Bruno Meirelles Paes INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera Membranacea SOBRE a DISFUNÇÃO VASCULAR Macaé 20

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira

Programa de Pós-graduação em Produtos

Bioativos e Biociência

Bruno Meirelles Paes

INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR

Macaé 2017

INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientadora: Profª. Drª. Juliana Montani Raimundo

Bruno Meirelles Paes

Macaé, 2017

Bruno Meirelles Paes

INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio de Janeiro para obtenção do grau de mestre em produtos e bioativos e biociências. Orientadora: Profª Drª Juliana Montani Raimundo Aprovada em 07/06/2017

BANCA EXAMINADORA

______Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo (Orientadora) Campus UFRJ-Macaé

______Profa. Dra.Cintia Monteiro de Barros Campus UFRJ-Macaé

______Prof. Dr. Leandro Louback da Silva Campus UFRJ-Macaé

______Prof. Dr. Thiago da Silveira Álvares Campus UFRJ-Macaé

Dedico esta conquista a todos os meus familiares, amigos e a todas as pessoas que me fazem felizes.

AGRADECIMENTO

Aos meus pais primeiramente, Moacyr e Alba. Sem o apoio, o incentivo ao estudo e o amor de vocês essa conquista não seria possível. Às minhas irmãs, Marina e Liana. Irmãos não servem apenas para brigar e sim, para apoiar, aprender e puxar as orelhas de vez em quando. Aos meus avós maternos, Wanilton e Alba. Com a calma, mimos, sabedoria, experiência e o amor de vocês. Aos meus avós paternos, Herval e Maria Francisca, também tenho mais além de agradecimentos. Apesar de não ter sido muito próximo do meu avô e minha avó ter falecido antes do meu nascimento, construíram de maneira perfeita os pilares de suas famílias e, um desses pilares, é o meu pai. A todos meus familiares que contribuíram de forma significativa para essa conquista. Destaco em especial aos meus tios, Mário, Luís Antônio, Paulinho e à minha única e preferida tia, Cida. Faço um agradecimento em especial à memória do meu tio Teté. Esse nos deixou no meio dessa jornada. Sempre foi um tio muito presente e incentivador aos estudos. À minha namorada Fernanda. Apesar de nos reencontramos no meio dessa jornada, foi essencial para o término da mesma através do seu amor, paciência e carinho. Aos meus amigos, em especial William, Reynaldo, Diego, Bruno Moraes, Jéssica Ladeira e Cinthya Maciel. Nessa trajetória de mestrado não houve tantas festas, bebedeiras e ressacas quanto no tempo de graduação, mas o apoio e a amizade de vocês foram essenciais para esta conquista. A todos os colegas que passaram e ficaram na minha vida nesse período do mestrado. A todos os amigos e colegas que fiz no LIP. Em especial à Cinthya Maciel, Millena Vidal e Letícia Ferreira. Todas vocês foram essenciais para essa conquista. Em especial à minha professora orientadora Juliana Montani. Pela calma, conhecimento, atitudes e paciência, mas muita paciência. E mais um pouco de paciência. Talvez mais um pouco de paciência. Pode ter certeza que o profissional que virei hoje, tirei um pouco de você. Aos professores que contribuíram de forma significativa para meu crescimento profissional e formação.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

RESUMO

Alterações vasculares morfológicas e funcionais, como estresse oxidativo e disfunção endotelial, são característicos das doenças cardiovasculares e seus fatores de risco. Sendo assim, há a necessidade de busca por novas substâncias capazes de atenuar e/ou prevenir a disfunção vascular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial farmacológico de produtos bioativos obtidos da espécie vegetal Kielmeyera membranacea (extrato hidroalcólico das folhas – EKM, frações e subfrações) na disfunção vascular. A atividade vasodilatadora e os efeitos na reatividade vascular na ausência e presença de disfunção vascular foram investigados em aortas isoladas de ratos Wistar preparadas para registro de tensão isométrica. O EKM provocou vasodilatação dependente do endotélio através da ativação da produção de óxido nítrico, com participação dos receptores de bradicinina B2 e de estrogênio ERα. A incubação de anéis de aorta com 25 mM de glicose por 2 h ou com 10 µM de pirogalol por 15 min resultou em aumento da contração induzida por fenilefrina e redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina. Quando a disfunção vascular foi induzida por glicose, o pré-tratamento com 3,5 µg/mL de EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou parcialmente a vasodilatação em resposta à acetilcolina. No entanto, quando a disfunção vascular foi induzida por pirogalol, o EKM normalizou apenas a reatividade à fenilefrina. A fração butanólica do EKM provocou intenso relaxamento vascular e foi mais potente que as demais frações e o EKM. Entre os flavonoides identificados na fração butanólica, a orientina parece ser o principal envolvido no efeito vasodilatador. Palavras chave: Disfunção vascular, óxido nítrico, vasodilatação.

ABSTRACT

Functional and morphological vascular changes, such as oxidative stress and endothelial dysfunction, are characteristics of cardiovascular diseases and its risk factors. Therefore, there discovery of new substances capable of attenuating and/or preventing vascular dysfunction is needed. The aim of the present work was to investigate the pharmacological potential of bioactive products from Kielmeyera membanacea species (hydroalcoholic extract of leaves – EKM, fracions and subfractions) for vascular dysfunction. The vasodilatory activity and the effects on vascular reactivity in the absence and presence of vascular dysfunction were assessed in Wistar rat aortas prepared for isometric tension recording. EKM-induced vasodilation was endothelium-dependent and mediated through the activation of NO production, with the involvement of bradykinin B2 and estrogen ERα receptors. Incubation of aortas with either 25 mM glucose for 2 h or 10 µM pyrogallol for 15 mim, resulted in augmented vasoconstriction to phenylephrine and reduced vasodilation to acetylcholine. When vascular dysfunction was induced by glucose, pretreatment with 3.5 µg/mL of EKM normalized vascular reactivity to phenylephrine and partially restored vascular reactivity to acetylcholine. On the other hand, when vascular dysfunction was induced by pyrogallol, pretreatment with EKM only restored vascular response to phenylephrine. Butanol fraction of EKM induced intense vasodilation and exhibited higher potency when compared with the other fractions and EKM. Among the flavonoids isolated from butanol fraction, orientin seems to be the main metabolite involved in the vascular effects of EKM. Key words: Vascular dysfunction, nitric oxide, vasodilatation.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo de vasodilatação causado pelo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) 21 Figura 2. Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS 24 Figura 3. Registro representativo do teste para avaliação da integridade do endotélio 34 Figura 4. Registro típico da resposta contrátil a 10µL de fenilefrina seguido a exposição a concentrações crescentes e cumulativas do EKM em anéis de aorta com endotélio 37 Figura 5. Efeito vasodilatador do EKM em anéis de aorta com e sem endotélio 38 Figura 6. Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do EKM 39 Figura 7. Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no efeito vasodilatador do EKM 40 Figura 8. Envolvimento da via PI3k/Akt e da ativação dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador do EKM 41 Figura 9. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina 42 Figura 10. Efeitos do EKM na reatividade vascular à acetilcolina 43 Figura 11. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por glicose 44 Figura 12. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 46 Figura 13. Efeito vasodilatador das frações hexânica, em diclorometano, em acetato de etila e butanólica do extrato hidroalcoólicos das folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio 48 Figura 14. Efeito vasodilatador das subfrações 1, 2 e 4 da fração butanólica do extrato hidroalcoólico das folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio 50 Figura 15. Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarpos flavona A 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica. 33

Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de 49 folhas de K. membranacea (EKM) e frações.

Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de 51 folhas de K. membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas subfrações. Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração 51 butanólica de K. membranacea.

LISTA DE ABRAVIATURAS E SIGLAS

2+ 2+ [Ca ]i – Concentração intracelular de Ca AcOEt – Acetato de etila AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ou monofosfato de adenosina cíclico

AMPK – Proteína quinase ativada pelo AMPc ATP – Trifosfato de adenosina

BH2 – 6-7-[8H]-H2-biopterina

BH3 – Trihidrobiopterina

BH4– Tetrahidrobiopterina BuOH – Butanol CaMKII – Proteína quinase II dependente da calmodulina

CI50 – Concentração inibitória média

CE50 – Concentração eficaz média DAG –Diacilglicerol DCNT – Doenças crônicas não transmissíveis DCVs – Doenças cardiovasculares DM – Diabetes mellitus DM-1 – Diabetes mellitus tipo 1 DM-2- Diabetes mellitus tipo 2 DMSO - Dimetilsulfóxido EDHF –Fator hiperpolarizante derivado do endotélio EKM – Extrato hidroalcóolico de folhas de Kielmeyera membranacea eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial ET-1 – Endotelina-1 FAD – Flavina adenina dinucleotídeo FMN – Flavina mononucleotídeo GCs– Guanilatociclase solúvel GMPc –Monofosfato de guanosina cíclico GTP – Guanosina trifosfato HAS – Hipertensão arterial sistêmica Hex – Hexano

IP3 –Inositol 1, 4, 5, trifosfato iNOS – Óxido nítrico sintase induzível

LDL – Proteína de baixa densidade L-NAME – L-NG-Nitroarginina metil éster MeOH –Metanol MLCK – Quinase de cadeia leve de miosina NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo NO – Óxido nítrico nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal NOS – Óxido nítrico Sintase ODQ – 1H-(1,2,4)oxidiazolo(4,3-a)quinoxalin-1-ona ONOO- - Peroxinitrito PA – Pressão arterial pCE50 – log da CE50 em M

PGF2 – Prostaglandina

PGI2 –Prostaciclina Phe – Fenilefrina

PIP2 – Fosfolipídeos fosfatidilinositolbifosfato PKA – Proteína quinase dependente de AMPc PKC – Proteína quinase C PKG – Proteína quinase dependente de GMPc PLC – Fosfolipase C ROS – Espécies reativas de oxigênio RNS – Espécies reativas de nitrogênio RS – Retículo sarcoplasmático SOD – Superóxido dismutase

TXA2 – Tromboxano A2 VEGF – Fator de crescimento endotelial vascular

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 15 1.1. Doenças cardiovasculares 15 1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos sanguíneos 16 1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais 18 1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais 18 1.2.2.1. NO 19

1.2.2.2. PGI2 21 1.2.2.3. EDHF 22 1.3. Disfunção endotelial 22 1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos vegetais 24 1.5. Kielmeyera membranacea 26 2. JUSTIFICATIVA 30 3. OBJETIVOS 31 3.1. Objetivos gerais 31 3.2. Objetivos específicos 31 4. MATERIAIS E MÉTODOS 32 4.1. Material vegetal 32 4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações 32 4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão isométrica 33 4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e subfrações 34 4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do EKM 35 4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular 35 4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por alta concentração de glicose 36

4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 36 4.9. Análise estatística 36 5. RESULTADOS 37 5.1. Efeito vasodilatador do EKM 37 5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina 41 5.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por glicose 43 5.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo 45 5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular 47 6. DISCUSSÃO 52 6.1. Efeito vasodilatador do EKM 52 6.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina 54 6.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por glicose 55 6.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo 56 6.5. Efeitos das frações do EKM no músculo liso vascular 56 7. CONCLUSÕES 60 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61 9. ANEXO 73

