Cultivos Tropicales ISSN: 0258-5936 [email protected] Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas Cuba
Castilla, Yanelis CULTIVO DE TEJIDOS DE ROSAS (Rosa sp): UN ACERCAMIENTO A INVESTIGACIONES RECIENTES Cultivos Tropicales, vol. 26, núm. 4, 2005, pp. 43-47 Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas La Habana, Cuba
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Revisión bibliográfica CULTIVO DE TEJIDOS DE ROSAS (Rosa sp): UN ACERCAMIENTO A INVESTIGACIONES RECIENTES Yanelis Castilla
ABSTRACT. Roses (Rosa sp) are among the most appreciated RESUMEN. Las rosas (Rosa sp) constituyen plantas muy apre- plants in the world, both in gardening and in the cut flower ciadas en todo el mundo, tanto en la jardinería como en el sector. This article shows the most recent results of the world, sector de las flores de corte. En el presente artículo se dan a in relation to the application of in vitro tissue culture conocer los resultados más recientes que se han obtenido a propagation of different species and varieties of roses. nivel internacional, con respecto a la aplicación del cultivo de Nowadays, the culture of buds and shoots, calluses and nods tejidos para la propagación in vitro de distintas especies y are among the most used techniques. In general, modern variedades de rosas. Entre las técnicas más utilizadas actual- shrubs are the most propagated roses, although the miniature mente se encuentran el cultivo de yemas y brotes, callos y potted roses still represent a wide area of investigation. nodos. De manera general, los rosales modernos son los más propagados, con excepción de las rosas en miniatura, que aún representan un amplio campo a investigar.
Key words: Rosa sp, tissue culture, plant growth Palabras clave: Rosa sp, cultivo de tejidos, sustancias substances de crecimiento vegetal
INTRODUCCIÓN co pétalos, generalmente de color mejora por mutagénesis y selección rosado, amarillo o blanco. in vitro. El cultivo de tejidos se pue- Desde los inicios de la humani- Rosales antiguos: híbridos de las de definir como un conjunto de téc- dad, el hombre sintió la necesidad especies silvestres, considerados nicas que permiten el cultivo en con- de cultivar plantas que, más allá de hasta 1867 en que surgió el primer diciones asépticas de órganos, teji- su utilidad alimentaria, embellecieran rosal moderno: el híbrido del té. dos, células y protoplastos emplean- el entorno, ya fuera por su porte o Rosales modernos: constituyen el 95 % do medios nutritivos artificiales. Otras por el atractivo de sus flores. Entre de los rosales que se cultivan en la ventajas consisten en que posibilitan estas plantas, conocidas como or- actualidad. Son más resistentes a las aumentar el coeficiente de multipli- namentales, unas de las más culti- enfermedades y sus flores perduran cación, producir independientemen- vadas en todo el mundo son las ro- por más tiempo. Se clasifican en te de las condiciones ambientales y sas (Rosa sp). Resulta difícil encon- ocho grupos, entre los que se desta- facilitar la comercialización de las trar un jardín donde no se cultive al- can comercialmente las rosas especies vegetales (3). A pesar de la guna especie o variedad de estas arbustivas, trepadoras, tapizantes y utilidad de estas técnicas, la infor- plantas, consideradas como la flor rosas en miniatura. Estas últimas mación concerniente a su aplicación número uno por las grandes civiliza- generalmente no sobrepasan una al- en el cultivo in vitro de la rosa se ciones . tura de 45 cm y resultan ideales para encuentra muy dispersa, por lo que De acuerdo con su origen, ac- sembrar en macetas. en el presente trabajo el objetivo fue tualmente las rosas pueden Las distintas especies de rosas dar a conocer los resultados más clasificarse en tres grupos (1): han sido sometidas durante muchos recientes que se han obtenido a ni- Especies