem UV–DDB–CUL4A/B, přičemž enzymatickou aktivitu vykazuje E3 ligáza RING1B (Gracheva et al., 2016). Jelikož CSA, faktor nezbytný pro TC-NER, sdílí určitou sekvenční homologii s DDB2, může se také navázat na CUL4A. Přesná funkce CUL4A v TC-NER však není zcela objasněna (Hannah a Zhou, 2013). CPD dimery vyvolávají kromě ubikvitinace změny v metylaci a acetylaci histonů. Dot1 histon metyltransferáza, potřebná pro metylaci histonu H3 lysinu 79 (H3K79), aktivuje kontrolní body při GC-NER v reakci na poškození DNA, ale nehraje žádnou úlohu v TC-NER. Trimetylace H3K79, ale také mono a dimetylace H3K79, podporují dráhu GC-NER (Tatum a Li, 2011). Na začátku opravných procesů se acetylační značky H3K56ac a H3K9ac kolem léze v DNA redukují, avšak postupem času se znovu obnovují. Rychlá deacetylace H3K56ac, navozená HDAC1 a HDAC2, je jedním z časných kroků NER (Zhu et al., 2015). Dále bylo pozorováno, že izoformy proteinu HP1 mohou být patrně zapojeny do nukleotidové i bázové excizní opravy (Luijsterburg et al., 2009; Stixová et al., 2014). V rámci těchto dějů například CK2 kináza fosforyluje chromodoménu proteinu HP1, což má za následek

49 uvolnění HP1 z komplexu s H3K9me3. Izomorfa HP1β se pak akumuluje v DNA lézích, indukovaných pouze UVA zářením o vlnové délce okolo 355nm, pro které je typický vznik cyklobutan pyrimidinových dimerů (CPD). V defektní DNA se pak protein HP1 nachází jak v euchromatinu, tak i v heterochromatinu, a funkce variant HP1 nezávisí na H3K9me3 (Zarebski et al., 2009). Z UVA ozářených oblastí chromatinu mizí H3K9 acetylace, což doprovází nárůst hladiny enzymu HDAC1 (Bártová et al., 2011). Na druhou stranu acetylace histonu H4 (H4K16, H4K12, H4K8 a H4K5) vzrůstá po UVC záření, což zefektivňuje odstranění CPD (Martínez- López et al., 2018). Zdárná nukleotidová excize vyžaduje přítomnost translační (TLS) DNA-polymerázy z rodiny Y Pol κ. Xiang et al. (2017) uvádí, že mechanismus DDR indukovaný UV zářením závisí na metylaci RNA, konkrétně na přítomnosti m6A RNA. Tato modifikace, která se okamžitě akumuluje v UVA lézi, je patrně nezbytná pro správnou funkci Pol κ (Xiang et al., 2017). Bylo též zjištěno, že aktivní demetylace DNA úzce souvisí s excizními opravami BER a nekanonickým MMR. Produkty demetylace cytosinu 5fC a 5caC odstraňuje enzym thymidin- DNA glykosyláza (TDG), zapojený také do dráhy BER (Grin a Ishchenko, 2016). V poslední době se hodně diskutuje o úloze TET proteinů v těchto reparačních dráhách, avšak jejich funkce v DDR není doposud zcela objasněna. Bylo však prokázáno, že UV záření zvýší globální hladinu TET3, což koreluje s drobným nárůstem 5hmC v DNA (Kantidze a Razin, 2017). Navíc bylo zjištěno, že u HeLa buněk TET2 zodpovídá za hromadění 5hmC v lokálně ozářené oblasti (Kafer et al., 2016). Jelikož ATM fosforyluje TET1 a ATR fosforyluje TET3, lze přepokládat, že k aktivní demetylaci může docházet i při jiných opravných procesech (Kantidze a Razin, 2017). Nedávný výzkum ukazuje, že demetylaci závislou na BER koordinují epigeneticky významné enzymy z rodiny SUMO. Například sumoylace XRCC1 usnadňuje fyzikální interakci s TDG a podporuje sestavení komplexu TDG s faktory BER. Následně se SUMO přenáší z XRCC1 na lysin v TDG, čímž podpoří disociace enzymu TGD i dokončení demetylace (Steinacher et al., 2019). V roce 2019 Zhang et al. (2019) ukázali, že HDAC1 a HDAC6 mohou interagovat s MHL1 (člen mechanismu MRM). Takto deacetylovaný MHL1 pak brání vytvoření komplexu MutSα-MutL a celou dráhu inhibuje (Zhang et al., 2019). V případě opravného mechanismu MMR H3K36me3 umožňuje navázání proteinu MSH6 a nepřítomnost této modifikace, nebo narušení interakce s MutSα, zvyšuje frekvenci spontánních mutací (Huang et al., 2018b)

Tabulka 2: Epigenetické změny během oprav poškozené DNA

epigenetické změny epigenetické změny v histonech v NK ubikivitinace/ reference DNA RNA metylace acetylace fosforylace sumoylace Dnmt1, Demeytylace H3K56ac , H2B T129, (Dinant et al., 5hmC, m6A histonů inhibují BER H2AX S139ph, ? 2012; Drohat a T Coey, 2016; Mao a BER 5caC? Wyrick, 2016) (TET proteiny) Dnmt1, H3K79me1/2/3, H2BK11/K16ac, H2AX S139ph, H2AK118ub, (Dinant et al., CPD, m6A, H3K36me3, H3K14ac, H3K9ac, H3S10, H3T11 H2AK119ub, 2012; Kakumu et al., 2017; 5hmC? m3G/TMG H4K20me1, H3K27ac, H3K56ac, H2BK123ub Karkhanis et al., NER 5caC? H2AR3me2, H4K5/K8/K12/K16ac, 2012; Li, 2012; H4R3me2 Mao a Wyrick, 2016; Xiang et al., 2017) 5hmC? H2AXK134me2, H3K56ac, H4K16ac, H2AX- H2BK120ub, (Hustedt a (TET1, H3K9me2/3, H2AK15ac, H2AX Ser139ph, H2AK27ub, Durocher, 2016; Jacquet et al., TET2, ? H3K4me3, K36ac, H2AX K5ac H2BT119ph, H2AK119ub, 2016; Sharma a TET3) H3K36me3, H2AXY142ph, H2AK127ub, Hendzel, 2019; HRR H3K79me3 H2AXT39ph H2AK129ub, Uckelmann a H2BS14ph, Sixma, 2017; Wilson a Durocher, H2AX T101ph, 2017; Xie et al., H2BSer14ph, 2010) H4T8ph 5hmC? H3K4me3, H3K56ac, H3K18ac, H2AX- H1-ub, (Fnu et al., 2011; (TET1, H3K9me3, Ser139ph, H2AK27ub Lee et al., 2018; Sharma a Hendzel, TET2, ? H3K36me2/3 H2AXT101ph, H2AK13ub, 2019; Svobodova TET3) H3K79me2, H2BS14ph, H2AK15ub, Kovarikova et al., cNHEJ H4K20me1/2, H3T11ph, H2AK119ub 2018; Van a H4K20me3 H4S1ph, Almeida Santos, 2018) H4T8ph

3 CÍLE Dílčí cíle

• Funkční charakteristika vybraných histonových modifikací během opravy DNA Porovnání reakce na poškození DNA u standardních myších fibroblastů (MEF) a u buněk s delecí v genech pro histon metyltransferázy SUV39H1/H2. Identifikace nových histonových značek, zapojených do konkrétního mechanismu opravy dvouřetězcových zlomů v DNA. Hledání interakcí mezi reparačním protein 53BP1 a metylacemi histonu H4. Zhodnocení vlivu buněčného cyklu na distribuci H4K20me3 během opravy lézí v DNA, indukovaných pomocí laseru s vlnovou délkou 355 nm.

• Změny v metylaci DNA a RNA indukované poškozením DNA Srovnání metylačních profilů standartních myších fibroblastů (MEF) a buněk s delecí v genech pro histon metyltransferázy SUV39H1/H2. Studium účinku různých druhů záření na vybrané 6 1 epigenetické modifikace nukleových kyselin (5mC, 5hmC, 5caC v DNA, m A, m A, m3G/TMG v RNA) a na enzymy za ně zodpovídající (Dnmt1, TET proteiny, METTL3, METTL14). Vliv inhibitoru RNA polymeráz na hypermetylaci m6A RNA v lokálních DNA lézích. Schopnost akumulace m6A RNA u nádorových a nenádorových buněčných linií.

4 MATERIÁL A METODY

Veškeré použité laboratorní vybavení a přístroje jsou uvedeny níže v seznamu.

• skenovací konfokální mikroskopy Leica TSC SP5 X a Leica TCS SP8 X SMD (Leica Microsystems GmbH, Německo)

• zdroj γ-záření: Chisostat, kobalt-60, Chirana, Česká republika

• detekce western blotu: LAS 3000, Amersham 680, Typhoon 9000

• inkubátor: MCO-18AC CO2 Incubator Sanyo (Schoeller)

• ochranný box s laminárním předením Safeflow 1.2 (BioAir, EuroClone)

• počítač buněk TC10™ Automated Cell Counter (BIO-RAD)

• centrifuga Centrifuge 5804 R (Eppendorf)

• vodní koupel TW8 (Julabo)

• spektrofotometr NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientifc)

• sonikátor UltraSonic Processor UP100H (Hielcher Ultrasound Technology)

• spektrofotometr μQuant™ (BioTek Instruments, Inc.)

• průtokový cytometr BD FACSVerse (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)

4.1 Kultivace použitých buněčných linií

Naše experimenty byly založeny na pozorování lidských a myších buněčných systémů. Všechny buněčné linie byly kultivovány při teplotě 37 °C a 5 % CO2 v kultivačním mediu a s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra (FBS) (FB-1090/500, Biosera, Francie), 100 IU/ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu (#XC-A4122/100, Biosera, Francie). Použité buněčné linie byly pasážovány 1-2x týdně dle rychlosti růstu a potřeby experimentů. Nejprve bylo odstraněno kultivační médium, buňky opláchnuty 1× PBS (10010023,

Thermo Fisher Scientific,USA) a po té byl přidán 1 ml trypsinu (#XC-T1717, Biosera, Francie), čímž došlo k uvolnění buněk od dna misky. Trypsin byl inaktivován přidáním 3 ml čerstvého média a část suspenze byla přenesena do nové 5 ml misky (#93100, TPP Techno Plastic Products AG, Švýcarsko) s nahřátým mediem.

4.1.1 Myší embryonální buňky Většina experimentů byla provedena na dvou adherentních imortalizovaných buněčných liniích, odvozených od myších embryonálních fibroblastů (MEF). Jedna z nich nese úplnou deleci dvou genů pro histonové metyltransferázy SUV39H1 a SUV39H2 (Suv39h1/h2 dn). Standardní MEF byly kultivovány v Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (D-MEM) (FBS #P03-0710, PAN-Biotech, Německo). Pro kultivaci buněk Suv39h1/2 dn bylo použito IMEF medium, které je obohaceno o 1 μl β-merkaptoetanol (31350-010, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), 1 % neesenciálních aminokyselin (100 ×; #1140-035, Thermo Fisher Scientific), 2 mM sodium pyruvát (11360-039, ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts,

USA) a 1.5 g NaHCO3.

4.1.2 Lidské adherentní linie Reakci na poškození DNA indukované UV-zářením jsme také sledovali na imortalizovaných lidských keranocytech HaCat, na nádorových liniích Hela (odvozená od karcinom děložního čípku) a U2OS (derivovanou od středně diferencovaného sarkomu). Pro studium buněčného cyklu jsme využili speciálně upravenou nádorovou linii Hela-Fucci (Life Technologies, USA). Hela-Fucci systém umožňuje vizuálně rozlišit jednotlivé fáze buněčného cyklu na základě specifické exprese proteinu RFP-Cdt1 během G1 fáze a GFP-geminin během fází S/G2/M. V kombinaci s imunofluorescenční detekcí reparačních markerů dovoluje tento systém odlišit opravnou dráhu HRR od NHEJ, které je typická pro S/G2 fázi BC.

Tabulka 3: Složení kultivačních linií

Buněčná linie Složení média (500 ml) Přídavek séra DMEM (pH 7,2) (L-glutamín, Glukóza 4,5 g/l) DMEM v prášku 6,023 g

MEF, Hela, NaHCO3 1,618 g FBS 10% Hela -Fucci, MQ voda 445 ml HaCat, U2OS antibiotika 5 ml (Penicilín 100 IU/ml / Streptomycín 10 mg/ml ) IMEF ( pH 7,2) (L-glutamín, Glukóza 4,5 g/l, HEPES) High –glucose DMEM 17,3 g NaHCO3 1,8 g Β-mercaptoethanol, 1 μl Suv39h1/h2 dn MEM MEM NEAA 5 ml FBS 10% sodium pyruvát 5 ml MQ voda 435 ml antibiotika 5 ml (Penicilín 100 IU/ml / Streptomycín 10 mg/ml )

4.2 Příprava a transfekce plazmidu

Při pokusech se živými buňkami byly použity následující plazmidové konstrukty: RFP- PCNA, který poskytl Prof. Cristina Cardoso (Technická univerzita, Darmstadt, Německo), mCherry-53BP1 (#19835, Addgene, Velká Británie), GFP-HP1β, který poskytl Dr. Tom Misteli (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), GFP-JMJD2b-1086, který poskytl prof. a Dr. Nicholas Shukeir (Max Planck institut Immunobiology, Freiburg, Německo),

55 pDEST FRT/T0 GFP-BRCA1 (#71116, Addgene, USA). DNA konstrukt byl vložen do bakterií kmene E. Coli DH5αTM-T1R (#12297016, Thermo Fisher Scientific, USA)

4.2.1 Transformace a výsev a namnožení bakterií Ke kompetentním buňkám DH5αTM-T1R (#12297016, Thermo Fisher Scientific, USA) bylo přidáno 2 – 4 µg plazmidové DNA, se kterou byly bakterie inkubovány na ledu po dobu 30 minut. Stav kompetice jsme navodili tepleným šokem ve vodní lázni (42 °C) po dobu 30 sekund. Poté byly buňky opět přeneseny na 2 minuty na led. Následně se k bateriím sterilně přidalo 250 μl S.O.C (#15544034, Thermo Fisher Scientific, USA), ve kterém se bakterie 60 min inkubovaly na třepačce při 230 rpm a 37 °C. Po inkubaci jsme za sterilních podmínek křížovým roztěrem naočkovali inokulum na agarové plotny se selekčním antibiotikem. Misky s transformovanými bakteriemi byly inkubovány přes noc v termostatu při 37 °C. Následující den jsme jednotlivé narostlé kolonie přenesli do 2 ml LB media s příslušným antibiotikem (ampicilin100 µg/ml) a nechali třepat po dobu 6-8 hodin (300 rpm, 37 ºC), až se tekutina zakalila. Z nejvíce zakalené ependorfky jsme přenesli 250 μl suspenze do 100 ml LB a směs se v Erlenmeyerově baňce inkubovala přes noc za stálého třepání při 37 °C. Další den ráno proběhla samotná izolace plazmidové DNA pomocí kitu HiSpeed Plasmid Maxi Kit (#12163; QIAGEN).

Složení LB média pro namnožení bakterií a přípravu agarových ploten

Rozpis pro izolaci jednoho plazmidového konstruktu (4x 100 ml LB + 4x agarová plotna)

Tabulka 4:Složení LB media pro kultivaci bakterií E.Coli kmene

ampicilin LB Trypton Kvasinkový NaCl MQ (AMP) médium + agar extrakt H2O c= 100 µg/ ml AMP LB 5 g 2,5 g 5 g 500 100 µl agarová 100 ml 1,5 g médium ml miska (3x)

4.2.2 Izolace plazmidů pro eukaryotickou transfekci Pracovní postup při izolaci plazmidové DNA vycházel z návodu od výrobce, který byl drobně modifikován. Izolace plazmidové DNA na kolonce pomocí kitu QIAGEN je založena na alkalické lýze, při které dochází k degradaci genomové DNA, následně k neutralizaci a k vysrážení plazmidové DNA.

