/OA (12) 특허협력 조약에 의하여 공개된 국제출원

(19) 세계지 식재산권기구 국제사무국 (10) 국제공개번호 (43) 국제공개일 WO 2017/142292 A l 2017 년 8 월 24 일 (24.08.2017) W Ο P C T

(51) 국제특허 분류: Incheon (KR). 최병현 (CHOI, Byeong-Hyeon); 08308 서 0 67/(927 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01) 울 시 구로구 구로동로 148, 연구동 2 층 흉부 외과 연구 실, Seoul (KR). (21) 국제출원번호: PCT/KR2017/001610 (74) 대 리 인 : 특 허 법 인 충 현 (CHUNG HYUN PATENT (22) 국제출원일: 2017 년 2 월 14 일 (14.02.2017) LAW FIRM); 06779 서울 시 서초 구 동산로 23 베 델 회 (25) 출원언어 : 한국어 관 8 층, Seoul (KR).

(26) 공개언어 : (81) 지정국 ( 별도 의 표 시가 없는 한 , 가능한 모든 종류의 국 내 권 리 의 보 호 를 위 하 여 ) : AE, AG, AL, AM, AO, (30) 우선권정보: AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, 10-2016-0017226 2016 년 2 월 15 일 (15.02.2016) K R CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DJ, DK, DM, 년 월 일 10-2017-00193 12 2017 2 13 ^13.02.2017; K R DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, (71) 출원인: 고 려대학교 산학협력단 (KOREA UNIVER HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KH, KN, SITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION) KP, KW, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, [KR/KR]; 0284 1 서 울 시 성 북 구 안 암 로 145, Seoul ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, CM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, (KR). RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, (72) 발명자: 김현구 (KIM, Hyun Koo); 06579 서울 시 서초 TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, 구 반포 대로 39 길 63-8, A 동 402 호 , Seoul (KR). 용환 ZM, ZW. 석 (YONG, Hwan-seok); 06002 서 울 시 강남구 압구정 (84) 지정국 ( 별도 의 표 시가 없는 한 , 가능한 모든 종류의 로 29 길 71, 33 동 1103 호, Seoul (KR). 팬위화 (QUAN, 역내 권 리 의 보호를 위 하 여 ) : ARIPO (BW, GH, GM, Yuhua); 14046 경기도 안 양 시 동 안구 달안로 62, 602 KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, 동 17이 호 , Gyeonggi-do (KR). 노지윤 (RHO, Jiyun); ZM, ZW), 유 라 시 아 (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, 21384 인천 시 부 평 구 경 원 대로 1269, 117 동 804 호 , TM), 유 럽 (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE,

[다음 쪽 계속]

(54) Title: METHOD FOR PRODUCING ANIMAL MODEL WITH LUNG CANCER

(54) 발명의 명칭 ：폐 암 동물모 델의 제조 방법

(57) Abstract: The present invention relates to a method for producing an animal model with lung cancer. The method for producing an animal model with lung cancer, according to the present invention, enables the production of an animal model in which the real time confirmation of whether the transplantation of a tumor tissue i s successful i s enabled by using CT and the success rate of trans - plantation i s also remarkably high. In addition, the present invention can provide a production method by which the side effects res - ulting fi"om the transplantation are significantly reduced and the production of an animal model with lung cancer i s enabled within a short time after the transplantation.

(57) 요약서 : 본 발 명은 폐 암 동물모델의 제조방 법 에 관한 것 이 본 발 명에 따른 폐암 동물모델의 제조 방 법은 CT 를 이 용하여 종 양 조 직 의 이식 이 성공적 인지 실 시 간으로 확 인하는 것 이 가능하면서 이식의 성공률도 현 저 히 높은 동물모델을 제조하는 것 이 가능 하다ᅳ 또한 이식 에 따른 부작용이 현저 히 줄 어들 며 , 이식 후 빠른 시간 안 에 폐 암 동물모델을 제조 할 수 있는 제조 방 법을 제공 할 수 있다ᅳ ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, 공개: MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, ― 국 제조 사 보고서 와 함 께 (조약 제 2 1 조(3)) SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG).

규칙 4.17 에 의한 선언서 : - 신 규 성 을 해치 지 아 니 하 는 개 시 또 는 신규성 상 실 의 예외 에 관 한 선 언 (규칙 4.17(v)) 명 세 서

발 명 의 명 칭 : 폐 암 동 물 모델의 제 조방법 기술분야 [1] 본 발 명 은 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 에 관 한 것 으로, 보 다 상 세 하게는 간단한 과 정 을 통 해 환 자 로부터 유 래 된 폐 암 세포를 동물에 주 입 하 여 정 위 적 으 로 폐 종양이 발 생 한 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 에 관 한 것 이 다 . 배 경 기술 [2] 폐 암 은 일반적 으 로 원 발 성 폐 암 을 의 미 하 며 , 원 발 성 폐 암 은 폐 에 서 기 원 한 악 성 종 양 을 의 미 한다. [3] 폐 암 에 걸 린 환자는 이 를 치 료하는 과 정 에 서 항암제 를 복 용하는 것 이 필 수 적 으 로 수반되 어 야 만 한다. 한편, 이 러 한 폐 암 의 발 생 원 인으로 가 장 많 이 알 려 진 것 은 흡연으 로 서 , 폐 암 의 85 는 흡 연 에 의 한 것으로 보 고 되 고 있다. 일 반 적 으 로 흡연은 폐 암 의 발 생 위 험 을 13 배 가 량 증가시 키 며 , 장 기 간 의 간 접 흡연은 1.5 배 정 도 증 가 시 키 는 것으로 알 려 져 있다. 하 지 만 , 폐 암 발 생자의 약 15 는 비 흡 연 자 및 예 전부터 전 혀 담배를 피 운 적 없 는 사 람 에 게 서 발 생 한다. 이 렇 게 흡 연 이 외 에 폐 암 을 발 병 시 키 는 원 인으로 는 간 접 흡 연 이 나 , 중금속 노출, 이 온화를 하 는 방 사선, 다 환 방향족 탄 화 수소, 폐 섬 유 증 등 이 보 고 되 고 있다. 또 한 유전적 요인도 폐 암 발 생 원 인 으로서 중요한 관련이 있다. 즉 , 폐 암 을 일 으 키 는 유전적 발 병 원인은 환 자마다 다양한 양 상으로 차 이 가 있 음 에 도 불 구 하고, 기 존 항 암제는 이 러 한 유전적 발 병 원인을 반 영 하 지 못하고 있 어 환 자마다 적 절 한 치 료 가 불가능 하다는 문 제 점 이 있 었다. 또 한 이 러 한 문 제 점 을 개 선하기 위 해 폐 암 환자의 감수성 검사를 진 행 한 후 항 암제를 처 리 하 고 있 기 는 하나, 상 기 검토한 바 와 같 이 기 존 항 암 제 가 다양한 유전적 발 병 원인을 반 영 하 지 못하는 문 제 점 으 로 인 해 감수성 검 사 의 실효를 거 두 지 는 못하고 있 는 실 정 이 다 . [4] 이 러 한 문 제 점 을 해 결 하고자 환 자 맞춤형 항암제 를 개 발하기 위 한 노 력 이 현 재

활 발하게 진 행 중 이 며 , 이 러 한 환 자 맞춤형 항 암 제 의 평 가 를 위 한 전 임 상 동 물 종 양 모 델 을 제 작하기 위 한 연 구들이 계 속 진 행 중 에 있다. 특 히 선 행 기 술 중 에 는 내 시 경 을 이 용하여 토 끼 VX2 를 토 끼 폐 에 주 입 하 는 동 물 모델에 관 한 기 술 등 이 있 으나, 토 끼 VX2 에 만 적 용 가 능 하다는 문 제 , 고 형 암 형 태 를 만 들 어 내 기 어 렵 다 는 문제, 이 식 의 정 확 성 이 현 저 히 떨 어 진 다 는 문 제 및 각 종 부 작용의 문 제 가 여 전 히 남 아 있다.

[5] 또 한 본 발 명 과 관련된 선 행 기 술문헌 으로는 대 한민국 공 개특허 제 10-2014-0133399 호 (특 허문헌 1) 가 있 으 며 , 상 기 특 허문헌 1에 는 종 양 세포의 일 차 배 양방법 및 이 를 이 용하여 암 환자의 발 병 장 기 와 동일한 장 기 에 이 식 하 는 자 기자리 이 식 동 물 모델에 관 한 기 술 이 개 시 되 어 있다. 발 명 의 상 세 한 설 명

기 술 적 과 제 [6] 본 발 명 은 상 술 한 문 제 점 을 해 결하기 위 해 안 출 된 것 으 로 서 , 본 발 명 의 목 적 은 간단한 과 정 을 통 해 정 확하게 폐 암 이 이 식 된 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 을 제 공하는 것 으로, 상 기 동 물 모델에 폐 암 세포를 이 식 하 여 도 부 작용이 발 생하지 않고, 폐 암 세포의 이 식 성 공율이 현 저 히 높 으 면 서 , 정 확 한 이 식 여부를 실 시 간으로 확인하 는 것 이 가능한 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 을 제 공 하 는 것 이

목 적 이 다 . 과 제 해 결 수 단 [7] 상 술 한 목 적 을 달 성 하 기 위 하 여 , 본 발 명 은 아 래 단계를 포함하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조방법 을 제 공 한다. [8] 1) 실 시 간 CT 로 동 물 의 폐 위 치 를 확 인하는 단 계 및 [9] 2) 상 기 단 계 에 서 확인된 동물의 폐 위 치 에 , 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액을 24-30 게 이 지 바늘로 주 사하는 단계. [10] 또 한 본 발 명 은 다 른 목 적 을 달 성 하 기 위 하 여 , 증 점 제 ；및 24-30 게 이 지 바

주사기 ；를 포 함하는 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 를 제 공 한다. [11] 또 한 본 발 명 은 또 다 른 목 적 을 달 성 하 기 위 하 여 아 래 단계를 포 함하는 항 암 제 의 스 크 리 닝 방 법 을 제 공 한다. [12] 1) 상 기 제 조방법 을 통 해 제조된 폐 암 동 물 모델에 항암제 후 보 물질을 투 여 하 는 단 계 ; 및 [13] 2) 상 기 1) 단 계 의 폐 암 동 물 모델에 서 종 양 세 포 의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 항암제 후 보 물질의 치 료 효능을 결 정 하 는 단계. [14] 또 한 본 발 명 의 또 다 른 목 적 을 달 성 하 기 위 하 여 아 래 단 계 를 포 함하는 폐 암 환 자 맞춤형 항암제 선 별 방 법 을 제 공 한다. [15] 1) 실 시 간 CT 로 동물의 폐 위 치 를 확 인하는 단계, [16] 2) 상 기 단 계 에 서 확인된 동물의 폐 위 치 에 , 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액을 24-30 게 이 지 바늘로 주 사하여 환 자 맞춤형 폐 암 동 물 모델을 수 득하는 단계, [17] 3) 상 기 수득된 환 자 맞춤형 폐 암 동 물 모델에 항 암제를 투 여 하 는 단 계 및 [18] 4) 상 기 환 자 맞춤형 폐 암 동 물 모델에 서 종 양 세 포 의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 환자에 따 른 항 암 제 의 치 료 효능을 결 정 하 는 단계. [19] [20] 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물 모델의 제 조방법 은 실 시 간 CT 를 이 용하여 종 양 세포의 이 식 이 성 공 적 인 지 실 시 간으로 확인하 는 것 이 가 능 하면서 이 식 의 성 공률도 현 저 히 높 은 동 물 모델을 제 조하는 것 이 가 능 하다. 또 한 이 식 에 따 른 부 작용이 현 저 히 줄 어 들 며 , 이 식 후 빠 른 시 간 안 에 폐 암 동 물 모델을 제 공하는 것 이 가 능 하다. 도면의 간 단 한 설 명 [21] 도 1은 실 시 예 1의 과 정 (폐 암 동 물 모델의 제 조 방법) 을 전 체 적 으 로 나 타내는 개 략 도 이 다 . [22] 도 2 는 실 시 예 1의 결과를 나타내 는 사 진 이 다 . [23] 도 3 은 실 시 예 2 의 과 정 을 전 체 적 으 로 나 타내는 개 략 도 이 다 .

