(Citrus Aurantium) Chez Le Rat Wistar Soumis À Un Régime Supplémenté En Cholestérol

Home , Candied fruit

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Abou Bekr Belkaid -Tlemcen-

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers Département de Biologie Laboratoire des Produits Naturels (LAPRONA)

THÈSE

Présentée par

Mme Nassima BRIXI GORMAT épouse BENMANSOUR

En vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Biologie Option : Biologie moléculaire et cellulaire

Activités biologiques de l’huile de pépins de Bigarade (Citrus aurantium) chez le rat Wistar soumis à un régime supplémenté en cholestérol

Soutenue le 10/12/2017, devant le jury composé de:

Présidente ATIK-BEKKARA Fouzia Pr Université de Tlemcen Examinateur HALBOUCHE Miloud Pr Université de Mostaganem Examinatrice BENDAHMANE Malika Pr Université de Sidi Belabbes Examinateur BENAMMAR Chahid MCA Université de Tlemcen Directrice de thèse BELARBI Meriem Pr Université de Tlemcen

Année Universitaire : 2017-2018

REMERCIEMENTS

Ce travail été réalisé au Laboratoire des Produits Naturels (LAPRONA) du département de Biologie, de la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers (SNV/STU), de l’Université Abou Bekr Belkaïd de Tlemcen.

C’est avec un réel plaisir que je réserve ces lignes en signe de gratitude et de profonde reconnaissance à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation et à l’aboutissement de ce travail.

Avant tout, je remercie Dieu tout puissant pour m’avoir aidé à réaliser ce modeste travail.

J’exprime tout d’abord mes remerciements à Mme BELARBI Meriem, professeur au département de Biologie, faculté SNV-STU, Université de Tlemcen, Chef d’équipe «Analyses physico-chimiques des plantes et leurs propriétés nutritionnelles » au laboratoire LAPRONA et Vice doyen chargé de la graduation, qui m’a honorée de sa confiance en acceptant la direction de cette thèse et a fait preuve de patience à mon égard, d’indulgence et de bienveillance. Je tiens à la saluer pour sa disponibilité, sa générosité, son infatigable dévouement et son intérêt porté pour mon sujet de recherche. Son enthousiasme pour la science m’a fortement encouragé, sa persévérance et sa rigueur ont pour moi valeur d’exemple. Je lui exprime ma profonde reconnaissance pour la qualité de son encadrement tant sur le plan scientifique qu’humain.

J’exprime mes respectueux remerciements à Madame ATIK-BEKKARA F, professeur à l’université de Tlemcen, pour l’honneur qu’elle me fait en acceptant de présider ce jury. Qu’elle trouve ici mes sincères impressions de gratitude et de respect.

J’adresse mes vifs remerciements à Mr BENAMMAR C., Maitre de conférences à l’Université de Tlemcen et chef de département de biologie, pour sa gentillesse, ses conseils et de m’avoir fait l’honneur d’être examinateur et de participer au jury de ce travail. Qu’il soit assuré de ma profonde gratitude.

Je remercie vivement Monsieur HALBOUCHE M., Professeur à l’Université de Mostaganem pour sa participation à mon jury de thèse et pour l’honneur qu’il me fait en acceptant de juger ce travail, qu’il trouve ici l’expression de toute ma reconnaissance.

Mes remerciements sincères et respectueux vont également Mme BENDAHMANE M., Professeur à l’Université de Sidi Belabbes pour sa participation au jury de thèse et pour l’honneur qu’elle me fait en acceptant de juger ce travail, qu’elle trouve ici l’expression de toute ma reconnaissance.

Mes remerciements vont aussi à Mr KHAN. N, Professeur à l’Université de bourgogne Dijon (France) et directeur du laboratoire UPRES 4183 « Lipides & Signalisation Cellulaire», Science Vie, de m’avoir accepté comme stagiaire dans son laboratoire.

Je suis particulièrement reconnaissante à Mr HICHAMI. A, Maitre de conférences à l’Université de Bourgogne Dijon (France), pour ses précieux conseils, sa disponibilité, sa patience et sa gentillesse lors de mon séjour à Dijon.

Je témoigne également ma reconnaissance à mes collègues du centre universitaire de Ain- témouchent et à mes amies pour leur aide et leur soutien durant les moments les plus difficiles, particulièrement Mr Bakli Mahfoud, Sour Souad, Zeriouh Meriem, Mami Zoubida, Boukli Salima et Ouadah Amina. Merci pour votre collaboration et votre amitié.

Pour terminer, je dédie ce manuscrit à ma famille et belle famille, tout particulièrement à ma mère (Allah yerhamha) et mon père pour leur amour sans limites et leurs sacrifices déployés à mon égard. Que ma réussite soit pour vous un gage de remerciements et sincère attachement.

Un grand merci à mon mari et mes enfants pour votre soutien, vos encouragements et surtout votre patience durant ces dernières années, je m’excuse pour les moments difficiles, ce travail n’aurait pas été possible sans votre soutien quotidien.

Mes pensées vont à mes frères et belles sœurs pour leur sympathie et leurs encouragements.

Un travail de thèse est le fruit d’un travail collectif. Je tiens à remercier ici toutes les personnes m’ayant aidé de près ou de loin tout au long de mon parcours.

Valorisation des travaux de recherche

Publications :

- Nassima Brixi Gormat, Meriem Belarbi, Zoubida Mami, Fatima zohra Djaziri (2015). Physico-chemical characteristics and antioxidant activity of phenolic compouds and oil of Citrus auarntium seeds from Northwest Algeria. International journal of phytomedicine. 7: 370-378. - Z. Soualem-Mami, N. Brixi-Gormat, F.Z. Djaziri, S. Hmimed, M. Belarbi (2015). Effet du son de seigle chez le rat diabétique. Phytothérapie. DOI 10.1007/s10298-015-0933-3 ; Lavoisier - Sour S, Belarbi M, Khaldi D, Benmansour N, Sari N, Nani A, Chemat F, Visioli F (2012). Argan oil improves surrogate markers of CVD in humans. British Journal of Nutrition. 107: 1800-1805.

Communications :

- Association Tunisienne des Sciences de la nutrition, 22-24 Avril 2016, Mammamet- Tunisie. Analyse de la composition des pépins de la bigarade (Citrus aurantium). Benmansour-Brixi Gormat N., Belarbi M., Mami Z., Djaziri FZ.

- 1ère Journée Scientifique des Sciences de l’Agriculture, Environnement et Santé, 3 Juin 2014, Tlemcen- Algérie. Study of the chemical composition of some cereals from Algeria. Z. Mami, N. Brixi Gormat, N. Gaouar, FZ. Djaziri, M. Belarbi.

- Mediterranean Conference on Natural Products (MCNP), 9-10 Octobre 2011, Tipaza- Algeria. Phytochemical study of seed oil of bitter orange (Citrus aurantiu) in Western Algeria (Tlemcen). Benmansour-Brixi Gormat N., Belarbi M., S. Sour, Z. Soualem, FZ. Sabri.

- Premier congrès international, santé au naturel, 7-9 Décembre 2010, Mostaganem, Algérie. Effet de l’huile d’argan (argania spinosa) de la région de Tindouf sur le métabolisme lipidique. Sour S, Belarbi M, Soualem Z, Benmansour N, Sari N, Chabane Sari D. Résumé

Les sous-produits d'agrumes représentent une source riche en composés phénoliques, en raison de la grande quantité de pelures et de pépins qu’ils contiennent. Ces résidus, qui sont généralement rejetés comme des déchets dans l'environnement, peuvent servir de ressources nutraceutiques potentielles. δ’orange amère (bigarade, Citrus aurantium) utilisé comme un arbre ornemental en Algérie, peut être considéré comme une source précieuse d’ingrédients fonctionnels. δe but de ce travail était, d’une part, d’analyser la teneur en métabolites primaires et en composés phénoliques des pépins du Citrus aurantium et de l’huile extraite à partir de ces pépins et évaluer leur capacité antioxydante par des méthodes colorimétriques. D’autre part, d'étudier l’effet d’un régime enrichi en huile de pépins du C. aurantium et supplémenté en cholestérol sur le métabolisme lipidique et le statut oxydant/antioxydant chez le rat Wistar.

δes caractéristiques physicochimiques des pépins et de l’huile de pépins de bigarade ont montré que les pépins contiennent 38,21% de matière grasse. La composition en acides gras de l’huile montre une insaturation importante, due aux teneurs élevées en acides oléique et linoléique. La détermination des indices (densité relative, indice de réfraction, indice d’acide et indice de saponification) a révélé que c’est une huile pure, contenant des taux non négligeables en α-tocophérol et en polyphénols totaux. En outre, les pépins du C.aurantium contiennent 2,12 mg AGE /g MS avec la prédominance des tanins condensés (0,3 mg CE/g MS), suivi par les deux fractions des flavonoïdes n-butanol et acétate d’éthyle (0,04γ mg CE/g εS et 0,0γγ mg CE/g εS respectivement). δ’évaluation du pouvoir antioxydant in vitro par les différentes méthodes (DPPH, FRAP, -carotène) a montré que les extraits phénoliques des pépins du C. aurantium et de l’huile avaient une activité antioxydante différente. Par ailleurs, la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes possède une activité élevée par rapport aux autres extraits.

Concernant la détermination des effets de la consommation de l’huile de pépins de bigarade sur l’hypercholestrolémie et le stress oxydatif induits par un régime enrichi en cholestérol chez le rat, nous avons mené une expérimentation in vivo sur un échantillon de quatre groupes de rats mâles, 5 chacun, qui étaient nourris soit avec un régime basal à base de l’huile de tournesol (NRT) ou à base de l’huile de bigarade (NRB), ou bien des rats consommant ce même régime basale supplémenté en 1% de cholestérol (NRTC ou NRBC). Les résultats ont montré que quelque soit la nature du régime, le poids évolue de la même manière, de même que la quantité d’aliment ingéré est statistiquement non significatif entre les régimes (p˃0,05). Nous avons noté une diminution significative des teneurs plasmatiques en glycémie, en cholestérol total, et en LDL-C chez les groupes NRBC comparés aux groupes NRTC (p<0,05). Cependant, aucune différence significative n’est observée dans les concentrations des triglycérides chez les groupes de rats supplémentés en cholestérol, alors qu’elles sont réduites chez le groupe NRB par rapport au NRT. De plus, l’enrichissement du régime par l’huile de pépins de bigarade joue un rôle important dans la défense antioxydante en augmentant les teneurs plasmatiques en vitamine E et en glutathion réduit, en stimulant l’activité de la catalase et de la superoxyde dismutase, et en réduisant les marqueurs de la peroxydation lipidique; en effet, nous avons noté une diminution significative des teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde, hydroperxydes et des diènes conjugués principalement chez les rats supplémenté en cholestérol NRBC par rapport aux NRB (p<0,05) .

Ces résultats indiquent que la supplémentation de l’huile de pépins de bigarade dans le régime des rats, en partie par l’intermédiaire de sa teneur en acides gras insaturés et en polyphénols, composés bioactifs, a prévenue l'altération de plusieurs marqueurs du stress oxydatif induit par l’hypercholestérolémie et pourrait être potentiellement utilisée dans la protection contre l’athérosclérose. Cette étude sur l'effet hypocholestérolémiant et antioxydant de l'huile de C.aurantium chez le modèle rat nécessite des études plus approfondies pour extrapoler ces résultats chez l’homme.

Mots clés : cholestérol, Citrus aurantium, acides gras, polyphénols, activité antioxydante, tocophérols, stress oxydatif. Abstract

Citrus by-products represent a rich source of phenolic compounds, owing to the large amount of peels and seeds they contain. The residues of Citrus fruits, which are discarded as waste in the environment, can be used as potential nutraceutical resources. Among orange varieties, (The bitter orange, Citrus aurantium) cultivated in Algeria as an ornamental tree, can be considered a potent source of functional ingredients. The purpose of this work was to analyze the content of primary metabolites and phenolic compounds in the seeds of Citrus aurantium and the oil extracted from these seeds and to evaluate their antioxidant capacity by colorimetric methods. Furthermore, to study the effect of a diet enriched with seed oil from C.aurantium and supplemented with cholesterol on lipid metabolism and oxidant / antioxidant status in the Wistar rat.

The physicochemical characteristics of the seeds and seed oil from C.aurantium showed that seeds contain 38,21% fat. The fatty acid composition of the oil shows considerable unsaturation due to the high oleic and linoleic acid contents. The determination of the indices (relative density, refractive index, acid index and saponification index) revealed that it is pure oil, containing non-negligible levels of α-tocopherol and total polyphenols. In addition, the C.aurantium seeds contain 2,12 mg AGE / g MS with the predominance of condensed tannins (0,3 mg CE / g MS), followed by the two fractions of n-butanol and ethyl acetate flavonoids (0,043 mg Mg CE / g MS and 0,033 mg CE / g MS respectively). The evaluation of the antioxidant power in vitro by the different methods (DPPH, FRAP, -carotene) showed that the phenolic extracts of the C. aurantium and oil seeds had a different antioxidant activity. Moreover, the ethyl acetate fraction of the flavonoids had a high activity compared to the other extracts.

In order to determine the effects of consumption of oleaginous seed oil on hypercholesterolemia and oxidative stress induced by a cholesterol-enriched diet in rats, we conducted an in vivo experiment on a sample of four groups of rats Males, each of which was fed either with a basal diet based on sunflower oil (NRT) or based on the oil of bigarade (NRB), or rats consuming this same basal diet supplemented with 1% of cholesterol (NRTC or NRBC). The results showed that whatever the nature of the diet, the weight changes in the same manner, as the amount of food ingested is statistically insignificant between diets (p˃0,05). We observed a significant decrease in plasma glucose, total cholesterol, and LDL-C levels in NRBC groups compared to NRTC groups (p<0,05). However, there were no significant differences in triglyceride concentrations in cholesterol-supplemented rats, whereas they were reduced in the NRB group compared to the NRT. In addition, the enrichment of the diet by the C.aurantium seed oil had an important role in the antioxidant defense by increasing the plasma contents of vitamin E and reduced glutathione, by stimulating the activity of catalase and superoxide dismutase, and reducing markers of lipid peroxidation; Indeed, we observed a decrease in plasma and erythrocytic contents in malondialdehyde, hydroperoxides and conjugated dienes mainly in rats supplemented with NRBC cholesterol compared to NRB (p<0,05).

These findings indicate that the supplementation of C.aurantium seed oil in the diet of rats, partly through its content of unsaturated fatty acids and polyphenols, bioactive compounds, prevented the alteration of several stress markers oxidative induced by hyper-cholesterolemia and could potentially be used in protection against atherosclerosis. This study on both cholesterol-lowering and antioxidant effect of C.aurantium in the rat model needs further în-depth studies to extrapolate these results in humans.

Key words: cholesterol, Citrus aurantium, fatty acids, phenols, antioxidant activity, tocopherols, oxidative stress. لص

تعتلتج لني لحي م غي بلك ليلي, يجع لك ل كي لق ل لي لتي تحتي. ه ل لتي يتم لتص م ع ع شل ني في لي ين ستم ك مغي يي فعل. من بين أصف لتق. تستعل شج لتق ل(bigarade، Citrus aurantium) كج تيين في لجئ, ين عته ك غي بلعص ليي، في ه إ ق بي بتقي كي لك ألي ليلي لتج في ب ه لت في ليت لست من ه ل, ك ق بخت لق ل لتأكس لست ليلي بست قي ليف لئي. بع لك ق بس فعلي ل لغئي لغي بيت ب لق (bigarade) لستل بللست ع لتغي ايي لهي ع حل أكس ع ل يست.

أ لئص لييكييئي ل لق ليت لست من ه ل أن تت من % γ8,β1 من ل لس ليت لست من ه ل تحت ع نسب علي من أح لهي لغي مع يجع لك ل ت مستي حض لييك حض ليلييك. ك تحي لش (لف لسي، معمل انس، مش لحض مش لتين) ليت نقت حتئ ع نس معت من تكفي لليي، تحت ي ب لق ع نس gεS/GEAmg β,1β من لليي غ بلتي ل (gεS/mgCE0,γ), يي جئين من لافنيي, بتن خا اثيل (gεS/mgCE0,0γγ gεS/mgCE0,04γ ). تقي ل ل لأكس ب مت (DPPH، FRAP، Carotène) أ لك ليلي ل ليت لم ن مت لأكس ل ناحظ أ جء خا اييل ل تتتع بق علي ل أكس مقن بلستج اخ.

في يص معف تأثي يت ب لق ع نس للست لعلي ع لضع لتكسي في ل بع تتلم ل لغئي لستل بللست، ق بتقسيم ل 4 أف، 5 في كل ف، NRT تت تغيتم بيت ع لس، NRB بيت ب لق، أم NRBC NRTC نمم لغئي مستل بللست ( %1 ).بيت لتئج أ ل كي لغء لستك لم تتغي بتغي ل لغئي. لق سج نض مح في مست لس للست C -δDδ في C بام ل NRBC مقن ب NRTC، لن لم نسجل أ تغيي في مست لتيغيسيي ع أف لست في ن غئ بللست غي أن كنت م ع ف NRB مقن ب NRT. بإضف ل لك أ ل لغئي لغي بيت لق لعب هم في تحسين لضع لتكسي لك بت لستي لامي ليتمين E لقتي لستجع ت ن نيم لتا سب أكسي يست ك تحسين عام أكس لهي سجت نض في مستي للنت ثئي الهي ليبيكسي في لام في لي لحء بل ع ل NRBC مقن ب NRB. بيت ه لتئج أ ضف يت لق في ل لغئي ل، ب تحتيه من أح هي مع من لي (من حيي،سع ع تحسين عام إج لتكسي ل عن ت نس للست في ل ك بإمن لحي ض م ت ليين. ه لس ح تأثي يت ب لق ع ن نس للست ل لتأكس ع ن ل يحت ل س أك عق حت يتس ستقئ ع إنس

الكلما المفتاحي : للست، trus aurantiumiC، أح هي، م للي، ل ل لأكس، تكفي، إج لتكسي. .

SOMMAIRE

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX LISTE DES ABRÉVIATIONS

INTRODUCTION………………………………………………………..…………………………..… 1

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE I. δes aliments fonctionnels………………...………………………………………………….……..….. 6 I.1. Généralités…………………………………………………………………………………..…..… 6 I.β. Définitions……………………………………...... …… 7 I.γ. les différents types d’aliments fonctionnels…...... ………………………...... … 10 I.γ.1. les antioxydants………...... ……………………………………………...... … 10 I.γ.1.1. Définition des antioxydants……...... …………………………………...... … 10 I.3.1.2. Les radicaux libres et les espèces réactives oxygénées...... 10 I.γ.1.γ. δe stress oxydatif………………………………………...... 12 …………………………………………… I.γ.1.4. δa peroxydation lipidique………………………………...... 14 I.γ.1.5. δes différents types d’antioxydants …………………………………...... 15 I.γ.1.5.1. δes antioxydants enzymatiques…………………………………...... 15 I.3.1.5.2. Les antioxydants non enzymatiques enzymatiques...... 16 ………………………………………………………………………….a. δes polyphénols…………....……………………………………………… 16 b. Les vitamines……………………………………....…………………….… 23 I.3.2. Les minéraux...... 25 I.3.3. Les stérols...... 27 I.3.4. Les acides gras polyinsaturés...... 29 I.3.5. Les prébiotiques...... 32 I.3.6. Les probiotiques...... 33 II. Valorisation des fruits et de leurs sous-produits...... 34

PARTIE EXPERIMENTALE PARTIE IN VITRO : Etude phytochimique des pépins du Citrus aurantium et de l’huile extraite à partir de ces pépins et évaluation des activités antioxydantes de leurs extraits phénoliques. MATERIEL ET METHODES I. εatériel végétal………………………………………………………………...... ……………... 40 II. Description et identification botanique……………………………………………………...... 40 III. Utilisation et vertus thérapeutique ...... 42 IV. Origine géographique et période de récolte des plantes ……………...... …. 43 V. Préparation des échantillons…………………………………………………...... ………………… 43 VI. εéthodes d’analyses...... 43 VI.1. Détermination de la teneur en eau ……………………………………………………...... 43 VI.2. Tests phytochimiques...... 43 VI.3. Détermination quantitative des métabolites primaires...... 48 VI.γ.1. Dosage de l’azote total et les protéines brutes ...... ……...... 48 VI.3.2. Dosage des fibres alimentaires ……………………………...... 48 VI.3.3. Dosage des sucres totaux...... 48

VI.3.4. Dosage des cendres……………………………………………………………………… 49 VI.3.5. Dosage des lipides totaux...... 49 VI.3.5.1. Détermination des indices physico-chimiques de l’huile...... 49 VI.3.5.2. Dosage des acides gras par Chromatographie en phase gazeuse (CPG)...... 51 VI.3.5.3. Dosage de la vitamine E...... 52 VI.4. Extractions et Dosages des métabolites secondaires...... 53 VI.4.1. Extraction et dosage des phénols totaux à partir de l’huile...... 53 VI.4.2. Extractions des composés phénoliques à partir des pépins du Citrus aurantium...... 53 VI.4.2.1. Extraction des polyphénols totaux...... 53 VI.4.2.2. Extraction des flavonoïdes…………………………………………………….. 53 VI.4.2.3. Extraction des tanins…………………………………………………………. 54 VI.4.3. Dosage des composés phénoliques...... 54 VI.4.3.1. Dosage des polyphénols totaux...... 54 VI.4.3.2. Dosage des flavonoïdes ………………………………………………………… 55 VI.4.3.3. Dosage des tanins condensés...... 55 VI.5. Tests d’activité antioxydante……………………………………………………………………. 55 VI.5.1. Effet scavenger du radical DPPH...... 55 VI.5.2. Test du blanchissement du -carotène...... 56 VI.5.3. Réduction du fer : FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)………………………… 56 RESULTATS ET INTERPRETATIONS I. Taux de la matière sèche...... 59 II. Tests phytochimiques...... 59 II. III. Métabolites primaires...... 60 IV. Analyse physico-chimique de l’huile de pépins du Citrus aurantium...... 61 IV.1. Valeurs des indices physico-chimiques de l’huile...... 61 IV.β. Détermination de la composition en acides gras de l’huile...... 61 IV.3. Teneurs en α-tochophérol et polyphénols de l’huile de pépins de bigarade...... 62 V. Rendements et dosages des composés phénoliques...... 62 VI. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium et de l’huile...... 63 VI.1. Le piégeage du radical libre DPPH ...... 64 VI.2. Le blanchissement du -carotène...... 65 VI.3. Le pouvoir réducteur du fer (FRAP)...... 67 DISCUSSION...... 70 PARTIE IN VIVO : Etude du pouvoir hypocholestérolémiant et antioxydant de l’huile des pépins de Citrus aurantium chez le rat « Wistar » I. Choix des animaux……………………………………………………………………………………. 84 II. Préparation des régimes……………………………………………...... … 84 III. Evolution du poids et de la glycémie...... 84 IV. Sacrifices et prélèvements de sang ……………………………………………………...... ……… 85 V. Analyses biochimiques…………………………………...... 86 V.1. Détermination des teneurs en protéines totales...... 86 V.β. Dosage de l’urée………………………………………………………………...... 86 V.3. Dosage de la créatinine...... 86 V.4. Dosage des paramètres lipidiques...... 86 V.4.1. Dosage du cholestérol total …………………………………………………………...... 86 V.4.β. Dosage des triglycérides …………………………………………………………...... 87 V.4.3. Dosage des fractions lipoprotéiques ……………………………...... 87 V.4.4. Détermination de la teneur en lipides totaux du foie ……...... 87 V.4.5. Détermination de la composition plasmatique en acides gras...... 88

VI. Evaluation du statut oxydant/antioxydant...... 88 VI.1. Détermination du taux des hydroperoxydes...... 88 VI.2. Dosage du malondialdéhyde (MDA)………………….……………………………………… 88 VI.3. Oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques ……………………………………...... 88 VI.4. Dosage des vitamines A et E ………...... 89 VI.5. Dosage de la vitamine C ………………………………...... 90 VI.6. Dosage du Glutathion réduit...... 90 VI.7. Détermination du pouvoir antioxydant total du plasma (ORAC)...... 90 VI.8. Détermination de l’activité des enzymes antioxydantes …………………...... 91 VI.8.1. Dosage de l’activité de la catalase plasmatique et érythrocytaire...... 91 …………………………VI.8.β. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase plasmatique et érythrocytaire (SOD).. 92 ….…….VI.8.γ. Dosage de l’activité de la glutathion réductase plasmatique (GSSG-Red)...... 92 ………………………………………………………………..….. VII. Analyse statistique…………...... 92 RESULTATS ET INTERPRETATIONS I. Evolution du poids corporel et quantité d’aliment ingérée chez les différents lots de rats...... 94 II. Evolution de la glycémie chez les différents lots de rats...... 95 III. Paramètres biochimiques plasmatiques chez les différents lots de rats...... 96 III.1. Teneurs plasmatiques en protéines, créatinine et en urée...... 96 III.2. Teneurs plasmatiques en triglycérides, cholestérol, et des lipoprotéines chez les différents lots de rats...... 98 III.3. Composition en acides gras des lipides sériques chez les différents lots de rats...... 99 IV. Poids relatif et taux des lipides totaux du foie chez les lots de rats...... 100 V. Le statut oxydant/antioxydant...... 101 V.1. Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde, et en hydroperoxydes chez les différents lots de rats...... 101 V.2.Oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les groupes de rats...... 103 V.3. Teneurs plasmatiques en vitamines antioxydantes (A, C, E) chez les groupes de rats...... 104 V.4. Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit et pouvoir antioxydant total chez les quatre lots de rats...... 106 V.5. Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires chez les différents lots de rats...... 107 DISCUSSION ...... 110 CONCLUSION GENERALE...... 131 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………………………… 135 ANNEXES……………………………………………………………………………………………….. 159

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Antioxydants et marqueurs d’oxydation……………...... 26 Tableau 2 : taux d’humidité et de la matière sèche des pépins du Citrus aurantium...... ….....….... 59 Tableau 3 : Résultats des réactions de caractérisation des différents groupes chimiques recherchés 60 dans les extraits des pépins du Citrus aurantium...... Tableau 4 : Les teneursrégimes………………………...... ……………………...... en métabolites primaires des pépins du Citrus aurantium, exprimées en 61 pourcentage de matière sèche.………...... …………......

Tableau 5 : Valeurs des indices physico-chimiques de l’huile de pépins de Citrus aurantium ...... 61 Tableau 6 : Composition en acides gras de l’huile de pépins de Citrus aurantium...... 62 Tableau 7 : Les teneurs en α-tocophérol et en polyphénols de l’huile de pépins Citrus aurantium. 62

Tableau 8 : Rendements et dosages des composés phénoliques des pépins du Citrus aurantium ... 63 Tableau 9 : 50% d’inhibition du radical libre DDPH des extraits phénoliques des pépins du 65 Citrus aurantium …………………………………………......

Tableau 10 : Valeurs des IC50 du test du blanchiment du -carotène des extraits phénoliques des 67 pépins du Citrus aurantium...... Tableau 11: Composition des régimes témoins et expérimentaux en pourcentage pondéraux et énergétiques …………………...... ………………………………...... ……...... 85 Tableau 12: Composition en acides gras (% pondéral) des lipides sériques chez les différents lots de rats...... 100

ANNEXES :

Tableau 13: Evolution du poids corporel (g) chez les différents lots de rats ...... 160

Tableau 14: Quantité d’aliment ingérée des rats témoins et expérimentaux ……...... 161 Tableau 15 : Variation de la glycémie (g/L) chez les rats témoins et expérimentaux...... 161 Tableau 16 : Teneurs plasmatiques en protéines (mg/ml), en créatinine (g/L) et en urée (mg/L) 162 chez les différents lots de rats………………………...... ……………………...... Tableau 17 : Teneurs en triglycérides et en cholestérol du plasma et des lipoprotéines (mmol/L) chez les différents lots de rats...... 162 Tableau 18 : Poids relatif (g/100g) et taux des lipides totaux du foie (mg/g de tissu) chez les lots de rats...... 163 Tableau 19 : Marqueurs plasmatiques et érythrocytaires du statut oxydant chez les différents lots de rats...... 163

Tableau 20 : εarqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les différents lots de rats ……...... 164 Tableau 21 : Teneurs plasmatiques en vitamine C, A et E chez les différents lots de rats ...... 164 Tableau 22 : Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit et le pouvoir antioxydant total chez les différents lots de rats …...... 165 Tableau 23: Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires chez les différents lots de rats...... 165 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Evolution des modes alimentaires au fil du temps...... 7 Figure 2 : Tableau du positionnement des aliments fonctionnels.………………...... 9 Figure 3 : Origine des différents radicaux libres oxygénés réactives de l’oxygène...... 12 Figure 4 : Facteurs intervenant dans l'équilibre de la balance anti/pro-oxydante...... 13

Figure 5 : Déséquilibre de la balance entre pro-oxydants et antioxydants...... 13 Figure 6 : Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature des 14 produits terminaux formés …………………………...... ……...... Figure 7 : εode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs 16 cofacteurs métalliques ………………………………………...... ………...... …... Figure 8 Classification des antioxydants phénoliques ………………………..……...... ….....… 18 Figure 9 : Classification des flavonoïdes des Citrus et leurs structures chimiques...... 19

Figure 10 : Représentation schématique du potentiel antioxydant et le mécanisme d'action des 22 Citrus …...... ……......

Figure 11 : Structure des principaux stérols des eucaryotes……….……………...... ……...... 24

Figure 12 : Structure des principaux stérols des eucaryotes……..………...... …………...... 27

Figure 13 : Acides gras saturés et insaturés et leurs principales sources …………...... 30

Figure 14 : Structure et métabolisme des acides gras n-3 et n-6 ………………………...... 31 Figure 15 : Fruits du bigaradier ………………………...... ………………...... 41

Figure 16 : Les pépins des bigarades ……………………...... ………………...... …...... 42

Figure 17 : Tests phytochimiques ……………………...... ………………...... 47

Figure 18 : Protocole général des extractions des polyphénols, flavonoïdes et tanins, les différents 57 dosages et les méthodes antioxydantes utilisées …………………...... …...... Figure 19 : Pourcentage d’inhibition du radical DPPH des extraits des pépins du Citrus 64 aurantium...... Figure 20 : Pourcentage d’inhibition du blanchiment du -carotène des extraits phénoliques des 66 pépins du Citrus aurantium...... Figure 21 : Pouvoir de réduction du fer des différents extraits phénoliques des pépins du Citrus 68 aurantium...... Figure 22 : Evolution du poids corporel (g) chez les différents lots de rats...... 94 Figure 23 : Quantité d’aliment ingérée (g) des rats témoins et expérimentaux...... 95 Figure 24: Evolution de la glycémie (g/L) chez les différents lots de rats...... 96 Figure 25 : Teneurs plasmatiques en protéines, en créatinine et en urée chez les différents lots 97 de rats......

LISTE DES FIGURES

Figure 26: Teneurs plasmatiques en cholestérol et en triglycérides chez les différents lots de 98 rats...... Figure 27 : Teneurs en cholestérol des HDL et LDL chez les différents lots de rats...... 99 Figure 28 : Poids relatif et taux des lipides totaux du foie chez les lots de rats...... 101 Figure 29 : Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde chez les différents lots de rats...... 102

Figure 30 : Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en hydroperoxydes chez les différents lots de rats...... 102

Figure 31 : εarqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les différents lots de rats...... …...... 104 Figure 32 : Teneurs plasmatiques en vitamines (A, C, E) chez les différents lots de rats...... 105

Figure 33 : Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit (nmol/L) et pouvoir antioxydant total chez les différents lots de rats...... 107 Figure 34 : Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires chez les différents lots de rats.………………...... …. 108

ANNEXES : Figure 35 : Courbe d’étalonnage du glucose pour le dosage des sucres...... 159 Figure 36 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des phénols totaux...... 159 Figure 37 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des flavonoïdes...... 159 Figure 38 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des tanins ...... 160

LISTE DES ABREVIATIONS

AA : Acide ascorbique

Aa : Acide Arachidonique

ADN : Acide Désoxyribonucléique

AGE: : Acide gallique équivalent

AGMI : Acides gras mono-insaturés.

AGPI : Acides gras poly-insaturés.

AGS : Acides gras saturés

ALA : Acide linolénique

AlCl3: : chlorure d’aluminium Apo : Apolipoproteine

ATP : Adénosine Triphosphate

BHA : Butylhydroxyanisole.

BHT : buthylhydroxytoluène

CAT : Catalse

CE : Catéchine équivalent

CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse

DC : Diènes conjugués

DHA : Acide Docosahexaénoïque

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil

DTNB : Acide 5,5 Dithiodis-2-Nitrobenzoïque d20 : Indice de densité

EDTA : Acide éthylenediaminetétraacetique

EPA : Acide Eicosapentaénoïque

ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène FAO : Food and Agriculture Organisation of the United Nations

FeCl3 : chlorure de fer

FRAP : Ferric reducing antioxidant power

GR : Globules rouges

LISTE DES ABREVIATIONS

GSH : Glutathion réduit

GSH -Px : Glutathion peroxydase

GSSH-red : Glutathion reductase

HDL : High density lipoprotein

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène HP : Hydroperoxydes

HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance

IA : Indice d’acide IC50 : concentration inhibitrice de 50%

IS : Indice de Saponification

LA : Acide linoléique

LCAT : Lecithin Cholesterol Acyl Transferase

LDL : Low Density Lipoprotein

LPL : Lipoprotéine Lipase

MCV : Maladies Cardiovasculaires

MDA : Malondialdéhyde

MeOH : Méthanol

MS : MS: matière sèche

NADP : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate

NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate Réduit

Ndt : Indice de Réfraction

NO : εonoxyde d’azote

•- O2 : δ’anion superoxyde

1 O2 : Le dioxygène singulet

OH• : le radical hydroxyl

OMS : Organisation mondiale de la santé

ORAC : Oxygen radical absorbance capacity

ONOO– : Peroxynitrite

LISTE DES ABREVIATIONS

RL : Radicaux libres

ROOH : Radical peroxyle

ROS : Reactive Oxygen Species

SOD : Superoxyde dismutase

TCA : Acide trichloroacétique

TG : Triglycérides

T(lag) : Phase de latence

T (max) : Temps d’Oxydation εaximal

INTRODUCTION

Introduction

Les plantes sont ancrées à la terre mère bien avant que l'homme met ses pieds sur terre (Parle and Chaturvedi, 2012). Les plantes médicinales ont toujours eu un rôle de grande importance sur la santé des hommes (Asgary et al., 2014; Carillon, 2000). Les deux tiers de la population mondiale (principalement dans les pays en voie de développement) repose entièrement sur ces thérapies médicales traditionnelles comme leur principale forme de soins de santé (Organization, 2005). Cette tradition de médecine végétale se poursuit jusqu’à nos jours en Inde, en Chine et dans beaucoup de pays africains et sud-américains (Eddouks et al., 2007). δ’organisation mondiale de la santé (OεS) estime que près de 80% de la population africaine dépend encore de médicaments à base de plantes pour le traitement de diverses maladies pour des raisons d’ordre socio-économiques, socioculturelles ainsi que pour leur disponibilité. Ainsi, Les plantes médicinales ont formé la base des systèmes traditionnels de médecine à travers les âges et ont formé la base de la pharmacologie moderne (Parle and Chaturvedi, 2012). Cependant, l’Algérie mène des Investigations visant à développer des médicaments issus de plantes de médecine traditionnelle en réalisant des études phytochimiques, pharmaco- toxicologiques et cliniques pour la mise au point de médicaments traditionnels améliorés (Benammar, 2011). À cet égard, une grande attention a été accordée ces dernières années à des composés naturels, tels que les polyphénols, les caroténoïdes, les peptides, les stérols ou les acides gras polyinsaturés (AGPI), et leurs activités biologiques associées (Baraka-Vidot et al., 2013). En effet notre alimentation actuelle est représentée par des apports lipidiques importants, notamment en acides gras saturés (AGS). Or, l’effet d’une surconsommation de ces nutriments sur le métabolisme de certains tissus, foie et muscle squelettique en particulier, ne semble pas neutre. Un nombre important d’études ces dernières années ont pu décrire les anomalies métaboliques liées à une telle consommation (Walrand et al., 2010). Il est bien connu que l'alimentation joue un rôle important dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol. Un régime riche en cholestérol est considéré comme un facteur important pour le développement de l'hyperlipidémie, l'athérosclérose et les maladies cardiaques (Braunwald, 1997, Wang et al., 2014).