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doenças cardiovasculares

As doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) são responsáveis por milhões de óbitos em todo o mundo, sendo as doenças cardiovasculares (DCVs) a principal causa de morte. A cada ano, cerca de 17,5 milhões de pessoas morrem em decorrência de DCVs, representando aproximadamente 31% de todas as causas de morte no mundo. Deste total, mais de 75% foi registrado em países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento (GUIMARÃES et al., 2015). No Brasil, no ano de 2011, foram registrados 335.213 mil óbitos, sendo 37.019 mil óbitos no Estado do Rio de Janeiro (DATASUS, 2016; GUIMARÃES et al., 2015). Estima-se que em 2030 o número de óbitos no mundo devido as DCVs será de 23,6 milhões, representando assim um grave problema de saúde pública (GUIMARÃES et al., 2015; WHO, 2016). As DCVs são caracterizadas por desordens do coração e dos vasos sanguíneos, como por exemplo, distúrbios coronarianos, doença cerebrovascular, doença arterial periférica, doença cardíaca reumática, doença cardíaca congênita e insuficiência cardíaca. Quatro em cada cinco mortes por DCVs estão associadas ao infarto agudo do miocárdio ou acidente vascular cerebral, sendo o acúmulo de gordura depositado nas paredes internas dos vasos sanguíneos a causa mais comum para essas desordens (WHO, 2016). Similarmente a qualquer doença, há fatores de risco que levam ao desenvolvimento das DVCs, os quais podem ser divididos em fatores comportamentais e fatores não comportamentais. Entre os fatores comportamentais citam-se hábitos alimentares inadequados, sedentarismo, tabagismo e uso constante e abusivo de bebidas alcoólicas. Os fatores de risco não comportamentais englobam a hipertensão arterial sistêmica (HAS), diabetes mellitus (DM), dislipidemia, estresse e obesidade (BRASIL, 2016; STAPLETON et al., 2008; WHO, 2016). A HAS, além de ser um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de DCVs, está entre as DCNT mais comuns atualmente. É caracterizada pela pressão arterial sistêmica cronicamente elevada e sustentada, estando frequentemente associada a alterações funcionais e estruturais do coração, 16 encéfalo, rins e vasos sanguíneos (GILES et al., 2012; WEISS et al., 2016). Esta enfermidade é classificada como uma doença multifatorial decorrente da ação combinada de fatores ambientais, genéticos e comportamentais e é responsável por aproximadamente 9,4 milhões de mortes por ano no mundo. Estima-se que em 2025, 1,56 bilhões de pessoas no mundo apresentem HAS (BOLÍVAR, 2013). A obesidade, condição que poderá afetar mais de 1,3 bilhões de indivíduos no mundo em 2030, está relacionada a desordens metabólicas, como por exemplo, intolerância à glicose, resistência à insulina e dislipidemia. Além disso, pode afetar a estrutura e a função cardiovascular, sendo então um fator de risco importante para o desenvolvimento de DCVs (CHENG et al., 2015). Acredita-se que o desbalanço na produção e liberação de substâncias anti- e pró-inflamatórias pelos adipócitos possa ser a ligação entre obesidade, resistência à insulina e DCVs (LACHINE et al., 2016). Adicionalmente, a obesidade e o sobrepeso são encontrados em outras situações clínicas, como no caso de pacientes com DM tipo 2 (DM2) (OKOP et al., 2016; CHENG et al., 2015). As DCVs são a principal causa de morte em pacientes com DM tipo1 (DM1) e DM2 (ABDULLAH, 2016). Dados da literatura sugerem que mulheres com DM1 apresentam risco pelo menos quatro vezes maior que mulheres não diabéticas de desenvolverem DCVs, assim como indivíduos com DM2 têm um risco aumentado em seis vezes de apresentarem doenças macrovasculares quando comparados a pessoas não diabéticas (BROWN et al., 2016; LACHINE et al., 2016). A aterosclerose é considerada o principal mecanismo no desenvolvimento de complicações macrovasculares em diabéticos, sugerindo que um estado inflamatório crônico possa desempenhar papel vital no seu desenvolvimento (ABDULLAH, 2016; LACHINE et al., 2016).

1.2. Estrutura e regulação da contratilidade dos vasos sanguíneos

Em temos histológicos, a parede vascular das artérias e veias é constituída por três túnicas distintas: a túnica adventícia, a túnica média e a túnica íntima. A túnica adventícia é a mais externa da parede vascular e em artérias de grande calibre é possível encontrar vasos sanguíneos denominados vasa vasorum que fornecem nutrientes e oxigênio para a camada média. Esta, a mais espessa, é 17 composta basicamente por células musculares lisas e elastina, e é responsável pela constrição e dilatação dos vasos (ORALLO, 1996). A contração da musculatura lisa vascular ocorre devido ao aumento da 2+ 2+ concentração intracelular de Ca ([Ca ]i). A formação do complexo Ca2+/calmodulina resulta na ativação da quinase da cadeia leve de miosina (MLCK) e consequente fosforilação da cadeia leve de miosina. Isto permite a interação com os filamentos de actina e a contração do músculo liso vascular. Já a redução da 2+ [Ca ]i e a desfosforilação da cadeia leve de miosina pela miosina fosfatase resulta em relaxamento vascular (BROZOVICH et al., 2016). Há dois mecanismos principais que podem iniciar a contração do músculo liso: a despolarização do potencial de repouso da membrana (acoplamento eletromecânico) e a ativação de receptores de membrana por agonistas (acoplamento fármaco-mecânico) (ORALLO, 1996). O componente elétrico de excitação das células musculares lisas é 2+ representado por potenciais de ação, onde o aumento da [Ca ]i ocorre através da sua entrada do espaço extracelular ou pela liberação das reservas intracelulares provenientes do retículo sarcoplasmático (RS). A ativação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L é a principal fonte do influxo de Ca2+ nas células da musculatura lisa (BROZOVICH et al., 2016). O acoplamento fármaco-mecânico resulta da ação de agonistas em receptores específicos, cujos efeitos são mediados por diferentes quinases. As vias RhoA e Rhoquinase (ROCK) são as mais importantes moduladoras da sensibilidade ao Ca2+ na musculatura lisa e, diversos agonistas vasoconstritores agem através dessas vias. Outra proteína quinase que também medeia o aumento da sensibilidade ao Ca2+ é a proteína quinase C (PKC). A ativação dos receptores de membrana acoplados a proteína Gq, como os receptores adrenérgicos α1, promove ativação da fosfolipase C (PLC), resultando na hidrólise do fosfatidilinositolbifosfato

(PIP2) à diacilglicerol (DAG) e inositol1,4,5- trifosfato (IP3). O DAG ativa a proteína 2+ quinase C (PKC), enquanto o IP3 provoca a liberação de Ca do RS, levando a contração da musculatura lisa (OGUT e BROZOVICH, 2003; ORALLO, 1996). Por fim, a camada íntima está diretamente em contato com o sangue e é composta por uma única camada de células endoteliais (GUYTON e HALL, 2011). O endotélio constitui uma barreira física entre o sangue e os tecidos, além de regular o fluxo de moléculas. Além disso, as células endoteliais metabolizam, sintetizam e 18 liberam uma variedade de substâncias que regulam o tônus vascular, a pressão arterial e o fluxo sanguíneo local, substâncias que participam da coagulação, fibrinólise e de reações inflamatórias e imunológicas, espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) envolvidas na oxidação e nitrosilação de proteínas e lipídios, e fatores de crescimento que promovem o crescimento celular (SU, 2015).

1.2.1. Fatores vasoconstritores endoteliais

As principais substâncias vasoconstritoras produzidas e liberadas pelo endotélio vascular são derivados do ácido araquidônico, endotelina (ET-1) e angiotensina II (DIAS et al., 2009).

A prostaglandina F2 (PGF2) e o tromboxano A2 (TXA2) destacam-se como substâncias vasoconstritoras derivadas do ácido araquidônico (COELHO et al., 2003). A ET-1 pode agir sobre os receptores acoplados à proteína G presentes na musculatura lisa (receptor A de endotelina) ou nas células endoteliais (receptor B de endotelina). A ativação dos receptores A causa uma potente contração da musculatura lisa, enquanto a ativação dos receptores B provoca vasodilatação (SAKURAI et al., 1992). A ação vasoconstritora da angiotensina II ocorre através da ativação dos receptores AT1, localizados no músculo liso vascular. Além disso, modula a proliferação celular através da ativação da via ERK1/2 (QIN e ZHOU, 2015).

1.2.2. Fatores vasodilatadores endoteliais

Em 1980, Furgchogott e Zawadzki descobriram um fator derivado do endotélio de extrema importância na regulação do tônus e manutenção da homeostasia vascular, sendo este um potente vasodilatador identificado posteriormente como óxido nítrico (NO). Este gás desempenha funções essenciais na regulação da pressão arterial e na prevenção contra a aterosclerose, na inibição da adesão e ativação de plaquetas e leucócitos e na inibição da proliferação das células musculares lisas. Outros importantes vasodilatadores liberados pelo endotélio são a prostaciclina (PGI2) e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (ZAGO e ZANESCO, 2006; FURGHOGOTT e VANHOUTTE, 1989).

1.2.2.1. NO

O NO é estruturalmente uma das moléculas biológicas mais simples e desempenha importantes funções no organismo por atuar nas mais diversas vias de sinalização. O NO consiste apenas de um átomo de oxigênio ligado à um nitrogênio. O seu caráter de ser um “radical livre” lhe confere propriedades específicas de reatividade química e determina sua interação com inúmeros alvos in vivo (DUDZINSK et al., 2005). O NO é sintetizado por NO sintases (NOS) a partir do aminoácido L-arginina. Atualmente são conhecidas três isoformas de NOS em mamíferos: NOS neuronal (nNOS), encontrada em sua maioria em neurônios; NOS induzível (iNOS), cuja expressão gênica é regulada por citocinas e mediadores inflamatórios; e NOS endotelial (eNOS), presente normalmente nas células endoteliais e plaquetas. Tanto a nNOS quanto a eNOS são definidas como NOS constitutivas e dependentes de Ca2+ (FÖRSTERMANN e SESSA, 2012; OLIVEIRA-PAULA et al., 2015). A ativação da eNOS envolve a ligação do complexo Ca2+/calmodulina, aliado a presença de co-fatores como a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato em sua forma reduzida (NADPH), O2 molecular, tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e flavinamononucleotídeo (FMN). A eNOS catalisa a síntese de NO em dois passos: o primeiro é a hidroxilação da L-arginina à Nw-hidroxi-L-arginina (permanece em grande parte ligada à enzima), e o segundo consiste na oxidação da Nw-hidroxi-L-arginina à L-citrulina e NO (FÖSTERMANN e SESSA, 2012). 2+ No endotélio vascular, a eNOS é ativada pelo aumento da [Ca ]i induzido por agonistas como a acetilcolina, histamina e ATP. A ligação do complexo Ca2+/calmodulina à eNOS facilita o fluxo de elétrons da NADPH e demais cofatores do domínio redutase para o domínio heme oxigenase. Em contraste, a eNOS 1177 também pode ser ativada pela fosforilação do resíduo de Ser , o que estimula o fluxo de elétrons, aumentando a sensibilidade ao Ca2+ e representando um mecanismo adicional e independente para a ativação da eNOS. O resíduo de Ser1177 nem sempre está na sua forma fosforilada nas células endoteliais, porém pode rapidamente sofrer esta ação após o estresse de cisalhamento ou ativação de receptores de estrogênio, de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou de insulina. As quinases envolvidas nesse processo variam de acordo com o estímulo. O estrogênio e o VEGF fosforilam a eNOS através da Akt; a insulina ativa a Akt e a 20 proteína quinase ativada pelo AMP (AMPK); a bradicinina ativa a quinase II dependente de calmodulina (CaMKII); e o estresse de cisalhamento provoca a fosforilação da eNOS via Akt e proteína quinase A (PKA). Além disso, este processo 2+ pode ser ou não dependente da [Ca ]i, dependendo da quinase envolvida na fosforilação da eNOS. Por exemplo, a ativação mediada pela CaMKII é dependente 2+ do aumento da [Ca ]i, enquanto a ativação mediada pela Akt não é afetada pela remoção do Ca2+ (FÖSTERMANN e SESSA, 2012; MICHEL e VANHOUTTE, 2010). Por ser um gás solúvel e ter caráter lipofílico, o NO produzido no endotélio vascular é difundido para a musculatura lisa e se liga à metade heme da guanilato ciclase solúvel (GCs), ativando a produção de GMPc. Este nucleotídeo cíclico ativa a proteína quinase G (PKG), levando a fosforilação de proteínas intracelulares, 2+ diminuição da [Ca ]i e vasodilatação. A ativação da PKG, assim como o NO + atuando diretamente, também pode provocar a abertura de canais de K , resultando em hiperpolarização da membrana plasmática, o que impede o influxo de Ca2+ a partir dos canais de cálcio tipo L (Figura 1) (ROE e REN, 2012).