[24] 도 4 는 실 시 예 2 에 따 른 폐 암 동 물 모델을 가 지 고 각 항암제 의 감수성 을 평 가 한 결과를 나 타내는 그래프 이 다 .

[25] 도 5 는 실 시 예 3 에 따 른 폐 암 동 물 모델에 사용되 는 개 량 주사기 를 촬 영 한 사 진 이 다 . [26] 도 6 은 실 시 예 3 에 따 른 폐 암 동 물모델 제 조 과 정 을 나타낸 사 진 이 다 . [27] 도 7 은 실 시 예 3 을 실 시 하 기 전 의 정 상 동 물모델 에 서 의 폐조직 (좌 측 )과 실 시 예 3 에 따 라 제조된 폐 암 동 물 모델의 폐 조 직 (우 측 )을 촬 영 한 사 진 이 다 .

[28] 도 8은 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 를 도 시 화 한 도 면 이 다 . [29] 도 9 는 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물모델 제 조 용 키 트 를 이 용하여 폐 암 동 물 모델을 제 조하는 일 예를 나타낸 개 략 도 이 다 . 발 명 의 실 시 를 위 한 최 선 의 형 태

[30] 이 에 본 발 명 자들은 종 양 이 식 성 공률이 높 은 소 형 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 을 개 발하기 위 하 여 예 의 연 구 노 력 한 결과, 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 을 발 견하여 본 발 명 을 완 성 하 였다.

[31] [32] 본 발 명 에 서 " 이 종 이 식 " 이 란 , 종 이 다 른 동물의 간 , 심 장 , 신 장 등 기 관 , 장 기 , 조 직 , 세 포 등 을 이 식 하 는 방 법 을 의 미 한다. 본 발 명 의 목 적 상 상 기 이 종 이 식 은 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세포를 동물에 이 식 하 는 방 법 으 로 이 해 될 수 있으나, 특별히 이 에 제 한 되 지 는 않 는다. [33] [34] 본 발 명 에 서 " 계 대 배 양 " 이 란 , 세 포 또 는 조 직 을 건강한 상 태 로 지 속 적 으 로 장 기 간 배 양하기 위 해 주 기 적 으 로 세 포 또 는 조 직 의 일부를 새 로 운 배 양용기 에 옮 긴 후 배 양 배 지 를 갈 아 주면서 세 포 또 는 조 직 의 대 (代 )를 계 속 이 어 서 배 양하는 방 법 을 의 미 한다. 한 정 된 공간을 가 진 배 양용기 내 에 서 세 포 또 는 조 직 내 세포의 수 가 늘 어 나면서 일 정 시 간 이 지 나 면 증 식 영 양분이 소 비 되 거 나 오 염 물 질 이 쌓 여 세포가 자연히 죽 게 되 므 로 , 건강한 세포의 수 를 늘 리 기 위 한

방 법 으 로 사 용 되 며 , 통 상 적 으 로 한 차 례 배 지 ( 배 양 용기) 를 교 체하는 것 또 는

세 포군을 나누어 배 양하는 것 을 1 계 대 ( 1 passage, F1) 라 고 한다. 일 반 적 인 계 대 배 양 에 서 의 배 양용기 로 는 면 역 결 핍 마 우스의 생 체 시 스 템 이 이 용 되 며 , 이 는 이 식 하 기 위 한 암 조 직 을 배 양하기 위 한 영 양 체 라 할 수 있다. 배 양 된 암 조 직 의 계 대 (passage, 예 ; F l → F2) 이 식 시 새 로 운 개 체 의 면 역 결 핍 마 우 스 가 사 용 되 는 것 이 바람직 하 며 , 이 를 마 우스의 순 계 생 산 을 위 한 근교계 ( 형 매교배 또 는

근 친교배 등 ) 와 흔 동하는 것 은 바 람 직 하 지 않다. 계 대 배 양 의 방 법 은 당 업 계 에 공지 된 방 법을 제한 없 이 사용할 수 있으나, 바람직 하게는 기계적 분 리 또는 효소적 분 리로 수 행될 수 있다. [35] 이때, 기계적 분 리 란, 물 리적 또는 기계적으로 세포 덩어리로서 의 조 직을 분 리하는 것을 의미하 며, 당업계에 공지 된 방법을 제한 없 이 사용할 수 있으나, 바람직 하 게는 블 레이드, 조 직 분 쇄기, 바늘, 피펫 팅, embryoid body divider 또는 스크 래퍼 중에서 어느 하나 이상을 이용할 수 있다. [36] [37] 일반적으로 세포는 생존을 위해 세포 의 특성을 변화시 키고 강한 생존 력을 갖는 세포는 계대 배 양시 계속 선 택되 기 때문에 본 래의 종양과 특 징 이 많 이 달 라지 게 된다. 특 히 암세포의 경우 환 경 인자에 따라 종 양세포의 분자적 특 징 및 표 현 형 이 쉽게 바뀔 수 있다는 문 제 점이 있다. 즉, 환자 유 래 암조직 을 이용 한 동물모델에 있어서 , 동물모델에 주 입하 기 전 암세포 를 다시 배양하고, 처리하는 전처 리단 계를 거치 게 된다면 상술한 문 제 점을 피해갈 수 없다는 한 계 점이 존 재한다. [38] 본 발 명 에서는 상 기 문 제 점을 해결하기 위하 여, 환자로부터 분 리된 폐암 세포를 별도의 처리 없 이 직접 주 입하 여 동물로부터 폐암을 유발하기 때문 에, 환자 고유의 폐암 상 태와 거의 동일한 형태 및 상태를 지닌 동물 모델을 제조할 수 있다. [39] [40] 본 발 명의 일 측면은 아 래 단계를 포함하는 폐암 동물모델의 제조방법 에 관한 것 이다. [41] 1) 실시 간 CT 로 동물의 폐위치를 확인하 는 단 계 및 [42] 2) 상 기 단계에서 확인된 동물의 폐 위치 에, 종 양세포 및 증 점제 흔 합액을 24-30 게이지 바늘로 주사하는 단계. [43] 우선, 사람을 제외한 동물의 폐를 실시 간 CT 촬 영 장치로 확 인한다. 이때 상 기 실시 간 CT 촬 영 장치는 일반 적 인 공지 의 CT 촬 영 장치 가 모두 포함될 수 있으나, 바람직 하게는 CT Fluoroscopy 기능 이 있는 CT 로서 , 일반 CT 와 달 리 Real time tracking 으로 촬 영되는 것 일 수 있다. [44] 다음, 상 기 실시 간 CT 촬 영 장치로 확 인한, 동물의 폐 위치 에, 종양세 포 및 증 점제 흔 합액을 24-30 게이지 바늘로 주사하여 폐암 동물모델을 제조 한다. [45] 본 발명에 있어서 , 상 기 동물은 인간을 제외한 어떠한 동물도 가능하며 , 바람직 하게는 포유동물로 원숭 이, 개, 고 양 이, 토 끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루 어진 군으로부터 선 택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 바람직 하게는 면 역 결핍 동물 이다. [46] 구 체적으로 상 기 동물은 크 게 소 형( 예: 마우스, 래트), 중 형(토 끼, 기니피그) 또는 대형(돼 지, 개) 동물로 분류할 수 있고, 이들 모두 포함될 수 있다. 다만, 상 기 중 형 또는 대형 동물모델은 외과용 동물모델로 바람직 하 며, 상 기 소 형 동물모델은 환자 맞춤형 폐암 동물모델로 제공될 수 있다. [47] 상 기 "면역 결 핍 동물" 이 란 , 암 이 발 병 될 수 있도록 면 역 시 스템을 구 성 하 는 일 부 구 성 요 소 를 유 전 자 수 준에서 인 위 적 으 로 손 상 시 켜 서 정 상 적 인 면 역 시 스 템 이 구 현 되 지 않도록 조 작하여 제조된 동 물 을 의 미 한다. 상 기 면 역

결 핍 동 물로는 신 경 계 가 형 성 된 동물을 사용할 수 있 는데, 바람직 하게는 면 역 결 핍 포유동 물 을 사 용 할 수 있고, 보 다 바 람 직 하 게 는 면 역 결 핍 되 도 록 조작된 마 우스, 랫트, 햄 스 터 , 기 니 어 피 그 등 의 면 역 결 핍 설 치 류 가 될 수 있 으 며 , 가 장 바람직 하 게 는 누 드 마 우 스 , NOD(nonobese diabetic) 마 우 스 , SCID(Severe combined immunodeficiency) 마 우 스 , NOD-SCID 마 우 스 , NOG(NOD/shi-SCID/IL2R null) 마우스 등 이 될 수 있다. [48] 또한, 상 기 동물은 종양이 발 생 되 지 않 은 정 상 동물을 의 미 한다. [49] 본 발 명 의 바 람 직 한 구 현 예 에 따르면 상 기 종 양 세포는 특별한 제 한 이 있 는 것 은 아 니 지 만 바람직 하 게 는 암 조 직 을 잘 게 분 쇄 한 후 이 를 필 터 링 하고, 그 후 원 심 분 리 하 여 수득되 는 것 일 수 있다. 이 러 한 과 정 을 통 해 상 기 종 양 세포는 24-30 게 이 지 의 바늘로 주 사하여 도 주 사 바늘이 막 히 지 않 고 폐 암 세 포 를 이 식 할 수 있 는 100 厚 미 만 의 크 기 로 선별하 는 것 이 바람직 하다. 종 래 기 술 은 16-18 게 이 지 인 바늘을 활 용하기 때문에 종 래 기 술에서 사 용 한 동 물 모델에 기 흉 등 의 부 작용이 있 어 바 람 직 하 지 않 았 으나, 본 발 명 의 경 우 24-30 게 이 지 의 바늘을 활 용하여 소 형 동 물 모델을 제 조함에 도 상 기 종 래 기 술 의 부 작용이 발 생하지 않 아 매 우 바람직 하다. 또 한 암 조 직 의 분쇄는 폐 암 세 포 가 파 괴 되 지 않 을 정 도 로 최 대 한 잘 게 분쇄하 는 것 이 바람직 하다. [50] 본 발 명 의 일 구 현 예 에 따르면 상 기 종양세 포 는 암 세 포주이 거 나 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세포일 수 있다. [51] 본 발 명 에 서 이 용 되 는 암 세 포주는 신장암 세포주 ( 예 컨대, RENCA), 위 암 세 포주, 뇌 암 세 포주, 폐 암 세 포주, 유방암 세 포주, 난소암 세 포주, 간 암 세 포주, 기 관 지 암 세 포주, 비 인두암 세 포주, 후두암 세 포주, 췌장암 세 포주, 방광암 세 포주, 결장암 세포주 및 자 궁 경부암 세 포주로 이 루 어 진 군 으 로부터 선 택 되 는 어 느 하나일 수 있다. 가 장 바람직 하게는 간 암 세포주 또 는 동 일 호 흡 기 관 계 세 포주인 폐 암 세 포주일 수 있다. 만 일 암 세 포주의 수 용자로 토 끼 와 같 은 중 형 동물이 이 용 되 는 경 우 에 는 간 암 세 포주인 VX2 를 이 용 하 는 것 이 가 장 바람직 하다. [52] 상 기 종양세 포 가 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세 포 인 경 우 , 환 자 맞춤형 폐 암 동 물 모델을 제조할 수 있 는 것 을 큰 특 징 으 로 한다. 일 반 적 으 로 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세포를 이 용하여 동 물 모델에 주 입 하 기 위 해 서 는 폐 암 환 자 로부터 분 리 한 폐 암 세 포 를 계 대 배 양하는 과 정 이 필수적 이 였다. 허 나 본 발 명 에 서 는

