Az FHR-1, FHR-3 És FHR-5 H-Faktorral Rokon Fehérjék Szerepe a Komplementrendszer Szabályozásában Doktori Értekezés

Az FHR-1, FHR-3 és FHR-5 H-faktorral rokon fehérjék szerepe a komplementrendszer szabályozásában Doktori értekezés

Csincsi Ádám István

Témavezető: Dr. Józsi Mihály, DSc, egyetemi docens

Biológia Doktori Iskola Immunológia Program

Doktori Iskola és Program vezető: Prof. Erdei Anna, DSc, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja

ELTE TTK Biológiai Intézet, Immunológiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Budapest

2018

A disszertációban ismertetett kutatásokat a Magyar Tudományos Akadémia (LP2012-43 sz. pályázat) és a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal (K 109055 sz. pályázat) támogatta.

Dr. Tóth Adriánnak

Tartalomjegyzék

Rövidítésjegyzék ...... 6 1. Bevezetés ...... 8 2. Irodalmi összefoglalás ...... 9 2.1. Az emberi komplementrendszer ...... 9 2.2. A komplementrendszer szabályozása ...... 12 2.2.1. A klasszikus, a lektin és a terminális utak szabályozása ...... 12 2.2.2. Az alternatív komplement út szabályozása ...... 13 2.3. A H-faktor molekulacsalád ...... 14 2.3.1. Az FHR fehérjéket kódoló gének ...... 16 2.3.2. Az FHR fehérjék szerkezete és tulajdonságaik ...... 17 2.3.3. Az FHR fehérjék és betegségek kapcsolata ...... 20 2.4. A tárgyalt betegségekkel kapcsolatos FH/FHR ligandumok ...... 27 2.4.1. A C3b ...... 27 2.4.2. A pentraxinok ...... 28 2.4.3. Az extracelluláris mátrix (ECM) ...... 30 2.4.4. A malondialdehid (MDA) ...... 31 3. Célkitűzések ...... 32 4. Felhasznált anyagok és módszerek ...... 33 4.1. A felhasznált anyagok ...... 33 4.1.1. Fehérjék és ellenanyagok ...... 33 4.1.2. Szérumok ...... 34 4.1.3. Pufferek és egyéb reagensek ...... 35 4.1.4. Az mCRP előállítása CRP-ből denaturációval ...... 37 4.2. Az alkalmazott módszerek ...... 37 4.2.1. Fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatása ...... 37 4.2.2. Kompetíciós kísérletek ...... 38 4.2.3. Kofaktor esszék ...... 38 4.2.4. In vitro alternatív C3-konvertáz esszék ...... 40 4.2.5. Komplementaktivációs kísérletek...... 41 4.2.6. Statisztikai analízis ...... 42 5. Eredmények ...... 43 5.1. Az FHR-1 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata ...... 43 5.1.1. Az FHR-1 kötődése CRP-hez ...... 43 5.1.2. Az mCRP kötőhely azonosítása az FHR-1-ben ...... 48 5.1.3. Az FHR-1 és a FH közötti kompetíció az mCRP kötésért ...... 49 5.1.4. Az FHR-1 szerepének vizsgálata a C3-konvertáz és a terminális út szintjén in vitro ...... 51 5.1.5. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-1-en ...... 53

5.2. Az FHR-3 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata ...... 56 5.2.1. Az FHR-3 kofaktor aktivitásának vizsgálata ...... 56 5.2.2. Pentraxinok kötődése FHR-3-hoz ...... 57 5.2.3. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-3 fehérjén ...... 58 5.2.4. Az FHR-3 komplement működésre gyakorolt hatása pentraxin ligandumokon ...... 62 5.2.5. Az FHR-3 kompetíciója FH-ral malondialdehiden ...... 62 5.3. Az FHR-5 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata ...... 65 5.3.1. Az FHR-5 kötődése PTX3-hoz ...... 65 5.3.2. Az FHR-5 – PTX3 kölcsönhatás jellemzése ...... 67 5.3.3. A C3b és a C1q hatása az FHR-5 – PTX3 kölcsönhatásra ...... 70 5.3.4. Az FHR-5 gátolja a FH – PTX3 kölcsönhatást ...... 71 5.3.5. Az FHR-5 kötődése a CRP módosult formájához és ennek következménye ...... 72 5.3.6. Az FHR-5 kölcsönhatása az extracelluláris mátrixszal ...... 74 5.3.7. Az FHR-5 és FH kompetíciója humán szérumban ...... 76 5.3.8. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-5-ön ...... 77 6. Diszkusszió ...... 80 6.1. Az FHR-1, az FHR-3 és az FHR-5 komplementaktivációt gátló szerepének vizsgálata in vitro ...... 81 6.2. Az FHR-1, az FHR-3 és az FHR-5 közvetlen szerepe az alternatív út C3- konvertázának képződésében in vitro ...... 83 6.3. Az FHR-1 kölcsönhatása CRP-vel ...... 83 6.4. Az FHR-3 kölcsönhatása pentraxinokkal és malondialdehiddel ...... 86 6.5. Az FHR-5 kölcsönhatása pentraxinokkal és az extracelluláris mátrixszal ...... 87 6.6. Összegzés, kitekintés ...... 90 7. Összefoglalás ...... 91 Irodalomjegyzék ...... 93 Köszönetnyilvánítás ...... 103

Rövidítésjegyzék

A dolgozatban bemutatott H-faktor molekulacsalád, valamint a többi komplement komponens elnevezése során figyelembe vettem a legutóbbi, nevezéktanra vonatkozó ajánlást [Kemper 2014]. Ennek alapján a H-faktor fehérjecsalád tagjainak elnevezése:

H-faktor FH H-faktor szerű fehérje FHL-1 H-faktorral rokon fehérje 1 FHR-1 H-faktorral rokon fehérje 2 FHR-2 H-faktorral rokon fehérje 3 FHR-3 H-faktorral rokon fehérje 4 FHR-4 H-faktorral rokon fehérje 5 FHR-5

A disszertációban előforduló egyéb rövidítések:

aHUS atípusos hemolítikus urémiás szindróma AMD időskori makuladegeneráció (age-related macular degeneration) ANOVA varianciaanalízis (analysis of variance) BSA szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin) CARPA komplementaktivációval kapcsolatos pszeudoallergiás reakció (complement activation-related pseudoallergy) C3G C3 glomerulopátia C3GN C3 glomerulonefritisz C4BP C4b-kötő fehérje (C4b-binding protein) CCP komplement-szabályozó fehérje [domén] (complement control protein [domain]) CD59 MAC-inhibitor fehérje (cluster of differentiation 59) CHO kínai hörcsög ovárium sejtvonal (chinese hamster ovary cells) CR1 komplement receptor 1 CRP C-reaktív protein DAF bomlást gyorsító faktor (decay accelerating factor) DDD dense deposit disease DNS dezoxiribonukleinsav DPBS Dulbecco-féle foszfát pufferes sóoldat (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) ECM extracelluláris mátrix EDTA etilén-diamin-tetraecetsav (ethylenediaminetetraacetic acid) EGTA etilénglikol-bis-(β-aminoetiléter)-N,N,N'N'-tetraecetsav (ethylene glycol-bis(β- aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) FB B-faktor

FD D-faktor FI I-faktor FP P-faktor, properdin HRP tormaperoxidáz [enzim] (horseradish peroxidase) HSA emberi szérum albumin (human serum albumin) HUVEC emberi köldökvéna endotélsejtek (human umbilical vein endothelial cells) IgAN IgA (immunglobulin A) nefropátia IL-1(β), -10 interleukin-1(β), interleukin-10 LDL alacsony sűrűségű lipoprotein (low-density lipoprotein) MAC membránkárosító komplex (membrane attack complex) MASP1, -2 MBL-asszociált szerin proteáz 1, 2 MaxGel ECM-et modellező folyadék márkaneve MBL mannózkötő lektin (mannose-binding lectin) MCP membrán kofaktor fehérje (membrane cofactor protein) mCRP monomer (denaturált) CRP mRNS messenger (hírvivő) ribonukleinsav mutFHR-5 mutáns FHR-5 (ld. 25. oldal) NET neutrofil extracelluláris csapda (neutrophil extracellular trap) NHS normál humán szérum NPTX, -2 neuronális pentraxin, neuronális pentraxin 2 NPTXR neuronális pentraxin receptor pCRP pentamer (natív) CRP PTX3, -4 pentraxin 3, pentraxin 4 RCA komplementaktivációt szabályozó molekulák [génklaszter neve] (regulators of complement activation) ROI, ROS reaktív oxigén intermedierek (reactive oxigen intermediers/species) SAP szérum amiloid P SCR short consensus repeat [domén neve] SD standard deviáció SDS nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulfate) SDS-PAGE nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) SEM standard hiba (standard error of the mean) Sf9 Spodoptera frugiperda ovárium sejtvonal SLE szisztémás lupusz eritematózusz TMB 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin TNF-α tumor nekrózis faktor alfa Tween 20 polioxietilén(20)-szorbitán-laurát, poliszorbát 20, E432

A dolgozatban előforduló aminosavak: C (cisztein), H (hisztidin), S (szerin), T (treonin), W (triptofán), Y (tirozin).

1. Bevezetés

A veleszületett immunitás részeként a komplementrendszer nélkülözhetetlen a kórokozók, apoptotikus sejtek, immunkomplexek szervezetből történő eltávolításában. Ugyanakkor az adaptív immunrendszerrel való kölcsönhatásai és sok más élettani folyamatban való részvétele miatt a szervezet egész immunhomeosztázisának fenntartásában fontos szerepe van. A kaszkádszerűen működő enzimrendszer szabályozása ezért rendkívül fontos, és ezt a funkciót számos, a komplementrendszer aktivációjának különböző szintjein ható szabályozó molekula látja el. A komplement talán leghatékonyabb ágának, az alternatív útnak a fő regulátora a H-faktor. Az egyébként oldékony molekula, főként polianionos természetű ligandumokhoz kötődve, a sejtek felszínén is képes a komplementaktiváció hatékony gátlására. Az 1991-2001 időszakban egymás után fedeztek fel olyan fehérjéket, amelyek a H- faktorral igen szoros szerkezeti rokonságban állnak. Éppen a nagyfokú hasonlóság miatt kezdetben feltételezték, hogy ezek a fehérjék „kis H-faktorként” működnek, és nem tulajdonítottak nekik nagy jelentőséget. Azonban nem elhanyagolható tény, hogy ezekből a fehérjékből hiányoznak azok a domének, amelyekkel homológ domének a H-faktorban a regulátor funkciót látják el. Ráadásul a felfedezésüket követő elmúlt csaknem 20 évben egyre több, főként genetikai vizsgálat eredménye látott napvilágot, amelyekben ezeknek a fehérjéknek egyes betegségekkel való kapcsolatát írták le. Dolgozatomban a H-faktor molekulacsalád bemutatása után röviden ismertetem azokat a betegségeket, amelyekben leginkább ismert a H-faktorral rokon fehérjék szerepe. Az irodalmi és módszertani áttekintés után pedig bemutatom azokat a kísérleti eredményeinket, amelyek talán közelebb vihetnek minket a fehérjék komplementaktivációban, illetve a betegségek patomechanizmusában játszott szerepének megértéséhez.

2. Irodalmi összefoglalás

2.1. Az emberi komplementrendszer

A komplementrendszer a vérben és egyéb testnedvekben alapvetően inaktív állapotban jelenlévő, egymást kaszkádszerűen aktiválni képes oldékony faktorok, a hasítási termékeket felismerő receptorok és az enzimrendszert szigorú szabályozás alatt tartó regulátor molekulák komplex rendszere [Erdei 2006]. Hagyományosan a komplementrendszert a veleszületett immunitás első védelmi vonalának tekintjük, melynek végső célja a szervezetbe jutó patogén mikroorganizmusok hatástalanítása, eliminálása. Ma azonban már jól tudjuk, hogy a komplement a mikroorganizmusok elleni effektor mechanizmuson túlmenően fontos szerepet játszik többek között az apoptotikus és nekrotikus sejtek, valamint az immunkomplexek eltávolításában, az angiogenezisben, a szöveti regenerációban, és nem utolsó sorban az adaptív immunrendszerrel való szoros együttműködése is elengedhetetlen az immunhomeosztázis fenntartásában [Ricklin 2010]. Az enzimrendszer alapvetően három különböző úton aktiválódhat: a klasszikus, az alternatív és a mannózkötő lektin (mannose-binding lectin, MBL) által indukált úton (2.1. ábra). A klasszikus utat elsősorban immunkomplexben lévő ellenanyagok képesek elindítani a C1 molekulakomplexhez tartozó C1q alegységgel való kölcsönhatás során. A kötődés eredménye a C1r és C1s alegységek aktiválódása, aminek következménye a C2 és C4 komponensek proteolízise. A két fehérje nagyobbik fragmenseiből kialakul a klasszikus út C3-konvertáza (C4b2b). A konvertáz hasítja a C3 molekulát és a képződő C3b fragmens a C3-konvertázhoz kötődve kialakítja a klasszikus C5-konvertáz enzimkomplexet (C4b2b3b). A C5 hasítása során képződő C5b fragmens kovalensen a közelben lévő felszínhez kötődhet, ezzel megindulhat a komplementaktiváció terminális útja (ld. később). A C3, illetve a C5 fehérjék hasadása során képződő kis molekulatömegű peptidek (C3a, illetve C5a) fontos élettani funkcióval bíró molekulák. Az erek áteresztőképességét fokozzák, elősegítik a gyulladást közvetítő anyagok felszabadulását, tehát anafilatoxikus hatásúak. Elsősorban a neutrofil granulocitákra ható kemotaktikus aktivitással is rendelkeznek. Az ún. lektin út aktiválódása főként a baktériumok és gombák falában található szénhidrátoknak köszönhető. A mannózkötő lektin, vagy a fikolinok felismerik ezen szénhidrátokat, és a hozzájuk kapcsolódó enzimeket aktiválva szintén a C2 és C4 komponensek hasítását eredményezik. Ettől a ponttól kezdve a lektin út a klasszikus úton halad tovább [Walport 2001, Erdei 2006].

2.1. ábra. A komplementrendszer alapvető mechanizmusai vázlatosan. Az ábra a klasszikus, a lektin és az alternatív utak aktiválódását, illetve a membránkárosító komplex (membrane attack complex, MAC) képződését mutatja sematikusan. MBL: mannózkötő lektin (mannose-binding lectin), MASP1, -2: MBL-asszociált szerin proteáz 1, 2. Forrás: Erdei 2006, Merle 2015.

Az alternatív út mechanizmusa jelentősen eltér a másik két út működésétől. Tulajdonképpen az alternatív út – patogének jelenlététől függetlenül – a szervezetben folyamatosan aktív, mely a központi C3 komponensben található tioészter kötés spontán hidrolízisének köszönhető. Az így kialakuló C3(H2O) molekulához kötődő B-faktort (FB) a D- faktor (FD) hasítja, és kialakul a C3(H2O)Bb jelzésű komplex. Utóbbi képes a C3 molekula hasítására, tehát (fluid fázisú) C3-konvertázként működik. A konvertáz működésének eredménye a C3 fehérje C3a és C3b fragmentumokra történő hasadása. A kisebbik fragmens (C3a) fontos szerepet tölt be a gyulladási folyamatokban és az adaptív immunrendszerrel való kapcsolatban is. A nagyobbik, C3b fragmensen feltáruló tioészterkötés lehetővé teszi a közelben lévő struktúrák OH- és NH2-csoportjaival való reakciót, tehát a C3b felszínhez történő kovalens kötődését. Amennyiben a C3b közvetlen közelében nem található alkalmas felszín, a molekula igen rövid, milliszekundum nagyságrendű idő alatt inaktiválódik. A felszínen lévő C3b-hez – hasonlóan a fluid fázisú C3-konvertáz létrejöttéhez – kötődik a B-faktor, amit a D-faktor hasítani képes. Az így kialakuló C3bBb komplex az alternatív út szilárd fázisú C3-konvertáz enzime. A bimolekuláris konvertáz labilis, felezési ideje mintegy 90 s [Xu 2001], ezt részben ellensúlyozza a konvertázhoz kötődő és azt stabilizáló properdin (FP, P-faktor). A konvertáz működése során újabb C3 molekulák hasítódnak, és az enzim működésének köszönhetően felerősödik a komplementaktiváció. Fontos kiemelni, hogy az alternatív út szilárd fázisú C3-konvertázának aktivitása következtében képződő C3b molekula képes új konvertáz komplexeket kialakítani. Ez a pozitív visszacsatolás, erősítés („amplification loop”) nagymértékben hozzájárul újabb C3b fragmensek képződéséhez, végső soron az igen gyors és hatékony komplementaktivációhoz. A C3b fragmensek képesek a felszínen kialakult C3-konvertázhoz kötődni, létrehozva ezáltal a C3bBb3b C5-konvertáz enzimet. A C5 komponens hasítása során képződő nagyobbik fragmens (C5b) kovalens módon szintén képes a felszínre kikötődni, és a hozzá kötődő C6 valamint további komponensek által aktiválódhat a terminális út is [Walport 2001, Erdei 2006]. A terminális út során a C5 komponenshez elsőként a C6 és C7 komponensek kötődnek, és a fehérje kölcsönhatások során feltáruló hidrofób régiók lehetővé teszik a C5b67 komplex membránokba való süllyedését. A C8 és számos C9 molekula kötődése és utóbbiak polimerizációja pedig létrehozza a membránkárosító komplexet (membrane attack complex, MAC), ami ideális esetben a membránban pórust formálva a kórokozó líziséhez vezet [Erdei 2006, Serna 2016].

Fontos megjegyezni, hogy a komplementrendszer fent leírt, lineáris kaszkádszerű modellje az elmúlt évtizedek kutatási eredményei alapján átalakulóban van. A hagyományos modell helyett a valóságot talán jobban megközelíti az a kép, amelyben a komplementre mint dinamikus hálózatra gondolunk. A rendszer funkcionális csomópontjai (C1q, C3b, C5a) sokoldalúan vesznek részt az immun- és a sejtszintű homeosztázis fenntartásában, más biológiai útvonalakkal kölcsönhatva, együttműködve [Ricklin 2010].

2.2. A komplementrendszer szabályozása

Az előző részben írtakból is jól látszik, hogy a komplement a veleszületett immunitás rendkívül hatékony effektor rendszere, mely az enzimek működése során számos ponton felerősödik. Éppen ezért elengedhetetlen a komplementrendszer szoros kontroll alatt tartása.

2.2.1. A klasszikus, a lektin és a terminális utak szabályozása

A komplementaktiváció klasszikus és lektin útjának kezdeti lépéseit gátolja a C1-inhibitor. Ez a szolúbilis molekula kötődik a C1 molekulakomplex C1r és C1s alegységeihez, ezáltal inaktiválva azokat, másrészt képes disszociáltatni az MBL-ről a MASP1 és MASP2 enzimeket. Ugyanilyen hatású az α2-makroglobulin is. A konvertázok kialakulását, illetve aktivitását – mindhárom út esetében – ún. SCR (short consensus repeat) doméneket tartalmazó oldékony és sejtmembrán fehérjék szabályozzák. (Az irodalomban az SCR alternatív elnevezéseként találkozhatunk még a Sushi domén, ill. CCP [complement control protein] domén elnevezésekkel is.) A C4b-kötő fehérje (C4b-binding protein, C4BP) a C4b kötésével gátolja a klasszikus konvertáz kiépülését, illetve elősegíti a konvertáz bomlását. Ezen kívül kofaktor az I-faktor (FI) számára, mely a C4b (és C3b, ld. később) enzimatikus hasítását végzi. Az FI kofaktora továbbá a sejtfelszíni komplement receptor 1 (CR1) és a membrán kofaktor protein (membrane cofactor protein, MCP). Az ún. DAF (decay accelerating factor) a C3-konvertáz szétesését segíti elő sejtfelszínen. A szolúbilis H-faktor is az FI kofaktora, részletesen ld. az alternatív komplement út szabályozása c. résznél. A lízist okozó membránkárosító komplex szabályozásáért felelős a C5b-7 komplexhez kötődő S-protein (vitronektin), melynek szerepe kettős. Egyrészt blokkolja a C5b-7 membránkötő helyét, így megakadályozza annak sejtmembránhoz való kötődését. Másrészt kisebb hatásfokkal, de gátolja a C9 molekula polimerizációját s így a pórus képződését [Milis

1993]. Szintén a MAC kialakulását gátolja a legtöbb magvas sejten jelen lévő sejtfelszíni molekula, a CD59 [Sugita 1995].

2.2.2. Az alternatív komplement út szabályozása

Az alternatív komplement út regulátorai közé tartoznak a már említett CR1 és MCP molekulák, mert ezek az FI kofaktorai a C3b (és C4b) enzimatikus inaktiválásában [Erdei 2006]. Az alternatív út fő szabályozó molekulája azonban a szolúbilis H-faktor (FH). (A FH és a vele rokon fehérjék részletesebb ismertetése a következő alfejezetben található.) Az SCR egységekből felépülő FH a C3-konvertáz szintjén gátolja a további komplementaktivációt. Működésének alapja, hogy kötődik a C3b fragmenshez, és ezáltal

- megakadályozza az alternatív út C3-konvertázának (C3bBb) kialakulását; - amennyiben a konvertáz már felépült, gyorsítja annak bomlását (decay accelerating activity); - kofaktor az FI számára a C3b enzimatikus inaktiválásában (cofactor activity).

A FH – elsősorban a C-terminális molekularészének segítségével – képes a szervezet saját struktúráihoz kötődni, így ez a molekula sejtfelszínen is hatékony regulátor. A felületekhez történő kötődés a gazdaszervezetre jellemző polianionos molekulák (pl. glükózamino-glikánok, sziálsav) segítségével történik. Mivel ezek a molekulák alapvetően hiányoznak a kórokozók sejtfelszínéről, a FH nem nyújt védelmet számukra a komplement aktivitása ellen. Érdemes azonban megjegyezni, hogy számos kórokozó megtanulta hasznosítani a szervezetben keringő regulátor molekulákat FH-kötő molekulák kifejezése révén. A FH megkötésével növelik esélyüket a túlélésre pl. a S. aureus [Haupt 2008] vagy a N. gonorrhoeae [Ram 1998] kórokozók [Lambris 2008].

2.3. A H-faktor molekulacsalád

A FH molekulacsalád tagjai a FH, a FH-szerű fehérje (factor H-like protein 1, FHL-1) és a FH-ral rokon fehérjék. A FH az alternatív komplement út fő szabályozó molekulája. Elsősorban a májban folyamatosan termelődik, és a különböző testnedvek segítségével testszerte jelen van, de kisebb mértékben más sejtek is termelik, pl. endotélsejtek. Plazmakoncentrációja az egyes mérési módszerektől, és a használt ellenanyagoktól is függően tág határok között változhat. Az újabb mérésekben olyan monoklonális ellenanyagokat használtak, amelyek a H-faktorral rokon fehérjéket nem ismerik fel, így a közölt értékek kisebbek, de az adatok a FH és az FHL-1 együttes mennyiségére vonatkoznak. Az irodalomban pl. a következő értékeket találjuk a FH koncentrációjára: 265-684 µg/ml [de Paula 2003], 116-562 µg/ml [Esparza-Gordillo 2004], 136- 349 µg/ml [Hakobyan 2008a], 78-437 µg/ml [Hakobyan 2010], 76-247 µg/ml [Merinero 2018]. Mivel a FH molekulatömege 155 kDa, ez a fehérje hozzávetőleg 0,5-3 µM koncentráció tartományban van jelen a plazmában. A FH egyláncú, 20 SCR doménből felépülő glikoprotein. Komplementet szabályozó funkcióját az N-terminális négy SCR doménje segítségével látja el, míg az SCR6-7 és a C- terminális 19-20. SCR domének felelősek elsősorban az egyes felszínekhez/ligandumokhoz történő kötődésért (2.2. ábra). A C3b-n és a már említett, saját sejtekhez történő kötődést elősegítő polianionos molekulákon (glükózamino-glikánok, sziálsav) túl, a FH kötődik egyéb endogén ligandumokhoz is. Kölcsönhatását leírták pentraxinokkal, az extracelluláris mátrixszal (ECM), DNS-sel, prion fehérjékkel, adrenomedullinnal, annexin II-vel és hisztonokkal. Ezek a kölcsönhatások lehetőséget adnak a gazdaszervezet saját struktúráinak védelmére olyan esetekben is, amikor a membránhoz rögzített szabályozó molekulák nem, vagy kis mértékben fejeződnek ki (pl. glomeruláris alapmembrán, ECM). Ezen ligandumok többsége C1q, MBL, illetve fikolinokkal való kölcsönhatás útján képes aktiválni a komplementrendszert. Az aktiváló (C1q, MBL) és a gátló (FH, C4BP) molekulák együttes kötődése a ligandumokhoz elősegítheti az opszonizációt, háttérbe szorítva a nemkívánatos előrehaladott és túlzott mértékű komplementaktivációt, amely gyulladást és szöveti károsodást eredményezhetne [Sjöberg 2009, Kopp 2012b].

2.2. ábra. A FH molekulacsalád tagjai sematikusan ábrázolva. Az ovális alakzatok a fehérjék SCR doménjeit reprezentálják, a bennük lévő számok a molekula N- terminálisától való sorrendet jelölik. Az FHR fehérjék doménjei alatt feltüntetett számok az adott domén szekvenciabeli hasonlóságát fejezik ki százalékban a FH homológ doménjeivel. A domének felett lévő kis négyzetek az ismert glikozilációs helyeket mutatják. A görög betűk a glikoziláltság mértékét jelölik (pl. FHR- 2 glikozilálatlan, FHR-2α egyszeresen glikozilált forma). Az „A” és „B” betűk izoformákat jelölnek (ld. a szövegben). Az FHL-1 fehérje 4 C-terminális aminosavval tartalmaz többet a FH-nál. Az ábrán szembetűnő, hogy az FHR fehérjékből hiányoznak a FH N-terminálisával homológ domének. Forrás: Timmann 1991, Skerka 1992, Skerka 1993, Skerka 1997, McRae 2001, Józsi 2008a.

Az FHL-1 egy 43 kDa tömegű fehérje, amely a FH-t kódoló gén alternatív („splice”) terméke. A FH első hét SCR doménjét tartalmazza, plusz négy további aminosavat (2.2. ábra). Az N-terminális régió megléte miatt az FHL-1 rendelkezik azokkal a regulátor funkciókkal, amelyeket ezek a domének a FH-ban közvetítenek. Az elmúlt évek eredményei alapján világossá vált, hogy a FH komplement szabályozó funkcióját egy fehérje csoport modulálja. A csoport tagjai mind evolúciós, mind szerkezeti szempontból nagyfokú hasonlóságot mutatnak a FH-ral, ezt fejezi ki az elnevezésük is: H- faktorral rokon (FHR) fehérjék. A FH-ral való homológia miatt kezdetben komplementgátló hatást feltételeztek ezekről a fehérjékről, azonban – ahogy az jelen értekezésben részletezett eredményeinkből is jól látszik – inkább a FH-éval ellentétes, komplementaktivációt elősegítő funkciót tulajdoníthatunk nekik [Józsi 2008a, Skerka 2013, Józsi 2015].

2.3.1. Az FHR fehérjéket kódoló gének

A fehérje család tagjait hat, egymás mellett elhelyezkedő gén kódolja az emberi 1-es kromoszómán (1q32) az ún. RCA (regulators of complement activation) génklaszterben (2.3. ábra). A CFH jelzésű génről íródik át a FH és splice variánsa, az öt H-faktorral rokon fehérje szekvenciáját pedig öt különböző gén (CFHR1-5) kódolja. Utóbbiak az evolúció során a CFH génből egymás utáni duplikációs események folytán képződtek, ezért ebben a kromoszomális szegmensben számos, nagyfokú szekvencia hasonlóságot mutató, ismétlődő régió található [Józsi 2015]. Ezek az ismétlődő régiók lehetővé tesznek nem homológ rekombinációs folyamatokat, melyek változatos kimenetelűek lehetnek (ld. CFHR gének és betegségek kapcsolata c. alfejezetet).

2.3. ábra. Az emberi FH molekulacsalád génjeinek elhelyezkedése az 1q32 sávban. Forrás: GeneCards adatbázis (www.genecards.org).

2.3.2. Az FHR fehérjék szerkezete és tulajdonságaik

Mindegyik gén terméke kizárólag SCR doméneket tartalmazó plazmafehérje (2.2. ábra). Az FHR fehérjék SCR egységei különböző fokú szekvenciabeli hasonlóságot mutatnak a FH megfelelő doménjeivel. Fontos kiemelni, hogy ezekből a fehérjékből hiányoznak a FH-ban a komplementszabályozó funkcióért felelős, azaz a FH N-terminálisával homológ domének. Ugyanakkor a FH C-terminálisa (18-20. SCR domének) és a 6-7. doménjei különböző mértékben ugyan, de konzerválódtak az FHR fehérjékben, ami megmagyarázza azt a képességüket, hogy képesek kölcsönhatni a FH legtöbb ligandumával [Józsi 2015]. Az FHR-1, FHR-2 és FHR-5 szekvenciáit összehasonlítva kimutatták, hogy a három fehérje N-terminálisában egy konzerválódott dimerizációs domén található, melynek következményeként ezek a fehérjék dimerek, ill. tetramerek formájában keringenek a vérben [Goicoehea de Jorge 2013]. Újabb vizsgálatok szerint az FHR-1 és az FHR-2 homo- és heterodimereket alkotnak, míg az FHR-5 csak homodimer formájában van jelen a vérben [van Beek 2017].