Figura 1: Mecanismo da vasodilatação causada pelo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF). AA, ácido araquidônico; eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; cAMP, monofosfato cíclico de adenosina; AC, adenilatociclase; GCs, guanilatociclase; cGMP, monofosfato cíclico de guanosina;SR, retículo sarcoplasmático; L-Arg, L-arginina; ATP,adenosina trifosfato; GTP, guanosina trifosfato; PKA, proteína quinase A; PKG, proteína quinase G. (Modificado de VANHOUTTE, 2003.)

1.2.2.2. PGI2

A PGI2 também tem papel importante na vasodilatação dependente do endotélio e na supressão da adesão de células sanguíneas e plaquetas, sendo, portanto, crucial na prevenção da aterosclerose e na formação de trombos. Esta molécula promove relaxamento vascular através da ativação de receptores IP acoplados à proteína Gs presentes nas membranas da musculatura lisa vascular, tendo como resposta a ativação da adenilato ciclase com consequente aumento na concentração citosólica de adenosina 3, 5-monofosfato cíclico (AMPc), o qual ativa a quinase dependente de AMPc (PKA) (Figura 1). Esta quinase promove a redução da 2+ 2+ [Ca ]i através da inibição da liberação de Ca do RS, aumento da captação para o RS, aumento da extrusão do Ca2+ e inibição da entrada a partir do meio extracelular.

A PGI2 também pode induzir a hiperpolarização da célula muscular lisa através da ativação dos canais de K+ sensíveis a ATP (PARKINGTON, 2004).

1.2.2.3. EDHF

O EDHF promove relaxamento da musculatura lisa vascular através da ativação dos canais de K+ ativados por Ca2+ de intermediária e baixa condutância com consequente hiperpolarização da membrana celular, embora outros mecanismos ainda não conhecidos possam estar envolvidos (FÉLÉTOU, 2009). Agonistas como acetilcolina e bradicinina também podem estimular a liberação de fatores envolvidos na hiperpolarização (SU, 2015). A transmissão da hiperpolarização gerada nas células endoteliais para as células da musculatura lisa estima-se ocorrer através das junções mioendoteliais (BRYAN et al., 2005; FÉLÉTOU, 2009). A identidade química desses compostos ainda não está bem definida, porém os ácidos epoxieicosatrienóicos e moléculas como monóxido de carbono e peróxido de hidrogênio são possíveis candidatos. Ressalta-se ainda que a vasodilatação ocasionada pelos EDHF é observada sem o aumento dos níveis dos nucleotídeos cíclicos (VANHOUTTE, 2004).

1.3. Disfunção endotelial

Em condições fisiológicas há um equilíbrio preciso entre a produção e a liberação dos fatores vasoconstritores e vasodilatadores derivados do endotélio, e qualquer perturbação que possa alterar esse balanço pode levar à disfunção endotelial, contribuindo para o desenvolvimento e progressão das DCVs (SU, 2015). A atenuação dos efeitos vasodilatadores, como por exemplo, a redução da biodisponibilidade de NO, aliada ao aumento da produção dos fatores contráteis derivados do endotélio favorece a ocorrência de vasoespasmos, trombose, penetração de macrófagos, crescimento celular e reações inflamatórias que levam à aterosclerose (VANHOUTTE, 2004). Clinicamente, a disfunção endotelial é caracterizada pela redução da vasodilatação dependente do endotélio em resposta a agonistas como acetilcolina e bradicinina, ou ao estresse de cisalhamento (GILES et al., 2012; SU, 2015). A disfunção endotelial está presente tanto em fatores de risco para DCVs, como hipercolesterolemia, DM e HAS (SU et al., 2015), como na doença já estabelecida (GILES et al., 2012). 23

Alguns mecanismos são propostos para explicar a disfunção endotelial, como a diminuição da liberação e a diminuição da sensibilidade da musculatura lisa aos fatores relaxantes derivados do endotélio, a disfunção na via de transdução de sinal dos fatores relaxantes endoteliais e o aumento na produção dos fatores contrateis derivados do endotélio (CARVALHO et al., 2001). Outro mecanismo, porém, não menos relevante, é a redução da biodisponibilidade de NO devido ao estresse oxidativo, o qual tem papel significativo no desenvolvimento da aterosclerose, HAS e DM (COHEN e TONG, 2010). O estresse oxidativo é caracterizado quando o processo pró-oxidativo supera a capacidade dos mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, com consequente aumento na formação das ROS (GILES et al., 2012). Os principais agentes antioxidantes enzimáticos são a superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase. Os sistemas antioxidantes não enzimáticos podem se subdividir em endógenos (vitamina E, glutationa) e exógenos (vitamina C, carotenoides, flavonoides) (COHEN e TONG, 2010). Há diversas enzimas que podem potencializar a produção de ROS na parede vascular, como a NADPH oxidase, xantina oxidase, enzimas mitocondriais da cadeia respiratória e eNOS na sua forma desacoplada. Dessas citadas, a NADPH oxidase é - a principal fonte de ânion superóxido (O2 ) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012; RODRIGO et al., 2013). O sistema renina-angiotensina-aldosterona é o principal ativador da NADPH oxidase na HAS. A angiotensina II estimula a NADPH oxidase tanto pelo aumento da expressão de subunidades dessa enzima quanto pelo aumento da produção de ROS. O bloqueio do receptor AT1 reduz o estresse oxidativo e aumenta a capacidade antioxidante plasmática, a qual é a capacidade dos agentes antioxidantes (vitamina C, α-tocoferol) plasmáticos têm de evitar a geração de radicais OH (COHEN e TONG, 2010). Em condições de estresse oxidativo é possível observar uma exacerbação na - geração de O2 e uma depleção na geração de NO. Este processo é referido como desacoplamento da eNOS. A eNOS em sua forma desacoplada ocorre, em geral, pelo déficit do substrato L-arginina ou de cofatores como o BH4. A redução na - disponibilidade de BH4 ocasiona em um aumento na produção de O2 ao invés de NO, resultando na formação do peroxinitrito (ONOO-) (GILES et al., 2012). Adicionalmente, a S-glutationilação também leva ao desacoplamento da eNOS em 24 condições de estresse oxidativo, com prejuízo na vasodilatação dependente do endotélio (FÖSTERMANN e SESSA, 2012). O DM e a HAS levam à geração aumentada de ROS através da super regulação da NADPH oxidase mediada pela PKC. Os produtos da NADPH oxidase e - - da eNOS, O2 e NO, rapidamente formam ONOO , o qual pode oxidar o BH4 a BH3.

O BH3 por sua vez pode gerar o BH2 e, como consequência, o desacoplamento da - eNOS contribui para o estresse oxidativo através da produção de O2 ao invés de NO (Figura 2) (FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

Figura 2: Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS. Super-regulação da NADPH oxidase em diversos tipos de doença cardiovascular. PKC, proteína quinase C; SOD, superóxido dismutase; - H2O2, peróxido de hidrogênio; ONOO , peroxinitrito; BH4, tetrahidrobiopterina; BH3, trihidrobiopterina; BH2, 6,7-[8H]-H2-biopterina; NADPH, dinucleotídeo adenina nicotinamida fosfato (Modificado de FÖSTERMANN e SESSA, 2012).

1.4. Potencial farmacológico cardiovascular de produtos vegetais

Há tempos imemoriais os povos primitivos já buscavam na natureza o alívio e a cura de doenças visando a manutenção da saúde. Com o passar dos anos, aliado aos avanços do conhecimento científico e tecnológico, descobriu-se que os produtos naturais representam fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, 25 sendo, as principais, as plantas, bactérias, fungos, insetos e organismos marinhos, as principais fontes de obtenção de fármacos (BARREIRO e BOLZANI, 2009). A maior parte dos fármacos em uso na clínica é de origem natural ou foi desenvolvida por síntese química planejada a partir de seus derivados. De 1981 a 2010, 64% das novas substâncias químicas foram obtidas de origem natural e apenas 34% de origem puramente sintética, indicando assim a importância dos produtos naturais na descoberta de novos fármacos (CRAGG e NEWMAN, 2013). Entre os produtos naturais que serviram de fonte para a descoberta de fármacos utilizados para o tratamento das doenças do sistema cardiovascular pode- se destacar: digoxina, isolada da espécie vegetal Digitalis purpurea e utilizada anteriormente para o tratamento da insuficiência cardíaca; captopril, obtido do veneno de cobra Jathropus jararaca, utilizado para o tratamento da HAS; ácido acetilsalicílico, obtido a partir da salicina isolada da espécie vegetal Salix alba e utilizado principalmente como antiagregante plaquetário; e reserpina, isolada da espécie vegetal Rauwolfia serpentina e já foi usada para o tratamento da HAS (BUTLER, 2004; JUNIOR et al., 2006). Segundo KENNEDY e WIGHTMANN (2011) é notório que as plantas vivam em seus microambientes particulares extremamente ricos em substâncias químicas, favorecendo, em termos evolutivos, a seleção natural de espécies fitoquímicas, ou seja, de metabólitos secundários ou especiais, como também são conhecidos. Ao contrário dos metabólitos primários, responsáveis pelo crescimento e desenvolvimento das plantas, os metabólitos secundários desempenham uma série de funções protetoras, de defesa e podem gerenciar o relacionamento interplantas (BARREIRO e BOLZANI, 2009; TAIZ e ZEIGER, 2002). Além dos metabólitos secundários estarem associados a inúmeras funções biológicas diretamente relacionadas à sobrevivência das plantas no meio ambiente, são responsáveis também pelos efeitos terapêuticos das plantas medicinais, com grande importância para o desenvolvimento de fármacos. Entre os metabólitos com destaque para as ações no sistema cardiovascular estão as substâncias fenólicas, as quais representam um grupo heterogêneo de metabólitos secundários amplamente encontrados na dieta (CURIN e ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005). Estudos epidemiológicos indicam que uma dieta rica em vegetais e frutas, bem como o consumo consciente de bebidas como vinho 26 tinto e chás estão associados à redução do risco cardiovascular (KERTH et al., 2011). Os flavonoides são os principais constituintes desse grupo de metabólitos, representando mais de 4 mil dos 8 mil compostos fenólicos. Eles compartilham de um núcleo comum formado por 15 átomos de carbono dispostos em 3 anéis, podendo ser divididos em flavanois (catequinas e epicatequinas), flavonois (quercetina e kaempferol), antocianidinas (cianidinas), flavonas (apigenina) e flavononas (naringerina). Nos compostos não-flavonoides, no anel aromático há um ou mais grupos hidroxilas, incluindo os estilenos (resveratrol), ácidos fenólicos (ácido gálico), saponinas (ginsenosídeo), cumarinas e taninos (CURIN e ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005). Diversos são os efeitos benéficos dos polifenois nas DCVS, como atividade antioxidante, redução da hiperlipidemia, do tônus vascular e da aterosclerose, e atividade anti-inflamatória (STOCLET et al., 2004). Os efeitos antioxidantes dos polifenois podem ser resultantes de diferentes mecanismos. Essas moléculas podem sequestrar diretamente ROS, como também podem inibir enzimas geradoras de ROS, como xantina oxidase e NADPH oxidase (VÁZQUEZ et al., 2013). Compostos polifenólicos do vinho tinto induzem o relaxamento vascular de forma dependente do endotélio por distintos mecanismos, como regulação da expressão da eNOS, regulação da atividade da eNOS pela fosforilação dessa enzima na Ser1177, regulação da atividade e expressão da GCs (STOCLET et al., 2004; VÁZQUEZ et al., 2013). Os compostos polifenólicos do vinho tinto protegem contra a oxidação do LDL em células endoteliais, promovem efeito antioxidante, antiagregante plaquetário, tendo papel contra a aterosclerose. Além disso, polifenois encontrados na toranja reduzem a susceptibilidade de oxidação do LDL em pacientes com doença coronariana (OU et al., 2005; CURIN e ANDRIANTSIOOHAIANA, 2005; KHALIL e SULAIMAN, 2010; MIDDLETON et al., 2000).

