Efecto De Los Depósitos Volcánicos En El Biofilm De Arroyos De La Cuenca Del Lago Nahuel Huapi (Río Negro, Argentina)

Universidad Nacional del Comahue - Centro Regional Universitario Bariloche

Efecto de los depósitos volcánicos en el biofilm de arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi (Río Negro, Argentina).

Trabajo de Tesis para optar al título de Doctora en Biología

Lic. Uara A. Carrillo

Directora: Dra. Verónica Díaz Villanueva Co-Directora: Dra. Beatriz Modenutti

Año 2019

Quiero agradecer

A mis padres, que son mis primeros maestros y a los que les agradezco infinitamente su crianza, su cariño, su entrega a la vida con tanta fortaleza…

A mi compañero Juan Martin por su amor, su compañía, por estar codo a codo, durante estos años y últimos meses tan intensos… pero sobre todo, por soñar juntos y tener un hijo tan hermoso como Benjamín… a vos Benjamín todo mi amor! Gracias por tu paciencia cuando mamá tenía que escribir la tesis y vos simplemente dormías… y todo pudo darse!

A mis cuatro hermanos Romina, Pablo, Leticia y Elías, por compartir la vida conmigo desde pequeña, y por acompañarnos ahora de grandes con cariño… y a mis cuatro sobrinos July, Valen, Lolo y Nacho cuatro soles hermosos que amo tanto.

A Vero, mi Directora, por brindarme su apoyo y confiar en mí, por enseñarme tantas herramientas para esta tarea de ser científicas, por ser tan detallista con sus correcciones, por corregirme incansablemente la gramática no solo del inglés sino del castellano, además de su labor como directora el de compartir como compañera desde lo ideológico, y compartir tantas marchas que año a año fueron creciendo aquí en Bariloche.

A Flor, por estar siempre, dando una mano, ayudando a no bajar los brazos y por ser una compañera sincera y con mucho cariño para dar.

A Anna Romaní por recibirme en la Universidad de Girona y estar siempre con tan buena predisposición para la interacción. A M. Teresa Wenzel por brindarme su apoyo y ofrecerme toda la bibliografía que necesitara para el estudio de las cianobacterias.

A los amigos todos! A los de La Plata a mi amiga Nadia por ser, por estar y porque siempre que nos vemos es como si el tiempo no pasara, a Marina, que siempre alguna consulta resolvíamos juntas y volver a la plata siempre tan divertido, a Pau Tobes por estar siempre, a Ani y Cin por seguir compartiendo la amistad. A los de Bari Naty Carro por las innumerables charlas sobre la vida misma, a Mayra por estar en esos momentos donde me sobrepasaba la situación, A Maha, May, Javi, Juli, Gi, Thilo, Edwin y las Synchrolocuras por estar durante mi etapa de embarazada, por cantar y disfrutar de esta vida… A Cesar y Vale por compartir momentos y felicidad, a Juancito Ochoa por ser tan delirante y hacerme 1

cantar, a Marce Bonino y Lea Lampugnani por salir a rockearla en las bicis y en la montaña… y disfrutar tanto!

A Lau Fernandez! Una amigaza que me dio una mano gigante para poder dar el taller en una escuela secundaria y poder terminar de completar los créditos del doctorado!. A los alumnos de 1ro y 3ro del secundario de adultos del CENS 9 del barrio Lavalle de la ciudad de Bariloche que escucharon y trabajaron muy motivados en el taller. Y a su director interino y preceptores que muy amablemente me abrieron sus puertas.

A Beatriz, y a Esteban por abrirme las puertas del laboratorio y por sus aportes en lo experimental. A Marcela por ser tan cálida siempre, por ayudarme con las mediciones de COD. Al resto de compañeros del laboratorio Lau, Caro, Chili y Nico.

A Patricia por ayudarme en todo lo que necesité y por disponerme un espacio para realizar el experimento en el invernadero. A José por ayudarme a construir la mesa para colocar los canales artificales.

A Horacio Trioiani Investigador del Centro Atómico Bariloche, por asistirme con el uso de microscopios del CAB. A María Belén Prados por facilitarme el protocolo y enseñarme la técnica del punto crítico, y a Paula Troyon, por tomar las fotografías en el SEM del CAB.

Al Jurado Nora Gomez, Romina Schiaffino y Guadalupe Beamud por las sustanciosas correcciones que mejoraron ampliamente la presente tesis.

Resumen

Las erupciones volcánicas de gran escala son perturbaciones que modifican el ambiente por decenas de años. La Patagonia argentina ha sido afectada por numerosos eventos de erupciones volcánicas, por hallarse en la zona volcánica del sur. El 4 de junio de 2011 se produjo una erupción explosiva del Complejo Volcánico Puyehue Cordón Caulle (CVPCC - 2236 m snm; 40°30’S, 72°12’O - Chile), la tercera en los últimos 100 años, que liberó más de 1,25 km3 de magma, el cual modificó el paisaje a cientos de kilómetros hacia el este del mismo. Estudios previos realizados sobre efectos de los depósitos volcánicos en el ambiente acuático indican que tienen consecuencias tanto sobre la química del agua, liberando diferentes cantidades de elementos (entre ellos P y Fe) que fertilizan el sistema, así como también sobre la biota, observando consecuencias por efectos directos como son la mortalidad, daños en los aparatos bucales, sistema digestivo, branquias, o indirectos, por modificación o pérdida del hábitat. En la presente tesis se estudió cómo afectan los depósitos volcánicos la química y la biota de los cuerpos de agua 4 y 7 años después de su caída en el ambiente. También observamos el sistema luego de una erupción reciente pero más leve (erupción del Volcán Calbuco en abril de 2015). En primer lugar se realizó una revisión de la bibliografía existente sobre los efectos de las erupciones volcánicas en los biofilms de los arroyos, la cual revela que sólo existe un trabajo al respecto, luego de la explosión del Monte Santa Helena. A continuación se realizó un experimento de lixiviación de cenizas volcánicas en laboratorio con el fin de cuantificar la cantidad de P y Fe que liberan. Asimismo, se analizó el efecto sobre la comunidad del biofilm en arroyos, mediante muestreos de 10 arroyos (Puyehue, Pantojo, Pereyra I y II, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra) ubicados al este del CVPCC en territorio argentino, a lo largo de un gradiente de depositación del material piroclástico sobre la cuenca del lago Nahuel Huapi (LNH). Los muestreos se realizaron en diferentes momentos del año y en años consecutivos para analizar la variabilidad estacional y la posible recuperación del sistema en 4 años. En principio se analizaron las variables fisicoquímicas del agua y la concentración de clorofila en el biofilm como variable respuesta. Luego se compararon otras variables, tanto estructurales (concentración de clorofila, densidad de productores primarios y bacteriana, composición de la comunidad de productores primarios, biomasa del biofilm, contenido de C, N y P) y funcionales (actividad de fosfatasa alcalina-APA, perfiles fisiológicos de la comunidad bacteriana), en dos arroyos afectados y dos arroyos no afectados por el material volcánico. Y por último, se realizó un experimento en mesocosmos, donde se aislaron dos factores muy modificados en los arroyos tras la erupción del volcán: los sólidos totales en suspensión (STS), simulados con el agregado de vidrio molido (factor V) y el fósforo reactivo soluble (PRS), adicionado mediante el uso de difusores de nutrientes (factor P). Por medio del experimento de lixiviación se demostró que la tefra presente en las cuencas afectadas por el volcán aún liberan P y Fe, particularmente si las rocas están sujetas a la molienda mecánica. Por medio del análisis a lo largo del gradiente de depositación se demostró que siete años después de la erupción volcánica, los arroyos de cabecera que

fueron originalmente más afectados (aquellos más cercanos al CVPCC) aún contienen más sólidos en suspensión y mayores concentraciones de P y Fe en el agua que arroyos más alejados. Los análisis intra e interanuales pusieron en evidencia la relevancia de las variaciones estacionales y de las precipitaciones en la dinámica de ingreso de material volcánico en los arroyos. A pesar de no hallar un patrón relacionado con el volcán en la concentración de clorofila, se observó un predominio de cianobacterias en los ambientes afectados. La comparación de arroyos afectados y no afectados, mostró que los depósitos volcánicos que persisten en las cuencas, al modificar la carga de sedimentos en suspensión y las concentraciones de P en los arroyos, generaron cambios sobre el biofilm. Estas perturbaciones sobre las comunidades del biofilm fueron: disminución de las relaciones C:P, disminución de la APA, disminución del índice autotrófico. También se observó un cambio en la dominancia de los grupos de autótrofos, siendo las cianobacterias dominantes en los arroyos afectados. El experimento en mesocosmos permitió identificar que tanto los sólidos en suspensión como el P (ambos factores que se modifican luego de una erupción volcánica) interactúan sobre las variables del biofilm. Tanto la concentración de clorofila, la biomasa final (PSLC), el contenido de C, N y P, como las relaciones elementales C:P y N:P y la APA fueron mayores en el tratamiento P, sin vidrio, mientras que tanto la relación C:clorofila como la concentración de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) por unidad de biomasa fue mayor en los tratamientos con V sin P. Dado que las comunidades del biofilm en los arroyos de bajo orden son importantes para el ciclo de nutrientes y carbono, se espera que un cambio en el metabolismo del biofilm afecte los ciclos de nutrientes de los arroyos que se transportarían aguas abajo. La conclusión final de esta tesis señala que estos tipos de eventos deben ser vistos como oportunidades para reunir información ecológica valiosa sobre cómo las perturbaciones severas, como las erupciones volcánicas, moldean el paisaje y los ecosistemas lóticos durante varios años después de ocurrido el evento.

Abstract

Effect of volcanic deposits on stream biofilms in the Nahuel Huapi lake catchment (Río Negro, Argentina).

Volcanic eruptions represent perturbations that modify the environment for decades. Argentinian Patagonia has been affected by numerous volcanic eruptions, as it is placed in the South Volcanic Zone. On 4th June 2011, the Puyehue-Cordón Caulle Volcanic Complex (PCCVC - 2236 m asl; 40°30’S, 72°12’W - Chile) explosively erupted, for the third time in the last 100 years. More than 1.25 km3 of magma was released, which modified the landscape over hundreds kilometers. Previous studies on the volcanic deposits effects in aquatic environments showed their consequences both on the aquatic chemistry, by releasing elements such as P and Fe with fertilizer effects, and on the biota. The effects on the biota may be direct, such as mortality, mouthparts damage, digestive problems, gills clogging, or indirect effects as consequences of habitat modification or loss. In the present thesis, the effects of volcanic deposits on stream chemistry and biota were studied 4 and 7 years after their fall into the environments. We also observed the effects of a recent, less sever eruption on the streams (eruption of Calbuco Volcano in April 2015). A bibliographic review on the effects of volcanic eruptions on stream biofilms revealed that there is only one paper on this topic, after the eruption of Mt Saint Helens. In this thesis, we carried out a laboratory leaching experiments of tephra to quantify P and Fe realising. Besides, we analyzed the effects of the tephra on stream biofilm communities, by sampling 10 streams (Puyehue, Pantojo, Pereyra I and II, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye and Casa de Piedra) eastwards the PCCVC, in Argentine, along a depositional gradient of piroclastic material on the Nahuel Huapi lake catchment. Samplings were carried out in different dates in 2014 and in consecutive years (2014, 2015, and 2018) to allow the analysis of seasonal variability and the possible ecosystem recuperation after 4 years. Firstly, we analyzed water physical and chemical variables as well as chlorophyll concentrations response variable. Then, we compared other variables, both structural (chlorophyll concentration, primary producers and bacterial density, primary producers community composition, biofilm biomass, and C, N and P content) and functional variables (alkaline phosphatase activity-APA, community level physiological profiles), in two affected and two unaffected streams. Finally, we carried out indoor experiments in mesocosms, where the two factors that were more modified after the volcanic eruptions were manipulated: total suspended solids (TSS), simulated by adding milled glass (factor V) and soluble reactive phosphorous (SRP), simulated by adding nutrient diffusing substrates (Factor P). Throughout the tephra leaching experiment we demonstrated that the tephra in catchments affected by the volcano still release P and Fe, particularly if the rocks are mechanically milled. The analysis along the depositional gradient demonstrated that after seven years of the volcanic eruption, headwater streams that were more affected (closer to the PCCCV) still bear more TSS and SRP and Fe than the unaffected streams. The intra and

interannual analyses revealed that seasonal variations and precipitation dynamics are relevant in the dynamics of volcanic material into the streams. Although we did not find a pattern of chlorophyll concentration related to the volcano material, differences in the primary producers community composition were found, with a dominance of cyanobacteria in affected environments. The comparison of affected and unaffected streams showed that volcanic deposits still present in catchments lead to changes in the stream biofilm by modifying TSS load and P concentration. These perturbations on biofilm communities consisted in the decrease of C:P ratios, APA, and the autotrophic index. Also, a change in the dominance of the primary producers community was observed, being cyanobacteria the most dominant group in affected streams. The indoor experiment in the mesocosms allowed to identify that there is an interactive effect of TSS and P (the two most affected factors after a volcanic eruption) on biofilm variables. Chlorophyll concentration, final biofilm biomass, C, N and P content, C:P and N:P ratios and APA were positively affected by P but only in the absence of glass; while C:chlorophyll ratio and extracellular polymeric substances (EPS) were higher in the presence of glass but without P. Given the recognized importance of the biofilm community of headwater streams in nutrient and carbon cycles, a change in biofilm metabolism will affect nutrient cycles downstream. These types of events should be seen as opportunities to gather valuable ecological information about how severe disturbances, like volcanic eruptions, shape landscapes and lotic systems for several years after the event.

IÍndice

Agradecimientos ------1 Resumen ------3 Abstract ------5 Índice ------7

Capítulo I: Patagonia, una región que evolucionó entre volcanes ------11 Introducción ------12 Complejo Volcánico Puyehue-Cordón Caulle (CVPCC) ------15 Meteorización de la tefra ------20 Las erupciones volcánicas, análisis de un disturbio natural ------23 Repercusiones de la tefra sobre el ambiente acuático ------25 Consecuencias de la tefra sobre las cuencas hidrográficas ------26 Efecto sobre la composición química del agua ------29 Efectos sobre la biota de los ecosistemas acuáticos ------29 Bacterias ------30 Autótrofos ------31 Invertebrados ------32 Peces ------33 Objetivo General ------35 Objetivos Específicos ------35 Hipótesis y Predicciones ------36 Capítulo II: Relación entre los depósitos de tefra y los productores primarios en arroyos ------39 Introducción ------41 Objetivo General ------44 Objetivos Específicos ------44 Hipótesis y Predicciones ------44 Area de studio ------46 Subcuenca del Pireco ------50 Materiales y Métodos ------51 Experimento de lixiviación ------51 Metodología de muestreo ------53 Procedimientos de laboratorio ------55 Elementos en el agua de los arroyos ------55 Muestras del biofilm ------56 Análisis de los datos ------58 Resultados ------58 Liberación de P y Fe desde la tefra ------59 Análisis completo de los arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi ------59 Parámetros medidos a campo ------61 Parámetros medidos en laboratorio ------61

Sólidos en suspensión y nutrientes ------61 Biofilm ------65 Variación intra-annual ------66 Sólidos en suspensión y nutrientes ------66 Biofilm------68 Variación inter-annual ------69 Sólidos en suspensión y nutrientes ------69 Biofilm------71 Calbuco: antes y después de su erupción ------72 Sólidos en suspensión y nutrientes ------72 Biofilm ------73 Análisis de cuenca: Pireco ------74 Sólidos en suspensión y nutrientes ------74 Biofilm ------75 Discusión ------76 Variación intra-annual ------78 Variación inter-annual ------79 Calbuco: antes y después de su erupción ------80 Análisis de cuenca: Pireco ------81

Capítulo III: Efectos de la ceniza volcánica sobre la estequiometría, la actividad enzimática y la composición comunitaria en el biofilm de arroyos de la Patagonia-Norte. ------85 Introducción ------87 Objetivo General ------88 Hipótesis y Predicciones ------88 Materiales y Métodos ------89 Área de estudio ------89 Muestreo de campo ------89 Procedimientos de laboratorio ------90 Elementos en el biofilm ------90 Determinación de APA ------93 Biomasa de autótrofos y heterótrofos ------93 Composición de autótrofos ------93 Diversidad funcional ------93 Análisis de los datos ------95 Resultados ------96 Sólidos en suspensión y nutrientes en los arroyos ------96 Biofilm ------98 Discusión ------108 Tabla Anaxa I ------113

Capítulo IV: Análisis experimental de los efectos físicos y químicos de las cenizas volcánicas sobre el biofilm ------115 Introducción ------117 Objetivo General ------119 Hipótesis y Predicciones ------119 Materiales y Métodos ------122 Diseño experimental ------122 Parámetros del biofilm ------126 Mediciones de laboratorio ------127 Productores primarios y bacterias ------127 Elementos del biofilm (C, N y P) ------127 Actividad enzimática ------128 Sustancias poliméricas extracelulares ------129 Estructura del biofilm ------129 Análisis de los datos ------129 Resultados ------130 Experimento I ------130 Experimento II ------138 Discusión ------144 Experimento I ------145 Experimento II ------146

Conclusiones Generales ------149 Referencias ------153 Artículo de respaldo ------175

Capítulo I

Patagonia, una región que evolucionó entre volcanes

Introducción

La Patagonia Andina es una zona volcánica que abarca parte de la Zona Volcánica del Sur y Andina de la Cordillera de los Andes (Fig. 1.1) (Gerlach et al. 1988, Singer et al. 2008). Esta joven cordillera fue generada por la subducción de la placa oceánica de Nazca por debajo del margen occidental de la placa continental Sudamericana (entre los 33° y 46° S), donde la influencia tectónica le confiere alta sismicidad. El paisaje patagónico actual ha co-evolucionado con sus volcanes. Algunos ejemplos de erupciones recientes son las de los volcanes Calbuco en 1961, 1972 y 2015; Hudson en 1971, 1991 y 2011; Chaitén en 2008; Llaima en 1994 y 2008, y el Complejo volcánico Puyehue-Cordón Caulle (CVPCC) en 1921-22, 1960 y 2011. Este vulcanismo genera depósitos intermitentes de tefra, que junto al clima húmedo y la influencia de la vegetación, determinan los tipos de suelos volcánicos presentes en la Patagonia andina (Broquen et al. 2005). Estos suelos, clasificados como Andisoles, se desarrollan a partir de la meteorización rápida del vidrio volcánico y muestran un predominio de arcillas no cristalinas que le otorgan características únicas como alta disponibilidad de fósforo y alta capacidad de retención de agua y estabilización de materia orgánica (Broquen et al. 2005). Los suelos formados sobre material volcánico son altamente fértiles (Dahlgren et al. 1993, Schmincke 2004) ya que a medida que el material se meteoriza (es decir, se disgrega física y químicamente), se comienza a liberar en el mediano o largo plazo una mayor cantidad de nutrientes que se incorporan al suelo (Chimner et al. 2011).

Fig. 1.1 Mapa de la Zona Volcánica del Sur (ZVS) de la Cordillera de los Andes, y los numerosos volcanes presentes, entre ellos, el Complejo Volcánico Puyehue-Cordón Caulle (CVPCC). Además se observan las Zonas Volcánicas del Norte, Central y Austral (ZVN, ZVC y ZVA respectivamente). Modificado de Singer et al. (2008).

El material liberado por un volcán es muy diverso, como pueden ser lava, gases, fragmentos sólidos, entre otros (Del Moral y Grishin 1999). Los depósitos piroclásticos expulsados por un volcán como material sólido fragmentado se denominan tefra. Según su tamaño puede diferenciarse como “ceniza”, que es la tefra fina (<2 mm), “lapilli” aquellas que tienen un tamaño entre 2 y 64 mm, y a los fragmentos > a 64 mm se los denomina “bombas volcánicas” (Francis 1993). Los lapilli se componen mayormente de pumicita, una

roca piroclástica compuesta por espuma de vidrio volcánico altamente vesicular cuya composición puede variar de basáltica a silícica, y que al tener una densidad menor al agua, flota (Fig. 1.2) (Fisher y Schmincke 1984).

Fig. 1.2 Fotografía del Lago Nahuel Huapi con sedimentos en suspensión tomada dos semanas después de la erupción del CVPCC. En el margen inferior derecho se observa una pumicita.

El material piroclástico está compuesto por una mezcla de varias partículas, que potencialmente pueden ser liberadas en diferentes escalas de tiempo. Las partículas pueden ser fragmentos de vidrio (fragmentos de magma extinguidos), minerales pirógenos (es decir, silicatos y óxidos) y partículas líticas (por ejemplo, material de roca erosionada del conducto volcánico de cualquier origen) (Óskarsson 1981). El material volcánico puede mezclarse con el agua meteórica (el agua que penetra entre las rocas), la de escorrentía superficial, la del deshielo parcial de glaciares o fusión de nieve, o la acumulada en algunos

cráteres, y desplazarse en masa por los barrancos y cauces fluviales que tienen sus cabeceras en las laderas del volcán. A estos flujos se los denomina lahares. Cada evento eruptivo posee características propias, como son la magnitud, la escala, la severidad, la frecuencia, etc. y además, dependiendo de la composición original de la lava, se liberan diferentes elementos y en distintas proporciones al ambiente circundante. Pero más allá de estas diferencias, el estudio de sus efectos abarca un marco teórico muy importante, y es el de conocer cómo es la dinámica de estos nuevos elementos en las distintas esferas: atmósfera, hidrósfera, litosfera y biosfera.

Complejo Volcánico Puyehue-Cordón Caulle (CVPCC)

El CVPCC se encuentra ubicado en la cordillera de Los Andes, en la Región de Los Lagos, Chile (2236 m snm; 40°30’S, 72°12’O, Fig. 1.1). Este complejo volcánico es uno de los 500 volcanes activos de Chile (Sernageomin 2011) y uno de los más activos de los Andes del Sur, que durante los últimos 10.000 años tuvo pulsos explosivos notables. En los últimos 100 años han ocurrido 3 erupciones importantes: 1921-22, 1960 y 2011-12, todas ellas en el Cordón Caulle, que han generado emisión de lava, dispersión de ceniza y lahares, a la que se suma una emisión de flujo piroclástico por los ríos Nilahue y Gol Gol en 2011 (Villagra y Jaramillo 2012). El 4 de junio de 2011 el CVPCC entró en erupción explosivamente, luego de 51 años de su última actividad, generando una columna eruptiva que alcanzó 14.000 m de altura y liberó diferentes productos piroclásticos (gases, cenizas, lapilli) (Aguilera y Navarrete 2012). La erupción tuvo dos episodios durante los cuales se liberaron 1,25 km3 de magma (Gaitán et al. 2011, Silva Parejas et al. 2012). Durante este evento, la temperatura de varios ríos se elevó, los lagos fueron cubiertos por pumicita y los asentamientos humanos enteros fueron expuestos al efecto de las cenizas (Villagra y Jaramillo 2012). Debido a la predominancia de vientos del cuadrante Oeste, gran parte de la ceniza, en especial la de los primeros días de la erupción que fue la más importante en volumen, cayó en territorio argentino (Fig. 1.3). El material más fino alcanzó cientos a miles de kilómetros desde su fuente, esparciendo más de 100 millones de toneladas de cenizas por todo el territorio argentino (Gaitán et al. 2011). La zona que resultó más afectada fue un sector del Parque

Nacional Nahuel Huapi (41º00’S, 71º30’O, Argentina), situado al SE del CVPCC. La caída de tefra tuvo fuertes efectos sobre la biota, como son la mortalidad inmediata de plantas y animales y la pérdida masiva de hábitat (Ghermandi y González 2012, Wilson et al. 2013, Magnin et al. 2017). Luego, las cenizas se dirigieron al este del Océano Pacífico Sur, casi completando un viaje alrededor del mundo en ocho días y provocando interrupciones de vuelos en Nueva Zelanda y Australia (Klüser et al. 2013, Wilson et al. 2013).

Fig. 1.3 Vista satelital de la pluma del CVPCC y mapa donde se observa las dimensiones de la pluma por encima de la cuenca del lago Nahuel Huapi. Tomado de Modenutti et al 2013.

Estudios realizados sobre los depósitos de tefra indicaron que la mineralogía de la ceniza volcánica del CVPCC contiene una predominancia de vidrio volcánico y fases minerales como plagioclasa feldespato, piroxeno y cuarzo (Daga et al. 2014). Sus productos eruptivos estuvieron compuestos en un 67-70% de SiO2 (Silva Parejas et al. 2012, Pistolesi et al. 2015). La tefra resultante posee una estratigrafía compleja, compuesta por capas alternadas de lapilli grueso y fino y ceniza (Fig. 1.4). De acuerdo con Pistolesi et al. (2015), la proporción de lapilli fue mayor en las cercanías del volcán (hasta los 15 km de distancia al volcán), mientras que a mayores distancias se hallaron proporciones mayores de partículas de tamaño ceniza. Por otro lado, el espesor del estrato fue mayor a 15 km del volcán (112 cm).

Fig. 1.4 Depósitos piroclásticos en la ribera de los arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi, ubicados a 50 km de distancia del CVPCC.

Meteorización de la tefra

El material piroclástico eyectado a la atmósfera es transportado por varios miles de kilómetros y comienza a ser meteorizado. Se entiende el proceso de meteorización como el proceso destructivo mediante el cual la tefra cambia de color, textura, composición, firmeza o forma al ponerse en contacto con agentes atmosféricos. En particular, la exposición prolongada de los productos piroclásticos a la intemperie puede provocar la liberación lenta de elementos de la estructura de sus fases minerales y de la matriz vítrea hacia los suelos y el agua. Por ende, la meteorización de rocas volcánicas juega un papel importante en el flujo de nutrientes a la biósfera. Un factor muy importante para considerar cuando estudiamos cualquier tipo de meteorización de la tefra es el tiempo desde su caída. Jones y Gislason (2008) observaron que la ceniza almacenada en el laboratorio se envejece, disminuyendo las cantidades de elementos que pueden movilizarse a partir de su estructura. Esto se ha observado en muestras de cenizas procedentes de los volcanes de la zona de subducción del océano Pacífico que luego de 10-20 años de almacenamiento, la solubilidad de las sales solubles de Fe presentes en las cenizas volcánicas disminuyó (Olgun et al. 2011).

La meteorización depende mucho de la estructura fisicoquímica del material, del tamaño de la tefra, de las condiciones climáticas del sitio, de la posición topográfica en donde haya sido depositada la tefra y de las condiciones de drenaje, como también la presencia de vegetación preexistente y de microorganismos (Flórez Molina y Parra 2010). Dicho proceso lo llevan a cabo diferentes agentes, que pueden ser físicos, químicos y biológicos (Hirsch et al. 1995a). La meteorización física se refiere a un grupo de procesos que ocurren en la superficie de la roca y la desintegración en partículas más pequeñas o la disolución en el agua. Las condiciones físicas que disgregan las rocas son la corrosión, el congelamiento y descongelamiento, el calentamiento y enfriamiento. Estos procesos son muy lentos, pueden durar cientos a miles de años (Flórez Molina y Parra 2010). Los rasgos de meteorización más destacados en estos minerales son la modificación física de las superficies, la pérdida de la forma, la modificación de los bordes y formas de los cristales, la formación de grietas, la fragmentación del mineral y el incremento del área superficial específica (Flórez 2004). (Fig. 1.5).

Fig. 1.5 Imagen de pumicita no erosionada (a) y otra erosionada por efecto del agua (b).

La meteorización química cambia la composición del mineral, siendo el agua el agente dominante. Los procesos más importantes que intervienen son la hidrólisis, hidratación, óxido-reducción (Fe, Mn) y corrosión (por adhesión de materia orgánica) (Flórez Molina y Parra 2010). La primera disolución rápida de elementos se produce en la pluma del volcán en un ambiente ácido, húmedo y a altas temperaturas. Durante la erupción, la superficie de las partículas de ceniza se recubren por una fina capa de sales que se forman al interactuar las partículas de cenizas con gases volcánicos (S, HCl y HF) y aerosoles (Óskarsson 1980, Delmelle et al. 2007). Posteriormente, en las primeras semanas después de una erupción volcánica, la tefra comienza a liberar elementos por medio de un proceso denominado lixiviación, afectando las condiciones químicas del ambiente donde se deposita. La cantidad de elementos lixiviados por unidad de masa de tefra aumenta a medida que disminuye el tamaño de partícula (Óskarsson 1980). Además la tefra puede sufrir cambios de color, pudiendo virar de beige a un color marrón oscuro, dependiendo del estado de oxidación del hierro en el vidrio (Castro y Dingwell 2009) pero no se deben a variaciones mineralógicas o de textura. Tanto la mineralogía como la composición química y la textura del material original determinan en gran medida la velocidad del desgaste químico (Dahlgren et al. 1993), incrementándose por ejemplo de 500 a 4500 años a medida que su composición cambia de basáltica a riolítica por su alto contenido de Si (Wolff-Boenisch et al. 2004). Se sabe que el vidrio volcánico es uno de los elementos más susceptibles a la meteorización química (Frogner et al. 2001), y está asociado a su estructura amorfa, debido al enfriamiento rápido. Aloja muchos cationes (Ca+, Mg2+, K+ y Na+) unidos de manera muy lábil en su interior y también pueden liberar P, Si y Fe, inyectando cantidades significativas de nutrientes que son utilizados por la biota. La meteorización por actividad biológica acelera sustancialmente el proceso del intercambio químico entre el material volcánico y el agua, desempeñando importantes funciones cuali y cuantitativas en el intercambio de elementos químicos entre la hidrosfera y la litosfera (Staudigel et al. 1998, 2002, Banerjee y Muehlenbachs 2003). En ecosistemas acuáticos, el biofilm que se forma sobre las partículas volcánicas contribuye a la desintegración de la roca, ya que los ácidos generados por el metabolismo de los microorganismos pueden disolver rocas (Hirsch et al. 1995b). Las bacterias tienen la

capacidad de alterar el material volcánico, por ejemplo, oxidando el vidrio volcánico (Templeton et al. 2005) o solubilizar el P insoluble a través de sus ácidos orgánicos (Puente et al. 2006, Satyaprakash et al. 2017). Se han aislado proteobacterias de la superficie de basalto en océanos, con la capacidad funcional de oxidar Fe+2 y Mn+2, pudiendo participar en el reciclado de estos elementos (Edwards y Sugg 2005). Por otro lado, las formas inorgánicas de P son solubilizadas por un grupo de microorganismos heterotróficos que excretan ácidos orgánicos que disuelven los minerales fosfatados y / o quelantes catiónicos asociados a los iones P, liberando el P directamente a la solución (He et al. 2002). Además de P, los microorganismos pueden liberar Fe de las cenizas volcánicas, por medio de agentes complejos denominados sideróforos, incrementando así la concentración de Fe disuelto en el ambiente (Bau et al. 2013). Por lo que la alteración biológica del material volcánico por ataque microbiano puede tener efectos sustanciales en los flujos geoquímicos de los cuerpos de agua. La sensibilidad del ambiente frente a los numerosos cambios producidos por la tefra depende de la composición química y la cantidad de elementos lixiviados desde la ceniza y de la capacidad del ecosistema para protegerse de sus efectos. Los ecosistemas acuáticos con una baja tasa de recambio (porcentaje de material que es reemplazado en un ecosistema por unidad de tiempo), son particularmente vulnerables a la re-movilización de ácidos y metales pesados tóxicos (Frogner-Kockum et al. 2006).

Las erupciones volcánicas, análisis de un disturbio natural.