상 기 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세 포 를 직 접 주 입 하 기 때 문 에 , 상 기 동물의 폐 에 이 종 이 식 된 폐 암 은 계 대 배 양 에 의 한 영 향 을 받 지 않아, 환자의 폐 암 과 거 의 동일한 상태를 보 여 줄 수 있다는 장 점 을 갖 는다. [53] 또한, 상 기 종양세 포 가 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세포이 고 , 상 기 폐 암 세 포 , 특 히 이 종 의 폐 암 세포를 인간을 제 외 한 동물에 직 접 투 여 하 게 될 경 우 ,

통상적 인 기 계 적 분 리 과 정 만 거 친 단순한 폐 암 세 포 의 주 입 만 으로는 그 동 물 내 에 서 암종이 발 생하지 않 으 며 , 발 생 하 더 라 도 암 의 병 기 가 매 우 느 리 다 는 단 점 이 존 재 하 였다. 그 러 나 놀 랍 게도, 본 발 명 에 따르면 환 자 로부터 분 리 한 폐 암 세 포 를 인 간 을 제 외 한 동물에 주사한 경 우 에 도 그 동 물 내 에 서 폐 암 을 5 내 지 20 일 의 짧 은 시 간 안 에 형 성 하 고 있음을 확인하 였다. 이 는 CT 촬 영 장 치 를 비 롯하여 , 폐 암 환 자 로부터 분 리 한 폐 암 세 포 와 조 영 제 를 포 함하는 폐 암 유 발 용액의 조 합 때문에 본 발 명 의 방 법 이 성 공 적 으 로 실 시 된 것 이 라 볼 수 있다. [54] 본 발 명 의 바 람 직 한 구 현 예 에 따르면 상 기 종 양 세포는 특별한 제 한 이 있는 것 은 아 니 지 만 바람직 하 게 는 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 조 직 을 잘 게 분 쇄 한 후 이 를 필 터 링 하고, 그 후 원 심 분 리 하 여 수득되 는 것 일 수 있다. 이 러 한 과 정 을 통 해 상 기 종 양 세포는 24-30 게 이 지 의 바늘로 주 사하여 도 주 사 바늘이 막 히 지 않 고 폐 암 세포를 이 식 하 는 것 이 가 능하게 된다. 또 한 종 래 기 술 은 16-18 게 이 지 인 바늘을 활 용하기 때문에 종 래 기 술에서 사용한 동 물 모델인 토 끼 에 기 흉 등 의 부 작용이 있 어 바 람 직 하 지 않 았 으나, 본 발 명 의 경 우 24-30 게 이 지 의 바늘을 활 용하여 소 형 동물모 델을 제 조함에 도 상 기 종 래 기 술 의 부 작용이 발 생 하 지 않 아 매 우 바람직 하다. 또 한 폐 암 조 직 의 분쇄는 폐 암 세 포 가 파 괴 되 지 않 을 정 도 로 최 대 한 잘 게 분쇄하 는 것 이 바람직 하다. [55] 또 한 본 발 명 의 바람직 한 다 른 구 현 예 에 따르면 상 기 폐 암 세 포 는 초 기 (primary) 종 양 세 포 또 는 구축된 (established) 종 양 세 포 일 수 있다 . [56] 상 기 이 식 되 는 폐 암 세포의 양 은 일 반 적 인 마 우스를 기 준으로 하 여 l x 104 내 지 lxlO 7 세포일 수 있다. 이 러 한 폐 암 세포의 수 가 104 개 미 만 이 거 나 , 107개 를 초 과하는 경 우 에 는 폐 암 동 물 모델의 이 식 성 공율이 감소할 수 있다. [57] 상 기 종 양세포 및 증 점 제 의 흔 합액을 주사할 때 , 사 용 되 는 주 사 기 의 바늘은 상 기 CT 촬 영 영상 의 단 면 위 치 에 그 단면과 평 행 하 는 방 향으로 주 사하는 것 이 바람직 하다. [58] 상 술 한 과 정 을 통 해 얻 어 진 폐 암 동 물모델 은 폐 암 환자의 유전적 발 병 요인을 정 확하게 반 영 하 여 환자의 개 인 적 인 유전적 원인에 맞 는 항 암제를 스크리 닝 하 는 용도로 사용될 수 있다. 폐 암 세포의 특성상 개복수 술과정 을 통 해 침 습 적 으 로 폐 암 세포를 폐 에 이 식 하 여 제조된 종 래 의 폐 암 동 물 모델에 비 해 , 본 발 명 에 따 른 폐 암 동물세 포 는 주사기 를 사 용하여 , 비 침 습 적 으 로 폐 에 폐 암 세 포 를 직 접 적 으 로 이 식 하 기 때 문 에 , 종 래 이 종 이 식 폐 암 동 물 모델에 비 해 이 식 성 공륭이 높 고 , 부 작용이 거 의 없 으 며 , 대 형 , 중 형 동 물 모 델 뿐 만 아 니 라 소 형 동 물모델 ( 예 : 마 우스) 에 도 높 은 이 식 률 을 달 성 할 수 있 기 때 문 에 , 인간에 적 합 하면서 환자의 개 별 적 인 유전적 요인을 보 다 정 확하게 나 타 낼 수 있다. [59] 상 기 증 점 제 로 인 해 보 다 정 확 한 위 치 에 종 양 세포를 이 식 하 여 고 정 하 는 것 이 가 능하게 된다. 이 러 한 증 점 제 는 바 람 직 하 게 는 상 업 용으로 활 용 되 는 메트 리젤(Metrigel, 제품 명: B D MatrigelTM Basement Membrane Matrix, 5ml vial) 또는 Cultrex Basemetn Membrane Extract(BME) 일 수 있다. [60] 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔 합액은 상 기 증 점제 100 중 량부에 대하여 종 양세포 가 1 내지 500 중 량부로 포함되 는 것 일 수 있는데, 바람직 하 게는 50 내지 350 중 량부일 수 있다. 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔 합액의 흔 합 중 량 비율 이 상 기 범위를 만족하여 야 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔 합액의 점도 가 3-25 cps, 바람직 하 게는 5-15 cps 를 조 건을 층족시 킬 수 있다. [61] 상 기 증 점제의 점도는 5-30 cps (바 람직 하게는 10-20 cps) 일 수 있으 며, 이러한 증 점제가 상술한 중 량부대로 종양세 포 와 흔합됨 으로써 , 종양세 포 및 증 점제 흔 합 액의 점도 가 3-25 cps(바 람직 하 게는 5-15 cps) 에 해 당할 수 있다. 만 일 종양세 포 및 증 점제 흔합액 의 점도 가 3 cps 미 만 이거나, 25 cps 를 초과할 경우 24 내지 30 게 이지 의 바늘을 통 해 동물의 폐 위치 에 주 입하는데 용 이하 게 주 입할 수 있고, 기흉이 생기는 등 의 문 제 점이 발 생할 수 있다. [62] 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔 합액은 조 영제를 더 포 함하는 것 일 수 있고, 상 기 조 영제로는 가도 리니움()-DPTA, Gd-D03A- 부트롤 (butrol), 바륨, 디아트 리조 에 이트(), 에티오다이 즈드 오 일(ethiodized oil), 구 연산갈륨 (gallium citrate), 아이오 카민산 (), 아 이오 세타민산 (), 아 이다마 이드(), 아 이오 디파마 이드(iodipamide), 아 이오 도자민산 (), 아 이오 글 라미드(iogulamide), 아이오 딕사 놀(), 아 이핵솔(), 아 이오 파미돌(), 아이오 파논산 (), 아 이오프로 에민산 (ioproemic acid), 아이오 프 로口 이드(), 아 이오 세파민산 (iosefamic acid), 아이오 세 린산 (ioseric acid), 아 이오 술 아 미드 메글루민 (iosulamide meglumine), 아 이오 세 메트산 (iosemetic acid), 아 이오타술 (iotasul), 아 이오테 트르산 (iotetric acid), 아 이오타 라민산 (iothalamic acid), 아 이오 트록 시산 (), 아이오 가 갈르산 (), 아 이오 시트 리아온산 (ioxitriaoic acid), 아 이포 데이트(ipodate), 메글루민 (meglumine), 메트 리자 마 이드(), 메트 리조 에 이트(metrizoate), 프 로 필 리돈() 및 탈로오스 클로 라 이드(thallous chloride) 로 이루 어진 군으로부터 선 택되는 어느 하 나 이상 을 사용할 수 있다. 보다 바람직 하 게는 요오드화 조 영제 인 아 이핵솔(iohexol), 아 이오자 갈르산 (ioxaglic acid) 및 에티오다 이즈드 오 일(ethiodized oil) 일 수 있다. [63] 상 술 한 조 영제를 사용할 경우, 실시 간 CT 를 통 해 인간을 제외 한 동물의 폐 위치를 정 확 히 확인할 수 있으므로, 중 형 동물을 비롯하여 소 형 동물에 대해서 도 정위 적으로 폐 종양이 발 생한 폐 암 동물모델의 제조가 가능하다. [64] 종 래기술 에서 는 일반 적으로 암 세포를 이식 한 암 동물모델을 제조할 시, 개복수술을 통 해 암 세포를 직접 해 당 부 위 에 이식하 거나, 계대 배 양 또는 전 배 양을 통 해 배 양된 암 세포를 주 입하는 방식 으로 이루 어져 왔다. 이러한 방 법은 이식 의 정확성 및 성 공률이 대단 히 낮을 뿐 만 아니 라 정위 적 인 이식 이 어 렵고, 폐 암 발 생에 인위 적 조작이 추 가 되 기 때문 에, 이식 된 암 세포가 유 래한 환자의 특성을 그 대로 반 영하지 못하는 문 제를 가져올 수 있다. [65] 이러한 문 제 점을 해결하고, 이식 의 성 공률 및 정확도를 높 이기 위해, 실시 간 CT 촬 영 장치 와 주사 기를 사 용함과 동시 에 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔 합 액에 조 영제(특히 요오 드 화 조 영제)를 포함하 였다. 상 기 조 영제 특 히 요오드화 조 영제를 사 용 할 경우 종 래 기술과는 달 리 주 입되는 폐 암 세포의 퍼 짐 현상이 발 생하지 않기 때문에 정확 한 이식 이 가능하다는 장 점이 있다. [66] 이와 같 이 확 립된 폐 암 동물모델의 제조 방 법은 환자 로부터 분 리된 폐 암 세포를 단순 기 계적 분 리 처 리만 거 친 후 , 동물의 폐 에 직접 적으로 정확하게 이식 할 수 있고, 이러한 간단한 일련의 이식 과 정만으로도 동물의 폐 에 환자의 폐 암 세포를 높은 성 공확률로 이식 할 수 있을 뿐 만 아 니 라, 동물 내 에서 5 내지 20 일 이내 에 폐 암의 발 병 이 확 인된다. 따 라서 , 환자의 폐 암 세포에 대한 치료 또는 예방 효능을 검증 할 수 있는 동물모델을 간단한 과 정과 빠른 시 간 내 에 제시 할 수 있다. [67] 본 발 명 에 따른 폐 암 동물모델 제조방법 은 동물모델 제조가 까다로운 소 형 동물에 대해서 도 높은 정확성과 성 공률로 정위 적 환자 맞춤형 폐 암 동물모델의 제조가 가능하다. [68] 상 기 요오드화 조 영제 중 에서 가장 바람직 하 게 에티오다이 즈드 오 일(ethiodized oil) 을 사용할 수 있다. 상 기 에티오디 자 이드 오일은 포 피시드 오 일(poppyseed oil) 의 지 방산 (fatty acid) 에틸 에스 테르(ethyl esters) 를 포 함하는 아 이오 딘으로 구성 될 수 있다. 또 한 상 기 에티오디 자 이드 오일은 더욱 바람직 하게는 상 업용으로 활용 되는 리피오돌 (Lipiodol, 종 래에는 눈물샘 누관이 막혔는지를 확 인하는데 사용되 거나, 또는 간 암 등 에 색전 효과가 있는 것으로 알려짐) 인 것 이 이식 의 정확성 및 성 공률을 보다 높 일 수 있으면서 쥐와 같은 소 형 동물모델에 보다 적합하게 적용 될 수 있어 바람직 하다. 한편, 종 래 기술 처 럼 수용성 분산제 ( 예：FDG) 를 사 용하게 되면, 상 기 문 제 점들 이외 에도 이식 의 정확성 및 성 공률을 조 금 이나마 높 이기 위해 사후 추 가 되는 공 정 이 많아져서 번거롭 게 되 어 바 람직하지 않다. [69] 상 기 조 영제는 상 기 종양세 포 및 증 점제 흔합액 중 에서 종양세 포 100 중 량부를 기준으로 조 영제를 1-200 중 량부로 포함될 수 있다. 만 약 상 기 조 영제가 상 기 종 양세포 및 증 점제 흔합액 중에서 종 양세포 100 중 량부를 기준으로 1 중량부 미만으로 포함될 경우 CT 상 에서 측 정 에 문 제가 발 생할 수 있고, 200 중 량부를 초과할 경우 조 영제 에 의해 흔합액 의 점도 가 낮아져 종 양 형성 이 제 대로 이루 어지지 않거 나, 폐 에 점착 되지 못하고 퍼지 게 되는 문 제가 발 생한다. [70] [71] 본 발 명의 일 실시 예에 있어서 , 상 기 종 양세포를 동물에 주사 할 때, 주사 기가 사용될 수 있는데 사용되 는 주사 기로는 주사 바늘과 주사기 가 직접 적으로 결 합 되 어 있 는 통 상 적 인 주 사 기 라 면 특별히 이 제 제 한 되 지 않 으나, 동 물모델 개 체 의 크 기 에 상 관없이 정 확 한 삽 입 과 정 량 주 입 이 가 능하고 시 야 확보가 용 이 한 개 량 주사기 를 사 용하는 것 이 더 욱 바람직 하다. [72] 상 기 개 량 주사기 는 주사기 의 주 입 구 (100) 와 24-30 게 이 지 바 늘 (200) 사 이 에 , 채 널 (300) 을 가 지 고 있고, 보 다 구 체 적 으 로 상 기 채 널 (300) 은 주사기 의 주 입 구 (100) 와 24-30 게 이 지 바 늘 (200) 을 연 결 하 여 , 주사기 로부터 공 급 되 는 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액을 상 기 동 물 모델의 폐 로 투 여 될 수 있 도록, 상 기 주 사 바늘로 안 내하기 위 해 상 기 주 사 기 의 주 입 구 에 결 합 되 는 것 을 특 징 으 로 한 다 (하기 도 5 참 조).