Postup:

1. Narostlé bakterie jsme centrifugovali 15 min při 4 °C a 6 000 × g. 2. Supernatant jsme odlili a pelet resuspendovali v 10 ml roztoku P1, který obsahoval RNázu A 3. K suspenzi jsme přidali lyzační pufr P2, 5 - 6x jemně zkumavku převrátili a nechali působit 5 min při RT. 4. Společně s 10 ml neutralizačního roztoku P3 jsme promíchanou směs inkubovali 20 min. na ledě a poté zkumavku centrifugovali 30 minut při 20 000 × g, 4 °C. 5. Sestavili jsme si filtrační soupravu QIAfiltee cartige (stříkačka + čepička), do které jsme nalili supernatant z kroku 4 a nechali inkubovat 10 min při RT. 6. Mezi tím jsme velkou kolonku HiSpeed Maxi Tip smočili 10 ml QBT pufru. 7. Ze stříkačky jsme protlačili kapalinu do kolonky, plazmidová DNA se zachytila na filtru. 8. Kolonka byla postupně promyta 60 ml QC roztoku a v mezičase jsme si předehřáli eluční QF pufr na 65 °C. 9. Plazmidová DNA byla uvolněna 15 ml QF pufru do nové zkumavky, následně vysrážena přidáním 10,5 ml izopropanolu a inkubována 5 min při RT. 10. Tuto směs jsme přenesli do 30 ml stříkačky a pomocí filtru QIA precipitator MAxi Module přefiltrovali. 11. Na filtru zachycenou plazmidovou DNA jsme promyli 2 ml etanolu a poté jsme filtrem 2x protlačili pouze vzduch (vysoušení). 12. Do malé stříkačky jsme nasáli 300 μl vody bez nukleáz a protlačili ji filtrem. 13. Krok 12. byl opakován ještě 2x, vždy s protlačenou tekutinou. 14. Výsledná koncentrace a čistota získané DNA byla měřena spektrofotometricky na přístroji NanoDrop2000.

4.2.3 Transfekce eukaryotických buněk plazmidovou DNA Transfekce obecně slouží k zavedení nukleových kyselin do buněk bez použití virových vektorů. Lipofekce patří mezi speciální chemické metody, používané především pro krátkodobou transfekci, založené na elektrostatické interakci pozitivně nabitých lipidových částic s negativní páteří DNA za vzniku lipozómu.

V naší laboratoři se používá metoda chemické transfekce za využití transfekčního činidla METAFECTENE (#T020, Biontex Laboratories GmbH, Německo). Na jednu mikroskopickou misku bylo potřeba 300 µl transfekční směsi, která je převážně tvoře sterilním 1x PBS.

Postup:

1. Den před samotnou transfekcí jsme nasadili požadované buňky na mirkoskopickou misku s mřížkou (#81166; Ibidi GmbH; Německo) tak, aby se jejich konfluence v den transfekce pohybovala okolo 80 %. 2. Do dvou ependorfek jsme dali 150 µl sterilního 1x PBS, do jedné jsme přidali 2–5 µg plazmidové DNA a do druhé transfekční činidlo METAFECTENE. 3. Obsah ependorfek jsme smíchali a nechali společně inkubovat 20min při RT. 4. Po inkubaci jsme opatrně nakapali směs do kultivačního media s buňkami, vložili do termostatu, kde činidlo 4 - 6 hodin působilo. 5. Po uplynulé době jsme odsáli medium s transfekčním činidlem a přidali k buňkám čerstvé medium. 6. Následující den byly buňky s konstruktem připraveny k experimentům.

4.3 Použité inhibitory

Inhibitory jsou obecně látky, které se v biologii využívají ke snížení aktivity enzymů a k zastavení buněčných procesů. Před pokusy s mikroiradiací, které byly zaměřeny na studium m6A RNA, jsme zainhibovali účinnost RNA polymeráz.

Transkripční aktivita RNA polymerázy I byla blokována látkou Actynomycinem D (#A1410, Merck, USA), který velice rychle a přednostně navodí zástavu transkripce ribozomálních genů.

Byla použita pracovní koncentrace Actynomincynu D 0,5 µg/ml po dobu 2 hodin před samotným experimentem. Procesivita RNA polymerázy II byla pozastavena toxinem α-amanitinem (#A2263, Merck, USA). α-amanitin také inhibuje RNA Pol III, avšak s mnohem menším účinkem než RNA pol ll. Proto k za blokování aktivity RNA pol ll stačí nižší koncentrace. Jedná se o děj nezvratný, protože nejprve dochází k zastavení a potom k degradaci velké podjednotky enzymu. Účinek α- amanitinu jsme sledovali v různých časových intervalech. α-amanitin o koncentraci 2 µg/ml jsme nechali působit 2 nebo 4 hodiny a poté jsme vyměnili médium (Bensaude, 2011). Mikroiradiační experimenty byly provedeny buď hned po odstranění inhibitoru, nebo po 12 hodinách.

4.4 Imunofluorescenční barvení

Tato imunohistochemická metoda slouží k vizualizaci endogenních proteinů, nukleových kyselin a buněčných struktur pomocí protilátky. Pro následující pokusy byly buňky nasazeny na krycí sklíčko, nebo na mikroskopické misky s mřížkou (#81166; Ibidi GmbH; Německo). V tabulce 5 a 6 jsou uvedeny veškeré použité primární a sekundární protilátky.

4.4.1 Imunofluorescenční barvení proteinů a histonových modifikací (standardní protokol) Postup:

1. Buňky jsme opláchli v 1x PBS a fixovali 4 % paraformaldehydem 12 min při RT (#19943, Thermo Fisher Scientific, USA). 2. Odstranili jsme paraformaldehyd a buňky jsme promyli v 1xPBS (5 min) 3. Buňky byly permeabilizovány 15 min 0,3 % tritonem X100 (#194854, MP Biomedicals, USA). 4. Opět jsme vzorek 2x 10 minut promyli v 1x PBS. 5. Nespecifické vazby byly zablokovány 1 % BSA + Tween (BSAT) nebo 5 % kozím sérem v PBS po dobu 1 hodiny.

6. Po blokaci jsme preparát opláchli (1xPBS) a nechali trochu oschnout. 7. Příslušné protilátky jsme ředili v poměru 1:50 až 1:200 v 1 % BSAT nebo v 5 % kozím séru. Na vzorek jsme napipetovali 25 µl naředěné protilátky a inkubovali přes noc při 4 °C. 8. Další den ráno byl vzorek 2x 5 min. promyt v 1xPBS. 9. Poté jsme přidali na 1 hodinu sekundární protilátku ředěnou v poměru 1:200 v 1 % BSAT, nebo v 5 % kozím séru. 10. Po inkubaci jsme preparát 2x 15 min. promyli 1xPBS a nechali oschnout. 11. Na misku/sklíčko jsme nakapali 20 µl směsi DAPI (#D9542, Merck, USA) s Vectashield (H-1000, Vector Laboratories,USA) v poměru 1:250 a přikryli sklíčkem.

Pro protilátky H4K20me2/3 byl výše uvedený návod upraven. K 4 % paraformaldehydu jsme po 5 min. přidali 100 µl 1 % SDS, aby došlo k lepší penetraci buněčné membrány.

4.4.2 Vizualizace CPD aduktů a nukleotidových derivátů na DNA Postup pro detekci DNA se od standardního imunofluorescenčního protokolu liší především v denaturačním kroku a použitím vyšších koncentrací některých činidel.

Postup:

1. Buňky jsme opláchli 1xPBS a fixovali 4 % paraformaldehydem 15 min při RT.

2. Promyté buňky (5 min 1xPBS) byly permeabilizovány 30 min 0,4 %- 0,5 % tritonem X100.

3. Triton jsme odstranili a DNA byla denaturována přidáním 2 M HCl (pro CPD, 5hmC a 5caC) nebo 4 M HCl (5mC) po dobu 1 hodiny v termostatu při 37 ºC.

4. Po denaturaci jsme preparát neutralizovali 10 minut v 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5) a promyli 2x 10 min. v 1x PBS.

5. Nespecifické vazby byly zablokovány 2 % BSAT pro 5mC, 3 % BSAT pro 5hmC a 5caC při RT a v případě CPD 20 % FBS při 37 ºC po dobu 1 h.

6. Po blokaci jsme preparát opláchli (1xPBS) a nachystali primární protilátku.

7. Protilátky proti CPD a 5mC jsme naředili v poměru 1:100 a 1:200 v příslušném blokačním činidlu, zakryli sklíčkem a ponechali při 37 ºC 1 hodinu inkubovat.

8. Protilátky pro 5hmc a 5caC jsme naředili v poměru 1:8000 a 1:6000 v 3 % BAST, nanesli na vzorek a přes noc uchovali při 4 ºC. Další den ráno jsme pokračovali standardním imunofluorescenčním protokolem.

9. Po inkubaci s primární protilátkou (CPD nebo 5mC) byl preparát promyt 3x 5 min a opět inkubován se sekundární protilátkou naředěnou 1:250 1 hodinu při 37 ºC.

10. Vzorek jsme po promytí (3 x 10 min.) zamontovali činidlem Vectashield a přikryli sklíčkem.

Tabulka 5: Primární protilátky

Název protilátky Katalogové Výrobce Hostitelské Ředění primárních protilátek číslo zvíře Imunofluorescenční barvení Westernový přenos

anti-53BP1 #ab21083 Abcam, Velká králík 1:100 v 1 % BSA 1:500 v normálním Británie (VB) mléce NM GAPDH #sc-365062 Santa Cruz, USA myš 1:1000 NM anti-HP1β #MAB3448 Merck, Německo myš 1:100 v 1 % BSA 1:1500 v NM

anti-α-tubulin #ab80779 Abcam, VB myš 1:2000 v NM METTL3 #A8370 Abclonal, USA králík 1:100 v 1 % BSA 1:1000 v NM/SM METTL14 #A8530 Abclonal, USA králík 1:100 v 1 % BSA 1:1000 v NM/SM Dnmt1 #ab188453 Abcam, VB králík 1:100 v 1 % BSAT 1:1000 v NM fibrillarin # ab4566 Abcam, VB myš 1:100 v 1 % BSAT - N 6 -metyladenin #202 111 SYSY králík 1:100 v 1 % BSAT - (m6A) Antibodies, Německo anti-2,2,7- # RN019M MBL myš 1:400 v 1 % BSAT - trimethylguanosin International

(m3G/TMG) Corporation, USA

1-methyladenosin # D345-3 MBL myš 1:100 v 1 % BSAT - (m1A) International Corporation, USA CPD #CAC-NM- Cosmo Bio, myš 1:100 v 5 % FBS - DND-001 Japonsko 5-methylcytosin #ab10805 Abcam, VB myš 1:200 v 2 % BSAT - (5mC)

5hmC #39999 Active Motif, myš 1:8000 v 3 % BSAT - USA 5caC #61225 Active Motif, králík 1:6000 v 3 % BSAT - USA anti-H3 #ab 1791 Abcam, VB králík 1:100 000 v NM ᵞH2AX; phospho S #ab2893, Abcam, VB králík 1:200 v 1 % BSA 1:1000 ve slané 139 želatině SG ᵞH2AX; phospho S #ab 22551 Abcam, VB myš 1:200 v 1 % BSA 1:1000 v SG 139 anti-H3K9me2 #ab1220 Abcam, VB myš 1:2000 v NM anti-H3K9me3 #ab8898 Abcam, VB králík 1:200 v 1 % BSA 1:2000 v NM anti- H4K20me1 #A2370 Abclonal, USA králík 1:100 v 1 % BSA anti- H4K20me2 #A-4047-050 Epigentek, Lab králík 1:50 v 1 % BSA 1: 1000 v NM Mark a.s, CZ anti- H4K20me3 #A-4048-050 Epigentek, Lab králík 1:200 v 1 % BSAT 1: 1000 v NM Mark a.s, CZ anti- #ab5176 Abcam, VB králík 1:100 v 1 % BSAT - H3 phospho S10 anti- #ab196698 Abcam, VB myš 1:100 v 1 % BSAT - H3 phospho S10 TET1 #A1506 Abclonal, USA králík 1:100 v 1 % BSAT 1: 1000 v NM TET2 #A16273 Abclonal, USA králík 1:100 v 1 % BSAT 1: 1000 v NM TET3 # A7612 Abclonal, USA králík 1:50 v 1 % BSAT 1: 1000 v NM

Tabulka 6: Sekundární protilátky

Název protilátky Katalogové číslo Výrobce Ředění sekundárních protilátek westernový přenos anti-rabbit IgG #A-4914 Merck, USA 1:2000 HRP antibody anti-mouse IgG #A-9044 Merck, USA 1:2000 HRP antibody anti-mouse IgG1 #sc-2060 Santa Cruz 1:2000 Biotechnology, HRP antibody USA Alexa Fluor 488 anti- #ab150077 Abcam, VB 1:4000 rabbit imunofluorescenční barvení Alexa Fluor® 405 #A-31553 Thermo Fisher 1:100 anti-mouse Scientific Alexa Fluor® 488 #A-11001 Thermo Fisher 1:200-300 anti-mouse Scientific Alexa Fluor® 594 #A-11032 Thermo Fisher 1:200-300 anti-mouse Scientific Alexa Fluor® 594 anti- # A-11012 Thermo Fisher 1:200-300 rabbit Scientific Alexa Fluor® 647 #A-21245 Thermo Fisher 1:200 anti-rabbit Scientific Alexa Fluor® 647 #A-28181 Thermo Fisher 1:200 anti-mouse Scientific

Alexa Fluor 488 #ab150077 Abcam, VB 1:300 anti-rabbit

4.5 Westernový přenos

Pro detekci a stanovení celkového množství vybraných proteinů byla využita metoda westernového přenosu. Tato metoda je založena na denaturaci proteinu činidlem SDS, které udá proteinům v rozpouštědlu záporným náboj. Následná separace v polyakrylamidovém gelu probíhá v důsledku změny pH. Proteiny migruji v elektroforetickém separačním gelu v závislosti na své molekulové hmotnosti. Poté jsou proteiny z gelu přeneseny na polyvinylovou (PVDF) membránu a detekovány pomocí protilátek. Složení použitých roztoků a koncentrace polyakrylamidových gelů jsou uvedeny v tabulkách 7 a 8.

4.5.1 Příprava lyzátů pro detekci protein Lyzáty byly připraveny z kontrolních neovlivněných buněk a z buněk vystavených γ-záření (o síle 5 Gy), UVA a UVC záření. Vzorky jsme sklidili v intervalech 30 min a 24 h od γ-ozáření, v případě UV záření po 2 minutách, po 1 a 2 hodinách.

Postup:

1. Misku s narostlými buňkami jsme 2x opláchli vychlazeným 1xPBS. 2. Nakapali jsme 100 - 200 µl 1 % SDS a škrabkou zlyzované buňky přenesli do ependorfky. 3. Před sonikací jsme ependorfku s lyzátem zamrazili nebo umístili na led. 4. Buněčný lyzát jsme sonifikovali v přístroji Ultrasonic Processor UP100H (Hielscher– Ultrasound Technology, Německo) 5. Koncentraci proteinu jsme stanovili pomocí kitu DC™ Protein Assay (#5000111, Bio-Rad, USA) a spektrofotometru. 6. Na destičku jsme v triplikátu nanesli 5 µl blanku (1 % SDS), 5 µl kalibračních standardů (o koncentracích 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2) a 5 µl našich vzorků. 7. Přidali jsme 25 µl směsi roztoku A a 200 µl roztoku B, poté nechali 15 minut ve tmě. 8. Koncentraci proteinů jsme měřili na přístroji Elisa MQX200 (BioTek, USA) a vyhodnotili v programu KC Junior. 9. U všech vzorků jsme výslednou koncentraci přepočítali na 1 µg/µl.

10. 200 µl lyzátu jsme odbarvili 10 µl směsi 0,01 % bromfenolové modři (#B0126, Merck, USA) s 1 % β-merkaptoetanol (#28625, Serva Electrophoresis, Německo). 11. Ependorfky se vzorkem jsme 5 minut povařili ve vodě a následně ochladili na ledu.

