Universidad De Guayaquil Facultad De Ciencias Naturales Escuela De Biología

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGÍA

TESIS DE GRADO PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE BIÓLOGO.

POTENCIALIDADES DEL USO DE QUITOSANO Y AGUA

DE COCO COMO PROMOTORES DEL CRECIMIENTO IN

VITRO DE LA ORQUÍDEA Cattleya sp.

JULIA ESTHER VALENCIA PACHO

GUAYAQUIL-ECUADOR 2016

DIRECTOR DE TESIS

------

MSc. Xavier Cornejo

iii UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGÍA

CALIFICACIÓN QUE OTORGA EL TRIBUNAL QUE RECIBE LA SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN:

TESIS

POTENCIALIDADES DEL USO DE QUITOSANO Y AGUA DE COCO COMO PROMOTORES DEL CRECIMIENTO IN VITRO DE LA ORQUÍDEA CATTLEYA SP.

Autora: Julia Esther Valencia Pacho

PREVIO A OBTENER EL TÍTULO DE BIOLÓGA

Miembros del tribunal CALIFICACIÓN (Números y Letras)

Blga. Mónica Armas Soto MSc. PRESIDENTE DEL TRIBUNAL ------

Blga. Shirley Moncayo Baño MIEMBRO DEL TRIBUNAL ------

Lcdo. José Suarez, MSc. MIEMBRO DEL TRIBUNAL ------

SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN REALIZADA EN LA SALA DE MAESTRÍA DE LA FACULTAD.

FECHA: ------CERTIFICO

Abg. José Solórzano Cabezas SECRETARIO DE LA FACULTAD

DEDICATORIA

Con humildad y sencillez dedico esta tesis a mi adorada hija Scarlet Lara, quien me prestó el tiempo que le pertenecía para terminar y me motivó siempre para nunca rendirme y poder ser un ejemplo para ella, a mi padre Sr. Galo

Valencia y mi madre Domitila Pacho, quienes me enseñaron desde pequeña a luchar para alcanzar mis metas. A mi familia, por brindarme su confianza y por el tiempo dedicado, a mis amigos y compañeros que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi Dios, quien me dio la fe, fortaleza, la salud y la esperanza para realizar esta tesis.

Ayer, hoy y siempre agradezco eternamente a mis padres, que me han dado su apoyo incondicional para realizar mis estudios.

A la empresa AGROVITROPARIS, Ing. Agr. Laura Paris Moreno Rivas, por permitir realizar esta investigación en sus laboratorios.

A los docentes, los cuales nos han ido capacitando arduamente profesionalmente para la elaboración de este trabajo.

A mis amigas Diana Rojas y Shirley Moncayo, que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos.

Al MSc. Xavier Cornejo que con su paciencia tiempo y dedicación contribuyó a culminar con éxito este proyecto.

RESUMEN

El presente estudio se realizó en los meses de junio a diciembre del 2015, en el cantón Daule, Provincia del Guayas, en el laboratorio de cultivos de tejidos in vitro de la empresa AGROVITROPARIS. Donde se determinó la dosis apropiada de quitosano y agua de coco para el desarrollo de la orquídea Cattleya sp.

Como material vegetal de inicio se utilizó explantes protocormos de la orquídea Cattleya sp. se evaluaron 5 variables: número de brotes, tallas de las vitroplantas, ancho central de la hoja, longitud de raíces e índice de mortalidad.

Para el cultivo se utilizó el medio Murashige y Skoog, suplementado con quitosano y agua de coco. Se realizó un diseño completamente al azar en forma grupal usando cinco tratamientos con distintas dosis de quitosano ** y agua de coco * (T1: 50 mg**50 mL*; T2: 80 mg**100 mL*; T3: 100 mg**150 mL*; T4: 125 mg**200 mL*; T5: 150 mg**250 mL*).

Los mejores resultados en las variables evaluadas se obtuvieron con el empleo de 150 mg de quitosano y 250 mL de agua de coco.

Las vitroplántulas obtenidas tuvieron 3 brotes, con una altura de 3.30 cm, diámetro de la hoja 1.40 cm y raíces vigorosas de 4.50 cm aproximadamente.

vii ABSTRACT

The present study was conducted between June to December 2015, in the laboratory of AGROVITROPARIS Company, located in Parish Daule, Province of

Guayas, Ecuador. The proper dose of quitosan and coconut water for the optimum development of Cattleya sp. orchid was determined.

As starting plant material explant protocorms of Cattleya sp. were used, and five parameters were measured number of sprouts, size of vitro plantlets, central width of blades, length of roots, and mortality rate.

For the culture, Murashige and Skoog media supplemented with quitosan and coconut water were used. It was conducted completely randomized design in groups using five treatments with different doses of quitosan and coconut water

(T1: 50 mg**50 mL*; T2: 80 mg**100 mL*; T3: 100 mg**150 mL*; T4: 125 mg**200 mL*; T5: 150 mg**250 mL*).

The best results among the evaluated variables were obtained with the use of 150 mg of quitosan and 250 mL of coconut water.

The vitro plantlets were three outbreaks, the highest sprout measures 3.30 cm; the leaf measures 1.40 cm and the strong roots 4.50 cm approximately.

viii

ÍNDICE GENERAL

Contenido

RESUMEN ...... vii ABSTRACT ...... viii LISTA DE TABLAS ...... xi LISTA DE FIGURAS ...... xii

1.INTRODUCCIÓN ...... 1 1.1 GENERO CATTLEYA SP...... 2 1.2 QUITOSANO ...... 5 1.3 AGUA DE COCO ...... 7 1.3.1. COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN EL AGUA DE COCO: ...... 7 1.4. PRINCIPALES COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO ...... 8 2. ANTECEDENTES ...... 9 3. HIPÓTESIS ...... 11 4. OBJETIVOS ...... 12 4.1. OBJETIVO GENERAL ...... 12 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 12 5. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 13 5.1. ÁREA DE ESTUDIO ...... 13 5.1.1. Datos geográficos: ...... 14 5.1.2. Datos climáticos: ...... 14 5.1.3. Duración del experimento ...... 14 5.2. DISEÑO EXPERIMENTAL ...... 14 5.3. ETAPA DE CULTIVO ...... 15 5.4. MEDIO DE CULTIVO ...... 15 5.5. MATERIAL VEGETAL...... 15 5.6. CONDICIONES AMBIENTALES ...... 16 5.7. METODOLOGÍA DE LA SIEMBRA ...... 16 5.8. VARIABLES A MEDIRSE...... 17 5.8.1. Número de brotes de las vitroplantas ...... 17 5.8.2. Tallas de las Vitroplantas ...... 17 5.8.3. Ancho en la parte central de la hoja y longitud de raíces ...... 18 5.8.4. Aclimatación...... 18

