Lina Bonilla Ioc Dout 2017.Pdf
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MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Programa de Pós-Graduação em MEDICINA TROPICAL ESTUDO DO CICLO DE TRANSMISSÃO SILVESTRE E SUBURBANO DE Leishmania (Viannia) panamensis NA COLÔMBIA: AVALIAÇÃO DO PAPEL DE Didelphis marsupialis (Didelphimorphia) E Canis familiaris (Carnívora) COMO POTENCIAIS RESERVATÓRIOS LINA MARIA CARRILLO BONILLA Rio de Janeiro Março de 2017 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical LINA MARIA CARRILLO BONILLA ESTUDO DO CICLO DE TRANSMISSÃO SILVESTRE E SUBURBANO DE Leishmania panamensis NA COLÔMBIA: INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DE Didelphis marsupialis (Didelphimorphia) E Canis familiaris (Carnivora) COMO POTENCIAIS RESERVATÓRIOS Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Orientador (es): Prof. Dr. Elisa Cupolillo Prof. Dr. Ivan Dario Velez RIO DE JANEIRO Março 2017 3 Aos meus pais Lilian Bonilla e Jaime Carrillo, que são minha razão de ser, a meu irmão Gabriel e minha sobrinha Valentina, a felicidade tem seus nomes. Para meu amor, amigo, companheiro da vida, Juan Carlos e nossa Rufamilia. Para meu anjo, minha avó Graciela e meu anjinho Amelia Para mis padres Lilian Bonilla y Jaime Carrillo, que son mi razón de ser, a mi hermano Gabriel y mi sobrina Valentina, la felicidad tiene sus nombres. Por mi amor, amigo y compañero de vida Juan Carlos y nuestra Rufamilia. 4 Para mi ángel mi abuelita Graciela y mi angelito Amelia AGRADECIMENTOS À minha orientadora Dra. Elisa Cupolillo pela, disponibilidade de se aventurar neste projeto, de me apoiar na ideia de fazer algo diferente, não obstante as limitações e o trabalho que poderia lhe trazer. Muito obrigada professora por me ajudar a cumprir meu sonho. À Ivan Dario Velez (diretor do Programa de Estudio y Control de las Enfermedades Tropicales –PECET-) que contribuiu de forma decisiva na minha formação, desde o mestrado até este momento. A forma como abordo os problemas científicos me foi ensinado por você. Ao chefe do Laboratório de Pesquisas em Leishmanioses (LPL) Renato Porrozi por seu acolhimento. À Martha Suárez Mutis coordenadora da pós-graduação pela revisão do texto, a paciência e compressão. À Sara Robledo professora e pesquisadora do PECET pela disponibilidade, competência, generosidade e especialmente por sua amizade. À Mariana Boité minha colega que se tornou minha amiga e guia. Não existem as palavras para agradecer tudo o que você fez por mim. Tem gente que chega a sua vida e muda ela para sempre. À Andres Velez, Horacio Cadena e Juan Estaban Perez pela imensa e dedicada contribuição no trabalho com os animais silvestres. À Patricia Cuervo, Sandra Vargas e Natalia Souza por me oferecer sua casa como se fosse a minha, e nesse calor familiar fornecer uma linda e duradoura amizade. Precicei muito de essa familiaridade que consegui com vocês, obrigada sempre. À Andres Montoya, Gustavo Blandon, Carlos Montoya, Amanda Cavalcanti pela complicidade e valiosa contribuição na padronização da PCR e PCR em rempo real. À Luz Adriana Acosta e Karina Mondragon, pela especial amizade e valorosa contribuição nas coletas e identificação dos insetos em Choco (Colombia). Viraram de ser minhas “filhas” para ser grandes amigas. 5 À Omar Cantillo do laboratório de Biologia y Control de la Enfermades Infecciosas – BCI-, Samantha Cristina de Chagas Xavier e Ana Jansen do Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos e pelo carinho e auxílio indispensável na realização das IFAT. As irmãs da vida Diana Tobon, Sandra Aguilar e Erika Loaiza por persistir nesta amizade apesar da distância e o abandono, nos “momentos de dificuldades” são nestas horas que reconhecemos os verdadeiros amigos. Obrigada por ser verdadeiras amigas. As comunidades de Acandí, Chocó e Puerto Valdivia, Antioquia por sua disposição, paciência e amor. Aos funcionários de saúde nas áreas de estudo tanto por sua valiosa ajuda quanto por seu trabalho generoso, silencioso e pouco reconhecido mas fundamental para as comunidades e o desenvolvimento do pais. Aos colegas do laboratório e amigas, Natalia Alvarez, Maria Fernanda Florez, Eugenia Cardona, pelo poio em todo momento, seu carinho e amizade sempre presente. À todos os Colegas do Laboratório de Pesquisas em Leishmanioses Camila Braga, Caroline Batista, Fernanda Morgano, Luiza Pereira, Gabriel Ferreira, Erika Costa, Andres Rodriguez, Monica Losada. Aos pesquisadores e todos os amigos do laboratório PECET e LPL. Comunidade de cientistas cheios de sonhos e todos dispostos a colaborar, faz mais fácil o caminho do doutorado. À Babarela por estar viva e seguir espalhando sua energia maravilhosa, suas palavras mágicas consegueram me tranquilizar nos momentos de desespero. À toda minha família Bonilla, minhas tia Fabiola, Mercedes, Gloria e Alcira, meus primos e seus filhos que sempre acompanharam a minha trajetória e acreditaram em mim. Todo meu amor para vocês À Patricia Montoya ela foi o sol na escuridão, devo a você as coisas esseciais que eu tenha que aprender neste doutorado, agradecida por sempre. Finalmente agradeço