FHR-1. Az FHR-1 5 SCR doménből áll, melyek szekvenciabeli hasonlóságot mutatnak a FH 6-7. és 18-20. SCR doménjeivel (2.2. ábra). Plazmakoncentrációja a korábbi mérések szerint 70-100 μg/ml [Heinen 2009], ennek bizonytalanságát növeli, hogy az FHR-1 FHR-2 és FHR-5 fehérjékkel dimerként és tetramerként is jelen van a plazmában, valamint az, hogy az FHR-1-et lipoprotein részecskékben is kimutatták [Park 1996]. Újabb, specifikus monoklonális antitestek segítségével elvégzett mérések szerint az átlagos szérum koncentrációja ennél jóval alacsonyabb: az FHR-1 homodimereké 11,5 µg/ml (146 nM), az FHR-1/FHR-2 heterodimereké pedig 5,2 µg/ml (78 nM) [van Beek 2017]. A fehérjének két különböző módon glikozilált formája mutatható ki plazmában: FHR-1α (egyszeresen glikozilált, 37 kDa) és FHR- 1β (kétszeresen glikozilált, 42 kDa) [Timmann 1991]. Ezen kívül ismert egy FHR-1 polimorfizmus is: az FHR-1*A forma 3. SCR doménje három aminosavban különbözik a FH 18. SCR doménjétől, míg az FHR-1*B esetében ez a két domén teljesen azonos [Abarrategui- Garrido 2009]. A jelölés a két izoforma különböző aminosavainak a természetéből (savas, acidic, A; és bázikus, basic, B) adódik. Az FHR-1 C-terminálisa igen nagyfokú hasonlóságot mutat a FH C-terminálisával (ld. 2.2. ábra), ezért legalább részben átfedés várható a két fehérje ligandumait illetően. Az FHR-1 – a FH-hoz hasonlóan – bizonyítottan kötődik pl. endotélsejtekhez és C3b-hez [Heinen 2009, Strobel 2011]. Kötődését az emberi pentraxin 3 molekulához szintén leírták [Kopp 2012a].

A FH N-terminálisával homológ domének hiányával összhangban az FHR-1-nek nincs komplementet szabályozó funkciója a C3-konvertáz szintjén [Timmann 1991]. A fehérjét a C5- konvertáz és a terminális út inhibitoraként írták le [Heinen 2009], azonban ezt az eredményt más kutatócsoportok nem tudták megerősíteni [Strobel 2011, Goicoechea de Jorge 2013]. Ezen kívül, bár az FHR-1 kötődését többen is leírták különböző kórokozókhoz, azt nem sikerült igazolni, hogy védené a kórokozókat a komplementrendszer ellen [Behnsen 2008, Losse 2010, Siegel 2010, Castiblanco-Valencia 2012]. Munkám során célkitűzéseink egyike volt ennek a kérdésnek a tisztázása.

FHR-2. Az FHR-2 fehérjéről meglehetősen kevés információval rendelkezünk. Négy SCR doménből álló fehérje, mely vélhetően egyetlen glikozilációs helyet tartalmaz. Humán szérumban kimutatható két formája: FHR-2 (nem glikozilált, 24 kDa) és FHR-2α (glikozilált, 29 kDa) [Skerka 1992]. Az FHR-1 fehérjével dimereket és tetramereket alkot [Goicoechea de Jorge 2013], és jelenlétét az FHR-1-hez hasonlóan lipoprotein részecskékben is kimutatták [Park 1996]. Szérumbeli koncentrációjára kevés az adat. van Beek és munkatársai mérései szerint az FHR-2 homodimerek koncentrációja 0,5 µg/ml (11 nM), míg az FHR-1/FHR-2 heterodimereké 5,2 µg/ml (78 nM) [van Beek 2017]. Zhang és munkatársai nem különböztették meg az egyes homo- /heterodimer formákat, tömegspektrofotometrián alapuló mérésük szerint az FHR-2 koncentrációja 3,64 µg/ml [Zhang 2017a]. Az FHR-2 kötődik C3b-hez, a konvertáz felépülését nem gátolja meg, de utóbbi funkcionálisan inaktív lesz. A H-faktorral viszont gyakorlatilag nem képes kompetálni a C3b ligandumért, így a feltételezések szerint az FHR-2 a H-faktorral együtt fejti ki hatását [Eberhardt 2013].

FHR-3. Az FHR-3 öt SCR doménből áll, plazmából detektálva 45-56 kDa között látható, valószínűleg négy különböző glikozilációs formának megfelelően [Skerka 1993]. Plazmakoncentrációja korábbi mérések szerint 50-80 μg/ml [Fritsche 2010], azonban újabb adatok alapján nagyságrendileg kevesebb, 0-2,7 μg/ml [Pouw 2016]. Az FHR-3 nagymértékű szerkezeti hasonlóságot mutat az FHR-4 fehérjével (2.2. ábra). Az FHR-3 kötődik a C3b molekula C3d részéhez és heparinhoz [Hellwage 1999], valamint FH-ral való kompetícióját is leírták felszínhez kötődött C3b-n [Hellwage 2010]. A fehérje kofaktor aktivitását első ízben csak igen magas, nem fiziológiás koncentrációban (400 μg/ml) sikerült kimutatni. Hasonlóan magas koncentrációkban adva azt tapasztalták, hogy az

FHR-3 erősíti a FH kofaktor aktivitását [Hellwage 1999]. Később 80 μg/ml koncentráció esetén erős direkt kofaktor aktivitást írtak le [Fritsche 2010], így ez a kérdés is tisztázandó.

FHR-4. Az FHR-4-nek két formája ismert, melyeket egyetlen gén (CFHR4) kódol. Az FHR-4A kilenc SCR doménből áll, és egy 86 kDa-os glikoproteinként van jelen a plazmában [Józsi 2005]. Az FHR-4B izoforma öt doménből álló, 42 kDa tömegű glikoprotein [Skerka 1997] (2.2. ábra). A hosszabb FHR-4A molekulában az 1-4. SCR és 5-8. SCR domének duplikációt valószínűsítenek és az FHR-4B öt doménje gyakorlatilag megfelel az FHR-4A 1. és 6-9. SCR egységeinek. Az átlagos plazmabeli FHR-4 koncentráció 25 μg/ml-nek adódott [Hebecker 2012], de újabban ennek kb. tizedét mérték, 2,42 μg/ml-t [Zhang 2017a]. Az FHR-4-et kimutatták trigliceridben gazdag lipoproteinekben [Skerka 1997]. Az FHR-4-nek fiziológiás koncentrációk esetén nincs kofaktor aktivitása, az FHR-3-hoz hasonlóan igen nagy koncentráció esetén tapasztaltak csak hatást [Hellwage 1999]. Ugyanakkor az FHR-4 – a C-terminálisán keresztül – kötődik C3b-hez és ez a kölcsönhatás lehetővé teszi egy funkcionálisan aktív alternatív C3-konvertáz (FHR-4-C3bBb) létrejöttét. Azaz az FHR-4 képes aktiválni a komplementrendszer alternatív útvonalát [Hebecker 2012]. Ezen kívül az FHR-4 kötődik nekrotikus sejtekhez és a CRP natív, pentamer formájához, így valószínűleg szerepet játszik a nekrotikus sejtek opszonizációjában is [Mihlan 2009a].

FHR-5. Az FHR-5 kilenc doménből álló 65 kDa-os glikoprotein, plazmakoncentrációja 3-6 μg/ml. Ezt a fehérjét glomerulonefritiszes betegek glomeruláris alapmembrán preparátuma ellen termelt monoklonális ellenanyagok segítségével fedezték fel [McRae 2001, McRae 2005]. Az FHR-5 kötődését is kimutatták C3b-hez in vitro [McRae 2001]. Ennek funkcionális következményeit vizsgálva a FH-énál jelentősen gyengébb kofaktor aktivitást, valamint a fluid fázisú alternatív C3-konvertáz működésének FHR-5 általi gátlását is leírták. Az FHR-5 széleskörű jelenléte egészséges és patológiás szöveti komplement depozitumokban, valamint kolokalizációja a C5b-9 terminális komplexszel valószínűsíti a szerepét a komplementrendszer szabályozásában. Az FHR-5 kötődését in vitro kimutatták még heparinhoz és CRP-hez, valamint lipoproteinekkel való asszociációját is leírták [McRae 2005].

Az FHR fehérjék egymással való evolúciós rokonságát vizsgálva kimutatható, hogy az FHR-1, FHR-2 és FHR-5 valamint az FHR-3 és FHR-4 egy-egy szorosabb rokonsági csoportot alkot (2.4. ábra).

2.4. ábra. Az FHR molekulacsalád filogramja. Az Európai Bioinformatikai Intézet Clustal Omega nevű programjának felhasználásával (többszörös szekvencia-illesztés, https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). 2.3.3. Az FHR fehérjék és betegségek kapcsolata

A CFHR génklaszter számos nagyméretű szekvencia ismétlődést (low copy repeat) tartalmaz, melyek mutációk, deléciók, duplikációk, átrendeződések és polimorfizmusok kialakulásának kedveznek. Az így kialakuló genetikai változatok különböző betegségekkel mutatnak összefüggést [Skerka 2013]:

• atípusos hemolítikus urémiás szindróma (aHUS) • C3 glomerulopátiák (C3G), azon belül o C3 glomerulonefritisz (C3GN), melynek egyik altípusa az FHR-5 nefropátia o dense deposit disease (DDD) • időskori makuladegeneráció (AMD) • IgA nefropátia (IgAN) • szisztémás lupusz eritematózusz (SLE) • (Neisseria) fertőzések

A következőkben röviden áttekintem a fenti betegségeket és azt, hogy ezek – eddigi tudásunk szerint – milyen módon hozhatók kapcsolatba az FHR fehérjékkel. Az 2.1. táblázat a CFHR génátrendeződések kapcsolatát mutatja az említett kórképekkel.

Genetikai Betegség Következmény Jelentőség Prevalencia összefüggés FH autoantitestekkel való ΔCFHR3-CFHR1 * FHR-3 és FHR-1 hiány asszociáció, sejtfelszíni gyakori ΔCFHR1-CFHR4 FHR-1 és FHR-4 hiány szabályozás károsodása hibrid fehérje: a FH C- számos nem sejtfelszíni szabályozás CFH::CFHR1 terminálisa az FHR-1 C- összefüggő károsodik terminálisára cserélődik esetet írtak le aHUS hibrid fehérje: a FH utolsó C- sejtfelszíni szabályozás CFH::CFHR3 terminális doménje az egész nagyon ritka károsodik FHR-3 molekulára cserélődik hibrid fehérje: az FHR-1 C- néhány nem sejtfelszíni szabályozás CFHR1::CFH terminálisa a FH C- összefüggő károsodik terminálisára cserélődik esetet írtak le abnormális mutáns FHR-1 fehérje oligomerizáció, dupCFHR1 (dimerizációs domének nagyon ritka megnövekedett duplikációja) kompetíció FH-ral DDD hibrid fehérje: FHR-2 1-2. abnormális SCR doménje, melyet a teljes oligomerizáció, CFHR2::CFHR5 FHR-5 molekula követ nagyon ritka megnövekedett (dimerizációs domének kompetíció FH-ral duplikációja) megnövekedett FHR-1 hibrid fehérje: FHR-3 1-2. koncentráció, C3G CFHR3::CFHR1 SCR doménje, melyet a teljes nagyon ritka megnövekedett FHR-1 molekula követ kompetíció FH-ral? hibrid fehérje: FHR-5 1-2. megnövekedett FHR-2 SCR doménje, melyet a teljes koncentráció, C3GN CFHR5::CFHR2 FHR-2 molekula követ nagyon ritka megnövekedett (dimerizációs domének kompetíció FH-ral? duplikációja) abnormális számos mutáns FHR-5 fehérje oligomerizáció, összefüggő, és dupCFHR5 (dimerizációs domének megnövekedett egy nem duplikációja) kompetíció FH-ral összefüggő eset FH-ral való kompetíció AMD ΔCFHR3-CFHR1 * FHR-3 és FHR-1 hiány gyakori hiánya? FH-ral való kompetíció IgAN ΔCFHR3-CFHR1 * FHR-3 és FHR-1 hiány gyakori hiánya? FH-ral való kompetíció SLE ΔCFHR3-CFHR1 * FHR-3 és FHR-1 hiány hiánya? gyakori autoimmunitás? 2.1. táblázat. Betegségekkel kapcsolatos génátrendeződések a CFHR régióban. *A ΔCFHR3-CFHR1 deléció aHUS és SLE betegségekben hajlamosító tényező, AMD-ben és IgAN-ban védő faktor. Rövidítések: aHUS: atípusos hemolítikus urémiás szindróma, C3G: C3 glomerulopátia, DDD: dense deposit disease, C3GN: C3 glomerulonefritisz, AMD: időskori makuladegeneráció (age-related macular degeneration), IgAN: IgA nefropátia, SLE: szisztémás lupusz eritematózusz. Forrás: Józsi 2015.

2.3.3.1. Atípusos hemolítikus urémiás szindróma (aHUS) A hemolítikus urémiás szindróma (HUS) egy súlyos, életet veszélyeztető vesebetegség, melyre jellemző tünethármas a mikroangiopátiás hemolítikus anémia, a trombocitopénia és az akut veseelégtelenség. A klinikai kép alapján további megkülönböztetés lehetséges. A heveny, gyakran véres hasmenéssel társuló forma Shiga toxint termelő mikroorganizmusokkal (tipikusan E. coli) való fertőzés következtében alakul ki. Az esetek többségében a vesefunkció visszaáll. A hasmenéssel nem járó, ritka (2 eset/1.000.000 fő/év incidenciájú) aHUS bármely életkorban előfordulhat, leggyakrabban azonban gyerekek esetében diagnosztizálják. A betegség rossz prognózisú, az esetek 50%-ában végstádiumú vesekárosodás következik be, és a betegek 25%-a meghal a betegség akut fázisában. Az aHUS-os betegek kb. felében komplement komponenst vagy komplementszabályozó fehérjét kódoló gén mutációja okozza a problémát: a FH, a MCP, az FI, a FB és a C3 génjeinek érintettségét igazolták [Kavanagh 2008]. A mutációk károsodott alternatív út szabályozást, így komplement mediált szöveti károsodást eredményeznek elsősorban a vesében [Józsi 2008a]. Az aHUS betegek egy részében (kb. 11%, német kohort) kimutatható FHR-1/FHR-3 együttes deficiencia és FH ellenes autoantitestek jelenléte. Az autoantitestek megjelenése és a fehérjék hiánya közötti erős korreláció alapján a ΔCFHR3-CFHR1 deléciót rizikófaktornak tekintjük az aHUS kialakulásában [Józsi 2008b]. (Érdekes, hogy ugyanez a kettős géndeléció más betegségek esetében – AMD, IgA nefropátia – protektív szereppel bír, ld. a megfelelő részeknél.) A kettős deléció mint polimorfizmus (2-33%) jelenik meg az egészséges populációban [Skerka 2013]. Egy angol aHUS kohort betegeiben kimutatták, hogy az FHR-1 teljes hiányát az egyik allélon a ΔCFHR3-CFHR1 deléció, a másikon pedig a ΔCFHR1-CFHR4 deléció is okozhatja. Mindezek alapján feltételezhető, hogy az autoantitestek képződése az FHR-1 fehérje deléciójával áll összefüggésben. Az, hogy a fehérje hiánya hogyan függ össze az autoantitestek képződésével, még nem bizonyított [Moore 2010]. Egy lehetséges magyarázat szerint az autoimmun folyamat oka egyes kórokozók által indukált neoepitóp megjelenése a FH 20. SCR egységében. Ez az epitóp az FHR-1 5. SCR doménjében a konformáció flexibilitása következtében spontán is kialakulhat, így toleranciát indukál. Az FHR-1 deléciója így eredményezheti a kóros immunfolyamatok elindulását [Bhattacharjee 2015]. Genetikai átrendeződések következményeként kialakuló hibrid gének és a nekik megfelelő fúziós fehérjék is szerepet játszhatnak az aHUS patogenezisében. Azok a hibrid FH fehérjék, melyek utolsó C-terminális doménje helyett az FHR-1 5. doménjét, vagy a teljes FHR-

3 fehérjét tartalmazzák (CFH::CFHR1, CFH::CFHR3 hibrid gének termékei), nem képesek a sejtekhez megfelelően kötődni, és ezáltal a komplement megfelelő szabályozására sejtfelszínen [Sánchez-Corral 2004, Heinen 2006, Venables 2006]. A CFHR1::CFH hibrid gén terméke egy olyan fehérje, amelyben az FHR-1 C-terminálisa (5. SCR domén) a FH utolsó doménjére cserélődött. Ez utóbbi fehérje is károsodott komplement szabályozást okoz, mert a sejtekhez kötődve – a megfelelő, regulációért felelős domének hiányában – nem képes ellátni a FH funkcióját, ugyanakkor részben leszoríthatja a FH-t [Józsi 2015, Valoti 2015].

2.3.3.2. C3 glomerulopátiák

A C3 glomerulopátia egy betegségcsoport, amelyben a glomerulusokban immunfluoreszcens mikroszkópiával domináns C3 fragmens depozíció, elektronmikroszkópos képeken pedig eletronsűrű régiók figyelhetők meg. A folyamat hátterében a komplementaktiváció nem megfelelő szabályozása, illetve az ebből eredő komplement lerakódás és degradáció áll. Ha a vesebiopszia elemzése felfedi a „glomerulonefritisz domináns C3 lerakódással” morfológiai képet, akkor további vizsgálatok (a komplementrendszert érintő gének vizsgálata, szerológiai tesztek stb.) segítségével lehetséges a pontos(abb) diagnózis felállítása [Pickering 2013]. A C3G két alapvető típusa az ún. dense deposit disease (DDD) és a C3 glomerulonefritisz (C3GN). Mindkét betegség jellemző tünete lehet vér és fehérje jelenléte a vizeletben (hematuria és proteinuria), csökkent fokú vizeletkiválasztás (oliguria, ill. anuria), ödéma, magas vérnyomás. A kialakuló veseelégtelenég gyakran végstádiumig fejlődik, vesetranszplantáció után a tünetek újra jelentkeznek. Oki terápia a C3G kezelésére jelenleg nem ismert, a tüneteket enyhítő, illetve a progressziót lassító készítmények és beavatkozások (angiotenzin-konvertáló enzim, angiotenzin- receptor blokkolók, Eculizumab, dialízis, vesetranszplantáció) alkalmazhatóak [NORD 2016]. A betegség patológiájában alapvető szerepe van az alternatív út szabályozatlan, szisztémás aktiválódásának [Appel 2005]. A nem megfelelő szabályozás oka többek között lehet (i) a FH plazmabeli hiánya, (ii) a FH mutációja, (iii) a FH ellen termelődő, szabályozást gátló autoantitest jelenléte, (iv) FB elleni autoantitest képződése vagy (v) az alternatív C3-konvertáz ellen létrejött autoantitest. Utóbbi, melyet nefritikus faktornak nevezünk, jelenlegi ismereteink szerint a leggyakoribb kiváltó ok. Jelenléte túlzott mértékben stabilizálja a konvertázt, és így elősegíti az aktivációt [Józsi 2008, Józsi 2014]. Ritkábban C4-nefritikus faktort is leírtak, illetve újabb adatok szerint C5-nefritikus faktorok is léteznek [Marinozzi 2017, Zhang 2017b].

Dense deposit disease (DDD). Ha a vesepreparátumokról készült elektronmikroszkópos felvételeken jellegzetesen elektronsűrű, ozmiofil depozitumok láthatóak a glomeruláris alapmembránban, akkor a C3 glomerulopátia „dense deposit disease” nevű altípusával állunk szemben [Fakhouri 2010, Pickering 2013]. (Ezt a betegséget 2-es típusú membránproliferatív glomerulonefritisznek is nevezik.) Gyakran a szemben található Bruch- membrán érintettsége is kimutatható. A legtöbb diagnózis 5-15 éves gyermekek esetében születik, és 10 éven belül a betegek végstádiumú veseelégtelenségben, egyes esetekben látásromlásban is szenvednek [Appel 2005]. A C3G-t kiváltó tényezőkön (ld. előző bekezdés) túl abnormális FHR fehérjékről is feltételezik, hogy szerepük lehet a DDD patomechanizmusában. Tortajada és munkatársai kimutattak egy mutáns FHR-1 fehérjét, amely az N-terminális domének duplikációja következtében szokatlanul nagy multimereket képez FHR-2 és FHR-5 fehérjékkel, illetve saját magával. Az abnormális multimerek megnövekedett aviditással kötődnek C3b-hez, így erősebben képesek kompetálni FH-ral, hátrányosan befolyásolva ezáltal a komplementaktiváció szabályozását [Tortajada 2013]. Hasonlóan, a C3b-hez történő erős kötődés, illetve a FH-ral való kompetíció által képes a komplementaktiváció fokozására a kromoszomális deléció révén létrejött FHR-21,2 – FHR-5 hibrid fehérje is [Chen 2014].

C3 glomerulonefritisz (C3GN). Azokat a C3 glomerulopátiákat, amelyekben a depozitumok kevésbé elektronsűrűek, és inkább mezangiális, illetve szubendotél elhelyezkedésűek, C3 glomerulonefritisznek nevezzük [Fakhouri 2010, Pickering 2013]. A DDD és a C3GN megkülönböztetésének problémáiról ld. az idézett összefoglalókat. A DDD-nél leírtakhoz hasonlóan a C3GN esetében is leírtak mutáns FHR fehérjéket, amelyeknek szerepe lehet a betegség kialakulásában. Malik és munkatársai egy korábban leírt familiáris C3GN-t mutató ír családban azonosítottak egy heterozigóta mutációt, amelynek eredménye az FHR-3 első két doménjét és a teljes FHR-1 fehérjét tartalmazó hibrid gén, illetve fehérje (FHR-31,2 – FHR-1). Mivel a hibrid gént intakt CFHR1 és CFHR3 géneket is tartalmazó allélon találták, és a két fehérje együttes deléciója ismert egészséges egyénekben, valamint protektív hatású IgA nefropátiában és AMD-ben, feltételezhető a hibrid fehérje direkt szerepe a C3GN kialakulásában [Malik 2012]. Egy másik, családi halmozódást mutató esetben felfedezett hibrid gén és fehérje az

FHR-5 első két doménjét, valamint a teljes FHR-2 fehérjét tartalmazza (FHR-51,2 – FHR-2), és szintén összefüggésbe hozható a C3GN megjelenésével [Zhang 2013]. Egy ciprusi kohortot vizsgálva pedig a CFHR5 gén egy belső duplikációját fedezték fel, melynek terméke, a mutáns FHR-5 (mutFHR-5) fehérje abnormális oligomerizációt, illetve

24 megnövekedett kompetíciót mutat a FH-ral. A jelenség oka a dimerizációs domének (1-2. SCR- ek) duplikációja [Gale 2010].

2.3.3.3. Időskori makuladegeneráció (AMD)

Az ún. időskori makuladegeneráció (age-related macular degeneration, AMD) az irreverzibilis időskori látásromlás egyik fő oka a fejlett országokban, 2015-ben 6,2 millió embert érintett világszerte [GBD 2015]. A betegség hátterében a sárgafolt környezetében képződő immun-lerakódás (drusen) áll a retinális pigment epitélium, illetve a lamina basalis (Bruch-membrán) között. A betegség multifaktoriális, az idős kor és egyes életmódbeli (pl. dohányzás), valamint környezeti (pl. napsugárzás) tényezők mellett a genetika meghatározó, több komplement és nem- komplement gént hoztak az AMD-vel összefüggésbe [Armstrong 2015]. Az apró, sárgás színű lerakódásokban megtalálható komplement fehérjék, illetve aktivációs termékek a komplementrendszer szerepét mutatják a betegség patofiziológiájában [Józsi 2008]. Érdekes módon a ΔCFHR3-CFHR1 deléciónak, mely aHUS esetén betegségre hajlamosító tényező, AMD esetében védő szerepe van [Hageman 2006, Hughes 2006]. Ennek egy lehetséges magyarázata az FHR-1 és a FH C-terminálisának nagyfokú hasonlóságán alapul. Az FHR-1, a FH-ral kompetícióba lépve képes lehet gátolni/csökkenteni a FH lokális komplement gátló hatását. Az FHR-1 hiánya a retinában így éppen ellenkezőleg, elősegítheti a FH védő szerepét [Józsi 2008]. Az FHL-1 lehetséges szerepéről az AMD patomechanizmusában ld. a 31. oldalon leírtakat.

2.3.3.4. IgA nefropátia (IgAN)

Az IgAN a leggyakoribb elsődleges glomerulopátia világviszonylatban, incidenciája felnőttekre nézve 2,5/100 000/év, és egyben a krónikus vesebetegségek egyik fő oka [McGrogan 2010]. Elsősorban fiatal felnőttek, főleg férfiak megbetegedése. Nevét onnan kapta, hogy a vesebiopsziákban domináns, diffúz, IgA tartalmú immunlerakódások figyelhetőek meg a fénymikroszkóposan normális és károsodott glomerulusokban egyaránt. Klinikailag visszatérő makroszkópos hematuria, idült lefolyású mikrohematuria és/vagy proteinuria jellemzi [Tulassay 2010a]. Bár a betegség patomechanizmusa részleteiben még nem ismert, teljes genom asszociációs vizsgálatokkal már azonosítottak a betegséggel összefüggésbe hozható lókuszokat.

Az érintett lókuszokon helyet foglaló gének közül számos gén különböző immunológiai folyamatot szabályoz (antigén feldolgozás és prezentáció, mukózális IgA termelés, patogének elleni veleszületett immunitás, komplementrendszer) [Magistroni 2015]. Az FHR fehérjék szempontjából kiemelendő, hogy a ΔCFHR3-CFHR1 deléció az AMD-hez hasonlóan az IgAN esetében is védő faktort jelent a szervezet számára [Gharavi 2011, Kiryluk 2012, Kiryluk 2014].

2.3.3.5. Szisztémás lupusz eritematózusz (SLE)

A szisztémás lupusz eritematózusz egy komplex autoimmun betegség, ismeretlen eredetű, több tényezős kórkép. Az SLE jelentkezhet bármely életkorban, de elsősorban a fogamzó korban lévő nők betegsége, az első tünetek leggyakrabban a 20-30. év körül jelentkeznek. 5-10/100 000/ év incidencia jellemzi. Klinikailag általános tünetek (gyengeség, fáradékonyság, láz, fogyás, hajhullás), bőrtünetek (pl. a jellegzetes ún. pillangó-eritéma), mozgásszervi tünetek (izom- és ízületi fájdalom), nefritisz és neuropszichiátriai tünetek jellemzik. Kialakulásáért genetikai és környezeti tényezők egyaránt felelősek [Tulassay 2010b]. A betegség kialakulásában alapvető szerepe van autoantitestek képződésének (pl. anti- natív DNS antitest), a komplementrendszer kóros aktivációjának, és az ebből eredő – különböző szerveket érintő – gyulladásos szöveti sérüléseknek. A vizsgálatok szerint a ΔCFHR3-CFHR1 deléciónak ebben a betegségben is van szerepe: hajlamosító tényező [Zhao 2011].

2.3.3.6. Az FHR fehérjék és a fertőzések kapcsolata

Az előbbi alfejezetekben leírt folyamatokon túlmutatva, a FH és az FHR fehérjék kölcsönhatásait leírták különböző mikroorganizmusokkal, illetve mikrobiális fehérjékkel is. Eddig azonban kevesen vizsgálták az interakciók funkcionális következményeit [Józsi 2015]. Siegel és munkatársai megmutatták, hogy a Borrelia burgdorferi kórokozó felszínéhez kötődő FHR-1, FHR-2 és FHR-5 nem gátolja a komplement aktiválódását, míg a FH jelenléte csökkenti vagy gátolja a C3b, ill. C5b-9 lerakódást és a lízist [Siegel 2010]. A Neisseria meningitidis egy felszíni lipoprotein (FH binding protein, fHbp) segítségével hasonló affinitással képes megkötni a FH-t és az FHR-3-at is. A két fehérje kompetíciója befolyásolja a patogén túlélését emberi szérummal végzett kísérletek alapján [Caesar 2014]. A FH-t kötő patogéneket, illetve mikrobiális fehérjéket felismerő FH domének konzerválódtak az FHR fehérjék körében. Így az előbbieket is figyelembe véve valószínűsíthető, hogy az FHR fehérjék „csaliként” jöttek létre/maradtak fent az evolúció során. Feltételezhető, hogy a kórokozók a FH helyett az FHR fehérjéket megkötve

26 kevésbé képesek a komplementrendszer kivédésére, ami a patogén gazdaszervezetből történő eliminálásának kedvezhet [Józsi 2015, Józsi 2017]. Kutatócsoportunk munkája részeként a dolgozat írója is foglalkozott egyes bakteriális fehérjék FHR fehérjékkel való kölcsönhatásának vizsgálatával, azonban ez a kutatási irány nem képezi a disszertáció tárgyát.

