NATHÁLIA LUÍZA ANDREAZZA PROSPECÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E FITODERIVADOS BIOATIVOS EM Guatteria blepharophylla (ANNONACEAE) E Indigofera truxillensis (FABACEAE) PARA APLICAÇÃO EM TERAPIA FOTODINÂMICA E DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS Campinas, 2014 i ii Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972 Andreazza, Nathalia Luiza, 1984- An25p AndProspecção de metabólitos secundários e fitoderivados bioativos em Guatteria blepharophylla (Annonaceae) e Indigofera truxillensis (Fabaceae) para aplicação em terapia fotodinâmica e desenvolvimento de procedimentos analíticos / Nathalia Luiza Andreazza. – Campinas, SP : [s.n.], 2014. AndOrientador: Marcos José Salvador. AndTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. And1. Guatteria. 2. Indigofera. 3. Metabolismo secundário. 4. Compostos bioativos. I. Salvador, Marcos José,1971-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título. Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Prospecting of secondary metabolites and phytoderivatives from Guatteria blepharophylla (Annonaceae) and Indigofera truxillensis (Fabaceae) for photodynamic therapy application and development of analytical procedures Palavras-chave em inglês: Guatteria Indigofera Secondary metabolism Bioactive compounds Área de concentração: Biologia Vegetal Titulação: Doutora em Biologia Vegetal Banca examinadora: Marcos José Salvador [Orientador] Elita Scio Fontes Maria Silvana Alves Paulo Cesar Pires Rosa Claudia Regina Baptista Haddad Data de defesa: 27-03-2014 Programa de Pós-Graduação: Biologia Vegetal iv Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) vi RESUMO Neste trabalho realizou-se estudo físico, químico e biológico para a prospecção de metabólitos secundários e fitoderivados em Guatteria blepharophylla (Annonaceae) e Indigofera truxillensis (Fabaceae) para aplicação em Terapia Fotodinâmica (PDT). A caracterização fitoquímica dos extratos metanólicos das espécies estudadas resultou no isolamento de cinco alcaloides isoquinolínicos de G. blepharophylla e um alcaloide bis- indólico de I. truxillensis. A investigação fotofísica dos extratos, frações e das substâncias isomoschatolina e índigo, revelou perfis de absorção na região entre 600 a 800 nm. Nas análises fotoquímicas, os extratos e fração alcaloídica de G. blepharophylla apresentaram resultados sugestivos quanto a produção de oxigênio singleto, assim como a substância isomoschatolina. Já em ensaio microbiológico in vitro com o emprego de substâncias supressoras de espécies reativas de oxigênio, observou-se a prevalência do mecanismo fotoquímico do tipo II para a isomoschatolina e do tipo I para o índigo. Nos ensaios biológicos de PDT antimicrobiana e antitumoral com os extratos, frações e as substâncias isoladas isomoschatolina e índigo observaram-se, para todas as estas amostras-teste, resultados efetivos na inativação de algumas das cepas indicadoras com redução do crescimento microbiano (UFC/ml) superior a 90%, assim como diminuição da sobrevida celular para as linhagens humanas de fibroblasto (3T3) e melanoma (UACC-62), sendo observado efeito em menores concentrações somente para UACC-62 quando associado à irradiação laser (660nm). Em ensaio biológico na presença das substâncias CaCl2 e MgCl2, a ação biocida dos alcaloides isomoschatolina e índigo, na fotoinativação da cepa Escherichia coli ATCC 10799 foi intensificada se comparado aos grupos controles. Portanto o conjunto de resultados observados sugerem que os extratos brutos e frações alcaloídicas das duas vii plantas estudadas e os alcaloides isomoschatolina e índigo apresentaram fotoatividade frente a bactérias, leveduras e frente à cultura de células de melanoma em concentração subinibitória. Na análise da interação dos alcaloides fotossensibilizantes berberina e isomoschatolina com LDL em modelos celulares, a caracterização dos complexos alcaloide/LDL permitiu identificar uma primeira classe de fixação, denominada classe P, a partir de alterações na fluorescência da apoproteína B-100. Para berberina e isomoschatolina verificou-se que cerca de 250 e 135 moléculas se complexam a porção proteica da partícula de LDL e proximidades, apresentando constante de afinidade iguais a 1,05.108 M-1 e 5,06.107 M-1, respectivamente. Uma segunda classe de fixação, chamada de classe L, determinada somente para a berberina, foi caracterizada a partir de alterações na fluorescência deste alcaloide e correspondeu a fixação de cerca de 80 moléculas de berberina na porção lipídica da partícula de LDL, com uma constante de afinidade de 7,10.107 M-1. Estes valores revelam que o processo predominante de interação da berberina com o LDL é a fixação de classe P. Nos ensaios em nível celular, realizados