Introduction

Le taux de cholestérol contenu dans les érythrocytes, les plaquettes, les leucocytes polynucléaires et les cellules endothéliales augmente dans l’hypercholestérolémie. Cette augmentation va activer ces cellules et favoriser la production des radicaux libres de l'oxygène (Prasad et al., 1989; Kok et al., 1991; Cheraghi et al., 2017). δes radicaux libres de l’oxygène, des dérivés de l’oxygène hautement réactifs et instables, conduisent à des dégâts cellulaires et moléculaires essentiellement par l’oxydation des protéines, de l’ADN ou des lipides. La mesure de leurs produits oxydatifs est difficile et la méthodologie imparfaite, mais ceux-ci apportent des indications sur le stress oxydatif, qui peuvent être reliées au développement de diverses pathologies (Dhalla et al., 2000; Bonnefont-Rousselot et al., 2002). Dans les systèmes biologiques, le stress oxydant est la conséquence d'un déséquilibre entre la production de radicaux libres et leur destruction par des systèmes de défenses anti-oxydantes (Brady et al., 2006, Youn et al., 2014). Pour échapper aux conséquences du stress oxydant, il est nécessaire de rétablir l’équilibre oxydant/antioxydant afin de préserver les performances physiologiques de l’organisme (Packer et al., 1999). De nombreux travaux de recherche se sont focalisés sur l'apport nutritionnel en acides gras insaturés et en antioxydants, et par voie de conséquence se penchent avec un intérêt toujours grandissant sur la composition en acides gras et en micronutriments des huiles et graisses végétales et leurs effets physiologiques et moléculaires sur le métabolisme chez l'homme (Gharby et al., 2011). En outre, les effets biologiques des polyphénols ont été évalués dans de nombreuses études et souvent associés à leurs propriétés antioxydantes intrinsèques. Il a été montré in vitro que les polyphénols avaient des effets protecteurs sur des modèles de stress oxydatif (Zhang and Tsao, 2016). Leurs propriétés sont largement étudiées dans le domaine médical où on leur reconnaît des activités anti-virales, anti-tumorales, anti-inflammatoires, anti- allergiques et anti-cancers. Ils ont également des actions positives sur l’obésité, le diabète, les maladies d’Alzheimer et de Parkinson (Manach et al., 2004, Pan et al., 2015). Ils jouent aussi un rôle important dans la qualité organoleptique des fruits et légumes, utilisés frais ou après transformation industrielle.

Introduction

Il a été suggéré que la consommation fréquente des fruits et légumes est associée à un moindre risque de cancer et de maladies cardiovasculaires (Liu et al., 2000, Bazzano et al., 2002) de part leur forte activité antioxydante (Baratto et al., 2003, Katalinic et al., 2006) ainsi que leur activité de piégeur puissant contre les radicaux libres (Kumaran and Karunakaran, 2007). En effet, les agrumes sont riches en divers nutriments tels que les vitamines A et C, l'acide folique et des fibres alimentaires. En outre, ces fruits sont une source de composés bioactifs, comme les flavonoïdes, des coumarines, limonoïdes et caroténoïdes (Ding et al., 2012, Turner and Burri, 2013). En fait, des études approfondies axées sur la partie comestible des agrumes ont montré que les extraits de jus possèdent un potentiel antioxydant important et représentent une source de composés phénoliques principalement les flavanones (Rapisarda et al., 1999; Gattuso et al. ; 2007; Jayaprakasha et al., 2008; Kelebek et al., 2008; Huang et al., 2007; Barreca et al., 2010; Ramful et al., 2010; Peterson et al., 2006). Environ 80% de la récolte d'agrumes est utilisée par l'industrie des jus. Toutefois, au cours du processus d'extraction de jus d'agrumes, de grandes quantités de déchets (sous-produits) sont produites (55% du poids). Ils sont constitués d’écorces et des pépins restants après extraction du jus et posent un sérieux problème pour leur élimination. Ainsi, de nouveaux aspects concernant l’utilisation de ces sous-produits comme additifs alimentaires ou comme suppléments à haute valeur nutritionnelle ont suscité un grand intérêt. Des études récentes ont montré que les sous produits des oranges sont une source de composés bioactifs (Andreelli and Jacquier, 2006; Hayat et al., 2010; Khan et al., 2010; Kim et al., 2008; Sahraoui et al., 2011), ils contiennent des antioxydants naturels tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes (Hayat et al., 2010; Kim et al., 2008). L'utilisation de ces résidus riches en composés bioactifs peut fournir une plate-forme efficace, peu coûteuse et respectueuse de l'environnement pour la production de nouveaux produits nutraceutiques ou pour l'amélioration des anciens (Rafiq et al., 2016). Des études portant sur les caractéristiques physicochimiques ainsi que sur la composition de l’huile extraite à partir des pépins du Citrus Sinensis (orange douce) et à partir des pépins du Citrus aurantium (orange amère ou bigarade), ont montré que ces huiles sont riches en acides gras essentiels tels que l’acide linoléique, oléique et linolénique, ainsi qu’en tocophérols (Anwar et al., 2008; Nwobi et al., 2006).

Introduction

En outre, une étude récente a montré que la consommation de l’huile des graines du Citrus sinensis chez des rats rendus diabétiques avait des effets positifs sur l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie (Chilaka et al., 2015). Cependant, il n'existe pas de travaux sur les effets de l’huile extraite à a partir des graines du Citrus aurantium (orange amère ou bigarade) sur l’hypercholestérolémie et le stress oxydatif. De ce fait, δ’objectif de ce travail de thèse porte tout d’abord sur l’évaluation in vitro de la composition chimique et l’activité antioxydante des pépins obtenus à partir de la bigarade Algérienne (Citrus aurantium) ainsi que sur l’huile extraite à partir de ces pépins. Ensuite nous avons évalué l’activité biologique de cette huile in vivo, à savoir son activité hypocholestérolémiante et anti-oxydante chez le rat Wistar.

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

Partie bibliographique

Au cours des dernières décennies, l’évolution de l’hygiène, les progrès de la médecine, la mise au point de nouveaux traitements thérapeutiques ont permis d’augmenter l’espérance de vie dans de nombreuses populations. Mais en conséquence, une recrudescence des maladies cardiovasculaires, diabète de type II, maladies neurodégénératives ou encore de certains cancers a été mesurée (Gay, 2009). Par ailleurs, de nombreuses études épidémiologiques visant à mettre en évidence les relations entre les habitudes alimentaires et les risques de développer des maladies graves ont démontré que notre alimentation avait un impact direct sur notre santé. Aujourd’hui, on s’entend que la consommation de « bons aliments» augmente la longévité et améliore la qualité de vie. Ainsi, entre l’aliment qui nourrit et le médicament qui guérit, une zone vierge à forte valeur ajoutée s’est ouverte depuis une vingtaine d’années aux industriels (Kiani, 2007).

I. Les aliments fonctionnels I.1. Généralités S'alimenter a pour but de satisfaire au mieux les besoins énergétiques (macronutriments) et les besoins qualitatifs (micronutriments) d'un individu en toutes circonstances (Lavallée et al., 2004). Aujourd'hui l'alimentation est une question mise sur le devant de la scène. Ce sujet est abordé de différentes façons et suscite un bon nombre de questionnements, en parlant de ce que nous mangeons, de comment nous mangeons, de comment sont fabriquées les denrées, mais aussi en évoquant l’impact qu'a cette alimentation sur notre corps: cholestérol, obésité, et maladies (Lavallée et al., 2004). En effet, les consommateurs sont passés du simple besoin, qui est de satisfaire la faim, à la consommation d’aliments pour le maintien du bien-être et la réduction des risques de maladie (Niva, 2007). Au cours des dernières années notamment durant la dernière décennie, diverses entreprises se sont investies dans les aliments santé (Pandey et al., 2010). Ce marché regroupe des spécialistes des compléments alimentaires, des produits de santé et de bien-être naturel, de la parapharmacie, de la diététique, des industriels de la pharmacie et enfin ceux de l’agroalimentaire. En effet, de nombreuses formulations issues de l’alimentation mais commercialisés sous une apparence pharmaceutique (comprimés, capsule, solutions, gels, poudres…) sont apparues sur le marché (Niva, 2007). Ces produits ne pouvant pas être considérés comme des produits alimentaires classiques et ayant a priori des effets sur la santé plus importants que les compléments alimentaires connus.

Partie bibliographique

Ce sont les aliments dit « fonctionnels » qui sont des aliments ordinaires ou d’apparence semblable qui présentent des avantages physiologiques dépassant leurs fonctions nutritionnelles de base ou qui réduisent les risques de maladies chroniques (Niva, 2007; Cencic and Chingwaru, 2010). Bien que le terme aliment fonctionnel soit apparu récemment, l’idée de «se nourrir pour guérir» n’est pas nouvelle en soi, celle-ci fut déjà exprimée à plusieurs reprises dans le passé: «Que ton aliment soit ton premier remède» (Hippocrate) ou «Tout menu est une ordonnance» (Jean Rostand). De tout temps, l’homme a mangé les aliments qui lui étaient proposés. C’est avec l’avancée technologique que celui-ci a vu apparaître de nouvelles gammes de produits sur le marché. Tenté par les tendances et les nouveautés, il a donc au fil du temps changé son alimentation (Figure 1).

Figure 1 : Evolution des modes alimentaires au fil du temps (Callias, 2007)

I.2. Définitions Le terme aliment fonctionnel a été introduit au Japon en 1980, se référant à des aliments naturels enrichis de constituants possédant des effets physiologiques bénéfiques (Kaur and Das, 2011; Martirosyan and Singh, 2015).

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La consommation d'aliments fonctionnels s'est par la suite diffusée dans le monde entier (Martirosyan and Singh, 2015), encouragée par l'intérêt alimentaire croissant des consommateurs (Hardy, 2000). Une des grandes difficultés pour reconnaître les dits «aliments santé» est que les noms les définissant sont multiples. On entend par exemple aliments fonctionnels, nutraceutiques, ou encore alicaments dans les pays francophones et/ou «nutraceuticals», «functional foods», «pharmafoods», «designer foods» dans les pays anglophones. Cela entraîne évidemment une confusion car ces termes, bien que très proches, n’ont pas tous la même signification. Dans les pays francophones, on distingue deux catégories du type «aliments santé»:

- Les nutraceutiques qui se rapprochent plus des médicaments car ils se présentent sous forme de poudres ou de pastilles.

- Les aliments fonctionnels et les alicaments, produits alimentaires enrichis en diverses substances (vitamines, sels minéraux, calcium…) (Callias, 2007). À titre de définition générale, un aliment est « fonctionnel » s’il contient une composante alimentaire qui affecte une ou plusieurs fonctions précises du corps et qui produit des effets positifs. Cet effet devrait être utile au bien-être et à la santé ou permettre de réduire le risque de maladie (Roberfroid, 1999) (Figure N°2). Un aliment fonctionnel est un aliment semblable à un aliment traditionnel, ou est un aliment traditionnel qui fait partie de l'alimentation normale, qui offre des bienfaits physiologiques prouvés ou qui réduit le risque de maladie chronique au-delà des fonctions nutritionnelles de base (Julien et al., 2005). Les aliments fonctionnels ont également été définis comme étant des produits qui ont été modifiés ou enrichis à l’aide de substances naturelles qui ont des effets préventifs ou avantageux pour la santé (Poulsen, 1999).

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Figure 2 : Tableau du positionnement des aliments fonctionnels (Saives and Cloutier, 2003).

Les aliments fonctionnels peuvent fournir des avantages pour la santé humaine. En effet, ils se focalisent sur la prévention ou du moins sur la diminution du risque de certaines pathologies. Les principales pathologies ciblées sont les affections cardiovasculaires (notamment l’hypercholestérolémie), les troubles gastro-intestinaux et l’ostéoporose (et plus globalement la santé des os et des articulations) (Lassoued et al., 2014). On sait désormais que plusieurs aliments (fruits, légumes) contiennent des nutriments et des composés bioactifs qui influencent le fonctionnement de l’organisme (Bellisle et al., 1998; Riedl et al., 2002; da Silva et al., 2016). Cette propriété tient à leur teneur en antioxydants (Balsano and Alisi, 2009), notamment la vitamine C, la vitamine E, les caroténoïdes et les polyphénols (flavonoïdes, catéchines, isoflavones) glucosinolate (Laguerre et al., 2007). Dans la section suivante, une attention particulière sera accordée aux composés phénoliques, les stérols, les acides gras polyinsaturés, etc qui représentent les principales classes de produits phytochimiques utilisées comme ingrédients dans les formulations alimentaires fonctionnelles.

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I.3. les différents types d’aliments fonctionnels I.3.1. Les antioxydants I.3.1.1. Définition des antioxydants Comme leur nom l’indique, les antioxydants protègent l’organisme de l’oxydation. Ce sont des substances capables de supprimer, retarder ou empêcher les processus d’oxydation causés par les radicaux libres et les espèces réactives de l'oxygène (ERO) (Heo et al., 2007; Pszczola, 2001; Klein and Kurilich, 2000; Berger, 2006).

I.3.1.2. les radicaux libres et les espèces réactives oxygénées Un radical libre est une espèce chimique contenant un électron non apparié. Extrêmement instable, ce composé peut réagir avec les molécules les plus stables pour apparier son électron. Il peut soit arracher un électron (se comportant comme un oxydant), soit en céder un (agissant alors comme un réducteur). Cette première réaction conduit généralement à la formation en chaîne de nouveaux radicaux. Ils sont formés le plus souvent par gain d’électron à partir de l’O2 (Milane, 2004).

L'O2 est une molécule biradicalaire formée de deux atomes présentant sur leur orbitale externe deux électrons non appariés. Il est donc susceptible de capter facilement 1 puis 2 électrons •- pour être partiellement réduit en O2 puis en H2O2. Il est ainsi à l'origine de la formation des espèces réactives de l’oxygéne (Reactive Oxygen Species : ROS). •- δ’appellation ROS inclut les radicaux libres de l’oxygène : l’anion superoxyde (O2 ), le radical hydroxyl (OH•), le monoxyde d’azote (NO•), peroxyl (ROO•), mais également les composés non radicalaires : l’hydroperoxyde (ROOH), peroxyde d’hydrogène (H2O2), le 1 dioxygène singulet ( O2) (Milane, 2004; Tessier and Marconnet, 1995).

Il est important d’évoquer alors le paradoxe de l’O2 : il est indispensable au fonctionnement cellulaire car il permet de produire de l’énergie en oxydant de la matière organique ; mais il est aussi la source des ERO qui peuvent provoquer des dommages aux macromolécules biologiques (ADN, protéines, phospholipides membranaire) (Dröge, 2002). La production des ERO est une conséquence inévitable du métabolisme aérobie. En effet, l’organisme a besoin d’O2 pour produire de l’énergie, via une réduction tétravalente séquentielle d’O2 en eau au cours de la respiration mitochondriale (Curtay and Robin,

2000). Toutefois, une partie de l’O2 échappe à sa réduction en eau (1-5%), qui peut alors être à l’origine de la production du superoxyde au niveau du transporteur d’électron ubiquinone (coenzyme Q) (Favier, 2003; Jahn et al., 2008; Spiteller, 2006).

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Les origines cellulaires des ERO sont essentiellement enzymatiques et découlent de plusieurs sources. Deux sources majeures sont principalement concernées. La première résulte d’imperfections de la chaîne respiratoire mitochondriale qui produit par réduction monoélectronique des ERO. La deuxième source majeure de production des ERO est constituée par la NADPH oxydase, essentiellement localisée au niveau de la membrane plasmique. δ’orientation de cette enzyme au niveau de la membrane plasmique lui permet d’interagir avec le substrat intracellulaire (NADH, H+, ou NADPH, H+) et de libérer l’ion superoxyde de façon préférentielle à l’extérieur ou à l’intérieur de la cellule en fonction de son caractère phagocytaire ou pas (Souza et al., 2001; Beaudeux and Vasson, 2005). La xanthine oxydase est une enzyme ubiquitaire impliquée dans le catabolisme de l’ATP. Elle est impliquée dans la production du radical superoxyde. Aussi, les ions métalliques comme le fer et le cuivre, sont de remarquables promoteurs de processus • radicalaires. Ils transforment H2O2 en radical hydroxyle (OH ), encore plus toxique. Des cellules sont capables de produire du monoxyde d’azote (NO•) à partir de l’arginine et l’oxygène, dans une réaction catalysée par la NO-synthase. À forte concentration, le •- monoxyde d’azote réagit avec un radical superoxyde (O2 ) pour former un puissant oxydant, le peroxynitrite (ONOO–). En outre, le peroxynitrite peut secondairement se décomposer en • • d’autres oxydants (NO 2, OH , etc.) (Oldham and Bowen, 1998).

La réactivité des radicaux de l'oxygène ne doit pas non plus être exagérée car elle est très variable selon la nature du radical. Ainsi, parmi les radicaux formés chez les êtres •- • vivants, l'anion radicalaire superoxyde (O2 ), comme le monoxyde d'azote (NO ), ne sont pas très réactifs mais constituent des précurseurs pouvant être activés en d'autres espèces plus réactives. La faible réactivité de ces deux radicaux permet d'ailleurs leur utilisation par l'organisme comme médiateurs régulant des fonctions biologiques telles la vasodilatation capillaire, la prolifération ou le message des neurones. Par contre des radicaux comme les radicaux peroxyls (ROO•) ou surtout le radical hydroxyl (HO•) sont extrêmement réactifs, et ce avec la plupart des molécules biologiques (Dröge, 2002, Favier, 1997a). Les différents processus de formation des ERO sont schématisés dans la figure ci-après :

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Figure 3: Origine des différents radicaux libres oxygénés réactives de l’oxygène (Favier, 2003).

I.3.1.3.Le stress oxydatif En condition physiologique, la production de ROS reste faible et ne concerne qu'un faible pourcentage de l'oxygène capté par la respiration. Elle est alors indispensable à l'organisme en participant à divers processus vitaux tels que : la transduction de signaux cellulaires, la régulation des gènes et le fonctionnement de certaines enzymes, la défense immunitaire contre les agents pathogènes et la destruction par apoptose de certaines cellules tumorales. Cependant, cette production de ROS peut être amplifiée de façon excessive par différents mécanismes physio-pathologiques (inflammation, activité sportive…) ou facteurs environnementaux (tabac, alcool, médicament, rayons gamma ou ultra-violets…) (figure 4), créant un déséquilibre de la balance prooxydant/antioxydant : c'est le stress oxydant (figure 5) (Youn et al., 2014). La cellule ne contrôle alors plus cet excès de ROS qui va engendrer de nombreux dégâts cellulaires ; une situation que l'on retrouve dans le processus de vieillissement (théorie radicalaire du vieillissement) et dans la plupart des pathologies humaines (Alzheimer, diabète, cancer, cataracte, parkinson, psoriasis, sida) (Persson et al., 2014; Pincemail et al., 2000; Delattre et al., 2005).

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En effet, la production excessive de radicaux libres provoque des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de l'ADN, des protéines, des lipides, des glucides), mais aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérés notamment lors de l'oxydation des lipides (Cadet et al., 2002; Dröge, 2002; Hourigan, 2010; Sanz and Fayad, 2008).

Figure 4 : Facteurs intervenant dans l'équilibre de la balance anti/pro-oxydante (Bayr, 2005).

Figure 5: Déséquilibre de la balance entre pro-oxydants et antioxydants (Achat, 2013).

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I.3.1.4. La peroxydation lipidique Les lipides, en particulier les acides gras polyinsaturés, sont la cible privilégiée de l'attaque par le radical hydroxyle capable d'arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons, pour former un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle. Cette réaction appelée peroxydation lipidique forme une réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d'un autre acide gras qui forme un nouveau radical diène conjugué et il se produit ainsi des hydroperoxydes de lipides (Atkin et al., 2005). Il en résulte une altération de la fluidité membranaire qui conduit inévitablement à la mort cellulaire (Halliwell and Whiteman, 2004; Thérond and Blache, 2005) (Figure 6). Les produits de la peroxydation lipidique seront neutralisés par la glutathion peroxydase. Les lipoperoxydes échappant à cette détoxification conduisent à des aldéhydes toxiques (malondialdéhyde, 4-hydroxynonénal), dont les activités pro-athérogènes sont bien connues (Cillard and Cillard, 2006).

Figure 6: Mécanisme en chaîne de la peroxydation des acides gras polyinsaturés et nature des produits terminaux formés (Favier, 2003).

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δes anomalies du métabolisme des lipides et des lipoprotéines sont à l’origine de perturbations biologiques, elles sont en grande partie responsables du développement de l’athérome et des pathologies cardiovasculaires (Bostick et al., 2000). Il est établi que l'hypercholestérolémie en conjonction avec le stress oxydatif joue un rôle important dans le développement de l’athérosclérose (Vouldoukis et al., 2004; Dimitrova- Sumkovska et al., 2006), engendrant des complications cardiovasculaires (Diao et al., 2016). Pour se prémunir contre ces pathologies, il est important de disposer de défenses antioxydantes adéquates qui doivent nous être apportées par une alimentation saine, particulièrement riche en fruits et légumes (Haleng et al., 2007). La nature des systèmes antioxydants diffère selon les tissus, les types cellulaires et le milieu intracellulaire ou extracellulaire.

I.3.1.5. Les différents types d’antioxydants Il existe deux types d’antioxydants : les antioxydants enzymatiques naturellement fabriqués par notre organisme ou antioxydants endogènes et les antioxydants d’origine alimentaire ou antioxydants exogènes. Les antioxydants enzymatiques sont produits par notre corps et sont représentés par trois systèmes enzymatiques, à savoir la SOD (Superoxyde Dismutase), la GPO (Glutathion Peroxydase) et la Catalase. Ces systèmes enzymatiques nécessitent des cofacteurs d’origine alimentaire tels que le cuivre, le manganèse, le magnésium, le zinc et le sélénium ; mais aussi certaines vitamines (C, E, A) ou des molécules comme le glutathion (Pincemail and Defraigne, 2003).

I.3.1.5.1. Les antioxydants enzymatiques • La superoxyde dismutase (SOD): est l'un des antioxydants enzymatiques intracellulaires les plus efficaces (Rahman, 2007). Elle contient du zinc, du cuivre et du manganèse. Elle transforme l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène et oxygène moléculaire (Mates, 2000; Matés et al., 1999). • La catalase : présente dans les hématies, elle est composée de quatre sous unités protéiques, chacune contenant un groupement héminique avec le Fe3+ lié au site actif. Chaque molécule a habituellement une molécule de NADPH+H+ qui lui est liée, la protégeant ainsi d’une éventuelle inactivation par le peroxyde d’hydrogène

(Bonnefont-Rousselot et al., 2003). La catalase réagit très efficacement avec le H2O2, pour former de l'eau et de l'oxygène moléculaire (Mates, 2000).

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• La glutathion peroxydase (GPx) : présente dans les mitochondries, c’est une enzyme dépendante du sélénium (Akbas et al., 2005). Elle détruit les peroxydases lipidiques. La GPx utilise le glutathion comme un donneur de proton (H+), et le glutathion (GSH) sera oxydé en glutathion oxydé (GSSG). La régénération du GSH est catalysée par la glutathion réductase (GR) (Serdar et al., 2006).

δ’organisme possède une seconde ligne de défense « les systèmes non enzymatiques». Ce groupe des antioxydants renferme de nombreuses substances endogènes parmi lesquelles on peut citer le glutathion, l’acide urique, la bilirubine, les hormones sexuelles, la mélanine, la mélatonine, l’acide lipoïque et le coenzyme Q (Vertuani et al., 2004) (Figure 7).

Figure 7: εode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques (Favier, 2003).

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I.3.1.5.2. Les antioxydants non enzymatiques : a. Les polyphénols Au cours des années quatre-vingts, c’est la découverte du rôle des radicaux libres dans les processus pathologiques qui a relancé l’intérêt pour les polyphénols dont les propriétés antioxydantes sont remarquables (Vladimir-Knežević et al., 2012; Rock and Fardet, 2014).

Les polyphénols, dénommés aussi composés phénoliques, sont des molécules spécifiques du règne végétal et qui appartiennent à leur métabolisme secondaire (Mompon et al., 1998; Anwar et al., 2008), ce qui signifie qu’ils n’exercent pas de fonctions directes au niveau des activités fondamentales de l’organisme végétal, comme la croissance, ou la production (Yilmaz and Toledo, 2006). Cependant, les polyphénols jouent un rôle majeur dans les interactions de la plante avec son environnement (Richter, 1993), contribuant ainsi à la survie de l’organisme dans son écosystème, en exerçant une fonction de défense contre les microorganismes et les insectes (Zhang and Tsao, 2016).

Les polyphénols sont caractérisés par la présence d'unités phénoliques dans leur structure moléculaire (Masaki, 2010). δ’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau phénolique à 6 carbones, auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle (OH) libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester ou hétéroside (Balasundram et al., 2006; Bruneton, 1999; Richter, 1993) (figure 8).

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Figure 8: Classification des antioxydants phénoliques (Shahidi and Ambigaipalan, 2015).

Les polyphénols comprennent une multitude de structures chimiques, à partir de molécules simples comme les acides phénoliques, aux composés hautement polymérisés, tels que les tannins condensés (Galleano et al., 2010). On distingue :

• Les acides phénoliques Ce sont des dérivés de l’acide hydroxybenzoïque, Cette catégorie est abondante dans les végétaux et les aliments, notamment les épices, les fraises, certains fruits rouges et l'oignon (Manach et al., 2004), et de l’acide hydroxycinnamique (Jean, 2009); L'acide caféique est le principal représentant de cette catégorie. Il est présent dans de nombreux végétaux (graine de café, tomate, olive, pomme), en particulier dans les fruits, principalement sous forme d'ester de l'acide quinique (acide chlorogénique) (Manach et al., 2004). Ils possèdent des activités antioxydantes et antiradicalaires (Cavin et al., 1999). Parmi les différentes classes qui composent les phénoliques, les flavonoïdes sont considérés comme importants pour la consommation humaine en raison de sa large distribution dans les aliments végétaux.

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• Les flavonoïdes Ce sont les composés les plus abondants parmi tous les composés phénoliques (Nakajima et al., 2014). Ils interviennent dans la pigmentation des fleurs et dans les processus de défense contre le rayonnement UV, les herbivores et les attaques microbiennes (Crozier, 2003). Ils se répartissent en plusieurs classes des molécules dont les plus importants sont les flavones, les flavonols, les flavanols, les flavanones, les dihydroflavanols, les isoflavones, les isoflavanones, les chalcones, les aurones et les anthocyanes. Ces substances existent généralement sous forme de glycosides (Chira et al., 2008). Les flavonoïdes sont présents dans une grande variété d'aliments (fruits et légumes, céréales...). Les agrumes constituent la principale source alimentaire de flavanones (figure 9). Les flavonoïdes sont des piégeurs de radicaux libres. Ils réagissent avec ces derniers, empêchant les dégradations liées à leur intense réactivité au niveau des phospholipides membranaires. Cette capacité antioxydante serait liée à l’affinité pour les radicaux et donc à leurs structure.

Figure 9 : Classification des flavonoïdes des Citrus et leurs structures chimiques (Yi et al., 2017).

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• Les tanins Les tanins sont des composés phénoliques très répondu dans le règne végétal. Ce sont des molécules volumineuses car résultant de la polymérisation de molécule élémentaire à fonction phénol. Selon la molécule élémentaire, on trouvera des tannins hydrolysables, des tannins condensés (catéchiques) : Tanins hydrolysables : ce sont des esters du D-glucose et de l’acide gallique ou de ses dérivés, en particulier l’acide ellagique (Cowan, 1999; O’connell and Fox, 2001). Ces substances sont facilement hydrolysables par voie chimique ou enzymatique (tannase) (Ribéreau-Gayon, 1968). Tannins condensés : les tannins condensés ou les proanthocyanidines sont des polymères constitués d’unités flavane reliées par des liaisons entre les carbones (De Bruyne et al., 1999; O’connell and Fox, β001). En raison de leur complexation avec les protéines salivaires, les tanins condensés sont responsables de l'astringence caractéristique des fruits avant maturité (raisin, pêche, pomme, poire, etc...) et de certaines boissons (cidre, thé, etc...) et de l'amertume du chocolat. Les tanins inhibent la peroxydation lipidique, ce sont des piégeurs de radicaux libres, des inhibiteurs de la formation de l’ion superoxyde (Bruneton, 1993).

De nombreuses études ont été réalisées sur l’impact de la consommation de végétaux sur la santé. La plupart ont mis en évidence une baisse du facteur de risque pour de nombreuses affections (infarctus, cancers du poumon, du côlon, de l’estomac, du rein, de la prostate et du sein) (Parr and Bolwell, 2000). Les polyphénols présentant une activité antioxydante sont de plus en plus étudiés. En effet, l’oxydation est un phénomène largement répandu aussi bien dans le domaine alimentaire (oxydation des lipides) que physiologique (stress oxydant) (Shahidi and Ambigaipalan, 2015). Les polyphénols suscitent beaucoup d’intérêts dans plusieurs domaines, en cosmétologie et surtout dans les industries agroalimentaires par leurs implications, en particulier, sur la flaveur des aliments et leur incidence sur la conservation des produits alimentaires. Ils permettent de prolonger la durée de conservation des AGPI, de les préserver lors de traitements thermiques et éventuellement après ingestion. Ainsi, ils pourraient constituer une alternative à l’utilisation des additifs alimentaires synthétiques, buthylhydroxyanisol (BHA) et buthylhydroxytoluène (BHT), qui ont montré des effets nuisibles (effet carcinogène) (Japón-Luján et al., 2008; Whysner et al., 1994).

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δ’ingestion de polyphénols par l’intermédiaire des fruits et des légumes pourrait permettre à notre organisme de renforcer ses moyens de défense contre les processus d’oxydation qui menacent quotidiennement nos cellules, même si les mécanismes mis en jeu dépassent sans doute largement la réduction directe des espèces oxygénées réactives par les polyphénols (Manthey and Grohmann, 2001; Chu et al., 2002). δes polyphénols et plus particulièrement les flavonoïdes provenant d’agrumes possèdent d’autres activités biologiques : - anti-inflammatoire, en fait il a été montré que L'hespéridine (flavonoïde naturel contenu dans le flavédo d’orange) inhibe les kinases et les phosphodiestérases responsables de la transduction et de l'activation du signal cellulaire pendant une réponse inflammatoire (Manthey and Grohmann, 2001). - anti-cancérigène, en effet Aranganathan et al., (β009) ont montré qu’une supplémentation en hesperétine chez les rats Wistar mâles inhibe la carcinogenèse du côlon induite par la démithylhydrazine (Aranganathan and Nalini, 2009). - anti-athérosclérose, l’étude de Wilcox et al., (2001) à révélé que le potentiel anti- athérosclérose des flavanones, de l'hesperétine et de la naringénine des Citrus a été attribué à leur capacité à réguler la sécrétion de l'ApoB (Apoprotéine B) et l'hémostasie du cholestérol cellulaire dans la lignée des cellules de l'hépatome humain (Wilcox et al., 2001; Aggarwal et al., 2010).

En outre, plusieurs études épidémiologiques ont démontré qu’un apport régulier en flavonoïdes provenant des Citrus est associé à une diminution du risque de maladies cardiovasculaires (Yamada et al., 2011; Tounsi et al., 2011). Les flavonoïdes contribueraient à améliorer la vasodilatation coronarienne, à diminuer l’agrégation des plaquettes sanguines et à prévenir l’oxydation du « mauvais » cholestérol (δDδ) (Benavente-Garcia and Castillo, 2008) (figure 10).

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Figure 10: Représentation schématique du potentiel antioxydant et le mécanisme d'action des Citrus (Zou et al., 2016). Cinq voies sont proposées dans la littérature: (1) Inhibition des enzymes oxydantes, réduction de la production cellulaire des ROS/ RNS, (2) l'interaction avec les voies de signalisation redox, conduisant à la réponse cellulaire anti-oxydante, (3) la réaction directe avec ROS/RNS comme ''piégeur de radicaux libres", (4) chélation avec des métaux de transition produisant moins de dommage oxydatif, (5) l'interaction de l'ingrédient de synergie, qui influence l'ensemble du système antioxydant. Les enzymes oxydantes qui produisent des ROS/ RNS sont : NOS (oxyde nitrique synthase), LOX (lipoxygénase), XO (xanthine oxydase), COX (cyclooxygénase), NOX (NADPH oxydase), MPO (myéloperoxydase). Les enzymes antioxydantes sont : SOD (superoxyde dismutase), CAT (catalase), glutathion peroxydase (GPx), Prx (peroxiredoxine), Tr X (thiorédoxine), GR (glutathion réductase), TR (thiorédoxine réductase).