4.5.2 SDS - PAGE a přenos na membránu Postup:

1. Do stojánku na přípravu gelů jsme dle velikosti proteinů připravili separační polyakrylamidový gel o požadované koncentraci. 2. Po zatuhnutí separačního gelu jsme přilili 5 % koncentrační gel a do něho dali hřebínek. 3. Sestavili jsme aparaturu a do jamek nanesli proteinový marker a naše vzorky. 4. Elektroforetickou aparaturu jsme zalili pufrem (viz tabulka 6) a zapojili ji do elektrického zdroje (80 V 20 min.). 5. Po zakoncentrování jsme napětí zvýšili na 135 V a nechali vzorky separovat 2 až 3 hodiny dle velkosti proteinů. 6. Sestavili jsme přenosovou aparaturu a při napětí 100 V po dobu 80 min nechali probíhat přenos proteinu z gelu na PVDF membránu v 15 % nebo 20 % transferovém pufru. 7. Po ukončení přenosu proteinu jsme membránu vložili na 1 hodinu do příslušného blokovacího roztoku. 8. V blokovacím pufru a s příslušnou protilátkou byla membrána inkubována přes noc za stálého otáčení při 4 ºC (viz tabulka 5). 9. Další den ráno byla membrána promyta v 1x TBS (3x 10 minut) a poté vložena na 2 hodiny do příslušné sekundární protilátky (viz tabulka 6). 10. Po inkubaci byla opět membrána promyta v 1x TBS (3x 10 minut). 11. K detekci proteinů jsme využívali kit ECL+Plus (#RPN 2232, GE Healthcare Life Sciences) založený na enzymatické reakci, nebo v případě fluorescenčního značení byl signál excitován přístrojem Typhoon 9000. 12. Intenzitu chemiluminiscence daného proteinu jsme detekovali přístrojem Amershan 6800. 13. Fluorescenční nebo chemiluminiscenční signál (band) jsme kvantifikovali v programech Fiji nebo ImageQuant TL a následně z těchto hodnot byly sestrojeny grafy v MS Excel.

Tabulka 7: Složení pufrů pro westernový přenos.

Název roztoku Složení Množství Tris 2,9 g Glycin 14,4 g Elektroforetický pufr 20 % SDS 5 ml Destilovaná voda do 1 l Tris 2,9 g Glycin 14,5 g 20 % transferový pufr Metanol 200 ml MQ voda do 1 l Tris 3 g Glycin 14,4 g 15 % transferový pufr Metanol 150 ml MQ voda do 1 l NaCl 60 g 2 M Tris (pH = 7,5) 50 ml 10× TBS – normální Tween 20 5 ml Destilovaná voda do 1 l NaCl 90 g 2 M Tris (pH = 7,5) 250 ml 10× TBS – slaný Tween 20 5 ml Destilovaná voda do 1 l

Tabulka 8: Složení gelů pro westernový přenos.

Složení 6 % gel 8 % gel 10 % gel 12 % gel 15 % gel MQ voda 2,7 ml 2,3 ml 2 ml 1,7 ml 1,2 ml 1,5 M Tris (pH = 8,8) 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml 30 % Akrylamid 1 ml 1,3 ml 1,7 ml 2 ml 2,5 ml 10 % SDS 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 10 % APS 60 µl 60 µl 60 µl 60 µl 60 µl TEMED 4 µl 3 µl 2 µl 2 µl 2 µl

4.6 Imunoprecipitace proteinů

Imunoprecipitační metody jsou založeny na reakci antigen - protilátka. V našem případě jsme tento princip využili k prokázání interakce mezi proteinem 53BP1 a metylacemi histonu H3, H4 a proteinem HP1. Interakce jsme studovali u dvou buněčných linií Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn, které byly vystaveny účinkům γ-záření (5 Gy). Intervaly ozáření jsme zvolili stejně jako při western blotu (30 min a 24 hodin). Imunoprecipitace proteinu byla provedena kitem Catch and Release v2.0 Reversible Immunoprecipitation Kit (#17-500, Merck Millipore, USA).

Postup:

Pro zjištění objemu lyzačního pufru jsme spočítali počet buněk. Na lýzy 1 × 106 buněk je zapotřebí 100 μl vychlazeného Pierce IP pufru (# 87788, Thermo Fisher Scientific, USA) s 1 % přídavkem inhibitorů proteáz (#87786, Thermo Fisher Scientific, USA).

1. Narostlé kontrolní a ozářené buňky jsme 2x promyli vychlazeným 1× PBS a jemně misku osušili. 2. Ke vzorkům jsme přidali adekvátní množství kompletního lyzačního činidla a nechali na ledu 5 minut působit. 3. Lyzáty byly centrifugovány (13 000 × g, 10 min, 4 °C) a supernatant odebrán. 4. V supernatantech jsme pomocí Elisa MQX200 změřili koncentraci celkových proteinů v IP pufru a upravili ji na výslednou koncentraci 1 µg/µl (viz kapitola 4.5 Westernový přenos).

5. Následně jsme přešli k vlastní imunoprecipitaci. 6. IP kolony byly 2x centrifugovány se 400 µl promývacího pufru (2 000 × g, 30 s) a po promytí jsme do nich v následujícím pořadí přenesli promývací pufr, 500 µg buněčného lyzátu o výsledné koncentraci 1 µg/µl, 4 µg primární protilátky anti-53BP1 (#ab21083, Abcam, Velká Británie) nebo negativní kontroly Goat Anti-Rabbit IgG (#A4914, Merck, USA) a 10 µl afinitního ligandu, sloužícího k zachycení protilátek. 7. Celkový objem roztoku v každé IP koloně byl 500 µl. 8. Kolony byly inkubovány přes noc na rotátoru při 4 °C a následující den byly třikrát promyty v 400 µl promývacího pufru (2 000 × g, 30 s). 9. Po promytí byl imunoprecipitát vyloučen z kolony 70 µl denaturačního a elučního roztoku s přídavkem 5 % β-merkaptoethanolu, centrifugován (2 000 × g, 30 s). 10. Inputy byly připraveny z lyzátu a Laemmliho pufru (#161-0737, Bio-Rad, USA) o výsledné koncentraci 1 µg/µl. 11. Interakce mezi proteiny a histonovými modifikaci jsme detekovali metodou westernového přenosu (viz kapitola 4.5 Westernový přenos) 12. Vzorky z IP byly naneseny na gel a následně přeneseny na PDFV membránu, která byla inkubovány s příslušnými primární protilátkam. 13. Analýza výsledků byla provedena v programech ImageJ .

4.7 Analýza buněčného cyklu

Pomocí průtokové cytometrie lze změřit obsah DNA v jednotlivých vzorcích a odlišit tak od sebe G1, S a G2/M fáze buněčného cyklu (BC). Výsledkem je rozložení buněčné populace v jednotlivých fázích BC, vzniklé na základě kvantifikace množství DNA v jednotlivých buňkách. Před analýzou musí být DNA značena fluorescenční sondou, například propidium jodidem, který se inkorporuje do struktury dsDNA. Následně se naznačený vzorek ozáří světlem o vlnové délce 488 nm a přístroj zaznamenává intenzitu emitujícího záření (> 560 nm).

Postup:

1. Buňky Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn jsme nasadili na kultivační misky (5ml) tak, aby jejich konfluence další den byla 70-80 %. 2. Od každé linie byla polovina misek vystavena γ-záření o dávce 5 Gy. 3. Po 24 hodinách od ozáření jsme kontrolní i ovlivněné buňky sklidili za použití trypsinu, promyli vychlazeným fyziologickým roztokem (PBS) a centrifugovali (5 min., 1500 rpm, 4 °C) 4. Na ledu (4 °C) byly buněčné pelety resuspendovány v 0,5 ml PBS. 5. Zkumavky se suspenzí byly centrifugovány (5 min., 1000 × g, 4 °C) a pelety fixovány 4 ml 70 % ethanolu po dobu 30 minut. 6. Opět jsme buňky promyli v PBS a centrifugovali (5 min., 1000 × g, 4 °C). 7. Buněčná jádra jsme barvili 30 minut při 37 °C Vindelovovým roztokem složeným z 1 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM NaCl, 0,1 % Triton X100, RNázy A (10 mg/ml) (#10109142001, Merck, USA) a propidium jodidu (5 ug/ml) 8. Buněčný cyklus analyzujme na průtokovém cytometru BD FACSVerse (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) a vyhodnotíme v programech ModFit (Verity Software House, Topsham, USA) a FACSuite (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA)

4.8 Konfokální mikroskopie a její využití

4.8.1 Technické vybavení Snímání a mikroskopické experimenty byly provedeny na konfokálních laserových skenovacích mikroskopech Leica TSC SP5 X (Leica Microsystems GmbH, Německo) a Leica TCS SP8 X SMD (Leica Microsystems GmbH, Německo). Kombinace bílého laditelného laseru (WLL) s AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter) umožňuje pokročilé analýzy obrazu v širokém spektru barev od UV oblasti až po oblast daleké červené. K detekci signálu pomocí hybridních detektorů dostačuje minimální intenzita excitačního laseru, což významně snižuje nežádoucí vysvícení (photobleaching) vybrané fluorescenční značky.

Tabulka 9: Technické parametry mikroskopů využitých při našich pokusech.

Objektiv PMT Hybridní Kultivace živých lasery + numerická detektor detektory buněk apertura (NA )

širokospektrální bílý: excitační čáry v intervalu 470 - 670 nm

(NKT HCX PL APO 3x 2x Photonics, Dánsko), Leica 63× lambda blue, PMNT fotonásobiče spektrální detektory Klima box EMBL SP5 X NA 1,4 olej 1x PMT trans (HyD) (průchozí světlo) diodový laser UVA 405 nm

laser UVA 355 nm (Coherent Inc, USA)

širokospektrální bílý pulzní: excitační čáry v HCX PL APO 2x 2x interval u 470-670 nm Leica 63× lambda blue, PMNT fotonásobiče spektrální Pecon i8 inkubátor (NKT SP8X NA 1,4 olej 1x PMT detektory (HyD) Photonics, Dánsko), SMD trans (průchozí světlo) s dynamickým rozsahem diodový laser UVA 405 nm

Tabulka 10:Parametry a typy použitých fluorescenčních látek

Fluorescenční značky Vlnová délka excitace Typ excitačního laseru

fluorochrom GFP 488 nm bílý laser

fuorochrom mCherry 570 nm bílý laser

fluorochrom DAPI 405 nm UVA diodový laser

Alexa Fluor 405 405 nm UVA diodový laser

Alexa Fluor 488 488 nm bílý laser

Alexa Fluor 594 580 nm bílý laser

Alexa Fluor 647 647 nm bílý laser

4.8.2 Indukce lokálního poškození DNA UVA lasery Mikroiradiace jádra buněk byla provedena UVA laserem o vlnové delece 405 nm a 355 nm. Při použití laseru s kratší vlnovou délkou vznikají kromě dvoudecových zlomů DNA (DSB) také CPD a další typy poškození, zatímco vlnová délka 405 nm by měla přednostně indukovat DSB. V závislosti na vlnové délce UVA laseru můžeme tedy rozlišit reparační mechanismy.

Existují dva základní mikroiradiační přístupy. První slouží ke studiu endogenních proteinů a epigenetických modifikací přímo v místě poškození. Buňky jsou ozářeny v konkrétním místě tzv. ROI, následně zafixovány a histochemicky obarveny příslušnou protilátkou. Druhý přístup kombinuje plazmidovou transfekci a využívá se především ke studiu kinetiky a dynamiky proteinů uvnitř DNA léze. I když plazmidový konstrukt umožní přímou vizualizaci proteinu, samotná transfekce je pro buňku zátěží, což může komplikovat hodnocení míry (rozsahu) poškození.

Obecné schéma indukce lokálního poškození UVA lasery:

Postup:

1. Příslušnou linii jsme vyseli na 35-mm mikroskopické misky s mřížkou (#81166; Ibidi GmbH; Německo), které nám usnadní hledání ozářené buňky. Konfluence by se v den experimentu měla pohybovat okolo 70 %, záleží na na vybrané linii.

2. V případě laseru UVA 355 nm jsme buňky 16 hodin před mikroiradiací ovlivnili analogem tyminu 10 µM 5-bromo-2'-deoxyuridin (5-Bromo-2'-deoxyuridine; BrdU) (#11296736001, Merck, USA). Při využití laseru UVA 405 nm se nepřidává BrdU jako senzitivní činidlo.

3. Následující den ráno jsme si vyhřáli komůrku u konfokálního mikroskopu SP5 a začali s lokálním ozařováním.

4. Nejprve jsme WLL pořídili fotku vybrané buňky v módu bidirectional a parametrech: rozlišení 1024x1024 pixelů, zoom 8 (1 pixel odpovídá 60,18 × 60,18 nm), line average 7, frekvence snímaní 400 HZ, výkon laseru: 70 %. Excitační intenzita laseru byla na AOTF nastavena na 100 %.

5. Na snímku jsme rámečkem (cca 2 µm2) označili místo indkuce DNA lézí.

6. Nastavení UVA laseru pro indukci lokálních DNA lézí:

a) UVA 355 nm : rozlišení 512 x 512 pixelů, výkon 25 mW, zoom 8, line average 48, frekvence snímaní 400 HZ, mód bidirectional. b) UVA 405 nm: rozlišení 512 x 512 pixelů, výkon 5 %, zoom 8, line average 16 (8), frekvence snímaní 400 HZ, mód bidirectional.

7. Akumulaci reparačních proteinů jsme pozorovali přímo v čase nebo jsme vzorky zafixovali a imunofluorescenčně naznačili příslušnou protilátkou.

8. Zpětně jsme obarvené preparáty nasnímali a analyzovali relativní intenzitu fluorescence v místě poškození DNA. Technické parametry viz bod 4.

9. V některých případech jsme také hodnotili, zda akumulace závisí na buněčném cyklu.

10. Množství ozářených buněk a různá doba, po kterou jsme mohli misku ozařovat, souvisely s výběrem oorávaného proteinu a epigenetické značky. Před detekcí nového markeru reparace DNA byla vždy udělána optimalizace, při které bylo ozářeno 30 buněk v průběhu cca 90 min.

4.8.3 Plošné ozáření UV lampou V našich experimentech jsme používali dva zdroje UV zářní: UVC lampau (Philips, Holland, model TUV 30 W T8 UVC, vlnová délka 254 nm) a UVA lampu (model GESP-15, 15 W UVA vlnová délka 330–400 nm, maximální účinnost při 365 nm). Buňky byly vystaveny účinkům UVA a UVC lampy po dobu 10 minut a poté fixovány v intervalech 2 minuty, 3 hodiny a 24 hodin. V případě UVA záření jsme buňky zesenzitivnili přidáním BrdU. Vzdálenost lampy od vzorku byla 70 cm pro zdroj UVC a 2 cm v případě UVA světla (Sorokin et al., 2015)

4.8.4 Stanovení počtu reparační ohnisek po indukci poškození γ-zářením γ-paprsky jsou dalším typem krátkovlnného záření, které velice silně poškozuje DNA. V našich pokusech byl jako zdroj použit kobalt-60 ( Chisostat, Chirana, Česká republika). Buňky byly kultivovány na mikroskopických miskách Ibida a následující den vystaveny γ-záření (dávka

5 Gy). Poté se vzorky v různých časových intervalech od ozáření zafixovaly a provedlo se imunofluorescenční značení protilátkou (30 min, 1 hodina a 24 hodin). Parametry snímání na konfokálním mikroskopu SP8: mód bidirectional, rozlišení 1024x1024 pixelů, zoom 5, frekvence 400 HZ. Výskyt ohnisek či změna intenzity fluorescence v důsledku γ-záření byly vždy vztaženy k neovlivněným kontrolním preparátům.

4.9 Statistika a normalizace dat

Denzita bendů získaných westrenový přenosem byla hodnocena v programu ImageQuant TL a ImageJ. V případě proteinů se vypočtené hodnoty normalizovaly k α-tubulinu a u histonových modifikací k histonu H3. Ze získaných hodnot byly sestrojeny grafy v programu MS Excel. Počty reparačních tělísek jsme hodnotili ve statistickém programu LAS X analýza obrazu. Do statistiky bylo zahrnuto 80-100 kontrolních a ovlivněných jader a v programu http://shiny.chemgrid.org byly udělány grafy. Absolutní intenzita fluorescence byla rovněž provedena softwarem LAS X.