[73] 상 기 채 널 (300) 은 외 경 (O.D) 에 대 한 내 경 (I.D) 의 비 율 (I.D/O.D) 이 0.2 내 지 1, 바람직 하 게 는 0.3 내 지 0.5 이 다 . 상 기 범 위 를 벗 어 날 경 우 , 내 구 성 이 나 유 연 성 이 약 해 주 입 되 는 용 액 의 압 력 에 버 티 질 못 하 고 찢 어 지 거 나 주사기 바늘과 쉽 게 분 리 되 는 등 의 다양한 문 제 가 발 생 할 수 있다.

[74] 또한, 가 장 본 발 명 에 서 사 용 되 는 주 사 기 의 바 늘 (24-30 게 이 지 ) 에 빈 틈없이

들 어 맞 는 상 기 채 널 (300) 의 사 이 즈 는 외 경 (O.D) 이 0.5 내 지 0.8 匪 , 내 경 (I.D) 은

0.25 匪 일 수 있다. 만 약 상 기 채 널 (300) 의 내 경 (I.D) 이 0.25 匪 미 만 일 경 우 , 채 널 (300) 이 주 사 기 의 바 늘 보 다 얇 아 지 기 때문에 상 기 채 널 과 주사기 바늘의

결합이 제 대 로 이 루 어 지 지 않 는 문 제 가 발 생 하고, 0.25 匪 를 초과할 경 우 24-30 게 이 지 바늘이 고 정 되 지 않 아 주 입 되 는 흔 합 액 이 외 부 로 새 어 나 갈 위 험 이 있다. [75] 또 한 재 질 은 세 포 조 직 에 독 성 을 가 지 지 않 는 물 질 이 면 특 별 이 이 에 제 한 되 지 않 으나, 바람직 하게는 폴 리 에 틸 렌 재 질 일 수 있다. [76] 한편, 상 기 제 조방법 에 의 하 여 제조된 폐 암 동 물 모델은 폐 암 유발용 액 을 주 사 한 후 1-4 주 (더 욱 바람직 하 게 는 2-3 주 ) 의 기 간 이 경 과 한 후 상 기 동 물 모델을 이 용하여 항 암제를 스크리 닝 하 거 나 폐 암 환 자 맞춤형 항암제 선별에 사용하 는 것 일 수 있다. 이 는 종 래 기 술 에 비 해 현 저 히 빠 른 속도로 항암제 스 크 리 닝 또 는 환 자 맞춤형 항암제 선 별 과 정 에 사용할 수 있 는 동 물 모델이 된다. 종 래 기 술 에 따 른 동 물 모델은 주 사 후 항암제 스 크 리 닝 과 정 등 에 제 공 되 는 데 3-4 달 정 도 가 소요되 어 본 발 명 에 의 하 는 경 우보다 항암제 스 크 리 닝 과 정 에 투 입 되 는 데 보 다 장 기 간 이 소 요 된다. 또 한 본 발 명 은 종 래 기 술 에 비 해 폐 에 고 형 암 의 형 태 가 더 욱 잘 나 타나게 되 어 바람직 하다. [77] 또 한 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물모델 에 서 는 폐 암 병 변 형 성 이 5 내 지 20 일 이 내 로 신 속하게 진 행 되 기 때 문 에 , 환 자 로부터 분 리 한 폐 암 세포를 간단한

처 리 과 정 을 통 해 동물에 주 입 한 후 , 짧 은 시 기 이 내 에 약 효 평 가 를 실 시 할 수 있다는 장 점 을 갖 는다. 또 한 본 발 명 에 따 른 폐 암 동 물 모델은 동일한 방 법 에 의 해 제조될 경 우 , 재 현 성 이 우 수 하다는 점 을 고 려 한다면 본 발 명 에 관 한 폐 암 동물모 델 특 히 환 자 맞춤형 동 물 모델에 있 어 서 의 우 수 성 이 인 정 된 다 할 것 이 다 . [78] 한편, 상 기 동물은 특별한 제 한 없 이 소 형 ( 예 : 마 우스, 래 트), 중 형 (토 끼 , 기 니 피 그 ) 또 는 대 형 (돼 지 , 개 ) 동 물 모델이 모 두 포 함 될 수 있다. 다만, 상 기 중 형 또는 대형 동물모델은 외과용 동물모델로 바람직 할 수 있으 며, 상 기 소 형 동물모 델로는 면 역 체계가 제거된 누드 마우스 또는 스 키드 마우스가 환자 맞춤형 폐 암 동물모델 등으로 제공되는 데 바람직 하다. [79] [80] 본 발 명 에 따른 폐 암 동물모델은 앞서 설 명한 바와 같 이 환자와 동일한 형 태 및 유 전정보를 갖는 이종 이식 동물모 델로, 이를 이용하여 새로운 항 암제를 다양한 조 건에서 시 험할 수 있으 며, 짧은 시 간 에 여 러 항 암제 의 효능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있고, 환자 에게 가장 적절 한 항 암제를 선별할 수 있으므로, 환자의 치료 기간 및 치료 비용을 절감할 수 있다.