ix 5.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE TUKEY 5% ...... 18 6. RESULTADOS ...... 19 6.1. ENSAYOS PREVIOS ...... 19 6.1.1 Medio de cultivo estándar sin agua de coco ni quitosano...... 19 6.1.2 Medio de cultivo estándar con agua de coco...... 19 6.1.3 Medio de cultivo estándar con quitosano...... 19 6.2. ÍNDICES DE MORTALIDAD ...... 20 6.3. NÚMEROS DE BROTES ...... 21 6.4. TALLAS DE LAS VITROPLANTAS ...... 22 6.5. ANCHO DE LAS HOJAS ...... 24 6.6. LONGITUD DE RAÍCES ...... 25 7. DISCUSIÓN ...... 26 8. CONCLUSIONES ...... 28 9. RECOMENDACIONES ...... 29 9. BIBLIOGRAFÍA...... 30 10. GLOSARIO ...... 36 11. ANEXOS ...... 38 ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG...... 38 ANEXO 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTES VARIABLES EVALUADAS . 40 ANEXO 3. ANÁLISIS DE VARIANZAS ...... 44 ANEXO 4. REGISTRO FOTOGRÁFICO ...... 48

x LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Composición de aminoácidos en el agua de coco…………………...... 7

Tabla 2. Dosis de quitosano y agua de coco utilizadas en el medio de cultivo….15

ANEXO. 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG…………….……...…..38

Tabla 1. Soluciones necesarias para obtener 1 litro de medio de cultivo para la siembra de orquídeas…………………………………………...…………….……..38

Tabla 2. Solución stock de vitaminas de Morel…………..……..……..………..38

Tabla 3. Solución stock de micronutriente de MS 1962…………….…………39

Tabla 4. Solución stock macronutriente B5………………..……………….…..39

ANEXO. 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTE VARIABLE EVALUADAS….40

Tabla 1. Números de brotes de los diferentes tratamientos………..………...40

Tabla 2. Tallas de las vitroplantas de los diferentes tratamientos……………41

Tabla 3. Ancho en la parte central de la hoja de los diferentes tratamientos.42

Tabla 4. Longitud de raíces de los diferentes tratamientos………………...... 43

ANEXO. 3. ANALISIS DE VARIANZA…………………………………..…….....…..44

Tabla 1. Análisis de varianza en Números de brotes……….…….………...….44

Tabla 2. Análisis de varianza en las tallas de las vitroplantas.……….…….…45

Tabla 3. Análisis de varianza ancho central de hoja………………...….….….46

Tabla 4. Análisis de varianza Longitud de las raíces………...…………….….47

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis……………….....…….13

Figura 2. Protocormos iniciales de orquídeas Cattleya sp……………………..….16

Figura 3. Medio de cultivo Murashige y Skoog…………………………………...…17

Figura 4. Porcentaje de mortalidad………………………………………...…………20

Figura 5. Número de brotes de orquídea Cattleya sp. obtenidos en los tratamientos………………………………………………...……………….…….….….21

Figura 6. Tallas de las vitroplantas de la orquídea Cattleya sp. obtenidas en los tratamiento………………………………………………………………………...... …..23

Figura 7. Ancho de las hojas de la orquídea Cattleya sp. en cada tratamientos…………...…………………………………………………………...... …24

Figura 8. Longitud de las raíces de la orquídea Cattleya sp. en cada tratamientos………..…………………………………………………..………….....….25

Figura 9. Toma de datos…………………………………………………..…...... ….48

Figura 10. Registrando la talla de las Vitroplantas……………..………....….....…48

Figura 11. Tratamiento 150 mg / 250 mL…………………………..………..………49

Figura 12. Vitroplantulas desarrollada……………..………………………………...49

Figura 13. Vitroplantas de orquídeas in vivo……………………………..….………50

Figura 14. Plántulas de orquídeas cattleya sp aclimatadas en sustrato de pomina in vivo……………………………………………………..…………………50

xii

1. INTRODUCCIÓN

Las orquídeas han fascinado al mundo durante siglos y han sido consideradas como flores místicas, algunos pueblos primitivos también las han utilizado con fines medicinales. En la antigua Grecia eran vistas como un símbolo de virilidad. Actualmente, debido a su belleza y al elevado costo que pueden alcanzar, las orquídeas son motivo de cultivo por particulares e industriales como flor cortada como planta ornamental y muchas llegan a tener una importancia económica aún a nivel mundial (Giap et al., 2015). Sus flores poseen formas extrañas y exóticas al tiempo que supone un reto cultivar y hacer florecer año tras año a determinadas especies.

Las orquídeas como regla general tienen un aspecto herbáceo, aunque las hay en una variadísima gama de formas, ello se debe principalmente a su clima y hábitats característicos en su ambiente natural (Gil et. Al., 2007).

El gran valor comercial que poseen ciertas especies de orquídeas ha determinado el saqueo indiscriminado de individuos silvestres, y a la vez la falta de conocimientos en el cultivo de estas plantas ha sido causa de grandes pérdidas de material valioso, con la consecuente erosión genética (Placencia, 2009).

Teofrasto (375 A.C), un discípulo de Aristóteles, dio el nombre de orquídeas a estas plantas; el nombre proviene del Griego Orchis, cuyo significado es “testículo” y se refriere a la similitud que presentan por la forma de sus pseudobulbos. En la actualidad, éstas conforman las Orchidaceae y están consideradas entre las familias que poseen la mayor diversidad de especies entre las plantas vasculares. Se estima que existen alrededor de 35.000 especies de

orquídeas en todo el mundo, pertenecientes a unos 750 géneros (Jardín Botánico

Lankester, 2000). Ecuador es un país megadiverso, cuenta con 227 géneros y más de 4.000 especies (Dodson, 2004).

1.1 GENERO CATTLEYA SP.

La orquídea Cattleya sp crece en forma epífita o algunas veces sobre rocas, con flores muy virtuosas y de mayor tamaño, presenta una variedad enorme de formas y colores desde el blanco puro hasta colores muy oscuros. Es una especie de orquídea nativa de la región amazónica del Ecuador, que además se encuentra en Venezuela, Colombia, Perú, Bolivia y Brasil, en bosques húmedos montanos en elevaciones alrededor de 200 a 700 metros. Su crecimiento se da en climas cálidos y fríos, florece en la primavera y principios de verano. (Maretzki y Hiraki,

1980).