Relativní intenzita akumulace v lokálních DNA lézích byla stanovena z poměrů fluorescence v místě ozáření ROI a v neozářené oblasti jádra u 30 - 40 buněk. Rozdíly mezi odlišnými liniemi byly vypočteny pomocí Studentova t-testu http://www.socscistatistics.com/tests/studentttest a grafy vytvořeny v programu http://shiny.chemgrid.org. Čas ozáření jednotlivých jader byl vždy zaznamenán a na jeho základě se určila kinetika reparačních proteinů a epigenetických značek do místa poškození DNA. Veškeré pokusy byly provedeny nejméně ve třech nezávislých biologických replikátech.

5 VÝSLEDKY

5.1 Detekce vybraných histonových modifikací a reparačních proteinů u myších fibroblastů a u buněk s delecemi v genech pro SUV39H1 a SUV39H2 metyltransferázy

5.1.1 Úplná delece genů SUV39H1/H2 snižuje kromě H3K9me3 také hladinu dalších modifikací histonů H3, H4 a reparačních markérů Pomocí westernového přenosu (WB) jsme stanovili globální hladiny vybraných histonových značek a opravných proteinů (γH2AX, H3K9me2, H3K9me3, H4K20me2, H4K20me3, HP1β a 53BP1). Pro tento experiment byly připraveny proteinové lyzáty z kontrolní MEF linie (Suv39h1/h2 wt) a od ní odvozené linie s delecí v genech pro SUV39h1/h2 metyltransferázy (Suv39h1/h2 dn). Abychom mohli sledovat markery DNA lézí, buňky byly předem vystaveny γ-záření (5 Gy) a sklizeny ve dvou časových intervalech (po 30 minutách a po 24 hodinách). Chemiluminiscenční nebo fluorescenční signál byl hodnocen v programu ImageQuant TL. Funkci metyltransferáz SUV39h1/h2 jsme ověřili detekcí sníženého množství H3K9me3 u Suv39h1/h2 deficientních buněk (dn) (obr. 8A, B). Delece genů koreluje také s nízkou hladinou H3K9me2, H4K20me2, H4K20me3 a HP1β proteinu (obr. 8A,B). Izoforma HP1β vykazuje navíc i odlišnou distribuci v buněčném jádře. U standardních MEF (SUV39h1/h2 wt) se HP1β formuje do zřetelných heterochromatinových ložisek, zatímco u mutantních buněk Suv39h1/h2 dn je HP1 β protein rovnoměrně rozprostřen v nukleoplazmě (obr. 9A). Po mikroiradiaci UVA laserem obecně dochází k akumulaci HP1β v místě poškození (obr. 9Bb.), ale buňky Suv39h1/h2 dn mají tuto schopnost signifikantně sníženou v porovnání s myšími fibroblasty s normální funkcí Suv39h1/h2 (P <0,05) (obr. 9Ba). Dále jsme odhalili, že metyltransferázy ovlivňují indukci fosforylace serinu 139 (γH2AX), jejíž množství u standardních myších fibroblastů rapidně vzrůstá již po 30 minutách od γ-ozáření

(5 Gy), zatímco u buněk Suv39h1/h2 dn jsme zaznamenali pouze slabý nárůst této histonové varianty (obr. 8A, B). Po 24 hodinách se u obou buněčných linií hladina γH2AX obnovila na původní úroveň, což potvrzuje fakt, že k fosforylaci histonu H2AX dochází v počátečních fázích oprav DNA (obr. 8A, B). U buněk s delecí genů Suv39h1/h2 jsme navíc pozorovali redukovanou hladinu opravného proteinu 53BP1 (obr. 8A, B), z čehož lze usuzovat, že mutanti by mohli mít narušenou opravnou dráhu cNHEJ. Abychom vyloučili vliv buněčného cyklu na množství proteinů, provedli jsme jeho analýzu pomocí průtokové cytometrie. Grafy na obr. 8C znázorňují rozložení buněčných populací v různých fázích buněčného cyklu (BC). Jak ukazují grafy, nezaznamenali jsme výrazné změny v profilech BC u neozářených ani u ozářených buněk. Třicet minut po ozáření je rozložení buněk téměř identické a po 24 h jsme naměřili nevýznamný posun buněk do G2-M fáze. Proto se domníváme, že detekované změny na úrovni proteinů (především histonů) jsou tedy pravděpodobně způsobeny poškozením DNA, nikoliv změnou v buněčném cyklu, která je v případě zvýšeného počtu buněk v S/G2 fázích doprovázena duplikací genomu.

Obrázek 8: Stanovení celkového množství vybraných histonových modifikací a opravných proteinů u buněk ovlivněných γ-zářením: A) Denzitomentrické nebo fluorescenční určení hladin proteinů a histonových modifikací pomocí westernového přenosu. Buňky byly vystaveny účinku γ-zaření (30 minut a 24h po ozáření). B) Kvantifikace celkových naměřených hodnot z western blotů (WB) softwarem ImageQuant TL. Hladiny proteinů 53BP1 a HP1β byly normalizovány k α- tubulinu (100 %) a hladiny histonových značek γH2AX, H3K9me2, H3K9me3, H4K20me2 a H4K20me3 byly vztaženy k celkovému množství histonu H3 (100 %). Sloupcové grafy odpovídají relativnímu množství proteinů vůči referenčnímu proteinu. C) Profily buněčného cyklu zaznamenány průtokovou cytometrií v neozářené nebo

γ-ozářené populaci myších fibroblastových linií Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn. Pomocí softwaru Mod- Fit bylo vypočteno procento buněk ve fázích cyklu G1 (červený pík), S (pík modře) a G2-M (zelený pík).

Obrázek 9: Jaderná distribuce proteinu HPβ a intenzita jeho akumulace v DNA lézi, indukované UVA zářením: A) Protein HP1β (zelená) v interfázních jádrech je soustředěn u Suv39h1/h2 wt do chromocenter a u Suv39h1/h2 dn je difuzně rozprostřen v buněčném jádře. Pokud není uvedeno jinak, buněčná jádra byla vizualizována pomocí fluorescenčního barviva DAPI (modře). B) Statisticky významně omezená schopnost akumulace mutantních buněk Suv39h1/h2 dn v místě poškození. Studentův t-test (P <0,05), hodnocen pro 30 jader od obou linií. Graf znázorňuje relativní intenzitu fluorescence ve vybrané oblasti zájmu-ROI (kolikrát se v ROI intenzita zvýšila oproti neozářené oblasti jádra). Nejnižší údaj v grafu znázorňuje 1,5 IQR spodního kvartilu, nejvyšší údaj 1,5 IQR horního kvartilu, horizontální linie znázorňuje medián. Meřítko (bíla linka) znázorňuje 10µm.

5.1.2 Funkce 53BP1 a γH2AX při opravě DNA závisí na Suv39h1/h2 metyltransferázách Na základě výsledků z westernového přenosu jsme se rozhodli podrobněji prostudovat jadernou distribuci markerů dvouřetězcových zlomů 53BP1 a γH2AX pomocí imunofluorescenčního barvení. Standardní (wt) a mutantní (dn) buňky byly vystaveny dvěma typům záření (UVA a γ-záření). Po ozáření vytváří reparační proteiny tzv. ložiska indukovaná ionizujícím ozářením (IRIF). Zjistili jsme, že buňky Suv39h1/h2 dn mají omezenou schopnost tvorby reparačních ohnisek (IRIF), pozitivních na protein 53BP1 a γH2AX (obr. 10A, B a 11A). Rozdíly v počtech ložisek 53BP1 mezi Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn jsou statisticky významné

(P <0,05). V programu LAS X bylo analyzováno pro každou linii 100 buněčných jader, průměrné hodnoty činily u standardních MEF 17 IRIF/buňka a u mutantní buněčné linie pouze 6 IRIF/buňka (obr. 10C). Před ozářením linie SUV39h1/h2 dn vykazovala celkově nižší absolutní fluorescenci γH2AX než buňky divokého typu (wt) (obr. 11B). Ačkoliv se absolutní fluorescence po γ-záření zvýšila u obou buněčných linií, u buněk Suv39h1/h2 dn nedošlo k tak markantnímu nárůstu, jako v případě buněk Suv39h1/h2 wt. V porovnání se standardními myšími fibroblasty (MEF) γ-záření indukovalo u mutantů tvorbu drobných a méně výrazných reparačních γH2AX-pozitivních ohnisek (obr. 11B). Zaznamenali jsme také změny v intenzitě fluorescence těchto markerů v lokálních DNA lézích, indukovaných UVA laserem o vlnové délce 355 nm, které vyvolává jak DSB, tak i přítomnost CPD. Výpočet relativní intenzity fluorescence akumulovaných proteinů byl proveden pro jednotlivé buňky jako podíl intenzity v ozářeném místě ROI a intenzity mimo oblast ROI. Pro všechny studované proteiny bylo hodnoceno nejméně 30 buněk z každé buněčné linie. Z průměrné hodnoty relativní intenzity fluorescence akumulace byl pro každou linii sestrojen příslušný graf. Obrázek 10D a 11A zobrazuje množství endogenního proteinu 53BP1 a γH2AX v ROI po mikroiradiaci. Akumulace 53BP1 byla dobře patrná v intervalu 12-180 min od ozáření, γH2AX se akumuluje v místě ozáření již velmi brzy (2-180 min po ozáření). Deficientní buňky mají zřetelně redukovanou akumulaci vybraných markerů DSB. Mutantní buňky se vyznačují i omezenou schopností akumulace γH2AX v lokální lézi v DNA, podobně jako jsme pozorovali při reakci na γ-záření (obr. 8A, B a 11). U divokého typu se relativní intenzita fluorescence proteinu 53BP1 v ROI zvýšila v průměru 4,5x, zatímco u Suv39h1/h2 dn došlo k navýšení méně než 2x, (P <0,05) (obr. 10D). Pro ověření vztahu mezi Suv39h1/h2 metyltransferázou, potažmo H3K9me3, a proteinem 53BP1, byly standardní buňky transfekovány plasmidovou DNA, kódující histonovou demetylázu GFP-JMJD2b. Tato demetyláza je zodpovědná za potlačení metylace H3K9me2/me3 v pericentromerickém heterochromatinu. Buňky se zvýšenou expresí enzymu GFP-JMJD2b vykazovaly nižší akumulaci reparačního proteinu 53BP1 v lokálních DNA lézích (obr. 10E). Z těchto výsledků usuzujeme, že metyltransferázy Suv39h1/h2 a jejich cílové substráty budou pravděpodobně hrát důležitou roli jak v počáteční, tak i v pozdní fázi opravy DNA mechanismem cNHEJ. Naše výsledky naznačují úzkou souvislost mezi funkcí metyltransferáz SUV39h1/h2 a opravným mechanismem cNHEJ.

Obrázek 10: Jaderná distribuce proteinu 53BP1 u Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn MEF v souvislosti s reakcí na poškození DNA: Rozložení proteinu 53BP1 (červená) v jádrech myších fibroblastů Suv39h1/h2 wt (A) a Suv39h1/h2 dn (B) před ozářením a po vystavení účinku γ-záření (5 Gy, 1 h). Grafy znázorňují absolutní intenzitu fluorescence vypočtenou softwarem LAS X - pro protein 53BP1 ukázáno červeně, pro DAPI modře. C) Srovnání počtu IRIF u linií Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn. U každé linie bylo spočítáno 100 buněčných jader kontrolních a 100 buněčných jader ozářených. Počty reparačních ohnisek byly zaneseny do grafu. γ-záření indukuje signifikantní zvýšení 53BP1 pozitivních ohnisek u Suv39h1/h2 wt ve srovnání s neozářenými MEF (Studentův t-test P<0,05). U Suv39h1/h2 dn je schopnost

79 tvorby ohnisek proteinu 53BP1 značně omezena. D) Porovnání akumulace proteinu 53BP1 (červená) v lokálních DNA lézích indukovaných UVA laserem 355 nm u buněk Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn. Relativní intenzita fluorescence v ROI byla stanovena u 30 buněk pro každou linii a z těchto hodnot byly zhotoveny grafy. Rozdíly mezi buňkami Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn v relativní intenzitě fluorescence v místě ozáření ROI (zelený rámeček) jsou statisticky významné (Studentův t-test P <0,05). E) Exogenní exprese histon demetylázy GFP-JMJD2b (zelená) utlumila akumulaci proteinu 53BP1 (červená) v DNA lézi u buněk s normálním karyotypem. Měřítko v panelech A, B představuje 10 µm a v D, E 5 µm.

Obrázek 11: Jaderná distribuce fosforylace serinu 139 histonu H2AX u buněk Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn MEF v poškozeném chromatinu: A) Porovnání akumulace γH2AX (červená) v UVA- indukované lokální DNA lézi u buněk Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn. B) Rozdílná hladina γH2AX (zelená) u buněk Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn za fyziologických podmínek a po vystavení účinkům γ-záření (1 hodina).

5.1.3 H4K20me3 interaguje s 53BP1 a při poškození DNA se účastní dráhy NHEJ H4K20me2 je nezbytná pro vazbu proteinu 53BP1 do místa zlomu v DNA (Hsiao a Mizzen 2013). My jsme se však zaměřili na posttranslační modifikaci H4K20me3, která dosud nebyla spojována s opravou DNA, a zjistili jsme, že reaguje na γ-záření i na UVA záření. Jak znázorňuje obrázek westernového přenosu (8A, B), u myších fibroblastů Suv39h1/h2 wt dochází k markantnímu nárůstu celkové hladiny H4K20me3 po 24h od γ-záření. Mikroiradiační pokusy odhalily, že množství této modifikace v kontrolní linii Suv39h1/h2 wt vzrůstá v oblasti ozářené

UVA laserem, zatímco koncentrace H4K20me1 a H4K20me2 se zde nemění (obr. 12Aa, C, D). Buňky s delecí opět vykazují odlišnou jadernou distribucí H4K20me3 a nižší odezvu této histonové značky na poškození DNA (obr. 12A, B). Podobně nevykazují změnu koncentrace H4K20me3 v mikroozářeném chromatinu ani standardní myší fibroblasty (Suv39h1/h2 wt) s uměle zvýšenou expresí histonové demetylázy GFP-JMJD2b (obr. 12E). Na obrázku 12B grafy a, b znázorňují absolutní intenzitu fluorescence v lokální DNA lézi (ROI). UVA záření indukuje přibližně 2x vyšší absolutní intenzitu fluorescence u fibroblastů Suv39h1/h2 wt než u Suv39h1/h2 dn. K nárůstu hladiny H4K20me3 v ROI došlo u buněk divokého typu po 15 minutách. Je zajímavé, že u mutantích buněk není H4K20me3 soustředěna do chromocenter, podobně jako izoformy HP1 (HP1β) (obr. 9A). Ionizující záření u buněk Suv39h1/h2 dn nevyvolalo změnu v intenzitě fluorescence (obr. 13Ab, d) a nedocházelo ani k významnému nárůstu H4K20me3 v oblasti DNA léze. Zvýšení hladiny H4K20me3 lze naopak pozorovat u buněk standardního typu (obr. 12A, 13Aa,c). Abychom zjistili, s jakou reparační dráhou je funkce H4K20me3 asociovaná, provedli jsme imunoprecipitaci 53BP1´a imunofluorescenční značení buněk transfekovaných plazmidem mCherry-53BP1. Obr. 13Aa-d ukazuje přítomnost H4K20me3 v 53BP1-pozitivních spontánních DNA lézích a IRIF u obou typů buněčných linií. Imunoprecipitační pokusy odhalily interakci mezi proteinem 53BP1 a histonovými modifikacemi (H3K9me3, H4K20me2 a H4K20me3) (obr. 13B, C). Je zajímavé, že vzájemná interakce mezi H3K9me3 a 53BP1, nebo H4K20me3 a 53BP1, byla zvýšena v buňkách Suv39h1/h2 dn, u kterých také došlo k silnější interakci mezi H4K20me2 a 53BP1 po poškození γ-zářením (obr. 13B, C). Z toho vyplývá, že interakce mezi proteinem 53BP1 a H4K20me3 není závislá na funkci Suv39h1/2, a že se 53BP1 váže na H4K20me3 i za fyziologických podmínek. Při stresu dochází pravděpodobně pouze ke zvýšení hladin těchto interakčních partnerů, jejich vzájemná vazba však zůstává stejná. Celkové množství proteinu 53BP1 a H4K20me3 ovlivňují funkční metyltransferázy Suv39h1/h2, jejichž hladina se zvyšuje v důsledku poškození DNA (Ayrapetov et al., 2014). Z tohoto důvodu pravděpodobně dochází i k nárůstu hladin 53BP1 a H4K20me3 po ozáření.

