Etude De Determinants De La Transmission Du Vih De La Mere a L’Enfant Au Burkina Faso

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

ANNEE 2003-2004

THESE

Pour obtenir le grade académique de

DOCTEUR EN SCIENCES AGRONOMIQUES ET INGENIERIE BIOLOGIQUE

FACULTE DES SCIENCES

Par

Mr Olivier MANIGART

ETUDE DE DETERMINANTS DE LA TRANSMISSION DU VIH DE LA MERE A L’ENFANT AU BURKINA FASO

Jury :

Directeur de thèse : Mr le Professeur Philippe VAN DE PERRE, co- Directrice de thèse : Mme le Professeur Carine VAN LINT,

Président : Mr le Professeur Georges HUEZ,

Mme le Professeur Véronique HALLOIN, Mr le Professeur Nicolas MEDA, Mr le Professeur John WERENNE, Mr le Professeur Arsène BURNY, Mr le Professeur Philippe LEPAGE.

Couverture : route Ouagadougou – Bobo-Dioulasso, juillet 2003.

2 A ma petite fille adorée, Isia,

3 4

Je me suis réveillé, tiré de la lourde torpeur d’une sieste de saison sèche par des cris stridents et des acclamations saccadées qui provenaient du devant de ma cour. Je me suis levé lourdement et j’ai écarté le pagne qui protège de la lumière et de la chaleur tellement vives en cette période, pour découvrir que les « Masques » étaient descendus dans la rue. Au contraire, la lumière était diffuse et sinistre et la lourdeur de l’air était telle qu’une angoisse profonde m’étreignit instantanément. En général, les « Masques » sortent lors de périodes rituelles – ce qui n’était pas le cas – ou, au cours de phénomènes étranges. Ce sont les initiés qui portent le masque et qui fustigent à tout-vas : c’est souvent l’occasion de corrections exemplaires pour ceux qui se sont mal comportés… ou de vengeances personnelles. J’ai levé les yeux pour observer le ciel : il était obscurci d’un halo de nuages circulaire d’un diamètre de ce qui semblait être plusieurs kilomètres. Le contour était cintré d’un arc-en-ciel et c’est cela qui donnait cette lumière claire-obscure. Jamais je n’avais observé un tel phénomène ; pour peu, j’en aurais suivi les Masques.

Les gens d’ici disent que lorsque cela se produit, une personne importante va mourir.

Moi, j’ai plutôt pensé à la détresse des milliers de personnes qui souffrent dans ce pays déjà si pauvre.

Ma réalité ; ma détresse !

Anonyme (festival Sida Ka Taa, 2001)

5 6 TABLES DES MATIERES :

Résumé : ...... 23

Abstract : ...... 25

Liste des tableaux :...... 27

Liste des figures : ...... 29

Abréviations : ...... 31

Définitions :...... 35

Données démographiques et sanitaires du Burkina Faso :...... 37

I. INTRODUCTION : ...... 39

1. Présentation du sujet : ...... 41

2. Origine et évolution génétique du virus :...... 41

2.1. Origines des virus VIH-1 et VIH-2 :...... 41 2.2. Causes et conséquences de la variabilité...... 43 2.2.1. Faible fidélité de la transcriptase inverse :...... 45 2.2.2. Fort taux de réplication ...... 45 2.2.3. Recombinaisons ...... 45 2.2.4. Pressions de sélection du système immunitaire : ...... 47 2.2.5. Conséquences :...... 47

3. Classification du VIH-1 : ...... 49

3.1. Trois groupes, 9 sous-types et plusieurs formes recombinantes (CRF) :...... 49 3.2. Critères de définition des sous-types et CRF : ...... 49

4. Variabilité du VIH et conséquences :...... 49

4.1. Efficacité des tests de sérodiagnostic et de suivi des patients :...... 51 4.2. Mise au point d’un vaccin :...... 51 4.3. Réponse aux antirétroviraux : ...... 53

5. Le HMA : un outil pour l’étude de la variabilité du VIH ?...... 55

5.1. Outils dont on dispose pour étudier la variabilité : ...... 55 5.1.1. Le séquençage suivi d’analyses phylogénétiques : ...... 55 5.1.2. Le sérotypage : ...... 55 5.1.3. Les techniques de PCR spécifiques :...... 55 5.1.4. La technique d’Heteroduplex Mobility Assay: ...... 55

6. La problématique des surinfections : ...... 57

7 6.1. La surinfection chez l’adulte :...... 57

6.2. La surinfection dans le contexte de la TME :...... 61

7. Modalité de la TME et impact de la variabilité virale : ...... 63

7.1. Transmission in utero :...... 65 7.1.1. Modulation des mécanismes immunitaires maternels durant la grossesse : ...... 65 7.1.2. Timing de la transmission in utero :...... 67 7.1.2. Histologie du placenta :...... 67 7.1.3. Mécanismes potentiels de la transmission in utero :...... 69 7.1.4. Transmission de souches SI versus NSI :...... 71 7.1.5. Passage de variants mineurs ? ...... 71 7.1.6. Génotype et transmission in utero :...... 73

7.2. Transmission intra-partum :...... 73 7.2.1. Timing de la transmission intra-partum : ...... 73 7.2.2. Immunologie du tractus génital féminin associée au VIH :...... 75 7.2.3. Insertions et délétions ?...... 75

7.3. Transmission post-partum :...... 77 7.3.1. Histologie de la glande mammaire :...... 77 7.3.2. Variabilité virale et transmission par l’allaitement : ...... 79 7.3. 3. Virus libres ou formes provirales :...... 79 7.3.4. Immunologie du compartiment mammaire associée au VIH et à la TME :...... 81

7.4. Portes d’entrée chez le nouveau-né :...... 83

8. Impact de la charge virale sur la TME dans le contexte d’un traitement court à l’AZT (Zidovudine) :...... 87

8.1. Dynamique de la réplication virale lors d’une monothérapie : ...... 87

8.2. Impact de la charge virale dans le sang sur la TME : ...... 89

8.3. Impact de la charge virale dans les sécrétions cervico-vaginales (SCV) sur la TME :.... 89 8.3.1. Modulations physiologiques du tractus génital associées à une susceptibilité infectieuse : ...... 91 8.3.2. Corrélation de la CV plasmatique avec la CV des sécrétions cervicovaginales :.. 91 8.3.3. Facteurs associés à la présence du VIH dans les SCV :...... 91

8.4. Impact de la charge virale dans le lait maternel sur la TME :...... 93 8.4.1. Compartimentalisation de la CV :...... 93 8.4.2. Déterminants d’une charge virale élevée dans le lait maternel :...... 95

9. Influence de la vitamine A sur la TME du VIH :...... 97

9.1. Rôle de la Vit A sur l’immunité :...... 97

9.2. Rôle de la Vit A sur l’infection par le VIH :...... 97

8 II. BUTS DE NOTRE TRAVAIL :...... 101

III. RESULTATS : ...... 107

Partie I : Résultats de l’étude DITRAME : ...... 109

1.1. Présentation de l’étude Ditrame (articles 1 & 2) :...... 109 1.1.1. Effectifs testés : ...... 109 1.1.2. Efficacité de la prophylaxie ZDV à six mois :...... 111 1.1.3. Compliance : ...... 111 1.1.4. Mortalité évaluée à 18 mois : ...... 111 1.1.5. Mortalité parmi les enfants non infectés par le VIH :...... 113 1.1.6. Causes de décès :...... 113

Partie II : Résultats de l’étude des charges virales dans trois compartiments physiologiques : le sang, les SCV et le lait maternel : ...... 115

2.1. Etude de l’influence des charges virales libres dans le sang sur la TME (article 3) :..... 115 2.1.1. Effectifs testés : ...... 115 2.1.2. Résultats à l’inclusion (34 à 36 semaines d’aménorrhée) :...... 115 2.1.3. Résultats à J8 post-partum : ...... 115 2.1.4. Résultats par groupes de transmission et groupes de « traitement » :...... 117 2.1.5. Analyse univariée par régression logistique ajustée sur le nombre de CD4 : ...... 117 2.1.6. Analyse multivariée : ...... 117

2.2. Etude de l’influence des charges virales libres et provirales dans les SCV sur la TME (article 4 en préparation) :...... 119 2.2.1. Description de l’effectif analysé : ...... 119 2.2.2. Comparaison du niveau biologique d’immunodéficience entre MT et MNT :.... 119 2.2.3. Comparaison des MT et MNT en terme de détectabilité des ARN et en moyenne des CV libres :...... 121 2.2.4. Comparaison des MT et MNT en terme de détectabilité des ADN et en moyenne des charges provirales : ...... 121 2.2.5. Comparaison des charges virales plasmatiques de l’échantillonnage de l’étude :121 2.2.6. Analyse univariée des déterminants de la TME dans cet échantillon:...... 121 2.2.7. Analyse multivariée : ...... 121

2.3. Etude de l’influence des charges virales libres dans le lait maternel sur la TME (article 5 JID – sous presse) :...... 123 2.3.1. Description des effectifs testés pour cette étude : ...... 123 2.3.2. Comparaison des CVlm des MT et des MNT (396 échantillons) :...... 125 2.3.3. Analyse des déterminants de la transmission postnatale : régression logistique, analyses univariées et multivariées : ...... 127 2.3.4. Comparaison de la CVlm chez les TP et chez les MNT en fonction du traitement (314 échantillons) :...... 129 2.3.5. Analyse de l’évolution des CVlm des femmes ayant transmis le virus post-partum :...... 131 2.3.6. Analyse des CVlm sur des effectifs disposant de prélèvements à différentes dates choisis de manière aléatoire : ...... 133

9 2.4. Etude de l’influence de la vitamine A sur la TME (article 6) :...... 135

Partie III : Analyse de la variabilité du VIH-1 et de son importance dans la TME : ...... 137

3.1. Analyse de la diversité des souches circulant en France dans le contexte de la « French National Cohort Study » (article 7) :...... 137 3.1.1. Effectifs testés : ...... 137 3.1.2. Résultats du sous-typage par HMAenv :...... 137

3.2. Analyse de la diversité des souches circulant au Burkina Faso (abstract CISMA 2001 – communication orale) :...... 139 3.2.1. Effectifs testés : ...... 139 3.2.2. Résultats du sous-typage par HMAenv :...... 139 3.2.3. Résultats du sous-typage par séquençage : ...... 139 3.2.4. Comparaison des résultats HMAenv et séquençage : ...... 141

3.3. Etude des surinfections par une technique de HMA autologue (article 8) : ...... 141 3.3.1. Validation de la technique de HMA autologue pour identifier les co-infections : ...... 143 3.3.2. Coinfections VIH-1 potentielles au sein de notre cohorte : ...... 143 3.3.3. Caractérisation des souches des femmes coinfectées :...... 143 3.3.4. Identification des surinfections : ...... 145 3.3.5. Prévalence des surinfections dans notre cohorte de “Femmes Vulnérables Face au VIH”:...... 145 3.3.6. Description détaillée des surinfections :...... 145

3.4. Etude des surinfections dans le contexte de la TME par une technique de HMA autologue (étude en cours) :...... 149 3.4.1. Effectifs testés : ...... 151 3.4.2. Timing de l’infection, charges virales des enfants :...... 151 3.4.3. Présence potentielle de coinfection :...... 151 3.4.3. Mortalité des enfants testés : ...... 153 3.4.4. Mortalité globale des enfants de la cohorte :...... 153 3.4.4. Séquençage des variants des deux populations virales : ...... 153 3.4.5. Caractéristiques des mères des enfants présentant des profils de coinfection par HMA : ...... 153

IV. DISCUSSION et PERSPECTIVES :...... 155

V. MATERIEL & METHODES :...... 185

1. Description de l’étude DITRAME :...... 187 1.1. Procédures d’inclusion :...... 187 1.2. Prophylaxie ZDV ou placebo :...... 187 1.3. Diagnostic PCR jusqu’à six mois et diagnostic sérologique ensuite : ...... 187 1.4. Diagnostic par sérologie :...... 189 1.5. Analyses statistiques de l’efficacité de la ZDV sur la diminution de la TME :...... 191

2. Etude des charges virales plasmatiques : ...... 191 2.1. Design de l’étude :...... 191

10 2.2. Comparaison statistique des CVpl entre T et NT et entre groupes de traitement :. 191

3. Etude des charges virales dans les SCV :...... 193 3.1. Design de l’étude :...... 193 3.2. Techniques de prélèvement de SCV : ...... 193 3.3. Comparaison statistique des CVscv entre T et NT : ...... 195

4. Etude des charges virales dans le lait maternel :...... 195 4.1. Design de l’étude :...... 195 4.2. Comparaison statistique des CVlm entre T et NT et entre groupes de traitement : 195

5. Techniques utilisées pour les mesures des charges virales dans les différents compartiments :...... 197 5.1 Etude des charges virales par la technique du DNA branché (Bayer-Chiron, Quantiplex 340TM, version 3.0, E. Walpole, MA, USA) : ...... 197 5.2. Etude des charges virales par la technique Amplicor (Amplicor HIV Monitor, version 1.5, Roche Diagnostics Systems Inc, Branchburg, New Jersey, USA):.. 198 5.3. Extraction particulière de l’ARN par la technique de Boom (Nuclisens Kit Organon Teknika, Boxtel, NL) : ...... 199

6. Etude des surinfections chez l’adulte et des surinfections potentielles chez les enfants : . 200 6.1. Description de la cohorte de “Femmes Vulnérables Face au VIH”:...... 200 6.2. Amplification par PCR nichée et HMA autologue dans la région env :...... 202 6.3. Manipulation des échantillons de sang pour l’étude des surinfections :...... 202 6.4. Clonage des ADN à partir des fragments d’acrylamide contenant les hétéroduplexes divergents :...... 203 6.5. Séquences et analyses phylogénétiques de deux clones divergents par individu potentiellement infecté :...... 205

7. Etude de l’impact du taux de vitamine A sur la TME :...... 205

VI. REFERENCES : ...... 207

VII. ANNEXES :...... 225

12 VII. ANNEXES : 225

Annexe 1 : Article 1 : 227 6-month efficacy, tolerance, and acceptability of a short regimen of oral zidovudine to reduce vertical transmission of HIV in breastfed children in Cote d'Ivoire and Burkina Faso: a double-blind placebo- controlled multicentre trial. DITRAME Study Group. 227 Dabis F; Msellati P; Meda N; Welffens-Ekra C; You B; Manigart O; Leroy V; Simonon A; Cartoux , Combe P; Ouangre A; Ramon R; Ky-Zerbo O; Montcho C; Salamon R; Rouzioux C; Van de Perre P; Mandelbrot L. Lancet 1999 Mar 6;353(9155):786-92 227

Annexe 2 : Article 2 : 237 18-month mortality and perinatal exposure to Zidovudine in West Africa. 237 Dabis F., Elanga N., Meda N., Leroy V., Viho I., Manigart O., Dequae-Merchadou L., Msellati P., Sombie I. for the Ditrame Study Group AIDS 2001, 15 :771-779. 237

Annexe 3 : Article 3 : 249 Maternal plasma viral load, Zidovudine and mother-to-child transmission of HIV-1 in Africa...... 249 Leroy V., Montcho C., Manigart O., Van de Perre P., Dabis F., Mselatti P., You B., Simonon A., Rouzioux C., for the Ditrame ANRS 049a trial. AIDS 2001, 15(4) ;517-522. 249

Annexe 4 : Article 4 : 257 Maternal viral load in vaginal fluids and mother-to-child transmission of HIV-1 in Côte d’Ivoire and Burkina Faso : the Ditrame ANRS 049a and 049b trials. 257 Manigart O, Leroy V, Burgard M, Dequae-Merchadou L, Meda N, Msellati P, Mandelbrot L, Dabis F, Van de Perre P, Rouzioux C for the Ditrame Study Group (ANRS 049a and 049b clinical trials). En cours de rédaction. 257

Annexe 5 : Article 5 : 273 Effect of Perinatal Zidovudine Treatment on the Evolution of Cell-free HIV-1 in Breast Milk and on Postnatal Transmission 273 Manigart O., Crépin M., Leroy V., Meda N., Valéa D., Rouet F., Dequae Merchadoux L., Dabis F., Rouzioux C., Van De Perre P. for the DITRAME Study Group. JID, 2004;190:1422-8. 273

Annexe 6 : Article 6 : 287 Maternal vitamin A status and mother-to-child transmission of HIV in West Africa. 287 Castetbon K., Manigart O., Bonard D., Thomas M.J., Dumon M.F., Malvy D., Van de Perre P., Dabis F. for the DITRAME Study Group. AIDS. 2000, 14(7) : 908-9. 287

Annexe 7 : Article 7 : 293 Diversity of HIV-1 genetic subtypes in France, in the context of mother-to-child transmission...... 293 Chaix M.L., Manigart O., Letourneur F., Burgard M., Mayaux M.J., Rouzioux C. The French Pediatric Cohort Study Group. AIDS. 2000 Feb 18 ; 14(3) : 327-8. 293

Annexe 8 : Article 8 : 297 Identification of two superinfection in a cohort of commercial sex workers in Burkina Faso by a technique of autologuous heteroduplex mobility assay. 297 Manigart O, Courgnaud V, Sanou O, Valea D, Meda N, Ouangré A, Delaporte E, Van de Perre P, Peeters M. AIDS. 2004 Aug 20;18:1645-51. 297

Annexe 9 : Article 9 : 307 Van De Perre P, Meda N, Manigart O. AIDS 2001;15(5):658-9. 307

Annexe 10 : 311 Tableau des essais vaccinaux dans le monde 311

Annexe 11 : Tableau des essais de PTME dans le monde 319

13 14 Remerciements :

Avant tout, je tiens à remercier mon père, parti trop tôt le 10 mai 2003, pour le soutien qu’il m’a toujours apporté et l’exemple passionné de vie qu’il m’a donné. J’aurais tellement voulu qu’il puisse voir ce travail accompli et que je puisse l’en remercier de vive voix…

Bien sûr, au même titre, je remercie ma mère, pour les espoirs continus qu’elle a mis en moi et le dévouement indéfectible dont elle a fait preuve lors de circonstances parfois difficiles. Que ce travail soit l’occasion de lui dire toute ma profonde reconnaissance et ma sincère gratitude.

Je les remercie tous deux des nombreuses visites qu’ils m’ont rendues dans les différents lieux, souvent éloignés où je me suis rendu. Elles m’ont mis du baume au cœur et m’ont encouragées dans la conviction que le travail que j’accomplissais était « la bonne voie » et selon les valeurs qu’ils m’avaient enseignées.

Je remercie également mes frères, Stéphane et Yannick, toujours à mes côtés où que j’aille. Et mes chères cousines, Eléonore et Alice.

Mon grand-père, Cara, venu me voir à 90 ans au Burkina Faso. Cet acte seul démontre le tempérament de toute une vie, de l’importance de la rencontre et de la découverte d’autres cultures. De même que mon oncle Pierre, baroudeur invétéré de toutes les mers du monde.

Cette envie « génétique » de partir à l’aventure n’aurait abouti à rien sans mon oncle, le Dr Michel Caraël, qui a généré mon intérêt pour la recherche contre le Sida, en 1983, et m’a convié au Rwanda en 1987, avant même que je ne commence mes études universitaires. Que le courage et l’engagement de ces pionniers soit ici salué.

Parmi ces pionniers se trouvait le Professeur Philippe Van de Perre, qui fait partie de ceux qui, au plus tôt, ont pu voir le danger que constituait le VIH et qui ont consacré leur vie à la recherche de solutions adaptées, essentiellement contre la transmission de la mère à l’enfant et en Afrique. Il m’a transmis sa passion dès notre première rencontre et, encore aujourd’hui, à chacune de nos entrevues, de nouvelles pistes de réflexion s’ouvrent à moi. Ses conseils pertinents, son enthousiasme exaltant m’ont toujours galvanisé et poussé à aller de l’avant. Merci pour tout Philippe, c’est grâce à toi que j’ai pu réaliser mon rêve d’aller travailler dans la recherche contre le Sida dans un pays en voie de développement. Merci aussi de m’avoir encadré dans tous mes travaux et d’avoir accepté d’être mon directeur de thèse.

Se trouvait aussi le Pr Philippe Lepage, qui m’a emmené dans le premier centre de recherche qu’il m’a été donné de voir en Afrique et a éveillé en moi l’intérêt d’un jeune étudiant pour la recherche scientifique et pour la vie en brousse. Merci pour tout cela et merci d’accepter de faire partie de mon jury de thèse.

Occasion m’est donnée aussi de remercier le Professeur Arsène Burny dont les leçons magistrales, dès les premières heures passées en faculté m’ont convaincues que je faisais le meilleur choix en m’orientant vers la biologie moléculaire. Mille Merci d’accepter d’être membre de mon jury, c’est pour moi un grand honneur.

Je tiens à remercier avec la plus chaleureuse amitié, le Docteur Nicolas Meda, qui m’a toujours conseillé sagement et m’a encadré dès mes premières heures au Centre Muraz.

15 16 Puisse-t-il y avoir de nombreux chercheurs de cet acabit et des solutions se mettront en place dans les pays qui subissent le plus ce terrifiant fléau. Merci aussi d’accepter de faire partie de mon jury.

J’ai un jour comparé le Centre Muraz à une grande école, tellement l’occasion nous était donnée d’échanger des idées, de confronter nos points de vue, de progresser et que l’atmosphère y était bon enfant. C’est cette image que je garde de mes cinq années passées là- bas et j’en profite pour remercier tous mes amis et collègues dont je ne pourrai citer tous les noms puisque plus de cent personnes y travaillent. Je pense tout particulièrement au Dr Thierry Baldet, ami de la première heure, le Dr Hubert Barennes, le Dr Yves Traore, le Dr Honoré Meda, le Dr Abdulaye Diabaté, le Dr Amadou Ouangré, le Dr Georges Dahourou, le Dr Abdulaye Ouedraogo, le Dr Seydou Yaro, le Dr Issiaka Sombier, le Dr Lucille Gauthier- Charpentier, le Dr Serge Diagbouga, Ibrahim Diallo, Thérèse Kagone, Maria-Augusta Aurora, Diane Valéa, Oumar Sanou, Djénéba Ouattara, Odette Ky-Zerbo, Guylain Préteseille, Jean Ballier, Alex Dutheil… etc.

Toute mon admiration et mes remerciements vont également aux Docteurs Adrien Sawadogo et Aristide Yameogo de l’Hôpital Sorou Sanon qui accomplissent un travail exemplaire, souvent ingrat et extrêmement difficile.

Notre travail n’aurait aucun sens sans les membres des associations de lutte contre le sida, dont la liste exhaustive serait bien trop longue aussi, et qui réalisent une tâche sans pareille à l’Hôpital Sorou Sanon et ailleurs à Bobo-Dioulasso, principalement, Christine Kafando, Colette Koala, Fatimata Sereme, Martine Somda, Djénéba Drabbo, Clarisse Kyélem, Edith.

Les travaux que je présente sont bien évidemment le fruit d’une collaboration soutenue avec d’autres équipes que j’aimerais remercier aussi : avant tout, ma collègue et amie le Dr Valérie Courgnaud du Laboratoire de rétrovirologie de l’U36 de l’IRD (Institut de Recherche et Développement) à Montpellier, le Dr Pierre Becquart, le Dr Martine Peeters et le Pr Eric Delaporte, ainsi que Christelle Butelle pour sa constante bonne humeur et son redoutable humour. Ainsi que l’équipe bordelaise de l’U 593 Institut de Santé Publique, Epidémiologie et Développement (ISPED), Université Victor Segalen Bordeaux 2, partenaire inséparable du projet DITRAME dont les plus ardents protagonistes ont fait un travail remarquable : le Pr François Dabis, le Dr Valériane Leroy, le Dr Katia Castetbon, Laurence Dequae-Merchadoux et Marie-Pierre Martin (il fait chaud) qui durent supporter mes innombrables questions et coups de téléphones. Sans oublier, le Dr Alice Desclaux dont les enquêtes anthropologiques nous éclairent sur bien des aspects que nous ne mesurons pas derrière les murs de nos laboratoires. Et nos alter ego de Abidjan : le Dr Philippe Mselatti, pour ses conseils avisés dans les situations les plus complexes, Bruno You, le Dr Xavier Anglaret, le Dr François Rouet, Dominique Bonnard, Gwenolla Gourvelec.

Et bien sûr, l’équipe du Pr Christine Rouzioux du laboratoire de virologie de l’Hôpital Necker Enfants-Malades qui m’a permis de faire mes armes dans les techniques qui concernent l’étude de la transmission de la mère à l’enfant du VIH : le Dr Marianne Burgard, qui m’a sauvé des eaux plus d’une fois, le Dr Marie-Laure Chaix qui m’a initié aux techniques de HMA avec Franck Letourneur, mes chers amis Serge Ivanoff et Eric Abachin. Merci beaucoup Christine de m’avoir accueilli pendant plus d’un an et demi.

17 18 Sans oublier le Pr Edouard Janoff du Mucosal and Vaccine Research Center (MAVRC), University of Minnesota School of Medicine et toute sa famille (Nancy, Jordan & André), qui m’a accueilli chez lui avec tant de chaleur et m’a permis de venir dans son laboratoire apprendre les techniques de culture de cellules du lait maternel. Un clin d’œil particulier aussi à Anthony Agadzi.

Bien souvent, nous avons eu besoin de conseils et de réorientation par rapport à nos projets de recherche ; dans ce but, notre Directeur a eu le bon sens de solliciter des chercheurs prestigieux des institutions les plus renommées afin d’élaborer un Comité Scientifique dont je tiens à remercier les membres dont les précieuses critiques nous ont permis de mener à bien nos travaux : Le Pr Michel Rey (Faculté de médecine de Clermont-Ferrand), le Pr Roger Salamon (Université Victor Segalen Bordeaux 2), le Pr Marc Coosemans (Département de parasitologie de l’Institut de Médecine Tropicale d’Anvers), le Pr Mireille Prince-David (Institut Pasteur de Lomé), le Pr Mireille Dosso (Institut Pasteur d’Abidjan). De même que les responsables de l’Agence Nationale de Recherche contre le Sida (ANRS) en France qui, en plus de l’appui méthodologique et financier, nous ont toujours prodigué des conseils avisés : le Pr Michel Kazachkine, le Dr Brigitte Bazin, Mme Chantal Canon.

Par ailleurs, je tiens à remercier vivement mes amis de l’association « Sida Ka Taa », qui fut une expérience inoubliable dans laquelle nous nous sommes tous investis avec une conviction sans pareil : Alex Dayo, Thomas Vergès, Moktar Traore, Abdrahmane Berthe, Anselme Sanou, Lionel Romier, Peter Soldan, le Dr Robert Cazal, les membres du Centre Muraz et tous les autres bénévoles qui se sont investis dans cette formidable aventure.

Mon expérience africaine dans la lutte contre le sida aurait été incomplète sans un travail plus près des patients, et sans doute, plus pragmatique. C’est pourquoi, je tiens à remercier également mes collègues de Médecins Sans Frontières dont je salue le travail courageux et efficace : Pascale Chaillet, le Dr Peter Firmenich, le Dr Annick Faure, le Dr Gérald Viretto, le Dr Alain Hien, le Dr Bernard Sawadogo, le Dr Mireille Cissé, Yacouba Kabore, Raymond Ouedraogo, Aïssita Ouedraogo, Johanna, Mme Karambiri, Nabi, Nikiema et Cyrille du Centre Médical à Antenne chirurgicale de Pissy.

Ce travail n’aurait pu être réalisé sans l’accueil cordial que m’a fait l’équipe du Professeur Carine Van Lint. Grâce à ses nombreux et pertinents conseils, je pourrai soutenir ma thèse en temps et en heure. Merci d’avoir accepté d’être ma co-Directrice de thèse. Ainsi que grâce aux conseils du Dr Martine Thily et ceux du Dr Vincent Quivy. Merci mille fois à vous tous.

Je tiens à adresser un remerciement tout particulier au Pr Georges Huez, de la Faculté des Sciences de l’ULB, qui a accepté de présider ma soutenance, ainsi que au Dr Véronique Halloin et au Dr John Werenne de l’Ecole des Ingénieurs en agronomie en Biotechnologie de l’ULB pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse : c’est pour moi un grand honneur de pouvoir présenter mon travail à des chercheurs de votre renommée.

J’ai un souvenir nostalgique de mes premiers pas en laboratoire de biologie moléculaire, à la Faculté des Sciences Agronomiques de Gembloux (et de toutes les merveilleuses années que j’y ai passé d’ailleurs), où j’ai appris les techniques et la rigueur qui me servent encore aujourd’hui. Je remercie toute l’équipe qui m’a appris à manier pipettes et éprouvettes, principalement, le Pr Richard Kettmann, le Dr Luc Willems, le Dr Franck, Renée, et tous les autres.

19 20 Je remercie également mes amis : Laurent Biernaux & Louise, Riton Galet & Marie-Hélène Masuka, Eric & Fabi & Roméo Van de Casteele, Laurent & Hannan, Sammy et Lina Lois, Pascal Joukowky et sa famille, Serge Rydlewski, Peter Soldan & Patsy & Colas, Philippe Malempré, Serge et Sylvie, Pauline et Maude Ivanoff, Eric et Eliane Abachin et famille, Florimond & Nadia et les enfants Dufoor, Fred & Marianne & Zoé Dufoor, Nathalie Boutonnet & Laurent Van de Casteele, Sophie Nollevaux, Séverine, Billitis, Inès, Alexandra Dufay et Lou Manigart. La bande : Vanessa Geuens, Daisy, Dim et Natacha Winners, Jo Giammorcaro, Pascal Collard, Patrick & Sihem, Leila & Salma Tielemans, Xav Deblier, Chris Meester & Nana Kouyoumdjisky & Milena, Nordinne Daouiat, Thierry Muller, Greg Kauffman, Stephane Kurgan, Dominique Sick, Philippe Speltincks, Valérie Cops & Olivier Hasquin. Les Gembloutoix : Vincent Leclerc et Sigrid Demeester et la famille, Pierre-Yves Dubois, Cédric Vermeulen, Bruno Portier, Alain Houyoux et Francine, Khalifa Traore, Michel Custers. Les amis du Burkina Faso : Thierry Baldet, Vinze Michel, Guylain Prêteseille, Lionel Ronnier & Soph, Abdulaye Kindo, Alex Dayo, Benoît Varenne et Alexandra, Clément Palé, Bernard & Mariam Gasca, les Saint-Michel, Marion, Pierre et Saskya, Gilberte Nombré, Etienne Bambara dit le Cee, Abdelkader Mercheri, Dominique & Catherine et les enfants Roberfroid, Sammy Lebel & Claudine et les enfants, Colas Hou & Sanata Nikiema, Pierre & Appauline Crozier et les enfants, Fulgence Coulibaly, Thomas Verges & Monique Sanou, les sœurs Hema et toute la famille, et surtout, la famille Ouattara, Mamadou, Delphine, Bouba et Assane.

Et Christelle…

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Résumé :

De 1994 à 1998, s’est déroulé l’essai clinique DITRAME ANRS 049a qui a démontré, pour la première fois, l’acceptabilité, la tolérance et l’efficacité d’un traitement court de zidovudine (ZDV) sur la diminution de la TME. Notre travail s’est inscrit dans le cadre de cet essai et a eu pour but d’en analyser certains des aspects virologiques et leur rapport avec la transmission de la mère à l’enfant du VIH (TME). D’une part, nous avons analysé les niveaux de réplication virale dans différents compartiments physiologiques : le sang, les sécrétions cervico-vaginales (SCV) et le lait maternel (LM) et leur rapport avec la transmission, par des études cas-témoins nichées dans la cohorte DITRAME. Nous avons démontré le rapport entre la charge virale libre (CV) dans le plasma à 34 semaines d’aménorrhée et à J8 postpartum et la TME dans le contexte africain où la probabilité d’avoir un allaitement exclusif à un an est de 46,6%, et analysé leur rapport avec le traitement ZDV. Nous avons également démontré que la TME est essentiellement due à une charge provirale plus élevée dans les SCV dans notre contexte. De plus, grâce à la mise au point d’une technique, nous avons démontré que la ZDV avait un effet global marqué sur la diminution de la CV libre dans le LM. Il s’agit de la première étude mettant en relation la CV dans le lait avec la transmission postnatale. De même, nous avons observé une différence très hautement significative entre les charges virales libres des femmes ayant transmis le VIH et les non transmettrices. De plus, nos analyses univariée et multivariée démontrent que la CVlm mesurée en log10 de la lactation précoce (J8) est un facteur indépendant très significativement associé à la TME. Chez les femmes ayant transmis le virus durant le post-partum et non traitées à la ZDV, la CVlm médiane a décru de 1608 copies/mL (c/ml) à J8 à 346 c/ml à J45. Par contre, chez les femmes ayant transmis le virus mais ayant reçu un traitement ZDV, la CVlm médiane évolue de 56 c/ml à J8 à 470,5 c/ml à J45. Cette tendance marquée à un effet rebond de la CVlm à J45 laisse penser que la TME qui a lieu chez les femmes traitées à la ZDV pourrait être une conséquence de l’arrêt de ce traitement, comme observé chez les adultes après arrêt du traitement HAART.

D’autre part, nous avons étudié la variabilité du VIH en fonction de la TME. Dans un premier temps, nous avons analysé la diversité du VIH-1 chez des mères africaines vivant en France, et par après au Burkina Faso. Ensuite, grâce à l’élaboration d’une nouvelle technique, nous avons démontré que le HMA pouvait être un outil adapté à l’étude des co- et sur-infection chez l’adulte. Nous avons identifié de cette manière deux surinfections parmi 147 femmes analysées au sein d’une cohorte de femmes à haut risque de surinfection. Nous avons ensuite utilisé ce moyen pour étudier des enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero qui auraient pu se surinfecter durant le peripartum ou ensuite par l’allaitement. Sept enfants parmi 18 analysés, présentant des profils HMA à suspicion de coinfection et qui présentaient un taux de mortalité plus élevé que la normale, ont été identifiés. Leurs séquences provirales env sont en cours d’analyse actuellement.

Par ailleurs, nous avons confirmé le fait que le taux de vitamine A n’a pas d’influence sur la TME.

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Abstract :

Between 1994 to 1998 the ANRS 049a DITRAME trial was conducted during which a short regimen of ZDV demonstrated for the first time acceptability, tolerance and efficacy on reduction of mother-to-child transmission (MTCT). Our major aim was to analyze certain virological characteristics of infected women in this cohort and their association to HIV-1 transmission. On the one hand, we analyzed the HIV-1 replication capacity in different physiological compartments : blood, vaginal fluids (VF) and breast milk (BM) related to MTCT were investigated by nested case control studies in the DITRAME cohort. We demonstrated the relationship between plasma viral load (VL), at 34 weeks of amenorrheae and at Day 8 post partum, and MTCT in Africa where the probability to be exclusively breastfed for an one year infant is 46.6%. We also analyzed relationship between plasma VL and ZDV treatment. Additionally, we demonstrated that MTCT is essentially the consequence of a high proviral load in VF in our context. Moreover, reduced levels of HIV-1 RNA in milk at Day 8 were observed in mothers receiving ZDV therapy rather than in mothers under placebo. For the first time, the association between BMVL and postnatal transmission has been studied. We observed a highly significative difference between BMVL of women who transmitted the virus and those who did not. Moreover, univariate and multivariate analyzes clearly indicated that early breastfeeding log10 HIV-RNA at Day8 is an independent factor significatively associated to MTCT. Decreased median BMVL from 1608 copies/mL (c/ml) at Day8 to 346 c/ml at Day45 were found for mothers who transmitted the virus during the postpartum and who received placebo. Nevertheless, for those who received ZDV, median BMVL increased from 56 c/ml at Day8 to 470.5 c/ml at Day45. This marked trend to a rebound effect of BMVL could be the consequence of the treatment withdrawal as observed for adults at HAART withdrawal. On the other hand, we studied the variability of HIV and its association with MTCT. First, we analyzed HIV-1 diversity in African women in France and Burkina Faso. In a second step, we demonstrated that HMA was an adapted tool for co and super-infections studies for adults. By this way, we identified two superinfections among 147 women within our commercial sex workers cohort. Additionally, we used this tool to analyze children of the DITRAME cohort who were infected in utero and who could be superinfected during the delivery or later by breastfeeding. We identified seven children, among 18 who were infected in utero, displaying HMA profiles suspicions for coinfections, and who had a more important mortality rate than normally. Their proviral env sequences are currently analyzed. Moreover, we confirmed the fact that the rate of vitamin A has no influence on MTCT.