Un disturbio es cualquier evento relativamente discreto en el tiempo que interrumpe la dinámica del ecosistema, la comunidad o la estructura de una población y cambia sus recursos, la disponibilidad del sustrato o el entorno físico (White y Pickett 1985). Los disturbios moldean las comunidades (White et al. 1999) por lo que constituyen componentes fundamentales en su dinámica. Los cambios en las condiciones ambientales generan gradientes ambientales, y como consecuencia de ello, una fuerte heterogeneidad espacial, siendo este un factor principal que controla la diversidad de especies (Connell 1978, White y Pickett 1985). Según el grado de intensidad se reconocen cuatro clases de disturbios: sin disturbio, disturbio bajo, medio y alto. La hipótesis del disturbio intermedio

(Connell 1978) predice que tanto los sitios no disturbados como los sitios que sufren perturbaciones graves, frecuentes o a gran escala, deben tener menos especies que los sitios sometidos a niveles "intermedios" de intensidad, frecuencia o extensión del área disturbada. La teoría se basa en la suposición de que, en sitios inalterados, ciertas especies son dominantes debido a sus capacidades competitivas superiores y excluyen especies menos competitivas, lo que deprime a las especies en general. En cambio, en sitios donde ocurren disturbios, se generan nuevos espacios susceptibles de ser colonizados por especies nuevas que llegan por azar. Las respuestas del ambiente luego de disturbios de origen volcánico pueden variar de acuerdo a la escala, frecuencia, magnitud y gravedad del evento (Del Moral y Grishin 1999). Una de las consecuencias directas de las erupciones volcánicas severas es el deterioro o pérdida masiva de hábitats (Arendt et al. 1999), lo que conlleva a una reducción de la densidad poblacional por la baja tasa de inmigración. Otro factor importante es el legado biológico, definido como el conjunto de propágulos, organismos o estructuras derivadas de organismos, y aquellos patrones ecológicos derivados del ecosistema que sobrevivieron a una perturbación y desempeñan un papel fundamental en la reorganización y recuperación de los ecosistemas post-disturbios (Franklin et al. 2000). El proceso de recuperación del ecosistema comienza una vez ocurrida la erupción, pero tomará diferentes caminos dependiendo el grado del disturbio. En los casos donde el grado fue alto (ecosistemas que han sido afectados con lavas, flujos piroclásticos y la mayoría de los lahares), comienza un proceso de sucesión primaria ya que no quedan legados biológicos. Por otro lado, en donde el grado de disturbio fue intermedio o bajo (ambientes con un impacto menor donde la tefra es una capa de pocos centímetros) ocurre una sucesión secundaria, ya que sobrevive el legado biológico (Halpern et al. 1990, Grishin et al. 1996). Por lo que es esperable que las funciones ecosistémicas se regeneren con diferente rapidez, según la posición del sitio a lo largo del gradiente de impacto por la deposición de cenizas (Chaneton et al. 2014). A medida que las condiciones mejoran (p.e. por acumulación de nutrientes) comienza a acelerarse gradualmente la tasa de recuperación del ecosistema. La tasa de sucesión depende del clima presente en la zona afectada, ya que la humedad y la temperatura permiten que la lixiviación de nutrientes desde la tefra sea más rápida (del Moral y Wood

1993, Crisafulli et al. 2015). Otro aspecto que favorece la recuperación del ecosistema es la facilitación biótica, por la colonización de nuevos organismos al ambiente perturbado que permitan el establecimiento de otras especies, generando nuevas redes más complejas de interacción (del Moral y Wood 1993). Si bien las tasas de sucesión pueden medirse por los cambios en la composición de las especies, la recuperación de las funciones del ecosistema, como la productividad, son también una medida de ello. En particular, en el caso de un disturbio causado por una erupción volcánica el aporte de nutrientes por parte del material volcánico favorece a la recuperación de las poblaciones. Por ejemplo, ya en una investigación realizada luego de la erupción del volcán Katmai de 1912 se relacionó el aporte de nitrógeno por parte de las cenizas en la recuperación de la vegetación terrestre (Shipley 1919). Contrariamente al efecto negativo esperado la erupción CVCPP produjo en suelos de la estepa patagónica un incremento en la actividad biótica y del reciclado del carbono (Berenstecher et al.). Luego de 10 meses de la erupción del CVPCC de 2011, se observó en la estepa patagónica (a 100 km del CVPCC) que la recuperación de la vegetación fue mayor en parches cubiertos con 3 cm de tefra que en aquellos sin ceniza (Ghermandi et al. 2015). El bosque sobreviviente desempeñó un papel clave en la recuperación del ecosistema después de la deposición de tefra, proporcionando semillas y materia orgánica y estableciendo las condiciones apropiadas para las plantas, los invertebrados y los microorganismos que a su vez aceleraran el desarrollo del suelo (Ferreiro et al. 2018). En cuanto a los efectos en la comunidad de invertebrados del suelo, si bien se ha observado un reemplazo de los grupos funcionales, por una reducción de la abundancia de los detritívoros (Elizalde 2014), Piazza et al (2018) observaron una mayor descomposición de la hojarasca ubicada debajo de las cenizas respecto a la que se encuentra sobre la capa de cenizas. Este resultado podría justificarse considerando que la capa de cenizas podría aislar de los pocos detritívoros y descomponedores activos en el suelo a la hojarasca depositada con posterioridad a la erupción.

Repercusiones de la tefra sobre el ambiente acuático

Los efectos que se han registrado de la caída de material volcánico sobre los ambientes acuáticos son diversos y abarcan desde cambios en la composición química del agua,

cambios físicos y en última instancia cambios en la biota (Ayris y Delmelle 2012). Las revisiones realizadas sobre los trabajos que registran los efectos causados por la caída de tefra sobre los ambientes dejan en evidencia que existe un sesgo hacia los efectos químicos, mientras que los efectos sobre la biota, y sobre todo la biota acuática, son escasos. Uno de ellos es el realizado por Stewart y colaboradores (2006), que se enfoca en los efectos contaminantes de las cenizas, como la abrasión de equipamientos, corrosión de estructuras metálicas como tuberías, aumento de turbidez en el agua que la hacen inapropiada para el consumo y hace mucho hincapié en los aspectos químicos, como la contaminación por ácido fluorhídrico en concentraciones que alcanzan límites tóxicos para personas y animales. Un trabajo más reciente (Ayris y Delmelle 2012) alude a trabajos de hace más de 50 años sobre efectos en el fitoplancton de agua dulce (Eicher y Rounsefell 1957, Kurenkov 1966), poniendo en evidencia que la mayoría de los trabajos se han concentrado en los efectos sobre el océano. Revisaré a continuación los efectos de la tefra sobre el ambiente acuático. Se revisaron 39 trabajos (Tabla 1.1), de los cuales 6 fueron efectos sobre ambientes oceánicos y 31 fueron en agua dulce. Se analizaron trabajos que reportan tanto efectos físicos (8), efectos sobre la composición química del agua (11), como efectos sobre la biota (bacterias-6, autótrofos-13, invertebrados-9 y peces-4).

Tabla 1.1 Resumen bibliográfica sobre efectos de las erupciones volcánicas en cuerpo de agua. EFECTO TIPO DE VOLCÁN AÑO AUTORES REPORTADO AMBIENTE Efectos físicos  Cambio en la morfología Cuencas Mt St. Helena, USA 1980 Janda, 1984 de la cuenca Pinatubo, Filipinas 1991 Hayes, 2002 Mayon, Filipinas 1993 Canisius, 2009  Aumento de la Marino El Hierro, Canarias 2011 Fraile-Nuez, 2012 temperatura  Aumento de la turbidez Lagos CVPCC, Chile 2011 Modenutti, 2013 Rios Pinatubo, Filipinas 1991 Hayes, 2002 Hudson, Chile 1991 Inbar, 1995 Chaiten, Chile 2008 Miserendino, 2012 CVPCC, Chile 2011 Lallement, 2016a Efecto sobre la composición química del agua  Liberación de elementos Acuático en Hekla, Islandia 1991 y Flaathen, 2007 al agua (Cl, F, Al, Fe, general (nieve, 2000

Mn, As, Cd, Pb, Zn, U) ríos, marino)  Liberación de P, Fe, Si y Marino Hekla, Islandia 2000 Frogner, 2001 Mn Anatahan, Marianas 2003 Lin, 2011

Kasatochi, Alaska 2008 Hamme, 2010 Langmann, 2010  Aumentos en la Lagos y lagunas Chaiten, Chile 2008 Martin, 2009 concentración de elementos traza (B, Cd, Zn, Tl, Cu, Ni)  Aumento de la Lagos Mt St. Helena, EEUU 1980 Baross 1982 concentración de McKnight, 1988 Carbono Orgánico Disuelto  Disminución del pH Marino El Hierro, Canarias 2011 Fraile-Nuez, 2012 Experimental Jones, 2008  Liberación de F, Fe, Si, P Experimental Jones, 2008 Olgún, 2011 Efectos sobre la biota Bacterias  Condiciones anaeróbicas, Lagos Mt St. Helena, EEUU 1980 Baross 1982 ultraeutrofización y aumento de bacterias  Cambios en la Lagos CVPCC, Chile 2011 Elser, 2015 composición de las Marino Sakurajima, Japón 2013 Witt, 2017 bacterias sobre la tefra  Aumento de la Lagos CVPCC, Chile 2011 Modenuti, 2016 respiración bacteriana  Aumento de bacterias Marino El Hierro, Canarias 2011 Fraile-Nuez, 2012 heterótrofas Autótrofos  Fertilización (aumento de Marino Hekla, Islandia 2000 Frogner, 2001 clorofila del fitoplancton) Anatahan, Marianas 2003 Lin, 2011 Kasatochi, Alaska 2008 Hamme, 2010 Langmann, 2010  Cambios en la Paleolimnología Mt Mazama, EEUU -6800 Abella, 1988 abundancia y estructura Lagos Alaska Barsdate 1972 de la comunidad de diatomeas Tanzania -4100 Barker, 2000 Opabin Lake Hickman, 1998 México Telford 2004 Lagos Besymjanny, Kamchatka 1955 Kurenkov, 1966 Arroyos Mt St Helens, EEUU 1980 Rushforth, 1986  Cambios en las especies Lagos y arroyos Mt St Helens, EEUU 1980 Ward, 1983 a favor de las cianobacterias  Cambios en la Lagos CVPCC, Chile 2011 Modenutti, 2013, composición del fitoplancton

Invertebrados  Aumento tardío de las Lagos Besymjanny, Kamchatka 1955 Kurenkov, 1966 poblaciones de copépodos ciclopoideos por aumento de diatomeas  Efecto negativo sobre CVPCC, Chile 2011 Wolinski, 2013 cladóceros por obstrucción alimentaria  Reducen colonización de Arroyos Mt St Helens, EEUU 1980 Brusven, 1984 los EPT  Efectos fisiológicos Mt St Helens, EEUU 1980 Gersich, 1982 sobre EPT  Cambios de especies de (sub-fósil) Llaima, Chile 1956 Araneda, 2007 quironómidos Paleolimnológico Zona Volcánica Norte, Quaternario Matthews-Bird, Ecuador 2017  Cambios en las Ríos y arroyos Redoubt, Alaska 1989-1990 Dorava, 1999 comunidades de Chaiten, Chile 2008 Miserendino, 2012 macroinvertebrados bentónicos CVPCC, Chile 2011 Lallement, 2014 Peces  Aumento de la Ríos y arroyos Katmai, Alaska 1912 Eicher, 1957 abundancia de salmones por efecto fertilizante luego de un año  Efectos negativos por Mt St Helens, EEUU 1980 Bisson, 2005 obstrucción de vías Newcomb, 1983 respiratorias  Disminución de la CVPCC, Chile 2013 Lallament, 2016b población y cambios en las especies de salmónidos

Consecuencias de la tefra sobre las cuencas hidrográficas

Una vez que el material piroclástico es dispersado por la atmósfera y se deposita en el ambiente terrestre y acuático, comienza una dinámica de este material dentro de las cuencas hidrográficas. La tefra que cae sobre los cuerpos de agua puede decantar para formar parte del fondo (de lagos, ríos y océanos) o ser transportado a través de los ríos (Hayes et al. 2002) (Fig. 1.6).

Fig. 1.6 Transporte y depósitos en el lecho de arroyos de material piroclástico de la cuenca del lago Nahuel Huapi.

Tanto la velocidad del flujo de agua como el tamaño de partícula son los factores que determinan si la tefra se deposita en el lecho del río o permanece en suspensión (Ayris y Delmelle 2012). El flujo del río puede arrastrar partículas de tefra <100 μm de diámetro dentro de la columna de agua indefinidamente. Si las velocidades del flujo caen por debajo de ~ 0,05 m s-1, las partículas se depositan (Collinson y Thompson 1989) (Fig. 1.7a,b), aunque a veces se ven aguas muy turbias con velocidades de flujo muy bajas (Hayes et al. 2002) (Fig. 1.7c). El material volcánico de menor densidad que el agua se mantiene en suspensión en los cuerpos de agua por tiempo prolongado, generando aumentos de turbidez (Inbar et al. 1995, Lallement et al. 2016). Como consecuencia de esto se produce un aumento en la dispersión de la luz y, por lo tanto, disminuye la penetración lumínica (Modenutti et al. 2013). Modenutti et al. (2013) hallaron además que la disminución de la intensidad fue pareja para todas las longitudes de onda de luz de PAR.

Fig. 1.7 Arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi con material piroclástico depositado y en suspensión. a) y b) A° Pireco y c) A° Totoral. Año 2014.

Los depósitos generados luego de erupciones volcánicas cambian la morfología del valle de los ríos y los límites de la cuenca hidrográfica, generando lahares e inundaciones por obstrucción del flujo en los canales (Hayes et al. 2002). El ingreso de tefra al sistema acuático produce un cambio en la morfología del canal, por la destrucción de canales históricos y la apertura de nuevos canales a través de la vegetación ribereña, provocando la muerte de árboles en las grandes áreas que fueron inundadas (Swanson y Major 2005, Lallement et al. 2014). Aunque en algunos casos, estos cambios pueden mejoran la eficiencia hidráulica de los canales (Major y Mark 2006, Pierson y Major 2014), varios arroyos del Mt. Santa Helena se enderezaron, se alisaron y cambiaron de sistemas de pools y rifles con lecho de grava a arroyos simplificados con lecho de arena y despojados de vegetación ribereña (Janda et al. 1984). Los depósitos de ceniza convierten a las riberas en ambientes muy inestables, ya que ocurren desprendimientos continuos de material hacia la corriente de agua. Luego de eventos de lluvia o nieve, el ingreso de material desde la ribera aumenta, causando daños drásticos aguas abajo (Canisius et al. 2009). Este ingreso de sedimento probablemente continúe durante muchos años después de la erupción. Aunque puede ocurrir que la

cubierta superficial de ceniza, al ser muy fina, desaparezca luego de una década debido a la erosión del agua y el viento, depositándose todo en los tramos inferiores y los deltas (Jorgenson et al. 2006).

Efecto sobre la composición química del agua

La entrada de tefra al ambiente acuático puede producir cambios importantes en las condiciones fisicoquímicas del agua. Ni bien la ceniza prístina entra en contacto con el agua (tanto por la lluvia o por caer en un cuerpo de agua) comienza una rápida liberación de sustancias que están adsorbidas a la superficie de la ceniza (Taylor y Lichte 1980). Por ejemplo, luego de algunas erupciones volcánicas se observaron aumentos en las concentraciones de elementos traza en lagunas temporarias ó de elementos tales como F, S, P, Fe, Si y Mn en océanos (Tabla 1.1). En algunos casos se libera una gran cantidad de

ácidos fuertes como H2SO4, HCl y HF reduciendo el pH del agua hasta 4 unidades (Tabla 1.1). La presencia de N y C en la tefra prístina puede ser producto de materia orgánica pirolizada arrastrada con la pluma (Cushing y Smith 1982). Se han registrado incrementos de carbono orgánico disuelto (COD) en lagos, que pasaron de 1 mg C L-1 a tener 30 mg C L-1. Incluso algunos llegaron a tener hasta 200 mg C L-1 luego de la erupción del Mt. Santa Helena, al recibir grandes cantidades de ceniza, restos de madera y compuestos orgánicos solubles tras la pirolisis del bosque destruido (Baross et al. 1982, McKnight et al. 1988). El aporte de COD en ambientes acuáticos perturbados puede aumentar la producción microbiana de CH4 (50%), CO2 (50%) y niveles de trazas de H2, CO y N2O (Baross et al. 1982). En lagos afectados por la erupción del CVCPP también se registró un incremento de la concentración de P y de la respiración bacteriana (Modenutti et al 2013, 2016).

Efectos sobre la biota de los ecosistemas acuáticos

Los cambios que generan las erupciones volcánicas pueden influenciar significativamente el desarrollo y la trayectoria del ecosistema, modelando la estructura, composición y función de las comunidades tanto de lagos como de ríos y arroyos {Lee, 1996; del Moral, 1999}. Una vez que el material piroclástico alcanza las cuencas, las

consecuencias pueden recaer sobre el ecosistema por medio de alteraciones que comprometan a toda la biota, o ser más específicas sobre ciertos grupos de organismos. Como ejemplo de los primeros, se ha observado que la caída de ceniza volcánica puede aportar elementos traza potencialmente tóxicos para la biota (Stewart et al. 2006), como sucedió luego de la erupción del volcán Heckla en 1970 (sudeste de Islandia), donde se observaron pulsos de F en los arroyos del área afectada (Óskarsson 1980). Este elemento, adsorbido y liberado en pocas horas por la tefra, se une con el Al, que también es liberado por la tefra, formando complejos altamente tóxicos para la biota (Flaathen y Gislason 2007). A veces los efectos recaen sólo en un grupo de organismos, por ejemplo metales como el cobre (Cu) y el zinc (Zn) pueden ser tóxicos para el fitoplancton {Sunda, 2000}.

Bacterias

La pumicita flotante se ha propuesto como un sustrato para la evolución química temprana y el origen de la vida debido a su combinación de superficies químicamente reactivas y pequeños vacíos interiores que podrían proteger moléculas protobiológicas tempranas y proporcionar un ambiente estable para diversas reacciones (Brasier et al. 2011). El ingreso de pumicita flotante a los cuerpos de agua ha generado micrositios donde se alojan comunidades bacterianas, con una composición única y diferente a la presente en la columna de agua del lago (Elser et al. 2015a). En arrecifes de coral impactados por cenizas volcánicas, se han registrado comunidades bacterianas muy diversas, luego de tres meses de colonización (Witt et al. 2017). Por lo que se observa que se produce un cambio a nivel estructural como funcional e los ambientes acuáticos luego del ingreso de material volcánico a los cuerpos de agua. Por lo tanto, los lagos afectados severamente por cenizas, representan sitios experimentales ideales para estudiar los procesos microbianos anaeróbicos y las transformaciones químicas que pudieron haber ocurrido en los ambiente acuáticos reductores de las arqueas (Baross et al. 1982). En lagos cercanos al cráter del Mt.

Santa Helena luego de su erupción, se observaron tasas bacterianas de fijación de N2 extremadamente altas, proporcionando una fuente de nitrógeno nuevo para estos ambientes limitados por este nutriente (Dahm et al. 1983, Ward et al. 1983). Además el incremento en las concentraciones de COD, compuestos sulfurados y metales en estos lagos luego de la

erupción trajo como consecuencia el aumento de la actividad microbiana anaeróbica (Baross et al. 1982). También en ambientes afectados por la erupción CVCPP se observaron cambios en la composición comunitaria bacteriana y un aumento de la respiración bacteriana (Modenutti et al 2016).

Autótrofos

Las erupciones volcánicas generan en un primer momento daños sobre la biota, que se traduce en la disminución drástica de la abundancia y la diversidad de autótrofos dado por el aumento de la temperatura y la acidez del agua, la anoxia, y el incremento de los sólidos en suspensión {Baross, 1982}. Una erupción volcánica genera un gradiente espacial a lo largo de la depositación de las cenizas por lo que se espera encontrar sitios cercanos al volcán muy afectados y una disminución del impacto a medida que nos alejamos del volcán {Baross, 1982}. Luego de la erupción comienza la recuperación del ecosistema, que se ve favorecida generalmente por la fertilización que producen las cenizas en el ambiente acuático y la disminución de los efectos negativos (como el incremento de sólidos totales en suspensión) {Modenutti, 2013}. Estos cambios pueden alterar tanto la abundancia como la composición específica de las poblaciones de autótrofos. En los ambientes acuáticos pobres en nutrientes (como son los océanos o los lagos ultraoligotróficos) las explosiones volcánicas han generado un crecimiento de los productores primarios, incrementando así la biomasa algal por un efecto fertilizante (Tabla 1.1). En particular, en los océanos los efectos de los sedimentos volcánicos están más asociados a los ingresos de Fe (Tabla 1.1). Además de los efectos por enriquecimiento de nutrientes, también se han observado efectos físicos, como aumento de la temperatura del agua y de la turbidez. Luego de la erupción del volcán El Hierro (2011), en las Islas Canarias, se observó que una disminución en la penetración de la luz en el mar causó que la capa fótica subiera y a 75 m de profundidad se produjo un reemplazo de bacterias fotosintéticas (cianobacterias) por bacterias heterótrofas (Fraile-Nuez et al. 2012). Por el contrario, en los lagos ultraoligotróficos que fueron afectados por el CVCPP, el aumento de turbidez causó un aumento de los autótrofos (Modenutti et al. 2013). Estos lagos son extremadamente transparentes, y las altas intensidades de luz reducen el crecimiento del fitoplancton por fotoinhibición (Modenutti et

al. 2004, Callieri et al. 2007, Alderkamp et al. 2010, Gerla et al. 2011 2011). Por lo que el aumento de sólidos en suspensión provocó un incremento de la extinción de la luz y como consecuencia de esto, una disminución de la fotoinhibición sobre las algas planctónicas (Modenutti et al. 2013). Esta disminución lumínica afectó positivamente a los autótrofos más que el incremento de nutrientes (Modenutti et al. 2013). La composición de algas en ecosistemas acuáticos perturbados por erupciones volcánicas es el reflejo de las asociaciones de colonizadores tempranos, y el desarrollo oportunista en un ambiente hostil. Muchos de los estudios realizados sobre el efecto de los depósitos de tefra sobre la composición de algas son paleolimnológicos. La posibilidad de encontrar los frústulos de las diatomeas asociados a las capas de tefras en testigos de fondos marinos y lacustres permitió determinar que las especies de diatomeas son muy sensibles a las perturbaciones causadas por las erupciones volcánicas (Tabla 1.1), posiblemente debido a cambios en la disponibilidad de nutrientes. En lagos afectados por el CVCPP se observó el incremento de diatomeas como Tabellaria flocculosa y Aulacoseira granulata (Modenutti et al 2013). Entre los cambios en la composición de los autótrofos, se ha observado un incremento de las cianobacterias (Cushing y Smith 1982). Luego de la erupción del Mt. Santa Helena, los niveles de N permanecieron bajos mientras el P, Fe entre otros se incrementaron, y por lo tanto la capacidad de fijar N2 atmosférico fue crucial, observándose altos niveles de actividad nitrogenasa en los lagos y lagunas afectados (Baross et al. 1982). Ligado a esto se hallaron cianobacterias fijadoras de N2, quienes poseen una ventaja competitiva frente al resto de las especies (Ward et al. 1983). Existen pocos registros de los efectos de la caída de cenizas volcánicas sobre la composición de los autótrofos en el perifiton de arroyos (Tabla 1.1). En los arroyos afectados por cenizas del Mt. Santa Helena se observó menor biomasa en el perifiton de los arroyos más disturbados (Cushing y Smith 1982), donde la comunidad estuvo dominada, en un estadío sucesional temprano, por Achnanthes minutissima (Rushforth et al. 1986). Estudios realizados 6 años después, indicaron que tanto la riqueza de especies como la diversidad tienden a ser más bajos en los sitios más perturbados. En ambientes perturbados que aún reciben descargas de material piroclástico fino desde el ambiente, dominaron las

diatomeas, con presencia de cianobacterias en todos los sitios llegando a dominar en ambientes termales cercanos al volcán (Steinman y Lamberti 1988).

Invertebrados

El aumento de sólidos en suspensión y sedimentación lleva a una disminución en la calidad del hábitat para los invertebrados (Wood y Armitage 1997). En términos generales, los sedimentos finos ejercen una presión selectiva sobre algunos rasgos específicos de los invertebrados que le confieren resistencia y resiliencia a este tipo de estrés (como son el polivoltinismo, ciclos de vida cortos y tamaños corporales pequeños), dando lugar a diferencias en la estructura de la comunidad a través de la cuenca (Buendia et al. 2013). La fauna planctónica suele verse negativamente afectada por el ingreso de ceniza volcánica, como sucedió luego de la erupción del monte Besymjanny (1955), donde se observó una disminución en 6 veces de la abundancia del ciclopoideo Cyclops scutifer (Kurenkov 1966). También tras la erupción del CVPCC la población del cladócero Daphnia commutata de lagos patagónicos decreció, a pesar de las altas concentraciones de Chl a (Wolinski et al. , Balseiro et al.). Estos crustáceos fueron afectados negativamente por ser filtradores no selectivos. Siendo la ceniza volcánica una partícula muy fina de estructura cristalina angulosa (Caneiro et al. 2011), la exposición a las cenizas provocó la oclusión intestinal generando un incremento de la mortalidad de los organismos filtradores del plancton (Wolinski et al. 2013). En los arroyos, el incremento de sólidos en suspensión en general, de cualquier origen, modifica la estructura de la comunidad bentónica, pasando de una dominada por Ephemeroptera, Plecoptera y Trichoptera (EPT) a otra dominada por Oligochaeta, Chironomidae y Bivalva, taxones adaptados al enterramiento (Wood and Armitage 1997). En ambientes volcánicos en particular, las capas de ceniza de varios milímetros que se depositan sobre los sustratos de roca inhiben significativamente la colonización por los EPT (Brusven and Hornig 1984). Por otro lado, la acumulación sustancial de cenizas en su exoesqueleto, específicamente sobre las branquias u otras estructuras respiratorias, dificulta la respiración (Gersich and Brusven 1982). El estrés respiratorio, sumado al desequilibrio hídrico e iónico, aumenta la susceptibilidad de los invertebrados expuestos a cenizas

volcánicas. Luego de la caída de ceniza volcánica del Chaitén (2008) se observó la eliminación de 25 taxones de invertebrados y a la vez un incremento de Oligochaeta (Miserendino et al. 2012). Por otro lado, tanto en registros sub-fósiles del lago Galletué tras la erupción del Llaima (1956) (Urrutia et al. 2007) como en evidencia más reciente tras la erupción del CVPCC (Lallement et al. 2014), se observó que el grupo beneficiado fue el de los Chironomidae. Incluso dentro de este grupo de invertebrados, los efectos del enterramiento por cenizas puede afectar de manera diferente a las especies que lo conforman. Estudios paleolimnológicos realizados en dos lagos neotropicales ubicados en el flanco andino oriental de Ecuador, indicaron cambios en estas poblaciones, cambiando la especie dominante (Matthews-Bird et al. 2017).

Peces

La inestabilidad ambiental que generan las erupciones volcánicas, por incrementos de la sedimentación, movimientos de suelo, incrementos en la turbidez y modificación de los canales que alteran patrones de drenaje y flujo de agua, impacta sobre la comunidad de peces también (Bisson 2005). Los sedimentos en suspensión tras la erupción del Mt. Santa Helena provocaron una gran mortalidad de los salmónidos debido a un bloqueo de su superficie osmorreguladora, por adherirse grandes cantidades de ceniza y moco sobre sus branquias (Newcomb and Flagg 1983). Los impactos de las cenizas sobre los salmónidos también están relacionados con su particular hábito de vida, la migración. Un ejemplo de esto se observó en Alaska (año 1912), donde se produjo un retraso en el ingreso de los salmónidos adultos en las corrientes por obstrucción directa de las vías de acceso y el incremento de la turbidez del agua que produjo gran mortandad por sofocamiento. Aunque varios años después hubo un fuerte crecimiento de la abundancia de salmones jóvenes (Oncorhynchus nerlca) posiblemente por efecto fertilizante de las cenizas (Eicher and Rounsefell 1957). La erupción del CVPCC produjo cambios en el ensamble de peces a lo largo de un gradiente de depósitos de cenizas (Lallement et al. 2016). La recolonización de estos arroyos por parte de los salmónidos se produjo a lo largo de cinco años a partir del ensamble común de especies de la cuenca del Limay Superior (Lallement 2016). Esta

recuperación posiblemente se deba, en principio, a una disminución de los sedimentos en suspensión y, por otro lado, a un efecto bottom-up por la acción fertilizante de las cenizas en los cuerpos de agua comentado más arriba. Luego de la revisión realizada respecto a los efectos del material volcánico depositado sobre los ecosistemas acuáticos se observa que no existen muchos estudios sobre el efecto de estos depósitos volcánicos sobre el biofilm de arroyos. Entender los factores que afectan a la biomasa y a la productividad del biofilm resulta crítico para entender el funcionamiento completo del ecosistema de arroyos (Mineau et al. 2013) y también para predecir los efectos del cambio climático global (Freixa y Romaní 2014). Por otra parte, la actividad enzimática extracelular del biofilm permite revelar patrones universales en la dinámica del C, N y P y nos permite entender cómo los microorganismos influencian los procesos a nivel ecosistema (Rier et al. 2014). Por lo que la erupción del CVPCC al afectar directamente la cuenca del lago Nahuel Huapi representa una oportunidad única para comprender el efecto de estos eventos naturales en diversos ambientes del área, incluyendo a los ríos y arroyos.

Objetivo General

Determinar el efecto de las cenizas volcánicas sobre la estructura y diversidad funcional del biofilm de arroyos andinos.

Objetivos específicos

1. Determinar las concentraciones de P (disuelto) y su efecto sobre la estructura y función del biofilm de arroyos ubicados a lo largo de un gradiente de depositación de cenizas volcánicas.

2. Analizar la estructura del biofilm en relación con el incremento de P y la abrasión por cenizas volcánicas.

Hipótesis y Predicciones

H₁: El aporte de cenizas volcánicas a los cuerpos de agua incrementa las concentraciones P (disuelto), disminuyendo la limitación por P del biofilm e incrementando sus relaciones C:P. P₁: Los arroyos afectados con ceniza tienen una mayor concentración de P disuelto disponible, en consecuencia va a decrecer la actividad de fosfatasa alcalina y la relación C:P del biofilm.

H₂: La biomasa del biofilm aumentará al aumentar el P (disuelto) del arroyo. P₂: La concentración de clorofila a (µg / cm² de biofilm) aumentará en los arroyos afectados, por tener una mayor disponibilidad por P.

H₃: La abrasión y la fertilización por las cenizas tendrán efectos contrapuestos sobre la estructura tridimensional del biofilm.

P₃a: El efecto abrasivo provocará un mayor desprendimiento del biofilm generando una estructura tridimensional más plana.

P₃b: El efecto fertilizante incrementará la estructura tridimensional del biofilm.