δ’étude des polyphénols présents dans l’alimentation vise à déterminer l’intérêt d’une alimentation plus riche en végétaux, notamment les agrumes ou de certaines plantes en particulier. En effet à travers une alimentation plus saine, on peut dire qu’on cherche à vieillir en bonne santé (Weisburger, 2000). Mais les effets sur la santé des polyphénols ne dépendent pas seulement de leurs niveaux de consommation mais aussi de leur biodisponibilité dans le plasma sanguin. A la différence de la vitamine E et des caroténoïdes qui s’accumulent dans le tissu adipeux, les polyphénols ne peuvent pas être stockés. La biodisponibilité des polyphénols a un effet sur la capacité antioxydante des tissus. In vitro, le pouvoir antioxydant de nombreux polyphénols est supérieur à celui de la vitamine C et de la vitamine E. S’ils étaient absorbés comme ces vitamines et non métabolisés, leur impact antioxydant serait considérable.

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Cependant, les polyphénols subissent la plupart du temps une transformation chimique. δ’efficacité de l’absorption intestinale dépend largement de la nature des flavonoïdes, et notamment de la glucosylation qui a un effet sur leur biodisponibilité (Edeas, 2007).

b. Les vitamines Les vitamines sont des micronutriments organiques présentes dans les aliments, mais en infimes quantités comparativement aux macronutriments (protéines, glucides et lipides). Les vitamines sont des éléments importants pour le bon fonctionnement du métabolisme, la croissance et le bien-être physique de notre organisme. Ce sont des substances qui se classent selon leur solubilité et qui possèdent, de ce fait des fonctions toutes très différentes, mais indispensables. • La vitamine E La vitamine E est un terme générique qui représente une famille de composés chimiquement apparentés qui est subdivisée en deux sous-groupes appelés tocophérols et tocotriénols. De plus, les tocophérols et les tocotriénols ont les formes α, , et , nommées sur la base du nombre et la position des groupements méthyles dans le cycle chromanol (Palozza et al., 2008; Masaki, 2010). Ces tocophérols participent à la conservation des huiles et possèdent aussi certaines propriétés thérapeutiques et antioxydantes grâce à leur capacité à piéger les radicaux libres (Reboul et al., 2007; Reiter et al., 2007). En effet, la vitamine E étant liposoluble, elle se fixe aux membranes et peut ainsi séquestrer les radicaux libres empêchant la propagation des réactions de peroxydation lipidique (Evans and Johnson, 2000). δes tocophérols protègent contre l’oxydation naturelle des acides gras, en particulier les acides gras polyinsaturés (AGPI) (Sebei et al., 2007). En plus, ces composés peuvent constituer un critère analytique pour le contrôle de la pureté des huiles. δe pouvoir vitaminique des tocophérols est lié à la teneur en α-tocophérol (vitamine E). Ce tocophérol est le plus fréquent dans la nature et le plus actif biologiquement. δes et -tocophérols ont une activité vitaminique réduite, le -tocophérol est pratiquement inactif (Reboul et al., 2007).

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• La vitamine C Connue aussi sous le nom d’acide ascorbique, la vitamine C est un antioxydant puissant, elle est largement présente dans les fruits et légumes frais (citron, orange, légumes à feuilles vertes). Ses principaux antioxydants partenaires sont la vitamine E et les caroténoïdes. En effet, la vitamine C, hydrosoluble, se trouve dans le cytosol et dans le fluide •- • extracellulaire, elle peut capter directement l’O2 et l’OH . Elle peut aussi réduire le radical α-tocophérol et ainsi permettre une meilleure efficacité de la vitamine E (Packer et al., 1997; Evans and Johnson, 2000). En effet, ces antioxydants cités précédemment sont soit synthétisés par l’organisme ou le plus souvent apportés par notre alimentation. Leurs effets sur le métabolisme oxydatif sont schématisés dans la figure 11 et Tableau 1.

Figure 11 : Effet du régime alimentaire sur le métabolisme oxydatif (Codoñer-Franch et al., 2011).

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I.3.2. les minéraux Tout comme les vitamines, les minéraux sont des éléments indispensables pour maintenir le bon fonctionnement corporel. Ils sont divisés en deux catégories selon leur quantité dans le corps :

• Les minéraux majeurs, ou macro-éléments Ce sont des substances nécessaires en grande quantité pour l'organisme. Ils comprennent : le sodium, le chlore, le potassium, le calcium, le phosphore et le magnésium.

• Les oligo-éléments, ou éléments traces Ces éléments minéraux sont présents en très faibles quantités dans le corps, ils comprennent le fer, l'iode, le zinc, le cuivre, le sélénium et le fluor. Les éléments minéraux interviennent dans une large gamme de fonctions : minéralisation, contrôle de l’équilibre hydrique, systèmes enzymatiques et hormonaux, systèmes musculaires, et nerveux. Ils participent également, au bon déroulement de la chaîne respiratoire, à l’élimination des radicaux libres dans la lutte contre le vieillissement ou encore dans le renforcement du système immunitaire. Les oligo-éléments et les minéraux sont présents dans de nombreux aliments en quantités très variables. On les trouve dans les viandes, les poissons ou encore les fruits, tels que les agrumes. Cependant, la moindre carence ou le moindre excès peut entrainer des troubles dans l’organisme. C’est pourquoi, il est important de respecter les besoins de l’organisme en ingérant chaque jour, une quantité minimale de chaque minéral ou oligo-éléments (Abdou Bouba, 2009).

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Tableau 1 : Antioxydants et marqueurs d’oxydation (Haleng et al., 2007). Mode d’action et intérêt du dosage Antioxydants Vitamine C - Piégeur de radicaux libres , marqueurs de la consommation de fruits - Valeur plasmatique basse associée avec l’apparition de diverses pathologies α- tocophérol - Inhibiteur de la peroxydation lipidique - Action de synergie avec la vitamine C (rapport idéal de concentration) - tocophérol - Valeur plasmatique basse plus prédictive que l’α-tocophérol dans la survenue de pathologies cardiovasculaires et de cancer de la prostate Vitamine A - Piégeur de radicaux libres - Implication dans la vision - carotene - Piégeur de radicaux libres - Implication dans la vision -εarqueur de la consommation de légumes piégeur de l’oxygène singulet (photoprotecteur) - Inhibition à forte concentration de mécanismes physiologiques de défense Glutathion réduit (GSH), - Marqueur de la présence d’un stress oxydant action de synergie Glutathion oxydé (GSSG) Rapport avec la vitamine C et l’α-tocophérol GSH/GSSG Acide urique - εarqueur de la présence d’un stress oxydant - Action de synergie avec la vitamine C et l’ α-tocophérol Vitamines B6, B9 et B12 - Régulatrices de la concentration plasmatique en homocystéine - Implication dans la synthèse de l’ubiquinone Superoxyde dismutase (SOD) - Elimination de l’anion superoxide Glutathion peroxydase (GPx) - Elimination du peroxyde d’hydrogène et des peroxydes lipidiques - Reflet d’une adaptation au stress oxydant Oligoéléments Sélénium - Cofacteur des différentes GPx - Rôle dans l’immunité Cuivre - Cofacteur de la SOD - Facteur prooxydant à forte concentration Zinc - Cofacteur de la SOD - Inhibe les réactions d’oxydation induites par le cuivre-rôle dans l’immunité - εarqueur de la présence d’un stress oxydant Rapport Cu/Zn - Corrélation positive avec le taux plasmatique de peroxydes lipidiques Marqueurs de l’oxydation Peroxydes lipidiques - Marqueur des dommages oxydatifs au niveau des lipides - Implication dans le développement de l’athérosclérose LDL oxydées - Facteur de risque cardiovasculaire - LDL petites et denses plus susceptibles à l’oxydation Isoprostanes - Marqueur spécifique de la peroxydation lipidique Sources d’oxydation Fer libre - Fer toxique conduisant à une augmentation accrue de radicaux libres Fer sérique - Surcharge en fer Ferritine - Facteur de risque cardiovasculaire indépendant du cholestérol Homocystéine - Contribue à l’oxydation des LDL

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I.3.3. Les stérols Les stérols appartiennent à la famille des isoprénoïdes ou terpénoïdes. Cette famille rassemble aujourd’hui plus de γ0000 composés (Chappell, 2002). Les stérols sont des alcools, solides, saturés ou insaturés qui possèdent tous un noyau composé de plusieurs cycles de carbone appelé noyau cyclopentanophénanthrénique ou noyau stérol. A la base, les stérols sont des composés cristallisés qui grâce à une estérification peuvent être présents sous forme lipidique (Callias, 2007) (figure 12).

Figure 12: Structure des principaux stérols des eucaryotes (Callias, 2007).

Les stérols sont une caractéristique majeure des cellules eucaryotes. Ces stérols peuvent être regroupés en trois familles selon les organismes: stérols fongiques, stérols animaux et stérols végétaux. Les membranes animales contiennent un stérol prépondérant : le cholestérol (Svoboda et al., 1995). Chez les mammifères, le cholestérol est certes un composant architectural des membranes, mais c’est aussi le précurseur des sels biliaires et des hormones stéroïdiennes comme les corticoïdes, les œstrogènes et les androgènes. Le cholestérol joue un rôle important dans la signalisation et le transport intracellulaire (Incardona and Eaton, 2000) (Haucke and Di Paolo, 2007). Il participe également au développement du système nerveux, et à la formation de la vitamine D, nécessaire à l’absorption du calcium et à la minéralisation et la formation osseuse (Van der Velde, 2010).

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δe cholestérol peut provenir de l’alimentation, qui est à l’origine d’environ un tiers des apports journaliers, ou de la biosynthèse responsable de l’apport des deux tiers restants (Morozova et al., 2010). δa seule voie importante d’élimination du cholestérol est sa transformation hépatique en acides biliaires. Le foie excrète le cholestérol et les acides biliaires dans la bile qui est déversée dans la lumière intestinale au moment de la prise alimentaire. La fraction non réabsorbée d’acides biliaires et de cholestérol est éliminée dans les fèces (Morozova et al., 2010). Cependant un régime riche en cholestérol est considéré comme un facteur important pour le développement de l'hyperlipidémie, l'athérosclérose et les maladies cardiaques (Fadini et al., 2014). Les stérols végétaux, quant à eux, ont un effet bénéfique sur la santé humaine, ils jouent en effet un rôle hypocholestérolémiant à plusieurs niveaux. Ils diffèrent du cholestérol animal par leur groupement alkyle en C24. Les stérols végétaux, appelés également phytostérols présentent la plus grande proportion de la fraction insaponifiable des lipides (Azadmard-Damirchi and Dutta, 2006; Cañabate-Díaz et al., 2007). Ils se trouvent en grande quantité dans les végétaux comme les fruits et légumes. Les phytostérols et leurs dérivés sont largement utilisés dans différents secteurs industriels (pharmaceutique, agro-alimentaire et cosmétique) en raison leurs activités biologiques spécifiques et de leurs propriétés physiques et chimiques (Xu et al., 2005). Dans les végétaux, on trouve également une deuxième sorte de stérols: les phytostanols, Ils sont présents dans les légumes, les huiles, les noix et les graines, mais en très faibles quantités. On les trouve principalement dans le bois dont on peut les extraire. Ces stérols végétaux sont peu absorbés au niveau des entérocytes, et les stérols qui pénètrent sont rapidement dégradés en sels biliaires dans le foie, ce qui résulte en une très faible concentration de stérols végétaux dans le plasma, le cholestérol est environ 500 à 1000 fois plus concentré (Turley and Dietschy, 2003). δes stérols végétaux bloquent l’absorption intestinale du cholestérol. δe cholestérol alimentaire est absorbé sous forme de micelles, formées de mono et diglycérides, de phospholipides et de sels biliaires, via des transporteurs situés à la surface des entérocytes (Altmann et al., 2004). Les stérols végétaux enteraient en compétition avec le cholestérol, et donc le déplaceraient dans ces micelles, il en résulterait une plus faible quantité de cholestérol absorbée via ces micelles (εel’nikov et al., 2004).

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Dans les entérocytes, le cholestérol absorbé est estérifié pour pouvoir être excrété dans le plasma. Les stérols végétaux agissent aussi à ce niveau comme des compétiteurs du cholestérol pour l’estérification, ce qui diminue la quantité d’ester de cholestérol libéré dans le plasma (Field et al., 2001). En faisant baisser la quantité d’ester de cholestérol synthétisé, les stérols végétaux diminuent la quantité de cholestérol libéré dans la circulation sanguine, et donc une réduction des lipoprotéines LDL, celles-ci ayant moins de particules à transporter, d’où un effet hypocholestérolémiant. Les stérols végétaux ont également des rôles annexes sur la santé humaine. Des activités immunologiques par leur action anti-inflammatoire, et des activités anti-cancéreuses en agissant sur la prolifération cellulaire (Abidi, 2004; Patel and Thompson, 2006; Piironen et al., 2000). Une alimentation riche en stérols végétaux entraîne une absorption moindre du cholestérol d’où le développement de nombreux produits alimentaires riches en stérols végétaux ou en stanol. La consommation régulière de ces produits est un traitement recommandé de l’hypercholestérolémie (Miettinen and Gylling, 2004). D’autres spécialistes affirment que les acides gras saturés et insaturés ont un effet important sur la cholestérolémie (Callias, 2007).

I.3.4. Les acides gras polyinsaturés Les acides gras sont les constituants élémentaires des lipides. Ils sont composés d’une chaîne hydrocarbonée comportant à une extrémité un groupement méthyle CH3 et à l’autre extrémité un groupement carboxyle COOH. Ils se définissent par leur nombre de carbone, leur degré d’insaturation (nombre de doubles liaisons) et la position des doubles liaisons. Cette chaîne carbonée peut être dépourvue de toute double liaison et, dans ce cas, les acides gras sont dits saturés (AGS). Elle peut aussi présenter une ou plusieurs double(s) liaison(s), les acides gras sont alors désignés sous les termes de monoinsaturés (AGMI) ou polyinsaturés (AGPI) (Harbeby, 2011; Labonté et al., 2015) (figure13).

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Figure 13: Acides gras saturés et insaturés et leurs principales sources (Bélanger, 2007).

Chez l’Homme, deux familles d’acides gras polyinsaturés sont considérées comme importantes de par leurs rôles biologiques : la famille des acides gras de la série n-6 (ou ω6) et la famille des acides gras de la série n-3 (ou ωγ). Les acides, linoléique (LA, 18:2 n-6) et linolénique (ALA, 18:3 n-3), sont dits indispensables. Ils sont synthétisés dans les tissus végétaux à partir de l'acide oléique grâce à deux désaturases présentes uniquement dans le règne végétal, les Δ1β- et Δ15-désaturases. Ces enzymes introduisent une double liaison dans la chaîne hydrocarbonée, respectivement, entre les carbones 12 et 13 et les carbones15 et 16, comptés à partir du groupement carboxyle (Harbeby, 2011). δes animaux terrestres ne possèdent pas ces désaturases de sorte qu’ils sont incapables de synthétiser ces deux acides gras. δeur apport chez l’Homme ne peut donc se faire que par le biais de l’alimentation, d’où leur caractère indispensable. D'autres acides gras sont dits essentiels de par leurs propriétés structurales et physiologiques déterminantes. Il s'agit des acides eicosapentaénoïque (EPA, 20:5 n-3), docosahexaénoïque (DHA, 22:6 n-3) et arachidonique (AA, 20:4 n-6). δe δA est le précurseur de l’AA alors que l’AδA est celui de l’EPA et du DHA via une série d’élongations de la chaîne carbonée de 2 atomes de carbone (à chaque étape) par une élongase, et de désaturations par les Δ5- et Δ6- désaturases (Burdge and Wootton, 2002; Arterburn et al., 2006; Harnack et al., 2009) (figure 14).

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Figure 14: Structure et métabolisme des acides gras n-3 et n-6 (Bélanger, 2007).

Les acides linoléique et alpha-linolénique sont présents en quantité notable dans les huiles végétales : principalement dans les huiles de tournesol et de maïs pour l’acide linoléique et dans les huiles de colza et de soja pour l’acide alpha-linolénique. Des études ont démontré que l'ingestion des acides gras polyinsaturés (ω-γ et ω-6), présents dans des huiles végétales, sont inversement proportionnels à l'incidence des maladies cardiaques en diminuant le taux du cholestérol plasmatique et du triacylglycérol (Simopoulos, 2002; Guesnet et al., 2005) . δes omégas γ et leurs métabolites actifs, l’acide eicosapentaénoïque et l’acide docosahexaenoique sont considérés comme ayant un potentiel important en matière de prévention de maladies cardiovasculaires. δeurs sites d’action sont multiples : prévention des arythmies, action anticoagulante et anti plaquettaire, modulation de la croissance cellulaire dans la paroi artérielle, régulation de la pression artérielle et action hypolipémiante (Guesnet et al., 2005).

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Ces ingrédients lipidiques tels que les acides gras essentiels et les phytostérols, présents dans les huiles végétales, ont des effets reconnus sur le maintien en forme de l’organisme. Ils possèdent chacun des rôles différents mais permettent d’agir sur des fonctions similaires comme la réduction du cholestérol sanguin. Celui-ci est à l’origine de certaines maladies cardiovasculaires, c’est pourquoi les aliments fonctionnels enrichis en oméga 3 ou en phytostérol sont utiles pour une partie de la population, touchée par cette maladie (Ferchaud-Roucher et al., 2013; Kassab-Chekir et al., 2004). Des études ont montré que l’huile de pépins de raisin est riche en acides gras insaturés tels que l’acide linoléique (7β%) ou l’acide oléique (18%), mais aussi en acides gras saturés tels que l’acide palmitique ou l’acide stéarique, et en tocophérols tels que la vitamine E (Demelin, 2012). Par conséquent, l’utilisation des huiles végétales en tant qu’ingrédients par les industries agroalimentaires et pharmaceutiques ne doivent pas être occultées. Par leur teneur en différents AG, de vitamines (liposolubles) et de composés mineurs (polyphénols, caroténoïdes, etc), les huiles végétales représentent un intérêt nutritionnel et pharmaceutique très important (Ramadan and Mörsel, 2003; Cañabate-Díaz et al., 2007). Cependant, les aliments fonctionnels enrichis en lipides ne sont pas les seuls. Ceux supplémentés en fibres (prébiotiques) et en bactéries (probiotiques) sont des ingrédients relativement importants sur le marché des aliments fonctionnels (Boudouhi et al., 2005).

I.3.5. Les prébiotiques : Les prébiotiques sont des substances alimentaires, tels que les oligosaccharides et les fibres, qui nourrissent un groupe sélectif de microorganismes vivant dans l’intestin. Ils stimulent la croissance des bactéries à effet positif aux dépens des autres à effets négatifs (Gurib-Fakim, 2006). Il existe plusieurs constituants qui peuvent être définis comme prébiotiques. La plupart sont des glucides ayant deux origines différentes, végétale ou synthétique, mais peuvent être également d’origine animale ou microbienne (Slavin, 2013). Parmi les prébiotiques les plus étudiés sont l’inuline, et l’oligofructose, qui représentent les fructo-oligosaccharides. Ce sont des fibres fermentescibles qui sont très présentes au niveau des plantes où ils assurent la fonction de réserve énergétique. Ils sont formés de nombreuses chaînes de fructose associées à une molécule de glucose (Boudouhi et al., 2005) (Hill et al., 2014).

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Les prébiotiques sont présents dans certains aliments, et en particulier dans les artichauts, les asperges, les oignons, l’ail, les poireaux, les tomates, les bananes. δes effets sur la santé sont multiples et variés. En effet, ils améliorent le fonctionnement du côlon, régularisent le transit intestinal et possèdent un effet curatif et/ou préventif sur la constipation, les diarrhées infectieuses ou encore les maladies inflammatoires intestinales (Apfelbaum et al., 2004).

I.3.6. Les probiotiques Tout comme pour les prébiotiques, les probiotiques ont un rôle important dans l’amélioration de certaines fonctions de l’organisme. δes propriétés de ces ingrédients sont à l’origine des effets mis en avant lors de leur incorporation à d’autres aliments pour en faire des aliments fonctionnels (Champagne and Fustier, 2007; Nissen et al., 2009). Les probiotiques (ou micro-organismes probiotiques) sont des microbes vivants qui peuvent être intégrés dans différents types de produits, y compris les aliments, les médicaments et les suppléments alimentaires (de Vrese and Schrezenmeir, 2008; Hill et al., 2014). Les bactéries lactiques sont parmi les principaux probiotiques. Leur nom vient du fait qu'elles ont la faculté de produire de l'acide lactique. Elles comprennent, notamment : Les lactobacilles (bactéries du genre Lactobacillus), les bifidobactéries (bactéries du genre Bifidus), les streptocoques (bactéries du genre Streptococcus) et les Lactobacillus plantarum (Maragkoudakis et al., 2010; Mitsuoka, 2014). Les probiotiques sont des micro-organismes « utiles » qui colonisent la flore présente dans l’organisme au niveau intestinal et vaginal. δeur présence permet notamment de limiter le développement des micro-organismes nuisibles et de digérer certains aliments ou nutriments. Il a été prouvé de manière significative, qu’ils permettaient d’améliorer la qualité nutritionnelle des aliments fermentés, d’améliorer la digestion du lactose, de stimuler le système immunitaire (Mitsuoka, 2014) et de réduire certaines réactions inflammatoires ou allergiques (Guarner et al., 2012).

C’est pourquoi faire des choix alimentaires intelligents tôt dans la vie contribue à réduire le risque de certaines maladies chroniques d'origine nutritionnelle : l’obésité, les maladies cardiovasculaires, l’hypertension, le diabète, et certains cancers (Dib et al., 2013). On estime qu'un tiers des cas de cancer et près de la moitié des cas de maladies cardiovasculaires sont liés à l'alimentation (Goldberg, 2012).

Partie bibliographique

Ainsi, la recherche de produits naturels représente un sujet de grand intérêt où le règne végétal est la plus importante source de fourniture de nombreux agents tels que les antioxydants (Kalt, 2001). Les fruits représentent un des éléments essentiels pour une alimentation équilibrée et sont connus pour leur rôle dans l’entretien des fonctions vitales de l’organisme humain. La valorisation de ces fruits sous forme de produits séchés, concentrés ou congelés conduit a l’apparition d’une gamme variée de sous-produits et déchets (Grigoraş, β012).

II. Valorisation des fruits et de leurs sous-produits : δ’industrie agroalimentaire constitue un réceptacle de premier choix pour les déchets qu’elle génère (Mirabella et al., 2014). Jadis, Les processus de valorisation étaient abandonnés au profit des techniques d'élimination simples et rapides (l'incinération et la mise en décharge) (Boucherba et al., 2014). Aujourd'hui cette situation n'a plus cours. La prise en compte de l'intérêt croissant des populations pour la préservation de l'environnement a conduit à modifier cette gestion des déchets. La valorisation des résidus agroindustriels revient à l'ordre du jour et la notion de déchet a bien évolué pour être remplacée par le terme coproduit (Boucherba et al., 2014). δ’importance de ces coproduits agricoles réside dans leur abondance, leur faible coût ainsi que dans le fait qu’ils représentent une source organique naturelle disponible partout sur la planète. Ceci a permis de stimuler l’intérêt pour l’utilisation des coproduits agricoles en tant que ressource naturelle renouvelable d’énergie et pour la production de nombreux composés chimiques (Grigoraş, β01β; Boucherba et al., 2014). Parmi ces coproduits agricoles, la culture de l'olivier, à forte valeur culturelle et patrimoniale en région méditerranéenne, et la production d'huile d'olive, représentent environ 97% de la production mondiale. Cette production s'accompagne de l'apparition de sous produits (restes de taille des oliviers, grignons et margines) peu ou pas valorisés à l'heure actuelle. Les sous-produits de l'olivier sont nombreux, de compositions différentes et d'utilisations très variées suivant les différents pays. Les grignons d'olive sont des sous produits solides essentiellement ligna-cellulosiques contenant la pulpe d'olive et du bois mais aussi des matières grasses, des sucres, des aminoacides, des polyphénols et des sels minéraux. La valorisation des grignons se fait dans diverses applications suivant les pays et le contexte (Roussas et al., 2009).

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En région méditerranéenne les conditions climatiques permettent aussi l’exploitation d’un nombre considérable d’arbres fruitiers, notamment les agrumes. Par ailleurs le secteur de l’industrie de transformation de ces fruits qui ne cesse de se développer permet la récupération d’une quantité importante de sous produits. Parmi ceux-ci, la pulpe obtenue après extraction des jus et huiles essentielles des agrumes présente un intérêt particulier dans la majorité des pays du bassin méditerranéen comme source d’énergie (Rihani, 1991). Frais ou sous forme de produits transformés, les fruits constituent une source inépuisable de nutriments dont les métabolites secondaires sont parmi les plus importants. δ’isolement et la caractérisation de ces composés connus généralement sous l’appellation de « composés bioactifs » constituent un sujet de recherche actuel (Grigoraş, β01β). De nombreuses études explorent aujourd’hui la possibilité de transformation des composés bioactifs en ingrédients incorporables dans différents produits alimentaires, cosmétiques ou pharmaceutiques. Cet intérêt particulier est dû au fait qu’au cours des dernières années, la société moderne s’oriente davantage vers l’utilisation de produits naturels au détriment de produits de la synthèse chimique (Grigoraş, β01β). De plus, de nombreuses études ont mis en évidence la capacité de ces composés bioactifs à participer au bon déroulement des fonctions vitales de l’organisme humain. Ils sont souvent considérés comme des « aliments fonctionnels » grâce au contenu riche en divers micronutriments tels que les composés phénoliques (reconnus notamment pour leur fort pouvoir antioxydant), les minéraux, les vitamines etc (Grigoraş, β01β).

Les oranges, qui font partie de la famille des agrumes qui est l'un des plus importants fruits cultivés au monde, sont une excellente source de nombreux nutriments et phytoconstituents (Mehl et al., 2014). Les acides phénoliques et flavanones sont les deux principaux groupes de composés phénoliques présents dans leur jus (Kelebek, 2010). En effet, certaines études ont montré que les écorces des oranges, considérées comme des sous produits représentent une source potentiellement riche en flavonoïdes naturels (Manthey and Grohmann, 2001; Rouseff et al., 1987; Sawalha et al., 2009).

Partie bibliographique

En effet, le traitement des sous-produits d'agrumes représente potentiellement une source riche en composés phénoliques et en fibres alimentaires. Ces résidus d'agrumes, qui sont généralement jetés comme déchets dans l'environnement, peuvent constituer des ressources nutraceutiques potentielles (Rafiq et al., 2016).

Dans ce contexte, les graines d'orange amère (bigarade, Citrus aurantium) sont considérées comme précieuses, car elles fournissent des composants essentiels pour les applications industrielles et pharmacologiques comme les antioxydants (Moulehi et al., 2012). Les graines du Citrus aurantium pourraient être utilisées comme source potentielle de flavonoïdes (néohespéridine et la naringine) (Bocco et al., 1998; Moulehi et al., 2012). En effet, de nombreuses études in vitro et in vivo ont suggéré que les flavonoïdes des Citrus possèdent des effets biologiques contre les maladies dégénératives comme le cancer et les maladies cardiovasculaires (Chanet et al., 2012; Benavente-Garcia and Castillo, 2008). En outre, d’autres études ont révélé que l'huile des pépins du Citrus aurantium est une bonne source d'acides gras essentiels, notamment l’acide oléique et linoléique (Reda et al., 2005) (JiGuo et al., 2009; Waheed et al., 2009). Cependant, peu d'études ont été réalisées sur l’effet biologique de cette huile extraite à partir des graines, d’où notre intérêt à étudier son effet sur le profil lipidique et le stress oxydatif chez les rats Wistar.

PARTIE EXPERIMENTALE

PARTIE IN VITRO :

Etude phytochimique des pépins du Citrus aurantium, et de l’huile extraite à partir de ces pépins et évaluation des activités antioxydantes de leurs extraits phénoliques

Matériel et Méthodes

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

I. Matériel végétal : Les agrumes possèdent de nombreuses vertus, leur teneur élevée en vitamines, leur faible apport calorique et leur potentiel antioxydant font de ces fruits un aliment très demandé au niveau mondial; leurs bienfaits sur la santé prônées par la médecine chinoise, ont été reconnus par de nombreuses études scientifiques (Parle and Chaturvedi, 2012). Les oranges appartiennent à la famille des Rutaceae, qui est l'une des cultures fruitières les plus importantes dans le monde. Elles sont largement cultivées dans les régions tropicales et subtropicales du monde, avec une production annuelle d'environ 102 millions de tonnes (Mehl et al., 2014). Les cédrats, citrons et oranges amères sont des fruits connus du Bassin Méditerranéen depuis l'époque Romaine; l'introduction d'autres espèces d'agrumes sous forme de fruits et de graines dans cette région est très ancienne et fait suite aux échanges commerciaux par les Arabes à travers la route de la soie (Arias and Ramón-Laca, 2005). En Algérie, le développement de la culture commerciale des agrumes est relativement récent, bien que la présence du bigaradier a été rapporté déjà dans l’empire des almohades et embelli les jardins des Beys dans les Casbahs pendant l’occupation Ottomane; par contre les orangers furent sans doute introduits d’Andalousie quelques siècles après. Puis au début du XXe siècle, fut découverte la clémentine dans la région de Misserghin, une espèce très prisée par le consommateur jusqu’à aujourd’hui (Mutin, 1969). Au cours de l’année 2010/2011, 571 mille tonnes d’agrumes ont été produites en Algérie, qui est le 19ème producteur dans le monde et le 3ème dans l'Union du Maghreb arabe (Lagha- Benamrouche and Madani, 2013). Oranges, citrons, pamplemousses et mandarines représentent environ 98% des cultures industrielles. Les oranges sont les plus pertinentes avec environ 82% (Pérez-Marín et al., 2007).

II. Description et identification botanique δ’oranger bigaradier (Citrus aurantium, Zanbouâ ou tranj en arabe) est un arbrisseau épineux, de croissance rapide, très décoratif de 4 à 5 m de haut, qui produit l’orange amère. Originaire de Chine. Il fut introduit en France par les croisés et en Palestine par les caravanes arabes. δes maures d’Andalousie l’acclimatèrent en Algérie, après en avoir développé la culture dans l’ancienne Espagne musulmane.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Le bigaradier est largement implanté en région méditerranéenne. Son tronc est très ramifié et ses feuilles sont d’un agréable vert brillant. Ses fleurs blanches à l’intérieur et pourpres en dehors, sont très odorantes. Les fleurs et les feuilles du bigaradier sont réputées pour leurs bienfaits sur l’équilibre nerveux et sur la digestion .Son fruit, plus petit que celui d’un oranger doux, est ovoïde et jaune foncé, appelé la bigarade, orange amère ou Citrus aurantium. δ’écorce est néanmoins plus épaisse et les pépins sont plus nombreux. δes fleurs sont habituellement odorantes, les fruits sont souvent des baies cloisonnées à pulpe vésiculeuse et juteuse formée de poils intracarpellaires: ce sont des hespéridés propres aux agrumes (HADRICH et al., 2009).

Figure 15 : Fruits du bigaradier

• Systématique du Citrus aurantium La classification qu'occupe Citrus aurantium dans la systématique est la suivante:

Règne...... Plantae Sous-règne...... Tracheobionta Division...... Magnoliophyta Classe...... Magnoliopsida Sous-classe...... Rosidae Ordre...... Sapindales Famille ...... Rutaceae Genre...... Citrus Espèce...... Citrus aurantium

δe fruit à été identifié par le Botaniste F. Hassani du laboratoire d’Ecologie et Gestion des Ecosystèmes Naturels ; Université de Tlemcen (Algérie).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes Le bigaradier, est un arbre ornemental cultivé en Algérie. La plupart de ses fruits et ses fleurs sont ignorés ou jetés. Toutefois, il est important de faire un usage plus efficace des produits agro-industriels et des sous-produits tels que les pulpes, les pépins, les feuilles, les fleurs ainsi que d’autres matériaux qui offrent de nombreux avantages économiques et écologiques du point de vue technologie. Par conséquent, la présente étude s’est intéressée à l'évaluation de l'utilisation des pépins d'orange amère C. aurantium comme une nouvelle source de polyphénols (Mazorra-Manzano et al., 2013).

Figure 16 : Les pépins des bigarades

III. Utilisation et vertus thérapeutique Le fruit du bigaradier est surtout utilisé en conserve ou cuit (confiture, sirop, marmelade). La marmelade d'orange est faite uniquement à partir de l'orange amère et non de l'orange douce. Très parfumée, la fleur du bigaradier sert à la fabrication de l'eau de fleur d’oranger et de l'essence de néroli riche en terpènes est utilisée en parfumerie et pour aromatiser les aliments. Cet agrume est très prisé en phytothérapie, il est utilisé comme Sédatif, anxiolytique, hypotenseur, propriétés anticancéreuses, hypolipémiant, anti-inflammatoire, somnifère léger, spasmolytique, anti-infectieux léger, tonique digestif, hémostatique, grâce à sa composition en: flavonoïdes, synéphrine (alcaloïde qui stimule le système nerveux central), pectines, huiles essentielles, limonènes, coumarines, vitamine C et carotènes (Kim et al., 2003; Fugh- Berman and Myers, 2004; Morley et al., 2007; Espina et al., 2011).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

IV. Origine géographique et période de récolte des plantes La récolte des oranges amères a été faite en mois de décembre 2009 à la région de FHOUL (Wilaya de Tlemcen), située dans le Nord Est de l'Algérie (γ4°5β41 de latitude ; 1°185γde longitude).

V. Préparation des échantillons Les pépins ont été récoltés manuellement, ensuite lavés abondamment avec de l’eau du robinet et mis ensuite dans l’étuve à 40°C pendant β4 heures. δes pépins sont ensuite broyés à l’aide d’un mixeur afin de subir les différentes analyses phytochimiques.

VI. Méthodes d’analyses VI.1. Détermination de la teneur en eau

• Principe: On procède à une dessiccation de l’échantillon à analyser dans une étuve à la température de 100°C à 105°C et sous la pression atmosphérique jusqu’à l’obtention d’une masse pratiquement constante. Pour éviter toute reprise d’humidité, il convient d’opérer dans des vases de tare, placées dans un dessiccateur (Audigie et al., 1980). δe taux d’humidité exprimé en pourcentage est calculé selon la formule suivante:

Taux d’humidité (%) = [(P2-P3) / (P2-P1)] x 100

P1 : masse en g du vase de tare. P2 : masse en g de la prise d’essai avant séchage. P3 : masse en g de la prise d’essai après séchage

VI.2. Tests phytochimiques : δ’examen phytochimique permet de détecter la présence ou l’absence des constituants chimiques à partir d’extrait de plantes ou directement sur la poudre d’échantillon à analyser.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Trois solvants de polarités différentes (eau, éther d’éthylique, éthanol) ont été utilisés au cours de ces tests qui sont basés sur des essais de solubilité, des réactions de coloration et de précipitation (Figure 17).

• Les saponosides Les saponosides constituent un vaste groupe d’hétérosides très fréquents chez les végétaux. Structurellement, les saponosides peuvent être classés en deux groupes selon la nature de leur génine : saponosides à génine stéroïdique et saponosides à génine triterpénique (Bruneton, 1999). De nombreuses plantes contiennent les saponosides. Elles ont un effet sur l’activité hormonale (Iserin et al., 2001).