silvestres de rosas: las que años a un proceso continuo de se- vel internacional, con respecto a la originalmente crecen en la naturale- lección e hibridaciones, que ha traí- aplicación del cultivo de tejidos para za y constituyen los ancestros de las do como resultado la aparición de la propagación de distintas especies demás rosas. La mayoría presenta nuevas variedades, por lo que actual- y variedades de rosas. flores pequeñas, solitarias, con cin- mente existen cerca de 30 000 (2). Sin embargo, existen también Yanelis Castilla, Reserva Científica del Depar- DESARROLLO tamento de Genética y Mejoramiento Vege- otras técnicas, como las del cultivo tal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, de tejidos, que investidas de mayor Entre las técnicas del cultivo de Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, La Ha- actualidad y aunque menos conoci- tejidos más empleadas para la pro- bana, CP 32 700. das, permiten la rápida introducción pagación in vitro de las rosas, se [email protected] de variedades de rosas, así como la encuentran el cultivo de yemas y bro-
43 Yanelis Castilla tes, callos y nodos. Otros métodos, neración de yemas, a partir de bro- TIBA también incrementó el número como el cultivo de embriones y tes in vitro. La máxima frecuencia de de hojas por brote y contenido de clo- protoplastos, presentan una mayor regeneración de yemas (93.4 % me- rofila en la hoja (11). especificidad y complejidad, por lo dia de los tres cultivares) y el mayor Cultivo de callos. El callo representa que son menos utilizados con este fin. número de yemas por explante un crecimiento desorganizado de Cultivo de yemas y brotes. Al reali- regenerante (3.7), se obtuvieron cuan- células obtenido a partir de determi- zar la propagación de plantas a par- do los foliolos fueron cultivados en nado tejido. Su formación comienza tir de yemas y brotes jóvenes, las medio MS con 6.8 µM de TDZ y con el aislamiento de órganos o teji- mutaciones espontáneas que se pue- 0.49 µM de IBA por siete días en la dos diferenciados, que posteriormen- den presentar son mínimas, ya que oscuridad y luego subcultivados en te desdiferencian ante la presencia estos derivan directamente de medio MS de regeneración suplemen- de auxina exógena en el medio de meristemos organizados y están su- tado con 2.22 µM de BA y 0.049 µM cultivo. Las células proliferan conti- jetos a bajos niveles de variación (4). de IBA expuesto a una radiación nua y aceleradamente, dando origen Se considera yema al rudimento de fotosintéticamente activa (PAR) de a una masa amorfa de tejidos (12). un vástago, que se forma habitual- 15 µmol.m-2.s-1. La capacidad de for- Aunque se considera que el cultivo mente en las axilas de las hojas y mación de yemas también estuvo de callos puede constituir una fuen- suele estar protegida por una serie significativamente afectada por el te de variación genética (4), tiene la de hojas, mientras que brote es el genotipo y el ambiente. La adición ventaja de que permite multiplicar término usual con que se designa el de nitrato de plata al medio de in- rápidamente el material vegetal. vástago en estado de desarrollo, a ducción aumentó significativamente En Rosa sp, se ha investigado partir de la yema hasta que ha termi- el porcentaje de regeneración en los el desarrollo de callos a partir de nado su crecimiento (5). tres genotipos probados. Los brotes explantes de pétalos de siete En R. hybrida se determinó el elongados fueron cortados y cultivares (Contempo, America’s Ju- efecto de reguladores del crecimien- enraizaron mejor en 1/ MS sin regu- nior Miss, Manasi, Mrinalini, Preyasi, 2 to, fuente de carbono y sales en el ladores del crecimiento (8). Sylvia y Queen Elizabeth), en distin- medio sobre la proliferación in vitro El uso de sustancias que tos medios, resultando los más satis- de explantes de yemas laterales, de incrementen