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Liste des tableaux :

Tableau 1 : Facteurs avérés et supposés de la transmission de la mère à l’enfant du VIH dans un contexte d’allaitement Tableau 2 : Interprétation du « timing » de la TME en fonction des résultats de PCR Tableau 3 : Modalités de la TME à différents temps Tableau 4 : Facteurs microbiologiques et immunologiques significativement corrélés (p<0,05) avec la présence VIH dans le tractus génital féminin Tableau 5 : Vitamine A et immunité contre les maladies infectieuses Résultats : Tableau 6 : CVpl maternelle, groupe de prophylaxie, et autres déterminants de la TME du VIH-1. Analyse univariée Tableau 7 : Nombre de cellules CD4+, CVpl maternelle à l’inclusion, à J8 postpartum, et entre ces deux dates et risque de TME du VIH-1 Tableau 8 : Nombre de cellules CD4+, CVpl log10, log HIV RNA et HIV DNA cellulaire dans les SCV en fonction du risque de TME Tableau 9 : Log HIV RNA et HIV DNA cellulaire dans les SCV, CVpl, groupe de prophylaxie, et autres déterminants de la TME peripartum du VIH-1. Analyse univariée Tableau 10 : Analyse descriptive des CV lait en fonction de la transmission dans les échantillons disponibles Tableau 11 : Analyse univariée des déterminants de la TME Tableau 12 : Analyse multivariée des déterminants de la transmission postnatale du VIH Tableau 13 : Comparaisons entre transmissions postnatales (test négatif à J8 (ou après) puis positif ensuite) et non transmissions en fonction du traitement Tableau 14 : Evolution des CVlm des mères ayant transmis durant le postpartum à Bobo- Dioulasso Tableau 15 : CV pour les mères ayant reçu une prophylaxie ZDV Tableau 16 : CV pour les mères ayant reçu un placebo Tableau 17 : Résultats des sous-typage HMA Tableau 18 : Résultats des séquençages Tableau 19 : Comparaison séquençages et HMA Tableau 20 : Répartition des femmes de la cohorte en six catégories Tableau 21 : Résultats préliminaires des surinfections chez les enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero Tableau 22 : Timing de l’infection, charge virale après la naissance chez des enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero à suspicion de surinfection par l’allaitement Tableau 23 : Caractéristiques des mères des enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero à suspicion de surinfection par l’allaitement Discussion : Tableau 24 : Variation et sélection chez les rétrovirus Matériel & méthodes : Tableau 25 : Avantages et limites des techniques de prélèvements SCV

28 Liste des figures :

Figure 1 : Projection phylogénétique de l’évolution calculée du VIH Figure 2 : Cycle de réplication du VIH + transcription inverse Figure 3 : Observation de séquences provirales VIH dans des splénocytes de patients infectés lors de différentes phases cellulaires Figure 4 : Arbre phylogénétique des groupes VIH et liens avec le SIV / Formes recombinantes les plus courantes en Afrique Figure 5 : Evaluation des différences de résistance aux ARVs entre sous-types B et non B dans les gènes de la protéase et de la transcriptase inverse Figure 6 : Muqueuse placentaire Figure 7 : Présentation des variations histologiques du cervix, potentiellement impliquées dans une différentiation de l’infectiosité du VIH Figure 8 : Coupes histologiques des tissus mammaires Figure 9 : Muqueuse digestive et rôle des cellules M Figure 10 : Représentation de l’adhésion du VIH à DC-SIGN

Résultats :

Figure 11 : Plan des résultats présentés dans notre travail Figure 12 : Effectifs testés pour l’étude DITRAME Figure 13 : Effectifs testés pour l’étude DITRAME-VIRO Figure 14 : Répartition des effectifs testés pour l’étude des charges virales libres dans le lait maternel Figure 15 : CV pour les mères ayant reçu un placebo (changement d’échelle sur la figure) Figure 16 : Répartition des sous-types circulants en France à partir des mères d’origine africaine (« French National Cohort Study ») Figure 17 : Répartition des effectifs testés pour l’évaluation des sous-types circulant au Burkina Faso Figure 18 : HMA autologues d’ADN de femmes de la cohorte mélangés 2 à 2, choisies de manière aléatoire, comparés à des souches de références mélangées 2 à 2 Figure 19 : Arbre phylogénétique de différents VIH-1 qui ont été caractérisés au sein de la cohorte et sujets coinfectés Figure 20 : HMA autologues séquentiels, et CVpl aux mêmes temps, des sujets surinfectés Figure 21 : Migrations HMA des clones de la D049 mélangés 2 à 2 et des souches A, B et C mélangées 2 à 2 en guise de témoins Figure 22 : Migrations HMA des clones des enfants SE-B-14-1 et SE-B-52-1

Matériel & méthodes :

Figure 23 : Représentation schématique de la technique bDNA Figure 24 : Représentation schématique de la dénaturation-renaturation aléatoire des brins d’ADN et de la migration sur gel d’acrylamide (principe du HMA)

30 Abréviations :

Ac : Anticorps ADN : Acide Désoxyribonucléique ALRI : Acute Lower Respiratory Tract Infection ANRS : Agence Nationale de Recherche contre le Sida ARN : Acide Ribonucléique ARV : Antirétroviraux bDNA : Branched DesoxyriboNucleic Acid C/ml : Copies par millilitre CCKR : Chemokine Receptor (Récepteur de chimiokine) ou CCR CD : Cluster of Differentiation (Marqueur de la différenciation) CD4/µl : (ou CD4/mm3) nombre de lymphocytes T-CD4+ par volume de 1 microlitre ou millimètre cube de sang périphérique prélevé au patient CI : Confidence Interval (intervalle de confiance – IC) CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité CRF : Circulating Recombinant Form (forme recombinante circulante) CTL : CytotoxicT Lymphocytes (lymphocytes T cytotoxiques) CVlm : Charge Virale dans le lait maternel CVpl : Charge Virale plasmatique CVscv : Charge Virale dans les sécrétions cervico-vaginales DC-SIGN : Dendritic Cells- Specific ICAM3 Grabbing Nonintegrin env : Enveloppe FDC : Follicular Dendritic Cell DITRAME : DIminution de la TRansmission de la Mère à l’Enfant dNTPs : didésoxyNucléotides TriPhosphates DO : Densité Optique DSMB : Data Safe Monitoring Board ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay ET: Ecart-Type Fc : Fragment constant d’immunoglobuline gag : Group antigen gene GALT : Guts Associated Lymphoid Tissue gp : Glycoprotéine HAART: Highly Active Anti-retroviral Therapy GuSCN : Thiocyanate de Guanidium HCV : Hepatite C Virus HLA-DQ : Human Leucocyte Antigen – DQ HMA : Heteroduplex Mobility Assay (Evaluation de la mobilité des hétéroduplexes) IFN : Interféron Ig : Immunoglobuline IL : Interleukine IST : Infection Sexuellement Transmise J : Jour LM : Lait Maternel LTR : Long Terminal Repeat MALT : Mucous Associated Lymphoid Tissue MNT : Mère N’ayant pas Transmis le virus à son enfant MT : Mère ayant Transmis le virus à son enfant NDV : Newcastel Disease Virus

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Nef : negative factor NF-κB : Facteur Nucléaire kappa B NK : Natural Killer PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophorese PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells (cellules mononucléaires du sang périphérique) PBS : Phosphat Buffer Solution PLA : femmes ayant reçu un placebo PVD : Pays en Voie de Développement RANTES : Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted RBP : Retinol Binding Protein Rev : regulation of virion protein RH: Relative Hazard RIP : Recombinations Identification Program RLU : Relative Luminiscence Unit RSV : Virus Respiratoire Syncitial RT : RetroTranscriptase (RT-) PCR : (RetroTranscription-) Polymerase Chain Reaction SCV : Sécrétions Cervico-Vaginales SI : Syncitium Inducing (Qui induit des syncitia) NSI : Non syncitium inducing SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise SIgA : Secretory Immunoglobulin A SIV : Simian Immunodeficiency Virus (Virus de l’immunodéficience simienne) SLPI : Secretory leukocytes protease inhibitor (Inhibiteur sécrétoire de la protéase leucocytaire) SSEIA : Subtype Specific Enzyme Immunosorbent Assay SU : Sub Unit Tat : trans-activator of transcription Th1 : T-helper type 1 TME : Transmission de la Mère à l’Enfant (PTME : prévention de la transmission de la mère à l’enfant) TNF : Tumor Necrosis Factor TP : mère ayant Transmis le virus à son enfant durant le Post-partum UV : Ultra-Violet V3-V5 : Variable region 3 – Variable region 5 Vif : virion infectivity factor VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine Vit A : Vitamine A Vpr : virion protein R Vpu : virion protein unknown ZDV : Zidovudine (ZDV = AZT : 3’azido-2’3’-didésoxythymidine)

34 Définitions :

Allaitement exclusif : Seul le lait maternel est donné à l’enfant, à l’exclusion de tout autre aliment, liquide ou solide (sauf médicaments), et même de l’eau.

Allaitement mixte : Le lait maternel est consommé par le bébé, de même qu’un autre aliment (eau, bouillie…etc.). Ce type d’allaitement est celui qui est le plus pratiqué au Burkina Faso. En effet, traditionnellement, l’on donne de l’eau à boire au bébé dès sa naissance.

Allaitement artificiel : l’allaitement artificiel signifie que le bébé n’est pas du tout nourri au sein, mais uniquement avec un aliment de substitution.

Sevrage : correspond à la période à laquelle l’enfant est confronté à un aliment autre que le lait maternel.

Sevrage total : correspond à la période à laquelle l’enfant ne consomme plus du tout de lait maternel. Transmission in utero : signifie que la transmission de l’agent pathogène s’est déroulée durant la grossesse, avant l’accouchement.

Transmission peri-partum : signifie que la transmission s’est déroulée autour de la période de l’accouchement, que ce soit en fin de grossesse, durant l’accouchement, ou tôt après l’accouchement. Ce terme est utilisé parce que, pratiquement, il est difficile de distinguer les trois types de transmission, in utero, intra-partum et post-partum autour de la période de l’accouchement. Pratiquement, l’on définit la période peri-partum comme la période entre le dernier trimestre de la grossesse et le 7ème jour post partum.

Transmission intra-partum : signifie que la transmission s’est faite pendant le travail et/ou l’accouchement.

Transmission post-partum précoce : signifie que la transmission s’est faite après l’accouchement, par l’allaitement pour la majorité des transmissions du VIH durant cette période et que l’enfant a été détecté positif par PCR entre 1 semaine et 1 à 3 mois selon les études.

Transmission post-partum tardive : signifie que la transmission s’est faite après l’accouchement, par l’allaitement pour la majorité des transmissions du VIH durant cette période et que l’enfant a été détecté positif entre 1 à 3 mois et la fin de l’allaitement.

36 Données démographiques et sanitaires du Burkina Faso :

Données géographiques et démographiques :

- Superficie : 274.000 km2 (environ les trois quarts de la France) - Population : 11.856.000 d’habitants - Population urbaine : environ 1.800.000 habitants - Population de Bobo-Dioulasso : environ 500.000 habitants - Taux de mortalité infantile : 16,3% ; taux de mortalité juvénile : 16,5% - Indice de fécondité : 6,6% - Espérance de vie : 44,7 ans

Données socio-économiques :

- Produit National Brut par habitant : 240 $ - Répartition par secteur des activités : % agriculture / Produit Intérieur Brut (PIB) : 33,3 % ; % industrie/PIB : 27,2% ; % services/PIB : 39,5%

Données de santé publique :

- Population pour un médecin : environ 20.000 personnes - Dépenses publiques de santé / PIB : 1,2%

Données concernant le Sida :

- Prévalence moyenne pondérée VIH (1997 à 2001) : de 6% (Côte d’Ivoire : prévalence de 9,7 % en 2001) - 10 cas de SIDA notifiés en 1986 - 19540 cas de SIDA cumulés au 30 juin 2002, 400.000 personnes infectées en 2004, 1.500 patients sous ARVs et 60.000 personnes en demande d’ARVs - Tranche d’âge de 25 à 49 ans la plus touchée surtout parmi les hommes - Evolution de la séroprévalence de 7,09% en 1998 (n=2226) à 5,5% en 2000 (n=2099) à 4,8% en 2001 pour l’ensemble du pays - Bobo-Dioulasso : prévalence stabilisée à 7,3% - La plupart des femmes allaite leur enfant pendant 2 ans au Burkina Faso (pour l’espacement des naissances notamment)

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I. INTRODUCTION :

39 Tableau 1 : Facteurs avérés et supposés de la transmission de la mère à l’enfant du VIH dans un contexte d’allaitement :

Classes - Types Références Viraux - Charge virale dans le plasma (non démontré dans (1, 2, 3) le contexte africain + ZDV) - Charge virale dans les SCV (idem) (4) - Charge virale dans le lait maternel (idem) (5) - Génotype viral : des variants mineurs ou majeurs (6) de la population virale maternelle sont retrouvés chez l’enfant - Phénotype viral : des variants NSI sont transmis à (7, 8) l’enfant ; des variants SI sont trouvés chez la mère - Résistance virale (9) Maternels - Nombre de CD4/mm3 de sang (10) - Anticorps neutralisants et autres facteurs immuns (11, 12) (spécifiques et non spécifiques) - Statut nutritionnel (Vitamine A) (13) - Statut clinique (14) - Dont santé du sein (mastites clinique ou subclinique, (15) abcès, blessures au mamelon) - Facteurs comportementaux (16, 17) - Traitement ARV(s) (18, 19) Obstétricaux - Rupture de membrane prolongée (>4 heures) - Mode d’accouchement - Hémorragies lors de l’accouchement - Traitement invasif du fœtus (20-23) Fœtaux - Enfant prématuré - Facteurs génétiques foetaux (24-27) Du - Type et durée d’allaitement (28) nouveau-né - Immaturité du système immunitaire - Statut clinique (morbidité – moins de capacités pour la succion)

(d’après Casper C. HIV-1 infection during pregnancy and in children : significance of HIV-1 variability and the placental barrier. ISBN91-628-4621-3. Et John-Steward G, Mbori-Ngacha D, Ekpini R et al. Breastfeeding and transmission of HIV-1. J Acquir Immune Defic Syndr 2004;35:196-202)

40 I. INTRODUCTION :

1. Présentation du sujet :

Le VIH se transmet entre individus selon trois principes : la transmission sexuelle, la transfusion sanguine et la transmission de la mère à l’enfant. Celle-ci peut se réaliser in utero, intra-partum et après l’accouchement par l’allaitement. Notre travail s’est déroulé au Burkina Faso entre les années 1997 et 2003 et a eu pour objet d’étudier certains des déterminants de la TME. Le tableau 1 reprend les facteurs avérés et supposés d’une transmission de la mère à l’enfant du VIH (1-28). Notre travail a été réalisé essentiellement dans le contexte d’un essai clinique de PTME, l’essai DITRAME qui a évalué l’efficacité d’un traitement court de ZDV sur la PTME. Il s’est focalisé plus particulièrement sur les facteurs indiqués en caractères gras dans le tableau 1, à savoir, l’influence de la variabilité du VIH sur la TME, dont un résumé des connaissances actuelles moléculaires et physiologiques, en fonction du moment de la transmission, sera présenté dans la première partie de notre introduction. Un des objectifs de notre travail a été de mettre au point un outil permettant de détecter les co et surinfections et d’évaluer leur fréquence. Un autre de nos objectifs a été de déterminer l’impact que pourrait avoir la transmission de plusieurs variants phylogénétiquement divergents de la mère à l’enfant. La deuxième partie évaluera les connaissances actuelles au sujet de l’influence des charges virales dans différents compartiments physiologiques (le sang, les SCV et le lait maternel) sur la TME, ce qui était l’objet de la deuxième partie de notre travail. De manière plus concise, une troisième partie sera plus particulièrement consacrée à l’influence de la vitamine A sur la TME.

2. Origine et évolution génétique du virus : 2.1. Origines des virus VIH-1 et VIH-2 :

Les virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1 et VIH-2) ainsi que ceux de l’immunodéficience simienne (SIV) appartiennent à la sous-famille des Lentiviridae, de la famille des Retroviridae. On dénombre à ce jour une trentaine d’espèce de primates africains naturellement infectés par le SIV (29, 30). Comme, dans la nature, les singes infectés ne

41 Figure 1 : projection phylogénétique datée de l’évolution du VIH :

Korber & al. Human Retroviruses and AIDS. Los Alamos. New Mexico, Los Alamos National Laboratory. Salemi M et al. Dating the radiation of HIV-1 group M in 1930s using a new method to uncover clock-like molecular evolution . FASEB J. 2001 Feb;15(2):276-8.

42 souffrent le plus souvent d’aucune pathologie, il est vraisemblable que l’infection est d’origine ancienne et que le virus s’est adapté progressivement à son hôte. Lors d’un passage d’une espèce à une autre, le virus peut voir se développer son pouvoir pathogène vis-à-vis de son nouvel hôte, comme ce fût le cas pour les virus VIH-1 et VIH-2. Il est aujourd’hui clairement acquis que ces virus proviennent de transmissions zoonotiques provenant de deux réservoirs différents : le VIH-2 correspondant à plusieurs transmissions du SIVsm de mangabeys enfumés (Sooty mangabey, Cercocebus atys) à l’homme en Afrique de l’Ouest, et le VIH-1 de transmissions répétées SIVcpz de chimpanzés (Pan troglodytes) d’Afrique Centrale (31-33). Le SIVcpz provient, lui, d'une recombinaison entre deux virus de l'immunodéficience simienne (SIV), dont sont porteurs le singe hocheur et le cercocèbe à collier blanc (34). Certaines populations en Afrique sont en contact régulier avec une diversité considérable de SIV, par la chasse et la consommation de viande de brousse (30). Le premier passage à l’espèce humaine aurait eu lieu autour des années 1930 (figure 1) vraisemblablement en République Démocratique du Congo où la prévalence est relativement faible – pour l’Afrique centrale – et stable depuis le début des années 1980. Le premier échantillon confirmé positif pour le VIH a été trouvé à Kinshasa et son origine daterait de 1959 (35-38). Il n'existe aucune preuve de transmission à l'homme des souches virales SIV provenant des singe hocheur et cercocèbe à collier blanc. Des études ont cependant montré que plusieurs types de SIV peuvent se répliquer dans des lymphocytes humains et qu'une contamination de l'homme, voire l'apparition d'un VIH-3, peut être envisageable. Une telle transmission pourrait aussi être à l'origine de nouvelles souches virales, notamment par recombinaison avec des VIH existants, et contribuerait à élargir l'éventail, déjà très étendu, des virus du sida qui circulent actuellement et accroître son adaptation à l’homme (39).

2.2. Causes et conséquences de la variabilité

Le taux d'évolution du génome rétroviral dépend de quatre facteurs : - le taux de mutations spontanées dues aux erreurs de la transcriptase inverse - le nombre de générations par unité de temps - les recombinaisons de deux ou plusieurs variants au sein d’une même cellule - les pressions de sélection positive et négative

43 Figure 2 : cycle de réplication du VIH :

Reconnais- sance et Fusion et liaison pénétration

Récepteur de chimiokine

Récepteur CD4+

Phase précoce

Phase tardive Transcription sur ribosome Transcription sur ribosome

Reticulum endoplasmique

Dégradation du CD4

Reconnaissance du génome

Assemblage

Maturation

Bourgeon- nement

Turner BG & Summers MF. Structural Biology of HIV. J Mol Biol 1999;285 :1-32.

44 2.2.1. Faible fidélité de la transcriptase inverse :

La transcriptase inverse a un taux d’erreur estimé à environ 10-4 mutations par site et par cycle, soit une erreur par cycle réplicatif en moyenne dans les études qui furent réalisées in vitro (40, 41). Cette ADN polymérase ne possède pas d’activité exonucléase 3’-5', et ne peut corriger les mauvaises incorporations de nucléotides essentiellement lors de la transcription de l'ARN en ADN (42). Des études in vivo donnent un taux de mutation plus faible [3x10-5 mutations par site et par cycle selon Mansky (43)].

2.2.2. Fort taux de réplication

Le taux de réplication du VIH estimé in vivo est de l'ordre de 109 à 1010 par jour (44), ce qui génère une grande quantité de variants (figure 2) (45).

2.2.3. Recombinaisons

La transcriptase inverse "switch" d’un brin d’ARN à l’autre durant la transcription (46, 47), pendant la synthèse du brin négatif (premier synthétisé) (48, 49). Les recombinaisons intramoléculaires (à l'intérieur d'une même molécule d'ARN) génèrent ainsi des délétions ou des insertions (50). Les co-infections sont à la base des phénomènes de recombinaison inter sous-types lorsque deux ARN de souches différentes sont ensemble dans le même virion (cfr infra). Une première forme de recombinaison est le transfert d'amorce durant la synthèse du provirus. Le LTR 5' synthétisé à partir de l'amorce ARNt Lys peut se fixer sur la deuxième molécule d'ARN lors de ce transfert. D'autres recombinaisons ont lieu pendant la transcription inverse, elles se produiraient pendant les pauses de l'enzyme (49) qui change de brin d'ARN, sur des régions de forte homologie (50). Cependant, une petite zone d’homologie semble suffisante pour l’échange de matériel génétique ce qui justifie l’existence de recombinants inter sous-types et inter- groupes. Récemment, Meyerhans et son équipe ont démontré que le taux de recombinaisons entre virus au sein d’une même cellule pourrait être beaucoup plus important qu’imaginé initialement. En effet, par des hybridations in situ dans des splénocytes après micro- dissection, ils ont identifié une moyenne de 3 à 4 séquences provirales dans l’ADN cellulaire et jusqu’à 8 séquences dans certaines cellules (figure 3). Ces découvertes démontrent que les phénomènes de recombinaisons modifient profondément la dynamique virale in vivo (51).

45 Figure 3 : Observation de séquences provirales VIH dans des splénocytes de patients infectés lors de différentes phases cellulaires (51):

Splénocytes de deux patients séropositifs pour le VIH : les points verts correspondent aux provirus VIH détectés par une sonde spécifique de l’enveloppe virale (sonde ∆env). Les points rouges indiquent les centromères du chromosome 12 (sonde D12Z1).

A : ce patient a un nombre de cellules T CD4+ évalué à 583/µl et une CVpl de 5900 c/ml B : ce patient a un nombre de cellules T CD4+ évalué à 317/µl et une CVpl de 126900 c/ml (51).

46 2.2.4. Pressions de sélection du système immunitaire :

Mutations synonymes : Les pressions dites négatives génèrent les mutations synonymes n'entraînant pas de changement d'acide aminé. Les régions indispensables aux activités enzymatiques, de même qu’aux fonctions d’une protéine particulière sont conservées. Par exemple, pour les protéines du gène gag, les zones d'interaction entre protéines sont conservées, pour pouvoir former la matrice et la capside de la particule virale. En revanche, les protéines de l'enveloppe comprennent des régions variables (V1- V5) qui subissent plus facilement des changements d'acides aminés : ce sont des mutations non synonymes (52).

Mutations non synonymes : Les pressions positives génèrent des mutations non synonymes qui favorisent les changements d'acides aminés. Les mutations des protéines de l'enveloppe peuvent induire des changements des épitopes conformationnels et structurels du virus, et donc l’échappement à la réponse des anticorps et des cellules immunitaires. De même, des mutations qui induisent une résistance aux ARVs peuvent être sélectionnées lors de traitements. De plus, il existe des souches naturellement résistantes à certains ARVs (53) (cfr infra).

2.2.5. Conséquences :

La formation de quasi-espèce est une des conséquences de la variabilité du VIH (54, 55) : plusieurs variants viraux co-circulent chez un même patient ; ils dérivent du variant initialement transmis par mutations, insertions et/ou délétions (56, 57). La diversité génétique des quasi-espèces est de l’ordre de 5% ; 17% sur le gène de l'enveloppe chez les patients en progression lente (58, 59) : elle augmente au fur et à mesure de l’évolution vers la maladie alors qu’elle est faible en primo-infection (60). La pression de sélection du système immunitaire des différents groupes d’individus infectés a généré de grands taxons viraux. Ils ont été classés en fonction de la divergence observée dans l’enveloppe virale dans un premier temps. Ensuite, lors de la découverte de virus chimères, cette classification s’est étendue en fonction d’analyses de séquences du génome tout entier, et un classement taxonomique en sous-types, sous sous-types et CRFs a été établi.

47 Figure 4 : Arbre phylogénétique des groupes VIH et liens avec le SIV / Formes recombinantes les plus courantes en Afrique :

a) Arbre phylogénétique de séquences complètes de génomes (la barre indique 10% de divergence) (le nombre indiqué aux branchements indique les valeurs de bootstrap). b) Structure mosaïque des CRF en Afrique c) Recombinant complexe de VIH-1 à partir de deux CRF et structure mosaïque de deux groupes différents (M/O)

Martine Peeters, Coumba Toure-Kane and John Nkengasong. Genetic diversity of HIV in Africa : impact on diagnosis, treatment, vaccine development and trials. AIDS 2003; 17(18):2547-2560

48 3. Classification du VIH-1 : 3.1. Trois groupes, 9 sous-types et plusieurs formes recombinantes (CRF) :

Au sein du type VIH-1, il existe à ce jour, trois groupes différents identifiés (figure 4): le groupe M (Major Group), le groupe O (Outlier group), qui présentent une variation des séquence en acides aminés dans la région de l’enveloppe de l’ordre de 47%, et le groupe N (intermédiaire) plus récemment mis en évidence (61). Le groupe M comprend la majorité des souches qui sont responsables de la pandémie. En 1995, pour la première fois, une infection par deux sous-types différents fut décrite ainsi que l’évidence de phénomène de recombinaisons (62, 63). Sur ces nouvelles bases, la classification du VIH-1, groupe M, qui autrefois était subdivisée en 10 sous-types (A à J) sur base des séquences de l’enveloppe, fut révisée. Le groupe M est maintenant divisé en 9 sous-types « purs » (formes non recombinantes) ( A, B, C, D, F, G, H, J et K) mais également de 15 formes recombinantes circulantes [dont les plus importantes sont : CRF01_AECM240 (Afrique Centrale, Asie),

CRF02_AGIbNG (Afrique de l’Ouest et Centrale, Taïwan), CRF05-DF (Congo), CRF06-cpx (AGJK – Burkina Faso, Mali), CRF010_CD et CRF011_cpx (ACGJ) (figure 4)]. Des sous sous-types ont également été définis en fonction de nouveaux regroupements observés à l’intérieur même des sous-types, mais, l’on ne peut définir avec certitude si cela correspond à des réalités évolutives du virus ou à un manque d’analyses génomiques qui permettrait de faire le lien entre les séquences des différents sous sous-types (61).

3.2. Critères de définition des sous-types et CRF :

La définition même du sous-type a été affinée et plusieurs critères doivent être remplis pour identifier un nouveau sous-type. 1) Deux variants, au moins, doivent être séquencés dans leur intégralité. 2) Ils doivent être semblables mais n’avoir de similitudes avec aucun autre sous-type existant sur l’entièreté de leur génome. 3) Ils doivent avoir pour origine au moins deux individus non reliés épidémiologiquement. Pour être désignés comme CRFs, les mêmes critères doivent être remplis. (64)

4. Variabilité du VIH et conséquences :

Beaucoup de polémiques ont été engendrées autour de la pertinence de l’analyse phylogénétique et de la réalité phénotypique qui pourrait lui être liée. Plusieurs études ont

49 50 démontré qu’il n’y avait pas de corrélation entre le sous-type génétique et les sérotypes de neutralisation. Certains virus sont neutralisés d’emblée, alors que la plupart sont relativement résistants à la neutralisation (65). Donc, bien qu’on n’en connaisse pas les raisons, la neutralisation n’est pas fonction du génotype viral (66, 67). De même, certaines études ont démontré que la réponse des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ne dépendait pas non plus du sous-type génétique. Mais, au contraire de la réponse des anticorps neutralisants, la réponse CTL est plus élargie et l’activation générée par un variant peut engendrer une réponse contre des variants d’autres sous-types (68). Chez le singe, dans le modèle SIV/macaque, l’immunité protectrice générée à partir d’essais vaccinaux a présenté des résultats similaires (69). Cependant, ces études ne sont que les balbutiements de la caractérisation phénotypique des sous-types et ont essentiellement été réalisées in vitro. Les valeurs moyennes des distances inter-clades entre les séquences protéiques de Gag, Pol et Env, sont respectivement de 15, 10 et 24%. Il serait étonnant que des protéines présentant une telle divergence n’aient pas des propriétés biologiques distinctes (70).

4.1. Efficacité des tests de sérodiagnostic et de suivi des patients :

Même si l’on n’a pu encore démontrer la pertinence de la classification phylogénétique, les implications de la variabilité du VIH sont nombreuses et il importe de surveiller l’évolution qu’elle peut prendre pour plusieurs raisons. La première, et la plus pragmatique, est de surveiller les performances des tests de diagnostic de la séropositivité et de la charge virale qui présentent parfois une sensibilité et/ou une spécificité faible pour certains sous-types (71, 72). Ce problème se pose essentiellement en Afrique où la diversité génétique est grande, et où, de plus en plus, ces outils sont mis en place sans que l’on connaisse réellement leur efficacité (73).

4.2. Mise au point d’un vaccin :

La deuxième raison qui justifie l’étude de la variabilité du VIH est l’objectif de la mise au point d’un vaccin efficace (cfr annexe 10, résumé des essais vaccinaux). Comme mentionné plus haut, il semble que les réponses immunes ne dépendent pas des séquences génotypiques des variants VIH, mais bien d’épitopes de conformation antigénique. Il importe

51 Figure 5 : Evaluation des différences de résistance aux ARVs entre sous-types B et non B dans les gènes de la protéase et de la transcriptase inverse :

100 90 80 70 60 B 50 Non-B 40 30 20 10 0 Pourcentage de polymorphisme de Pourcentage

/R R V 36I / M L63P A71V V77I V82I K20I/ L10I Mutations de résistance du gène de la protéase à un AR V

Différences de substitutions en acides aminés dans le gène de la protéase entre sous-types B et non B, recueillies à partir de différentes souches VIH-1 publiées : 108 sous-types B et 348 non B (87A, 74C, 31D, 8F1, 13F2, 11G, 10J, 4O, 26CRF-01_AE et 84CRF-02_AG)

100 90 80 70 60 B 50 Non-B 40 30 20 10 0 Pourcentage de polymorphisme I G 6I 8I C /E F 1L 69 / 1R 0 0 T F/Y 1K 4 T S 0 1 1 8I/ 0 1 M4 8 1 V V 1 9I/ 2 21 9 K 1 7 21 R L A V 1 L V Mutations de résistance du gène de la transcriptase inverse à un ARV

Différences de substitutions en acides aminés dans le gène de la transcriptase inverse entre sous-types B et non B, recueillies à partir de différentes souches VIH-1 publiées : 13 sous-types B et 206 non B (8A, 74C, 5D, 25F, 3G, 3J, 4O, 3CRF-01_AE et 81CRF-02_AG). (76)

52 donc de cartographier ces épitopes de façon à pouvoir les utiliser dans un pool vaccinal pour générer une réponse aussi large que possible aux différentes souches qui circulent dans une région géographique donnée. Il est vraisemblable qu’un pool vaccinal efficace, capable d’induire une réponse en anticorps neutralisants à large spectre devra prendre en compte les critères phénotypiques et génotypiques du virus. De plus, l’étude de son efficacité devra être régulièrement testée en fonction des nouveaux sous-types et CRFs circulants mis en évidence (74). Cet aspect du problème semble de plus en plus primordial, vu le nombre important de coinfections et de recombinants observés ces dernières années. La fréquence de ces coinfections/surinfections demeure cependant inconnue et il n’existe à l’heure actuelle, aucun outil simple permettant l’évaluation de la fréquence de ces co et surinfections (cfr infra). Cette question sera d’ailleurs l’objet d’une partie de nos travaux présentés ici.

4.3. Réponse aux antirétroviraux :

La troisième raison est la réponse aux ARV. A l’heure actuelle, les ARV sont peu utilisés dans les pays en voie de développement (environ 75.000 personnes traitées ; environ 38 millions de personnes infectées), où circulent des sous-types non B ; l’on sait donc globalement peu de choses au sujet de la vitesse d’apparition des résistances aux ARV chez ces virus (74). Cependant, des différences parfois très significatives dans les mutations mineures de résistance, autant dans la région de la transcriptase inverse que dans la protéase, existent entre virus B et non B (figures 5) (75). De même parfois, entre sous-types non B, des différences existent comme pour la névirapine pour laquelle une résistance plus importante fut observée entre 6 et 8 semaines post-partum pour les souches D par rapport aux A dans le cadre d’un essai de PTME en Ouganda (76).

Toutes ces raisons justifient le fait de pratiquer une surveillance accrue de la variabilité du VIH et de caractériser cette variabilité en fonction d’objectifs pratiques. La transmission de la mère à l’enfant en fonction de la variabilité est un point crucial peu investigué (cfr infra) et un des objets de notre travail.

54 5. Le HMA : un outil pour l’étude de la variabilité du VIH ?

5.1. Outils dont on dispose pour étudier la variabilité :

5.1.1. Le séquençage suivi d’analyses phylogénétiques :

Le Standard d’Or reste le séquençage suivi d’une analyse phylogénétique pour identifier les sous-types et éventuellement d’autres analyses pour identifier les recombinants (RIP, Diversity Plots, Bootscanning methods), mais ce sont des techniques lourdes et coûteuses qui demandent une formation et du matériel souvent inadaptés aux études de grande envergure qui devraient être mises en place pour évaluer la dynamique de variation virale. D’autres techniques ont donc été développées.

5.1.2. Le sérotypage :

Une technique de sérotypage [subtype-specific enzyme immunoassay (SSEIA)] utilisait un principe de blocage avec des peptides spécifiques de chacun des sous-types en phase liquide. Bien que des résultats préliminaires aient mis en avant cette technique comme la technique adaptée à l’étude des sous-types, puisqu’elle était relativement simple et pouvait être mise en place dans tous les laboratoires disposant d’une chaîne ELISA, (77) d’autres données ont mis en évidence de nombreux problèmes de croisement (essentiellement entre les sous-types A et C ainsi que D et C) qui la rendait inadaptée à la caractérisation des sous-types, (78-80) vraisemblablement à cause de la présence de séquences octamérique dans la boucle V3, qui sont communes à plusieurs sous-types ; de nouveaux peptides tétramériques, spécifiques de chacuns des sous-types génétiques, devraient être mis au point. (74).

5.1.3. Les techniques de PCR spécifiques :

D’autres méthodes, impliquant des techniques de PCR spécifiques, donc plus lourdes à mettre en place, ont également été développées. (81, 82)

5.1.4. La technique d’Heteroduplex Mobility Assay:

A l’heure actuelle, la technique qui semble la mieux adaptée à l’étude de la variabilité « large envergure » du VIH-1 est l’étude de la mobilité des hétéroduplexes (cfr matériel & méthodes). Comme il s’agit d’une technique qui requiert une PCR nichée, c’est une technique relativement lourde qu’il n’est pas facile de mettre en place, par exemple, dans les pays en voie de développement. Mais, c’est une technique plus simple que le séquençage suivi d’une analyse phylogénétique et qui présente une forte corrélation avec celle-ci. (83). Dans l’analyse

55 56 de la variabilité, les infections duales de même que les surinfections et les phénomènes de recombinaisons ont une importance considérable. La surinfection est définie comme une réinfection d’un individu après l’infection primaire, donc après que la réponse immunitaire ait été établie (en dehors de la fenêtre sérologique), par une souche virale hétérologue d’un même sous-type ou d’un sous-type différent (84). Sa mise en évidence est donc tributaire d’une analyse longitudinale d’un même individu. D’autre part, on parle de coinfection lorsqu’une personne est infectée à un temps donné, par deux virus différents qui ne peuvent être issus d’une souche similaire (dont la divergence totale dépasse 5%), sans spéculation sur le mode de contamination des deux virus. Il peut donc s’agir d’une surinfection, mais aussi, d’une contamination simultanée (durant la période de la fenêtre sérologique). La fréquence de recombinants serait de l’ordre de 10% et les études les plus récentes démontrent que cette valeur serait minimisée (85-87). Le groupe de M. Peeters a démontré que 30% des variants séquencés dans une étude de la variabilité au Nigéria étaient des recombinants (88). C’est pourquoi, un HMA dans la région gag a été mis au point, qui devrait permettre la mise en évidence des recombinants entre les régions env et gag (89). Depuis 1995, de nombreuses infections duales ont été mises en évidence, ainsi que de nombreux recombinants (84, 90-100). Mais, pour la plupart, ces recombinants, de même que les infections duales, ont été mis en évidence grâce à des techniques de PCR suivies de séquençage et analyses phylogénétiques, lourdes à utiliser. Bien qu’il ait été mis en avant comme une technique simple d’usage pour l’étude de la variabilité dans les années 1990s (83, 101), le HMA est aujourd’hui abandonné au profit du séquençage, certainement grâce à l’allègement du prix et la simplification de ces techniques. Cependant, le HMA reste un moyen simple d’étude de la variabilité et surtout des coinfections, utilisé aussi pour l’étude d’autres virus que le VIH (102).

6. La problématique des surinfections :

6.1. La surinfection chez l’adulte :

C’est tout récemment que les premiers cas avérés de surinfection ont été mis en évidence. Dans une première étude, réalisée par Ramos et al en Thaïlande où deux souches majeures cocirculent (la souche recombinante CRF01-AE et la souche B), deux usagers de

57 58 drogue par voie intraveineuse se sont surinfectés malgré une réponse humorale et cellulaire importante contre le virus primaire (103). L’un des patients s’est infecté trois mois après l’infection primaire, tandis que le deuxième l’a été 11 mois plus tard. Cette démonstration génère de nombreuses réflexions quant à la capacité vaccinale à protéger contre des infections hétérologues (103). Une deuxième étude menée par Jost et al, décrit le cas d’un homosexuel de 38 ans, infecté par une première souche AE. Enrôlé dans une cohorte de mise sous HAART, ce patient s’est surinfecté lors de vacances thérapeutiques par une souche B durant un voyage au Brésil (104). Un rebond de la charge virale plasmatique jusqu’à 400.000 copies/ml fut observé lors de la surinfection, et le premier variant CRF01_AE devint indétectable par la suite. Dans une troisième étude, Altfeld et al (105) ont mis en évidence une surinfection chez un individu qui présentait pourtant, à nouveau, une large réponse CD8 contre 25 épitopes des protéines virales Gag, RT, Intégrase, Env, Nef, Vpr, Vif et Rev contre le virus primaire de sous-type B. Cet individu présentait un rebond de charge virale plasmatique important lors de la surinfection par un sous-type B divergent de 12% dans l’enveloppe. De même, la réponse des lymphocytes CD8 a subi une régression importante conséquente à la présence du nouveau variant (105). Une quatrième étude a décrit une surinfection après acquisition de résistance d’un variant B, par un autre variant sauvage, du même sous-type (106). Plus récemment encore, l’équipe de Jost a procédé d’une manière originale en recherchant, au sein d’une cohorte suisse d’usagers de drogue par voie intraveineuse, ceux qui avaient un pic de charge virale élevé sans raison définie (5 parmi 136). Deux nouveaux cas de surinfection d’un sous- type B par un variant CRF011_cpx furent mis en évidence de cette manière (107). Au vu de ces résultats, il semble de plus en plus évident que les phénomènes de surinfection ne soient pas des phénomènes marginaux, mais, que, au contraire, ils sont plus fréquents qu’initialement imaginé par la communauté scientifique (108). De nombreuses polémiques ont suivi ces publications, et les avis sont partagés quant à l’impact de ces découvertes sur la conception d’un vaccin efficace. En effet, la surinfection a été induite chez les chimpanzés avec le VIH (109), comme chez le macaque avec le SIV (110, 111). Dans ces deux modèles expérimentaux, l’infection secondaire génère une dégradation de l’immunité ralentie par rapport à l’infection avec le premier variant et la charge virale plasmatique est stabilisée (109-111). De plus, lorsque expérimentalement, le compartiment CD8+ est éliminé, les hauts niveaux de virémie initiaux persistent (112).

59 Tableau 2. Interprétation du « timing » de la TME en fonction des résultats de (RT)- PCR :

Transmission/RT- J1/J8 J45 J90 J180 PCR* Perinatale Positif Positif Positif Positif Postpartum précoce Négatif Négatif ou Positif Positif Positif Postpartum tardive Négatif Négatif Négatif avec Positif ou négatif résultat positif avec résultat plus tard positif plus tard Pas de transmission Négatif Négatif Négatif Négatif sans résultat positif plus tard

*Infection déterminée par RT-PCR spécifique de l’ARN VIH sur le plasma du nouveau-né

60 Chez l’homme, l’espoir de la mise au point d’un vaccin qui permettrait d’engendrer une large réponse immunitaire, contre un large spectre de variants génétiquement différents reste maintenu (113, 114). Jay Levy rappelle que pour de nombreux virus, la réinfection est un phénomène courant, comme pour le virus Epstein-Barr, le cytomégalovirus et les papillomavirus (113). La surinfection avec le VIH n’est donc pas surprenante, et la réponse immunitaire, une fois installée contre le second variant devrait permettre une stabilisation de la virémie, comme observé in vitro (115). Cependant, Goulder et Walker signalent l’importance de la mise en évidence de nouveaux cas de surinfection, de l’observation de la naissance de nouvelles formes recombinantes dans le cas de surinfections et du fait de savoir si elles peuvent s’opérer au sein de mêmes clades (114). Par ailleurs, les deux réflexions présentées mettent en avant le fait que les personnes surinfectées étaient ou avaient été sous HAART, et que la réponse immunitaire devait, dès lors, s’en trouver affaiblie. Notre travail a eu pour objectifs de développer un outil simple, basé sur le HMA, pour l’identification des surinfections chez des adultes non traités, puis d’évaluer si celles-ci pouvaient être détectées chez les enfants.

6.2. La surinfection dans le contexte de la TME :

Jusqu’à présent, aucune équipe n’a présenté de résultats sur l’impact que pouvaient avoir de telles coinfections/surinfections sur les femmes enceintes et sur la transmission de variants différentiels de la mère à l’enfant. Mais, l’on sait, d’après ce qui a été étudié sur la TME que, dans certains cas pour le moins, des variants mineurs de la quasi-espèce peuvent être transmis (116-118). Dès lors, deux scenarii peuvent se présenter qui pourraient influencer les types de variants lors de TME et mimer une surinfection chez l’enfant : 1°) La mère présente une population virale très divergente, comme c’est le cas lorsqu’un patient évolue vers le stade SIDA (116), et transmet in utero un variant mineur qui acquière la propriété de traverser la membrane placentaire. L’enfant est infecté in utero et présente une PCR positive quelques jours après la naissance (tableau 2). Cependant, il est probable qu’un variant qui acquerrait la propriété de franchir les muqueuses mammaires cette fois, serait de type différent de celui qui avait acquis les propriétés de pénétrer la membrane placentaire. Si cette nouvelle classe de variants, qui se multiplient dans les glandes mammaires, infecte le nouveau-né, on se trouverait dans un cas similaire à celui d’une surinfection du nouveau-né par un nouveau variant, mais par l’allaitement. Le nouveau-né pourrait aussi s’infecter intrapartum avec un variant différent présent dans les SCV (119) ; dès lors, l’on se trouverait à nouveau dans une situation de surinfection

61 62 mais intrapartum cette fois. Ce phénomène pourrait avoir lieu a fortiori si la mère est coinfectée par deux populations virales différentes.