• Les triterpènes et stérols Elaborés à partir des mêmes précurseurs (le squalène qui est formé par la condensation des unités isoprènes), les terpénoïdes et les stéroïdes forment sans doute le plus vaste ensemble connu des métabolites secondaires des végétaux. Ils constituent le principe odoriférant des végétaux (Bruneton, 1999).

• Les alcaloïdes Formant un groupe très large, les alcaloïdes possèdent un atome d’azote qui les rend pharmaceutiquement très actif. Il est parfois difficile de situer les frontières qui séparent les alcaloïdes des autres métabolites azotés naturels (Iserin et al., 2001). Ils existent à l’état de sel et constituent avec les hétérosides, la majorité des principes actifs des plantes médicinales (Bruneton, 1999).

• Les flavonoïdes Les flavonoïdes sont présents sous forme de pigments polyphénoliques chez les végétaux ; et contribuent à colorer les feuilles et les fruits (Bruneton, 1999). Ils sont omniprésents dans les fruits, les légumes, les graines, les boissons tels le thé et le vin rouge et d’autres parties de la plante (Tsimogiannis and Oreopoulou, 2006).

• Les tanins Les tanins sont définis comme des composants polyphénoliques dont le poids moléculaire est compris entre 500 et 3000 Dalton (Selvakumar et al., 2007) capables de se lier aux protéines en solution et de les précipiter (Scalbert and Williamson, 2000). 44

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Les tanins sont caractérisés par une saveur astringente et sont trouvés dans toutes les parties de la plante : l’écorce, le bois, les feuilles, les fruits et les racines (Scalbert, 1991).

Ils peuvent être divisés selon Scalbert, en deux groupes différents par leur structure et par leur origine biogénétique :

• Tanins hydrolysables qui sont des oligo ou des polyesters d’un sucre et d’un nombre variable d’acide phénol. δe sucre est très généralement le D-glucose et l’acide phénol est soit l’acide gallique dans le cas des gallotanins soit l’acide ellagique dans le cas des tanins classiquement dénommés ellagitanins (Bruneton, 1993).

• Tanins condensés qui se différent fondamentalement des tanins hydrolysables car ils ne possèdent pas de sucre dans leur molécule et leur structure est voisine de celle des flavonoïdes. Il s’agit des polymères flavaniques constituées d’unité de flavan-3-ols liées entre elles par des liaisons carbonecarbone (Bruneton, 1999).

• L’amidon δ’amidon constitue la principale forme de réserve glucidique des végétaux, il existe sous forme d’une structure correspondante à un homopolymère de D-glucose (Bruneton, 1999).

• Les composés réducteurs Les glucides, appelés hydrates de carbone ou saccharides, sont des composés organiques carbonylés (aldéhydique ou cétoniques) (Trease and Evans, 1987).

• Glycosides cyanogénétiques Les hétérosides cyanogènes dérivés des acides aminés sont facilement détectés par un papier imprégné de réactif susceptible de donner une réaction colorée avec l’acide cyanhydrique qui se dégage lorsque le matériel végétal frais est broyé (Bruneton, 1999).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Triterpènes Saponosides Tanins Flavonoïdes Alcaloïdes et stérols

5 ml d’extrait aqueux, 10 ml d’extrait aqueux 1 ml d’extrait aqueux, 5 ml d’extrait aqueux 0,2 ml d’extrait aqueux, étherique ou étherique ou éthanolique/ étherique méthanolique méthanolique Evaporation à sec Filtration +5ml d’HCδ aqueux 1% +10 ml d’eau distilée +10 ml d’eau distilée Solubilisation du résidu avec +3 gouttes de FeCl3 Agitation pendant 2mn Ajouter 5ml de solution Agitation dans un Anhydre acétique/chloroforme diluée d’NH3+ H2SO4 bain-marie/15mn (0,5ml/0,5ml+ 2ml H2SO4 Coloration Filtration Bleu noir Brun verdâtre

1ml 1ml +3 gouttes Coloration jaune +3 gouttes Mousse Emulsions Formation d’un anneau réactif de Wagner qui disparaît après réactif de Mayer persistante après formées après brunâtre-rouge ou violet à la Tanins Tanins condensés un moment 15 mn addition de l’huile surface + coloration verte hydrolysable d’olive violette de la solution Une précipitation ou une turbidité

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Les sucres Coumarines Quinones Anthraquinones Les glycosides L’amidon cyanogénétique réducteurs s

1g de poudre dans un 1g poudre+ 15 à 30 10ml d’extrait 3g de poudre+ βml d’extrait aqueux 5ml d’extrait tube+ quelques gouttes ml d’éther de pétrole chloroformique quelques gouttes de et éthanolique aqueux d’eau chloroforme Agitation Macération/24 h Couvrir le tube avec δ’extrait est filtré et +5ml KOH aqueux +5ml de mélange de Quelques gouttes Couvrir par un papier papier imbibé de NaOH concentré au rotavapeur 10% (V/V) volume égale de la du réactif d’amidon dilué imbibé par l’acide solution de Fehling picrique A+B Agitation Ebullition Incubation au bain Ajout de quelques Examen sous UV marie à 35°C/3h gouttes de NaOH (1/10) Ebullition/2mn Virage de la phase Fluorescence jaune Virage au bleu aqueuse au rouge Virage au rouge violacé Formation d’un précipité rouge Virage de la phase brique aqueuse au jaune- rouge ou violet

Figure 17 : Tests phytochimiques (Trease and Evans, 1987; Sofowora, 1993; Bruneton, 1999; Rizk, 1982)

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

VI.3. Détermination quantitative des métabolites primaires VI.3.1. Dosage de l’azote total et les protéines brutes Il a été réalisé par la méthode de Kjeldahl (Cunniff, 1995), elle comprend trois étapes: la minéralisation, la distillation et la titration. • Principe δa méthode consiste à détruire la matière organique par l’acide sulfurique concentré et chaud, qui fait passer quantitativement l’azote à l’état de sulfate d’ammonium. δ’ammoniac est ensuite déplacé par de la soude et recueilli dans un excès d’acide sulfurique de concentration connue. Un titrage en retour par de la soude de concentration connue permet de déduire la quantité d’ammoniac formée, donc la teneur en azote de l’échantillon δa conversion du taux d’azote en taux de protéines est calculée selon la formule : Protéines brutes (%) = N %x 6,25

VI.3.2. Dosage des fibres alimentaires Il a été réalisé par la méthode de Henneberg et Stohmann (Carpenter et al., 1993), appelée aussi la méthode Weende en utilisant un extracteur des fibres brutes FIWE-VELP SCIENTIFICA. • Principe Elle consiste à traiter l’échantillon à analyser successivement avec de l’acide sulfurique et de la potasse. δ’hydrolyse acide/ basique (à chaud) permet de solubiliser la quasi-totalité du contenu cellulaire à l’exception des fibres alimentaires et des sels minéraux. Le résidu obtenu est séché, incinéré puis pesé.

VI.3.3. Dosage des sucres totaux δ’appréciation de la quantité en oses présents dans les polysaccharides repose sur le dosage des sucres totaux par la méthode de (Dubois et al., 1956) appelée aussi méthode phénol/acide sulfurique. • Principe Le dosage des monosaccharides constitutifs des polysaccharides nécessite la rupture de toutes les liaisons glycosidiques par hydrolyse acide (l’acide sulfurique). δ’analyse repose sur des techniques colorimétriques. δe principe des dosages colorimétriques se base sur la condensation par estérification d’un chromogène (Phénol, Orcinol, Anthrone) avec les produits de déshydratation des pentoses, hexoses et acides uroniques.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

En milieu acide fort et à chaud, ces oses se déshydratent respectivement en des dérivés du furfural, 5- hydroxy-méthyl-furfural et de l’acide 5-formylfuroïque. Les chromophores ainsi formés de couleur jaune- orange absorbent dans le domaine du visible proportionnellement avec la quantité des sucres présents (Ruiz, 2005). δa teneur des sucres est exprimée en μg/ml (converti en gramme/litre) de αD-Glucose à partir d’une courbe d’étalonnage.

VI.3.4. Dosage des cendres • Principe Il consiste en une calcination au bec Benzène de l’échantillon jusqu’à apparition d’une fumée noire, puis en son incinération dans un four à moufle, dans des creusets en porcelaine, à une température de 750°C jusqu’à ce que les résidus deviennent blancs après refroidissement (Audigie et al., 1980).

VI.3.5. Dosage des lipides totaux (ISO, 1988) Afin d’éliminer le reste d’humidité, l’échantillon à analyser a subit un séchage à l’étuve à 40 °C/14 heures. • Principe δ’extraction de l’huile de pépins du Citrus aurantium est réalisée dans un extracteur de type soxhlet à l’aide d’un solvant organique (le n- hexane). Après évaporation du solvant d’extraction, l’extrait obtenu représente la matière grasse contenue dans la prise d’essai (5- 10g).

VI.3.5.1. Détermination des indices physico-chimiques de l’huile : Les indices physico-chimiques de l’huile de pépins du Citrus aurantium ont été déterminés selon la norme (AFNOR, 1978).

• Indice de densité d20 : Cette méthode consiste à déterminer le rapport de la masse d’un volume donné d’huile à β0°C et la masse d’un volume égal d’eau distillée à la même température, en utilisant un pycnomètre muni d’un thermomètre gradué et étalonner à β0°C.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

La densité relative d20 est donnée par la formule suivante:

d20 = (m2 – m0) / (m1 – m0) m0 : la masse du pycnomètre vide, m1 : la masse du pycnomètre rempli d’eau distillée, m2 : la masse du pycnomètre rempli d’huile. t • Indice de réfraction (Nd ) t δ’indice de réfraction (Nd ) consiste à déterminer le rapport entre le sinus de l’angle d’incidence et le sinus de l’angle de réfraction d’un rayon lumineux de longueur d’onde déterminée passant de l’air dans l’huile à une température constante (β0°C), en utilisant le réfractomètre. δ’indice de réfraction est donné par la formule suivante: 20 t Nd = n d + 0.00035 (t - 20) 20 Nd : indice de réfraction à la température 20°C. t n d : valeur de lecture à la température à laquelle a été effectuée la détermination. t : la température à laquelle a été effectuée la détermination.

• Indice d’acide (IA)

δ’indice d’acide (IA) d’un corps gras consiste à déterminer la quantité d’hydroxyde de potassium exprimée en milligramme nécessaire pour neutraliser l’acidité due aux acides gras libres contenus dans 1 gramme du corps gras. Une quantité de 0,5 g d’huile est solubilisée dans β0 ml d’éthanol 96%. β ml d’indicateur coloré (phénolphtaléine à 1%) sont ensuite ajoutés et cette solution est titrée contre une solution d’hydroxyde de potassium à 0,1 N. Un essai à blanc (contenant la même quantité que le solvant sans l’huile) est réalisé dans les mêmes conditions. δ’indice d’acide est donné par la formule suivante:

IA = (V1 – V0) x M x N x f/ m

V1 : volume en ml de potasse alcoolique utilisé pour neutraliser les acides libres de la prise d’essai.

V0 : volume en ml de potasse alcoolique utilisé pour le témoin. M : masse molaire de KOH (56,11 g / mol). N : normalité de la solution de potasse : 0,1N. F : facteur de correction de la normalité de la solution de potasse. M : masse de la prise d’essai.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

• Indice de saponification (IS) Il correspond au nombre de milligramme d’hydroxyde de potassium nécessaires pour la saponification d’un gramme de corps gras. Une quantité d’un gramme d’huile est saponifiée à reflux par 25ml de KOH éthanolique (0,5N) pendant une heure. δ’excès du KOH est neutralisé par l’acide hydrochlorique HCl (0,5N) en présence de phénophtaléine comme indicateur coloré. Un essai à blanc est réalisé dans les mêmes conditions sans l’huile.

δ’indice de saponification est calculé par la relation suivante :

IS= (V0 –V1) x M x N/ m.

V0: volume en ml de la solution d’acide chlorhydrique utilisé pour le témoin.

V1: volume en ml de la solution d’acide chlorhydrique utilisé pour la prise d’essai M : masse molaire de KOH : 56,11g/mole N : normalité de la solution de potasse : 0,5N m : masse de la prise d’essai.

VI.3.5.2. Dosage des acides gras par Chromatographie en phase gazeuse (CPG): (Bligh and Dyer, 1959).

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique de séparation des substances chimiques qui repose sur des différences de comportement de séparation entre une phase mobile courante et une phase stationnaire pour séparer les composants d’un mélange. Elle se fait après extraction des lipides à partir de l’huile (β0µl). Une quantité déterminée d’étalon interne (19:0, dilué dans du benzène à 2mg/ml) est ajoutée. Après mélange au vortex, deux phases se forment, la phase inférieure est récupérée et séchée sous azote. La fraction des lipides totaux obtenue est évaporée à sec sous flux d’azote. Les échantillons sont ensuite saponifiés en présence de NaOH 0,5N à 80°C pendant 20 min, puis méthylés en présence de BF3 méthanolique à 14% (SIGMA-ALDRICH). Les esters méthyliques d’acides gras sont extraits par l’hexane et une solution aqueuse de NaCl 35%. Après agitation, les échantillons sont centrifugés à 2000×g pendant 10 min et la phase inférieure héxanique contenant les esters méthyliques est récupérée pour la CPG. La CPG est réalisée à l’université de Bourgogne, France. Le chromatographe Packard modèle 483A (Perkin Elmer, Boston, MS, USA) est équipé d’une colonne capillaire de verre de 30 m de long, 0,32 mm de diamètre interne et 0,25µm de film (SPIRAL, Couternon, France) imprégnée d’une phase stationnaire polaire (carbowax20M).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

-1 Le gaz vecteur utilisé est l'hélium, le débit est de 3 mL.min . Les esters méthyliques d'AG des lipides totaux sont injectés dans la colonne capillaire à l'aide d'un injecteur "on- column". Le détecteur à ionisation de flamme est maintenu à une température de 230°C. δ’appareil est couplé à un intégrateur Packard (Perkin Elmer). Les différents esters méthyliques d’acides gras sont ensuite identifiés en fonction de leur temps de rétention relatif, en les comparants avec un mélange d’acides gras connus (standard 68A, Nu-Check-Prep). La surface des pics d’acides gras est proportionnelle à leur quantité; elle est calculée à l’aide d’un intégrateur. La quantification des acides gras est déterminée grâce au pic de standard interne.

VI.3.5.3. Dosage de la vitamine E δa vitamine E (α-tocophérol) est analysée sur l'huile par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse selon la méthode de Zaman et al. (Zaman et al., 1993). Cette méthode permet une analyse quantitative basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est proportionnelle à la concentration de la vitamine E présente dans l'huile, par comparaison au pic de l'étalon interne, Tocol (Lara Spiral, Couternon, France), introduit dans l'échantillon avant l'injection dans le chromatographe. La phase stationnaire inverse est composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 18 atomes de carbones (colonne C18; HP ODS Hypersil C18 ; 200 mm x 4,6 mm; Lara Spiral, maintenance temperature of analytical column, 35°C). La phase mobile est constituée par le mélange méthanol/eau (98/2, V/V), délivrée à un débit constant, 1ml/min grâce à une pompe (Waters 501 HPLC Pomp). Après précipitation des protéines par l’éthanol et addition de l’étalon interne (5μg de tocol pour β00μl de l’huile), la vitamine E, est extraite de l’huile par β ml d’hexane. δa phase supérieure est reprise soigneusement et est évaporée sous vide. Le résidu est repris dans 50μl de diethyl éther, et complété avec 150μl de la phase mobile méthanol/eau (95/5 ; v/v). δe dosage de la vitamine E est réalisé par HPLC équipée d'un détecteur à absorption UV qui permet de détecter le pic correspondant à la vitamine E à 292nm.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

VI.4. Extractions et Dosages des métabolites secondaires

VI.4.1. Extraction et dosage des phénols totaux à partir de l’huile δa méthode appliquée pour extraire les composés phénoliques est celle de l’extraction liquide- liquide selon Pirisi et al. (Pirisi et al., 2000). Le principe est basé sur la solubilisation d’huile (βg) dans 1 ml du n–hexane et β ml du méthanol/ l’eau (v/v, 60/40). δe volume total subit une séparation par centrifugation à 3000 tr/min. Les surnageants (phase n-hexane) vont subir γ extractions successives à fin d’extraire le maximum. Les parties résiduelles récupérées sont lavées par le n-hexane et évaporer à sec sous pression réduite à température de 35°C. δ’extraction des polyphénols totaux à partir de l’huile est suivie par un dosage spectrophotométrique en utilisant la méthode de Singleton et Rossi (Singleton and Rossi, 1965), reporté par (Dogan et al., 2005). δa réaction est basée sur la réduction de l’acide phoshomolybdique du réactif Folin-Ciocalteu (un acide de couleur jaune, constitué de polyhétérocycles acides contenant du molybdène et tungstène) par les polyphénols en milieu alcalin. Elle se traduit par le développement d’une coloration bleu foncée due à la formation d’un complexe molybdène tungstène mesuré au spectrophotomètre. δa teneur en polyphénols totaux est déterminée à partir d’une équation de la régression linéaire déduite de la courbe d’étalonnage et exprimée en milligramme équivalent d’acide gallique par 100 gramme de matière sèche.

VI.4.2. Extractions des composés phénoliques à partir des pépins du Citrus aurantium VI.4.2.1. Extraction des polyphénols totaux δ’extraction des polyphénols consiste à macérer à froid l’échantillon (la poudre dégraissée) à analyser dans une solution d’acétone aqueuse pendant β4 heures. Après filtration sous vide l’extrait est évaporé à sec sous pression réduite à 45°C. δe résidu obtenu est pesé et repris par 3 ml du méthanol. δ’acétone aqueuse, et le méthanol aqueux, avec des proportions entre 50% et 70% (v/v), sont les solvants les plus utilisés pour l’extraction des polyphénols (Bok et al., 2000).

VI.4.2.2. Extraction des flavonoïdes Dix gramme de poudre végétale est ajoutée à 100 ml de méthanol bouillant en présence de 5g de CaCo3. δ’ébullition est maintenue sous réfrigérant à reflux pendant une heure.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Après filtration, le dépôt est traité de nouveau pendant une heure à ébullition dans les mêmes quantités d’alcool. δes deux solutions sont réunies, puis sont éliminées par distillation sous pression réduite et le résidu sirupeux est repris par 50 ml d’eau distillée bouillante. δa solution aqueuse est filtrée à chaud et le filtrat subit des extractions successives par l’acétate d’éthyle (AcEto), et le n-butanol (BuOH) dans une ampoule à décanter. Après agitation et décantation des deux phases, δa phase aqueuse issue de l’extraction est reprise avec de l’acétate d’éthyle. (δ’opération est répétée deux fois). δa phase acétate d’éthyle est séchée au rotavapor, refaire de même jusqu’à obtention de la phase n-butanol et la sécher au rotavapor (Dauguet and Foucher, 1982; Bekkara et al., 1998).

VI.4.2.3. Extraction des tanins Dix gramme de matériel végétal broyé en présence de 100 ml d'eau distillée et 100 ml d'acétone; l'ensemble est porté à une macération à froid (4°C) pendant 4 jours. Filtrer et extraire la solution deux fois avec 50 ml de dichlorométhane afin d'éliminer les pigments et les lipides. Décanter et extraire la phase aqueuse quatre fois avec 50 ml d'acétate d'éthyle

(AcOEt).Sécher la phase organique avec MgSO4 ensuite évaporer le solvant à sec (Bruneton, 1999).

VI.4.3. Dosage des composés phénoliques VI.4.3.1. Dosage des polyphénols totaux δ’estimation quantitative des polyphénols, est réalisée à l’aide du réactif Folin- Ciocalteu Singleton et Rosi (Singleton and Rossi, 1965), mélange d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique, réduit lors de l’oxydation des phénols, en mélange d’oxydes bleus de tungstène et de molybdène. La coloration bleue produite possède une absorption maximale aux environs de 760 nm. Elle est proportionnelle aux taux de composés phénoliques. Un volume de β00 μl pour chaque extrait est introduit dans des tubes à essais, le mélange (1ml de Folin Ciocalteu dilué 10 fois et 0,8 ml de carbonate de sodium à 7,5%) est additionné. δes tubes sont agités et conservés durant γ0 min. δ’absorbance est mesurée à 765 nm. Une courbe d’étalonnage à différente concentration d’acide gallique a été préparée. δes teneurs en phénols totaux dans les extraits sont exprimées en milligramme (mg) équivalent d’acide gallique par gramme (g) du poids de la matière sèche (mg EAG/ g MS).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

VI.4.3.2. Dosage des flavonoïdes La quantification des flavonoïdes a été effectuée par une méthode adaptée par Zhishen et al.(Zhishen et al., 1999), avec le trichlorure d'aluminium et la soude. Le trichlorure d'aluminium forme un complexe jaune avec les flavonoïdes et la soude forme un complexe de couleur rose absorbe dans le visible à 510 nm. Le flavonoïde standard utilisé est la catéchine.

VI.4.3.3. Dosage des tanins condensés Les quantités des tanins condensés sont estimées en utilisant la méthode à vanilline en milieu acide (Julkunen-Tiitto, 1985; Oueslati et al., 2012). Un volume de 50 μl de l’extrait brut est ajouté à 1500 μl de la solution vanilline/méthanol (4 %, m/v) et puis mélangé à l’aide d’un vortex. Ensuite, 750 μl de l’acide chlorhydrique concentré (HCl) est additionné et laissé réagir à la température ambiante pendant 20 min. L'absorbance à 550 nm est mesurée contre un blanc. La concentration des tannins est estimée en milligramme (mg) équivalents de catéchine par gramme (g) du poids de la matière sèche (EC)/g) à partir de la courbe d’étalonnage (Figure 18).

VI.5. Tests d’activité antioxydante δa mise en évidence de l’activité antioxydante in vitro de nos extraits phénoliques (préparés à partir des pépins de la bigarade ainsi qu’à partir de l’huile de pépins de bigarade) a été réalisée par trois techniques chimiques à savoir, le piégeage du radical libre DPPH, la réduction du fer, et le test de blanchissement de -carotène.

VI.5.1. Effet scavenger du radical DPPH Cette méthode est basée sur la mesure de la capacité des antioxydants à piéger le radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH). Ce dernier est réduit à la forme d’hydrazine (non radical) en acceptant un atome d’hydrogène. δ’effet de chaque extrait sur le DPPH est mesuré par la procédure décrite par Brand-Williams et al. (Brand-Williams et al., 1995). Le DPPH absorbe dans le visible à la longueur d’onde de 515 nm à 5β0 nm.

% DPPH = [(A0 – At)/A0] x 100

A0: absorbance du contrôle.

At: absorbance du test effectué. Les pourcentages du DPPH résiduels en fonction des concentrations des échantillons, nous permettent d’obtenir la quantité d’antioxydant nécessaire pour diminuer la concentration

DPPH initiale à 50%. Cette valeur est appelée la concentration efficace et parfois notée IC50.

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

Elle est exprimée en milligramme d’extrait par rapport au gramme DPPH. δ’acide ascorbique est utilisé comme contrôle positif.

VI.5.2. Test du blanchissement du β-carotène δe -carotène est physiologiquement un composé important reconnu par sa forte activité biologique. Dans l’industrie agro-alimentaire, il est utilisé dans les boissons comme un agent de coloration et sa décoloration indique la réduction de qualité de ces produits (Bougatef et al., 2009). δe test de blanchiment de -carotène utilisé pour évaluer l'activité antioxydante de nos extraits est celui de (Koleva et al., 2002), reporté par (Kartal et al., 2007). Cette méthode consiste à mesurer, à 470 nm, la décoloration du -carotène résultant de son oxydation par les produits de décomposition de l’acide linoléique. δa dispersion de l’acide linoléique et du -carotène dans la phase aqueuse est assurée par du Tween. δ’oxydation de l’acide linoléique est catalysée par la chaleur (50°C). δ’addition d’antioxydants purs ou sous forme d’extraits végétaux induits un retard de la cinétique de décoloration du -carotène (Laguerre et al., 2007). Cette méthode est sensible, s’agissant d’une mesure spectrophotométrique dans le visible. δ’acide gallique et le BHA sont utilisés comme contrôles positifs. δ’activité antioxydante (%) des extraits est évaluée en termes de blanchiment du -carotène en employant la formule suivante :

Pourcentage d’inhibition (%)= [(A (120)-C(120))/ (C(0)-C(120))] x100 A (1β0) : représente l’absorbance en présence de l’extrait à 1β0 min. C(120) : représente l’absorbance du contrôle à 1β0min. C(0) : représente l’absorbance du contrôle à 0 min.

VI.5.3. Réduction du fer : FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) δe pouvoir réducteur d’un extrait est associé à son pouvoir antioxydant. δ’activité réductrice du fer de nos extraits est déterminée selon la méthode décrite par (Oyaizu, 1986), reportée par (Pan et al., 2008), basée sur la réaction chimique de réduction du Fe+3 présent dans +2 le complexe K3Fe(CN)6 en Fe . Cette capacité réductrice peut servir comme un indicateur significatif de l’activité antioxydante potentielle d’un composé. δ’absorbance du milieu est déterminée à 700 nm. δ’acide ascorbique et BHA sont utilisés comme contrôles positifs (Figure 18).

Partie in vitro : Matériel et Méthodes

2g de matériel végétal dégraissé+ 10g de matériel végétal dégraissé+ 10g de matériel végétal dégraissé+ acétone /eau 70 :30 (v/v) 100ml de méthanol + 5g CaCO3 200 ml acétone /eau 45:25 (v/v)

Reflux pendant 1h (2×) Macération 24h Macération 4jours à 4°C Filtration (2×) Filtration Filtration

Réunir les deux filtrats Eapoatio de latoe Eapoatio de latoe aqueuse Evaporation à sec Macération 4jours à 4°C

Récupérer le résidu avec 50ml Filtration d’eau bouillante Récupération dans 3ml Filtration Récupération dans 3ml de méthanol Extraction avec l’acétate d’éthyle de méthanol Evaporation à sec

Phase aqueuse

Extraction par le n- butanol Dosage des tanins ; Dosage des polyphénols ; Activité antioxydante : Phase Phase Activité antioxydante : Piégeage du radical libre DPPH acétate d’éthyle butanolique Piégeage du radical libre DPPH Réduction du fer FRAP Réduction du fer FRAP Décoloatio du β-carotène -carotène Doloatio du β Dosage des flavonoïdes ; Activité antioxydante : Piégeage du radical libre DPPH ; Réduction du fer FRAP ; Doloatio du β-carotène

Figure 18 : protocole général des extractions des polyphénols, flavonoïdes et tanins, les différents dosages et les méthodes antioxydantes utilisées.

Résultats et interprétations

Partie In vitro : Résultats et interprétations

I. Taux de la matière sèche

δ’appréciation de la teneur en matière sèche repose sur la détermination du taux d’humidité contenue dans l’échantillon à analyser. δe pourcentage d’humidité obtenu après perte de poids lors de la dessiccation ainsi que le pourcentage en matière sèche sont résumés dans le tableau 2. δ’analyse du taux d’humidité au niveau des pépins du Citrus aurantium a montré une faible proportion estimée à 6,52%. À partir de cette valeur, nous avons pu déterminer le pourcentage en matière sèche (εS) qui s’est révélé important de 93,48 %.

Tableau 2: taux d’humidité et de la matière sèche des pépins du Citrus aurantium

Humidité Taux de matière sèche

Citrus aurantium 6.52 93.48%

II. Tests phytochimiques

Les tests phytochimiques ont été réalisés sur différents extraits préparés à partir de matériel végétal réduit en poudre mettant en évidence la présence de métabolites secondaires. Les méthodes de détection consistent en une précipitation ou une coloration par des réactifs spécifiques. Ces tests ont permis de détecter les différentes familles de composés par des réactions de caractérisation (voir Tableau 3).

Partie In vitro : Résultats et interprétations

Tableau 3: Résultats des réactions de caractérisation des différents groupes chimiques recherchés dans les extraits des pépins du Citrus aurantium

Extrait Extrait Extrait aqueux éthanolique ethérique Saponosides - - - Stérols + +++ +++ Triterpènes - ++ +++ Tanins hydrolysables - - - Tanins condensés - ++ - Flavonoïdes - ++ - Alcaloïdes ++ -- +- Amidon - - - Sucres réducteurs - - - Anthraquinones - ND ND Coumarine - ND ND Quinone - ND ND Glycosides - ND ND cyanogénétiques

+++ : Fortement positif ; ++ : Moyennement positif ; + : Faiblement positif ; - : Négatif ; ND : non déterminé.

Les résultats des tests phytochimiques montrent la forte présence des stérols dans les pépins du Citrus aurantium, suivi par la famille des triterpènes. Les flavonoïdes et les alcaloïdes sont présents en quantité appréciable dans les pépins. δes tanins hydrolysables sont totalement absents alors qu’il est noté la présence des tanins condensés dans les pépins étudiés. δa famille des saponosides, l’amidon ainsi que les composés réducteurs sont totalement absents dans nos extraits.

III. Métabolites primaires Les résultats obtenus montrent que les pépins étudiés présentent des teneurs considérables en lipides (38,21%) suivi par les protéines (5,17%). Le taux de sucres et de cendres sont relativement proches avec des teneurs respectivement de 2,05% et 2,73%. Les pépins de la bigarade présentent des teneurs faibles en fibres (0,89%) (Tableau 4).

Partie In vitro : Résultats et interprétations

Tableau 4 : Les teneurs en métabolites primaires des pépins du Citrus aurantium, exprimées en pourcentage de matière sèche.

Constituants (%) Lipides Protéines sucres fibres cendres

Citrus 38,21 ± 0,74 5,17 ± 1,74 2,05 ± 0,02 0,89 ± 0,01 2,73 ± 0,65 aurantium

IV. Analyse physico-chimique de l’huile de pépins du Citrus aurantium

IV.1. Valeurs des indices physico-chimiques de l’huile

δes résultats de la détermination des indices de densité, d’acide, de réfraction, et de saponification de l’huile de pépins de Citrus aurantium donnent des valeurs estimées à 0,926 ; 1,121 ; 1,467 et 191,52 respectivement (Tableau 5).

Tableau 5: Valeurs des indices physico-chimiques de l’huile de pépins de Citrus aurantium

Indices physico-chimiques Valeurs

Indice de densité 0,926 ± 0,024

Indice d’acide 1,121 ± 0,115

Indice de réfraction 1,467 ± 0,060

Indice de saponification 191,52 ± 6,09

IV.2. Détermination de la composition en acides gras de l’huile

δa composition en acides gras de l’huile de pépins du Citrus aurantium analysée par la CPG est représentée dans le tableau 6. δ’acide linoléique (C18:2) est l’acide gras majoritaire, il présente la teneur la plus élevée de 38,29%. Cet acide gras polyinsaturé essentiel est de type oméga-6. δ’acide oléique (C18:1) est le principal AGMI, il présente un taux de 27,70%. Le troisième acide gras rencontré dans l’huile de pépins de la bigarade est l’acide palmitique (C16:0), c’est un acide gras saturé ; il est contenu dans l’huile avec une proportion de 26,85 %. L’acide stéarique est présent aussi dans l’huile avec un faible pourcentage de 7,15 %.

Partie In vitro : Résultats et interprétations

Tableau 6: Composition en acides gras de l’huile de pépins de Citrus aurantium

Acides gras Teneurs en % d’huile

Acide palmitique C16 :0 26,851 Acide stéarique C18 :0 7,149 Acide oléique C18 :1 27,703 Acide linoléique C18 :2 38,295 AGS 34 AGIS 65,998 AGIS/AGS 1,941

IV.3. Teneurs en α-tochophérol et en polyphénols de l’huile de pépins de bigarade

δa détermination de la teneur en vitamine E dans l’huile de pépins du Citrus aurantium sous la forme α- tocophérol a donné une concentration estimée à 194.β5µg/ ml d’huile. Nous avons constaté aussi que notre huile contient un taux non négligeable en polyphénols totaux (0,219 mg AG/gMS) (Tableau 7).

Tableau 7: Les teneurs en α-tocophérol et en polyphénols de l’huile de pépins Citrus aurantium.

Composants Teneurs en huile

α-Tocopherol (µg/ml) 194,25

Polyphénols (mg AG/g) 0,219± 0,002

V. Rendements et dosages des composés phénoliques

Les rendements (Tableau 8) ont été déterminés par rapport à 100 g de la matière végétale sèche. Nous constatons que l’extrait phénolique des pépins du Citrus aurantium enregistre un fort rendement de l’ordre de 22% suivi par la fraction n-butanol des flavonoïdes et des tanins à raison de 5,4% et 1% respectivement. δe taux de la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes étant le plus faible (0,4%).

Partie In vitro : Résultats et interprétations

Les analyses quantitatives des phénols totaux, des flavonoïdes et des tanins condensés sont déterminées à partir des équations de la régression linéaire de chaque courbe d’étalonnage. Leurs teneurs sont résumés dans le tableau ci-dessous. Les résultats sont exprimés en mg d'équivalents de chaque étalon par g de poids sec de la matière végétale. Les résultats indiquent que les pépins du Citrus renferment des teneurs non négligeables en polyphénols 2,126 mg AGE /g MS. Les valeurs des tanins condensés sont estimées à 0,3 mg CE/g MS. Les pépins étudiés ont montré la présence des tanins condensés et l’absence des tanins hydrolysables, ce résultat a été confirmé par la présence d’une réaction positive et une coloration verte brune lors de l’examen phytochimique. Quant aux fractions des flavonoïdes (acétate d’éthyle, n-butanol), leurs teneurs sont faibles estimées à 0,033 et 0,043 mg CE/g MS respectivement.

Tableau 8: Rendements et dosages des composés phénoliques des pépins du Citrus aurantium

Rendement (%) Dosage

Polyphénols 22 % 2,126 ± 0,0018 mg AGE /g MS

Flavonoïdes Acétate d’éthyle 0,4 % 0,033 ± 0,004 mg CE/g MS

Flavonoides n-butanol 5,4 % 0,043 ± 0,005 mg CE/g MS

Tanins condensés 1 % 0,3 ± 0,03 mg CE/g MS

AGE: mg équivalent d’acide gallique/g de la matière sèche. CE: mg équivalent de catéchine/g de la matière sèche.

VI. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium et de l’huile

Pour mieux comprendre l’activité de nos graines, nous nous sommes intéressés aux propriétés antioxydantes de leurs extraits. En effet, l’activité antioxydante semble être le principe d’action d’un certain nombre de produits pharmaceutiques. À travers l’étude bibliographique, il apparait clairement qu’une seule méthode n’est pas suffisante pour caractériser les potentialités antioxydantes en raison de la nature complexe de composés phytochimiques et de leurs interactions. δ’utilisation de plusieurs tests d’évaluation des activités antioxydantes est nécessaire.