[81] [82] 본 발 명의 다른 측면은 폐 암 동물모델 제조용 키트 에 있어서 , 증 점제가 보관된 바 이알(10); 및 24-30 게 이지 바늘을 갖는 주사기 (20); 를 포 함하는 폐 암 동물모델 제조용 키트 에 관 한 것 이다. 이에 대한 구 체적 인 구성은 도 8에 도시하 였고, 상 기 키트를 사 용하여 폐 암 동물모델을 제조하는 일 예는 도 9 에 나타내 었다. [83] 본 발 명 에서 는 언제 어디서 나 종양세 포를 채취하 여, 소 형, 중 형 등 의 어떠 한 동물에 나 적용 할 수 있도록, 증 점제가 보관된 바 이알과 24-30 게 이지 바늘을 갖는 주사기 로 구성 된 폐 암 동물모델 키트를 제공하고자 한다. 폐 암 환자 로부터 분 리한 폐 암 세포(100 厚 미만 의 세포 크 기를 가 짐)를 본 발 명의 증 점제가 보관된 바 이알과 24-30 게 이지 바늘을 갖는 주사기 로 구성 된 키트 에 적용 한 폐 암 동물모델 제조 시 험 에서 모두 같은 결과를 나타내 었다. [84] 이를 통 해, 채취 한 종양세 포 특 히, 폐 암 환자 로부터 분 리한 폐 암 세포를 이용하여 바로 환자 맞춤형 폐 암 동물 모 델세포를 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다. [85] 상 기 증 점제로 인해 보다 정확 한 위치 에 종 양 세포를 이식하 여 고 정하는 것 이 가능하게 된다. 이러한 증 점제는 바 람직하 게는 상 업용으로 활용 되는 메트 리젤(Metrigel, 제품 명: B D MatrigelTM Basement Membrane Matrix, 5ml vial) 또는 Cultrex Basemetn Membrane Extract(BME) 일 수 있다. [86] 상 기 증 점제의 점도는 5-30 cps(바 람직 하게는 10-20 cps) 인 것 이 바람직 한데, 상 기 증 점제의 점도 가 상 기 범위 미만 이거나 초과할 경우, 추후 종양세 포 가 흔합될 경우 최종 흔 합액의 점도 가 3-25 cps 의 범위를 벗 어나, 24 내지 30 게 이지 의 바늘을 통 해 동물의 폐 위치 에 주 입하는데 용 이하 게 주 입할 수 있고, 기흉이 생기는 등 의 문 제 점이 발 생할 수 있다. [87] 상 기 증 점제는 조 영제를 더 포함할 수 있다. 상 기 조 영제는 상 기 증 점제와 별도의 바 이알 에 보관된 상 태로 키트를 구성하 거나 상 기 증 점제와 하나의 바 이알 에 흔 합 되 어 있는 상 태로 키트를 구성 할 수 있다. 바람직 하 게는 상 기 조 영제는 상 기 증 점제와 하나의 바 이알 에 흔합된 상태로 보관하 는 것 일 수 있다. [88] 상 기 증 점제와 상 기 조 영제를 하나의 바 이알 에 흔합된 상 태로 보관함 하 면, 채취 한 종양세 포를 흔 합하고 주사기 로 이동시 키면서 나타나는 문 제 점을 차단할 수 있다. 즉 채취 한 종양세 포를 상 기 증 점제와 상 기 조 영제 에 각각 흔 합하는 동안의 오 염이나 세균 감 염을 완전히 차단할 수 있다. 또 한 채취 한 종 양세포를 1차 흔 합 후 바로 동물에 적용 할 수 있어 과 정 상 의 간소화를 통 해 환자 맞춤형 폐 암 동물모델 제조를 용 이하 게 한다. [89] 상 기 조 영제로는 가도리 니움(gadolinium)-DPTA, Gd-D03A- 부트롤 (butrol), 바륨, 디아트 리조 에 이트(diatrizoate), 에티오다이 즈드 오 일(ethiodized oil), 구 연산갈륨 (gallium citrate), 아이오 카민산 (iocarmic acid), 아 이오 세타민산 (iocetamic acid), 아 이다마 이드(iodamide), 아 이오 디파마 이드(iodipamide), 아 이오 도자민산 (iodoxamic acid), 아 이오 글 라미드(iogulamide), 아이오 딕사 놀(iodixanol), 아 이핵솔(iohexol), 아 이오 파미돌(iopamidol), 아이오 파논산 (iopanoic acid), 아 이오프로 에민산(ioproemic acid), 아이오 프 로口 이드(iopromide), 아 이오 세파민산 (iosefamic acid), 아이오 세 린산(ioseric acid), 아 이오 술 아 미드 메글루민 (iosulamide meglumine), 아 이오 세 메트산(iosemetic acid), 아 이오타술 (iotasul), 아 이오테 트르산 (iotetric acid), 아 이오타 라민산 (iothalamic acid), 아 이오 트록 시산(iotroxic acid), 아이오 가 갈르산 (ioxaglic acid), 아 이오 시트 리아온산 (ioxitriaoic acid), 아 이포 데이트(ipodate), 메글루민 (meglumine), 메트리자 마 이드(metrizamide), 메트리 조 에 이트(metrizoate) 프 로 필 리돈(propyliodone) 및 탈로오스 클로 라 이드(thallous chloride) 로 이루 어진 군으로부터 선 택되는 어느 하 나 이상 을 사용할 수 있다. 보다 바람직 하 게는 요오드화 조 영제 인 아 이핵솔(iohexol), 아 이오자 갈르산 (ioxaglic acid) 및 에티오다 이즈드 오 일(ethiodized oil) 일 수 있다. [90] 상술한 조 영제를 사용할 경우, 실시 간 CT 를 통 해 동물의 정확 한 폐 위치를 확 인하면서 주 입할 수 있으므로, 중 형 동물을 비롯하여 소 형 동물에 대해서 도 정위 적으로 폐 종양이 발 생한 폐 암 동물모델을 제조할 수 있게되는 장 점을 갖 게된다. [91] 본 발 명의 일 실시 예에 있어서 , 상 기 주사기 (20) 는 24-30 게 이지 의 주사 바늘과 주사 기가 직접 적으로 결합 되 어 있는 통상적 인 주사 기 라면 특별히 이제 제 한되지 않으나, 동물모델 개체의 크 기 에 상 관없이 정확 한 삽 입과 정량 주 입이 가능하고 시 야 확보가 용 이한 개량 주사기 를 사 용하는 것 이 더욱 바람직 하다. [92] 상 기 개량 주사기 는 주사기 의 주 입구(100) 와 24-30 게 이지 바늘(200) 사 이에, 채널(300) 을 가지 고 있고, 보다 구 체적으로 상 기 채널(300) 은 주사기 의 주 입구(100) 와 24-30 게 이지 바늘(200) 을 연결하 여, 주사기 로부터 공급 되는 종 양세포 및 증 점제 흔 합액을 상 기 동물모델의 폐로 투 여될 수 있도록, 상 기 주사 바늘로 안내하기 위해 상 기 주사 기의 주 입구 에 결합 되는 것을 특 징으로 한다(하기 도 5 참조).

[93] 상 기 채널(300) 은 외경(O.D) 에 대한 내경(I.D) 의 비율(I.D/O.D) 이 0.2 내지 1, 바람직 하 게는 0.3 내지 0.5 이다. 상 기 범위를 벗 어날 경우, 내구성 이나 유 연성 이 약 해 주 입 되 는 용 액 의 압 력 에 버 티 질 못 하 고 찢 어 지 거 나 주사기 바늘과 쉽 게 분 리 되 는 등 의 다양한 문 제 가 발 생 할 수 있다.

[94] 또한, 가 장 본 발 명 에 서 사 용 되 는 주 사 기 의 바 늘 (24-30 게 이 지 ) 에 빈 틈없이

들 어 맞 는 상 기 채 널 (300) 의 사 이 즈 는 외 경 (O.D) 이 0.5 내 지 0.8 匪 , 내 경 (I.D) 은

0.25 匪 일 수 있다. 만 약 상 기 채 널 (300) 의 내 경 (I.D) 이 0.25 匪 미 만 일 경 우 , 채 널 (300) 이 주 사 기 의 바 늘 보 다 얇 아 지 기 때문에 상 기 채 널 과 주사기 바늘의

결합이 제 대 로 이 루 어 지 지 않 는 문 제 가 발 생 하고, 0.25 匪 를 초과할 경 우 24-30 게 이 지 바늘이 고 정 되 지 않 아 주 입 되 는 흔 합 액 이 외 부 로 새 어 나 갈 위 험 이 있다. [95] 또 한 재 질 은 세 포 조 직 에 독 성 을 가 지 지 않 는 물 질 이 면 특 별 이 이 에 제 한 되 지 않 으나, 바람직 하게는 폴 리 에 틸 렌 재 질 일 수 있다. [96] [97] 본 발 명 의 또 다 른 측면은 아 래 단계를 포 함하는 폐 암 동 물 모델을 이 용하여 항암제 의 치 료 효능을 분 석 하 는 방 법 에 관 한 것 이 다 . [98] 1) 상 기 폐 암 동 물모델 제 조방법 을 통 해 제조된 폐 암 동 물모델 에 항암제 를 투 여 하 는 단 계 ; [99] 2) 상 기 1) 단 계 의 동물에 서 폐 암 세 포 의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 항암제 의 항 암 효과를 확 인하는 단계. [100] 우선, 1) 상 기 폐 암 동 물 모델에 항암제 를 투 여 한다. 상 기 폐 암 동 물 모델은 앞 서 설 명 한 폐 암 동 물모델 제조방 법 으 로 제조된 것 일 수 있다. [101] 상 기 단 계 에 서 폐 암 이 유발된 동물의 정 맥 에 항 암제를 투 여 할 수 있고, 일 예 로 상 기 페 암 이 유발된 동물이 마 우스인 경 우 꼬 리 정 맥 에 항 암제를 투 여 할 수 있 으나, 특별히 이 에 한 정 되 지 않 는다. [102] 다 음 2) 상 기 1) 단 계 의 동물에 서 폐 암 세 포 의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 항 암 제 의 항 암 효과를 확 인 한다. 폐 암 관 련 유 전자의 발 현 정 도 또 는 미 세 혈 관 밀도를 측 정 하 여 항 암 제 의 치 료 효능을 분 석 할 수 있고, 폐 암 세 포 의 성 장 또 는 전 이 를 육 안으로 관 찰하여 치 료 효능을 분 석 할 수 있다. 이 때 , 폐 암 세 포로의 성 장 을 관 찰하기 위 하 여 캘 리 퍼 스 와 같 은 도구를 이 용하여 측 정 할 수 있다. [103] 구 체 적 으 로 상 기 폐 암 동 물 모델에 서 폐 암 세 포 의 추가적 인 성 장 이 억 제 되 었 거 나 , 전 이 가 억 제 된 경 우 에 는 , 사용한 항암제 에 대 해 항 암 효과가 있다고 확인할 수 있다. 상 기 폐 암 세 포 의 성 장 을 측 정 할 경 우 , 항 암 제 의 치 료 효능을 수 치 화하여 정 량 적 으 로 파악할 수 있다. 통 상 항암제 투 여 종 료 후 에 폐 암 세포의 크 기 를 측 정 하고, 그것을 항암제 비 투 여 군 또 는 항암제 투 여 전 의 폐 암 세포의 크 기 와 비 교하는 방 법 을 이 용하여 항 암 제 의 치 료 효과를 정 량 화 할 수 있다. 또한, 본 발 명 에 의 하 면 상 기 와 같 이 폐 암 세포의 크 기 를 계 측하는 것 이 외 에 도 , ① 항암제 투 여 회 수 를 일 정 하 게 하 여 치 료까지 의 시 간 을 측 정 한다, ② 치 유 될 때까지 항 암제를 일 정 간 격 으 로 투 여 한 회 수 를 구하는 등 과 같 은 방 법 에 의 해 서 도 항암제 효과의 강도를 평 가 할 수 있다. [104] 항암제 를 임 상 수준에 서 실 시 하 기 위 하 여 , 우 선 동 물 모델에 서 상 기 항암제 의 효능과 안정성 이 확 인되 어야 하는데, 본 발 명은 이러한 동물모 델-기 초 시험을 환자별로 가능하게 한다. 본 발 명 에 따른 상 기 폐암 동물모델은 폐암 환자로부터 분 리한 폐암 세포의 이종 이식을 통 해 제조된 것으로서 , 환자에 따라 적절 히 가장 적절한 후보자 항암제를 선별할 수 있다. [105] 평가 대상이 되는 항암제는 폐암 동물모델에 국소 적으로 투 여될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 즉 어떠한 투 여 경로 의 항암제도 선별할 수 있다. 비경구 적 및 경구 적으로 투 여되는 함암제도 선별할 수 있다. 항암제 의 투 여량은 약제 의 성질, 투 여 대상의 종류, 연령이나 체중 등 의 조 건을 기초로 종합적으로 판단하 여, 최적의 양을 적절하게 결 정 해야 하 며 특별히 한정되지 않는다. [106] 투 여 시기나 투 여 회수 등의 투 여 조건은 약제 의 성질, 시험 및 평가 목 적 등 에 따라 적절하게 최적이 되도록 설정하면 되며 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 투 여 시기에 대해서는 폐암 동물모델을 제작한 직후 또는 환자와 동 일한 상 태까지 병변을 발생시 킨 직후부터 30분 마다 수 회 투 여한 후, 그 다음 1시간 마다 수 회 투 여하고, 그 때마다 증상의 변화를 관찰, 평가하는 방 법 이 많 이 이용된다. 투 여 회수 에 대해서 는 항암제 의 성질 에 따라 다르고, 1회 이상 수 회가 될 수도 있다. [107] [108] 본 발명의 또 다른 측면은 하 기 단계를 포함하는 폐암 동물모델을 이용하여 항암제 를 스크 리닝 방 법 에 관한 것 이다.