Capítulo II

Relación entre los depósitos de tefra y los productores primarios en arroyos

Introducción

En las laderas de las montañas comienzan a formarse los arroyos por agua que fluye en superficie o subsuperficialmente. Estos pequeños ecosistemas se denominan arroyos de cabecera y pueden componer más del 80% de la longitud total del sistema de drenaje de una red fluvial (Richardson y Danehy 2007). Son ecosistemas biogeoquímicamente muy activos debido al fuerte contacto entre la atmósfera, las riberas y el lecho bentónico (Liu et al. 2008). Una característica hidromorfológica muy importante en este tipo de ecosistemas es el alto cociente entre el borde del arroyo y su área (Vannote et al. 1980). En consecuencia, estos ambientes acuáticos poseen una interacción alta con el medio terrestre circundante, siendo muy dependientes de los aportes de materia y energía provenientes del exterior. Las erupciones volcánicas explosivas perturban el agua y los flujos de sedimentos en las cuencas hidrográficas. Por otro lado, las tormentas y las inundaciones extraordinarias pueden actuar como agentes de disturbio alterando el hábitat físico y modificando la diversidad espacial. En regiones volcánicamente activas, el ingreso de material volcánico (tefra) al ambiente acuático afecta inmediatamente a las comunidades acuáticas, mientras que gran parte del material que cae lejos de las riveras es arrastrado por la escorrentía y el deshielo hacia los cursos de agua, teniendo un efecto tardío (Bisson 2005). En arroyos de montaña, los procesos de sedimentación y removilización de material son fenómenos usuales y no están vinculados necesariamente a eventos volcánicos, sino que son desencadenados en ocasiones por fuertes lluvias y/o eventos de deshielo. Los efectos adversos de estos fenómenos sobre la biota dependen tanto de la duración del disturbio como del transporte natural de las partículas (Shaw y Richardson 2001). Además, después de los efectos físicos iniciales, los procesos naturales post-eruptivos (es decir, avalanchas, lahares y el transporte fluvial) podrían producir (por meteorización mecánica) nuevas superficies frescas de los piroclastos, generando mayor cantidad de partículas de grano fino y mayor superficie de contacto para lixiviar elementos (Genareau et al. 2016). La concentración de nutrientes en los ríos y arroyos, N, C, pero principalmente P, y Fe está determinada en gran parte por la constitución geológica de la cuenca (Smith et al. 2001). En ambientes donde la cuenca es afectada por el vulcanismo, uno de los elementos responsable del efecto fertilizante tras la caída del material volcánico es el P y otro muy

estudiado en océanos es el Fe (Cap. I). El reciclado tanto de P como de Fe en los arroyos está íntimamente asociado con los microorganismos asentados en el lecho del arroyo (el biofilm) (Mulholland et al. 1994, Dodds 2003). Los productores primarios de los arroyos crecen embebidos en una matriz adherida al sustrato denominada biofilm. Esta matriz representa un ecosistema complejo, formado por bacterias heterótrofas, autótrofos, ciliados, todos incluidos en una trama de sustancias polisacáridas (Lock 1993). Estas comunidades ocupan la base de la cadena trófica y son fundamentales para la biogeoquímica de los ecosistemas lóticos de montaña al ser responsables de las mayores transformaciones de C, N y P que tienen lugar en un arroyo (Allan 1995). En particular, los arroyos andino-patagónicos se caracterizan por poseer bajas concentraciones de nutrientes (asociadas al origen ígneo del paisaje geológico). El bosque que rodea las cabeceras de los arroyos (en la Patagonia Norte por encima de los 1000 m snm) es monoespecífico de la especie caducifolia Nothofagus pumilio. Constituye un bosque cerrado y la biomasa de autótrofos suele ser baja (Buria et al. 2010). Aguas abajo están rodeados por bosques perennes de especies nativas tales como Nothofagus dombeyi y Austrocedrus chilensis y con un dosel más abierto que permite el desarrollo de un biofilm con mayor biomasa de autótrofos (Villanueva et al. 2010a). El área recibe aproximadamente 2000 mm año-1 de precipitaciones en forma de lluvia y nieve, siguiendo un régimen hidrológico bimodal con los máximos caudales durante el otoño y la primavera (por lluvia y deshielo, respectivamente) y los mínimos caudales durante el verano y el otoño temprano. En el área del Parque Nacional Nahuel Huapi se han determinado tres fuentes de material volcánico a partir del análisis de perfiles sedimentarios de diferentes lagos del PNHN: El complejo volcánico Puyehue-Cordón Caulle (CVPCC) y los volcanes Chaitén y Calbuco (Daga et al. 2008). Tras la erupción del CVPCC (Cap. I), y debido a la predominancia de vientos del cuadrante oeste, gran parte de la ceniza cayó en territorio argentino. La superficie del suelo de la cuenca del lago Nahuel Huapi se cubrió por depósitos de material volcánico, y en las zonas más cercanas al volcán la vegetación se tapó completamente (Ghermandi et al. 2015). Este nuevo suelo, dominado por material piroclástico, aportó al ambiente acuático nuevos materiales disueltos y particulados. La magnitud del impacto de este evento está en gran

medida relacionada con la cantidad y tipo de ceniza caída que está determinada por varios factores, como la cercanía al volcán (con gran incidencia en el tamaño de partículas, siendo mayores cuanto menor es la distancia al centro efusivo) y las características del viento (dirección e intensidad). Estos factores causaron que la capa depositada de cenizas no haya sido homogénea, siendo mayor (hasta 50 cm) en la localidad de Villa La Angostura (Gaitán et al. 2011). En relación con los ambientes acuáticos, los lagos más impactados fueron aquellos situados cerca del volcán en Argentina: los lagos Espejo y Correntoso, mientras que hacia el Norte o el Sur el impacto fue de menor magnitud (Modenutti et al. 2013). Además, durante el desarrollo de la presente tesis se produjo una nueva erupción del volcán Calbuco que afectó a la cuenca del lago Nahuel Huapi. Esta erupción fue mucho menor (0.27 km3) respecto al CVPCC (1,25 km3 de magma). En las cercanías a la ciudad de Bariloche, los depósitos encontrados consistían en una película delgada con un espesor máximo de 0,1- 1,0 mm, siendo mayor en el paso Cardenal Samoré y la ciudad de Villa La Angostura donde el espesor llegó a tener 0,5 cm (Romero et al. 2016). Este evento representó una oportunidad para estudiar el impacto inmediato del depósito de material volcánico en arroyos de cabecera en la cuenca del lago Nahuel Huapi.

OBJETIVO GENERAL

El objetivo general de este capítulo fue identificar los patrones ambientales que fueron afectados en los ecosistemas de arroyos tras la erupción del CVPCC (2011), y determinar si existe relación con la biomasa y composición de los productores primarios del biofilm.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Evaluar si la tefra presente en la cuenca aún libera P y Fe a los ambientes. 2. Caracterizar los parámetros fisicoquímicos de los arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi a lo largo de un gradiente de depositación de material piroclástico, y a lo largo de una cuenca cercana al volcán, para identificar patrones ambientales y temporales que se relacionen con los depósitos volcánicos. 3. Evaluar el efecto inmediato de los depósitos de la erupción del volcán Calbuco en los arroyos 4. Determinar si la biomasa y composición de las comunidades de los productores primarios del biofilm de los arroyos andinos responde a un gradiente ambiental generado por los depósitos del CVPCC.

Hipótesis y Predicciones

H1: La tefra continúa liberando P y Fe al ambiente acuático luego de cuatro años del evento.

P1: Al exponer tefra colectada del ambiente en agua destilada se lixiviarán elementos tales como P y Fe.

H2: Los arroyos andino-patagónicos más cercanos al CVPCC presentan diferentes condiciones fisicoquímicas (como son los sólidos totales en suspensión (STS), y

concentración de nutrientes) respecto a los arroyos más alejados, luego de 7 años de la erupción volcánica.

P2: Los ambientes más cercanos al CVPCC tendrán mayores concentraciones de material piroclástico, por lo tanto van a presentar mayores valores de STS y concentración de nutrientes como el P y el Fe, que los ambientes más alejados.

H3: La comunidad de productores primarios del biofilm responderá a las nuevas condiciones ambientales (profundidad de la capa de cenizas y condiciones fisicoquímicas) de los arroyos a lo largo del gradiente de depositación plasmado en su biomasa y composición de especies.

P3: Los arroyos más afectados tendrán una mayor biomasa y diferente proporción de grupos algales que aquellos ambientes no afectados por la tefra.

Las hipótesis fueron testeadas de la siguiente manera:

1. Mediante experimentos de lixiviación de tefra en laboratorio 2. Comparando el contenido de STS, PRS, Fe y COD en el agua de los arroyos a lo largo del gradiente de depositación en la cuenca del lago Nahuel Huapi. 3. Comparando el contenido de Chl-a y proporción de los grupos de productores primarios del biofilm de los arroyos a lo largo del gradiente de depositación en la cuenca del lago Nahuel Huapi.

Área de estudio

La erupción del CVPCC dispersó un gran volumen de tefra en un área amplia. Durante la fase climática inicial de la erupción (entre el 4 y 5 de junio), las columnas de 11–14 km de altura dispersaron la mayor parte de la tefra erupcionada hacia el este en dirección a la Argentina, llegando hasta el Océano Atlántico (Pistolesi et al. 2015). Teniendo en cuenta que la granulometría y el espesor de la tefra del CVPCC (Fig. 2.1) determinaron un gradiente en el sentido NO-SE (Cap. I) se seleccionaron 10 arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi con el objetivo de considerar la heterogeneidad espacial generada (Fig. 2.2, Tabla 2.1).

Fig. 2.1 Depósitos de material volcánico en la zona ribereña de un arroyo afectado por la erupción volcánica del Puyehue, fotografía tomada durante el muestreo de marzo de 2015.

Fig. 2.2 Ubicación del CVPCC, volcán Calbuco y los puntos de muestreo a lo largo de la Cuenca del lago Nahuel Huapi. a) Puyehue, b) Pantojo, c) Pereyra II, d) Pereyra I, e) Pireco, f) Totoral, g) La Estacada, h) Ragintuco, i) Goye y j) Casa de Piedra.

Todos descargan sus aguas en el lago Nahuel Huapi, salvo los A° Goye y Casa de Piedra que descargan sus aguas en el lago Moreno, el cual está conectado con el lago Nahuel Huapi. Los arroyos son de orden 3 con excepción del Pireco, que es de orden 4 y drenan sobre áreas prístinas, donde la única actividad humana es el senderismo. Los Arroyos Puyehue y Pantojo, muestreados por encima de los 1000m de altura snm, drenan un bosque de N. pumilio mientras que el resto fue muestreado en el bosque mixto de N. dombeyii y A. chilensis. Los arroyos Goye y Casa de Piedra fueron seleccionados en el extremo Este del gradiente, ya que estudios realizados antes y después de la erupción sobre estas cuencas indicaron que no hubo incrementos de STS, COD ni nutrientes luego de la erupción del CVPCC en 2011 (García 2016).

Tabla 2.1 Descripción de algunas características de las cuencas estudiadas: distancias al volcán, altura sobre el nivel del mar, orientación, área de la cuenca y número de orden de los arroyos muestreados. Distancia Altura sobre Área de N° de Arroyo Abreviatura al volcán el nivel del Orientación cuenca 2 orden (km) mar (m) (km ) Puyehue Puye 28,9 1193 SO-NE 7,7 3 Pantojo Pan 29,8 1174 SO-NE 9,5 3 Pereyra II Per. II 32,0 997 O-E 10 3 Pereyra I Per. I 34,2 917 NO-SE 32,6 3 Pireco Pco 35,4 817 NO-SE 73,7 4 Totoral Tot 37,4 800 NO-SE 57,7 3 La Estacada LE 63,0 793 N-S 53,0 3 Ragintuco Rco 65,0 786 N-S 46,3 3 Goye Go 82,4 838 SO-NE 32,9 3 Casa de CdP 89,4 853 SO-NE 62,7 3 Piedra

El lecho de los arroyos está dominado por una combinación de roca ígnea, volcánica y plutónica, compuesto principalmente por partículas de tamaño grava y guijarro (4 ≤ x ≤ 64 mm y 64 ≤ x ≤ 128 mm, respectivamente). También fueron abundantes sustratos de tamaño mayor (guijón = 128 ≤ x ≤ 256 mm y bloque = x ≥ 256 mm), mientras que en áreas deposicionales fueron comunes las acumulaciones de arena y grava, con depósitos de material volcánico en los intersticios entre las rocas de los arroyos de la margen Norte del

lago Nahuel Huapi (Fig. 2.3a). En el caso particular del arroyo Totoral, las cenizas volcánicas cubrieron el 100 % del lecho (Fig. 2.3b).

Fig. 2.3 Diferente grado de impacto en lechos de arroyos afectados por el volcán a) depósito de material volcánico entre los intersticios de las rocas en el arroyo Ragintuco, y b) lecho del arroyo Totoral completamente colmatado de material piroclástico. Año 2014.

Los datos pluviométricos utilizados en el análisis de resultados se obtuvieron de la página de la Autoridad Interjurisdiccional de las Cuencas (AIC) de los ríos Limay, Neuquén y Negro (http://www.aic.gov.ar/sitio/home), donde publican con periodicidad mensual la información de sus estaciones meteorológicas. Con el fin de tener datos de precipitaciones a lo largo de la cuenca del lago Nahuel Huapi, cercanos a los sitios de muestreo, se seleccionaron las estaciones meteorológicas de la AIC (Fig. 2.4): Cerro Mirador (A° Puyehue y A° Pantojo), El Rincón (A° Pireco y A° Totoral), Villa La Angostura (A° La Estacada y A° Ragintuco) y Bahía López (A° Goye y A° Casa de Piedra). En el caso de los puntos de muestreo sobre el A° Pereyra (I y II) se promediaron los valores de las precipitaciones de las estaciones Cerro Mirador y El Rincón.

Fig. 2.4 Estaciones meteorológicas de la AIC utilizadas para obtener los datos pluviométricos a lo largo de la cuenca del Lago Nahuel Huapi durante las fechas muestreadas. 1) Cerro Mirador, 2) El Rincón, 3) Villa La Angostura y 4) Bahía López.

Subcuenca del Pireco

Con el fin de analizar la variabilidad espacial a lo largo de una cuenca afectada por los depósitos volcánicos se seleccionó la subcuenca del Arroyo Pireco (Fig. 2.5). Está ubicada al Oeste del CVPCC, en la cuenca del lago Nahuel Huapi, sobre un basamento de origen piroclástico, con material no consolidado o de pobre diagenización denominada Formación Río Pireco (Laya 1977). Presenta un área total de 133,5 km2.

Fig. 2.5 Cuenca del Pireco, donde se observan los sitios de muestreo sobre los A° Puyehue, Pantojo, Pereyra (II y I) y Pireco.

Materiales y métodos

Experimento de lixiviación

Con el fin de determinar si la tefra es fuente de P y Fe para el ambiente, diseñamos un experimento de laboratorio en el que cuantificamos la liberación de estos elementos desde la tefra, cuatro años después de su depositación. Además, evaluamos si el efecto de la

molienda aumenta la lixiviación. Para evaluar el efecto de la molienda usamos dos tamaños de partículas: partículas grandes o “lapilli” (2.0 ± 0.1 cm de diámetro) y partículas pequeñas ó “ceniza” (<500 μm), obtenida al moler las de tamaño lapilli. El material volcánico se obtuvo de los depósitos que se encuentran en la rivera de los arroyos afectados. Las muestras se colectaron con una pala estéril excluyendo la capa superior de 4 cm para evitar la suciedad del suelo, y se transportaron al laboratorio en bolsas estériles plásticas. En el laboratorio el material piroclástico fue inmediatamente secado a 60 °C por 48 h. Luego, cuatro lapilli (2,0 ± 0,1 cm de diámetro) fueron molidas mecánicamente con un mortero manual y se tamizaron a través de un tamiz de 500-µm para obtener partículas de ceniza <500 µm (Fig. 2.6). La lixiviación se llevó a cabo añadiendo 1 g de partículas volcánicas (tamaño grande/pequeño para cada caso) a 250 ml de agua Milli Q en Erlenmeyer estériles (4 réplicas cada uno). Los Erlenmeyers se mantuvieron en agitación suave y continua en un agitador a 140 rpm en una incubadora a 15 °C. Las muestras para medir P y Fe fueron tomadas después de 24 h (Cronin et al. 1997), y luego de 48 h tal como sugiere Witham et al. (2005). El agua fue filtrada luego a través de un filtro GF/F de 0,7- μm de poro. El P fue determinado usando el método del ácido ascórbico (Eaton et al. 2005) y el Fe con el método de fenantrolina (Páscoa et al. 2009) (ver Procedimientos de laboratorio). Los resultados fueron expresados como μg P o Fe por g de ceniza.

Fig. 2.6 Experimento de laboratorio de lixiviación de P y Fe de material piroclástico.

Metodología de muestreo

Los arroyos fueron muestreados en siete ocasiones, durante los años 2014, 2015 y 2018 (Tabla 2.2). En todas las ocasiones, los arroyos se muestrearon por triplicado, en diferentes puntos de un mismo tramo del arroyo. De esta manera se obtuvieron registros que abarcaron tanto la variabilidad espacial como la temporal que muestran los arroyos, por un lado en épocas en condiciones de caudal alto y bajo (intraanuales), y por otro lado las variaciones interanuales. Además, los muestreos de marzo y abril del 2015 tuvieron la finalidad de evaluar el efecto de la erupción del volcán Calbuco, ocurrida el 22 de abril.

Tabla 2.2 Resumen de las fechas y los arroyos muestreados.

Arroyos Enero´14 Abril´14 Octubre´14 Marzo´15 Abril´15 Enero´18 Abril´18 (verano) (otoño) (primavera) (verano) (otoño) (verano) (otoño) Puyehue x x Pantojo x x Pereyra II x x x x x Pereyra I x x x x x x x Pireco x x x x x x x Totoral x x x x x La Estacada x x x x x x x Ragituco x x x x x x x Goye x x x x x x x Casa de x x x x x x x Piedra

En cada sitio de muestreo se midieron las siguientes variables: - profundidad de la capa de cenizas en la orilla de los arroyos con una regla. - turbidez como NTU (Unidad Nefelométrica de Turbidez) con un turbidímetro portátil (Lutron TU-2016, Taipei, Taiwan). - pH con un pHmetro (HANNA, HI8424). - conductividad, concentración de oxígeno y temperatura con una multisonda (YSI 85, Yellow Spring, Ohio).

- velocidad de corriente con correntímetro (GlobalWater, California, USA). - ancho y profundidad con una cinta métrica y regla. El caudal se calculó para dos fechas contrastantes, en la época de deshielo (Octubre de 2014) y a fines del verano (Marzo del 2015). El cálculo del caudal (Q) se realizó multiplicando el área de un corte transversal del arroyo (A) por la velocidad del agua (v) (Elosegi et al. 2009) (Fig. 2.7). Para obtener el área del corte transversal se tomaron medidas de profundidad a intervalos que variaron según el ancho máximo del arroyo, dividiendo el ancho en 10 partes iguales. En cada intervalo de profundidad se midió la velocidad de corriente y la profundidad. Para determinar el caudal de cada sección

(caudales parciales, Qn) se multiplicó su área parcial (An) por su velocidad de corriente (vn). Por último se sumaron los caudales parciales para obtener el caudal total.

Fig. 2.7 Esquema donde se representa como se ha calculado el caudal de los arroyos. Donde Q es el caudal total del arroyo y Q1, Q2, Q3 representan los caudales parciales.

Se tomaron muestras de agua para medir la concentración de sólidos totales en suspensión (STS) y de nutrientes, en contenedores plásticos de 2 L, previamente enjuagados con ácido diluido. Las muestras fueron inmediatamente transportadas con aislamiento térmico hasta el laboratorio. Para los muestreos del biofilm, se recogieron tres rocas (guijarros, de una superficie promedio aproximada de 90 ± 4 cm2) en cada sitio de muestreo de áreas de correderas, evitando la línea costera. Se almacenaron individualmente en bolsas de plástico que fueron transportadas hasta el laboratorio en condiciones de oscuridad en contenedores con

aislamiento térmico. En el caso del arroyo Totoral no se pudo proceder al muestreo del biofilm de rocas por estar completamente cubierto de arena volcánica (Fig. 2.3b).

Procedimientos de laboratorio

Elementos en el agua de los arroyos

Una parte de la muestra de agua de cada arroyo se utilizó para cuantificar la concentración de STS, filtrando 400 mL a través de filtros GF/F previamente muflados y pesados. Los filtros fueron secados durante 48 h a 80°C y pesados en balanza de precisión (± 0,01 mg). El peso seco (PS) de los sólidos fue calculado por la diferencia del peso del filtro antes y después de filtrar el agua. Para poder determinar qué proporción de los sólidos en suspensión era orgánica e inorgánica, los filtros con el material secado fueron muflados durante 1,5 h a 500°C y vueltos a pesar para obtener el peso de las cenizas (materia inorgánica). El agua filtrada fue utilizada para determinar las concentraciones de: - carbono orgánico disuelto (COD), con un analizador (Shimadzu TOC V-CSH) que quema las muestras a altas temperaturas, utilizando potasio hidrógeno ftalato como estándar. - fósforo reactivo soluble (PRS) con el método de reducción del complejo fosfomolíbdico con ácido ascórbico (APHA 2005) y medición espectrofotométrica. - hierro (Fe) fue medido como Fe+2. Para esta determinación se utilizó 1,10- fenantrolina, que forma un complejo rojo-anaranjado al unirse con el Fe+. Luego se cuantificó la concentración de Fe+2 utilizando un espectrofotómetro a 508 nm (Páscoa et al. 2009).

Muestras del biofilm

El biofilm se obtuvo al raspar rocas individuales con un cepillo y enjuagándolas cuidadosamente con agua Milli Q. La suspensión obtenida fue llevada a un volumen constante de 100 mL y se expresó en relación a las 2/3 partes de la superficie total de la 55

roca (cm2) (Biggs y Close, 1989), que fue estimada a partir de los ejes longitudinales x, y y z (Graham, 1987). El volumen obtenido se utilizó para la estimación de la concentración de clorofila a (Chl-a), y abundancia y composición de productores primarios. Se usó una submuestra de la suspensión para la extracción de Chl-a, usando etanol caliente al 90% (Nusch 1980). Las lecturas espectrofotométricas se llevaron a cabo a 665 nm y 750 nm. Las correcciones para la feofitina se realizaron por acidificación con HCl. Para el análisis de la composición de productores primarios, se fijó una submuestra (10 ml) de la suspensión con solución ácida de Lugol. Las identificaciones se realizaron bajo el microscopio (Olympus BX50) a 1000x cuando fue necesario, hasta el nivel de género cuando fue posible. La bibliografía consultada para la identificación de las diatomeas fue Krammer y Lange-Bertalot (1986 ), (Krammer y Lange-Bertalot 1988, 1991a, 1991b), Díaz Villanueva y Maidana (1999) y Maidana y Díaz Villanueva (2001) además del sitio web AlgaeBase (Guiry y Guiry 2019). Para las cianobacterias seguimos a Komárek y Anagnostidis (1989, 1998, 2005), Komárek et al. (2013), Díaz (1993) y Wenzel (2008). Para las determinaciones de la abundancia de productores primarios, se examinaron tres alícuotas en una cámara tipo sedgwick Rafter con 20 µL de volumen total bajo un microscopio directo (Olympus BX50) a 400x y se obtuvieron al menos 60 imágenes aleatorias de cada alícuota con una cámara digital (Olympus DP 70), se promediaron las tres alícuotas, expresando las abundancias como número de células por cm2.

Análisis de los datos

Para el experimento de liberación de P y Fe desde la tefra se realizaron análisis estadísticos utilizando el software SPSS 18 y SigmaStat versión 12.5 (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.). Las diferencias estadísticas entre las concentraciones de P y de Fe en los lixiviados de material volcánico se evaluaron utilizando Análisis de Varianza de una vía con medidas repetidas (RM-ANOVA). El factor entre-sujeto fue el tamaño de partícula (Pequeño y Grande) y como el factor intra- sujeto se utilizó el tiempo de lixiviado (24 h y 48 h).

Para el análisis completo de los arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi se realizaron cinco tipos de análisis de los datos: a) Análisis completo de los datos obtenidos en todas las fechas de muestreo: se comparan los arroyos de la cuenca teniendo en cuenta tanto las variaciones intraanuales como interanuales b) Análisis de la variación intraanual se comparan los arroyos en dos momentos dentro del mismo año con caudales contrastantes: bajo caudal a principios del otoño (abril de 2014) versus alto caudal en primavera, luego del comienzo del deshielo (octubre de 2014) con el fin de evaluar cómo influyen las variaciones del caudal en los efectos de los depósitos volcánicos c) Análisis de la variación interanual se comparan los arroyos en un mismo momento del año (abril, bajo caudal) en tres años (2014, 2015 y 2018) con el objeto de establecer si a lo largo de los años se observa una recuperación de los sistemas más afectados por el volcán d) Efecto de una erupción reciente. Inmediatamente después de la erupción del volcán Calbuco (abril de 2015) se realizó un muestreo para observar la respuesta de los arroyos, y compararlo con el muestreo realizado antes de la erupción (marzo de 2015). e) Análisis a nivel de cuenca, La subcuenca del arroyo Pireco, la más cercana al volcán (Fig. 2.1), fue muestreada en cinco sitios: Arroyos Puyehue, Pantojo, Pereyra (II y I) y Pireco (Fig. 2.2) en dos fechas, ambas en bajo caudal (en enero y en abril de 2018), con el fin de comparar las variaciones de los parámetros fisicoquímicos a lo largo de la cuenca y sus efectos sobre los productores primarios. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 18 y SigmaStat versión 12.5 (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.). Las diferencias estadísticas de los parámetros fisicoquímicos medidos a campo (capa de cenizas, turbidez, pH, conductividad, O2, temperatura, velocidad, ancho, caudal) se testearon con un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía cuando había normalidad ó un test no paramétrico de Kruskal-Wallis cuando fallaba la normalidad. Por lo contrario, los parámetros medidos en laboratorio (STS y nutrientes de los arroyos) se testearon a través de un análisis de la covarianza (ANCOVA) ya que se incorporó la precipitación media mensual como covarianza. Se realizaron todas las comparaciones múltiples por pares con el método de

Dunn´s. Además se realizaron correlaciones entre los valores de STS y el resto de variables de los arroyos utilizando el coeficiente de Pearson. Para identificar las variaciones intraanuales e interanuales se realizaron ANCOVA utilizando el software SPSS. Para todos los casos, se consideraron como factores fijos "Arroyo" (con seis niveles: Pereyra II, Pireco, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra) y "Mes": con dos niveles en las variaciones intraanuales (abril.2014 y octubre.2014), con tres niveles en las variaciones interanuales (abril.2014, abril.2015 y abril.2018). Donde los factores del arroyo que se consideraron variables respuesta fueron: STS, PRS, Fe y COD, y del biofilm se utilizó la Clorofila a (estimación de la biomasa algal) como variable respuesta. Las concentraciones de STS, Fe, PRS fueron previamente transformadas a log10 para normalizarlos. Para testear las variaciones antes-después del Calbuco se realizó un ANOVA de dos vías con un factor “antes/después” y el otro factor “Arroyo” donde se comparan las variables a estudiar por medio de los tratamientos Antes y Después de un evento de impacto (erupción del volcán Calbuco) y a la vez se lo comparan varios sitios a lo largo del gradiente de impacto. El factor temporal con dos niveles Antes (marzo.2015) y Después (abril.2015); y el Factor espacial “Arroyos” (Pereyra I y II, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra). Donde los factores del arroyo que se consideraron variables respuesta fueron: STS, PRS, Fe y COD, y del biofilm se utilizó la Clorofila a como variable respuesta. Las concentraciones de STS, Fe, PRS fueron previamente transformadas a log10 para normalizarlos. Para analizar la cueca del Pireco se utilizó un ANOVA de dos vías. Para todos los análisis a posteriori se usaron las pruebas de Holm-Sidak para comparar los efectos principales. Estos contrastes se basan en las comparaciones pareadas linealmente independientes entre las medias marginales estimadas.

Resultados

Liberación de P y Fe desde la tefra

Los experimentos de lixiviado de cenizas mostraron que las partículas pequeñas (ceniza) liberaron tres veces más de P y diez veces más de Fe que las partículas grandes (lapilli), después de 24 h y 48 h (ANOVA RM de una vía, sin interacción para el P,

Ptamaño=0.018 y Ptiempo<0.001 y con interacción para el Fe, Pinteracción<0,001; Fig. 2.8a y b). Estos resultados muestran que después de cuatro años desde la erupción, las partículas aún liberan P y Fe y que la molienda mecánica aumenta efectivamente la liberación de estos nutrientes.

6 a) P Grande 5 Pequeño )

-1 4

P (µg g ceniza 2

0 0.025 b) Fe

0.020 ) -1

0.015

0.010 Fe (mg g ceniza

0.005

0.000 24hs 48hs

Fig. 2.8 Concentración de fósforo (a) y hierro (b) liberado por los dos tamaños diferentes de partículas volcánicas (grandes y pequeñas) después de 24 hs y 48 hs en el experimento de lixiviación. Las barras de error representan ± estándar error.

Análisis completo de los arroyos de la cuenca del lago Nahuel Huapi

Parámetros medidos a campo

El espesor de la capa de depósitos volcánicos hallado en las zonas ribereñas no mostró un gradiente correspondiente a la distancia al volcán sino que los mayores valores se

hallaron en los arroyos Pireco y Totoral, a 35 y 37 km del mismo (Tabla 2.3). Comparando los rangos de valores de los parámetros fisicoquímicos de los arroyos muestreados durante diferentes momentos del año y en distintos años, se observó que, además de diferenciarse por sus dimensiones y caudales (mayores en los arroyos Pireco, Totoral y Casa de Piedra), se diferenciaron por su turbidez, mayor en el rio Totoral y mucho menor en los arroyos Goye y Casa de Piedra (Tabla 2.3). Las temperaturas fueron levemente más bajas en los arroyos Pereyra I y II, probablemente por tener mayor altura sobre el nivel del mar (Tabla 2.1). El resto de las características se mantuvo dentro de rangos similares.

Tabla 2.3 Valores máximos y mínimos de los parámetros fisicoquímicos de los arroyos muestreados. Capa de Turbidez Conductividad O Temperatura Velocidad Ancho Q Arroyo cenizas pH 2 (NTU) (μS cm−1) (mg L-1) (°C) (cm s-1) (m) (l s-1) (cm) Max 7,5 40,0 8,0 240,3 Puyehue 40 10,7 16,7 Min 3,1 Max 7,6 46,0 7,0 644 Pantojo 24 14,4 17,0 Min 3,7

Max 4,4 7,9 74,7 6,6 606,5 Pereyra II 12 7,0 22,7 18,0 Min 0,6 3,8 17,7 6,0 55,4 Max 4,7 7,8 43,3 9,0 647,1 Pereyra I 20 7,2 50,5 11,5 Min 4,3 4,5 12,8 7,2 200,1 Max 8,9 11,5 100,3 30,0 4105,2 Pireco 43 6,9 36,4 12,2 Min 0,6 5,3 24,7 10,0 681,2 Max 25,6 15,1 100,3 25,0 3655,7 Totoral 40 7,2 51,0 10,4 Min 1,6 9,0 30,0 6,0 476,7 La Max 5,6 12,5 68,0 15,0 2725,9 12 7,5 53,0 11,7 Estacada Min 3,2 5,0 27,0 8,4 328,8 Max 5,6 13,8 93,0 10,0 1784,6 Ragintuco 10 7,8 46,3 11,7 Min 2,9 5,2 14,4 5,0 218,8

Capa de Turbidez Conductividad O Temperatura Velocidad Ancho Q Arroyo cenizas pH 2 (NTU) (μS cm−1) (mg L-1) (°C) (cm s-1) (m) (l s-1) (cm) Max 1,6 10,6 56,5 11,8 3536,5 Goye 0 7,5 37,0 12,4 Min 0,0 4,7 22,0 5,0 416,9

Casa de Max 1,5 11,5 61,0 24,0 7766,0 0 7,4 42,4 12,0 Piedra Min 0,0 5,1 23,7 9,0 512,4

Parámetros medidos en laboratorio

Sólidos en suspensión y nutrientes

Analizando los datos de todos los arroyos estudiados y teniendo en cuenta todas las fechas de muestreo, se hallaron diferencias significativas en las concentraciones de STS, PRS y Fe (Fig. 2.9a, b y c; P=<0.001) y no en las de COD (Fig. 2.9d; P=0,112; respectivamente). Además, se hallaron correlaciones significativas entre las concentraciones de STS y las demás variables: PRS, Fe y COD (P<0,001; P<0,001 y P<0,001 respectivamente). Los arroyos Goye y Casa de Piedra, más alejados del volcán y que actualmente no poseen capa de cenizas en sus cuencas, presentaron valores de STS menores que el Totoral (Fig. 2.9a; P<0.05). Las concentraciones de PRS fueron mayores en los arroyos Pereyra I, Pereyra II y Pireco que en los dos arroyos no afectados por ceniza (Goye y Casa de Piedra) (Fig. 2.9b). El Fe fue mayor en los arroyos Totoral y Pireco que en los arroyos Goye y Casa de Piedra, mientras que los arroyos Pereyra, La Estacada y Ragintuco, con valores intermedios, sólo se diferenciaron significativamente del Totoral (Fig. 2.9c). Finalmente, el COD no mostró deferencias significativas entre los arroyos (Fig. 2.9d; P=0,112 y P=0.134 respectivamente), aunque sí se observó que los valores más altos se encontraron en los arroyos afectados.

50 a a a) c)

40 40 ) ) -1 30 30 -1

ab 20 20 PRS (µg L (µg PRS STS (mg L (mg STS ab a ab ab a ab ab 10 10 ab ab b b b b 400 0 d)Per. II Per. I Pco Tot LE Rco Go CdP 35 b) a

30 ab 1.5 ) )

25 -1 -1 bc 20 1.0

bc Fe (µg L Fe 15 COD (mg L (mg COD bc bc 10 c c 0.5

0 0.0 Per. II Per. I Pco Tot LE Rco Go CdP Per II Per I Pco Tot LE Rco Go CdP

Fig. 2.9 a. Variables medidas en los arroyos muestreados: Pereyra II y I, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra, en enero, abril y octubre de 2014, marzo y abril de 2015 y abril de 2018, a. Concentración de sólidos totales en suspensión (STS), b. Concentración de Hierro (Fe), c. Concentración de fósforo reactivo soluble (PRS) y d. Concentración de carbono orgánico disuelto (COD).

El arroyo Totoral tiene concentraciones de STS y Fe mucho mayores al resto de los arroyos. Este arroyo presenta varias diferencias con los otros, principalmente por tratarse de un arroyo que drena un lago. Se encuentra completamente modificado por la erupción del volcán, presentando su lecho colmatado de cenizas volcánicas, su rivera completamente modificada tanto por vegetación muerta seca en pie como así también suelo y vegetación atrapada debajo de los depósitos (Fig. 2.10). Esto indicaría que este es el arroyo más afectado por la erupción volcánica de los arroyos analizados en la presente tesis.