2.4. A tárgyalt betegségekkel kapcsolatos FH/FHR ligandumok 2.4.1. A C3b

A C3b molekula a C3-konvertáz enzimek működése során a C3 komplement komponensből keletkező fragmentum. A klasszikus/lektin út C5-konvertázának, és az alternatív út C3- ill. C5- konvertázának alkotóeleme. A MAC kialakulásához vezető folyamatokban betöltött szerepe mellett a C3b, illetve hasítási termékei számos egyéb fontos, főként komplementreceptorok által közvetített biológiai funkcióval rendelkeznek [Erdei 2006, Erdei 2016]. A C3b-t a FH fő ligandumaként tartjuk számon (ld. 2.2.2. fejezet). A FH-ban összesen négy régiót azonosítottak a C3b, illetve hasítási termékeinek kötésére: SCR 1-4, SCR 6-8, SCR 12-14 és SCR 19-20 [Sharma 1996, Jokiranta 2000, Schmidt 2008]. Újabb adatok szerint azonban a fő kötőhelyek az N-terminálison található SCR 1-4, illetve a C-terminálison lévő SCR 19-20 domének, és a másik két kötőhely léte, illetve fiziológiás szerepe kérdéses [Schmidt 2008, Kopp 2012b]. Az FHR fehérjék mindegyike kötődik C3b-hez, de a komplementet szabályozó funkcióért felelős, tehát a FH N-terminálisával homológ domének hiánya miatt FH-szerű szabályozó funkciójuk nincsen. Ugyanakkor kimutatták, hogy az FHR-4 a C3b-t megkötve kialakíthatja az alternatív út C3-konvertázát, elősegítve ezzel a komplemementaktivációt [Hebecker 2012].

2.4.2. A pentraxinok

A pentraxinok evolúciósan konzerválódott, multimer szerkezetű fehérjék. Közös jellemzőjük a kb. 200 aminosavat tartalmazó, C-terminális domén, melyben megtalálható a 8 aminosavból álló, jellegzetes pentraxin szekvencia (HxCxS/TWxS, x valamely aminosavat jelenti). A pentraxinok a veleszületett immunitás humorális ágának fontos komponensei, a kollektinek, fikolinok mellett az oldékony mintázatfelismerő receptorok közé tartoznak [Bottazzi 2010]. Az ún. rövid pentraxinok közé a C-reaktív protein1 (CRP) és a szérum amiloid P (SAP) tartozik. A hosszú pentraxinok képviselői az elsőként leírt pentraxin 3 molekula (PTX3), a tengerimalacból izolált apexin, a neuronális pentraxin 1 (NPTX), a neuronális pentraxin 2 (NPTX2), a neuronális pentraxin receptor (NPTXR), valamint a legutóbb felfedezett pentraxin 4 (PTX4) fehérje [Bottazzi 2010]. A pentraxinok fontosabb, ismert ligandumait a 2.2. táblázat tartalmazza. Az egyes ligandumok pentraxinok általi kötése az esetek többségében Ca2+-függő, ugyanakkor a kölcsönhatások következményei még kevésbé ismertek, a kutatások tárgyát képezik. Az azonban már ismert, hogy a pentraxinok a C1q-val, a fikolinokkal, a C4BP-vel, valamint a FH-ral való kölcsönhatás következtében a komplementrendszer mindhárom útján át részt vesznek az aktivációban, illetve a rendszer szabályozásában.

CRP, SAP PTX3 ▪ Komplement komponensek (C1q, FH, fikolin ▪ Komplement komponensek 1, fikolin 2, C4BP, ill. FHR-4 a CRP esetén) (C1q, MBL, FH, FHR-1, fikolin ▪ Mikroorganizmusok (baktériumok, vírusok, 1, fikolin 2, C4BP) gombák, paraziták) ▪ Mikroorganizmusok ▪ Foszforilkolin (baktériumok, vírusok, gombák) ▪ Szénhidrátok ▪ ECM fehérjék (IαI, TSG-6) ▪ Módosult LDL ▪ Apoptotikus sejtek ▪ ECM fehérjék (fibronektin, kollagén (IV), ▪ FGF2 laminin, proteoglikánok ▪ Amyloid rostok ▪ DNS

2.2. táblázat. A rövid (CRP, SAP) és a hosszú (PTX3) pentraxinok ismert ligandumai. Rövidítések: LDL: kis sűrűségű lipoprotein (low-density lipoprotein), ECM: extracelluláris mátrix, IαI: inter-alfa-tripszin inhibitor (inter-alpha-trypsin inhibitor), TSG-6: TNF-α-indukálta gén 6 által kódolt fehérje (TNF-stimulated gene 6 protein), FGF-2: fibroblaszt növekedési faktor 2 (fibroblast growth factor 2). Forrás: Mihlan 2009a, Bottazzi 2010, Kopp 2012a.

1 A CRP-t William Tillett és Thomas Francis 1930-ban fedezte fel, mint a Streptococcus pneumoniae C- poliszacharidjával reagáló anyagot. 28

2.4.2.1. A rövid pentraxinok

A CRP, illetve a SAP fő akut-fázis fehérjék emberben, illetve egérben. Mindkét fehérjének másodlagos kémiai kötőerők révén kialakult pentameres szerkezete van. Az egészséges ember plazmájában a CRP kis koncentrációban (0-5 mg/l) van jelen, azonban gyulladási stimulus (főként IL-6) hatására koncentrációja 1000-szeresére is nőhet a májban történő transzkripció megnövekedett szintje miatt. Bár mRNS szinten májon kívüli szövetekben is kimutatták jelenlétét, az extrahepatikus sejtek nem járulnak hozzá számottevően a CRP plazmaszintjéhez. A CRP-t a klinikumban a gyulladás, a fertőzés, illetve a szöveti károsodás nemspecifikus, szisztémás markerének tekintik. A SAP-t a hepatocita sejtek termelik, egérben fő akut-fázis fehérje, emberben konstitutív módon jelen van 30-50 mg/l plazmakoncentrációval [Bottazzi 2010]. A CRP natív, pentameres szerkezete (pCRP) denaturáló körülmények között átalakul a monomeres formává (mCRP). Erre alkalmas in vitro módszerek a fehérje szerkezetének stabilizációjához szükséges Ca2+-ionok kelációja (EDTA), ureával történő denaturáció, a hőmérséklet növelése és a fehérje műanyag felületen történő immobilizációja [Kresl 1998]. Az mCRP fiziológiás jelenléte és szerepe még vitatott. A CRP és a SAP a C1q globuláris feji részével kölcsönhatva aktiválja a klasszikus komplement utat, ezáltal a sejttörmelékek, az apoptotikus sejtek, illetve a sérült szövetek eltakarításához nagymértékben hozzájárulhatnak. A saját felszíni struktúrákon beinduló kaszkádrendszer az opszonizáció céljából a kezdeti lépésekre korlátozódik, minimális C5-C9 felhasználással. Ennek a mechanizmusnak a fenntartásában valószínűleg nagy szerepe van a CRP-hez kötődő FH és C4BP regulátor tulajdonságának [Mold 1999]. Mihlan és munkatársai a pentameres szerkezetű CRP új ligandumaként azonosították az FHR-4-et, és feltételezték, hogy a nekrotikus sejtekhez kötődő FHR-4 fehérje a pentraxinnal történő kölcsönhatásával hozzájárul a sejtek opszonizációjához [Mihlan 2009a].

2.4.2.2. A hosszú pentraxinok

A hosszú pentraxinok szerkezetére jellemző, hogy a pentraxin doménen kívül tartalmaznak egy hosszú, N-terminális régiót, mely nem mutat rokonságot más, ismert fehérje szekvenciával. A PTX3 molekula komplex, oktameres szerkezettel rendelkezik, amely két, kovalens módon összekapcsolódott tetramer egységből jön létre. Ezt a fehérjét – ellentétben a rövid pentraxinokkal – számos különböző sejttípus (pl. endotélsejtek, makrofágok, dendritikus sejtek,

29 granulociták, simaizomsejtek stb.) képes termelni gyulladásos stimulusok (pl. IL-1, TNF-α, IL- 10) hatására. A polimorfonukleáris sejtek a PTX3-at a laktoferrin tartalmú granulumaikban tárolják. A sejtfelszíni mintázatfelismerő receptoraik aktivációja során a PTX3 felszabadul, és a neutrofil extracelluláris csapda (neutrophil extracellular trap, NET) részét képezi. Így részt vesz az antimikrobiális környezet kialakításában és végső soron a kórokozók eliminálásában [Bottazzi 2010]. A PTX3 kölcsönhatása a C1q molekulával a klasszikus komplement út aktivációját eredményezi [Nauta 2003]. A MBL, illetve egyes fikolinok PTX3-hoz történő kötődése a komplementrendszer lektin útját indítja be [Ma 2009, Gout 2011, Ma 2011]. A CRP-hez hasonlóan a PTX3 is képes a FH megkötésére, aminek következtében a PTX3-mal bevont felületekre történő FH lokalizációval segít megakadályozni a túlzott komplementaktivációt [Deban 2008, Bottazzi 2010]. Kopp és munkatársai kimutatták a PTX3 kötődését a FH-on kívül az FHL-1-hez és az FHR-1-hez is, és azt találták, hogy a pentraxinhoz kötődött FH és FHL-1 megtartja a komplementszabályozó tulajdonságát [Kopp 2012a]. Leírták még a PTX3 egy további regulátor molekulával, a C4b-kötő fehérjével való kölcsönhatását is [Braunschweig 2011].

2.4.3. Az extracelluláris mátrix (ECM) Az extracelluláris mátrix (ECM, sejtközötti állomány) kötőszöveti rostokból (kollagén-, rugalmas, rácsrost és fibrillin) és kocsonyás, erősen vízkötő természetű alapállományból áll. Meghatározó szerepe van a kötőszövet sejtjeinek támasztékaként, de ezen túlmenően a sejtek élettani folyamatainak szabályozásában is fontos szerepet tölt be. Az amorf alapállomány proteoglikánokból, illetve glukózaminoglikánokból valamint adhéziós molekulákból álló rendszer, így a makromolekuláris struktúráltság miatt nem jelenik meg önálló strukturális elemként fénymikroszkópos képeken [Röhlich 2006]. Az alapállomány szénhidráttartalmú komponensei közé tartozik a hialuronsav, a kondroitinszulfát, a heparánszulfát, a keratánszulfát, a dermatánszulfát, valamint különböző proteoglikánok. A fontosabb adhéziós glikoproteinek: fibronektin, laminin, tenaszcin, entaktin és trombospondin [Röhlich 2006]. A vese glomeruláris alapmembránja specializálódott ECM: az átlagosnál vastagabb és a fent említett fehérjecsaládok bizonyos tagjait (laminin-521, α3α4α5(IV) kollagén, agrin) tartalmazza nagy mennyiségben [Miner 2012]. A szemben található ún. Bruch-membrán (üveghártya, lamina vitrea) is az ECM része [Röhlich 2006].

Az ECM sérülések, kóros folyamatok során a komplementrendszer komponenseivel érintkezve, elindíthatja a komplement aktivációját és gyulladásos folyamatokat. A nemkívánatos komplementaktivitás csökkentése, kiküszöbölése elengedhetetlen. Korábbi vizsgálatok szerint a FH és az FHL-1 az ECM komponensekhez kötődnek és valószínűleg szerepük van az ECM komplementaktiváció elleni védelmében [Clark 2014, Day 2014]. Érdekes felfedezés, hogy a méretbeli különbségek miatt az FHL-1 passzív diffúzió útján képes áthatolni a Bruch- membránon, míg a FH nem. Az FHL-1 kölcsönhatása a Bruch-membránnal nagyrészt a heparánszulfátnak köszönhető. A jelenségnek az AMD patomechanizmusában lehet szerepe [Clark 2014].

2.4.4. A malondialdehid (MDA)

Az emberi anyagcsere egyik alapfolyamata az oxigénmolekula redukciója, melynek eredményeképpen víz keletkezik. A reakciók során azonban fiziológiás körülmények között is képződhetnek reaktív oxigén intermedierek (ROI vagy ROS, reactive oxygen intermediers/species). Ezek olyan tökéletlenül redukált oxigénszármazékok, melyek vegyértékhéjukon párosítatlan elektront tartalmaznak (szabad gyökök). Az így képződő rendkívül reaktív gyököket antioxidáns enzimek, anyagok folyamatosan inaktiválják és eliminálják. Ha viszont az antioxidáns mechanizmusok nem működnek megfelelően, akkor kialakulhat az ún. oxidatív stressz állapota. A felhalmozódó reaktív gyökök miatt ilyenkor különböző molekulák (nukleinsavak, fehérjék, lipidek, szénhidrátok) alakulhatnak át pl. mutagenezist, membránkárosodást, fehérjeoxidációt vagy lipid-peroxidációt eredményezve [Ádám 2006]. A sejtmembránt alkotó lipidek peroxidációja során megnő a membrán átjárhatósága, károsodik a sejt integritása. A lipidekből létrejövő peroxidokat, így pl. a malondialdehidet és kondenzációs termékeit az oxidatív stressz markereinek tekintik [Weismann 2011]. Ezen anyagok szerepét több betegségben is kimutatták, pl. érelmeszesedésben [Chou 2008, Miller 2011] és AMD-ben [Suzuki 2007, Hollyfield 2008]. Weismann és munkatársai egerekkel végzett in vivo kísérletekkel kimutatták, hogy a FH kötődik MDA-hoz, és gátolja az MDA által módosult fehérjék makrofágok általi felvételét, illetve az MDA által indukált gyulladásos folyamatokat. Az eredmények felhívták a figyelmet a veleszületett immunitás szerepére az oxidatív stressz folyamataiban [Weismann 2011].

3. Célkitűzések

A doktori munkám során célul tűztük ki az FHR fehérjék közül az FHR-1, az FHR-3 és az FHR- 5 funkciójának, fiziológiás és patológiás folyamatokban betöltött szerepének vizsgálatát. Ezek a fehérjék az irodalmi áttekintésben említett betegségekkel való kapcsolatuk miatt kiemelt szereppel bírnak. Ezért a következőket terveztük vizsgálni:

1. Az FHR fehérjéket rekombináns úton előállítva, jellemezni kívántuk a molekulák kölcsönhatását pentraxinokkal (CRP, PTX3) és extracelluláris mátrix fehérjékkel, melyek az egyes betegségekkel is kapcsolatos, potenciális ligandumok lehetnek, illetve ismert FH ligandumok. 2. Vizsgálni kívántuk azt is, hogy képesek-e a FH komplementszabályozó funkcióját befolyásolni (gátolni). 3. Korábbi, az FHR-4-ről publikált eredményekre építve vizsgálni kívántuk azt is, hogy az FHR-1, FHR-3 és FHR-5 fehérjék a C3b-vel való kölcsönhatásuk révén tudják-e közvetlenül aktiválni a komplementrendszer alternatív útját. 4. Az eddigi ellentmondásos irodalmi adatok miatt célul tűztük ki továbbá annak tisztázását, hogy a vizsgált FHR fehérjék rendelkeznek-e önmagukban komplement gátló tulajdonsággal akár a C3, akár a terminális út szintjén.

A tervezett kísérletek során használt főbb módszerek: PCR, fehérje-expresszió rovarsejtekben és fehérje tisztítás, ELISA, SDS-PAGE, Western blot, C3-konvertáz és kofaktor esszék.

4. Felhasznált anyagok és módszerek

A doktori disszertációmban bemutatott eredményekhez elsősorban a kutatócsoportunk által előállított és tisztított rekombináns fehérjéket, illetve kereskedelmi forgalomban kapható ellenanyagokat és tisztított emberi fehérjéket használtam fel. Az alkalmazott módszerek főként ELISA és Western blot különböző változatai voltak.

4.1. A felhasznált anyagok

4.1.1. Fehérjék és ellenanyagok

A dolgozatban bemutatott kísérletekhez felhasznált rekombináns humán FHL-1, FHR-1, FHR-

3, FHR-4A, FHR-4B fehérjéket, illetve fragmentumaikat (FH8-14, FH19-20) pBSV-8His bakulovírus expressziós vektorral, Spodoptera frugiperda (Sf9) rovarsejtek segítségével állítottuk elő, géntechnológiai tevékenységre szóló hatósági engedély birtokában. A fehérjéket nikkel affinitás kromatográfiával tisztítottuk, és a tisztaságukat ezüstfestéssel ellenőriztük [Hebecker 2010, Castiblanco-Valencia 2012]. Az FHR fehérjék rekombináns módon előállított C-terminális fragmentjeit (FHR-14-5, FHR-23-4, FHR-34-5, FHR-48-9, FHR-58-9) Susan Lea (Sir William Dunn School of Pathology, Oxford) adta felhasználásra. A rekombináns mutáns FHR-5-öt irányított in vitro mutagenezis módszerével állították elő Goicoechea de Jorge és munkatársai [Goicoechea de Jorge 2013]. A rekombináns humán PTX3 C- és N-terminálisát tartalmazó fragmentek pEF4/Myc-His B vektor és kínai hörcsög ovárium sejtvonalának (chinese hamster ovary cells, CHO sejtek) felhasználásával készültek [Daigo 2012]. Az FHR-1*A és FHR-1*B izoformákat emberi plazmából izolálták Rodríguez de Córdoba és munkatársai [Kopp 2012a]. A felhasznált rekombináns humán FHR-5, PTX3, mono- és poliklonális anti-FHR-5 ellenanyagok, valamint a biotinilált kecske anti-PTX3 ellenanyag az R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Németország) kereskedelmi forgalomban kapható termékei. Az általunk használt tisztított emberi FH, C3, C3b, FB, FD, FP, FI, C1q, és a rekombináns humán CRP fehérjék, valamint a poliklonális kecske anti-humán FH, poliklonális kecske anti-humán FB,

33 poliklonális kecske anti-humán C1q ellenanyagok a Merck (Merck Kft., Budapest) vállalat termékei. A rekombináns humán GST-fúziós FHR-2-t az Abnova-tól (Tajpej, Tajvan), a rekombináns humán GST-fúziós FHR-3-at pedig a Proteintech Europe (Manchester, Egyesült Királyság) cégtől vásároltuk. A monoklonális anti-humán FH (A254) és a monoklonális anti-humán FP (A235) ellenanyagokat a Quidel-től (Biomedica Hungaria Orvostechnikai Kft., Budapest), míg a C18 jelzésű monoklonális anti-FH ellenanyagot az Alexis Biochemicals-tól (Enzo Life Sciences GmbH, Lörrach, Németország) vásároltuk. A HRP-konjugált poliklonális kecske anti-C3 (antiszérum) az MP Biomedicals (Solon, Ohio, USA) terméke. A poliklonális nyúl anti-FHR-3 ellenanyagot Diana Wouters-től (University of Amsterdam, Amsterdam) kaptuk felhasználásra. Az ECM modellként használt MaxGel, a poliklonális kecske anti-humán CRP, és a monoklonális anti-mCRP ellenanyag a Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Kft., Budapest) termékei, míg a monoklonális anti-pCRP-t az antibodies-online.com (antibodies-online GmbH, Aachen, Németország) weboldalról rendeltük. A HRP-konjugált másodlagos ellenanyagokat (sertés anti-nyúl immunoglobulin, nyúl anti-kecske immunoglobulin és kecske anti-egér immunglobulinok) a Dako (Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Németország) gyártótól vásároltuk.. A HRP-konjugált Streptavidint az R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Németország) cégtől vásároltuk. Az MDA-BSA adduktumot Santiago Rodríguez de Córdoba-tól (Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid) kaptuk felhasználásra.

4.1.2. Szérumok

A normál emberi szérumot egészséges donoroktól gyűjtöttük (etikai engedély birtokában), és egyesítés után felhasználásig -80°C-on tároltuk. A szepszises betegek szérumát a budapesti Semmelweis Egyetemen gyűjtötték az etikai irányelvek betartása mellett. A FH-depletált emberi szérumot a Complement Technology (Tyler, Texas, USA) cégtől vásároltuk. A mutFHR-5-tel rendelkező beteg szérumát Elena Goicoechea de Jorge és Matthew C. Pickering (Imperial College, London) adta felhasználásra.

4.1.3. Pufferek és egyéb reagensek

A kísérletekhez az alábbi puffereket és reagenseket használtam fel:

1. DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Lonza, Verviers, Belgium), 0,0095 M foszfáttartalommal Összetétele:

Koncentráció Képlet (mM) KCl 2,68 NaCl 137

KH2PO4 1,47

Na2HPO4 8,06

2. DPBS (Lonza, Verviers, Belgium), 0,0095 M foszfáttartalommal, Ca2+- és Mg2+-kal Összetétele:

Koncentráció Képlet (mM) KCl 2,68 NaCl 137

KH2PO4 1,47

Na2HPO4 · 7 H2O 8,06

CaCl2 · 2 H2O 0,884

MgCl2 · 6 H2O 0,492

3. A C3-konvertáz (C3bBb) felépítéséhez Ni2+-tartalmú puffert készítettem. A Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS-hez adtam még a következő anyagokat:

Képlet Koncentráció

NiCl2 2,00 mM BSA 4,00 m/V % Tween 20 0,100 V/V %

4. Az egyes mosási lépések során (ELISA, Western blot) a megfelelő puffert kiegészítettem 0,05 V/V % Tween 20 [polioxietilén(20)-szorbitán-laurát] nem-ionos detergenssel a nem specifikus kölcsönhatások visszaszorítására. 5. A blokkoláshoz a következő anyagokat használtam. ELISA esetében 4 m/V % HSA- t (A3782, Sigma-Aldrich Kft., Budapest), BSA-t (A1391, AppliChem GmbH, Németország) vagy zselatint (104070, Merck Kft., Budapest) oldottam fel a megfelelő pufferben 0,05 V/V % Tween 20 mellett. Western blot technika esetében a nitrocellulóz membrán blokkolását 4 m/V % tejpor-oldat és 1 m/V % BSA-oldat elegyével végeztem 0,05 V/V % Tween 20 hozzáadásával. A felhasznált tejpor a Carl Roth vállalat terméke (T145). 6. A gélelektroforézissel történő vizsgálatokhoz a fehérjemintákat „Roti-Load 2” (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany) SDS mintapufferrel vittem fel a gélre. Összetétele:

Képlet Koncentráció SDS ~ 8 m/V % glicerin ~ 40 V/V % brómfenolkék ~ 0,015 m/V % foszfát puffer védett információ

Redukáló körülmények biztosításához „Roti-Load 1” mintapuffert használtam, ami a fentieken kívül tartalmaz még ~ 20 V/V % 2-merkaptoetanolt. 7. Az előhíváshoz (ELISA, Western blot) TMB Plus szubsztrát oldatot (Kem-En-Tec Diagnostics, Taastrup, Dánia) használtam. 8. A komplementaktivációs kísérletekben, annak biztosítására, hogy csak az alternatív komplement út működhessen, a megfelelő pufferhez 5 mM Mg2+-EGTA-t adtam

törzsoldatból (0,1 M MgCl2, 0,1 M EGTA; Complement Technology Inc, Tyler, USA) kiindulva. A komplementrendszer működésének blokkolásához 5 mM EDTA- t (09171-1-01-38, Reanal Laborvegyszer Kft., Budapest) adtam a pufferbe. 9. A terminális út szintjén végzett komplementaktivációs kísérletekhez használt zimozánt a Complement Technology cégtől vásároltuk (Tyler, USA).

4.1.4. Az mCRP előállítása CRP-ből denaturációval

A pentameres szerkezetű CRP könnyen monomer egységekre bontható urea és EDTA segítségével [Kresl 1998]. Kresl nyomán az alábbi módon állítottam elő mCRP preparátumokat. 400 µg rekombináns emberi CRP-hez ureát (8 M végkoncentráció), EDTA-t (10 mM végkoncentráció) és kb. 2,5 mg NaOH-ot (az EDTA oldódásának elősegítésére) adtam. Az elegy térfogatát 1,5 ml-re egészítettem ki Ca2+- és Mg2+-mentes DPBS pufferrel. Egy órás rázatás (37°C, 500 rpm) után a fehérjét 3 kDa-os Amicon Ultra koncentráló cső (Merck Kft., Budapest) segítségével mostam és koncentráltam. A preparátum koncentrációját cseppfotométerrel (NanoDrop) határoztam meg.

4.2. Az alkalmazott módszerek

4.2.1. Fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatása

Az egyes fehérjék egymáshoz való kötődését ELISA módszerrel vizsgáltam. Ehhez és általában a dolgozatban bemutatott kísérletekhez Microlon (655061, „High binding”) 96 lyukú ELISA lemezeket (Greiner Bio-One Hungary Kft, Budapest) használtam fel. A kísérletekhez általában Ca2+- és Mg2+-tartalmú DPBS puffert használtam, eltérő esetben ld. az adott kísérlet leírását az Eredmények című részben. Az egyes pufferek összetételének leírása megtalálható a 4.1.3. részben. A kísérleteket az ELISA módszerének általános gyakorlata szerint végeztem el. A lemez lyukaiba az egyes reagensek 50 µl végtérfogatban kerültek bele. A szilárd felülethez történő adszorpcióhoz („coat” készítéshez) általában az adott fehérje 5 µg/ml oldatát használtam, az inkubáció 4°C-on történt egy éjszakán át. A blokkolást a 4.1.3. alfejezet 5. pontjában leírt anyagok segítségével 1 órán át, 20°C-on végeztem. Az inkubációs lépések 20°C-on vagy – ha az adott kísérletnél külön jeleztem – 37°C-on, egy órán át történtek. Az ellenanyagokat jellemzően a gyári oldat 200-2000-szeres hígításában használtam fel. Az egyes lépések között 0,05% Tween 20-at tartalmazó pufferrel mostam a lemez lyukait. A HRP-konjugált ellenanyagok láthatóvá tételéhez TMB Plus kromogén szubsztrátot, a színrekació leállításához 0,2 M H2SO4-oldatot használtam. Az abszorbanciát 450 nm-en mértem spektrofotométerrel (Thermo Scientific Multiskan EX).

Egyes fehérjék emberi szérumból adott ligandumhoz történő kötődését (pl. a szérumbeli FHR-5 kötődését PTX3-hoz) ELISA és Western blot technikák kombinálásával mutattam ki. Ehhez a fent leírt ELISA elrendezésben a megfelelő lyukakba 25% vagy 50% NHS-t adtam, majd egy órás 37°C-os inkubáció után a lyukakat mostam. Az ELISA lemezre immobilizált ligandumokhoz kötődött fehérjéket SDS-tartalmú mintapufferrel eluáltam, majd az egyes lyukakból származó fehérjéket 10% SDS-PAGE gélben elektroforézis segítségével szétválasztottam. A blottolást a Bio-Rad cég (Bio-Rad Magyarország Kft., Budapest) gyorsblottoló rendszerével (Trans-Blot Turbo Transfer System) végeztem a gyártó által javasolt puffer (10026938) segítségével. A nitrocellulóz membrán blokkolását a 4.1.3. alfejezet 5. pontjában leírt összetételű oldattal végeztem. Mosási lépések közbeiktatásával a megfelelő (elsődleges, jelöletlen és/vagy HRP-konjugált) ellenanyagokkal inkubáltam a membránt. Az inkubációk 20°C-on ~ 1 órán át, vagy 4°C-on egy éjszakán át történtek. A detektáláshoz kemilumineszcens HRP szubsztrátot (WBKLS0500, ECL detekciós kit, Merck Kft., Budapest) használtam. Molekulatömeg markerként a Lonza előfestett „ProSieve QuadColor” (193837; 4,6-300 kDa) termékét használtam.

4.2.2. Kompetíciós kísérletek

Az in vitro kompetíciós kísérletek során az előző pontban leírt ELISA-ra vonatkozó lépések szerint jártam el. A puffer Ca2+- és Mg2+-tartalmú DPBS volt, a blokkoláshoz 4 m/V % BSA-t használtam. Az inkubációk 20°C-on történtek. Az egyes kísérletekre vonatkozó specifikus adatokat tartalmazza a 4.1. táblázat. A „coat” cellákban zárójelben az ELISA lemezek típusa szerepel (ld. 4.2.1. és 4.2.4.1.).

4.2.3. Kofaktor esszék

Az FHR-3 esetleges kofaktor aktivitását a C3b inaktiválásban – folyadék fázisban – az alábbiak szerint vizsgáltam. Háromszor 200 ng C3b-t és 100 ng FI-t egy-egy mikrocentrifuga csőben Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS pufferben előinkubáltam (10 min, 37°C), majd hozzájuk FH-t (210 nM), FHR-3-at (2 µM) vagy puffert adtam 15 µl végtérfogatban. Inkubáció (37°C, 1 h) után redukáló körülmények között SDS-PAGE/Western blot technikával (ld. 4.2.1.) vizsgáltam a mintákat. Detektáló ellenanyagként a C3b-t és hasítási fragmentumait (a C3d kivételével) felismerő, HRP-konjugált poliklonális anti-humán C3-at (antiszérum) használtam 1250-szeres hígításban.