2°) Un autre scénario qui pourrait se présenter est que la mère, déjà infectée, se surinfecte par un nouveau variant, lors de sa grossesse ou après l’accouchement. En effet, durant ces deux périodes, la femme se trouve dans une situation de switch immunitaire d’une réponse cellulaire – plus adaptée contre le VIH – vers une réponse en Ac (cfr infra)(120). Dès lors, avec l’augmentation de CVpl (générant une plus grande diversité génétique) et la baisse des lymphocytes T CD4+ consécutifs à l’infection primaire, il est vraisemblable que l’infection in utero peut être facilitée. Et que, parmi les deux populations virales présentes, il s’en trouve une ayant des propriétés pour franchir la membrane placentaire. D’autre part, cette diversité génétique, et l’augmentation de la CVpl liée à la surinfection devrait favoriser la transmission par l’allaitement également. Un autre argument qui favorise cette hypothèse est le fait qu’après l’accouchement, la femme se trouve dans une situation de fragilisation des muqueuses cervicales (ectopion, cfr infra) qui favorise la transmission hétérosexuelle. En cas de surinfection, l’augmentation de CVpl et donc de CVlm (121) devrait donc également favoriser la transmission par l’allaitement. Quoiqu’il en soit, il est vraisemblable qu’en période de grossesse, le phénomène de surinfection puisse survenir plus facilement chez la mère et avoir un impact sur la TME.

7. Modalité de la TME et impact de la variabilité virale :

Récemment, les résultats d’une étude très intéressante chez le singe macaque rhésus (Macaca mulata) qui avait pour objectif d’évaluer les mécanismes de la transmission du virus SIV de la mère au nouveau-né, par l’allaitement, ont été présentés (122). Après avoir été inoculées par une souche SIV durant la lactation, 5 des 8 mères ont transmis le virus par l’allaitement endéans dix mois (de 14 à 318 jours après l’infection de la mère). Des pics de CVlm libres furent observés 14 jours après l’inoculation (de 104 à 105 c/ml) tandis que les

CVpl étaient de 3 log10 plus élevées au même temps. Cependant, une seule femelle a transmis le virus durant cette période de charges virales élevées et a dû être ensuite euthanasiée à cause de la progression rapide de sa maladie. Globalement, la CVlm ne fut pas corrélée avec la TME. D’autre part, les génotypes dans la région hypervariable V1-V2 furent comparés. Deux

63 Tableau 3 : modalités de la TME à différents temps :

Timing Exposition potentielle au VIH-1 In utero Contact cutané et/ou muqueux du fœtus avec le liquide amniotique (virions libres et/ou cellules infectées) après passage d’un variant particulier au travers de la membrane placentaire. Contact au travers des échanges entre la mère et le fœtus via le cordon ombilical. Peri-partum Contact cutané et/ou muqueux du fœtus avec le liquide amniotique (virions libres et/ou cellules infectées) après passage d’un variant particulier au travers de la membrane placentaire. Contact cutané et/ou muqueux du fœtus avec les variants présents dans les SCV (virions libres et/ou cellules infectées) ou le sang maternel (variants présents dans le sang maternel). Ingestion de variants ayant pu traverser les membranes mammaires présents dans le colostrum (contact des muqueuses avec virions libres et/ou cellules infectées). Contact cutané et/ou muqueux du nouveau-né avec le sang maternel et/ou des exsudats cutanés (lésion des tétons ou du sein maternels et/ou lésion orale du nouveau-né) (variants présents dans le sang maternel). Post partum Ingestion de variants ayant pu traverser les membranes mammaires présents dans le colostrum et/ou de lait maternel (contact des muqueuses – amygdales, bronches et intestins - avec virions libres et/ou cellules infectées) Contact cutané et/ou muqueux du nouveau-né avec le sang maternel et/ou des exsudats cutanés (lésion des tétons ou du sein maternels et/ou lésion orale du nouveau-né) (variants présents dans le sang maternel).

D’après Van de Perre P. Mother-to-child transmission of HIV-1 : the « all mucosal » hypothesis as a predominant mechanism of transmission. AIDS 1999 ; 13 : 1133-1138 (237).

64 des cinq nouveau-nés furent infectés par un variant mineur présent dans le lait maternel, et tous les cinq par des populations très homogènes, ce qui laisse penser qu’un phénotype particulier est requis pour la transmission orale chez le nouveau-né. Par contre, des inoculations directes d’un virus similaire chez le nouveau-né, donc, sans passage par les muqueuses mammaires, n’avait pas démontré la transmission d’un variant mineur (122). Ceci tendrait à démontrer qu’un mécanisme particulier impliquant des constituants du lait comme les Ig spécifiques pourrait se dérouler. Les populations virales du sang maternel n’ont pas été analysées malheureusement. Lors d’une seconde partie de l’étude, 3 parmi 4 femelles macaques infectées durant la gestation (J90 pour une gestation de 165 jours) ont transmis le virus à leur progéniture par l’allaitement après plus de 6 semaines d’allaitement (123). Malgré le fait que l’analyse génétique des variants VIH apparaisse comme cruciale pour la compréhension des principes par lesquels le virus traverse les différentes membranes lors de la TME, à l’heure actuelle, peu d’études ont été réalisées sur ce sujet et souvent, elles l’ont été sur des effectifs très réduits. De nombreuses études ont été réalisées sans distinction sur le moment réel de la transmission (distinction entre in utero, peri-partum et post-partum). Il semble vraisemblable que, parmi le pool de variants qui constitue la quasi-espèce virale de la mère, certains ont, ou acquièrent la propriété d’infecter le fœtus ou le nouveau-né (124). Il est vraisemblable également que plusieurs processus d’infection différents existent en fonction des moments de la transmission. En plus de la sélection au niveau des muqueuses intestinales de l’enfant, qui doit avoir lieu in utero, lors de l’accouchement et de l’allaitement. L’exposition potentielle au VIH-1 et le timing de la transmission de variants de la mère au fœtus/nouveau-né peuvent être résumés selon le tableau 3.

7.1. Transmission in utero :

7.1.1. Modulation des mécanismes immunitaires maternels durant la grossesse :

Les cellules maternelles et fœtales s’échangent au-travers de la membrane placentaire durant la grossesse (125, 126, 120), ce qui signifie que des mécanismes qui bloquent la réponse immunitaire contre les alloantigènes fœtaux doivent se développer. Ces mécanismes affectent aussi bien la réponse immunitaire innée non spécifique que les réponses adaptatives spécifiques (127). Globalement, le nombre de granulocytes augmente (128), le nombre de lymphocytes diminue et les monocytes restent en nombre constant (129). Cependant, ces derniers sont activés et expriment en surface un grand nombre de molécules d’adhérence (CD11a, CD11b, CD54) qui jouent un rôle important dans la médiation leucocytaire aux

65 Figure 6 : muqueuse placentaire :

66 stimuli inflammatoires et dans les interactions de cellules à cellules (129, 130). De même, l’expression du récepteur Fc des IgG (FcγR-1, CD64) sur les monocytes, qui génère la phagocytose et la destruction des microorganismes, est augmentée. MIC-1 (macrophage inhibitory cytokine 1) et la néoptérine, des marqueurs de l’activation des monocytes, sont également en augmentation (131, 132). Ces molécules pourrait aussi être des activateurs de NF-κB qui est un activateur de la transcription du VIH (127). Par ailleurs, la susceptibilité accrue à certaines infections virales durant la grossesse, et à des agents pathogènes intra-cellulaires, comme Listeria – qui est résistant à la phagocytose par les monocytes – serait due à une baisse de l’activité des cellules T (133-135). Au contraire, les cellules B restent fonctionnelles ainsi que la production d’anticorps (134), vraisemblablement, par l’augmentation d’IL4, IL5 et IL10, qui renforcent la réponse humorale. Ceci engendre un switch de la réponse immunitaire de type 1 (production d’IFN-γ, de TNF-α, et d’IL2) au profit de la réponse de type 2. Ceci inhibe la réponse immunitaire cellulaire T qui pourrait être destructrice pour le fœtus (136, 137), bien qu’il ait été démontré que l’IFN-γ est indispensable pour le développement des tissus placentaires et la défense contre certains pathogènes létaux pour le fœtus (138, 139). Par ailleurs, la présence de facteurs immunosuppressifs dans le sérum de femmes enceintes a été démontrée (140). Globalement, il apparaît donc que l’équilibre de l’homéostasie durant la grossesse est rompu au profit de l’activation des capacités monocytaires, et au dépens de la réponse T et NK qui pourtant sont en grand nombre à l’interface materno-fœtal (125).

7.1.2. Timing de la transmission in utero :

La transmission précoce in utero du VIH-1 semble rare comme l’a montrée une étude de l’infection des thymus de cent fœtus provenant de mères infectées et ayant avorté spontanément, où seuls deux fœtus avaient été détectés positifs par PCR au deuxième trimestre de la grossesse (141). Parmi les enfants non allaités au sein, infectés par le VIH-1, il semble qu’environ un tiers ait acquis l’infection in utero (principalement pendant le 3ème trimestre de la grossesse) et 2/3 pendant le travail et l’accouchement (142).

7.1.2. Histologie du placenta :

Le placenta est un organe spécialisé dans les échanges entre la circulation maternelle et le fœtus (figure 6). La barrière placentaire qui sépare le sang maternel et fœtal est composée de deux couches de trophoblastes, du tissu conjonctif du villus chorionique et de l’endothélium du vaisseau sanguin fœtal. Elle est très fine surtout en début de grossesse, et

67 68 s’étend au cours de la grossesse. Les trophoblastes sont des cellules qui ne possèdent pas d’antigène du CMH de classe II ce qui permet la « tolérance » du placenta par la mère. Les syncytiotrophoblastes n’expriment pas d’antigène du CMH de classe I ni II (143).

7.1.3. Mécanismes potentiels de la transmission in utero :

Potentiellement, l’infection du fœtus peut survenir selon quatre modes différents : par l’infection des trophoblastes, par l’infection des cellules du stroma après transcytose, à cause de lésions placentaires ou à cause d’une chorioamnionite (infection ascendante). Comme pour les autres compartiments physiologiques, peu de choses sont connues sur les mécanismes de passage du virus dans l’utérus. On ne sait pas avec certitude si le virus libre infecte plus particulièrement certaines cellules, ou si un contact de cellule à cellule est nécessaire, bien que du virus ait été détecté in situ dans les cellules syncytiotrophoblastiques du placenta, dans les cellules de Hofbauer et dans les macrophages placentaires (144-148), mais d’autres études ont présenté des résultats contradictoires (149, 150). Vraisemblablement, l’identification cellulaire représente une étape cruciale et des contaminations par des cellules maternelles infectées ont pu biaiser les études mettant en évidence des cellules trophoblastiques infectées (150). De plus, les trophoblastes n’expriment pas de récepteur CD4 (151-153), ni les corécepteurs CCR5, CXCR4, CCR3, CR2b et Bonzo lorsqu’on approche du terme de la grossesse (154), au moment auquel se font les transmissions materno-fœtales. Il semble donc que la transmission pourrait préférentiellement se dérouler selon un principe indépendant des CD4 comme la transcytose, après fixation à un récepteur Fc d’un complexe immun, par exemple. La présence de tels récepteurs sur les trophoblastes a été documentée (155), et la transcytose de virus cellulaire, mais pas de virus libre, au-travers d’une barrière trophoblastique a été démontrée in vitro. Le virus pourrait alors se propager vers les cellules du stroma, comme les cellules de Hofbauer, des macrophages placentaires qui expriment les récepteurs CD14 et CD4, mais pas CCR5 ou CXCR4 (156-158). Par ailleurs, il a été démontré que les lésions placentaires ne constituent pas un facteur indépendant significativement associé à la transmission materno-fœtale (159). De même, la chorioamnionite, une inflammation des membranes extraplacentaires, du chorion et du cordon ombilical, est plus fréquente chez les femmes infectées par le VIH (43% versus 20% au sein d’un groupe de femmes non infectées par le VIH), mais aucune association formelle avec la TME du VIH n’a été mise en évidence (160). Cependant, l’incapacité du placenta à préserver l’intégrité totale du fœtus et la démonstration de passage de cellules entre la mère et le fœtus a été faite à plusieurs reprises

69 70 (148). Il est donc possible que des cellules infectées par le VIH profitent de lésions dans la couche syncytiotrophoblastique pour gagner le fœtus (159).

7.1.4. Transmission de souches SI versus NSI :

Une sélection négative semble avoir lieu au niveau du placenta qui permet à certains variants de franchir la membrane placentaire et d’infecter le fœtus (162). Plus vraisemblablement, il s’agit de variants à tropisme macrophagique R5 – souches NSI qui utilisent le corécepteur CCR-5 – qui seraient capables de traverser la membrane et d’infecter le fœtus (163-167), bien que trois études italiennes aient montré la transmission d’un phénotype SI (ou X4, c’est-à-dire utilisant le co-récepteur CXCR4 favorisant le tropisme lymphocytaire), qui fut associée avec une évolution plus rapide de la maladie de l’enfant (8, 168-169). Mais, dans ces études bien souvent, aucune distinction en fonction du « timing » de la transmission n’a été réalisée (pas de distinction entre transmission in utero, peri-partum et post-partum). Dans un travail qui tenait compte du timing de la transmission, Tscherning- Casper et son équipe ont proposé l’hypothèse d’une transmission préférentielle via des lésions placentaires. Selon eux, il n’y aurait pas de sélection de virus au niveau du placenta. Cette sélection s’opérerait plutôt chez le fœtus où il semble que seuls des virus R5 se multiplient dans un premier temps, bien que des virus X4 soient probablement présents sous forme de populations minoritaires (170).

7.1.5. Passage de variants mineurs ?

Pour certains, il semble que ce soit un variant « mineur » parmi le pool de variants maternels, qui soit capable d’infecter et/ou de se multiplier dans le fœtus (116-118, 165) comme démontré dans plusieurs études sur des effectifs très réduits (dix couples mères- enfants au total). Par ailleurs, plusieurs études ont présenté des résultats contradictoires, où des variants multiples ont été transmis, mais à nouveau, ces études portaient sur des effectifs réduits, de quatre couples mère-enfant pour deux d’entre elles, d’une mère et deux de ses enfants infectés, de trois couples mère-enfant (171-173). Seule une étude thaïlandaise a porté sur des effectifs plus importants, à savoir 17 couples mère-enfant et cette étude a mis en évidence la transmission de variants mineurs, comme de variants multiples (174).

71 Figure 7 : Présentation des variations histologiques du cervix, potentiellement impliquées dans une différentiation de l’infectiosité du VIH :

Zone de jonction et de transformation du cervix (transition entre un épithélium pavimenteux stratifié en épithélium simple)

L’exocervix ou ectocervix (ex), est recouvert par une extension vaginale de l’épithélium pavimenteux stratifié. Oscj (original squamocolumnar junction) représente la transition entre cet épithélium et un epithelium monocouche de l’endocervix (en) extrêmement fin.

Des cryptes invaginées abritent des cellules secrétrices de mucines (tubular-branching glands tbg) à production maximale juste avant ovulation. Le stroma du cervix est composé de tissu collagène et de nombreux lymphocytes CD8+ et CD4+ et de cellules inflammatoires. Des hormones et d’autres facteurs altèrent la forme et le volume du cervix ce qui peut faire s’étendre la zone épithéliale mono cellulaire à l’exocervix pour former ce qu’on appelle l’ectropion (ect). Ce phénomène se déroule notamment durant la grossesse, après l’accouchement pour les femmes au terme d’une première grossesse avec une zone de transformation cervicale particulièrement immature qui peut persister de longues périodes. L’ectopie est associée au risque de transmission du VIH. [immature metaplasia (im), cervical transformation zone (ctz), new squamocolumnar junction (nscj), mucous (Nabothian) cysts (nc)]

Des phénomènes d’inflammation peuvent avoir lieu dans des zones érodées de l’épithélium submuqueux [shallow ulcerations (su)] provoquant une cervicite. Par exemple, l’infection herpétique est associée à de profonds ulcères [herpetic epithelial ulcers (huc)] avec infiltrations lymphocytaires. Les infections Chlamydia trachomatis génèrent des lymphoid germinal centers (lgc) et érodent la membrane basale exposant les mononucléaires inflammatoires à la lumière vaginale. [epithelial erosions (er), chlamydial inclusions (ci), microabscesses (ma)]

D’après Jacobson DL, Peralta L, Farmer M, Graham NM, Wright TC, Zenilman J. Cervical ectopy and the transformation zone measured by computerized planimetry in adolescents. Int J Gynaecol Obstet 1999, 66:7-17.

72 7.1.6. Génotype et transmission in utero :

Récemment, les prémisses d’une étude plus large qui vise à déterminer l’influence du génotype sur la transmission in utero ont été présentés. Cette étude a été réalisée au Brésil où co-circulent les sous-types B et F auprès de 108 femmes. Le sous-type a été déterminé par HMA, aucune différence de transmission n’a été identifiée (175). D’autre part, Tscherning-Casper et al ont montré que l’usage du corécepteur CXCR4 détermine le phénotype biologique (slow/low, NSI ou rapid/high SI) pour tous les sous-types, mais que l’usage du CXCR4 était rare pour les sous-types C. De plus, le tropisme pour les deux corécepteurs CXCR4 et CCR5 était rare pour les sous-types D. Ceci laisse penser qu’il peut exister des différences de virulence, de tropisme tissulaire et de transmissibilité entre variants de sous-types différents (176). Il semblerait également qu’un motif particulier de la p17 (valine en position 107) soit corrélé avec la non transmission du virus (12 couples mère- enfant, p=0,014), mais ces données n’ont jamais été corroborées (177).

7.2. Transmission intra-partum :

7.2.1. Timing de la transmission intra-partum :

La transmission intra-partum a lieu durant l’accouchement. Pratiquement, il est difficile de définir avec certitude ce type de transmission (178, 179). Une des études qui a permis de confirmer l’importance de la transmission intra-partum a porté sur des jumeaux dont le premier né avait deux fois plus de risque d’être infecté que le second. En effet, au moment de l’accouchement, ce dernier passe moins de temps dans la filière génitale de sa mère et est donc moins exposé au virus présent dans les sécrétions cervico-vaginales de celle- ci (180). Des études plus récentes ont démontré qu’un accouchement par césarienne programmée réduisait le risque de la transmission, vraisemblablement en évitant au nouveau- né d’être exposé aux SCV maternelles où le virus peut être présent (4, 181, 182). D’autre part, une rupture prolongée des membranes (>4 heures) est un facteur de risque de la transmission peri-partum (183). Le virus provient majoritairement de la zone cervicale et vraisemblablement, également des zones supérieures du tractus génital (184). Ces zones sont sujettes à des changements histologiques importants tout au long de la vie d’une femme, fonction des modulations hormonales, des facteurs exogènes physiques et infectieux (185) (figure 7). L’ectopie cervicale a été associée à un risque accru de transmission hétérosexuelle (186), et l’inflammation cervicale à un risque accru de présence virale (187, 188).

73 74 Tous les facteurs qui influencent la présence virale dans le tractus génital ont un impact sur ce moment de la transmission (figure 7).

7.2.2. Immunologie du tractus génital féminin associée au VIH :

D’un point de vue immunologique, les anticorps des sous-classes IgG1 et IgG3 prédominent dans les sécrétions cervicales (189), au détriment des IgA (190, 191). Les sous- classes IgG1 et IgG3 sont associées avec une activité de cytotoxicité cellulaire anticorps- dépendante et une fonction d’activation du complément. Ces activités semblent dépendantes de la charge virale SCV elle-même (192). Cependant, deux études de cohortes de prostituées ont montré que des IgA spécifiques du VIH pouvaient conférer une protection contre l’infection VIH. In vitro, ces IgA spécifiques du VIH-1 sont capable de bloquer la transcytose à travers une monocouche de cellules épithéliales (193, 194). De même, des IgA capables d’inhiber l’interaction entre gp120 et CD4 soluble ont été détectées dans le sérum et la salive de patients infectés par le VIH (195). Par ailleurs, des cellules B et des monocytes ont été isolés à partir d’échantillons de l’endocervix (196), de même que des cellules T CD4+ et CD8+ avec une prépondérance des CD8+ présentant une activité cytotoxique spécifique anti- VIH (197, 198). Cette activité cytotoxique spécifique anti-VIH présente dans les SCV serait responsable d’une protection de certaines prostituées au Kenya contre l’infection VIH (199). Il est vraisemblable que ces facteurs puissent également jouer un rôle contre l’infection du nouveau-né au moment de l’accouchement. Plusieurs études ont mis en évidence l’existence de facteurs naturels immuns non spécifiques contre l’infection VIH via le tractus génital féminin ; il s’agit de la chimiokine RANTES et de la cytokine IFNγ de type 1 (200), des intégrines (201), des défensines (202), des protégrines (203) et des « secretory leukocytes protease inhibitor » (SLPI) (204) qui ont tous été relativement peu étudiés dans les SCV, de même que certaines propriétés physiques telles que le pH acide, des lactobacilles producteurs de peroxyde d’hydrogène et d’acide lactique, la production de mucus et une muqueuse épithéliale stratifiée (205), facteurs qui pourraient tous avoir une influence sur la TME peri-partum.

7.2.3. Insertions et délétions ?

Une étude réalisée par Overbaugh et al avait montré que des variants présents dans les sécrétions vaginales et les PBMC de 2 femmes chroniquement infectées étaient divergents et que les différences génétiques majeures entre variants au sein d'un même individu étaient des insertions résultant de la duplication de régions adjacentes, entraînant ainsi l'apparition de

75 76 nouveaux sites de glycosylation (notamment dans les boucles V1 et V2). La comparaison des variants dans les deux compartiments montrait que les compartiments systémiques et vaginaux contenaient des populations virales distinctes mais possédant des variants communs. Chez l'une de ces patientes, les différents variants présents dans les sécrétions génitales étaient proches d'un des variants détectés dans les PBMC. D'autre part, tous les génotypes des variants détectés dans les sécrétions vaginales ainsi que les génotypes des variants majoritaires dans les PBMC étaient compatibles avec le phénotype macrophage-tropique (119).

7.3. Transmission post-partum :

Dans les pays industrialisés, depuis 1985, l’allaitement est déconseillé aux femmes séropositives pour le VIH (206). Dans les pays en développement, il est difficile de conseiller aux mères séropositives de ne pas pratiquer l’allaitement, essentiellement parce que le colostrum et le lait maternel protègent le nouveau-né contre la plupart des maladies infantiles (207), mais aussi à cause du coût des aliments de substitution et de la stigmatisation générée par l’allaitement artificiel (208). Par ailleurs, la transmission postnatale précoce est importante et 1/5 des enfants non infectés à la naissance pourrait être infecté dans les six premiers mois de vie s’ils sont allaités par une femme infectée par le VIH (209). Cependant, la transmission par l’allaitement maternel peut survenir pendant toute la durée de l’allaitement et la transmission postnatale tardive doit être prise en compte dans l’élaboration des interventions de PTME (210, 211). Une méta-analyse menée par le groupe de Gand incluant huit études de cohortes a estimé que le risque de transmission postnatal tardif (après 2,5 mois de vie) était de 3,5 cas par an pour cent enfants allaités par une mère infectée pour le VIH (212). Il est plus élevé en cas de séroconversion pendant l’allaitement (213), en cas d’immunodéficience maternelle (CD4 bas et charge virale élevée), en cas de mastite, même subclinique, d’abcès ou de crevasses (15, 213) (cfr infra).

7.3.1. Histologie de la glande mammaire :

Le sein comporte quatre types de tissus : glandulaire, adipeux, vasculaire, et tissu de soutien fibreux. Le tissu glandulaire est composé de 10 à 20 lobes, eux-même composés de lobules bordés de cellules épithéliales sécrétoires responsables de la sécrétion lactée. Les acini sont entourés de cellules myoépithéliales, qui se contractent pour éjecter le lait dans les canaux lactifères, jusqu'au mamelon. Mamelon et aréole sont situés dans une région riche en

77 Figure 8 : coupes histologiques des tissus mammaires :

Acinus mammaire avec cellules épithéliales à activité sécrétrice apocrine ; des extrusions cytoplasmiques sont observables vers la lumière. Une couche de cellules myoépithéliales dont certaines sont vacuolées est visible.

Coloration des cellules myoépithéliales autour de l’acinus mammaire. Ces cellules sont contractiles et très sensibles à l’ocytocine.

From : http://www.medlib.med.utah.edu/

78 muscles annulaires, dont la contraction provoquera l'érection du mamelon et l'éjection du lait hors des sinus lactifères (figure 8).

7.3.2. Variabilité virale et transmission par l’allaitement :

Concernant la variabilité virale et la transmission par l’allaitement sensu stricto, très peu d’études ont été réalisées. Une étude qui portait sur trois couples mère-enfant, dont les mères avaient séroconverti durant la période post-partum a cependant démontré que les variants présents chez les enfants étaient des variants mineurs dont la diversité génétique s’accroissait au cours du temps, dans les gènes des protéines env (boucle V3) et gag (p17) (215). Mais le même groupe, après une étude élargie à un effectif plus important, a mis en évidence un couple mère-enfant dont la population virale était hétérogène (1,4 à 2,8% pour la boucle V3 et 1,0 à 1,9% pour la P17) (216). Une étude récente réalisée par Pierre Becquart et ses collaborateurs a comparé la diversité des séquences de l’enveloppe VIH dans le sang et le lait de trois femmes infectées. Deux d’entre elles avaient dans leur lait un variant majeur qui était peu présent dans le sang. Deux femmes exprimaient, parmi les variants libres du lait maternel, un virus qui n’était pas retrouvé du tout dans le sang. De même, les variants libres (ARN) du colostrum des trois mères étaient différents des variants ADN proviraux. Ceci démontre que les pressions exercées à l’intérieur du compartiment de la glande mammaire sont différentes de celles exercées dans le sang, vraisemblablement à cause d’une différence immunitaire locale, notamment dans la production d’Ac (124).

7.3. 3. Virus libres ou formes provirales :

Par ailleurs, il a été estimé par PCR, que 0,1 à 30% des cellules du lait étaient infectées par le VIH (217). Il a également été démontré in vitro que ce serait plus vraisemblablement les formes virales cellulaires qui seraient responsables de la transmission par l’allaitement. Cependant, plusieurs études ont montré que les formes virales libres sont associées avec la TME (121, 218, 219). Il semble donc vraisemblable qu’à l’intérieur même des glandes mammaires, une activation des cellules porteuses du virus aient lieu. Il a été évalué que, globalement, les macrophages sont les cellules les plus infectées parmi le pool de cellules présentes dans le lait maternel. Dans le colostrum et le premier lait se trouvent 0,1 à 1% de macrophages et de cellules T capables de produire du virus en culture in vitro. Cependant, lorsque ces cellules sont mélangées à de la salive, elles éclatent (220), vraisemblablement à cause des propriétés d’hypotonicité de la salive (221).

79 80 L’origine même du VIH dans les glandes mammaires est sujette à différentes hypothèses. Du virus libre peut provenir du compartiment systémique, surtout en cas d’inflammation de la glande mammaire (cfr infra). Cette hypothèse a été proposée en raison de l’infectiosité accrue du lait maternel en période de primo-infection maternelle (217). Cependant, le polytropisme du VIH est compatible avec une production virale par des cellules non lymphoïdes, comme les cellules épithéliales de la glande mammaire. In vitro, les cellules ductales et alvéolaires de l’épithélium mammaire humain peuvent être infectées et produire du VIH-1 (220). Ce phénomène est modulé par l’action de certaines hormones comme la tri- iodothyronine, le β-oestradiol et la prolactine. Certains variants auraient-ils un tropisme particulier pour ce type de cellules ? Quoi qu’il en soit, il apparaît que certains variants libres ou cellulaires ont la propriété de franchir les membranes mammaires, de pénétrer les canaux galactophores et d’être transmis à l’enfant.

7.3.4. Immunologie du compartiment mammaire associée au VIH et à la TME : Contrairement à ce qui se passe chez l’animal (222), les Ac maternels provenant du lait ne pénètrent pas la circulation sanguine du nouveau-né chez les humains (223). L’effet protecteur du lait provient essentiellement des IgA sécrétoires générées par l’environnement pathogène de la mère, et qui servent de premières défenses des muqueuses de l’enfant comme de l’animal (223, 224). Dès lors, deux axes majeurs peuvent être déterminés dans le transfert de cette immunité spécifique: l’axe entéro-mammaire (à partir du GALT) et l’axe broncho-mammaire (ou respiratoire) (à partir du MALT) (225). Les cellules M y jouent un rôle important dans l’induction de l’immunité spécifique à partir des sites muqueux effecteurs (226). Elles représentent environ 2% des cellules épithéliales des plaques de Peyer et sont présentes également dans le tissu lymphoïde nasal et les amygdales (225). Elles induisent une réponse spécifique via l’un et/ou l’autre des deux axes majeurs par la « présentation » des bactéries, virus ou vaccins aux cellules T et B. Ces dernières produisent des IgA dimériques et des IgM pentamériques qui migrent et se fixent (« homing ») vers les surfaces basolatérales des cellules épithéliales de la glande mammaire pour s’y lier à des récepteurs polymériques (pIgR), grâce à la présence de chaîne « J » (226, 227). Un transport actif des Ig liées au pIgR via des endosomes a lieu jusqu’à la surface apicale. Le passage vers la lumière a lieu après le clivage du pIgR dont un résidu de 80 kDa forme un « composant sécrétoire » lié de manière covalente aux Ig qui les protége de la dégradation par des enzymes protéolytiques (228, 229). Les S IgA sont les immunoglobulines les plus présentes dans le lait maternel, suivies des S

81 82 IgM et IgG. La concentration en S IgA est plus importante dans le colostrum (12 mg/ml) que dans le lait mature (1 mg/ml) et un enfant allaité dans des conditions normales ingère 0,5 à 1 g/J de S IgA (223). Leur rôle majeur est de réaliser l’exclusion immune. Cependant, dans une étude réalisée au Rwanda auprès de 208 mères infectées par le VIH, Van de Perre et al ont démontré que les S IgA spécifiques du VIH n’étaient pas prédominantes dans le lait maternel. Les IgG anti-VIH probablement originaires du compartiment systémique de même que des IgM sécrétoires (S IgM) étaient les plus présentes (217). Néanmoins, la transmission la plus importante fut corrélée d’une part à la présence virale et d’autre part, à la déficience en S IgA spécifiques du VIH. A l’opposé, l’absence d’infection était associée à la persistance d’une réponse de type S IgM spécifique du VIH-1. Mais, dans le contexte de l’infection par le VIH et de la TME, le paradoxe est que le transfert de l’immunité protectrice est également une voie d’infection du virus (217).

7.4. Portes d’entrée chez le nouveau-né :

Concernant le passage du virus au travers des muqueuses du nouveau-né – que ce soit durant l’accouchement lors de l’ingestion de matières génitales maternelles ou lors de l’allaitement (tableau 3) – au vu des données disponibles aujourd’hui, plusieurs hypothèses se posent. Il semble même possible que plusieurs mécanismes existent en fonction du site anatomique considéré. Trois sites peuvent être potentiellement des voies d’entrée virales : les voies respiratoires supérieures (muqueuses bucco-gingivales) et les amygdales, les bronches et le tube digestif. Les cellules épithéliales de la muqueuse orale ne possèdent pas de récepteur Fc et ne peuvent donc pas procéder à un mécanisme de transcytose de complexes immuns. Cependant, sous la couche épithéliale se trouvent des cellules de Langerhans en faible quantité, des lymphocytes T, des monocytes et macrophages en nombre plus important. La transmission du virus via des brèches pourrait dès lors être possible. Cependant, il semble plus plausible que la transmission se fasse majoritairement via le tractus digestif, surtout chez le nouveau-né dont l’acidité gastrique est peu développée juste après la naissance (achlohydrie). Une autre hypothèse propose que ce soient les cellules de Langerhans (cellules dendritiques du CMH de classe II, CD4+) ou même les macrophages de la lamina propria qui pourraient être les premières cellules à être infectées comme cela fut observé chez le macaque rhésus sur des cellules similaires (230, 231). De l’ADN proviral et de l’ARN ont été détectés dans le compartiment épidermique de la peau d’individus infectés, mais à des charges virales

83 Figure 9 : muqueuse digestive et rôle des cellules M :

Figure 10 : Représentation de l’adhésion du VIH à DC-SIGN :

Steinman RM, 2000 Cell;100 :491-4.

84 relativement faibles (232, 233). Pourtant, il faut que le virus franchisse les cellules épithéliales sus-jacentes auparavant, et, normalement, les virions VIH ne s’attachent pas à la membrane basale des entérocytes humains. Pourtant, Morgane Bomsel et son équipe ont montré qu’une monocouche épithéliale humaine intestinale peut être infectée par une cellule infectée par le VIH polarisée, et traversée par des virions par un processus de transcytose, du pôle apical de la cellule épithéliale (lumière intestinale) vers le pôle basolatéral (cellules sous-jacentes de la muqueuse) (234). Ce transport actif se fait via des vésicules transcellulaires endosomales (235), sans qu’il y ait d’infection de l’épithélium (230, 236). Mais, ceci pourrait également avoir lieu via les entérocytes ou d’autres cellules comme les cellules M par l’usage de récepteurs galactosyl céramide et 3’ sulfogalactosyl céramide (237) (figure 9). Cette hypothèse a été renforcée par une étude ayant mis en évidence le fait que les cellules épithéliales intestinales, porteuses de récepteurs galactosyl céramides transfèrent des virus R5 (à tropisme vers les macrophages) et non les virus X4 (à tropisme lymphocytaire) vers des cellules CCR5+ qui peuvent activement multiplier le virus (236). De plus, les cellules dendritiques paraissent transmettre sélectivement des virus R5 à des lymphocytes autologues in vitro (238). Ce passage du virus vers les cellules sous-jacentes de la muqueuse intestinale pourrait également se faire par l’usage des récepteurs de lectines de type C des cellules dendritiques (de Langerhans) (239). Ces cellules expriment le DC-SIGN (CD209) et le récepteur de mannose (CD206) qui capturent le virion et facilitent son entrée dans la cellule (figure 10). D’autre part, Alfsen et al (240) ont également montré que la transcytose du VIH au- travers de l’épithélium pouvait être inhibée par la présence de S IgA et S IgM. Cette inhibition pouvait être levée par l’ajout d’une molécule anti-composant sécrétoire (240), ce qui fait supposer que ce composant joue un rôle important dans la protection contre la TME. De même, parmi les Ac, ceux qui possédaient le motif ELDKWA (épitope de Kattinger) de l’ectodomaine de la gp41 étaient les plus efficient dans la neutralisation (241). Cet épitope est responsable de la reconnaissance des récepteurs galactosyl céramide des cellules épithéliales. Cependant, l’Ac monoclonal 2F5 d’isotype d’IgG qui reconnaît cet épitope ne peut inhiber la transcytose (242). Par ailleurs, le tropisme de la souche virale (R5 versus X4) n’apparaît pas lié à l’efficacité de la transcytose (243).

86 8. Impact de la charge virale sur la TME dans le contexte d’un traitement court à l’AZT (Zidovudine) :

La zidovudine est un analogue de thymidine (3’azido-2’3’-didésoxythymidine) qui, après phosphorylation cellulaire en métabolite zidovudine triphosphaté, inhibe la transcriptase inverse spécifique du VIH et empêche la polymérisation de l’ADN proviral (244).

8.1. Dynamique de la réplication virale lors d’une monothérapie :

La dynamique de réplication virale a été décrite dans différents contextes (245, 246) et il apparaît que dans le contexte d’un traitement à la ZDV, comme pour d’autres monothérapie vraisemblablement, la réduction de la charge virale chez un patient naïf pour les ARVs est brève étant donné le turnover important des cellules infectées par le VIH (tous les 1 à 2 jours) et du virus libre (toutes les 6 heures approximativement) (245, 246). Lors d’une monothérapie prolongée, des virus résistants se multiplient, générant une augmentation importante de la charge virale, parfois à des niveaux similaires à ceux observés avant traitement. Ce problème fait que, très tôt, les monothérapies ont été inadaptées pour le traitement à long terme, mais estimées adéquates pour la prévention de la transmission sur de courtes périodes, comme pour la PTME. Bien qu’elle ait fait ses preuves dans ce contexte (19), lors d’un traitement d’environ 4 semaines avant accouchement, la ZDV donnée uniquement intrapartum ne protège pas le nouveau-né de l’infection (18). La demi-vie de la ZDV a été évaluée à 4,7 jours, 1,3 et 0,9 jours dans le plasma, le cervix et le vagin respectivement (p<0,001) (247). Chez les adultes, lors de traitement HAART, un rebond de la CVpl à des niveaux similaires à ceux qui existaient au moment de la mise sous traitement peut être observé lors de l’arrêt du traitement (248). Par ailleurs, l’efficacité de la ZDV à prévenir la transmission postnatale du VIH-1 est étroitement liée à l’état d’immunodéficience de la mère. En effet, dans une méta-analyse de 2 essais cliniques de l’évaluation de l’efficacité de la ZDV, Leroy et al (249) ont démontré que le taux de TME chez les femmes dont les CD4+ étaient <500 cellules/ml était de 22% alors qu’il était de 2% pour les femmes pour lesquelles le nombre de CD4+ était > 500 cellules/ml (249). D’autre part, il est important de souligner le fait qu’aucune étude sur l’évolution des charges virales dans le temps n’a pris en compte le sous-type viral (247).

87 88 8.2. Impact de la charge virale dans le sang sur la TME :

Les déterminations quantitatives de la charge virale ont montré que des taux élevés présentent une corrélation avec un risque accru de progression clinique vers la maladie, tandis qu'une réduction des taux plasmatiques est associée à une diminution du risque de progression clinique (250). D’autre part, l’on sait qu’une haute CVpl de la mère influence défavorablement l’évolution de la maladie chez l’enfant jusqu’à six mois (251). Fang et ses collaborateurs avaient les premiers démontré une association entre la CVpl et le risque de TME en analysant 30 femmes, dont 20 n’avaient pas transmis le virus avec des CVpl détectables. Un modèle statistique a permis de définir un seuil de 100.000 c/ml en-deçà duquel la probabilité d’avoir une TME est très faible (3%) (1). Plusieurs études ont également montré que le taux de TME était inversement corrélé à la charge virale maternelle au moment de l’accouchement ; cependant, il n’a pas été formellement démontré de valeur seuil en- dessous de laquelle le risque de TME est nul (3). Une autre étude importante menée par Mofenson et al (252) auprès de 480 mères et leur enfant traités par l’AZT selon le protocole ACTG 076 (cfr annexe 2 liste des essais cliniques de PTME) a montré que le seul facteur prédictif de la TME en analyse multivariée était la charge virale plasmatique avec un risque accru de 3,4 à chaque augmentation de 1 log10 de la charge virale libre à l’accouchement. Mais, aucune transmission n’a été reportée dans cette étude pour des femmes ayant une charge virale indétectable (seuil à 500 c/ml) à la naissance de l’enfant (252). Dans une méta-analyse réalisée par Ioannidis et al (253), le taux de TME a été évalué <1% pour les femmes ayant une CVpl <1000 c/ml au moment de l’accouchement (253). Pratiquement, il semble difficile de déterminer une valeur fixe au-delà de laquelle la TME serait systématique, et vice versa, en raison de la multitude de facteurs qui interviennent dans la TME (tableau 1). Notre travail a eu pour objectif de déterminer l’impact de la CVpl en virus libres sur la TME dans un contexte où l’allaitement peut difficilement être évité, et où une prophylaxie courte de ZDV a été administrée aux mères pour éviter la TME.

8.3. Impact de la charge virale dans les sécrétions cervico-vaginales (SCV) sur la TME :

Le VIH-1 a été isolé dès 1986 dans les SCV de femmes séropositives (254, 255) et détecté aussi bien sous forme d'ADN proviral cellulaire que sous forme libre (4, 256).