1.5. Kielmeyera membranacea

A espécie selecionada para este trabalho foi a Kielmeyera membranacea, pertencente à ordem Malpighiales, família Calophyllaceae, gênero Kielmeyera. Esta ordem é uma das maiores e mais diversas do clado das rosídeas e inclui o grupo 27 dos clusioides, representado pelas famílias Clusiaceae, Calophyllaceae, Bonnetiaceae, Hypericaceae e Podostemaceae (RUHFEL et al., 2011). Os gêneros da família Calophyllaceae são de ampla distribuição sendo frequentemente encontrados nas América Latina e Central, além da África Central e Ásia. Já foram identificados 14 gêneros e aproximadamente 476 espécies pertencentes a essa família no mundo. No Brasil já foram catalogados 8 gêneros – Calophyllum L., Caraipa Aubl., Clusiella Planch & Triana, Haploclathra Benth., Kielmeyera Mart. & Zucc., MahureaAubl., Marila Sw. e Neotatea Maguire – e 81 espécies, sendo 59 endêmicas, inclusive a K. membranacea (MOBOT, 2014; WURDACK - DAVIS, 2009; REFLORA, 2014). Entre as atividades biológicas já estudadas para espécies da família Calophyllaceae encontradas no Brasil citam-se o tratamento de lesões cutâneas provocadas por leishmaniose (Calophyllum brasiliense) (LEMOS et al., 2012), antibiótica (Kielmeyera variabilis) (TIUMAN et al., 2012) e anti-inflamatória (Haploclathra paniculata) (SUFFREDINI et al., 2006). Já foram descritas atividades protetoras contra a disfunção endotelial de espécies não encontradas no Brasil, como Mammea neurophyllae e Calophyllum flavoramulum, pelo mecanismo de inibição da formação dos produtos finais da glicação avançada (DANG et al., 2014; FERCHICHI et al., 2012). O gênero Kielmeyera é endêmico da América do Sul, sendo a maior parte das 47 espécies descritas na literatura encontradas exclusivamente no Brasil. Espécies desse gênero são amplamente encontradas em todas as regiões do país, principalmente na região sudeste e em diversos domínios fitogeográficos, como na floresta Amazônica, em cerrados, caatingas e Mata Atlântica (restinga) (SADDI, 1982; REFLORA, 2014). Na medicina popular, muitas espécies do gênero Kielmeyera são utilizadas no tratamento de diversas doenças tropicais, como malária, esquistossomose, leishmaniose e infecções fúngicas e bacterianas. Cita-se também que algumas espécies desse gênero já foram estudadas quanto à sua atividade biológica, destacando-se as espécies K. coriacea, K. variabilis, K. aureovinosa, K. neglata e K. rugosa (ZAGOTO et al., 2006). A espécie K. coriacea é relatada por ter um potencial efeito antidepressivo, visto que o extrato hidroalcoólico do caule inibe a recaptação de serotonina, noradrenalina e dopamina (OBICI et al., 2008). Estudos sugerem que a fração em 28 diclorometano do caule de K. coriacea pode ser uma importante alternativa terapêutica no tratamento do transtorno da ansiedade e do pânico (BIESDORF et al., 2012). O extrato etanólico e a fração ciclohexânica desta espécie obtidos a partir da casca, também apresentaram atividades antioxidante e antifúngica contra T. rubrum (AQUINO et al., 2013; SILVA et al., 2009). Segundo FIGUEIREDO e colaboladores (2014), constituintes das folhas da espécie vegetal K. coriacea apresentaram atividade antitumoral. O fracionamento cromatográfico das frações mais potentes obtidas das folhas da espécie K. variabilis conduziu à identificação de 3 flavonoides com atividade antioxidante (COQUEIRO et al., 2013). Os extratos das folhas das espécies K. aureovinosae e K. neglecta (extrato etanólico e fração em acetato de etila) apresentaram atividade antibiótica e citotóxica, respectivamente (CARVALHO et al., 2012; SOUZA et al., 2012), e a fração diclorometânica obtida do caule da K. rugosa demonstrou atividade antitumoral sem substancial toxidez (OLIVEIRA et al., 2013). MELO e colaboradores (2014) demonstraram atividades anti-hiperalgésicas e anti- inflamatórias a partir do extrato metanólico do caule da K. rugosa. As espécies do gênero Kielmeyera também têm sido estudadas quanto à sua composição química, marcada caracteristicamente pela presença de xantonas e cumarinas, além de antraquinonas, terpenos, esteroides e flavonoides glicosídicos (COQUEIRO et al., 2016; MARTINS et al., 2015; NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL et al., 2009). Algumas substâncias já foram isoladas como por exemplo, 4-alquilcumarinas, 4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas, sendo estas duas últimas extraídas de folhas de K. rugosa. A composição química das espécies do gênero Kielmeyera também varia de acordo com o ambiente em que se localiza, onde em espécies encontradas no cerrado a classe das xantonas predomina e, por outro lado, em espécies de restinga predominam a 4-fenilcumarinas e 4-n-propilcumarinas (NOGUEIRA et al., 2009; SOBRAL et al., 2009). As xantonas apresentam efeitos benéficos em algumas DCVs, incluindo isquemia, aterosclerose, HAS e trombose. Atividades antioxidante, anti-inflamatória, antitrombótica e vasodilatadora são consideradas efeitos protetores provocados por essas substancias contra as DCVs. Ressalta-se, em particular, que o antagonismo dos inibidores endógenos da NOS provocado pelas xantonas pode representar a base para a melhoria da função endotelial (DE-JIAN et al., 2004). 29

Já foram descritas também atividades farmacológicas das cumarinas, com ações antioxidante, antiplaquetária, anti-inflamatória e hipotensiva (FARZEI et al., 2013; SONG et al., 2014). Estudos demonstraram potente atividade inibitória da formação de produtos finais de glicação avançada pelas 4-fenil e 4-(1-acetoxipropil) cumarinas. Ressalta-se ainda que uma série de potentes inibidores da enzima colesterol acetiltransferase, potentes agentes terapêuticos para o tratamento da aterosclerose, tem em sua base a 4-fenilcumarina (OGINO et al., 2011). A espécie vegetal K. membranacea, objeto deste estudo, é endêmica do Brasil, sendo encontrada nos estados de Minas Gerais, Bahia, Espírito Santo e Rio de Janeiro, sendo seu domínio fitogeográfico a Mata Atlântica, em especial a restinga (REFLORA, 2013). Apesar de não haver descrição de uso popular ou atividade farmacológica no sistema no cardiovascular, uma triagem do efeito vasodilatador de extratos vegetais realizado no Laboratório Integrado de Pesquisa do Campus UFRJ-Macaé mostrou que a K. membranacea e suas frações apresentam potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014), despertando o interesse para o estudo mais aprofundado de suas propriedades farmacológicas.

2. JUSTIFICATIVA

As DCVs são uma das principais causas de morte no Brasil e no mundo e são caracterizadas por alterações funcionais e morfológicas (WHO, 2016). Visto todo prejuízo que essas doenças causam, é de extrema importância a pesquisa e descoberta de novas substâncias que possam atenuar e/ou prevenir o seu desenvolvimento. Os produtos naturais são uma importante fonte de descoberta de novas substâncias com atividades biológicas e farmacológicas, inclusive com ações no tratamento das DCVs (CRAGG e NEWMAN, 2013). Até o presente momento não há relatos na literatura sobre o uso popular bem como atividade biológica ou farmacológica da espécie vegetal Kielmeyera membranacea no que diz respeito ao sistema cardiovascular. Uma triagem do efeito vasodilatador de extratos vegetais realizada no Laboratório Integrado de Pesquisa do Campus UFRJ-Macaé mostrou que o extrato hidroalcoólico das folhas de K. membranacea apresenta uma potente atividade vasodilatadora (PAES, 2014), despertando assim o interesse para o aprofundamento do conhecimento de suas propriedades farmacológicas.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivos gerais: Identificar subastâncias bioativas obtidas da espécie vegetal K. membranacea com potencial farmacológico em alterações vasculares.

3.2. Objetivos específicos:  Investigar o efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações das folhas de K. membranacea;  Investigar o mecanismo de ação do efeito vasodilatador do extrato bruto;  Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina;  Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por alta concentração de glicose;  Avaliar os efeitos do extrato bruto na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório Integrado de Pesquisa, Pólo Universitário do Campus UFRJ-Macaé Professor Aloísio Teixeira. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética com Animais de Experimentação do Campus UFRJ-Macaé, sob protocolo MAC019. Foram utilizados ratos Wistar machos (200-280 g), os quais foram mantidos em biotério com temperatura e umidade controladas, em um ciclo de 12h/12h claro/escuro, com água e ração disponibilizadas sem restrição.

4.1. Material vegetal

Folhas da espécie Kielmeyera membranacea foram coletadas no PARNA de Jurubatiba no município de Carapebus – RJ (22°16´S/41°39´W). A coleta e a identificação botânica foram realizadas pela Profª. Drª. Tatiana Ungaretti Paleo Konno e, uma exsicata foi depositada no Herbário do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ (RFA38752).