Fig. 2.10 Fotografía de la zona ribereña del arroyo Totoral afectada por los depósitos del volcán Puyehue 4 años después de la erupción.

Por otro lado, el arroyo Pereyra I se diferenció por ser el de mayor contenido de PRS. Esto podría deberse a que este arroyo es el único que deriva de una mallín ubicado a 0,8 km aguas arriba del sitio de muestreo. Por estas razones consideramos que los arroyos Totoral y Pereyra I no son comparables con el resto y decidimos excluirlos de las comparaciones. Al realizar los análisis estadísticos excluyendo los arroyos Pereyra I y Totoral, se observan diferencias significativas entre los valores medianos de las concentraciones de PRS (P<0,001), menores en los arroyos Goye y Casa de Piedra (no afectados por las cenizas) que en los arroyos Pereyra II, Pireco, La Estacada y Ragintuco (afectados por las cenizas). Las demás variables no resultaron consistentemente diferentes entre afectados y no afectados.

Biofilm

La biomasa de los productores primarios estimada como concentración de clorofila fue enormemente variable si tenemos en consideración todas las fechas de muestreo (Fig. 2.11) y no se encontraron diferencias significativas en este nivel de análisis entre los arroyos muestreados (P= 0,960).

)) 2 -2

ln (Clorofila a (µg cm (µg a (Clorofila ln -1

-2

-3 Per. II Per. I Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.11 Diagrama de caja de las concentraciones de Chl-a de los arroyos muestreados teniendo en cuenta todas las fechas de muestreo.

Sin embargo, respecto a las abundancias de los diferentes grupos algales (Fig. 2.12), al hacer el promedio de todas las fechas de muestreo podemos observar que el grupo algal dominante dependió del arroyo observado (interacción, P=0,038, F=2,00), si bien la tendencia fue que en los ambientes afectados por tefra predominaron las cianobacterias (siendo en todos los casos cercanos o mayores al 80 % de su abundancia), estas fueron significativamente dominantes respecto a las diatomeas y clorofitas en los arroyos La Estacada (P=0,040 y P=0,027 respectivamente) y Ragintuco (P<0,001 y P<0,001 respectivamente). En cambio, en los ambientes no afectados, si bien las cianobacterias siguen siendo mayoritarias se observó una mayor proporción de diatomeas y clorofitas (casi ausentes en los ambientes afectados).

100 CIANO ) DIATO -2 CLORO 80

20 Abundancia algal (N° de células cm

0 Per.II Per.I Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.12 Promedios de las abundancias relativas de todas las fechas muestreadas a lo largo de los arroyos estudiados. Se observan los tres grupos algales encontrados.

Variación intra-anual

Sólidos en suspensión y nutrientes

Tanto las concentraciones de STS como de nutrientes (PRS, Fe y COD) difirieron entre los arroyos dependiendo del momento de muestreo (Tabla 2.4). Las mayores concentraciones de STS se hallaron en abril en los arroyos Pireco, La Estacada y Ragintuco, los tres en la zona más afectada por el volcán (a posteriori, P<0,05), mientras que durante octubre las diferencias disminuyeron y no fueron significativas (Fig. 2.13a). De manera similar, la concentración de PRS fue mayor en abril, en el arroyo La Estacada, seguido por los demás arroyos ubicados en la zona más afectada, y menor en los arroyos Goye y Casa de Piedra (a posteriori, P<0,05, Fig 2.13b). La concentración de Fe en abril también fue menor en los arroyos no afectados, con los mayores valores alcanzados en el arroyo Pireco, seguido por los demás arroyos afectados (a posteriori, P<0,05, Fig. 2.13c).

Por otro lado, la concentración de COD fue mayor en los arroyos afectados que en los no afectados en los dos muestreos (Fig. 2.13d; a posteriori, P<0.05).

Fig. 2.13 Variables medidas en los arroyos muestreados: Pereyra II, Pireco, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra, en abril de 2014 (época de precipitaciones) y octubre de 2014 (época de deshielo). Concentraciones de: a. sólidos totales en suspensión (STS), b. fósforo reactivo soluble (PRS), c. Hierro (Fe) y d. carbono orgánico disuelto (COD) en los arroyos muestreados. Las barras indican 1 error estándar.

Tabla 2.4 Resultados del ANOVA de dos vías para las concentraciones de STS, PRS, Fe y COD en los arroyos muestreados y las fechas analizadas en cada uno. Mes* Arroyo Mes x Arroyo Variables F P F P F P STS 18.187 <0.001 13.297 0.001 4.017 0.009 PRS 630.626 <0.001 265.323 <0.001 179.269 <0.001 Fe 771.429 <0.001 269.01 <0.001 187.943 <0.001 COD 14.49 0.013 111.628 <0.001 20.781 <0.001

Biofilm

La concentración de clorofila difirió entre los arroyos dependiendo del momento de muestreo (Tabla 2.5), siendo mayor en octubre respecto a abril en los arroyos Pereyra II, Pireco y Goye (Fig. 2.14, a posteriori, P<0.01, P<0.01 y P=0,015 respectivamente) menos en La Estacada, Ragintuco y Casa de Piedra.

Abril.14 5 Octubre.14 )

-2 4 (µg cm

a 3

2 Clorofila

0 Per. II Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.14 Concentración de clorofila en el biofilm en los arroyos muestreados en abril.14 y octubre.14.

Tabla 2.5 Resultados del ANOVA de dos vías para las concentraciones de Chl-a en los arroyos muestreados y las fechas analizadas en cada uno. # En el caso del “Análisis Intraanual” este factor es Mes no Año. Precipitación Año # Arroyo Año x Arroyo Análisis F P F P F P F P Intraanual 126,84 <0,001** 24,19 <0,001** 49,93 <0.001** Interanual 0,10 0,755 4,21 0.023* 0,54 0,741 1,42 0,212

Precipitación Año # Arroyo Año x Arroyo Análisis F P F P F P F P Comparación Antes y 0.03 0.865 11.59 <0.001** 10.72 <0.001** Después del Calbuco Cuenca del 116.60 <0.001** 15.67 <0.001** 0.99 0.434 Arroyo Pireco

Variación inter-anual

Sólidos en suspensión y nutrientes

Los muestreos realizados en abril en tres años diferentes mostraron que las diferencias entre los arroyos variaron en el tiempo (Tabla 2.6, Fig. 2.15). Aunque los STS fueron siempre mayores en los arroyos afectados respecto a los no afectados, en abril.14 y abril.18 tuvieron los valores más altos en Pireco, La Estacada y Ragintuco. Por otra parte, los STS en los arroyos no afectados (Goye y Casa de Piedra) se mantuvieron constantes en los tres años muestreados (Fig. 2.15a). La concentración de PRS en los arroyos también varió según el año (Tabla 2.6, Fig. 2.15b) siendo diferente cada año en los arroyos afectados, pero se mantuvo constante en los arroyos Goye y Casa de Piedra y significativamente menor que en todos los arroyos afectados. Aunque no se cuenta con datos de concentración de Fe ni COD durante el año 2018 la comparación entre los años 2014 y 2015 muestra que diferencia entre los arroyos dependió del año muestreado (Tabla 2.6, Fig. 2.15c). En abril.14 la concentración de Fe fue mayor en los arroyos afectados, mientras que en abril.15 la diferencia solo se mantuvo con el arroyo Pireco, que presentó mayores concentraciones que todos los demás arroyos muestreados. Las diferencias en las concentraciones de COD entre los arroyos dependió de la fecha muestreada (Tabla 2.6, Fig. 2.15d), fueron siempre mayores en los arroyos afectados (Pereyra II, Pireco, La Estacada y Ragintuco) respecto a los no afectados (Goye y Casa de Piedra) siendo aún más marcadas en el año 2014 que en el año 2015.

Estas diferencias coincidieron con el hecho de que en el año 2015 las precipitaciones fueron casi la mitad que en los otros dos años comparados (Fig. 2.15e). Las diferencias en las precipitaciones parecen marcar las diferencias entre STS y PRS encontradas, más que el efecto anual en si (como tiempo transcurrido luego de la erupción). A la vez sigue viéndose el gradiente espacial, ya que los sitios más alejados presentan menores concentraciones de las variables.

25 30 a) b) abril.14 abril.15 25 20 abril.18

20 ) ) -1 15 -1

10 PRS (µg L (µg PRS STS (mg L (mg STS 10

5 5

0 0 Per. II Pco LE Rco Go CdP Per. II Pco LE Rco Go CdP 30 c) d)

1.5 ) ) -1

-1 20

1.0 Fe (µg L Fe COD (mg L (mg COD 10 0.5

0 0.0 Per. II Pco LE Rco Go CdP Per II Pco LE Rco Go CdP

400 e) pp.abril.14 pp.abril.15 300 pp.abril.18

200 Precipitaciones (mm) 100

0 Per. II Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.15 Variables medidas en los arroyos muestreados: Pereyra II, Pireco, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra, en abril de 2014, 2015 y 2018 expresado con puntos. Concentraciones de: a. sólidos totales en suspensión (STS), b. fósforo reactivo soluble (PRS), c. Hierro (Fe), d. carbono orgánico disuelto (COD) en los arroyos muestreados y e) Registro de precipitaciones de las estaciones seleccionadas durante las fechas muestreadas. Las barras indican 1 error estándar.

Tabla 2.6 Resultados del ANOVA de dos vías para las concentraciones de STS, PRS, Fe Y COD en los arroyos muestreados y las fechas analizadas en cada uno, donde la precipitación es la covariable. Precipitación Año Arroyo Año x Arroyo Variables F P F P F P F P STS 1,52 0,236 2,14 0,132 63,09 <0,001** 8,03 <0,001** PRS 1,57 0,227 225,40 <0,001** 223,68 <0,001** 83,34 <0,001** Fe 2,14 0,171 2,02 0,183 48,67 <0,001** 5,17 0,011* COD 2,55 0,124 4,32 0,049* 9861,87 <0,001** 4062,74 <0,001**

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La concentración de clorofila no difirió entre los arroyos de acuerdo a su grado de impacto, las diferencias de la clorofila dependieron del año de muestreo (Tabla 2.5). Los mayores valores correspondieron al año 2015 (Fig. 2.16), lo cual coincidió con menores precipitaciones.

100

Abril.14 Abril.15 Abril.18 ) 10 -2

log-Clorofila a (µg cm a log-Clorofila 0.1

0.01 Per. II Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.16 Concentración de clorofila en el biofilm en los arroyos muestreados entre los meses abril.14, abril.15 y abril.18.

Calbuco: antes y después de su erupción

Sólidos en suspensión y nutrientes

Luego de la erupción del volcán Calbuco, se observó que los STS se incrementaron hasta 6 veces en los arroyos ubicados en el Oeste del gradiente, mientras que en los arroyos Goye y Casa de Piedra no hubo modificaciones (Fig. 2.17a; Tabla 2.7). Sólo fueron significativas las diferencias entre el antes y el después en los ambientes afectados (a posteriori, P<0,001), y los ambientes afectados y no afectados se diferenciaron luego del impacto del volcán Calbuco. Sin embargo, las concentraciones de PRS y de Fe no se vieron afectadas por la erupción del Calbuco (Fig. 2.17b y c; Tabla 2.7). En cambio, las concentraciones de COD sí fueron mayores después de la erupción del volcán (Fig. 2.17d; Tabla 2.7) en los arroyos afectados.

50 40 a) b) Antes Después 40 30 ) ) -1 30 -1

20 20 PRS (µg L (µg PRS STS (mg L (mg STS

10 10

0 0 c) d)d)Per. II Per. I Pco Tot LE Rco Go CdP 30 1.0

0.8 ) ) -1

-1 20 0.6 Fe (µg L Fe

0.4 L (mg COD 10

0.2

0 0.0 Per. II Per. I Pco Tot LE Rco Go CdP Per II Per I Pco Tot LE Rco Go CdP

Fig. 2.17 Variables medidas en los arroyos muestreados: Pereyra II y I, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra antes (Marzo de 2015) y después (Abril de 2015) de la erupción del volcán Calbuco. Concentraciones de: a. sólidos totales en suspensión (STS), b. Hierro (Fe), c. fósforo reactivo soluble (PRS) y d. carbono orgánico disuelto (COD) en los arroyos muestreados.

Tabla 2.7 Resultados del ANOVA de dos vías para las concentraciones de STS, PRS, Fe Y COD en los arroyos muestreados y las fechas analizadas en cada uno. Mes Arroyo Mes x Arroyo Variables F P F P F P STS 93,99 <0,001** 39,79 <0,001** 23,65 <0,001** PRS 4,18 0,058 404,41 <0,001** 3,96 0,011* Fe 1,67 0,214 67,10 <0,001** 7,92 <0,001** COD 1261,95 <0,001** 400,89 <0,001** 333,25 <0,001**

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La concentración de Chl-a tuvo un patrón muy marcado por la caída de cenizas tras la erupción del Calbuco. La interacción entre el factor temporal (Antes-Después) con el factor Arroyo (Pereyra II y I, Pireco, Totoral, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra) fue significativa (Tabla 2.5). También lo fue la interacción para las variables informadas en la Tabla 2.7. En aquellos arroyos afectados por las cenizas, la concentración de Chl-a decayó tras la erupción. En cambio, en los arroyos no afectados por las cenizas hubo un incremento de la concentración de Chl-a luego de la erupción (Fig. 2.18).

Antes 60 Después

) 50 -2

Clorofila a (µg cm 20

0 Per. II Per. I Pco LE Rco Go CdP

Fig. 2.18 Concentraciones de clorofila a en los arroyos muestreados: Pereyra I y II, Pireco, La Estacada, Ragintuco, Goye y Casa de Piedra antes (Marzo de 2015) y después (Abril de 2015) de la erupción del volcán Calbuco.

Análisis de cuenca: Pireco

Sólidos en suspensión y nutrientes

Si bien no se pudo obtener réplicas de los STS en los muestreos realizados a lo largo de la cuenca del Pireco, se observó un patrón muy claro, en el cual los STS se mantuvieron constantes en el muestreo de Enero.18 (con precipitaciones de 58-25 mm) mientras que fueron incrementándose aguas abajo en los muestreos de Abril.18 (con precipitaciones de 410-350 mm) (Fig. 2.19a). En cambio, no se obtuvo un patrón longitudinal en las concentraciones de PRS, aunque igualmente se observó una influencia temporal en la diferenciación de los arroyos (interacción, P<0,001, F=1044,84).

20 35

18 a) b) 30 Enero.18 16 Abril.18 14 25 ) ) -1 12 -1 20 10 15 8 PRS (µg L (µg PRS STS (mg L (mg STS

6 10

4 5 2

0 0 Puye Pan Per. II Per. I Pco Puye Pan Per. II Per. I Pco

500

c) pp.enero.18 pp.abril.18 400

300

200 Precipitaciones (mm)

100

0 Puye Pan Per. II Per. I Pco

Fig. 2.19 a. Concentraciones de STS, b. PRS en los arroyos de la cuenca del Pireco: Puyehue, Pantojo, Pereyra I y II y Pireco en los meses de enero de 2018 y Abril de 2018 y d) Registro de precipitaciones de las estaciones seleccionadas durante las fechas muestreadas. Las barras indican 1 error estándar.

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La concentración de Chl-a mostró un incremento río abajo en la cuenca del Pireco (P<0,001), independientemente de la fecha de muestreo (interacción, P=0,434), y fue

mayor en enero que en abril (P<0,001). Las mayores concentraciones se encontraron en el Pireco (orden 4) y fueron mayores en el Pereyra I que en el Puyehue (Fig. 2.20). Al comparar la concentración de clorofila a con la concentración de STS se encontró una correlación altamente significativa entre ambos parámetros y positiva (r2=0,978, n=5 , P=0,004)

100 Enero.18 Abril.18

) 10 -2

log-Clorofila a (µg cm a log-Clorofila 0.1

0.01 Puyehue Pantojo Per. II Per. I Pco

Fig. 2.20 Concentración de clorofila a lo largo de la cuenca del arroyo Pireco en enero y abril del año 2018.

Discusión

Los resultados obtenidos del estudio de parámetros fisicoquímicos en arroyos ubicados a distancias crecientes del CVPCC mostraron que siete años después de la erupción volcánica, los arroyos de cabecera que fueron originalmente más afectados (aquellos más cercanos al volcán) contienen más sólidos en suspensión y mayores concentraciones de P y

Fe en el agua que arroyos más alejados. Aunque es importante destacar que observamos que la distancia al volcán no es el principal factor a tener en cuenta para determinar el grado de impacto de un determinado sector, sino la profundidad de la capa de ceniza, la concentración de sólidos totales en suspensión ó la concentración de elementos en el sistema acuático. Esto también fue observado por Lallement et al (2016). Por su parte, el experimento de lixiviación de cenizas permitió demostrar que el material presente cuatro años después de la erupción, en las cuencas afectadas por el volcán, aún liberan P y Fe, particularmente si las rocas están sujetas a la molienda mecánica, confirmando así nuestras dos primeras predicciones. Por lo tanto, los depósitos volcánicos en las cuencas pueden representar una fuente importante de sólidos y nutrientes que se introducen a los ambientes acuáticos varios años después de la erupción. Las precipitaciones no sólo son responsables de la movilización de depósitos volcánicos hacia el agua (Bisson 2005), sino que también aumenta las tasas de meteorización química. Shkinev et al. (2016) encontraron que el 15% de P de la ceniza fresca del CVPCC depositada sobre las superficies terrestres, se perdió después de la primera lluvia. Pero el material volcánico puede seguir liberando P, ya que la molienda mecánica de la piedra pómez introduce nutrientes en el agua con implicaciones importantes para los ciclos químicos (Genareau et al. 2016). Una vez que la ceniza volcánica ingresa a un cuerpo de agua, libera iones y elementos de acuerdo con su constante de equilibrio de adsorción/desorción, y estos iones se vuelven disponibles para los productores primarios (Frogner et al. 2001). La ceniza prístina (no meteorizada) emitida por el CVPCC liberó 90 μg de P por gramo de ceniza (Modenutti et al. 2013). En el presente capítulo hemos demostrado que después de cuatro años de intemperie, este material volcánico continuó liberando P, y esta lixiviación aumenta con la molienda mecánica, probablemente como resultado de la exposición de nuevas superficies frescas de las partículas. La diversidad de las comunidades depende de múltiples factores, como son las condiciones climáticas, así como los factores históricos y biogeográficos. Las variaciones espaciales y temporales en la composición de la comunidad también están influenciadas por perturbaciones ecológicas. Luego de una perturbación, la biota recoloniza desde aguas arriba y así se recupera fácilmente en los tramos afectados, aunque el éxito depende de los organismos y de la red de drenaje (Resh et al. 1988). Por un lado, la perturbación puede

crear nuevas oportunidades para la colonización de especies (aumentando la diversidad de especies) (Hutchinson 1953, Townsend et al. 1997, Hawkins et al. 2015) aunque también puede excluir especies que carecen de las adaptaciones a las nuevas condiciones (Death 2002). Los efectos del ingreso de material piroclástico a los cuerpos de agua sobre los productores primarios son diversos (Cap. I). En particular, los efectos del CVPCC sobre los lagos afectados fue un aumento de la biomasa de autótrofos planctónicos, por disminución de la fotoinhibición (Modenutti et al. 2013). En el biofilm de los arroyos, luego de 4 y 7 años de la erupción, la biomasa de productores primarios no presentó un patrón claro que muestre diferencias entre los arroyos más cercanos al volcán y los más alejados (Fig. 2.11), sino que se vio muy afectada por diferencias de caudal. Esto rechaza parte de la tercera hipótesis, en cuanto al efecto sobre la biomasa de productores primarios. Sin embargo, encontramos claros efectos en la composición taxonómica, con predominio de cianobacterias en los ambientes afectados (Fig. 2.12). Este resultado coincide con lo hallado luego de la erupción del Mt. Santa Helena en ambientes lóticos (Cushing y Smith 1982), relacionado con que los niveles de N permanecieron bajos mientras el P, Fe se incrementaron, y por lo tanto la capacidad de fijar N2 atmosférico fue crucial (Baross et al. 1982, Ward et al. 1983). Por otro lado, en lagos se observó un incremento en la abundancia de Cryptophyceae en aquellos lagos más cercanos al CVPCC y tanto de Cryptophyceae como de diatomeas en el LNH (Modenutti et al. 2013). Sin embargo, En regiones volcánicamente activas, la actividad pasada de un volcán influye sobre los patrones de cambio de su entorno y afecta las respuestas biofísicas ante nuevos eventos de perturbación. Así, la historia ecológica del área local y su contexto regional determinan el conjunto de especies disponibles para colonizar un área perturbada, las capacidades de esas especies para responder a la perturbación y la variedad de tipos de hábitats disponibles para el desarrollo ecológico posterior al disturbio (Swanson et al. 2005). Posiblemente las erupciones volcánicas estén marcando una heterogeneidad espacial en los arroyos de la cuenca del LHN. Las variaciones anuales e interanuales propias de los ecosistemas de arroyos muchas veces solapan los cambios que pueden deberse a factores transversales, como puede ser una erupción volcánica. Es por eso que realizamos varios análisis para poder abarcar y entender mejor el comportamiento del sistema años después de una erupción volcánica.

Variación intraanual

Las variaciones en el caudal generan un gran impacto de erosión y transporte de sedimentos en cuencas afectadas por una erupción (Majoran et al. 2000). Esto quedó de manifiesto en nuestro estudio al comparar los STS en momentos de alto y bajo caudal. Las diferencias en todas las variables estudiadas entre los arroyos dependieron del momento del año en que fueron medidas. A pesar de no hallar diferencias durante el muestreo de octubre (alto caudal), en el muestreo de abril todas las variables fueron menores en los arroyos no afectados (Fig. 2.13). Esto se debió a que en los arroyos afectados todas las variables medidas fueron más altas en abril. Probablemente el deshielo de octubre produzca un efecto de dilución en estas cuencas, que afecta también a los elementos disueltos (PRS, Fe y C orgánico). Este patrón difiere al hallado en otros ambientes de la zona, en los cuales la mayor carga de sedimentos (en una alta proporción orgánicos) coincide con los mayores valores de caudal (García 2016, Villanueva et al. 2016). Las diferencias encontradas en la concentración de clorofila entre los arroyos afectados y no afectados en el muestreo de octubre evidentemente no pueden ser explicadas por ninguna de las variables que medimos. Los mayores valores en octubre (primavera) que en abril (otoño) son un resultado esperado, de acuerdo con lo hallado en otros arroyos de la cuenca del LNH (Villanueva et al. 2010b), por lo cual llama la atención que los arroyos La Estacada y Ragintuco no hayan presentado este patrón.

Variación interanual

Los ambientes cercanos al volcán poseen grandes masas de material piroclástico que, luego de eventos de precipitación, pueden ingresar a los cuerpos de agua y ser transportadas a lo largo de la cuenca, contribuyendo de esta manera a la recuperación del sistema. Major y colaboradores (Majoran et al. 2000) encontraron que tantos años después de la erupción del volcán Monte Santa Helena, eventos de altas precipitaciones ocasionaron que los arroyos transportaran cantidades de sedimentos equivalentes a aquellas halladas en las fechas inmediatamente posteriores a la erupción. Los resultados de este capítulo indican

que luego de 7 años de la erupción volcánica (año 2018), en la cuenca del LNH existe aún una marcada heterogeneidad espacial, observándose ambientes con grandes cantidades de depósitos de tefra en sus cuencas a 50 km desde volcán y con concentraciones de STS mayores (y tan elevadas como en 2014) que en los ambientes a 80 km del volcán. Sin embargo, los valores de PRS sí disminuyeron, lo que sugiere que el contenido de P en el material piroclástico está disminuyendo. Se necesitarían estudios más a largo plazo para confirmarlo. A pesar de haber hallado concentraciones de STS tan elevadas en 2018 como en 2014, las concentraciones disminuyeron significativamente en el año 2015, año en que las precipitaciones fueron mucho más bajas. Esto indica que en los ambientes afectados, los STS ingresan al sistema como consecuencia de las lluvias, mientras que en los ambientes no afectados el ingreso lateral de sólidos no es significativo. Por otro lado, el COD sí parecería ingresar al arroyo por escorrentía debido a que fue mayor en el 2014 que en el 2015, tanto en ambientes afectados como no afectados. Los aumentos de COD luego de las precipitaciones han sido registrados previamente a lo largo de una cuenca perteneciente al LNH (Villanueva et al. 2016) y en los arroyos no afectados de este estudio (García 2016). Las diferencias interanuales se reflejaron también en la concentración de Chl-a, que fue siempre mayor en el año menos lluvioso (2015), sin diferencias entre los arroyos. Tanto las comparaciones intraanuales como las interanuales mostraron que los efectos del material volcánico en las cuencas sobre la biomasa de productores primarios son complejos y será necesario tener en cuenta otras variables del biofilm para poder entenderlos. Estos estudios serán reflejados en el siguiente capítulo.

Antes y después del Calbuco

La erupción del volcán Calbuco en 2015 permitió comparar los efectos de la caída de material piroclástico, ya que a 34 días de haber realizado un muestreo previo a la erupción (22 de marzo) pudimos realizar otro muestreo (28 de abril) 6 días después de la erupción. A diferencia de los efectos de la caída de material proveniente del CVPCC, los efectos del material proveniente del Calbuco no implicaron aumentos de nutrientes (P y Fe), probablemente porque las concentraciones de nutrientes de este material piroclástico era

pobre en estos elementos. Sin embargo, el COD aumentó en mayor proporción en los arroyos ubicados al Oeste, lo cual podría indicar otra diferencia con el material del CVPCC, ya que luego de esta erupción el COD no aumentó en los lagos cercanos al volcán (Modenutti et al. 2013). La presencia C en la tefra ha sido registrada anteriormente en otras erupciones y su origen se atribuyó a la materia orgánica pirolizada arrastrada con la pluma (Cushing y Smith 1982). La erupción del Calbuco tuvo efectos sobre la concentración de Chl-a, donde observamos un patrón muy marcado. En los arroyos afectados por el material volcánico la concentración de Chl-a decayó (Fig. 2.18). Este efecto negativo sobre la biomasa de productores primarios puede deberse a la depositación de sólidos sobre el biofilm. Se ha demostrado que el enterramiento del biofilm por la decantación de sedimentos limita tanto la llegada de luz como el intercambio de elementos (oxígeno y nutrientes) con la columna de agua, produciendo un decaimiento de su biomasa (Izagirre et al. 2009). En cambio, en los arroyos no afectados, Goye y Casa de Piedra, hubo un incremento de la concentración de Chl-a que probablemente esté relacionado con procesos naturales de la dinámica del biofilm. Por lo tanto, en este análisis se observan patrones (tanto la clorofila como el COD) que se ven alterados inmediatamente después de la erupción, que no se observaron en el análisis intraanual e interanual, lo que podría indicar diferencias entre efectos inmediatos y efectos luego de 4 y 7 años de una erupción donde ya hay una recuperación del sistema.

Cuenca del Arroyo Pireco

Desde sus nacientes en la alta montaña, los arroyos van formando una red dendrítica, acrecentando de orden cuando confluyen con otros arroyos, aumentando así su ancho y su caudal (Vannote et al. 1980). En su transcurso transportan material que además va siendo transformado física y biológicamente (Webster y Meyer 1997, Tank et al. 2010). En particular, los arroyos de la Patagonia tienen sus nacientes por encima de o en el bosque caducifolio de Nothofagus pumilio y luego circulan por bosques perennes de N. dombeyii. La cuenca del Arroyo Pireco fue muestreada en sitios con bosque de N. dombeyii (Arroyos Puyehue y Pantojo) y aguas abajo, en bosque de N. pumilio (Arroyos Pereyra y Pireco), donde se pudo observar claramente un gradiente en la cantidad de STS aguas abajo (Fig.

2.19a). Además, pudo observarse también un efecto estacional, con un aumento de los STS en abril, cuando las precipitaciones fueron mayores. Una vez más, los resultados indican que las precipitaciones son un factor fundamental que define las concentraciones de STS en los arroyos afectados por cenizas volcánicas. Sin embargo, este patrón observado en los STS no fue acompañado con un patrón en la concentración de PRS, como se hubiera esperado. Probablemente, luego de 7 años de exposición el material depositado en las cuencas ya no liberen cantidades significativas de P. Esto es lo que sucede también en los otros arroyos afectados, que las concentraciones de PRS son menores en abril de 2018 que en abril de 2014 (Fig. 2.15b). El incremento de chl-a a lo largo de la cuenca es un resultado indiscutible dado que a medida que los ríos aumentan su ancho aguas abajo, entra más luz y se desarrollan mejor los productores primarios (Vannote et al. 1980). Por otro lado, hemos observado una correlación entre la concentración de clorofila y los STS por lo que éste es un patrón relacionado con los depósitos de material volcánico en las cuencas. Luego de 7 años se observó que el material piroclástico presente en el ambiente aún sigue manteniéndose en suspensión, aunque en menor medida que años anteriores. A la vez, este material sigue aportando elementos al ambiente, como P y Fe, que podrían ser utilizados por los organismos del biofilm (ver Cap. III). En los análisis a escala regional (a, b, c y d), se observó que la concentración tanto de STS como de P y Fe son mayores en aquellos ambientes más cercanos al volcán. Por otro lado, a escala de cuenca (e), los STS se incrementaron a medida que aumentó el número de orden del arroyo. Además sólo se observó relación entre la variable respuesta (clorofila a) y los STS a nivel de cuenca, no observándose este patrón a escala regional. Por otro lado, sí se observó una marcada diferencia en la composición de los grandes grupos algales entre los ambientes afectados y los no afectados. Por lo tanto, en el siguiente capítulo se llevará a cabo un estudio más profundo teniendo en cuenta una amplia variedad de parámetros del biofilm, respecto a su estructura y función, con el fin de profundizar su análisis.

Capítulo III

Efectos de la tefra sobre la estequiometría, la actividad enzimática y la composición comunitaria en el biofilm de arroyos de la Patagonia-Norte.

Introducción

El vulcanismo activo de la Patagonia andina genera depósitos intermitentes de tefra, que junto al clima húmedo y la influencia de la vegetación, determinan los tipos de suelos volcánicos presentes (Broquen et al. 2005). Luego de una explosión volcánica, la acumulación de material piroclástico en las cuencas de ríos y arroyos incrementa los sólidos totales en suspensión y modifica la vegetación de la zona ribereña (Cap. I y II). Una vez ocurrida la erupción comienza un proceso de recuperación del ecosistema, que tomará diferentes caminos dependiendo el grado del disturbio. En los casos donde el grado fue alto (ecosistemas que han sido afectados con lavas, flujos piroclásticos y la mayoría de los lahares), comienza un proceso de sucesión primaria ya que no quedan legados biológicos. Por otro lado, en donde el grado de disturbio fue intermedio o bajo (ambientes con un impacto menor donde la tefra es una capa de pocos centímetros) ocurre una sucesión secundaria, ya que sobrevive el legado biológico (Halpern et al. 1990, Grishin et al. 1996). Por lo que es esperable que las funciones ecosistémicas se regeneren con diferente rapidez, según la posición del sitio a lo largo del gradiente de impacto por la deposición de cenizas (Chaneton et al. 2014). Además de los efectos físicos, por ingreso de partículas, la liberación de elementos es una de los efectos que más modifican las funciones de los ecosistemas (Cap I). Estos cambios en la composición química de los cuerpos de agua, además de modelar su estructura y composición, puede modificar la función del ecosistema (Lee, 1996; del Moral, 1999). En ambientes ultraoligotróficos, donde el P es un nutriente muy escaso, tanto algas como bacterias pueden adquirir el P desde moléculas orgánicas por medio de la liberación de enzimas extracelulares, tales como la fosfatasa alcalina, hacia el interior de la matriz del biofilm (Sand-Jensen 1983). Es posible que tras el ingreso de este nutriente al ecosistema luego de una erupción volcánica, estos microorganismos se eviten este paso tan costoso y sinteticen menos enzima. La utilización de moléculas orgánicas para obtener tanto P como C y N por parte de las comunidades microbianas puede diferenciarse de acuerdo con la disponibilidad que encuentren en el ambiente. Se han encontrado diferencias en el uso de sustratos comparando comunidades planctónicas marinas en sitios oligotróficos versus eutróficos

(Sala et al. 2006a), en lagos con diferentes ingresos de materia orgánica autóctona y alóctona (Díaz Villanueva et al. 2018) y en el biofilm de un río en su gradiente desde aguas arriba y abajo (Freixa y Romaní 2014). En ambientes afectados por volcán el aumento de N y C por ingreso de tefra puede ser producto de materia orgánica pirolizada arrastrada con la pluma (Cushing y Smith 1982). Estos ingresos podrían afectar también la disponibilidad de diferentes moléculas orgánicas y de esta manera modificar el metabolismo de las comunidades microbianas. No sólo las concentraciones de nutrientes son importantes para el desarrollo de los autótrofos sino también los balances entre ellos. El desbalance de nutrientes en un ecosistema puede limitar el desarrollo de los organismos que lo componen (Sterner y Elser 2002). El N y el P, por ejemplo, desempeñan un papel especialmente importante en este concepto, porque estos elementos son esenciales para la estructura y la función del organismo (Elser et al. 1996). En aquellas áreas afectadas por depósitos volcánicos, puede ocurrir un desbalance de nutrientes, dado que la tefra libera P, afectando la relación N:P (Modenutti et al. 2013). Luego de la erupción del Mt. Santa Helena en 1980, los niveles de

N permanecieron bajos, y por lo tanto la capacidad de fijar N2 atmosférico fue crucial, observándose altos niveles de actividad nitrogenasa en los lagos y lagunas afectados

(Baross et al. 1982). Ligado a esto se hallaron cianobacterias fijadoras de N2, que poseen una ventaja competitiva frente al resto de las especies (Ward et al. 1983 2006).