a vida por me dar esta grande oportunidade de viver a grandeza do povo Brasileiro 6 “Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós. ”Antoine de Saint-Exupéry “É intentando o impossível como se consegui o possível” Henry Barbusse 7 INSTITUTO OSWALDO CRUZ ESTUDO DO CICLO DE TRANSMISSÃO SILVESTRE E SUBURBANO DE L. panamensis NA COLÔMBIA: INVESTIGAÇÃO DO PAPEL DE Didelphis marsupialis E Canis familiaris COMO POTENCIAIS RESERVATÓRIOS RESUMO DISSERTAÇÃO TESE DE DOUTORADO EM MEDICINA TROPICAL Lina Maria Carrillo Bonilla O conhecimento dos reservatórios de Leishmania spp. é chave para seu controle. O trabalho teve como alvo a avaliação do papel de Didelphis marsupialis e Canis familiaris como potenciais reservatórios de L. panamensis no ciclo silvestre e suburbano, na Colômbia. Amostras de sangue e pele foram coletadas dos animais. Realizamos isolamento do parasito da lesão e teste de Montenegro na população humana, PCR com Hsp70, eletroforese de isoenzimas, tipagem por sequências multilocus, e carga parasitária por qPCR, assim como xenodiagnóstico. Um total de 675 amostras foi obtido, incluindo 27 isolados de lesões de pacientes e três de gambás, identificadas como L. panamensis. O teste de Montenegro demonstrou a endemicidade da doença, 67/233 (29%) na área silvestre e 61/143 (43%) na área suburbana. Os títulos de anticorpos em cães por IFI foram de 21% na área suburbana e 28% na área silvestre. Os resultados da PCR demonstraram uma alta positividade para ambas as espécies, com aproximadamente 40% na área suburbana e 3% na área silvestre. O sequenciamento de hsp70 e de outros genes identificou a L. panamensis como a única espécie infectante. A carga parasitária foi medida, tendo como alvos DNApol e ssRNA. Para a área silvestre, as médias foram muito baixas para as duas espécies, de maneira contrária à área suburbana. Em um total de 13 xenodiagnósticos, nenhum dos animais foi positivo por microscopia, no entanto seis de oito cães foram positivos por PCR dos insetos usados no xenodiagnóstico. Além de caracterizar o perfil epidemiológico, o presente estudo aplicou métodos moleculares para a tipagem genética das cepas de L. panamensis nas diferentes áreas de estudo, indicando elevada homogeneidade genética. O mesmo foi observado nas análises da estrutura populacional, que identificaram só dois complexos clonais com a maioria das cepas. Finalmente, observamos uma tendência na frequência de positividade dos animais com respeito ao regime de chuva. Esses resultados sugerem que ambos animais possuem papéis diferentes em cada ciclo de transmissão, correspondendo isso à teoria de foco em leishmanioses. Na área silvestre, com um ciclo de transmissão principalmente extradomiciliar e selvático, os gambás são os que possuem o papel de mais preponderância que os cães, no entanto, sendo uma área que tem uma alta diversidade, pode ser que outras espécies estejam envolvidas no ciclo de transmissão, reduzindo a importância das espécies estudadas. Na área suburbana, o rol de ambas as espécies parece aumentar. Ainda que alguns resultados não cumpram com os critérios teóricos para categorizar as espécies de estudo como reservatório, esses resultados se acoplariam à nova teoria dinâmica dos reservatórios como um conjunto de espécies que atuam como fonte de manutenção do parasito, especialmente na área suburbana, muito provavelmente fazendo parte da população que mantém e perpetua o ciclo que contribui para a endemicidade da LTA causada por L. panamensis na Colôm 8 INSTITUTO OSWALDO CRUZ ABSTRACT PHD THESIS MEDICINA TROPICAL Lina Maria Carrillo Bonilla Knowledge of Leishmania reservoirs is key to its control, but currently there are few conclusive results. The main aim of this work was to evaluate the role of Didelphis marsupialis and Canis familiaris as potential reservoirs of L. panamensis in sylvatic and suburban transmission cycles in Colombia. Samples of blood and skin were collected from the animals. The activities performed in order to achieve this were: isolation of skin lesion parasite, Montenegro test in the human population, PCR with Hsp70, isoenzyme electrophoresis, multilocus sequence typing, and parasitic load by qPCR, as well as xenodiagnosis. 675 samples were obtained, incluing addition to 27 isolates from patient lesions and three from opossums, all identified as L. panamensis. Montenegro tests confirmed the continued endemicity of the disease, 67/233 (29%) in the sylvatic area and 61/143 (43%) in the suburban area. Antibody titers in dogs by IFI were 21% in the suburban area and 28% in the sylvatic area. PCR results showed a high positivity for both species, with approximately 40% and 3% in the suburban area and the sylvatic area respectively. Sequencing of hsp70 and other genes identified L. panamensis as the only infecting species. Parasite load was measured with DNApol and ssRNA as targets. For the sylvatic area, parasite load was very low for the two species of animals, with the two targets. The opposite was observed in the suburban area. In the suburban area 13 xenodiagnoses were carried out none of the animals were positive by microscopy.