4.2. Obtenção do extrato hidroalcoólico, frações e subfrações

Todos os extratos, frações e subfrações utilizados nos experimentos foram cedidos pelo Laboratório de Produtos Bioativos do Campus UFRJ-Macaé. Os resultados farmacológicos guiaram a análise fitoquímica da K. membranacea. Após a seleção do material, este foi seco em estufa com circulação de ar com temperatura ajustada para 40 °C. A secagem foi considerada completa quando o peso da amostra se tornou constante. As folhas de K. membranacea foram trituradas em moinho de facas. Para o processo de maceração foi utilizado 50,35 g de folhas de K. membranacea, previamente secas e pulverizadas, utilizando-se etanol:água (7:3) como sistema de solvente extrator, em temperatura ambiente. O extrato hidroalcoólico foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (IKA®) sob pressão reduzida resultando no extrato bruto. As frações do extrato bruto foram obtidas através de partição líquido-líquido utilizando solventes com polaridade crescente: hexano PA (Hex), diclorometano PA (CH2Cl2), acetato de etila PA (AcOEt) e butanol 33

PA (BuOH). Foram utilizados 6,19 g do EKM ressuspendido em 100 ml de metanol–

água (MeOH:H2O) 9:1. Será feito um fracionamento da fração com maior potência e perfil vasodilatador. Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais promissora para o prosseguimento do estudo. Esta foi submetida à fracionamento cromatográfico em coluna de vidro, tendo como fase estacionária 17 cm de sílica-gel 60 silanizada de fase reversa (tamanho 0,063-0,200 mm). Para o fracionamento, uma massa de 0,888 g da Fr. BuOH foi solubilizada em água destilada e aplicada na coluna. O gradiente de eluição utilizado foi iniciado com 100% de água destilada e finalizado com 100% de metanol e a proporção de solventes seguiu conforme apresentado na Tabela 1. As subfrações foram recolhidas em frascos de vidro e reunidas por gradiente totalizando 5 subfrações.

Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica Subfração Gradiente de Volume Rendimento eluição (ml) (g) 1 100% H2O 200 0,353

2 70% H2O e 30% 200 0,278 MeOH 3 50% H2O e 50% 400 0,1031 MeOH

4 30% H2O e 70% 600 0,0713 MeOH 5 100% MeOH 1000 0,0138

4.3. Preparo dos anéis de aorta para registro de tensão isométrica

Ratos Wistar machos foram eutanasiados para retirada da porção torácica da aorta, a qual foi transferida imediatamente para uma cuba contendo solução de

Krebs-Henseilet (em mM: NaCl 118; KCl 4,7; KH2PO41,2; MgSO4 1,2; CaCl2 2,5;

NaHCO3 25; glicose 11; pH 7,4) para remoção do tecido conjuntivo adjacente. A aorta então foi cortada em cilindros de aproximadamente 3 mm de comprimento, que foram posicionados em cubas verticais de 10 mL preenchidas com a mesma solução de Krebs-Henseilet, continuamente oxigenada com mistura carbogênica composta

(95% de O2 e 5% de CO2), à uma temperatura constante de 37 °C. Uma das 34 extremidades do tecido era conectada a um transdutor de tensão isométrica (MLT0201; ADInstruments), e os sinais gerados eram digitalizados (Power Lab 4/30; ADInstruments) e armazenados em computador para posterior análise através do programa LabChart Pro (ADInstruments). Durante o período de estabilização da preparação, 90 minutos, a solução nutridora era substituída nos tempos de 20, 40 e 60 minutos. Após o período de equilíbrio, a integridade do endotélio vascular era verificada através da indução da contratura do músculo liso vascular com 10 µM de fenilefrina, seguida da adição de 10 µM de acetilcolina. O endotélio foi considerado íntegro quando o relaxamento em resposta à acetilcolina foi igual ou superior a 80%. Em alguns experimentos foi realizada a remoção mecânica do endotélio utilizando- se uma cânula, sendo confirmada pela ausência de relaxamento (ou inferior 10%) frente à acetilcolina (Figura 3).

1 g

5 min

Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM

2 g

5 min

Fenilefrina 10 µM Acetilcolina 10 µM

Figura 3: Registros representativos do teste para avaliação da integridade do endotélio. Em A, aorta com endotélio e em B, aorta sem endotélio.

4.4. Avaliação do efeito vasodilatador do EKM, frações e subfrações

O EKM e suas frações foram solubilizados em DMSO, em soluções estoques de 10 e 50 mg/mL. Em estudo controle realizado no Laboratório Integrado de 35

Pesquisa, foi possível observar que este solvente não alterou a atividade vascular na concentração máxima utilizada (0,65%). Após o período de equilíbrio da preparação, a contratura do músculo liso vascular foi induzida com 10 µM de fenilefrina e, estabelecido o platô, foram adicionadas concentrações crescentes cumulativas do extrato, frações ou subfrações (1 a 30 µg/mL).

4.5. Estudo do mecanismo de ação do efeito vasodilatador do EKM

Para determinar o mecanismo vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis de aorta com e sem endotélio. A investigação do mecanismo de ação do extrato seguiu-se em anéis aórticos com endotélio através do pré-tratamento dos mesmos por 15 minutos (antes da indução da contratura com fenilefrina) com diferentes inibidores ou antagonistas: L-NG-Nitroarginina metil éster(L-NAME; 100 µM), inibidor da NO sintase; 1H-[1,2,4]oxadiazol [4,3-a] quinoxalino-1-um (ODQ; 10 µM), inibidor da GCs; wortmannin (0,3 µM), inibidor da PI3K; atropina (10 µM), antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos; fulvestrant (10 µM), antagonista seletivo dos receptores de estrogênio ERα; indometacina (10 µM), inibidor da enzima ciclooxigenase; HOE 140 (10 µM), inibidor dos receptores de bradicinina B2 (RAIMUNDO et al., 2009; PONTES et al., 2012).

4.6. Efeitos do EKM na reatividade vascular

Curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas em aortas com endotélio na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). A concentração do EKM utilizada foi definida por ser um pouco maio do que a sua CI50. A curva concentração-resposta para fenilefrina também foi realizada em anéis de aorta sem endotélio e em anéis com endotélio pré-tratados com L-NAME (100 µM) (RATTMANN et al., 2012).

4.7. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por alta concentração de glicose

Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 2 horas com solução Krebs-Henseilet contendo 25 mM de glicose. Após este período, curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL) (DHAR et al., 2010).

4.8. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo

Anéis de aorta com endotélio foram incubados por 15 min com 10 µM de pirogalol. Após este período, curvas concentração-resposta para fenilefrina (10-9 – 10-5 M) e para acetilcolina (10-9 – 10-5 M) foram obtidas na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL) (YEAH-SIANG et al., 2011).

4.9. Análise estatística

Todos os resultados foram apresentados como média ± E.P.M. Os resultados de relaxamento vascular foram expressos como percentual de relaxamento da contratura máxima induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Prism 5.0 (GraphPad Software, USA). A concentração inibitória média (CI50) do EKM e frações, e a concentração eficaz média (CE50) da fenilefrina e da acetilcolina, foram calculadas através de regressão não linear. Para múltiplas comparações foi utilizado o teste análise de variância (One-way - ANOVA) seguido do pós teste Dunnett ou Newman-Keuls. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando P< 0,05.

5. RESULTADOS

5.1. Efeito vasodilatador do EKM

Para a avaliação do efeito vasodilatador do EKM, foram utilizados anéis de aorta com endotélio preparados para registro de tensão isométrica. A contração do músculo liso vascular foi induzida através da adição de 10 µM de fenilefrina e, após a observação do platô de contração, foram adicionadas concentrações cumulativas do EKM (Figura 4). O EKM provocou relaxamento da musculatura lisa vascular de forma dependente da concentração, sendo de 88,3 ± 3,8 % na concentração de 30 µg/mL (P<0,05; Figura 5). A concentração necessária para reduzir a contratura induzida por fenilefrina em 50% (CI50) foi de 3,2 ± 0,1 µg/mL. Para avaliar a importância da participação dos fatores endoteliais no relaxamento provocado pelo EKM, foram realizados experimentos com anéis de aorta sem endotélio. A remoção do endotélio inibiu completamente a atividade vasodilatadora do EKM, como mostrado na figura 5.

Figura 4: Registro típico da resposta contrátil a 10 μM de fenilefrina seguido da exposição a concentrações crescentes e cumulativas do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em um anel aorta com endotélio.

Com endotélio 100 Sem endotélio

% Relaxamento 20

0 * * *

1 10 100 EKM (g/mL)

Figura 5: Efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) em anéis de aorta com (n= 12) e sem endotélio (n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

Sabendo que o efeito vasodilatador provocado pelo EKM é totalmente dependente do endotélio e o principal fator vasodilatador produzido e liberado pelo endotélio é o NO, foram realizados experimentos para investigar a participação da via do NO/GMPc no seu efeito vasodilatador. O relaxamento provocado pelo EKM foi completamente inibido após o pré-tratamento com L-NAME, inibidor da NOS, e com ODQ, inibidor da GCs, confirmado a participação da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do extrato (Figura 6).

A B

Com endotélio Com endotélio 100 + L- NAME 100 M 100 + ODQ 10 M

80 80

60 60

40 40 % Relaxamento 20 % Relaxamento 20 * * * 0 0 * * *

1 10 100 1 10 100 EKM (g/mL) EKM (g/mL)

Figura 6: Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM em aortas com endotélio na ausência (n= 12) e presença de L-NAME (A; n= 6) ou ODQ (B; n= 6). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

A fim de identificar como o EKM ativa a produção endotelial de NO, foram utilizados antagonistas dos receptores muscarínicos e de bradicinina: atropina e HOE140, respectivamente. Na presença de atropina não houve alteração significativa na curva concentração-resposta do EKM (Figura 7A). Porém, ao pré- tratar os anéis aórticos com HOE140, houve um efeito inibitório significativo da vasodilatação provocada pelo EKM na concentração de 30 µg/mL, indicando que os receptores de bradicinina B2 estão envolvidos no efeito do EKM (Figura 7B).

A B

Com endotélio Com endotélio + HOE 140 100 + Atropina 100

80 80 * 60 60

40 40 % Relaxamento % Relaxamento 20 20

0 0

1 10 100 1 10 100 EKM (g/mL) EKM (g/mL)

Figura 7: Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM, em aortas com endotélio, na ausência (n= 12) e presença de atropina (A; n= 6) ou HOE140 (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado a com endotélio.

Com o intuito de avaliar a participação da via PI3K/Akt na ativação da eNOS foi utilizado o bloqueador wortmaninn, inibidor da PI3K, o qual inibiu completamente o relaxamento provocado pelo EKM (Figura 8). Em seguida, foi avaliada a participação dos receptores de estrogênio no efeito do EKM, já que estes receptores provocam a ativação da eNOS através da via PI3K/Akt. Na presença de fulvestrant, o relaxamento provocado pelo EKM foi significativamente reduzido (Figura 8B), sugerindo a participação desses receptores no mecanismo de ação do EKM.