Obrázek 12: Srovnání intenzity fluorescence H4K20me1/me2/me3 v lokální DNA lézi: A) Koncentrace histonové značky H4K20me3 uvnitř chromatinu poškozenému UVA laserem u myších fibroblastů Suv39h1/h2 wt (a) a buněk Suv39h1/h2 dn (b). B) Grafy absolutní intenzity fluorescence (softwarem LAS X) v ROI (zelený rámeček). Kvantifikace množství H4K20me3 v ROI u buněk Suv39h1/h2 wt (a) a buněk Suv39h1/h2 dn (b). Distribuce histonových modifikací uvnitř DNA léze indukované UVA laserem. C) H4K20me1 (červená), D) H4K20me2 (červená) a opravného markeru f γH2AX (světle modrá) u buněk Suv39h1/h2 wt. E) Exogenní exprese histonové demetylázy GFP-JMJD2b (zelená) u standardních buněk bránila zvýšení koncentrace H4K20me3 (světle modrá) v poškozeném chromatinu.

Obrázek 13: Rozložení proteinu 53BP1 a modifikace H4K20me3 v buňkách Suv39h1/h2 wt a Suv39h1/h2 dn MEF vystavených γ-záření: A) Jaderná distribuce H4K20me3 (zelená) a proteinu 53BP1 (červená) v neozářených myších fibroblastech (a, b), nebo po působení γ-záření o dávce 5 Gy (c, d). Buňky byly fixovány v intervalech 1 hodina a 24 hodin po ozáření. Šipky ukazují kolokalizaci H4K20me3 a 53BP1 v 53BP1-pozitivních spontánních lézích DNA i v reparačních ohniscích (IRIF). B) Imunoprecipitační experimenty (IP) ukázaly interakci mezi histonovými modifikacemi (H3K9me3, H4K20me2, H4K20me3) a reparačním proteinem 53BP1. Protein HP1β neinteragoval s proteinem 53BP1. C) Kvantifikace IP fragmentů, hvězdičky (*) označují statistickou významnost (P<0,05).

5.1.4 Hladina H4K20me3 v místě poškození DNA závisí na fázích buněčného cyklu Protože jsme předpokládali, že modifikace H4K20me3 souvisí s opravným mechanismem cNHEJ, který buňka využívá především v G1 fázi BC, studovali jsme hladinu H4K20me3 v lokálních DNA lézích během různých fází cyklu u dvou buněčných modelů. K této analýze jsme využívali jednak HeLa-Fucci systém, exprimující RFP-Cdt1 během G1 fáze, a GFP-geminin v S/G2 fázi. U myších fibroblastů byly fáze G1 a G2 od sebe rozpoznány na základě jaderného rozložení fosforylace H3S10 (Bártová a kol., 2018), fáze S pak podle typické distribuce proliferačního buněčného jaderného antigenu (PCNA) (Bártová et al., 2017). Nejvyšší hladinu H4K20me3 v mikro ozářené oblasti chromatinu MEF jsme detekovali ve fázi G1. V dalším průběhu BC hladina H4K20me3 klesala až na nejnižší hodnotu ve fázi G2, což jasně ukazují grafy absolutní intenzity (obr. 14A-C.). Když jsme zvýšili expresi proteinu BRCA1, akumulujícího se v G2 fázi BC, pomocí tramsfekce GFP-BRCA1, pozorovali jsme u standardních buněk se zvýšenou expresí GFP-BRCA1 sníženou hladinu H4K20me3 v místě poškození DNA (obr. 14D). Závislost koncentrace H4K20me3 v místě poškození na BC jsme potvrdili také u HeLa- Fucci buněk. Marker γH2AX (uplatňující se v cNHEJ i HRR opravné dráze) se stejnou mírou akumuluje ve všech fázích BC (obr. 14E), avšak hustota histonové značky H4K20me3 v ROI vykazuje stejný trend, jako u MEF.

Obrázek 14: Závislost koncentrace H4K20me3 v DNA lézi na buněčném cyklu: A) G1 fáze buněčného cyklu rozlišena podle jaderné distribuce H3S10 fosforylace (ph) (červená) a zvýšené množství H4K20me3 (zelená) v ROI (žlutý rámeček). Graf znázorňuje absolutní intenzitu fluorescence v ROI. B) Pozdní S fázi buněčného cyklu charakterizují ložiska proteinu PCNA (červená) v nukleoplazmě a silná akumulace v ROI.

Koncentrace H4K20me3 (zelená) v místě poškození redukována. Graf znázorňuje absolutní intenzitu fluorescence v ROI. C) V G2 fázi buněčného cyklu H3S10ph (červená) utváří výrazná jaderná ohniska, navíc v této fázi byla nejnižší hladina H4K20me3 (zelená) v místě poškození. Graf znázorňuje absolutní intenzitu fluorescence v ROI. D) Buňka s exogenní expresí GFP-BRCA1 byla charakteristická oslabením koncentrace H4K20me3 v DNA lézi. Panel E) ukazuje HeLa Fucci buňky exprimujících RFP-Cdt1 (červená) během G1 fáze a GFP-geminin (zelená) během S a G2 fáze BC. V těchto fázích BC byla zjištěna konstantní akumulace γH2AX (fialová), ale změna hladiny H4K20me3 (světle modrá) v poškozeném chromatinu v průběhu BC. Měřítko ve všech panelech představuje 10 µm.

6 DISKUZE

Náplní předkládané práce bylo studium epigenetických změn na úrovni DNA, RNA a histonů, ke kterým dochází při poškození a následné opravě DNA, pomocí pokročilých konfokálních metod. V posledních letech zájem o tuto problematiku značně vzrůstá, avšak stále zůstává hodně nezodpovězených otázek, zejména pak jak jsou mechanismy opravy DNA regulovány. Náš výzkum přispívá k pochopení těchto složitých dějů, navozených replikačním stresem v důsledku ozáření ionizujícím i neionizujícím zářením.

6.1 Chování histonových značek po radiačním poškození a v průběhu oprav DNA

Specifické post-translační modifikace histonů slouží jako poznávací značka pro proteiny signálních drah opravy DNA. Změny v epigenetickém kódu jsou nezbytnou součástí odpovědi na poškození DNA. Z hlediska reakce na poškození DNA byla největší pozornost věnována fosforylaci serinu 139 histonu H2A (γH2AX) a dimetylaci H4K20, která představuje vazebný epigenetický marker pro protein 53BP1 při opravě DNA (Botuyan et al., 2006). Po poškození DNA se 53BP1 váže na H4K20me2 prostřednictvím tandemové domény Tudor 53BP1. V místě dvouvláknových zlomů DNA dochází k utváření reparačních ohnisek 53BP1 v těsné blízkosti již dříve dimetylovaného histonu H4 v pozici lysinu 20 a tuto interakci potlačuje acetylace H4K16 (Hsiao a Mizzen, 2013). V naší práci jsme však ukázali, že na rozdíl od H4K20me1 a H4K20me2 se v lokálních DNA lézích indukovaných UVA laserem hojně objevuje trimetylace H4K20me3, a to po 15 minutách od ozáření (obr. 12A). Nejvýraznější je H4K20me3 uvnitř poškozené DNA v G1 fázi a její intenzita v průběhu buněčného cyklu postupně slábne (obr. 14). V pozdní S fázi se v zasaženém chromatinu markantně akumuluje protein PCNA (Bártová et al., 2017), a proto předpokládáme, že množství H4K20me3 by mohlo být omezeno právě PCNA. Nejen protein BRCA1, ale i PCNA, rozhoduje tedy o tom, zda buňka využije k opravě DSB dráhu NHEJ, nebo HRR. Přestože obecně je značka H4K20me3, lokalizovaná v oblastech promotorů a transpozonů,

100 především spojována s represí transkripce (Mikkelsen et al., 2007), zde odhalujeme její novou důležitou funkci při opravných procesech probíhajících v genomu organizmů. Jak již bylo zmíněno, homologní rekombinace je vázána na S fázi BC (Moynahan a Jasin, 2010), proto na základě našich výsledků můžeme usuzovat, že H4K20me3 hraje úlohu při nehomologním spojování konců (NHEJ). Toto pozorování podporuje skutečnost, že v S fázi buněčného cyklu klesá schopnost 53BP1 rozpoznávat chromatin v DSB, což je způsobeno „vyředěním“ H4K20me2 během replikace (Pellegrino et al., 2017). Simonetta et al. (2018) dále prokázali, že dimetylace H4K20 se objevuje v místech DSB současně s proteinem MAD2L2, což následně umožní tvorbu proteinového komplexu 53BP1 a RIF1 (Simonetta et al., 2018). Nereplikující buňky s vysokou hladinou H4K20me2 rovněž charakterizuje výrazný nárůst komplexu 53BP1-RIF1-MAD2L2 v poškozeném chromatinu. Bylo zjištěno, že během replikace DNA se množství H4K20me2 může redukovat na polovinu a z oblasti DSB je uvolněn soubor proteinů 53BP1-RIF1-MAD2L2, který nahrazuje protein BRCA1. Zde jsme ukázali, že zvýšení exprese BRCA1 pomocí plazmidové transfekce také redukuje koncentraci H4K20me3 v ozářeném chromatinu (obr. 12E). Ačkoliv jsme nepotvrdili navýšení hladiny H4K20me2 v lokální DNA lézi (obr. 12D), nelze vyloučit, že její množství v ozářených oblastech dostačuje k navázání proteinu 53BP1 na DSB, jak bylo již dříve publikováno (Botuyan et al., 2006). Kromě toho imunoprecipitace potvrdila interakci mezi 53BP1 a H4K20me2 jak v ozářených, tak v neozářených buňkách, přičemž jejich vazbu neovlivňuje deplece genů pro metyltransferázy SUV39H1/H2 (obr. 13B, C). Dále jsme ukázali vzájemnou funkční spojitost mezi histonovými modifikacemi H4K20me3, H3K9me3 a proteinem 53BP1. Imunoprecipitace odhalila, že ani vazba mezi proteinem 53BP1 a H3K9me3, ale také mezi 53BP1 a H4K20me3, není podmíněna funkcí metyltransferáz Suv39h1/h2 a síla jejich interakce se nemění po vystavení γ-záření (obr. 13B, C). Vzájemné (reciproční) působení těchto histonových modifikací by mohlo potenciálně přispět k dimerizaci proteinu 53BP1, což je podstatné pro opravný mechanismus cNHEJ. Do jisté míry 53BP1 rozpoznává chromatin v DSB i ve fázi G2 (Suchankova et al., 2015), ačkoliv metylace H4K20 jsou oslabeny (obr. 12 a 14) (Simonetta et al., 2018). Existenci 53BP1 v DNA lézi během G2 fáze můžeme vysvětlit následujícími způsoby:

101

• 53BP1 také interaguje s H3K9me3 a s H3K79me2, což je podle autorů Wakeman et al. (2012) hlavní histonový cíl proteinu 53BP1 v místech DSB v pozdních fázích BC (Wakeman et al., 2012). • Hladiny H4K20me2 a H4K20me3 by měly být v postreplikačních fázích buněčného cyklu dostatečné pro akumulaci 53BP1 v poškozeném chromatinu. Tyto výsledky naznačují, že metyltransferázy Suv39h1/h2 jsou nezbytné pro lokalizaci jednotlivých reparačních faktorů do oblasti poškozené DNA, ale ne pro jejich vzájemnou vazbu (obr. 10 a 13). Protein HP1β patří k dobře charakterizovaným interakčním partnerům H3K9me3, avšak jak jsme prokázali, na rozdíl od H3K9me3 neinteraguje s 53BP1. To potvrzuje předešlé zjištění Zarebského et al. (2009), kteří popsali existenci izoforem HP1 v DNA lézi, nezávislou na H3K9me3 a podmíněnou jejich disociací (Zarebski et al., 2009). HP1β se vyskytuje společně s CPD, proto má pravděpodobně funkci v excizních opravách DNA, a naopak H3K9me3 společně s H4K20me3 sehrávají úlohu při opravě DSB. To potvrzuje i Sun et al. (2009) ve své práci, kde popisují interakci mezi acetyltransferázou Tip60 a H3K9me3, stěžejní pro zahájení opravné dráhy HHR. My zde předkládáme nové poznatky o zapojení H3K9me3 a H4K20e3 do mechanismu cNHEJ prostřednictvím interakce 53BP1. Schotta et al. (2004) již dříve prokázali spojitost mezi trimetylací histonu H3 lysinu 9 a trimetylací histonu H4 lysinu 20, což také potvrdily naše experimenty. H4K20me3 je podobně jako H3K9me3 soustředěna do chromocenter v interfázních jádrech, kde spolu kolokalizují (Schotta et al., 2004). To patrně souvisí s naším pozorováním, že deplece histon metyltransferáz Suv39hl/h2 znemožňuje nárůst H4K20me3 v lokální DNA lézi, a navíc oslabí akumulaci 53BP1 i tvorbu reparačních ohnisek po γ-záření (obr. 10 a 12). V posledních letech se ukazuje, že lysin v poloze 20 histonu H4 může být metylován i jinými enzymy, než jsou Suv4-20h nebo SETD8, jako například MMSET / WHSC1 (Hajdu et al., 2011; Pei et al., 2011). Na základě našich experimentů navrhujeme, že i metyltransferázy Suv39h1/h2 za určitých podmínek přispívají k trimetylaci lysinu 20 na histonu H4. Také jsme pozorovali korelaci mezi funkčními metyltransferázami Suv39h1/h2 a globální hladinou dimetylace H3K9, které souvisí s HRR (Sun et al., 2010). Peters a kol. 2001 prokázali, že myší jedinci s deficiencí metyltransferáz Suv39h1/h2 mají narušený vývoj a často se u nich vyskytují nádory (Peters et al., 2001). Naše výsledky by mohly tyto defekty vysvětlit, protože jsme u mutantních buněk pozorovali sníženou 102 reakci na poškození. Obrázek 24 znázorňuje množství opravných faktorů v lokální DNA lézi, vyvolané UVA laserem o stejné intenzitě u standartních MEF a mutantních myších fibroblastů. Disfunkce Suv39h1/h2 metyltransferáz koreluje s celkově redukovanou hladinou proteinu 53BP1 a s omezenou fosforylací serinu 139 histonu H2AX. Vyvstává zde otázka, zda delece genů způsobí celkové snížení markeru opravy DNA, nebo buňky díky deleci nejsou k záření tak citlivé, či mají posílen jiný mechanismus opravy.

Obrázek 24: Schematické znázornění opravných faktorů v DNA lézi u standardních MEF a myších fibroblastů s delecí v genech pro SUV39H1/H2. Barevné tečky ilustrují množství vybraných proteinů a histonových modifikací v chromatinu, ozářeném lokálně UVA laserem (oblast ROI znázorněna bílým obdélníkem): HP1p (růžová), H3K9me3 (oranžová), H3K9ac (tmavě zelená), H4K20me3 (červená), γH2AX (světle zelená) a 53BP1 (bílá).

Celkově jsme ukázali, že v chromatinu poškozeném UVA zářením se nachází trimetylace histonů H3K9 a H4K20, které jsou závislé na funkčních metyltransferázách Suv39h1/h2. Naše výsledky dále naznačují kooperaci mezi H3K9me3, H4K20me3 a Suv39h1/h2, patrně důležitou pro signalizaci mechanismu cNHEJ. H4K20me3 je nejvýraznější v místě opravy během G1 fáze buněčného cyklu, proto se domníváme, že jakmile buňky vstoupí do pozdní S fáze, dojde k nahrazení komplexu H3K9me3-H3K20me3-53BP1 reparačními proteiny PCNA-BRCA1, typickými pro dráhu HRR.

