Développement D'outils Et De Ressources Moléculaires Pour L'utilisation De L'espèce Hebeloma Cylindrosporum Comme Modèle D'étude De La Symbiose Ectomycorhizienne
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Développement d’outils et de ressources moléculaires pour l’utilisation de l’espèce Hebeloma cylindrosporum comme modèle d’étude de la symbiose ectomycorhizienne Raphaël Lambilliotte To cite this version: Raphaël Lambilliotte. Développement d’outils et de ressources moléculaires pour l’utilisation de l’espèce Hebeloma cylindrosporum comme modèle d’étude de la symbiose ectomycorhizienne. Biochimie, Biologie Moléculaire. Université de montpellier 2, 2004. Français. tel-02551724 HAL Id: tel-02551724 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02551724 Submitted on 23 Apr 2020 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. UNIVERSITE MONTPELLIER II SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE MONTPELLIER II Discipline : Physiologie Formation doctorale : Développement et adaptation des plantes Ecole Doctorale : Biologie intégrative présentée et soutenue publiquement par Raphaël Lambilliotte Le 21 décembre 2004 Titre : Développement d'outils et de ressources moléculaires pour l'utilisation de l'espèce Hebeloma cylindrosporum comme modèle d'étude de la symbiose ectomycorhizienne Travail réalisé dans le laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes UMR 5004 Agro-M/CNRS/INRA/Université Montpellier II 2, Place Viala 34060 Montpellier cedex 1 JURY : M. Richard Cooke, Directeur de Recherche, CNRS Perpignan Rapporteur M. Francis Martin, Directeur de Recherche, INRA Nancy Rapporteur M. Roland Marmeisse, Chargé de Recherche, CNRS Lyon Examinateur M. Bruno Touraine, Professeur, Université Montpellier II Président du jury Mme Sabine Zimmermann, Chargé de recherche, CNRS Montpellier Co-directrice de thèse M. Hervé Sentenac, Directeur de Recherche, INRA Montpellier Directeur de thèse Six années déjà, beaucoup d'eau a coulé sous le pont depuis mon arrivée au Laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaires des Plantes. Ces années ont été difficiles pour moi et j'ai vécu cette période comme une épreuve que je n'ai guère savourée. Pourtant, cela m'a permis d'acquérir des bases solides pour appréhender le présent et le futur sereinement avec dorénavant une démarche qui m'est propre. C'est en quoi cette expérience a été essentielle et j'exprime ici toute ma gratitude aux nombreux Êtres que j'ai côtoyés et rencontrés. La richesse de ces contacts et échanges de par leur large diversité ont été pour moi une source de réflexion et de prise de conscience extraordinaire. J'éprouve un profond respect et une grande reconnaissance à ces Êtres qui de façon brève ou prolongée, ponctuelle ou soutenue ont été présents et ont contribué à ce travail de thèse. Merci Abréviations ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire ADNg: ADN génomique ARN: acide ribonucléique ARNm: ARN messager BEt: bromure d'éthydium BSA: albumine de sérum de bœuf CI: mélange chloroforme/alcool isoamylique (48/2) DEPC: diéthylpyrocarbonate dNTP: désoxyribonucléotide triphosphate DTT: dithiothréitol EDTA: acide ethylènediaminetétraacétique GUS: ß-glucuronidase kb: kilopaire de bases LB: milieu de Luria et Bertani -1 LBM: milieu LB additioné 0,2% de maltose et 10 mmol.L de MgSO4 nt: nucléotide pb: paire de bases PCI: mélange phénol/chloroforme/alcool isoamylique (50/48/2) PCR: réaction en chaine à la polymérase PEG: polyéthylène glycol p/v: rapport poids/volume RACE: amplification rapide des extrémités d'ADNc RLM-RACE: amplification rapide des extrémités d'ADNc médiatisé par l'ARN ligase rpm: rotation par minute SDS: dodécylsulfate de sodium SSC: solution de chlorure de sodium 3M et de citrate trisodique 0,03 M TE: tampon tris-EDTA TEA: tétraéthyl ammonium Tris: tris-(hydroxyméthyl)aminométhane v/v: rapport volume/volume Table des matières Table des matières.............................................................................................................1 Introduction générale ........................................................................................................4 Chapitre 1 Données bibliographiques: Mycorhization, nutrition minérale de la plante et transports membranaires..............................................................................................5 1.1. Les différents types de mycorhize..................................................................................... 5 1.2. Effets favorables de l'ectomycorhization sur la nutrition minérale de l'arbre............... 6 1.3. Exploration du sol et coût énergétique de la fonction de nutrition minérale ................ 7 Annexe 1 du chapitre 1 An update on nutrient transport processes in ectomycorrhizas.................................................................................................................8 Annexe 2 du chapitre 1 Hebeloma cylindrosporum – a model species to study ectomycorrhizal symbiosis from gene to ecosystem .....................................................9 Chapitre 2 Matériel et Méthodes. ....................................................................................10 2.1. Matériel fongique et conditions de culture ..................................................................... 10 2.1.1. Souches utilisées ....................................................................................................................... 10 2.1.2. Milieux de culture ....................................................................................................................... 10 2.1.3. Conditions de culture.................................................................................................................. 11 2.2. Méthodes de biologie moléculaire................................................................................... 12 2.2.1. Les banques utilisées................................................................................................................. 12 2.2.1.1. La banque d’ADNc................................................................................................................. 12 2.2.1.2. La banque génomique ........................................................................................................... 12 2.2.2. Criblage de la banque d'ADN génomique.................................................................................. 12 2.2.3. Extraction d’ADN de phages ...................................................................................................... 13 2.2.4. Complémentation fonctionnelle de mutants de levure par la banque d'ADNc........................... 14 2.2.5. Purification de l'ADN génomique d'Hebeloma ........................................................................... 14 2.2.6. Purification des ARN d’H. cylindrosporum ................................................................................. 15 1 2.2.7. Hybridations moléculaires: Southern et northern blots .............................................................. 15 2.2.8. Amplification des acides nucléiques par PCR ........................................................................... 16 2.2.9. Amplification des régions manquantes des ADNc par RACE-PCR........................................... 17 2.2.9.1. RACE-PCR classique ............................................................................................................ 17 2.2.9.2. Utilisation du kit "FirstChoice® RLM RACE" d'Ambion.......................................................... 18 2.2.10. Production et ordonnancement d'une banque d'ADNc .............................................................. 18 2.3. Analyses bioinformatiques............................................................................................... 19 2.3.1. Matériel et logiciels..................................................................................................................... 19 2.3.2. Traitement des séquences et analyse de la ressource d'étiquettes .......................................... 20 Chapitre 3 Participation au développement d'Hebeloma cylindrosporum en tant qu'espèce modèle: construction d'une banque d'ADNc et d'une ressource d'étiquettes. ......................................................................................................................22 Chapitre 4 Identification d'un canal potassique de la famille Shaker chez Hebeloma cylindrosporum................................................................................................................23 4.1. Eléments bibliographiques............................................................................................... 23 4.1.1. Rôles du potassium dans la cellule............................................................................................ 23 4.1.2. Les systèmes de transport de K+ chez les plantes et chez les champignons: données cinétiques et électrophysiologiques ......................................................................................................... 24 4.1.2.1. Données chez les plantes...................................................................................................... 24 4.1.2.2. Données chez les levures et champignons filamenteux.......................................................