Kompetáló anyagok és koncentrációjuk 50 Elsődleges Másodlagos Kísérlet „Coat” µl végtérfogatra ellenanyag ellenanyag számolva 5 µg/ml 5 µg/ml PTX3 + PTX3 és mCRP FHR-1 mCRP növekvő biotinilált anti- streptavidin- közötti kompetíció (High mennyiségben (0-20 PTX3, 1 µg/ml HRP, 1 µg/ml FHR-1-en binding) µg/ml) poliklonális 10 µg/ml FHR-1 és FH 5 µg/ml mCRP + kecske anti-CRP poliklonális FH15-20 közötti kompetíció 1 µM (38,5 µg/ml) (1000-szeres nyúl anti-kecske (High mCRP-n FHR-1 hígítás, Ig, 0,5 µg/ml binding) antiszérum) FHR-1/FHR-3 és 5 µg/ml FHR-1 vagy FHR-3 (0- monoklonális poliklonális FH közötti MDA-BSA 240 nM), HSA (240 anti-FH (A254), kecske anti-egér kompetíció MDA- (High nM) 15 percig + FH 4 µg/ml Ig, 1 µg/ml BSA adduktumon binding) (30 nM) 45 percig FHR-5 (0-20 µg/ml), FHR-5 és FH 5 µg/ml monoklonális poliklonális HSA (20 µg/ml) 20 közötti kompetíció PTX3 anti-FH (A254), kecske anti-egér percig + FH (50 µg/ml) PTX3-on (Nunc) 2 µg/ml Ig, 1 µg/ml 60 percig 5 µg/ml CRP FHR-5 (0-20 µg/ml), FHR-5 és FH monoklonális poliklonális (Ca- és Mg- HSA (20 µg/ml) 20 közötti kompetíció anti-FH (A254), kecske anti-egér mentes percig + FH (50 µg/ml) CRP-n 2 µg/ml Ig, 1 µg/ml DPBS, 60 percig (Nunc) MaxGel 30- FHR-5 (0-20 µg/ml), FHR-5 és FH monoklonális poliklonális szoros HSA (20 µg/ml) 20 közötti kompetíció anti-FH (A254), kecske anti-egér hígításban percig + FH (50 µg/ml) MaxGel-en 2 µg/ml Ig, 1 µg/ml (Nunc) 60 percig

4.1. táblázat. A kompetíciós ELISA kísérletekre vonatkozó adatok. A „coat” cellákban zárójelben az ELISA lemezek típusa szerepel (ld. 4.2.1. és 4.2.4.1.).

A különböző ligandumokhoz (felszínhez) kötődött FH kofaktor aktivitását FHR-5 jelenlétében ELISA lemezek segítségével vizsgáltam. Első lépésként PTX3-at (10 µg/ml, 30 nM), CRP-t (10 µg/ml, 87 nM) és MaxGel-t (1:30 hígításban) immobilizáltam a felszínre Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS-ben. Blokkolás (4 m/V % BSA) után előbb FHR-5-öt (20 µg/ml, 300 nM), majd mosás után FH-t (50 µg/ml, 300 nM) adtam a lyukakba 20°C-on, 1-1 órán át. További alapos mosási lépések után lyukanként, 50 µl térfogatban C3b-t (10 µg/ml, 60 nM) plusz FI-t (20 µg/ml, 220 nM) adtam, és inkubáltam a lemezt 37°C-on 1 órán át. A lyukakból kiszívtam a felülúszót, és 15-15 µl mintához 5-5 µl redukáló SDS mintapuffert adtam, majd 5 percig 95°C-on inkubáltam. SDS-PAGE/Western blot technikával (ld. 4.2.1.) vizsgáltam tovább a mintákat. Detektáló ellenanyagként HRP-konjugált poliklonális anti-humán C3-at (antiszérum) használtam 1000-szeres hígításban.

4.2.4. In vitro alternatív C3-konvertáz esszék

4.2.4.1. A C3bBb konvertáz enzim felépítése

Az FHR fehérjéken felépülő alternatív C3-konvertáz kísérletekhez Nunc („MaxiSorp”) 96 lyukú ELISA lemezeket (Thermo Fisher Scientific) használtam fel. Az adott FHR fehérjét, HSA-t vagy BSA-t (negatív kontroll) 5 µg/ml koncentrációban Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS- ben immobilizáltam. Blokkolás (4 m/V % BSA) és mosás után 10 µg/ml C3b-t adtam a lyukakba (20°C, 1 óra). A konvertázhoz szükséges további komponenseket Ni2+-ionokat tartalmazó pufferben (ld. 4.1.3. rész 3. pont) adtam a lyukakba: FB (2 µg/ml), FD (0,1 µg/ml) és FP (4 µg/ml). Az inkubáció ebben a lépésben 37°C-on 30 percen át tartott. A képződött enzimet kecske poliklonális anti-humán FB ellenanyaggal és a megfelelő HRP-konjugált másodlagos ellenanyaggal detektáltam (1000-szeres hígítású antiszérum, a konvertáz felépítéshez használt pufferben).

4.2.4.2. A C3bBb konvertáz enzim aktivitásának mérése

Az előző pontban leírt módon felépített konvertáz enzim aktivitását 10 µg/ml tisztított humán C3 hozzáadádával ellenőriztem (37°C, 1 óra). Az enzimműködés eredményeképpen képződő C3a-t a felülúszóból egy kereskedelmi forgalomban kapható C3a ELISA kit-tel (MicroVue C3a Plus Enzyme Immunoassay, Quidel, San Diego, USA) mértem, a gyártó által ajánlott protokoll szerint.

4.2.4.3. Az FHR-1 C3bBb konvertáz bomlására gyakorolt hatásának vizsgálata

A 4.2.4.1. pontban leírt módon felépített C3bBb konvertázhoz FH-t (2,5 µg/ml, 16 nM), FHR- 1-et (10 µg/ml, 260 nM), FHR-5-öt (10 µg/ml, 160 nM), FH + FHR-1-et, illetve FH + FHR-5- öt együtt adtam (20°C, 30 perc). A megmaradó konvertáz mennyiségét kecske poliklonális anti- humán FB ellenanyaggal és a megfelelő HRP-konjugált másodlagos ellenanyaggal detektáltam (1000-szeres hígítás, antiszérum).

4.2.5. Komplementaktivációs kísérletek

4.2.5.1. Komplementaktivációs mérések a C3 szintjén

Az FHR fehérjék komplementaktiváló képességét emberi szérummal az alábbiak szerint vizsgáltam. Az FHR fehérjéket (FHR-1, FHR-3, FHR-4A, FHR-4B, FHR-5), és a kontroll fehérjéket (HSA, BSA, C3b, FH) 5 µg/ml koncentrációban Nunc („MaxiSorp”, Thermo Fisher Scientific) ELISA lemezre immobilizáltam Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS-ben. Blokkolás (4 m/V % BSA) és mosás után a megfelelő lyukakba 10 V/V % NHS-t adtam 5 mM Mg2+-EGTA-t vagy 5 mM EDTA-t tartalmazó Ca2+- és Mg2+-mentes DPBS pufferben (37°C, 30 perc). Az aktiváció során lerakódó C3b-t, Bb-t és FP-t a megfelelő elsődleges és másodlagos ellenanyaggal mértem (anti C3-HRP és anti-FB: 1000-szeres hígítású antiszérum, egér anti-FP: 1 µg/ml, nyúl anti-kecske-HRP: 0,5 µg/ml, kecske anti-egér-HRP: 1 µg/ml). Az egyes ligandumokon megvalósuló FH és FHR-1/FHR-3/FHR-5 közötti kompetíciót követő komplementaktivációt hasonlóan, NHS-sel mértem. Nunc ELISA lemezekre CRP-t (10 µg/ml), PTX3-at (10 µg/ml) és MaxGel-t (1:30 hígítás) immobilizáltam Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS-ben. Blokkolás (4 m/V % BSA) és mosás után a lyukakba 12,5 V/V % (CRP és PTX3 esetében) vagy 25 V/V % (MaxGel esetében) NHS-t adtam FHR-1 (38,5 µg/ml, 1 µM), FHR-3 (12,5 µg/ml, 300 nM), FHR-4A (20 µg/ml, 230 nM), FHR-5 (20 µg/ml, 300 nM) jelenlétében vagy anélkül, DPBS-ben. Az aktivációt jelző C3-fragmentumok lerakódását HRP- konjugált poliklonális kecske anti-C3 ellenanyaggal mértem (1000-szeres hígítású antiszérum).

4.2.5.2. Komplementaktivációs mérések a terminális út (C5b-9) szintjén

Az FHR-1 esetleges terminális út gátló hatását az aktiváció során keletkező C5b-9 komplexek mérésével vizsgáltam. Komplementaktivátorként zimozánt (20 µg/ml) adtam 30 V/V % NHS- hez FHR-1 (2 µM), FH (1 µM), illetve FH + FHR-1 együttes jelenlétében 20 µl végtérfogatban

(Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DPBS). Inkubáció (37°C, 30 perc) után a terminális út működése során képződő szolúbilis C5b-9 komplexeket egy kereskedelmi forgalomban kapható C5b-9 ELISA kit-tel (MicroVue SC5b-9 Plus Enzyme Immunoassay, Quidel, San Diego, USA) mértem, a gyártó által ajánlott protokollt követve.

4.2.6. Statisztikai analízis

A statisztikai vizsgálatokat a GraphPad Prism kiértékelő program 4.00 verziójával (GraphPad Software, San Diego, USA) végeztük. A p<0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

5. Eredmények

5.1. Az FHR-1 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata

Az FHR-1 kötődését PTX3-hoz már kimutatták [Kopp 2012a], de a CRP-vel való kölcsönhatását – az elérhető irodalmi adatok alapján – még nem vizsgálták korábban. Mivel a FH-CRP kölcsönhatást többen részletesen vizsgálták, és lehetséges szerepét gyulladásos folyamatok szabályozásában az AMD kialakulásában korábban már leírták [Jarva 1999, Laine 2007, Skerka 2007, Mihlan 2009b, Hammond 2010, Okemefuna 2010], ezért az FHR-1-gyel kapcsolatos kutatásainkat a doktori témámon belül a molekula CRP-vel való kölcsönhatásának leírására összpontosítottuk.

5.1.1. Az FHR-1 kötődése CRP-hez

Elsőként megvizsgáltuk, hogy a natív FHR-1 fehérje kötődése a CRP-hez kimutatható-e emberi szérumból. A CRP-t ELISA lemezre immobilizáltam és emberi szérummal inkubáltam. A kötődött fehérjéket mosás után SDS tartalmú pufferrel eluáltam, és az eluátumot gélelektroforézis és Western blot módszerekkel vizsgáltam. Az előhíváshoz poliklonális anti-FH ellenanyagot használtam, amely az FHR-1-et is felismeri. Így sikerült kimutatni a szérumbeli FHR-1 izoformák (és a FH) CRP-hez való kötődését in vitro (5.1. ábra).

5.1. ábra. A natív FHR-1 kötődése CRP-hez 50% emberi szérumból in vitro. Az immobilizált CRP-hez kötődő fehérjéket eluálás után 10% SDS-PAGE és nitroceullulóz membránra való blottolást követően Western blot technikával mutattam ki, poliklonális anti-FH ellenanyag segítségével (3. és 4. oszlop). Kontrollként zselatinnal fedett felszínt (1. és 2. oszlop) használtam. Három kísérlet eredményéből egy reprezentatív blotot mutat az ábra [Csincsi 2017, 2. ábra A].

Ezzel a módszerrel azonban nem zárhatjuk ki az indirekt kötődést, például a C3 fragmentumokon keresztül történő kölcsönhatást. Utóbbi magyarázhatja a zselatinhoz, mint negatív kontrollhoz történő FH kötődést (5.1. ábra, 2. sáv). A CRP-ről ismert, hogy számos ligandumához pH-függő módon kötődik: erősebb a kötődés enyhén savas közegben, aminek gyulladás során lehet szerepe [Hammond 2010]. Ezért megvizsgáltuk a natív CRP kötődését FHR-1-hez különböző pH-n. CRP forrásként egy szepszises beteg szérumát használtuk. Míg pH 7,4 értéknél nem volt kötődés, a CRP szignifikánsan kötődött pH 6,5 és pH 5,5 esetén. Az FHR-5 esetében hasonló eredményeket kaptunk, míg a FH-hoz nem kötődött a CRP az adott kísérleti körülmények között (5.2. ábra A). Az eredményeket rekombináns pCRP-vel is megerősítettük (5.2. ábra B).

◄ 5.2. ábra. CRP kötődése FHR-1-hez. A) ELISA lemezre tisztított FH-t, rekombináns FHR-1-et, FHR-5-öt és HSA-t (negatív kontroll) immobilizáltam, majd egy szepszises beteg 161 μg/ml CRP-t tartalmazó, 2,5 V/V %-os szérumát adtam hozzájuk különböző pH-n. A kötődött CRP-t poliklonális anti-CRP ellenanyaggal mértem. B) Az A)-ban leírt kísérletet megismételtem 5 μg/ml (∼43 nM) rekombináns CRP-vel is. Az adatok négy (A), illetve három (B) mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01, one-way ANOVA [Csincsi 2017, 2. ábra B és C].

Az előbbi kísérletek alapján megállapítottuk, hogy a CRP kötődik az FHR-1-hez, viszont az eredmények nem adtak közvetlen információt arról, vajon a CRP melyik formája (mCRP vagy pCRP) vesz részt ténylegesen a kölcsönhatásban. Az immobilizált CRP és az alacsonyabb pH az mCRP formának kedvező. Ezért a pentameres natív forma kötődését az FHR család tagjaihoz megmértem ELISA-val fiziológiás pH-n és Ca2+-tartalmú pufferben. A pCRP erősen kötődött az FHR-4-hez a korábbi eredményeknek megfelelően [Mihlan 2009a], és jóval gyengébben, de szignifikánsan az FHR-3-hoz is (5.3. ábra).

5.3. ábra. pCRP kötődése az FHR molekulacsalád tagjaihoz. Az FHR fehérjéket, a FH-t és a HSA-t (negatív kontroll) ELISA lemezre immobilizáltam ekvimoláris koncentrációban (65 nM), majd rekombináns pCRP-t adtam hozzájuk az ábrán látható kocentrációkban. A kötődött CRP-t poliklonális anti-CRP ellenanyaggal detektáltam. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2017, 3. ábra A].

Az FHR-5 esetében csekély mértékben, csak a legnagyobb vizsgált pCRP koncentrációnál, a FH, FHR-1 és FHR-2 esetében pedig egyáltalán nem tapasztaltunk kötődést ezen a pH-n. Az urea/EDTA kelációval előállított mCRP viszont ugyanilyen körülmények között erősen kötődött a FH-hoz, az FHR-1-hez és az FHR-5-höz is (5.4. ábra).

5.4. ábra. mCRP kötődése FH-hoz, FHR fehérjékhez és a homológ C-terminális doménekhez. Az urea/EDTA kelációval előállított mCRP kötődése. Az ábrán feltüntetett fehérjéket ELISA lemezre immobilizáltam, majd 10 μg/ml mCRP-t adtam hozzájuk, és a kötődést poliklonális anti-CRP ellenanyaggal mértem. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2017, 3. ábra B].

A CRP kötődését az ismert két allélikus FHR-1 izoforma (FHR-1*A és FHR-1*B) esetében is összehasonlítottuk. Az emberi plazmából izolált két formához növekvő koncentrációban adott mCRP esetén nem találtunk különbséget a kötődés erősségében (5.5. ábra). Az FHR-1 és a CRP közötti kölcsönhatást fordított elrendezésben is vizsgáltuk. A CRP- t ELISA lemezre immobilizálva EDTA jelenlétében mCRP-t kapunk [Mihlan 2009b]. Az így előállított mCRP-hez a FH, FHR-1 és FHR-5 hígítási sorait adtam, majd a fehérjék pentraxinhoz történő kötődését mértem. Bár a detektáláshoz használt poliklonális anti-FH ellenanyag az FHR- 5-tel kevésbé reakcióképes, mint az FHR-1-gyel (az FHR-5 szekvenciabeli hasonlósága a FH- éhoz alacsonyabb fokú, mint az FHR-1 hasonlósága a FH-hoz), erősebb kötődést mértem az FHR-5 esetében (5.6. ábra).

5.5. ábra. Növekvő mennyiségben adott mCRP kötődése az FHR-1*A és FHR-1*B izoformákhoz. A szérumból izolált FHR-1 fehérjék ELISA lemezre történő immobilizációja után 10 μg/ml mCRP-t adtam, és a kötődést poliklonális anti-CRP ellenanyaggal mértem. Az adott kísérleti körülmények között nem volt kimutatható különbség az allélikus formák mCRP kötésében. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD) [Csincsi 2017, 3. ábra C].

5.6. ábra. Növekvő mennyiségben adott FH, FHR-1 és FHR-5 kötődése CRP-hez. Az ábrán feltüntetett FHR fehérjék ELISA lemezre kötött, mCRP formában jelenlévő CRP-hez történő kötődését poliklonális anti-FH ellenanyaggal mértem. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard hibájuk (SEM). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; two-way ANOVA [Csincsi 2017, 3. ábra D].

5.1.2. Az mCRP kötőhely azonosítása az FHR-1-ben

Korábban a FH C-terminálisában, a FH19-20 régióban mutattak ki egy mCRP kötőhelyet [Mihlan

2009b]. Az ELISA méréseink szerint az FHR-1 ezzel homológ régiójához, az FHR-14-5-höz is jól kötődik az mCRP in vitro. A többi FHR homológ doménjei esetében nem tapasztaltunk kötődést (5.4. ábra). A kötőhelyet megerősítettük a C18 nevű monoklonális ellenanyaggal is, ami a FH 20. és az FHR-1 5. SCR doménjéhez kötődik [Oppermann 2006, Bhattacharjee 2015]. A C18 szignifikánsan gátolta az mCRP kötődését az FHR-1-hez (kb. 70%-os gátlás), míg a kontrollként használt, a FH egyik középső doménjét felismerő monoklonális ellenanyag (A255) nem befolyásolta a kölcsönhatást (5.7. ábra).

5.7. ábra. Az FHR-1 C-terminálisában lévő mCRP kötőhely izolálása. Az mCRP ELISA lemez felszínéhez kötött FHR-1-hez történő kötődését jelentősen gátolta a FH- és FHR-1-specifikus C18 monoklonális ellenanyag. Kontrollként az A255 jelzésű monoklonális ellenanyagot, detektáláshoz poliklonális anti-CRP ellenanyagot használtam. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 4. ábra A].

Mivel a PTX3 kötődését az FHR-1-hez (ill. a FH-hoz) előzőleg kimutatták a C-terminális régióban, kompetíciós kísérletet terveztünk a két pentraxin között. Az FHR-1-hez egy kiválasztott, állandó koncentrációban adott PTX3 kötődését mértem növekvő mennyiségű mCRP jelenlétében. Az általam alkalmazott legnagyobb mCRP koncentráció (20 μg/ml) esetén kb. 40%-os csökkenés következett be a PTX3 FHR-1-hez történő kötődésében in vitro (5.8. ábra), ami részleges kötőhely-átfedésre utalhat a két pentraxin esetében.

5.8. ábra. PTX3 és mCRP közötti kompetíció vizsgálata FHR-1-ért in vitro. ELISA lemezre immobilizált FHR-1-hez 5 μg/ml PTX3-at adtam különböző koncentrációkban adott mCRP-vel együtt. A detektálást poliklonális anti-PTX3 ellenanyaggal végeztem. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 4. ábra D].

5.1.3. Az FHR-1 és a FH közötti kompetíció az mCRP kötésért

Korábbi in vitro vizsgálatokban megmutatták, hogy az FHR fehérjék és a FH kompetícióba léphetnek egymással különböző ligandumokon (pl. C3b-n [Goicoechea de Jorge 2013], tengerimalac eritrocitákon [Tortajada 2013]). A homológ mCRP kötőhelyek (FHR-14-5 és FH19-

20) alapján feltételeztük, hogy kompetíció léphet fel az FHR-1 és a FH között az mCRP kötésért. Ennek vizsgálatához az mCRP kötőhelyet tartalmazó rekombináns FH15-20 fehérjét ELISA lemez felszínére immobilizáltam, és a hozzáadott mCRP kötődését mértem FHR-1 jelenlétében. Az FHR-1 1 μM koncentrációban adva szignifikánsan gátolta (∼25%-os gátlás) az mCRP FH15-20–hoz való kötődését a kontroll HSA fehérjéhez képest (5.9. ábra). Ezzel szemben az FHR-1 és az FHL-1 között nem tudtunk kimutatni kompetíciót hasonló körülmények között.

5.9. ábra. Az FHR-1 és a FH közötti kompetíció mCRP kötésért in vitro. A FH C-terminális fragmensét

(FH15-20) immobilizáltam, majd 5 μg/ml mCRP-t adtam hozzá 1 μM FHR-1 jelenlétében. A kötődött pentraxint poliklonális anti-CRP ellenanyaggal mértem. Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 5. ábra A].

Az FHR-1 – CRP kölcsönhatás vizsgálatához ELISA lemezt CRP-vel vontam be, és NHS-sel, illetve FH-depletált szérummal inkubáltam. A CRP ismereteinknek megfelelően beindította a komplementaktivációt, viszont a szérumokhoz adott 2 μM FHR-1 sem bizonyult elegendőnek ahhoz, hogy szignifikánsan megnövekedett C3 lerakódást tudjunk kimutatni. Ezzel szemben az FHR-5 már 300 nM koncentrációban adva szignifikáns és jelentős növekedést eredményezett az aktivációban, a C3-specifikus jel szerint (5.10. ábra).

5.10. ábra. Az FHR-1 és a FH közötti kompetíció következménye. A) CRP-t, immobilizáció után NHS-sel inkubáltam önmagában vagy FHR-1 (2 μM), ill. FHR-5 (300 nM) jelenlétében. A CRP által indukált komplementaktiváció során képződött és lerakódott C3-fragmenseket poliklonális anti-C3 ellenanyaggal mértem. B) Az A)-ban leírt kísérletet FH-depletált szérummal (FHD) is megismételtem. Az adatok négy (A), illetve három (B) mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01; ***p < 0,001; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 5. ábra B és C].

5.1.4. Az FHR-1 szerepének vizsgálata a C3-konvertáz és a terminális út szintjén in vitro Az FHR-1-gyel mint komplement inhibitorral kapcsolatban több, ellentmondásos eredményt írtak le eddig [Heinen 2009, Strobel 2011, Goicoechea de Jorge 2013]. Munkánk egyik célkitűzése volt ezért annak tisztázása, hogy az FHR-1 rendelkezik-e komplementet gátló aktivitással. Elsőként az FHR-1-nek a C3-konvertáz felépülésére, illetve stabilitására kifejtett hatását vizsgáltuk. C3b-t ELISA lemezre kötöttem, majd az alternatív út C3-konvertázához szükséges további komponenseket (FB, FD, FP) adtam hozzá FHR-1, FHR-5, FH és BSA jelenlétében, a megfelelő pufferben. Az FHR-1-nek 1 μM koncentrációban nem volt hatása a konvertáz képződésére (az FHR-5, ill. BSA kontroll fehérjékhez hasonlóan), míg a FH – az irodalmi adatoknak megfelelően – az alkalmazott kb. 65 nM koncentrációban szignifikánsan gátolta a FB C3b-hez való kötődését (5.11. ábra A). A képződött konvertáz enzimek funkcionálisan sem károsodtak (a FH esetében mérhető alacsonyabb C3a szint oka a kisebb mennyiségben képződött konvertáz) (5.11. ábra B). Megvizsgáltuk azt is, hogy vajon az FHR-1-nek van-e valamilyen hatása a már kialakult konvertáz enzimre, rendelkezik-e a konvertáz bomlását gyorsító tulajdonsággal (decay accelerating activity). Ehhez az előző bekezdés szerint előállított C3-konvertáz enzimhez FH-t, FHR-1-et vagy FHR-5-öt adtam, és 1 óra elteltével mértem a visszamaradó konvertáz mennyiségét. A FH-ral ellentétben sem az FHR-1, sem az FHR-5 hozzáadása nem csökkentette szignifikánsan az enzim mennyiségét (5.11. ábra C). Továbbá, az FHR-1 a FH-ral együtt adva, 16-szoros moláris feleslegben sem módosította a FH működését. (Az FHR-5 viszont kb. 50%-os csökkenést eredményezett, ami nem volt szignifikáns.) Egy korábbi publikáció szerint az FHR-1 a terminális út aktivációját gátolja [Heinen 2009], bár mások ezt a hatást megkérdőjelezték [Strobel 2011, Goicoechea de Jorge 2013]. Ezért vizsgáltuk az FHR-1 terminális C5b-9 komplexre gyakorolt hatását, zimozán indukálta komplementaktivációs kísérletben. Az élesztő sejtfalából kivont glükán kiváló komplementaktivátor, és humán szérummal való inkubációja után jól mérhető a képződött szolúbilis C5b-9 komplex erre a célra gyártott ELISA kit-tel. Az FHR-1 az általunk alkalmazott legnagyobb koncentrációban (2 μM) sem gátolta a szolúbilis C5b-9 képződését, míg a FH 1 μM koncentráció esetén kb. 40%-os csökkenést eredményezett (5.12. ábra). Az FHR-1 a FH-hoz adva nem módosította annak gátló hatását.

5.11. ábra. Az FHR-1 hatásának vizsgálata az alternatív C3-konvertáz enzim felépülésére és aktivitására. A) ELISA lemezre immobilizált C3b-hez FB-t, FD-t és FP-t adtam FH (10 μg/ml), FHR-1 (50 μg/ml), FHR-5 (10 μg/ml) és BSA (50 μg/ml) jelenlétében (37°C, 30 perc). A konvertázt poliklonális anti-FB ellenanyaggal detektáltam. B) Az A)-ban leírt módon képződött konvertázhoz tisztított humán C3-at (10 μg/ml, 37°C, 1 óra) adtam, és a konvertáz aktivitása következtében képződött C3a-t a felülúszóból ELISA kit-tel (Quidel) mértem. C) A felépített konvertáz enzimet 2,5 μg/ml FH-ral, 10 μg/ml FHR-1- gyel, 10 μg/ml FHR-5-tel, vagy – az előző koncentrációkban – FH és valamelyik FHR fehérje együttesével inkubáltam. Az inkubáció után megmaradó enzim mennyiségét mértem poliklonális anti-FB-ral. Az adatok mindhárom kísérletben három független mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 6. ábra].

5.12. ábra. Az FHR-1 szerepének vizsgálata a terminális komplex szintjén, in vitro. Az alternatív komplement utat 20 μg/ml zimozánnal aktiváltam normál humán szérumban, és a képződött szolúbilis C5b-9 komplexek mennyiségét mértem ELISA kit-tel (Quidel). Az 1 μM koncentrációban alkalmazott kontroll FH gátolta a komplexek képződését, míg az FHR-1 az alkalmazott 2 μM koncentrációban nem volt képes erre, és amikor a FH-ral együtt adtam, nem befolyásolta annak hatását. Az adatok három független mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 7. ábra].

5.1.5. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-1- en Az FHR-1 tehát, eddigi ismereteink és az előző részben leírt eredményeink alapján nem rendelkezik C3b-t, illetve C3-konvertázt szabályozó funkcióval. Tudjuk azonban, hogy az FHR- 4, a C3b kötődésén keresztül részt tud venni egy működőképes C3bBb konvertáz enzim felépítésében in vitro [Hebecker 2012]. Megvizsgáltuk ezért, hogy az FHR-1 esetében tapasztalunk-e hasonlót. Ehhez FHR-1-et immobilizáltam ELISA lemez felszínére, és a konvertáz enzimhez szükséges C3b-t, majd külön lépésben a tovább komponenseket: FB-t, FD- t és properdint adtam. Ebben az in vitro kísérletben szignifikáns mennyiségű C3bBb-t tudtam detektálni (5.13. ábra A). A képződött konvertáz mennyisége szignifikánsan kevesebb volt, mint a C3b kontrollon kialakult enzim mennyisége. Ez az FHR-1-hez kötődött C3b kisebb mennyiségével magyarázható, összevetve a közvetlenül műanyag felszínhez kötött C3b mennyiségével. Az így kialakult konvertáz enzim funkcionálisan is aktív volt, amit a hozzáadott C3 molekulából keletkező C3a megjelenése bizonyított (5.13. ábra B). Az anafilatoxin

53 megjelenése azt jelezte, hogy az FHR-1 – az FHR-4-hez hasonlóan – részt vehet a komplement alternatív útjának aktivációjában. Utóbbit alátámasztja az is, hogy szérumban is sikerült kimutatni a konvertáz keletkezését FHR-1 jelenlétében. Az ELISA lemezre kötött FHR-1-et humán szérummal inkubáltam Mg2+/EGTA tartalmú pufferben, hogy csak az alternatív komplementút mentén történhessen az aktiváció. A pozitív kontrollként használt FHR-4B-hez hasonlóan az FHR-1-hez kötődött C3-fragmensek, FB és properdin jelenlétét tudtam detektálni (5.13. ábra C), ami a felépülő alternatív út C3-konvertázra utal.