Taxonomía del género Cattleya sp.

Phylum: Euphyta

División: Magnoliophyta

Clase: Liliopsida

Orden: Asparagales

Familia: Orchidaceae

Género: Cattleya sp

Fuente: (L. LINDEN Y RCHB.F, 1860)

Los cambios globales están implicando transformaciones substanciales en todas las actividades humanas, inclusive en la forma cómo la agricultura es practicada. Por tanto, la agricultura moderna será un sinónimo de la agricultura

científica. En un futuro cercano, la competitividad del agronegocio y el desempeño de la actividad florícola ecuatoriana, serán total e irreversiblemente dependientes de la capacidad científica y tecnológica del país.

La biotecnología ofrece alternativas rápidas y eficientes para la multiplicación de plantas. La obtención de cultivares tolerantes a factores adversos, o portadores de atributos que superen al donante, principalmente en cuanto a la calidad y el rendimiento, son algunas de las problemáticas en las que las herramientas biotecnológicas han sido aplicadas exitosamente.

Según Valerín (2005), el éxito de la técnica de cultivo de tejidos vegetales como un instrumento en la propagación masiva de plantas, depende de la capacidad para manejarlas a gran escala durante el periodo de adaptación en el vivero, de esta manera se logra un alto grado de sobrevivencia a bajo costo.

Se ha demostrado que el tiempo, la mano de obra y el espacio, se pueden reducir hasta más de la mitad del que toman los métodos tradicionales. Sin embargo, la regeneración es el proceso fundamental para poder aplicar cualquiera de los métodos y usos de nutrientes al cultivo in vitro.

El cultivo in vitro se hace en frascos cerrados y en condiciones controladas y estériles. El sustrato de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo a de contener los elementos necesarios que contienen una solución de sales que aportan con macro y micronutrientes esenciales acompañados por vitaminas, reguladores de crecimiento, aminoácidos y una fuente de carbono (George et al.,

2008). Para que las plantas pueda crecer lo suficiente, para después ser trasplantadas al sustrato definitivo.

El cultivo de tejidos vegetales consiste en un grupo de técnicas por medio de las cuales se pueden obtener plantas a partir de una porción vegetal con crecimiento activo de una planta donante; a esta porción se le denomina “explante”.

Su tamaño generalmente es pequeño, ocasionalmente microscópico y su manipulación debe ser bajo condiciones de laboratorio aséptico e inoculado en medios de cultivo apropiados, bajo condiciones ambientales controladas (Pachón,

2008).

Los medios nutritivos empleados en los cultivos de tejidos fueron establecidos a partir de las exigencias internas de las plantas, con modificaciones para atender las necesidades específicas in vitro. Así mismo, varios compuestos son adicionados para suprimir las necesidades metabólicas, energéticas y estructurales de las células, ya que las mismas vías bioquímicas básicas que operan en las plantas son mantenidas en los cultivos in vitro (Stancoto, 2008).

La mayoría de las especies existentes en los bosques, como es el caso de orquídeas, están sufriendo un proceso de disminución de sus poblaciones debido a factores antropogénicos como tala y quema, así como la extracción de minerales, alterando su hábitat natural. Cattleya sp. es una orquídea cuyas poblaciones son depredadas y comercializadas ilegalmente, por lo que se considera que podría llegar a desaparecer. Esta situación se podría compensar aplicando técnicas de propagación in vitro a partir de explantes, siempre y cuando aseguremos su

reproducción en cantidades adecuadas y las plantas propagadas serían distribuidas a viveros. Por tal motivo, en la presente tesis se plantea la búsqueda de la dosis apropiada de quitosano y agua de coco que adicionada al medio de cultivo in vitro, permita el desarrollo óptimo de Cattleya sp.

1.2 QUITOSANO

El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico, es un polímero policatiónico que contiene más de 5000 unidades de glucosamina, es un compuesto derivado de la quitina en forma parcialmente desacetilada 2-amino2- deoxy-β-D-glucosa (Pastor de Abram, 2004). Sus cargas positivas le confieren numerosas propiedades fisiológicas y biológicas, con un gran potencial y amplio intervalo de uso en la industria farmacológica, médica y agrícola (Liu et al., 2004;

Bautista et al., 2005).

La interacción de quitosano-membrana genera afectaciones en la integridad de membrana e inclusive se ha observado en bicapas de lípidos y provoca la formación transitoria de agujeros por donde podrían liberarse proteínas (Hong et al., 2006).

Un estudio más reciente, relacionado con el crecimiento de tejidos vegetales, ha mostrado que el origen del quitosano es un aspecto importante. Los quitosanos procedentes de hongos necesitarán de dosis menores para la inducción de la diferenciación de tejidos de plantas de orquídeas por dos razones: (a) la presencia natural de quitosano en las paredes celulares no genera efectos adversos para el

microorganismo y (b) las interacciones electrostáticas del quitosano añadido

(exógeno), cargado positivamente, deberían verse menos favorecidas con paredes celulares que poseen quitosano endógeno que cuando éstas poseen material con cargas negativas que los oligómeros procedentes de caparazones de camarones

(Nge et al., 2006).

La quitina obtenida del exoesqueleto de camarones y cangrejos tiene una estructura cristalográfica, en la que las cadenas principales están ordenadas en agregados antiparalelos que les permite formar puentes de hidrógenos intermoleculares muy fuertes, mientras que la procedente de las plumas de calamar tiene una estructura b, con las cadenas ordenadas en arreglos paralelos y fuerzas intermoleculares más débiles (Tolaimate et al., 2000). Además, estudios demuestran que el quitosano estimula el crecimiento del ancho de la hoja de la orquídea (Molina, 2012).

En lo que se refiere a Latinoamérica el uso de estos biomateriales en el área de la agricultura se puede vislumbrar un panorama prometedor a corto y mediano plazo. En primer lugar, algunos cálculos han estimado que la región genera material quitinoso que permitiría producir quitina y quitosano en cantidad suficiente para satisfacer más allá de la demanda mundial actual. En segundo término, ya existen en la región varias empresas que producen y comercializan quitina y quitosano, un paso importante para comenzar a garantizar el abastecimiento local de estos productos, lo que obviamente dependerá de los vaivenes del mercado internacional (Alvarado, 2008).