Partie In vitro : Résultats et interprétations

De ce fait, trois méthodes complémentaires pour évaluer le potentiel antioxydant des extraits phénoliques des pépins du Citrus, ont été utilisées. Il s’agit du piégeage du radical libre DPPH, le système de blanchiment du -carotène et du pouvoir réducteur de fer FRAP.

VI.1. Le piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) Le DPPH est un radical libre nous permettant de déterminer le potentiel de piégeage de nos extraits grâce à sa sensibilité à détecter les composants actifs à des basses concentrations (He et al., 2008). δ’activité antiradicalaire a été estimée spectrophotométriquement en suivant la réduction du DPPH à 515nm (Maisuthisakul et al., 2007). Les valeurs obtenues ont permis de tracer des courbes représentées sur la figure 19 qui montre la variation du pourcentage d’inhibition en fonction des concentrations de nos extraits.

100 AA 90 Poly FLVAc 80 FLVnB 70 Tc Poly huile 60

Pourcentage d'inhibition (%) d'inhibition Pourcentage 20

0 02468 1012141618 Concentration (mg/ml)

Figure 19: Pourcentage d’inhibition du radical DPPH des extraits des pépins du Citrus aurantium. AA : acide ascorbique, Poly : polyphénols, FδVAc : flavonoïdes phase acétate d’éthyle, FLVnB : flavonoïdes phase butanolique, Tc : tanins condensés, Poly huile : polyphénols huile.

D’après les résultats, l’activité antiradicalaire augmente avec l’augmentation des concentrations des extraits dans le milieu réactionnel.

L'activité inhibitrice du radical libre DPPH par l'acide ascorbique a été la plus élevée par rapport aux extraits. δa fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes et les polyphénols totaux des pépins du Citrus aurantium ont montré une activité de piégeage du radical DPPH plus

Partie In vitro : Résultats et interprétations importante que celles des flavonoïdes n-butanol et des tanins, δ’extrait phénolique de l’huile de pépins du Citrus a montré une faible activité de piégeage. A partir de la courbe des taux d’inhibition, nous avons pu déduire graphiquement les valeurs d’IC50 des différents extraits; représentées dans le tableau 9.

δ’IC50 est la concentration en extrait nécessaire pour réduire 50% du radical DPPH. Plus la valeur de l’IC50 est petite, plus l’activité antioxydante de l’extrait testé est grande (Pokorny et al., 2001).

À partir des valeurs des IC50, on constate que la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes des pépins (5,83 ±0,12 mg/ml) est plus importante par rapport à celle de l’extrait phénolique (13,21±0,02 mg/ml) et de la fraction butanolique des flavonoïdes (15,55 ± 0,06 mg/ml), mais reste largement inférieure à l’antioxydant de synthèse (0,11 ± 0,08 mg/ml).

Tableau 9 : 50% d’inhibition du radical libre DDPH des extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium.

IC 50 DPPH (mg/ml) Extraits des pépins du Citrus Poly FLVAc FLVnB Tc Poly huile aurantium 13,21±0,02 5,83±0,12 15,55±0,06 ND ND

AA 0,12 ± 0,08

AA : acide ascorbique, Poly : polyphénols, FδVAc : flavonoïdes phase acétate d’éthyle, FδVnB : flavonoïdes phase butanolique, Tc : tanins condensés, Poly huile : polyphénols huile, ND : non déterminé.

VI.2. Le blanchissement du β-carotène

Nous avons évalué l’activité antioxydante de nos extraits par la décoloration du -carotène qui est une méthode spectrophotométrique qui permet de suivre, à 470nm, la décoloration du -carotène au cours du temps de la réaction. δ’acide linoléique présent dans le mélange réactionnel, produit des hydroperoxydes comme radicaux libres durant l’incubation à 50°C. Ces radicaux libres sont formés lors de l'élimination d'un atome d'hydrogène d’un de ses groupes méthylène diallyliques et attaquent les molécules de -carotène hautement insaturées.

Partie In vitro : Résultats et interprétations

Cependant, la présence d’un antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres dérivés de l’acide linoléique et donc prévenir l’oxydation et le blanchiment du -carotène (Kubola and Siriamornpun, 2008). Les résultats représentés dans la figure 20 montrent que les pourcentages d’inhibitions de l’oxydation du -carotène sont proportionnels aux concentrations des différents extraits. Les résultats montrent que tous les extraits des pépins du C. aurantium sont capables d'inhiber la décoloration du -carotène en piégeant les radicaux libres dérivés de linoléate et sont parfois plus efficaces en comparaison avec l'acide gallique comme c’est le cas avec l’extrait flavonique acétate d’éthyle et celui des tanins.

Poly FLVAc FLVnB Tc Poly huile 90 AG 80 BHA

Pourcentage d'inhibition (%) (%) d'inhibition Pourcentage 20

0 01234567 Concentration (mg/ml)

Figure 20 : Pourcentage d’inhibition du blanchiment du -carotène des extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium. Poly : polyphénols, FδVAc : flavonoïdes phase acétate d’éthyle, FLVnB : flavonoïdes phase butanolique, Tc : tanins condensés, Poly huile : polyphénols huile, AG : acide gallique, BHA : butylhydroxyanisole.

Nous remarquons que l’extrait tannique suivi par la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes décèlent la meilleure activité antioxydante avec 0,20±0,002 mg/ml, et 0,33±0,01mg/ml respectivement, en comparaison avec IC50 de l’acide gallique estimée à 0,43 ± 0,001mg/ml suivie par l’extrait flavonoïque n-butanol avec 0,56±0,06 mg/ml. Mais ces valeurs restent largement inferieure à celle du BHA (IC50= 0,044 ± 0,002mg/ml).

Partie In vitro : Résultats et interprétations

δ’extrait phénolique de l’huile extraite à partir des pépins du Citrus aurantium a représenté la moins forte activité inhibitrice du blanchiment du -carotène avec une IC50 égale à 1,18±0,009 mg/ml suivi par l’extrait phénolique des pépins du C. aurantium (5,49± 0,10 mg/ml) (tableau 10).

Tableau 10: Valeurs des IC50 du test du blanchiment du -carotène des extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium.

IC 50 β-carotène (mg/ml) Extraits des pépins du Poly FLVAc FLVnB Tc Poly huile Citrus aurantium 5,49± 0,10 0,33±0,01 0,56±0,06 0,20±0,002 1,18±0,009

AG 0,43 ± 0,001 BHA 0,044 ± 0,002

AG : acide gallique, BHA : butylhydroxyanisole.Poly : polyphénols, FLVAc : flavonoïdes phase acétate d’éthyle, FLVnB : flavonoïdes phase butanolique, Tc : tanins condensés, Poly huile : polyphénols huile.

VI.3. Le pouvoir réducteur du fer (FRAP)

Il existe une corrélation directe entre les activités antioxydantes et le pouvoir réducteur de certains extraits de plantes (Duh and Yen, 1997). La figure ci-dessous résume les activités radicalaires du fer des différents extraits phénoliques (phénols totaux, fraction acétate d’éthyle et butanolique des flavonoïdes, tanins) des pépins du Citrus aurantium et des standards (l’acide ascorbique et le BHA). δa fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes a montré la meilleure activité réductrice du fer suivie par la fraction butanolique des flavonoïdes et les tanins. Cependant ce pouvoir réducteur du fer reste inferieur à celui de l’acide ascorbique et le BHA.

Partie In vitro : Résultats et interprétations

AA 2,8 Poly FLVAc 2,4 FLVnB Tc BHA 2,0

1,6

1,2

Absorbance à 700 nm 700 à Absorbance 0,8

0,4

0,0

012345678 Concentration (mg/ml)

Figure 21 : Pouvoir de réduction du fer des différents extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium. AA : acide ascorbique, BHA : butylhydroxyanisole, Poly: polyphénols, FLVAc : flavonoïdes phase acétate d’éthyle, FδVnB : flavonoïdes phase butanolique, Tc : tanins condensés.

Discussion

Partie in vitro : Discussion

«Que ton aliment soit ta première médecine» conseillait Hippocrate il y a vingt cinq siècles. δ’utilisation des aliments dans le cadre de la médecine et de la prévention « santé » remonte ainsi à la plus haute antiquité (Gay, 2009). Le retour au « naturel » connaît un fort engouement depuis quelques années et se traduit au quotidien par une modification de nos comportements vis-à-vis de ce que nous consommons. Ce phénomène touche effectivement un grand nombre de domaines parmi lesquels l’agroalimentaire, la cosmétique, la pharmacie et la santé (Rolet, 2012).

De nos jours, le défi alimentaire n’est plus seulement d’ordre quantitatif mais aussi d’ordre qualitatif. En effet, les gens se soucient plus de leur santé. Nous ne sommes plus de l’époque « je mange pour survivre » mais d’une époque « je mange pour vivre plus et vivre bien ». Ce qui a conduit à concevoir de nouveaux aliments, plus sain qui réduisent le risque de plusieurs maladies chroniques. C’est dans cette perspective que les aliments fonctionnels sont apparus. Les aliments fonctionnels contiennent des ingrédients qui confèrent des avantages au-delà de leur valeur nutritionnelle, améliorant ainsi la fonction du corps. Il s’agit des minéraux, des vitamines et des acides gras spécifiques, des fibres alimentaires, des substances phytochimiques, des antioxydants ou des probiotiques (Datsis et al., 2010; Kaur and Das, 2011).

Les plantes et leurs constituants ont une position clé dans la progression des études modernes et des connaissances sur l'activité biologique ou les substances actives. Les espèces végétales sont des sources importantes d’aliments, de médicaments et de produits de santé, leurs composés bioactifs sont des produits de leur métabolisme (Gurib-Fakim, 2006). Les plantes synthétisent de nombreux composés appelés métabolites primaires qui sont indispensables à leur existence. Ceux-ci englobent les protéines, les lipides et les hydrates de carbone qui servent à la subsistance et à la reproduction, non seulement de la plante elle- même mais encore des animaux qui s'en nourrissent. De plus, les plantes synthétisent une autre gamme de composés appelés métabolites secondaires dont la fonction est loin de faire l'unanimité. Ces composés requièrent une importance croissante, notamment pour leurs effets bénéfiques sur la santé. En effet, leur rôle d’antioxydants naturels suscite de plus en plus d’intérêt pour la prévention du cancer et le traitement des maladies cardiovasculaires et inflammatoires (Awika and Rooney, 2004).

Partie in vitro : Discussion

La plupart des enquêtes épidémiologiques qui ont analysé les facteurs alimentaires impliqués dans la prévention de nombreuses pathologies, ont mis en évidence le rôle important des fruits et légumes. La valeur alimentaire, diététique et thérapeutique des fruits est unanimement acceptée. Ils sont souvent considérés comme des « aliments fonctionnels » grâce au contenu riche en divers micronutriments tels que les composés phénoliques (reconnus notamment pour leur fort pouvoir antioxydant), les minéraux, les vitamines etc (Grigoraş, β01β). En effet, depuis une quinzaine d'années, chercheurs et industriels de l'agro-alimentaire s'intéressent de plus en plus à une catégorie d'antioxydants, les polyphénols. La reconnaissance des propriétés antioxydantes de ces composés, leur abondance dans l'alimentation et leur rôle probable dans la prévention des maladies associées à un stress oxydant sont les principales raisons de cet engouement (Achat, 2013).

Récemment des études ont montré que les sous-produits des agrumes pourraient être une source d'antioxydants naturels.(Barreca et al., 2011; Ramful et al., 2011; de Moraes Barros et al., 2012).

De ce fait, cette présente étude tente de mettre en évidence des produits naturels présentant un potentiel prometteur dans le développement d’aliments de santé pour une application comme antioxydants à partir de différents extraits phénoliques des pépins de l’orange amère (Citrus aurantium), considérés comme des sous produits peu valorisés.

Nous avons d’abord étudié la composition chimique des pépins du Citrus aurantium ainsi que l’huile extraite à partir de ces pépins et évalué ensuite l’activité antioxydante des extraits phénoliques. δ’analyse du taux d’humidité au niveau des graines du Citrus aurantium, qui reste un indice très important nous informons sur la qualité de notre échantillon, a montré une faible proportion estimée à 6,52 %, et à partir de cette valeur nous avons déterminé le pourcentage en matière sèche (εS) qui s’est révélé important de 93,48 %. δes graines sont connues par leur richesse en gras et leur pauvreté en eau, c’est une relation inversement proportionnelle entre ces deux paramètres ce qui explique les faibles teneurs en humidité. Nos résultats sont légèrement différents de ceux trouvé par Waheed et al., le taux d’humidité trouvé dans les pépins de la bigarade pakistanaise est de 8,8%, cela est probablement lié au climat de chaque plante (Waheed et al., 2009).

Partie in vitro : Discussion

Afin de connaître l’activité d’une plante, il faut déterminer et identifier ses composants chimiques, précisément ses métabolites secondaires. δ’apparition d’une coloration, précipitation ou encore une floculation par l’intermédiaire de certains réactifs spécifiques présentent une réaction positive et affirment la présence de certaines familles de composés chimiques. Les résultats du screening phytochimique effectué sur les pépins du Citrus aurantium ont mis en évidence la forte présence en stérols et en triterpènes dans les extraits alcoolique et éthérique et à un degré moindre si ce n’est absent dans l’extrait aqueux. La présence des stérols dans nos extraits corrobore avec les travaux de Waheed et al., (2009) qui ont trouvé des quantités assez importantes dans les pépins du Citrus aurantium par rapport aux Citrus sinensis (orange douce) et Citrus paradisi (pamplemousse). La présence des triterpènes dans nos graines est probablement liée à la résine qui les couvre et c’est eux qui confèrent aux pépins leurs odeurs, puisqu’ils sont considérés comme des composés aromatiques. δes tanins condensés et les flavonoïdes sont concentrés dans l’extrait alcoolique mais complètement absents dans l’extrait ethérique et aqueux, alors que les alcaloïdes sont présents dans l’extrait aqueux et non pas dans les autres extraits. En revanche, on assiste à une absence des saponosides, des tanins hydrolysables, sucres réducteurs, amidon, anthraquinones, quinones libres et coumarines dans tous les extraits. Nos résultats sont en accords avec ceux de Kim et al., et Hayat et al., qui confirment que les sous produits des oranges sont une source de composés bioactifs. Ils contiennent des antioxydants naturels tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes (Kim et al., 2008; Hayat et al., 2010) .

Les résultats de ces tests phytochimiques sont préliminaires et qualitatifs, ils peuvent nous renseigner sur les phytoconstituants majoritaires présents dans les pépins de l’orange amère. δ’usage des solvants ou mélange des solvants de polarité différente semble influencer sur la quantité et la qualité du composé extrait. Ainsi, l’éthanol un solvant polaire, permet l’extraction de la plupart des métabolites secondaires présents dans les pépins. En outre, la composition chimique de l'ensemble des agrumes et de leurs sous-produits peut varier en fonction de l’écologie et du stade de maturation de ces derniers (Sun et al., 2005; Huang et al., 2007).

Partie in vitro : Discussion

δ’évaluation des teneurs en métabolites primaires de nos pépins a montré de faibles teneurs en protéines (5,17 %), des valeurs encore plus petites ou plus grandes ont déjà été proposées pour d’autres espèces d’oranges d’origine pakistanaise tels que les pamplemousses (3,90%) et les mandarines (9,56%) (Anwar et al., 2008), Concernant le taux de sucre, les résultats montrent que les pépins du Citrus aurantium contiennent un faible taux de 2,05% très proche à celui obtenu pour les graines du Citrus aurantium égyptien (2,61%) (El-Adawy et al., 1999). Les teneurs en fibres (0,89%) présents dans notre échantillon sont largement inferieurs par rapport à ceux trouvés dans le Citrus pakistanais (Anwar et al., 2008). Les teneurs en cendres trouvés dans les pépins sont de 2,73%. Ce résultat est en accord avec ceux obtenus par Habib et al., et El-Adway et al., qui ont rapporté des teneurs en cendres des pépins d'agrumes égyptiens situées entre 2,2-3,5%.(Habib et al., 1986; El-Adawy et al., 1999)

Concernant les teneurs en lipides, les résultats montrent que les pépins du Citrus aurantium sont fortement riches en huile (38,21%), ces résultats sont en accord avec ceux rapportées pour les pépins du Citrus aurantium Nigerian (32,4%) (Ajewole and Adeyeye, 1993), les pépins des agrumes tunisiennes (orange sanguine, orange amère et bergamote) (26.1- 36.1%) (Saidani et al., 2004) et les pépins des agrumes égyptiens (Citron, orange et mandarine) (38,9 - 42,6%) (Rossell and Pritchard, 1991). Cependant, le rendement en huile des pépins de l’orange amère pakistanais est inferieur à celui trouvé dans notre échantillon. (Saidani et al., 2004). En effet, les teneurs des graines en huile ainsi que sa composition en acides gras peuvent varier en fonction de l'origine géographique et de la zone de production de l'huile (climat, latitude) (Mohamed Mousa et al., 1996; Abaza et al., 2002). Notre huile à été extraite dans un extracteur de type Soxhlet à l’aide d’un solvant organique (le n-hexane) à partir des pépins du Citrus aurantium. δ’intérêt principal des analyses des indices physico-chimiques réside dans l’identification de l’huile à travers ses propriétés physico-chimiques. δes résultats de la détermination des indices de densité, d’acide, de réfraction et de saponification de notre huile donnent des valeurs estimées à 0,926 ; 1,121 ; 1,467 et 191,52 respectivement. Ces résultats se rapprochent de ceux obtenus sur l’huile de pépins des agrumes du Pakistan qui ont rapporté des valeurs de l’indice de densité (0,9β0-0,941), d’acide (0,50-2,18), de réfraction (1,464-1,467) et de saponification (180,90-198,85) (Anwar et al., 2008). Ainsi que ceux obtenus par les pépins des agrumes égyptiens pour l’indice de réfraction (1,465-1,468) et de densité (0,913-0,933) (Habib et al., 1986).

Partie in vitro : Discussion

Cependant, les valeurs de l'indice de saponification (191,52) déterminées dans la présente analyse ont été plus élevées que ceux déclarés par les pépins de Citrus aurantium Nigérien (Ajewole and Adeyeye, 1993). δ’indice de densité est considéré comme un critère physique qui permet le contrôle de la pureté de l’huile extraite. Notre résultat se rapproche de ceux de l’huile de lin, mais reste au dessus de celle de l’huile d’olive (Firestone, 1999). δ’indice de réfraction est également un critère important de la pureté de l’huile, il est proportionnel au poids moléculaire des acides gras. Il augmente avec la longueur de la chaîne et avec l’augmentation de l’insaturation. δ’indice de réfraction (1,4671) déterminé dans notre analyse corrobore avec celui rapporté pour les huiles de graines de tournesol (1,467-1,469), du soja (1,467 à 1,470) (Rossell and Pritchard, 1991), et de l’huile d’argan (1,46γ-1,472) fixé par la norme marocaine NM.080.5.090 (Marocaine, 2003). δ’indice d’acide d’un corps gras est considéré comme un excellent moyen pour déterminer son degré d’altération. Il s’agit d’un critère chimique de fraîcheur et de pureté de l’huile (Olle¨, 2002). δa détermination de l’indice d’acide de l’huile de pépins des bigarades a donné des valeurs ( 1,121) identiques à ceux des pépins de l’huile de mandarine égyptienne (El- Adawy et al., 1999) ; mais inférieurs à ceux trouvés pour l’huile des pépins de l'orange maltaise tunisienne (Citrus sinensis) (2,74) (El Mannoubi et al., 2010). δ’indice de saponification renseigne sur la longueur de la chaîne carbonée des acides gras qui constituent les triglycérides (fraction majoritaire d’un corps gras), il est d’autant plus élevé que la chaîne des acides gras est courte. δ’indice de saponification de l’huile étudiée (191,5β) correspondant à celui de l’huile de palme (190-β09), l’huile d’olive (184-196), l’huile de tournesol (188-194) et l’huile de soja (189-195) (Firestone, 1999). Il ressort de l’analyse des indices physico-chimiques de l’huile de pépins de l’orange amère (Citrus aurantium) que c’est une huile pure et riche en acides gras insaturés de chaîne moyenne C18, ce qui va être confirmé plus tard par l’analyse chromatographique des acides gras constitutifs de cette huile. En effet, δa teneur en acides gras de l’huile est un bon indicateur de sa qualité nutritionnelle (Aubret and Mireille, 2003) (Rahmani, 2005). Notre analyse montre que les acides gras de l’huile de pépins du C. aurantium étudiée sont principalement des acides gras insaturés (AGI) présentant 65,99%, de type oléique et linoléique avec des taux respectifs de 27,70 % et 39,30 %. Concernant les acides gras saturés (AGS), l’analyse révèle la prédominance de l’acide palmitique (β6,85%) et stéarique (7,15%).

Partie in vitro : Discussion

Cette distribution est comparable avec celle reportée pour l’huile de pépins du C. aurantium nigérienne à l’exception de l’acide stéarique qui reste inferieur (γ%). δes teneurs de l’acide oléique (γ0,87%) et de l’acide linoléique (ββ,0γ%) reportées par l’huile de pépins du C. aurantium pakistanaise (Waheed et al., 2009) sont différentes de celles trouvées dans la présente étude. Ces résultats peuvent être expliqués par l’origine géographique différente de ces Citrus qui peut influencer la composition en acides gras de l’huile. δ’acide palmitique est l’acide gras saturé majoritaire présent dans notre huile (26,85%). Si la majorité des études ont montré un effet hypercholestérolémiant de cet acide gras (Hunter et al., 2001), d’autres ont démontré une relative neutralité (Hayes and Khosla, 1992; Khosla and Hayes, 1996). En émettent l’hypothèse d’un seuil, ils postulent qu’au-delà de 400 mg de cholestérol alimentaire ingéré par jour, l’acide palmitique augmenterait le taux de δDδ- cholestérol (de manière qui peut-être supérieure à l’acide myristique), tandis qu’il serait plutôt neutre en deçà de cette valeur (Hayes and Khosla, 1992; Khosla and Hayes, 1996). On constate que l’huile de pépins du C. aurantium est constituée essentiellement par des acides gras de chaîne moyenne C16 et C18 ce qui confère à l’huile une viscosité et une bonne fluidité. δ’acide oléique est le principal AGεI présent dans notre huile, c’est aussi l’acide gras majoritaire de nombreuses huiles végétales, en particulier des huiles d’olive et de colza. La teneur élevée en acide oléique la rend particulièrement intéressante dans la régulation du taux de cholestérol (Hunter et al., 2000). En outre, l’huile du C. aurantium est riche en acide linoléique (C18:2) précurseur de la série oméga-6 qui se trouve essentiellement dans les graines et les huiles de tournesol et de soja, jouant le rôle de précurseur pour la synthèse de plusieurs biomolécules. En effet, l’acide linoléique est métabolisé par désaturations et élongations successives en un acide gras à plus longue chaîne, l’acide arachidonique (β0 :4n-6), qui peut être également apporté directement par l’alimentation par la consommation de produits animaux (oeuf, viande) qui auront eux- mêmes absorbés le précurseur (Lavialle and Layé, 2010, El Mannoubi et al., 2010). δ’absence de l’acide érucique (Cββ:1) fait de l’huile de Citrus une huile comestible non toxique. Du fait de sa richesse en acides gras insaturés, l’huile de Citrus peut être sujette à l’oxydation. δa grande stabilité des huiles végétales, dans les conditions d’oxydation, est due à la présence d’un taux élevé d’antioxydants naturels dont les plus importants sont les tocophérols. Les tocophérols protègent contre l’oxydation naturelle des acides gras, en particulier les acides gras polyinsaturés (AGPI) (Sebei et al., 2007).

Partie in vitro : Discussion

En plus, les vitamines sont des éléments importants dans le fonctionnement correct de notre organisme. La carence en vitamine E peut causer des maladies dégénératives sévères (telles que l'ataxie, dégénérescence musculaire dystrophique de Duchenne et l’infertilité) (Aggarwal et al., 2010). δa détermination de la teneur en vitamine E dans l’huile de pépins du C. aurantium sous la forme α-tocophérol a donné une concentration estimée à 194,25 µg/ml. Cette dernière est largement supérieure à celle trouvée pour l’huile de tournesol (1β,7 µg/ml) et l’huile d’olive (25,99 µg/ml) (Didi et al., 2014).

Il est maintenant bien établi qu'une faible consommation d'aliments gras et une forte consommation d’aliments d'origine végétale aident à maintenir un bon état de santé. En effet, il existe une association entre un régime alimentaire riche en fruits et légumes et un risque réduit de certaines maladies mortelles telles que les maladies cardiovasculaires et le cancer (Parr and Bolwell, 2000). D’autre part, de nombreux métabolites secondaires phénoliques présents dans les aliments d'origine végétale exercent des effets bénéfiques dans la prévention de ces maladies dégénératives (Benavente-Garcia and Castillo, 2008; Del Rio et al., 2010). D’une manière générale, ces métabolites secondaires, considérés comme les composés biactifs des plantes, peuvent être identifiés et caractérisés à partir d'extraits de racines, tiges, écorce, feuilles, fleurs, fruits et pépins (Bernhoft, 2010).

Dans la section suivante, notre attention sera accordée aux composés phénoliques extraits des pépins de l’orange amère, qui représentent l’un des principales classes des substances phytochimiques reconnus comme ingrédients importants dans les aliments fonctionnels (da Silva et al., 2016). δ’extraction des polyphénols se fait grâce à plusieurs solvants ou à des mélanges de solvant/eau. Le mélange acétone/eau et méthanol ont été choisis pour la réalisation des extractions. Ce choix est basé sur les résultats des travaux antérieurs qui ont rapporté que l’acétone aqueuse, et le méthanol aqueux, avec des proportions entre 50% et 70% (v/v), sont les solvants les plus utilisés et les plus efficaces pour l’extraction des polyphénols (Bok et al., 2000; Siddhuraju and Becker, 2003; Mussatto et al., 2011). L’extrait phénolique des pépins étudiés représente le rendement le plus élevé (22% par rapport au poids total), suivi par la fraction n-butanol des flavonoïdes (5,4%) puis l’extrait tannique (1%) et enfin la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes (0,4%).Il est difficile de comparer ces résultats avec ceux de la bibliographie, car le rendement n’est qu’une grandeur

Partie in vitro : Discussion relative et semble être lié aux propriétés génétiques des plantes, à l’origine géographique, à la date de récolte, et surtout au degré de maturité (Ghalem et al., 2014). Afin de caractériser les extraits préparés à partir des pépins, un dosage des polyphénols totaux, des flavonoïdes et des tanins a été effectué. La teneur en polyphénols totaux des pépins extraites de l’orange amère de notre région est estimée à 2,126±0,0018 mg AGE /g MS, légèrement supérieure à celle des composés phénoliques extraits des pépins du Citrus aurantium tunisien (1,35 mg GAE /g MS) (Moulehi et al., 2012). En fait, peu de travaux concernant les teneurs en composés phénoliques des pépins du Citrus aurantium ont été réalisés. Cependant, d’autres études sur les écorces et les feuilles de la bigarade algérienne ont été réalisées, ces derniers ont montré des valeurs largement supérieur que celles des pépins (31,62±0,88 mg GAE /g MS, 44,41±0,49 mg GAE /g MS respectivement) (Lagha- Benamrouche and Madani, 2013). Jung et al., rapportent que les espèces d’agrumes notamment Citrus aurantium contiennent une large gamme d’ingrédients actifs tels que les limonoïdes et les flavonoïdes (Jung et al., 2006). Ces derniers peuvent présenter diverses activités biologiques comme antioxydant, anti- inflammatoire, anti-athérosclérose et anti-cancérigène (Aubret and Mireille, 2003, Kitts, 2005, Aggarwal et al., 2010) à travers une variété de mécanismes (Manthey and Grohmann, 2001; Xiao et al., 2011). En effet, plusieurs études ont démontré que les flavonoïdes et les limonoïdes des agrumes et de leurs jus pourraient avoir un effet hypocholestérolémiant (Bok et al., 1999, Kurowska et al., 2000; Boshtam et al., 2010). En outre, des études récentes ont indiqué que les flavonoïdes empêcher la prolifération de diverses lignées de cellules cancéreuses et modifier le comportement du cycle cellulaire (Lee et al., 2012, Ding et al., 2012). Les teneurs en flavonoïdes des deux fractions acétate d’éthyle et n-butanol des pépins étudiés sont faibles estimées à 0,033±0,004 mg CE/gMS et 0,043±0,005 mg CE/g MS respectivement par rapport à ceux trouvés dans les pépins tunisiens (1,31-1,50 mg CE/g MS) (Moulehi et al., 2012). En fait, au cours de la procédure d’extraction, la qualité d’un extrait peut être influencée par plusieurs paramètres, à savoir la partie de la plante utilisée, la polarité du solvant, ainsi que le temps, la température et le mode d’extraction (Tiwari et al., 2011).

Partie in vitro : Discussion

Par ailleurs, Moulehi et al., rapportent que sur la base de l'analyse RP-HPLC des flavonoïdes des pépins matures du Citrus aurantium dix composés ont été identifiés (l’épigallocatéchine, la naringine, l’hespéridine, la néohespéridine, l’apigénine, la quercétine, le résorcinol, la catéchine, la rutine et le kaemphérol), et caractérisés par la prédominance des glycosides de flavanone (la naringine, l'hespéridine et la néohespéridine) (Moulehi et al., 2012). La naringine, l'hespéridine et la néohespéridine sont connus pour leur accumulation dans les espèces de Citrus. La naringine et la néohespéridine sont des néohesperidosides responsables du gout amère de la plante (Peterson et al., 2006). En plus, δ’extrait des flavonoïdes des pépins de l’orange amère tunisien contient aussi des teneurs appréciables de flavanols (catéchine et épigallocatéchine) et flavonols (quercétine, rutine et kaempférol) (Moulehi et al., 2012). Concernant, les autres sous produits de l’orange amère algérien, Lagha-Benamrouche et al., ont trouvé que les teneurs des écorces et des feuilles en flavonoïdes totaux varient de 1,17-3,25 mg CE/g MS respectivement (Lagha- Benamrouche and Madani, 2013). Des études récentes montrent que les extraits des flavonoïdes obtenus à partir de l’écorce d’agrumes peuvent être utilisés dans le traitement de l'obésité en réduisant la synthèse des adipocytes et l'accumulation de lipides (Nakajima et al., 2016).

Notre analyse a montré la présence des tanins condensés et l’absence des tanins hydrolysables dans les pépins du C. aurantium, ce résultat a été confirmé par la présence d’une réaction positive et une coloration verte brune lors du screening phytochimique. δes teneurs en tanins condensés des pépins obtenues après extraction à l’acétone sont supérieures (0,3 ± 0,03 mg CE/g MS) comparées avec celles des flavonoïdes. En effet, plusieurs travaux ont montré que le mélange acétone/eau (70/30) était le solvant approprié à l’extraction de ces composés notamment les tanins condensés (Chavan et al., 2001, Macheix et al., 2005; Trabelsi et al., 2010). Les valeurs des tanins condensés de nos pépins sont en accord avec ceux trouvées dans l’orange amère tunisien (0.37 mg CE/g MS). Plusieurs observations, chez les humains comme chez les animaux de laboratoire suggèrent que les tanins exhibent un large spectre de propriétés pharmaceutiques, thérapeutiques et chimioprotectrices dues à leur propriété antiradicalaire (Tohge et al., 2005).

Partie in vitro : Discussion

En effet, les tanins protègent contre les toxicités induites par différents agents (hydrogène peroxyde, extraits contenus dans la fumés du tabac…), et contre l’hypercholestérolémie. Ils jouent aussi un rôle dans la prévention contre les deux formes de mort cellulaire connues, apoptose et nécrose, diminuant ainsi les dommages causés dans l’ADN (Ray et al., 1999).

Très peu de travaux ont été réalisés sur l’étude des propriétés antioxydantes des pépins de l’orange amère. Jusqu’à présent, il n’y a pas une méthode simple et universelle par laquelle l’activité antioxydante est évaluée qualitativement et quantitativement (Prior et al., 2005). Pour cette raison, nous avons utilisé trois techniques complémentaires (DPPH, FRAP et - carotène) qui permettent de mesurer la capacité de piégeage du radical libre DPPH, la puissance de réduction du fer et le pourcentage d’inhibition du blanchiment du β-carotène, respectivement, des différents extraits phénoliques des pépins du Citrus aurantium et de l’extrait phénolique de leur huile. Puisque le principal mécanisme d’action antioxydant des polyphénols des végétaux est le piégeage des radicaux libres, la méthode par le DPPH a été choisie pour évaluer l’activité antioxydante de nos extraits parce qu’elle est l’une des méthodes la plus simple, rapide et efficace à cause de la grande stabilité du radical (Bozin et al., 2008). Cette technique met en évidence la capacité des composé phénoliques à libérer un électron de leur groupe hydroxyle et piéger le radical DPPH en fonction des différentes concentrations (Maisuthisakul et al., 2007). Le pouvoir antioxydant de réduction ferrique (FRAP) mesure la capacité réductrice des antioxydants contre les effets oxydatifs des espèces réactives de l'oxygène. Ce dosage est basé sur la capacité des antioxydants à réduire la forme ferrique (Fe3+) à la forme ferreux (Fe2+). Par conséquent, la réduction peut être déterminée par mesure de la formation du bleu de Prusse de Perl à 700 nm (Chung et al., 2002; Gulçin et al., 2010).

δa méthode d’évaluation de l’activité antioxydante par la décoloration du -carotène est une méthode spectrophotométrique qui permet de suivre, à 470nm, la décoloration du - carotène (Moure et al., 2000). Cependant, le -carotène subit une décoloration rapide en l’absence d’un antioxydant qui aboutit à une réduction de l’absorbance de la solution d’essai avec le temps de réaction (Khadri et al., 2008), cela est dû à l’acide linoléique présent dans le mélange réactionnel qui produit des hydroperoxydes comme radicaux libres durant l’incubation à 50°C (Kubola and Siriamornpun, 2008), ces derniers attaquent les insaturations

Partie in vitro : Discussion du -carotène, et en conséquence, la couleur caractéristique de ce dernier (orange) disparaît (Khadri et al., 2008). δa présence d’antioxydants dans le milieu comme ceux présents dans nos extraits réduit l’oxydation du -carotène par les hydroperoxydes. Ces derniers qui sont formés dans le système seront donc neutralisés par les antioxydants (Dib et al., 2013).