OBJETIVO GENERAL

El objetivo del presente capítulo fue evaluar si luego de 4 años de la erupción se observan efectos sobre los biofilms de arroyos, comparando la estequiometria (relaciones C:P, N:P y C:N), la APA, las capacidades metabólicas y la composición de las comunidades de productores primarios del biofilm.

Hipótesis y Predicciones

H1: El aumento de P en el ambiente afecta el contenido de P, la APA, las capacidades metabólicas y la composición de los productores primarios del biofilm.

P1: los arroyos más cercanos al volcán, con altos niveles de solidos totales en suspensión (STS) y mayores concentraciones de P, tendrán más P en el biofilm;

P2: el biofilm de los ambientes afectados presentará menores niveles de APA que el de ambientes no afectados; y

P3: las diferencias en la disponibilidad de P será reflejada en las capacidades metabólicas del biofilm y la composición de las comunidades de los productores primarios.

Las hipótesis fueron testeadas de la siguiente manera:

1. Comparando el contenido de P en el agua y los atributos del biofilm en 2 arroyos que fueron afectados por los depósitos de tefra emitidos por el CVPCC con 2 arroyos no afectados, en la cuenca del lago Nahuel Huapi.

Materiales y métodos

Área de estudio

Basándonos en los resultados del capítulo anterior, se seleccionaron cuatro arroyos de los descriptos (Fig. 3.1) teniendo en cuenta la presencia/ausencia de depósitos de ceniza, diferenciando dos tipos de arroyos: - arroyos afectados (AA): La Estacada (A1) y Ragintuco (A2), - arroyos no afectados (AN): Goye (N1) y Casa de Piedra (N2)

Fig. 3.1 Mapa de los arroyos muestreados. Arroyos afectados: A1 (La Estacada) y A2 (Ragintuco) y Arroyos no afectados: N1 (Goye) y N2 (Casa de Piedra). Complejo Volcánico Puyehue Cordón-Caulle (CVPCC). Modificado de Gaitán, 2011.

Muestreo de campo

Se utilizaron los datos ambientales de los muestreos descriptos en el capítulo 2 correspondientes a condiciones de alto caudal en primavera (Octubre 2014), y otras dos en condiciones de bajo caudal, en verano y otoño (Marzo y Abril de 2015). Para los muestreos de biofilm, se procedió como se describe en el capítulo anterior.

Procedimientos de laboratorio

Las concentraciones de STS, COD y PRS se determinaron como se describe en el capítulo 2. El fósforo disuelto total (PDT) se determinó a partir de una muestra de agua filtrada (GF/F), luego de una digestión con persulfato de potasio a 125 °C a 1,5 atm por 1 hora, seguido de una reacción ácida con molibdato de amonio y lecturas espectrofotométricas (Eaton et al. 2005). El nitrógeno disuelto total (NDT) se determinó de las mismas muestras que el COD, usando una unidad TN-M1 en el Shimadzu TOC V-CSH. Asimismo, el biofilm se obtuvo de la manera descripta en el capítulo anterior. La suspensión obtenida se utilizó para la estimación del contenido de fósforo (P), carbono (C) y nitrógeno (N), materia orgánica total (estimada como peso seco libre de cenizas: PSLC), actividad de la fosfatasa alcalina (APA), concentración de clorofila a (Chl-a), abundancia de bacterias y composición y biovolúmenes de los autótrofos del biofilm y diversidad funcional por medio de la técnica de Biolog Ecoplate®.

Elementos en el biofilm

El contenido de P del biofilm se determinó filtrando 5 ml de la suspensión a través de filtros GF/F lavados previamente con ácido (HCl 10%), y secados a 60 ºC durante 48 horas. Después de la combustión a 550 °C durante 1.5 h, se analizó el contenido de P utilizando el método del molibdato de amonio (Eaton et al. 2005). Las mediciones de C y N del biofilm se realizaron filtrando otros 5 ml de la muestra homogeneizada a través de filtros GF/F previamente muflados, y se secaron a 60 °C durante 48 h. El contenido de C y N de las colonias de Nostoc se determinó luego de aislar manualmente 2 g de colonias desde el biofilm que se secaron a 60 °C durante 48 h. Ambas

muestras fueron procesadas con un analizador elemental Thermo Finnigan EA 1112 CN (Thermo Scientific, Milano, Italia). Con los resultados del contenido de C, N y P en el biofilm, se calcularon las relaciones C:N, C:P y N:P atómicas. Las submuestras para la determinación del PSLC (5-10 ml) se filtraron con filtros Whatman GF/F previamente muflados y pesados, luego fueron secados a 80 °C durante 48 h. Los filtros fueron pesados para obtener el peso seco (PS) y muflados a 550 °C durante 1.5 h. Luego se volvieron a pesar para obtener el peso de las cenizas y el PSLC se calculó como la diferencia entre el PS y el peso de las cenizas (APHA 2005).

Determinación de APA

Las determinaciones de APA en la muestra homogeneizada se llevaron a cabo durante 30 minutos de incubación, de acuerdo con Hoppe (1983), utilizando metilumbeliferil fosfato (MUP; 36 μM) en tampón Tris (pH 8,3). La temperatura se estabilizó en un baño térmico a 25 °C (para optimizar la temperatura de la actividad enzimática) durante 30 minutos. A continuación, se agregó una solución de 0,5 mL de MUP a todas las muestras, blanco y estándares de MUP. La fluorescencia se midió con un fluorómetro Perkin Elmer LS45. Los valores se expresaron como nM MU g PSLC-1 h-1.

Biomasa de autótrofos y heterótrofos

Se usó una submuestra de la suspensión para la extracción de Chl-a, procediendo como en el capítulo 2. El índice autotrófico se calculó como la relación entre las concentraciones de Chl-a y PSLC para estimar la importancia relativa de la fracción fotosintética en la comunidad (Havens et al. 1996). Para la determinación de la abundancia bacteriana una submuestra fue fijada en formaldehído filtrado a una concentración final de 2% v/v. La abundancia de células bacterianas se determinó filtrando por filtros de policarbonato negro de 0,2 μm (Poretics), submuestras de 250 μl previamente teñidas con 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración final de 0,2% p/v, de acuerdo con Porter y Feig (1980). El recuento se realizó

bajo un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX50) a un aumento de 1250x usando luz UV (filtro U-MWU). Se contaron 20 campos por filtro.

Composición de autótrofos

Para el análisis de la composición algal, se fijó una submuestra (10 ml) de la suspensión con solución ácida de Lugol. Las identificaciones se realizaron bajo el microscopio (Olympus BX50) a 1000x, hasta el nivel de género cuando fue posible. La bibliografía consultada para la identificación de las diatomeas fue Krammer y Lange-Bertalot (1986 1988, 1991a, 1991b), Díaz Villanueva y Maidana (1999) y Maidana y Díaz Villanueva (2001) además del sitio web AlgaeBase (Guiry y Guiry 2019). Además, para las cianobacterias seguimos a Komárek y Anagnostidis (1989, 1998, 2005), Komárek et al. (2013), Díaz (1993) y Wenzel (2008). Para las determinaciones de la abundancia algal, se examinaron tres alícuotas en una cámara de volumen de 20 μL bajo un microscopio directo (Olympus BX50) a 400x y se obtuvieron al menos 60 imágenes aleatorias de cada alícuota con una cámara digital (Olympus DP 70). Las células se contaron y se midieron usando un sistema de análisis de imágenes (Image ProPlus, Media Cybernetics, Warrendale, PA, EE. UU.). El biovolumen se estimó con los modelos geométricos que mejor ajustaban, utilizando dimensiones promedio de un mínimo de 20 células por especie por muestra (Hillebrand et al. 1999). El biovolumen de las colonias esféricas macroscópicas de Nostoc se calculó por medición de colonias individuales bajo lupa a 50x.

Diversidad funcional

El estudio de la diversidad funcional en las comunidades microbianas ha sido simplificado con el uso de sustratos artificiales como son los Biolog Ecoplates (Hayward, CA, USA) (Zak et al. 1994). Esta técnica permite detectar variaciones en la habilidad microbiana para metabolizar diferentes compuestos orgánicos. Son placas que contienen 31 fuentes de carbono diferentes y un control, con representantes de cinco tipos moleculares (hidratos de carbono, polímeros, aminoácidos, ácidos carboxílicos y aminas) en pozos

triplicados (96 pozos en total), mas una sal de tetrazolio, la cual es reducida a un compuesto de color violeta al ser metabolizado (Garland y Mills 1991) y esto puede ser cuantificado colorimétricamente (Fig. 3.2).

Fig. 3.2 Placa de Biolog EcoPlate® donde se observan las 96 celdas con los 31 diferentes fuentes de carbono además de un control (por triplicado).

Las capacidades metabólicas se estudiaron en muestras extraídas de los cuatro arroyos en dos momentos del año: verano y otoño (marzo y abril 2015). Cada celda fue inoculada con 125 µL de la suspensión e incubada a 21°C en oscuridad durante 7 días. El desarrollo del color fue medido espectrofotométricamente con un lector de microplacas (Chromate® Model 4300, Awareness Technology Inc.) a 595 nm al tiempo cero y luego cada 24 horas, hasta alcanzar el desarrollo máximo de color. El desarrollo promedio del color de cada placa se expresó como el AWCD (por sus siglas en inglés, average well colour development) definido como: [ ( )] = 93 ∑ 𝑅𝑅 − 𝐶𝐶 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 donde R es la absorbancia de cada celda, C es el promedio de la absorbancia de las celdas control. Los valores negativos se consideraron cero. El desarrollo del color en la placa fue analizado comparando su dinámica temporal, la cual describe una curva sigmoidal con el tiempo, y se definen los parámetros cinéticos de la ecuación (Lindstrom et al. 1998): a

(absorbancia máxima alcanzada) y x0 (tiempo en alcanzar la máxima velocidad de desarrollo de color).

Las comparaciones en la utilización de los diferentes substratos se llevaron a cabo en el tiempo x0 (Garland 1996). La matriz de datos de absorbancia de los diferentes substratos fue normalizada dividiendo cada valor (promedio de las tres réplicas de la placa) por el AWCD. Esto se hace para minimizar la influencia de la densidad de bacterias, previa confirmación de que el AWCD está correlacionado con la densidad bacteriana en la muestra original (Garland y Mills 1991). Se compararon también el número de sustratos consumidos por arroyo y el uso de los cinco grupos de moléculas (polímeros, carbohidratos, ácidos carboxílicos, aminoácidos y aminas), sumando las absorbancias de los sustratos pertenecientes a cada grupo y dividiendo por la cantidad de sustratos dentro de cada grupo, para estandarizar.

Análisis de los datos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 18 y SigmaStat versión 12.5 (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.). Tanto las diferencias entre las variables fisicoquímicas del agua de los arroyos y los parámetros del biofilm (contenido de P, C y N del biofilm, relación C:P y C:N, APA, Chl-a, PSLC, relación Chl-a:PSLC, abundancia de bacterias y algas y biovolumen de algas y los parámetros cinéticos del desarrollo de los biologs) entre los dos tipos de arroyos también se analizaron utilizando ANOVA de dos vías. Para todos los casos, el factor entre-sujeto fue el "Impacto" (con dos niveles: AA y AN) y como el factor intra-sujeto se utilizó el "Tiempo" (con tres niveles: octubre, marzo y abril, con excepción de los biologs que sólo se analizaron en marzo y abril). Para los análisis a posteriori, se usaron las pruebas de Bonferroni para comparar los efectos principales. Estos contrastes se basan en las comparaciones pareadas linealmente independientes entre las medias marginales estimadas. La normalidad y la esfericidad se verificaron previamente. La corrección Greenhouse- Geisser se usó para calcular el nivel P ajustado de la prueba F cuando no se alcanzó la esfericidad. La magnitud de la diferencia entre tratamientos se estimó mediante el análisis del tamaño del efecto (h2) en ANOVA como:

2 h = SSefecto / SStotal

donde SSefecto es la suma de cuadrados para los factores y SStotal es la suma de cuadrados total para todos los efectos, interacciones y errores en el ANOVA. La matriz de utilización de los sustratos de las placas Biologs fue usada para generar una matriz de similitud entre las muestras de los cuatro arroyos correspondientes a verano y otoño, usando el índice de Bray-Curtis. Se aplicó una ordenación especial utilizando un análisis multidimensional no métrico (NMDS - del inglés non-metric multidimensional scaling). Las diferencias entre arroyos y fechas de muestreo fueron analizadas con una análisis de similitudes (ANOSIM) en el programa PRIMER (PRIMER & PERMANOVA.6). Para el ordenamiento de los sitios en los diferentes muestreos del año según las especies de productores primarios identificadas se utilizó un Análisis de Componentes Principales (ACP) con las abundancias (previa estandarización de los datos) utilizando el programa PRIMER.

Resultados

Sólidos en suspensión y nutrientes en los arroyos

Las arroyos AA y AN difirieron en la concentración de STS y PDT (Tabla 3.1). Los STS se relacionaron positivamente tanto con la turbidez del agua como con el PDT (regresión lineal r2=0.97, g.l.=11, P<0.01; y r2=0.53, g.l.=11, P<0.01 respectivamente). Por el contrario, no se observaron diferencias en la concentración de COD ni NDT (Tabla 3.1). La relación N:P difirió entre los tipos de arroyos y se observó el valor más bajo en los arroyos AA en marzo (Tabla 3.1).

Tabla 3.1 Parámetros fisicoquímicos del agua de los arroyos afectados (AA) y los no afectados (AN) durante el período de estudio y los resultados del ANOVA. Los valores corresponden a las mediciones en cada uno de los dos sitios para cada tipo de arroyo.

Tiempo Octubre Marzo Abril Estadística Impacto x Impacto AA AN AA AN AA AN Impacto Tiempo Tiempo -1 5.9 0.3 6.2 2.4 3.5 0.3 STS (mg L ) <0.001* 0.004* 0.031* 6.1 0.2 7.2 2.2 2.5 0.4 4.1 1.6 4.1 2.1 3.2 0.6 Turbidez (UNT) 0.001* 0.032* 0.627 4.2 1.5 4.7 1.9 2.9 0.9 3.6 1.3 8.5 2.6 6.6 2.1 PRS (µg L-1) 0.004* 0.048* 0.132 4.0 1.3 6.7 2.2 6.7 1.6 -1 5.8 6.2 15.1 6.9 5.0 2.1 PDT (µg L ) 0.037* 0.023* 0.047* 5.3 6.7 12.2 4.68 4.9 2.05

0.6 0.4 0.8 0.5 0.9 0.6 COD (mg L-1) 0.078 0.140 0.507 0.6 0.4 0.7 0.4 0.6 0.5 53.8 28.5 55.1 57.8 57.8 37.8 NDT (µg L-1) 0.227 0.101 0.059 58.7 28.6 42.8 71.9 36.7 30.0 20.4 10.2 8.1 18.5 25.6 39.2 N:P (molar) 0.119 0.153 0.044* 24.3 9.4 7.7 34.0 16.8 32.4 Velocidad 55.6 51.0 17.4 27.1 35.5 22.0 0.748 0.008* 0.154 (cm s-1) 63.7 59.6 14.0 29.7 25.7 29.7 5.7 4.7 11.4 10.6 7.9 5.9 Temperatura (°C) 0.161 0.001* 0.303 7.0 6.2 13.8 11.5 8.6 5.2

94.0 92.0 63.0 91.4 38.7 91.7 Oxígeno (%) 0.016* 0.069 0.060 91.0 86.4 85.0 100.0 37.8 93.2 Conductividad 17.0 11.7 50.0 37.0 43.4 29.6 0.017* 0.018* 0.842 (µS cm-1) 25.2 9.8 46.3 42.4 38.7 33.6 7.5 7.5 7.4 7.4 7.3 7.5 pH 0.937 0.091 0.091 7.2 7.1 7.2 7.2 7.3 7.1

Biofilm

El contenido de P del biofilm fue mayor en los arroyos AA (Fig. 3.3a; Tabla 3.2). Como consecuencia de valores semejantes en el contenido de C y N (mayores en los arroyos AA que en los arroyos AN), la relación C:N del biofilm fue menor en los arroyos AA (C:N=8 ± 0,1) que en los arroyos AN (C:N=10 ± 0,4; Tabla 3.2). Aunque tanto las concentraciones de C como de N fueron mayores en los arroyos AA que en los AN (Fig. 3.3). Las relaciones C:N de las colonias aisladas de Nostoc fueron de 9,17.

Fig. 3.3 Variables del biofilm en las tres fechas de muestreo (octubre.2014, marzo.2015 y abril.2015) en los arroyos afectados (A1 y A2) y los arroyos no afectados (N1 y N2). a) Contenido de fósforo, b) Contenido de carbono y c) Contenido de Nitrógeno. Las barras de error representan ± error estándar.

La relación C:P fue siempre menor en los AA (Fig. 3.4a; Tabla 3.2). Como consecuencia del alto contenido de P en el biofilm de los arroyos AA, su APA fue menor que en el biofilm de los arroyos AN (Fig. 3.4b; Tabla 3.2).

800 8000 a) b)

700 7000 MU mgAPA (nM OM AA 600 AN 6000 500 5000 400 4000

C:P (molar) 300 3000 -1

200 2000 h -1 ) 100 1000 0 0 Octubre Marzo Abril Octubre Marzo Abril Fig. 3.4 Variables del biofilm en las tres fechas de muestreo (octubre.2014, marzo.2015 y abril.2015) en los arroyos afectados (A1 y A2) y los arroyos no afectados (N1 y N2). a) Relación C:P atómica y b) Actividad de la fosfatasa alcalina (APA). Las barras de error representan ± error estándar.

Aunque la concentración de Chl-a no difirió entre los tipos de arroyos, el número total de células autótrofas, el biovolumen y el PSLC del biofilm fueron mayores en los arroyos AA (Fig. 3.5a, b y c; Tablas 2 y 3). Por lo tanto, el índice autotrófico (Chl-a:PSLC) fue menor en los arroyos AA (Fig. 3.5d, Tabla 3.2). Sin embargo, las abundancias bacterianas no difirieron entre los tipos de arroyos (Tabla 3.3).

200 10000 a) b) 1000 Biovolumen (mm 150 AA 100 ) AN -2 10 100 (µg cm

a 1 -3 cm Chl

0.1 -2

50 ) 0.01

0 0.001 c) October March April d) October March April 5 0.3 ) Chl Chl -2 4 a : PSLC : 3 0.2

PSLC (mg cm PSLC (mg 2 0.1 1

0 0.0 Octubre Marzo Abril Octubre Marzo Abril Fig. 3.5 Variables del biofilm en las tres fechas de muestreo (octubre.2014, marzo.2015 y abril.2015) en los arroyos afectados (A1 y A2) y los arroyos no afectados (N1 y N2). a) Concentración de Clorofila a, b) Biovolumen de algas, c) Peso seco libre de ceniza (PSLC), y d) Relación Clorofila a/PSLC. Las barras de error representan ± error estándar.

100

Tabla 3.2: Resultados del RM-ANOVA de una vía para los parámetros del biofilm del agua de los arroyos afectados (AA) y no afectados (AN) durante el período de estudio.

Fuente de variación Impacto Tiempo Impacto x Tiempo Biofilm parameters F P h2 F P h2 F P h2 P (µg cm-2) 34.92 <0.001* 0.777 27.46 <0.001* 0.733 14.67 0.003* 0.595 C (µg cm-2) 15.48 0.003* 0.607 41.70 <0.001* 0.807 8.44 0.002* 0.458 N (µg cm-2) 0,15 0,864 0,032 4,99 0,052 0,35 0,03 0,967 0,007 Relación C:P (molar) 13.89 0.004* 0.581 5.42 0.0130* 0.351 0.30 0.740 0.029 Relación C:N (molar) 8.91 0.02* 0.497 1.31 0.29 0.127 4.87 0.02* 0.351 APA -1 -1 15.23 0.003* 0.604 16.89 <0.001* 0.628 7.91 0.009* 0.442 (nM MU mg OM h ) Chl a (µg cm-2) 0.94 0.360 0.086 28.11 <0.001* 0.738 0.045 0.930 0.004 Biovolumen (mm3 cm-2) 113.01 <0.001* 0.919 5.69 0.011* 0.363 5.69 0.011* 0.362 AFDM (mg cm-2) 31.22 <0.001* 0.757 45.60 <0.001* 0.820 18.41 <0.001* 0.648 Chl a : AFDM 31.61 <0.001* 0.760 10.52 0.001* 0.513 2.22 0.134 0.182

Tabla 3.3: Resultados de la abundancia de algas y bacterias y RM-ANOVA de una vía para los parámetros del biofilm del agua de los arroyos afectados (AA) y no afectados (AN) durante el período de estudio.

Tiempo Octubre Marzo Abril Estadísticos Impacto x Impacto Tiempo Impacto A U A U A U Tiempo F P F P F P N° de células algales 4.3±0.2 6.6±0.1 2.5±0.2 1.2±0.5 105 1.1±0.7 105 8.2±2.2 5 -2 28.8 <0.01* 153.4 <0.01* 34.7 <0.01* (10 cell cm ) 4.7±0.1 3.1±0.1 4.1±2.2 2.6±0.7 105 1.9±1.2 105 3.2±0.5 N° de células bacterianas 2.6±0.1 3.3±0.2 13.9±1.0 20.0±1.7 36.8±4.3 27.3±1.6 6 -2 0.1 0.74 14.4 0.015* 1.2 0.38 (10 cell cm ) 5.6±0.4 4.4±0.3 14.0±1.1 17.6±1.2 22.1±1.6 16.1±0.6

101

La composición de la comunidad autótrofa difirió entre los tipos de arroyos. Mientras que en AN el ensamble estuvo dominado por Bacillariophyta (76,9% y 89,9% de biovolumen en marzo y abril, respectivamente), el biofilm en AA estuvo dominado por cianobacterias (99,9% del biovolumen total de algas), en particular en marzo y abril (Fig.6). del agua (molar) agua del 40 N:P Relación 140 30 20 120 10 100 0

20 Biovolumen algal algal Biovolumen

0 AA1 AA2 AN1 AN2 AA1 AA2 AN1 AN2 AA1 AA2 AN1 AN2 Octubre Marzo Abril Cyanobacteria Bacillariophyta Chlorophyta Fig. 3.6 Biovolumen de Cianobacterias (barras negras), Bacillariophyta (barras grises claras) y Chlorophyta (barras grises oscuras) en los arroyos afectados (A1 y A2) y los arroyos no afectados (N1 y N2) y relación N:P para cada arroyo en cada fecha de muestreo (octubre.2014, marzo.2015 y abril.2015).

Teniendo en cuenta las abundancias de las especies halladas las comunidades de los arroyos afectados se diferenciaron fuertemente de las de los no afectados (Fig. 3.7). El análisis del gradiente realizado logró explicar el 76% de la variancia en el primer componente del ordenamiento (PC1) y un total del 91.2% al sumarle la variancia explicada por el segundo eje (PC2). Tres especies fueron las principales en determinar esta diferencia: Nostoc sp., asociada en un 90.6% al PC1, Homeotrix sp., asociada negativamente en un 75.9% al eje 2 y Gomphonema sp., asociada positivamente al eje 2. (Fig. 3.7). Los arroyos afectados se caracterizaron por altas cantidades de Nostoc sp, que en marzo y abril alcanzó casi el 100% de la abundancia de células (Tabla anexo I) y el biovolumen, desarrollando colonias macroscópicas, además se encontraron dos especies de diatomeas que presentan cianobacterias simbiontes Rhopalodia gibba y Epithemia adnata. Sin embargo en Octubre, la comunidad de los arroyos afectados fue más parecida a la de los arroyos no afectados y estuvo caracterizada por una alta abundancia de Homeotrix sp (Tabla anexo I). Esta condición no se observó en los AN, en los cuales el ensamble estuvo dominado por diatomeas, particularmente por Gomphonema sp.

102

N2 Octubre Marzo N1 N2 Abril N2 N1 Gomphonema sp A1 A2 N1 A2 A1 2 C P A1 Nostoc sp A2

Homeotrix sp

PC1 Figura 7: Distribución de los sitios de muestreo (A1: La Estacada, A2: Ragintuco, N1: Goye y N2: Casa de Piedra) de acuerdo al Análisis de Componentes principales (ACP) a partir de las especies de productores primarios halladas en Octubre (círculos amarillos), Marzo (círculos verdes) y abril (círculos naranjas).

103

Fig. 3.8 Fotografias de las algas más abundantes halladas en las muestras en los ambientes afectados: a) Calothrix sp, b) Homeothrix sp, c) Nostoc sp, y en los no afectados predominaron d) Gomphoneis herculeana, y e) Synedra sp y se hallaron f) Rhopalodia gibba en los afectados.

Diversidad funcional

La absorbancia en las placas de los Biologs a lo largo de los 7 días mostró el esperado desarrollo de manera sigmoidal. Las absorbancias máximas estimadas a partir de los ajustes (todos ellos significativos y con R2 > 0,98) variaron entre 0,7 y 1,0 (Tabla 3.4), sin diferencias entre tipos de arroyo ni entre fechas de muestreo. Sin embargo, el tiempo para llegar al a máxima velocidad de desarrollo del color fue diferente en los dos tipos de arroyo dependiendo de la fecha de muestreo (interacción, P=0,002), y fue mayor en los arroyos afectados en las muestras de verano pero mayor en los no afectados en las de otoño. Esto se debió a una gran diferencia en los valores de X0 en las muestras de los arroyos afectados, mayores en verano, mientras que en los no afectados se mantuvo en los mismos valores en ambas fechas (Tabla 3.4).

Tabla 3.4: Parámetros de la dinámica del desarrollo de la absorbancia en las placas de Biologs en las muestras de biofilm de roca en cuatro arroyos con diferente grado de impacto del volcán en verano y otoño. Donde a es la absorbancia máxima alcanzada y x0 es el tiempo en alcanzar la máxima velocidad de desarrollo de color.

Arroyos a max X0 (días) Marzo Abril Marzo Abril La estacada 1,01 ± 0,02 0,88 ± 0,01 76,0 ± 2,0 59,0 ± 0,5 Ragintuco 0,70 ± 0,01 0,82 ± 0,03 78,0 ± 1,0 61 ± 2,0 Goye 0,70 ± 0,06 0,49 ± 0,03 68,0 ± 0,3 71,0 ± 0,8 Casa de Piedra 0,64 ± 0,06 0,86 ± 0,05 69,0 ± 0,2 67,0 ± 1,0

En cuanto a los sustratos utilizados por las diferentes comunidades de los biofilms, el total varió entre 19 y 25 (Tabla 3.5). Hubo 5 sustratos que no fueron consumidos por ninguna de las comunidades. Si bien no se hallaron diferencias estadísticas en los consumos entre los arroyos afectados y no afectados (ANOSIM, Rho global = 0.25, P=0,55), ni entre las muestras tomadas en verano y en otoño (ANOSIM, Rho global = 0.25, P=0,11) la distribución de los sitios en el análisis NMDS muestra un gradiente en el que las comunidades de los arroyos no afectados se encuentran hacia la derecha (con excepción del Goye en verano) mientras que los arroyos de verano se encuentras ubicados por encima de los de otoño (Fig. 3.8).

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Tabla 3.5: Absorbancia de los sustratos de los biologs en las muestras de biofilm de roca en Marzo y Abril en arroyos con diferente grado de impacto por el volcán. Marzo Abril GRUPO SUSTRATO AA AN AA AN LE Rco Go CdP LE Rco Go CdP 1) Tween 40 1,14 0,79 0,80 0,90 0,87 0,36 0,29 0,42 2) Tween 80 1,29 1,53 1,35 0,82 0,87 0,26 0,30 0,42 3) α –Cyclodextrina 0,97 1,02 0,30 0,07 1,24 1,44

Polímeros 4) Glcógeno 0,14 0,46 0,67 1,28 1,23 0,04 1,12 1,37 5) D-Cellobiosa 1,78 0,99 1,28 1,55 0,96 1,41 1,10 1,86 6) α -D-Lactosa 2,11 1,60 2,05 2,23 1,10 1,89

7) β-Methyl-D-Glucosido 1,45 1,26 2,03 1,03 1,72 2,23 1,39 1,57 8) D-xylosido 0,59 0,86 1,12 0,39 0,51 1,47 0,26

9) i-Erythritol 1,04 0,10 0,16

10) D-Mannitol 1,85 3,03 2,35 1,44 2,65 2,13 1,52 1,86 11) N-Acetyl-D- 1,97 2,60 2,12 1,39 1,69 2,06 1,26 1,89 Glucosamina

Carbohidratos 12) Glucosa-1-fosfato 1,00 1,08 1,21 1,19 0,64 0,45 0,93

13) D,L-α-Glicerol fosfato 14) Ácido D-Galactonic 1,01 1,08 0,91 1,16 1,41 1,70 1,29 1,43 γ-Lactona 15) Ácido Pirúvico Metil 1,18 1,23 1,43 1,34 1,70 1,59 1,26 1,34 Ester 16) Ácido D- 1,69 1,90 1,79 1,47 1,48 1,22 1,67 0,79 Glucosaminic

17) Ácido D-galacturonic 1,68 2,37 1,56 1,19 2,07 1,86 0,92 1,51 18) Ácido 2-Hidroxy 0,73 0,67 Benzoico 19) Ácido 4-Hidroxy 1,23 1,62 0,99 1,27 1,20 1,27 1,35 1,66 Benzoico 20) Ácido γ - Ácido Carboxílico Hydroxybutírico 21) Ácido Itacónico 1,47 1,65 1,45 1,31 1,23 1,18 1,18 0,56 22) Ácido α - Ketobutírico 23) Ácido D-Málico 0,13 1,32 0,72 1,28 0,65 2,02 1,72 1,55 24) L-Arginina 1,89 3,08 2,50 1,71 2,40 2,04 2,17 2,30 25) L-Aparagina 2,19 2,89 2,46 1,51 2,48 2,29 2,09 2,17 26) L-Fenilalanina

27) L-Serina 0,85 1,27 1,40 1,09 1,36 1,82 1,70 1,56 28) L-Threonina

Aminoácidos 29) Ácido Glicil-L- 0,08 0,89 Glutámico 30) Feniletil-amina 1,43 1,97 1,86 0,89 1,40 1,71 1,18 Aminas 31) Putrescina 0,84 0,86 1,06 1,33 0,75 0,86 0,93 1,32

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Marzo N2 Abril 12 A1 1 16 25 19 9 2 8 26 N1 27 3 N1 20 4 A2 6 11 17 1014 22 A1 23 18 15 21 7 N2 A2 24 13

Fig. 3.8 Distribución de sitios de acuerdo con el uso de diferentes sustratos en placas Biologs (ver referencia de los números de cada sustrato en Tabla 3.5) comparando comunidades de Marzo (círculos verdes) y Abril (círculos naranjas) en muestras de biofilms extraído de arroyos con diferente impacto (iniciales de acuerdo con: La Estacada (A1), Ragintuco (A2), Goye (N1) y Casa de Piedra (N1)).

Al comparar el uso de los grupos químicos se observó también gran similitud entre todos los grupos (Tabla 3.6) con la excepción de las aminas, que fueron más utilizadas en los arroyos no afectados (Fig. 3.9).