1.3 AGUA DE COCO

En cocos tiernos, técnicamente el líquido es uno de los nutrimentos más puros y alimenticios que nos provee la naturaleza. Es una bebida a la cual se le atribuyen muchas virtudes por su elevado contenido en sales minerales, vitaminas y carbohidratos. Fue utilizada durante la segunda Guerra Mundial como sustituto del suero glucosado, es una bebida isotónica natural con el mismo equilibrio electrolítico que nuestra sangre, es el líquido de la vida por así decirlo afirma

(Satín, 2001).

1.3.1. COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN EL AGUA DE COCO:

Tabla 1. Composición de aminoácidos en el agua de coco PORCENTAJE DE AMINOÁCIDOS PROTEÍNA TOTAL Alanina 2.41

Arginina 10.75

A. aspártico 3.60

Cisteína 0.97-1.17

A. glutámico 9.76-14.5

Histidina 1.85-2.05

Leucina 1.95-4.18

Lisina 1.95-4.57

Prolina 1.21-4.12

Fenilalanina 1.23

Serina 0.59-0.91

Tirosina 2.83-3.00

1.4. PRINCIPALES COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

Son combinaciones de sustancias químicas que los investigadores han

descrito después de numerosos experimentos y que permiten que las plantas

crezcan y se multipliquen in vitro (López, 1990).

 Sales inorgánicas: Mezcla de macronutrientes y micronutrientes. Se han

llevado a cabo muchas investigaciones con el fin de optimizar las

necesidades de plantas específicas, lo cual ha traído como consecuencia la

formulación de varias mezclas salinas.

 Los compuestos orgánicos: Se clasifican en tres grupos: Carbohidratos,

sustancias hormonales y vitaminas.

 Carbohidratos: La sacarosa es la fuente de carbono más ampliamente usada

y se emplea a una concentración de 2 a 3 %; sin embargo, en ciertas

especies se emplean concentraciones muy elevadas.

 Sustancias hormonales: Auxina. El nombre auxina (del griego auxein=

crecer) fue dado a la sustancia reguladora de crecimiento producida en el

ápice del coleóptilo de avena. Sin embargo, en la actualidad se sabe que

las auxinas están universalmente presentes en las plantas superiores. Se

piensa que AIA (ácido indol-3-acético) es la principal auxina en las plantas

superiores, aunque existen otras sustancias que tienen actividad auxínica.

 Citoquininas. El nombre genérico de las citocininas es empleado para

aquellas sustancias químicas que pueden estimular principalmente la

división celular o citocinesis. Casi todas las citocininas conocidas, tanto

naturales como sintéticas son derivados de la adenina, en los cuales el

grupo amino lleva determinados sustituyentes en la posición 6.

2. ANTECEDENTES

En términos generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos positivos en el crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la germinación de semillas como en el crecimiento de raíces, retoños y hojas. En algunos casos, se ha observado que la estimulación de la germinación de semillas por tratamiento con quitosano ha logrado elevar el porcentaje de germinación a los niveles requeridos para la certificación (Bhaskara et al., 1999).

Sardi L. et al., 2007. En su trabajo realizado, germinación y crecimiento en orquídea Epidendrum secundum, con productos naturales (agua de coco y plátano verde), a la medida de cuatro y cinco meses de observación se demostró superiores resultados en el medio de agua de coco más plátano con MS (1,74 cm) y coco con el plátano (1,18 cm). En cuanto al crecimiento de hojas, el agua de coco más MS obtuvo las plantas con mayor número de hoja esto puede deberse a la presencia de auxina en el agua de coco las cuales estimulan el crecimiento de los ápices de las hojas. La concentración de los productos naturales pudo influir en los resultados de germinación, crecimiento, enraizamiento y numero de hojas, debido a la cantidad de agua de coco utilizada (30 mL 퐿−1 ) fue una nueva prueba en el medio para orquídea.

Investigaciones de Vargas (2012) señala que la utilización de agua de coco al medio de cultivo al agregar 500 mL de agua de coco al medio de cultivo, a los 80 días después de la siembra hubo un crecimiento de 7.44 mm en la hoja y una

longitud en la raíz de 5.91 mm. La adición al medio de cultivo agua de coco influyo de manera positivo al crecimiento de las plántulas ayudando en el desarrollo de la hoja y raíces de las vitroplántulas.

Molina (2012) comprobó que el empleo del quitosano provocó un incremento significativo del número de hojas, y altura de las vitroplantas con un valor significativamente superior cuando se empleó la mayor dosis, lográndose 6.88 hojas por planta, superior estadísticamente a los tratamientos donde se emplea

300mg.ha-1 de quitosano con un promedio de 5,08 y 4,66 hojas por planta, respectivamente, se obtuvo una altura de 8,4 cm, se aprecia resultados favorables al incrementar mayor dosis de quitosano estimulando el vigor de la misma.

Rojas D. (2015) utilizó agua de coco en la propagación in vitro de la orquídea

Phalaenopsis violácea a través de la vara floral, obteniendo la mejor longitud en raíces (1.6 cm) al añadir un 12% de agua de coco al medio de cultivo Murashige

Skoog.

3. HIPÓTESIS

HO: El uso de quitosano y agua de coco, no tendrá un efecto positivo sobre el crecimiento in vitro de explantes de la orquídea Cattleya sp.

HA: El uso de quitosano y agua de coco, tendrá un efecto positivo sobre el crecimiento in vitro de explantes de la orquídea Cattleya sp

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

 Investigar la dosis apropiada de quitosano y agua de coco para el desarrollo in

vitro en la orquídea Cattleya sp.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Evaluar el efecto de la adición de quitosano y agua de coco en el cultivo in vitro

de la orquídea Cattleya sp sobre el número de brotes, talla y ancho de hoja y

longitud de raíces.

 Obtener vitroplantas de orquídeas Cattleya sp. Listas para su endurecimiento y

aclimatación in vivo.

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. ÁREA DE ESTUDIO

Figura 1. Ubicación geográfica del laboratorio Agrovitroparis.

La presente investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivos de tejidos in vitro AGROVITROPARIS, ubicada en:

Provincia: Guayas

Cantón: Daule

Dirección: Av. Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434

Latitud Sur: 1º 51' 37,77" S (613866.52 UTM)1/

Longitud Occidental: 79º 58' 34,42" W (9794326.09 UTM)1/

Número telefónico: 042797639

5.1.1. Datos geográficos:

La empresa está localizada al noreste del cantón, a una altitud de 15 m.s.n.m y en un terreno de topografía plana.