A B

Com endotélio Com endotélio 100 + Fulvestrant 100 + Wortmannin 80 80 * 60 60

40 40 % Relaxamento

20 Relaxamento % 20 * * 0 * 0

1 10 100 1 10 100 EKM (g/mL) EKM (g/mL)

Figura 8: Envolvimento da via PI3K/Akt e dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM). Curvas concentração-resposta para EKM na ausência (n=12) e presença de wortmannin (A; n= 5) ou fulvestrant (B; n= 8). Os dados representam a média ± E.P.M.. *P<0,05 comparado ao controle.

5.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina

Para avaliar os efeitos do EKM na reatividade vascular, foram realizadas curvas concentração-resposta para fenilefrina e para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença do EKM. O pré tratamento com o EKM (3,5 µg/mL) reduziu a contração induzida pela fenilefrina em até 58,83% na concentração de 10 µM (Figura 9A), com alteração da pCE50 de 7,1 ± 0,1 para 6,2 ± 0,1 (P< 0,05). Como o efeito vasodiltador do extrato é dependente do endotélio e da liberação de NO, conforme mostrado anteriormente, o mesmo experimento foi realizado em aortas sem endotélio. Como apresentado na figura 9B, o EKM não provocou qualquer alteração significativa da curva concentração-resposta para fenilefrina em aortas sem endotélio (pCE50 7,5 ± 0,1 e 7,4 ± 0,1), indicando que o efeito do extrato em atenuar a vasoconstrição induzida pela fenilefrina é dependente do endotélio. Resultados semelhantes foram obtidos em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (Figura 9C), indicando que o EKM reduz a contração induzida pela fenilefrina através da ativação da produção de NO

(pCE50 7,7 ± 0,2 e 7,7 ± 0,1).

2.0 Com endotélio A + EKM 3,5 g/mL

1.5

1.0

* * 0.5 *

Contração (g) Contração * * 0.0 *

-9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Fenilefrina], M

B 2.0 Sem endotélio + EKM 3,5 g/mL 1.5

1.0

0.5

Contração (g)Contração

0.0

-9 -8 -7 -6 -5 -4

Log [Fenilefrina], M

BCom endotélio + L-NAME C 2.0 + EKM 3,5 g/mL

1.5

1.0

0.5

(g)Contração

0.0

-9 -8 -7 -6 -5 -4

Log [Fenilefrina], M C Figura 9: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à fenilefrina. Em A e B, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com e sem endotélio, respectivamente. Em C, curvas concentração-resposta para fenilefrina na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL), em aortas com endotélio pré-tradas com L-NAME (100 µM). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado a com endotélio.

Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um deslocamento para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina com alteração da pCE50 de 7,3 ± 0,1 para 7,9 ± 0,3 (P> 0,05), sem alterar o relaxamento máximo (Figura 10).

120 Controle + EKM 3,5 g/mL 100

80 * 60 * 40 *

% Relaxamento 20

0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Acetilcolina], M

Figura 10: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular à acetilcolina. Curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 7-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

5.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por glicose

A incubação das aortas com 25 mM de glicose por 2 horas resultou em aumento da contração máxima induzida por fenilefrina de 1,5 ± 0,1 g para 2,2 ± 0,2 g

(P< 0,05) e pCE50 de 6,6 ± 0,1 (Figura 11 A). O relaxamento máximo provocado pela acetilcolina foi reduzido de 98,4 ± 0,4 % para 25,9 ± 4,5 % (P< 0,05), com pCE50 de 3,3 ± 0,7 (Figura 11 B). Na presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada e a vasodilatação em resposta à acetilcolina (10 µM) foi parcialmente restaurada para 75,5 ± 2,9 %, com pCE50 de 6,3 ± 0,1 (P< 0,05; Figura 11 A e B).

A Controle + 25 mM glicose

+ 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM 2.5 * * * 2.0

1.5

1.0

(g)Contração 0.5

0.0

-9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Fenilefrina], M

B Controle + 25 mM glicose 120 + 25 mM glicose + 3,5 g/mL EKM

100

80 # # #

60 #

40 * * * * * % Relaxamento * 20 * 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4

Log [Acetilcolina], M

Figura 11: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por glicose. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração- resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de glicose 25 mM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle; #P<0,05 comparado a + 25 mM glicose.

5.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo

O pré-tratamento com pirogalol provocou um deslocamento para esquerda da curva concentração-resposta da fenilefrina, com aumento da contração máxima de

1,5 ± 0,1 g para 1,9 ± 0,1 g e alteração da pCE50 para 7,6 ± 0,1 (Figura 12 A). Na presença de 3,5 µg/mL de EKM, a reatividade à fenilefrina foi normalizada (Figura 12 A). O relaxamento vascular induzido pela acetilcolina foi significativamente reduzido com o pré-tratamento com pirogalol de 98,4 ± 0,4 % para 23,6 ± 0,4 %, e alteração da pCE50 para 3,5 ± 0,1. O pré-tratamento com EKM (3,5 µg/mL) não foi capaz de restaurar a disfunção endotelial provocada pelo pirogalol (Figura 12 B).

A Controle 2.5 + Pirogalol + EKM 3,5 g/mL * 2.0 * * * 1.5 * * 1.0 B * % Contração 0.5

0.0

-9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Fenilefrina], M

B Controle 120 + Pirogalol 100 + EKM 3,5 ug/mL 80 60 40 ** ** * * * 20 * * * 0 * % Relaxamento * * * -20 -40 -9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Acetilcolina], M

Figura 12: Efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo. Em A, curvas concentração-resposta para fenilefrina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Em B, curvas concentração-resposta para acetilcolina em aortas com endotélio na ausência e presença de pirogalol 10 µM, e na ausência e presença de EKM (3,5 µg/mL). Os dados representam a média ± E.P.M. de 6-21 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

5.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular

As frações do EKM foram testadas com a finalidade de sugerir as possíveis classes de metabólitos secundários responsáveis pela atividade vasodilatadora do extrato, além de direcionar as etapas posteriores de fracionamento. A partição líquido-líquido do extrato bruto originou quatro frações (hexânica, em diclorometano, em acetato de etila e butanólica) que foram testadas em aortas com endotélio. A fração hexânica (Fr. Hex) não alterou significativamente o tônus vascular. A fração em diclorometano (Fr. CH2Cl2) provocou um intenso e significativo relaxamento de 77,7 ± 0,9 % na concentração de 100 µg/mL. De forma semelhante, a fração em acetato de etila (Fr. AcOEt) provocou intenso relaxamento dos anéis aórticos a partir da concentração de 10 μg/mL. Com 30 μg/mL foi observado relaxamento de 79,1 ± 5,0 %. A fração butanólica (Fr. BuOH) também provocou relaxamento vascular, sendo este significativo a partir da concentração de 3 μg/mL. Na concentração de 30 μg/mL, foi observado relaxamento de até 85,2 ± 1,3 % (Figura 13).

A B

100 100

80 * 80

60 60

40 40

20 % Relaxamento % Relaxamento 20 * 0 0 * *

1 10 100 1 10 100

Fr hex (g/ml) Fr. CH2Cl2 (g/mL)

C D 100 100

* * * 80 80 * * * 60 60

40 40

% Relaxamento % Relaxamento 20 20

0 0

1 10 100 1 10 100 Fr. AcOEt (g/mL) Fr BuOH (g/ml)

Figura 13: Efeito vasodilatador das frações hexânica (FrHex), em diclorometano (Fr CH2Cl2), em acetato de etila (Fr AcOEt) e butanólica (Fr BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B, C e D, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5-7 experimentos. *P<0,05 comparado com controle.

A tabela 2 mostra as CI50 do extrato bruto e suas frações, onde observa-se que as frações em diclorometano e em acetato de etila foram menos potentes que o extrato, enquanto a fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também mais potente que o extrato. Sendo assim, a fração butanólica foi selecionada para os demais experimentos, com o objetivo identificar as prováveis substâncias responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM.

Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM) e frações Amostra CI50 (µg/mL) EKM 3,2 ± 0,5* Fr. Hex -

Fr. CH2Cl2 67,3 ± 0,7* Fr. AcOEt 11,3 ± 2,3* Fr. BuOH 1,7 ± 0,4 *P<0,05, comparado a Fr BuOH

Considerando os resultados obtidos para as frações nos ensaios de atividade vasodilatadora, a fração butanólica (Fr. BuOH) foi selecionada como a mais promissora para o prosseguimento do estudo. O fracionamento da fração butanólica resultou na obtenção de 5 subfrações, sendo que 3 delas foram avaliadas. As subfrações 3 e 5 não foram testadas por dificuldades de solubilização. Na concentração de 30 µg/mL, as subfrações 1, 2 e 4 provocaram relaxamento de 85,6 ± 0,7 %, 98,2 ± 1,8 % e 36,5 ± 6,0 %, respectivamente (Figura 14).

A B

Fr. BuOH Fr. BuOH Subfr. 2 100 Subfr. 1 100

80 80

60 60

40 40

% Relaxamento % 20 % Relaxamento 20

0 0

1 10 100 1 10 100 g/mL g/mL

Fr. BuOH 100 Subfr. 4

40 *

Relaxamento % 20 * 0 *

1 10 100 g/mL Figura 14: Efeito vasodilatador das subfrações (Subfr.) 1, 2 e 4 da fração butanólica (Fr. BuOH) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio em A, B e C, respectivamente. Os dados representam a média ± E.P.M. de 2-6 experimentos. *P<0,05 comparado ao controle.

As CI50 das subfrações foram obtidas e foi possível observar a equivalência de potências entre a Fr BuOH e a subfração 2 (Tabela 3).

Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de folhas de K. membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas subfrações.

Amostra CI50 (µg/mL) EKM 3,2 ± 0,5* Fr. BuOH 1,7 ±0,4 Subfraçao 1 6,3 ± 1,7* Subfração 2 1,9 ± 0,3 Subfração 4 - *P<0,05, comparado a Subfração 2

A análise por métodos espectrométricos da subfração 2 da fração butanólica resultou na obtenção e identificação de 4 constituintes majoritários, a orientina, isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona A, todos eles pertencendo a classe dos flavonoides (Tabela 4; Anexo 1).

Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração butanólica de K. membranacea

Subfração Constituintes Majoritários 1 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, luteolina-O-glicuronídeob, metoxi luteolina-C-glicuronídeoc 2 isoorientinaa, orientinaa, isovitexinaa, podocarpusflavona Ab 3 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab 4 amentoflavonab, podocarpusflavona Ab 5 podocarpusflavona Ab aProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms e pelo espectro ms2 do ion molecular. bProposta estrutural com base no espectro de massas modo full ms. cflavonoide não identificado completamente.

6. DISCUSSÂO

A disfunção endotelial está envolvida tanto no desenvolvimento como na progressão das DCVs (GILES et al., 2012; SU et al., 2015). Baseado nessas evidências, a descoberta de novos produtos bioativos que possam atenuar e/ou prevenir as alterações vasculares relacionadas às DCVs torna-se de extrema importância. Neste trabalho foram investigados os efeitos vasculares de produtos bioativos obtidos da espécie K. membranacea, uma espécie endêmica no Brasil.