► 5.13. ábra. Az FHR-1 elősegíti a komplementaktivációt. A) A C3bBb konvertáz enzim felépülése FHR-1-en. Rekombináns FHR-1-et, BSA-t és C3b-t (negatív, illetve pozitív kontroll) ELISA lemezre immobilizáltam és a lyukakba 10 µg/ml C3b-t adtam. Az alternatív út konvertázát a tisztított komponensek (FB, FD és properdin) hozzáadásával építettem fel a megfelelő pufferben (37°C, 30 perc). Az enzimet poliklonális anti-FB ellenanyaggal detektáltam. Az adatok négy független mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). B) az FHR-1 alapú konvertáz aktivitását 10 µg/ml tisztított C3 hozzáadásával ellenőriztem (37°C, 1 óra). A képződött C3a mennyiségét ELISA kit-tel (Quidel) mértem. Az adatok három független mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). C) Az FHR-1-et immobilizáltam, majd 10 V/V % NHS-sel inkubáltam 5 mM Mg2+-EGTA tartalmú pufferben biztosítva, hogy csak az alternatív komplement út működhessen. A C3b, a Bb és a properdin lerakódást a megfelelő ellenanyagokkal detektáltam. Az FHR-4B-t és a HSA-t pozitív, illetve negatív kontrollként használtam. Az adatok három független mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; one-way ANOVA [Csincsi 2017, 9. ábra].

5.2. Az FHR-3 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata

Az FHR-3 mások által korábban leírt kísérleti eredmények szerint kofaktor aktivitással rendelkezik, illetve segíti, fokozza a FH kofaktor aktivitását [Hellwage 1999, Fritsche 2010]. Mivel ezekben a kísérletekben nagy FHR-3 koncentrációkat használtak, egyik célkitűzésünk volt ennek az aktivitásnak a vizsgálata. További célunk volt az FHR-3 egyes potenciális ligandumokkal való kölcsönhatásainak vizsgálata is.

5.2.1. Az FHR-3 kofaktor aktivitásának vizsgálata

A kofaktor aktivitást folyadék fázisban Western-blot technika segítségével vizsgáltam. A C3b, és a hasítást végző FI keverékéhez FH-t (pozitív kontroll), illetve FHR-3-at adtam. Inkubáció (37°C, 1 óra) után a komponenseket redukáló körülmények között elválasztottam (SDS-PAGE), majd blottoltam. Az előhívást poliklonális anti-C3 ellenanyaggal végeztem. A kísérleti körülmények között az FHR-3 2 µM (~100 µg/ml) koncentráció alkalmazása mellett sem mutatott kofaktor aktivitást, szemben a FH-ral (210 nM) (5.14. ábra).

5.14. ábra. Az FHR-3 kofaktor aktivitásának vizsgálata folyadék fázisban. C3b (200 ng) és FI (100 ng) keverékét 37°C-on, 1 órán át inkubáltam, majd az elegy komponenseit 10% SDS-PAGE módszerrel szétválasztottam redukáló körülmények (2-merkaptoetanol) között. Blottolás és poliklonális anti-C3 ellenanyaggal való detektálás után jól láthatóvá váltak a C3b alfa’ és béta láncai (1). Ha az inkubáció előtt FH-t (210 nM) adtam az elegyhez, akkor az FI működésbe lépett, és a C3b alfa’ láncának hasítási termékei megjelentek a reakcióelegyben (2). A FH helyett FHR-3-at adva, még 2 µM koncentráció esetén sem tapasztaltam kofaktor aktivitást (3). Az ábra három független kísérlet egyikének eredményét mutatja.

5.2.2. Pentraxinok kötődése FHR-3-hoz

Az FHR-1 új ligandumaként azonosítottuk a CRP-t (ld. 5.1.1. alfejezet). Annak vizsgálatakor, hogy melyik izoforma (mCRP vagy pCRP) lép kölcsönhatásba az FHR-1-gyel, láttuk, hogy az FHR-3 is szignifikánsan és koncentrációfüggő módon kötődik a pCRP molekulához (ld. 5.3. ábra). Újabb kísérletben megvizsgáltam, hogy van-e kölcsönhatás az FHR-3 és az egyik hosszú pentraxin, a PTX3 között. Az 5.15. ábrán feltüntetett eredményből jól látszik, hogy a PTX3 szignifikánsan kötődik az FHR-3-hoz, csakúgy, mint a pozitív kontrollként használt C1q molekulához is.

5.15. ábra. PTX3 kötődése FHR-3-hoz. 5 µg/ml PTX3-at adtam ELISA lemezre immobilizált FHR-3-hoz, C1q-hoz (pozitív kontroll) és HSA-hoz (negatív kontroll), Ca2+-tartalmú PBS pufferben. A kötődött pentraxint poliklonális, biotinilált anti-PTX3-mal és Streptavidin HRPO-val mértem. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one- way ANOVA.

Mivel tehát a PTX3 kötődik C1q-hoz és FHR-3-hoz is, megvizsgáltuk a három molekula kölcsönhatását egymással, az alábbi kísérleti elrendezésben. Felszínhez kötött FHR-3-hoz első lépésben 5 µg/ml PTX3-at, majd mosási lépéseket követően 25 µg/ml C1q-t adtam. A C1q kötődését poliklonális anti-C1q ellenanyagot felhasználva mutattam ki. A PTX3 FHR-3-hoz való kötődése nem befolyásolta előbbi képességét, hogy kösse a C1q-t (5.16. ábra).

5.16. ábra. C1q kötődése FHR-3-hoz kötődött PTX3-hoz. Immobilizált zselatinhoz (negatív kontroll), ill. FHR-3-hoz első lépésben 5 µg/ml PTX3-at adtam. Mosási lépések után 25 µg/ml C1q-t adtam az ELISA lemez lyukaiba. A kötődött C1q-t poliklonális anti-C1q ellenanyaggal mértem. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA.

5.2.3. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-3 fehérjén Mivel az FHR-4-en, és az előző fejezetben leírt kísérleti eredmények alapján az FHR-1-en is felépülhet az alternatív útvonal C3-konvertáza, megvizsgáltuk, hogy ez az FHR-3 esetében is lehetséges-e, különös tekintettel arra, hogy az FHR-3 és az FHR-4 C-terminális doménjeinek aminosav szekvenciái nagyfokú egyezést mutatnak (2.2. ábra, 15. oldal). Az FHR-3-at, FHR-4B-t (pozitív kontroll) és HSA-t (negatív kontroll) ELISA lemez felszínére immobilizáltam, majd C3b-t adtam hozzájuk. A konvertázhoz szükséges további komponensekkel (FB, FD, properdin) történő inkubáció után a létrejött enzimet poliklonális anti-FB ellenanyaggal detektáltam. Az FHR-4 esetéhez hasonlóan jelentős mennyiségű konvertáz képződött a felszínhez kötött FHR-3 molekulán is, a HSA-hoz viszonyítva (5.17. ábra).

5.17. ábra. Az alternatív út C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-3-on. ELISA lemezre FHR-3-at, FHR-4B-t és HSA-t immobilizáltam, majd 10 μg/ml C3b-t adtam hozzájuk. A konvertáz enzimet a további komponensek (FB, FD és FP) hozzáadásával építettem fel (30 perc, 37°C). A detektálás poliklonális anti- FB ellenanyaggal történt. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA.

Az így felépült konvertáz működőképességét is vizsgáltam. 10 µg/ml C3-mal való inkubáció után, az enzimműködés következtében képződött C3a fragmentumot tudtam mérni a felülúszóban egy kereskedelmi forgalomban elérhető C3a ELISA kit-tel (5.18. ábra). Tehát az FHR-3-on is egy működőképes C3-konvertáz enzim épülhet fel.

5.18. ábra. Az 5.17. ábra alatt leírt módon felépített konvertázhoz 10 μg/ml C3-at adtam (1 h, 37°C), majd a keletkezett C3a fragmentumot ELISA kit-tel (Quidel) mértem. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA.

Az előző két eredmény alapján feltételeztük, hogy az FHR-3 is képes a komplementrendszer aktivációjára az alternatív út beindítása révén. Ennek igazolására az FHR- 3-at 10% humán szérummal inkubáltam Mg2+/EGTA tartalmú puffer jelenlétében, hogy kizárjam a klasszikus és a lektin út működését. A megfelelő ellenanyagokkal detektálni tudtam a C3b, Bb, és properdin lerakódását az FHR-3 tartalmú lyukakban (5.19. ábra). Az ábrán az is jól látszik, hogy EDTA jelenlétében – a komplement működéséhez szükséges Ca2+- és Mg2+-ionok kivonása miatt – nem történt Bb és properdin depozíció. Az anti-C3 ellenanyaggal mért jel valószínűleg a C3b FHR-3-hoz, illetve FHR-4-hez történő közvetlen kötődésének következménye.

► 5.19. ábra. Az FHR-3 általi komplementaktiváció. Az FHR-3-at, FHR-4B-t (pozitív kontroll) és HSA- t (negatív kontroll) ELISA lemezre immobilizáltam, majd 10% normál humán szérummal inkubáltam 5 mM Mg2+-EGTA-t vagy 5 mM EDTA-t tartalmazó pufferben. A C3b (A), Bb (B) és FP (C) lerakódását a megfelelő ellenanyagokkal detektáltam. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA.

5.2.4. Az FHR-3 komplement működésre gyakorolt hatása pentraxin ligandumokon Az FHR-3 kötődése pentraxinokhoz elméletileg az FHR fehérje FH-ral való kompetícióját vonhatja maga után ezeken a ligandumokon. Ennek vizsgálatára ELISA lemezre immobilizáltam a pentraxinokat (és az ECM modell MaxGel-t), majd NHS-t adtam hozzájuk FHR-3 jelenlétében vagy anélkül. A poliklonális anti-C3 ellenanyaggal mérve a C3 depozíciót jól látszik, hogy az FHR-3 jelenléte az adott kísérleti körülmények között elősegítette a komplementaktivációt mindkét pentraxinon (5.20. ábra). A MaxGel esetében nem tapasztaltam szignifikáns hatást. Az FHR-5 ebben a kísérletben pozitív kontrollként szerepelt (ld. később, 5.3.7. alfejezet).

5.20. ábra. Az FHR-3 komplementaktivációt moduláló hatása. ELISA lemezre CRP-t, PTX3-at és MaxGel-t immobilizáltam, majd NHS-t (12,5 V/V % a pentraxinok esetében, 25 V/V % MaxGel esetében) adtam hozzájuk FHR-3, illetve FHR-5 jelenlétében vagy nélkülük. Az FHR-3 koncentrációja 300 nM (CRP), illetve 600 nM (PTX3, MaxGel) volt, míg az FHR-5 koncentrációja 300 nM volt minden esetben. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, one-way ANOVA.

5.2.5. Az FHR-3 kompetíciója FH-ral malondialdehiden

A FH malondialdehidhez való kötődése, illetve az oxidatív stressz elleni védelemben játszott szerepe korábbi irodalmi adatok alapján ismert (ld. 31. oldal). Mivel a FH 7. SCR doménjének kritikus szerepe van ezekben a folyamatokban, és az FHR-3 homológ doménje nagyfokú szekvenciabeli hasonlóságot mutat ezzel a doménnel (ld. 2.2. ábra), megvizsgáltuk, hogy az FHR-3 kötődik-e malondialdehidhez.

Ehhez elsőként ELISA lemezre MDA-BSA adduktumot immobilizáltam, majd FHR-3- at adtam hozzá növekvő koncentrációban, 30 nM-ig. Az FHR-3 koncentrációfüggő módon és szignifikánsan kötődött az adduktumhoz (5.21. ábra).

5.21. ábra. Az FHR-3 malondialdehid-BSA adduktumhoz való kötődése. Az MDA-BSA adduktumot ELISA lemez felszínére immobilizáltam (5 µg/ml), majd a rekombináns FHR-3 fehérjét a 0-30 nM (0- 1,2 µg/ml) koncentráció-tartományban adtam hozzá. A kötődött fehérje mennyiségét poliklonális nyúl anti-FHR-3 ellenanyaggal és a megfelelő HRP-konjugált másodlagos ellenanyaggal mértem. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD).

A fenti adatok birtokában FH/FHR-3 és – az ismert ΔCFHR3-CFHR1 géndeléció miatt – FH/FHR-1 kompetíciós kísérletet terveztünk. Az immobilizált MDA-BSA adduktumhoz 30 nM FH-t adtam különböző koncentrációjú (0-240 nM) FHR-1, illetve FHR-3 jelenlétében. Az FHR fehérjék mellett az MDA-BSA-hoz kötődő FH mennyiségét anti-FH ellenanyaggal mértem. Az 5.22. ábrán jól látszik, hogy az FHR-3 koncentrációfüggően és jelentősen visszaszorította a FH kötődését az adduktumhoz, míg a negatív kontroll HSA-nak a legnagyobb koncentrációban sem volt hatása. Az FHR-1 az FHR-3-hoz viszonyítva kevésbé tudta gátolni a FH kötődését MDA-BSA-hoz.

5.22. ábra. Az FHR-1 és az FHR-3 kompetíciója FH-ral MDA-BSA adduktumon. Az adduktumot ELISA lemez felszínére immobilizáltam (5 µg/ml), majd 30 nM FH-t adtam hozzá növekvő mennyiségű (0-240 nM) FHR-1, illetve FHR-3 jelenlétében. A kötődött FH mennyiségét monoklonális anti-FH ellenanyaggal (A254) mértem. A 450 nm-en mért abszorbancia értékeket a 0 nM FHR-1/FHR-3 esetén mért abszorbanciához (100%) képest ábrázoltam. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01, one-way ANOVA.

5.3. Az FHR-5 komplementaktivációban játszott szerepének vizsgálata 5.3.1. Az FHR-5 kötődése PTX3-hoz

Mivel ismert volt, hogy a szérumbeli FH és FHR-1 molekulák kötődnek a PTX3-hoz [Kopp 2012], megvizsgáltuk, hogy kimutatható-e hasonló kölcsönhatás az FHR-5 és a PTX3 esetében. Anne Kopp előkísérletei során PTX3-mal borított ELISA lyukakat emberi szérummal inkubált és a felülethez kötődött fehérjéket SDS-PAGE, illetve Western blot módszerrel vizsgálta. Az FHR-5-re specifikus ellenanyaggal ily módon sikerült kimutatnia a natív FHR-5 kötődését a PTX3 molekulához (5.23. ábra). 5.23. ábra. Natív FHR-5 kötődése PTX3-hoz. Az ELISA lemezre immobilizált PTX3-at vagy zselatint 25% emberi szérummal inkubálva, majd mosás után SDS-mintapufferrel eluálva a kötődött fehérjék tovább vizsgálhatók. Az FHR-5-re specifikus monoklonális ellenanyag az eluátumok FHR-5 tartalmát mutatja 10%-os SDS-PAGE elválasztás, valamint Western blot technika alkalmazása után. Az ábra bal szélső oszlopában látható fehérjecsíkok a gélre pozitív kontrollként felvitt NHS-ben detektált FHR-5-öt, illetve FH-t mutatják. Három kísérlet eredményéből egy reprezentatív blotot mutat az ábra [Csincsi 2015, 1. ábra B].

Mivel ez a módszer nem feltétlenül a közvetlen kölcsönhatást mutatja ki, hanem például az FHR-5 kötődését indirekt módon, C3-fragmentumokon keresztül, ezért a kötődést a kereskedelmi forgalomban kapható rekombináns FHR-5-tel részletesebben is vizsgáltam ELISA módszerrel. A méréseim szerint az FHR-5 (és a FH, összhangban a korábbi eredményekkel) koncentráció-függő módon és szignifikánsan kötődik a PTX3-hoz in vitro, és a kötődés az FHR- 5 esetében hangsúlyosan kisebb koncentrációnál megy át telítésbe, mint a FH esetében (5.24. ábra). Másik irányból megközelítve, ha immobilizált FHR-5-höz növekvő mennyiségben PTX3- at adunk, akkor a kötődött PTX3 növekvő mennyiségét tudjuk kimutatni (Anne Kopp mérése, 5.25. ábra). Dózisfüggő kötődést látunk az 1-10 nM tartományban, azonban az affinitás/aviditás meghatározása nehézkes az FHR-5 homodimeres, illetve a PTX3 oktameres szerkezete miatt.

5.24. ábra. Az FHR-5 és a FH PTX3-hoz való kötődésének összehasonlítása. Immobilizált PTX3-hoz, ill. zselatinhoz az ábrán feltüntetett koncentrációkban rekombináns FHR-5-öt, illetve tisztított FH-t adtam, és a fehérjék kötődését poliklonális anti-FH ellenanyaggal detektáltam. Az adatok négy mérésből származó középértékek és standard hibájuk (SEM). Mindkét fehérje szignifikánsan erősebben kötődött PTX3-hoz, mint a zselatin kontrollhoz (p< 0,001, two-way ANOVA) [Csincsi 2015, 1. ábra C].

5.25. ábra. Növekvő mennyiségű PTX3-at felülethez kötött FHR-5-höz adva telítési profilt látunk. A kötődött PTX3 mennyiségét kalibrációs görbe segítségével határozta meg Anne Kopp. Az adatok nyolc mérésből származó középértékek és standard hibájuk (SEM) [Csincsi 2015, 1. ábra D].

5.3.2. Az FHR-5 – PTX3 kölcsönhatás jellemzése

Ahhoz, hogy összehasonlítsam a PTX3 kötődését a FHR család egyes tagjaihoz, ekvimoláris mennyiségű FH-t, FHR-1-et, FHR-4A-t és FHR-5-öt ELISA lemezre kötöttem, és a PTX3-at a folyadék fázisban adtam hozzájuk. A PTX3 az FHR-5-höz a FH-hoz történő kötődéshez képest szignifikánsan erősebben kötődött, míg az FHR-1 alacsonyabb PTX3-kötő képességet mutatott (5.26. ábra). Az FHR-4A kötődése a PTX3-hoz a leggyengébb a vizsgált FHR-ek közül, hasonlóan az FHR-4B-re mások által kapott eredményhez [Deban 2008].

5.26. ábra. A PTX3 különböző FHR fehérjékhez történő kötődésének összehasonlítása. Az ábra vízszintes tengelye mentén feltüntetett fehérjéket 200 nM-os koncentrációban immobilizáltam ELISA lemezen, és 5 μg/ml PTX3-at adtam hozzájuk (37°C, 1 óra). A kötődött PTX3-at egy poliklonális anti- PTX3 ellenanyaggal detektáltam. Az értékek a PTX3 – FH kötődésre normalizáltak és három független mérésből származó középértékek, illetve standard hibák (SEM). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 2. ábra A].

A kötődésben szerepet játszó pentraxin domén feltérképezéséhez a teljes rekombináns PTX3 fehérjét, valamint annak N- és C-terminális fragmenseit ELISA lemezre kötöttem és rekombináns FHR-5-tel való inkubáció után mértem az utóbbi fehérje kötődött mennyiségét. Az FHR-5 a PTX3 molekula mindkét doménjéhez kötődött (5.27. ábra A). A mérésben kontrollként használt FH szintén mindkét fragmenshez kötődött, míg a FH8-14 egyikhez sem, összhangban Deban és munkatársainak eredményeivel [Deban 2008].

5.27. ábra. Az FHR-5 – PTX3 kölcsönhatásban szerepet játszó domének feltérképezése. A) PTX3-at, PTX3 N- és C-terminális fragmentumát ELISA lemezen immobilizáltam (5 μg/ml), és FH (40 μg/ml),

FH8-14 (10 μg/ml), ill. FHR-5 (10 μg/ml) hozzáadása után poliklonális anti-FH ellenanyaggal mértem a fehérjék kötődését. **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA. B) A PTX3 kötődése az FHR fehérjék

FH19-20 doménjével homológ doménjeihez, ELISA módszerrel mérve. Az abszcisszán felsorolt fehérjéket immobilizáltam (5 μg/ml) majd PTX3-at (10 μg/ml) adtam hozzájuk, és poliklonális anti-PTX3 ellenanyaggal mértem a kötődést. Az adatok négy (A), illetve három (B) mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 3. ábra A és B].

Az FHR-5 PTX3-hoz való kötődéséért felelős domén(ek) meghatározásához a kiindulópontunk az volt, hogy korábbi eredmények alapján a FH – PTX3 kölcsönhatásban a

FH19-20 C-terminális doméneknek fontos szerepe van [Deban 2008, Kopp 2012]. Megvizsgáltuk tehát az FHR-5, illetve a többi FHR fehérje homológ régióinak kötődését a PTX3 molekulához.

Az FHR-58-9-hez nem kötődött a PTX3, míg a teljes FHR-5 fehérjéhez igen (5.27. ábra B). A

FH19-20 és az FHR-14-5 fragmenseket kivéve az FHR-23-4, FHR-34-5 és az FHR-48-9 doménekhez sem kötődött a PTX3. Az FHR-5-ben a PTX3 kötőhely tehát feltehetően a molekula középső, SCR3-7 doménjeiben található. Az N-terminálisán belső duplikációt tartalmazó mutáns FHR-5 (mutFHR-5, ld. FHR-5 nefropátia, 25. oldal) kötődését is megvizsgáltuk. Ebben a fehérjében az első két SCR egység kétszer szerepel egymás után. Ezen domének lehetséges szerepét a PTX3-mal való kölcsönhatásban ELISA és SDS-PAGE/Western-blot módszerekkel tanulmányoztam. A mérések alapján a mutFHR-5-höz kevesebb PTX3 kötődött, mint a vad típusú, rekombináns

68 fehérjéhez (5.28. ábra A). Ezzel szemben a komplementaktivációs folyamatokban központi szerepet játszó C3b molekula hasonló mértékben kötődött mindkét FHR-5 változathoz. A fenti különbséget szérumbeli FHR-5-tel is sikerült kimutatni. PTX3-mal, illetve CRP- vel fedett ELISA lemez lyukait normál humán szérummal, illetve a vad típusú fehérje mellett mutFHR-5-öt is tartalmazó beteg szérumával inkubáltam. A kötődött fehérjéket a lemezről történő elúció, valamint SDS-PAGE – Western blot kombinált technikával, poliklonális anti- FHR-5 ellenanyaggal detektáltam. Bár a beteg szérumában a mutFHR-5 mennyisége nyilvánvalóan nagyobb, mint a vad típusú fehérje mennyisége (5.28. ábra, B), a pentraxinokhoz való kötődéskor halványabb fehérjecsíkokat láthatunk a mutFHR-5 esetében, jelezve a gyengébb kölcsönhatást (5.28. ábra, B).

5.28. ábra. A mutFHR-5 szerepének vizsgálata a PTX3-mal való kölcsönhatásban. A) 10 μg/ml mutFHR- 5, FHR-5 és zselatin kontroll immobilizációja után 10 μg/ml PTX3-at, C3b-t és poliklonális anti-FHR-5 ellenanyagot adtam az ELISA lemez lyukaiba. Az adatok négy mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05, one-way ANOVA. B) PTX3-mal (1-3. oszlop) és CRP-vel (4-6. oszlop) fedett ELISA lyukakban 50% normál humán szérumot (NHS, 2. és 5. oszlop), illetve egy beteg mutFHR-5-öt és vad típusú fehérjét is tartalmazó szérumát (3. és 6. oszlop) inkubáltam. A kötődött fehérjéket elúció után 10%-os SDS-PAGE/Western blot technikával és poliklonális anti-FHR-5 ellenanyaggal mutattam ki. A 7. és 8. oszlopok a poliklonális ellenanyag reaktivitását mutatják a gélre felvitt 1-1 μl NHS-sel, illetve betegszérummal [Csincsi 2015, 3. ábra C és D].

5.3.3. A C3b és a C1q hatása az FHR-5 – PTX3 kölcsönhatásra

Vizsgáltuk, hogy az FHR-5 fő ligandumaként ismert C3b befolyásolja-e az FHR-5 PTX3-mal való kölcsönhatását. A műanyag felszínre kötött FHR-5-öt növekvő koncentrációjú C3b-vel előinkubáltam, majd 5 μg/ml PTX3-at adtam az ELISA lemez megfelelő lyukaihoz. Bár – ahogy az várható volt – a C3b koncentrációfüggő módon kötődött az FHR-5-höz, nem befolyásolta a PTX3 kötődését az alkalmazott 50 μg/ml koncentrációig (nincs ábrázolva). Mivel a PTX3-hoz kötődő C1q molekula elindíthatja a komplementaktiváció klasszikus útját, az FHR-5 lehetséges szerepét vizsgáltuk ebben a mechanizmusban is. Immobilizált PTX3- at növekvő mennyiségű FHR-5-tel előinkubáltam, majd adott mennyiségű C1q kötődését mértem. Az FHR-5 részlegesen gátolta a C1q PTX3-hoz való kötődését, az alkalmazott kísérleti körülmények között kb. 50%-ig (5.29. ábra A). Fordított elrendezésben az FHR-5-höz kötött PTX3 molekula C1q-kötő képességét vizsgáltuk. A C1q kötődött az immobilizált FHR-5-höz, és a kötődés erőssége számottevően megnövekedett az FHR-5-höz kötődött PTX3 jelenlétében (5.29. ábra B). A C1q tehát képes kötődni az FHR-5-tel kölcsönhatásban lévő PTX3-hoz is.

5.29. ábra. A) A C1q kötődését mértem PTX3-hoz növekvő mennyiségű FHR-5, illetve FH jelenlétében ELISA-val, anti-C1q ellenanyaggal. B) A C1q kötődik az FHR-5-höz kötődött PTX3-hoz. Immobilizált (5 µg/ml) FHR-5-öt 5 µg/ml PTX3-mal, majd 25 vagy 50 µg/ml C1q-val inkubáltam. A C1q kötődést anti- C1q-val mértem, zselatint használtam negatív kontrollként. Az adatok négy mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, two-way (A) és one-way (B) ANOVA [Csincsi 2015, 4. ábra A és B].

5.3.4. Az FHR-5 gátolja a FH – PTX3 kölcsönhatást

A FH kötődése a PTX3-hoz gátolhatja a komplement aktivációját [Deban 2008, Kopp 2012]. Az FHR-5 lehetséges szerepét a fenti két fehérje kölcsönhatásában vizsgálva kiderült, hogy az FHR-5 koncentráció függő módon, számottevően képes gátolni a FH kötődését a pentraxinhoz, in vitro (5.30. ábra A). A fenti kompetíció funkcionális következményét vizsgálva kimutattuk, hogy az FHR-5 szignifikánsan csökkenti a PTX3-hoz kötődött FH kofaktor aktivitását in vitro (a FH leszorítása által). Az 5.30. B ábrán lévő Western blot képén jól látszik, hogy a pentraxinhoz kötődött FH jelenlétében az FI képes hasítani a C3b-t (2. sáv), míg ezt a hatást a hozzádott FHR- 5 jelentősen csökkenti (3. sáv). Az FHR-5-nek ilyen körülmények között nem sikerült kimutatni önálló kofaktor aktivitását (4. sáv).

5.30. ábra. Az FHR-5 és a FH közötti kompetíció és következménye PTX3-on. A) 50 μg/ml (300 nM) FH kötődését mértem PTX3-hoz növekvő koncentrációjú FHR-5 jelenlétében, maximum 20 μg/ml (∼300 nM) koncentrációig, ELISA-val. A detektáláshoz egy anti-FH monoklonális ellenanyagot használtam. A kontroll HSA nem, viszont az FHR-5 szignifikánsan gátolta a FH kötődését (20 μg/ml, párosítatlan t-próba, p=0,0005). Az adatok négy mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). B) PTX3-hoz kötődött FH kofaktor aktivitását FHR-5 jelenlétében Western blottal vizsgáltam. ELISA lemezt PTX3-mal (10 μg/ml) fedve 50 μg/ml FH-ral inkubáltam 20 μg/ml FHR- 5 jelenlétében vagy anélkül a blot alatti jelzéseknek megfelelően. A lyukakba C3b-t és FI-t adtam, majd inkubáció után gélelektroforézissel szétválasztottam a komponenseket, és a blotot poliklonális anti-C3 ellenanyaggal hívtam elő. Ez az ellenanyag a C3b-t és fragmenseit a C3d kivételével felismeri. Az ábra jobb oldalán a C3b láncait és az α’ lánc fragmenseit tüntettem fel. Az ábrán látható blot három független kísérlet egyikének eredményét mutatja [Csincsi 2015, 5. ábra A és B].

5.3.5. Az FHR-5 kötődése a CRP módosult formájához és ennek következménye A rövid pentraxinok közül az emberben akut fázis fehérjeként viselkedő CRP kölcsönhatását FHR-5-tel McRae és munkatársai korábban kimutatták [McRae 2005], de sem a CRP kölcsönható formáját, sem a kötődés következményeit nem vizsgálták. Ezért először megvizsgáltam rekombináns pCRP és általam ebből előállított mCRP kölcsönhatását FHR-5-tel. A mi méréseink szerint az FHR-5 nem kötődik in vitro a natív pCRP formához, viszont a denaturált mCRP formához igen (5.31. ábra A és B). A mérésekben kontrolként használt FHR- 4A, illetve FH fehérjék viszont jól kötődtek a pCRP-hez, illetve az mCRP-hez, a korábbi eredményekkel összhangban [Mihlan 2009].

5.31. ábra. Az FHR-5 kötődése a CRP két formájához. A) FH-t, FHR-4A-t és FHR-5-öt immobilizálás (5 μg/ml) és blokkolás után 50 μg/ml pCRP-vel inkubáltam Ca2+- és Mg2+-ionokat is tartalmazó DBS pufferben. A detektálás poliklonális anti-CRP ellenanyaggal történt. B) Párhuzamos kísérletekben natív CRP-ből urea/EDTA keláció segítségével előállított (ld. 37. oldal) 25 μg/ml mCRP kötődését mértem Ca2+-mentes DPBS pufferben, poliklonális anti-CRP detektáló ellenanyaggal. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 6. ábra A és B].