δa capacité antioxydante d’un composé est d’autant plus élevé que son IC50 est petite. En effet, l’extrait tannique des pépins du Citrus aurantium révèle une forte activité à inhiber l’oxydation du -carotène (IC50= 0,20 ±0,002 mg/ml) par rapport aux autres extraits. Par contre, la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes par rapport aux autres extraits possède la meilleure activité de piégeage du radical DPPH (IC50= 5,83±0,12 mg/ml), une activité élevée

à inhiber l’oxydation du -carotène (IC50= 0,33±0,01mg/ml) ainsi qu’une capacité importante de réduction de fer mais reste inférieur à celle de l’acide ascorbique et du BHA (antioxydants de référence). δ’extrait phénolique de l’huile extraite à partir des pépins du C. aurantium inhibe le blanchissement du -carotène à des différentes concentrations par le piégeage des radicaux libres, il présente une valeur d’IC50 égale à 1,18±0,009 mg/ ml par rapport à l’acide gallique et au BHA (0,43 ± 0,001 mg/ml- 0,044 ± 0,002 respectivement).

Dans notre étude, nous avons constaté que les extraits étudiés du C. aurantium exercent une activité antioxydante différente. En règle générale, une corrélation positive entre les composés phénoliques et l’activité antioxydante a été rapportée (Maisuthisakul et al., 2007), mais récemment il a été montré que l'activité antioxydante des extraits peut être liée à leur composition phénolique et dépend fortement de leurs structures (Kwee and Niemeyer, 2011). En effet, les travaux de Moulehi et al., sur les pépins de l’orange amère ont révélé que l'augmentation des activités antioxydantes des extraits polyphénoliques au cours de la maturation pourrait être liée à leurs teneurs élevées en kampférol, naringine et néohespéridine (Moulehi et al., 2012). En effet, il a été rapporté que la Néohespéridine et la naringine présentent la propriété antioxydante et antiradicalaire et offre une protection contre la peroxydation lipidique grâce à leur structure (Di Majo et al., 2005; Hamdan et al., 2014). En outre, kampférol pourrait participer aux activités antioxydantes de l'orange amère, car c’est un composé antioxydant puissant (JiGuo et al., 2009).

Partie in vitro : Discussion

Plusieurs auteurs attestent que la composition chimique et l'activité antioxydante de l'ensemble des fruits et des sous-produits d'agrumes peuvent varier en fonction du type de culture et du stade de maturation (Castillo et al., 1993; Sun et al., 2005; Huang et al., 2007).

En fonction de ces résultats, on constate que les pépins du C. aurantium renferment différents métabolites secondaires en particuliers, les flavonoïdes qui ont un effet antioxydant important. En outre, l’huile extraite à partir de ces pépins s’est révélée intéréssante de part sa richesse en acides gras insaturés, en tocophérols et en polyphénols. Ces composés confèrent à cette huile de très bonnes qualités permettant des applications cosmétiques et/ou des vertus diététiques pouvant intervenir dans la prévention de l’hypercholestérolémie. Par ailleurs, Ces résultats intéressants ne peuvent être confirmés que par des analyses biologiques in vivo.

PARTIE IN VIVO: Etude du pouvoir hypocholestérolémiant et antioxydant de l’huile de pépins du Citrus aurantium chez le rat « Wistar »

Matériel et Méthodes

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

I. Choix des animaux

Dans ce travail, nous avons utilisé des rats blancs (Rattus norvegicus) de souches Wistar de sexe mâle, provenant de l’institut Pasteur (Alger). Ils sont maintenus en conditions contrôlées (au niveau de l’animalerie du département de biologie, faculté des sciences de la nature et de la vie et sciences de la terre et de l’univers, université Abou Bekr Belkaïd de Tlemcen), température (β5 à γ0°C), taux d’humidité entre 60 et 70%, avec un rythme nycthéméral de 1β h. δes rats ont un accès libre à l’eau et sont nourris avec un régime commercial équilibré fabriqué par l’O.N.A.B (Office Nationale d’Aliment de Bétail unité Eδ ALF Ain-Fezza Tlemcen). δorsqu’ils atteignent l’âge de 10 semaines et un poids corporel de 200±10 g, ces animaux sont séparés en 4 groupes de 5 rats.

II. Préparation des régimes Ces quatre groupes de rats ont reçu pendant 4 semaines d’expérimentation quatre régimes alimentaires différents d’après le protocole de (Gorinstein et al., 2003): • Régime témoin : un lot constitué de 5 rats nourris au régime témoin à base d’huile de tournesol (NRT) ; • Régime expérimental : Ce régime a la même composition que le régime témoin sauf que l’huile de tournesol est remplacée par l’huile de pépins de bigarade (NRB) ; • Régime témoin supplémenté avec du cholestérol : un lot de 5 rats recevant un régime témoin à base d’huile de tournesol + 1% cholestérol (NRTC); • Régime expérimental supplémenté avec du cholestérol : lot de 5 rats consommant le régime expérimental à base d’huile de pépins de bigarade + 1% cholestérol (NRBC) La composition des différents régimes est donnée dans le Tableau 11.

III. Evolution du poids et de la glycémie δe poids corporel des rats ainsi que l’aliment ingéré sont mesurés quotidiennement, la glycémie hebdomadaire à partir de la veine caudale est mesurée à l’aide d’un glucomètre tout au long de l’expérimentation.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

Tableau 11 : Composition des régimes témoins et expérimentaux en pourcentage pondéraux et énergétiques.

Régime Régime Valeur Régime Valeur Régime Valeur Régime Valeur

NRT énergétique NRB énergétique NRTC énergétique NRBC énergétique

(%pondéral) (Kcal/100g) (%pondéral) (Kcal/100g) (%pondéral) (Kcal/100g) (%pondéral) (Kcal/100g) Constituants Caséine 15 60 15 60 15 60 15 60 Amidon 69,3 277,2 69,3 277,2 68,3 273,2 68,3 273,2 Huile de 10 90 0 0 10 90 0 - tournesol Huile de pépins de 0 - 10 90 0 - 10 90 bigarade Cholestérol 0 - 0 - 1 9 1 9 Cellulose 1 - 1 - 1 - 1 - Vitamines 1 - 1 - 1 - 1 - Minéraux 3,7 - 3,7 - 3,7 - 3,7 - Total 100 427,2 100 427,2 100 432,2 100 432,2

-Composition en minéraux (g/100 g poids sec): Ca2+,4; K+, 2,4; Na+, 1,6; Mg2+, 0,4 ; Fe2+, 0,12; éléments traces: manganèse, 0,032; cuivre, 0,05; zinc, 0,018. -Composition en Vitamine (mg/kg poids sec): rétinol, 1,8; cholicalciférol, 0,019; thiamine, 6; riboflavine, 4,5; acide pantothénique, 21; inositol, 5; acide ascorbique, 240; L-tocophérol, 51; acide nicotinique, 30; acide folique, 1,5; biotine, 0,09.

IV. Sacrifices et prélèvements de sang Après un mois de régime, les rats des différents lots sont anesthésiés au chloral

(C2H3Cl3O2) à 10%, à raison de 0,3 ml/100 g du poids corporel, après un jeun de 12h. δe sang est prélevé par ponction dans l’aorte après incision abdominale. Une quantité du sang prélevé est récupérée dans des tubes à EDTA et l’autre partie est recueillie dans des tubes secs. Les échantillons prélevés sur tubes EDTA sont centrifugés à 3000 tr/min pendant 15min. Le plasma est prélevé pour le dosage des paramètres biochimiques et du statut oxydant/antioxydant. Les érythrocytes restants sont lavés avec de l’eau physiologique trois fois de suite, puis sont lysés par addition de l’eau distillée glacée et incubation pendant 15 min dans la glace. Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 5000 tr/min pendant 5 min. Le lysat est ensuite récupéré afin de doser les marqueurs érythrocytaires du statut oxydant/antioxydant.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

δe foie est soigneusement prélevé, rincé avec du NaCl à 9‰, puis pesé et conservé à -20°C, en vue des dosages lipidiques.

V. Analyses biochimiques V.1. Détermination des teneurs en protéines totales Les protéines totales plasmatiques sont dosées par la méthode colorimétrique BCA, basé sur l'acide bicinchonique (Smith et al., 1985). Les protéines réduisent l'ion cuivrique Cu(II) en Cu(I) en milieu alcalin. L'acide bicinchoninique est un réactif colorigène hautement spécifique pour le Cu(I), formant un complexe pourpre. δ’absorption est mesurée à 540nm et elle est proportionnelle à la concentration de protéines.

V.2. Dosage de l’urée δ’urée plasmatique est dosée par une méthode colorimétrique basée sur l’utilisation du diacetylmonooxine et des ions Fe3+ (Kit PROCHIεA). δ’urée réagit avec le diacetylmonooxine en présence d’ions Fe3+ et d’un réducteur, pour donner un complexe coloré en rose. δ’intensité de la coloration obtenue est proportionnelle à la quantité d’urée présente dans l’échantillon. δa lecture se fait à une longueur d’onde de 5β5 nm (Berthelot, 1859).

V.3. Dosage de la créatinine La créatinine plasmatique est dosée par une méthode colorimétrique basée sur la réaction de l’acide picrique avec la créatinine en milieu basique formant un complexe coloré en jaune orange (Murray, 1984). δ’intensité de la coloration est mesurée à une longueur d’onde de 5γ0 nm (Kit Prochima).

V.4. Dosage des paramètres lipidiques V.4.1. Dosage du cholestérol total Le cholestérol total est dosé par la méthode colorimétrique enzymatique La détermination du cholestérol dans le sang se fait par la méthode colorimétrique enzymatique (Roeschlau et al., 1974) en utilisant le kit (Biomaghreb, Tunisie). Les esters de cholestérol sont hydrolysés par le cholestérol estérase en cholestérol libre et acide gras ; le cholestérol libre ainsi produit et celui préexistant sont oxydés par le cholestérol oxydase en 4-cholesténone et peroxyde d’hydrogène. Ce dernier en présence de peroxydase, oxyde le chromogène en un composé coloré rouge. δ’intensité de la coloration de la quinonimine, mesuré à 505 nm, est directement proportionnelle à la quantité de cholestérol présent dans l’échantillon.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

V.4.2. Dosage des triglycérides Les triglycérides sont dosés par une méthode colorimétrique enzymatique en utilisant le kit (Biomaghreb, Tunisie). δes triglycérides sont hydrolysés par l’action des lipases en acides gras et glycérol. Ce dernier, sous l’action du glycérol kinase, est transformé en glycérol-3-phosphate, puis il est oxydé en dihydroxyacétone phosphate et peroxyde d’hydrogène. Celui-ci, en présence de 4- aminoantipyrine et de 4- coropherol, avec l’action de la peroxydase, forme la quinone imine. La concentration en quinone imine, à 505 nm, est proportionnelle à la concentration totale en triglycérides présents dans l’échantillon.

V.4.3. Dosage des fractions lipoprotéiques Les chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité (VLDL) et de faible densité (δDδ) contenus dans l’échantillon (sérum) sont précipités par addition d’acide phosphotungstique en présence d’ions magnésium. δe surnagent obtenu après centrifugation contient les lipoprotéines de haute densité (HDL) dont le cholestérol est dosé par le réactif cholestérol enzymatique (Kit Biomaghreb, Tunisie). δes δDδ présentes dans l’échantillon, précipitent en présence de sulfate de polyvinyl. δa concentration en cholestérol LDL est calculée en faisant la différence entre les valeurs en cholestérol dans le sérum et dans le surnageant obtenues après centrifugation (Assmann et al., 1984) (Kit BioSystems S.A., Spain).

V.4.4. Détermination de la teneur en lipides totaux du foie Les lipides totaux du foie sont déterminés par la méthode de (Folch et al., 1957). Elle consiste à broyer 1g de tissu avec 4 ml de chloroforme et β ml de méthanol à l’aide d’un homogénéisateur (type thurax) pendant 2 min. Le mélange est filtré, ensuite on ajoute 4 ml du réactif de Folch, mélange chloroforme : méthanol (2:1, v:v), sur le résidu pour assurer l’extraction de la totalité des lipides. δe filtrat est transféré dans un tube à essai avec un ajout de 0,2 volume de solution de NaCl à 0,7 %. Après séparation de deux phases, la phase inférieure est récupérée, puis le solvant est évaporé par un évaporateur rotatif (par étuvage dans notre cas suite à la quantité minime des lipides), pour obtenir la masse des lipides. Le résultat est exprimé en pourcentage (%) de foie.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

V.4.5. Détermination de la composition plasmatique en acides gras δ’analyse se fait par chromatographie en phase gazeuse (CPG) après extraction des lipides. Cette dernière se fait à partir du plasma par un mélange méthanol/ chloroforme/ NaCL (2M) (1/1/0,9 ; v/v/v), selon la méthode de (Bligh and Dyer, 1959 ), décrite précédemment. Cette analyse a été effectuée à l’Université de Bourgogne, France.

VI. Evaluation du statut oxydant/ antioxydant VI.1. Détermination du taux des hydroperoxydes δes hydroperoxydes plasmatiques et érythrocytaires sont mesurés par l’oxydation d’ions ferriques utilisant le xylénol orange (Foxβ ; kit Peroxoquant méthanol-compatible formulation, Rockford, IL, USA) en conjugaison avec le ROOH réducteur spécifique de la triphenylphosphine (TPP), selon la méthode de (NOUROOZ-ZADEH et al., 1996). Cette méthode est basée sur une peroxydation rapide transformant le Fe2+ en Fe3+ en milieu acide. Les ions Fe3+ en présence du xylénol orange [(O-cresolsulfonphtalein-γ’,γ’’-bis (methyliminodiacetic acid sodium)], forment un complexe Fe3+–xylénol orange. δe taux d’hydroperoxydes plasmatique et érythrocytaire correspond à la différence entre l’absorbance de l’échantillon et l’absorbance du blanc.

VI.2. Dosage du malondialdéhyde (MDA) Le malondialdehyde (MDA) est le marqueur le plus utilisé en peroxydation lipidique. Ce dosage est réalisé selon la méthode de Nourooz-Zadeh et al. par un traitement acide à chaud, grâce à l’utilisation de l’acide thiobarbiturique (TBA) à 0.67 % (NOUROOZ-ZADEH et al., 1996). Le TBA réagit avec les aldéhydes pour former un produit de condensation chromogénique constitué en deux molécules de TBA et une molécule de εDA. δ’absorption intense de ce chromogène se fait à 532 nm. La concentration en MDA plasmatique (ou érythrocytaire) donnée par μmol/l, est calculée en utilisant une courbe étalon de εDA ou le coefficient 5 -1 -1 d’extinction du complexe MDA - TBA (E= 1.56 10 mol .L.cm à 532 nm).

IV.3. Oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques. δ’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques, induite par les métaux (cuivre), est déterminée par le suivi au cours du temps de la formation des diènes conjugués selon la méthode d’Esterbauer et al. (Esterbauer et al., 1989).

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

δes diènes sont considérés comme les produits primaires de l’oxydation lipidique et présentent une absorption dans l’ultraviolet à βγ4 nm. δ’addition du CuSO4 (100με) au plasma provoque l’oxydation des lipoprotéines plasmatiques qui se traduit in vitro par l’augmentation progressive de la densité optique à βγ4 nm, après une phase de latence. Cette augmentation de l’absorbance marque la formation de plus en plus importante des diènes conjugués dont la concentration est estimée en utilisant le coefficient d’extinction ( =β9,50 mmol-1. L .cm-1; à βγ4 nm). δes variations de l’absorbance des diènes conjugués en fonction du temps permettent de tracer la courbe cinétique où trois phases consécutives sont déterminées : phase de latence, phase de propagation et phase de décomposition. A partir de cette courbe cinétique, plusieurs marqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques sont déterminés: - t(lag) min correspond à la durée de la phase de latence et marque le début de l’augmentation de la densité optique par rapport à la valeur initiale. δe t(lag) permet de d’estimer la résistance des lipoprotéines à l’oxydation in vitro. - Taux initial des diènes conjugués (μmol/l) - Taux maximum des diènes conjugués (μmol/l) - t(max) min correspond au temps nécessaire pour obtenir l’oxydation maximale. Il marque la fin de la phase de propagation et le début de la phase de décomposition. Il se calcule sur la courbe cinétique en projetant la valeur de densité optique maximale sur l’axe des X (temps exprimé en minutes).

IV.4. Dosage des vitamines A et E δes vitamines A (rétinol) et E (α- tocophérol) sont analysées sur le plasma des différents groupes de rats par chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inverse selon la méthode de Zaman et al. comme il a été décris précédemment (Zaman et al., 1993). Le dosage des vitamines A et E ont été réalisés par HPLC à l’université de Bourgogne, France. Le chromatographe équipé d'un détecteur (à barettes de diodes) à absorption UV permet de détecter simultanément le pic correspondant à la vitamine E à 292 nm, celui de la vitamine A à 325 nm.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

IV.5. Dosage de la vitamine C La vitamine C plasmatique est dosée selon la méthode de (Jagota and Dani, 1982) utilisant le réactif de Folin et une gamme étalon d’acide ascorbique. Après précipitation des protéines plasmatiques par l’acide trichloriacétique (10%) et centrifugation, le réactif de Folin est ajouté au surnageant. La vitamine C présente dans le surnageant réduit le réactif de Folin donnant une coloration jaune. δ’intensité de la coloration obtenue est proportionnelle à la concentration en vitamine C à une longueur d'onde de 769 nm présente dans l’échantillon. δa concentration est déterminée à partir de courbe étalon obtenu grâce à une solution d’acide ascorbique.

VI.6. Dosage du Glutathion réduit Le taux du glutathion réduit (GSH) est mesuré sur le lysat érythrocytaire chez les mères et leurs nouveau-nés et au niveau du placenta. Le dosage est réalisé par le réactif d’Ellman (DTNB) (Ellman, 1959). La réaction consiste à couper la molécule d’acide 5,5 dithiodis-2- nitrobenzoïque (DTNB) par le GSH, ce qui libère l’acide thionitrobenzoique (TNB). Ce dernier à pH (8-9) alcalin présente une absorbance à 412 nm avec un coefficient d’extinction -1 -1 égal à 13,6 mM .cm .

VI.7. Détermination du pouvoir antioxydant total du plasma (ORAC)

δe pouvoir antioxydant total du plasma, c’est à dire sa capacité à absorber les radicaux oxygènes libres (ORAC: Oxygen Radical Absorbance Capacity) est estimé par la capacité des hématies à résister à l'hémolyse induite par les radicaux libres in vitro en présence du plasma, selon la méthode de Blache et Prost (Blache and Prost, 1992). Cette méthode est basée en fonction du temps de l'hémolyse des GR (globules rouges) induite par un générateur de RL (radicaux libres). Il s'agit de soumettre une suspension d'hématies à une agression radicalaire dans des conditions strictement contrôlées, et standardisées. Tous les systèmes enzymatiques et chimiques de l'échantillon se mobilisent pour protéger l'intégrité des cellules jusqu'a leur lyse. Ainsi, l'hémolyse se fait graduellement en fonction de temps. La mesure de l'augmentation de l'absorbance à 450 nm toutes les 5 minutes permet de suivre la cinétique de l'hémolyse. L'addition d'une quantité déterminée d'un antioxydant, vitamine E (Trolox) ou vitamine C (acide ascorbique) permet de neutraliser une quantité de RL dans le milieu d'incubation

Partie in vivo : Matériel et Méthodes et peuvent donc dévier et un décalage de la courbe est observé en fonction du temps, le plasma contient plusieurs systèmes de défenses antioxydants et permet aussi la protection des GR contre l'attaque radicalaire. En présence du plasma, un décalage de la courbe de la cinétique d'hémolyse des GR est aussi observé. Le pouvoir antioxydant total du plasma représente donc la capacité du plasma à neutraliser des RL générés in vitro (ORAC) et donc à freiner l'hémolyse des GR attaqués, donc indirectement ralentir l'augmentation de la densité optique à 450 nm. Afin de permettre une quantification de ce pouvoir antioxydant total, l'utilisation des antioxydants purifiés (Trolox, vit C) à concentration connues permet l'étalonnage. Ainsi, une unité ORAC correspond à la surface de protection donnée par 1 με du Trolox ou β με de la vitamine C (concentration finale). δ’ORAC de chaque échantillon de plasma est calculé en mesurant la surface S de protection nette sous les courbes cinétiques de l'hémolyse.

Ainsi : ORAC échantillon = (S blanc – S échantillon) / (S blanc – S antiox) Où S = Aire calculée sous la courbe cinétique de l'hémolyse ; Antiox= Trolox (1 με) ou Vitamine (β με).

VI.8. Détermination de l’activité des enzymes antioxydantes VI.8.1. Dosage de l’activité de la catalase plasmatique et érythrocytaire (CAT; EC 1.11.1.6) Cette activité est mesurée par analyse spectrophotométrique du taux de la composition du peroxyde d’hydrogène (Aebi, 1974). En présence de la catalase, la décomposition du peroxyde d’hydrogène conduit à une diminution de l’absorption de la solution de H2O2 en fonction du temps. La lecture se fait à 420 nm. Les concentrations du H2O2 restant sont déterminées à partir d’une gamme étalon de H2O2 avec le tampon phosphate et le réactif

TiOSO4 de façon à obtenir dans le milieu réactionnel des concentrations de 0.5 à 2 mmol/l.

δe calcul d’une unité d’activité enzymatique est : A= log A1 – log A2.

A1 est la concentration de H2O2 de départ.

A2 est la concentration de H2O2 après incubation (au bout de 5 min). δ’activité spécifique est exprimée en U/g Hb ou en U/ml.

Partie in vivo : Matériel et Méthodes

VI.8.2. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase plasmatique et érythrocytaire (SOD ; EC 1.15.1.1) δ’activité de cette enzyme est mesurée selon la méthode d’Elstner et al. (Elstner et al., 1983). Le principe est basé sur la réaction chimique qui génère l’ion superoxyde (O2-) à partir de l’oxygène moléculaire en présence d’EDTA, de εnCl2 et de mercaptoéthanol. δ’oxydation du NADPH est liée à la disponibilité des ions superoxyde dans le milieu. Dès que la SOD est ajoutée dans le milieu réactionnel, elle entraine l’inhibition de l’oxydation du NADPH. La lecture se fait à 540 nm, après incubation de 20 min. δa gamme d’activité est réalisée avec la SOD étalon.

VI.8.3. Dosage de l’activité de la glutathion réductase plasmatique (GSSG-Red ; EC 1.6.4.2) Cette activité enzymatique est déterminée par la mesure du taux de l’oxydation du NADPH en présence du glutathion oxydé (Goldberg, 1985). δ’activité de la glutathion réductase est déterminée en suivant l’oxydation du NADPH et donc par conséquent la disparition du NADPH du milieu réactionnel. Par action de la glutathion et en présence du NADPH, le glutathion oxydé GSSG est réduit en GSH. δa gamme d’activité est celle de la glutathion réductase (100 U/0.ββ ml) à partir des dilutions de ½ = 500 U/l à 1/64 = 15.63 U/l. δa lecture de la densité optique (qui régresse) se fait à γ40 nm tout les γ0 secs. δ’activité enzymatique est exprimée en unité. Une unité de l’activité de la glutathion réductase est définie comme le taux d’enzyme capable d’oxydé 1 mε de NADPH oxydé par min. δes dosages des vitamines A et E ainsi que l’activité des enzymes antioxydantes ont été réalisés à l’Université de Bourgogne, Dijon, France.

VII. Analyse statistique Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type. Après analyse de la variance, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats témoins et entre les deux groupes de rats obèses est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Tous les tests sont réalisés à l’aide du programme STATISTICA version 8.1 (STATSOFT). δes moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

Résultats et interprétations

Partie in vivo : Résultats et interprétations

I. Evolution du poids corporel et quantité d’aliment ingérée chez les différents lots de rats (Figure 22 et 23, Tableaux 13 et 14 en annexes)

Le poids corporel ne présente pas de variation significative entre les différents lots de rats. Cependant, les rats consommant le régime enrichi en cholestérol ont un poids légèrement élevé que celui des rats nourris au régime témoin (NRT). Il en est de même pour les rats témoins consommant le régime enrichi en cholestérol (NRTC) par rapport aux rats consommant le régime enrichi en huile de bigarade (NRBC).

La consommation alimentaire quotidienne ne présente pas de différence significative entre les rats que ce soit témoins ou expérimentaux.

NRT NRB NRTC NRBC

300

200

100 Poids corporel (g) corporel Poids

0 J0 J7 J14 J21 J28

Figure 22 : Evolution du poids corporel (g) chez les différents lots de rats

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n= 5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime témoins +1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade +1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

10 Aliment Aliment ingéré(g) 5

0 Lots

Figure 23 : Quantité d’aliment ingérée (g) des rats témoins et expérimentaux.

II. Evolution de la glycémie chez les différents lots de rats (Figure 24, Tableau 15 en annexes)

Nous avons noté une diminution significative de la glycémie au cours de l’expérimentation chez les rats recevant un régime enrichi en huile de pépins de bigarade avec ou sans supplémentation de cholestérol. Cette différence est observée surtout à j14 et j28.

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

1.4 a 1.2 a a ab a a b 1.0 c

0.8

0.6

Glycémie (g/L) Glycémie 0.4

0.2

0.0 J0 J7 J14 J21 J28

Figure 24: Evolution de la glycémie (g/L) chez les différents lots de rats.

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n= 5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime + 1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade + 1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

III. Paramètres biochimiques plasmatiques chez les différents lots de rats

III.1. Teneurs plasmatiques en protéines, créatinine et en urée (Figures 25, Tableaux 16 en annexes)

Les teneurs plasmatiques en protéines, en créatinine et en urée ne montrent aucune différence significative chez les quatre groupes de rats étudiés, quelque soit le type de régime consommé.

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC 90 80 70 60 50 40 30 20

protéinestotales(mg/ml) 10 0 Lots

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3 Urée(g/L) 0.2

0.1

0 Lots

Créatinine (mg/L) 2

0 Lots

Figure 25: Teneurs plasmatiques en protéines, en créatinine et en urée chez les différents lots de rats.

Partie in vivo : Résultats et interprétations

III.2. Teneurs plasmatiques en triglycérides, cholestérol, et des lipoprotéines chez les différents lots de rats (Figues 26 et 27, Tableaux 17 en annexes)

Les teneurs plasmatiques en triglycérides sont significativement augmentées chez les rats nourris au régime supplémenté en cholestérol (NRTC et NRBC) comparés à leurs témoins respectifs (NRT et NRB). Cependant, la consommation du régime enrichi en huile de pépins de Citrus induit une diminution significative des taux des triglycérides plasmatiques observée surtout chez les rats témoins (NRB) par rapport (NRT). Les teneurs en cholestérol plasmatique et des fractions lipoprotéiques sont augmentées de manière significative chez les rats consommant les régimes enrichis en cholestérol (NRTC et NRBC) par rapport aux rats recevant les régimes témoins (NRT et NRB), sauf pour des teneurs en C-HDL, qui ne montrent aucune différence significative entre les rats consommant du cholestérol par rapport à leurs témoins. δa consommation de l’huile de pépins de bigarade présente un effet positif aussi bien chez les NRB que chez les NRBC, du fait qu’elle induit une réduction significative du cholestérol du plasma et des LDL-C.

NRT NRB NRTC NRBC

a 0.7 4 a ab b b 0.6 c cd 0.5 c 3 0.4 2 0.3

0.2 1 Cholestérol(mmol/L) Triglycérides (mmol/L) Triglycérides 0.1 0 0 Lots Lots

Figure 26 : Teneurs plasmatiques en cholestérol et e n triglycérides chez les différents lots de rats

Partie in vivo : Résultats et interprétations

3.0 2.0 a 2.5 1.5 c 2.0 c c 1.5 1.0

1.0 HDL-C (mmol/L) HDL-C LDL-C (mmol/L) LDL-C 0.5 0.5

0.0 0.0 Lots Lots Figure 27: Teneurs en cholestérol des HDL et LDL chez les différents lots de rats Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n= 5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime + 1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade + 1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

III.3. Composition en acides gras des lipides sériques chez les différents lots de rats (Tableau 12)

La composition en acides gras des lipides sériques chez les différents lots de rats est représentée dans le tableau 12. On remarque que le taux des AGS est plus élevé chez les rats recevant le régime supplémenté en cholestérol (NRTC et NRBC) par rapport à leurs témoins (NRT et NRB), à l’exception de l’acide myristique (C14 :0). La consommation du régime enrichi en huile de bigarade entraîne une diminution significative des teneurs en acides gras saturés (C16:0 et C18:0) chez les rats NRB et NRBC par rapport aux rats NRT et NRTC respectivement ; ainsi qu’une nette augmentation des teneurs en acides gras polyinsaturés (AGPI) chez les rats consommant le régime témoin comparés aux rats consommant le régime expérimental. En effet, on remarque que les teneurs en acide linoléique (C18:2) et en acide arachidonique (C20:4n-6) sont significativement plus élevé chez les rats NRB comparés aux rats NRT. En revanche, l’huile de bigarade n’influence pas les teneurs en acides gras mono-insaturés (AGMI).

Partie in vivo : Résultats et interprétations

Tableau 12: Composition en acides gras (% pondéral) des lipides sériques chez les différents lots de rats

Lots AG NRT NRB NRTC NRBC

C14:0 1,43 ± 0,05 b 2,03 ± 0,46 a 1,49 ± 0,40 b 2,09 ± 0,22 a

C16:0 33,82 ± 1,58 c 29,46 ± 1,52 e 39,04 ± 1,84 a 34,92 ± 1,64 c

C16:1 2,14 ± 0,19 c 1,69 ± 0,21 c 3,24 ± 0,28 a 2,40 ± 0,30 c

C18:0 17,38 ± 2,70 cd 17,59 ± 1,47 cd 24,67 ± 1,41 a 20,36 ± 1,18 c

C18:1 14,32 ± 1,09 15,78 ± 1,85 12,96 ± 1,11 14,61 ± 2,17

C18:2 15,06 ± 1,46 b 17,39 ± 1,97 a 13,22 ± 2,14 bc 13,27 ± 1,49 bc

C20:4n-6 7,07 ± 0,66 c 12,02 ± 2,07 a ND 7,95 ± 0,61c

C22:4n-6 ND 2,25 ± 0,74 a 1,14 ± 0,43 b 1,71 ± 0,12 ab

AGS : acides gras saturés, AGMI : acides gras mono insaturés, AGPI : acides gras polyinsaturés, ND : non déterminé, C14:0 (acide myristique), C16:0 (acide palmitique), C16:1 (acide palmitoléique), C18:0 (acide stéarique), C18:1 (acide oléique), C18:2 (acide linoléique : LA), C20:4n-6 (acide arachidonique :AA), C 2 2 : 4 n - 6 ( d o c o s a t é t r a é n o ïq u e : D T A ) . Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n= 5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime + 1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade ; NRBC: rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de la bigarade + 1% cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

IV. Poids relatif et taux des lipides totaux du foie chez les lots de rats (Figure28, Tableau 18 en annexes) Le poids du foie est significativement plus élevé chez les rats consommant du cholestérol (NRTC et NRBC) comparés à leurs témoins (NRT et NRB). Par ailleurs, l’huile de Citrus n’influence pas le poids du foie chez les rats NRB et NRBC par rapport aux rats NRT et NRTC. En ce qui concerne les teneurs en lipides totaux du foie, leurs valeurs sont augmentées de manière significative chez les deux lots consommant le régime supplémenté en cholestérol. En outre, ces teneurs diminuent légèrement chez les rats consommant l’huile de pépins de bigarade comparés à leurs témoins.

100

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

5 120 a ) a a ab 100 4 c c 80 3 60 c c 2 de tissu ) tissu de 40

1 20 lipides totaux du foie (mg/g foie du totaux lipides

Poids relatif du foie (g/100g foie du relatif Poids 0 0 Lots Lots

Figure 28: Poids relatif (g/100g) et taux des lipides totaux du foie (mg/g de tissu) chez les lots de rats.

V. Le statut oxydant/antioxydant

V.1. Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde, et en hydroperoxydes chez les différents lots de rats (Figures 30, Tableau 19 en annexes).

Les teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde et en hydroperoxydes sont significativement plus élevées chez les rats recevant le régime cholestérol enrichi en huile de tournesol ou en huile de bigarade (NRTC et NRBC) par rapport à leurs témoins respectifs (NRT et NRB). La supplémentation de l’huile de bigarade influence positivement les teneurs plasmatiques mais surtout érythrocytaires en MDA chez les rats NRB et NRBC par rapport aux NRT et NRTC quelque soit le type de régime (figure 29). En revanche l’huile de bigarade induit une diminution significative des teneurs plasmatiques et surtout érythrocytaires des hydroperoxydes que chez les rats supplémentés en cholestérol (NRBC) par rapports à leurs témoins (NRB) (figure 30).

101

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

3.5 1.4 a 3.0 1.2 a ab b b 2.5 b 1.0 bc c 2.0 0.8 0.6 1.5 0.4 1.0

0.2 (µmol/L) érythrocytaire MDA 0.5 MDA MDA plasmatique(µmol/L) 0.0 0.0 Lots Lots

Figure 29: Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en malondialdéhyde chez les différents lots de rats.

a 3.5 a 5 ab b 3 c 4 2.5 c c 2 3 c

1.5 2 (µmol/L) 1 Hydroperoxyde 1

0.5 érythrocytaire(µmol/L)

Hydroperoxydeplasmatique 0 0 Lots Lots

Figure 30: Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en hydroperoxydes chez les différents lots de rats.

102

Partie in vivo : Résultats et interprétations

V.2.Oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les groupes de rats (Figure 31, Tableau 20 en annexes).

Chez les rats rendus hypercholestérolémiques, δes marqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines montrent d’une part une augmentation significative des taux initial et maximal des diènes conjugués et d’autre part une diminution du Tlag et du Tmax comparés à leurs témoins. Nous avons noté que l’huile de bigarade diminue significativement le taux initial et maximal en diènes conjugués chez les rats recevant le régime enrichi en cholestérol (NRBC) par rapport à leurs témoins (NRTC), mais elle n’agit pas sur les NRB. De plus, le temps correspondant au début de l’oxydation des lipoprotéines (Tlag) ; ainsi que le temps nécessaire pour obtenir l’oxydation maximale des lipoprotéines in vitro (Tmax) sont significativement plus élevé chez le même groupe de rats (NRBC) par rapport à leurs témoins (NRTC).

NRT NRB NRTC NRBC

180 300 a 160 a ab c 250 ab ab 140 d c 120 200 100 150

80 T lag lag T (min) 60 Tmax(min) 100 40 50 20 0 0 Lots Lots

103

Partie in vivo : Résultats et interprétations

14 a a b 14 12 b b b c cd 12 10 10 8 8 6 6

DIC DIC (µmol/L) ti 4 4 DIC DIC (µmol/L)tm 2 2 0 0 Lots Lots

Figure 31: εarqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les différents lots de rats.

V.3. Teneurs plasmatiques en vitamines antioxydantes (A, C, E) chez les groupes de rats (Figure 32, Tableau 21 en annexes).