5.1.2. Datos climáticos:

La temperatura media anual es de 28°C, tiene una precipitación media anual de 1607,86 mm y una humedad relativa anual de 76%. (Fuente: http://www.mundivideo.com/coordenadas_chrome.htm. 2014)

5.1.3. Duración del experimento

Se inició durante los meses de junio a diciembre del 2015.

5.2. DISEÑO EXPERIMENTAL

Se evaluaron 5 variables: Número de brotes de las vitroplantas, tallas de las vitroplantas, ancho en la parte central de la hoja, longitud de raíces e índice de mortalidad. El diseño experimental consta de 5 tratamientos, 5 dosis de quitosano y agua de coco adicionado a un medio de cultivo estándar y 15 repeticiones por tratamiento.

Previo a los ensayos se realizaron pruebas de crecimiento con el fin de evaluar el desarrollo de los protocormos y la elección de las dosis a utilizar. Los medios de cultivo utilizados fueron:

 Medio de cultivo estándar sin agua de coco y quitosano

 Medio de cultivo estándar con agua de coco

 Medio de cultivo estándar con quitosano

5.3. ETAPA DE CULTIVO

 Fase Ɩ. Iniciación (siembra o cultivo inicial).

 Fase II. Multiplicación de brotes.

 Fase III. Enraizamiento

5.4. MEDIO DE CULTIVO

Se utilizó el medio de cultivo Murashige y Skoog (ANEXO 1), suplementado con quitosano y agua de coco, utilizando cinco tratamientos (Tabla 2).

Tabla 2. Dosis de quitosano y agua de coco utilizadas en el medio de cultivo Tratamientos Agua de coco Quitosano (mg) (mL) T1 50 50 T2 100 80

T3 150 100

T4 200 125

T5 250 150

5.5. MATERIAL VEGETAL

Se utilizó explantes de orquídeas de Cattleya sp. en etapa de protocormos

(Fig. 2).

Figura 2. Protocormos iniciales de orquídeas Cattleya sp

5.6. CONDICIONES AMBIENTALES

 Fase I y II. Intensidad lumínica de 1 000 hasta 2 000 luxes, temperatura de

26°C ± 2°C, fotoperiodo 16/8 horas de iluminación, humedad relativa de 80 a

90 %.

 Fase III: Intensidad lumínica de 8 000 a 10 000 luxes, temperatura de 26°C ±

2°C, fotoperiodo 16/8 horas de iluminación, humedad relativa de 80 a 90 %.

5.7. METODOLOGÍA DE LA SIEMBRA

El medio de cultivo (Fig. 3) se dispensó en frascos de 200 mL con 20 mL del medio, se taparon con papel aluminio y se esterilizaron en autoclave a 1 Kg/cm2 de presión durante 5 minutos.

Figura 3. Medio de cultivo Murashige y Skoog

A cada frasco se les inoculó una pequeña cantidad de los protocormos expandidos en la parte superior del mismo. La base del protocormo quedó

"sentada" sobre la superficie del medio de cultivo del frasco aséptico. El frasco se tapó con papel aluminio y se transfirió al cuarto de incubación.

5.8. VARIABLES A MEDIRSE.

5.8.1. Número de brotes de las vitroplantas

Los brotes de cada uno de los tratamientos se contaron visualmente a los 30 días de la siembra.

5.8.2. Tallas de las Vitroplantas

Las tallas de las vitroplantas de cada uno de los tratamientos se midieron a los 60 días de siembra, con la ayuda de un calibrador Vernier, desde la parte basal hasta el ápice de la hoja.

5.8.3. Ancho en la parte central de la hoja y longitud de raíces

A los 120 días de la siembra, se midió el ancho de las hojas y la longitud de raíces con la ayuda de un calibrador Vernier.

5.8.4. Aclimatación

Una vez establecidos los mejores resultados, las vitroplantas se sembraron en sustrato de pomina para su endurecimiento y aclimatación in vivo. (Anexo 4,

Fig.12).

5.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE TUKEY 5%

Para conocer si existían diferencias estadísticas significativas entre los cinco tratamientos de quitosano ** y agua de coco * (T1: 50 mg**50 ml*; T2: 80 mg**100 ml*; T3: 100 mg**150 ml*; T4: 125 mg**200 ml*; T5: 150 mg**250 ml*) con 15 repeticiones, se realizó un diseño experimental al azar, se comparó mediante el

Análisis de varianza de un factor (ANOVA) utilizando el programa estadístico

InfoStat/E licencia estudiantil. Las comparaciones de las medias de los tratamientos se las realizó mediante la prueba de Tukey con un 95% de significancia.

6. RESULTADOS

6.1. ENSAYOS PREVIOS

6.1.1 Medio de cultivo estándar sin agua de coco ni quitosano.

A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 90 días un pequeño brote, a los 120 días se obtuvo una altura de 0,3 cm sin hojas ni raíz.

6.1.2 Medio de cultivo estándar con agua de coco.

A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 60 días un pequeño brote, a

los 120 días se obtuvo una altura de 1,4 cm con dos pequeñas hojas de 0,28 cm de

ancho y una raíz 0,90 cm.

6.1.3 Medio de cultivo estándar con quitosano.

A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 60 días un pequeño brote, a

los 120 días se obtuvo una altura de 1,8 cm con tres pequeñas hojas de 0,40 cm de

ancho y una raíz 1,20 cm.

6.2. ÍNDICES DE MORTALIDAD

De los resultados obtenidos se observó un mayor porcentaje de mortalidad en los tratamientos con menor cantidad de quitosano y agua de coco. El tratamiento T1 presentó un 20% de mortalidad, T2 un 10.5%, T3 con un 13.64%,

T4 con 3.23% y T5 con 2.86% (Fig. 4).

25,00%

20,00%

15,00% 13,64%

10,53%

% Mortalidad % 10,00%

5,00% 3,23% 2,86%

0,00% Tratamiento ** Quitosano * Agua de Coco

T1 T2 T3 T4 T5

Figura 4. Porcentaje de mortalidad

6.3. NÚMEROS DE BROTES

Los tratamientos T4 y T5 produjeron el mayor número de brotes (Fig. 5,

Anexo 2, Tabla 1) encontrándose diferencias significativas con los demás tratamientos (p>0.05).

35 35 31 30

25 22

20 19

Número Brotes 15

T1 T2 T3 T4 T5 Figura 5. Número de brotes de orquídea Cattleya sp. obtenidos en los tratamientos.

Para poder determinar los porcentajes de diferencia que existe entre los tratamientos, es necesario utilizar un método estadístico denominado:

Números Índices, el cual consiste de un número que expresa el cambio relativo en longitud comparado con un promedio que lo tomamos como base. La base o

promedio siempre debe ser el promedio menor del tratamiento y ese equivale al cien por ciento (100%) (Lind, Marchal y Wathen, 2008).