Tabla 3.6 Resultados de los ANOVAS de dos vías de la comparación de las absorbancias de los grupos químicos entre ambientes afectados (AA) y no afectados (NA) en muestras de Marzo (M) y Abril (A). Mes Impacto Interacción Grupo (M vs A) (AA vs NA) (Mes x Impacto) F P F P F P Carbohidratos 0,054 0,827 2,322 0,202 0,448 0,540 Acidos 0,279 0,625 0,299 0,613 0,278 0,626 carboxílicos Polímeros 0,863 0,406 1,109 0,352 0,748 0,436 Aminoácidos 0,047 0,840 0,182 0,692 0,013 0,914 Aminas 0,041 0,850 7,697 0,050* 1,417 0,300

106

2.0 Aminas Marzo 1.6 Abril

1.2

0.8

0.4

0.0 Carbohidratos Acido carboxílico 1.2

0.8

0.4 AbsorbanciaRelativa

0.0 Polímeros Aminoácidos 1.2

0.8

0.4

0.0 AA NA AA NA

Fig. 3.9 Absorbancias relativas de los diferentes grupos químicos en arroyos afectados (AA) y no afectados (NA)

Discusión

En este capítulo se pudo poner a prueba la hipótesis planteada y confirmamos las predicciones de que como consecuencia de la diferencia en la concentración de P en el agua (3 veces mayor en AA que en AN), hay diferencias en la composición elemental del biofilm, la actividad enzimática y el ensamble de algas entre los dos tipos de arroyos (Fig. 3.11).

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Fig. 3.11 Resumen de resultados hallados en el presente capítulo.

Las características estructurales y funcionales del biofilm son sensibles a los cambios en el contenido de nutrientes y otros factores, como la temperatura, la velocidad de corriente y la luz, que determinan no solo la composición de la comunidad del biofilm, sino también su espesor, abundancia relativa de autótrofos/heterótrofos y, en última instancia, su función (Sekar et al. 2002, Francoeur y Biggs 2006, Romaní et al. 2013, Battin et al. 2016). La absorción de P depende de diferentes factores, incluida la concentración de P en el agua, el contenido de P en el biofilm, las formas de P disponibles, y la etapa de crecimiento y el espesor del biofilm (Sand-Jensen 1983, Cotner y Wetzel 1992). La relación entre la concentración de elementos en el agua y en el biofilm (es decir, la capacidad del biofilm para acumular un elemento específico) podría estar sujeta a procesos internos de éste y a la limitación de elementos. En ambientes limitados por P, los microorganismos pueden absorber rápidamente P (Rier y Stevenson 2001), lo que lleva a un aumento en el contenido de P en el biofilm (Horner et al. 1990, Hill y Fanta 2008, Kamjunke et al. 2015). Aunque las algas y las bacterias

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también pueden obtener P de la materia orgánica, este mecanismo requiere la síntesis de fosfatasa alcalina (Jansson et al. 1988). Por lo tanto, un APA más alta en el biofilm refleja la severa limitación de P en los ambientes. La falta de diferencias en el contenido de P entre los dos tipos de arroyos en octubre podría atribuirse a la baja biomasa de biofilm en esta época del año. En primavera, el deshielo produce incrementos extremadamente altos en la velocidad de corriente (~ 60 cm s-1 velocidad de corriente en los arroyos estudiados). La velocidad de corriente se reconoce como un factor principal que afecta las variaciones del biofilm en un hábitat dado (Stevenson et al. 1996, Battin et al. 2003a), debido a que causa grandes desprendimientos del biofilm por fricción. Las entradas de P en ambientes ultraoligotróficos, como las cuencas andino patagónicas, pueden conducir a cambios en el ensamble/composición de los productores primarios. Modenutti et al. (2013) encontraron que en los lagos profundos, el efecto inmediato de los aportes piroclásticos fue un cambio en la biomasa y composición del fitoplancton, pasando de estar dominada por el nanoflagelado Crysochromulina parva (Haptophyceae) a un predominio de Criptophyceae (en particular Plagioselmis lacustris) y diatomeas (particularmente Tabellaria flocculosa y Aulacoseira granulata). La composición de algas del biofilm en arroyos pertenecientes a la misma cuenca en condiciones previas a la erupción estuvo altamente dominada por diatomeas (Villanueva y Albariño 1999, Díaz Villanueva y Modenutti 2004). Inmediatamente después de la erupción, los arroyos se vieron gravemente afectados por la acumulación de cenizas, el aumento de la turbidez y los cambios en la zona ribereña (Lallement et al. 2016). Cuatro años después de la erupción, los AN mantuvieron el biofilm dominado por diatomeas, mientras que las cianobacterias fijadoras de N2 (Nostoc, Calothrix), predominaron en los AA, donde se encontraron también individuos de los géneros de diatomeas Epitemia y Rhopalodia, que contienen endosimbiontes cianobacterianos (Stancheva et al. 2013). Esto sugiere que el aumento de P puede afectar positivamente a este grupo de productores primarios. A pesar de las diferencias halladas en la composición de los productores primarios del biofilm, la utilización de los sustratos orgánicos ofrecidos en las placas de Biologs reveló pocas diferencias en las capacidades metabólicas. A pesar de apreciarse cierto gradiente en el NMDS, con los arroyos no afectados hacia la derecha, y las muestras de verano hacia arriba del gráfico, las diferencias no fueron significativas. Esto indicaría que la oferta de los diferentes tipos de materia orgánica es similar en ambos tipos de arroyo, con la excepción de las aminas, que fueron más utilizadas en los arroyos no

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afectados. Estudios previos en donde se ha utilizado esta técnica indicaron que las diferencias en los ingresos de materia orgánica a lo largo de un gradiente desde aguas arriba y abajo de un río coinciden con diferencias en las capacidades metabólicas del biofilm (Freixa y Romaní 2014) y, más recientemente, en lagos del PNNH se relacionaron las diferencias entre las capacidades metabólicas de comunidades de lagos profundos y someros con diferentes proporciones de materia orgánica autóctona y alóctona (Díaz Villanueva et al. 2018). El gradiente observado en el MDS sugeriría que existen algunas diferencias en el uso general de los sustratos orgánicos entre veranos y otoño y entre arroyos afectados y no afectados. Sin embargo, las diferencias no fueron suficientes como para poder asegurar que la presencia de tefra en el ambiente pueda originar cambios en las proporciones de moléculas que conforman el COD de estos arroyos. No sólo las concentraciones de nutrientes son importantes para el desarrollo de los autótrofos sino que son importantes también los balances entre ellos. El desbalance de nutrientes en un ecosistema puede limitar el desarrollo de los organismos que lo componen (Sterner y Elser 2002). El N y el P, por ejemplo, desempeñan un papel especialmente importante en este concepto porque estos elementos son esenciales para la estructura y la función del organismo (Elser et al. 1996). En aquellas áreas afectadas por cenizas, ocurrió un desbalance de nutrientes, por un aumento de P pero no de N, afectando a la recuperación del sistema. Esto mismo se observó previamente luego de otros eventos de ingreso de material volcánico en ambientes acuáticos (Shipley 1919, Ward et al. 1983).

La capacidad de las cianobacterias para fijar el N2 atmosférico las favorece cuando el N es limitante (Marcarelli y Wurtsbaugh 2006), en particular cuando las relaciones N:P están por debajo de 16 (Smith y Kalff 1983, Levine y Schindler 1999, Ahn et al. 2002, Biggs y Smith 2002, Stancheva et al. 2013). Cuando las condiciones ambientales son favorables, las células pueden multiplicarse rápidamente, formando floraciones bentónicas (Fristachi et al. 2008). Este patrón se observó en los arroyos AA, donde las colonias macroscópicas de Nostoc dominaron el biofilm. Aunque no se realizó identificación molecular de las cianobacterias en estos arroyos, la presencia de Nostoc fue confirmada por la plataforma Illumina MiSeq asociada con entradas piroclásticas del mismo evento volcánico (Modenutti et al. 2016). En las colonias de Nostoc, los polisacáridos extracelulares pueden llegar a representar más del 60% del peso seco de la matriz (Hill et al. 1997). La capacidad de Nostoc para generar una capa gruesa de

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polisacáridos en la matriz es una posible explicación del alto contenido de C en el biofilm de los arroyos AA, lo que da como resultado un índice autotrófico más bajo (Chl-a:PSLC) que en los arroyos AN. Estas modificaciones en la composición de la comunidad conducen a cambios en la estequiometría del conjunto. A pesar de su gran síntesis de polisacáridos, la capacidad de las cianobacterias para fijar el N2 atmosférico determinó la baja relación de C:N del biofilm en los arroyos AA. En ambientes con alto STS, la depositación de partículas en la matriz del biofilm puede tener efectos negativos sobre su biomasa (Boulêtreau et al. 2010). La matriz polimérica da como resultado una respuesta adaptativa que puede proteger al biofilm de la erosión (Flemming y Wingender 2010). Las cianobacterias filamentosas, por ejemplo, tienen la capacidad de construir estructuras que les permitan colonizar sustratos altamente erosionables (Garcia-Pichel y Wojciechowski 2009, Vignaga et al. 2013). La presencia de Nostoc en los arroyos afectados por cenizas volcánicas fue observada previamente por Cushing y Smith (1982) después de la erupción de Monte St. Helena en 1980. La alta capacidad de Nostoc para producir estructuras masivas de polisacáridos formando las colonias macroscópicas mencionadas anteriormente puede conferir a este género una gran ventaja en ambientes post-eruptivos. Por lo tanto, es posible que tanto las condiciones de nutrientes como un entorno perjudicial (STS alto) pudieran haber actuado simultáneamente, favoreciendo la proliferación de Nostoc en los arroyos afectados. Como las cianobacterias bentónicas han recibido menos atención que sus contrapartes planctónicas de agua dulce (Quiblier et al. 2013, Fetscher et al. 2015), se sabe poco sobre las variables fisicoquímicas que promueven su proliferación en los ríos (Wood et al. 2017). Por otro lado, la ausencia de colonias de Nostoc en los arroyos AN, a pesar de las relaciones N:P inferiores a 16 (en Octubre de 2014), puede estar relacionada con las bajas concentraciones de P en estos arroyos, ya que la actividad de la enzima nitrogenasa, responsable de la fijación del N2, requiere concentraciones de P > 8 μg P L-1 (Stewart et al. 1970).

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Tabla Anexo I

10 5 4 3 10 10 10 10

Octubre Marzo Abril LE RCO GO CP LE RCO GO CP LE RCO GO CP

Cyanophyceae Nostocales Nostocaceae Nostoc sp 2 6 1 2 Stigonemataceae Stigonema sp 2 2.5 Rivulareaceae Calothrix sp 5.4 1.4 1.2 10 4 5.4 1 2 Microchaete sp 1.2 Oscillatoriales Oscillatoriaceae Oscillatoria sp 1.0 1.7 7.3 1.3 2.4 6.2 5.6 5.0 1.1 9.1 5.0 Lyngbya sp 2.2 5.0 2 1.3 1.1 Phormidium 4.2 1.8 Homeotrichaceae Homeothrix sp 3 4 1.6 3.2 2 5 2.4 1.3 2 1 Gomontiellaceae Komvophoron sp 6.5 1.0 7.4 7.0 9.8 7.8 6.4 Chroococcales Microcystaceae Gloeocapsa sp 4.1 1.8 1.8 Synechococcales Merismopediaceae Aphanocapsa 7.2 2.1 Fil. Cyano F 9.1 3 1.3 6.2 Fil. Cyano 1 2 2 3.6 4.2 Fil. Cyano 2 1.9 2.6 Fil. Cyano 3 7.2 6.8 1.6 Fil. Cyano 4 3.9 6.3 Fil. Cyano G 2.7 5.1 6.1 7.5 Fil. Cyano 5 1.8 2

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Coscinodiscophyceae Melosirales Melosiraceae Melosira varians 1.5 6.2

Bacillariophyceae Cocconeidales Cocconeidaceae Cocconeis placentula 4.6 3.2 2.0 8.0 4.8 2.5 1.0 3.6 5.3 2.0 Cymbellales Cymbellaceae Cymbella sp 1 4.8 3.3 1.0 2.1 7.9 Cymbella sp 2 1.3 Gomphonemataceae Gomphoneis herculeana 6.5 9.3 3.5 7.5 4.3 4.9 4.6 6.2 Gomphonema sp 3.4 3.4 3.1 6.4 2.5 1.5 2.4 1 2.1 2.4 5.8 2 Naviculales Amphipleuraceae Amphipleura pelucida 0.9 Naviculaceae Berkella linearis 2.5 2.5 5.3 Navicula sp 1 5.3 1.5 1.7 2.8 1.1 8.0 5.1 2.2 6.8 1.9 8.0 3.4 Navicula sp 2 1.1 8.9 4.1 5.6 Navicula sp 3 9.7 1.6 Rhopalodiales Rhopalodiaceae Epithemia adnata 6.7 2.1 0.9 1.0 2.7 5.0 1.6 Rhopalodia gibba 1.3 Surirellales Surirellaceae Surirella angusta 9.3 Tabellariales Tabellariaceae Diatoma mesodon 8.1 1.1 2.0 6.9 1.3 4.9 4.6 1.7 Fragilariales Fragilariaceae Synedra ulna 5.6 5.9 5.2 1.1 3.0 2.5 5.0 1.0 Synedra sp1 3.2 1.2 2.7 2.5 3.4 2.2

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Fragilaria capuccina 3.2 6.4 2.3 2.1 2.0 5.6 1.2 2.7 2.5 6.8 Licmophorales Ulnariaceae Hannaea arcus 1.5 1.0 1.4 1.6 4.9 3.5 1.2 2.8 1.1 1.2 Diatomea1 9.0 2.5 2.2 3.8 2.0 7.6 4.2 Diatomea2 3.3 1.1 1.0 Chrysophyceae Hydrurales Hydruraceae Hydrurus 3.8 2.3 1.4 Chromulinales Chrysosphaeraceae Chrysosphaera 8.8 9.3 7.0 3.1 Ulvophyceae Ulotrichales Ulotrichaceae Ulothrix sp 1.2 1.9 1.4 6.7 Cladophorales Cladophoraceae Rhizoclonium sp 2.6 Chlorophyceae Chaetophorales Chaetophoraceae Stigeoclonium 2.5 2.5 2.2 1.2 5.5 2.9 2.2 Oedogoniales Oedogoniaceae Oedogonium sp 2.0 Sphaeropleales Radiococcaceae Gloeocystis sp 1.9 Microspoaceae Sp 1 2.3 5.7 2.8 Sp 2 5.7 1.3 Zygnematophyceae Zygnematales Mougeotia sp 1.9 4.0 3.18 Cosmarium sp 5.6 3.8

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Capítulo IV

Análisis experimental de los efectos físicos y químicos de las cenizas volcánicas sobre el biofilm

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Introducción

Las cenizas volcánicas presentan dos tipos de efectos, físicos y químicos, que pueden modificar la estructura y la función del biofilm. Por un lado, entre los efectos físicos, el material en suspensión (los STS) al sedimentar podría tener efectos negativos sobre la biomasa del biofilm (Yamada and Nakamura 2002), aislando al biofilm de la columna de agua, fuente de oxígeno y nutrientes, e impidiendo la llegada de luz (Peterson 1996). Otro efecto físico adverso sería si en lugar de (ó además de) sedimentarse produjera un estrés por fricción (del inglés shear stress) sobre las superficies colonizadas por biofilm, limitando la fijación de la comunidad sobre el sustrato rocoso (Biggs and Thomsen 1995). Por otro lado, están los efectos químicos, ya que las cenizas volcánicas liberan nutrientes como el P y el Fe al ambiente (Cap. I, II y III). Los estudios sobre el efecto de la fertilización producida por estos elementos químicos sobre el biofilm de arroyos son numerosos (Borchardt, 1996; Dodd, 2003; Francoeur, 2001) e indican que el biofilm desempeña varias funciones en la eliminación de P de la columna de agua (Newbold et al. 1981, Mulholland 1996), incluída la captación tanto de P disuelto como particulado, disminuyendo la velocidad de transporte aguas abajo (Dodds 2003). Luego de la depositación de tefra sobre los ecosistemas acuáticos cambia la disponibilidad de superficies de colonización en los lechos de los arroyos. Las cenizas volcánicas pueden ocupar los intersticios entre las rocas o cubrir completamente el lecho (Hayes, 2002; Cap. I), lo cual se ha observado en el arroyo Totoral (Fig. 1.7). El efecto inmediato de la sedimentación es el enterramiento del biofilm, con claros efectos negativos sobre su biomasa (Peterson 1996, Yamada and Nakamura 2002). Aunque el biofilm puede adaptarse a estos cambios, ya que algunas especies son tolerantes a los disturbios por enterramiento, como por ejemplo algunas especies de diatomeas que son capaces de desplazarse hacia las capas superiores de la matriz (Díaz Villanueva et al. 2000), la biomasa tanto de algas como de bacterias suele ser mayor sobre rocas que en la arena (Romani and Sabater 2001). No obstante Witt y colaboradores (2017) han comprobado experimentalmente que frente a otros sustratos con estructura similar (como son el vidrio volcánico sintético, arena de arrecife, arena de calcita y arena de cuarzo) el biofilm que coloniza la ceniza volcánica recién depositada sobre ambientes marinos posee mayor

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diversidad bacteriana indicando con esto que las cenizas volcánicas tienen un potencial para promover la diversidad bacteriana en un escenario inmediatamente posterior a una erupción volcánica. Sin embargo, cuando la velocidad de corriente aumenta, los sedimentos son arrastrados aguas abajo y el efecto por enterramiento disminuye, dando paso a otro efecto, el desprendimiento por fricción (Fisher et al. 1982, Power and Stewart 1987). Algunos estudios mostraron que el aumento de sólidos en suspensión aumenta el desprendimiento del biofilm (Boulêtreau et al. 2010). Las comunidades epilíticas de los arroyos suelen tener adaptaciones que les permiten adherirse a los sustratos, como es el mucílago de diversos géneros de diatomeas (como Cocconeis, Gomphonema por ejemplo). El biofilm produce sustancias poliméricas extracelulares (EPS, del inglés extracellular polymeric substances) que contribuyen a la estabilidad mecánica y a la adhesión de la comunidad a las superficies (Lock 1993) y que frente a aumentos repentinos de la carga de sedimentos, la secreción de polisacáridos aumenta drásticamente (Ramasamy and Zhang 2005). Estas respuestas variables del biofilm ante el ingreso de material piroclástico al ecosistema indican una clara necesidad de comprender mejor los factores que pueden dictar la recuperación de los ecosistemas de arroyos andinos después de la depositación de cenizas.

Objetivo

El objetivo de este capítulo fue estudiar experimentalmente las respuestas del biofilm (estructura y función) a los efectos físicos (mayor concentración de STS mediante el agregado de vidrio molido) y químicos (enriquecimiento con P) de manera aislada y su interacción y compararlos con los efectos de las cenizas volcánicas.

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Hipótesis y predicciones

Experimento 1

H1: La interacción de los factores por la acción mecánica y fertilizante generará efectos antagónicos en las variables del biofilm.

P1: La interacción entre los dos factores a evaluar (tratamiento con agregado de vidrio molido y fósforo), generará un biofilm más desarrollado (mayor biomasa, clorofila y bacterias) que en el tratamiento con sólo vidrio (V) pero menos desarrollado que en el tratamiento con sólo fósforo (P).

H2: La acción mecánica del material particulado (por fricción ó depositación) sobre el biofilm modificarán las características del biofilm.

P2: La acción mecánica disminuirá la producción de biomasa por la fricción y/o depósito ejercida por el material particulado, por lo que crecerá menos que en el tratamiento control.

P3: El biofilm que presente material particulado secretará mayor cantidad de EPS para evitar el desprendimiento.

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H3: Las mayores concentraciones de P biodisponible provocarán un cambio en las relaciones C:P y en la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina.

P4: Las comunidades del biofilm con mayor concentración de P biodisponible, tendrán mayor biomasa, menor actividad de la fosfatasa alcalina y relaciones C:P y presentarán una composición algal con predominio de cianobacterias, que el biofilm que crece con menos P.

Experimento 2

H1: El tratamiento Ceniza y el tratamiento VP tendrán efectos similares sobre las variables del biofilm.

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P1: El biofilm del tratamiento Ceniza tendrá similares valores de biomasa algal (clorofila), abundancia de bacterias, P, C y N del biofilm y APA que el tratamiento VP.

Las hipótesis fueron testeadas de manera experimental

Materiales y métodos

Diseño experimental

Se llevaron a cabo dos experimentos de colonización de sustratos artificiales durante 84 días. Para ello se utilizaron canales artificiales, que son muy utilizados para realizar este tipo de experiencias (Horner et al. 1990, Pinelalloul et al. 1996, Sabater et al. 2002, Izagirre et al. 2009). Por un lado, para simular el efecto físico de la ceniza y evitar la lixiviación de elementos tales como el P, hemos utilizado vidrio molido. Por otro lado, para simular el efecto químico de la ceniza se utilizó una sal de P. Los canales artificiales se ubicaron en las instalaciones del invernadero del INIBIOMA. El experimento 1 (Fig. 4.1) tuvo un diseño factorial, con agregado de sólidos (vidrio molido) y P como factores, obteniendo cuatro tratamientos: Control (sin sólidos y sin P), V: con agregado de sólidos pero sin P, P: con agregado de P pero sin sólidos, VP: con agregado de sólidos y P. El experimento 2 se realizó para confirmar la validez de usar una sal de P y vidrio molido en el experimento 1, para evaluar el efecto químico y mecánico de las cenizas, tratamiento (VP) con el agregado de cenizas volcánicas (Ceniza).

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Fig. 4.1 Resumen del experimento 1, donde se indican los tratamientos realizados. Los factores utilizados fueron el Fósforo y Vidrio.

Cada mesocosmo (unidad experimental) consistió en un canal artificial de PVC de 76 cm de largo, 15 cm de ancho y 10 cm de alto. Como sustratos artificiales de colonización (SAC) para el crecimiento del biofilm se colocaron vidrios esmerilados de 1 cm x 2 cm de lado (Fig. 4.2). Los mesocosmos fueron llenados con 4 L de agua del arroyo Goye previamente filtrada (filtros GF/F). Se eligió utilizar agua de este arroyo por su bajo contenido de P (PRS <2 µg L-1). Se inoculó cada mesocosmos con 60 ml de una suspensión de biofilm obtenida al raspar rocas colectadas del arroyo Goye, con concentración de clorofila de 13,5 ± 0.4 ml L-1. El agua se hizo recircular por medio de una bomba sumergible (Atman-102, 600 L/h, 8.2 W) por cada canal a velocidad constante (0,04 m s-1). La luz y la temperatura fluctuaron de acuerdo a las condiciones ambientales. Se colocó un data logger (HOBO UA-001-08 Pendant Temp) en uno de los mesocosmos para medir las variaciones de temperatura, que mostró una gran amplitud diaria, con mínimas de 16 °C y máximas de 30 °C. Cada 4 días se agregó 500 ml de agua del arroyo filtrada para reemplazar la que se perdía por evaporación. En ambos experimentos se utilizaron 3 réplicas (mesocosmos) de cada tratamiento.

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Fig. 4.2 a. Canales artificiales. b. Disposición de los SAC en el fondo de los canales; c) esquema de un mesocosmos con el flujo de agua.

Para simular el efecto físico de las cenizas se utilizó vidrio molido. Luego de moler el vidrio se tamizó a través de un tamiz con poro de 500 µm. Luego de una serie de ensayos para determinar qué cantidad de vidrio era necesario agregar para que, luego de decantar, se mantenga en suspensión una concentración similar a la media hallada en los ambientes afectados por cenizas volcánicas (15 mg L-1 aproximadamente), se agregaron 240 mg en cada canal (de 4 lts) para obtener una concentración final de 60 mg L-1 en suspensión. Al final del experimento se midió la concentración de sólidos en suspensión de todos los mesocosmos, filtrando 400 ml de agua a través de filtro GF/F previamente pesado. Luego de ser secado en estufa (60°C, 48 h) se volvió a pesar y por diferencia se calcularon los sólidos por litro. Para simular el efecto de enriquecimiento por P se utilizaron difusores de agar enriquecido con P (NDS – del inglés Nutrient Diffusing Substrata). Este tipo de dispositivos es ampliamente utilizado para experiencias de enriquecimiento en biofilm (Corkum 1996, Rugenski et al. 2008, Scott et al. 2009). Para determinar la concentración de P en los difusores que nos mantuviera la concentración de P deseada en los mesocosmos se

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llevó a cabo un ensayo previo en el que se dispusieron difusores con tres concentraciones de P (0,05; 0,25 y 0,005 M) y un control (sin agregado de P) con tres replicas cada uno. Para la construcción de los difusores (Gibeau Jr and Miller 1989), se preparó una solución madre de K2HPO4 0,05 M. Los difusores fueron construidos en cubetas de plástico previamente lavados con ácido sulfúrico al 10% y enjuagado con agua destilada y esterilizados en microondas. Como sustrato se preparó agar 2%, con agua Milli Q y la sal de P de la siguiente manera:

a. 0.05 M = 50 ml de sol. Madre de K2HPO4 + 1 g de agar

b. 0.025 M = 25 ml de sol. Madre de K2HPO4 + 25ml de agua Milli Q + 1 g de agar

c. 0.005 M = 5ml de sol. Madre de K2HPO4 + 45ml de agua Milli Q + 1 g de agar d. Control = 50ml de agua Milli Q + 1g de agar

La solución se calentó hasta disolver el agar y se esterilizó durante 20 min a 130 °C. Las cubetas fueron rellenadas con la solución bajo flujo laminar donde se dejaron enfriar, tapadas con envoltura de aluminio y se reservaron en la heladera hasta su uso. Los difusores se colocaron dentro de los canales con agua. Tomamos muestras del agua para medir la concentración inicial de P (t0) y luego de una hora, y luego de 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 días (Fig. 4.3).

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Fig. 4.3 Concentraciones de P (medido como PRS) liberadas en cada concentración: Control (sin el agregado de P), y las concentraciones de 0,005; 0,025 y 0,05 M de P a lo largo del tiempo.

Así se determinó que se utilizaría una concentración de 0,005 M y que el difusor sería reemplazado cada 5 días (ya que luego de los 5 días disminuyó la difusión de P al sistema). En los tratamientos sin agregado de P se colocaron los mismos difusores de agar pero sin P, para que los aportes de C que podría estar ocasionando el agar sean comunes en todos los tratamientos. La concentración de PRS fue medida cada 5 días, previamente al recambio del difusor, en todos los mesocosmos, para confirmar que se mantuviera constante. La medición de PRS se realizó como se explica en el Cap. II.

En el experimento 2 los tratamientos consistieron en: VP (con vidrio y P): Se utilizaron las mismas concentraciones de vidrio molido y P que en el experimento anterior. Ceniza (con cenizas): Se utilizaron cenizas colectadas de los depósitos tras la erupción del volcán Puyehue. Las muestras de ceniza fueron colectadas de los depósitos de tefra seca, a 5 cm de profundidad de capas que superaban los 20 cm de profundidad. Se utilizaron palas plásticas para su recolección y fueron colocadas en bolsas ziploc limpias. Las cenizas previamente a su uso en los mesocosmos, se autoclavaron para evitar la presencia de

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bacterias externas al experimento. Además se colocaron difusores de agar sin el agregado de P.

Parámetros del biofilm

Las respuestas del biofilm a los diferentes tratamientos fueron evaluadas de la siguiente manera: La dinámica de colonización del biofilm se analizó mediante el aumento de concentración de clorofila y la abundancia bacteriana. Además, se cuantificó el contenido de C, N y P, la actividad de fosfatasa alcalina (APA) y la cantidad de EPS en diferentes momentos de la colonización. Se calcularon las relaciones C:P, C:N y N:P. La biomasa en términos de peso seco libre de ceniza (PSLC) fue cuantificada al final del experimento. Se realizaron observaciones al microscopio para determinar el grupo de productores primarios dominante en cada tratamiento. Además, para comparar la estructura del biofilm, se observaron sustratos extraídos en la última fecha del experimento con imágenes obtenidas con un microscopio electrónico de barrido (SEM) (Tabla 4.1). Para cada parámetro y en cada fecha se utilizó un SAC entero, que fue recolectado en tubos Falcon y transportados al laboratorio inmediatamente.

Tabla 4.1 Resumen de las fechas de muestreo realizadas junto con los parámetros medidos del biofilm y del canal en cada fecha.

T1 T2 T3 T4 T5 T6 7 días 14 días 28 días 42 días 63 días 84 días (8/11) (15/11) (29/11) (13/12) (3/01) (24/01) STS x PRS x x x x x x Clorofila x x x x x x Bacterias x x x x x C y N x x x x P x x x x x APA x x x EPS x x x x PSLC x SEM x

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Mediciones de laboratorio

Productores primarios y bacterias

Las mediciones de concentración de clorofila se realizaron colocando el SAC dentro del tubo de extracción con alcohol. La extracción se realizó según la metodología de Nusch (1980), las lecturas se llevaron a cabo en un fluorómetro Perkin Elmer LS45, que es un método más sensible que permite determinar concentraciones muy bajas de clorofila (Rivera et al. 2005). Para las identificaciones algales se guardaron los SAC en solución de lugol y luego fueron procesadas como en el Cap. II. Para los recuentos bacterianos se fijaron las muestras en formol al 2% v/v luego de sonicar el SAC en 3 ml de agua Milli Q durante 2 minutos en un baño sonicador (Selecta S.A., España) a 40 W y 40 kHz. Luego las muestras fueron filtradas y los recuentos realizados como se explica en el Cap. III.

Elementos del biofilm (C, N y P)

El C y N del biofilm fueron medidos de la misma muestra. Un SAC fue raspado con un escalpelo en esterilidad y la suspensión obtenida con 2 ml de agua Milli Q fue filtrada por filtros previamente muflados (GF/F). Los filtros se secaron a 60 °C durante 48 h. Las muestras fueron procesadas con un analizador elemental Thermo Finnigan EA 1112 CN (Thermo Scientific, Milano, Italia). Para medir el P del biofilm, se utilizó un SAC para la digestión con persulfato de amonio (1,5 atm por 1 h) y luego se midió el PRS con el método del molibdato de amonio descripto en el Cap. II. La biomasa final del biofilm se estimó mediante el peso seco libre de cenizas (PSLC) que fue obtenido raspando un SAC con escalpelo. La suspensión obtenida con agua Milli Q fue filtrada por filtros muflados (GF/F) y luego se procedió como se describe en el Cap. III.

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Actividad enzimática

Para le medición de la APA se procedió con la misma metodología que en el Cap. II con la diferencia de que se utilizaron muestras frescas (Romani 2010). Los SAC fueron introducidos en tubos Falcon con agua Milli Q e incubados con el sustrato fluorescente durante 30 min.

Sustancias poliméricas extracelulares

Para la extracción de las EPS se utilizó una resina de intercambio catiónico (Romani et al. 2008). Para el acondicionamiento previo de la misma se colocaron 20 g de resina en agua MilliQ durante toda la noche a temperatura ambiente. Al dia siguiente se cambió el agua por HCl 4 M por 1 h y luego se enjuagó con sucesivos cambios de agua MilliQ hasta volver al pH neutro. Por último la resina se colocó en NaOH 1 M durante 4 h con enjuagues posteriores hasta recuperar el pH neutro. Este procedimiento de lavados ácido-base se repitió 2 veces más. Una hora antes de la extracción, la resina se incubó con buffer fosfato. El biofilm se obtuvo raspando la superficie del SAC y lavando con 1,5 ml de buffer fosfato. Se agregaron 0,5 g de resina a la suspensión del biofilm, y se incubó en hielo durante una hora a 250 rpm de agitación. Después de la incubación, se centrifugó la muestra a 11000 rpm (12000 g) durante 15 minutos a 4 ° C. Del volumen total del sobrenadante, se extrajeron 500 µL de cada muestra en tubos de vidrio para la determinación del contenido de polisacárido mediante el ensayo de fenol / H2SO4 (Dubois, 1956). Este método se basa en el hecho de que el fenol se puede utilizar para la cuantificación colorimétrica de polisacáridos en presencia de ácido sulfúrico. A los extractos de EPS (500 µL) en tubos de vidrio se le agregaron 12,5 µL de solución de fenol 80 % (P/P) y 1,25 ml de H2SO4 concentrado. Luego de 10 minutos, se colocaron en un baño de agua donde se incuban durante 20 minutos a 30° C. Se midió absorbancia a 485 nm. Se realizó un estándar de glucosa para determinar la concentración de polisacáridos a partir de la absorbancia.