Nous avons constaté que les teneurs plasmatiques en vitamines A, C ne montrent aucune différence significative chez les rats soumis au régime supplémenté en cholestérol (NRTC et NRBC) comparés à leurs témoins (NRT et NRB). En revanche, l’huile de pépins de bigarade augmente de manière significative les teneurs plasmatiques en vitamine E chez les rats NRB et NRBC ; mais n’agit pas sur les teneurs plasmatiques en vitamines A et C chez ces rats.

104

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

5 Vitamine C (µmol/L) C Vitamine 0 Lots

20 Vitamine A (µmol/L) A Vitamine

0 Lots

12 a

) 10 ab b 8 c

Vitamine E (µmol/L E Vitamine 2

0 Lots

Figure 32 : Teneurs plasmatiques en vitamines (A, C, E) chez les différents lots de rats.

105

Partie in vivo : Résultats et interprétations

V.4. Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit et pouvoir antioxydant total chez les quatre lots de rats (Figure 33, Tableau 22 en annexes)

Les teneurs en glutathion plasmatique et érythrocytaire sont significativement diminuées chez les rats consommant le régime riche en cholestérol, cette diminution est surtout observée chez le groupe NRTC par rapport aux NRT. Par ailleurs, la consommation de l’huile de bigarade augmente significativement les teneurs en glutathion plasmatique et érythrocytaire chez les rats supplémentés en cholestérol par rapport aux rats témoins. La capacité du plasma à absorber les radicaux libres (ORAC) est significativement diminuée chez les deux lots de rats ayant reçu une supplémentation en cholestérol quelque soit le type de régime (NRTC et NRBC) comparés à leurs témoins (NRT et NRB).

NRT NRB NRTC NRBC

180 a a 160 ab 140 c 120 100 80 60

Glutathionréduit 40

érythrocytaire(nmol/L) 20 0 Lots

200 a ab ab 150 c

100 (nmol/L)

plasmatique 50 Glutathionréduit

0 Lots

106

Partie in vivo : Résultats et interprétations

2.5

a 2.0 a ab b 1.5

1.0 ORAC ORAC (UA)

0.5

0.0 Lots

Figure 33: Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit (nmol/L) et pouvoir antioxydant total chez les différents lots de rats.

V.5. Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires chez les différents lots de rats (Figure 34, Tableau 23 en annexes)

Chez les rats consommant le régime supplémenté en cholestérol, les activités plasmatiques et érythrocytaires de la catalase et de la superoxyde dismutase sont significativement plus basses par rapport aux témoins. δ’huile de bigarade induit une augmentation significative de l’activité enzymatique de la catalase érythrocytaire chez le groupe NRBC et de la superoxyde dismutase plasmatique aussi bien chez les rats recevant le régime témoin, que chez les rats consommant le régime supplémenté en cholestérol. δ’activité antioxydante de la glutathion réductase (GSSG-Red) plasmatique et érythrocytaire ne révèle aucune variation entre les quatre groupes de rats étudiés.

107

Partie in vivo : Résultats et interprétations

NRT NRB NRTC NRBC

350 a ab 250 bc a 300 b ab 200 bc 250 d 200 150 150

100 (U/ml/min) 100 (U/ml/min)

Catalase Catalase plasmatique 50

50 Catalase érythrocytaire

0 0 Lots Lots

400 a 300 350 ab a c c 250 bc 300 e cd 250 200 200 150 150

(U/ml/min) 100

100 SOD SOD érythrocytaire

50 50 SOD SOD plasmatique(U/ml/min) 0 0 Lots Lots

60 60

50 50

40 40

30 30

20 20

plasmatique(U/ml)

Gluthationréductase Gluthationréductase 10 érythrocytaire(U/ml) 10

0 0 Lots Lots Figure 34: Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires chez les différents lots de rats.

108

Discussion

Partie in vivo : Discussion

Ces dernières années ont été marquées par l'apparition d'un nouveau concept appelé syndrome métabolique. Cette condition est caractérisée par un ensemble de facteurs de risque incluant l'obésité abdominale, les dyslipidémies athérogènes, l'hypertension artérielle et l’insulinorésistance. D'autres anomalies peuvent également être présentes, notamment un état pro-inflammatoire ou encore un stress oxydatif élevé (Eckel et al., 2010; Libby, 2012; Akiyama et al., 2010). Ces facteurs sont impliqués dans l'étiologie et la pathogenèse de certaines maladies cardiovasculaires, telle que l'athérosclérose (Callias, 2007, Libby, 2012). Elles sont responsables chaque année du décès de plus de 17 millions de personnes, soit 30% de la mortalité dans le monde, dont les trois quart ont lieu dans les pays du tiers monde (Rachid and Hassan, 2007; Mathers and Loncar, 2006; Oboh et al., 2014).

Des études cliniques ont montré le rôle des régimes hyperlipidiques en général et hypercholestérolémiques, en particulier, dans la genèse de l’inflammation et les processus athéroscléreux (Ainouz et al., 2015). Après leur absorption intestinale et leur synthèse hépatique, les lipides (cholestérol non estérifié, triglycérides et phospholipides) sont transportés dans l’organisme sous forme de complexes macromoléculaires, les lipoprotéines (Ramful et al., 2010). Ce sont des particules sphériques composées d’un coeur de lipides neutres (essentiellement TG et CE) entouré d’une monocouche de lipides polaires (PL et cholestérol libre) ; le tout associé à des apoprotéines (Andreelli and Jacquier, 2006). Ces dernières ont une double fonction de structure et de régulation métabolique: elles assurent la cohésion du complexe lipidique et sa solubilisation et agissent également comme activateurs des enzymes du métabolisme des lipides à la surface de ces lipoprotéines et aussi en tant que ligands pour des récepteurs à la surface cellulaire (Rachid and Hassan, 2007). Il existe plusieurs types de lipoprotéines, se différenciant selon leur taille, leur densité, leur contenu lipidique et leur contenu en apolipoprotéines (Jain et al., 2013). Certaines sont proathérogènes (δDδ), d’autres ont un effet antiathérogène (HDδ). Ainsi, les lipoprotéines de haute densité exercent un effet protecteur vis-à-vis de la formation de la plaque d’athérome (Toth, 2010), alors que les particules de densité plus légère comme les lipoprotéines de très basse densité, les lipoprotéines de densité intermédiaire et surtout les lipoprotéines de basse densité favorisent cette étape (Ramasamy, 2016).

110

Partie in vivo : Discussion

Grâce aux récepteurs LDL, le cholestérol entre dans les cellules où il sera stabilisé par une estérification. S’ajoutant au cholestérol alimentaire, du cholestérol endogène est synthétisé par le foie grâce à une enzyme clé, l’HεG-CoA réductase. Le foie distribue alors l’ensemble de ces cholestérols d’origine variée au reste de l’organisme. En cas d’excès de cholestérol intracellulaire, les cellules diminuent le nombre de leurs récepteurs LDL de surface, ce qui peut conduire à une augmentation de la concentration de LDL-cholestérol circulant (Andreelli and Jacquier, 2006). Chez l’homme, des concentrations élevées en δDδ-cholestérol et/ou des concentrations diminuées de HDL cholestérol sont des facteurs de risque indépendants associés à la survenue de maladies cardiovasculaires, en particulier d’atteinte coronaire (Torres et al., 2015).

En effet, l'hypercholestérolémie se caractérise par l’élévation des taux de δDδ-cholestérol (LDL-C) et des triglycérides (TG) avec ou sans diminution du taux de HDL-cholestérol (HDL-C) (De Backer et al., 2003; Devi and Sharma, 2004; Kim et al., 2008; Achat, 2013). Ces facteurs pro-athérogènes favorisant la formation de la plaque athéromateuse sont responsables en partie des anomalies du métabolisme des acides gras (AG) et des triglycérides (TG) dans le foie et le tissu adipeux (Grundy et al., 2005; Reaven, 2005). Ces derniers, lorsqu’ils sont en excès, entrainent une accélération des échanges inter-lipoparticules par l’intermédiaire de la CETP (protéines de transfert des esters de cholestérol) au dépend des fractions δDδ et HDδ dans le sang. Ces modifications quantitatives sont à l’origine d’une diminution de la concentration de HDL-cholestérol et de la formation de LDL, petites et denses, beaucoup plus athérogènes (Torres et al., 2015; Packard and Libby, 2008). La diminution du HDL-cholestérol est encore favorisée par l’activation de la lipoprotéine lipase hépatique stimulée par l’hyperinsulinisme et le taux élevé d’acides gras libres. Ces différents mécanismes expliquent le profil lipidique athérogène caractéristique du syndrome métabolique (Vincent-Baudry et al., 2005).

Par ailleurs, des études ont montré que l’excès d’AGS alimentaires participe à l’étiologie des maladies cardiovasculaires (εCV) de par leur effet sur la lipémie, en particulier l’augmentation de la cholestérolémie (δDδ-cholestérol), qu’ils induisent (Haug et al., 2007)

111

Partie in vivo : Discussion

Deux hypothèses ont été proposées pour expliquer l’augmentation du taux sanguin du δDδ- cholestérol sous l’effet des AGS. D’une part, ils pourraient être responsables d’une diminution de l’expression des récepteurs aux apolipoprotéines à la surface des hépatocytes et, d’autre part, leur incorporation dans les phospholipides membranaires des cellules pourrait affecter la fluidité des membranes en déstabilisant l’action de ces récepteurs et ainsi à l’épuration des δDδ (Dubois et al., 2007; Walrand et al., 2010).

De plus, de nombreux travaux suggèrent que l’excès de cholestérol alimentaire induit un stress oxydatif pour l’organisme (Shehata and Yousef, 2010). En effet, la production excessive des radicaux libres induit des processus de peroxydation lipidique au sein des acides gras polyinsaturés des lipoprotéines ou de la membrane cellulaire aboutissant à la désorganisation complète de la membrane altérant ainsi ses fonctions d’échange et de barrière (Cadenas and Davies, 2000; Hulsmans et al., 2012).

Dans le cadre de la prévention de l’hypercholestérolémie et ses complications et de la valorisation des sous produits d’agrumes, en particulier les feuilles (Lagha-Benamrouche and Madani, 2013), les écorces et pulpes (Lagha-Benamrouche and Madani, 2013; Nakajima et al., 2016; Mir et al., 2016; Ramful et al., 2011),et les fleurs (Mazorra-Manzano et al., 2013) peu d’études se sont intéréssées aux pépins d’agrumes (Moulehi et al., 2012; El Mannoubi et al., 2010; Waheed et al., 2009; Chilaka et al., 2015). Par conséquent, la deuxième partie de notre étude s’inscrit dans cette démarche.

Pour ce faire, nous avons mis en évidence l’effet de l’huile de pépins de la bigarade (Citrus aurantium), comparé à celui de l’huile de tournesol (Helianthus annuus), sur les paramètres lipidiques et ceux du stress oxydatif chez des rats normaux et des rats adaptés à un régime supplémenté en cholestérol pendant 4 semaines. Cependant, peu de travaux scientifiques ont été réalisés in vivo afin de tester l’effet de l’huile extraite des pépins de bigarade (Citrus aurantium) sur l’hypercholestérolémie et le stress oxydatif.

Après la consommation des régimes préparés pour les quatre lots de rats, et après 28 jours de régime, nous avons observé une légère prise de poids, mais qui n’est pas significative, cette dernière peut être due à une augmentation de la ration alimentaire quotidienne. De même l’addition du cholestérol (1%) au régime des rats nourris avec l’huile de tournesol ou de l’huile de Citrus ne présente pas de différence significative sur la quantité d’aliment ingéré.

112

Partie in vivo : Discussion

Nos résultats concordent avec ceux de Gorinstein et al., qui affirment dans leur étude comparative entre la consommation de trois huiles différentes (l’huile de tournesol, de colza et de cacahuète) qu’il n’y a aucune différence significative, chez des rats Wistar nourris avec ou sans cholestérol pendant 4 semaines de régime ; De même les travaux de Wang et al., sur la détermination de l’effet du cholestérol alimentaire sur le métabolisme lipidique chez des rats Wistar, avec les mêmes conditions (cholestérol à 1% et 4 semaines d’expérimentation), n’ont observé aucune variation du poids corporel et de la l’aliment ingéré entre les groupes de rats (Gorinstein et al., 2003; Wang et al., 2010).

Dans notre étude, le régime supplémenté en cholestérol n’affecte pas le métabolisme des protéines. En effet, nos résultats n'ont pas révélé de modification des teneurs en protéines totales au niveau du plasma chez les quatre groupes de rats. Puisque le régime utilisé est normo-protéique, il permet donc de satisfaire le besoin énergétique, le besoin en azote et en acides aminés essentiels pour assurer les synthèses protéiques corporelles (Hunter et al., 2000). De même, les teneurs plasmatiques en urée et en créatinine sont les mêmes pour les quatre lots de rats, ceci est peut être en faveur d’une fonction rénale normale non affectée par le régime supplémenté en cholestérol. Cependant, notre étude est la première qui met en évidence une réduction significative de la glycémie chez les rats recevant le régime enrichi en huile de pépins de bigarade par rapport à celui enrichi en huile de tournesol, et ceci malgré la supplémentation du cholestérol aux régimes. Ces résultats soulignent l’effet bénéfique de l’huile de bigarade, et sont en accord avec l'étude de Chilaka et al. (2015) qui montrent qu’un régime à base d’huile de pépins d’orange douce (Citrus sinensis) pendant deux semaines chez des rats rendus diabétiques par injection d'alloxane, entraine une diminution significative de la glycémie chez ces rats. En effet, ces auteurs ont mis l’accent sur l’efficacité de la consommation de l'huile des graines africaines du Citrus sinensis riche en acides gras monoinsaturés, principalement l’acide oléique, dans la réduction de la glycémie (Chilaka et al., 2015). En outre, les lipides alimentaires, dont les composants majeurs sont des acides gras, sont des nutriments indispensables à la croissance et au fonctionnement de l’organisme. Si les AGS sont qualifiés de « lipotoxiques », les acides gras monoinsaturés (AGMI) et polyinsaturés (AGPI) sont considérés comme « bénéfiques », en tant que précurseurs pour d’autres

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Partie in vivo : Discussion métabolites bioactifs. En effet, les AGεI améliorent la sensibilité à l’insuline et le profil lipidique (Reaven and Witztum, 1996).

Plusieurs études ont prouvé que la consommation d’un régime riche en acide oléique améliore la sensibilité à l’insuline et également les taux de pro-insuline à jeun. Par ailleurs, l’acide oléique réduit les teneurs plasmatiques post-prandiales en insuline et en glucose (Herrera et al., 2001; Paniagua et al., 2007; López et al., 2008). Ainsi, le remplacement diététique de glucides et de lipides saturés par l’acide oléique conduit à une réduction de la glycémie et de la pression artérielle et à une augmentation des HDL chez les patients atteints de diabète (Riccardi et al., 2004). Sachant que l’huile de tournesol tout comme l’huile de bigarade présentent des pourcentages assez élevés en acide oléique (30 % et 27,70% respectivement) (Gorinstein et al., 2003), cela suggère qu’elles agissent de la même manière sur le métabolisme des glucides.

Cependant, de nombreuses études corrèlent la participation des phénols présents dans les Citrus à la réduction du taux de la glycémie chez des modèles diabétiques (Chilaka et al., 2015, Jung et al., 2006, Andreelli and Jacquier, 2006). Ces auteurs ont suggéré que la naringénine (bioflavonoïde) est capable de réduire l'absorption du glucose et d'inhiber ses transporteurs actifs (Sodium glucose co-transporters) dans l’intestin et les reins des lapins et des rats (Andreelli and Jacquier, 2006) ; et que l’association de la naringine avec l'hespéridine augmente significativement le taux d’ARNm de la glucokinase, alors que la naringine à elle seule réduit l'expression du taux d'ARNm de la Phosphoénolpyruvate carboxykinase et de la glucose-6-phosphatase dans le foie des souris. D’autre part, Kim et al., ont montré que les extraits de Dangyuja (un agrume coréen), contenant des taux élevés de glycosides de flavanone, pourrait être utilisé pour contrôler le taux de la glycémie chez les patients diabétiques en inhibant l’amylase et l’α glucosidase dans le tractus intestinal (Kim et al., 2009). Les flavonoïdes présents dans les fruits de bergamote (agrumes ressemblant au citron) influencent le métabolisme des glucides et des lipides au niveau moléculaire. δ’effet de ces flavonoïdes peut s’expliquer par leur capacité à activer l’AεP (adénosine monophosphate) kinase, qui est un régulateur central du métabolisme du glucose et des acides gras et par le fait qu’ils inhibent l’AεPc phosphodiestérases, impliquées dans la régulation de la lipolyse dans les adipocytes et le foie (Janda et al., 2016).

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Partie in vivo : Discussion

En effet, l’AεP kinase est un régulateur des voies métaboliques impliquées dans la production d'ATP dans les cellules des mammifères. Cette enzyme agit comme un senseur des taux AMP/ATP. L'AMP intracellulaire augmente, lorsque le niveau d'énergie est faible et se lie à l'AMPK pour permettre son activation.(Day et al., 2007; Hawley et al., 2003) Les effets thérapeutiques de l'activation de l'AMPK sont essentiels à l'augmentation de l'absorption intracellulaire du glucose. Cela se produit par l'intermédiaire de différents effecteurs, et conduit à l'activation des transporteurs de glucose GLUT1 et GLUT4 dans toutes les cellules (Hwang et al., 2009). En même temps, l'AMPK empêche la synthèse du glycogène d'augmenter la disponibilité cellulaire du glucose pour la production d'énergie et favorise la glycolyse. Ceci se produit vis-à-vis de l'inhibition directe de la glycogène synthase et de l'activation des enzymes glycolytiques comme la 6-phosphofrukto-2-kinase (Hwang et al., 2009). De plus, il a été montré que différents flavonoïdes peuvent activer l'AMPK, à la fois in vitro et in vivo à la suite d'une supplémentation alimentaire en flavonoïdes dans des études chez l'animal et chez l'homme (Baur et al., 2006, Timmers et al., 2011). δ’effet de ces flavonoïdes a également été montré pour abaisser le taux de la glycémie chez des modèles de souris expérimentales rendus diabétiques et cela a été corrélé avec l'activation de l'AMPK (Murase et al., 2009; Lee et al., 2009).

Janda et al. ont montré aussi que certains polyphénols peuvent agir comme inhibiteur de la hydroxy-3-Méthylgutaryl coenzyme A (HMG-CoA) réductase, enzyme clé de la synthèse du cholestérol (Janda et al., 2016).

δ’élévation de la teneur en cholestérol peut induire le développement de la plaque d’athérome, même en l’absence d’autres facteurs de risque (diabète, hypertension et obésité) (Suleria et al., 2015), d’où l’importance de contrôler les teneurs en cholestérol via la régulation de sa synthèse et de sa captation par le foie, celui-ci joue un rôle central dans l’homéostasie du cholestérol autant dans sa synthèse que dans son excrétion, ainsi que son transport dans la circulation par les lipoprotéines (Inoue, 2014).

Plusieurs études expérimentales mis en évidence l’effet du cholestérol alimentaire sur la cholestérolémie. les travaux de Balkan et al., affirment qu’un régime riche en cholestérol, à raison de 2%, augmente largement les taux du cholestérol dans le plasma des rats Wistar (Balkan et al., 2004).

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Partie in vivo : Discussion

Fungwe et al., ont révélé davantage que le cholestérol alimentaire provoque une augmentation de la sécrétion des VLDL et une hypertriglycéridémie en induisant une stéatose hépatique chez le rat et chez le hamster. Cette augmentation est due à la réduction de l'oxydation des acides gras d’une part, et de la stimulation de la synthèse des acides gras et leur incorporation accrue dans les triglycérides hépatiques d’une autre part (Fungwe et al., 1994). Cependant, les travaux de Wang et al., ont montré que le cholestérol alimentaire augmente l'accumulation des triglycérides dans le foie, mais ne stimule pas l'activité et l'expression des enzymes hépatiques liées à la biosynthèse des triglycérides et des acides gras (Wang et al. 2010). Dans notre étude, la consommation du régime enrichi en huile de pépins de bigarade induit une diminution significative des taux des triglycérides plasmatiques, du cholestérol total et des LDL-C chez les rats par rapport aux rats consommant de l’huile de tournesol. En revanche, les teneurs en HDL-C ne montrent aucune différence significative entre les deux régimes. Ces résultats sont en accord avec les travaux de Chilaka et al, qui ont suggéré que l’huile de graines de Citrus sinensis entraîne une diminution des TG sériques, du cholestérol total et des LDL-cholestérol (Chilaka et al., 2015). Cette diminution des TG sériques peut être attribuée à la possibilité que l'huile possède une capacité d'activation des récepteurs activés (PPARs) par les proliférateurs de peroxysomes. Les PPARs sont des récepteurs nucléaires activés par plusieurs ligands exogènes et endogènes en modulant des gènes liés à l'homéostasie des lipides, du glucose et de l'insuline. PPARɤ (peroxisome proliferation activated receptor ɤ), exprimée dans le tissu adipeux et le foie, régule le stockage des lipides et le métabolisme du glucose (Mishra et al., 2009).

Cet effet hypolipidémiant et hypocholestérolémiant de l’huile de pépins de Citrus peut être expliqué aussi par sa composition riche en acides gras insaturés (oléique-linoléique) ainsi qu’en antioxydants (les polyphénols, stérols et les tocophérols). En effet, plusieurs études ont montré que l’acide oléique a un effet bénéfique sur le profil lipidique et le risque de développement de MCV (Erkkilä et al., 2006; Moreno and Mitjavila, 2003; Paniagua et al., 2007), l’administration de cet acide gras chez l’homme diminue l’oxydation des δDδ (Fitó et al., 2007; Lapointe et al., 2006), les teneurs en C-LDL et en triglycérides (Williams, 2001). Cette variation des niveaux de ces composés lipidiques est due à l’augmentation de l’oxydation des acides gras par induction de la voie de la -oxydation.

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Partie in vivo : Discussion

Parmi les dérivés d’acide linoléique, l’acide -linoléique en particulier s’est avéré bien efficace en réduisant le cholestérol total, le C-VLDL et le C-δDδ chez l’homme et le rat (Takada et al., 1994; Nijjar et al., 2010).

D’autres études ont attribué le rôle des polyphénols, en particulier les flavonoïdes présents dans les Citrus dans l’amélioration du profil lipidique (Rafieian-Kopaei et al., 2013; Tripoli et al., 2007; Jeon et al., 2004). Nous avons constaté que notre huile contient un taux non négligeable en polyphénols totaux (0,β19 mg/g εS) mais, nous n’avons pas identifié les différentes classes appartenant à ces polyphénols, cependant, des travaux effectués par (Moulehi et al., 2012), rapportent sur la base de l'analyse RP-HPLC que les flavonoïdes des pépins matures du Citrus aurantium sont caractérisés par la prédominance des glycosides de flavanone (la naringine, l'hespéridine et la néohespéridine).

Ces flavanones sont de puissants inhibiteurs de l'activité de l’hydroxy-méthyl- glutaryl- coenzyme A réductase (HMG-CoA réductase) et de l'acyl coenzyme A: cholestérol acyltransférase (ACAT) in vivo (Bok et al., 1999; Himmelfarb and Hakim, 2003; Choi et al., 2004) et in vitro (Wilcox et al., 2001). La HMG-CoA réductase est impliquée dans la synthèse du cholestérol et la sécrétion du cholestérol-VδDδ et l’ACAT dans l'absorption intestinale et l’estérification du cholestérol, ce qui explique leur effet hypocholestérolémiant chez des animaux consommant un régime supplémenté en cholestérol.

En effet, beaucoup d’études ont rapporté que la supplémentation en hespéridine et en naringine chez le rat consommant un régime enrichi en cholestérol, entraîne une diminution des triglycérides plasmatiques (Himmelfarb and Hakim, 2003; Choi et al., 2004; Miceli et al., 2007; Akiyama et al., 2010) et une inhibition de la synthèse et de l'absorption du cholestérol (Elavarasan et al., 2012; Wang et al., 2011). Cette propriété hypolipidémiante de la naringine est due à son action inhibitrice de la HMG-CoA réductase chez les rats (Jeon et al., 2004; Morin et al., 2008). En outre, le supplément de naringine semblait préserver la morphologie des tissus des dommages induits par le régime élevé de cholestérol chez les lapins (Jeon et al., 2004). Cependant, la sélection du modèle animal reste significative pour tester l'efficacité de ces nutraceutiques dans la prévention d'une maladie spécifique (Bok et al., 2000; Riedl et al., 2002).

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Partie in vivo : Discussion

δ’ACAT (acyl CoA cholestérol acyltransférase) est une autre enzyme clé de régulation du cholestérol qui catalyse l'estérification du cholestérol avec des acides gras à longue chaîne et qui est impliquée dans la sécrétion de cholestérol LDL hépatique chez les rats (Wang et al., 2011). Elle est considérée comme jouant un rôle vital dans la progression des lésions athérosclérotiques (Uelmen et al., 1995). Étant donné que l'augmentation de l'activité microsomale hépatique de l'ACAT est normalement associée à un régime alimentaire riche en cholestérol (Grogan et al., 1991), il a été rapporté que la naringine abaisse l'activité microsomale hépatique de l’ACAT (Wilcox et al., 1998; Bok et al., 2000) et il a également

été signalé que la naringine en diminuant l'activité de l’ACAT1 et l'ACAT2 entraîne une diminution de l'accessibilité des lipides à intégrer les lipoprotéines contenant l’apoB et une augmentation de la concentration plasmatique de HDL (Mortensen et al., 2001), qui joue un rôle défensif dans la fonction endothéliale chez le patient hypercholestérolémique (Diodati et al., 1998). Tout comme la naringine, l'hespéridine, est aussi un glycoside de flavanone trouvé abondamment dans les agrumes, est facilement absorber dans l'alimentation quotidienne humains. (Rizza et al., 2011) ont rapporté que l'administration d'hespéridine par voie orale (500 mg une fois par jour pendant 3 semaines) a favorablement modifié le profil lipidique chez des sujets atteints du syndrome métabolique.

La diminution du taux de cholestérol ainsi que des LDL-C trouvée dans notre étude sous l’effet de l’huile de graines de bigarade peut aussi être expliqué par le fait que notre huile est très riche en phytostérols (Waheed et al., 2009). Par ailleurs, il existe ce qu'on appelle les phytostérols, qui sont des stérols végétaux structurellement similaires au cholestérol qui agissent dans l'intestin en diminuant l'absorption du cholestérol. Les phytostérols déplacent les micelles intestinales de cholestérol, ce qui réduit la réserve de cholestérol absorbable, mais elles sont également prises rapidement par les entérocytes et augmentent l'expression du transporteur de stérol A1 lié à l'adénosine triphosphate. Ainsi, les esters de phytostérols dissous dans la graisse alimentaire réduisent le cholestérol-LDL de 10% à une dose efficace maximale de 2g / jour (Ostlund Jr, 2004).

Concernant la composition en acides gras des lipides plasmatiques, la supplémentation du cholestérol dans le régime des rats ne semble pas altérée la qualité des différents types d’acides gras plasmatiques (saturés, mono et polyinsaturés). En revanche, on note des

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Partie in vivo : Discussion modifications liées à la consommation de l’huile de pépins de bigarade; une baisse significative des taux des AGS (C16 :0 et C18 :0) est observée chez les deux lots (NRB et NRBC), ainsi qu’une augmentation significative des taux des AGPI principalement l’acide linoléique (δA), et l’acide arachidonique (AA ; β0:4n-6) observée chez les rats NRB par rapport aux autres groupes. En effet, un double système enzymatique fabrique continuellement, à partir des deux acides gras précurseurs (acide linoléique et l’acide linolénique), des acides gras polyinsaturés à longues chaînes. Les Elongases permettent d'allonger les acides gras en augmentant le nombre de carbones et les Désaturases permettent à l'organisme, en fonction de ses besoins, d'augmenter le nombre de doubles liaisons en désaturant certaines portions de la chaîne carbonée d'un acide gras. Ainsi sont synthétisés, à partir de δA, l’acide arachidonique (AA ; 20:4n-6) suite à l’action de la Δ6-Désaturase, l’Elongase et la Δ5-Désaturase, et à partir de l’acide linolénique (AδA), les acides eicosapentaénoïque (EPA ; 20:5n-3) et docosahexaénoïque (DHA ; 22:6n-3), suite à une rétroconversion peroxysomale (Surette et al., 2004; Harbeby, 2011)

δa présence de l’acide oléique dans le plasma des lots de rats peut être liée à la conversion de l’acide stéarique qui subit la 9-Désaturase pour donner de l’acide oléique. Il en est de même pour l’acide docosatétraénoïque ou adrénique (DTA ; 22:4n-6) qui est présent en quantité significative dans le plasma des rats NRB par rapport aux autres lots, suite aux réactions de désaturations et d’élongations que subi l’acide arachidonique lors de son métabolisme dans le tissu hépatique. δ’acide docosatétraénoïque peut poursuivre sa conversion jusqu’à l’obtention de l’acide docosapentaénoïque (DPA ; ββ:5n-6) par les enzymes désaturases et élongases dans le réticulum endoplasmique et par -oxydation dans les peroxysomes (Harbeby, 2011).

En effet, avec un apport alimentaire respectant l’équilibre entre les séries n-6 et n-3, la voie de synthèse de la série n-6 s’arrête à l’AA, mais en cas de déficience en n-3 la voie de conversion se poursuit jusqu’à l’apparition de l’acide docosapentaénoïque (DPA ; 22:5n-6). La production de DPA compense entièrement (sur le plan biochimique), la diminution de synthèse de DHA, le DPA devenant ainsi le marqueur biochimique spécifique de la déficience en AGPI n-3 (Harbeby, 2011).

Si la voie de conversion des AGPI précurseurs en dérivés à longue chaîne est primordiale sur le plan physiologique, elle reste cependant mineure sur le plan quantitatif. Ainsi, des études

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Partie in vivo : Discussion métaboliques ont montré chez le rat en croissance que seulement 3% du LA consommé étaient convertis en AGPI n-6 à plus longue chaîne, plus de 75% étant -oxydés et près de 20% étant accumulés tels quels dans les membranes et surtout dans les triglycérides de réserve (principalement dans la graisse des viscères) (Cunnane and Anderson, 1997) Nos résultats correspondent en partie, à ceux de Aidoud, qui ont étudié le profil des acides gras des homogénats hépatiques chez des rats consommant l’huile d’argan et l’huile d’olive (Aidoud, 2007). En outre, le foie est le principal organe responsable du maintien de l’homéostasie du cholestérol. Plusieurs études ont montré que, chez le rat soumis à un régime enrichi en cholestérol, les teneurs hépatiques en cholestérol (Suanarunsawat et al., 2011) et en triglycérides (Xie et al., 2011) sont augmentées, comparés à leur témoins ; Ce qui indique que le cholestérol alimentaire a perturbé le métabolisme des lipides hépatiques (Wang et al., 2010). Dans notre étude, nous avons remarqué qu’après 4 semaines de régime, les poids relatifs des foies des rats sont augmentés par l’apport de cholestérol alimentaire. Cette augmentation est statistiquement non significative dans le cas du régime à base de l’huile de bigarade (4β%) par rapport à celui à base l’huile de tournesol (4γ%). Cependant l’effet de l’huile sur les poids relatifs des foies n’est observable que lorsque le cholestérol est présent dans le régime. Nos résultats sont comparables à ceux obtenus par Gorinstein et al. (2003), qui ont montré que la présence du cholestérol dans le régime des rats consommant l’huile de colza et l’huile de tournesol ne montre pas de différence significative du poids des foies des rats. De même, l’étude faite par Bravo et al., suggère que la consommation de l’huile d’olive comparés à celle de l’huile de maïs, ne présente aucune différence significative du poids de foie chez les rats (Bravo et al., 1998).

De plus, nous avons démontré que l’administration du cholestérol dans le régime des rats augmentait de manière significative les teneurs en lipides totaux dans le foie des rats quelque soit le type d’huile consommée. Ceux malgré, une légère diminution de ces taux de lipides totaux hépatiques chez les rats recevant le régime à base d’huile de bigarade. Nos résultats rejoignent ceux de Wang et al., (2010) qui ont montré que la supplémentation de 1% de cholestérol dans le régime des rats induit une augmentation signification des concentrations du CT et des TG hépatiques. Ces auteurs ont démontré que l'administration du cholestérol dans le régime des rats réduit le catabolisme des acides gras.

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Partie in vivo : Discussion

De plus, Fukada et al. ont montré que la suppression de la bêta-oxydation des acides gras peut être responsable de la conversion des acides gras en TG et CE (Fukuda and Ontko, 1984). Cependant, d'autres études indiquent que le régime riche en cholestérol ne motive pas l'homéostasie hépatique des TG chez les rats (Zhao et al., 1998; Zhao et al., 2006).

Ces études biochimiques globales indiquent que le régime enrichi en huile de pépins de bigarade entraine une réduction de la glycémie ainsi qu’une amélioration du profil lipidique chez les rats Wistar, en effet nous avons mis en évidence une diminution de la triglycéridémie, de la cholestérolémie et des LDL-C au niveau du plasma. Cet effet hypolipidémiant est lié à son profil en acides gras insaturés et en composants antioxydants tels que les polyphénols, en particulier les flavonoïdes.

Le deuxième volet de notre travail porte sur un concept important, le stress oxydatif, reconnu aujourd’hui comme la base moléculaire de certaines maladies (Sour et al., 2015). Dans les systèmes biologiques, le stress oxydatif se définit comme un déséquilibre entre les systèmes de production d'espèces oxydantes (anion superoxyde, monoxyde, peroxyde d'hydrogène, radical hydroxyle, etc.) et des systèmes anti-oxydants en faveur de ceux-ci (Baraka-Vidot et al., 2013).

En raison de leurs propriétés oxydantes, ces espèces peuvent endommager de nombreuses macromolécules biologiques, y compris les acides gras, les protéines, l'acide désoxyribonucléique (ARN et ADN) et les hydrates de carbone (Pincemail et al., 2002) et entraîner par conséquent des lésions cellulaires et le développement de diverses anomalies physiologiques et pathologiques comme le vieillissement, des maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson et Huntington) (Gliszczyńska-Świgło, β006), des maladies cardiovasculaires (athérosclérose, insuffisance cardiaque) et de nombreux cancers (Weisburger, 2002). δ’origine de ce déséquilibre peut avoir diverses origines, telles que la surproduction endogène d’agents pro-oxydants d’origine inflammatoire (Picchi et al., 2006, Savini et al., 2013), une alimentation pauvre en antioxydants, ou une exposition aux rayons ultraviolets (U.V), à l’action de substances oxydantes (solvants, pesticides, anesthésiques, tabac) (Lehucher-Michel et al., 2001; Colacino et al., 2014).