[109] 1) 상 기 폐암 동물모델 제조방법 을 통 해 제조된 폐암 동물모델에 항암제 후보 물질을 투 여하는 단 계；및 [110] 2) 상 기 1) 단 계의 폐암 동물모델에 서 폐암 세포 의 성장 또는 전 이를 측 정하 여 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정하는 단계. [111] 상 기 1) 단계는 폐암 이 유발된 동물에 항암제 후보물질을 투 여하는 단 계 이다. 상 기 폐암 동물모델은 앞서 설 명 한 폐암 동물모델 제조방 법으로 제조된 것 일 수 있다. [112] 폐암 이 유발된 동물의 정맥에 항암제를 투 여할 수 있고, 일예로 상 기 페암 이 유발된 동물이 마우스인 경우 꼬 리 정맥에 항암제 를 투 여할 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. [113] 상 기 "항암제 후보물질" 이란 폐암 동물모 델에서 폐암 세포의 성장 또는 전 이에 대하여 억제 활성 을 가지는지 여부를 검사하기 위하 여 스크리 닝에서 이용 되는 미지의 물질을 의미한다. 상 기 후보물질은 화학물질, 펩타 이드, 단 백질, 항 체 및 천 연 추출물 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발 명의 스크 리닝 방 법 에 의해 분석 되는 후보물질은 단 일 화합물 또는 화합물들의 흔합물 ( 예컨대, 천 연 추출물 또는 세포 또는 조 직 배양물) 이다. 후보물질은 합성 또는 천 연 화합물의 라 이브 러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라 이브 러리를 얻는 방 법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라 이브 러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA) 에서 상 업적으 로 구 입 가 능하 며, 천 연 화 합물의

라 이브 러리는 p a n Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA) 에서 상 업적으 로 구 입가 능하다. 후보물 질은 당 업계 에 공지 된 다 양한 조 합 라 이브 러리 방 법 에 의 해 얻을 수 있으 며, 예를 들 어, 생물학적 라이브 러리, 공 간 어드레서 블 패 러 럴 고상 또 는 액상 라 이브 러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디 컨볼 루션이 요 구 되는 합성 라 이브 러리 방 법, 1- 비드 1- 화합물 라 이브 러리 방 법, 그 리고 친화성 크 로마토 그 래피 선별을 이용하는 합성 라 이브 러리 방 법 에 의 해 얻을 수 있다. 분자 라이브 러리의 합성 방 법은 , DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등 에 개시 되 어 있다. [114] 상 기 2) 단계는 항암제 후 보 물질의 항 암 효과를 확 인하는 단 계 이다 . 폐 암 관 련 유 전자의 발 현 정도 또 는 미 세 혈관 밀도를 측 정하 여 항 암제 의 치 료 효능을 분 석 할 수 있고, 폐 암 세포의 성 장 또 는 전 이를 육 안으로 관 찰하여 치 료 효능을 분 석 할 수 있다. 이때, 폐 암 세포로의 성 장 을 관 찰하기 위하 여 캘 리퍼스 와 같은 도구를 이용하여 측 정 할 수 있다. 상 기 관 련 유 전자는 당 업계 에 널 리 공지 되 어 있다. [115] 구 체 적으 로 상 기 폐 암 동 물 모델에 서 폐 암 세포 의 추가적 인 성 장 이 억제 되 었거 나, 전 이가 억제 된 경우 에는 , 사용한 항암제 후 보물질 에 대해 항 암 효과가 있다고 확인할 수 있다. 상 기 폐 암 세포의 성 장 을 측 정 할 경우 , 항암제 후 보 물질의 치 료 효능을 수 치 화하여 정 량 적으 로 파악할 수 있다. 통상 항암제 후 보 물질의 투 여 종 료 후 에 폐 암 세포의 크 기를 측 정하고, 그것을 항암제 후 보물질 비투 여군 또 는 항암제 후 보물질 투 여 전의 폐 암 세포의 크 기 와 비교하는 방 법을 이용하여 항암제 후 보 물질의 치 료 효과를 정 량 화 할 수 있다. 또한, 본 발 명 에 의하 면 상 기 와 같 이 폐 암 세포 의 크 기를 계측하는 것 이외 에도 , ① 항암제 후 보 물 질 의 투 여 회수 를 일정하 게 하 여 치 료 까 지 의 시 간을 측 정 한다, ② 치 유 될 때까지 항암제 후 보 물질을 일정 간 격으 로 투 여 한 회수 를 구하는 등 과 같은 방 법 에 의 해서 도 항암제 효과의 강도를 평 가 할 수 있다. [116] 항암제 를 임상 수준에 서 실 시 하 기 위하 여, 우 선 동 물 모델에 서 상 기 항암제 후 보 물질의 효능과 안정성 이 확 인되 어 야 하 는 데, 본 발 명은 이 러한 동 물모델 -기 초 시 험을 환자별로 가 능하게 한다. 본 발 명 에 따른 상 기 폐 암 동물모 델은 폐 암 환자 로부터 분 리 한 폐 암 세포의 이종 이식 을 통 해 제조된 것으 로서 , 환자에 따 라 적절 히 가장 적절 한 항 암제를 스크 리 닝할 수 있다. [117] 평 가 대상이 되는 항암제 후 보 물질은 폐 암 동 물 모델에 국 소 적으 로 투 여될 수 있으나, 특별히 이에 제 한되지 않는다. 즉 어떠 한 투 여 경로 의 항암제 후보물 질도 선 별 할 수 있다. 비 경구 적 및 경구 적으 로 투 여되는 항암제 후 보 물질도 선 별 할 수 있다. 항암제 후 보 물질의 투 여 량 은 약 제 의 성 질 , 투 여 대상의 종류, 연 령 이 나 체 중 등 의 조 건 을 기 초 로 종 합 적 으 로 판 단 하 여 , 최 적 의 양 을 적 절하게 결 정 해 야 하 며 특별히 한 정 되 지 않 는다. [118] 투 여 시 기 나 투 여 회 수 등 의 투 여 조건은 항암제 후 보 물질의 성 질 , 시 험 및 평 가 목 적 등 에 따 라 적 절하게 최 적 이 되 도 록 설 정 하 면 되 며 특별히 제 한 되 지 않 는다. 예 컨대, 투 여 시 기 에 대 해 서 는 폐 암 동 물 모델을 제 작 한 직 후 또 는 환자와 동 일 한 상 태까지 병 변 을 발 생 시 킨 직 후부터 30분 마 다 수 회 투 여 한 후 , 그 다 음 1시 간 마 다 수 회 투 여 하고, 그 때마다 증상의 변화를 관찰, 평 가하는 방 법 이 많 이 이 용 된다. 투 여 회 수 에 대 해 서 는 항 암 제 의 성 질 에 따 라 다 르고, 1회 이 상 수 회 가 될 수 도 있다. [119] 이 러 한 과 정 을 통 해 유전적 원 인 등 을 반 영 하 여 환 자 개 인 에 적 합 한 항 암제를 선 별하여 치 료 할 수 있다. 발 명 의 실 시 를 위 한 형 태

[120] 이 하 본 발 명 을 바람직 한 실 시 예 를 참고로 하 여 본 발 명 이 속하는 기 술 분 야에서 통상의 지 식 을 가 진 자 가 용 이 하 게 실 시 할 수 있도록 상 세 히 설 명 한다. 그 러 나 본 발 명 은 여 러 가 지 상 이 한 형 태 로 구 현 될 수 있으며 여 기 에 서 설 명 하 는 실 시 예 에 한 정 되 는 것 은 아 니 다 . [121] [122] 실 시 예 [123] < 심 시 예 1: 토 끼 폐 암 동 물 모델의 제 조 > [124] 토 끼 의 VX2 종 양 조 직 을 추 출하였 으 며 , 이 를 잘 게 분쇄하 였다. 이 를 분 쇄 액 을 통 해 거 른 후 , 원 심 분 리 기 를 통 해 원 심 분 리 하 여 토 끼 의 종 양 세포를 수득하 였다. 그 리 고 상 기 토 끼 로부터 수 득 한 종 양세포 0.1 , 리 피오돌 0.15 및 메 트 리 젤 0.25 를 흔합한 용액을 토 끼 의 폐 에 26 게 이 지 의 바늘을 가 진 주사기 를 이 용하여 주사하 였다. 이 때 실 시 간 CT 촬 영 장 치 (본 실 시 예 에 사용된 CT 는 CT Fluoroscopy 기 능 이 있 는 CT 로 서 , Real time tracking 이 가 능함) 에 서 촬 영 하 는 영상의 임 의 의 단면과 일 치 하 는 방 향으로 레 이 져 를 조 사하였 으 며 , 이 렇 게 조 사 되 는 레 이 져 에 토 끼 의 폐 를 레 이 져 와 일 직 선 이 되 게 고 정 하 였다. 그 리 고 레 이 져 의 조 사 방향과 일 치 하 게 주 사 바늘을 고 정 시 킨 상 태 에 서 토 끼 의 폐 에 상 기 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 주사하 였다. 한편, 주 사 과 정 에 서 실 시 간 CT 촬 영 장 치 를 통 해 실 시 간으로 전송되 는 화면을 통 해 레 이 저 와 주 사 바늘이 폐 에 수 직 인 방 향으로 일 치 되 는 것 을 확 인 하면서 정 교하게 주사하 였다. 하 기 도 1은 본 참 고 예 의 전 체 적 인 과 정 을 나 타내는 개 략 도 이 며 , 하 기 도 2는 본 참 고 예 의 방 법 을 이 용하여 토 끼 VX2 종 양 세포를 토 끼 의 폐 에 이 식 한 결과를 나 타내는 사 진 이 다 . [125] [127] 고 려 대 학 교 구 로 병 원 에 입 원 중 인 폐 암 환 자 로부터 폐 암 조 직 을 추출하 였다. 그 리 고 이 를 종 양 세 포 가 파 괴 되 지 않 을 정 도 로 잘 게 분쇄하 였다. 이 렇 게 분 쇄 된

종 양 세포를 100厚 의 cell strainer 로 필 터 링 하 여 걸 러 내 었으며 , 2500 rpm (바 람 직 하게는 100-5000 rpm) 속도로 3분 ( 바 람 직 하게는 1-10 분 ) 동 안 원 심 분 리 기 를 이 용하여 최 종 적 으 로 폐 암 종 양 세포를 획 득 하 였다. 이 렇 게 획 득 한 폐 암 종 양 세 포 용 액( 폐 암 세 포 수득물 0.1 )을 리 피 오 돌 (Lipiodol, 0.1 ) 및 메트리 젤 (Metri-gel, 0.2 )과 흔 합하여 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 제조하 였다. [128] 이 렇 게 제조된 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 26 게 이 지 의 바늘을 가 진 주사기 를 이 용하여 쥐 의 폐 에 주사하 였다. 이 때 실 시 간 CT 촬 영 장 치 (본 실 시 예 에 사용된 CT 는 CT Fluoroscopy 기 능 이 있 는 CT 로 서 , Real time tracking 이 가 능함) 에 서 촬 영 하 는 영상의 임 의 의 단면과 일 치 하 는 방 향으로 레 이 져 를 조 사하였 으 며 , 이 렇 게 조 사 되 는 레 이 져 에 쥐 의 폐 를 레 이 져 와 일 직 선 이 되 게 고 정 하 였다. 그 리 고 레 이 져 의 조 사 방 향 과 일 치 하 게 주 사 바 늘 을 고 정 시 킨 상 태 에 서 쥐 의 폐 에 상 기 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 주사하 였다. 한편, 주 사 과 정 에 서 실 시 간 CT 촬 영 장 치 를 통 해 실 시 간으로 전송되 는 화면을 통 해 레 이 저 와 주 사 바늘이 폐 에 수 직 인 방 향으로 일 치 되 는 것 을 확 인 하면서 정 교하게 주사하 였다. 이 렇 게 주사를 완 료하여 최 종 폐 암 동 물 모델을 제 조 하였다 (하기 도 3은 상 기 과 정 의 전 체 적 인 개 략 도 임).

[129] 이 렇 게 제조된 폐 암 동 물 모델은 2 주 가 경 과 한 후 에 항암제 후 보 물질을 투 여 하 여 각 환자별 맞춤형 항암제 를 스 크 리 닝 하 였다.