Az FHR-5 és az mCRP kölcsönhatása akkor is bekövetkezik in vitro, ha az mCRP-t a natív forma műanyag felületre (ELISA lemezre) való immobilizálásával hozzuk létre, és ehhez adjuk hozzá az FHR-5-öt (5.32. ábra).

5.32. ábra. Az FHR-5 kötődése felülethez kötött CRP-hez. ELISA lemez műanyag felszínére 5 μg/ml CRP-t adtam PBS-EDTA pufferben. Ilyen körülmények között a CRP monomer egységeire esik szét [Kresl 1998, Mihlan 2009a]. A kontroll lyukakat zselatinnal fedtem. 300 nM FH és FHR-5 kötődését mértem poliklonális anti-FH ellenanyaggal. Az adatok négy független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 6. ábra C].

A PTX3 esetében leírtakhoz hasonlóan a FH mCRP-hez való kötődését az FHR-5 szignifikánsan és koncentráció-függő módon gátolta (5.33. ábra A). Az mCRP-hez kötődve a FH képes volt kifejteni kofaktor aktivitását az FI általi C3b hasításban (5.33. ábra B, 2. sáv), és ezt a funkciót nagymértékben gátolta a FH-ral kompetáló FHR-5 (3. sáv). Az FHR-5 önmagában nem mutatott kofaktor aktivitást az adott kísérleti körülmények között (5.33. ábra B, 4. sáv).

5.33. ábra. Az FHR-5 és a FH közötti kompetíció CRP-n és annak következménye. A) 50 μg/ml (300 nM) FH kötődését mértem mCRP-hez, növekvő koncentrációjú FHR-5 jelenlétében (a 20 μg/ml FHR-5 ∼300 nM koncentrációnak felel meg), ELISA lemezen. A detektáláshoz egy anti-FH monoklonális ellenanyagot használtam. A kontroll HSA nem, viszont az FHR-5 szignifikánsan gátolta a FH kötődését (20 μg/ml, párosítatlan t-próba, p=0,0001). Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). B) CRP-hez kötődött FH kofaktor aktivitását FHR-5 jelenlétében Western blot segítségével vizsgáltam. ELISA lemezt CRP-vel (10 μg/ml) fedve 50 μg/ml FH-ral inkubáltam 20 μg/ml FHR-5 jelenlétében vagy anélkül a blot alatti jelzéseknek megfelelően. A kofaktor esszét az 5.30. ábra B részében leírtakkal megegyezően végeztem el. Az ábrán látható blot három független kísérlet egyikének eredményét mutatja [Csincsi 2015, 6. ábra D és E].

5.3.6. Az FHR-5 kölcsönhatása az extracelluláris mátrixszal

Korábbi vizsgálataink szerint (Kopp 2012) a FH, az FHL-1 és az FHR-1 kötődik az ECM-hez in vitro. Saját méréseimben az FHR-5 kölcsönhatását vizsgáltam az ECM modelljeként használatos MaxGel preparátummal. (A MaxGel háromdimenziós háló létrehozására alkalmas, emberi extracelluláris komponenseket tartalmazó keverék. Fő összetevői: kollagének, laminin, fibronektin, elasztin, tenaszcin, proteoglikánok és glukózaminoglikánok.) A natív FHR-5 kötődését emberi szérumból a MaxGel-hez Western blottal sikerült kimutatni (5.34. ábra A). A koncentráció-függés vizsgálatához rekombináns FHR-5-öt használtam. A fehérje szignifikáns és dózisfüggő kötődést mutatott a MaxGel-hez in vitro (5.34. ábra B). Az FHR-5 kötődése a MaxGel-hez ebben az esetben is a FH leszorítását eredményezte (5.35. ábra A) és a komplement regulátor molekula felületi kofaktor aktivitásának gátlásához vezetett (5.35. ábra B).

5.34. ábra. Az FHR-5 kölcsönhatása ECM-mel. A) MaxGel-lel, illetve HSA-val fedett ELISA lemez lyukait NHS-sel inkubáltam. A kötődött fehérjét mosás és elúció után 10%-os SDS-PAGE/Western blot technikával és poliklonális anti-FHR-5 ellenanyaggal mutattam ki. Az ábrán látható blot három független kísérlet egyikének eredményét mutatja. B) Immobilizált MaxGel-hez és zselatinhoz a rekombináns FHR-5-öt az ábrán feltüntetett koncentrációkban adtam, és a kötődést poliklonális anti- FHR-5 ellenanyaggal ELISA-val mértem. Az adatok négy független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). *p < 0,05; **p < 0,01; two-way ANOVA [Csincsi 2015, 7. ábra A és B].

5.35. ábra. Az FHR-5 és a FH közötti kompetíció MaxGel-en és annak következménye. A kísérleteket az 5.30. ábránál leírtakkal azonos módon végeztem el. A) A kontroll HSA nem, viszont az FHR-5 szignifikánsan gátolta a FH kötődését (20 μg/ml, párosítatlan t-próba, p=0,0027). Az adatok három mérésből származó középértékek és standard deviációjuk (SD). B) A MaxGel-hez kötődve a FH képes volt kifejteni kofaktor aktivitását az FI általi C3b inaktiválásban (2. oszlop), és ezt a funkciót nagymértékben gátolta a FH-ral kompetáló FHR-5 (3. oszlop). Az FHR-5 önmagában nem mutatott kofaktor aktivitást az adott kísérleti körülmények között (4. oszlop). Az ábrán látható blot három független kísérlet egyikének eredményét mutatja [Csincsi 2015, 7. ábra C és D].

Mivel tudjuk, hogy a PTX3 kötődik az extracelluláris mátrix egyes komponenseihez és a MaxGel-hez [Bottazzi 2010, Braunschweig és Józsi 2011], megvizsgáltuk, hogy az FHR-5 milyen hatással van erre a kapcsolatra. Eredményeink szerint az FHR-5 jelenléte nagymértékben fokozta a PTX3 ECM-hez történő kötődését in vitro, akár MaxGel-t, akár HUVEC eredetű sejtmentes ECM modellt használtunk (5.36. ábra). Fordított kísérleti elrendezésben, a PTX3- nak csak kismértékű hatása volt az FHR-5 ECM-hez történő kötődésére (nincs ábrázolva).

5.36. ábra. A FH molekulacsalád tagjainak hatása a PTX3 ECM-hez történő kötődésére. Immobilizált MaxGel-t és HUVEC eredetű ECM-et FH, FHL-1 (100 μg/ml), FHR-1 és FHR-5 (20 μg/ml) fehérjékkel előinkubáltunk, és 5 μg/ml PTX3 kötődését poliklonális anti-PTX3 ellenanyag segítségével mértük ELISA módszerrel. Az adatok négy független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 7. ábra E].

5.3.7. Az FHR-5 és FH kompetíciója humán szérumban

Az FHR-5 és a FH általunk vizsgált három ligandumért (PTX3, CRP és MaxGel) történő kompetícióját emberi szérumban is kimutattuk. Ehhez immobilizáltam a ligandumokat, majd hőinaktivált humán szérumot adtam hozzájuk. A szérum hőinaktivációjára a komplementaktiváció következtében lerakódó C3 fragmensek és a hozzájuk kötődő FH kizárása céljából volt szükség. A rendszerhez adott rekombináns FHR-5 szignifikánsan csökkentette a FH kötődését a vizsgált ligandumokhoz, a negatív kontrollként használt FHR-4A molekulával ellentétben (5.37. ábra A). Komplement-aktív humán szérumot használtam annak kimutatására, hogy az FHR-5 a FH-ral kompetícióba lépve annak aktivitását gátolja ezeken a ligandumokon in vitro (5.37. ábra B), azaz FHR-5 jelenlétében nőtt a lekötődött C3-fragmentumok mennyisége.

5.37. ábra. Az FHR-5 és a FH közötti kompetíció szérumban, és az FHR-5 hatására megnövekedett C3 depozíció. A) ELISA lemezen immobilizált PTX3-at, CRP-t (10 μg/ml) és MaxGel-t (1:30) hőinaktivált NHS-sel inkubáltam (25 V/V%, 37°C, 30 min) 0,5 μM FHR-5, ill. FHR-4A hozzáadásával vagy anélkül. A FH kötődését A254 monoklonális ellenanyaggal és a megfelelő másodlagos ellenanyaggal detektáltam. B) Az A) részben leírt módon előkészített ELISA lemez lyukait 12,5 V/V% (PTX3, CRP) és 25 V/V% (MaxGel) NHS-sel inkubáltam (37°C, 30 min) 20 μg/ml FHR-5, ill. FHR- 4A jelenlétében. A komplementaktiváció mértékét a lerakódott C3 fragmentumok mérésével (poliklonákis anti-C3 ellenanyaggal) határoztam meg. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 8. ábra A és B].

5.3.8. Az alternatív útvonal C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-5- ön Hebecker és munkatársai megmutatták, hogy az FHR-4 fehérjén felépülhet az alternatív út C3- konvertáza, és így ez a fehérje képes a komplementrendszer aktiválására [Hebecker 2012]. Az FHR-5 komplementaktiváló képességét ezért az alábbiak szerint vizsgáltuk. Az FHR-5-öt ELISA lemezre kötöttem, majd blokkolás után C3b-vel inkubáltam. Mosás után a C3-konvertázhoz (C3bBb) szükséges további komponenseket adtam hozzá: FB-t, FD-t és properdint (ez utóbbi stabilizálja az enzimet). A konvertáz képződését a Bb fragmens detektálásával mutattam ki. Saját méréseim szerint a FB önmagában nem kötődik az FHR-5-höz. A kontroll FHR-4A-hoz hasonlóan az FHR-5 is lehetővé tette a konvertáz felépülését in vitro (5.38. ábra A). Az enzim működőképességének igazolásához tisztított C3-at adtam hozzá, és a képződő C3a fragmenseket mértem (5.38. ábra B).

5.38. ábra. Az alternatív út C3-konvertázának (C3bBb) felépülése FHR-5-ön. A) ELISA lemezre FHR- 5-öt, FHR-4A-t és HSA-t immobilizáltam, majd 10 μg/ml C3b-t adtam hozzájuk. A C3bBb C3- konvertázt a további komponensek (FB, FD és FP) hozzáadásával építettem fel (30 perc, 37°C). A detektálás poliklonális anti-FB ellenanyaggal történt. Az adatok öt független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). B) Az FHR-5-ön képződött konvertáz aktivitását a konvertázhoz adott 10 μg/ml C3 hozzáadása (1 h, 37°C) után C3a ELISA kit-tel (Quidel) mértem. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 9. ábra A és B].

A konvertáz képződését, illetve az alternatív út FHR-5 általi aktivációját az egyes komponensek hozzáadása helyett teljes humán szérumban is kimutattuk. Amikor a felszínre kötött FHR-5-öt 10% normál humán szérummal inkubáltam 5 mM Mg2+-EGTA jelenlétében, a megfelelő ellenanyagokkal a felszínre rakódott C3, FB és FP jelenlétét tudtam kimutatni. A Ca2+- ionokra érzékeny EGTA kelátor a Ca2+-ionok kivonása mellett lehetővé teszi a Mg2+-ionok jelenlétét, ezáltal biztosítja, hogy csak az alternatív út tud működésbe lépni a rendszerben. 5 mM EDTA jelenlétében végezve a kísérletet a szükséges ionok hiányában a komplementaktiváció nem indul el, konvertáz képződést nem detektáltunk (5.39. ábra). Az FHR-4 esetében látható jel a C3-fragmentumok direkt kötődésének következménye.

► 5.39. ábra. Az FHR-5 általi komplementaktiváció. Az FHR-5-öt ELISA lemezre immobilizáltam, majd 10% normál humán szérummal inkubáltam 5 mM Mg2+-EGTA-t vagy 5 mM EDTA-t tartalmazó pufferben. A C3b (A), Bb (B) és FP (C) lerakódását a megfelelő ellenanyagokkal detektáltam. Az FHR- 4A-t pozitív kontrollként, a FH-t és a HSA-t negatív kontrollként használtam a kísérletekben. Az adatok három független mérésből származó átlag abszorbancia értékek és standard deviációjuk (SD). **p < 0,01, ***p < 0,001, one-way ANOVA [Csincsi 2015, 10. ábra A, B és C].

6. Diszkusszió

Az elmúlt évtizedek FHR fehérjékkel kapcsolatos kutatásai alapján levont következtetések több helyen is ellentmondásban állnak egymással. Jól ismert, hogy a H-faktorral rokon fehérjék egyikében sem található meg a FH N-terminálisával homológ régió, mely a FH-ban a komplementaktivációt gátló feladatot látja el. Ennek megfelelően több vizsgálat is rámutatott a fehérjék FH-szerű komplement-szabályozó funkciójának hiányára fiziológiás koncentrációk esetén [Timmann 1991, Hebecker 2012, Goicoechea de Jorge 2013, Tortajada 2013]. Egyes tanulmányok azonban gyenge kofaktor aktivitást mutattak ki az FHR-3, FHR-4 és FHR-5 esetében [Hellwage 1999, McRae 2005], illetve mások erős kofaktor aktivitást tulajdonítottak az FHR-3-nak [Fritsche 2010]. A komplementrendszer terminális útjának gátlását írták le az FHR- 1-re és az FHR-2-re [Heinen 2009, Eberhardt 2013], de ezt az FHR-1 esetében mások nem tudták igazolni [Strobel 2011, Goicoechea de Jorge 2013], az FHR-2-re pedig egyelőre nincs több adat. A leírt komplementgátló tulajdonságok ellenére az FHR-1-et, FHR-2-t, illetve FHR-5-öt a felszínén megkötő Borrelia burgdorferi nem volt védve a komplement mediálta lízistől [Siegel 2010, Hammerschmidt 2012], ami szintén megkérdőjelezi ezeknek az FHR-eknek a komplementaktivációt gátló szerepét. Az FHR-4 esetében pedig C3b-, illetve CRP közvetített, komplementet aktiváló funkciót mutattak ki [Hebecker 2010, Hebecker 2012]. Az FHR fehérjék koncentrációjának meghatározása a nagyfokú szerkezeti hasonlóságuk, és emiatt a jól jellemzett, monospecifikus antitestek hiányában egészen a legutóbbi időkig nehézkes volt, és az értékek függnek az egyén genetikai adottságaitól (kópiaszám-variáció) is. A jelenleg rendelkezésre álló adatok szerint az FHR-1 homodimerek szérumkoncentrációja kb. ~400 nM [van Beek 2017], az FHR-3 0-60 nM [Pouw 2016], az FHR-5 pedig 45-90 nM [McRae 2005] koncentrációban van jelen a szérumban. A tapasztalatok alapján az FHR fehérjéknek lokálisan megnövekedhet a koncentrációja fertőzés hatására [Närkiö-Mäkelä 2001], és az FHR- 1-nek a FH-ral való kompetícióját egyes bakteriális ligandumokért [Haupt 2007, Reuter 2010], illetve C3b-ért [Goicoechea de Jorge 2013] is kimutatták. Utóbbi adatok arra utalnak, hogy az FHR fehérjék a FH szabályozó funkcióját befolyásolhatják, módosíthatják. Az eddigi eredmények alapján tehát vitatható az az elképzelés, amelyben az FHR-eket, mint FH-szerű komplementgátló faktorokat tartjuk számon. Ugyanakkor a fertőzéses folyamatok során tapasztalt koncentráció növekedésük, az eddig leírt kölcsönhatásaik egyes

80 ligandumokkal (pl. C3b, CRP), és a betegség-asszociációs vizsgálatok jelzik a molekulacsalád fontos szerepét az élettani folyamatokban.

6.1. Az FHR-1, az FHR-3 és az FHR-5 komplementaktivációt gátló szerepének vizsgálata in vitro

Az FHR fehérjék komplementaktivációt gátló hatásáról szóló ellentmondásos eredmények miatt a fehérjék funkciójának részletesebb vizsgálatát, illetve a komplementregulációban betöltött szerepük tisztázását tűztük ki célul. Az alternatív útvonal C3-konvertázára való hatást vizsgáló kísérleteinkből kiderült, hogy a rekombináns FHR-1 nem képes a szilárd fázisú C3-konvertáz kialakulását gátolni, még akkor sem, ha a FH-hoz képest ~15-szörös moláris koncentrációban (1 µM) alkalmazzuk. Az FHR-1 a képződött konvertáz működésére sem volt hatással (5.11. ábra A és B). Kísérleteink alapján az is megállapítható, hogy az FHR-1-nek önmagában nincsen a konvertáz bomlását gyorsító hatása, sőt, 16-szoros moláris feleslegben adva (260 nM) FH mellett, nem módosította annak működését sem (5.11. ábra C). Ezek az eredmények részben várhatóak, hiszen az FHR-1-ből hiányoznak a FH SCR1-4-gyel homológ domének, és egybevágnak azzal, hogy az FHR-1 1991-es felfedezésekor 10 µM koncentráció esetén sem tudták kimutatni kofaktor aktivitását [Timmann 1991]. A folyadék fázisú kofaktor esszénk alapján elmondható, hogy az FHR-3, a FH-hoz képest ~10-szeres moláris mennyiségben adva (2 µM) sem mutat kofaktor aktivitást (5.14. ábra). Más kutatócsoportok vizsgálatai ezzel ellentétes eredményre jutottak, de pl. Hellwage 8 µM FHR-3 esetében tapasztalt gyenge kofaktor aktivitást [Hellwage 1999]. Fritsche az általunk alkalmazotthoz hasonló, 1,6 µM koncentrációban tapasztalt jelentős kofaktor aktivitást [Fritsche 2010]. Az általa használt rekombináns FHR-3 előállítási (pBSV-8His bakulovírus expressziós vektor, Sf9 rovarsejtek) és tisztítási (nikkel affinitás kromatográfia) módszerei az elérhető információk alapján megegyeznek az általunk alkalmazott eljárásokkal. Így az ellentmondás oka egyelőre nem ismert, mivel viszont újabb mérések szerint az FHR-3 szérum koncentrációja ezeknél jóval alacsonyabb [Pouw 2016, Schäfer 2016], kimondhatjuk, hogy valószínűtlen a mások által leírt kofaktor aktivitás fiziológiás jelentősége. Az FHR-5-nek sincs az általunk alkalmazott koncentrációig (160 nM) hatása a szilárd fázisú C3bBb C3-konvertáz kialakulására vagy működésére, illetve nincsen konvertáz bomlást gyorsító hatása (5.11. ábra A, B és C). Bizonyos mértékű folyadék fázisú kofaktor- és konvertáz

81 lebomlást gyorsító aktivitást ugyanakkor leírtak az FHR-5 esetében [McRae 2005], ezekben a kísérletekben viszont szintén a fiziológiásnál jelentősen magasabb koncentrációkat (kb. 0,75-7,5 μM) alkalmaztak a FH-éval összevethető aktivitás kimutatásakor. A szilárd fázisú kofaktor kísérleteink szerint az FHR-5 (300 nM) PTX3-hoz, CRP-hez vagy az ECM modell MaxGel-hez kötődve önmagában nem rendelkezik kofaktor aktivitással (5.28. ábra B, 5.31. ábra B, 5.33. ábra B). Zimozán által indukált komplementaktiváció során, a terminális komplement út működésekor képződő C5b-9 mennyiségének mérésével megmutattuk, hogy az FHR-1 2 µM koncentrációig nem képes a terminális út gátlására, szemben a FH-ral. Ezt az eredményünket sikerült megerősíteni az ún. CARPA (complement activation-related pseudoallergy) reakciók modellezése során is [Mészáros 2016]. A modern gyógyszertechnológiában alkalmazott gyógyszerhordozó nanorészecskék hatékonyságuk mellett komoly veszélyeket rejtenek magukban. Egyes liposzomális gyógyszerek (pl. Doxil, Ambisome, DaunoXome), micelláris oldószerek (pl. a kemoterápiában alkalmazott Taxol oldószere, a Cremophor EL) stb. alkalmazása a komplement rendszer aktiválódása miatt akut, életet veszélyeztető hiperszenzitivitási reakció kialakulásához vezethet [Szebeni 2005]. A Dr. Szebeni Jánossal és Mészáros Tamással (Nanomedicina Kutató és Oktató Központ, Semmelweis Egyetem) együttműködésben végzett kísérletekben, amelyekben liposzomális amfoterecin B-vel (a gombaellenes Ambisome hatóanyaga), illetve Cremophor EL hordozóval, emberi szérumban aktiváltuk a komplementet, az FHR-1 nem csökkentette a képződő C5b-9 mennyiségét, míg a FH igen [Mészáros 2016]. Ugyanakkor Hannan és munkatársai tengerimalac eritrocitákon végzett hemolízis esszékkel más eredményt kaptak. 140 nM rekombináns FH mellett adott 2 µM FHR-1 esetén 23%-os hemolízist mértek, szemben a csak 140 nM FH jelenlétében mért 8% értékkel [Hannan 2016]. Birka vörösvérsejteken végzett hemolízis esszékben pedig 80 µg/ml FH (~0,5 µM) adása a vörösvérsejtek lízisének 75%-os gátlását, míg 80 µg/ml FHR-1 (~2 µM) 13%- os gátlást eredményezett [Heinen 2009]. Az FHR-1 fiziológiás koncentrációját tekintve azonban utóbbi eredmények jelentősége megkérdőjelezhető. Figyelembe véve a fehérjék ismert fiziológiás koncentrációit, a fenti eredményeink alapján levonhatjuk a következtetést, hogy ezek a molekulák valószínűleg nem rendelkeznek a komplementet a C3 vagy a terminális út szintjén gátló hatással.

6.2. Az FHR-1, az FHR-3 és az FHR-5 közvetlen szerepe az alternatív út C3-konvertázának képződésében in vitro

Az FHR fehérjék mindegyike kötődik C3b-hez, ugyanakkor az előző alfejezetben összegzett és megbeszélt eredmények alapján is látható, hogy ezek a fehérjék nem képesek a C3b-t tartalmazó alternatív C3-konvertáz kiépülését gátolni, vagy bomlását elősegíteni, illetve a C3b I-faktor általi hasítását kofaktorként hatékonyan segíteni. Mivel az FHR-4 esetében már korábban leírták az FHR-4–C3bBb működőképes konvertáz létrejöttét [Hebecker 2012], megvizsgáltuk, működhet- e hasonló folyamat az FHR-1, -3, ill. -5 esetében is. Kimutattuk, hogy az FHR-1, -3, és -5 fehérjékhez C3b-t és a C3-konvertáz létrejöttéhez szükséges többi komponenst (FB, FP, FD) adva szignifikáns mennyiségű C3bBb képződik, továbbá azt is, hogy a létrejött enzim minden esetben működőképes, mert tisztított C3-at adva hozzá ki lehet mutatni az enzimműködés eredményeképpen létrejövő C3a fragmentumokat (5.13. ábra A és B, 5.15., 5.16. és 5.36. ábrák). Emberi szérummal inkubálva az FHR fehérjéket, lerakódott C3-fragmentumokat, FB-t és FP-t detektáltunk, megerősítve az FHR-1, -3 és -5 alternatív komplement út aktiváló képességét (5.13. ábra C, 5.17. és 5.37. ábrák). Ezek az eredmények a három fehérje új, a komplementaktivációban betöltött szerepét mutatják, éles ellentétben a FH komplementaktivációt gátló hatásával. Más kutatócsoportok egyelőre nem vizsgálták részletesen ezt az aktivitást, csak az FHR- 5-ről jelent meg adat arra vonatkozóan, hogy az FHR-5 a properdin megkötése révén aktiválhatja az alternatív utat, amit a C3b depozíció kimutatásával igazoltak [Chen 2016]. Ugyanakkor saját eredményeink szerint az FHR-5-höz nem kötődik közvetlenül a properdin, hanem az FHR-5- ön kialakuló C3bBb konvertázhoz kötődhet [Csincsi 2015].

6.3. Az FHR-1 kölcsönhatása CRP-vel

A FH kötődését CRP-hez, valamint a kölcsönhatás szerepét a gyulladásos folyamatok szabályozásában, és az apoptotikus részecskék immunológiailag csendes fagocitózisában korábban már leírták. Feltételezik, hogy a két fehérje közötti, a FH SCR7-ben lévő Y402H aminosavcsere következtében csökkent mértékű kölcsönhatásnak szerepe lehet az AMD patogenezisében is [Laine 2007, Skerka 2007]. A FH ugyanakkor nemcsak az SCR7-en keresztül kötődik a CRP-hez, hanem a C-terminális SCR19-20 doméneken keresztül is [Mihlan 2009b,

Okemefuna 2010]. Ezen eredmények ismeretében megvizsgáltuk, hogy az FHR-1 kötődik-e a CRP-hez. Sikerült kimutatnunk, hogy emberi szérumból a natív FHR-1, valamint a rekombináns FHR-1 fehérje is kötődik CRP-hez (5.1. ábra). Mint ahogyan az a CRP számos más liganduma esetén ismert, az FHR-1-hez való kötődése is kémhatásfüggőnek bizonyult: enyhén savas körülmények között a kölcsönhatás erősebb (5.2. ábra). További vizsgálataink kimutatták, hogy az FHR-1-hez kötődő forma nem a natív, pentamer szerkezetű CRP, hanem a módosult mCRP forma (5.4. ábra). Utóbbi képződhet savas kémhatáson, magasabb hőmérsékleten, alacsony Ca2+-tartalom esetén, illetve a CRP különböző membránokhoz vagy felszínekhez való kötődése esetén [Potempa 1983, Taylor 2007, Hakobyan 2008b, Mihlan 2009a, Hammond 2010]. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az FHR-1–mCRP kölcsönhatásnak főként gyulladásos körülmények esetén lehet szerepe, elképzelhető, hogy az FHR-1 erősíteni tudja a CRP-indukálta komplementaktivációt. Az mCRP kötőhelyet az FHR-1 C-terminálisában azonosítottuk (5.7. ábra). Ez az eredmény nem váratlan, mert az FHR-1 4., illetve 5. SCR doménjei homológok a FH 19., illetve 20. SCR doménjeivel, valamint a homológia mellett az egyezés a megfelelő domének között az aminosavszekvencia szintjén 100%, ill. 97%, és az SCR19-20 tartalmazza a FH egyik fő mCRP kötőhelyét [Mihlan 2009b, Okemefuna 2010]. Ugyanakkor a homológ doméneket ugyancsak tartalmazó, de szekvencia szintjén kevésbé hasonló FHR-5 esetében az mCRP-kötő hely nem itt, hanem a molekula más doménjeiben (SCR3-7) található [McRae 2005], amivel egybevág az, hogy az FHR-5 SCR8-9 fragmentuma nem kötött a kísérleteinkben mCRP-t. Bár az FHR-1*A izoforma AMD-vel való összefüggését leírták [Martínez-Barricarte 2012], mi nem találtunk különbséget a két izoforma (FHR-1*A és FHR-1*B) mCRP-hez történő kötődésében (5.5. ábra). Ennek valószínű magyarázata a két allélikus változat két C-terminális SCR doménjének azonossága. Kompetíciós kísérleteink során láttuk, hogy az FHR-1 és a FH C-terminálisát tartalmazó

FH15-20 fragmentum kompetitív módon képes kötődni mCRP-hez (5.9. ábra). Ugyanekkor ez a kompetíció már nem volt észlelhető FHR-1 és FHL-1 esetében, valószínűleg az utóbbi fehérje 7. SCR doménjében található másik mCRP kötőhely miatt. CRP-n kiváltott komplementaktivációt vizsgáló kísérleteinkben a hozzáadott FHR-1 (2 µM) csak kis mértékű (nem szignifikáns) növekedést okozott a C3 lerakódás mértékében akár normál humán szérumban, akár FH-depletált szérumban történt a mérés (5.10. ábra). Figyelembe véve az előbbi

84 eredményeket, a FH-ban lévő három CRP kötőhelyet és a két fehérje fiziológiás koncentrációját valószínűtlen, hogy az FHR-1 és a FH között normális folyamatokban szignifikáns kompetíció léphet fel a CRP-ért, melynek eredménye fokozott komplementaktiváció lenne. Azonban nem zárható ki, hogy lokális savas környezet, emelkedett FHR-1 koncentráció, vagy csökkent FH koncentráció, illetve növekedett mértékű FHR-1–FHR-5 oligomerizáció esetén komplement dereguláció lép fel CRP-n. Ilyen körülmények lehetőségét támasztják alá a következő megfigyelések: (1) a CFHR1 gén nagymértékben expresszálódik emberi retinális pigment epiteliumban [Bennis 2015], (2) az FHR-1 koncentrációja megváltozik gyulladásos és más kóros folyamatokban [Närkiö-Mäkelä 2001, Corbett 2007] és (3) a CFHR1 gén mutációja magasabb rendű FHR-1 homo-oligomerek képződéséhez vezethet, amely formák erősebben kompetálhatnak a FH-ral [Tortajada 2013]. Fontos megemlíteni azt is, hogy számos adat mutatja a szérum FH szintek nagyfokú variabilitását is, amely részben genetikailag meghatározott [Esparza-Gordillo 2004, de Córdoba 2008], és hatással lehet az általunk vizsgált kölcsönhatásra is. Az általunk kimutatott CRP kötőhely az FHR-1 C-terminálisában átfed a korábban leírt PTX3 kötőhellyel [Kopp 2012a]. Ezt igazolta a C18 jelzésű monoklonális ellenanyag segítségével elvégzett kísérletünk (5.7. ábra). A C18 antitest az FHR-1 5. SCR doménjéhez kötődik és meggátolja mind az mCRP, mind a PTX3 kötődését az FHR-1-hez. A két pentraxin között pedig részleges kompetíciót figyeltünk meg FHR-1-ért (5.8. ábra). Elképzelhető, hogy az akut fázis reakció során, a szisztémásan jelentősen emelkedett CRP szint kedvezhet az FHR-1–CRP kötődésnek, viszont a lokálisan emelkedett PTX3 szint visszaszoríthatja ezt a reakciót. Összefoglalva tehát úgy tűnik, hogy a FH-éhoz képest gyengébb CRP- és PTX3-kötés miatt az FHR-1, normális körülmények között, a FH-ral való kompetíció által nem képes a komplementaktiváció deregulációjára. Azokban az esetekben azonban, amikor a FH aviditása a pentraxinokhoz lecsökken (pl. FH mutációk/polimorfizmusok miatt), vagy az FHR-1 aviditása megnő (pl. mutációk, magas ligandumkoncentrációk esetén bivalens kötődés) a dereguláció folyamata reális és számottevő lehet. Az AMD-vel asszociált ΔCFHR3-CFHR1 deléció védő szerepe részben magyarázható az eredményeinkkel. Mivel a Bruch membránon a mérete miatt a FH átjutása feltételezhetően korlátozott, a fő alternatív út regulátor szerepét az FHL-1 veszi át [Clark 2014]. A helyi gyulladás és az alacsonyabb kémhatás kedvezően hathat a CRP–FHR-1 kötődésre, és ezért kompetíció léphet fel az FHR-1 és az FHL-1 között, teret hagyva a komplementaktivációnak. A géndeléció következtében a hiányzó FHR-1 miatt ez a hatás nem

85 lép fel, így a komplement regulációja FHL-1 által zavartalanul megtörténhet. Azonban ezt a hipotézist további vizsgálatokkal kellene alátámasztani.