De esta manera podemos determinar el porcentaje de los diferentes tratamientos, haciendo la siguiente relación:

X1= 1 X5 X4 X3 X2 X1 1 100%

X2= 1,27 2,33 2,07 1,47 1,27 1 x= 1,27

X3= 1,47 x= 1,47

X4= 2,07 233% 207% 147% 127% 100% x= 2,07

X5= 2,33 26% 20% 27% x= 2,33

Hay significancia entre los tratamientos, entre el T1 y T2 se obtuvo un 27%, entre T2 y T3 del 20%, entre el T4 y T5 del 26%, existiendo una diferencia significativa entre los tratamientos (Anexo 3, Tabla 1).

6.4. TALLAS DE LAS VITROPLANTAS

Con respecto al desarrollo caulinar de las vitroplantas, se encontró que a mayor dosis de quitosano y agua de coco, los explantes alcanzaron mejor desarrollo. Las mejores tallas se obtuvieron con los tratamiento T4 (2.3 cm) y T5

(2.8 cm) (Fig. 6, Anexo 2, Tabla 2), encontrándose diferencias significativas con los demás tratamientos (p>0.05).

2,8

2,5 2,3

1,6

1,5 1,4 Promedio de tallas las (cm)

1 1

0,5

0 T1 T2 T3 T4 T5

Figura 6. Tallas de las vitroplantas de la orquídea Cattleya sp. obtenidas en los tratamientos

Entre los tratamientos T1 y T2 no hay diferencia significativa, entre los tratamiento T2 y T3 hay una diferencia del 18%, el tratamiento T4 y T5 tuvo 54% más de crecimiento presentando una diferencia del 36% en la talla de las vitroplantas (Anexo 3, Tabla 2).

6.5. ANCHO DE LAS HOJAS

La presencia de hojas bien desarrolladas se observó al cabo de los 120 días después de la siembra in vitro, las hojas presentaron un brillo intenso y un verde muy asentado. El mayor ancho de la hoja fue de 1.02 cm, éste se obtuvo con el tratamiento T5; lográndose los mayores valores, no así los explantes que contenían los tratamientos T1, T2 y T3, con menos dosis de quitosano y agua de coco tuvieron menor ancho de hoja (Fig. 7, Anexo 2, Tabla 3). Se encontraron diferencias estadísticas entre los tratamientos T4 y T5 del 54% con los demás tratamientos (p>0.05), los tratamientos T1, T2, T3 obtuvo un 4% no presentando diferencias estadísticas entre ellos. (Anexo 3, Tabla 3).

1,2

1,02

) 0,84

0,8

0,6

0,42 0,43 0,4

0,31 Promedio Ancho de hoja (cm

0,2

0 T1 T2 T3 T4 T5

Figura 7. Ancho en la parte central de las hojas de la orquídea Cattleya sp. en cada tratamientos.

6.6. LONGITUD DE RAÍCES

En cuanto a la longitud de las raíces, no se registraron diferencias significativas entre los tratamientos T1 (0.83 cm), T2 (1.08 cm), y T3 (1.55 cm). La mejor longitud de raíces con un promedio de 3.49 cm de largo se obtuvo con el tratamiento T5 (Fig. 8, Anexo 2. Tabla 4). Lo cual demostró que a medida que se eleva la dosis de quitosano y agua de coco se produce la elongación radicular de las vitroplantas. Se evidenció una gran cantidad de raíces largas muy visibles de color blancas verdosas. Se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos T4 y T5 del 74% con los demás tratamientos (p>0.05). (Anexo 3,

Tabla 4).

3,49 3,5

3 2,78

2,5

2 1,55 1,5

longitud longitud de Raices (cm) 1,08 1 0,83

0,5

0 T1 T2 T3 T4 T5

Figura 8. Longitud de las raíces de la orquídea Cattleya sp. en cada tratamientos.

7. DISCUSIÓN

La mayor dosis de agua de coco y quitosano adicionado al medio de cultivo produjo los mejores resultados en las variables medidas en la presente investigación con relación al número de brote, tallas, ancho de la hoja y longitud de raíces, en lo cual hubo un menor porcentaje de mortalidad.

A los ensayos previos evaluados con diferentes dosis de medio de cultivo se observó crecimiento, pero al adicionar quitosano y agua de coco hubo un mayor crecimiento lo que demuestra que estos bioestimulantes ofrecen mayor resultado para el desarrollo de la vitroplanta.

Con relación al número de brotes se pudo notar que al aplicar mayor dosis de quitosano y agua de coco se logró tres brotes por frasco, esto pudo deberse a la presencia de auxina en el agua de coco lo cual estimula el crecimiento. Sardi et al., (2007) señala que la concentración de los productos naturales influye en los resultados de germinación de semillas así como en el crecimiento.

La talla de las vitroplantas tuvo resultados menores en comparación con la investigación de Molina (2012) señalan que, la utilización de la mayor dosis de quitosano obtuvo una altura de 8.4 cm, resultados mucho mayores que en la presente investigación donde se obtuvo 3.30 cm de altura. Esto pudo haber sido causado porque este trabajo se realizó a nivel de laboratorio y de Molina a nivel de campo abierto, pero concuerda que el quitosano en un buen bioestimulante para el

crecimiento de las vitroplantas y al combinar con el agua de coco ejerce un efecto benéfico.

Investigaciones de Vargas (2012) señalan que la utilización de agua de coco tuvo un crecimiento de 0.74 cm en la hoja, resultados menores que el de la presente investigación donde se obtuvo un ancho de hoja de 1.40 cm. Esto pudo haber sido causado porque este trabajo tuvo como material vegetal protocormos y

Vargas trabajo con semillas y según sus condiciones en el laboratorio, pero concuerda que la adición de agua de coco al medio de cultivo es un buen bioestimulante para el crecimiento de las hojas y al combinar con el quitosano influye de manera positiva al crecimiento de las vitroplantas ayudando el desarrollo de la hoja.

En la presente investigación al combinar agua de coco y quitosano se obtuvo raíces con una longitud de 4.50 cm, mientras que Rojas D. (2015) con el uso de agua de coco observó la aparición de raíces con una longitud de 1.6 cm, con menor desarrollo. Esto pudo deberse a que Rojas sólo trabajo con agua de coco, por lo que se demuestra que la combinación de ambos bioestimulantes en el presente trabajo es un medio muy completo, siendo una respuesta favorable al agregar al medio de cultivo.