89 Tableau 4 : Facteurs microbiologiques et immunologiques significativement corrélés (p<0,05) avec la présence du VIH dans le tractus génital féminin :

Corrélation Type de recherche VIH Population étudiée Vaginose bactérienne ARN USA Herpès Simplex 2 ARN Afrique Centrale Human Papillomavirus Virus libre et ARN cellulaire Italie Chlamydia trachomatis ARN Côte d’Ivoire Ecouvillons ARN et ADN Kenya Multiples Afrique Neisseria gonorrheae ARN Côte d’Ivoire Ecouvillon ADN Kenya Ecouvillon ADN et ARN Kenya Multiple Multiple Candida vulvovaginitis ADN Kenya Ecouvillon ARN et ADN Kenya Ulcères et/ou inflammation Virus libre et ARN cellulaire de lavage USA non spécifiés cervicovaginaux ARN de lavages cervicovaginaux USA ADN et ARN de biopsie vaginale Thaïlande Ecoulement vaginal ADN Kenya Cytokines (IL6, TNF-α) ARN USA (IL1β, IL4, IL6, TGF-β, ARN USA IL8, IL10) Marqueurs solubles de ARN USA l’activation (sCD25, sCD14) Chimiokines (MIP1α, ARN USA MIP1β, RANTES) Cellules CD4+ dans les ARN USA/Thaïlande tissus génitaux Nombre de CD4+ ARN USA d’après “HIV type-1 infection in the genital tract Coombs et al .” (205)

90 Une étude longitudinale sur deux cycles menstruels a démontré que l’ARN viral génital pouvait être détecté dans 29% des échantillons de manière continue, 58% de manière intermittente, et 13% dans aucun des échantillons (184).

8.3.1. Modulations physiologiques du tractus génital associées à une susceptibilité infectieuse :

Plusieurs études ayant pour but d’identifier les déterminants de la présence virale dans les SCV ont été réalisées, souvent sur de faibles effectifs ou sur des cohortes africaines (où de nombreux variants VIH circulent). Parmi ces déterminants, le nombre de CD4/mm3 de sang, la charge virale plasmatique, la présence de mucus cervical et d’inflammations, l’usage d’hormones contraceptives, la grossesse, la déficience en vitamine A et la coinfection avec d’autres IST ont été incriminées (257-263).

8.3.2. Corrélation de la CV plasmatique avec la CV des sécrétions cervicovaginales :

La charge virale plasmatique est peu prédictive de la charge virale dans les SCV et dans le liquide séminal (184, 258-272), et plusieurs études n’ont pas mis en évidence de corrélation entre ces deux compartiments (259-264), dont une étude très récente réalisées auprès de 38 femmes, au cours de laquelle, en éliminant les trois femmes qui avaient une CVpl très élevée, la corrélation avec les CVscv disparaissait. Les auteurs de cette étude préconisent donc une analyse individuelle de la CVscv pour évaluer le risque de TME (262). Dans une de ces études sur un effectif important réalisée aux Etats-Unis, Kovacs et al ont mis en évidence un fait important qui confirme l’existence d’une compartimentalisation de la réplication virale dans certains contextes (263). En effet, parmi 247 femmes enrôlées dans l’étude, 111 (36%) avaient une charge virale plasmatique indétectable. Cependant, parmi celles-ci, 24% (27 femmes) avaient une charge virale détectable dans les SCV au sein desquelles 74% (20 femmes) avaient reçu une trithérapie. Ceci suggère le fait qu’il pourrait exister un problème de diffusion tissulaire de certains antirétroviraux ce qui pourrait favoriser la réplication virale dans le tractus génital (263, 272), comme dans d’autres compartiments. L’un des objectifs de notre travail est de déterminer l’influence de la charge virale dans les SCV sur la TME.

8.3.3. Facteurs associés à la présence du VIH dans les SCV :

Le tableau 4 reprend de manière synthétique, les facteurs microbiologiques et immunologiques associés de manière significative à la présence virale dans le tractus génital

91 92 féminin, en plus des facteurs déjà cités (205). Il est vraisemblable que les co-infections génitales augmentent la charge virale VIH par le recrutement d’un nombre important de cellules cibles immunitaires au site de l’infection (205, 273 + figure 6). D’autre part, contrairement à la diminution de la charge virale VIH observée après traitement des co- pathogènes, le traitement d’ulcérations génitales active des cytokines inflammatoires qui peuvent transitoirement augmenter les charges virales VIH (274).

8.4. Impact de la charge virale dans le lait maternel sur la TME :

8.4.1. Compartimentalisation de la CV :

Une des premières études réalisées sur les CVlm a été menée à Nairobi et publiée en 1998, et a montré qu’une charge virale libre détectable était mesurable dans environ la moitié des échantillons de lait maternel de mères infectées (75 femmes) par le VIH-1, par une technique de PCR quantitative ARN (5). Les charges virales mesurées dans le lait étaient cependant nettement inférieures aux charges virales plasmatiques. Le portage VIH (« shedding ») était plus important dans le lait « mature » (47%) que dans le lait de transition et le colostrum (27%). Cette étude avait montré qu’il existe une compartimentalisation du virus VIH dans les différents compartiments physiologiques (plasma, cellules du sang, lait maternel, sécrétions cervicovaginales…etc.). Il est vraisemblable que seuls quelques variants présents dans le pool de variants de la mère ont la propriété de parvenir dans les glandes mammaires et de s’y multiplier (124), par sélection virale par transmission sélective au- travers de la barrière mammaire ou par amplification sélective (276). De même, cette étude a évalué à plus de 630000 copies d’ARN VIH par jour, l’exposition du nouveau-né jusqu’à l’âge de 4 mois (consommation de 700 ml de lait/J) (5), Semba et al ont, eux, évalué l’ingestion quotidienne à 322000 particules/J (214), tandis que Nduati et al l’ont évaluée à 25000 cellules infectées/J (276). L’ingestion quotidienne de lait maternel du nouveau-né le confronte donc à un risque équivalent à celui d’un rapport sexuel non protégé avec une personne infectée (277). Plus récemment, d’autres équipes ont confirmé l’importance de la CV libre et de la charge provirale dans la TME. Mais, ces études furent réalisées sans faire de distinction entre la transmission postnatale, peri-partum et in utero, bien qu’elles aient été réalisées sur des effectifs plus importants (218, 219), ce qui hypothèque le rôle réel joué par la CVlm sur la transmission postnatale. Cependant, Willumsen et al ont travaillé en tenant compte du timing de la transmission, mais sur un effectif très faible (8 transmission post-

94 partum) et n’ont pu mettre en évidence qu’une tendance démontrant l’importance de la CVlm libre sur la transmission postnatale (121). Il est important de noter que l’analyse des CVlm de la cohorte suivie au Malawi, réalisée sur un effectif plus important (275 femmes) a mis en évidence une CVlm ARN plus importante dans le colostrum/lait de transition que dans le lait « mature », prélevé 14 jours après l’accouchement. Ces résultats furent confirmés par une autre étude réalisée en Afrique du Sud (278). Par ailleurs, le risque de TME a été évalué comme deux fois plus important pour chaque augmentation de 1log10 de la CVlm libre (p=0,001) (277).

8.4.2. Déterminants d’une charge virale élevée dans le lait maternel :

Il y a plusieurs années, un cas surprenant de transmission postnatale par l’allaitement maternel avait été décrit chez un enfant rwandais, associé à la survenue d’un abcès mammaire chez sa mère (15). Richard Semba et ses collègues ont étudié l’impact des mastites subcliniques sur la transmission du VIH-1 par l’allaitement maternel (214). Dans cette étude réalisée au Malawi, la CVlm dans le lait prélevé 6 semaines après l’accouchement était associée à la TME. Environ 16% des femmes allaitantes infectées par le VIH-1 avaient une concentration élevée de sodium dans le lait maternel, ce qui suggère une mastite qu'elle soit clinique ou subclinique. Une charge virale libre VIH-1 était détectable chez 75 % de ces femmes porteuses de mastite pour seulement 33% chez les femmes non porteuses de mastite. La mastite est un processus inflammatoire au cours duquel des brèches entre les cellules alvéolaires mammaires sont ouvertes, permettant aux cellules inflammatoires et au fluide extracellulaire de pénétrer dans le lait. Elle provoquerait une augmentation en IL1, IL6 et TNFα, de même qu’une augmentation en IgA systémique (278). Il semblerait, d’après une étude gambienne, que la concentration en IgA, en facteur C3 du complément, en lactoférine et en composant sécrétoire puisse avoir un rôle protecteur contre les mastites (279). Ceci pourrait expliquer le rôle protecteur contre la TME du VIH par l’allaitement qui a été démontré pour certains de ces composants. Ce phénomène inflammatoire permet à des variants libres ou à des cellules telles que des lymphocytes infectés par le VIH de pénétrer dans le lait maternel, d’augmenter la charge virale libre et dès lors, le risque de transmission du virus de la mère à son enfant (214, 280-284). En dehors de ce déterminant avéré de la CVlm et de la TME par l’allaitement, d’autres déterminants biologiques ont été associés à une CV élevée dans le lait maternel, essentiellement la CVpl, un faible taux de cellules CD4+ et la détection d’ARN VIH dans les SCV (277).

95 Tableau 5 : Vitamine A et immunité contre les maladies infectieuses :

Effets de la Vitamine A sur l’immunité Maladie Réponse immune Effet clinique de la Vit A Sujets humains Modèles animaux Rougeole Réponse primaire type Th2- ↓morbidité, mortalité ↑IgG contre ↓morbidité, ↑réponse like rougeole cytotoxique contre le virus NDV ↑Nombre de chez le poulet lymphocytes ↓réplication virale Diarrhées Réponse S IgA importante ; ↓morbidité, mortalité Inconnue ↓morbidité, ↑sIgA contre le réponse immune variable rotavirus chez la souris Maladies Motilité ciliaire ; ↓morbidité, mortalité de la pneumonie Inconnue ↓morbidité ↑sIgA contre le virus respiratoires macrophages alvéolaires associée à la rougeole, peu d’effets sur Influenza A chez la souris RSV et ALRI Malaria Réponses Ac et cellulaire, ↓morbidité Inconnue ↓morbidité pour P.berghei chez immunité protectrice mal les rats définie VIH/Sida Réponses en Ac et cellulaire ↓morbidité, mortalité ↑CD4+ et NK Inconnue Tuberculose Réponse primaire type Th1- Inconnue Inconnue ↓morbidité to M. bovis chez la like souris

96 Cependant, aucune étude n’a mesuré l’impact d’une prophylaxie à l’AZT sur la CV dans le lait maternel. Or, de même que cela est observé dans le traitement de l’adulte, il est possible que l’arrêt des prophylaxies, tel que pratiqué pour la PTME provoque un rebond de la charge virale dans le lait maternel (248). Un des objectifs de notre travail a été d’évaluer l’impact de la ZDV sur la CVlm.

9. Influence de la vitamine A sur la TME du VIH : 9.1. Rôle de la Vit A sur l’immunité :

Ces vingt dernières années ont vu la démonstration du rôle protecteur de la vitamine A contre un nombre important de maladies infectieuses. D’une manière générale, la supplémentation de Vit A chez des enfants en âge préscolaire diminue la mortalité d’environ un tiers dans les PVD (285). Elle pourrait avoir un rôle sur les fonctions et la production de nombreuses molécules telles que les kératines et les mucines, la lymphopoïèse, l’apoptose, les cytokines, les neutrophiles, les NK, les monocytes et les macrophages, les lymphocytes B et T et les Ig via des récepteurs nucléaires des acides rétinoïques au niveau du génome de même que via l’induction cellulaire de rétro-rétinoïdes (286). Ceci démontre que son action est complexe et que ses effets à l’encontre de différents agents pathogènes sont différentiels. Le tableau 5 reprend de manière synthétique les effets cliniques et immunologiques de la Vit A envers quelques maladies (287). Contre le virus de la rougeole, qui induit une réponse immunitaire de type Th2-like (production d’Ac par l’intermédiaire d’IL-4, IL-6 et IL-10) et la suppression d’un réponse de type cellulaire par l’inhibition d’IL-12, elle a un effet promoteur sur la production d’IgG et le nombre de cellules lymphocytaires comparé à un placebo (13). Dans un modèle souris utilisé pour mesurer son impact sur l’infection par les rotavirus, les souris déficientes en Vit A étaient plus susceptibles à l’infection et avaient de plus grandes pathologies des intestins par destruction des microvillosités (288). La Vit A a donc un rôle important dans la protection des muqueuses intestinales. De même, ces souris déficientes en Vit A avaient un taux sérique en Ac spécifiques des rotavirus plus faible que les souris non déficientes (289, 290).

9.2. Rôle de la Vit A sur l’infection par le VIH :

Lors de l’infection VIH, un bon nombre d’agents opportunistes provoquent microentéropathies, malabsorptions, stéatorrhées et même anorexie et un faible taux sérique de Vit A a été décrit à tous les stades de la maladie (291). Cependant, le taux et la prise de Vit

97 98 A sont associés avec une augmentation de la progression de la maladie, la mortalité et un plus haut taux de TME (292). Pourtant, une supplémentation périodique de Vit A semble diminuer la morbidité des enfants nés de mères séropositives pour le VIH (291), mais n’influence pas la CVpl (293). Une supplémentation en complexe vitaminé pendant la grossesse diminue la mortalité fœtale et le faible poids à la naissance de 40%, mais il n’y a pas d’effet similaire de la Vit A seule (294), bien qu’à forte dose, elle diminue la mortalité d’enfants infectés par le VIH qui présentent une importante affection respiratoire (295). Chez les enfants infectés par le VIH, il semble qu’elle ait pour effet d’augmenter le nombre de cellules CD4+ et NK un mois après supplémentation par une dose importante (296).

99 100

II. BUTS DE NOTRE TRAVAIL :

101 102 II. BUTS DE NOTRE TRAVAIL :

Peu de choses sont connues à l’heure actuelle sur les mécanismes de la TME. Deux grandes voies de recherche peuvent être appréhendées pour tenter d’obtenir des réponses à ce sujet : la recherche fondamentale qui se base sur des modèles cellulaires ou histologiques en travaillant sur un ou quelques virus. Mais, également, la recherche épidémiologique qui permet d’observer directement chez les individus, la réponse à la présence de certains facteurs, propres au virus, à l’hôte, ou à un facteur exogène apporté dans le contexte d’un essai clinique par exemple. Ces deux modes de recherche sont interdépendants et ce sont les synergies qui les relient qui permettent d’obtenir des réponses cohérentes aux problèmes qui nous sont posés. Dans ce travail, nous évaluerons certains déterminants de la TME, dans le contexte de l’essai DITRAME. Dans la première partie, en guise d’introduction à notre contribution personnelle, nous évaluerons les modalités et les résultats, à six mois et à dix-huit mois post-partum, de l’essai clinique DITRAME qui avait pour but de réduire la transmission du virus par un traitement par l’AZT, et dont la population des mères a constitué la majeure partie des effectifs étudiés dans le cadre de ce travail, excepté pour l’étude de la variabilité, et pour la validation de la technique de détection des co-infections et surinfections, pour laquelle il était nécessaire de travailler sur un groupe à haut risque. Dans la deuxième partie, nous étudierons l’influence des charges virales libres de différents compartiments physiologiques, à savoir le plasma, le lactosérum et les sécrétions cervico-vaginales sur la TME lors d’une prophylaxie par ZDV. Une attention particulière sera portée sur la transmission par l’allaitement pour laquelle il était nécessaire de mettre au point une technique spécifique étant donné les charges virales très basses, et de travailler sur des femmes ayant transmis le virus durant le postpartum, deux choses qui n’avaient jamais été réalisées auparavant. Une réflexion quant à l’usage des ARVs dans le contexte des pays en voie de développement, où souvent, l’allaitement est indispensable et/ou inévitable, sera proposée dans notre discussion. Un chapitre très succinct décrira ensuite notre étude sur le rôle de la vitamine A sur la TME dans le contexte ouest-africain. Dans la troisième partie, nous nous proposons d’évaluer l’impact de la variabilité du virus sur la TME tout en mettant en avant l’usage du HMA comme étant un outil adapté pour ce type d’étude.

103 Figure 11 : Plan des résultats présentés dans le cadre de notre travail :

DITRAME : Tolérance, acceptabilité et efficacité à 6 mois d’un traitement court de zidovudine pour réduire la transmission verticale du VIH chez des enfants allaités en Côte d’Ivoire et au Burkina Faso (travail réalisé avec le Ditrame Study Group)

DITRAME : Mortalité à 18 mois et exposition périnatale à la zidovudine en Afrique de l'Ouest (travail réalisé avec le Ditrame Study Group)

Déterminants de la transmission de la mère à l'enfant (contribution personnelle) :

Etude de la variabilité : Etude des charges virales libres dans différents compartiments physiologiques lors d'une prophylaxie par l'AZT (DITRAME) :

Evaluation de la technique HMA pour Etude de la charge virale libre dans l'étude des sous-types sur une le sang par la technique du bDNA population africaine vivant en France (Bayer)

Evaluation de la technique HMA Etude de la charge virale libre et pour l'étude des sous-types sur la provirale dans les SCV par la population vivant au Burkina Faso technique (RT-)PCR Amplicor (Roche) après extraction de Boom

Evaluation de la technique HMA pour l'étude des surinfections sur la population adulte vivant au Burkina Etude de la charge virale libre dans Faso le lait maternel par la technique RT- PCR Amplicor (Roche) après extraction de Boom

Evaluation de la technique HMA pour l'étude des surinfection par l'allaitement chez les enfants de la Réflexion sur l'usage des ARV pour la cohorte DITRAME PTME dans un contexte d'allaitement

Etude de l’influence de la Vit A sur la TME

104 Quatre volets seront développés : 1) L’application et la validation du HMA pour l’étude de la variabilité chez les nouveau-nés et l’évaluation des sous-types circulants en France chez des enfant africains dans le contexte de la « French National Cohort Study » : Le but de cette étude était de décrire la répartition des sous-types chez des patients vivants en France, mais originaires d’Afrique, dans le contexte de la transmission de la mère à l’enfant. En effet, la proportion de mères africaines infectées par le VIH a augmenté de manière considérable entre 1990 et 1997 passant de 10% à 40% (297). Une patiente infectée par un VIH de groupe O qu’elle avait transmis à son enfant avait même été décrite (298) dans cette cohorte. 2) L’évaluation par HMA des variants circulants au Burkina Faso et la confirmation d’un échantillonnage par séquençage. 3) L’évaluation d’une technique que nous avons appelée « HMA autologue », développée dans le contexte de cette étude pour l’analyse des co-infections et des surinfections chez les adultes au sein d’une population à haut risque de sur-infection. 4) L’évolution de l’histoire naturelle de la maladie chez le nouveau-né en fonction de la diversité virale lors d’une transmission in utero et l’apparition d’une nouvelle population virale transmise intrapartum ou par l’allaitement, évaluée par notre technique de HMA autologue.

La figure 11 présente l’organisation de ce travail.

105 106

III. RESULTATS :

107 Figure 12 : Effectifs testés pour l’étude DITRAME à six mois :

Femmes éligibles pour l’inclusion à la première visite N = 17195

Femmes ayant accepté le test VIH N = 14385

Femmes VIH-1 ou coinfectées VIH-1+2 N = 1579

Femmes positives pour le VIH revenues pour le postest N = 931

Femmes positives pour le VIH éligibles pour l’inclusion N = 873

Femmes inclues de manière aléatoire N = 431

Zidovudine Placebo N = 214 N = 217 Femmes exclues de Femmes exclues de l’analyse l’analyse N = 5 Femmes analysées Femmes analysées N = 5 N = 209 N = 212

Femmes perdues de Femmes perdues de vue avant Accouchements Accouchement vue avant accouchement N = 201 N = 206 accouchement N = 8 N = 6

Nombre Nombre d’accouchements d’accouchements N = 203 N = 211 Mort-né Mort-nés N = 1 N = 7 Enfants nés vivants Enfants nés vivants N = 202 N = 204 Jumeaux exclus Dont 2 paires jumeaux Dont 4 paires jumeaux Jumeaux exclus de l’analyse de l’analyse N = 2 N = 4 Enfants analysés Enfants analysés N = 200 N = 200 Statut VIH inconnus Statut VIH inconnus N= 8 Infectés Infectés N= 3 N = 33 N = 52

108 III. RESULTATS :

La plupart des résultats présentés dans le cadre de notre travail personnel concerne la cohorte DITRAME.

Partie I : Résultats de l’étude DITRAME : 1.1. Présentation de l’étude Ditrame (articles 1 & 2) :

De 1994 à 1998, se sont déroulés, au Burkina Faso, dans la ville de Bobo-Dioulasso, et en Côte d’Ivoire, à Abidjan, des essais cliniques de phase II, puis de phase III, qui avaient pour but d’évaluer la tolérance et l’acceptabilité, puis l’efficacité respectivement, d’un traitement de ZDV (AZT) donnée selon un schéma court par rapport à l’usage prolongé appliqué en Europe et aux Etats-Unis (ACTG 076), sur la diminution de la transmission du VIH de la mère à l’enfant. Un traitement de 300 mg de ZDV deux fois par jour fut donné aux femmes à partir de la 34ème semaine d’aménorrhée jusqu’au travail, 600 mg lors du début du travail, et 300 mg, à nouveau, après l’accouchement durant une semaine. Notre travail consistait, pour cette étude, à la mise en place d’une technique de PCR, utilisable en routine, pour le dépistage des enfants nés de mères infectées et l’étude du timing de leur infection, pour le site de Bobo-Dioulasso. Il a permis de déterminer le nombre d’enfants infectés pour l’étude réalisée à six mois et à quinze mois et l’étude de la mortalité à dix-huit mois.

1.1.1. Effectifs testés :

Au cours de cette étude, 17.195 femmes enceintes ont été consultées parmi lesquelles, 1579 furent diagnostiquées positives pour le VIH-1 ou pour une coinfection VIH-1-VIH-2. Au sein de celles-ci, 431 furent finalement incluses dans la cohorte, 214 reçurent un traitement ZDV et 217 un placebo. Les analyses purent finalement être réalisées pour 421 femmes et 400 enfants nés vivants (la figure 12 présente les effectifs qui ont été testés dans le cadre de cette étude).

109 110 1.1.2. Efficacité de la prophylaxie ZDV à six mois :

La probabilité selon Kaplan-Meier d’avoir une infection du nouveau-né à six mois fut de 18,0% dans le groupe ayant reçu de la ZDV (n=192) et de 27,5% dans le groupe ayant reçu un placebo (n=197) avec une efficacité relative de 38% [IC95% (0,05-0,60) ; p=0,027]. Un ajustement par rapport au centre, la période de recrutement, le mode d’accouchement, le nombre de CD4 de la mère, la durée du travail, les ruptures prolongées de membranes et la durée d’allaitement n’a pas changé les résultats de l’effet du traitement.

1.1.3. Compliance :

La proportion de femmes ayant pris plus de 80% de la dose maximale prévue était de 75% avant l’accouchement, de 81% pendant le travail, et de 83% post-partum sans différence statistique entre les groupes. Il n’y a pas eu de complication biologique ou clinique majeure répertoriées auprès des femmes et des enfants du groupe ayant reçu de la ZDV. Le traitement fut donc bien accepté, bien toléré et permet une diminution de la transmission de la mère à l’enfant de 38% - malgré le contexte de l’allaitement - jusqu’à six mois.

1.1.4. Mortalité évaluée à 18 mois :

Cette étude a porté sur 407 enfants nés vivants. Le risque de décès était de 176/1000 dans le bras ayant reçu de la ZDV et 221/1000 dans le bras ayant reçu un placebo. La proportion de décès (RH) à 230 jours de vie (ZDV versus placebo) était de 0,47 (IC 95% : 0,2-1,0). Le nombre de cellules CD4+ de la mère (<200/mm3) (RH 2.92; CI 1.4–6.1) et l’infection à VIH de l’enfant (RH 12.6; CI 6.6–24.3) accroît la mortalité de tous les enfants nés de mères séropositives pour le VIH. Parmi 101 enfants infectés (40 dans le bras ZDV), 51 sont décédés à 18 mois. Leur probabilité de décès à 18 mois était de 590/1000 dans le groupe ayant reçu une prophylaxie de ZDV et de 510/1000 dans le groupe ayant reçu un placebo. Si l’on ne considère que le groupe des enfants infectés, la prophylaxie maternelle de ZDV diminue le risque de décès à 230 jours après la naissance ou avant (RH 0.18; CI 0.1–0.5), mais, ensuite, la probabilité de décès devient plus importante. Les mères ayant un nombre de cellules CD4 < 200/mm3 (RH 3.25; CI 1.3–8.4), le décès de la mère (RH 9.65; CI 1.7–56.0), le diagnostic d’une infection pédiatrique à ou avant 12 jours (RH 18.1; CI 4.8–69.0) et entre J13 et J45 (RH 7.63; CI 2.0–29.5), un SIDA pédiatrique clinique (RH 5.37; CI 2.3–12.7) étaient des facteurs de risque associés au décès des enfants infectés par le VIH.

111 Figure 13 : Effectifs testés pour l’étude DITRAME-VIRO :

Femmes éligibles pour l’inclusion à la première visite N = 17195

Femmes ayant accepté le test VIH N = 14385

Femmes VIH-1 ou coinfectées VIH-1+2 N = 1579

Femmes positives pour le VIH revenues pour le postest N = 931

Femmes positives pour le VIH éligibles pour l’inclusion N = 873

Femmes inclues de manière aléatoire N = 431

Etude parmi les mères d’enfants Etude parmi les mères des essais Etude parmi les mères d’enfants infectés à 15 mois cliniques de phase IIa et b : infectés à 24 mois

93 mères d’enfants infectés 27 mères d’enfants infectés 98 mères d’enfants infectés 291 mères d’enfants non infectés 80 mères d’enfants non infectés 286 mères d’enfants non infectés durant peripartum (PLA)

Mères pour l’étude des CVpl : Mères pour l’étude des CVscv : Mères pour l’étude des CVpl :

55 mères d’enfants infectés : 23 20 mères d’enfants infectés Etude globale : ZDV et 32 placebo 62 mères d’enfants non infectés 68 mères d’enfants infectés 130 mères d’enfants non infectés 117 mères d’enfants non infectés : 47 ZDV et 70 placebo Etude postnatale : 20 mères d’enfants infectés 60 mères d’enfants non infectés

Voir figure 14

112 1.1.5. Mortalité parmi les enfants non infectés par le VIH :

Parmi les 296 enfants non infectés par le VIH, il y eut 18 décès durant les 18 premiers mois de vie. Huit parmi les 155 enfants dont la mère avait reçu de la ZDV et 10 parmi les 141 ayant reçu un placebo. Trois décès ont été enregistrés lors de la première semaine de vie, un entre J8 et J28 et 14 entre J29 et 18 mois. Le taux de mortalité à 18 mois de ces enfants était de 53/1000 dans le groupe ZDV (CI 17–89) et de 78/1000 (CI 31–125) dans le groupe placebo (p = 0.46).

1.1.6. Causes de décès :

Tous les décès qui concernent les enfants infectés par le VIH ont eu lieu durant la période néonatale. Les trois causes principales de décès furent : pneumonies (19 cas), diarrhées et malnutritions (14 cas) et septicémies (7 cas). Onze parmi les 51 décès ont été attribués à une cause directement liée au SIDA ou à l’infection à VIH. Parmi les 18 enfants non infectés décédés, la pneumonie fût responsable de 5 décès. Deux décès ont été dus à des problèmes neurologiques chez les enfants non infectés exposés à la ZDV : un est mort de méningite et l’autre de paludisme cérébral. Toutes les PCR concernant le diagnostic pédiatrique et pour l’étude du « timing » de la TME pour la cohorte de Bobo-Dioulasso ont été réalisées au laboratoire du Centre Muraz, ainsi que le suivi des résultats sérologiques à partir de 9 mois.

Dans le but de déterminer quels sont les facteurs qui peuvent influencer la TME, un projet d’étude virologique fut « greffé » sur l’étude de la cohorte « DITRAME », et fut appelé « DITRAME-VIRO ». Ce projet avait pour but, notamment, d’évaluer l’influence des charges virales libres dans trois compartiments, le sang, les sécrétions cervico-vaginales et le lait maternel, sur la TME.

C’est ce travail qui sera présenté dans la partie II et qui constitue notre contribution personnelle.

113 Tableau 6 : CVpl maternelle, groupe de prophylaxie, et autres déterminants de la TME du VIH-1. Analyse univariée :

Etude cas-témoin nichée dans l’essai DITRAME ANRS 049a. Abidjan et Bobo-Dioulasso, 1995-1998.

Mères Mères non Intervalle de p- transmettrices transmettrices Odds ratio confiance à 95% N = 55 N = 117 Site Abidjan, % 69.1 75.2 0.73 0.4-1.5 0.39 a Phase 2 de l’essai, % 10.9 20.5 2.10 0.8-5.5 0.12 a Traitement maternel ZDV, % 41.8 40.1 1.07 0.5-2.1 0.83 a

Age médian de la mère (range) 25 (18-42) 24 (18-41) 1.17 b 0.6-1.7 0.60 Nombre de CD4 /mm3 à l’inclusion (range) 329 (136-1355) 534 (93-1456) 1.35 c 1.2-1.5 0.0001 a Faible poids à la naissance (<2 500g) (%) 25.9 (14/54) 11.2 (13/116) 2.77 1.2-6.4 0.017 a Prématurité (<37 semaines de gestation) (%) 11.1 (5/45) 9.0 (9/100) 1.26 0.4-4.0 0.69 PROM e (>4 heures), % 31.7 (16/51) 22.8 (23/101) 1.55 0.7-3.3 0.26

d a CVpl moyenne maternelle en log10 HIV 4.61 (0.08) 3.69 (0.08) 5.07 2.8-9.0 0.0001 copies/mL à l’inclusion (écart-type) d a CVpl moyenne maternelle et log10 HIV 4.73 (0.10) 3.73 (0.08) 5.99 3.1-11.5 0.0001 copies/mL à J8 (écart-type) Différence moyenne entre les CVpl à l’inclusion 0.10 (0.08) 0.02 (0.07) 1.20 d 0.7-2.0 0.49 et à J8 postpartum en log10 HIV copies/mL a b c d e Variables inclues dans l’analyse multivariée Pour une augmentation de 10 ans. Pour une diminution de 100 CD4. Pour une augmentation de 1 log10 . Rupture prolongée des membranes.

114 Partie II : Résultats de l’étude des charges virales dans trois compartiments physiologiques : le sang, les SCV et le lait maternel :

Les trois études virologiques des différents compartiments physiologiques (plasma, SCV et lait maternel) furent des études cas-témoins nichées dans la cohorte. En effet, il aurait été difficile de tester tous les échantillons de la cohorte ; c’est pourquoi, des mères ayant transmis le virus à leur enfant furent choisies de manière aléatoire et comparées, dans la mesure du possible, à 2 témoins de mères non-transmettrices (figure 13).

2.1. Etude de l’influence des charges virales libres dans le sang sur la TME (article 3) :

2.1.1. Effectifs testés :

Sur 93 mères d’enfants infectés à 15 mois de l’étude DITRAME (299), les charges virales libres plasmatiques purent être mesurées pour 55 d’entre elles (23 ZDV et 32 placebo), tandis que parmi les 291 mères d’enfants non infectés, 117 furent sélectionnées pour leur être appariées (47 ZDV et 70 placebo).

2.1.2. Résultats à l’inclusion (34 à 36 semaines d’aménorrhée) :

A l’inclusion, la moyenne exprimée en log10 était de 4,61 chez les mères ayant transmis le virus et de 3,69 (p=0,0001) (tableau 6) chez les mères n’ayant pas transmis le virus à leur enfant.

A l’inclusion, la moyenne en log10 était comparable entre les groupes ZDV et placebo : 4,09 (écart-type : 0,92) et 3,91 (ET : 0,90) respectivement (p=0,12). A l’inclusion, parmi les femmes ayant transmis le virus, les CVpl étaient plus élevées de 0,37 pour les femmes du groupe ZDV que pour les femmes du groupe placebo (p=0,01) tandis qu’il n’y avait pas de différence significative entre ces deux groupes pour les femmes non transmettrices.

2.1.3. Résultats à J8 post-partum :

A J8 post-partum, la moyenne des CVpl exprimée en log10 fut 1 log10 plus élevée parmi les transmettrices que les non transmettrices (p=0,0001 tableau 6), avec près de 6 fois

115 Tableau 7 : Nombre de cellules CD4+, CVpl maternelle à l’inclusion, à J8 postpartum, et entre ces deux dates et risque de TME du VIH- 1 par groupe de prophylaxie :

Mères transmettrices Mères non transmettrices

ZDV Placebo p-value ZDV Placebo p-value n = 23 n = 32 n = 47 n = 70 Nombre median de cellules CD4+ à 307 (168-412) 358 (263-623) 0.19 487 (327-757) 563 (407-756) 0.16 l’inclusion (IQR*) Log10 HIV copies/mL à l’inclusion Moyenne (écart-type) 4.82 (0.08) 4.45 (0.12) 0.01 3.73 (0.13) 3.66 (0.11) 0.70 Min-Max 3.80-5.48 3.20-5.69 1.70-5.27 1.69-5.33 Valeurs indétectables ** (n) 0 0 0 3 Log10 HIV copies/mL à J 8 n = 20 n = 28 n = 42 n = 63 Moyenne (écart-type) 4.70 (0.12) 4.74 (0.15) 0.84 3.29 (0.13) 4.03 (0.09) <10-4 Min-Max 3.75-5.69 1.96-5.69 1.69-4.55 1.69-5.69 Valeurs indétectables ** (n) 0 0 3 1 Différence absolue J 8-inclusion, log10 HIV n = 20 n = 28 n = 42 n = 63 copies/mL Moyenne (écart-type) -0.13 (0.12) 0.27 (0.11) 0.01 -0.35 (0.10) 0.27 (0.07) <10-4 Min-Max -1.58-0.85 -1.60-1.52 -1.50-1.47 -1.06-2.09 Différence absolue J 8-inclusion /inclusion, n = 20 n = 28 n = 42 n = 63 log10 HIV copies/mL Moyenne (écart-type) -0.02 (0.11) 0.07 (0.15) 0.008 -0.08 (0.19) 0.10 (0.22) 10-4 Min-Max -0.29-0.22 -0.45-0.42 -0.38-0.52 -0.21-1.21 * Interquartile range ** < 50 copies de HIV-1 RNA.

116 plus de risques de transmission pour chaque augmentation de 1 log10 de la CVpl tandis qu’il ne l’étaient que d’un peu plus de 5 fois à l’inclusion pour chaque augmentation de 1 log10.

2.1.4. Résultats par groupes de transmission et groupes de « traitement » :

Au sein des femmes transmettrices, la différence de CVpl entre l’inclusion et J8 post- partum (le lendemain de l’arrêt du traitement) fut de – 0,13 dans le groupe ZDV et de + 0,27 pour le groupe placebo (p=0,01) (tableau 7). Au sein des femmes non transmettrices, cette même différence fut de – 0,35 dans le groupe ZDV et de + 0,27 également dans le groupe placebo (p<10-4). Les différences relatives (J8 – inclusion/inclusion) suivent la même tendance et sont significativement différentes entre groupes de traitement (tableau 7).

2.1.5. Analyse univariée par régression logistique ajustée sur le nombre de CD4 :

Les facteurs qui furent associés à la TME ont été au nombre de quatre : le nombre de CD4 à l’inclusion, un faible poids à la naissance, la CVpl à l’inclusion et à J8 post-partum. Par contre, le site de l’étude, la phase de l’essai, le traitement, l’âge de la mère, l’accouchement prématuré et une rupture prolongée des membranes ne le furent pas (tableau 6).

2.1.6. Analyse multivariée :

En analyse multivariée, ajustée sur le site de l’étude, la phase de l’essai et le groupe de traitement, les seuls facteurs significativement et indépendamment associés au risque de TME furent : - le nombre de CD4 à l’inclusion avec 1,22 fois plus de risque de transmission pour chaque diminution de 100 cellules/µl de sang - la charge virale libre plasmatique à l’inclusion avec 8,7 fois plus de risques

de transmission pour chaque augmentation de 1 log10 - la différence de charge virale libre entre l’inclusion et J8 avec un « odd

ratio » de 4,2 pour une augmentation de 1log10.

117 Tableau 8 : Nombre de cellules CD4+, CVpl log10, log HIV RNA et HIV DNA cellulaire dans les SCV en fonction du risque de TME. (N=82/107)

Caractéristiques Mères transmettrices Mères non p-value N = 20/27 transmettrices N = 62/80 Médiane CD4+ (IQR) 478 (306-692) 628 (395-809) 0.04*

Log HIV RNA/mL SCV n=19 n=54 Moyenne (écart-type) 3.89 (0.78) 3.33 (0.62) 0.002 Min-Max 2.9-5.8 2.3-5.4 Valeurs détectables n, (%) 10 (52.6) 11 (20.4) 0.0075** Moyenne (écart-type) 4.27 (0.88) 3.46 (0.82) 0.04 Min-Max 2.9-5.8 2.6-5.4 Valeurs indétectables n, (%) 9 (47.3) 43 (79.6) Moyenne (écart-type) 3.46 (0.33) 3.29 (0.56) 0.40 Min-Max 3.0-3.9 2.3-4.9

Log HIV DNA/millions cellules SCV n = 16 n = 53 Moyenne (écart-type) 2.41 (0.44) 1.87 (0.60) 0.0015 Min-Max 1.6-3.3 0.6-3.2 Valeurs détectables n, (%) 14 (87.5) 24 (45.3) 0.018** Moyenne (écart-type) 2.43 (0.47) 2.01 (0.58) 0.025 Min-Max 1.6-3.3 1-3.0 Valeurs indétectables n, (%) 2 (12.5) 29 (54.7) Moyenne (écart-type) 2.25 (0.04) 1.75 (0.60) 0.25 Min-Max 2.2-2.3 0.6-3.2

Log CVpl n = 11 n = 30 Moyenne (écart-type) 4.79 (0.56) 3.64 (0.84) 0.0002 Min-Max 3.8-5.5 1.7-5.2 IQR : inter-quartile range ; * Test non paramétrique de Wilcoxon ; ** Test Chi-carré.

118 2.2. Etude de l’influence des charges virales libres et provirales dans les SCV sur la TME (article 4 en préparation) :

2.2.1. Description de l’effectif analysé :

De septembre 1995 à mai 1997, 121 femmes ont été incluses dans les bras placebo des essais 049a et 049b1 de l’étude DITRAME pour réaliser une étude sur les charges virales libres et provirales dans les SCV. Deux femmes perdues de vue, cinq enfants au statut indéterminé, quatre mères au statut indéterminé pour le nombre de cellules CD4+ (dont une ayant transmis le virus peri-partum) et trois femmes ayant accouché d’un enfant mort-né ne purent être retenus pour cette analyse. Parmi les enfants nés de 107 femmes éligibles pour l’étude, 27 ont été infectés par le VIH durant la période peri-partum et 80 ne le furent pas (mais cinq contractèrent le virus par l’allaitement par après). Pour l’étude cas-témoin nichée dans la cohorte, vingt mères ayant accouché d’un enfant infecté disposaient d’un échantillon de SCV parmi les 27 (74%) et 62 mères d’enfants non infectés ont été sélectionnées pour être comparées à ces vingt mères transmettrices durant le peri-partum (figure 13). Les femmes incluses dans la présente étude étaient comparables aux femmes non incluses pour ce qui concerne l’essai (p=0,37), la médiane du nombre de cellules CD4+ (p=0,59), la proportion d’enfants infectés (p=0,71), le nombre d’enfants nés avant terme (p=0,28), le nombre de ruptures de membranes prolongées >4 heures (p=0,22) et la césarienne (p=0,99). Ces femmes venaient préférentiellement du site de Bobo-Dioulasso (49%) comparé à Abidjan (12%) (p=0,001) et étaient plus âgées de deux ans (24 ans vs 22 ans pour les femmes non incluses) (p=0,01).