la proliferación de bro- factorios para la formación de callos: el 10 cultivares distintos. El medio fi- tes, resulta muy aconsejable para la MS con 1 mg.L-1 de ANAy 1 mg.L-1 de nalmente adoptado, incluyó las multiplicación comercial. Dos com- BA y el Schenk y Hildebrandt (SH) formulaciones de sales de Quoirin y puestos como el tidiazurón (TDZ) y con 2 mg.L-1 de 2,4 D y 1 mg.L-1 de BA, Lepoiure, 30 g.L-1 de sacarosa, 3 mg.L-1 forclorfenurón (CPPU) son capaces aunque no se observó embriogénesis de BA y 0.5 mg·L-1 de ANA. En es- de aumentar la brotación en R. somática ni organogénesis en ningu- tas condiciones, se obtuvo un ritmo hybrida, cvs. Sonia y Raktagandha, no de los medios (13). de multiplicación de 30.3 plántulas al sumergir por un corto período de El efecto de algunas hormonas por explante, luego de 180 días (6). tiempo los explantes en 100 y 200 µM, en la inducción de callos también ha En cambio, el medio MS resul- respectivamente, antes de subcultivarlos sido objeto de estudio en Rosa cani- tó el mejor en cuanto al rápido esta- en medio de proliferación normal (9). na y Rosa dumalis. Los segmentos blecimiento y la diferenciación de ye- A su vez, el TDZ es útil para inducir nodales de 0.4 a 0.5 cm fueron sem- mas axilares de Rosa hybrida (7). Es- la floración in vitro, pues la combina- brados en medio MS y se detectó tas fueron sembradas en medio MS ción de 0.5 mg.L-1 de este con 0.1 mg.L-1 que en R. canina la inducción de con 2 ó 4 mg.L-1 de KIN o 2 ó 4 mg.L-1 de NAA en medio MS, aumentó a un callos era alta con elevadas concen- de BAP, individualmente o en combi- 49 % la producción de flores en el traciones de ANA y BA, mientras en nación con 0.1 mg·L-1 de ANA. El em- cv. Orange Parade (10). R. dumalis bajas concentraciones de pleo de 4 mg.L-1 de BAP permitió la La micropropagación de R. ANA y altas de BA tuvieron el mismo inducción de múltiples brotes. En hybrida se ve incrementada al utili- efecto (14). En R. hybrida también medio suplementado con 2 mg·L-1 de zar anti-auxinas. Brotes de los ha sido inducida la morfogénesis in KIN seguido de 2 mg.L-1 de BAP se cultivares Super Star y Sonia fueron vitro de callos (15). obtuvieron brotes largos con el ma- multiplicados por 10 subcultivos a in- En R. damascena cv. Noorjahan yor número de hojas, aunque no de- tervalos de cuatro semanas en me- y R. chinensis landrace, dos espe- sarrollaron raíces en el medio de dio MS suplementado con 22.19 µM cies productoras de aceites esencia- enraizamiento. Los brotes que se de BA, 1.07µM de ANA y 0.05 µM de les, ha sido investigada la regeneraron del medio que contenía AG . La adición de las anti-auxinas organogénesis, tanto directa como 3 0.25 mg.L-1 de BAP y 0.25 mg.L-1 de ácido triiodobenzoico (TIBA) (2 µM) y indirecta. Para el primer aspecto, se KIN respondieron más eficientemente ácido 2,4,6 triclorofenoxiacético probaron 12 combinaciones de me- al enraizamiento y a la aclimatación (0.39 µM) en el medio de prolifera- dios, en las cuales el medio basal al transferirlos al invernadero. ción, incrementaron el número de MS fue suplementado con distintas En tres cultivares de R. hybrida brotes por explante y su longitud en concentraciones de 6-BAP y ANA, fue desarrollado un sistema de rege- ambos cultivares. El tratamiento con para inducir regeneración de brotes