103

Z dosavadních poznatků vyplývá, že úspěšná oprava DNA bezpochyby závisí na posttranslačních úpravách histonů. Kromě dobře známé fosforylace serinu 139 histonu H2AX jsme zde poukázali na významnou úlohu metylací H3K9me3 a H4K20me3. Do signálních drah DDR jsou však zapojeny mnohé další histonové modifikace (viz tabulka 2).

104

7 ZÁVĚR

Předmětem této disertační práce bylo prohloubit dosavadní poznatky v podoblasti výzkumu, zaměřeného na opravu poškozené DNA. Jelikož jednou ze základních podmínek fyziologického vývoje organizmu je zachování integrity genomu, disponuje každý jedinec složitou sítí signálních drah, které zajištují ochranu genetické informace. V posledních letech se ukazuje, že epigenetické faktory a remodelace chromatinu mají velký podíl na regulaci těchto dějů. Zde jsme studovali změny na úrovni metylace DNA, posttranskripčních modifikací RNA a posttranslačních modifikací histonů, ke kterým dochází v průběhu opravy poškozené DNA. Nejzávažnější chybou v sekvenci DNA jsou dvouřetězcové zlomy, pro jejichž opravu buňka využívá mechanismus homologní rekombinace, kanonického nehomologního spojování konců, nebo alternativního nehomologního spojování konců. Dobře charakterizované histonové modifikace H2AX a H4K20me2 slouží jako stěžejní faktory opravných drah DSB. Zjistili jsme, že histonová značka H4K20me3 se také účastní reparační dráhy cNHEJ prostřednictvím interkace s proteinem 53BP1. Koncentrace této histonové značky v DNA lézi navíc závisí na fázi BC. Nejvýraznější je v G1 fázi, kdy se také přednostně uplatňuje NHEJ. K regulaci signalizace DDR dochází na všech epigentických úrovních, které se vzájemně ovlivňují. Prokázali jsme korelaci mezi delecí genů pro histon metyltransferázy SUV39H1/H2 a nižší metylací histonu H3 a H4. U buněk, které nedisponují enzymy Suv39h1/h2, jsme navíc pozorovali omezenou retenci DNA metyltransferázy 1 (Dnmt1) do lokální UVA léze. Takto narušený metylační stav také snižuje difuzi hypermetylovaných molekul RNA (m6A) do jádra, vyvolanou UV zářením. Zjistili jsme, že velice rychlá akumulace m6A v lokální DNA lézi byla nahrazena redukcí trimetylace guaninu (m3G/TMG), která se specificky vyskytuje na malé jaderné RNA (snRNA). V pozdějších krocích opravných mechanismů pravděpodobně dochází k aktivní demetylaci, doprovázenou přeměnou 5mC na 5hmC a konečný 5caC. Naše výsledky naznačují, že demetylační procesy účinněji probíhají v nádorových buňkách. Výše uvedené experimenty potvrzují důležitou úlohu epigenetiky v opravných drahách. Klíčem k rozluštění složitých signálních drah DDR je propojení poznatků na všech molekulárních úrovních. Tato závěrečná práce rozšířila dosavadní informace o významu komplexní a dobře fungující epigenetické krajiny v průběhu opravy poškozené DNA

109

8 SEZNAM LITERATURY

Adimoolam, S., Sirisawad, M., Chen, J., et al. (2007). HDAC inhibitor PCI-24781 decreases RAD51 expression and inhibits homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19482-19487. Akichika, S., Hirano, S., Shichino, Y., et al. (2019). Cap-specific terminal N (6)-methylation of RNA by an RNA polymerase II-associated methyltransferase. Science 363, Alarcon, C.R., Lee, H., Goodarzi, H., et al. (2015). N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature 519, 482-485. Alberts, B. (1998). Essential cell biology: an introduction to the molecular biology of the cell (New York: Garland Publishing). An, J., González-Avalos, E., Chawla, A., et al. (2015). Acute loss of TET function results in aggressive myeloid cancer in mice. Nat Commun 6, 10071-10071. Antequera, F. (2003). Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci 60, 1647-1658. Aparicio, T., Baer, R., Gottesman, M., and Gautier, J. (2016). MRN, CtIP, and BRCA1 mediate repair of topoisomerase II-DNA adducts. The Journal of cell biology 212, 399-408. Ayrapetov, M.K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., et al. (2014). DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 9169- 9174. Barau, J., Teissandier, A., Zamudio, N., et al. (2016). The DNA methyltransferase DNMT3C protects male germ cells from transposon activity. Science 354, 909-912. Bartova, E., Legartova, S., Krejci, J., et al. (2018). Depletion of A-type lamins and Lap2alpha reduces 53BP1 accumulation at UV-induced DNA lesions and Lap2alpha protein is responsible for compactness of irradiated chromatin. Journal of cellular biochemistry 119, 8146-8162. Bártová, E., Suchánková, J., Legartová, S., et al. (2017). PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S-phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma 254, 2035-2043. Bártová, E., Šustáčková, G., Stixová, L., et al. (2011). Recruitment of Oct4 Protein to UV- Damaged Chromatin in Embryonic Stem Cells. PLOS ONE 6, e27281. Bellizzi, D., D'Aquila, P., Scafone, T., et al. (2013). The control region of mitochondrial DNA shows an unusual CpG and non-CpG methylation pattern. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 20, 537-547. Bensaude, O. (2011). Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity? Transcription 2, 103-108. Bestor, T.H. (2000). The DNA methyltransferases of mammals. Human Molecular Genetics 9, 2395-2402. Bétermier, M., Bertrand, P., and Lopez, B.S. (2014). Is Non-Homologous End-Joining Really an Inherently Error-Prone Process? PLoS genetics 10, e1004086. Bianco, P.R., Tracy, R.B., and Kowalczykowski, S.C. (1998). DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library 3, D570-603. Bird, A. (1997). Does DNA methylation control transposition of selfish elements in the germline? Trends in Genetics 13, 469-470.

110

Bird, A. (2002). DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & development 16, 6- 21. Bogdanović, O., and Veenstra, G.J.C. (2009). DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma 118, 549-565. Bokar, J.A., Shambaugh, M.E., Polayes, D., et al. (1997). Purification and cDNA cloning of the AdoMet-binding subunit of the human mRNA (N6-adenosine)-methyltransferase. RNA 3, 1233- 1247. Botuyan, M.V., Lee, J., Ward, I.M., et al. (2006). Structural basis for the methylation state- specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell 127, 1361-1373. Bradbury, E.M. (1978). Histone Interactions, Histone Modifications and Chromatin Structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences 283, 291-293. Brehove, M., Wang, T., North, J., et al. (2015). Histone core phosphorylation regulates DNA accessibility. The Journal of biological chemistry 290, 22612-22621. Britton, L.-M.P., Newhart, A., Bhanu, N.V., et al. (2013). Initial characterization of histone H3 serine 10 O-acetylation. Epigenetics 8, 1101-1113. Brown, J.A.L., Eykelenboom, J.K., and Lowndes, N.F. (2012). Co-mutation of histone H2AX S139A with Y142A rescues Y142A-induced ionising radiation sensitivity. FEBS Open Bio 2, 313-317. Brownell, J.E., Zhou, J., Ranalli, T., et al. (1996). Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84, 843-851. Caldecott, K.W. (2003). DNA Single-Strand Break Repair and Spinocerebellar Ataxia. Cell 112, 7-10. Cao, X., Aufsatz, W., Zilberman, D., et al. (2003). Role of the DRM and CMT3 Methyltransferases in RNA-Directed DNA Methylation. Current Biology 13, 2212-2217. Carlberg, C., and Molnár, F. (2018). Human Epigenomics. Ciccia, A., and Elledge, S.J. (2010). The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell 40, 179-204. Clark, J.P., and Lau, N.C. (2014). Piwi Proteins and piRNAs step onto the systems biology stage. Adv Exp Med Biol 825, 159-197. Couturier, M., and Lindås, A.-C. (2018). The DNA Methylome of the Hyperthermoacidophilic Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. Front Microbiol 9, 137-137. D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I., and Poirier, G.G. (1999). Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. The Biochemical journal 342 ( Pt 2), 249-268. D'Amours, D., and Jackson, S.P. (2002). The Mre11 complex: at the crossroads of dna repair and checkpoint signalling. Nature reviews. Molecular cell biology 3, 317-327. Demple, B., and DeMott, M.S. (2002). Dynamics and diversions in base excision DNA repair of oxidized abasic lesions. Oncogene 21, 8926-8934. Deplus, R., Brenner, C., Burgers, W.A., et al. (2002). Dnmt3L is a transcriptional repressor that recruits histone deacetylase. Nucleic Acids Res 30, 3831-3838. Deshmukh, S., Ponnaluri, V.K.C., Dai, N., et al. (2018). Levels of DNA cytosine methylation in the Drosophila genome. PeerJ 6, e5119. Dhall, A., Wei, S., Fierz, B., et al. (2014). Sumoylated human histone H4 prevents chromatin compaction by inhibiting long-range internucleosomal interactions. The Journal of biological chemistry 289, 33827-33837.

111

Dinant, C., Bartek, J., and Bekker-Jensen, S. (2012). Histone displacement during nucleotide excision repair. Int J Mol Sci 13, 13322-13337. Ding, N., Bonham, E.M., Hannon, B.E., et al. (2016). Mismatch repair proteins recruit DNA methyltransferase 1 to sites of oxidative DNA damage. Journal of molecular cell biology 8, 244- 254. Drane, P., Brault, M.E., Cui, G., et al. (2017). TIRR regulates 53BP1 by masking its histone methyl-lysine binding function. Nature 543, 211-216. Drohat, A., and T Coey, C. (2016). Role of Base Excision "Repair" Enzymes in Erasing Epigenetic Marks from DNA. Chemical reviews 116, Easwaran, H.P., Leonhardt, H., and Cardoso, M.C. (2005). Cell cycle markers for live cell analyses. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 4, 453-455. Easwaran, H.P., Schermelleh, L., Leonhardt, H., and Cardoso, M.C. (2004). Replication- independent chromatin loading of Dnmt1 during G2 and M phases. EMBO Rep 5, 1181-1186. Edwards, J.R., Yarychkivska, O., Boulard, M., and Bestor, T.H. (2017). DNA methylation and DNA methyltransferases. Epigenetics Chromatin 10, 23-23. Fabbrizio, E., El Messaoudi, S., Polanowska, J., et al. (2002). Negative regulation of transcription by the type II arginine methyltransferase PRMT5. EMBO Rep 3, 641-645. Fan, D.N., Tsang, F.H., Tam, A.H., et al. (2013). Histone lysine methyltransferase, suppressor of variegation 3-9 homolog 1, promotes hepatocellular carcinoma progression and is negatively regulated by microRNA-125b. Hepatology (Baltimore, Md.) 57, 637-647. Fei, J., Kaczmarek, N., Luch, A., et al. (2011). Regulation of nucleotide excision repair by UV- DDB: prioritization of damage recognition to internucleosomal DNA. PLoS Biol 9, e1001183. Feng, S., and Jacobsen, S.E. (2011). Epigenetic modifications in plants: an evolutionary perspective. Curr Opin Plant Biol 14, 179-186. Fidalgo da Silva, E., and Reha-Krantz, L.J. (2007). DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Res 35, 5452-5463. Filion, G.J.P., Zhenilo, S., Salozhin, S., et al. (2006). A family of human zinc finger proteins that bind methylated DNA and repress transcription. Mol Cell Biol 26, 169-181. Finch, J.T., and Klug, A. (1976). Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 1897-1901. Fnu, S., Williamson, E.A., De Haro, L.P., et al. (2011). Methylation of histone H3 lysine 36 enhances DNA repair by nonhomologous end-joining. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 540-545. Fong, J.J., Nguyen, B.L., Bridger, R., et al. (2012). β-N-Acetylglucosamine (O-GlcNAc) is a novel regulator of mitosis-specific phosphorylations on histone H3. The Journal of biological chemistry 287, 12195-12203. Fousteri, M., and Mullenders, L.H. (2008). Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects. Cell research 18, 73-84. Fousteri, M., Vermeulen, W., van Zeeland, A.A., and Mullenders, L.H. (2006). Cockayne syndrome A and B proteins differentially regulate recruitment of chromatin remodeling and repair factors to stalled RNA polymerase II in vivo. Mol Cell 23, 471-482. Fraga, M.F., Ballestar, E., Paz, M.F., et al. (2005). Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 10604-10609. Fu, Y., Luo, G.-Z., Chen, K., et al. (2015). N6-methyldeoxyadenosine marks active transcription start sites in Chlamydomonas. Cell 161, 879-892.

112

Fujita, N., Shimotake, N., Ohki, I., et al. (2000). Mechanism of transcriptional regulation by methyl-CpG binding protein MBD1. Mol Cell Biol 20, 5107-5118. Fuks, F., Hurd, P.J., Deplus, R., and Kouzarides, T. (2003). The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res 31, 2305- 2312. Gagnon, J., Daou, S., Zamorano, N., et al. (2015). Undetectable histone O-GlcNAcylation in mammalian cells. Epigenetics 10, 677-691. Garzon, R., Liu, S., Fabbri, M., et al. (2009). MicroRNA-29b induces global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting directly DNMT3A and 3B and indirectly DNMT1. Blood 113, 6411-6418. Gelot, C., Magdalou, I., and S Lopez, B. (2015). Replication Stress in Mammalian Cells and Its Consequences for Mitosis. Genes 6, 267-298. Goll, M.G., Kirpekar, F., Maggert, K.A., et al. (2006). Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science 311, 395-398. Gottlieb, T.M., and Jackson, S.P. (1993). The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen. Cell 72, 131-142. Gowher, H., Liebert, K., Hermann, A., et al. (2005). Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases by Dnmt3L. The Journal of biological chemistry 280, 13341-13348. Gracheva, E., Chitale, S., Wilhelm, T., et al. (2016). ZRF1 mediates remodeling of E3 ligases at DNA lesion sites during nucleotide excision repair. The Journal of cell biology 213, jcb.201506099. Grawunder, U., Wilm, M., Wu, X., et al. (1997). Activity of DNA ligase IV stimulated by complex formation with XRCC4 protein in mammalian cells. Nature 388, 492-495. Greenberg, R.A. (2008). Recognition of DNA double strand breaks by the BRCA1 tumor suppressor network. Chromosoma 117, 305-317. Greer, E.L., Blanco, M.A., Gu, L., et al. (2015). DNA Methylation on N6-Adenine in C. elegans. Cell 161, 868-878. Grin, I., and Ishchenko, A.A. (2016). An interplay of the base excision repair and mismatch repair pathways in active DNA demethylation. Nucleic Acids Res 44, 3713-3727. Gruenbaum, Y., Stein, R., Cedar, H., and Razin, A. (1981). Methylation of CpG sequences in eukaryotic DNA. FEBS Letters 124, 67-71. Gujar, H., Weisenberger, D.J., and Liang, G. (2019). The Roles of Human DNA Methyltransferases and Their Isoforms in Shaping the Epigenome. Genes 10, 172. Guo, F., Li, X., Liang, D., et al. (2014). Active and Passive Demethylation of Male and Female Pronuclear DNA in the Mammalian Zygote. Cell stem cell 15, 447-459. Guseinov A, V., Kiryanov, G., and Vanyushin, B. (1975). Intragenome distribution of 5- methylcytosine in DNA of healthy and wilt-infected cotton plants (Gossypium hirsutum L.), Vol 2. Gustafsson, J.R., Katsioudi, G., Degn, M., et al. (2018). DNMT1 regulates expression of MHC class I in post-mitotic neurons. Molecular Brain 11, 36. Ha, K., Lee, G.E., Palii, S.S., et al. (2011). Rapid and transient recruitment of DNMT1 to DNA double-strand breaks is mediated by its interaction with multiple components of the DNA damage response machinery. Hum Mol Genet 20, 126-140.