2.2.2. Comparaison du niveau biologique d’immunodéficience entre MT et MNT :

Le nombre médian de cellules CD4+ était significativement plus bas de 150/mm3 parmi les MT que parmi les MNT (p=0,04) (tableau 8).

1 L’essai b de l’étude DITRAME avait pour objectif d’évaluer l’acceptabilité et la tolérance d’un traitement vaginal prophylaxique de chorure de benzalkonium sous forme d’ovule.

119 Tableau 9 : log HIV RNA et HIV DNA cellulaire dans les SCV, CVpl, groupe de prophylaxie, et autres déterminants de la TME peripartum du VIH-1. Analyse univariée. (N=82/107)

Mères transmettrices Mères non 95% confidence transmettrices N = 20 Odds ratio interval N = 62 Site Bobo-Dioulasso (%) 50.0 48.3 0.93 0.3-2.6 a 049b trial/049a(%) 20.0 29.0 1.63 0.5-5.6 a Age médian de la mère (range) 25.5 (22-28) 24 (21-28) 1.57 c 0.6-3.8 Nombre de CD4 /mm3 à l’inclusion 478 628 0.89 b 0.7-1.1 a d a Moyenne log10 HIV RNA SCV à l’inclusion 3.89 3.33 3.13 1.4-7.2 d a Moyenne log10 HIV DNA SCV à l’inclusion 2.41 1.87 5.66 1.7-18.3 d a Moyenne log10 HIV RNA plasmatique à l’inclusion 4.79 3.64 7.99 2.1-30.3 PROM e (>4 hours) (%) 31.3 21.2 1.69 0.5-5.9 Faible poids à la naissance (<2 500g) (%) 5.0 13.3 0.34 0.04-2.9 a Variables inclues dans l’analyse multivariée. b Pour une diminution de 100 CD4. c pour une augmentation de dix ans. d pour une augmentation de 1 log. e Rupture prolongée de membrane

120 2.2.3. Comparaison des MT et MNT en terme de détectabilité des ARN et en moyenne des CV libres :

L’ARN VIH dans les SCV a été détecté chez 52,6% des MT contre 20,4% des MNT (p=0,0075). Ces valeurs détectables avaient une moyenne plus élevée pour les MT de 0,81 log10 que les MNT (4,27 versus 3,46) (p=0,002) (tableau 8).

2.2.4. Comparaison des MT et MNT en terme de détectabilité des ADN et en moyenne des charges provirales :

L’ADN proviral a été détecté chez 87,5% des 16 MT qui disposaient d’échantillons de SCV et 45,3% des 53 MNT (p=0,0018).

Pour ces valeurs détectables, l’ADN était 0,42 log10 plus élevé parmi les MT que parmi les MNT (2,43 vs 2,01 copies/millions de cellules) (p=0,0015) (tableau 8).

2.2.5. Comparaison des charges virales plasmatiques de l’échantillonnage de l’étude :

La moyenne des CVpl était plus élevée de 1,15 log10 chez les MT que chez les MNT (4,79 vs 3,64) (p=0,0002).

2.2.6. Analyse univariée des déterminants de la TME dans cet échantillon:

En analyse univariée après régression logistique, la charge virale libre exprimée en log10 du nombre de copies d’ARN, la charge provirale exprimée en log10 du nombre de copies par million de cellules, la charge virale libre plasmatique à l’inclusion étaient les trois facteurs significativement associés à la TME durant le peri-partum (tableau 9).

2.2.7. Analyse multivariée :

Malheureusement, le manque de données concernant la CVpl ne permit pas de l’inclure dans l’analyse finale qui concernait 15 cas vs 45 contrôles. Cette analyse finale fut ajustée sur le nombre de cellules CD4+ /µl, la CV libre et la charge provirale dans les SCV. Seule la charge provirale dans les SCV fut un facteur significativement et indépendamment associé à la transmission de la mère à l’enfant durant la période peri-partum avec 3,9 fois plus de risques de transmettre le virus à l’enfant pour chaque augmentation de 1 log10 de la charge provirale. La charge virale libre tend à y être associée mais de manière non significative.

121 Figure 14 : répartition des effectifs testés pour l’étude des charges virales libres dans le lait maternel :

421 femmes incluses

200 ZDV 401 enfants 201 placebo

7 sans mesures CD4+ 10 indéterminés pour le VIH

384 femmes disponibles pour l’analyse LM

25,5% 74,5% 24 mois : T = 98 femmes NT = 286 femmes

9,8% 62,2% 37,8% Tperipartum = 61 Tpostpartum = 37

Tprécoce = 23 Ttardive = 14

Etude globale :

J8 : 40 échantillons disponibles 28 68 transmettrices globales

130 non transmettrices sélectionnées aléatoirement

Etude postnatale uniquement : 28 28 transmettrices postnatales

J45 : 25 échantillons disponibles 22 82

J90 : 17 échantillons disponibles 6 46

______Total 82 56 258 Total PT vs NT 314

Total T vs NT 396

122 2.3. Etude de l’influence des charges virales libres dans le lait maternel sur la TME (article 5 JID – sous presse) :

2.3.1. Description des effectifs testés pour cette étude :

De septembre 1995 à février 1998, 421 femmes ont été incluses et ont accouché de 401 enfants vivants (200 ZDV et 201 placebo). Dix enfants au statut indéterminé pour le VIH et sept mères dont la numération des CD4 n’avait pas été réalisée ont été exclus de l’analyse DITRAME (figure 14). Parmi les 384 couples mères-enfants restant, 98 mères (25,5%) ont transmis le virus endéans les 24 premiers mois, et 286 (74,5%) ne l’ont pas transmis. Selon notre définition du « timing » de la transmission (tableau 2), 61/98 transmissions ont eu lieu pre ou peri-partum (62,2%) et 37/98 ont eu lieu post-partum (37,8%). Dès lors, 9,8% des femmes de toute la cohorte ont transmis le virus post-partum (37/384). Au sein de ces 37 femmes, 23 (62,2%) l’ont transmis durant la période postnatale « précoce » et 14 (37,8%), durant la période postnatale « tardive » (tableau 2). Parmi les 98 femmes transmettrices, 68 (69,4%) échantillons de lait ont pu être collectés à J8 ; 40 parmi 61 (65,6%) femmes qui avaient transmis le virus peri-partum et 28 parmi 37 (76%) femmes qui avaient transmis durant le post-partum. Des 286 femmes n’ayant pas transmis le VIH, furent sélectionnées de manière aléatoire 130 femmes comparables aux 68 transmettrices pour ce qui concerne le site de l’étude (Bobo-Dioulasso ou Abidjan, p=0,13) et la prophylaxie donnée (ZDV vs placebo, p=0,74) pour l’étude globale.

Pour l’étude cas-témoins nichée dans la cohorte focalisée plus particulièrement sur la transmission postnatale, 158 femmes furent sélectionnées dont 28 (TP) transmettrices postnatales et 130 femmes n’ayant pas transmis le virus (MNT). Au total, en incluant les analyses réalisées pour les femmes ayant transmis le virus durant le peri-partum, 396 échantillons de lait maternel étaient disponibles pour les mesures de charge virale libre ; 198 à J8 post-partum (68 chez les MT et 130 chez les MNT), 129 à J45 (47 chez les MT et 82 chez les MNT) et 69 à J90 (23 chez les MT et 46 chez les MNT).

123 Tableau 10 : Analyse descriptive des CV lait en fonction de la transmission dans les échantillons disponibles

TABLEAU 1a: transmission en 3 classes

Mères Mères Mères non global TP vs Tperi vs TP vs transmettrices peri- transmettrices post- transmettrices NT NT Tperi partum partum

J 8 post-partum (n) 40 28 130 Détectables (%) 82,5 78,6 39,2 <0.0001 0.0002 <0.0001 0.69 Médiane CVlm 330 196,5 31,5 <0.0001<0.0001 <0.0001 0.74 (c/ml) Interquartile (39 – 2159) (49 – 1683,5) (13 - 83) Min 8 6 4,5 Max 55074 17975 21161 J 45 post-partum (n) 25 22 82 Détectables (%) 80,0 81,8 46,3 0.0006 0.003 0.0031 1.00 Médiane CVlm 228 413 20 <0.0001<0.0001 <0.0001 0.69 (c/ml) Interquartile (74 – 6895) (72 - 796) (12 – 54) Min 11 7 5 Max 38098 6567 12537 J 90 post-partum (n) 17 6 46 Détectables (%) 70,6 100 41,3 0.0069 0.0087 0.039 0.27 Médiane CVlm 38,1 190,5 14,5 0.0008 0.0019 0.007 0.26 (c/ml) Interquartile (16 – 584) (55 - 1620) (9 – 37) Min 6,4 34 6 Max 202058 2127 1643,5

124

Septante six femmes ne disposaient que d’un seul échantillon à tester. Deux échantillons furent testés pour 109 d’entre elles et trois échantillons pour 34 d’entre elles (données non présentées).

2.3.2. Comparaison des CVlm des MT et des MNT (396 échantillons) :

2.3.2.1. Valeurs extrêmes : Pour tous les échantillons testés, l’ARN VIH a été mesuré de « en dessous du seuil de détection » jusque 202058 c/ml (tableau 10).

2.3.2.2. Résultats des mesures (% de détectables et médianes) au cours du temps : Globalement, à J8, la charge virale libre était détectable chez 67,3% des échantillons de lait maternel des mères ayant reçu un placebo [n=128, Intervalle de Confiance 95% (IC95%): 75,4 – 59,2]. A J8, J45 et J90, l’ARN VIH a été plus fréquemment détectable dans le lait maternel des femmes ayant transmis le virus à leur enfant post-partum (78,6%, 81,8% et 100% respectivement) que l’ARN VIH chez les MNT (39,2%, 46,3% et 41,3% respectivement) (tableau 10). De même, lorsqu’on compare les femmes ayant transmis le virus peri-partum, le pourcentage de détection est respectivement aux trois dates de 82,5%, 80,0% et 70,6%. Toutes ces valeurs étant très significativement différentes pour ce qui concerne les comparaisons entre femmes ayant transmis le virus à leur enfant - que ce soit durant le peri- partum ou durant le post-partum - et les MNT. A J8, J45 et J90, la médiane de la CVlm était très significativement plus élevée chez les TP en comparaison avec les MNT à chaque date testée : 196,5 c/ml, 413 c/ml et 190,5 c/ml respectivement pour les TP versus 31,5 c/ml (p<0.0001), 20 c/ml (p<0.0001) et 14,5 c/ml (p=0.0019) respectivement pour les MNT. De même, ces valeurs sont très significativement différentes entre les femmes ayant transmis le virus durant le peri-partum, et les MNT avec des valeurs médianes de 330 c/ml (p<0.0001), 228 c/ml (p<0.0001) et 38,1 c/ml (p=0.007) respectivement aux trois dates testées (tableau 10).

125 Tableau 11 : Analyse univariée des déterminants de la transmission postnatale par le lait maternel du VIH :

Mères transmettrices Mères non Intervalle de p- postpartum transmettrices Odds ratio confiance 95% N = 20 N = 60 Site Abidjan, % 70.0 70.0 1.0 0.33 – 3.02 1.0 Prophylaxie ZDV, % 50.0 38.3 1.6 0.58 – 4.46 0.36 Médiane CD4 (x 106/l) à l’inclusion (range) 335 (123-1355) 504 (93 - 1176) 1.30 a 1.03 – 1.64 0.030 Moyenne CVpl log maternelle HIV-1 RNA à J 8 post- 4.51b 1.85 – 11.00 0.001 10 4.61 (0.57) 3.77 (0.90) partum (écart-type) b Moyenne log10 HIV-1 RNA lait maternel à J 8 (écart-type) 2.37 (0.99) 1.75 (0.65) 2.71 1.37 – 5.37 0.0042 c Moyenne de la différence log10 HIV-1 RNA entre J8 et J45 + 0.11 (1.11) - 0.21 (0.74) 4.87 2.05 – 11.58 0.0003 (écart-type) a + b c pour une diminution de 100 cellules CD4 T. par augmentation de 1 log10 HIV-1 RNA. pour une augmentation de 1 log et ajusté sur la valeur initiale.

Tableau 12 : Analyse multivariée des déterminants de la transmission postnatale par le lait maternel du VIH :

Odds ratio Intervalle de p- confiance 95% Site Abidjan 0.56 0.12 – 2.61 0.46 Prophylaxie ZDV 3.92 0.79 – 19.5 0.095 Médiane CD4 (x 106/l) à l’inclusion 1.04 a 0.81 – 1.33 0.77 b Moyenne CVpl log10 maternelle HIV-1 2.78 0.98 – 7.93 0.056 RNA à J 8 post-partum b Moyenne log10 HIV-1 RNA lait maternel à 6.24 1.57 – 24.84 0.0093 J8 b Moyenne de la différence log10 HIV-1 RNA 3.77 1.49 – 9.56 0.0052 entre J8 et J45 a + b pour une diminution de 100 cellules CD4 T. par augmentation de 1 log10 HIV-1 RNA.

126 2.3.3. Analyse des déterminants de la transmission postnatale : régression logistique, analyses univariées et multivariées :

2.3.3.1. Effectifs testés : L’analyse univariée a été réalisée en comparant les cas de transmissions postnatales aux MNT. Parmi les 28 TP, seules 20 disposaient de charges virales plasmatiques mesurées à J8, de CVlm à J8 et J45 et des données connues qui ont été associées à la TME. Nous avons tiré au sort, parmi nos 130 MNT qui disposaient de charges virales plasmatiques à J8, 60 témoins. Les femmes sélectionnées pour cette analyse étaient comparables aux autres femmes non sélectionnées pour ce qui concerne le site et le traitement, mais non pour la phase et le nombre de CD4 (données non présentées).

2.3.3.2. Analyse univariée : Parmi tous les déterminants potentiels analysés (tableau 11), quatre étaient très significativement associés à la TP, à savoir : - le nombre médian de cellules CD4+ de la mère

- la charge virale plasmatique moyenne mesurée en log10 à J8 post-partum avec 4,51 fois plus de probabilité de transmettre le virus à l’enfant pour

chaque augmentation de 1 log10 c/ml (odd ratio) (p=0,001)

- la charge virale dans le lait maternel mesurée en log10 à J8 post-partum

avec un odd ratio de 2,71 pour chaque augmentation de 1 log10 c/ml (p=0,0042) - la différence moyenne de charge virale dans le lait maternel entre J45 et J8

mesurée en log10 avec un odd ratio de 4,87 pour chaque augmentation de 1

log10 c/ml (p=0,0003) (tableau 11).

2.3.3.3. Analyse multivariée : Ces facteurs, de même que le site (Abidjan vs Bobo-Dioulasso), le traitement (ZDV vs placebo), le nombre de CD4 à J8 ont été inclus dans une analyse multivariée de manière à identifier les déterminants indépendants de la TME par l’allaitement.

Seules la charge virale moyenne dans le lait maternel à J8 mesurée en log10 avec un odd ratio de 6,24 pour chaque augmentation de 1 log10 (p=0,0093) et la différence des moyennes des charges virales dans le lait maternel entre J45 et J8 avec un odd ratio de 3,77

127 Tableau 13 : comparaisons entre transmissions postnatales [test négatif à J8 (ou après) puis positif ensuite] et non transmissions en fonction du traitement :

TP MNT ZDV Placebo p-valueZDV Placebo p-value p-value p-value p-value ZDV NT/ PLA NT/ ZDV / PLA ZDV T PLA T J 8 post-partum (n) 13 15 47 83 Détectable (%) 61,5 93,3 0,069 25,5 47,0 0,016 0,022 0,0009 0,011 Médiane CVlm 56 1608 0,0015 24 41 0,067 0,13 < 0,0001 0.012 copies/ml (c/ml) Interquartile (18 – 136) (182 – 3031) (12 – 46) (13 – 143) Min 6 19 9 4,5 Max 799 17975 1982 21161 J 45 post-partum (n) 10 12 24 58 Détectable (%) 80,0 83,3 1,00 37,5 50,0 0,30 0,024 0,034 0,58 Médiane CVlm 470,5 346 0,72 18,5 20 0,84 0,0077 0,0061 0.27 (c/ml) Interquartile (72 – 792) (105 – 975,5) (13,5 – 42,5) (12 – 61) Min 13 7 10 5 Max 6567 4040 1363 12537 J 90 post-partum (n) 2 4 10 36 Détectable (%) 100 100 - 30,0 44,4 0,49 - - 0,61 Médiane CVlm 932,5 95,5 0,35 8,5 16 0,014 0,031 0,030 0.096 (c/ml) Interquartile (245 – 1620) (44,5 – (7 - 15) (9,5 - 57) 1131,5) Min 245 34 6 6,8 Max 1620 2127 90 1643,5

128 pour chaque augmentation de 1 log10 (p=0,0052) sont des déterminants indépendants associés à la TME, alors que la charge virale libre à J8 devient « borderline » (tableau 12).

2.3.4. Comparaison de la CVlm chez les TP et chez les MNT en fonction du traitement (314 échantillons) :

2.3.4.1. Effectifs testés : 314 échantillons furent testés pour l’analyse de l’influence de la prophylaxie ZDV sur la transmission postnatale (figure 14) : 158 à J8, 104 à J45 et 52 à J90. Les raisons de certaines mesures manquantes pour cette analyse sont les suivantes : 124 volumes insuffisants (< 800µl), 37 échantillons manquants, 3 enfants sevrés à J45, une femme fut perdue de vue à J45 et 5 à J90.

2.3.4.2. Valeurs extrêmes : Pour tous les échantillons testés, l’ARN VIH a été mesuré de « en dessous du seuil de détection » jusque 21161 c/ml (tableau 13).

2.3.4.3. Résultats des mesures (% de détectables et médianes) au cours du temps : Les charges virales étaient relativement basses puisque seulement 8,9% des échantillons (14/158) avaient des valeurs supérieures à 1000 copies/ml à J8, 6,7% (7/104) à J45 et 5,8% (3/52) à J90. Pour cette étude, à J8, la charge virale libre était détectable pour 33,0% (20/60, IC95%: 21,7 – 46,7) chez les mères traitées à la ZDV versus 54,1% (53/98, IC95%: 43,7 – 64,2) pour le groupe placebo. Parmi les TP, à J8, J45 et J90, la CVlm VIH était détectable chez 61,5%, 80,0% et 100% respectivement pour les femmes ayant reçu de la ZDV alors qu’elle l’était chez 93,3% (p=0,069), 83,3% (p=1,0) et 100,0% (p=1,0) chez les femmes ayant reçu un placebo. Parmi les MNT, à J8, J45 et J90, la CVlm VIH était détectable chez 25,5%, 37,5% et 30,0% respectivement pour les femmes ayant reçu de la ZDV alors qu’elle l’était chez 47,0% (p=0,016), 50,0% (p=0,30) et 44,4% (p=0,49) chez les femmes ayant reçu un placebo. De même, les médianes des CVlm furent calculées. Pour les TP à J8, la médiane de la CVLM était de 1608 c/ml dans le groupe placebo, et il était très significativement inférieur dans le groupe ZDV (56 c/ml, p=0,0015). Chez les MNT, la médiane de la CVlm était de 24 c/ml pour le groupe ZDV versus 41 c/ml pour le groupe placebo.

129 Figure 15 : Evolution des CVLM entre J8 et J45 en fonction du traitement et de la transmission postnatale :

3,5

2,5

2 PLA NT PLA TP AZT NT 1,5 AZT TP Médianes des CVLM (en log) 1

0,5

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Temps

130 Parmi les TP à J45, la CVlm diminue à 346 c/ml pour le groupe placebo et augmente à 470,5 c/ml pour le groupe ZDV (p=0,72). Par contre, chez les MNT, la CVlm stagne à 18,5 c/ml dans le groupe ZDV et 20,0 c/ml dans le groupe placebo (figure 15). Parmi les MTP, les valeurs médianes augmentent encore pour le groupe ZDV en passant à 932,5 c/ml, tandis qu’elles stagnent pour le groupe placebo à 95,5 c/ml. Parmi les MNT, les valeurs restent à 8,5 et 16 c/ml pour les groupes ZDV et placebo respectivement (p=0,014).

2.3.5. Analyse de l’évolution des CVlm des femmes ayant transmis le virus post- partum :

Cette étude a porté plus particulièrement sur les femmes ayant transmis le virus durant le post-partum à Bobo-Dioulasso. Parmi ces femmes, 4 avaient transmis le virus entre J8 et J90, trois avaient reçu de la ZDV et une un placebo. Trois femmes disposaient de mesures de CVlm à deux dates. Celles qui avaient reçu un placebo avaient une CVlm en diminution tandis que les deux femmes qui avaient reçu de la ZDV avaient une CVlm en augmentation [tableau 14 (En gras sont indiquées les caractéristiques des femmes ayant transmis le virus avant J90)].

Tableau 14 : Evolution des CVlm des mères ayant transmis durant le post-partum à Bobo-Dioulasso :

N° Date de l’infection (Jours) Prophylaxie CVlm à J 8 CVlm à J 45 CVlm à J 90 1 253 placebo 106 ND ND 2 162 placebo 3031 197 ND 3 253 placebo 1608 298 ND 4 254 placebo 1984 229 ND 5 83 placebo 76 13 ND 6 159 placebo 1759 ND ND 7 459 placebo < 19 < 7 ND 8 386 placebo 369 394 136 9 524 placebo 17975 1155 55 10 524 placebo 211 4040 ND 11 151 ZDV < 6 < 13 ND 12 84 ZDV < 11 ND ND 13 250 ZDV 136 ND ND 14 82 ZDV < 9 805 ND 15 279 ZDV 706 ND ND 16 77 ZDV 81 698 ND 17 432 ZDV < 64ND ND 18 516 ZDV 42 ND 329 19 363 ZDV 799 304 245

131 Tableau 15 : CVlm et nombre de cellules CD4+ chez les mères ayant reçu une prophylaxie ZDV :

CD4 339 504 1052 415 885 264 434 599 400

CVlm B-053-ZDV-IND B-060-ZDV-NT B-064-ZDV-NT B-065-ZDV-NT B-067-ZDV-NT B-072-ZDV-T B-073-ZDV-NT B-074-ZDV-NT B-077-ZDV-NT J1 <13 1352 1521 <250 <250 J8 1248 <250 <13 <250 <13 <250 J10 1059 <250 <13 <250 <13 <250 731 J15 <250 <250 <13 <13 1910 <13 <250 3178 J20 873 <250 <13 16230 2161 2020 J25 <250 <13 4098 J30 93 <250 <13 1991 <13 546 J35 1201 6870 J40 <250 <250 866 3539 J45 <250 2775 <13 673 <13 1049 7073

Evolution pos pos pos pos pos pos

IND = enfant dont le statut VIH n’a pu être déterminé

Tableau 16 : CVlm et nombre de cellules CD4+ chez les mères ayant reçu un placebo :

CD4 510 796 524 589 1492 749 524 IND

CVlm B-050-Placebo-T B-052-Placebo-T B-059-Placebo-T B-066-Placebo-NT B-070-Placebo-NT B-071-Placebo-NT B-078-Placebo-NT B-079-Placebo-NT J1 <250 2054 250 <250 <250 J8 3777 <13 633 250 41 <250 <250 J10 894 250 48 <250 <250 J15 1393,25 <250 <250 <13 842 J20 <250 <250 1146 126,12 <250 J25 244,25 1994 1666 J30 364 171 <250 1224 1340 <250 J35 <250 <250 165 <250 J40 <250 250 J45 <13 67 <250 <250 3622 2099 <250

Evolution <250 pos pos

13 = moyenne des seuils de détection pour les mesures effectuées par la technique Amplicor (Roche), précédée par une extraction de Boom (Nuclisens). 250 = seuil de la technique bDNA (Chiron) utilisée pour la première partie de l’étude

132 2.3.6. Analyse des CVlm sur des effectifs disposant de prélèvements à différentes dates choisis de manière aléatoire :

Une étude plus fine de l’évolution des charges virales dans le lait fut réalisée. Pour ce faire, 17 femmes ont été tirées au sort et l’équipe du laboratoire a travaillé en aveugle. Il a été décidé de les prélever à des dates plus rapprochées (J1, J8, J15, J20, J25, J30, J35, J40, J45, J50) lorsque cela était possible. Seules deux femmes ne disposaient pas de plus de trois prélèvements, l’une dans le groupe ayant reçu un placebo, l’autre dans le groupe ayant reçu une prophylaxie ZDV. Cependant, elles disposaient de prélèvements à des dates différentes de celles analysées pour l’étude princeps, c’est pourquoi elles furent incluses malgré tout dans cette analyse (tableaux 15 et 16). Cependant, une partie des analyses a été réalisée avec la technique bDNA lorsque le seuil de détection était de 250 copies/ml, et l’autre partie par la technique Amplicor après extraction de Boom, où le seuil de détection a été fixé à 13 copies/ml en moyenne pour toute l’analyse. Dans le tableau 16, on peut voir que pour le groupe placebo, seules deux femmes sur neuf ont une évolution positive de la CVlm entre J1 et J45 (B-70 et B-78) au-dessus de 250 c/ml avec des maxima de 3622 c/ml et de 2099 c/ml à J45. Cependant, ces deux femmes n’ont pas transmis le virus à leur enfant. Elles avaient un nombre de cellules CD4+ élevé pour l’une (B-70, 1492 cellules/µl) et relativement bas pour l’autre (B-78, 524 cellules/µl). Par contre, pour le groupe ZDV, 6 femmes parmi les 9 analysées présentaient des CVlm croissantes au-dessus de 250 c/ml. Une seule parmi les femmes traitées a transmis le virus à son enfant. C’est cette femme qui présente le pic de CVlm le plus élevé parmi les femmes analysées avec une valeur de 16230 c/ml à J20 qui décroît ensuite pour atteindre une valeur de 673 c/ml à J45. Cette femme avait un nombre de cellules CD4+ bas avec une valeur de 264 cellules/µl (tableau 15).

On observe donc, parmi une population de femmes sélectionnées de manière aléatoire et testées en aveugle, une tendance à l’augmentation de la CVlm chez les femmes ayant pris de la ZDV, à l’arrêt de la prophylaxie, et une transmission avec un pic de CVlm élevé pour la seule femme ayant un nombre de CD4+ <500 cellules/mm3 (approchant les 250 cellules/mm3). Les femmes ayant reçu un placebo ne présente pas ce profil, avec seulement deux femmes ayant une CVlm en augmentation alors que 4 femmes parmi 8 testées ont transmis le virus à leur enfant malgré un nombre de CD4+ supérieur à 500 cellules/mm3.

133 134 2.4. Etude de l’influence de la vitamine A sur la TME (article 6) :

Par ailleurs, une étude de l’influence de la vitamine A [taux de rétinol et de Rétinol Binding Protein (RBP)] sur la TME a été réalisée en parallèle de l’étude DITRAME. En effet, à l’époque, plusieurs études avaient présenté des résultats contradictoires concernant l’importance de la vitamine A sur la TME (300-302). 241 échantillons furent analysés et les taux de rétinol, RBP et le rapport rétinol/RBP ne furent pas différent entre MT et MNT. A nouveau, seuls le nombre de CD4 et la charge virale plasmatique à l’inclusion furent associés significativement et indépendamment à la TME dans cette analyse. Par ailleurs, un tiers des femmes présentait un déficit modéré en vitamine A. Cependant, une supplémentation en vitamine A n’a pas d’influence sur la diminution de la TME, tandis qu’une supplémentation en complexe vitaminé semble plus indiquée (294).

135 Figure 16 : répartition des sous-types circulants en France à partir des mères d’origine africaine (« French National Cohort Study ») :

136

Partie III : Analyse de la variabilité du VIH-1 et de son importance dans la TME : 3.1. Analyse de la diversité des souches circulant en France dans le contexte de la « French National Cohort Study » (article 7) :

Cette étude avait pour but d’évaluer les sous-types circulants en France à partir des mères d’origine africaine de la « French National Cohort Study ». Tous les variants disponibles ont été testés en HMAenv selon la technique adaptée par Delwart et al (83), par comparaison avec des souches de référence de chacun des sous-types VIH-1. Cette étude constitue les prémices de l’étude plus large réalisée au Burkina Faso.

3.1.1. Effectifs testés :

Tous les échantillons disponibles provenant de patients africains entre 1986 et 1996 ont été sélectionnés au sein des échantillons disponibles de la « French National Cohort Study ».

Au total, 163 souches de VIH-1 ont été analysées par HMAenv. Parmi ces 163 échantillons analysés, 70 provenaient de mères ayant infectés leur enfant, tandis que 93 autres provenaient de mères non transmettrices. Les différents variants analysés provenaient de 18 pays différents présentés sur la figure 16.

3.1.2. Résultats du sous-typage par HMAenv : L’origine était inconnue pour sept patientes parmi les 163 analysées. Six étaient de sous-type A et un de sous-type D (figure 16). Parmi les femmes originaires d’Afrique de l’Ouest, le sous-type A était prédominant avec 41 souches sur 53 (76%) s’appariant au mieux avec cette souche de référence. Parmi les femmes originaires d’Afrique Centrale, cependant, la répartition était plus complexe puisque au sein des 102 patientes analysées, tous les sous-types principaux furent retrouvés. La répartition était la suivante : 56 A, 13 B, 5 C,10 D, 2 E, 6 F, 7 G, 3 H.

137 Figure 17 : répartition des effectifs testés pour l’évaluation des sous-types circulant au Burkina Faso :

119 échantillons testés par HMA env

25 cohorte 49 mères ANRS 049a 45 « femmes « Jeunes » DITRAME vulnérables »

SEQUENCAGE

n = 8 n = 14 n = 15

Tableau 17 : résultats des sous-typages HMA :

Cohortes Sous-types VIH-1 par HMA env Total

Jeunes 16A 7G 2 IND* 25

Mères DITRAME 33A 14G 2 IND 49

Femmes vulnérables 26A 9G 1B 9 IND 45

Total 75A 30G 1B 13 IND 119 ______% 63,0 25,2 0,8 10,9

*IND = Indéterminé

Tableau 18 : résultats des séquençages :

Cohortes (n) variants VIH-1 : séquençage env

A G CRF-02 CRF-06 IND Jeunes 2 1 2 3 - (n=8) Mères DITRAME 2 0 6 5 1 (n=14) Femmes vulnérables 4 0 7 3 1 (n=15) Total (n=37) 8 1 15 11 2 ______% 21.6 2.7 40.5 29.7 5.4

138 3.2. Analyse de la diversité des souches circulant au Burkina Faso (abstract CISMA 2001 – communication orale) :

Cette étude nous a permis d’évaluer les sous-types circulant au Burkina Faso.

3.2.1. Effectifs testés :

Pour cette étude, des échantillons furent sélectionnés de manière aléatoire au sein de trois cohortes suivies au Centre Muraz à Bobo-Dioulasso : la cohorte « Jeunes », la cohorte « DITRAME » et la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH » (figure 19).

Cent dix-neuf HMAenv ont été réalisés, dont 25 provenant de la cohorte « Jeunes », 49 de la cohorte « DITRAME » qui sont deux cohortes représentatives de la population générale et 45 de la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH » qui constitue une population plus particulière, constituée autant de femmes et jeunes filles du Burkina Faso, que de professionnelles du sexe qui voyagent dans la sous-région [Nigéria, Ghana, Côte d’Ivoire essentiellement (303)]. Huit échantillons parmi 25 (32%) de la cohorte « Jeunes », 14 échantillons parmi 49 (29%) de la cohorte « DITRAME » et 15 échantillons parmi 45 (30%) de la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH » ont été séquencés.

3.2.2. Résultats du sous-typage par HMAenv :

Sur les 25 échantillons testés par HMAenv de la cohorte « Jeunes », 16 variants étaient du sous-type A, 7 du sous-type G et 2 indéterminés (tableau 17). Les 49 variants infectant les mères de la cohorte « DITRAME » testés se répartissaient en 33 sous-types A, 14 sous-types G et 2 indéterminés. Parmi les 45 femmes de la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH », 26 variants étaient du sous-type A, 9 du sous-type G, 1 du sous-type B et 9 indéterminés. Donc, globalement, pour les trois populations testées au Burkina Faso, on obtient une répartition des 119 échantillons testés en 75 A (63%), 30 G (25,2%), 1 B (0,8%) et 13 indéterminés (10,9%).

3.2.3. Résultats du sous-typage par séquençage :

37 échantillons (environ un tiers de chacune des populations) ont été testés par séquençage parmi les 119 testés par HMAenv (31%) (tableau 18).

139 Tableau 19 : comparaison séquençages et HMA : V- Sous-typage VIH-1 (tous les sujets)

A CRF-02 G CRF-06 IND

Résultats HMA% 63 - 25.2 - 10.9

Résultats séquençage% 21.6 40.5 2.7 29.7 5.4

Total séquençage% 62.1 32.4

*IND = Indéterminé

Tableau 20 : Répartition des femmes de la cohorte en six catégories :

Catégories Tabourets Trotteuses Serveuses Cabaret Vendeuses Elèves Total Effectif n 57 66 61 57 51 58 350 Burkinabé % 5,3 39 63 100 76 100 63

Age moy 33 26 25 35 30 21 28 Clients/Sem moy 25 17 3 3 2,2 2 7 Préservatif/sem moy 24,7 16,7 2,6 0,6 1,4 1,7 6,4 MST/an moy 0,78 0,55 0,75 1,43 0,96 1,08 0,92 VIH+ % 54,4 19,7 34,4 14 41,2 10,3 28,6 VIH+ IC % 40,7-67,6 10,9-31,3 22,7-47,7 6,3-25,8 27,6-55,8 3,9- 24,0- 21,2 33,7

Nagot N, Ouangré A, Ouedraogo A, et al. Spectrum of commercial sex activity in Burkina Faso: classification model and risk of exposure to HIV. J Acquir Immune Def Syndr 2002; 29: 517-21 (304)

140 8 échantillons de la cohorte « Jeunes » répartis en 2 variants du sous-type A, 1 du sous-type G, 2 de la forme recombinante CRFO2_AG et 3 CRFO6_cpx. 14 échantillons de la cohorte « DITRAME » répartis en 2 sous-types A, 6 CRFO2_AG, 5 CRFO6_cpx et un indéterminé. 15 échantillons de la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH », répartis en 4 variants du sous-type A, 7 CRFO2_AG, 3 CRFO6_cpx et un indéterminé. Ce qui fait une répartition des 37 échantillons testés en 8 A (21,6%), 1 G (2,7%), 15 CRFO2_AG (40,5%), 11 CRFO6_cpx (29,7%) et 2 indéterminés (5,4%).

3.2.4. Comparaison des résultats HMAenv et séquençage :

Les résultats obtenus par HMAenv ont été comparés à ceux obtenus par séquençage ; le compte-rendu de cette analyse est présenté dans le tableau 19.

Comme le HMAenv ne distingue pas les souches A des CRFO2_AG, ni les souches G des CRFO6_cpx (mêmes séquences dans l’enveloppe), on peut voir que les souches A déterminées grâce au HMA qui représentaient 63% des souches analysées se répartissent en 21,6% de A réels et 40,5% de CRFO2_AG analysées par séquençage, ce qui fait un total de 62,1% (comparable aux 63% par HMA). Par contre, seuls 2,7% des 25,2% de souches G identifiées par HMA se retrouvent en séquençage. 29,7% des souches séquencées sont CRFO6_cpx et 5,4% sont indéterminées versus 10,9% en HMA. Nous n’avons pas jugé nécessaire de confirmer le sous-type B identifié par HMA car le résultat HMAenv était indubitable.

3.3. Etude des surinfections par une technique de HMA autologue (article 8) :

Grâce à l’étude précédente, nous avons pu observer que la population de virus circulants au Burkina Faso était suffisamment diversifiée que pour générer des coinfections par deux populations virales différentes et, éventuellement, des surinfections. Nous avons donc étudié, auprès d’une population estimée à haut risque d’infection, la présence éventuelle de co et sur-infections et leur prévalence. Nous avons considéré que la cohorte de « Femmes Vulnérables Face au VIH », constituée d’un grand nombre de professionnelles du sexe convenait pour cette étude. Les « prostituées » de la cohorte ont été définies comme des

141 Figure 18 : HMA autologues d’ADN de femmes de la cohorte mélangés 2 à 2, comparés à des souches de références mélangées 2 à 2. Les femmes sont choisies de manière aléatoire :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Des Heteroduplex Mobility Assays ont été réalisés entre ADN de femmes de la cohorte choisies de manière aléatoire et comparés à des ADN de souches de référence mélangés deux à deux : [puit n°1 : (D007 et D054), puit n°2 : (D024 et D061), puit n°3 : (D060 et D079), puit n°4 : (D082 et D083), puit n°5 : (D082 et D084), puit n°6 : (AH009 et D007) ; puit n°7 (marqueur phiX173) ; puit n°8 : (A1 et E2), puit n°9 (B1 et E2), puit n°10 (B1 et F2), puit n°11 (A1 et B1), puit n°12 (B1 et C1), puit n°13 (C1 et E2)].

142 personnes ayant des rapports sexuels en échange d’argent (303). Elles ont été réparties de manière équilibrée entre six catégories qui présentent des caractéristiques décrites dans le tableau 20 (304). Cette cohorte ouverte comprend approximativement 350 femmes en permanence, dont 1/3 environ sont séropositives pour le VIH-1. Nous avons pensé que ces femmes séropositives pour le VIH-1, constituaient une population à haut risque de surinfection parce qu’un bon nombre d’entre elles n’utilisent pas systématiquement voire pas du tout le préservatif, malgré les conseils et la mise à disposition de préservatifs, et que plus de 50% d’entre elles sont porteuses d’une MST (304). De plus, l’incidence de l’infection par le VIH-1 y était estimée à 2,5% pour 100 femmes/année.

3.3.1. Validation de la technique de HMA autologue pour identifier les co-infections :

Dans un premier temps, il nous fallait évaluer si la technique de HMA autologue nous permettrait d’identifier des coinfections dans le contexte burkinabè. Pour ce faire, des échantillons d’ADN de femmes de notre cohorte, choisis de manière aléatoire, furent mélangés 2 à 2 pour simuler une coinfection. Dans le même temps, ces échantillons ont également été séquencés et leur distance génétique évaluée. Dès lors, des comparaisons entre les distances phylogénétiques et la mobilité sur gel acrylamide ont été réalisées (figures 18 et 19). Sur la figure 18, on observe que la migration des souches provenant des femmes de notre cohorte sélectionnées de manière aléatoire, est ralentie de la même manière que les souches de référence A et E mélangées, ou B et E par exemple.

3.3.2. Coinfections VIH-1 potentielles au sein de notre cohorte :

Parmi les 447 femmes de notre cohorte, 152 étaient séropositives (34%). Cent quarante sept d’entre elles ont été testées par la technique de HMA autologue. Les échantillons d’ADN de quatre femmes (2,7%) ont présenté un profil de migration qui nous laissait supposer qu’elles étaient coinfectées par deux populations virales.

3.3.3. Caractérisation des souches des femmes coinfectées :

Les régions V3-V5 env ont été clonées après extraction du gel d’acrylamide, amplifiées à nouveau de manière à pouvoir réaliser un nouvel HMA autologue des clones

143 Figure 19 : arbre phylogénétique de différents VIH-1 qui ont été caractérisés au sein de la cohorte (vert) et sujets coinfectés (bleu pour la D062 et rouge pour la D049)

144 deux à deux. Ce nouvel HMA permet d’identifier les clones divergents, sans avoir à séquencer un trop grand nombre d’échantillons. Après séquençage des deux clones divergents de chacun des hétéroduplexes identifiés, deux des femmes testées étaient porteuses de variants délétés d’un fragment d’environ 50 pb dans la région env en même temps que de la souche sauvage non délétée, ce qui explique la présence d’hétéroduplexes migrant peu. Les deux autres (D049 et D062) étaient porteuses de variants phylogénétiquement divergents ce qui confirmait la coinfection de variants VIH. La femme D049 était infectée par les souches CRFO2_AG et CRFO6_cpx et la femme D062 par les souches CRFO2_AG et un variant apparenté aux CRFO11_cpx et au sous-type A (figure 19).