8. CONCLUSIONES

Del trabajo experimental realizado, los dos bioestimulante utilizado como promotores de crecimiento in vitrio de la orquídea Cattleya sp, promovieron crecimiento en la planta en relación al números de brotes, tallas, ancho de la hoja y longitud de raíces, trayendo la formación de una planta completa.

El tratamiento T5 (150 mg de quitosano y 250 mL de agua de coco) logró los mejores resultados en todas las variables evaluadas, debido que se utilizó mayor dosis de quitosano y agua de coco.

Se obtuvo una planta completa con 3 brotes una altura de 3.30 cm, ancho de la hoja 1.40 cm y raíces vigorosas de 4.50 cm, con un porcentaje de mortalidad del

2.86%.

Los bioestimulantes quitosano y agua de coco, constituyen una alternativa favorable en la propagación de la orquídea Cattleya sp, mejorando significativamente el desarrollo in vitro de la misma en un corto plazo.

9. RECOMENDACIONES

 Utilizar la presente investigación como referencia para la siembra aséptica

con otras especies de orquídeas de clima tropical y hacerlo extensivo a otros

laboratorios del país.

 Realizar estudios a nivel in vitro de otras sustancias químicamente no

definidas como son: puré de banano, jugo de piña etc.

 Efectuar otros proyectos con la presencia de quitina.

 En futuras investigaciones de orquídeas in vitro utilizar el quitosano y agua

de coco interaccionando con hormonas como TDZ y AIB.

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10. GLOSARIO

ASEPTICO: Aquello que está libre de algún tipo de infección o contaminación.

AUXINAS: Forma parte un grupo de hormonas vegetales (fitohormonas) que

promueven la división y la diferenciación celular.

BIOTECNOLOGÍA: Se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas

biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o

modificación de productos o procesos para usos específicos

BIODEGRADABLE: Que puede descomponerse en elementos químicos naturales

por la acción de agentes biológicos, como el sol, el agua, las bacterias, las

plantas o los animales.

CULTIVO IN VITRO: Significa hacer el cultivo en recipientes de vidrio bajo

condiciones asépticas en el laboratorio

CITOCINAS: Son proteínas que regulan la función de las células que las producen

u otros tipos celulares.

EXPLANTE: Se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta,

que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.).

FOTOPERIODO: Tiempo relativo diario luz y oscuridad los que los distintos

organismos se ven sometidos.

FITOHORMONAS: También llamadas hormonas vegetales, son sustancias

producidas por células vegetales en sitios estratégicos de la planta y estas

hormonas vegetales son capaces de regular de manera predominante los

fenómenos fisiológicos de la planta.

GLUCOSAMINA: La glucosamina es un amino-azúcar que actúa especialmente

como precursor en la glicosilación de las proteínas y de los lípidos.

MEDIO DE CULTIVO: Es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas

sales minerales que aportan los elementos esenciales para el crecimiento y

desarrollo de los tejidos vegetales in vitrio, Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y

Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Una fuente de carbono,

la sacarosa debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro.

Puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del

Crecimiento.

PROTOCORMO: Masas de células producidos a partir de la germinación de

embriones de orquídeas.

Ph: Es una medida de la acidez o basicidad de una disolución

VITROPLANTAS: Plantas clonadas en recipientes de laboratorio.

11. ANEXOS

ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG

Tabla 1. Soluciones necesarias para obtener 1 litro de medio de cultivo para la siembra de orquídeas. Sustancias1. Cantidad

Macroelementos2. B5 1 mL Microelementos MS 2 mL 3. Vitaminas de Morel 2 mL 4. Agua de coco y quitosano De acuerdo a los 5. tratamientos

Sacarosa6. 20 g BAP 5x10−4g 7. ANA 2,5x10−5g

Phytagel 1.5 g Llevar a 1000 mL con agua destilada. Ajustar a pH 4

Tabla 2. Solución stock de vitaminas de Morel REACTIVO Cant. (g/L) Mio-inositol 2.000 Ácido icotínico 0.01 Piridoxina 0.01 Thiamine HCL 2x10−3 Glicina 0.04

Tabla 3. Solución stock de micronutriente de MS 1962 REACTIVO Cant. (g/L)

8.푯 ퟑ B푶ퟑ 1.24 Mn S푶 . 7푯 O 3.38 9. ퟒ ퟐ Zn S푶ퟒ. 7 푯ퟐO 1.72 10.KI 0.166

N풂ퟐ2Mo0. 2푯ퟐ0 0.05 Cu S푶 . 5푯 0 5x10−3 ퟒ ퟐ −3 Co C풍ퟐ. 6푯ퟐ0 5x10

Tabla 4. Solución stock macronutriente B5. REACTIVO Cant. (g/L)

K N푶ퟑ. 푯ퟐ0 2.500

Ca C풍ퟐ. 2푯ퟐ0 0.15

Mg S푶ퟒ. 7푯ퟐ0 0.25

(N푯ퟒ)ퟐ S푶ퟒ 0.134

N풂ퟐ EDTA 0.0373

Fe S0. 7푯ퟐ0 0.0278

ANEXO 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTES VARIABLES EVALUADAS

Tabla 1. Números de brotes de los diferentes tratamientos

Número de Brotes

# Muestras Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

1 1 1 1 3 3

2 1 1 2 2 2

3 2 1 1 1 3

4 1 2 0 3 2

5 1 2 2 2 2

6 2 1 2 3 2

7 1 0 2 3 0

8 0 2 2 2 3

9 1 1 0 1 2

10 1 2 0 3 3

11 2 0 2 2 3

12 0 2 2 3 3 13 0 1 3 0 2

14 1 2 2 1 3

15 1 1 1 2 2

∑ Total 15 19 22 31 35

Tabla 2. Tallas de las vitroplantas de los diferentes tratamientos Tallas de las Vitroplantas (cm)

# Muestra Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

1 1,30 1,80 2,00 2,60 2,80

2 1,20 1,50 2,10 2,40 2,80

3 1,40 1,60 2,00 2,20 3,10

4 1,10 1,60 0,00 2,70 2,80

5 1,50 1,80 2,10 2,60 2,90

6 1,30 1,60 1,30 2,40 3,00

7 1,40 0,00 1,80 2,10 0,00

8 0,00 1,80 2,10 2,10 3,00

9 1,00 1,80 0,00 2,80 3,30

10 1,20 1,40 0,00 2,60 3,00

11 1,00 0,00 2,10 2,40 3,00

12 0,00 1,60 2,30 2,50 3,20

13 0,00 1,60 1,80 0,00 3,00

14 1,50 1,50 2,00 2,10 3,10

15 1,00 1,40 2,00 2,60 3,20

Promedio 0,99 1,40 1,57 2,27 2,81

Tabla 3. Ancho en la parte central de la hoja de los diferentes tratamientos

Ancho de la parte central de las hojas (cm)