com a berberina, verificou-se que a sua complexação com o LDL não prejudica o seu reconhecimento pelos receptores apoproteína B/E da superfície membranar das células U87MG e que a sua internalização pode ocorrer associada o LDL pela via de endocitose. No entanto, não foi verificado acumulo de berberina nos lisossomos, mas apenas nas mitocôndrias, o que sugere que após a internalização, o alcaloide rapidamente sofre um processo de redistribuição intracelular. Para células cultivas em Ultroserum G, observou-se aumento da produção de produtos da peroxidação lípidica nas células tratadas com berberina complexada em relação àquelas tratadas com o alcaloide livre, nas doses de irradiação de 50 e 100 J/cm2. Todas estas evidências revelam a possibilidade de complexação de ambos os alcaloides com o LDL como molécula carreadora para aplicação em PDT antitumoral, sendo viii que para berberina a associação não só aumenta sua incorporação celular, assim como sua efetividade como agente fotoativo. ix x ABSTRACT In this work it was carried out chemical and biological studies for secondary metabolites and phyto-derivatives prospecting from Guatteria blepharophylla (Annonaceae) and Indigofera truxillensis (Leguminosae) for antimicrobial and antitumor photodynamic therapy (PDT) application. The phytochemical characterization of the methanol extracts from both species resulted in the isolation of five isoquinoline alkaloids from G. blepharophylla, isomoschatoline, O-methylmoschatoline, liriodenine, subsessiline and lysicamine, and one bis-indole alkaloid, indigo, from I. truxillensis. Photophysical characterization of crude extracts, fractions and the substances isomoschatoline and indigo showed absorption profiles in the region between 600 to 800 nm and fluorescence emission when excited at their absorption wavelenght. In photochemical analysis, at 1,3-DPBF probe assay, crude extracts and alkaloidal fraction from G. blepharophylla showed positive results regarding singlet oxygen production, as well as isomoschatoline. At in vitro microbiological assay with reactive oxygen species suppressors, it was observed the prevalence of type II photochemical mechanism for isomoschatoline and type I for indigo, as also suggested by 1,3- DPBF assay results. In the antimicrobial and antitumor PDT biological assays, with crude extracts, fractions, isomoschatoline and indigo, effective results for microbial strains inactivation were found with microbial growth reduction (CFU/mL) superior to 90%, as well as decreased cell survival of human fibroblast (3T3) and melanoma (UACC-62) cell lines, in which this effect for the latter, was observed at lower concentrations when combined with laser irradiation. It was also found that both isomoschatoline and indigo exhibit enhanced photodynamic antimicrobial activity against Gram-negative bacteria (Escherichia coli ATCC 10799 strain) in comparison to control groups, when CaCl2 and MgCl2 additives were employed. Therefore, xi in light of all assays results it is suggested that crude extracts and alkaloid fractions from both plant species and the alkaloids isomoschatoline and indigo showed photoactivity against bacteria and yeasts strains and against melanoma human cell line at sub-inhibitory concentration when associated with laser irradiation at 660 nm. At interaction studies between photosensitizing alkaloids berberine and isomoschatoline with LDL and cellular models, changes in LDL’s Apoprotein B-100 fluorescence allowed the identification of a first class of substances fixation in this particle called, P fixation class. For berberine and isomoschatoline it was found that about 250 and 135 molecules, respectively complexes to LDL’s protein portion and its vicinity, leading to affinities constants equals to 1,05.108 M-1 and 5,06.107 M- 1, respectively. A second fixation class, the L fixation class, accessed only for berberine, was obtained by changes in the alkaloid fluorescence and correspond to 80 molecules attached to LDL’s lipid portion, leading to affinity constant equal to 7,10.107 M-1. These results reveal that the predominant process of berberine interaction with LDL is by P fixation class. At cellular level assays, performed only with berberine, it was found that the alkaloid complexation with LDL did not affect LDL recognition by apoprotein B/E membrane surface receptors of U87MG cells and that berberine internalization may occur associated with the particle via LDL endocytosis. However, there was no accumulation of berberine found in lysosomes. Mitochondria accumulation was observed suggesting that, after internalization, this alkaloid undergoes rapid intracellular redistribution process. At cells cultured with Ultroserum G and treated with complexed berberine