113

Hajdu, I., Ciccia, A., Lewis, S.M., and Elledge, S.J. (2011). Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 is involved in the cellular response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 13130-13134. Hannah, J., and Zhou, P.B. (2013). The CUL4A ubiquitin ligase is a potential therapeutic target in skin cancer and other malignancies. Chinese journal of cancer 32, 478-482. Hartlerode, A.J., and Scully, R. (2009). Mechanisms of double-strand break repair in somatic mammalian cells. The Biochemical journal 423, 157-168. Hermann, A., Gowher, H., and Jeltsch, A. (2004a). Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 61, 2571-2587. Hermann, A., Goyal, R., and Jeltsch, A. (2004b). The Dnmt1 DNA-(cytosine-C5)- methyltransferase methylates DNA processively with high preference for hemimethylated target sites. The Journal of biological chemistry 279, 48350-48359. Hess, M.T., Schwitter, U., Petretta, M., et al. (1997). Bipartite substrate discrimination by human nucleotide excision repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 6664-6669. Hong, K. (2018). Emerging function of N6-methyladenosine in cancer. Oncol Lett 16, 5519-5524. Horii, T., and Hatada, I. (2016). Regulation of CpG methylation by Dnmt and Tet in pluripotent stem cells. J Reprod Dev 62, 331-335. Hossain, M.A., Lin, Y., and Yan, S. (2018). Single-Strand Break End Resection in Genome Integrity: Mechanism and Regulation by APE2. Int J Mol Sci 19, 2389. Hsiao, K.Y., and Mizzen, C.A. (2013). Histone H4 deacetylation facilitates 53BP1 DNA damage signaling and double-strand break repair. Journal of molecular cell biology 5, 157-165. Huang, H., Weng, H., Sun, W., et al. (2018a). Recognition of RNA N(6)-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation. Nature cell biology 20, 285-295. Huang, Y., Gu, L., and Li, G.M. (2018b). H3K36me3-mediated mismatch repair preferentially protects actively transcribed genes from mutation. The Journal of biological chemistry 293, 7811- 7823. Hustedt, N., and Durocher, D. (2016). The control of DNA repair by the cell cycle. Nature cell biology 19, 1. Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R.A., Jr., et al. (2004). Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature 432, 406-411. Chédin, F., Lieber, M.R., and Hsieh, C.-L. (2002). The DNA methyltransferase-like protein DNMT3L stimulates de novo methylation by Dnmt3a. Proceedings of the National Academy of Sciences 99, 16916-16921. Chen, J., Le, S., Basu, A., et al. (2015). Mechanochemical regulations of RPA's binding to ssDNA. Scientific Reports 5, 9296. Chen, T., Ueda, Y., Xie, S., and Li, E. (2002). A novel Dnmt3a isoform produced from an alternative promoter localizes to euchromatin and its expression correlates with active de novo methylation. The Journal of biological chemistry 277, 38746-38754. Chen, Y., Sprung, R., Tang, Y., et al. (2007). Lysine propionylation and butyrylation are novel post-translational modifications in histones. Mol Cell Proteomics 6, 812-819. Cheng, X., and Blumenthal, R.M. (2008). Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective. Structure 16, 341-350. Choudhary, C., Kumar, C., Gnad, F., et al. (2009). Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science 325, 834-840.

114

Ito, S., Shen, L., Dai, Q., et al. (2011). Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5- formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 333, 1300-1303. Jackson, S.P., and Bartek, J. (2009). The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461, 1071. Jacquet, K., Fradet-Turcotte, A., Avvakumov, N., et al. (2016). The TIP60 Complex Regulates Bivalent Chromatin Recognition by 53BP1 through Direct H4K20me Binding and H2AK15 Acetylation. Molecular cell 62, 409-421. Jain, D., Meydan, C., Lange, J., et al. (2017). rahu is a mutant allele of Dnmt3c, encoding a DNA methyltransferase homolog required for meiosis and transposon repression in the mouse male germline. PLoS genetics 13, e1006964. Jeltsch, A., and Jurkowska, R.Z. (2016). Allosteric control of mammalian DNA methyltransferases - a new regulatory paradigm. Nucleic Acids Res 44, 8556-8575. Ji, P., Wang, X., Xie, N., and Li, Y. (2018). N6-Methyladenosine in RNA and DNA: An Epitranscriptomic and Epigenetic Player Implicated in Determination of Stem Cell Fate. Stem Cells Int 2018, 18. Jiang, D., Wei, S., Chen, F., et al. (2017). TET3-mediated DNA oxidation promotes ATR- dependent DNA damage response. EMBO Rep 18, 781-796. Jiang, T., Zhou, X., Taghizadeh, K., et al. (2007). N-formylation of lysine in histone proteins as a secondary modification arising from oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 60-65. Jiang, W., Crowe, J.L., Liu, X., et al. (2015). Differential phosphorylation of DNA-PKcs regulates the interplay between end-processing and end-ligation during nonhomologous end- joining. Molecular cell 58, 172-185. Jiang, X., Xu, Y., and Price, B.D. (2010). Acetylation of H2AX on lysine 36 plays a key role in the DNA double-strand break repair pathway. FEBS Lett 584, 2926-2930. Johnson, R.D., and Jasin, M. (2000). Sister chromatid gene conversion is a prominent double- strand break repair pathway in mammalian cells. EMBO J 19, 3398-3407. Kafer, Georgia R., Li, X., Horii, T., et al. (2016). 5-Hydroxymethylcytosine Marks Sites of DNA Damage and Promotes Genome Stability. Cell reports 14, 1283-1292. Kakumu, E., Nakanishi, S., Shiratori, H.M., et al. (2017). Xeroderma pigmentosum group C protein interacts with histones: regulation by acetylated states of histone H3. Genes to Cells 22, 310-327. Kantidze, O.L., and Razin, S.V. (2017). 5-hydroxymethylcytosine in DNA repair: A new player or a red herring? Cell cycle (Georgetown, Tex.) 16, 1499-1501. Kari, V., Raul, S.K., Henck, J.M., et al. (2019). The histone methyltransferase DOT1L is required for proper DNA damage response, DNA repair, and modulates chemotherapy responsiveness. Clin Epigenetics 11, 4-4. Karkhanis, V., Wang, L., Tae, S., et al. (2012). Protein arginine methyltransferase 7 regulates cellular response to DNA damage by methylating promoter histones H2A and H4 of the polymerase δ catalytic subunit gene, POLD1. The Journal of biological chemistry 287, 29801- 29814. Kee, J.-M., Villani, B., Carpenter, L.R., and Muir, T.W. (2010). Development of stable phosphohistidine analogues. J Am Chem Soc 132, 14327-14329. Keeney, S., Eker, A.P., Brody, T., et al. (1994). Correction of the DNA repair defect in xeroderma pigmentosum group E by injection of a DNA damage-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 4053-4056.

115

Kelly, T.L.J., and Trasler, J.M. (2004). Reproductive epigenetics. Clinical Genetics 65, 247- 260. Khan, D.H., Healy, S., He, S., et al. (2017). Mitogen-induced distinct epialleles are phosphorylated at either H3S10 or H3S28, depending on H3K27 acetylation. Mol Biol Cell 28, 817-824. Kim, J.J., Lee, S.Y., and Miller, K.M. (2019). Preserving genome integrity and function: the DNA damage response and histone modifications. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 1-34. Kim, J.K., Samaranayake, M., and Pradhan, S. (2009). Epigenetic mechanisms in mammals. Cell Mol Life Sci 66, 596-612. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., and Iliakis, G. (2008). Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic acids research 36, 5678-5694. Kniewel, R., Murakami, H., Liu, Y., et al. (2017). Histone H3 Threonine 11 Phosphorylation Is Catalyzed Directly by the Meiosis-Specific Kinase Mek1 and Provides a Molecular Readout of Mek1 Activity in Vivo. Genetics 207, 1313-1333. Koh, K.P., Yabuuchi, A., Rao, S., et al. (2011). Tet1 and Tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell stem cell 8, 200- 213. Kohlmaier, A., Savarese, F., Lachner, M., et al. (2004). A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol 2, E171-E171. Kouzarides, T. (2007). Chromatin Modifications and Their Function. Cell 128, 693-705. Kouzminova, E., and Selker, E.U. (2001). dim-2 encodes a DNA methyltransferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora. EMBO J 20, 4309-4323. Kriaucionis, S., and Heintz, N. (2009). The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324, 929-930. Ku, H.-Y., and Lin, H. (2014). PIWI proteins and their interactors in piRNA biogenesis, germline development and gene expression. Natl Sci Rev 1, 205-218. Kuo, M.H., Zhou, J., Jambeck, P., et al. (1998). Histone acetyltransferase activity of yeast Gcn5p is required for the activation of target genes in vivo. Genes & development 12, 627-639. Lebeaupin, T., Smith, R., Huet, S., and Timinszky, G. (2017). Poly(ADP-Ribose)-Dependent Chromatin Remodeling in DNA Repair. Methods Mol Biol 1608, 165-183. Lee, N.S., Chang, H.R., Kim, S., et al. (2018). Ring finger protein 126 (RNF126) suppresses ionizing radiation-induced p53-binding protein 1 (53BP1) focus formation. The Journal of biological chemistry 293, 588-598. Lence, T., Akhtar, J., Bayer, M., et al. (2016). m(6)A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature 540, 242-247. Lewinska, A., Adamczyk-Grochala, J., Kwasniewicz, E., et al. (2018). Reduced levels of methyltransferase DNMT2 sensitize human fibroblasts to oxidative stress and DNA damage that is accompanied by changes in proliferation-related miRNA expression. Redox Biol 14, 20-34. Li, M.L., Jiang, Q., Bhanu, N.V., et al. (2019). Phosphorylation of TIP60 Suppresses 53BP1 Localization at DNA Damage Sites. Mol Cell Biol 39, Li, S. (2012). Implication of posttranslational histone modifications in nucleotide excision repair. Int J Mol Sci 13, 12461-12486. Lieber, M.R. (2008). The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of biological chemistry 283, 1-5.

116

Lister, R., O'Malley, R.C., Tonti-Filippini, J., et al. (2008). Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell 133, 523-536. Liu, B., Lin, Y., Darwanto, A., et al. (2009). Identification and characterization of propionylation at histone H3 lysine 23 in mammalian cells. The Journal of biological chemistry 284, 32288- 32295. Liu, Y., Long, Y.H., Wang, S.Q., et al. (2016). Phosphorylation of H2A.X(T)(yr39) positively regulates DNA damage response and is linked to cancer progression. The FEBS journal 283, 4462-4473. Lu, Y., Xu, Q., Liu, Y., et al. (2018). Dynamics and functional interplay of histone lysine butyrylation, crotonylation, and acetylation in rice under starvation and submergence. Genome Biology 19, 144. Luijsterburg, M.S., Dinant, C., Lans, H., et al. (2009). Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. The Journal of cell biology 185, 577-586. Macleod, D., Charlton, J., Mullins, J., and Bird, A.P. (1994). Sp1 sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes & development 8, 2282- 2292. Machnicka, M.A., Milanowska, K., Osman Oglou, O., et al. (2013). MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update. Nucleic Acids Res 41, D262-267. Makharashvili, N., and Paull, T. (2015). CtIP: A DNA damage response protein at the intersection of DNA metabolism. DNA repair 32, Mao, P., and Wyrick, J.J. (2016). Emerging roles for histone modifications in DNA excision repair. FEMS Yeast Res 16, fow090. Martinez-Fernandez, L., Banyasz, A., Esposito, L., et al. (2017). UV-induced damage to DNA: effect of cytosine methylation on pyrimidine dimerization. Signal Transduct Target Ther 2, 17021- 17021. Martínez-López, W., Moreno-Ortega, D., Valencia-Payan, J., et al. (2018). Influence of chromatin remodeling in the removal of UVC-induced damage in TCR proficient and deficient Chinese hamster cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 836, 124-131. Masutani, C., Sugasawa, K., Yanagisawa, J., et al. (1994). Purification and cloning of a nucleotide excision repair complex involving the xeroderma pigmentosum group C protein and a human homologue of yeast RAD23. EMBO J 13, 1831-1843. Mateos-Gomez, P.A., Kent, T., Deng, S.K., et al. (2017). The helicase domain of Polθ counteracts RPA to promote alt-NHEJ. Nat Struct Mol Biol 24, 1116-1123. Mazón, G., Mimitou, E.P., and Symington, L.S. (2010). SnapShot: Homologous Recombination in DNA Double-Strand Break Repair. Cell 142, 648.e641-648.e642. McIntyre, A.B.R., Alexander, N., Grigorev, K., et al. (2019). Single-molecule sequencing detection of N6-methyladenine in microbial reference materials. Nat Commun 10, 579-579. Meehan, R., D. Lewis, J., McKay, S., et al. (1989). Meehan RR, Lewis JD, McKay S, Kleiner EL, Bird APIdentification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. Cell 58: 499-507. Cell 58, 499-507. Melcher, M., Schmid, M., Aagaard, L., et al. (2000). Structure-Function Analysis of SUV39H1 Reveals a Dominant Role in Heterochromatin Organization, Chromosome Segregation, and Mitotic Progression. Mol Cell Biol 20, 3728-3741. Messner, S., Altmeyer, M., Zhao, H., et al. (2010). PARP1 ADP-ribosylates lysine residues of the core histone tails. Nucleic acids research 38, 6350-6362.

117

Meyer, K.D., Patil, D.P., Zhou, J., et al. (2015). 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell 163, 999-1010. Meyer, K.D., Saletore, Y., Zumbo, P., et al. (2012). Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell 149, 1635-1646. Mikkelsen, T.S., Ku, M., Jaffe, D.B., et al. (2007). Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448, 553-560. Millan-Zambrano, G., Santos-Rosa, H., Puddu, F., et al. (2018). Phosphorylation of Histone H4T80 Triggers DNA Damage Checkpoint Recovery. Mol Cell 72, 625-635.e624. Mochan, T.A., Venere, M., DiTullio, R.A., Jr., and Halazonetis, T.D. (2004). 53BP1, an activator of ATM in response to DNA damage. DNA Repair (Amst) 3, 945-952. Moraes, I., Yuan, Z.-F., Liu, S., et al. (2015). Analysis of Histones H3 and H4 Reveals Novel and Conserved Post-Translational Modifications in Sugarcane. PloS one 10, e0134586-e0134586. Mortusewicz, O., Schermelleh, L., Walter, J., et al. (2005). Recruitment of DNA methyltransferase I to DNA repair sites. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 8905-8909. Moynahan, M.E., and Jasin, M. (2010). Mitotic homologous recombination maintains genomic stability and suppresses tumorigenesis. Nature reviews. Molecular cell biology 11, 196-207. Musselman, C.A., Gibson, M.D., Hartwick, E.W., et al. (2013). Binding of PHF1 Tudor to H3K36me3 enhances nucleosome accessibility. Nat Commun 4, 2969-2969. Nan, X., Campoy, F.J., and Bird, A. (1997). MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell 88, 471-481. Ngernprasirtsiri, J., Kobayashi, H., and Akazawa, T. (1988). DNA methylation as a mechanism of transcriptional regulation in nonphotosynthetic plastids in plant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85, 4750-4754. Nimonkar, A.V., Genschel, J., Kinoshita, E., et al. (2011). BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1- BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & development 25, 350-362. O'Carroll, D., Scherthan, H., Peters, A.H., et al. (2000). Isolation and characterization of Suv39h2, a second histone H3 methyltransferase gene that displays testis-specific expression. Mol Cell Biol 20, 9423-9433. O'Donovan, A., Davies, A.A., Moggs, J.G., et al. (1994). XPG endonuclease makes the 3' incision in human DNA nucleotide excision repair. Nature 371, 432-435. O'Hagan, H.M. (2014). Chromatin modifications during repair of environmental exposure- induced DNA damage: a potential mechanism for stable epigenetic alterations. Environ Mol Mutagen 55, 278-291. Okano, M., Bell, D.W., Haber, D.A., and Li, E. (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99, 247-257. Ozata, D.M., Gainetdinov, I., Zoch, A., et al. (2019). PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions. Nature Reviews Genetics 20, 89-108. Pan, Y., Ma, P., Liu, Y., et al. (2018). Multiple functions of m(6)A RNA methylation in cancer. J Hematol Oncol 11, 48-48. Parashar, N.C., Parashar, G., Nayyar, H., and Sandhir, R. (2018). N6-adenine DNA methylation demystified in eukaryotic genome: From biology to pathology. Biochimie 144, 56- 62. Pastor, W.A., Pape, U.J., Huang, Y., et al. (2011). Genome-wide mapping of 5- hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature 473, 394-397.