[130] [131] < 심 시 예 3>: 마우스 폐 암 동 물 모델의 제 조 > [132] 루 이 스 폐 암 (Lewis Lung Cancer ；LLC) 세 포 5xl0 6 cells / (종양 세 포 용 액 0.035 )를 리 피오돌 (Lipiodol, 0.005 ) 및 메 트 리 젤 (Metri-gel, 0.01 )과 흔 합하여 폐 암 종 양 조 직 흔합액 (total 0.05 )을 제조하 였 다 . [133] 일 반 적 인 0.5 cc 주 사 기 를 사 용 할 경 우 소 형 폐 암 동 물 모델의 폐 에 주 입 하 는 과 정 에 있어서 정 량 주 입 및 시 야 확 보 면에서 어 려 움 이 있 으 므로, 이 를 개 선하기 위 하 여 개 량 주 사 기 를 사용하 였다. [134] 상 기 개 량 주사기 는 0.5 cc 주사기 의 주 입 구 와 29 게 이 지 바 늘 사 이 에 , 0.25 匪 의 I.D 와 0.61 匪 의 O.D 를 갖 는 폴 리 에 틸 렌 재 질 의 제 1 채 널 (류 브 ) 이 연 결 되 어 있 는 것 으로, 이 렇 게 제조된 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 상 기 개 량 주 사 기 를 이 용하여

쥐 의 폐 에 주 사 하였다 (하기 도 5 는 개 량 주 사 기 의 전 체 적 인 개 략 도 임). [135] 이 때 실 시 간 CT 촬 영 장 치 (본 실 시 예 에 사용된 CT 는 CT Fluoroscopy 기 능 이 있 는 CT 로 서 , Real time tracking 이 가 능함) 에 서 촬 영 하 는 영상의 임 의 의 단면과 일 치 하 는 방 향으로 레 이 져 를 조사하 였으며 , 이 렇 게 조사되 는 레 이 져 에 쥐 의 폐 를 레 이 져 와 일 직 선 이 되 게 고 정 하 였다. 그 리 고 개 량 주 사 기 의 바늘을 마 이크로 핀 셋 (micro-forcep) 을 이 용하여 레 이 져 의 조 사 방향과 일 치 하도록 개 량 주 사 기 의 바늘을 정 확하게 고 정 시 킨 상 태 에 서 쥐 의 폐 에 상 기 폐 암 종 양 조 직 흔 합액을 주사하 였다. 한편, 주 사 과 정 에 서 실 시 간 CT 촬 영 장 치 를 통 해 실 시 간으로 전송되 는 화면을 통 해 레 이 저 와 주 사 바늘이 폐 에 수 직 인 방 향으로 일 치 되 는 것 을 확 인 하면서 정 교하교 정 확하게 주사하 였다. 이 렇 게 주사를 완 료하여 최 종 폐 암 동 물 모델을 제 조 하였다 (하기 도 6은 상 기 과 정 의 전 체 적 인 개 략 도 임). [136] 이 렇 게 제 조 된 폐 암 동 물 모델은 2 주 가 경 과 한 후 , 폐 암 병 변 이 발 생 하였는 지 를 , 정상군 (페 암 종 양 조 직 흔 합 액을 투 여 하 기 전 의 정 상 동 물모델 에 서 의 폐 조직) 과 비 교 하 였다. [137] [138] 비 교 예 [139] 상 기 실 시 예 의 폐 암 환자에 게 서 추출한 폐 암 조 직 을 Cell 라 인 배 양 을 통 한 일 반 적 인 방 법 으 로 항 암제를 스 크 리 닝 하 였다. [140] [141] 실 험 예 [142] < 폐 안 동 물 모템의 함 안 체 감 수 성 가 > [143] 상 기 실 시 예 2 에 따 른 폐 암 동 물 모델을 가 지 고 각 항암제 의 감수성 을 평 가하는 검사를 실 시 하 였다. 즉 , 동일한 환 자 에 게 서 수득한 폐 암 종 양 조 직 을 가 지 고 실 시 예 2 에 따 라 10 개 의 폐 암 동 물 모델을 제조한 후 , 각 폐 암 동 물 모델에 각 항암제 를 투 여 하 고 이 에 대 한 감수성 을 측 정 하 는 방 식 으 로 진 행 하 였으며 , 이 의 결과는 하 기 표 1 및 도 4 에 나타내 었다. 하 기 도 4 에 서 는 막 대 그 래프가 높 아 질수록 사용된 약 제 의 암 조 직 에 대 한 감 수 성 이 높음을 의 미 한다. 하 기 표 1 및 도 4 에 서 확인할 수 있는 바 와 마 찬가지 로 8 번 항암제 를 처 리 한 폐 암 동 물 모델이 가 장 감 수 성 이 높 은 결과를 보 임 을 확인할 수 있으 며 , 기 타 1 번 또 는 4 번 항 암 제 의 경 우 에 도 높 은 감수성 을 보 임 을 확 인 할 수 있 었다. 한편, 하 기 표 1에 서 TAX 는 Taxol, CBP 는 Carboplatin, CDDP 는 Cisplatin, GEM 은 Gemcitabine 의 약 어 이 다 . [144] [표 1]

[145] [146] <심 험 예 3으 로부터 제 조 뒤 폐 안 동 물 모델의 폐 안 병 변 확 1> [147] 상 기 실 시 예 3에 따 라 제조된 폐 암 동 물모델 로부터 폐 암 병 변 발 생 유무를 확 인 하고자 실 시 예 3을 실 시 하 기 전 의 정 상 동 물모델 에 서 의 폐조직 과 실 시 예 3에 따 라 제 조 된 폐 암 동 물 모델의 폐 조 직 을 비 교하였 으 며 , 이 의 결 과 는 하 기 도 7 에 나타내 었다. [148] 하 기 도 7 에 나타난 바 와 같 이 루 이 스 폐 암 세포를 소 형 동 물 모델인 쥐 에 주 입 한 결과, 정 상 동 물모델 에 서 의 폐조직 과 달 리 폐 암 병 변 이 발 생 한 것 을 확인할 수 있었다 (우측 사 진 노 란 화살표 참 조). 즉 본 발 명 에 따 라 제조할 경 우 , 소 형 동물의 경 우 에 도 비 침 습 적 인 과 정 을 통해, 투 여 된 폐 암 조 직 으 로 발 병 한 폐 암 병 변 을 갖 는 폐 암 동 물 모델을 확 립할 수 있음을 확인하 였다. [149] [150] 상 기 에 서 는 본 발 명 의 바람직 한 실 시 예 에 대 하 여 설 명 하였지 만 , 본 발 명 은 이 에 한 정 되 는 것 은 아 니 고 , 본 발 명 의 기 술 사 상 범 위 내 에 서 여 러 가 지 로 변 형 하 여 실 시 하 는 것 이 가 능 하고, 이 또 한 첨부된 특 허 청 구 범 위 에 속하는 것 은 당 연 하다. 산 업상 이용 가능성 [151] 본 발 명 은 폐 암 동 물 모델의 제 조방법 에 관 한 것 으로, 간단한 과 정 을 통 해 환 자 로부터 유 래 된 폐 암 세포를 동물에 주 입 하 여 정 위 적 으 로 폐 종양이 발 생 한 폐 암 동 물 모델을 효 과 적 으 로 제조할 수 있다. W O 2017/142292 PCT/KR2017/001610

청 구 범 위

[ 청 구 항 1] 1) 실 시 간 CT 로 동물의 폐 위 치 를 확 인하는 단 계 ; 및 2) 상 기 단 계 에 서 확인된 동물의 폐 위 치 에 , 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액을 24-30 게 이 지 바늘로 주 사하는 단 계 ;를 포 함하는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 2] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종 양 세 포 의 크 기 는 100 厚 미 만 인 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 3] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종양세 포 는 암 세 포주이 거 나 폐 암 환 자 로부터 분 리 된 폐 암 세포인 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 4] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종 양 세 포 및 증 점 제 흔합액 은 상 기 증 점 제 100 중 량부에 대하여 종 양 세 포 가 1-500 중 량부로 포 함 되 는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 5] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액의 점 도 는 3-25 cps 인 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 6] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종 양세포 및 증 점 제 흔합액 에 는 조 영 제 를 더 포 함하는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 7] 제 6항 에 있 어 서 , 상 기 조 영 제 는 상 기 종 양세포 및 증 점 제 흔합액 중에서 종 양세포 100 중 량부를 기 준으로 조 영 제 를 1-200 중 량부로 포 함 되 는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 8] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 동물은 마우스 또 는 랫트인 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 9] 제 1항 에 있 어 서 , 상 기 종 양세포 및 증 점 제 흔 합액은 주 사 기 를 사 용하여 주 사 하 되 , 상 기 주 사 기 의 바늘이 상 기 C T 촬 영 영상의 단 면 위 치 에 그 단면과 평 행하는 방 향으로 주 사 되 는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 10] 제 9 항 에 있 어 서 , 상 기 주 사 기 는 개 량 주사기 인 것 을 특 징 으 로 하고, 상 기 개 량 주 사 기 는 주사기 (100), 주 사 바 늘 (200) 및 채 널 (300) 을 포 함 하고, W O 2017/142292 PCT/KR2017/001610

상 기 채 널 (300) 은 상 기 주 사 기 의 주 입 구 (100) 와 상 기 주 사 바 늘 (200) 사 이 에 결 합 되 어 있 는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물 모델의 제 조 방 법 . [ 청 구 항 11] 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 에 있 어 서 , 증 점 제 가 보관된 바 이 알 ; 및

24-30 게 이 지 바늘을 갖 는 주사기 ；를 포 함하는 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 . [ 청 구 항 12] 제 11항 에 있 어 서 , 상 기 주 사 기 는 개 량 주사기 인 것 을 특 징 으 로 하고, 상 기 개 량 주 사 기 는 주사기 (100), 주 사 바 늘 (200) 및 채 널 (300) 을 포 함 하고, 상 기 채 널 (300) 은 상 기 주 사 기 의 주 입 구 (100) 와 상 기 주 사 바 늘 (200) 사 이 에 결 합 되 어 있 는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 . [ 청 구 항 13] 제 11항 에 있 어 서 , 상 기 증 점 제 는 조 영 제 를 더 포 함하는 것 을 특 징 으 로 하 는 폐 암 동 물모델 제조용 키 트 . [ 청 구 항 14] 1) 제 1항 에 따 라 제 조 된 폐 암 동 물모델 에 항암제 를 투 여 하 는 단 계 ;

2) 상 기 1) 단 계 의 동 물에서 폐 암 세포의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 항 암 제 의 항 암 효과를 확 인하는 단 계 ;를 포 함하는 폐 암 동 물 모델을 이 용하여 항 암 제 의 치 료 효능을 분 석 하 는 방 법 . [ 청 구 항 15] 1) 제 1항 에 따 라 제 조 된 폐 암 동 물모델 에 항암제 후 보 물 질 을 투 여 하 는 단 계 ; 및 2) 상 기 1) 단 계 의 폐 암 동물모 델에서 종 양 세포의 성 장 또 는 전 이 를 측 정 하 여 항암제 후 보 물질의 항 암 효과를 확 인하는 단 계 ;를 포 함하는 폐 암 동 물 모델을 이 용하여 항 암제를 스 크 리 닝 방 법 .

International application No. PCT R2 17/0 16 0

A . CLASSIFICATION O F SUBJECT MATTER

AOIK 67/027(2006M)i GOIN 33/50(2006.0 ) i

According to International Patent Classification (IPC) o r to both national classification and IPC

B . FIELDS SEARCHED

Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)

AOIK 67/027; C12N 5/09: A61K 47/36; C12N 5/095; C12Q / 0 4 ; A 6 B 10/00; A B 6/03: A K 9/06; CI2Q 1/68; GOIN 33/50

Documentation searched other than minimum documentation to the extent thai such documents are included in the fields searched Korean iiii modeis and applications for Utility modeis: P C as above Japaiiese Utility modeis and applications f o i ii models: IPC as above

Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search te s used)

eKOMPASS ( Ρ Ο internal) & Keywords: animal mod l n o se r a t C coraputed tomography, sca n i g

C . DOCUMENTS CONSIDERED T O B E RELEVANT

Category* Citation o f document, with indication, where appropriate, o f the relevant passages Relevant to claim No.