44 Cultivo de tejidos de rosas (Rosa sp): un acercamiento a investigaciones recientes adventicios a partir de explantes Para la micropropagación de R. el medio MS (3/ macroelementos y 4 nodales de las dos especies. Para damascena se han utilizado segmen- 1/ microelementos) suplementado, 2 lograr la organogénesis indirecta se tos simples de nodos, de arbustos respectivamente, con 0.5 mg.L-1 de empleó el medio MS 1/ con 0.5 mg·L-1 maduros. El efecto del TDZ fue com- IBA, 0.5 mg.L-1 de ANA y 2.5 g.L-1 2 de BAP, suplementado con AG y parado con el del BA en la prolifera- de sacarosa, y con 0.2 mg·L-1 de 3 disulfato de adenina (ADS). En am- ción de brotes in vitro. Los cultivos IBA, 0.2 mg.L-1 de ANA y 30 g.L-1 bos experimentos se obtuvo regene- iniciados en medio con TDZ y/o cul- de sacarosa (22). ración de brotes a partir de los tivados continuamente en medio con Cultivo de embriones y protoplastos. explantes nodales y los callos (16). TDZ, por 32 ó 48 semanas, exhibie- El cultivo in vitro de embriones ha sido El genotipo de la planta y el tipo ron considerablemente mayor proli- una herramienta útil para la propaga- de explante utilizado son factores feración de brotes y crecimiento du- ción de varias especies de rosa, que que influyen también en la inducción rante el cultivo subsiguiente en me- solo son viables mediante semillas y proliferación de callos, como fue dio con BA. Los brotes inducidos en y presentan dificultades para germi- demostrado (17) para seis cultivares medio con TDZ y subcultivados 8-12 nar convencionalmente. A través del de R. floribunda. Tres tipos de veces en medio con BA, desarrolla- cultivo de embriones ha sido posible, explantes fueron cultivados en me- ron la capacidad de crecer y prolife- por ejemplo, superar la dormancia de dio MS con BA, ANA y 2,4-D para rar en medio libre de reguladores del las semillas e incrementar rápida- obtener callos, alcanzándose la mayor crecimiento. Los microbrotes de cul- mente el número de especies de ro- frecuencia de inducción, en el cultivar tivos inducidos con TDZ enraizaron sales silvestres en la colección del Dacapo, usando las bases de las ye- fácilmente en medio con IBA (10 µM, Jardín Botánico de Montreal, Cana- mas como explantes, aunque el mejor 12 h). Las plantas enraizadas fueron dá, a partir de un número muy limita- crecimiento de los callos fue observa- transferidas exitosamente a mace- do de semillas obtenidas de institucio- do en Lili Marlene, al emplear pétalos. tas, obteniéndose un 70 % de su- nes botánicas de todo el mundo (23). Cultivo de nodos. Los nodos o nu- pervivencia (19). El principal criterio para la siem- dos son los segmentos del tallo de Otros plantean la siembra de bra de cultivares de rosas en regio- la planta donde se encuentran las explantes nodales (1.5-3 cm) de 10 nes norteñas son: buena resistencia hojas, generalmente cubriendo a las cultivares de rosas en medio MS con al viento, alta resistencia a enfer- yemas axilares, por lo que constitu- varios niveles de AIA y BAP (20). En medades fúngicas y alta calidad de yen puntos de ramificación y creci- medio con 2 mg.L-1 de AIA se produ- las flores en condiciones de hume- miento. Los esquejes constituyen pre- jeron múltiples brotes. La adición de dad y bajas temperaturas en verano cisamente los fragmentos de estos nitrato de plata al medio posibilitó la y otoño. Hasta cierto punto, la espe- nodos, con el objetivo de sembrarlos reducción de la abscisión foliar y au- cie R. rugosa Thunb reúne estos re- en el medio de cultivo o en la tierra. mentó el crecimiento de brotes querimientos, pues 12 de sus varie- El efecto de dos citoquininas axilares. Las plántulas crecidas in dades no necesitan cubierta durante antagonistas (2-cloro-4-ciclobutil- vitro fueron enraizadas en 1/ MS con el invierno, forman arbustos de 1.2 a 4 amino-6-etilamino-1,3,5-triazina y N- 0.1 mg·L-1 de AIA y 0.1 mg.L-1 de IBA. 1.5 m de altura, tienen un período de (4-piridil)-O-(4-clorofenil)-carbamato) El enraizamiento fue evidente en floración continua y el color de la flor fue estudiado en la brotación de ye- ocho cultivares, mientras que dos no varía desde blanco (‘Parsla’) hasta mas de nodos sencillos de dos respondieron (Windy City y Doris rosado con el centro blanco cultivares de R. hybrida (Madelon y Tysterman). Las plántulas resultan- (‘Abelzieds’) o púrpura (‘Zilga’). No Motrea), que difieren en su dominan- tes fueron aclimatizadas y crecidas