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Partie in vivo : Discussion

Ainsi, ayant besoin d'une certaine quantité de ROS, l'organisme ne cherche pas à les éliminer mais à contrôler leur niveau pour éviter ce stress oxydant (Garait, 2006). Les ROS sont principalement générés au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale. Parmi les différents paramètres modulant leur production, la nature des équivalents réduits (NADH,H+ et FADH2) et l'apport en oxygène sont essentiels. Ces équivalents réduits sont fournis par les divers nutriments que nous ingérons, la composition des régimes alimentaires peut donc avoir une répercussion sur la production de ROS (Garait, 2006).

δes études ont signalé que l’excès en cholestérol alimentaire induit un stress oxydatif chez les rats (Gorinstein et al., 2003; Sudhahar et al., 2006; Shehata and Yousef, 2010). En effet, un régime hypercholestérolémique (5% de cholestérol et 0,γ5% d’acide cholique) pendant 15 jours, chez le rat induit des altérations métaboliques, un stress oxydant et une réponse inflammatoire, par une augmentation de la production des radicaux libres qui favorise la lipo-peroxydation (Shehata and Yousef, 2010).

Cependant, la consommation d’antioxydants naturels tels que les polyphénols (retrouvés dans des fruits et légumes et leurs sous produits,…) pourrait être associée à un risque réduit d’apparition de plusieurs maladies liées au stress oxydatif, telles que les maladies cardiovasculaires et le cancer (Halliwell, 2007; Barreca et al., 2011; Riccioni et al., 2012). Dans cette partie, nous avons évalué l’effet de l’huile de pépins de bigarade sur les marqueurs du statut oxydant/antioxydant chez des rats consommant un régime supplémenté en cholestérol, au niveau du plasma et des érythrocytes, en comparaison avec un régime témoin (enrichi en huile de tournesol).

Afin d’évaluer le statut oxydant chez les quatre groupes de rats, nous avons déterminé la peroxydation lipidique en mesurant le taux des hydroperoxydes (HP) ; produits essentiels de la peroxydation des lipides, d’acides gras polyinsaturés (AGPI) ou de leurs esters (comme les phospholipides et triglycérides) (Mundy et al., 2007). Ces molécules oxydées peuvent se décomposer en « produits secondaires » et « terminaux » pour former des endoperoxydes cycliques et finalement des aldéhydes comme le MDA (dialdéhyde malonique, un autre paramètre de la peroxydation des lipides) (Flourie et al., 2006; Haleng et al., 2007). Nous avons aussi mesuré le taux des diènes conjugués (DC), considérés comme marqueurs de la peroxydation lipidique. δ’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques, induite par les métaux (cuivre), est déterminée par le suivi au

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Partie in vivo : Discussion cours du temps de la formation de ces diènes conjugués (DC) (Esterbauer et al., 1989). Le principal mode d'attaque des acides gras polyinsaturés est dû à l'action du radical hydroxyl, capable d'arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons, position particulièrement fragile. Le radical acide polyinsaturé formé va très vite évoluer en un radical diène conjugué, plus stable, par délocalisation de la double liaison (Favier, 1997b).

Nous avons observé, lors de notre étude, une augmentation des teneurs plasmatiques et érythrocytaires en MDA et en hydroperoxydes chez les rats recevant un régime supplémenté en cholestérol (NRTC et NRBC) en faveur de la peroxydation des lipides. Nos résultats montrent que les taux initial et maximal des diènes conjugués sont plus élevés chez les rats nourris au régime supplémenté en cholestérol (NRTC et NRBC) comparés aux témoins (RT et RTA).

Ainsi, la formation des radicaux libres et la peroxydation lipidique semblent augmentées face à l’hypercholestérolémie. En effet, Il a été montré que des rats soumis au régime riche en cholestérol présentaient un stress oxydatif se manifestant par une augmentation des teneurs en hydroperoxydes et en carbonyles au niveau du plasma, des tissus et des érythrocytes (Naughton et al., 2009). En outre, l'hypercholestérolémie est associée à une augmentation de la production des radicaux libres d’oxygène et de l’augmentation de l'oxydation du cholestérol LDL (Napoli et al., 1995; Davi et al., 1997).

De même, Sudhahar et al., et Lassoued et al., ont montré que l'hypercholestérolémie est associée à la détérioration de l'état antioxydant, résultant de l'augmentation des taux des marqueurs de la peroxydation lipidique (εDA) et une diminution de l’activité de quelques enzymes antioxydantes (Sudhahar et al., 2006; Lassoued et al., 2014).

Cependant, la consommation de l’huile de pépins de bigarade réduit significativement la peroxydation lipidique au niveau du plasma et des érythrocytes, en diminuant le taux en MDA et en hydroperoxydes surtout chez les rats hypercholestérolémiques. De même, nos résultats montrent que les taux initial et maximal des diènes conjugués ont été diminués significativement chez les rats recevant un régime hypercholestérolémiant enrichi en huile de bigarade. De plus, elle induit une augmentation du temps de latence (Tlag) et du temps maximal (Tmax) chez le même groupe de rats. Plus le Tlag est long et plus les lipoprotéines sont résistantes à l’oxydation (Esterbauer et al., 1989). Ceci peut être expliqué par la protection des lipoprotéines par les antioxydants lipophiles comme la vitamine E, considérée

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Partie in vivo : Discussion comme le principal antioxydant lipidique soluble (Jialal and Grundy, 1992), son caractère hydrophobe lui permet de s’insérer au sein des acides gras de la membrane cellulaire et des lipoprotéines, où elle joue un rôle protecteur en empêchant la propagation de la peroxydation lipidique induite par un stress oxydant (Vertuani et al., 2004; Magosso et al., 2013).

La lipoperoxydation des membranes va altérer leur fonctionnalité (modification de leur perméabilité, de leur fluidité, perte d’activité d’enzymes, de récepteurs...). δes lipoprotéines telles que les LDL, riches en cholestérol et en phopholipides sont des cibles privilégiées de la peroxydation lipidique. δes δDδ oxydées sont fortement incriminées dans l’athérogenèse (Cillard and Cillard, 2006).

Il a été montré par Jialal et Grundy, que l’incubation des δDδ avec l'α-tocophérol in vitro inhibe sa modification oxydante. Ces mêmes auteurs ont montré que la supplémentation alimentaire de l’alpha-tocophérol diminue la formation des diènes conjugués et entraîne une diminution de la sensibilité des LDL à l'oxydation chez les patients comparés à leur témoins pendant 12 semaines de régime (Jialal and Grundy, 1992).

Selon Kamal-Eldin et Budilarto, l'activité antioxydante des tocols est principalement due à leur capacité à donner leur hydrogène phénolique aux radicaux libres lipidiques (Kamal- Eldin and Budilarto, 2015) Par ailleurs, la réduction de la peroxydation lipidique chez les rats après consommation de l’huile de pépins de bigarade peut être due à la combinaison de l’α-tocophérol avec les polyphénols présents dans cette huile. En effet, des études ont prouvé que les aliments riches en tocophérols et en composés phénoliques peuvent réduire la susceptibilité des lipoprotéines à la peroxydation lipidique (Reaven et al., 1993; Visioli et al., 1995).

De même, d’autres études ont montré que les composés phénoliques alimentaires peuvent avoir une activité antioxydante directe exercée dans le tractus gastro-intestinal, comme la réduction de la peroxydation lipidique, ce qui entraînerait une amélioration globale du statut antioxydant animal (Kerem et al., 2006).

Selon Mora et al., l’hespéridine, la naringénine et le naringine, principalement présents dans les agrumes, ont présenté une faible activité antioxydante dans les systèmes de peroxydation lipidique (Mora et al., 1990; Yuting et al., 1990). Cependant, dans la littérature récente, les flavonoïdes d’agrumes qui comprennent la naringine, la naringénine, l'hesperidine,

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Partie in vivo : Discussion l'hesperetine et la tangerétine, ont montré des effets inhibiteurs sur la production des ROS (Manna et al., 2016; Yoon et al., 2010). D’après Zou et al., ces flavonoïdes agissent comme agents préventifs qui provoque la scission de la chaîne oxydative, détruisant efficacement les espèces réactives d'oxygène (Zou et al., 2016).

D’autres études ont montré que les extraits des flavonoïdes des Citrus ou les flavonoïdes purs des Citrus présentent également une capacité inhibitrice potentielle de la peroxydation lipidique, car ils sont capables d'inhiber l'accumulation des ROS ou de les éliminer du système biologique (Arul and Subramanian, 2013; Paul et al., 2015; Singh et al., 2014).

En effet, la naringénine a empêché la peroxydation lipidique et les dommages des cellules hépatiques, elle a également protégé le système antioxydant de l'hépatocarcinogenèse induite par la N-nitrosodiméthylamine chez les rats (Arul and Subramanian, 2013). δa diminution de la peroxydation lipidique par l’huile de bigarade peut être aussi expliquée par sa richesse en acide oléique. Il a été suggéré qu’une teneur élevée en AGεI peut réduire le risque de maladies cardiovasculaires, car les particules de LDL enrichies en acide oléique sont plus résistantes à l’oxydation (Lapointe et al., 2006; Fitó et al., 2007) . Par conséquent, ce groupe d’acides gras n’est pas facilement oxydable et il est impliqué dans la modulation de la fluidité des HDL ce qui augmente le flux du cholestérol (Sola et al., 1990).

Comme il a été cité précédemment, le stress oxydatif est un phénomène sous-jacent à l’hypercholestérolémie (Moreira et al., 2011). En effet, plusieurs études ont révélé que l'hypercholestérolémie est associée à une perturbation des défenses antioxydantes (Küçükgergin et al., 2010; Coban et al., 2013; Lassoued et al., 2014). Par ailleurs, plusieurs lignes de défense antioxydantes sont mises à la disposition des cellules de l'organisme, incluant des composants enzymatiques ou non, qui protègent les biomolécules (protéines, lipides…) contre les effets néfastes des radicaux libres, en effet, l’hyperproduction de radicaux libres, et donc les dommages tissulaires qu’ils engendrent, sont limités par la présence naturelle endogène de substances antioxydantes (Jaeschke, 1995; Wilson, 2009).

Dans notre étude, nous avons, dans un premier temps, dosé les taux plasmatiques des vitamines A, C et E. en effet, la vitamine A a un effet antioxydant lié principalement à une réaction avec les radicaux peroxyls (Peng et al., 2013). La vitamine C élimine le radical hydroxyle et l’anion superoxyde dans les milieux biologiques mais aussi des espèces azotées

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Partie in vivo : Discussion réactives, par la formation de l'acide semi-dehydroascorbique empêchant ainsi la dégradation oxydante des biomolécules essentielles (Sung et al., 2013; Ding et al., 2012). Bien que l'acide ascorbique n'est pas un piégeur direct des radicaux lypophiles, il agit en synergique avec le tocophérol, dans l’élimination des peroxydes lipidiques. En effet, à l'interphase lipidique-aqueuse, l'acide ascorbique réagit avec le radical tocopheroxyl oxydé lié à la membrane en le réduisant et en régénérant le tocophérol actif, sera capable d'accomplir ses rôles antioxydants (Kojo, 2004; Ding et al., 2012).

δ’alpha-tocophérol (la vitamine E) lutte contre la peroxydation lipidique des membranes cellulaires, en stoppant la chaîne radicale par la formation d’un dérivé à faible réactivité incapable d'attaquer les substrats lipidiques (Descamps Latscha et al., 2001). Ainsi, la vitamine E accomplit son rôle dans la préservation de la membrane Contre les ‐ dommages causés par les radicaux libres favorisés par les lipoprotéines de faible densité (Himmelfarb and Hakim, 2003). La vitamine E contribue ainsi à stabiliser les plaques d'athérosclérose (Devaraj and Jialal, 1998; Diaz et al., 1997).

Nos résultats montrent que l’huile de bigarade augmente de manière significative les teneurs plasmatiques en vitamine E chez les rats témoins et hypercholestérolémiques, mais n’agit pas sur les teneurs plasmatiques en vitamines A et C. Cette augmentation en vitamine E plasmatique peut être due à l’abondance en huile de bigarade en α-tocophérol (194,25 µg/ml). En effet, il a été montré que le statut vitaminique d’un individu dépend directement de ses apports alimentaires en vitamines (Lavallée et al., 2004).

De nombreuses études ont signalé que la vitamine E contenue dans les agrumes peut chélater les ions métalliques ferreux (Fe2+) et les ions cuivre (Cu2+), considérés comme les promoteurs les plus influents qui causent la peroxydation des lipides (Dávalos et al., 2003; Amitava and Kimberly, 2014).

Nous avons aussi mesuré l’activité antioxydante des enzymes ; la catalase, la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GSH-Px) et réductase (GSSG-Red) et le glutathion réduit. δe pouvoir antioxydant total du plasma (ORAC), c’est-à-dire sa capacité à absorber les radicaux oxygène libres est aussi analysé en suivant l’hémolyse des globules rouges générée par les radicaux libres in vitro.

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Partie in vivo : Discussion

La réduction de la capacité antioxydante totale ORAC a été associée à l’augmentation des marqueurs du stress oxydatif tels que MDA et les hydroperoxydes chez les rats consommant le régime supplémenté en cholestérol.

Le glutathion est un tripeptide à cystéine (acide glutamique-cystéine-glycine). Le glutathion sous forme réduite est l’antioxydant le plus important des cellules, les protégeant notamment des radicaux libres (Ding et al., 2012). Par des échanges thiol-disulfure, le GSH contribue au métabolisme des protéines et à la régulation de leurs activités. En situation de stress oxydant, son rôle protecteur et détoxifiant résulte principalement de sa fonction de coenzyme des glutathion peroxydases et des glutathion-S-transférases. Le glutathion joue un rôle clé dans le recyclage d’autres antioxydants bien connus, telles que les vitamines C et E, en les conservant dans leur état actif (Gerard-Monnier and Chaudiere, 1996).

La glutathion peroxydase (GSH-Px) peut réduire le peroxyde d’hydrogène en eau en utilisant les capacités réductrices du couple glutathion / glutathion disulfide (GSH / GSSG) et permettre également de limiter la propagation des réactions radicalaires en chaîne en réduisant les peroxydes instables en acides gras hydroxylés. La glutathion réductase (GSSH- Red) permet la régénération du glutathion réduit à partir du glutathion oxydé en présence de NADPH (Gerard-Monnier and Chaudiere, 1996). Dans notre étude, le régime hypercholesterolémique provoque une réduction significative du Glutathion réduit chez les rats consommant ce régime, ces résultats sont en accords avec les travaux de Balkan al. (β00β) qui a révèlé qu’une supplémentation de 1% en cholestérol chez les lapins pendant deux mois de régime induit une diminution des teneurs en glutathion réduit et en glutathion peroxydase (Balkan et al., 2002). En revanche, la consommation de l’huile de pépins de bigarade augmente de manière significative les teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit chez les rats supplémentés en cholestérol, ceci peut être due à la diminution de l’activité de la glutathion peroxydase suite à la réduction de la production d’espèces réactives de l’oxygène. δ’élévation des niveaux de glutathion combat l’oxydation des acides gras présents dans la circulation sanguine, incluant le cholestérol, retardant ainsi le processus de formation de plaques dans les artères (Stamler and Slivka, 1996).

δ’organisme dispose d'enzymes antioxydantes telles que les superoxydes dismutases (SOD), les catalases, les glutathion réductases et les glutathion peroxydases, qui agissent à la source même de la réaction en chaîne induite par les espèces réactives de l’oxygène et

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Partie in vivo : Discussion constituent donc, le premier et l’un des principaux maillons du processus de défense contre les radicaux libres (Matsuda and Shimomura, 2013). La superoxyde dismutase transforme l'anion superoxyde en peroxyde d'hydrogène qui est éliminé par la glutathion peroxydase ou la catalase empêchant ainsi, la formation des radicaux libres oxygénés plus agressifs comme le peroxynitrite ou le radical hydroxyle (Afonso et al., 2007). Un faible niveau de superoxyde est constamment généré par la respiration aérobie. La chaîne de transport d'électrons des mitochondries, destinée à escorter quatre électrons à l'oxygène moléculaire pour former de l'eau, échappe occasionnellement à un seul électron. Le superoxyde réduit Fe (III) en Fe (II), libérant le fer des sites de stockage afin qu'il puisse réagir avec du peroxyde d'hydrogène et produire des radicaux hydroxyle. La SOD convertit le superoxyde en peroxyde d'hydrogène et en oxygène moléculaire. Cette dernière assure ainsi la première ligne de défense contre le stress oxydant (Afonso et al., 2007). Nous avons noté une modification des activités des enzymes antioxydantes chez les différents lots de rats. δ’enrichissement du régime en cholestérol peut influencer l’activité des enzymes impliquées dans la défense antioxydante. En effet, l’étude de εantha et al., a montré chez le lapin consommant un régime enrichi en cholestérol, une diminution de l’activité de la SOD au niveau sérique (Mantha et al., 1993). Nos résultats montrent que la consommation de l’huile de bigarade provoque une augmentation significative de l’activité de la catalase érythrocytaire chez les NRBC et de la SOD plasmatique aussi bien chez les rats témoins que chez les rats hypercholesterolémiques. En revanche, l’activité de la glutathion réductase était inchangée chez les quatre groupes de rats. D’aprés Mahfouz and Kummerow, l’augmentation de l’activité de la catalase dans le foie de rats nourris au cholestérol pourrait avoir un rôle protecteur contre l'oxydation, empêchant ainsi la formation de peroxydation lipidique et d'oxysterols (Mahfouz and Kummerow, 2000).

δ’activation du système enzymatique est due à la présence des composés bioactifs dans l’huile de bigarade notamment les polyphénols et la vitamine E, qui ont un rôle protecteur contre les différentes pathologies. De nombreuses études ont montré que la naringénine, principal flavonoïde des agrumes, réduit de manière significative la proxydation lipidique et restaure les teneurs en antioxydants, comme la SOD, la catalase, la glutathion peroxydase et le glutathion transférase dans le foie des rats (Harbeby, 2011; Renugadevi and Prabu, 2010).

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Partie in vivo : Discussion

En outre, d’autres études ont montré que la supplémentation de la naringine chez des rats diabétiques, améliore les enzymes anti-oxydantes (SOD, catalase et GPx) (Punithavathi et al., 2008, Jeon et al., 2002). δ’effet de la naringine sur les enzymes anti-oxydantes à été prouvé aussi chez les lapins consommant du cholestérol (Jeon et al., 2002). Selon la littérature, les polyphénols comme la quercétine ainsi que les extraits de certains produits naturels induisent une réponse antioxydante par l’activation du Nrf-2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2) (Arredondo et al., 2010; Tanigawa et al., 2007). Le Nrf-2 est un facteur de transcription activé par un signal oxydatif dans le cytoplasme, qui provoque la translocation vers le noyau, où il induit l'expression des gènes antioxydants et cytoprotecteurs comme la SOD, Glutathion trasférase, et la NADPH-quinone oxydase (Eggler et al., 2008).

La supplémentation du cholestérol dans le régime des rats provoque un déséquilibre du statut oxydant/antioxydant. Toutefois, il est important de noter que le régime à base d’huile de pépins de bigarade provoque non seulement la diminution de la production excessive des produits de la peroxydation, mais aussi l’augmentation des capacités de défenses antioxydantes par l’augmentation de certaines activités d’enzymes chez les rats. Ces résultats confirment l’effet bénéfique de l’huile de pépins de bigarade (Citrus aurantium) sur les troubles oxydatifs lié à l’hypercholestérolémie.

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CONCLUSION GENERALE

Conclusion générale

De nos jours, l'un des principaux domaines de recherche en Science et technologie des aliments est l'extraction et la caractérisation de nouveaux ingrédients naturels ayant une activité biologique qui peut être incorporée dans un aliment fonctionnel, contribuant au bien- être du consommateur (da Silva et al., 2016). En effet, ces dernières années, la recherche s'est concentrée sur les plantes médicinales riches en antioxydants naturels et peu coûteux qui peuvent remplacer les additifs synthétiques qui pourrait être carcinogène et toxique (Lagha-Benamrouche and Madani, 2013). Ces dernières années, l'activité antioxydante des agrumes et leurs rôles dans la prévention et le traitement de diverses maladies chroniques et dégénératives ont attiré de plus en plus d'attention (Zou et al., 2016). Cependant, des recherches récentes ont montré que leurs sous-produits sont prometteurs dans l'industrie alimentaire en tant que sources de composés bioactifs ; représentant ainsi un excellent candidat pour les nutraceutiques et les aliments fonctionnels destinés à réduire ou empêcher les maladies causées par le stress oxydatif (Rafiq et al., 2016).

C’est dans ce contexte, que notre étude a porté sur la valorisation d’un sous- produit, peu étudié, les pépins d’orange amère (Citrus aurantium), en étudiant leur composition en métabolites primaires et secondaires, notamment les polyphénols et leurs activités antioxydantes, ainsi que la valeur nutritionnelle et thérapeutique de leur huile.

Dans le premier volet, l’analyse phytochimique des pépins du Citrus aurantium a montré que les lipides présentaient le constituant majoritaire (38,21%) des métabolites primaires, suivi de protéines, minéraux et sucres. Il ressort de l’analyse des indices physicochimiques de l’huile extraite à partir des pépins que c’est une huile pure et riche en acides gras insaturés de chaine moyenne C18. Ces résultats sont confirmés par l’analyse chromatographique de la composition en acides gras qui montre une richesse en acides oléique (27,70%) et linoléique (39,30%), ainsi qu’une prédominance de l’acide palmitique (26,85%). La partie insaponifiable de l’huile a montré sa richesse en α- tocophérols (194,25 µg/ml) la protégeant ainsi contre l’oxydation naturelle des acides gras insaturés lors du stockage et assurant un bon apport alimentaire en antioxydants.

En ce qui concerne les métabolites secondaires, la quantification des composés phénoliques, des pépins des bigarades par les méthodes spectrophotométriques est estimée à 2,13 ± 0,0018 mg AGE /g MS, dominée par les tanins condensés (0,3 ± 0,03 mg CE/g MS)

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Conclusion générale suivi par les deux fractions acétate d’éthyle et n-butanol des flavonoïdes (0,033±0,004 mg CE/g εS et 0,04γ±0,005 mg CE/g εS). δa fraction phénolique de l’huile extraite à partir des pépins est estimée à (0,219 mg AG/g MS).

δ’évaluation de l’activité antioxydante des extraits phénoliques in vitro par les trois méthodes utilisées (DPPH, FRAP et carotène) a montré que les différents extraits possèdent une capacité antioxydante. Cependant la fraction acétate d’éthyle des flavonoïdes possède la meilleure activité antioxydante mais qui reste inférieur à celle de la vitamine C et du BHA. Par ailleurs, l’extrait phénolique de l’huile de pépins de bigarade inhibe le blanchissement du -carotène à des différentes concentrations par le piégeage des radicaux libres, elle présente une valeur d’IC50 égale à 1,18±0,009 mg/ml par rapport à celle de l’acide gallique (0,43 ± 0,001 mg/ml).Ces résultats peuvent être attribués à ces composés antioxydants mineurs tels que les tocophérols et les polyphénols.

Dans le deuxième volet, nous avons mis en évidence les effets de l’huile de pépins de bigarade sur la dyslipidémie, en particulier les variations de la cholestérolémie d'une part, et sur les marqueurs du stress oxydatif et de la défense antioxydante, d'autre part chez des rats Wistar rendus hypercholestérolémiques induit par du cholestérol alimentaire (1%). δ’enrichissement du régime en cholestérol peut causer des troubles métaboliques chez les rats comme l’augmentation du cholestérol, du δDδ-cholestérol et des triglycérides. L'hypercholestérolémie induite par le régime supplémenté en cholestérol peut influencer non seulement la production excessive de radicaux libres, mais aussi la diminution de l’activité des enzymes impliquées dans la défense antioxydante. En effet, nous avons observé une augmentation significative des teneurs en hydroperoxydes et en MDA plasmatiques et érythrocytaires chez les rats hypercholestérolémiques, ces teneurs sont diminuées de manière significative chez les rats recevant un régime enrichi en huile de bigarade.

δ’huile de pépins de bigarade, riche en acides gras insaturés (oléique-linoléique) ainsi qu’en antioxydants (les polyphénols, stérols et les tocophérols), semble avoir un effet hypoglycémiant, hypotriglycéridémiant et hypocholestérolémiant contre l’effet du régime hypercholestérolémiant chez les rats Wistar.

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Conclusion générale

De plus, il a été constaté que l’huile de pépins de bigarade pourrait avoir un effet bénéfique sur le statut redox par son action antioxydante. En effet, cette action s’est résumée à l’amélioration des marqueurs de la peroxydation lipidique (εDA et hydroproxydes) et de l’activité de certains enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires (SOD et catalase) ainsi que l’augmentation des taux des antioxydants non enzymatiques, tels que la vitamine E et le glutathion réduit en particuliers chez les rats recevant un régime supplémenté en cholestérol. Ces résultats seraient probablement dus à l’association de plusieurs composés bioactifs ayant une activité antioxydante importante, présents dans l’huile de pépins de bigarade notamment la vitamine E et les polyphénols, en particulier les flavonoïdes.

δes teneurs en acides gras insaturés et en tocophérols pourraient conférer à l’huile de pépins de bigarade de bonnes qualités permettant des applications cosmétiques. En revanche, la consommation de cette huile pourrait constituer une cible thérapeutique très prometteuse pour le traitement de l’hypercholestérolémie et des désordres associés.

A la lumière de cette étude, ce travail préliminaire consacré aux pépins du Citrus aurantium (bigarade) et de leur huile nécessite d’être poursuivie en s’intéressant essentiellement à :

- δa réalisation d’une étude phytochimique approfondie qui consiste à la purification, l’identification et la caractérisation des polyphénols pour les pépins et l’huile, - Déterminer la composition des stérols dans l’huile, - Faire une étude histologique au niveau du foie, et du tissu adipeux chez les rats pour mieux étudier les complications liées à l’hypercholestérolémie induit par le cholestérol alimentaire, - Faire une étude des mécanismes moléculaires des constituants des pépins et de l’huile de bigarade responsables de l’effet hypocholestérolémiant. - Et enfin, tester ces sous produits de l’orange amère sur d’autres pathologies, comme le diabète, l’obésité et le cancer.

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Références bibliographiques

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ANNEXES

Annexes

Figure 35 : Courbe d’étalonnage du glucose pour le dosage des sucres totaux.

Figure 36 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique pour le dosage des phénols totaux.

Figure 37 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des flavonoïdes.

159

Annexes

Figure 38 : Courbe d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des tanins.

Tableau 13: Evolution du poids corporel (g) chez les différents lots de rats

Lots NRT NRB NRTC NRBC Jours J0 198,08 ± 5,20 200,04 ± 8,38 202,87 ± 10,80 201,60 ± 16,23

J7 222,04 ± 9,19 227,34 ± 5,89 230,34 ± 11,67 229,28 ± 12,84

J14 239,66 ± 9,57 242,7 ± 9,62 250,86 ± 13,78 248,86 ± 11,63

J21 256,3 ± 8,74 266,3 ± 10,24 272 ± 9,92 269,8 ± 9,96

J28 271,04 ± 9,76 278,04 ± 10,66 287,3 ± 8,71 282,3 ± 10,67

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n=5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime témoins +1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade +1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

160

Annexes

Tableau 14 : Quantité d’aliment ingérée des rats témoins et expérimentaux.

Lots NRT NRB NRTC NRBC

Aliment ingéré (g) 17,97 ± 1,36 18,75 ± 1,35 19,49 ± 2,28 19,28 ± 2,00

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n=5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime témoins +1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade +1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

Tableau 15 : Variation de la glycémie (g/L) chez les rats témoins et expérimentaux

Lots Jours NRT NRB NRTC NRBC

J0 1,10 ± 0,07 1,05 ± 0,14 1,14 ± 0,12 1,15 ± 0,03

J7 1,06 ± 0,06 1,03 ± 0,05 1,10 ± 0,07 1,11 ± 0,04

J14 1,07 ± 0,05 a 0,89 ± 0,07 c 1,03 ± 0,06 a 1,00 ± 0,04 ab

J21 1,02 ± 0,07 0,98 ± 0,06 1,02 ± 0,06 1,04 ± 0,07

J28 1,02 ± 0,06 a 0,88 ± 0,05 b 1,03 ± 0,06 a 0,99 ± 0,08 a

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n=5. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime témoins +1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade +1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

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Annexes

Tableau 16: Teneurs plasmatiques en protéines (mg/ml), en créatinine (g/L) et en urée (mg/L) chez les différents lots de rats.

Lots NRT NRB NRTC NRBC Paramètres Protéines totales 73,76 ± 5,84 76,07 ± 7,05 79,64 ± 7,47 77,37 ± 6,15

Urée 0,52 ± 0,07 0,51 ± 0,09 0,51 ± 0,09 0,45 ± 0,05

Créatinine 7,6 ± 0,55 6,4 ± 0,55 6,6 ± 0,89 7,2 ± 0,84

Tableau 17: Teneurs en triglycérides et en cholestérol du plasma et des lipoprotéines (mmol/L) chez les différents lots de rats

Lots NRT NRB NRTC NRBC Paramètres Triglycérides 0,51 ± 0,04 b 0,43 ± 0,04 c 0,60 ± 0,03 a 0,57 ± 0,05 ab

Cholestérol 2,95 ± 0,16 c 2,79 ± 0,24 cd 3,76 ± 0,22 a 3,32 ± 0,18 b

HDL-C 1,35 ± 0,08 1,38 ± 0,07 1,31 ± 0,05 1,45 ± 0,08

LDL-C 1,66 ± 0,08 c 1,46 ± 0,10 c 2,48 ± 0,10 a 1,85 ± 0,16 c

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Annexes

Tableau 18: Poids relatif (g/100g) et taux des lipides totaux du foie (mg/g de tissu) chez les lots de rats.

Lots NRT NRB NRTC NRBC Foie Poids relatif 2,88 ± 0,13 c 2,73 ± 0,22 c 4,12 ± 0,36 a 4,12 ± 0,16 a

Lipides totaux 46,76 ± 9,62 c 38,22 ± 7,65 c 105,52 ± 10,70 a 98,72 ± 4,83 ab

Tableau 19: marqueurs plasmatiques et érythrocytaires du statut oxydant chez les différents lots de rats

Lots Paramètres NRT NRB NRTC NRBC

MDA plasmatique (µmol/L) 0,96 ± 0,08 b 0,84 ± 0,12 bc 1,14 ± 0,08 a 1,02 ± 0,09 ab

MDA érythrocytaire (µmol/L) 2,34± 0,08 b 2,11± 0,16 c 2,69 ± 0,08 a 2,46 ± 0,10 b

HP plasmatique (µmol/L) 2,10 ± 0,46 c 1,81 ± 0,15 c 2,91 ± 0,23 a 2,52 ± 0,37 ab

HP érythrocytaire (µmol/L) 2,86 ± 0,16 c 2,30 ± 0,43 c 4,42 ± 0,50 a 3,62 ± 0,44 b

163

Annexes

Tableau 20: εarqueurs de l’oxydation in vitro des lipoprotéines plasmatiques chez les différents lots de rats

Lots NRT NRB NRTC NRBC Paramètres T lag (min) 148,6± 4,10 a 140,60 ± 2,30 ab 122,4± 8,32 d 133,34± 7,07 c

T max (min) 232 ± 12,52 ab 239 ± 12,63 a 209 ± 8,94 c 230 ± 9,27 ab

DIC ti (µmol/l) 9,92± 0,42c 9,12± 0,74 cd 11,89± 0,40 a 10,68± 0,81b

DIC tm (µmol/l) 11,94± 0,83 b 11,77± 0,52 b 13,10± 0,93 a 11,754± 0,60 b

Chaque valeur représente la moyenne ± Ecart type, n= 5. DCi : diènes conjugués initiaux ; DCmax : diènes conjugués maximaux ; T lag = temps correspondant au début de l’oxydation des lipoprotéines ; T max = temps nécessaire pour obtenir l’oxydation maximale des lipoprotéines in vitro. NRT : rats nourris au régime témoin ; NRTC : rats nourris au régime témoins +1 % cholestérol ; NRB : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade ; NRBC : rats nourris au régime expérimental enrichi en huile de pépins de bigarade +1 % cholestérol. Après vérification de la distribution normale des variables, la comparaison des moyennes entre les deux groupes de rats soumis au régime témoin et entre les deux groupes de rats soumis au régime enrichi en cholestérol est effectuée par le test ANOVA à un facteur. Cette analyse est complétée par le test de Tukey afin de classer et comparer les moyennes deux à deux. Les moyennes indiquées par des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P < 0,05).

Tableau 21: Teneurs plasmatiques en vitamine C, A et E chez les différents lots de rats

Lots NRT NRB NRTC NRBC Paramètres Vitamine C (µmol/L) 12,63 ± 2,45 14,70 ± 2,11 12,14± 2,73 12,58 ± 2,06

Vitamine A (µmol/L) 44,02 ± 3,06 42,33 ± 2,27 40,72 ± 3,29 41,16 ± 2,78

Vitamine E (µmol/L) 7,43±0,93b 9,17± 1,03a 6,66± 0,73c 8,56± 0,91ab

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Annexes

Tableau 22: Teneurs plasmatiques et érythrocytaires en glutathion réduit (nmol/L) et pouvoir antioxydant total chez les différents lots de rats

Lots Paramètres NRT NRB NRTC NRBC

Teneur plasmatique 151,16± 9,22 ab 159,82± 14,43a 130,03± 8,06c 146,35 ± 10,48ab

Teneur érythrocytaire 149,10± 9,66a 149,1± 9,74a 121,34± 6,68c 140,44± 9,03ab

ORAC (UA) 1,67 ± 0,12a 1,74± 0,15a 1,33± 0,25b 1,52± 0,17ab

Tableau 23 : Activités des enzymes antioxydantes plasmatiques et érythrocytaires U/ml/min chez les différents lots de rats.

Lots Paramètres NRT NRB NRTC NRBC Catalase plasmatique ab a bc b (U/ml/min) 290,11± 13,40 303,48± 17,29 260,08 ± 21,35 266,68 ± 9,41

Catalase érythrocytaire ab a d bc (U/ml/min) 191,23 ± 8,24 205,01± 8,89 150,43± 8,85 177,29± 12,18

SOD plasmatique c a e c (U/ml/min) 303,14 ± 12,03 348,76 ± 10,53 253,56± 9,59 293,13 ± 12,71

SOD érythrocytaire ab a cd bc (U/ml/min) 236,50 ± 16,84 247,70 ± 14,73 187,14± 8,86 216,78± 10,99 GSSH-red plasmatique (U/ml) 40,15 ± 2,77 41,63 ± 3,67 43,50 ± 4,05 45,76 ± 3,29 GSSH-red érythrocytaire (U/ml) 44,13 ± 3,47 46,93 ± 3,24 45,91 ± 3,86 48,04 ± 2,90

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Annexes

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