118

Patil, D.P., Chen, C.-K., Pickering, B.F., et al. (2016). m(6)A RNA methylation promotes XIST- mediated transcriptional repression. Nature 537, 369-373. Patil, V., Ward, R.L., and Hesson, L.B. (2014). The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics 9, 823-828. Pedersen, M.T., and Helin, K. (2010). Histone demethylases in development and disease. Trends in Cell Biology 20, 662-671. Pei, H., Zhang, L., Luo, K., et al. (2011). MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites. Nature 470, 124-128. Pellegrini, L., Yu, D.S., Lo, T., et al. (2002). Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex. Nature 420, 287-293. Pellegrino, S., Michelena, J., Teloni, F., et al. (2017). Replication-Coupled Dilution of H4K20me2 Guides 53BP1 to Pre-replicative Chromatin. Cell reports 19, 1819-1831. Pendleton, K.E., Chen, B., Liu, K., et al. (2017). The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell 169, 824-835.e814. Peters, A.H.F.M., O'Carroll, D., Scherthan, H., et al. (2001). Loss of the Suv39h Histone Methyltransferases Impairs Mammalian Heterochromatin and Genome Stability. Cell 107, 323- 337. Polo, S.E., and Jackson, S.P. (2011). Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development 25, 409-433. Portela, A., and Esteller, M. (2010). Epigenetic modifications and human disease. Nature Biotechnology 28, 1057. Potts, P.R., Porteus, M.H., and Yu, H. (2006). Human SMC5/6 complex promotes sister chromatid homologous recombination by recruiting the SMC1/3 cohesin complex to double-strand breaks. EMBO J 25, 3377-3388. Prohaska, S.J., Stadler, P.F., and Krakauer, D.C. (2010). Innovation in gene regulation: the case of chromatin computation. Journal of theoretical biology 265, 27-44. Qin, W., Leonhardt, H., and Pichler, G. (2011). Regulation of DNA methyltransferase 1 by interactions and modifications. Nucleus (Austin, Tex.) 2, 392-402. Rai, K., Chidester, S., Zavala, C.V., et al. (2007). Dnmt2 functions in the cytoplasm to promote liver, brain, and retina development in zebrafish. Genes & development 21, 261-266. Rao, V.K., Pal, A., and Taneja, R. (2017). A drive in SUVs: From development to disease. Epigenetics 12, 177-186. Rasmussen, K.D., and Helin, K. (2016). Role of TET enzymes in DNA methylation, development, and cancer. Genes & development 30, 733-750. Romani, M., Pistillo, M.P., and Banelli, B. (2018). Epigenetic Targeting of Glioblastoma. Front Oncol 8, 448-448. Rosidi, B., Wang, M., Wu, W., et al. (2008). Histone H1 functions as a stimulatory factor in backup pathways of NHEJ. Nucleic acids research 36, 1610-1623. Roth, S.Y., Denu, J.M., and Allis, C.D. (2001). Histone Acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry 70, 81-120. Rothbart, S.B., and Strahl, B.D. (2014). Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta 1839, 627-643. Sabari, B.R., Zhang, D., Allis, C.D., and Zhao, Y. (2017). Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nature reviews. Molecular cell biology 18, 90-101.

119

Santoro, R., and Grummt, I. (2005). Epigenetic mechanism of rRNA gene silencing: temporal order of NoRC-mediated histone modification, chromatin remodeling, and DNA methylation. Mol Cell Biol 25, 2539-2546. Shamanna, R.A., Lu, H., de Freitas, J.K., et al. (2016). WRN regulates pathway choice between classical and alternative non-homologous end joining. Nat Commun 7, 13785. Sharma, A.K., and Hendzel, M.J. (2019). The relationship between histone posttranslational modification and DNA damage signaling and repair. International journal of radiation biology 95, 382-393. Sharma, G.G., So, S., Gupta, A., et al. (2010). MOF and histone H4 acetylation at lysine 16 are critical for DNA damage response and double-strand break repair. Mol Cell Biol 30, 3582-3595. Shimada, M., and Nakanishi, M. (2008). Checkpoints meet the transcription at a novel histone milestone (H3-T11). Cell cycle (Georgetown, Tex.) 7, 1555-1559. Shock, L.S., Thakkar, P.V., Peterson, E.J., et al. (2011). DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 3630-3635. Schärer, O.D. (2013). Nucleotide excision repair in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, a012609-a012609. Schotta, G., Lachner, M., Sarma, K., et al. (2004). A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive heterochromatin. Genes & development 18, 1251-1262. Simithy, J., Sidoli, S., Yuan, Z.-F., et al. (2017). Characterization of histone acylations links chromatin modifications with metabolism. Nat Commun 8, 1141-1141. Simonetta, M., de Krijger, I., Serrat, J., et al. (2018). H4K20me2 distinguishes pre-replicative from post-replicative chromatin to appropriately direct DNA repair pathway choice by 53BP1- RIF1-MAD2L2. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 17, 124-136. Singh, R.K., and Gunjan, A. (2011). Histone tyrosine phosphorylation comes of age. Epigenetics 6, 153-160. Skucha, A., Ebner, J., and Grebien, F. (2019). Roles of SETD2 in Leukemia-Transcription, DNA-Damage, and Beyond. Int J Mol Sci 20, 1029. Slade, D.J., Horibata, S., Coonrod, S.A., and Thompson, P.R. (2014). A novel role for protein arginine deiminase 4 in pluripotency: the emerging role of citrullinated histone H1 in cellular programming. Bioessays 36, 736-740. Smestad, J., Erber, L., Chen, Y., and Maher, L.J., 3rd. (2018). Chromatin Succinylation Correlates with Active Gene Expression and Is Perturbed by Defective TCA Cycle Metabolism. iScience 2, 63-75. Snustad, D.P.a.S.M.J. (2017). Genetika (Brno, Masarykova univerzita). So, C.C., Ramachandran, S., and Martin, A. (2019). E3 Ubiquitin Ligases RNF20 and RNF40 Are Required for Double-Stranded Break (DSB) Repair: Evidence for Monoubiquitination of Histone H2B Lysine 120 as a Novel Axis of DSB Signaling and Repair. Mol Cell Biol 39, Sone, K., Piao, L., Nakakido, M., et al. (2014). Critical role of lysine 134 methylation on histone H2AX for γ-H2AX production and DNA repair. Nat Commun 5, 5691. Song, C.-X., Szulwach, K.E., Fu, Y., et al. (2011a). Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature biotechnology 29, 68-72. Song, J., Rechkoblit, O., Bestor, T.H., and Patel, D.J. (2011b). Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation. Science 331, 1036- 1040.

120

Song, S., and Yu, Y. (2019). Progression on Citrullination of Proteins in Gastrointestinal Cancers. Front Oncol 9, 15-15. Sorokin, D.V., Stixova, L., Sehnalova, P., et al. (2015). Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus 6, 301-313. Steinacher, R., Barekati, Z., Botev, P., et al. (2019). SUMOylation coordinates BERosome assembly in active DNA demethylation during cell differentiation. EMBO J 38, Sterner, D.E., and Berger, S.L. (2000). Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 64, 435-459. Stixová, L., Sehnalová, P., Legartová, S., et al. (2014). HP1β-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin 7, 39. Sueoka, T., Koyama, K., Hayashi, G., and Okamoto, A. (2018). Chemistry-Driven Epigenetic Investigation of Histone and DNA Modifications. The Chemical Record 18, 1727-1744. Sugasawa, K., Okuda, Y., Saijo, M., et al. (2005). UV-induced ubiquitylation of XPC protein mediated by UV-DDB-ubiquitin ligase complex. Cell 121, 387-400. Suchankova, J., Kozubek, S., Legartova, S., et al. (2015). Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biology of the cell 107, 440-454. Sun, Y., Jiang, X., and Price, B.D. (2010). Tip60: connecting chromatin to DNA damage signaling. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 9, 930-936. Svobodova Kovarikova, A., Legartova, S., Krejci, J., and Bartova, E. (2018). H3K9me3 and H4K20me3 represent the epigenetic landscape for 53BP1 binding to DNA lesions. Aging 10, 2585-2605. Tan, L., and Shi, Y.G. (2012). Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development 139, 1895-1902. Tan, M., Peng, C., Anderson, K.A., et al. (2014). Lysine glutarylation is a protein posttranslational modification regulated by SIRT5. Cell Metab 19, 605-617. Tang, J., Cho, N.W., Cui, G., et al. (2013). Acetylation limits 53BP1 association with damaged chromatin to promote homologous recombination. Nat Struct Mol Biol 20, 317-325. Tao, Y., Neppl, R.L., Huang, Z.P., et al. (2011). The histone methyltransferase Set7/9 promotes myoblast differentiation and myofibril assembly. The Journal of cell biology 194, 551-565. Tatum, D., and Li, S. (2011). Evidence that the histone methyltransferase Dot1 mediates global genomic repair by methylating histone H3 on lysine 79. The Journal of biological chemistry 286, 17530-17535. Thiagarajan, D., Dev, R.R., and Khosla, S. (2011). The DNA methyltranferase Dnmt2 participates in RNA processing during cellular stress. Epigenetics 6, 103-113. Turek-Plewa, J., and Jagodzinski, P. (2005). Turek-Plewa, J. & Jagodzinski, P. P. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cell Mol. Biol. Lett. 10, 631-647, Vol 10. Tuzon, C.T., Spektor, T., Kong, X., et al. (2014). Concerted activities of distinct H4K20 methyltransferases at DNA double-strand breaks regulate 53BP1 nucleation and NHEJ-directed repair. Cell reports 8, 430-438. Uckelmann, M., and Sixma, T.K. (2017). Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair 56, 92-101. Vadnais, C., Chen, R., Fraszczak, J., et al. (2018). GFI1 facilitates efficient DNA repair by regulating PRMT1 dependent methylation of MRE11 and 53BP1. Nat Commun 9, 1418-1418.

121

Vakoc, C.R., Sachdeva, M.M., Wang, H., and Blobel, G.A. (2006). Profile of histone lysine methylation across transcribed mammalian chromatin. Mol Cell Biol 26, 9185-9195. Van, H., and Almeida Santos, M. (2018). Histone Modifications and the DNA Double-Strand Break Response. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 17, Van, H.T., and Santos, M.A. (2018). Histone modifications and the DNA double-strand break response. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 17, 2399-2410. Vanyushin, B.F., Alexandrushkina, N.I., and Kirnos, M.D. (1988). N6-Methyladenine in mitochondrial DNA of higher plants. FEBS Letters 233, 397-399. Waddington, C.H. (2011). The Epigenotype. International Journal of Epidemiology 41, 10-13. Wakeman, T.P., Wang, Q., Feng, J., and Wang, X.F. (2012). Bat3 facilitates H3K79 dimethylation by DOT1L and promotes DNA damage-induced 53BP1 foci at G1/G2 cell-cycle phases. EMBO J 31, 2169-2181. Wang, F., Dai, J., Daum, J.R., et al. (2010). Histone H3 Thr-3 phosphorylation by Haspin positions Aurora B at centromeres in mitosis. Science 330, 231-235. Wang, L., Liu, L., and Berger, S.L. (1998). Critical residues for histone acetylation by Gcn5, functioning in Ada and SAGA complexes, are also required for transcriptional function in vivo. Genes & development 12, 640-653. Wang, P., Doxtader, K.A., and Nam, Y. (2016a). Structural Basis for Cooperative Function of Mettl3 and Mettl14 Methyltransferases. Molecular cell 63, 306-317. Wang, X., Feng, J., Xue, Y., et al. (2016b). Structural basis of N(6)-adenosine methylation by the METTL3-METTL14 complex. Nature 534, 575-578. Wang, X., and He, C. (2014). Dynamic RNA Modifications in Posttranscriptional Regulation. Molecular Cell 56, 5-12. Wang, Y., Chen, X., Sheng, Y., et al. (2017). N6-adenine DNA methylation is associated with the linker DNA of H2A.Z-containing well-positioned nucleosomes in Pol II-transcribed genes in Tetrahymena. Nucleic Acids Research 45, 11594-11606. Ward, I.M., Minn, K., van Deursen, J., and Chen, J. (2003). p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol 23, 2556-2563. Watanabe, S., Iimori, M., Chan, D.V., et al. (2018). MDC1 methylation mediated by lysine methyltransferases EHMT1 and EHMT2 regulates active ATM accumulation flanking DNA damage sites. Sci Rep 8, 10888. Weinhold, B. (2006). Epigenetics: the science of change. Environ Health Perspect 114, A160- A167. Wilson, M.D., and Durocher, D. (2017). Reading chromatin signatures after DNA double-strand breaks. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences 372, 20160280. Woodrick, J., Gupta, S., Camacho, S., et al. (2017). A new sub-pathway of long-patch base excision repair involving 5' gap formation. EMBO J 36, 1605-1622. Wossidlo, M., Nakamura, T., Lepikhov, K., et al. (2011). 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat Commun 2, 241. Wu, W., Nishikawa, H., Fukuda, T., et al. (2015). Interaction of BARD1 and HP1 is required for BRCA1 retention at sites of DNA damage. Cancer research 75, Xiang, Y., Laurent, B., Hsu, C.H., et al. (2017). RNA m(6)A methylation regulates the ultraviolet-induced DNA damage response. Nature 543, 573-576. Xiao, C.-L., Zhu, S., He, M., et al. (2018). N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome. Molecular Cell 71, 306-318.e307.

122

Xie, A., Odate, S., Chandramouly, G., and Scully, R. (2010). H2AX post-translational modifications in the ionizing radiation response and homologous recombination. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 9, 3602-3610. Xie, Z., Dai, J., Dai, L., et al. (2012). Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Mol Cell Proteomics 11, 100-107. Xing, M., Yang, M., Huo, W., et al. (2015). Interactome analysis identifies a new paralogue of XRCC4 in non-homologous end joining DNA repair pathway. Nat Commun 6, 6233. Xiong, J., Ye, T.T., Ma, C.J., et al. (2019). N 6-Hydroxymethyladenine: a hydroxylation derivative of N6-methyladenine in genomic DNA of mammals. Nucleic Acids Res 47, 1268-1277. Yaneva, M., Kowalewski, T., and Lieber, M.R. (1997). Interaction of DNA-dependent protein kinase with DNA and with Ku: biochemical and atomic-force microscopy studies. EMBO J 16, 5098-5112. Yang, S.-M., Kim, B.J., Norwood Toro, L., and Skoultchi, A.I. (2013). H1 linker histone promotes epigenetic silencing by regulating both DNA methylation and histone H3 methylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 1708- 1713. Yeo, J.E., Khoo, A., Fagbemi, A.F., and Scharer, O.D. (2012). The efficiencies of damage recognition and excision correlate with duplex destabilization induced by acetylaminofluorene adducts in human nucleotide excision repair. Chemical research in toxicology 25, 2462-2468. Zarebski, M., Wiernasz, E., and Dobrucki, J. (2009). Recruitment of heterochromatin protein 1 to DNA repair sites. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 75, 619-625. Zeng, Y., and Chen, T. (2019). DNA Methylation Reprogramming during Mammalian Development. Genes (Basel) 10, Zhang, L., Wang, Z., Shi, R., et al. (2018). RNF126 Quenches RNF168 Function in the DNA Damage Response. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 16, 428-438. Zhang, M., Hu, C., Moses, N., et al. (2019). HDAC6 regulates DNA damage response via deacetylating MLH1. The Journal of biological chemistry 294, 5813-5826. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H.P., and Lowndes, N.F. (2011). Modification of histones by sugar beta-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. The Journal of biological chemistry 286, 37483-37495. Zhang, Z.-C., Liu, Y., Li, S.-F., et al. (2014). Suv39h1 mediates AP-2α-dependent inhibition of C/EBPα expression during adipogenesis. Mol Cell Biol 34, 2330-2338. Zhou, B.-B.S., and Elledge, S.J. (2000). The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature 408, 433-439. Zhu, J., and Yao, X. (2009). Use of DNA methylation for cancer detection: Promises and challenges. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 41, 147-154. Zhu, Q., Battu, A., Ray, A., et al. (2015). Damaged DNA-binding protein down-regulates epigenetic mark H3K56Ac through histone deacetylase 1 and 2. Mutation research 776, 16-23.

123