# Muestras Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

1 0,40 0,40 0,50 0,80 1,40 2 0,30 0,50 0,60 0,90 1,20

3 0,40 0,50 0,50 0,80 1,10

4 0,30 0,60 0,00 1,00 1,20 5 0,30 0,40 0,40 1,00 1,00

6 0,30 0,50 0,50 0,80 1,00

7 0,40 0,00 0,60 0,90 0,00 8 0,00 0,40 0,60 0,80 1,00

9 0,40 0,50 0,00 0,70 1,30

10 0,40 0,50 0,00 0,90 1,10

11 0,50 0,00 0,50 0,90 0,90 12 0,00 0,50 0,50 1,00 1,00

13 0,00 0,50 0,60 0,00 0,80

14 0,50 0,50 0,50 1,10 1,00

15 0,40 0,50 0,60 1,00 1,30

Promedio 0,31 0,42 0,43 0,84 1,02

Tabla 4. Longitud de raíces de los diferentes tratamientos

Longitud de raíces (cm)

# Muestra Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5

1 0,90 1,50 1,80 2,80 4,40 2 0,60 1,20 2,00 3,20 4,10

3 1,00 1,30 1,80 2,80 3,80 4 1,00 1,40 0,00 3,00 3,90

5 1,20 1,40 2,20 3,00 3,60 6 0,90 1,20 1,90 2,60 3,80

7 1,00 0,00 1,80 3,30 0,00 8 0,00 1,30 1,80 3,20 3,80

9 0,90 1,40 0,00 2,90 4,00 10 0,80 1,00 0,00 2,90 3,60

11 1,20 0,00 2,20 2,70 3,20

12 0,00 1,10 1,80 2,90 3,00 13 0,00 1,10 2,00 0,00 3,20

14 1,30 1,10 1,90 3,20 3,50

15 1,60 1,20 2,10 3,20 4,50 Promedio 0,83 1,08 1,55 2,78 3,49

ANEXO 3. ANÁLISIS DE VARIANZAS

Tabla 1. Análisis de varianza en Números de brotes. Análisis de varianza de un factor

RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza 50mg**50ml* 15 15 1 0,42 80mg**100ml* 15 19 1,26 0,49 100mg**150ml* 15 22 1,46 0,83 125mg**200ml* 15 31 2,06 0,92 150mg**250ml* 15 35 2,33 0,66 ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados Promedio F Probabilidad Valor variaciones cuadrados de de los crítico libertad cuadrados para F Entre grupos 18,6 4 4,65 6,94 9,15 2,50 Dentro de los 46,9 70 0,67 grupos

Total 65,54 74

Test: Tukey Alfa=0,05 Error: 0,6705 gl: 70 Tratamiento Medias n E.E. 1 1 15 0,21 A 2 1,27 15 0,21 A B 3 1,47 15 0,21 A B 4 2,07 15 0,21 B C 5 2,33 15 0,21 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Tabla 2. Análisis de varianza Tallas de las vitroplantas

Análisis de varianza de un factor

RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza 50mg**50ml* 15 14,9 1,0 0,3 80mg**100ml* 15 21 1,4 0,3 100mg**150ml 15 23,6 1,6 0,7 * 125mg**200ml 15 34,1 2,3 0,4 * 150mg**250ml 15 42,2 2,8 0,6 *

ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados Promedio F Probabilidad Valor variaciones cuadrado de de los crítico s libertad cuadrados para F Entre grupos 32 4 8 16 1,7 2,50 Dentro de los 34 70 0,5 grupos

Total 66 74

Test: Tukey Alfa=0,05 Error: 0,4841 gl: 70 Medias n E.E. TRATAMIENTO 1 0,99 15 0,18 A 2 1,40 15 0,18 A 3 1,57 15 0,18 A 4 2,27 15 0,18 B 5 2,81 15 0,18 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Tabla 3. Análisis de varianza del Ancho central de la hoja

Análisis de varianza de un factor

RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza 50mg**50ml* 15 4,6 0,31 0,03 80mg**100ml* 15 6,3 0,42 0,03 100mg**150ml* 15 6,4 0,43 0,05 125mg**200ml* 15 12,6 0,84 0,07 150mg**250ml* 15 15,3 1,02 0,11

ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados Promedio F Probabilidad Valor variaciones cuadrados de de los crítico libertad cuadrados para F Entre grupos 5,74 4,00 1,43 25,21 5,94 2,50 Dentro de los 3,98 70,00 0,06 grupos

Total 9,72 74,00

Test: Tukey Alfa=0,05 Error: 0,0569 gl: 70 Tratamiento Medias n E.E. 1 0,31 15 0,06 A 2 0,42 15 0,06 A 3 0,43 15 0,06 A 4 0,84 15 0,06 B 5 1,02 15 0,06 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

Tabla 4. Análisis de varianza Longitud de las raíces

Análisis de varianza de un factor

RESUMEN Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza 50mg**50ml* 15 12,4 0,83 0,24 80mg**100ml* 15 16,2 1,08 0,21 100mg**150ml* 15 23,3 1,55 0,67 125mg**200ml* 15 41,7 2,78 0,63 150mg**250ml* 15 52,4 3,49 1,11

ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados Promedio F Probabilidad Valor variaciones cuadrados de de los crítico libertad cuadrados para F Entre grupos 78,70 4,00 19,68 34,41 7,17 2,50 Dentro de los 40,02 70,00 0,57 grupos

Total 118,73 74,00

Test: Tukey Alfa=0,05 Error: 0,5718 gl: 70 Tratamiento Medias n E.E. 1 0,83 15 0,2 A 2 1,08 15 0,2 A 3 1,55 15 0,2 A 4 2,78 15 0,2 B 5 3,49 15 0,2 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)

ANEXO 4. REGISTRO FOTOGRÁFICO

Figura 9. Toma de datos.

Figura 10. Registrando la talla de las Vitroplantas.

Figura 11. Tratamiento 150mg/250ml.

Figura 12. Vitroplantulas desarrolladas.

Figura 13. Vitroplantas de orquídeas in vivo.

Figura 14. Plántulas de orquídeas cattleya sp aclimatadas en sustrato de pomina in vivo