6.1. Efeito vasodilatador do EKM

Diversos estudos relatam a atividade vasodilatadora provocada por produtos naturais, incluindo diversas espécies vegetais, podendo ser este efeito, dependente ou não de fatores derivados do endotélio vascular. O efeito vasodilatador provocado pelo EKM é dependente da liberação dos fatores vasodilatadores endoteliais, tendo em vista que a resposta vasodilatadora foi observada em anéis de aorta com endotélio e inexistente em anéis de aorta sem endotélio. Em experimentos realizados com L-NAME e ODQ (inibidores da eNOS e GCs, respectivamente), o efeito do EKM foi completamente inibido, indicando que a ação vasodilatadora se deve a liberação de NO, principal fator vasodilatador liberado pelo endotélio. A maior parte dos produtos bioativos vegetais com atividade vasodilatadora dependente do endotélio exerce seu efeito vasorelaxante através da via NO/GMPc (LUNA-VÁZQUEZ et al., 2013; McNEILL e JURGENS, 2006). Assim como o EKM, a brasilina, um homoisoflavonoide obtido da Caesalpina sappan, induz a ativação da eNOS, sendo seu efeito inibido com o pré tratamento com L-NAME (HU et al., 2003). PARK e colaboradores (2015) mostraram o efeito vasodilatador dependente do endotélio provocado pelo extrato etanólico de Camellia japonica, com aumento da concentração de GMPc em aortas intactas e redução do efeito e da concentração de GMPc em aortas onde a eNOS foi inibida. Resultados semelhantes foram obtidos para o extrato das folhas de Apocynum venetum (LAU et al., 2015). O NO promove vasodilatação através da ativação da GCs, que por sua vez aumenta os níveis de GMPc com posterior ativação da PKG, proteína responsável 2+ + pela diminuição da [Ca ]i, além de poder também ativar os canais de K , o que gera 53 hiperpolarização da membrana celular levando a vasodilatação (VANHOUTTE, 2001; CARVALHO et al., 2001). 2+ A ativação da eNOS ocorre principalmente devido ao aumento da [Ca ]i e ligação do complexo Ca2+/calmodulina à enzima, como ocorre após a ativação de receptores muscarínicos, de bradicinina e de histamina. No entanto, a fosforilação da eNOS em determinados resíduos de aminoácidos também pode levar a ativação da enzima, como devido à ativação de receptores de insulina e de estrogênio (FÖSTERMANN e SESSA, 2012). Com o intuito de identificar os receptores envolvidos na ativação da produção endotelial de NO, anéis de aorta com endotélios foram pré-tratados com antagonistas de diversos receptores endoteliais. Na presença da atropina não houve alteração significativa na curva concentração-resposta do EKM, sugerindo assim a ausência da participação dos receptores M3 para o efeito vasodilatador do extrato. Por outro lado, ao pré-tratar os anéis aórticos com HOE140, houve uma pequena inibição da vasodilatação provocada pelo EKM, sugerindo um envolvimento parcial dos receptores de bradicinina B2 no mecanismo de ação do EKM. A bradicinina é um dos agonistas da eNOS melhores caracterizados e os receptores B2 são amplamente distribuídos no endotélio vascular de mamíferos (DUDZINSKI et al., 2006). Estes receptores são acoplados a proteína Gq e medeiam a ativação da 2+ eNOS principalmente através do aumento da [Ca ]i, porém também podem induzir a fosforilação da eNOS no resíduo Ser1177 mediada pela CAMKII (FÖSTERMANN e SESSA, 2012). Na presença de wortmannin, o efeito do EKM foi completamente inibido, indicando que a via PI3K/Akt tem um papel crucial na ativação da eNOS provocada pelo extrato. A via PI3K/Akt é uma importante via de sinalização envolvida no controle do tônus vascular que tem sido proposta para a ação de substâncias oriundas de produtos naturais (LUNA-VÁSQUEZ et al., 2003; LAU et al., 2015). Como exemplo, o efeito vasodilatador provovado pela epigalocatequina-3-galato, a catequina mais abundante encontrada em Camellia sinensis, foi significativamente reduzido quando utilizado o bloqueador wortmannin, sugerindo assim que esta substância ativa a via NO/GMPc pela indução da fosforilação da eNOS (ROMANO e LOGRANO, 2009). Há um papel especial dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador de substâncias fenólicas, onde a ativação desses receptores leva a produção de NO 54 através da via PI3K/Akt (TANG et al., 2015). O tratamento das células endoteliais com concentrações nanomolares de resveratrol leva a uma rápida fosforilação do resíduo Ser1177, aumentando a atividade enzimática da eNOS e, este efeito é observado nas células endoteliais humanas através da ativação do receptor ERα (LI e FÖSTERMANN, 2009). Em adição, a delfinidina, um polifenol encontrado no vinho tinto, e a isoflavona, são também substâncias que ativam o receptor ERα e promovem o aumento da expressão e da atividade da eNOS (CHAPOLIN et al., 2010; RÄTHEL et al., 2009). O receptor ERα também está envolvido na atividade vasodilatadora do EKM, uma vez que na presença de fulvestrant o efeito do extrato foi significativamente inibido. Desta forma, até o momento é possível dizer que o efeito vasodilatador do

EKM é mediado pela ativação de receptores B2 e de receptores ERα. No entanto, como o wortimannin inibiu completamente o efeito do EKM, pode ser que outro receptor que ative a via PI3K/Akt esteja envolvido na ação vascular do extrato.

6.2. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina

O pré-tratamento de anéis de aorta com EKM modificou a reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina. A resposta vasoconstritora foi reduzida na presença de EKM somente em aortas com endotélio, indicando que o efeito do extrato é dependente do endotélio. Ainda, em aortas com endotélio pré-tratadas com L- NAME, o efeito do EKM foi inibido, indicando que a resposta vasoconstritora à fenilefrina é reduzida devido a ativação da produção endotelial de NO induzida pelo extrato. Estes resultados corroboram os demais experimentos que mostraram que o efeito vasodilatador do EKM ocorre através da ativação da via NO/GMPc. Em relação à reatividade à acetilcolina, o EKM provocou um discreto deslocamento para esquerda da curva concentração-resposta para acetilcolina, sem alterar o relaxamento máximo. Este efeito pode ser decorrente do aumento da produção de NO induzido pelo extrato ou também estar relacionado a um aumento da biodisponibilidade do NO, uma vez que DUTRA e colaboradores (2012) mostraram que o EKM apresenta atividade antioxidante utilizando-se o método de DPPH. AMEER e colaboradores (2010) demonstraram que extratos derivados de plantas podem provocar o deslocamento da curva concentração-resposta da 55 acetilcolina para a esquerda como resultado do aumento da meia-vida do NO devido a redução da sua inativação.

6.3. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por glicose

Há uma clara relação entre o DM e doenças micro e macrovasculares, sendo o estado hiperglicêmico sustentado um fator de risco importante para a disfunção endotelial (SHI e VANHOUTTE, 2017; ZHOU et al., 2011). A incubação dos anéis de aorta em meio com alta concentração de glicose resultou em um aumento da contração máxima induzida pela fenilefrina e redução do relaxamento máximo induzido pela acetilcolina. A literatura mostra resultados divergentes sobre os efeitos da glicose na contração vascular induzida pela fenilefrina. Já foi mostrado que em vasos isolados de animais com diabetes induzida por estreptozotocina a reatividade à fenilefrina estava aumentada (TOPAL et al., 2013), em aortas incubadas por 3 h com 44 mM de glicose foi observada redução da resposta contrátil a fenilefrina (EL-AWADY et al., 2014), e em aortas incubadas por 6 h com 55 mM de glicose não foi observada alteração da resposta à fenilefrina (WU et al., 2015). De forma similar ao observado neste trabalho, já foi mostrado que a exposição a altas concentrações de glicose leva a redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina devido a disfunção endotelial. Esta disfunção está associada a alterações morfológicas dos vasos, redução dos níveis de SOD e GSH, aumento da atividade da NADPH oxidase, peroxidação lipídica e redução da atividade da eNOS (WU et al., 2015; EL-AWADY et al., 2014; DHAR et al., 2010). O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou parcialmente a reatividade à acetilcolina. Uma vez que a disfunção endotelial no DM está relacionada ao estado de estresse oxidativo (SHI e VANHOUTTE, 2017), o efeito restaurador do EKM pode ser devido à sua propriedade antioxidante (DUTRA et al., 2012). Resultados semelhantes já foram observados com outros produtos naturais como o própolis (EL-AWADY et al., 2014) e o estilbeno glicosilado polidatina, uma das principais substâncias ativas extraídas da Polygonum cuspidatum (WU et al., 2015). 56

6.4. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina e à acetilcolina na presença de alterações vasculares induzidas por estresse oxidativo

A literatura mostra que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia das DCVs e do DM e desempenha um papel importante na disfunção endotelial (SHI e VANHOUTTE, 2017; BARADARAN et al., 2014; COHEN & TONG, 2010; HIGASHI et al., 2009). Foram realizados experimentos onde o dano vascular foi induzido com pirogalol, o qual rapidamente se auto-oxida em meio aquoso contendo O2 formando - - O2 . Este radical rapidamente reage com o NO para formar ONOO , que por sua vez causa o desacoplamento da eNOS através da oxidação do seu cofator BH4, levando - a produção de O2 ao invés de NO (QIAN et al., 2012). Na presença de pirogalol, a resposta contrátil à fenilefrina foi aumentada e a resposta vasodilatadora à acetilcolina foi reduzida, como mostrado em outros trabalhos (ALI & WOODMAN, 2015; QIAN et al., 2012; DHAR et al., 2010). O pré-tratamento com EKM normalizou a reatividade à fenilefrina, o que pode estar relacionado à atividade antioxidante do EKM, assim como à ativação da produção de NO induzida pelo EKM. No entanto, o extrato não foi capaz de restaurar a vasodilatação dependente do endotélio induzida pela acetilcolina, o que indica que - o EKM, provavelmente, não é capaz sequestrar o O2 produzido pela oxidação do pirogalol.

6.5. Efeitos das frações e subfrações do EKM no músculo liso vascular

Os resultados obtidos com a avaliação do efeito vasodilatador das frações do EKM mostraram que substâncias presentes principalmente nas frações butanólica e em acetato de etila são responsáveis pelo efeito vasodilatador do EKM. Ainda, a fração butanólica foi a mais potente entre as frações e também mais potente que o extrato. Os solventes utilizados na partição líquido-líquido do EKM extraem diversas substâncias e esta extração baseia-se na polaridade das mesmas. As substâncias preferencialmente extraídas pelo solvente butanol são flavonoides glicosilados, saponinas e taninos, enquanto o solvente acetato de etila extrai, preferencialmente, 57 flavonoides, taninos, xantonas, ácidos triterpênicos, saponinas e cumarinas simples (FILHO e YUNES, 1997; SIMÕES et al., 2010). As subfrações 1 e 2 da fração butanólica provocaram relaxamento vascular semelhante ao obtido com o EKM e com a fração butanólica, enquanto o relaxamento provocado pela subfração 4 foi significativamente menor e seu efeito vasodilatador máximo não ultrapassou 50%. A avaliação fitoquímica da subfração 2 da fração butanólica resultou na identificação dos flavonoides orientina, isoorientina, isovitexina e podocarpusflavona A (Figura 15). Estes flavonoides também foram identificados na subfração 1.

A B

C D

Figura 15: Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarposflavona A em A, B, C e D, respectivamente.