Y JP 20 0 7 5 27 2.16 A (CENTRAL INSTITUTE FOR EXPERIMENTAL ANIMALS ε Ε a ,) - 15 2 7 Sepiember 2007

See claims 1—21 a d A

Y JP 2008—525126 A (BIO-TREE SYSTEMS, INC.) 7 July 2008 1-10,14-15 See claims i-29 figure 2 .

Y K R 10-2011-0105265 A (KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY 4—7,10,12-13 INDUSTRY- ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION) 2 6 September 2 0 See paragraphs 0 3 5Η 0 0 3 9 and i g r e 1 ,

Y JP 2013 -510175 A ( SP G H T TECHNOLOGY PARTNERS LLC.) 2 March 2013 11-13 See claims 8 , 124.

Y K R !0-20144)133399 A ( Ε ASAN FOUNDATION) 19 November 2014 .14-15 See c a s 18-19 and figure 6 .

F X C O Byeong Hyeon e a ., "Reai-Tiine C p ed Tomograpy Fluoroscopy inoculation 1—15 of VX2 Lung Cancer Model n Rabbit", l d Molecular imaging Society, 8 Sepiember 2 0 6 See pages 1-2, The above o m e Ei s dociiraenl d g exceptions io lack of n e .y by the

Further documents are listed in the continuation o f Box C . See patent family annex.

* Special categories of cited documents: "'Τ" later document published after the international filing date or priority A " document defining the general state of the art which isnot considered date and not i conflict with the application but cited to understand to be of particular relevance the principle or theory underlying the invention 'Έ" earlier application or patent but blished on or a te the international X " document of particular relevance; the claimed invention cannot b i ng date considered novel or cannot be considered to involve an inventive ' _" document which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document i s taken alone cited to establish the publication date of another citation or other Ύ " document of particular relevance; the claimed invention cannot be special reason (as specified) considered to involve an inventive step when the document is O" document referring to a oral disclosure, use, exhibition or other combined with one or more other such documents, such combination means being obvious to a person skilled in the art ' " document published prior to the international filing date but later t a document member of the same patent family the priority date claimed

Date o f l;he actual completion o f the international search Dal e o f m ailing the tera a i o n a search report

17 MAY 20 7 ( 17.05 2017) 18 MAY 2017 (18.05.2017)

Name and tnailing address o f the ISA/KR Authorized officer Korean intellectual Er p r Office G vei e C plex-Daej n, 189 - , Daej n 3 2-7 , Republic of Korea Facsimile No. +82-42-481-8578 Telephone No.

Form PCT/ISA/210 (second sheet) (January 2015) Intemaiioiial application No. Information on patent family members P C T / 20 7/00 6 10

Paieni document Fiiblication Patent f a y F b c at i o n cited i n search report date member date

P 2007-5272 6 A 27/09/2007 AT 458997 T 15/03/2010 AU 2004-263079 A 17/02/2005 CA 253 9 16 A 17/02/2005 EP 1644732 A2 12/04/2006 EP 1644732 B 24/02/2010 J P 20 1-030570 A 17/02/201 P 4663634 B2 06/04/20 US 2005— 132427 A 1 16/06/2005 O 2005-01 3682 A2 17/02/2005 WO 2005—01 3682 A3 28/07/2005

JP 2008- 52 6 A 17/07/2008 CA 2634466 A 29/06/2006 EP 1877980 A2 16/0 /2008 J P 20 12-2236 16 A 15 / 20 12 P 20 15-09 4 32 A 14/05/20 5 J P 6023235 B2 09/ 20 16 US 2009—Ό05693 A 0 / 0 /2009 o wo 2006—069379 A2 29/06/2006

o 2006-0 o69379 A3 18/0 1/2007 o

KR - 20 --0 05265 A 26/09/20 NONE

JP 20 3- 5 10175 A 2 /03/20 3 AU 20 10-3 14992 A 17/05/20 2 AU 20 10-314992 B2 15/09/2016 CA 2780294 A 12/05/201 CN 102695500 A 26/09/2012 EP 2498763 A 19/09/20 2 EP 2498763 A4 07/ 10/2015 J P 5864429 B2 17/02/2016 NZ 599524 A 30/04/2014 S 2 /02/20 3 o 2 0 - 0 5 7 13 1 A 1 12/05/201

KR 10—20 4 —0 133399 A 19/ 11/20 14 KR 1위 674468 B 1 10/ 11/2016

Form PCT/ISA/2 i O (patent family annex) (Jamiaiy 2015) A . 발 명 이 속 하 는 기 술분류 (국 제 특 허 분 류 (IPC))

AOIK 67/027(2006.01)i, G01N 33/50(2006.01)i

B . 조사된 분 야

조사된 최 소문헌 (국제 특 허 분류를 기 재 ) A0 1 67/027 ； C12N 5/09 ； A6 1 47/36 ； C12N 5/095 ； C12Q 1/04 ； A61B 10/00 ； A61B 6/03 ； A6 1 9/06 ； C12Q 1/68 ； G01N 33/50

조사된 기 술 분야에 속 하 는 최 소문헌 이 외 의 문 헌 한 국등록 실용신 안공보 및 한 국 공 개 실 용 신 안 공 보 : 조사된 휙 소 문 헌 란 에 기 재 된 IPC 일 본등록 실용신 안공보 및 일 본 공 개 실 용 신 안 공 보 : 조사된 최 소 문 헌 란 에 기 재 된 IPC

국 제 조사에 이 용 된 전 산 데 이 터 베 이 스 ( 데 이 터 베 이 스 의 명 칭 및 검 색 어 ( 해 당 하 는 경 우)) eKOMPASS ( 특 허 청 내 부 검 색 시 스 템 ) & 키 워 드 : 동 물 모 델 , 마 우 스 , 래 트 , CT, 컴 퓨 터 단 층 촬 영 , 주 사

C . 관 련 문 헌

카 테 고 리 * 인 용 문헌명 및 관 련 구 절 ( 해 당하는 경 우 ) 의 기 재 관 련 청 구 항

Y J P 2007-527216 A (CENTRAL INSTITUTE FOR EXPERIMENTAL ANIMALS 등 ) 2007 . 09 . 27 1—15 청 구 항 1-21 및 도 면 1A 참 조 .

Y J P 2008-525126 A (BIO-TREE SYSTEMS , INC. ) 2008 . 07 . 17 1—10 , 14—15 청 구 항 1-29 및 도 면 2 참 조 .

Y 10-2011-0105265 A ( 경 북 대 학 교 산학협 력 단 ) 2011 . 09 . 26 4—7 , 10, 12—13 단 락 [0035]- [0039] 및 도 면 1 참 조 .

Y J P 2013-510175 A (SPOTLIGHT TECHNOLOGY PARTNERS LLC. ) 2013 . 03 . 21 11-13 청 구 항 8 , 124 참 조 .

Y KR 10-2014-0133399 A ( 재 단 법 인 아산사 회 복 지 재 단 ) 2014 . 11 . 19 14-15 청 구 항 18-19 및 도 면 6 참 조 .

PX Byeong Hyeon Cho i 등 , Real-Time Computed Tomogr apy Fluoroscopy inocul at i on 1—15 o f VX2 lung cancer model i n rabbi t ' , Wor l d Mo ecul ar Imaging Soc i ety, 2016 . 09 . 18 페 이 지 1-2 참 조 . 위 문헌은 출 원 인 이 신규성 상실의 예 외 로 서 선 언 한 공지문 헌 임 .

ᄆ추 가 문 헌 이 C ( 계 속 ) 에 기 재 되 어 있 습 니 다 . ¾ 대 웅 특 허 에 관 한 별 지 를 참 조하십 시 오 .

인용된 문헌의 특 별 카 테 고 리 : 국 제 출 원 일 또 는 우선일 후 에 공개된 문 헌 으로, 출원과 상 층하지 않으며 발 명 의 기 초 가 되 는 원 리 나 이 론 을 이 해 하 기 위 해 인용된 "A" 특별히 관련이 없 는 것 으 로 보 이 는 일 반 적 인 기 술수준 을 정 의 한 문 헌 문 헌 "E" 국 제 출 원 일 보 다 빠 른 출 원 일 또 는 우선일 을 가 지 나 국 제 출 원 일 이 후 특 별 한 관련이 있 는 문헌. 해 당 문 헌 하 나 만으로 청 구 된 발 명 의 신 에 공 개 된 선출원 또 는 특 허 문 헌 규 성 또 는 진보성 이 없 는 것으로 본다.

"L" 우선권 주장에 의 문 을 제 기 하 는 문 헌 또 는 다 른 인 용 문헌의 공 개 일 Y 특 별 한 관련이 있 는 문헌. 해 당 문 헌 이 하 나 이 상 의 다 른 문헌과 또 는 다 른 특 별 한 이 유 ( 이 유 를 명 시 ) 를 밝 히 기 위 하 여 인용된 문 헌 조 합하는 경 우 로 그 조합이 당 업 자 에 게 자 명 한 경 우 청 구 된 발 명 "0" 구 두 개 시 , 사용, 전 시 또 는 기 타 수단을 언 급하고 있 는 문 헌 은 진 보 성 이 없 는 것으로 본다.

"P" 우선일 이 후 에 공 개 되 었 으 나 국 제 출 원 일 이 전 에 공개된 문 헌 "&" 동 일 한 대 웅특허 문헌에 속하는 문 헌

국 제 조사의 실 제 완료일 국 제 조 사 보고서 발송일 2017 년 05 월 17 일 ( 17. 05 . 2017) 2017 년 05월 18 일 ( 18 . 05 . 2017)

τ ISA/KR 의 명 ᅵ ᅵ및 ¾ ¾ 소 심 사 관 、교 、\

(35208) 대 전 광 역 시 서 구 청사로 189, 강민정 4 동 ( 둔 산 동 , 정 부 대 전 청 사 )

꿰 스 번 호 +82-42-481-8578 전 화 번 포 +82-42-481-813 1 서 식 PCT/ISA/210 (두 번 째 용 지 ) (20 15 년 1월 ) 대웅 특 허 에 관 한 정 보 PCT/KR2017/001610

국 제 조 사보고 서 에 서 공 개 일 대 웅 특 허문헌 공 개 일 인용된 특 허 문 헌

JP 2007-527216 A 2007/09/27 AT 458997 T 2010/03/15 AU 2004-263079 Al 2005/02/17 CA 2531916 Al 2005/02/17 EP 1644732 A2 2006/04/12 EP 1644732 Bl 2010/02/24 JP 2011-030570 A 2011/02/17 JP 4663634 B2 2011/04/06 US 2005-132427 Al 2005/06/16 wo 2005-013682 A2 2005/02/17 wo 2005-013682 A3 2005/07/28

JP 2008-525126 A 2008/07/17 CA 2634466 Al 2006/06/29 EP 1877980 A2 2008/01/16 JP 2012-223616 A 2012/11/15 JP 2015-091432 A 2015/05/14 JP 6023235 B2 2016/11/09 US 2009-005693 Al 2009/01/01 wo 2006-069379 A2 2006/06/29 wo 2006-069379 A3 2007/01/18

KR 10-2011-0105265 A 2011/09/26 l

JP 2013-510175 A 2013/03/21 AU 2010-314992 Al 2012/05/17 AU 2010-314992 B2 2016/09/15 CA 2780294 Al 2011/05/12 CN 102695500 A 2012/09/26 EP 2498763 Al 2012/09/19 EP 2498763 A4 2015/10/07 JP 5864429 B2 2016/02/17 NZ 599524 A 2014/04/30 US 2013-0045182 Al 2013/02/21 WO 2011-057131 Al 2011/05/12

KR 10-2014-0133399 A 2014/11/19 KR 10-1674468 Bl 2016/11/10

/ISA/210 ( 대 웅특허 추 가 용 지 ) (2015 년 1월 )