obstante, los métodos tradicionales cia apical. Los compuestos se apli- en macetas, desarrollándose normal- de propagación no han tenido éxito caron en el medio de cultivo a tres mente. en producir rosas de floración fre- concentraciones distintas, por sepa- En condiciones in vitro, resulta cuente con flores amarillas o rojo bri- rado o en combinación con BA. Las importante la inducción de raíces de llantes, ni variedades trepadoras. citoquininas antagonistas redujeron los explantes, con vistas a su poste- Para expandir el programa de propa- el número de yemas brotadas en rior adaptación en tierra. En Rosa gación, se empezó a desarrollar ambos cultivares a distintas longitu- centifolia Linn, var. Andhra Red, uno embriones estériles en cultivo. Los des, dependiendo su efecto fuerte- de los medios más eficaces para la métodos in vitro han sido usados mente de la concentración aplicada rizogénesis de microesquejes resul- principalmente para los híbridos del y de la duración del período de culti- ta ser el MS (1/ ) con 15 % de saca- té, más raramente para las minirosas 2 vo. La sustitución de las citoquininas rosa, 0.5 mg.L-1 de AIA y 0.1 mg.L-1 y se ha intentado iniciar la con BA en el medio dio como resul- de ANA, aunque el mayor número de embriogénesis somática en el culti- tado una superación de la supresión raíces se obtiene en medio MS (1/ ) vo de callos. Existe escasa informa- 2 de la brotación de las yemas. Ambos con sacarosa y 1 mg·L-1 de IBA (21). ción concerniente a las condiciones compuestos inhibieron significativa- En cambio, en los cultivares Super de cultivo de embriones de rosa mente el sobrecrecimiento de las ye- Star y Sonia (Rosa hybrida), la for- inmaduros, por lo que los estudios mas (18). mación de raíces se ve favorecida en se dirigen hacia dos direcciones: el
45 Yanelis Castilla desarrollo de cultivos de callos con obtenidos de cada gramo de TFE ino- malformes estaba restringida al saco iniciación de embriones somáticos y culado con Agrobacterium. Los ca- del ovario de los pistilos transforma- la elaboración de tecnología para llos embriogénicos transformados dos y no ocurrió en las partes que obtener semillas fértiles in vitro de fueron transferidos a medio de ma- representan tubos del estilo transfor- embriones inmaduros aislados en duración para formar embriones mados. La acumulación de estadios tempranos luego de cruces somáticos, que luego produjeron transcriptos de RAG no fue incompatibles (24). plantas. La naturaleza transgénica de detectable en etapas tempranas del Los protoplastos son células estas fue confirmada por ensayos desarrollo en flores anormales del cv. vegetales a las que les ha sido de- enzimáticos, PCR e hibridización Motrea ni en la rosa verde (29). gradada la pared celular a través de Southern. Aproximadamente 100 Cultivo de tejidos en las rosas en procesos enzimáticos. Se obtienen plantas transgénicas fueron estable- miniatura. Con respecto a las rosas como paso previo para lograr la hibri- cidas en el suelo y florecieron en el en miniatura, los estudios referidos al dación somática, mediante la fusión invernadero. Este procedimiento fa- cultivo de tejidos son más escasos. de dos protoplastos (células) con cilita la introducción de genes desea- Por ejemplo, ha sido investiga- dotaciones cromosómicas diferentes, bles, especialmente los que contro- do el crecimiento y desarrollo de lo que permite la introducción de lan el color de la flor en cultivares plántulas de diversas poblaciones, en material genético en el núcleo o cito- comerciales de rosa (27). comparación con el de sus clones plasma de la célula y que se trans- Posiblemente el desarrollo de auto-enraizados, con el objetivo de mita a la descendencia. De manera esta investigación haya servido de seleccionar cultivares adaptados al general, no es un método muy emplea- precedente a la creación de la rosa cultivo en