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Estructura del biofilm

Para observar la estructura del biofilm se obtuvieron imágenes en el microscopio electrónico de barrido (Scanning Electron Microscopy - SEM) de SACs correspondientes a la última fecha del experimento. Los SACs fueron cuidadosamente colocados en el fondo de un frasco de vidrio y fijados inmediatamente con 2,5% glutaraldehido en 0,1 M buffer cacodilato, pH 7,2–7,4 hasta el día siguiente. Luego se realizaron 3 lavados con buffer fosfato, de 5 minutos cada uno. Por último las muestras se deshidrataron de la siguiente manera: Etanol 40% 5 min, Etanol 60% 5 min, Etanol 80% 5 min, Etanol 100% 10 min. La muestra mantenida en el etanol 100% fue transportada al Laboratorio de Microscopía del Grupo de Caracterización de Materiales del Centro Atómico Bariloche, donde se realizó el secado en punto crítico con CO2. Luego las muestras fueron cubiertas por una capa de oro y se obtuvieron las imágenes con un SEM FEI Inspect S50.

Análisis de datos

En el experimento 1, tanto el PRS de los mesocosmos como los parámetros del biofilm (clorofila, abundancia de bacterias, contenido C, N y P del biofilm, relaciones C:P, C:N y N:P, APA y EPS) se analizaron utilizando RM-ANOVA de dos vías. El análisis se realizó según el diseño experimental bifactorial: Vidrio – Fósforo, a lo largo del tiempo (para cada caso). Los factores entre-sujeto fueron dos: “Vidrio” (con dos niveles: con y sin) y “Fósforo” (con dos niveles: con y sin). El factor intra-sujeto fue "Días" (con distintos niveles según Tabla 1). El experimento 2 se analizó mediante ANOVA de 1 vía y en los casos que hubiera medidas a lo largo del tiempo se utilizó RM-ANOVA de 1 vía, donde se comparó el factor “Origen” del sedimento, con tres niveles: Natural (cenizas volcánicas), Artificial (vidrio molido y agregado de P) y Control (sin ningún agregado). Tanto en el experimento 1 como en el 2, las variables que se analizaron sólo en el Tf (relación C:clorofila, PSLC y EPS/PSLC) se hicieron mediante un ANOVA de dos vías (exp 1) o 1 via (exp 2).

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Para los análisis a posteriori, se usaron las pruebas de Bonferroni para comparar los efectos principales. Estos contrastes se basan en las comparaciones pareadas linealmente independientes entre las medias marginales estimadas. La normalidad y la esfericidad se verificaron previamente. La corrección Greenhouse- Geisser se usó para calcular el nivel P ajustado de la prueba F cuando no se alcanzó la esfericidad.

Resultados

Experimento 1

Condiciones experimentales de los arroyos

En los canales con agregado de P se logró una concentración de PRS mayor que en los que no se les agregó P (Tabla 4.2). En los tratamientos P y VP, las concentraciones se mantuvieron constantes, en alrededor de 100 µg L-1 hasta los 42 días, luego de lo cual decayó, mientras que en los tratamientos sin agregado de P (C y V), se mantuvo cercano a 2,5 µg L-1 a lo largo del experimento (Fig. 4.4). Los sólidos totales en suspensión fueron diferentes entre los tratamientos en el T6 cuando fue medido (P=0,007), siendo diferentes el tratamiento VP (7,8 ± 1,0 mg L-1) respecto al C (2,2 ± 1,0 mg L-1) y al P (3,3 ± 1,0 mg L-1) (a posteriori, P=0,015 y P=0,013 respectivamente). Con el tratamiento V (7,8 ± 1,0 mg L-1) no hubo diferencias. La turbidez estuvo por debajo del nivel de detección.

130

Fig. 4.4 Concentraciones de fósforo reactivo soluble (PRS) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento.

Tabla 4.2 Resultados de los RM-ANOVA de dos vías para los parámetros del biofilm durante el experimento.

Vidrio Fósforo Vidrio x Fósforo Variables F P F P F P PRS 0,27 0,62 384,50 <0,001** 0,77 0,41 Clorofila 20,47 0,002* 40,96 <0,001** 7,86 0,023* Bacterias 12,40 0,008* 8,71 0,018* 17,14 0,003* C 6,43 0,035* 5,74 0,044* 7,41 0,026* N 41,10 <0,001** 33,69 <0,001** 46,82 <0,001** P 2,78 0,13 7,55 0,25 15,34 0,004* C:Clorofila 0,62 0,453 0,59 0,464 9,98 0,013* C:P 24,72 0,001* 1,16 0,31 6,37 0,036* C:N 2,25 0,172 1,60 0,242 10,64 0,012* N:P 12,38 0,008* 3,77 0,088 6,27 0,037* APA pslc -1 17,39 0.003* 13,73 0,006* 5,78 0,043* (cm-2) 7,99 0,022* 2,66 0,141 1,23 0,299 EPS (pslc-1) 12,86 0,016* 0,58 0,479 34,89 0,002* PSLC 13,59 0,010* 39,53 <0,001** 35,76 <0,001**

131

Desarrollo de la biomasa

El desarrollo algal sobre los SACs se incrementó a lo largo del tiempo y alcanzó la máxima capacidad de carga sólo en el tratamiento P, observada en el día 64, luego del cual se produjo una disminución (Fig. 4.5), probablemente por desprendimiento del biofilm senescente. El efecto del P dependió de la presencia de vidrio (Tabla 4.2), ya que la concentración de clorofila fue 10 veces mayor en el tratamiento P que en el tratamiento VP a los 64 días (a posteriori, P=0,005; Fig. 4.5). El biofilm del tratamiento P fue el que tuvo mayor biomasa algal respecto a los tratamientos C, V y VP (a posteriori, P=0,001; P<0,001 y P=0,005 respectivamente). La abundancia bacteriana alcanzó un crecimiento estacionario en todos los tratamientos, entre los 40 y 60 días del experimento excepto en el tratamiento P, en el cual siguió creciendo (Fig. 4.6). Los factores P y V también interactuaron en el efecto sobre la abundancia bacteriana (Tabla 4.2), alcanzando los mayores valores en el tratamiento P respecto a los tratamientos C, V y VP (a posteriori, P=0,006; P=0,001 y P=0,004 respectivamente). Las determinaciones al microscopio de los grandes grupos de productores primarios indican un predominio de cianobacterias en los tratamientos P y VP, observando en el tratamiento P que el alga dominante fue Nostoc diferenciándose del tratamiento VP donde domino la cianobacteria Calothrix. En los tratamientos C y V dominaron las diatomeas.

132

0.35 0.08 C V 0.30 0.06 0.25

0.20 0.04 0.15 ) 0.02

-2 0.10

0.05 0.00 0.00

VP P 3 0.3

VP 2

Clorofila (µg cm (µg Clorofila 0.2

1 0.1

0.0 0

0 20 40 60 80 1000 20 40 60 80 100

Fig. 4.5 Dinámica de colonización de los autótrofos medido a través de la concentración de Clorofila en cada uno de los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento. La curva se graficó sólo en los casos en que ésta tuviera un buen ajuste (todas excepto P).

Fig. 4.6 Abundancia de bacterias en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento. La escala fue logaritmizada para disminuir la diferencia con el tratamiento P y poder comparar los efectos de los diferentes tratamientos en un mismo gráfico.

133

Los efectos del P en la biomasa del biofilm expresado como peso seco libre de ceniza (PSLC), también dependió de la presencia de vidrio, siendo mayor en el tratamiento P (Tabla 4.2; Fig. 4.7).

1.6

1.4

1.2 )

-2 1.0

0.8

0.6 PSLC (mg cm PSLC (mg 0.4

0.2

0.0 C V VP P

Fig. 4.7 Peso seco libre de cenizas (PSLC) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) en el Tf.

Carbono, Nitrógeno y Fósforo.

Tanto el contenido de C como el de N y P en el biofilm fueron afectados positivamente por el aumento de P sólo en ausencia de vidrio (Tabla 4.2; Fig. 4.8).

Fig. 4.8 Concentración de C (a), N (b) y P (c) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento.

134

La relación C:Clorofila al final del experimento, al contrario, fue mayor en el tratamiento V (Tabla 4.2; Fig. 4.9), indicando un biofilm más heterotrófico en este tratamiento.

5000

4000 ) -1

3000

2000

C/Clorofila (mg mg (mg C/Clorofila 1000

0 C V VP P

Fig. 4.9 Relación C/Clorofila en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) en el Tf.

Relación C:P y Actividad de la fosfatasa alcalina

La relación C:P fue mayor en el tratamiento con agregado de P pero sin vidrio (Tabla 4.2) (Fig. 4.10a). También hubo interacción entre los tratamientos P y V en la APA (Tabla 4.2), siendo el biofilm del tratamiento control el que secretó las mayores concentraciones de APA respecto a los tratamientos V, VP y P (a posteriori, P=0,010; P=0,003 y P=0,015 respectivamente).

135

Fig. 4.10 Relación C:P (a) y actividad de la fosfatasa alcalina (APA) (b) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento.

Relaciones C:N y N:P

No hubo diferencias entre los tratamientos ni entre las fechas a lo largo del experimento en las relaciones C:N (Tabla 4.2; Fig. 4.11a). En cambio, hubo interacción entre los factores en la relación N:P (Tabla 4.2; Fig. 4.11b), siendo mayores en el tratamiento P respecto a los tratamientos V y VP (a posteriori, P=0,029 y P=0,017 respectivamente).

Fig. 4.11 Relación C:N (a) y N:P (b) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento.

136

Sustancias poliméricas extracelulares (EPS)

Las EPS por unidad de superficie estuvieron negativamente afectadas por el factor vidrio (Tabla 4.2; Fig. 4.12a). Sin embargo, la cantidad de EPS por biomasa de biofilm al final del experimento nos indica que la proporción de EPS fue mayor en el tratamiento V (Tabla 4.2; Fig. 4.12b).

Fig. 4.12 Concentración de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) en los tratamientos Control (C), Vidrio (V), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento por unidad de área (a) y en el Tf por unidad de biomasa de biofilm (b).

Imágenes en el Microscopio Electrónico de Barrido

Las imágenes obtenidas de los SAC de los tratamientos V y PV muestran la presencia de partículas de vidrio en ambos tratamientos pero con un desarrollo del biofilm mucho más conspicuo en el tratamiento VP (Fig. 4.13).

137

Fig. 4.13 Fotografías en el SEM, a) tratamiento V, b) tratamiento VP Escala: la barra representa 200 µm. Las flechas indican los cristales de vidrio depositado.

Experimento 2

PRS

El PRS fue diferente (P<0,001) entre los tratamientos. El P liberado por las cenizas fue de 6,45 ± 0,96 µg P L-1, significativamente menor que el agregado en el tratamiento VP (a posteriori, P=0,002; Fig. 4.14). No hallamos diferencias significativas entre el tratamiento con cenizas y el C (a posteriori, P=0,849). La concentración de STS fueron diferente entre los tratamientos (P=0,025), siendo mayores en el tratamiento Ceniza (25,0 ± 11,0 mg L-1) que en C (2,2 ± 1,0 mg L-1) y VP (7,8 ± 1,0 mg L-1) (a posteriori, P<0,005 en ambos casos). En relación a la turbidez, el tratamiento Ceniza fue el único que presentó valores de turbidez medibles (NTU=133,63 ± 73,29).

138

4.14 Concentraciones de fósforo reactivo soluble (PRS) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Fósforo (P) a lo largo del experimento.

Clorofila y abundancia de Bacterias

La concentración de clorofila difirió entre los tratamientos (P=0,004). El efecto de la ceniza sobre la biomasa de autótrofos fue similar al del tratamiento VP (a posteriori, P=1.000; Fig. 4.15a) pero se diferenció del tratamiento C (a posteriori, P=0,010) siendo mayor en este último. La abundancia de las bacterias fue diferente entre los tratamientos (P=0,0013), siendo mayor en el tratamiento Cenizas respecto a los tratamientos VP y C (a posteriori, P=0,019 y P=0,037 respectivamente, Fig.15b).

139

)

1e+0 -2 1.4e+7 a) b) C VP 1.2e+7

) 1e-1 Ceniza -2 1.0e+7

1e-2 8.0e+6

6.0e+6 1e-3

4.0e+6

log Clorofila (µg cm (µg Clorofila log 1e-4 2.0e+6

1e-5 Abundancia de bacterias células (N° cm 0.0 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Días Días Fig. 4.15 Concentración de clorofila-a (a) y abundancia de bacterias (b) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza a lo largo del experimento.

Por otro lado, hubo diferencias en la biomasa del biofilm (PSLC) entre los tratamientos (P<0,001), siendo el tratamiento Ceniza el que tuvo mayor contenido de biomasa respecto al tratamiento C y VP (a posteriori, P=0,002 y P=0,008 respectivamente; Fig. 4.16).

0.7

0.6

) 0.5 -2 0.4

0.3

PSLC (mg cm PSLC (mg 0.2

0.1

0.0 C VP Ceniza

Fig. 4.16 Peso seco libre de cenizas (PSLC) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza en el Tf.

Carbono, Nitrógeno y Fósforo

140

A pesar de que no se observaron diferencias entre los tratamientos en el contenido de C y N (P=0,053 y P=0,180; Fig. 4.17a y b respectivamente), sí se diferenciaron respecto al contenido de P (P=0,030), siendo menor en el tratamiento C respecto al tratamiento Ceniza (a posteriori, P=0,035; Fig. 4.17c), y el tratamiento VP no difirió del tratamiento Ceniza (a posteriori, P=0,846).

40 3.0 2.0 a) b) c) C 1.8 VP 35 2.5 Ceniza 1.6 ) ) -2 -2 -2) 30 1.4 2.0 25 1.2 1.5 1.0 20 0.8 1.0 0.6 15 cm (µg biofilm P C biofilm (µg cm (µg biofilm C N biofilm (µg cm (µg biofilm N 0.4 10 0.5 0.2 5 0.0 0.0 20 30 40 50 60 70 80 90 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dias Días Días Fig. 4.17 Concentración de C (a), N (b) y P (c) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza a lo largo del experimento.

Relación C:clorofila

La relación C:Clorofila varió entre los tratamientos (P=0,004). Los tratamientos Ceniza y VP fueron semejantes (a posteriori, P=1,000; Fig. 4.18) y la relación fue mayor que en el C (a posteriori, P=0,010).

1e+6 C VP 1e+5 Ceniza ) -1

1e+4

1e+3

C/Clorofila (mg mg (mg C/Clorofila 1e+2

1e+1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Días

141

Fig. 4.18 Relación C/Clorofila en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza a lo largo del experimento.

Relación C:P y APA

La relación C:P del biofilm fue diferente entre los tratamientos (P=0,029). Sin embargo, el efecto de las cenizas tuvo el mismo efecto que en el tratamiento VP (a posteriori, P=1,000; Fig. 4.19a) pero se diferenciaron en la relación C:P con el C (a posteriori, P=0,048). La secreción de APA fue diferente entre los tratamientos (P=0,003), siendo en el tratamiento ceniza tan alta como en el control, y significativamente mayor que en el tratamiento VP (a posteriori, P=0,065 y P<0,001 respectivamente; Fig. 4.19b).

140 1200 a) C b)

120 VP ) 1000 Ceniza -1 h -1 100 800

80 600

60 400

40 200 C:P (relación atómica)

20 PSLC APA (nM MUmg 0

0 30 40 50 60 70 80 90 30 40 50 60 70 80 90 Días Días Fig. 4.19 Relación C:P (a) y actividad de la fosfatasa alcalina (APA) (b) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza a lo largo del experimento.

Relaciones C:N y N:P

Respecto a las relaciones C:N del biofilm no encontramos diferencias entre los tratamientos (P=0,604), pero si la hubo en las relaciones N:P del biofilm entre los tratamientos (P=0,009; Fig. 4.20) siendo diferentes el tratamiento Ceniza respecto a los tratamientos C y VP (a posteriori, P=0,015 y P=0,016 respectivamente).

142

40 10 a) b)

8 30

6 20 4

10 N:P (relación atómica) C:N (relación atómica) 2

0 0 C VP Ceniza C VP Ceniza Fig. 4.20 Relación C:N (a) y N:P (b) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza en el Tf.

Sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y Peso seco libre de ceniza (PSLC)

La liberación de EPS por el biofilm no difirió entre los tratamientos, sin embargo hubo una tendencia a ser mayores en el tratamiento C (P=0,078; Fig. 4.21).

10 EPS (ug mg PSLC) (ugEPS mg

0 C VP Ceniza

Fig. 4.21 Concentración de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y peso seco libre de cenizas (PSLC) en los tratamientos Control (C), Vidrio y Fósforo (VP) y Ceniza en el Tf.

Imágenes en el Microscopio Electrónico de Barrido

143

En la siguiente imagen se observa las diferencias en la superficie entre una partícula de vidrio y una volcánica (Fig. 4.21 a y b). La superficie de la pumicita posee una mayor rugosidad, por lo cual una relación superficie/volumen mucho mayor.

Fig. 4.22 Fotografías en el SEM, a) Cristales de vidrio, b) Partícula piroclástica (Fotografía tomada de: (Daga, 2012). Escala: la barra representa a) 25 µm y b) 100 µm.

Discusión

El efecto de las cenizas volcánicas en el ambiente es complejo debido a que son múltiples los factores que se modifican al mismo tiempo. Nuestro diseño experimental permitió evaluar los efectos de los STS y del PRS por separado así como también su interacción sobre la estructura y función del biofilm. Nuestros datos validan la predicción de que hay interacción entre los dos factores estudiados. Tanto la concentración de clorofila, la biomasa final (PSLC), el contenido de C, N y P, como las relaciones elementales C:P y N:P y la APA fueron mayores en el tratamiento P, sin vidrio, mientras que tanto la relación C:clorofila como la concentración de EPS por unidad de biomasa fue mayor en los tratamientos con V sin P.

144

Experimento I

Los efectos físicos que pueden causar sobre el biofilm los STS están asociados a su transporte en suspensión y decantación. Los factores que determinan este comportamiento son la velocidad del flujo y el tamaño de las partículas (Ayris and Delmelle 2012). En los arroyos, las partículas de tefra <100 μm de diámetro pueden transportarse dentro de la columna de agua indefinidamente, pero con velocidades de flujo por debajo de 0,05 m s-1 pueden depositarse (Collinson and Thompson 1989). En relación a esto, hemos observado tanto en los tratamientos con vidrio como con ceniza (Experimento 2) la depositación de algunos milímetros de sedimento, aunque menores a las observadas en otros trabajos que llegaron a registrar 1 cm (Izagirre et al. 2009) ó hasta 10 cm de depósitos (Brookes 1986). En nuestro caso, debido al tamaño de partícula, que fue <500 μm de diámetro, y a la velocidad baja de flujo alcanzada, de 0,04 m s-1, el efecto del agregado de sólidos se debe atribuir a la decantación más que a la erosión. La depositación de sedimentos sobre los SACs modificó la disponibilidad de superficies de colonización. La biomasa tanto de algas como de bacterias suele ser mayor sobre rocas que en la arena en los lechos de los arroyos (Romani and Sabater 2001). El efecto de la sedimentación es el enterramiento del biofilm, con claros efectos negativos sobre su biomasa (Peterson 1996, Díaz Villanueva et al. 2000, Yamada and Nakamura 2002, Izagirre et al. 2009, Boulêtreau et al. 2010). Nosotros obtuvimos el mismo efecto negativo en los tratamientos con V. Además, la decantación del vidrio molido aumentó la cantidad de EPS/mg, con lo cual también aumentó la relación C/clorofila, generando un biofilm mucho menos autotrófico. Uno de las principales funciones de los EPS es la adhesión de las células al sustrato. La matriz polimérica además da como resultado una respuesta adaptativa que puede proteger al biofilm de la erosión (Flemming and Wingender 2010). En el capítulo anterior (Cap. III), mostramos que en los arroyos afectados por cenizas volcánicas, el biofilm contenía mayor proporción de C y un índice autotrófico más bajo, a pesar de tener altas concentraciones de clorofila y se lo atribuimos a que estos biofilms estaban dominados por colonias de Nostoc, al igual que los tratamientos P del experimento (y Calothrix en el tratamiento VP), con

145

altos contenidos de polisacáridos. Con los resultados del presente experimento confirmamos que la presencia de sólidos, tanto porque se encuentren en suspensión como por su decantación, promueven la generación de una matriz con mayor proporción de EPS. El incremento de P respecto al N en los ecosistemas acuáticos promueve un aumento en la abundancia de cianobacterias fijadoras de N2 (Smith and Kalff 1983, Levine and Schindler 1999, Marcarelli and Wurtsbaugh 2006). En el Capítulo III observamos que a mayores concentraciones de P (arroyos afectados) se favorecía el predominio de cianobacterias. Los resultados de nuestro experimento fueron consistentes con esta respuesta del biofilm. Llamativamente, las relaciones N:P del biofilm del tratamiento P fueron mucho mayores que en los demás tratamientos. Esto se debió a que, al tener mayor disponibilidad de P, el biofilm no sólo contuvo más P sino que además incorporó mucho más N que en los demás tratamientos, seguramente gracias a la fijación de N2 por parte de Nostoc. Por otro lado, en el tratamiento VP esto no sucedió. En el tratamiento VP, la presencia de vidrio pareció impedir la fijación de las colonias de Nostoc y en su lugar se vio un predominio de Calotrhix. A pesar de que Calotrhix también posee la capacidad de fijar

N2, Nostoc tiene además la ventaja de poseer grandes cantidades del pigmento C-

Ficocianina, que frente a limitaciones por N (ya que la fijación N2 puede representar un alto costo energético) pueden degradarlo para usarlo como fuente de N sin ninguna consecuencia sobre su tasa de crecimiento (Boussiba and Richmond 1980, Lee et al. 2017) siendo una posible explicación a las mayores relaciones N:P en el tratamiento P (21) respecto al tratamiento VP (5). En el Capítulo III, observamos que en los arroyos afectados, con bajas relaciones C:P, encontramos las menores concentraciones de APA. Los microorganismos, ante el déficit de P biodisponible tienen la capacidad de liberar enzimas extracelulares (Jansson et al. 1988). Scott y colaboradores (2009) observaron que la APA siempre fue menor en los tratamientos enriquecidos con P respecto a aquellos enriquecidos con N y en el control. Nosotros también obtuvimos valores significativamente mayores en los controles, lo cual indica que el biofilm se encontraba limitado por P.

Experimento 2

146

El efecto del agregado de cenizas volcánicas no logró ser simulado perfectamente por el agregado de P y vidrio molido. En principio, los menores valores de PRS en el agua en el tratamiento cenizas que el VP pudo deberse a que el lixiviado de P por parte de las cenizas sucede en las primeras horas (24-48 hs) de verter las cenizas en los canales (Cap. II). Este ingreso de P pudo haber sido utilizado rápidamente por el biofilm, mientras que en el tratamiento VP la liberación de P por medio de los difusores es constante. Estas diferencias en la concentración de P no se vieron reflejadas en la concentración de clorofila, ya que fueron similares en los tratamientos cenizas y VP. Sin embargo, la sedimentación de las cenizas tuvo un efecto negativo sobre los productores primarios mayor que el que tuvo el tratamiento VP, ya que sólo el tratamiento con cenizas tuvo menor concentración de clorofila que el control. Esto puede deberse a que las cenizas dejaban pasar menos la luz respecto a los tratamientos VP y C, ya que presentaron mayores STS y mayor turbidez, en cambio el tratamiento VP tuvo mucho menos STS y presentó valores indetectables de turbidez. En lagos afectados por cenizas volcánicas también se observó un incremento de los niveles de STS y en consecuencia una disminución en la penetración de la luz (Modenutti et al. 2013). A diferencia de Modenutti y colaboradores, que observaron un incremento en la concentración de clorofila por un efecto de sombreo que favorece la actividad fotosintética en estos ambientes ultraoligotróficas con altas radiaciones, nuestros datos indican que este sombreo (por aumento de turbidez) junto con la mayor concentración de STS fue en detrimento del desarrollo autotrófico. Esta diferencia en la respuesta de los autótrofos podría deberse a que las intensidades lumínicas en las instalaciones estaban reducidas por una mediasombra sobre los canales. El biofilm de arroyos en estas latitudes está afectado negativamente por las altas radiaciones (2000-2600 μE.m-2.s-1 en verano) (Villanueva et al. 2010a, Martyniuk et al. 2016) por lo cual la mediasombra en condiciones experimentales permitió el desarrollo adecuado del biofilm. Por otro lado, las cenizas tuvieron un efecto positivo sobre el número de bacterias que el tratamiento VP no tuvo. Estos resultados, junto a una biomasa (PSLC) mayor en el tratamiento cenizas, indicarían que se formó un biofilm más heterotrófico. Posiblemente las diferencias entre los efectos de las cenizas y el vidrio molido sobre el biofilm se deban a diferencias en la estructura y composición del sedimento (las diferencias estructurales entre la ceniza y el vidrio). Ann y colaboradores (2019) indicaron que las características físicas

147

de los sedimentos (por ejemplo, la heterogeneidad y la porosidad del sedimento) influencian la densidad bacteriana. Por su gran relación superficie/volumen (Fig. 4.21b) la pumicita permite la colonización microbiana exitosamente (Di Lorenzo et al. 2005). Además de la porosidad extremadamente alta, las vesículas interconectadas y la abundancia de minerales expuestos, como el sílice, la pumicita tiene la capacidad inusualmente alta de adsorber elementos biológicamente importantes, incluidos compuestos orgánicos tales como lípidos y compuestos inorgánicos como los fosfatos, así como para maximizar el área de superficie efectiva necesaria para las reacciones químicas (Brasier et al. 2011). Elser et al (2015b) indicaron que el ingreso de pumicita en lagos ultraoligotroficos creó nuevos sustratos flotantes para la vida microbiana, que alojan conjuntos microbianos que divergen a los hallados en la columna de agua. A pesar de no haber logrado simular el efecto de las cenizas con el tratamiento VP, el experimento sirvió para demostrar la interacción de estos dos factores que actúan de manera simultánea cuando ingresan las cenizas volcánicas al arroyo.

148

ConclusionesPor medio de los estudios realizados Generales en la presente tesis concluimos que:

Luego de la erupción volcánica se produjo una marcada heterogeneidad espacial a lo largo del gradiente de depositación, observando cuencas afectadas y cuencas no afectados dentro de los 80 km al este del CVPCC.

Los depósitos volcánicos presentes en las cuencas afectadas por el volcán aún liberan P y Fe, particularmente si las rocas están sujetas a la molienda mecánica.

7 años después de la erupción volcánica, los arroyos de cabecera que fueron originalmente más afectados (aquellos más cercanos al CVPCC) aún contienen más sólidos en suspensión y mayores concentraciones de P y Fe en el agua que arroyos más alejados.

Las variaciones estacionales de caudal y las precipitaciones participan en la dinámica de ingreso de material volcánico en los arroyos.

Las perturbaciones observadas en la cuenca tras la erupción volcánica generaron cambios sobre el biofilm. Dichos cambios fueron los siguientes:

o Disminución de las relaciones C:P o Disminución de la APA o Disminución del índice autotrófico

149

o Cambio en la dominancia de los grupos de autótrofos, siendo las cianobacterias dominantes en los arroyos afectados. Dado que las comunidades del biofilm en los arroyos de bajo orden son importantes para el ciclo de nutrientes y carbono, se espera que un cambio en el metabolismo del biofilm afecte los ciclos de nutrientes de los arroyos que se transportarían aguas abajo.

Por medio del experimento en mesocosmos pudimos identificar que tanto los sólidos en suspensión como el P (ambos factores que se modifican luego de una erupción volcánica) interactúan sobre las variables del biofilm.

La concentración de clorofila, la biomasa final (PSLC), el contenido de C, N y P, como las relaciones elementales C:P y N:P fueron mayores en el tratamiento P, sin vidrio, mientras que tanto la relación C:clorofila como la concentración de EPS por unidad de biomasa fue mayor en los tratamientos con V sin P, finalmente el tratamiento C tuvo la mayor APA.

La presencia de sólidos, tanto porque se encuentren en suspensión como por su decantación, promueven la generación de una matriz en el biofilm con mayor proporción de EPS.

La sedimentación de los STS, por disminución de la velocidad de flujo, provoca un efecto negativo sobre el biofilm por enterramiento.

Las características fisicoquímicas de los depósitos volcánicos, como su gran rugosidad y elevada relación superficie/volumen, así como también la presencia de minerales expuestos superficialmente, proveen nuevos sustratos para que se aloje la vida microbiana. Promoviendo de esta manera el desarrollo bacteriano.

Como conclusión final de esta tesis podemos decir que estos tipos de eventos deben ser vistos como oportunidades para reunir información ecológica valiosa sobre cómo las

150

perturbaciones severas, como las erupciones volcánicas, moldean el paisaje y los ecosistemas lóticos durante varios años después de ocurrido el evento.

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Sustained effects of volcanic ash on bioﬁlm stoichiometry, enzyme activity and community composition in North- Patagonia streams

Uara Carrillo, Verónica Díaz-Villanueva ⁎, Beatriz Modenutti

Laboratorio de Limnología, Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente (INIBIOMA), CONICET — Universidad Nacional del Comahue, Quintral 1250, Bariloche, Río Negro 8400, Argentina

HIGHLIGHTS GRAPHICAL ABSTRACT

• Volcanic deposits changed habitat and bioﬁlm composition near the volcano. • Affected streams had higher suspended solids and P concentrations than unaffected streams. • Bioﬁlm C:P ratio and alkaline phosphatase activity were lower in affected streams than in unaffected streams. • Lower dissolved N:P ratio in affected streams led to higher Cyanobacteria biomass.

article info abstract

Article history: Volcanic eruptions are extreme perturbations that affect ecosystems. These events can also produce persistent Received 13 September 2017 effects in the environment for several years after the eruption, with increased concentrations of suspended par- Received in revised form 22 November 2017 ticles and the introduction of elements in the water column. On 4th June 2011, the Puyehue-Cordón Caulle Vol- Accepted 24 November 2017 canic Complex (40.59°S-72.11°W, 2200 m.a.s.l.) erupted explosively in southern Chile. The area affected by the Available online xxxx volcano was devastated; a thick layer of volcanic ash (up to 30 cm) was deposited in areas 50 km east of the vol- Editor: Daniel Wunderlin cano towards Argentina. The aim of the present study was to evaluate the effect of volcanic ash deposits on stream ecosystems four years after the eruption, comparing biofilm stoichiometry, alkaline phosphatase activity, Keywords: and primary producer's assemblage in streams which were severely affected by the volcano with unaffected Volcanic eruptions streams. We confirmed in the laboratory that ash deposited in the catchment of affected streams still leach phos- P-limitation phorus (P) into the water four years after eruption. Results indicate that affected streams still receive volcanic Nutrient ratios particles and that these particles release P, thus stream water exhibits high P concentration. Biofilm P content Cyanobacteria was higher and the C:P ratio lower in affected streams compared to unaffected streams. As a consequence of Disturbance less P in unaffected streams, the alkaline phosphatase activity was higher compared to affected streams. Cyanobacteria increased their abundances (99.9% of total algal biovolume) in the affected streams suggesting that the increase in P may positively affect this group. On the contrary, unaffected streams contained a diatom dominant biofilm. In this way, local heterogeneity was created between sub-catchments located within 30 km of each other. These types of events should be seen as opportunities to gather valuable ecological information about how severe disturbances, like volcanic eruptions, shape landscapes and lotic systems for several years after the event. © 2017 Elsevier B.V. All rights reserved.

⁎ Corresponding author. E-mail addresses: [email protected] (U. Carrillo), [email protected] (V. Díaz-Villanueva), [email protected] (B. Modenutti).