3.3.4. Identification des surinfections :

Nous avons alors analysé rétrospectivement les échantillons stockés dont nous disposions pour ces deux femmes ; pour chacune d’entre elles, le premier échantillon disponible ne présentait pas d’hétéroduplexe typique d’un profil de coinfection. Nous en avons déduit que ces deux femmes avaient été surinfectées entre les dates des premiers et second échantillons analysés.

3.3.5. Prévalence des surinfections dans notre cohorte de “Femmes Vulnérables Face au VIH”:

Après avoir exclu les deux femmes qui présentaient une délétion d’un des variants de la quasi-espèce, la prévalence fut estimée à 1.3% [95% Confidence Interval (CI): 0.0 – 3.23%].

3.3.6. Description détaillée des surinfections :

3.3.6.1. Sujet D062 Cette femme est une professionnelle du sexe qui a découvert sa séropositivité pour le VIH au moment de son inclusion dans la cohorte, en janvier 2001. Elle avait 25 ans à ce moment, et avait commencé à se prostituer à 20 ans, trois ans avant son arrivée du Ghana à Bobo-Dioulasso. Elle a déclaré qu’elle utilisait toujours des préservatifs avec ses clients, mais, jamais avec son partenaire régulier. Elle l’avait rencontré fin 2000 et n’avait pas de compagnon auparavant.

145 Figure 20 : HMA autologues séquentiels, et CVpl aux mêmes temps, des sujets surinfectés :

Sujet D 062 O A B C D E F

Å hétéroduplexes avec coinfection = migration ralentie (A, B, C, D, E, F)

Hétéroduplexe sans coinfection Æ = migration rapide (O)

D 062 Novembre Janvier 2001 Avril 2001 Juillet 2001 Octobre 2001 Janvier 2002 Avril 2002 1999 (O) (A) (B) (C) (D) (E) (F) CV Pas de 134,173 155,421 171,941 49,178 c/mL 22,839 c/mL 40,220 Plasma plasma c/mL c/mL c/mL c/mL

Sujet D 049 O A B

Å hétéroduplexes avec coinfection = migration lente (A, B)

hétéroduplexe sans coinfection Æ = migration rapide (O)

D049 Mars 2000 (O) Novembre 2000 (A) Février 2001 (B) CV Plasma 55,287 copies/mL (c/mL) 187,927 c/mL 11,092 c/mL

146 Cette femme reçoit en moyenne 30 clients par semaine et fait partie de la catégorie « femmes tabourets » présentée dans le tableau 20. A l’inclusion, elle présentait une trichomonase vaginale et une candidose. Pendant son suivi, elle a eu deux épisodes d’infections génitales à Chlamydia trachomatis. Sept échantillons de sang était disponibles pour cette femme aux dates suivantes : novembre 1999, janvier 2001, avril 2001, juillet 2001, octobre 2001, janvier 2002 et avril 2002. Le premier HMA fut réalisé sur l’échantillon de juillet 2001 au cours du premier « screening » (cross-sectionnal study) réalisé et son interprétation faisait indubitablement penser à une coinfection (figure 20). Après clonage, des HMA autologues furent réalisés en mélangeant les ADN des clones deux à deux de manière à identifier les clones phylogénétiquement différents (cfr figure 21 pour la D049). Par séquençage, l’on put determiner que ces clones appartenaient à deux populations différentes : CRFO2_AG et un variant apparenté au groupe CRFO11_cpx, mais, nettement divergent (figure 19). Des coinfections furent confirmées sur tous les échantillons disponibles, excepté l’échantillon de novembre 1999. La figure 20 montre la photo du gel d’acrylamide et de la migration des échantillons successifs : l’échantillon de novembre 1999 est constitué d’une population homogène (« homoduplexes ») qui ne forme pas d’hétéroduplexes migrant peu (migration rapide, pas de coinfection). Ce premier échantillon testé rétrospectivement et séquencé ne présentait qu’une population appartenant au groupe taxonomique CRF02_AG (blast: 87% with CRF02-AG; Figure 19). Dès lors, nous en avons conclu que cette femme s’était surinfectée avec un variant CRFO11_cpx entre novembre 1999 et janvier 2001. De plus, les CVpl ARN VIH-1 ont une valeur maximale en juillet 2001 et diminuent au cours des analyses suivantes.

3.3.6.2. Sujet D049 :

Cette femme est également une professionnelle du sexe qui a été inclue dans la cohorte en mars 2000, à l’âge de 22 ans. Elle avait commencé à se prostituer à l’âge de 20 ans, lorsqu’elle est arrivée dans la ville de Bobo-Dioulasso. Elle provenait d’un village en zone rurale.

147 Figure 21 : Migrations HMA des clones de la D049 mélangés 2 à 2 et des souches A, B et C mélangées 2 à 2 en guise de témoins :

5 13 17 23 29 30

Des Heteroduplex Mobility Assays ont été réalisés entre clones mélangés deux à deux . Sur cette photo, on peut observer les hétéroduplexes formés entre les clones des populations virales de la femme D049. Ces Hétéroduplexes sont donc constitués de clones de deux populations différentes (CRF02 et CRF06, cfr figure 2 pour la D049) pour les puits suivants : [puit n°5 (clone 1 et clone 6), puit n°13 (clone 2 et 6), puit n°17 (clone 3 et 6) et puit n°23 (clone 4 et 6)] qui présentent des migrations ralentie par rapport à un témoin constitué d’un hétéroduplexe entre les souches de référence A et B (puit n°29) et entre les souches de référence A et C (puit n°30).

148 Elle avait en moyenne trois clients par semaine et faisait partie de la catégorie « trotteuse » du tableau 20. Elle avait aussi un partenaire régulier et prétendait toujours utiliser le préservatif lorsqu’elle avait des relations sexuelles, autant avec ses clients qu’avec lui. Elle était déjà séropositive pour le VIH-1 lors de son inclusion dans la cohorte et a subi plusieurs épisodes d’infections génitales à Chlamydia trachomatis durant son suivi, ce qui laisse penser qu’elle avait, malgré ses déclarations, des rapports sexuels non protégés. De plus, elle était enceinte en mai 2001 et est décédée des suites de son accouchement en juillet 2001. Trois échantillons étaient disponibles pour cette femme : mars 2000, novembre 2000 et février 2001. Ces trois échantillons ont été testés par HMA autologue. La figure 20 montre que l’échantillon de mars 2000 est constitué d’une population homogène. Le premier échantillon fut séquencé et le variant se révéla appartenir au groupe de formes recombinantes CRF02_AG (figure 19).

Au contraire, les échantillons suivants (novembre 2000 et février 2001) étaient constitués de populations virales divergentes formant des hétéroduplexes (figure 20). Ces deux populations furent séquencées – après clonage et « screening » pour identifier les clones divergents (figure 21) – pour chacun des échantillons, ce qui démontra qu’à nouveau un virus de souche CRF06_cpx, de même qu’un autre de souche CRF02_AG, étaient présents (figure 19). Nous en avons conclu que la femme D049 infectée avec un variant CRF02_AG s’était surinfectée entre mars 2000 et novembre 2000 avec un variant CRF06_cpx. En parallèle, les CVpl, à chacune des dates, furent mesurées : un rebond important de la charge virale fut mesuré en novembre 2000 (figure 20).

3.4. Etude des surinfections dans le contexte de la TME par une technique de HMA autologue (étude en cours) :

Après avoir validé notre technique de mise en évidence des surinfections chez les adultes de notre cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH », à haut risque de surinfection, nous nous sommes posé la question de savoir si le phénomène de surinfection pouvait avoir un impact sur la TME (cfr réflexion p.18).

149 Tableau 21 : Résultats préliminaires des surinfections chez les enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero :

Numéro de J1/J8 Ech Ech J 45 Ech Ech J 90 Ech Ech J Ech randomisation dispo dispo dispo dispo dispo dispo 180 dispo À À À À À À À tester tester tester tester tester tester tester Prés LM SM Prés LM SM Prés LM SM Prés Hété J= J= Hété J= J= Hété J= J= Hété Rodu Rodu Rodu Rodu plex plex plex plex SE- -B-014-1 001 Non 45 ++ 90 SE- -B-052-1 008 Non 45 45 ++ 90 SE- -B-068-1 ++ 5-8 45 45 ++ 90 SE-BB-016-1 8 Non 45 90 ++ SE-BB-044-1 2-8 45 90 ++ SE-AB-127-1 Non 3-8 8 ++ 45 45 dout 90 eux SE-AB-133-1 8 8 Non 45 ++

LM = lait maternel disponible SM = Sang maternel disponible

150 C’est pourquoi, nous avons testé par la technique de HMA autologue, tous les enfants qui avaient été infectés in utero continuant d’être exposés au VIH par l’allaitement maternel et pour lesquels des échantillons étaient disponibles au sein de la cohorte DITRAME de Bobo-Dioulasso.

3.4.1. Effectifs testés :

Au total, 18 enfants avaient des échantillons disponibles et furent testés par HMA autologue. Sur ces 18 enfants, 7 (39%) ont présenté un hétéroduplexe autologue migrant peu, nous faisant penser qu’ils pourraient être infectés par des populations virales divergentes (tableau 21).

3.4.2. Timing de l’infection, charges virales des enfants :

Le tableau 22 présente les données qui concernent le diagnostic de l’infection chez l’enfant. Malheureusement, 4 des enfants n’avaient pas de prélèvement disponible à J8 et le diagnostic de leur infection n’a pu être réalisé qu’à « J45 » (lorsqu’elle était disponible, la date exacte du prélèvement a été indiquée). Il est donc possible qu’ils aient été infectés durant l’accouchement ou peu après la naissance par l’allaitement. Par ailleurs, ces quatre enfants présentent une charge virale très élevée (> 75000 c/ml) au moment du diagnostic. Pour les trois autres, une RT-PCR a été réalisée à J8.

3.4.3. Présence potentielle de coinfection :

Parmi ces 7 enfants, 2 présentaient une coinfection potentielle (hétéroduplexe autologue migrant peu) à J180, 4 à J90 et 1 à J45 (tableau 21 et figure 22). Parmi ces 7 enfants, 6 purent être testés sur des échantillons antérieurs de manière à définir si la coinfection était présente auparavant. Pour 1 d’entre eux seulement, la coinfection était présente auparavant (hétéroduplexe autologue migrant peu observé à J8 pour l’enfant SE-B-068-1), ce qui pourrait signifier que cet enfant a été infecté in utero, par deux populations virales distinctes. Les cinq autres aurait donc pu être surinfectés entre la date de diagnostic d’une coinfection potentielle et la date à laquelle on n’observe pas d’hétéroduplexe migrant peu. C’est pourquoi, nous avons décidé de séquencer les variants présents, après extraction du gel de polyacrylamide et clonage.

151 Tableau 22 : Timing de l’infection, charge virale après la naissance chez des enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero à suspicion de surinfection par l’allaitement :

N°randomisation Date de naissance J8 / CVpl J45 / CVpl J90 / CVpl J180 / CVpl M9 M12 SE-B-014-1 06/01/1996 19/02/1996 282660 05/04/1996 1822318 DCD 23/5/96 SE-B-052-1 03/07/1996 4/7/1996 2445 13/01/1997 1626086 DCD26/5/97 SE-B-068-1 27/07/1996 10/09/1996 558169 DCD 18/11/96 SE-BB-016-1 24/11/1996 >75000 SE-BB-044-1 12/02/1997 6520360 >75000 SE-AB-127-1 26/08/1997 29/8/1997 Ps 2083 9/10/97 Ps 682026 DCD SE-AB-133-1 19/09/1997 29/09/1997 159072 07/01/1998 2480350 DCD jumeau 133-2 19/09/1997 Négatif Négatif Négatif 30/3/98 Négatif 19/6/98 Négatif

Pas de prélèvement disponible

Tableau 23 : Caractéristiques des mères des enfants de la cohorte DITRAME infectés in utero à suspicion de surinfection par l’allaitement :

N°randomisation Age CD4 CD8 Stade clinique Prophylaxie SE-B-014-1 28 518 810 0 PLACEBO SE-B-052-1 ND 796 1273 0 PLACEBO SE-B-068-1 24 389 1361 0 AZT SE-BB-016-1 23 1267 1303 1 PLACEBO SE-BB-044-1 29 189 947 1 PLACEBO SE-AB-127-1 28 527 990 1 AZT SE-AB-133-1 24 30 1079 1 AZT jumeau 133-2

152 3.4.3. Mortalité des enfants testés : Les enfants SE-B-14-1, SE-B-68-1, SE-B-127-1 et SE-B-133-1 qui présentaient tous les quatre des hétéroduplexes (SE-B-127-1 douteux à J90, mais bien évident à J45) migrant peu à J90 sont décédés endéans les trois mois qui suivaient. L’enfant SE-B-52-1 à suspicion de coinfection à J90 est décédé 9 mois plus tard. Ceci correspond donc à une mortalité de 5 enfants sur 7 qui présentaient des suspicions de coinfection, sur 18 (27%) enfants testés qui pouvaient avoir été infectés in utero. La mortalité à 6 mois est donc de 57% et elle est de 71% à 12 mois.

3.4.4. Mortalité globale des enfants de la cohorte :

Parmi 101 enfants infectés (40 dans le bras ZDV), 51 sont morts (cfr mortalité à 18 mois). Leur probabilité de décès à 18 mois était de 590/1000 dans le groupe ayant reçu une prophylaxie de ZDV et de 510/1000 dans le groupe ayant reçu un placebo. Ces résultats sont globalement inférieurs à ceux observés dans notre groupe d’enfants qui pourraient avoir été infectés in utero.

3.4.4. Séquençage des variants des deux populations virales :

4 enfants disposaient d’échantillons antérieurs en suffisance que pour pouvoir réaliser tous les séquençages. Nos investigations se sont donc focalisées sur ces quatre enfants. Par ailleurs, nous disposons d’échantillons de la mère (lait maternel et sang, cfr tableau 21) pour analyser les populations virales présentes et leur possible moment de transmission (in utero versus par l’allaitement).

3.4.5. Caractéristiques des mères des enfants présentant des profils de coinfection par HMA :

Deux mères avaient un nombre de cellules CD4+ très bas (tableau 24), en-deçà de 250 cellules/µl (B-133 et BB-044). Les autres avaient toutes des valeurs de CD4+ au-dessus de 500 cellules/µl, sauf une femme (B-068). Les charges virales dans le LM étaient disponibles pour deux femmes (B-052, et BB- 16) à J8, J45 et J90. Leurs valeurs sont restées en-dessous des 50 copies/ml aux trois dates pour les deux femmes (données non présentées). Trois d’entre elles avaient également reçu de l’AZT (B-068, B-127 et B-133), les quatre autres n’avaient reçu qu’un placebo.

153 Figure 22 : Migrations HMA des clones des enfants SE-B-14-1 et SE-B-52-1:

1 3 5 6

Le puit numéro 3 du gel de migration polyacrylamide présente la migration des hétéroduplexes formé entre les ADN simples brins de l’enfant SE-B-14-1, tandis que dans le puit numéro 5, nous avons fait migrer les hétéroduplexes formés par les ADN de l’enfant SE-B-52-1. Dans le puit numéro 6 s’est faite la migration d’un témoin constitué de La migration du marqueur est présentée dans le puit numéro 1.

154

IV. DISCUSSION et PERSPECTIVES :

155 Tableau 24 : Variation et sélection chez les rétrovirus :

HTLV FeLV VIH Effet sur la diversité Source de mutations Réplication par mitoses ++++ ++ + Faible Turnover viral Æ erreur de la transcriptase inverse + ++ ++++ Important Forces de sélection CTL +++ ++* +++ Variable** Anticorps +/- ++* +++ Variable Tropisme cellulaire - +++ ++ Elevé Génération de variation Intra-individu Faible Modérée*** Elevé Entre hôtes Faible Faible Elevé

* Peu de choses sont connues sur la sélection immunitaire du FeLV, il ne s’agit donc que de présomptions

** L’effet de la sélection immunitaire sur la diversité de séquences dépend du degré de détection du virus par l’hôte et de l’ampleur de la réponse immunitaire générée

*** Sans tenir compte de la variation qui a lieu lors de recombinaison avec des séquences cellulaires qui peut générer une divergence de près de 20% par rapport à la séquence mère.

156 IV. DISCUSSION et PERSPECTIVES :

Chaque maladie virale présente une situation de relation hôte-virus originale, générée autant par les particularités du génome et la stratégie de réplication du virus que par les capacités de réponse de l’hôte. Infection aiguë et infection persistante correspondent en fait, à deux stratégies mises en œuvre par les virus qui doivent survivre dans l’environnement hostile constitué par les organismes qu’ils infectent et surtout, le système immunitaire des animaux supérieurs. Le système hôte-virus est stable lorsque le compromis optimal pour la survie de l’ensemble des partenaires est trouvé (305). Schématiquement, certains virus utilisent une stratégie aiguë et profitent de la période de déphasage entre leur invasion de l’organisme cible et la réponse immunitaire qui doit se mettre en place, pour se multiplier intensément. Ils se transmettent avant que la réponse immunitaire ne soit suffisamment efficace, éventuellement vers un hôte intermédiaire (influenza, arbovirus, rabdovirus…etc.), ou avant que leur hôte ne soit détruit (ebola…etc.). D’autres virus (herpesvirus, poliovirus…etc.), comme les lentivirus, ont une multiplication moindre, mais une persistance prolongée dans les organismes qu’ils infectent, et leur stratégie de survie met en place des mécanismes leur permettant d’échapper à la réponse immunitaire. Bien que tous les rétrovirus possèdent une transcriptase inverse qui génère un haut taux d’erreur lors de la multiplication virale, la diversité génétique et le taux d’évolution diffèrent fortement entre rétrovirus. Deux forces de sélection en sont responsable : le système immunitaire, mais également le nombre de cellules cibles disponibles (306). A ce sujet, une comparaison a été réalisée par J. Overbaugh et C. Bangham entre certains oncovirus et lentivirus qui est résumée dans le tableau 24. FeLV-A et HTLV-1 ont 2% et de 1 à 4% de variabilité dans l’enveloppe respectivement, entre les différentes souches observées, ce qui est relativement peu au regard de la variabilité de l’enveloppe chez les lentivirus. Ceci serait expliqué partiellement chez HTLV-1 par le fait que ce virus subit une sélection positive de la part des CTL dès l’expression de la protéine de régulation Tax et avant qu’un cycle de réplication complet puisse être réalisé. La haute charge provirale observée serait donc essentiellement due aux mitoses cellulaires qui ne génèrent pas de variabilité, et la charge virale libre reste basse (306). Au contraire, le VIH et le SIV dans le modèle macaque, ont une haute charge virale libre, un haut taux de mutations généré par les erreurs de la transcriptase inverse et de fortes pressions de sélection de la part du système immunitaire, autant par la réponse cellulaire que celle en anticorps, entraînant un switch dans l’usage des corécepteurs. De plus, l’on sait depuis peu que, pour le VIH, huit séquences provirales peuvent être présentes en même temps dans la même cellule (51). Dès lors, les phénomènes de

157 158 recombinaison participent plus que spéculé auparavant, à la production de diversité du VIH. A fortiori, lors de co-infection et/ou de surinfection. Niveau de multiplication virale, et procédure d’évasion face à la réponse immunitaire sont donc les deux clés de la persistance des virus. Ce sont les deux aspects qui ont été abordés dans le cadre de ce travail. De 1994 à 1998, s’est déroulé l’essai clinique DITRAME qui a démontré, pour la première fois, l’acceptabilité, la tolérance et l’efficacité d’un traitement court de ZDV sur la diminution de la TME dans des pays où les populations allaitent (la Côte d’Ivoire et le Burkina Faso) et où il semble difficile de l’éviter. La tolérance était généralement bonne, malgré le fait que bon nombre de femmes puissent être anémiées, mais, une supplémentation en fer et acide folique était systématiquement donnée dans le contexte de l’essai (307). La diminution relative de la TME était de plus d’un tiers à six mois de vie de l’enfant (38%) pour une population à l’immunodéficience moyennement avancée. Ces résultats sont comparables à ceux d’autres équipes, qui présentaient une plus grande efficacité pour des populations où l’allaitement pouvait être évité (19), ou une efficacité similaire pour des populations où il est difficile de l’éviter (308, 309). L’efficacité maximale de la ZDV a été évaluée entre J3 et J8, et les courbes d’acquisition de l’infection VIH en fonction du temps, des populations traitées et non traitées, ont évolué ensuite de manière quasi parallèle jusqu’à six mois. A six mois, aucun effet rebond d’augmentation de la transmission post-partum dû à l’arrêt de la ZDV ne fut observé. Mais, l’efficacité mesurée était influencée par l’état immunitaire maternel (nombre de CD4+/µl), bien que la fréquence d’immunodéficiences sévères étaient faible, comme souvent dans les pays en développement (308, 309). La probabilité d’être allaité à 6 mois était de 90,7% pour le groupe ZDV et de 93,8% pour le groupe placebo et à 15 mois, il était de 45.6% et 40.1%, respectivement, sans différence entre les deux groupes (p=0.56) (populations ivoirienne et burkinabè confondues). La probabilité d’être infecté à 3, 6 et 15 mois était significativement plus basse dans le groupe ZDV que dans le groupe placebo (overall log-rank test p=0.022) et l’efficacité de la ZDV à 15 mois, fut estimée à 30% pour diminuer la TME (95% CI 22 to 52) (299). Néanmoins, une analyse plus fine réalisée à 24 mois, entre 2 essais cliniques de PTME dont les données furent compilées (DITRAME et RETRO-CI) a permis de démontrer qu’un effet significatif de la ZDV n’est mesurable qu’auprès de femmes dont le nombre de cellules CD4+ dépasse 500 cellules/µl. En-dessous de ce seuil, aucune différence n’est significative, et à un an, il n’y a plus aucune différence mesurable entre le groupe placebo et le groupe ayant

159 160 reçu une prophylaxie ZDV (310). Par ailleurs, l’analyse de la mortalité à 18 mois de l’étude DITRAME, nous avait déjà appris qu’un nombre de CD4+ <200 cellules/µl augmente de plus de trois fois le risque de mortalité des enfants. De plus, parmi les enfants infectés, la prophylaxie ZDV devenait délétère à partir de 230 jours puisque la probabilité de décès devenait plus importante pour ce groupe à partir de cette date. De même, pour ces enfants infectés, la probabilité de décès mesurée à 18 mois était plus importante pour le groupe ayant reçu une prophylaxie ZDV que pour les femmes ayant reçu un placebo (590/1000 vs 510/1000). On peut donc comprendre que l’efficacité de telles prophylaxies périnatales est intimement liée à la pratique de l’allaitement en même temps qu’à l’état d’immunodéficience de la mère. Mais, dans le contexte de l’Afrique de l’Ouest, et surtout au Burkina Faso, l’allaitement est profondément ancré dans les traditions et véhicule de nombreuses représentations (17). De plus, il est très difficile pour une femme de prendre la décision de ne pas allaiter son enfant ; en général, elle devra se plier aux exigences de ses paires et de son entourage direct (311). Les progrès doivent donc s’orienter selon deux axes majeurs pour ce qui concerne la PTME : promouvoir l’état immunitaire de la femme en lui donnant des traitements adaptés, et orienter les pratiques d’allaitement selon le contexte (312). Il est donc primordial de comprendre quels sont les déterminants de la TME de manière à trouver des solutions adaptées au contexte de l’Afrique de l’Ouest ; c’est pourquoi, notre travail s’est focalisé plus particulièrement sur certains points virologiques (charges virales dans les différents compartiments physiologiques, variabilité du virus) mais aussi maternels (supplémentation en vitamine A) qui nous semblaient prépondérants dans la TME (tableau 1). La première partie de notre travail personnel avait pour objectifs d’analyser l’influence des charges virales de trois compartiments physiologiques (le sang, le lait maternel et les sécrétions cervicovaginales) sur la TME, pour des mères ayant reçu une prophylaxie ZDV ou un placebo, et s’est appelée DITRAME-VIRO. Pour étudier la CVpl et son rôle dans la TME, nous avons utilisé une technique adaptée au contexte africain où de nombreux variants circulent : la technique bDNA de Bayer (ex-Chiron), qui permet, grâce à un système d’amplification du signal, et non pas de l’ADN copie, d’avoir des résultats fiables pour tous les sous-types (313). Il convient de préciser également le fait que l’analyse a comparé des femmes non transmettrices à des femmes ayant transmis le virus à leur enfant jusqu’à 15 mois. Cela

161 162 signifie qu’elle prend également en compte le rôle de la CVpl durant le post-partum et de son influence sur la transmission par l’allaitement. A l’instar d’autres études, nous avons démontré dans notre analyse que la CVpl était un facteur déterminant de la TME, mesurée à l’inclusion, comme à J8 post-partum, après le traitement ZDV (1-3, 252). Parmi toutes les femmes qui allaient recevoir de la ZDV, celles qui ont transmis le virus avaient une CVpl plus élevée au moment de l’inclusion que celles qui avaient reçu un placebo et qui ont transmis le virus également (+0,37 ; p=0,01). Il ressort également de l’analyse multivariée que les facteurs « nombre de CD4 » (qui constituait une variable d’ajustement dans cette analyse), « CVpl à l’inclusion » sont significativement et indépendamment associés à la TME, mais également, la « diminution de la CVpl entre l’inclusion et la fin du traitement ». L’on pouvait déjà percevoir, grâce à cette analyse, le rôle important que joue l’état immunitaire de la mère sur l’efficacité du traitement (310). Entre les femmes transmettrices et non transmettrices qui avaient reçu une prophylaxie

ZDV la différence de CVpl entre l’inclusion et J8 est mesurable [-0,22 log10 (-0,13 versus -0,35)] tandis qu’entre les femmes transmettrices et non transmettrices ayant reçu un placebo, il y a une augmentation semblable entre ces deux dates (+0,27). L’on peut donc considérer que, dans des conditions normales, les mères de notre cohorte subissent une faible augmentation de la CVpl au moment de l’accouchement, qui doit être mise en parallèle avec les changements immunitaires subits par la femme en fin de grossesse : la reprise d’une réponse immunitaire spécifique des cellules T, donc, potentiellement, leur multiplication et l’augmentation de cibles pour le virus (306), et la fin de la réponse renforcée en monocytes (120, 133). D’autre part, cela signifie également que la diminution de la CVpl a été moindre pour les femmes transmettrices que pour les NT ayant reçu de la ZDV, ce qui met en avant, à nouveau, le fait que son efficacité est limitée chez les mères qui avaient une CVpl élevée. Ces femmes étaient sans doute moins aptes à répondre au traitement ZDV, de par une déficience immunitaire, puisque aucune femme ne pouvait être en période de séroconversion. Cependant, un certain nombre des mères analysées a transmis le virus malgré des CVpl très basse ; dès lors, il ne nous a pas été possible de définir un seuil à partir duquel la transmission aurait été systématique comme dans l’étude de Fang et al (1). Cependant, notre étude a démontré l’importance de la CVpl dans la TME dans le contexte africain, et le rôle que peut jouer la ZDV dans sa diminution, et donc, dans la PTME.

163 164 Dans le but de comprendre les mécanismes de la TME durant la période peri-partum, le deuxième volet de notre analyse de l’influence des charges virales sur la TME a concerné les sécrétions cervico-vaginales. Pour cette analyse, des femmes ayant transmis le virus durant le peri-partum ont été comparées à des femmes n’ayant pas transmis le virus. Un résultat majeur en ressort : Seules les charges provirales sont significativement et indépendamment associées à la TME dans un modèle multivarié. Ceci nous laisse supposer que la transmission de cellules infectées pourrait jouer un rôle plus important dans la TME au moment de l’accouchement, que la CV libre. Le processus du passage du tractus digestif, puis des muqueuses digestives intestinales pourrait impliquer une activation cellulaire et une multiplication virale dans l’intestin puis un passage au travers d’entérocytes ou de cellules M, par un processus de transcytose (234). Cependant, il semble plus vraisemblable que le passage se fasse directement de cellule à cellule (235, 314), par contact d’une cellule infectée maternelle avec un entérocyte ou une cellule M, ce qui permettrait au virus d’échapper à la réponse immunitaire en Ac maternels. La transmission directe cellule-cellule semble être le mode de transmission privilégié du virus HTLV-1 (315). Ce processus pourrait faire appel à la construction d’une synapse virale, qui fonctionnerait sur un mode similaire aux synapses neurologiques et immunologiques (316, 317). Il requerrait un recrutement des molécules CD4, CCKR5 et LFA-1 de la cellule cible grâce aux molécules d’actine et un rapprochement des molécules Env et Gag virales dans la cellule effectrice, suivie d’un transfert de Gag vers la cellule cible (318). Il a été démontré que les cellules dendritiques infectées par le VIH présentent le virus à l’interface cellulaire pour permettre le transfert cellule-cellule vers une cellule T (318). Le processus de la TME au moment de l’accouchement pourrait donc faire appel plus particulièrement à un principe de transmission cellule-cellule. Plus tard cependant, par l’allaitement, le virus libre semble avoir une importance sur la transmission comme le suggère notre analyse de la transmission postnatale.

Afin de mieux comprendre les mécanismes de la transmission postnatale, le troisième volet de notre analyse du rôle de la charge virale sur la TME concerne le compartiment mammaire et, plus particulièrement la charge virale libre dans le lait maternel. A notre connaissance, il s’agit de la première étude des charges virales dans le lait maternel après une extraction de Boom. La mise au point de cette technique pour l’étude de

165 166 lait maternel nous a permis de diminuer le seuil de sensibilité à des valeurs autour de 10 copies/mL en éliminant les inhibiteurs de PCR et en augmentant le volume analysé (800 µL). C’est pourquoi, les niveaux de détection observés pour le groupe placebo (67,3%) furent plus élevés que dans trois études précédentes [39%, 42,5% et 63,2% et (5, 121, 218)]. Il s’agit aussi de la deuxième étude mettant en relation la CV dans le lait avec la transmission postnatale, deux des études publiées mesurant un taux de transmission mère-enfant du VIH regroupant transmission in utero, peripartum et postnatale et la troisième, ne portant que sur six enfants ayant été infectés avec certitude par l’allaitement (121). Cinq femmes de notre étude ont transmis le virus à leur enfant, après la naissance, malgré le fait qu’au temps d’analyse le plus proche de la transmission, elles avaient une CVlm en deçà de 50 copies/mL (données non présentées). Par ailleurs, nous avons observé une différence très hautement significative entre les charges virales libres, autant en pourcentage de détection qu’en valeurs médianes, des femmes ayant transmis le VIH et les non transmettrices. De plus, nos analyses univariée et multivariée démontrent que la CVlm mesurée en log10 de la lactation précoce (J8) est un facteur indépendant très significativement associé à la TME. De même, lorsqu’on s’attache plus particulièrement à l’analyse des femmes ayant transmis durant le peri-partum (PCR positive à J8 ou indéterminée et positive ensuite), l’on peut remarquer que la CVlm à une importance très marquée puisqu’elle reste significativement différente de celles des MNT aux trois dates étudiées ce qui suggère, pour la transmission globale, une importance non négligeable de la transmission par le colostrum, le premier lait de la lactation (217). Cependant, elle est aussi significativement différente aux trois dates aux CVlm mesurées pour les TP ; de plus, les médianes mesurées en c/ml ont une diminution marquée entre J8, J45 et J90 (330, 228 et 38,1 c/ml respectivement) tandis que pour les TP, on observe un rebond important à J45 (196,5, 413 et 190,5 respectivement). Notre analyse démontre également, pour la première fois, qu’une monothérapie ZDV diminue de manière significative la CVlm puisque celle-ci fut moins souvent détectable à J8 et à un niveau significativement plus bas chez les femmes traitées à la ZDV que chez les femmes ayant reçu un placebo. Chez les femmes ayant transmis le virus durant le post-partum et non traitées à la ZDV, la CVlm médiane a décru de 1608 copies/mL à J8 à 346 copies/mL à J45 et à 95,5 copies/mL à J90. Cette régression progressive correspond à la charge cellulaire plus importante dans le lait en début de lactation (319) et vraisemblablement, à un nombre plus important de cellules qui pourraient produire du virus. Des variations dans la réponse

167 168 immunitaire maternelle qui suivent la période de l’accouchement et plus particulièrement, sans doute, la diminution progressive de la suppression immunitaire de la grossesse peuvent vraisemblablement expliquer également cette régression au cours du temps comme c’est décrit pour le VIH dans les SCV (320), mais également pour d’autres agents pathogènes tel que le Plasmodium falciparum (321). Par contre, chez les femmes ayant transmis le virus après la naissance, mais ayant reçu un traitement ZDV, la CVlm médiane évolue de 56 copies/mL à J8 à 470,5 copies/mL à J45 bien que ces différences, avec les femmes ayant transmis le virus et ayant reçu un placebo, ne soient plus significatives après J8, du fait de nos faibles effectifs (J90 n’est calculé que pour deux femmes) (figure 15). Cette tendance s’est encore trouvée confirmée par l’analyse de femmes de la cohorte de Bobo-Dioulasso, ayant transmis durant le post-partum et ayant des CVlm disponibles (19 femmes) où trois femmes ayant reçu une prophylaxie ZDV ont transmis le virus avant J90 (sur 9 femmes), et dont deux ont une CVlm qui augmente, alors qu’une seule femme ayant reçu un placebo a transmis le virus durant cette période, avec une évolution de la charge virale au cours du temps très faible (tableau 14). L’analyse des mesures de CVlm à des temps plus rapprochés, qui avaient été réalisée auprès de femmes sélectionnées de manière aléatoire, conforte également l’idée que certaines femmes traitées à la ZDV pourraient transmettre le virus à leur enfant suite à un rebond de la CVlm. En effet, la seule femme ayant transmis le virus parmi les femmes ayant reçu de la ZDV, était aussi celle qui avait le nombre de cellules CD4+ le plus bas (264 cellules/µl), bien que trois autres femmes avaient un nombre de CD4+ plus bas que 500 cellules/µl ; cependant, elle a eu une CVlm qui a évolué de façon importante à J 20 (16230 copies/ml), mais qui s’est abaissée considérablement jusque J 45 (630 copies/ml). Ce pic de CVlm n’aurait donc pas été détecté dans notre analyse princeps. Son enfant a été diagnostiqué positif à J45 ; il avait une CVpl de 1534478 copies/ml et est décédé à 3 mois (données non présentées). De plus, parmi les 9 femmes ayant reçu de la ZDV et les huit ayant reçu un placebo, 6 ont une CVlm en augmentation dans le groupe ZDV, versus 2 dans le groupe placebo (tableaux 14 et 15). D’autre part, les analyses univariée et multivariée de notre analyse princeps démontrent que l’augmentation de la charge virale entre J8 et J45 est très significativement et indépendamment associée à la TME.

169 170 La question de l’évolution de la CVlm au cours du temps en fonction du groupe de traitement est très importante parce qu’elle a des implications potentielles sur les interventions préventives. Cette tendance marquée à un effet rebond de la CVlm à J45 laisse penser que la TME qui a lieu chez les femmes traitées à la ZDV pourrait être une conséquence de l’arrêt de ce traitement, comme observé chez les adultes après arrêt du traitement HAART (248, 322, 323). La transmission du VIH par l’allaitement est bien évidemment multifactorielle. Des études à venir auront à considérer la charge virale cellulaire (ARN viral intracellulaire comme charge provirale) et même la charge virale de la couche lipidique (124) de façon à comprendre la répartition du virus dans le lait maternel. D’autres caractéristiques virales (phénotype, génotype) ou propres à l’hôte (HLA, polymorphisme des récepteurs de chemiokines ou de leur promoteurs) aussi bien que les déterminants nutritionnels et socio-comportementaux devront être pris en considération dans les modélisations futures de la transmission du VIH. Par exemple, une pratique courante au Burkina Faso, qui dans certaines région est pratiquée pour toutes les femmes, pourrait influencer la charge virale dans le compartiment mammaire. Il s’agit d’un massage traditionnel des seins qui a pour but de « casser les boules des seins ». Ce procédé a la réputation de faciliter l’allaitement et, dans certains contextes, peut être très violent (17). Cette pratique pourrait favoriser le passage du virus du compartiment systémique au compartiment mammaire. Son impact n’a jamais encore été évalué. Notre étude montre que la ZDV a un effet marqué sur la diminution de la CVlm. La transmission postnatale est associée à une augmentation de la charge virale, ce qui pourrait être une conséquence de l’arrêt du traitement prophylactique en période peri-partum. Par ailleurs, des analyses plus poussées ont démontré que, dès 12 mois de vie de l’enfant, les effets bénéfiques du traitement court ZDV sont perdus à cause de la transmission par l’allaitement chez des mères ayant moins de 500 cellules CD4+/µL (310). Il serait important que d’autres investigations au cours de nouveaux essais cliniques aient pour objectif de confirmer si la perte de l’effet bénéfique des traitements antirétroviraux est dû à un effet rebond de la charge virale. Ces données nous ont poussés à une réflexion plus particulière générée également par les résultats d’autres essais cliniques de PTME. C’est ce qui a fait l’objet de l’article 9 de notre travail. Cette réflexion s’est basée sur les résultats de quatre essais cliniques de PTME (RETRO-CI, DITRAME, HIVNET012 et PETRA, cfr annexe 11), qui montraient une baisse

171 172 importante de leur efficacité après plusieurs mois. Cependant, l’essai PETRA, associait zidovudine et lamivudine, alors que les trois autres évaluaient des monothérapies (ZDV et névirapine). L’essai PETRA démontrait une réduction de son efficacité mesurée entre 6 semaines et 18 mois proportionnellement plus importante qu’avec les monothérapies (324). Par ailleurs, chez l’adulte, lors de l’arrêt de traitement HAART, un effet rebond de la

CVpl est observé, qui peut atteindre des valeurs dépassant de 0,6 à 1,5 log10 la CVpl qui prévalait avant l’initiation du traitement, pour revenir par après aux valeurs pré-traitement (248, 322, 323). Bien que, pour l’adulte, cet effet rebond n’ait bien souvent que peu de conséquences d’un point de vue clinique, il est probable que l’impact en terme de transmissibilité ne soit pas négligeable. Si l’on postule le fait que la différence observée entre l’efficacité des quatre essais considérés n’est pas engendrée par une différence due aux populations étudiées (différences dans les critères d’inclusion, pratiques d’allaitement, taux de césariennes, etc…), il est vraisemblable qu’elle puisse être due à un effet rebond de la CVlm, proportionnel au type de traitement utilisé pour la PTME. Dans l’étude de la CVpl de l’essai DITRAME, nous avons démontré qu’une baisse moyenne de 0,13 à 0,37 log10 était générée par le traitement ZDV selon que les mères transmettent ou non le virus respectivement. Si un effet rebond de la CVpl survenait après l’arrêt du traitement, ce que notre essai ne nous permettait pas de démontrer, il est probable qu’il devrait être relativement faible. Cependant, notre étude de la CVlm nous a démontré qu’un certain nombre de femmes subissait cet effet, et transmettait le virus à leur enfant par l’allaitement. Dès lors, nous nous demandons si un traitement plus lourd, comme une bithérapie dans l’essai PETRA, ou des traitements HAART, n’auraient pas un effet pervers inattendu chez les populations qui ne peuvent éviter l’allaitement. A l’arrêt du traitement, un rebond de la CVpl de l’ordre de 4 log10, équivalent à la baisse générée par le traitement pourrait survenir et provoquer un rebond proportionnel dans le compartiment mammaire. Ces réflexions sont d’autant plus d’actualité que l’équipe de Lallemand en Thaïlande a démontré que la névirapine génère des résistances importantes jusqu’à 36 semaines après l’accouchement et que le gouvernement thaïlandais a décidé, suite à la présentation de ces résultats, d’associer la ZDV à toutes les prophylaxies données pour la PTME (325). D’autre part, il nous reste à analyser les corrélations qui existent entre les charges virales des différents compartiments étudiés en fonction du timing de la transmission.