maceta. De manera gene- do en las rosas, aunque en R. azul, pues se afirma que esta «ya ral, las plántulas y sus clones se damascena y R. borboniana, dos de está llegando» (28). Investigadores comportaron de forma similar, aun- las especies de mayor importancia japoneses han creado la rosa azul que el nivel de expresión de siete comercial debido a su aroma y al con- tras varios años de investigación, al caracteres difirió significativamente. tenido de aceites esenciales, se han implantar el gen que codifica para la De esta manera, en las plántulas el establecido protocolos de micropropa- síntesis del pigmento azul en pen- botón floral se formó tempranamen- gación mediante segmentos nodales samientos. El color de la nueva rosa te, pero floreció después que sus y se ha estudiado el cultivo de proviene enteramente del pigmento clones. En el momento de la antesis, protoplastos, como alternativas viables ‘delphinidin’, que no existe en las las plántulas presentaron brotes más para una rápida propagación y obten- rosas naturales. cortos, menor número de hojas, ma- ción de nuevas variedades (25). RAG, el gen homólogo del yor número de yemas florales, un Otras aplicaciones del cultivo de te- AGAMOUS de Arabidopsis, fue ais- mayor porcentaje de yemas axilares jidos en rosas. Existen otras técni- lado de flores de rosas. Niveles de y menos pétalos por flor que sus cas que aunque directamente no se transcriptos de RAG fueron exami- clones (30). incluyen dentro del cultivo de tejidos, nados en órganos florales de flores La mayoría de las investigacio- se han visto beneficiadas por el de- normales del cv. Ragged Robin (R. nes se refieren a la influencia, sobre sarrollo de este, como es el caso de chinensis), que no mostraron carac- el desarrollo de las flores, de diver- las técnicas de transformación terísticas de malformación; en flores sos factores ambientales como la genética de plantas. Estas consis- normales y malformadas (mostran- temperatura (31), la aplicación ten en la transferencia de genes do los filodios) del cv. Motrea (R. exógena de fitohormonas (ácido exógenos al interior del genoma ve- hybrida) y flores completamente abscísico y etileno) (32) y las esta- getal, los cuales previamente han malformadas del mutante estable ciones del año (invierno y verano) (33). sido modificados in vitro para permi- ‘rosa verde’ (R. chinensis ‘Viridiflora’). También existen informes acerca de tir su expresión (26). La acumulación de transcriptos de los procedimientos más adecuados Tejidos friables embriogénicos RAG fue evidente en todas las eta- para lograr la desinfección de (TFE) de cultivos de filamentos de pas del desarrollo del botón en flores explantes, específicamente en el rosa (R. hybrida cv. Royalty) fueron normales de Ragged Robin y Motrea. cultivar ‘Baby Masquerade’ (34). obtenidos y cocultivados con Un nivel relativamente alto de RNA Como se aprecia, resulta nece- m Agrobacterium tumefaciens o A. de RAG, similar al encontrado en las sario profundizar en los estudios so- rhizogenes, portando un vector con flores normales, también estuvo pre- bre técnicas del cultivo in vitro, como los genes neomicina fosfotransferasa sente en los órganos reproductores el cultivo de yemas y meristemos, II (npt II), glucuronidasa (GUS) o lu- de flores malformadas de Motrea en así como la embriogénesis somática, ciérnaga luciferasa (LUC). Las colo- estadios avanzados del desarrollo del aplicadas a las distintas variedades nias supuestamente transformadas botón (más de 10 mm de diámetro). de rosas en miniatura, que constitu- fueron seleccionadas en kanamicina. No obstante, análisis más detallados yen plantas tan codiciadas y comer- De 50 a 60 líneas de callos revelaron que la acumulación de cializadas en todo el mundo. embriogénicos transformados fueron transcriptos de RAG en órganos
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