6.4. Az FHR-3 kölcsönhatása pentraxinokkal és malondialdehiddel

A FHR-3 új ligandumaként azonosítottuk a pentraxinok közé tartozó CRP-t és a PTX3-at. Az FHR-3 a pentraxin natív, pCRP alakjával lép kölcsönhatásba (5.3. és 5.15. ábrák). Az FHR-1- gyel ellentétben az FHR-3-nak nem a C-terminális doménjei kötik az mCRP-t, amit ezeknek a doméneknek a FH és az FHR-1 C-terminusához való kismértékű hasonlósága magyarázhat. Mivel az egyik fő mCRP-kötő hely a FH SCR 7. doménjében van [Jarva 1999], valószínű, hogy az FHR-3-ban is megtalálható homológ domén, az aminosav szekvenciában 86%-os egyezést mutató SCR2 felelős az FHR-3 mCRP-hez való kötődéséért, de ezt a feltételezést további vizsgálatokkal lehet csak igazolni vagy megcáfolni. Kísérleteink szerint a PTX3 szignifikáns módon kötődik az FHR-3-hoz (5.15. ábra). A pentraxinok jól ismert liganduma a komplementaktiváció elindításában szerepet játszó C1q molekula. Az FHR-3-hoz kötődött PTX3 molekula megtartotta C1q-kötő képességét (5.16. ábra), tehát az FHR-3 elméletileg képes lehet PTX3 kötése útján a C1q helyi koncentrációjának növelésére, és ez által a komplementaktiváció elősegítésére. Az mCRP esetében viszont nem sikerült kimutatnunk a C1q-kötődés fokozódását. Emberi szérumban mindkét pentraxin esetén az FHR-3 és az FH közötti kompetíciót, illetve a kompetíció eredményeként jelentkező megnövekedett komplementaktivációt detektáltunk (5.18. ábra). Az FHR-3 általi direkt komplementaktiváción (ld. 6.2. alfejezet) túl, ez az indirekt mechanizmus egy további módja lehet annak, ahogyan az FHR-3 részt vesz a komplementrendszer finomabb szintű szabályozásában. Az MDA és kondenzációs termékei az oxidatív stressz jelzői, és kimutatták kapcsolatukat számos betegséggel, köztük AMD-vel is [Suzuki 2007, Hollyfield 2008]. Weismann és munkatársai az MDA-t mint a FH egyik fő ligandumát írták le apoptotikus és nekrotikus sejteken. Kimutatták, hogy az MDA epitópok lehetőséget adnak a FH számára gyulladást nem elősegítő iC3b fragmentumok létrehozására [Weismann 2011]. MDA-BSA adduktum segítségével megmutattuk, hogy az FHR-3 is szignifikánsan és koncentrációfüggő módon kötődik MDA-hoz (5.19. ábra). Kompetíciós kísérletünkből pedig

86 láttuk, hogy az FHR-3 jelentős mértékben képes gátolni a FH (és az FHL-1) kötődését MDA- hoz, míg ugyanilyen körülmények között az FHR-1 jóval kisebb mértékben tud a FH-ral versengeni (5.20. ábra). Az FHR-3 szignifikáns kompetíciója FH-ral magyarázatot adhat a ΔCFHR3-CFHR1 géndeléció védő szerepére AMD esetében. A betegség során képződő immun-lerakódásokban kimutatták az MDA jelenlétét [Schutt 2003]. A mutációval nem rendelkező egyénekben az FHR-3 hatékonyan versenghet a FH-ral (illetve, amennyiben a FH átjutása a Bruch-membránon gátolt, az FHL-1-gyel) a megjelenő MDA-epitópokért, korlátozva így a FH (FHL-1) szabályozó szerepét. A kettős géndeléció miatt hiányzó FHR-3 esetén azonban a FH (FHL-1) hatékonyabban gátolhatja a komplement aktivációját, és végső soron a gyulladást is. Nem sikerült tehát igazolni az FHR-3 korábban leír kofaktor aktivitását, de kimutattuk a fehérje direkt, C3b kötésén alapuló komplement aktiváló szerepét. Az FHR-3 FH-ral történő versengése pentraxin ligandumokon és MDA-n a komplement dereguláció indirekt módját mutatja. A FH CRP-vel való kapcsolatának szerepét AMD-ben korábban már hangsúlyozták [Skerka 2007, Okemefuna 2010]. Woo és munkatársai kimutatták, hogy emberi retinális pigment epitél sejtek gyulladási citokinek hatására (TNF-α, IL-1β) PTX3-at termelnek [Woo 2013]. Mindenezek alapján feltételezzük, hogy az FHR-3 kötődése MDA epitópokhoz, illetve pentraxinokhoz, és a FH-ral (FHL-1-gyel) történő kompetíciója magyarázat lehet a ΔCFHR3- CFHR1 deléció védő szerepére AMD-ben.

6.5. Az FHR-5 kölcsönhatása pentraxinokkal és az extracelluláris mátrixszal

A PTX3-at, az mCRP-t és az ECM-et az FHR-5 új ligandumaiként azonosítottuk. Az FHR-5 szerepét kimutatták több, elsősorban vesét érintő patológiás folyamatban genetikai és fehérje szintű vizsgálatokban egyaránt [Murphy 2002, Abrera-Abeleda 2006, Monteferrante 2007, Gale 2010, Goicoechea de Jorge 2013]. Eredményeink szerint nem csak a C3b, illetve C3b- fragmentumok FHR-5 általi kötése lehet fontos ezen betegségek patomechanizmusában, hanem a gyulladás során nagyobb mennyiségben képződő pentraxinokkal, illetve az ECM fehérjéivel való kölcsönhatások is. Ezt alátámasztják proteomikai vizsgálatok is, melyekben az FHR-5-öt és a PTX3-at is glomeruláris ECM-mel asszociált fehérjékként írták le [Byron 2014, Lennon 2014].

A kísérleteink szerint az FHR-5 fiziológiás koncentrációban, szignifikáns módon képes versengeni a FH-ral PTX3, CRP és ECM ligandumokért (5.28., 5.31. és 5.33. ábrák). Ezt a kompetíciót és a ligandumok jelenlétében fellépő emelkedett komplementaktivációt szérumban is kimutattuk (5.35. ábra). Ez tulajdonképpen indirekt komplement dereguláció: az FHR-5 a FH fiziológiás ligandumaival versengve visszaszorítja a FH hatását, azaz a regulációt. Illetve itt kell utalni az FHR-5 közvetlen komplementaktiváló képességére C3b-hez való kötődésének útján (ld. 6.2. alfejezet). A dereguláció és a közvetlen aktiváció valószínűleg együtt érvényesül. Úgy tűnik tehát, hogy az egyes ligandumok jelenlététől, a FH és az FHR-5 koncentrációjától függően az FHR-5 képes lehet a komplement szabályozásának finomhangolására. Az általunk vizsgált FH molekulacsalád tagjai közül az FHR-5 kötődése volt a legerősebb a PTX3-hoz (5.24. ábra). Ez a kölcsönhatás jelentős mértékben csökken Ca2+-mentes pufferben [Csincsi 2015], hasonlóan a FH, FHL-1 és FHR-1 PTX3-hoz való kötődéséhez [Deban 2008, Kopp 2012a]. Alacsonyabb pH értéken, mely például gyulladásos folyamatok esetén következhet be, szintén csökken a kötődés mértéke [Csincsi 2015]. Korábbi adatok szerint savasabb kémhatás esetén a PTX3 C1q-hoz, illetve FHR-1-hez való kötődésében mennyiségileg nincs változás, azonban megnő a PTX3 kötődése komplement gátló molekulákhoz (FH, FHL-1, C4BP). Tehát az adatok alapján, gyulladásos folyamatokban előtérbe kerül a komplement gátlása egyrészt az inhibitor molekulák fokozott kötődése miatt, másrészt a deregulátor FHR-5 fehérje kötődésének csökkenése miatt. A FH-ban korábban két PTX3 kötőhelyet mutattak ki. Az elsődleges kötőhely a FH C- terminálisában található (FH19-20), míg egy másik kötőhely a FH 7. SCR doménjében van [Deban 2008]. Az FHR-1-ben pedig konzerválódott a C-terminális PTX3 kötőhely [Kopp 2012a]. Méréseink szerint az FHR-5 C-terminálisához nem kötődött a PTX3 (5.25. ábra B). Továbbá, a PTX3 teljes FHR-5-höz történő kötődését nem befolyásolta az FHR-5 C-terminálisához kötődő C3b. Az FHR-5 első két SCR doménje a molekula dimerizációját közvetítő doménjei, és a FH megfelelő doménjeihez képest jelentősen különböznek szerkezeti és funkcionális szempontból egyaránt. A CRP kötődését FHR-5-höz már kimutatták, és a kötőhelyet az FHR-

53-7 régióban írták le [McRae 2005]. Ezek alapján feltételezhető, hogy a PTX3 kötőhely is az FHR-5 3-7. SCR domén-régióban van, de ez még megerősítésre vár. A C3 glomerulopátiával összefüggésbe hozott mutáns FHR-5 fehérje esetén kisebb mértékű PTX3 kötődést tapasztaltunk a vad típusú fehérjével összehasonlítva (5.26. ábra). Ez a PTX3 kötőhely

88 korlátozott elérhetősége miatt lehet a mutáns fehérjében, amely fokozott mértékben képes oligomerek képzésére [Goicoechea de Jorge 2013]. A PTX3 ligandumaként ismert C1q kísérleti körülményeink között részlegesen gátolta a PTX3 FHR-5-höz történő kötődését (5.27. ábra A). Ez részlegesen átfedő kötőhelyeket és/vagy a PTX3-ban a C1q hatására bekövetkező konformációs változásokat jelez. Az FHR-5-höz kötődött PTX3 viszont megtartotta C1q-kötő képességét (5.27. ábra B). Az FHR-5 CRP-hez való kötődését már korábban leírták [McRae 2005], azonban nem vizsgálták a kötődő CRP formáját. A FH elsődlegesen mCRP-hez kötődik [Hakobyan 2008], bár akut fázist jellemző magas CRP koncentráció esetén pCRP-vel való kölcsönhatását is tapasztalták [Okemefuna 2010]. Ezzel ellentétben az FHR-4 elsősorban a pCRP formához kötődik, az SCR1- en keresztül, ami csak kismértékű szekvencia hasonlóságot mutat a FH SCR6 doménjével [Mihlan 2009a, Hebecker 2010]. Az FHR-5 esetében pedig az mCRP-hez való erős kötődést mértünk (5.30. ábra). Az egyes FH molekulacsaládba tartozó fehérjék tehát különböző, egymással nem homológ doménjeikkel eltérő CRP formákat köthetnek, illetve a kötődések erőssége is eltérő lehet. Az FHR-5 ezen kívül erősen és dózisfüggően kötődött az ECM modelljeként használt MaxGel-hez (5.32. ábra), és hatékonyan gátolta a FH kötődését (5.33. ábra A), valamint utóbbi kofaktor aktivitását (5.33. ábra B) ezen a ligandumon. Ezen túlmenően, az FHR-5 az ECM-hez való kötődés után is képes volt PTX3 molekulák megkötésére (5.34. ábra). Ezek a megfigyelések összhangban vannak proteomikai vizsgálatokkal, melyekben kimutatták az FHR-5 és a PTX3 jelenlétét glomeruláris eredetű ECM-ben [Byron 2014, Lennon 2014]. Az FHR-5 ECM-mel való kapcsolata kialakulhat például a vese endotéliumának sérülése esetén. Ezek a kölcsönhatások arra utalnak, hogy az FHR-5 képes lehet a helyi komplementaktiváció elősegítésére. A fenti eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy az FHR-5 az alábbi három mechanizmus útján fokozhatja a komplementaktivációt. 1) Az FHR-5 a FH-ral kompetícióba lépve megakadályozza utóbbi kötődését PTX3- hoz, CRP-hez és ECM-hez. 2) Az FHR-5 elősegítheti a komplementaktivációt elindító C1q molekula kötődését a sérülés helyszínén. 3) Az FHR-5 C3b kötés útján elősegíti az alternatív út C3-konvertáz (C3bBb) képződését.

6.6. Összegzés, kitekintés

Összegezve az eredményeinket elmondható, hogy a vizsgált FHR-1, FHR-3 és FHR-5 molekulák új ligandumaiként azonosítottuk a pentraxinok közé tartozó PTX3-at és CRP-t, valamint az FHR-3 esetében az MDA epitópokat, FHR-5 esetében pedig az extracelluláris mátrixot. Megállapítottuk, hogy a FH-ral szemben ezek az FHR fehérjék a komplementaktiváció fokozására képesek, részben az egyes ligandumokért a FH-ral való kompetíció révén, részben pedig a C3b megkötésével az alternatív út aktiválása révén. Az újabb irodalmi adatokkal együtt ezek az eredmények tehát a vizsgált FHR-1, FHR-3 és FHR-5 fehérjéket a komplementrendszer pozitív szabályozó molekuláiként azonosítják. Eredményeink így hozzájárultak a H-faktor molekulacsalád egyes tagjai funkciójának megismeréséhez. A jövő kutatásainak egyik feladata lesz azoknak a ligandumoknak és körülményeknek a pontosabb azonosítása, ahol ezek a folyamatok in vivo is végbe mehetnek fiziológiás, illetve kóros körülmények között. Ez reményt adhat arra is, hogy a molekulák funkciójának ismeretében később célzottan és a működését kedvező irányba befolyásolva avatkozhassunk be a komplementrendszer aktiválódásába.

7. Összefoglalás

Az értekezés tárgyát képező munkánkban arra kerestünk választ, hogy a komplementaktivációt gátló H-faktorral (FH) rokon, jórészt ismeretlen funkciójú FHR-1, FHR-3 és FHR-5 fehérjéknek mi lehet a szerepe a komplementaktiváció folyamatában. Ehhez a rekombináns FHR fehérjék pentraxinokkal, extracelluláris mátrixszal (ECM) és C3b-vel való kölcsönhatását jellemeztük in vitro ligandum kötődési és komplementaktivációs esszékben. Kimutattuk, hogy az FHR-1 kötődik a C-reaktív protein monomer egységéhez (mCRP), az ismert FH ligandumhoz. Az érintett fehérjék mennyiségi változásai vagy mutációi esetén, illetve gyulladás során a megváltozott aviditások miatt, az FHR-1 általi komplement dereguláció (a FH CRP-ről való leszorítása miatt) reális folyamat lehet. Ennek szerepe lehet például időskori makuladegenerációban (AMD) szenvedő betegek szemében, ahol a gyulladás okozta kémhatás változás miatt az FHR-1–CRP kötődés szerepe megnőhet. Az FHR-3 ligandumaként azonosítottuk a natív, pentameres CRP-t (pCRP) és a pentraxin 3-at (PTX3), és kimutattuk az FHR-3 komplement moduláló hatását ezekhez a ligandumokhoz kötődve. Megmutattuk továbbá, hogy az FHR-3 kötődik az oxidatív stressz során képződő malondialdehidhez is, és hogy az FHR-3 ezért a ligandumért hatékonyan képes kompetálni a FH-ral. Az FHR-3-at érintő géndeléció esetén, a fehérje hiányában a dereguláció nem történhet meg. Az FHR-1 és az FHR-3 általunk azonosított, a komplementaktiváció fokozásában játszott szerepe egy lehetséges magyarázatot adhat a ΔCFHR3-CFHR1 kettős géndeléció védő szerepére AMD-ben. A PTX3-at, az mCRP-t és az ECM-et az FHR-5 új ligandumaiként azonosítottuk. Megállapítottuk, hogy az FHR-5 képes versengeni a FH-ral ezen ligandumokért, és a FH leszorításával a komplement deregulációját idézheti elő, és szérumban fokozza a komplementaktivációt ezeken a ligandumokon. Néhány korábbi eredménnyel ellentétben mi azt találtuk, hogy ezek a fehérjék nem rendelkeznek komplement gátló tulajdonsággal. Éppen ellenkezőleg, C3b-hez történő kötődésükkel lehetővé teszik az alternatív út C3-konvertázának kiépülését, és ezáltal az alternatív út aktivációját. Bizonyos körülmények között a FH ligandumaival való kölcsönhatásuk, és a FH- ral való kompetíció révén is hozzájárulnak a komplementaktiváció fokozásához, ezért ezek az FHR molekulák pozitív komplementszabályozó fehérjéknek tekinthetőek.

Summary

In our research presented in this dissertation, we aimed to assess the function of the factor H (FH)-related proteins FHR-1, FHR-3 and FHR-5 in the course of complement activation. The role of these members of the complement system has been hitherto poorly explored. We examined the interactions of recombinant FHR proteins with pentraxins, extracellular matrix (ECM) and C3b utilizing in vitro binding assays and complement activation experiments. We showed that FHR-1 bound the monomeric form of C-reactive protein (mCRP), a known FH ligand. The complement deregulation by FHR-1 (due to competition with FH for CRP) may be relevant when a change in avidity occurs, due to mutation, change in concentrations or during inflammation. The interaction between FHR-1 and CRP may be important in the eye of patients with age-related macular degeneration (AMD), where local inflammation may cause a shift in pH. We identified the native, pentameric CRP (pCRP) and pentraxin 3 (PTX3) as ligands of FHR-3 and demonstrated the ability of FHR-3 to modulate complement activation when bound to these ligands. We also found that FHR-3 bound to the oxidative stress marker malondialdehyde, and that FHR-3 could readily compete with FH for this ligand. The deregulation, however, cannot take place when FHR-3 is absent due to gene deletion. The complement activating properties of FHR-1 and FHR-3 thus provide a possible explanation for the protective role of the ΔCFHR3-CFHR1 double gene deletion in AMD. We found that PTX3, mCRP and ECM were new ligands of FHR-5. We demonstrated the competition of FHR-5 with FH for these ligands, as well as the consequent deregulation of complement. We also showed that FHR-5 enhanced complement activation in human serum when bound to pentraxins or to the ECM. In contrast to previous results, we could not show the complement inhibitory capacity of FHR-1, FHR-3 and FHR-5. On the contrary, we found that they enable the assembly of the alternative complement pathway C3-convertase by binding C3b, and eventually they promote complement activation. Under certain circumstances they are also able to compete with FH ligands resulting in increased complement activation. These FHR proteins should thus be considered as positive complement regulators.

Irodalomjegyzék

Abarrategui- Abarrategui-Garrido C, Martínez-Barricarte R, López-Trascasa M, de Córdoba SR, Garrido 2009 Sánchez-Corral P. Characterization of complement factor H-related (CFHR) proteins in plasma reveals novel genetic variations of CFHR1 associated with atypical hemolytic uremic syndrome. Blood 2009 114:4261-4271. Abrera-Abeleda Abrera-Abeleda MA, Nishimura C, Smith JL, Sethi S, McRae JL, Murphy BF, Silvestri 2006 G, Skerka C, Józsi M, Zipfel PF, et al. Variations in the complement regulatory genes factor H (CFH) and factor H related 5 (CFHR5) are associated with membranoproliferative glomerulonephritis type II (dense deposit disease). J Med Genet 2006 43:582–589. Ádám 2006 Ádám V (ed.). Orvosi biokémia. Medicina Könyvkiadó, 2006, Budapest Appel 2005 Appel GB, Cook HT, Hageman G, Jennette JC, Kashgarian M, Kirschfink M, Lambris JD, Lanning L, Lutz HU, Meri S, Rose NR, Salant DJ, Sethi S, Smith RJ, Smoyer W, Tully HF, Tully SP, Walker P, Welsh M, Würzner R, Zipfel PF. Membranoproliferative glomerulonephritis type II (dense deposit disease): an update. J Am Soc Nephrol 2005 16:1392-1403. Armstrong 2015 Armstrong RA, Mousavi M. Overview of Risk Factors for Age-Related Macular Degeneration (AMD). J Stem Cells 2015 10:171-191. Behnsen 2008 Behnsen J, Hartmann A, Schmaler J, Gehrke A, Brakhage AA, Zipfel PF. The opportunistic human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus evades the host complement system. Infect Immun 2008 76:820-827. Bennis 2015 Bennis A, Gorgels TG, Ten Brink JB, van der Spek PJ, Bossers K, Heine VM, Bergen AA. Comparison of mouse and human retinal pigment epithelium gene expression profiles: potential implications for agerelated macular degeneration. PLoS One 2015 10: e0141597. Bhattacharjee Bhattacharjee A, Reuter S, Trojnár E, Kolodziejczyk R, Seeberger H, Hyvärinen S, 2015 Uzonyi B, Szilágyi Á, Prohászka Z, Goldman A, et al. The major autoantibody epitope on factor H in atypical hemolytic uremic syndrome is structurally different from its homologous site in factor H-related protein 1, supporting a novel model for induction of autoimmunity in this disease. J Biol Chem 2015 290:9500–9510. Bottazzi 2010 Bottazzi B, Doni A, Garlanda C, Mantovani A. An integrated view of humoral innate immunity: pentraxins as a paradigm. Annu Rev Immunol 2010 28:157-183. Braunschweig Braunschweig A, Józsi M. Human pentraxin 3 binds to the complement regulator c4b- 2011 binding protein. PLoS One 2011 6:e23991. Byron 2014 Byron A, Randles MJ, Humphries JD, Mironov A, Hamidi H, Harris S, Mathieson PW, Saleem MA, Satchell SC, Zent R, et al. Glomerular cell cross-talk influences composition and assembly of extracellular matrix. J Am Soc Nephrol 2014 25:953–966. Caesar 2014 Caesar JJE,1, Lavender H, Ward PN, Exley RM, Eaton J, Chittock E, Malik TH, Goiecoechea De Jorge E, Pickering, MC, Tang CM, and Lea SM. Competition between antagonistic complement factors for a single protein on N. meningitidis rules disease susceptibility. eLife 2014 3:e04008.

Castiblanco- Castiblanco-Valencia MM, Fraga TR, Silva LB, Monaris D, Abreu PA, Strobel S, Józsi Valencia 2012 M, Isaac L, Barbosa AS. Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H, FHL-1, FHR-1, and C4BP. J Infect Dis 2012 205:995-1004. Chen 2014 Chen Q, Wiesener M, Eberhardt HU, Hartmann A, Uzonyi B, Kirschfink M, Amann K, Buettner M, Goodship T, Hugo C, Skerka C, Zipfel PF. Complement factor H– related hybrid protein deregulates complement in dense deposit disease. J Clin Invest 2014 124:145-155. Chen 2016 Chen Q, Manzke M, Hartmann A, Büttner M, Amann K, Pauly D, Wiesener M, Skerka C, Zipfel PF. Complement Factor H-Related 5-Hybrid Proteins Anchor Properdin and Activate Complement at Self-Surfaces. J Am Soc Nephrol 2016 27:1413-1425. Chou 2008 Chou MY, Hartvigsen K, Hansen LF, Fogelstrand L, Shaw PX, Boullier A, Binder CJ, Witztum JL. Oxidation-specific epitopes are important targets of innate immunity. J Intern Med 2008 263:479-488. Clark 2014 Clark SJ, Schmidt CQ, White AM, Hakobyan S, Morgan BP, Bishop PN. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch's membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol 2014 193:4962-4970. Corbett 2007 Corbett B. A., Kantor AB, Schulman H, Walker WL, Lit L, Ashwood P, Rocke DM, Sharp FR. A proteomic study of serum from children with autism showing differential expression of apolipoproteins and complement proteins. Mol Psychiatry 2007 12:292– 306. Csincsi 2015 Csincsi ÁI, Kopp A, Zöldi M, Bánlaki Z, Uzonyi B, Hebecker M, Caesar JJ, Pickering MC, Daigo K, Hamakubo T, Lea SM, Goicoechea de Jorge E, Józsi M. Factor H- related protein 5 interacts with pentraxin 3 and the extracellular matrix and modulates complement activation. J Immunol 2015 194:4963-4973. Csincsi 2017 Csincsi ÁI, Szabó Z, Bánlaki Z, Uzonyi B, Cserhalmi M, Kárpáti É, Tortajada A, Caesar JJE, Prohászka Z, Jokiranta TS, Lea SM, Rodríguez de Córdoba S, Józsi M. FHR-1 binds to C-reactive protein and enhances rather than inhibits complement activation. J Immunol 2017 199:292-303. Daigo 2012 Daigo K., Yamaguchi N, Kawamura T, Matsubara K, Jiang S, Ohashi R, Sudou Y. The proteomic profile of circulating pentraxin 3 (PTX3) complex in sepsis demonstrates the interaction with azurocidin 1 and other components of neutrophil extracellular traps. Mol Cell Proteomics 2012 11:M111.015073. Day 2014 Day AJ, Clark SJ, Bishop PN. Understanding the molecular basis of age-related macular degeneration and how the identification of new mechanisms may aid the development of novel therapies. Expert Rev Ophthalmol 2014 6:123-128. de Córdoba 2008 de Córdoba SR, de Jorge EG. Translational mini-review series on complement factor H: genetics and disease associations of human complement factor H. Clin Exp Immunol 2008 151:1-13. de Paula 2003 de Paula PF, Barbosa JE, Junior PR, Ferriani VP, Latorre MR, Nudelman V, Isaac L. Ontogeny of complement regulatory proteins - concentrations of factor h, factor I, c4b-binding protein, properdin and vitronectin in healthy children of different ages and in adults. Scand J Immunol 2003 58:572-577. Deban 2008 Deban L., Jarva H, Lehtinen MJ, Bottazzi B, Bastone A, Doni A, Jokiranta TS, Mantovani A, and Meri S. Binding of the long pentraxin PTX3 to factor H: interacting

domains and function in the regulation of complement activation. J Immunol 2008 181:8433-8440. Eberhardt 2013 Eberhardt HU, Buhlmann D, Hortschansky P, Chen Q, Böhm S, Kemper MJ, Wallich R, Hartmann A, Hallström T, Zipfel PF, Skerka C. Human factor H-related protein 2 (CFHR2) regulates complement activation. PLoS One 2013 18:e78617. Erdei 2006 Erdei A (ed.), Sármay G, Prechl J. Immunológia. Medicina Könyvkiadó, 2012, Budapest Erdei 2016 Erdei A, Sándor N, Mácsik-Valent B, Lukácsi S, Kremlitzka M, Bajtay Z. The versatile functions of complement C3-derived ligands. Immunol Rev 2016 274:127-140. Esparza-Gordillo Esparza-Gordillo J, Soria JM, Buil A, Almasy L, Blangero J, Fontcuberta J, Rodríguez 2004 de Córdoba S. Genetic and environmental factors influencing the human factor H plasma levels. Immunogenetics 2004 56:77-82. Fakhouri 2010 Fakhouri F, Frémeaux-Bacchi V, Noël LH, Cook HT, Pickering MC. C3 glomerulopathy: a new classification. Net Rev Nephrol 2010 6:494-499. Fritsche 2010 Fritsche LG, Lauer N, Hartmann A, Stippa S, Keilhauer CN, Oppermann M, Pandey MK, Köhl J, Zipfel PF, Weber BH, Skerka C. An imbalance of human complement regulatory proteins CFHR1, CFHR3 and factor H influences risk for age-related macular degeneration (AMD). Hum Mol Genet 2010 19:4694-4704. Gale 2010 Gale DP, Goicoechea de Jorge E, Cook HT, Martinez-Barricarte R, Hadjisavvas A, McLean AG, Pusey CD, Pierides A, Kyriacou K, Athanasiou Y, Voskarides K, Deltas C, Palmer A, Frémeaux-Bacchi V, Rodriguez de Cordoba S, Maxwell PH, and Pickering MC. Identifi cation of a mutation in complement factor H-related protein 5 in patients of Cypriot origin with glomerulonephritis. Lancet 2010 376:794–801. GBD 2015 GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990–2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet 2016 388:1545–1602. Gharavi 2011 Gharavi AG, Kiryluk K, Choi M, Li Y, Hou P, Xie J, Sanna-Cherchi S, Men CJ, Julian BA, Wyatt RJ, Novak J, He JC, Wang H, Lv J, Zhu L, et al. Genome-wide association study identifies susceptibility loci for IgA nephropathy. Nat Genet 2011 43:321-327. Goicoechea de Goicoechea de Jorge E, Caesar JJ, Malik TH, Patel M, Colledge M, Johnson S, Jorge 2013 Hakobyan S, Morgan BP, Harris CL, Pickering MC, Lea SM. Dimerization of complement factor H-related proteins modulates complement activation in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2013 110:4685-4690. Gout 2011 Gout E, Moriscot C, Doni A, Dumestre-Pérard C, Lacroix M, Pérard J, Schoehn G, Mantovani A, Arlaud GJ, Thielens NM. M-ficolin interacts with the long pentraxin PTX3: a novel case of cross-talk between soluble pattern-recognition molecules. J Immunol 2011 186:5815-5822. Hageman 2006 Hageman GS, Hancox LS, Taiber AJ, Gehrs KM, Anderson DH, Johnson LV, Radeke MJ, Kavanagh D, Richards A, Atkinson J, Meri S, Bergeron J, Zernant J, Merriam J, Gold B, Allikmets R, Dean M. Extended haplotypes in the complement factor H (CFH) and CFH-related (CFHR) family of genes protect against age-related macular degeneration: characterization, ethnic distribution and evolutionary implications. Ann Med 2006 38:592-604. Hakobyan 2008a Hakobyan S, Harris CL, Tortajada A, Goicochea de Jorge E, García-Layana A, Fernández-Robredo P, Rodríguez de Córdoba S, Morgan BP. Measurement of factor