173 174 L’étude de l’influence de la vitamine A sur la TME réalisée au cours des essais DITRAME a confirmé les résultats des dernières études américaines qui avaient été faites à ce sujet (13, 300, 302). Cependant, il nous reste à analyser les résultats d’une telle supplémentation sur la charge virale dans le lait maternel. En effet, le rôle de la vitamine A dans le maintien de l’intégrité des muqueuses a été démontré (287), et, dans un contexte où les mastites, essentiellement subcliniques sont nombreuses (214), il est vraisemblable qu’elle puisse avoir un effet particulier sur le compartiment mammaire, qui n’a pas encore été investigué.

La troisième partie de notre travail a concerné la variabilité du virus et, essentiellement dans le quatrième volet, son rôle éventuel sur la TME. Dans une première analyse, nous avons démontré, grâce à une technique de HMA, qu’un grand nombre de variants viraux étaient transmis de la mère à l’enfant en France, au sein de groupes de populations originaires principalement d’Afrique centrale et de l’ouest. Nichée dans la « French Cohort Pediatric Study » où les mères d’origine africaine ont évolué de 10% en 1990 à 40% en 1997 (297), cette étude avait pour objectif d’analyser tous les échantillons d’ADN disponibles, collectés entre 1986 et 1996, provenant de cellules de mères infectées d’origine africaine. 163 échantillons furent ainsi caractérisés démontrant qu’un grand nombre de sous-types A (41/54 ; 76%), dont on sait qu’il est vraisemblable que ce furent des souches CRF02_AGIbNg provenaient des mères d’Afrique de l’Ouest (figure 3). Cependant, pour les 102 patientes originaires d’Afrique Centrale, une grande diversité était présente (56 A, 13 B, 5 C, 10 D, 2 E, 6 F, 7 G et 3 H) (figure 18). Nous avons également été confrontés à un taux anormalement élevé de sous-type B (13%) alors que les femmes testées ne vivaient bien souvent en France que depuis 2 à 3 années et qu’elles fréquentaient essentiellement leur propre communauté. La mise en évidence d’une telle diversité de variants au sein de communautés vivant en France nous invite à une grande prudence quant à l’usage des tests de suivi des patients (73), et aux tests de diagnostic pédiatrique [usage de plusieurs couples d’amorces sélectionnées dans des régions conservées pour la PCR, notamment pour la PCR en temps réel utilisée en routine (326)]. Par ailleurs, aucune différence de taux de transmission liée au sous- type n’a pu être mise en évidence au sein de la cohorte. Dans le deuxième volet, nous avons réalisé le même type de travail au Burkina Faso, mais pour des populations adultes réparties en trois groupes. Le premier groupe était constitué des femmes de la cohorte DITRAME, déjà décrite. Le deuxième groupe était constitué d’une

175 176 population de jeunes gens représentative de la population générale burkinabè du même âge et d’adultes dans le cadre d’une enquête sur la prévalence du VIH et des IST, appelée cohorte « Jeunes ». Le troisième groupe était constitué d’une population de femmes à haut risque d’infection et de surinfection pour le VIH, appelée initialement cohorte « Prostituées », mais rebaptisée par la suite « Femmes Vulnérables Face au VIH », du fait qu’elle n’est pas uniquement constituée de professionnelles du sexe, mais aussi de femmes dans la précarité qui ont recours à des rapports sexuels pour survivre (303). Cette étude a mis en évidence plusieurs faits importants. Tout d’abord, plusieurs souches différentes coexistent au Burkina Faso, à Bobo-Dioulasso, qui est un carrefour commercial d’envergure pour la sous-région. En effet, notre travail a identifié quatre souches majeures [CRF02_AGIbNg (40,5%), CRF06_cpx (30%), A (22%) et G (3%)] et une mineure (B ; 1 cas unique). Par ailleurs, le HMA dans la région génomique env n’est pas suffisant pour réaliser de la surveillance des souches circulantes au Burkina Faso, et un séquençage est indispensable pour faire la différence entre les souches CRF02_AGIbNg et A, et CRF06_cpx et G, qui comportent les mêmes séquences dans l’enveloppe (figure 3). La distinction entre ces souches pourrait être réalisée par HMA dans d’autres régions, en prenant des variants de référence propres à notre zone géographique. Ce travail a été initié dans la région tat du génome, mais n’a pu être terminé. Il conviendrait de le poursuivre car le HMA est beaucoup moins coûteux et plus facile à mettre en place pour réaliser la surveillance des souches circulantes, que le séquençage (83, 101). Cependant, notre travail a mis en évidence la diversité de souches à Bobo-Dioulasso, au Burkina Faso, ce qui laisse penser que des coinfections et des recombinaisons, voire des surinfections entre différents sous-types peuvent avoir lieu. Ces conclusions ont justifié la mise en place du troisième volet de notre étude, qui avait pour but d’identifier des surinfections au sein d’une population à haut risque de surinfection par transmission sexuelle : la cohorte « Femmes Vulnérables Face au VIH » (tableau 20). Le premier but de cette étude était de développer un outil simple, rapide et peu coûteux pour l’identification d’individus qui pourraient être coinfectés, voire surinfectés. Cette technique est fondée sur le HMA de l’ADN du sang périphérique d’un individu qui permet de mettre en évidence des hétéroduplexes. Ces derniers traduisent la présence de deux populations divergentes (la migration se fait à un niveau similaire à celui de deux souches de référence mélangées entre elles). Après avoir cloné les hétéroduplexes extraits de l’acrylamide, et avoir réalisé un deuxième « run » des clones mélangés deux à deux afin de distinguer les clones divergents, un séquençage des clones phylogénétiquement distincts a été

177 178 réalisé. Huit séquences seulement furent nécessaires pour toute notre étude et les résultats d’une centaine de HMA autologues peuvent être obtenus en quelques heures. Cependant, si l’on avait dû utiliser des techniques de séquençage pour obtenir les mêmes résultats, il est vraisemblable que plus de 1500 clonages et séquences auraient dû être réalisés, ce qui est très coûteux et prend énormément de temps. Le HMA a été décrit pour d’autres études sur la diversité intra-patient (83) et l’heteroduplex tracking assay, une technique dérivée du HMA a déjà été utilisée pour identifier des coinfections et des surinfections (327). Cette technique a démontré sa validité en terme de sensibilité pour l’identification de virus de groupes différents, de formes recombinantes (CRFs) mais également de virus de même sous-type (ou équivalent taxonomique pour les CRFs) avec une divergence plus importante que celle qui prévaut chez un individu, et qui est due à la quasi- espèce (de l’ordre de 5%) (328). Par ailleurs, une procédure identique a été utilisée pour identifier des coinfections HCV ou TTV et a démontré une grande sensibilité (102). En effet, elle a permis de détecter des coinfections des virus de sous-types 1a / 3a dans des proportions de l’ordre de 1%/99% de chacune des populations virales. De plus, la PCR env que nous avons utilisée a été décrite comme une technique suffisamment sensible que pour pouvoir détecter tous les sous-types et CRFs (83). Ces couples d’amorces sont d’ailleurs utilisés pour le diagnostic routine dans les PCR « home made » avec d’autres couples d’amorces (329). Dans la partie expérimentale de cette étude, nous avons mélangé des variants provenant de l’ADN des femmes de notre cohorte deux à deux, et nous avons comparé la migration des hétéroduplexes formés avec ceux formés par des souches de référence mélangées deux à deux. Ceci dans le but de mimer de manière aléatoire une coinfection par deux souches comme cela peut se passer naturellement (figure 20). Par cette démarche, nous avons démontré que le HMA autologue permettrait d’identifier des coinfections et des surinfections des sous-types et CRFs qui existent au Burkina Faso. Notre étude a été réalisée auprès de 147 femmes infectées et régulièrement exposées au VIH. Après avoir éliminé deux femmes de notre analyse parce qu’elles présentaient des délétions dans la région env, ce qui générait une migration lente des hétéroduplexes, au même niveau qu’une coinfection, deux coinfections réelles furent identifiées (2/147, 1.3%) et confirmées par séquençage. Cependant, pour chaque femme, le premier échantillon disponible ne comprenait qu’une seule population virale. Jusqu’à présent, seules 5 surinfections ont pu être mises en évidence dans le monde et ce phénomène reste considéré comme relativement marginal (113, 114). Néanmoins, les deux cas identifiés dans notre cohorte parmi 147 femmes analysées démontrent que le phénomène

179 180 pourrait ne pas être si exceptionnel. De plus, un des arguments avancés pour justifier la surinfection était que les cinq cas décrits étaient sous traitement HAART, ce qui pourrait diminuer l’immunité des individus et la capacité à réagir face à un nouveau virus (114). Cependant, aucune des femmes surinfectées que nous avons identifiées n’avait reçu de traitement ARV. D’autre part, il est probable que notre évaluation sous-estime encore la prévalence de ces surinfections puisque nous ne travaillons que dans la région env du génome et que ces régions sont similaires entre les souches majeures circulantes à Bobo-Dioulasso, à savoir les souches CRF02_AGIbNg et A, et les souches CRF06_AG et G (figure 3). De plus, notre technique pourrait manquer de sensibilité pour détecter des populations virales mineures. Au vu de ces données, il est plus que vraisemblable de conclure qu’un certain nombre d’individus infectés par un premier variant n’a pas une réponse immunitaire suffisante que pour les protéger de l’acquisition d’un second variant (106). Si ces données étaient confirmées, cela signifierait que la mise au point d’un vaccin pourrait être plus complexe qu’initialement imaginé, nonobstant le fait qu’un individu non-infecté par le VIH devrait avoir une réponse immunitaire plus efficiente qu’un individu infecté et immunodéficient (113). Par ailleurs, comme cela avait déjà été décrit auparavant pour d’autres cas de surinfection, les CVpl, mesurées aux mêmes temps que les tests de HMA autologues, ont subi un rebond correspondant à l’acquisition du second variant (103-105). Ce rebond de charge virale, semblable à celui observé lors d’une primo-infection, doit certainement avoir des effets délétères en terme de transmissibilité et d’évolution de la maladie. En ce moment, le même type d’analyse est réalisé pour d’autres cohortes dans le but d’évaluer les prévalences des surinfections dans d’autres régions du monde.

D’autre part, selon le raisonnement présenté dans notre introduction, nous avons voulu évaluer, par notre technique, si la transmission de plusieurs variants pouvait avoir lieu de la mère à l’enfant, à des temps différents. C’est l’objet du quatrième volet de notre travail. Nous serions dès lors confronté au cas d’un enfant infecté in utero par un premier variant, qui acquerrait ensuite, par un phénomène de surinfection, un autre variant maternel, soit intra-partum, soit par l’allaitement. En effet, la compartimentalisation de la multiplication virale a été démontrée, et, il est probable qu’elle soit liée à la présence de variants propres à chacun des compartiments considérés (108, 124). Il est donc logique de considérer qu’un enfant infecté in utero puisse acquérir une autre population virale présente dans les SCV ou

181 182 dans le lait maternel (119, 216), d’autant plus que la CVpl augmente entre la fin de la grossesse et J8 post-partum, comme l’a démontré notre étude (+0,27 log10 sans traitement). Dès lors, nous avons analysé par la technique de HMA autologue, 18 enfants infectés in utero de la cohorte DITRAME, pour lesquels des échantillons de PBMC étaient disponibles à des temps différents. Nous avons ainsi identifié 7 enfants dont le profil HMA correspondait, à un temps, à la présence de deux populations virales phylogénétiquement divergentes, mais qui, au temps précédent, n’en présentaient qu’une (sauf pour un enfant pour lequel les deux populations étaient présentes dès J 5) (tableau 21, figure 22). Par ailleurs, cinq des enfants identifiés sont décédés très rapidement (tableau 22), malgré le fait que trois mères avaient reçu une prophylaxie ZDV (tableau 23), ce qui correspond à une mortalité de 71% à douze mois. Mais la mortalité infantile à 18 mois des enfants infectés présentée en introduction à ce travail est plus faible (510/1000 sous placebo et 590/1000 sous ZDV). L’on peut donc imaginer que la mortalité importante observée dans ce contexte pourrait être liée à la présence de plusieurs populations virales et à un phénomène de surinfection intra ou post-partum. Quatre ADN viraux parmi ceux des sept enfants sont en cours d’analyse par séquençage après clonage et identification des clones divergents par HMA. Deux enfants étaient infectés par deux populations dont les divergences étaient dues à une délétion dans la région de l’enveloppe. Cependant, de telles insertions/délétions avaient déjà été décrites dans la population virale des SCV par l’équipe de Overbaugh (119). Il est donc possible que ces enfants infectés in utero se soient surinfectés au moment de l’accouchement par ingestion des matières génitales maternelles contenant des cellules infectées par le VIH. De plus, il conviendrait de comprendre pourquoi de telles populations virales délétées dans l’enveloppe trouvent un avantage à se multiplier. En effet, parmi les femmes de notre étude des surinfections chez l’adulte, deux d’entre elles présentaient déjà ce type de délétion. D’autre part, ils auraient pu également s’infecter par des variants différents de ceux qui avaient acquis les propriétés de traverser la membrane placentaire, par l’allaitement (108, 124).

Ce travail est en cours à l’heure actuelle et nous attendons, avec un grand intérêt, les futurs résultats !

183 184

V. MATERIEL & METHODES :

185 186 V. MATERIEL & METHODES :

1. Description de l’étude DITRAME :

Il s’agit d’une étude clinique randomisée, en double-aveugle. Elle a commencé d’abord par une étude de tolérance (phase II), puis fut prolongée par une étude d’efficacité (phase III) incluant les observations de la phase II avec un suivi prolongé des patients. Le protocole a été approuvé par les Comités d’éthique de la Côte d’Ivoire, du Burkina Faso, de l’Hôpital Universitaire de Bordeaux et de l’ANRS.

1.1. Procédures d’inclusion :

Après counselling pré-test et signature d’un consentement éclairé, le test VIH fut réalisé à partir d’un prélèvement de sang par un test commercial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA, Genelavia Mixt™, Diagnostics Pasteur, France or Murex ICE 1-O-2™, Murex Biotech Ltd, UK). La confirmation et la discrimination VIH-1 et 2 ont été réalisées par un test peptidique synthétique commercial ELISA (Peptilav 1-2™, Diagnostics Pasteur). Les résultats furent donnés lors du post-test, en général après deux semaines. Un test rapide discriminant était alors réalisé pour les femmes positives pour le premier test (Multispot™, Diagnostics Pasteur). Les femmes qui remplissaient les critères d'inclusion et acceptaient le principe de l'étude devaient revenir entre 36 et 38 semaines de grossesse.

1.2. Prophylaxie ZDV ou placebo :

Les femmes inclues dans la cohorte ont reçu de la ZDV (250 mg deux fois par jour pendant la phase II et 300 mg pendant la phase III) ou un équivalent placebo, jusqu’au début du travail, ensuite, une dose unique per os de 500/600 mg jusqu’à l’accouchement et 500/600 mg par jour jusqu’à sept jours après l’accouchement. Aucun traitement n’a été donné au nouveau-né.

1.3. Diagnostic PCR jusqu’à six mois et diagnostic sérologique ensuite :

Un prélèvement de sang du nouveau-né fut récolté dans des tubes microtainer EDTA (Becton Dickinson) entre J 1 et J 8. Un à 2 ml de sang périphérique fut prélevé également à J 45, J 90 et J 180. Au laboratoire, nous avons séparé les PBMC sur gradient de Ficoll (Histopaque™, Sigma, France). Après deux lavages PBS (phosphate buffered saline) les cellules étaient comptées et stockées en culots secs à -70°C jusqu'à leur utilisation.

187 188 Ensuite, nous récupérions les cellules par centrifugation ; la lyse se faisait sur 107 cellules/ml avec de la protéinase K pendant 12 à 16 heures à 56°C, puis chauffage pour sa désactivation à 95°C pendant 10 minutes. Le volume final était calculé de manière à avoir 2.5 105 cellules pour 20 µl. Une PCR nichée était ensuite réalisée avec trois couples d'amorces spécifiques (Eurogentec™, Belgium) selon des techniques décrites par Rouzioux et al, (17). Les régions amplifiées étaient les suivantes : gag (GAG881-882/SK38-39) et pol (H1POL42- 45/43-44 et POL001-004/002-003) du génome. Dix µl d'amplicons après PCR nichée furent déposés sur gel d'agarose 2%, puis visualisés sous UV après coloration au bromure d'éthidium. Tous les tests furent réalisés en duplicate, avec des contrôles positifs et négatifs. La validation de la série testée par PCR nichée ne pouvait être faite que grâce à un contrôle positif de la lignée 8 E5 avec un seuil de détection de 5 copies provirales. Si l’échantillon était négatif pour l’amplification par les amorces situées dans pol (les plus sensibles), la qualité de l’ADN était vérifiée par une PCR HLA-DQα. La PCR était considérée comme positive si un signal positif était généré par au moins deux des trois couples d’amorces utilisées. Nous avons testé tous les échantillons collectés à J 180, ou plus tôt si celui de J 180 n’était pas disponible, selon ce principe. Si cet échantillon était positif, tous les échantillons précédents étaient testés pour évaluer le « timing » de la transmission qui a été établi selon les principes du tableau 2 (18). A Bobo-Dioulasso, les échantillons furent testés par la suite par un test commercial qui s’est avéré aussi efficace que la PCR “maison”, et plus rapide. Il s’agit d’un test RT-PCR à partir du plasma des enfants (Amplicor HIV Monitor™, version 1.5, Roche Diagnostics Systems Inc, Branchburg, NJ, USA).

1.4. Diagnostic par sérologie :

A partir de 9 mois, le diagnostic s’est fait par sérologie, selon le même principe que pour les mères (test ELISA, Genelavia Mixt™, Diagnostics Pasteur, Paris, France ou Murex ICE 1-O-2™, Murex Biotech Ltd, Dartford, UK). La confirmation sur le même échantillon s’est faite par ELISA (Peptilav 1-2™, Diagnostics Pasteur). Si ces tests étaient positifs et que la PCR n’avait pas été réalisée, à partir de 15 mois, ces tests étaient également considérés comme critère de diagnostic de l’infection pédiatrique. Les enfants qui n’avaient pas de diagnostic PCR et ne pouvaient être suivis au-delà de six mois avaient un statut indéterminé.

189 190 1.5. Analyses statistiques de l’efficacité de la ZDV sur la diminution de la TME :

La taille de l’échantillon qui était nécessaire pour l’étude (n=780) a été calculée pour une diminution estimée de 40% du taux vertical de transmission à six mois, pour un taux initial de TME estimé à 25%, avec une erreur de type 1 de 5% (two-sided test), une puissance de 90% et 20% de perdus de vue (20). Une analyse intermédiaire était prévue à partir de 500 observations. Comme les inclusions furent stoppées à partir de février 1998 (résultats de l’étude thaïlandaise qui a montré l’efficacité de la ZDV sur la PTME), l’étude fut arrêtée après analyse par le DSMB. Les comparaisons entre groupes furent réalisées par un test t de Student et par un test non paramétrique de Mann-Withney pour les variables quantitatives, et des test χ² et de Fisher pour les variables qualitatives. La probabilité d’infection à un âge donné, de l’allaitement, et la mortalité de l’enfant ont été estimés par la technique de courbe de survie de Kaplan-Meier et comparaison par log rank test. Un modèle multivarié de Cox a été utilisé pour étudier l’efficacité relative de la ZDV exprimée comme 1 – le ratio aléatoire. Dans le cas de jumeaux, un seul enfant était considéré pour l’analyse.

2. Etude des charges virales plasmatiques :

2.1. Design de l’étude :

L’étude des charges virales libres dans le sang a consisté en une étude cas-témoin nichée dans la cohorte DITRAME. Des femmes ayant transmis le virus à leur enfant ont été considérées comme les cas, et comparées à des femmes n’ayant pas transmis le virus. Deux à trois contrôles furent sélectionnés par cas, comparable pour la phase de l’essai (II ou III), le site de l’étude (Bobo-Dioulasso versus Abidjan) et la prophylaxie (ZDV versus placebo). L’ARN VIH plasmatique a été mesuré grâce à la technique du DNA branché (bDNA) avec un seuil de détection fixe de 50 copies/ml (Bayer-Chiron, Quantiplex 340TM, version 3.0, E. Walpole, MA, USA) (voir description de la technique en infra).

2.2. Comparaison statistique des CVpl entre T et NT et entre groupes de traitement :

Les CVpl ont été exprimées en log10 de manière à obtenir une courbe normale ; les moyennes et écart-types ont été évaluées et des comparaisons entre T et NT et entre groupes de traitement ont été faites par le test t de Student. Les différences absolues entre J8 post- partum et l’inclusion, et leur évolution entre ces deux dates ont été étudiées également. Les variables décrites comme associées à la TME habituellement, et qui étaient disponibles pour

191 Tableau 25 : Avantages et limites des techniques de prélèvements (prélvts) SCV

Méthodes de Avantages Limites prélvts Sno-strip  wick Echantillons de fluides muqueux Faible volume d’échantillon (environ 8 (Tampons) µl) Weck-Cel  Sponge Permet d’évaluer le virus libre Diminue le seuil de détection de l’ARN (éponge) primaire VIH Volume précis L’éponge doit être pesée directement avant et après prélvt Situation du prélvt précise Cytobrush/swab Permet de collecter plus de cellules Irrite la muqueuse (Ecouvillons) que les deux types précédents Permet de détecter plus d’ARN et Contamination sanguine à cause de d’ADN VIH que Sno-strip l’irritation de la muqueuse Volume peu précis Lavage Volume important Dilution du liquide vaginal Permet l’aliquotage Difficile à standardiser Prélvt de virus libre comme proviral Ne permet pas une localisation du prélvt aussi précise que les autres types Aspiration directe Pas de dilution Volume limité Pas de biais sur le seuil de détection Plus difficile à réaliser que les autres de l’ARN et de l’ADN viraux prélvts Localisation précise du prélvt d’après “HIV type-1 infection in the genital tract Coombs et al .” (205)

192 notre analyse ont été intégrées à une analyse univariée, en plus des variables étudiées. Celles associées à la TME (p <0,25) furent reprises dans une analyse multivariée.

3. Etude des charges virales dans les SCV :

3.1. Design de l’étude :

A nouveau, il s’agit d’une étude cas-témoins nichée dans la cohorte DITRAME, mais, uniquement à partir de femmes des essais de phase II, essentiellement de la cohorte de Bobo- Dioulasso, mais aussi de quelques femmes de Abidjan. Ces essais visaient à évaluer la tolérance de la ZDV (essai a), mais aussi du Chlorure de benzalkonium (essai b). Le même protocole d’inclusion était appliqué que pour l’étude des charges virales plasmatiques. Toutes les femmes dont le nombre de cellules CD4+ avait été mesuré à l’inclusion et qui avaient transmis le virus à leur enfant ont constitué les cas. Leurs charges virales libre et provirale ont été mesurées lorsqu’un échantillon de SCV était disponible à l’inclusion et/ou à J 8 post-partum et ont été comparées aux mêmes mesures faites chez des femmes n’ayant pas transmis le virus à leur enfant (les contrôles, 2 par cas), comparables pour le site et le nombre de cellules CD4+. Les femmes qui avaient transmis le virus durant le post-partum (tableau 1) ont été considérées dans cette étude comme des non-transmettrices. Un prélèvement à la micropipette de 20 à 50 µl a été réalisé au niveau de l’endocol à l’inclusion, c’est à dire de 36 à 38 semaines de grossesse. Pour certaines femmes, un lavage a été réalisé avec un tampon faiblement salin puis stocké à – 80°C. L’ARN-VIH a été extrait par la technique de Boom et une amplification réalisée par la technique Amplicor HIV-1 Monitor (voir description des technique en infra).

3.2. Techniques de prélèvement de SCV :

Par ailleurs, concernant les SCV, une grande diversité de modes de prélèvements existe dont les avantages et les inconvénients sont présentés dans le tableau 25, qui participe, de même que la variabilité biologique, à la variabilité des résultats des différentes analyses (330). Pour notre travail, nous avons préféré utiliser une technique de prélèvement directe au niveau de l’endocol, qui, bien qu’elle soit plus difficile à réaliser, permet de rapporter les mesures à un volume précis.

193 194 3.3. Comparaison statistique des CVscv entre T et NT :

Les CVpl maternelles, les valeurs ARN et ADN proviraux des SCV ont été comparées, après transformation logarithmique, par un test non paramétrique de Kruskal- Wallis. A nouveau, les variables disponibles et connues pour être associées à la TME ont été intégrées à une analyse univariée, en plus des variables étudiées, et des variables d’ajustement (phase de l’essai et site). Ces dernières, ainsi que les variables associées à la TME dans cette analyse (p<0,25) furent intégrées à une analyse multivariée.

4. Etude des charges virales dans le lait maternel :

4.1. Design de l’étude :

Pour compléter l’étude des charges virales dans différents compartiments, nous avons réalisé une étude cas-témoins nichée dans la cohorte DITRAME des charges virales dans le lait maternel. Les cas étaient les femmes qui avaient transmis le virus à leur enfant durant le post-partum et les témoins, des femmes non transmettrices sélectionnées de manière aléatoire, et comparable pour le site (Abidjan versus Bobo-Dioulasso) et la prophylaxie donnée (ZDV versus placebo). La transmission postnatale a été évaluée selon les résultats de PCR tels que définis dans le tableau 1. Les échantillons de lait ont été obtenus par expression manuelle de l’un ou l’autre des seins, en fin de lactation à J8, J45 et J90. Ces échantillons ont été centrifugés à 2000 g durant 10 minutes - endéans les 5 heures après la collecte - pour séparer lipides, phase aqueuse (lactosérum) et cellules. La couche lipidique a été éliminée, le lactosérum stocké -80°C, et les cellules stockées à -80°C sous forme de culots secs après trois lavages PBS. Une extraction de Boom et une amplification par RT-PCR selon la technique Amplicor (cfr infra) ont été réalisées sur le lactosérum.

4.2. Comparaison statistique des CVlm entre T et NT et entre groupes de traitement :

Les comparaisons de mesures d’ARN-VIH entre T (postnatales) et NT et entre types de prophylaxies ont été réalisées grâce au test non paramétrique de Wilcoxon. Ensuite, une analyse univariée a estimé les odds ratio pour la transmission postnatale pour les valeurs des CVlm à J8 et J45 post-partum, pour les différences de valeurs entre ces deux dates, pour les valeurs de CVpl à J8 et la valeur médiane des CD4+ à l’inclusion. Les variables associées à la TME (p<0,25), de même que les variables d’ajustement (site et prophylaxie) ont été intégrées

195 POUDégradation de la membrane Hybridation de la sonde cible Etape de pré-amplification virale, dégradation des Rnases, et capture et libération du RNA

Acide nucléique Add Lysis Buffer HybridationHybridation des des Ces Ces et LEset à HybridationHybridation du pré- pré- Ajout du Tp de lyse la cible et accrochage au puit LEs à la cible et amplificateurplificateur au LEsau accrochage au puit LEs

Etape d’amplification Etape des sondes de Génération du marquage signal

HybrideHybride les lespré- pré- HybrideHybride les les sondes sondes de Ajout de Dioxitane et amplificateurs aux marquage aux Ajout de amplificateursamplificateurs de marquage aux mesure de aux amplificateurs chimioluminescenceDioxitane amplificateurs

Figure 23 : Principe de la technique du bDNA

196 dans un modèle multivarié. Une autre analyse multivariée a également été réalisée de manière a évaluer les déterminants d’un accroissement de la CVlm entre J8 et J45.

5. Techniques utilisées pour les mesures des charges virales dans les différents compartiments :

5.1 Etude des charges virales par la technique du DNA branché (Bayer-Chiron, Quantiplex 340TM, version 3.0, E. Walpole, MA, USA) :

Cette technique a été choisie pour la mesure des CVpl essentiellement parce qu’elle procède par sondes (17 sondes qui se fixent dans la région pol du virus), qui sont elles-mêmes amplifiées ensuite, et non pas par RT-PCR, pour laquelle le couple d’amorces utilisées peut parfois ne pas – ou peu – s’accrocher, et créer ainsi de faux négatifs. Cette technique permet donc une quantification non biaisée des sous-types non B (73). Elle procède par technique sandwich d’hybridation de l’acide nucléique. Le VIH-1 est tout d’abord concentré par centrifugation à partir du plasma. Une fois que l’ARN génomique est libéré des virions, il est capturé sur un support solide (micropuits) par l’intermédiaire de sondes de capture spécifiques constituées d’oligonucléotides de synthèse (figure 23). Une série de sondes cibles permet de réaliser l’hybridation de l’ARN viral avec les sondes Pré- Amplificateur. Les sondes de capture composées de 17 extendeurs de capture individuels, et les sondes cibles composées de 81 extendeurs cibles individuels, se fixent à différentes régions du gène pol de l’ARN viral. La sonde Amplificateur s’hybride au Pré-Amplificateur en formant un complexe d’ADN branché (bDNA). De nombreuses copies d’une sonde marquée à la phosphatase alcaline (PA) s’hybrident ensuite avec ce complexe immobilisé. La détection est obtenue par incubation du complexe avec un substrat chimioluminescent. L’émission de signaux lumineux est directement proportionnelle à la quantité d’ARN du VIH-1 présente dans chaque échantillon, et les résultats sont enregistrés en unités relatives de lumière (RLU) par l’analyseur. Une courbe étalon est obtenue à partir de l’émission de signaux lumineux des étalons contenant des concentrations connues de virus traité à la bêta propiolactone (BPL). Les concentrations en ARN du VIH-1 des échantillons sont déterminées à partir de cette courbe étalon. La luminescence émise est directement fonction du nombre de copies d’ARN VIH-1 par ml. Une courbe sigmoïde est utilisée pour relier le logarithme des RLU à la concentration en ARN-VIH-1. Le logiciel de gestion des données utilise les RLU et les concentrations des six Etalons pour déterminer le meilleur tracé de la courbe, et pour calculer la concentration en

197 ARN -VIH-1 de chaque contrôle et chaque échantillon de patient. Les critères d’interprétation des résultats sont les suivants : • La valeur la plus basse donnée par le test est 50 copies/ml. • Les échantillons dont les valeurs sont inférieures à 50 copies/ml seront indiqués comme en-dessous de la limite du test. • Les échantillons avec une valeur égale ou supérieure à 50 copies/ml contiennent de l’ARN HIV-1 au taux indiqué. • Les échantillons dont les valeurs sont supérieures à 500 000 copies/ml sont au-dessus de la limite supérieure de quantification et doivent être dilués pour qu’une valeur quantitative puisse être obtenue. Cette technique a été utilisée dans sa globalité (extraction + amplification du signal après hybridation) pour la mesure des charges virales plasmatiques au Centre Muraz, de même qu’elle a été utilisée pour les SCV après extraction de Boom (cfr point suivant)(uniquement amplification du signal après hybridation).

5.2. Etude des charges virales par la technique Amplicor (Amplicor HIV Monitor, version 1.5, Roche Diagnostics Systems Inc, Branchburg, New Jersey, USA):

Cette technique a été utilisée pour le diagnostic pédiatrique, après avoir été comparée à la technique de PCR « home made », et validée par le laboratoire de virologie de l’Hôpital Necker-Enfants Malades, notre laboratoire de référence pour l’étude DITRAME. Après avoir fait ses preuves pour l’étude du timing de l’infection pédiatrique, nous l’avons utilisée pour la mesure des CVlm après extraction de Boom. L’ARN-VIH est extrait à partir de 200 µl de liquide biologique grâce à 600 µl d’un tampon de lyse comprenant de l’isothiocyanate de guanidium auquel est rajouté une quantité connue d’un standard interne constitué d’un ARN de Chlamydia pouvant être amplifié par les mêmes amorces que le VIH et d’une taille similaire. L’ARN est précipité dans de l’isopropanol et centrifugé à vitesse maximale (au moins 12.500 g) pendant 15 minutes à température ambiante, lavé dans 1 ml d’éthanol à 70% et resuspendu dans 400 µl de diluant. 50 µl de solution (équivalent de 25 µl de plasma) est rajouté au Master Mix pour la réaction de RT- PCR. Celle-ci se fait dans la région gag du génome viral. Le Master Mix est constitué de glycérol, d’acétate de potassium et d’acétate de manganèse, de dNTPs (dATPs, dCTPs, dTTPs, dGTPs et de dUTPs – usage d’uracile-N-glycosylase pour éviter les contaminations), d’amorces biotinylées (antisens SK431 et sens SK462), de l’ADN polymérase de Thermus thermophilus et d’azide de sodium. La RT-PCR se fait par chauffage 2 min à 50°C, puis par

198 30 min à 60°C. Ensuite, la PCR a été réalisée par 4 cycles de [10 sec à 95°C ; 10 sec à 55°C ; 10 sec à 72°C], puis 26 cycles de [10 sec à 90°C ; 10 sec à 60°C ; 10 sec à 72°C], et pour finir, 15 min à 72°C. La détection des amplicons de 142 pb VIH et du standard est réalisée par colorimétrie après dénaturation par une solution de dénaturation, et dépôt en dilutions sériées de raison cinq dans des micropuits « coatés » avec une sonde spécifique du VIH. La dilution du standard ne se fait qu’une fois, dans des micropuits « coatés » avec une sonde spécifique au standard. L’hybridation se fait pendant 60 min à 37°C. La microplaque qui contient les produits hybridés spécifiques au VIH et au standard est ensuite lavée, et un conjugué avidine- peroxidase rajouté pendant 15 min à 37°C. Après un nouveau lavage, un substrat composé d’H2O2 et de tétraméthylbenzidine est ajouté 10 min à température ambiante. La mesure de densité optique (DO) peut alors se faire à 450 nanomètres après ajout d’un réactif qui permet de stopper la réaction (H2SO4). Il s’agit ensuite de supprimer le « background » de densité optique et de la multiplier par le facteur de dilution opérée. La formule suivante peut alors être appliquée pour obtenir la mesure en ARN de l’échantillon considéré : Nombre de copies d’ARN par millilitre de liquide considéré : (DO totale mesurée / DO du standard mesurée) X nombre de copies du standard par réaction

5.3. Extraction particulière de l’ARN par la technique de Boom (Nuclisens Kit Organon Teknika, Boxtel, NL) :

D’un point de vue technique, il a été démontré que le sperme contient des inhibiteurs de PCR chez environ 40% des sujets testés, ce qui a justifié l’usage d’une extraction à l’aide de silice pour les mesures d’ARN viral provenant de liquides autres que le plasma (331, 332). Notre travail visait également à évaluer la qualité des extractions d’acides nucléiques réalisées par cette technique. La technique de Boom (commercialisée par Organon Teknika) profite des propriétés de fixation des acides nucléiques par la silice ou le verre en présence d’agents chaotropiques (333, 334). Elle débute par une lyse par un tampon contenant de l’isothiocyanate de guanidium (GuSCN) en présence de silice (50 µl de silice en solution étaient ajoutés à chaque échantillon). Cette molécule GuSCN a des propriétés chaotropiques et est un agent puissant de purification et de détection de l’ARN et de l’ADN grâce à ses capacités de lyse cellulaire couplées à celles de potentiel d’inhibition des nucléases (335, 336). L’ARN libéré se fixe à la silice et peut être isolé par centrifugation. Ensuite, le complexe silice-ARN est lavé par un tampon contenant de GuSCN, puis deux fois par de

199 l’éthanol 70%, et ensuite par de l’acétone. Après séchage sur un bain à sec, les acides nucléiques sont détachés à 56°C et élués dans 50 µl de tampon faiblement salin. Après récupération, l’éluat contenant l’ARN est prêt pour l’amplification. Nous procédions en rajoutant d’emblée le standard interne de la technique Amplicor, puisque nous poursuivions, après extraction, par la technique d’amplification RT-PCR Amplicor. Le fait de mettre le standard interne nous permettait de vérifier la qualité de notre extraction de Boom. Cette technique a été utilisée pour éliminer les inhibiteurs de PCR présent dans le lait maternel et les SCV et pour travailler sur un volume plus important que ceux préconisés par la technique Amplicor. Dès lors, nous avons travaillé sur des échantillons de lait maternel de 800 µl, mais des échantillons de sécrétions cervicovaginales de 20 µl à 5 ml.

6. Etude des surinfections chez l’adulte et des surinfections potentielles chez les enfants :

6.1. Description de la cohorte de “Femmes Vulnérables Face au VIH”:

A partir d’octobre 1998, une cohorte ouverte a été créée à Bobo-Dioulasso avec comme objectif majeur, l’étude de l’impact d’une approche de traitement syndromique des IST sur l’incidence du VIH dans une communauté de femmes ayant des rapports sexuels pour de l’argent (autant des professionnelles du sexe que des non professionnelles). Un consentement éclairé a été signé par toutes les femmes inclues dans l’étude et celle-ci a été approuvée par le Ministère de la Santé du Burkina Faso et le Comité d’éthique du Centre Muraz. Cette étude était également contrôlée par le Comité d’éthique de l’ANRS. Tous les trois mois, des examens gynécologiques et médicaux ont été réalisés par un médecin et des prélèvements de sang et de SCV pratiqués pour le diagnostic du VIH et des IST. Les femmes bénéficiaient alors de soins pour les IST et de conseils pour la prévention du VIH, ainsi que de préservatifs. Les tests VIH étaient réalisés grâce au test ELISA Murex HIV-1.2.O (Murex, Dartford, United Kingdom). Si le résultat était positif, une confirmation par « HIV-1 specific ELISA Wellcozyme recombinant » et « HIV-2 specific ELISA Murex HIV-2 » (tous deux de Murex, Dartford, United Kingdom) était faite. En juin 2000, 447 femmes ont été inclues dans l’étude. 152 parmi elles étaient séropositives pour le VIH. La plupart des caractéristiques de cette cohorte à l’inclusion ont déjà été décrites (303, 304).

200 Figure 24 : représentation shématique de la dénaturation-renaturation aléatoire des brins d’ADN et de la migration sur gel d’acrylamide (principe du HMA) :

201 6.2. Amplification par PCR nichée et HMA autologue dans la région env :

Le principe du HMA autologue est de réaliser une dénaturation par simple chauffage de l’ADN à 96°C puis, une réhybridation aléatoire des brins d’ADN deux à deux par simple refroidissement sur de la glace à 4°C. Les brins sont donc réappariés de manière aléatoire et vont former « mismatches » et boucles en quantité proportionnelle à la divergence qu’ils présentent entre eux. Si des variants fort divergents sont présents chez un même individus, ils vont constituer des hétéroduplexes qui migreront peu lors d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, à cause des misappariements et des boucles qu’ils constitueront, en comparaison avec des brins plus proches, ou même, des homoduplexes, voire des ADN simples brins ; cette migration est proportionnelle à la divergence qu’ils présentent (figure 24). Cette technique a déjà été utilisée pour identifier des infections multiples de virus de l’hépatite C (HCV) de même que pour le TT Virus (TTV) et a prouvé que la technique pouvait identifier des co-infections dans des proportions aussi faibles que 1 : 99 (102). Cependant, la publication de ces résultats n’a été réalisée qu’en 2000, tandis que nous avons rédigé notre projet en 1999.