1. Introduction producer's composition in the biofilm. We tested this hypothesis by comparing streams which received different ash discharges in the Explosive volcanic eruptions are extreme perturbations that affect Nahuel Huapi catchment. Our predictions are: 1) streams with high ecosystems due to the ejection and emission of gases, ash, pumice, levels of suspended solids (TSS) will have higher P concentrations and lava (Franklin et al., 2000; Lindenmayer et al., 2010; Sousa, 1984). both in the water and in the biofilm; 2) biofilms with low P availability This material arrives in the biosphere directly from the Earth's interior, in the environment will present higher levels of APA; and 3) differences introducing new elements into ecosystems (Jones and Gislason, 2008; in P availability will be reflected in the composition of primary producer Óskarsson, 1980; Stewart et al., 2006; Witham et al., 2005). Many stud- communities. ies have examined how fresh ash deposition introduces a range of po- tentially toxic elements into the ecosystem, such as arsenic, copper, 2. Material and methods zinc, fluoride, and molybdenum (Cronin et al., 2014; Duggen et al., 2007; Ruggieri et al., 2011; Stewart et al., 2006). Ash and pumice can 2.1. Study area also deliver different key nutrient into the waters, such as iron or phosphorus, that can stimulate marine or lacustrine primary producers After the eruption of the Puyehue, the predominant westerly winds (Boyd et al., 2000; Frogner et al., 2001; Hamme et al., 2010; Modenutti of Patagonia generated a gradient (NW-SE) in the thickness of the de- et al., 2013). In addition to this enrichment effect, the increased posited material (Elser et al., 2015; Gaitán et al., 2011)(Fig. 1). In the af- concentrations of suspended particles (volcanic ash) in the water col- fected area (50 km from the volcano), the pyroclastic layers are mostly umn may also positively affect phytoplankton growth by reducing characterized by bimodal grain-size distributions, alternating lapilli photoinhibition in very clear lakes (Modenutti et al., 2013). layers capped by multiple fine ash layers (Pistolesi et al., 2015). The Besides the immediate effects, volcanic ash can also produce persis- mineralogy and chemical composition of these deposits were studied tent effects in the environment lasting several years after the eruption immediately after the eruption and they are mainly composed of silicate (Dale et al., 2005). Volcanic material that falls into water bodies imme- glass (Caneiro et al., 2011; Castro et al., 2013; Shkinev et al., 2016). It is diately affects the aquatic communities, while much of the material that common that in fresh volcanic particles P occurs primarily in acid solu- falls inland can reach the streams decades after the event due to rain ble forms and its solubility decreases with chemical weathering and snowmelt (Bisson, 2005). In this way, accumulation of ash in stream (Nanzyo et al., 1993). Adsorption of volcanic salt aerosols is the main channels increases total suspended solids and changes the riparian mechanism responsible for the presence of soluble compounds on vol- zone, causing habitat loss that affects macroinvertebrate communities canic particles (Smith et al., 1982; Smith and Kalff, 1983; Taylor and for years after eruption (Lallement et al., 2016; Miserendino et al., Stoiber, 1973). 2012). Additionally, following the initial physical effects, mechanical Pristine (non-weathered) pumice produced by the Puyehue leached pyroclast disaggregation resulting from natural post-eruptive processes 90 μgPg−1 (Modenutti et al., 2013). The most affected lakes showed an (i.e. avalanches, lahars, and fluvial transport) could produce new fresh increase of total suspended solids and in light attenuation, higher P con- particle surfaces with the increase of fine-grained particles that can centrations and phytoplankton biomass relative to pre-eruption condi- also leach elements (Genareau et al., 2016). In this sense, there are tions (Modenutti et al., 2013). By 2012, lake transparency had greatly very few studies investigating the effect of element inputs after the oc- recovered (Balseiro et al., 2014); however, thick pyroclastic deposits currence of volcanic eruptions on aquatic environments. persist in the catchments (Fig. 2). Sampling was carried out in four One of the elements responsible for fertilization effects after addition streams according to the presence/absence of ash deposits (Fig. 1). We of ash is phosphorus (Modenutti et al., 2013). Phosphorus (P) recycling chose the streams based on the NW-SE gradient of deposit thickness in streams is intimately associated with microorganisms attached to the and previous exploratory sampling, in order to select comparable sys- bottom (the biofilm) (Dodds, 2003; Mulholland et al., 1994). In P- tems regarding stream order, size, slope, vegetation cover and bottom limited environments, algae and bacteria can acquire P from organic morphology. Two types of streams were selected: Affected streams molecules by releasing extracellular enzymes, such as alkaline phospha- (A-streams), La Estacada (A1) and Ragintuco (A2), located closer to tase, into the biofilm matrix (Sand-Jensen, 1983). Therefore, estimation the volcano (approximately 50 km), with a 10-cm layer of ash in the of alkaline phosphatase activity (APA) can be used to detect P deficiency floodplain; and Unaffected streams (U-streams), Goye (U1) and Casa in aquatic ecosystems (Münster and Chróst, 1990). Since volcanic ash de Piedra (U2), located 80 km from the volcano, without the presence releases P, a decrease in P limitation would affect the N:P ratio of volcanic ash in the floodplain. The A-streams discharge into Lake (Modenutti et al., 2013) and this new environment would, in turn, affect Nahuel Huapi and have a N-S exposition. The U-streams discharge biofilm composition since cyanobacteria would be favoured, increasing into Lake Moreno, which is connected with Lake Nahuel Huapi, and

N2 fixation under an increased P supply (Marcarelli and Wurtsbaugh, have a SW-NE exposition (Fig. 1). The streams are fourth order streams 2006). and drain pristine areas, where the only human activity is hiking. Northern Patagonia is an active volcanic region with historically high Streambeds were dominated by a mixture of crystalline igneous, eruption frequency (Inbar et al., 1995). On 4th June 2011, the Puyehue- volcanic, and plutonic rocks with approximately 50% of boulders, 40% Cordón Caulle Volcanic Complex (40.59°S-72.11°W, 2200 m.a.s.l.) of cobbles, and 10% of gravel and sand, with volcanic deposits in the in- erupted explosively in southern Chile. The volcano produced 1.46 km3 terstices of rocks in A-streams. The streams are surrounded by perennial of rhyolitic volcanic material (or 0.2–0.4 km3 dense rock equivalent py- native forests of Nothofagus dombeyi and Austrocedrus chilensis.Thearea roclastic deposits) (Silva Parejas et al., 2012), a similar amount to that receives approximately 2000 mm year−1 as rainfall and snow, following erupted by Mount St. Helens in 1980. The total area (7.5 million hect- a bimodal hydrological regime with high discharges in late autumn and ares) affected by the volcano was covered by 9.5 × 1011 kg of pyroclast spring (rainfall and snowmelt, respectively) and the lowest discharge in material, which fell differentially south-eastwards, depositing a thick summer–early autumn. layer (up to 30 cm) in areas 50 km east of the volcano towards Argentina (Gaitán et al., 2011). This event created an opportunity for 2.2. Leachate experiment the study of ecological disturbance following explosive eruptions. The aim of the present study was to evaluate the effect of volcanic ash de- In order to investigate volcanic deposits as a source of P in the envi- posits on stream ecosystems, analysing biofilm stoichiometry, APA ronment, we performed a laboratory experiment in which we quanti- and composition of primary producer communities four years after fied P released from lapilli four years after the eruption. In addition, the eruption. Our hypothesis is that volcanic ash still releases P to the we assessed whether the effect of milling increased P leachate. We aquatic environment and this affects P content, APA and primary assessed the milling effect using two grain-size particles: Large size U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244 237

Fig. 1. Area affected by volcanic deposits along the West–East gradient layers depth in Nahuel Huapi catchment. Affected streams: A1 and A2. Unaffected streams: U1 and U2. PCCVC: Puyehue Cordón Caulle volcanic complex located in Chile (40.59°S-72.11°W, 2200 m.a.s.l.).

“lapilli” (2.0 ± 0.1 cm diameter) and Small size particles “ash” (b500 the upper 4 cm layer to avoid soil debris, and transported to the labora- μm), obtained from the milling of lapilli. Volcanic material was obtained tory in sterile polyethylene bags. In the laboratory, sediments were im- from the deposits that remained in the riparian zone of the A-streams mediately dried at 60 °C for 48 h. Then, four lapilli (2.0 ± 0.1 cm (Fig. 2). The samples were collected with a sterile shovel excluding diameter) were mechanically milled in a manual mortar and sieved

Fig. 2. Photograph of the deposits of volcanic material at the riparian zone of an affected stream during March 2015 sampling. 238 U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244 through a 500-μm sieve to obtain ash particles b500 μm. Leaching was 550 °C for 1.5 h, then re-weighed, and AFDM was computed as the dif- carried out by adding 1 g of volcanic particles (Large or Small size) to ference in mass before and after incineration (APHA, 2005). 250 mL Milli Q water in sterile Erlenmeyer flasks (4 replicates each). Determinations of APA in the homogenized sample were carried out The flasks were gently and continuously agitated in a shaker at during 30 min of incubation, according to Hoppe (1983),using 140 rpm in an incubator at 15 °C. Samples for P measurement were methylumbelliferyl phosphate (MUP; 36 μM) in Tris buffer (pH 8.3). taken after 24 h (following Cronin et al., 1997), and 48 h as suggested Temperature was stabilized in a water bath at 25 °C (to optimize the by Witham et al. (2005). The water was then filtered through 0.7-μm temperature of the enzymatic activity) for 30 min; 0.5 mL MUP solution GF/F filters and P was determined using the ascorbate-reduced molyb- was then added to all samples, blanks and MUP standards. Fluorescence denum method (APHA, 2005) (see Laboratory procedures). The results was measured with a Perkin Elmer LS45 fl uorometer. Values were were expressed as μg P per g ash. expressed as nM MU g AFDM−1 h−1. A subsample of the suspension was used for Chl-a extraction, using 2.3. Field sampling 90% hot ethanol (Nusch, 1980); spectrophotometric readings were carried out at 665 nm and 750 nm. Corrections for phaeophytin were per- Streams were sampled on three occasions, one in high discharge formed by acidification with HCl. Autotrophic index was calculated as conditions (October 2014), and two in low discharge conditions the relationship between Chl-a and AFDM concentrations to estimate (March 2015 and April 2015). On each sampling occasion, temperature, the relative importance of the photosynthetic fraction in the community oxygen concentration, and conductivity were measured with a (Havens et al., 1996). multiprobe (YSI 85, Yellow Spring, Ohio) and pH was measured with a Determination of bacterial abundance involved fixing a subsample pHmeter (HANNA, HI8424). Turbidity was measured as NTU (Nephelo- in filtered formaldehyde at a final concentration of 2% v/v. Abundance metric Turbidity Units) with a portable turbidity meter (Lutron TU- of bacterial cells was determined by filtering 250 μLsubsample,previ- 2016, Taipei, Taiwan). Flow velocity was measured with a water flow ously stained with 4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) at a final meter (Global Water, California, USA). Water samples for nutrient con- concentration of 0.2% w/v,accordingtoPorter and Feig (1980).Counting centration measurements were collected in acid-washed 2-L plastic was performed on 0.2-μm black polycarbonate filters (Poretics) under containers and immediately transported to the laboratory. an epifluorescence microscope (Olympus BX50) at ×1250 magnifica- For biofilm sampling, three rocks (cobbles, surface area 90 ± 4 cm2 tion using a UV light (U-MWU filter). Twenty fields per filter were approximately), were collected at each sampling site and individually counted. stored in a plastic bag according to Biggs and Close (1989), from riffle For algal composition analysis, a subsample (10 mL) of the suspen- areas of the main channel of the stream, avoiding the shore line. Rocks sion was fixed with acid Lugol's solution. Identifications were per- were transported to the laboratory under dark conditions and in ther- formed under microscope (Olympus BX50) at 1000×, to genus level mally insulated containers. when possible, according to the website AlgaeBase (Guiry and Guiry, 2017). Besides, for Cyanobacteria we followed Komárek and 2.4. Laboratory procedures Anagnostidis (1989, 1999, 2005) and Komárek et al. (2014). For diatoms, 1 mL of the samples was treated with peroxide in order to oxidise Stream water was filtered through pre-combusted GF/F filters to de- organic matter to facilitate the identification. Samples were mounted in termine dissolved organic carbon and dissolved nutrient concentra- Naphrax ® and examined under microscope at 1000×. Identifications tions. Dissolved organic carbon (DOC) concentration was determined were performed according to Krammer and Lange-Bertalot (1986, with a high-temperature combustion analyser (Shimadzu TOC V-CSH), 1988, 1991). For algal abundance determinations, three aliquots were using potassium hydrogen phthalate as the standard. Total dissolved ni- examined in a chamber of 20 μL volume under a direct microscope trogen (TDN) was analysed in filtered lake water using a TN-M1 unit on (Olympus BX50) at 400× magnification and at least 60 random images the Shimadzu TOC V-CSH. Total dissolved phosphorus (TDP) was of each aliquot were obtained with a digital camera (Olympus DP 70). analysed after digestion with potassium persulphate at 125 °C at Cells were counted and measured using an image analysis system 1.5 atm for 1 h. Phosphorus concentration was measured using the (Image ProPlus; Media Cybernetics, Warrendale, PA, USA). Biovolume ascorbate-reduced molybdenum blue technique (APHA, 2005). Total was estimated with best fitting geometric models, using average dimen- suspended solids (TSS) were quantified by filtering 400 mL stream sions of a minimum of 20 cells per species per sample (Hillebrand et al., water through pre-combusted and pre-weighed GF/F filters. Water 1999). The biovolume of macroscopic spherical colonies of Nostoc was N:P ratios (atomic) were calculated as TDN to TDP atomic calculated by measurement of individual colonies at 50× magnification. concentrations. The biofilm was obtained by scraping individual rocks with a brush 2.5. Data analysis and carefully rinsing them with Milli Q water. The obtained suspension was used for the estimation of biofilm phosphorus (P), carbon (C) and Statistical analyses were performed using SPSS 18 software and nitrogen (N) content, total organic matter as ash-free dry mass SigmaStat version 12.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA.). Statis- (AFDM), alkaline phosphatase activity (APA), chlorophyll a (Chl-a)con- tical differences between P concentrations in leachates of volcanic ma- centration, bacterial and algal abundance, and autotroph biovolume and terial were assessed using one-way repeated measures of Analysis of composition (Romaní and Sabater, 2001). The biofilm P content was de- Variance (RM-ANOVA), with particle size (Small and Large) as the termined by filtering 5 mL of the suspension through acid-washed (10% between-subject factor and leachate time (24 h and 48 h) as the HCl) GF/F filters and dried at 60 °C for 48 h. After combustion at 550 °C within-subject factor. for 1.5 h, P content of ash was analysed using the ascorbate-reduced Differences in stream water physical and chemical variables and bio- molybdenum method (APHA, 2005). Measurements of C and N in biofilm parameters (biofilm P and C content, C:P and C:N ratio, APA, Chl-a, film were conducted by filtering another 5 mL of the homogenized sam- AFDM, Chl-a:AFDM, bacterial and algal abundance and algal biovolume) ple through pre-combusted GF/F filters, dried at 60 °C for 48 h and between stream types were also analysed using one-way RM-ANOVA. analysed with a Thermo Finnigan EA 1112 CN elemental analyser (Ther- We used “Impact” as the between-subject factor (with two levels: A- mo Scientific, Milano, Italy). The results were expressed as C:N and C:P streams and U-streams) and “Time” as the within-subject factor (with atomic ratios. three levels: October, March and April). A posteriori Bonferroni's tests Subsamples for ash-free dry mass (AFDM) determination were fil- were used to compare main effects. These contrasts are based on the lin- tered on pre-combusted and pre-weighed Whatman GF/F filters and early independent paired comparisons between the estimated marginal dried at 80 °C for 1.5 h. The filters were weighed and combusted at means. U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244 239

Table 1 Physiochemical parameters of stream water in affected (A) and unaffected (U) streams during the study period and results of the one-way RM-ANOVA. Values correspond to individual measurements at each of the two sites for each stream type.

Time October March April 2015 Statistics 2014 2015

Impact A U A U A U Impact Time Impact × Time

−1 ⁎ ⁎ ⁎ TSS (mg L ) 5.9 0.3 6.2 2.4 3.5 0.3 b0.001 0.004 0.031 6.1 0.2 7.2 2.2 2.5 0.4 ⁎ ⁎ Turbidity (NTU) 4.1 1.6 4.1 2.1 3.2 0.6 0.001 0.032 0.627 4.2 1.5 4.7 1.9 2.9 0.9 −1 ⁎ ⁎ ⁎ TDP (μgL ) 5.8 6.2 15.1 6.9 5.0 2.1 0.037 0.023 0.047 5.3 6.7 12.2 4.68 4.9 2.05 DOC (mg L−1) 0.6 0.4 0.8 0.5 0.9 0.6 0.078 0.140 0.507 0.6 0.4 0.7 0.4 0.6 0.5 TDN (μgL−1) 53.8 28.5 55.1 57.8 57.8 37.8 0.227 0.101 0.059 58.7 28.6 42.8 71.9 36.7 30.0 ⁎ N:P (atomic) 20.4 10.2 8.1 18.5 25.6 39.2 0.119 0.153 0.044 24.3 9.4 7.7 34.0 16.8 32.4 ⁎ Flow velocity 55.6 51.0 17.4 27.1 35.5 22.0 0.748 0.008 0.154 (cm s−1) 63.7 59.6 14.0 29.7 25.7 29.7 ⁎ Temperature (°C) 5.7 4.7 11.4 10.6 7.9 5.9 0.161 0.001 0.303 7.0 6.2 13.8 11.5 8.6 5.2 ⁎ Oxygen (%) 94.0 92.0 63.0 91.4 38.7 91.7 0.016 0.069 0.060 91.0 86.4 85.0 100.0 37.8 93.2 ⁎ ⁎ Conductivity 17.0 11.7 50.0 37.0 43.4 29.6 0.017 0.018 0.842 (μScm−1) 25.2 9.8 46.3 42.4 38.7 33.6 pH 7.5 7.5 7.4 7.4 7.3 7.5 0.937 0.091 0.091 7.2 7.1 7.2 7.2 7.3 7.1

⁎ statistic signiﬁcance.

Normality and sphericity assumptions were veriﬁed previously. The Fig. 3). This results show that after four years since the eruption particles Greenhouse–Geisser correction was used to compute adjusted P-level still release P and the mechanical milling effectively increases the P of F-test when sphericity was not met. The main effects were compared release. using Bonferroni's tests. The magnitude of the difference between treat- The A-streams and U-streams differed in TSS concentration and TDP ments was estimated by the Effect Size Analysis (h2) in ANOVA as: (Table 1). TSS was positively related to both water turbidity and P (lin- ear regression r2 = 0.97, d.f. = 11, P b 001; and r2 =0.53,d.f.=11,P b 2 h ¼ SSeffect=SStotal 0.01 respectively). These results suggest that A-streams still receive volcanic particles (more TSS and turbidity) and that these particles release where SSeffect is the Sum of Square for the factors and SStotal is the total P (3-fold higher in A-streams than in U-streams). In contrast, we did not Sum of Squares for all effects, interactions and errors in the ANOVA. observe differences in DOC or TDN concentration (Table 1). The N:P ratio differed between stream type and the lowest value (below 16) 3. Results was observed in A-streams in March (Table 1). Finally, there were no differences between the studied streams in terms of ﬂow velocity, 3.1. Ash P leachate and stream water characteristics water temperature and pH (Table 1).

The leachate experiments showed that small particles (ash) released 3.2. Bioﬁlm three-fold more P than large particles (lapilli), after both 24 h and 48 h

(one-way RM-ANOVA, no interaction, Psize = 0.018 and Ptime b 0.001; Biofilm P content was higher in A-streams (Figs. 4aand3b; Table 2), and the C:P ratio was always lower (Fig. 4c; Table 2). As a consequence of the high P content in the biofilm of A-stream, APA was lower than in the biofilm of the U-stream (Fig. 4d; Table 2). The biofilm C:N ratio was lower in A-streams (C:N = 8 ± 0.1) than in U-streams (C:N = 10 ± 0.4; Table 2). Although Chl-a concentration did not differ between stream types, total autotroph cell number, biovolume and biofilm AFDM were higher in A-streams (Fig. 5a, b and c; Tables 2 and 3). Thus, the autotrophic index (Chl-a:AFDM) was lower in A-streams (Fig. 5d, Table 2). Howev- er, bacterial abundances did not differ between stream types (Table 3). Composition of the autotrophic community differed between stream types. While in U-streams the assemblage was dominated by Bacillariophyta (76.9% and 89.9% of biovolume in March and April, respectively), biofilms in A-streams were dominated by Cyanobacteria (99.9% of total algal biovolume) in particular in March and April (Fig. 6). Among the Cyanobacteria, the most abundant identified genera were Nostoc (90%), Calothrix (4%) and Homeothrix (3%). In particular, in March and April Nostoc reached almost 100% of cell abundance and Fig. 3. Phosphorus released by the two different sizes of volcanic particles (Large and Small) after 24 h and 48 h in the leaching experiment. Error bars represent ±standard biovolume, developing macroscopic colonies. This condition was not error. observed in U-streams in which the assemblage was a cohesive thin 240 U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244

Fig. 4. Biofilm variables on the three sampling dates (October 2014, March 2015 and April 2015) in Affected streams (A1 and A2) and Unaffected streams (U1 and U2). a) Biofilm phosphorus content, b) Biofilm carbon content, c) Biofilm C:P atomic ratio, and d) Alkaline Phosphatase Activity (APA). Error bars represent ±standard error. layer dominated by diatoms, with Gomphoneis herculeana, Hannaea ash was lost after the first rain. But volcanic material may continue to re- arcus and Syendra ulna accounting for N80% of the biovolume. On the lease P, as mechanical milling of pumice introduces nutrients into the contrary, in A-streams the diatom species Rhopalodia gibba and water with important implications for chemical cycles (Genareau Epithemia adnata were observed always in very low abundance (b1%). et al., 2016). Once volcanic ash enters a water body, it releases ions Finally, Chlorophyta were only found in U-streams. and elements according to their adsorption/desorption equilibrium constant, and these ions become available for primary producers 4. Discussion (Frogner et al., 2001). Pristine (non-weathered) ash emitted by the Puyehue volcano released 90 μg P per gram of pyroclasts (Modenutti Our results show that four years after the volcanic eruption, headwa- et al., 2013). We showed that after four years of weathering, this volca- ter streams that were originally heavily affected contained more nic material continues to leach P, and this leaching increases with me- suspended solids and higher P concentrations in the water than other chanical disaggregation, probably as a result of exposure of new, streams in the catchment. This condition can be related to the presence reactive particle surfaces. As a consequence of the difference in P con- of deposits in their watershed that release P, particularly if the rocks are centration in the water (3-fold higher in A-streams than in U- subjected to mechanical milling as performed in our laboratory experi- streams), we observed differences in biofilm elemental composition, ments. Therefore, our results demonstrate that volcanic deposits in the enzymatic activity and algal assemblage between the two types of catchments may represent an important source of solids and phospho- streams. rus introduced into aquatic environments several years after eruption. Biofilm structure and function are sensitive to changes in nutrient Precipitation not only is responsible for mobilizing volcanic deposits content and other factors, such as temperature, flow velocity, and into the water (Bisson, 2005) but it also increases chemical weathering light, which determine not only the biofilm community composition, rates. Shkinev et al. (2016) found that 15% of the P of the Puyehue fresh but also its thickness, relative abundance of autotrophs/heterotrophs,

Table 2 Results of the one-way RM-ANOVA for the bioﬁlm parameters of stream water in affected (A) and unaffected (U) streams during the study period. Values correspond to individual measurements at each of the two sites for each stream type.

Source of variation Impact Time Impact × Time

Bioﬁlm parameters F Ph2 F Ph2 F Ph2

−2 ⁎ ⁎ ⁎ P (mg cm ) 34.92 b0.001 0.777 27.46 b0.001 0.733 14.67 0.003 0.595 −2 ⁎ ⁎ ⁎ C (mg cm ) 15.48 0.003 0.607 41.70 b0.001 0.807 8.44 0.002 0.458 ⁎ ⁎ C:P ratio (atomic) 13.89 0.004 0.581 5.42 0.0130 0.351 0.30 0.740 0.029 ⁎ ⁎ C:N ratio (atomic) 8.91 0.02 0.497 1.31 0.29 0.127 4.87 0.02 0.351 ⁎ ⁎ ⁎ APA 15.23 0.003 0.604 16.89 b0.001 0.628 7.91 0.009 0.442 (nM MU mg OM−1 h−1) −2 ⁎ Chl a (μgcm ) 0.94 0.360 0.086 28.11 b0.001 0.738 0.045 0.930 0.004 3 −2 ⁎ ⁎ ⁎ Biovolume (mm cm ) 113.01 b0.001 0.919 5.69 0.011 0.363 5.69 0.011 0.362 −2 ⁎ ⁎ ⁎ AFDM (mg cm ) 31.22 b0.001 0.757 45.60 b0.001 0.820 18.41 b0.001 0.648 ⁎ ⁎ Chl a: AFDM 31.61 b0.001 0.760 10.52 0.001 0.513 2.22 0.134 0.182

⁎ statistic signiﬁcance. Bold indicate the highest effect size (h2) U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244 241

Fig. 5. Biofilm variables on the three sampling dates (October 2014, March 2015 and April 2015) in Affected streams (A1 and A2) and Unaffected streams (U1 and U2). a) Chlorophyll a concentration, b) Total algal biovolume, c) Ash free dry mass (AFDM), and d) Chlorophyll a/AFDM ratio. Error bars represent ±standard error. and ultimately its function (Battin et al., 2016; Francoeur and Biggs, the phytoplankton biomass and composition from a community domi- 2006; Romaní et al., 2013; Sekar et al., 2002). P uptake depends on dif- nated by the nanoflagellate Crysochromulina parva (Haptophyceae) to ferent factors including water P concentration, biofilm P content, forms a dominance of Cryptophyceae (in particular Plageoselmis lacustris) of P available, and the growth stage and thickness of the biofilm (Cotner and diatoms (particularly Tabellaria flocculosa and Aulacoseira and Wetzel, 1992; Sand-Jensen, 1983).The relationship between the granulata). concentration of elements in the water and in biofilms (i.e. the capacity The algal composition of the biofilm in the study area (pre-eruption of the biofilm to accumulate a specific element) might be subjected to condition) was highly dominated by diatoms (Díaz-Villanueva and biofilm internal processes and element limitation. In P-limited environ- Albariño, 1999; Díaz-Villanueva and Modenutti, 2004; Gaglioti, 1992). ments, additional P may be quickly taken up by microorganisms (Rier Immediately after the eruption, streams were severely affected by ash and Stevenson, 2001), leading to increases in P content in biofilm (Hill accumulation, turbidity increase and changes in the riparian zone and Fanta, 2008; Horner et al., 1990; Kamjunke et al., 2015). Although (Lallement et al., 2016). Four years after the eruption, differences in bio- algae and bacteria can also obtain P from organic matter, this mecha- film autotroph dominance between affected and unaffected streams nism requires the synthesis of alkaline phosphatase (Jansson et al., were observed. Cyanobacteria increased their abundances in the A- 1988). Thus, higher APA in biofilms of streams with low P content re- streams suggesting that the increase in P may positively affect this flects the severe P-limitation in these streams. The lack of differences group. On the contrary, U-streams retained a diatom dominant biofilm. in P-content between stream types in October might be attributed to The ability of Cyanobacteria to fix atmospheric N2 favours them the low biomass of biofilm in the spring. Flow velocity is recognized as when N is limiting (Marcarelli and Wurtsbaugh, 2006), in particular amajorfactoraffectingbiofilm variations in a given habitat (Battin when N:P ratios are below 16 (Ahn et al., 2002; Biggs and Smith, et al., 2003; Stevenson et al., 1996), and in temperate mountain streams, 2002; Levine and Schindler, 1999; Smith and Kalff, 1983; Stancheva snowmelt produces extremely high increases in discharge (~60 cm s−1 et al., 2013). When environmental conditions are favourable, cells can flow velocity in our studied streams), causing biofilm drag and slough. rapidly multiply, forming benthic blooms (Fristachi et al., 2008). This Inputs of P in ultraoligotrophic environments, such as Patagonian pattern was observed in A-streams, where macroscopic Nostoc colonies Andean catchments, may lead to changes in the assemblage/composi- dominated the biofilm. Although no molecular identification was car- tion of the primary producers. Modenutti et al. (2013) found that in ried out for cyanobacteria in these streams, the presence of Nostoc was deep lakes, the immediate effect of pyroclastic inputs was a change in confirmed by Illumina MiSeq platform associated with pyroclastic

Table 3 Results of algal and bacterial abundance and one-way RM-ANOVA of bioﬁlm of stream water in affected (A) and unaffected (U) streams during the study period.

Time October 2014 March 2015 April 2015 Statistics

Impact A U A U A U Impact Time Impact × Time

F P F P F P

5 5 ⁎ ⁎ ⁎ Algal cell number 4.3 ± 0.17 6.6 ± 0.02 2.5 ± 0.2 10 1.2 ± 0.5 1.1 ± 0.7 10 8.2 ± 2.2 28.8 b0.01 153.4 b0.01 34.7 b0.01 (105cell cm−2) 4.7 ± 0.03 3.1 ± 0.09 4.1 ± 2.2 105 2.6 ± 0.7 1.9 ± 1.2105 3.2 ± 0.5 6 −2 ⁎ Bacterial cell number (10 cell cm ) 2.6 ± 0.14 3.3 ± 0.19 13.9 ± 1.0 20.0 ± 1.7 36.8 ± 4.3 27.3 ± 1.6 0.1 0.74 14.4 0.015 1.2 0.38 5.6 ± 0.44 4.4 ± 0.28 14.0 ± 1.1 17.6 ± 1.2 22.1 ± 1.6 16.1 ± 0.6 242 U. Carrillo et al. / Science of the Total Environment 621 (2018) 235–244

Fig. 6. Biovolume of Cyanobacteria (black bars), Bacillariophyta (light grey bars) and Chlorophyta (dark grey bars) in Affected streams (A1 and A2) and Unaffected streams (U1 and U2) and N:P atomic ratio for each stream on each sampling date (October 2014, March 2015 and April 2015). inputs from the same volcanic event (Modenutti et al., 2016). In Nostoc Acknowledgments colonies, extracellular polysaccharides were found to account for N60% of dry weight of the matrix (Hill et al., 1997). The capacity of Nostoc to We acknowledge the anonymous reviewers for their constructive generate a thick layer of polysaccharide matrix is a possible explanation comments on this manuscript. We thank the National Park Nahuel for the high C content in biofilm from A-streams, resulting in lower au- Huapi for allow us to sample the streams. We thank Dr. Pablo Alarcón totrophic index (Chl-a:AFDM) than in U-streams. These modifications for his help with the map drawing. in community composition lead to changes in the stoichiometry of the assemblage. The lowest C:N ratio of biofilm in A-streams could be asso- Funding ciated with the ability of Cyanobacteria to fixatmosphericN2. In environments with high TSS, particle deposition in the biofilm Data was produced via grants from the Fondo para la Investigación matrix can have negative effects on biofilm biomass (Boulêtreau et al., Científica y Tecnológica (FONCyT, PICT 2014-1604 to VDV and PICT 2010). In these environments, the polymeric matrix results in an adap- 2015-0418 to BM). tive response that can protect biofilm from erosion (Flemming and Wingender, 2010). Filamentous Cyanobacteria, for example, have the References capacity to build structures which enable them to colonize highly erod- Ahn, C.Y., Chung, A.S., HM, Oh., 2002. Rainfall, phycocyanin, and N:P ratios related to ible substrates (Garcia-Pichel and Wojciechowski, 2009; Vignaga et al., cyanobacterial blooms in a Korean large reservoir. Hydrobiologia 474:117–124. 2013). The presence of Nostoc in streams affected by volcanic ash was https://doi.org/10.1023/A:1016573225220. previously observed by Cushing and Smith (1982) after the 1980 APHA, 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association, AWWA, Washington, D.C. Mount St. Helens eruption. The high capacity of Nostoc to produce mas- Balseiro, E., Souza, M.S., Serra Olabuenaga, I., Wolinski, L., Bastidas Navarro, M., sive polysaccharide structures forming macroscopic colonies men- Laspoumaderes, C., et al., 2014. Effect of the Puyehue-cordon Caulle volcanic complex tioned above may confer on this genus a great advantage in post- eruption on crustacean zooplankton of Andean lakes. Ecol. Austral 24, 75–82. eruptive environments. Therefore, it is possible that both nutrient con- Battin, T.J., Kaplan, L.A., Newbold, J.D., Cheng, X., Hansen, C., 2003. Effects of current velocity on the nascent architecture of stream microbial biofilms. Appl. Environ. Microbiol. ditions and a harmful environment (high TSS) could have acted simul- 69, 5443–5452. taneously, favouring the bloom of Nostoc in the A-streams. As benthic Battin, T.J., Besemer, K., Bengtsson, M.M., Romani, A.M., Packmann, A.I., 2016. The ecology fi – cyanobacteria have received less attention than their planktonic fresh- and biogeochemistry of stream bio lms. Nat. Rev. Microbiol. 14:251 263. https:// www.nature.com/articles/nrmicro.2016.15. water counterparts (Fetscher et al., 2015; Quiblier et al., 2013), little is Biggs, B.J.F., Close, M.E., 1989. Periphyton biomass dynamics in gravel bed rivers: the rel- known about the physicochemical variables promoting their prolifera- ative effects of flows and nutrients. Freshw. 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