H variants in plasma using variant-specific monoclonal antibodies: application to assessing risk of age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008 49:1983-1990. Hakobyan 2008b Hakobyan S, Harris CL, van den Berg CW, Fernandez-Alonso MC, de Jorge EG, de Cordoba SR, Rivas G, Mangione P, Pepys MB, Morgan BP. Complement factor H binds to denatured rather than to native pentameric C-reactive protein. J Biol Chem 2008 283:30451–30460. Hakobyan 2010 Hakobyan S, Tortajada A, Harris CL, de Córdoba SR, Morgan BP. Variant-specific quantification of factor H in plasma identifies null alleles associated with atypical hemolytic uremic syndrome. Kidney Int 2010 78:782-788. Hammerschmidt Hammerschmidt C, Hallström T, Skerka C, Wallich R, Stevenson B, Zipfel PF, and 2012 Kraiczy P. Contribution of the infection-associated complement regulator-acquiring surface protein 4 (ErpC) to complement resistance of Borrelia burgdorferi. Clin Dev Immunol 2012 349657. Hammond 2010 Hammond Jr. DJ, Singh SK, Thompson JA, Beeler BW, Rusiñol AE, Pangburn MK, Potempa LA, and Agrawal A. Identification of acidic pH-dependent ligands of pentameric C-reactive protein. J Biol Chem 2010 285:36235–36244. Hannan 2016 Hannan JP, Laskowski J, Thurman JM, Hageman GS, Holers VM. Mapping the Complement Factor H-Related Protein 1 (CFHR1):C3b/C3d Interactions. PLoS One 2016 11:e0166200. Haupt 2007 Haupt K., Kraiczy P, Wallich R, Brade V, Skerka C, and Zipfel PF. Binding of human factor H-related protein 1 to serum-resistant Borrelia burgdorferi is mediated by borrelial complement regulator-acquiring surface proteins. J Infect Dis 2007 196:124– 133. Haupt 2008 Haupt K, Reuter M, van den Elsen J, Burman J, Hälbich S, Richter J, Skerka C, Zipfel PF. The Staphylococcus aureus protein Sbi acts as a complement inhibitor and forms a tripartite complex with host complement Factor H and C3b. PLoS Pathog 2008 4:e1000250. Hebecker 2010 Hebecker M, Okemefuna AI, Perkins SJ, Mihlan M, Huber-Lang M, and Józsi M. Molecular basis of C-reactive protein binding and modulation of complement activation by factor H-related protein 4. Mol Immunol 2010 47:1347–1355. Hebecker 2012 Hebecker M, Józsi M. Factor H-related protein 4 activates complement by serving as a platform for the assembly of alternative pathway C3 convertase via its interaction with C3b protein. J Biol Chem 2012 287:19528-19536. Heinen 2006 Heinen S, Sanchez-Corral P, Jackson MS, Strain L, Goodship JA, Kemp EJ, Skerka C, Jokiranta TS, Meyers K, Wagner E, Robitaille P, Esparza-Gordillo J, Rodriguez de Cordoba S, Zipfel PF, Goodship TH. De novo gene conversion in the RCA gene cluster (1q32) causes mutations in complement factor H associated with atypical hemolytic uremic syndrome. Hum Mutat 2006 27:292-293. Heinen 2009 Heinen S, Hartmann A, Lauer N, Wiehl U, Dahse H-M, Schirmer S, Gropp K, Enghardt T, Wallich R, Hälbich S, Mihlan M, Schlötzer-Schrehardt U, Zipfel PF, Skerka C. Factor H related protein 1 (CFHR-1) inhibits complement C5 convertase activity and terminal complex formation. Blood 2009 114:2439-2447. Hellwage 1999 Hellwage J, Jokiranta TS, Koistinen V, Vaarala O, Meri S, Zipfel PF. Functional properties of complement factor H-related proteins FHR-3 and FHR-4: binding to the

C3d region of C3b and differential regulation by heparin. FEBS Lett 1999 462:345- 352. Hollyfield 2008 Hollyfield JG, Bonilha VL, Rayborn ME, Yang X, Shadrach KG, Lu L, Ufret RL, Salomon RG, Perez VL. Oxidative damage-induced inflammation initiates age-related macular degeneration. Nat Med 2008 14:194-198. Hughes 2006 Hughes AE, Orr N, Esfandiary H, Diaz-Torres M, Goodship T, Chakravarthy U. A common CFH haplotype, with deletion of CFHR1 and CFHR3, is associated with lower risk of age-related macular degeneration. Nat Genet 2006 38:1173-1177. Jarva 1999 Jarva H, Jokiranta TS, Hellwage J, Zipfel PF, Meri S. Regulation of complement activation by C-reactive protein: targeting the complement inhibitory activity of factor H by an interaction with short consensus repeat domains 7 and 8-11. J Immunol 1999 163:3957-3962. Jokiranta 2000 Jokiranta TS, Hellwage J, Koistinen V, Zipfel PF, Meri S. Each of the three binding sites on complement factor H interacts with a distinct site on C3b. J Biol Chem 2000 275:27657-27662. Józsi 2005 Józsi M, Richter H, Löschmann I, Skerka C, Buck F, Beisiegel U, Erdei A, Zipfel PF. FHR-4A: a new factor H-related protein is encoded by the human FHR-4 gene. Eur J Hum Genet 2005 13:321-329. Józsi 2008a Józsi M, Zipfel PF. Factor H family proteins and human diseases. Trends Immunol 2008 29:380-387. Józsi 2008b Józsi M, Licht C, Strobel S, Zipfel SL, Richter H, Heinen S, Zipfel PF, Skerka C. Factor H autoantibodies in atypical hemolytic uremic syndrome correlate with CFHR1/CFHR3 deficiency. Blood 2008 111:1512-1514. Józsi 2014 Józsi M, Reuter S, Nozal P, López-Trascasa M, Sánchez-Corral P, Prohászka Z, Uzonyi B. Autoantibodies to complement components in C3 glomerulopathy and atypical hemolytic uremic syndrome. Immunol Lett 2014 160:163-171. Józsi 2015 Józsi M, Tortajada A, Uzonyi B, Goicoehea de Jorge E, Rodríguez de Córdoba S. Factor H-related proteins determine complement-activating surfaces. Trends Immunol 2015 36:374-384. Kavanagh 2008 Kavanagh D, Richards A, Atkinson J. Complement regulatory genes and hemolytic uremic syndromes. Annu Rev Med 2008 59:293-309. Kemper 2014 Kemper C, Pangburnb MK, Fishelson Z. Complement Nomenclature 2014. Mol Immunol 2014 61:56-58. Kiryluk 2012 Kiryluk K, Li Y, Sanna-Cherchi S, Rohanizadegan M, Suzuki H, Eitner F, Snyder HJ, Choi M, Hou P, Scolari F, Izzi C, Gigante M, Gesualdo L, Savoldi S, et al. Geographic differences in genetic susceptibility to IgA nephropathy: GWAS replication study and geospatial risk analysis. PLoS Genet 2012 8:e1002765. Kiryluk 2014 Kiryluk K, Li Y, Scolari F, Sanna-Cherchi S, Choi M, Verbitsky M, Fasel D, Lata S, Prakash S, Shapiro S, Fischman C, Snyder HJ, Appel G, Izzi C, et al. Discovery of new risk loci for IgA nephropathy implicates genes involved in immunity against intestinal pathogens. Nat Genet 2014 46:1187-1196. Kopp 2012a Kopp A, Strobel S, Tortajada A, Rodríguez de Córdoba S, Sánchez-Corral P, Prohászka Z, López-Trascasa M, and Józsi M. Atypical hemolytic uremic syndrome- associated variants and autoantibodies impair binding of factor H and factor H-related protein 1 to pentraxin 3. J Immunol 2012 189:1858–1867.

Kopp 2012b Kopp A, Hebecker M, Svobodová E, Józsi M. Factor h: a complement regulator in health and disease, and a mediator of cellular interactions. Biomolecules 2012 2:46-75. Kresl 1998 Kresl JJ, Potempa LA, Anderson BE. Conversion of native oligomeric to a modified monomeric form of human C-reactive protein. Int J Biochem Cell Biol 1998 30:1415- 1426. Laine 2007 Laine M, Jarva H, Seitsonen S, Haapasalo K, Lehtinen MJ, Lindeman N, Anderson DH, Johnson PT, Järvelä I, Jokiranta TS, Hageman GS, Immonen I, Meri S. Y402H polymorphism of complement factor H affects binding affinity to C-reactive protein. J Immunol 2007 178:3831-3836. Lambris 2008 Lambris JD, Ricklin D, Geisbrecht BV. Complement evasion by human pathogens. Nat Rev Microbiol 2008 6:132-142. Lennon 2014 Lennon R., Byron A, Humphries JD, Randles MJ, Carisey A, Murphy S, Knight D, Brenchley PE, Zent R, Humphries MJ. Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix. J Am Soc Nephrol 2014 25:939–951. Losse 2010 Losse J, Zipfel PF, Józsi M. Factor H and factor H-related protein 1 bind to human neutrophils via complement receptor 3, mediate attachment to Candida albicans, and enhance neutrophil antimicrobial activity. J Immunol 2010 184:912-921. Ma 2009 Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Synergy between ficolin-2 and pentraxin 3 boosts innate immune recognition and complement deposition. J Biol Chem 2009 284:28263-28275. Ma 2011 Ma YJ, Doni A, Skjoedt MO, Honoré C, Arendrup M, Mantovani A, Garred P. Heterocomplexes of mannose-binding lectin and the pentraxins PTX3 or serum amyloid P component trigger cross-activation of the complement system. J Biol Chem 2011 286:3405-17. Magistroni 2015 Magistroni R, D'Agati VD, Appel GB, Kiryluk K. New developments in the genetics, pathogenesis, and therapy of IgA nephropathy. Kidney Int 2015 88:974-989. Malik 2012 Malik TH, Lavin PJ, Goicoechea de Jorge E, Vernon KA, Rose KL, Patel MP, de Leeuw M, Neary JJ, Conlon PJ, Winn MP, Pickering MC. A hybrid CFHR3-1 gene causes familial C3 glomerulopathy. J Am Soc Nephrol 2012 23:1155–1160. Marinozzi 2017 Marinozzi MC, Chauvet S, Le Quintrec M, Mignotet M, Petitprez F, Legendre C, Cailliez M, Deschenes G, Fischbach M, Karras A, Nobili F, Pietrement C, Dragon- Durey MA, Fakhouri F, Roumenina LT, Fremeaux-Bacchi V. C5 nephritic factors drive the biological phenotype of C3 glomerulopathies. Kidney Int 2017 92:1232-1241. Martínez- Martínez-Barricarte R, Recalde S, Fernández-Robredo P, Millán I, Olavarrieta L, Barricarte 2012 Viñuela A, Pérez-Pérez J, García-Layana A, Rodríguez de Córdoba S, Spanish Multicenter Group on AMD. Relevance of complement factor H-related 1 (CFHR1) genotypes in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 2012 53:1087– 1094. McGrogan 2010 McGrogan A, Franssen CF, de Vries CS. The incidence of primary glomerulonephritis worldwide: a systematic review of the literature. Nephrol Dial Transplant 2011 26:414- 430. McRae 2001 McRae JL, Cowan PJ, Power DA, Mitchelhill KI, Kemp BE, Morgan BP, Murphy BF. Human factor H-related protein 5 (FHR-5). A new complement-associated protein. J Biol Chem 2001 276:6747-6754.

McRae 2005 McRae JL, Duthy TG, Griggs KM, Ormsby RJ, Cowan PJ, Cromer BA, McKinstry WJ, Parker MW, Murphy BF, Gordon DL. Human factor H-related protein 5 has cofactor activity, inhibits C3 convertase activity, binds heparin and C-reactive protein, and associates with lipoprotein. J Immunol 2005 174:6250-6256. Merinero 2018 Merinero HM, García SP, García-Fernández J, Arjona E, Tortajada A, Rodríguez de Córdoba S. Complete functional characterization of disease-associated genetic variants in the complement factor H gene. Kidney Int 2018 93:470-481. Merle 2015 Merle NS, Church SE, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Complement System Part I – Molecular Mechanisms of Activation and Regulation. Front Immunol 2015 6:262. Mészáros 2016 Mészáros T, Csincsi ÁI, Uzonyi B, Hebecker M, Fülöp TG, Erdei A, Szebeni J, Józsi M. Factor H inhibits complement activation induced by liposomal and micellar drugs and the therapeutic antibody rituximab in vitro. Nanomedicine 2016 12:1023-1031. Mihlan 2009a Mihlan M, Hebecker M, Dahse HM, Hälbich S, Huber-Lang M, Dahse R, Zipfel PF, Józsi M. Human complement factor H-related protein 4 binds and recruits native pentameric C-reactive protein to necrotic cells. Mol Immunol 2009 335-344. Mihlan 2009b Mihlan M, Stippa S, Józsi M, and Zipfel PF. Monomeric CRP contributes to complement control in fluid phase and on cellular surfaces and increases phagocytosis by recruiting factor H. Cell Death Differ 2009 16:1630–1640. Milis 1993 Milis L, Morris CA, Sheehan MC, Charlesworth JA, Pussell BA. Clin Exp Immunol 1993 92:114-119. Miller 2011 Miller YI, Choi SH, Wiesner P, Fang L, Harkewicz R, Hartvigsen K, Boullier A, Gonen A, Diehl CJ, Que X, Montano E, Shaw PX, Tsimikas S, Binder CJ, Witztum JL. Oxidation-specific epitopes are danger-associated molecular patterns recognized by pattern recognition receptors of innate immunity. Circ Res 2011 108:235-248. Miner 2012 Miner JH. The Glomerular Basement Membrane. Exp Cell Res 2012 318:973–978. Mold 1999 Mold C, Gewurz H, Du Clos TW. Regulation of complement activation by C-reactive protein. Immunopharmacology 1999 42:23-30. Monteferrante Monteferrante G, Brioschi S, Caprioli J, Pianetti G, Bettinaglio P, Bresin E, Remuzzi 2007 G, Noris M. Genetic analysis of the complement factor H related 5 gene in haemolytic uraemic syndrome. Mol Immunol 2007 44:1704–1708. Moore 2010 Moore I, Strain L, Pappworth I, Kavanagh D, Barlow PN, Herbert AP, Schmidt CQ, Staniforth SJ, Holmes LV, Ward R, Morgan L, Goodship TH, Marchbank KJ. Association of factor H autoantibodies with deletions of CFHR1, CFHR3, CFHR4, and with mutations in CFH, CFI, CD46, and C3 in patients with atypical hemolytic uremic syndrome. Blood 2010 115:379-387. Murphy 2002 Murphy B, Georgiou T, Machet D, Hill P, McRae J. Factor Hrelated protein-5: a novel component of human glomerular immune deposits. 2002 Am J Kidney Dis 39:24–27. Närkiö-Mäkelä Närkiö-Mäkelä M, Hellwage J, Tahkokallio O, and Meri D. Complementregulator 2001 factor H and related proteins in otitis media with effusion. Clin Immunol 2001 100:118– 126. Nauta 2003 Nauta AJ, Bottazzi B, Mantovani A, Salvatori G, Kishore U, Schwaeble WJ, Gingras AR, Tzima S, Vivanco F, Egido J, Tijsma O, Hack EC, Daha MR, Roos A. Biochemical and functional characterization of the interaction between pentraxin 3 and C1q. Eur J Immunol 2003 33:465-73.

NORD 2016 C3 Glomerulopathy: Dense Deposit Disease and C3 Glomerulonephritis National Organization for Rare Disorders http://rarediseases.org/rare-diseases/c3-glomerulopathy-dense-deposit-disease-and- c3-glomerulonephritis/ 2016. július 24. Okemefuna 2010 Okemefuna AI, Nan R, Miller A, Gor J, Perkins SJ. Complement factor H binds at two independent sites to C-reactive protein in acute phase concentrations. J Biol Chem 2010 285:1053–1065. Oppermann 2006 Oppermann M, Manuelian T, Józsi M, Brandt E, Jokiranta TS, Heinen S, Meri S, Skerka C, Götze O, and Zipfel PF. The C-terminus of complement regulator Factor H mediates target recognition: evidence for a compact conformation of the native protein. Clin Exp Immunol 2006 144:342–352. Park 1996 Park CT, Wright SD. Plasma lipopolysaccharide-binding protein is found associated with a particle containing apolipoprotein A-I, phospholipid, and factor H-related proteins. J Biol Chem 1996 271:18054-18060. Pickering 2013 Pickering MC, D'Agati VD, Nester CM, Smith RJ, Haas M, Appel GB, Alpers CE, Bajema IM, Bedrosian C, Braun M, Doyle M, Fakhouri F, Fervenza FC, et al. C3 glomerulopathy: consensus report. Kidney Int 2013 84:1079-1089. Potempa 1983 Potempa LA., Maldonado BA, Laurent P, Zemel ES, Gewurz H. Antigenic, electrophoretic and binding alterations of human C-reactive protein modified selectively in the absence of calcium. Mol Immunol 1983 20:1165–1175. Pouw 2016 Pouw RB, Brouwer MC, Geissler J, van Herpen LV, Zeerleder SS, Wuillemin WA, Wouters D , Kuijpers TW. Complement Factor H-related protein 3 serum levels are low compared to Factor H and mainly determined by gene copy number variation in CFHR3. PLoS One 2016 11:e0152164. Ram 1998 Ram S, McQuillen DP, Gulati S, Elkins C, Pangburn MK, Rice PA. Binding of complement factor H to loop 5 of porin protein 1A: a molecular mechanism of serum resistance of nonsialylated Neisseria gonorrhoeae. J Exp Med 1998 188:671-680. Reuter 2010 Reuter M., Caswell CC, Lukomski S, and Zipfel PF. Binding of the human complement regulators CFHR1 and factor H by streptococcal collagenlike protein 1 (Scl1) via their conserved C termini allows control of the complement cascade at multiple levels. J Biol Chem 2010 285:38473–38485. Ricklin 2010 Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol 2010 11:785-797. Röhlich 2006 Röhlich P (ed.). Szövettan. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2006, p112, p119, p470. Sánchez-Corral Sánchez-Corral P, González-Rubio C, Rodríguez de Córdoba S, López-Trascasa M. 2004 Functional analysis in serum from atypical Hemolytic Uremic Syndrome patients reveals impaired protection of host cells associated with mutations in factor H. Mol Immunol 2004 41:81-84. Schäfer 2016 Schäfer N, Grosche A, Reinders J, Hauck SM, Pouw RB, Kuijpers TW, Wouters D, Ehrenstein B, Enzmann V, Zipfel PF, Skerka C, Pauly D. Complement Regulator FHR-3 Is Elevated either Locally or Systemically in a Selection of Autoimmune Diseases. Front Immunol 2016 7:542. Schmidt 2008 Schmidt CQ, Herbert AP, Kavanagh D, Gandy C, Fenton CJ, Blaum BS, Lyon M, Uhrín D, Barlow PN. A new map of glycosaminoglycan and C3b binding sites on factor H. J Immunol 2008 181:2610-2619.

100

Schutt 2003 Schutt F, Bergmann M, Holz FG, Kopitz J. Proteins modified by malondialdehyde, 4- hydroxynonenal, or advanced glycation end products in lipofuscin of human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003 44:3663-3668. Serna 2016 Serna M, Giles JL, Morgan BP, Bubeck D. Structural basis of complement membrane attack complex formation. Nat Commun 2016 7:10587. Sharma 1996 Sharma AK, Pangburn MK. Identification of three physically and functionally distinct binding sites for C3b in human complement factor H by deletion mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:10996-11001. Siegel 2010 Siegel C, Hallström T, Skerka C, Eberhardt H, Uzonyi B, Beckhaus T, Karas M, Wallich R, Stevenson B, Zipfel PF, Kraiczy P. Complement factor H-related proteins CFHR2 and CFHR5 represent novel ligands for the infection-associated CRASP proteins of Borrelia burgdorferi. PLoS One 2010 5:e13519. Sjöberg 2009 Sjöberg AP, Trouw LA, Blom AM. Complement activation and inhibition: a delicate balance. Trends Immunol 2009 30:83-90. Skerka 1992 Skerka C, Timmann C, Horstmann RD, Zipfel PF. Two additional human serum proteins structurally related to complement factor H. Evidence for a family of factor H-related genes. J Immunol 1992 148:3313-3318. Skerka 1993 Skerka C, Kühn S, Günther K, Lingelbach K, Zipfel PF. A novel short consensus repeat-containing molecule is related to human complement factor H. J Biol Chem 1993 268:2904-2908. Skerka 1997 Skerka C, Hellwage J, Weber W, Tilkorn A, Buck F, Marti T, Kampen E, Beisiegel U, Zipfel PF. The human factor H-related protein 4 (FHR-4). A novel short consensus repeat-containing protein is associated with human triglyceride-rich lipoproteins. J Biol Chem 1997 272:5627-5634. Skerka 2007 Skerka C, Lauer N, Weinberger AA, Keilhauer CN, Sühnel J, Smith R, Schlötzer- Schrehardt U et al. Defective complement control of factor H (Y402H) and FHL-1 in age-related macular degeneration. Mol Immunol 2007 44:3398-3406. Skerka 2013 Skerka C, Chen Q, Fremeaux-Bacchi V, Roumenina LT. Complement factor H related proteins (CFHRs). Mol Immunol 2013 56:170-180. Strobel 2011 Strobel S, Abarrategui-Garrido C, Fariza-Requejo E, Seeberger H, Sánchez-Corral P, Józsi M. Factor H-related protein 1 neutralizes anti-factor H autoantibodies in autoimmune hemolytic uremic syndrome. Kidney Int 2011 80:397-404. Sugita 1995 Sugita Y, Masuho Y. CD59: its role in complement regulation and potential for therapeutic use. Immunotechnology 1995 1:157-68. Suzuki 2007 Suzuki M, Kamei M, Itabe H, Yoneda K, Bando H, Kume N, Tano Y. Oxidized phospholipids in the macula increase with age and in eyes with age-related macular degeneration. Mol Vis 2007 13:772-778. Szebeni 2005 Szebeni J. Complement activation-related pseudoallergy: a new class of drug-induced acute immune toxicity. Toxicology 2005 216:106-121. Taylor 2007 Taylor KE, van den Berg CW. Structural and functional comparison of native pentameric, denatured monomeric and biotinylated C-reactive protein. 2007 Immunology 120:404–411. Timmann 1991 Timmann C, Leippe M, Horstmann RD. Two major serum components antigenically related to complement factor H are different glycosylation forms of a single protein with no factor H-like complement regulatory functions. J Immunol 1991 146:1265-1270.

101

Tortajada 2013 Tortajada A,Yébenes H, Abarrategui-Garrido C, Anter J, García-Fernández JM, et al. C3 glomerulopathy–associated CFHR1 mutation alters FHR oligomerization and complement regulation. J Clin Invest 2013 123:2434-2446. Tulassay 2010a Tulassay Z. A belgyógyászat alapjai 1. Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest, 2010, p1244 Tulassay 2010b Tulassay Z. A belgyógyászat alapjai 2. Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest, 2010, p45- 49. Valoti 2015 Valoti E, Alberti M, Tortajada A, Garcia-Fernandez J, Gastoldi S, Besso L, Bresin E, Remuzzi G, et al. A novel atypical hemolytic uremic syndrome-associated hybrid CFHR1/CFH gene encoding a fusion protein that antagonizes factor H-dependent complement regulation. J Am Soc Nephrol 2015 26:209-219. van Beek 2017 van Beek AE, Pouw RB, Brouwer MC, van Mierlo G, Geissler J, Ooijevaar-de Heer P, de Boer M, et al. Factor H-related (FHR)-1 and FHR-2 form homo- and heterodimers, while FHR-5 circulates only as homodimer in human plasma. Front Immunol 2017 8:1328. Venables 2006 Venables JP, Strain L, Routledge D, Bourn D, Powell HM, Warwicker P, Diaz-Torres ML, et al. Atypical haemolytic uraemic syndrome associated with a hybrid complement gene. PLoS Med 2006 3:e431. Walport 2001 Walport MJ. Complement. First of two parts. N Eng J Med 2001 344:1058-1066. Weismann 2011 Weismann D, Hartvigsen K, Lauer N, Bennett KL, Scholl HP, et al. Complement factor H binds malondialdehyde epitopes and protects from oxidative stress. Nature 2011 478:76-81. Woo 2013 Woo JM, Kwon MY, Shin DY, Kang YH, Hwang N, Chung SW. Human retinal pigment epithelial cells express the long pentraxin PTX3. Mol Vis 2013 19:303-310. Xu 2001 Xu Y, Narayana SV, Volanakis JE. Structural biology of the alternative pathway convertase. Immunol Rev 2001 180:123-135 Zhang 2013 Zhang Y, Xiao X, Garcia-Fernandez J, Rodríquez de Cordoba S, Zipfel P, Meyer N, Sethi S, Nester C, Ghossein C, Smith R. A novel fusion gene CHFR5–CFHR2 causes C3 Glomerulonephritis. Mol Immunol 2013 56:297. Zhang 2017a Zhang P, Zhu M, Geng-Spyropoulos M, Shardell M, Gonzalez-Freire M, Gudnason V, et al. A novel, multiplexed targeted mass spectrometry assay for quantification of complement factor H (CFH) variants and CFH-related proteins 1-5 in human plasma. Proteomics 2017 17. Zhang 2017b Zhang Y, Meyer NC, Fervenza FC, Lau W, Keenan A, Cara-Fuentes G, Shao D, Akber A, et al. C4 Nephritic Factors in C3 Glomerulopathy: A Case Series. Am J Kidney Dis 2017 70:834-843. Zhao 2011 Zhao J, Wu H, Khosravi M, Cui H, Qian X, Kelly JA, Kaufman KM, et al. Association of Genetic Variants in Complement Factor H and Factor H-Related Genes with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility. PLoS Genet 2011 7:e1002079.

102

Köszönetnyilvánítás

Elsőként szeretnék köszönetet mondani Misinek, témavezetőmnek. Mérhetetlen türelmének, kitartásának, precizitásának és kifogyhatatlan tudományos ötleteinek köszönhetem az elért eredményeket. Kivételes ember, ezért büszke vagyok, hogy együtt dolgozhattunk. Szeretném megköszönni az Immunológiai Tanszék oktatóinak, munkatársainak a doktorandusz évek alatt nyújtott támogatást, segítséget. Erdei Annának, a tanszék korábbi vezetőjének külön hálával tartozom. Végzős vegyész hallgatóként meghallgatott, és másokkal együtt lehetőséget biztosított nekem az Immunológia Doktori Programban. Kutatócsoportunk minden tagjának köszönöm az elmúlt néhány évet. Különösen Barbarának vagyok hálás, aki meglepően nagy türelemmel és bölcsességgel áll úgy az emberekhez, mint a tudományos kísérletekhez. Nagyon sokat tanultam Tőle. Andi, Évi, Marci, Szandi, szerettem Veletek dolgozni. Majának köszönöm a beszélgetéseket és az időnkénti, inkubációs idők alatti sétákat. Családomnak, szüleimnek és testvéremnek köszönöm a támogatást és azt, hogy vannak nekem. Köszönöm még barátaimnak a vidám, és kevésbé vidám együtt töltött perceket. Szeretettel gondolok vissza a mindig kedves és életvidám Joó Erikára, aki sajnos ezeket a sorokat már nem olvashatja.

103

104