6.3. Manipulation des échantillons de sang pour l’étude des surinfections :

A nouveau, les échantillons de sang furent récoltés sur tubes EDTA (Becton Dickinson) et les PBMC furent séparés par gradient Ficoll (Histopaque™, Sigma, France). Après avoir été lavées deux fois par du PBS, les cellules sont comptées et stockées sous forme de culots secs à – 70°C jusqu’au moment du test. L’ADN est extrait par la technique QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Germany). Un unique test HMA autologue a été réalisé par femme infectée par le VIH-1 pour identifier des co-infections dans le cadre de notre analyse transversale (cross-sectional study). Si l’on se trouve confronté à un profil migratoire qui fait penser à une co-infection, confirmée ensuite par séquençage, les échantillons précédents sont testés suivant le même principe pour identifier des surinfections. Les amorces du premier round de la PCR nichée sont ED3 et ED12 (ou ED5 et ED14 si l’amplification ne fonctionnait pas) et les amorces de second round ES7 et ES8 (ou éventuellement E00 et E80) qui amplifient la région V3-V5 de l’enveloppe virale sur une distance génomique de environ 630 paires de bases (83). Deux microgrammes d’ADN génomique évalués par densité optique sont en général amplifiés. Parfois, un volume correspondant à une quantité plus ou moins importante est utilisé en cas de problèmes d’amplification.

202 Après visualisation de l’amplification sur gel d’agarose 2% et bromure d’éthidium, 20 µl d’amplicons de second round sont dénaturés à 95°C pendant 2 minutes dans un tampon d’hybridation [10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 100 mM NaCl, and 5 mM EDTA] et refroidis rapidement dans de la glace submergée par de l’eau pour permettre un refroidissement et un réappariement rapide et uniforme. Ceci génère la formation d’hétéroduplexes et d’homoduplexes entre les ADN simples brins de la quasi-espèce de l’individu testé, et la formation d’hétéroduplexes entre ADN simples brins de souches différentes si l’individu testé est co-infecté par deux souches différentes (« interclade ») (figure 24). Un tampon de charge (10× = 4.2% Orange-G and 25% Ficoll-400) et la migration réalisée sur gel de polyacrylamide 5% (PAGE, acrylamide-bis, 37.5:1) dans un tampon Tris-borate-EDTA durant 3.00 h à 250 V. Les gels sont ensuite déposés dans des bacs immergé du même tampon et de bromure d’éthidium (0.5 µg/ml) pendant 20 min, visualisés sous UV et photographiés. Les co-infections peuvent être identifiées si la migration est réduite au même niveau que celle d’un témoin constitué d’ADN simples brins réappariés entre deux souches différentes (interclade).

6.4. Clonage des ADN à partir des fragments d’acrylamide contenant les hétéroduplexes divergents :

Pour augmenter les chances d’identifier les clones phylogénétiquement les plus divergents et ne pratiquer que peu de séquençage, une extraction de l’hétéroduplexe à partir de l’acrylamide peut être réalisée. Ceci permet donc une extraction et un clonage en proportions égales des ADN les plus divergents uniquement. Après un nettoyage minutieux des outils utilisés avec de l’HCl 0,1N pour éviter toute contamination, les bandes sont excisées sous UV, réduites en petit morceaux et éluées dans un tampon [0,5M ammonium acetate, 1mM EDTA, pH 8.0] et précipitées par de l’acétate de sodium (pH 5.2) dans de l’éthanol (337), puis clonées dans le vecteur PGEM-TEasy (Promega). Après transformation dans des bactéries compétentes E. Coli, les colonies blanches sont repiquées de manière aléatoire et les fragments V3-V5 de l’enveloppe virale, amplifiés par les amorces ES7–ES8. Les clones subissent une nouvelle étape de HMA autologue deux à deux, dans le but d’identifier les clones divergents, puis seuls deux clones divergents sont séquencés.

203 204 6.5. Séquences et analyses phylogénétiques de deux clones divergents par individu potentiellement infecté :

Les colonies des clones divergents identifiés sont ensuite cultivées pendant 24 heures dans 3 ml de milieu LB avec de l’ampicilline, puis purifiées par le kit QIAprep Miniprep (QIAGEN, GmbH, Germany). Les inserts sont ensuite séquencés par la méthode Sanger (dye terminator) avec des amorces universelles sur séquenceur automatique (ABI 373, MODEL STRETCH, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.). Les séquences virales de chaque patient sont alignées grâce au programme CLUSTALW (338) suivies de corrections manuelles. Les arbres phylogénétiques sont construits par la méthode de neighbor-joining (339) et la fiabilité des arbres validée par 100 bootstrap. Les séquences analysées au cours de cette étude ont été déposées à la GenBank de Los Alamos selon les numéros suivants : AY345993 to AY346008.

7. Etude de l’impact du taux de vitamine A sur la TME :

Le rétinol fut mesuré par HPLC et le RBP par néphélométrie. Le statut en vitamine A fut évalué par le taux de rétinol et le rapport équimolaire rétinol/RBP. Un déficit modéré fut défini par un taux inférieur à 30 µg/dL ou un rapport de moins de 1,3, tandis qu’un déficit sévère était déterminé par un taux inférieur à 20 µg/dL ou un rapport inférieur à 0,8. Les comparaisons des moyennes maternelles en vitamine A entre T et NT ont été réalisées par un test T de Student. Les comparaisons des déficits l’ont été par un test χ2.

205

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VI. REFERENCES :

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223 339) Saitou N, Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Bio Evol 1987; 4:406-425.

224

VII. ANNEXES :

225 226 Annexe 1 : Article 1 :

6-month efficacy, tolerance, and acceptability of a short regimen of oral zidovudine to reduce vertical transmission of HIV in breastfed children in Cote d'Ivoire and Burkina Faso: a double-blind placebo- controlled multicentre trial. DITRAME Study Group.

Dabis F; Msellati P; Meda N; Welffens-Ekra C; You B; Manigart O; Leroy V; Simonon A; Cartoux , Combe P; Ouangre A; Ramon R; Ky-Zerbo O; Montcho C; Salamon R; Rouzioux C; Van de Perre P; Mandelbrot L. Lancet 1999 Mar 6;353(9155):786-92

227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 Annexe 2 : Article 2 :

18-month mortality and perinatal exposure to Zidovudine in West Africa.

Dabis F., Elanga N., Meda N., Leroy V., Viho I., Manigart O., Dequae-Merchadou L., Msellati P., Sombie I. for the Ditrame Study Group AIDS 2001, 15 :771-779.

237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 Annexe 3 : Article 3 :

Maternal plasma viral load, Zidovudine and mother-to-child transmission of HIV-1 in Africa

Leroy V., Montcho C., Manigart O., Van de Perre P., Dabis F., Mselatti P., You B., Simonon A., Rouzioux C., for the Ditrame ANRS 049a trial. AIDS 2001, 15(4) ;517-522.

249 250 251 252 253 254 255 256 Annexe 4 : Article 4 :

Maternal viral load in vaginal fluids and mother-to-child transmission of HIV-1 in Côte d’Ivoire and Burkina Faso : the Ditrame ANRS 049a and 049b trials.

Manigart O, Leroy V, Burgard M, Dequae-Merchadou L, Meda N, Msellati P, Mandelbrot L, Dabis F, Van de Perre P, Rouzioux C for the Ditrame Study Group (ANRS 049a and 049b clinical trials). En cours de rédaction.

257 258 Maternal viral load in vaginal fluids and mother-to-child transmission of HIV-1 in Côte d’Ivoire: the DITRAME ANRS 049a and 049b trials. (Article en preparation)

O. MANIGART1, V. LEROY2, M. BURGARD3, L. DEQUAE-MERCHADOU4,

N. MEDA1, P. MSELLATI4, L. MANDELBROT5, F. DABIS2, P. VAN DE PERRE1, C.

ROUZIOUX3,

for the DITRAME Study Group (ANRS 049a and b clinical trials) *.

1 Centre MURAZ/OCCGE, Bobo-Dioulasso, Burkina Faso

2 INSERM U330, Université Victor Segalen Bordeaux 2, France

3 Laboratoire de virologie, Hôpital Necker, Paris, France

4 IRD, Abidjan, Côte d’Ivoire

5 Maternité Port-Royal, Hôpital Cochin, Paris, France

This study has been reported in part at the CROI in Chicago, USA, February 2002 (abstract

WePpB1302).

Running Head: HIV-RNA in maternal vaginal fluids and mother-to-child transmission.

Short report : xx words, references, 2 tables.

259 The DITRAME Study Group is organized as follows:

Coordination: INSERM U 330, Université Victor Segalen Bordeaux 2, Bordeaux, France (F. Dabis). Principal investigators: Centre Hospitalier Universitaire de Yopougon, Abidjan, Côte d’Ivoire (C. Welffens-Ekra), Maternité Cochin Port-Royal, Paris, France (L. Mandelbrot). Abidjan Center (Côte d’Ivoire): CeDReS, Centre Hospitalier Universitaire de Treichville (D. Bonard, P. Combe, N. Elenga, R. Likikouet, C. Montcho, V. Noba, F. Sylla-Koko, I. Viho, B. You); Centre Hospitalier Universitaire de Yopougon (R. Camara, M. Dosso, M. Timité); DITRAME Project (G. Gourvellec, R. Ramon); ORSTOM Petit Bassam (P. Msellati, local coordinator) and the Health Centers of Anonkoua-Koute, Ouassakara, Yopougon-Attie and Yopougon. Bobo-Dioulasso Center (Burkina Faso): Centre Muraz/OCCGE (M. Cartoux, A.M. Cassel- Beraud, L. Gautier-Charpentier, O. Ky-Zerbo, O. Manigart, N. Meda (local coordinator), A Ouangré, O Sanou, A. Simonon, I. Sombié, S. Tiendrebeogo, S. Yaro); Centre Hospitalier National Sourô Sanou (A. Bazié, B. Dao, B. Nacro, F. Tall) and the Health Centers of Accart- Ville, Farakan and Social Security. Data management: INSERM U 330, Bordeaux (L. Dequae-Merchadou). Methodology: INSERM U 330, Bordeaux (V. Leroy, R. Salamon); Centre MURAZ/OCCGE (P. Van de Perre); Laboratoire de Virologie, Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, France (C. Rouzioux). Data and Safety Monitoring Board: J-F. Delfraissy (President), D. Costagliola and C. Chouquet (statisticians), B. Bazin, P. Lepage, B. Masquelier and K. Toure Coulibaly.

Corresponding author:

Olivier Manigart, Laboratoire de rétrovirologie, CRP-Santé, Rue Barblé, 4, L-1210 Luxembourg Tel: 00 (352) 44-11-61-05 Fax: 00 (352) 44-11-61- E-mail: [email protected]

260 Introduction

- Most of the mother-to-child (MTCT) transmission of HIV occurs during the intra-

partum period, particularly in developed countries (Rouzioux et al. AJE 1995. Mock et al.

AIDS 1999).

- HIV has been identified in both intracellular viral DNA and cell-free virions in genital

secretions.

- Recent studies have shown that high maternal HIV levels in plasma and cervico-

vaginal lavage are associated with increased risk of MTCT (Chuachoowong et al. JID

2000. Gaillard P. et al. AIDS 2000)

- But the relation between HIV in vaginal fluids (VF) and MTCT according to other

critical factors, such as plasma viral load or CD4 count has not been yet fully evaluated.

- Our present report is aimed to study the relationship between RNA levels in vaginal

fluids and the risk of risk of mother-to-child transmission (MTCT) of HIV-1 in African

children in the DITRAME ANRS 049a and 049b trials conducted in Abidjan, Côte

d’Ivoire and Bobo-Dioulasso, Burkina Faso.

261 Methods

Nested case-control study within the two placebo groups from two phase II randomised clinical trials conducted in Abidjan, Côte d'Ivoire and Bobo-Dioulasso, and assessing the tolerance of two interventions : a short-course maternal zidovudine (ZDV) regimen (ref) or of

Benzalkonium Chloride (BC) vaginal pessaries (ref). Consenting HIV-1 seropositive women were randomized at 36-38 weeks gestation to receive ZDV/BC or a matching placebo.

Pediatric HIV infection was defined as a positive HIV-1 PCR, or if aged >15 months, a positive HIV serologic test. For all women, with available CD4 cell count at entry , who did transmit HIV to their children (cases) and had samples available, viral load was measured in cervico-vaginal fluids at inclusion and/or one week after entry and were compared to women who did not transmit (two controls per case) comparable for trial and CD4 cell count strata.

Postnatal transmission (child with a negative PCR from a sample obtained at age >30 days who later became infected as defined above) were considered as uninfected controls in this analysis.

Maternal free HIV-1 RNA levels (Chiron bDNA or RNA Amplicor Roche assays ?) and cellular proviral DNA. Preparation of samples

– Vaginal fluid or vaginal lavage (3 ml of saline) collected at 36-38 weeks

– Diluted in buffer 20 to 40 times (except for lavage)

– Centrifugated and frozen at – 80°C

• Quantification of vaginal extra-cellular HIV RNA

– Extraction of extra-cellular HIV RNA by adsorption on silica (Organon).

– HIV-RNA level (expressed as HIV RNA copies per ml of fluid)

• Abidjan: HIV-1 RNA assay (bDNA Chiron v. 3.0) 200 HIV copies/mL

threshold

262 • Bobo: Amplicor HIV-1 Monitor assay (Roche v. 1.5)

• Quantification of vaginal cellular HIV DNA

– DNA extraction: Qiagen method after addition of HIV DNA internal standard of

Roche.

– HIV DNA: Amplicor HIV-1 Monitor test (Roche, v 1.5)

– Total cellular DNA: fluorometry in presence of Bisbenzimide (Pharmacia).

– The results are expressed as HIV DNA copies per million of cells.

Branched DNA assay with a threshold of sensitivity to detect 50 HIV RNA copies/mL (Bayer-Chiron, Quantiplex 340TM, version 3.0, E. Walpole, MA, USA) was used to measure maternal plasma HIV viral load at entry when available. Comparisons of maternal RNA levels between transmitting and non transmitting mothers and between treatment groups were made using Student t- test. Median CD4 count and maternal age were described and compared using Wilcoxon non parametric test. Mean maternal plasma RNA, RNA and proviral DNA in VF after log10 transformation were described and compared using the Kruskal-Wallis non parametric test. Univariate logistic regression analysis estimated the odds ratio of HIV transmission for maternal CD4 count, VF RNA level at entry, maternal log RNA at entry when available (only 049a), other known determinants of MTCT (low birth weight <2500g, prematurity<37 weeks of gestation, prolonged rupture of membranes≥4hours) and adjustment variables (trial, site). Trial, site, CD4 count, treatment variables and the variables associated in univariate analysis to MTCT of HIV with p <0.25 were included in a multivariate logistic regression stepwise descendant model.

263 Results

Between Sept. 1995 and May 1997: 121 women were enrolled within the placebo arms of 049a phase2 and 049b-Bobo trials. Two women lost to follow-up before delivery, five children with indeterminate HIV status, four mothers with indeterminate CD4 count

(including one peri-partum transmitter) and three women having delivered a stillbirth were not eligible for this analysis. Among the 107 women remaining eligible, 27 children were infected during the peri-partum period and 80 uninfected at time of delivery of whom five became later postnatal transmission cases. Maternal vaginal fluid samples were available and measurable for 20 cases out of the 27 mothers (74%) of children diagnosed as infected peri- partum and 62 controls were selected to be comparable to the 20 infected cases.

These two groups of women included and not included in the present study were comparable in terms of trial (p=0.37), median maternal maternal CD4 count (p=0.59), proportion of infected children (p=0.71), proportion of prematurity (p=0.28), prolonged rupture of membranes > 4h. (p=0.22) and C-section (0.99). Mothers who were included in the present analysis were more likely to come from the Bobo site than those not included, 49% vs. 12%, respectively (p=0.001) and were two years older, 24 years vs. 22 years, respectively

(p=0.01).

Median maternal CD4 count was significantly lower of 150 cells/mm3 among transmitting mothers (TM) compared to non transmitting mothers (NTM), (p=0.04), (Table 1). When available, HIV RNA in VF was detected in 52.6% of the TM and 20.4% of the NTM (p=0.0075). For those detectable values, mean HIV RNA was 0.81 log higher in TM than in NTM (p=0.04). There was no statistical difference between HIV RNA levels of TM and NTM for undetetectable values. Proviral DNA was detected in 87.5% of the 16 transmitting mothers samples available and 45.3% of the 53 non transmitters (p=0.0018). For those detectable values, HIV DNA was 0.42 log higher in TM than in NTM (p=0.025) while there was no statistical difference between undetectable HIV DNA levels of TM and NTM. Mean log plasma viral load was 1.15 log higher in TM than in NTM (p=0.0002).

Correlation log HIV RNA and log HIV DNA in VF (voir figures) 264

In logistic regression univariate analysis, log HIV RNA and HIV DNA in VF and log plasma HIV RNA were significantly associated with peri-partum MTCT (Table 2). Maternal plasma viral load was not documented well enough to be included in the final model. In the final multivariate model (15 cases, 45 controls) adjusting for maternal CD4 count, maternal

HIV RNA and HIV DNA in VF, only HIV DNA in VF remained independently associated with peri-partum MTCT (adjusted Odds Ratio [aOR]:3.9 for one log increase;95%

Confidence Interval [CI]: 1.05-14.4). HIV RNA in VF tended to be independently associated with peri-partum MTCT with reaching the significant level (aOR:2.1 for one log increase;95% CI: 0.89-5.2).

265 Discussion

This results supports the hypothesis that babies exposure to HIV-1 in birth canal is

strongly associated with the risk of peri-partum MTCT of HIV-1 in Africa. Consistent

with other studies.

Lack of statistical power to analyse the plasma viral load effect on MTCT.

There is a high priority to develop interventions aimed to reduce vaginal HIV-1 shedding in African pregnant women

Conclusion: Viral load in cervico-vaginal fluids at the end of pregnancy strongly predicts

MTCT of HIV during the in utero or intra-partum periods in Africa. Decreasing vaginal

HIV-1 shedding could reduce significantly MTCT of HIV. Further research is urgently

needed.

266 267 Table 1 : Baseline maternal CD4+ count, plasma log10 HIV-1 RNA levels, log HIV RNA and cellular HIV DNA in vaginal fluids (VF) according to the risk of peri-partum MTCT of HIV. Nested case-control study within the placebo arms of DITRAME ANRS 049a and 049b trials. Abidjan and Bobo-Dioulasso, 1995-1997. (N=82/107)

Baseline characteristics Transmitting mothers Non transmitting p-value N = 20/27 mothers N = 62/80 Median CD4+ count (IQR) 478 (306-692) 628 (395-809) 0.04*

Log HIV RNA/mL in VF n=19 n=54 Mean (standard error) 3.89 (0.78) 3.33 (0.62) 0.002 Min-Max 2.9-5.8 2.3-5.4 Detectable values n, (%) 10 (52.6) 11 (20.4) 0.0075** Mean (standard error) 4.27 (0.88) 3.46 (0.82) 0.04 Min-Max 2.9-5.8 2.6-5.4 Undetectable values n, (%) 9 (47.3) 43 (79.6) Mean (standard error) 3.46 (0.33) 3.29 (0.56) 0.40 Min-Max 3.0-3.9 2.3-4.9

Log HIV DNA/millions cells in VF n = 16 n = 53 Mean (standard error) 2.41 (0.44) 1.87 (0.60) 0.0015 Min-Max 1.6-3.3 0.6-3.2 Detectable values n, (%) 14 (87.5) 24 (45.3) 0.018** Mean (standard error) 2.43 (0.47) 2.01 (0.58) 0.025 Min-Max 1.6-3.3 1-3.0 Undetectable values n, (%) 2 (12.5) 29 (54.7) Mean (standard error) 2.25 (0.04) 1.75 (0.60) 0.25 Min-Max 2.2-2.3 0.6-3.2

Log plasma viral load n = 11 n = 30 Mean (standard error) 4.79 (0.56) 3.64 (0.84) 0.0002 Min-Max 3.8-5.5 1.7-5.2 IQR : inter-quartile range ; * Wilcoxon non parametric test ; ** Chi-square test.

268 Table 2: Maternal log HIV RNA and cellular HIV DNA in vaginal fluids (VF), plasma HIV-1 RNA levels, treatment group, and other determinants of peri-partum mother-to-child transmission of HIV-1. Univariate logistic regression. Nested case-control study within the plaebo arms of DITRAME ANRS 049a and 049b trials. Abidjan and Bobo-Dioulasso, 1995-1997. (N=82/107)

Transmitting mothers Non transmitting 95% confidence N = 20 mothers Odds ratio interval N = 62 Bobo-Dioulasso site (%) 50.0 48.3 0.93 0.3-2.6 a 049b trial/049a(%) 20.0 29.0 1.63 0.5-5.6 a Median maternal age (range) 25.5 (22-28) 24 (21-28) 1.57 c 0.6-3.8 Median CD4 cells/mm3 at entry 478 628 0.89 b 0.7-1.1 a d a Mean VF log10 HIV RNA at entry 3.89 3.33 3.13 1.4-7.2 d a Mean VF log10 HIV DNA at entry 2.41 1.87 5.66 1.7-18.3 d a Mean plasma log10 HIV RNA at entry 4.79 3.64 7.99 2.1-30.3 PROM e (>4 hours) (%) 31.3 21.2 1.69 0.5-5.9 Low birth-weight (<2 500g) (%) 5.0 13.3 0.34 0.04-2.9 Prematurity (<37 weeks of gest age) (%) 0 11.6 Not included - C-section (%) 0 3.4 Not included - a Variables included in the multivariate stepwise descendant logistic regression model. b for a decrease of 100 CD4. c for an increase of 10 years. d for one log increase. e Prolonged rupture of membranes.

269 Correlation between log10 HIV RNA and HIV DNA in VF according to the risk of peri-partum MTCT of HIV(N=60, p=0.34) (I: infected;NI:uninfected)

270 Correlation between plasma log10 HIV RNA and log10 HIV RNA in VF according to the risk of peri-partum MTCT of

HIV(N=25). (I: infected;NI:uninfected)

271 Correlation between plasma log10 HIV RNA and log10 HIV DNA in VF according to the risk of peri-partum MTCT of HIV(N=25). (I: infected;NI:uninfected)

272 Annexe 5 : Article 5 :

Effect of Perinatal Zidovudine Treatment on the Evolution of Cell-free HIV-1 in Breast Milk and on Postnatal Transmission

Manigart O., Crépin M., Leroy V., Meda N., Valéa D., Rouet F., Dequae Merchadoux L., Dabis F., Rouzioux C., Van De Perre P. for the DITRAME Study Group. JID, 2004;190:1422- 8.

273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 Annexe 6 : Article 6 :

Maternal vitamin A status and mother-to-child transmission of HIV in West Africa.

Castetbon K., Manigart O., Bonard D., Thomas M.J., Dumon M.F., Malvy D., Van de Perre P., Dabis F. for the DITRAME Study Group. AIDS. 2000, 14(7) : 908-9.

287 288 289 290 291 292 Annexe 7 : Article 7 :

Diversity of HIV-1 genetic subtypes in France, in the context of mother-to-child transmission

Chaix M.L., Manigart O., Letourneur F., Burgard M., Mayaux M.J., Rouzioux C. The French Pediatric Cohort Study Group. AIDS. 2000 Feb 18 ; 14(3) : 327-8.

293 294 295 296 Annexe 8 : Article 8 :

Identification of two superinfection in a cohort of commercial sex workers in Burkina Faso by a technique of autologuous heteroduplex mobility assay.

Manigart O, Courgnaud V, Sanou O, Valea D, Meda N, Ouangré A, Delaporte E, Van de Perre P, Peeters M. AIDS. 2004 Aug 20;18:1645-51.

297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 Annexe 9 : Article 9 :

Long term reduction of HIV transmission from mother to breastfed child by antiretrovirals : is more drugs better than less ?

Van De Perre P, Meda N, Manigart O. AIDS 2001;15(5):658-9.

307 308 309 310 Annexe 10 :

Tableau des essais vaccinaux dans le monde

311 312 Nom de Statut en août Prime Boost protocole 2003 Classe Producteur Produit Adjuvant Class Producteur Produit Adjuvant References J.Cohen, Science Vecteur Protéïne 302, 1309 (2003) Canarypox (clade subunit Burton &al, HIVNET Immunisations B Env, Gag, Pro, ALVAC (clade gp-120 Aluminum Science 303, 316 026 (n=160) complètes RT, Nef) Aventis Pasteur vCP1452 B Env) VaxGen MN hydroxide/thimerosol (2004) Vecteur Goepfert P, et al. Canarypox (clade ALVAC vCP 10th CROI, Feb HVTN Immunisations B Env, Gag, Pro, 1452 (high- 10-14, 2003; 039 (n=110) complètes RT, Nef) Aventis Pasteur dose) Boston. Abs #82 Inclusions aux USA; Date de démarrage Afrique HVTN du Sud : octobre VEE Vecteur 040 (n=96) 2003 (clade C Gag) AlphaVax AVX-101 Protéïne (clade B Nef-Tat Protéïne fusion + HVTN Immunisations clade B Env Nef Tat + 041 (n=84) complètes subunit) GlaxoSmithKline gp120W61D AS02A

DNA plasmidique (clade B Env, HVTN Immunisations Gag, Pro, RT, Emory Univ. (H. pGA2/JS2 045 (n=30) complètes Tat, Vpu, Rev) Robinson) DNA DNA plasmidique (poly-épitopique : Gag, Pol, Vpr, HVTN Nef, Rev, and 048 (n=42) Inclusions Env) Epimmune EP HIV-1090 Inclusions aux Vecteur HVTN USA; Date de adenoviral non- 050/Merck démarrage hors replicatif (clade MRKAd5 018 (n=435) USA : Août 2003 B Gag) Merck HIV-1 Gag

313 Nom de Date de Prime Boost protocole démarrage prévue Classe Producteur Produit Adjuvant Class Producteur Produit Adjuvant HVTN Vecteur Canarypox Lipopeptides (poly- Aventis Aventis ALVAC 042/ANRS Q1 2004 (clade B Env, Gag, epitopiques: clade B Pasteur/ LIPO-5 Pasteur vCP1452 VAC19 (n=174) Pro, RT, Nef) Gag, Pol, Nef) ANRS DNA plasmidique DNA HVTN (clade B Gag-Pol- VRC- plasmidique Q4 2003 NIH VRC 044 (n=60) Nef; clade HIVDNA-009 cytokine A,B,C Env) (IL2-Ig) Gag and Env gp140 SF-162 HVTN DNA plasmidique Protéïne subunit Q4 2003 Chiron DNA/PLG PLG Chiron Oligomérique, 049 (n=168) (clade B Gag, Env) (clade B Env) micro-particules V2-délétée HIV DNA plasmidique HVTN (clade B Gag-Pol- VRC- Q3 2003 NIH VRC Boost possible avec vecteur adénoviral vaccin VRC-HIVADV-010 052 (n=180) Nef; clade HIVDNA-009 A,B,C Env) Recombinant Saccharomyces HVTN Q4 2003 cerevisiae tué à la GlobeImmune HIVAX-GS 053 (n=116) chaleur (clade B Gag) Vecteurs adénoviraux non HVTN 054 réplicatifs (clade VRC- 2004 NIH VRC (n=364) B Gag-Pol- HIVADV-010 Nef; clade A,B,C Env) MVA vecteurs Vecteurs Fowlpox TBC- HVTN TBC-M358; Q4 2003 (clade B Env, Gag; Therion (clade B Env, Gag; Therion F357;TBC- 055 (n=150) TBC-M335 Tat, Rev, Nef, Pol) Tat, Rev, Nef, Pol) F349

314 DNA Wyeth Peptides (poly- plasmidique HVTN 056 multiepitope RC-529-SE, DNA plasmidique Q4 2003 epitopiques: clade B Wyeth Wyeth WLV003 cytokine (IL- (n=96) CTL peptide GM-CSF (clade B Gag) Env, Gag, Nef) 12) + vaccine bupivacaine DNA plasmidique DNA plasmidique TBD Q1 2004 Wyeth WLV003 cytokine (IL- Wyeth peptides (see 056 prime) (clade B Gag) 12) + bupivacaine DNA plasmidique Vecteurs MVA (poly-epitopic: Gag, (poly-epitopiques Bavarian- TBD 2004 Epimmune EP HIV-1233 MVA-mBN32 Pol, Vpr, Nef, Rev, : Gag, Pol, Vpr, Nordic Env) Nef, Rev, Env) DNA plasmidique (clade B Gag, Pro, HIVB DNA TBD 2004 GeoVax RT, Env, Tat, Rev, pGA2/JS7#2 Vpu) DNA plasmidiques SAAVI- (clade C Gag, RT, pThr.grttnC, TBD 2004 SAAVI Tat, Nef; clade SAAVI- C Env) pThr.gp150CT

Essai planifié :

Numéro de Date de Prime Boost Protocole démarrage Classe Producteur Produit Adjuvant Class Producteur Produit Adjuvant DNA plasmidique (clade Non-replicating VRC- VRC- HVTN B Gag-POL-Nef; clade adenoviral vectors (clade 2004 NIH VRC HIVDNA- B Gag-Pol-Nef; clade NIH VRC HIVADV- 204 (n=500) A Env; clade B Env; clade 009 A Env; clade B Env; clade 010 C Env) C Env)

315 Essai terminé :

Numéro de Année de fin Prime Boost Protocole de protocole Classe Producteur Produit Adjuvant Classe Producteur Produit Adjuvant

Vecteur Canarypox Protéïne AIDSVAX B/B HVTN Aventis ALVAC gel d’hydroxide 2003 (clade B Env, Gag, subunit (clade VaxGen (gp120 MN, 203 (n=330) Pasteur vCP1452 d’ aluminum Pro, RT, Nef) B Env) gp120 GNE8)

316 Annexe 11 :

Tableau des essais cliniques de PTME dans le monde

317 318

Nom de Molécules et posologie Efficacité Evolution/ Remarques/ l’essai observée Allaitement (Pays) Pays en développement : Bangkok AZT : (300 mg 2X/jr) + ttes 3h pdt 9,4 vs 18,9% Terminé (Thaïlande) CDC (13) accoucht (p=0,006) NON RETRO- AZT : (300 mg 2X/jr) + ttes 3h pdt 15,7 vs 24,9% M3 Terminé arrêté (Côte CI(14) accoucht (p=0,07) après résultats d’Ivoire) Bangkok CDC OUI PETRA AZT+Lamivudine : 15 (1) vs 18 (2) vs Terminé (Ouganda, (15) 1) avt+pdt+après accoucht 20 (3) vs 22% (4) En février Afrique du (mères et enfants) à 18 mois 1998 : Sud, 2) Idem 7,0 vs 11,6 vs suppression Tanzanie) Pdt+après(mères et enfts) 17,5 vs 18,1% à 6 placebo Augmentation 3) Idem semaines OUI importante Pdt due à 4) Placebo l’allaitement HIVNET NVP vs AZT : A M4 : Terminé (Ouganda) 012 (16) NVP : 200mg mère 1X 13,1% NVP OUI Problème 2 mg/Kg enft 1X (72h) 25,1% AZT avec FDA AZT : 600 mg pdt accoucht 4mg/Kg/jr nouveau-né 7jrs HIVNET NVP : Terminé But : obtenir 023 (17) 1) 4 mg/Kg 1X/sem ; J14 8 OUI un taux mg/Kg 1X/sem sérique de 2) 4 mg/Kg 2X/sem ; J14 8 NVP> mg/Kg 1X/sem 100mg/ml 3) 2 mg/Kg/jr : J14 : 4 (enfts allaités mg/Kg/jr Æ M6) Après prophylaxie classique NVP SAINT NVP vs AZT+lamivudine Terminé (Afrique du (18) Sud) NTPHPT AZT (Thaïlande) (19) 1) Mère : 3 mois avt accoucht + à l’accoucht Enfant : 6 semaines 2) Mère : 3 mois avt accoucht + à l’accoucht Enfant : 3 jours 3) Mère : 6 semaines avt accoucht + à l’accoucht Enfant : 6 semaines 4) Mère : 6 semaines avt accoucht + à l’accoucht Enfant : 3 jours Coutsoudi Vitamine A Pas de différence Terminé Pas de s démontrée sur la démonstration TME d’un effet de Essai mis à profit pour analyser Allaitement la Vit A sur la les pratiques d’allaitement : exclusif : 14,6% PTME Allaitement artificiel : 24,1%

319 P=0,03 ANRS Démarré 1271 Pays industrialisés

ACTG AZT NON (France, USA) 076 (8, 9) 24ème semaine d’aménorrhée (500 mg/jr), IV durant travail (2 mg/kg, 1 h, 1 mg/kg entretien) ; enft : 8 mg/kg/jr, 6 semaines ACTG Désinfection vaginale NON 185 (=) NYCPT AZT NON New York (19) 1) avant accoucht 1) 6,,4% City (USA) : 2) en cours d’accoucht 2) 10% Femmes hors 3) 48 premières h de vie de 3) 9,3% protocoles l’enfant 4) 18,4% venant 4) 3 jrs ou + après accoucht Pas traitt = 26,6% accoucher en catastrophe P2C2 NON PENTA 5 Chez l’enft : NON 1) AZT+lamivudine 2) AZT+abacavir 3) Lamivudine+abacavir INCAS NON PACTG Vaccination de l’enft endéans 72 h Toléré et En cours (USA) 326 (=) de vie, 4, 8, et 12 jrs. immunogénique NON 1) Alvac-HIV vCP1452 2) Aids Vax B/B + 1452 3) Saline placebo 4) Saline pla + alum pla

PACTG NVP versus Pla chez des femmes Evaluation de Arrêté Le taux de 316 (=, =) recevant une thérapie standard l’apparition de NON TME attendu résistances = 15% de 5% s’est (près de 10%= révélé K103N) inférieur (USA, Europe) PACTG Protocole nutritionnel après En cours (USA) 247 (=) prophylaxie AZT (ACTG 076) NON PACTG NFV/3TC/AZT NON 353 (=) Prévention de la transmission par l’allaitement : Prophylaxie ARV de l’enfant pendant une courte période (1 semaine) Nom et type d’essai Antepartum Intrapartum Postpartum Statut Prophylaxie néonatale Pas de prophylaxie Pas de prophylaxie Bras 1 : NVP x 1 Recrutement post-exposition Malawi (2mg/kg) arrêté / DSMB

Essai randomisé Bras 2 : NVP x 1 contrôlé – Mères non (2mg/kg)+ ZDV dépistées (4mg/kg) 1 sem

320 Prophylaxie néonatale Pas de prophylaxie Pas de prophylaxie Bras 1 : NVP x 1 terminé post-exposition Afrique (2mg/kg) du Sud Bras 2 : ZDV x 1 Essai randomisé (4mg/kg) 6 sem contrôlé – Mères non dépistées ANRS1201DitramePlus ZDV (300 mg) à ZDV (600 mg)+ NVP chez le En cours Côte d’Ivoire partir de 36 sem NVP (200 mg) à nouveau-né partir du début du uniquement x 1 (2 Essai ouvert Depuis jan03 travail mg/kg) + ZDV (2 Comparaison avec les ZDV+3TC à partir mg/kg) 1 sem résultats poolés de 32 sem Depuis jan03 d’Afrique de l’Ouest ZDV+3TC Prophylaxie ARV de l’enfant pendant une période intermédiaire (4-6 semaines) Prevention of Mother to ZDV (300 mg) à NVP x 1 (2mg/kg) 1 : NVP x 1 En cours ème Infant HIV partir de 36 sem en début de travail (2mg/kg)+ 2 sem Recrutement à M6 Vit + NVP 0,5 Transmission in India ml/J démarré en Essai randomise 2 : NVP x 1 août 02 (2mg/kg)+ 2ème sem à M6 Vit Projet NIGAT ZDV (300 mg) à NVP x 1 (2mg/kg) 1 : NVP x 1 En cours ème Ethiopie partir de 36 sem en début de travail (2mg/kg)+ 2 sem Recrutement à M6 Vit + NVP 0,5 Essai randomisé ml/J démarré en 2 : NVP x 1 février 01 (2mg/kg)+ 2ème sem à M6 Vit HIV1GLOB/NVP Bras 1 : rien NVP x 1 (200mg) 1 : NVP x 1 Stade projet Ouganda en début de travail (2mg/kg) NVP x 1 (200mg) 2 : NVP x 1 Essai randomisé Bras 2 : rien en début de travail (2mg/kg)+ 2ème sem NVP x 1 (200mg) à M6 NVP 0,5 ml/J en début de travail 3 : NVP x1 Bras 3 : (2mg/kg) + HIV1GLOB à 37- HIV1GLOB 38 sem endéans les 18h

Prophylaxie ARV de l’enfant pendant une période prolongée (6 mois) SIMBA ZDV + DDI à ZDV/3h + DDI Bras 1 : Terminé ème Rwanda-Ouganda partir de la 36 Mère :ZDV+DDI Premiers sem Pdt 1 sem Essai randomisé Nouveau-né :3TC 6 résultats mois attendus (mi- Bras 2 : 2004) Mère :ZDV+DDI En cours Pdt 1 sem Allaitement Nouveau-né :NVP 6 exclusif pour mois 90% des femmes MITRA ZDV + 3TC à ZDV toutes les 3 3TC pdt 6 mois Démarré ème Tanzanie partir de la 36 heures + 3TC Essai ouvert sem Mashi Study ZDV (300 mg) à Bras 1 :ZDV - ½ randomisée En cours Botswana partir de 34 sem toutes les 3 h pour allaiter 6 mois Recrutement Bras 2 : ZDV + ZDV Essai randomise toutes les 3 h + - ½ allaitement démarré en 01

321 NVP en début de artificiel + ZDV 4 mars 01 travail sem - NVP x 1 - ½ randomisée pour allaiter 6 mois + ZDV - ½ allaitement artificiel + ZDV 4 sem HTPN 046 Pas de prophylaxie NVP x 1 (200mg) Bras 1 : NVP x 1 Planifié Afrique du Sud, en début de travail Bras 2 : NVP x 1/J pendant 6 mois Tanzanie, Ouganda, (avec incrément de Zimbabwe 6 à 28 mg/J) Essai randomisé Thérapie ARV de la mère – HAART (6 mois) Kisumu Breastfeeding ZDV+3TC+NVP ZDV+3TC+NVP Mère : Planifié Study A partir de 34 sem ZDV+3TC+NVP pdt 6 mois et plus si Kenya SIDA Phase II ouvert – Nouveau-né : NVP Comparaison avec x 1 HIVNET012 Etude Kesho Bora 1 : 1 : Mères : Recrutement Burkina Faso, Kenya, ZDV+3TC+NVP ZDV+3TC+NVP si en 2003 Tanzanie 1 : possible pour la vie ZDV+3TC+NVP 1 : à partir de 34 2 : Mères à CD4<200 : sem ZDV x 1 + NVP x 2 : Mères : Modalités essai ouvert 1 en début de ZDV+3TC+NVP particulières 2 : 2 : travail pour 6 mois selon le type Bras 1 : 200 500 : Bras 2 : ZDV à 3 : ZDV x 1 + 3 : rien Essai ouvert partir de 34 sem NVP x 1 en début 3 : ZDV à partir de de travail 36 sem UNC-CDC Toutes les femmes NVP x 1 et Toutes les mères Démarrage des collaborative Study to reçoivent une ZDV+3TC pdt 7 J reçoivent 2kg de inclusions consultation farine de maïs et un decrease MTCT of HIV prénatale et un aliment de juillet 2003 during breastfeeding in comptage CD4. substitution de Malawi Celles à Hg<7mg l’allaitement Malawi ou CD4<200 Bras 1 : supplément Essai randomisé cellules/mm3 sont nutritionnel à la inéligibles pour mère 2 X/ J University of North l’essai, mais prises Groupe A : California – Center of en charge sous Mères : Diseases Control HAART ZDV+3TC+NVP pour 28 sem Groupe B : Nouveau-né : NVP x 1/J pendant 28 sem (avec incrément de 6 à 28 mg/J) Groupe C : Nouveau-né : NVP

322 x 1 à la naissance et 7 J ZDV+3TC Bras 2 : Pas de supplémentation nutritionnelle des mères/ Idem pour les trois groupes D’après Gaillard P, Fowler MG, Dabis F et al. Use of antiretroviral drugs to prevent HIV-1 transmission through breast-feeding : from animal studies to randomized clinical trials. J Acquir Immune Defic Syndr.2004;35:178-187

323