O potencial farmacológico dos flavonoides para prevenção e tratamento das DCVs é bastante descrito na literatura. Atividade antioxidante, ativação das vias + +2 NO/GMPc e PGI2/AMPc, ativação dos canais de K e bloqueio dos canais de Ca tipo L são mecanismos de ação descritos na literatura para os efeitos vasculares dos flavonoides (AHMAD et al., 2013; VÁZQUEZ et al., 2013). Além disso, os flavonoides são um dos únicos constituintes químicos que podem ser extraídos de hastes, folhas 58 e flores de diversas espécies de vegetais, os quais apresentam um grande espectro de atividades biológicas, apresentando uma baixa toxidez (AN et al., 2016). A orientina é um flavonóide C-glicosilado solúvel em água, podendo ser extraída de diversas espécies vegetais. Entre as suas principais atividades biológicas destacam-se as atividades antioxidante, vasodilatadora e cardioprotetora (LAM et al., 2016). Os níveis de catalase, glutationa peroxidase e SOD estão aumentados quando camundongos são tratados com orientina (LAM et al., 2016). Além disso, em um estudo realizado por FU e colaboradores (2005), foi demonstrado que a resposta vasodilatadora à orientina em aortas isoladas de coelhos envolve a ativação da via NO/GMPc. A orientina apresenta efeito cardioprotetor através do aumento da atividade antioxidante endógena e da redução da agregação plaquetária induzida por ácido araquidônico em coelhos (FU et al., 2007). Acredita-se que esses efeitos cardioprotetores da orientina estejam, em parte, associados à via de sinalização da via PI3K/Akt (LAM et al., 2016). A isoorientina, por sua vez, destaca-se por suas atividades antimicrobiana e hepatoprotetora (CHELYN et al., 2014) e sua ação no sistema cardiovascular ainda permanece pouco estudada. ALMEIDA e colaboradores (2006) demonstraram um discreto relaxamento vascular em aortas isoladas de ratos, enquanto em aortas isoladas de coelhos não foi observado efeito significativo (FU et al., 2005). A isovitexina apresenta efeito antioxidante, mediado principalmente através do aumento da concentração de glutationa e de SOD (LV et al., 2016; MÜLLER et al., 2016). Em concentrações entre 0,1 e 30 µM, a isovitexina não provocou relaxamento em aortas de coelhos (FU et al., 2005). A vitexina, isômero da isovitexina, apresenta efeito vasodilatador em aortas isoladas de ratos de forma dependente do vasoconstritor utilizado. Em anéis de aorta pré-contraídos com fenilefrina a vitexina não apresentou atividade vasodilatadora (KIM et al., 2000), enquanto em aortas pré-contraídas com forbol, um ativador da quinase ativadora da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK), a vitexina provocou relaxamento vascular independente do endotélio (JE et al., 2014). No entanto, em aortas isoladas de coelhos, a vitexina não apresentou efeito vasodilatador (FU et al., 2005). Por fim, a podocarpusflavona A já foi identificada na espécie vegetal Kielmeyera variabilis e possui atividade antioxidante (COQUEIRO et al., 2013). Assim como na K. membranacea, essa substância pode ser encontrada na fração 59 butanólica das folhas da K. variabilis, justificando a atividade antioxidante exibida pelo EKM. Tendo em vista a presença apenas de amentoflavona e podocarpusflavona A como constituintes majoritários nas subfrações 3 e 4, espera-se um efeito vasodilatador para subfração 3 semelhante ao observado para subfração 4. Diferente da podocarpusflavona A, que ainda não possui efeito vasodilatador descrito na literatura, a amentoflavona apresenta atividade vasodilatadora dependente da via NO/GMPc em aortas isoladas de ratos (KANG et al., 2004). A subfração 5, por sua vez, possui como constituinte majoritário apenas a podocarpusflavona A, a qual ainda precisa ser estudada. Portanto, para determinar todos os metabólitos secundários envolvidos no efeito vasodilatador do EKM novos estudos ainda precisam ser realizados, como a avaliação dos efeitos vasculares das substâncias isoladas.

7. CONCLUSÕES

 O EKM provoca intensa vasodilatação dependente do endotélio em anéis de aorta pré-contraídos com fenilefrina;

 O mecanismo de ação do EKM envolve a ativação da eNOS a partir da ativação da via PI3K/Akt;

 A ativação dos receptores endoteliais de bradicinina B2 e de estrogênio ERα está envolvida no mecanismo de ação do EKM;

 O EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e reverteu parcialmente a disfunção endotelial em aortas com disfunção vascular induzida por alta concentração de glicose;

 O EKM normalizou somente a reatividade à fenilefrina em aortas com disfunção vascular induzida por estresse oxidativo;

 A fração butanólica foi a mais potente vasodilatadora entre as frações obtidas do EKM;

 Entre os flavonoides já identificados na fração butanólica, a orientina parece ser a principal responsável pelo efeito vasodilatador;

 Novos estudos ainda são necessários para determinar os metabólitos secundários responsáveis pelas atividades vasodilatadora e restauradora da disfunção vascular exibidas pelo EKM.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDULLAH S. A., ABDULRAHMAN A., MOHAMMAD B., JUSTIN L., LANNES M., ANGLE M., LO B., TEITELBAUM J.. Safety and outcome of high doses IV milirinone in subarachnoid hemorrhage with refractory vasospasm. Stroke, v. 47, p. 201-221, 2016.

AHMAD A., KHAN R. M.A., ALKHARFY K. M. Effects of selected bioactive natural products on the vascular endothelium. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 61, p. 111-121, 2013.

ALI S. F., WOODMAN O. L. Tocotrienol Rich Palm Oil Extract Is More Effective Than Pure Tocotrienols at Improving Endothelium-Dependent Relaxation in the Presence of Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2015, p. 1-10, 2015.

ALMEIDA, R.R., RAIMUNDO, J.M., OLIVEIRA, R.R., KAPLAN, M.A.C., GATTASS, C.R., SUDO, R.T., ZAPATA-SUDO, G. Activity of Cecropia lyratiloba extract on contractility of cardiac and smooth muscles in Wistar rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 33, p. 109-113, 2006.

AMEER, O.Z., SALMAN, I.M., SIDDIQUI, M.J.A., YAM, M.F., SRIRAMANENI, R.N., MOHAMED, A.J., SADIKUN, A., ISMAIL, Z., SHAH, A.M., ASMAWIAM, Z.. Pharmacological mechanisms underlying the vascular activities of Loranthus ferrugineus Roxb.in rat thoracic aorta. Journal of Ethnopharmacology, v. 127, p. 19–25, 2010.

AQUINO F. J. T., MARTINS C. M., MORAIS S. A. L., CUNHA L. C. S., ALOISE G. R. G., CHANG R., OLIVEIRA A., MORAES T. S., CUNHA W. R., MARTINS C. H. G. Antioxidant and antimicrobial activity of Kielmeyera coriacea Mart. and Zucc. Journal of Medicinal Plants Research, v. 7, n. 37, p. 2722-2728, 2013.

AVIRAM M., ROSENBLAT M. Pomegranate for your cardiovascular health. Rambam Maimonides. Medical Journal, v. 4, n. 2, 2013.

BARABADAN A., NASRI H., KOPAEI M.R. Oxidative stress and hypertension: Possibility of hypertension therapy with antioxidants. Journal of Research in Medicinal Sciences, v. 19, n. 4, p. 358-367, 2014.

BARREIRO E. J., BOLZANI V. S. Biodiversidade: Fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, 2009.

BOLIVAR J. J. Essential hypertension: Na approach to its etiology and neurogenic pathophysiology. International Journal of hypertension, v. 213, p. 1-11, 2013.

BRASIL. Doenças cardiovasculares. Disponível em:. Acesso em: 12 de abril de 2016.

BROWN T. L., MAAHS D. M., BISHOP F. K., SNELL-BERGEON J. K., WADWA R. P. Influences of gender on cardiovascular disease risk factors in adolescents with 62 and without type 1 diabetes. International Journal of Pediatric Endocrinology, v. 8, p. 1-8, 2016.

BROZOVICH F. V., NICHOLSON C. J., DEGEN C. V., GAO Y. Z., AGGARWAL M., MORGAN K. G. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews, v. 68, p. 476-532, 2016.

BRYAN R. M., YOU J., GOLDING E. M., MARRELI S. P. Endothelium-derived hyperpolarizing factor: A cousin to nitric oxide and prostacyclin. Anesthesiology, v. 102, n. 6, p. 1261-1277, 2005.

BUTLER M. S. The role of natural products chemistry in drug discovery. Journal of Natural Products, v. 67, p. 2141-2153, 2004.

CARVALHO A. P., MIRANDA O. P., JULIÃO L. S., OLIVEIRA G. M. A. M., GOMES M. Plant extract obtained from Kielmeyera aureovinosa which has antibiotic activity, isolated chemical compound, compositions comprising same, uses thereof and methods for preventing and treating bacterial infections. Organização Mundial da Propriedade Intelectual, n. 174622, 2012.

CARVALHO M. H. C., NIGRO D., LEMOS V.S, TOSTES R. C. A., FORTES Z. B. Hipertensão arterial: o endotélio e suas múltiplas funções. Revista Brasileira de Hipertensão, v. 8, n. 1, p. 76-88, 2001.

CARVALHO P. F. Z., TOMAZETT P. K., SANTOS S. C., FERRI P. H., BORGES C. L., MARTINS W. S., SOARES C. M. A., PEREIRA M. Transcriptional profile of Paracoccidioides induced by oenothein B, a potential antifungal agent from the Brazilian Cerrado plant Eugenia uniflora. BMC Microbiology, v. 13, p. 1-16, 2013.

CHANG H. W., LI Y. W., HSIEH C. H., LIU P. Y., LIN G. M.. Association of body mass index with all-cause mortality in patients with diabetes: A systemic review and meta-analysis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy, v. 6, n. 2, p. 109-119, 2015.

CHALOPIN, M., TESSE, A., MARTÍNEZ, M.C., ROGNAN, D., ARNAL, J.F., ADRIANTSITOHAINA, R.A. Estrogen receptor alpha as a key target of red wine. PLoS ONE, v. 5, e8554, p.1-7, 2010.

CHELYN J. L., OMAR M. H., MOHD N. S., RANGGASAMY R., WASIMAN M. I. I., ISMAIL Z. Analysis of flavone C-glycosides in the leaves of Clinacanthus nutans (Burm. f.) Lindau by HPTLC and HPLC-UV/DAD. The Scientific World Journal, v. 10, p. 1-15, 2014.

COELHO S. M., TAYLOR A. R., RYAN K. P., SOUSA-PINTO I., BROWN M. T., BROWNLEE C.. Spatiotemporal patterning of reactive oxygen production and Ca2+ wave propagation in Fucus rhizoid cells. Plant Cell, v. 14, p. 2369-2381, 2003.

COGOLLUDO A., MORENO L., VILLAMOR E. Mechanism controlling vascular tone in pulmonary arterial hypertension: Implications for vasodilator therapy. Pharmacology, v. 79, p. 65-75, 2006.

COHEN R. A., TONG X. Y. Vascular oxidative stress: the common link in hypertensive and diabetic vascular disease. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 55, n. 4, p. 308-316, 2010.

CONSOLINI A. E., SARUBBIO M. G. Pharmacological effects of Eugenia uniflora (Myrtaceae) aqueous crude extract on rat's heart. Journal of Ethnopharmacology, v. 81, n. 1, p. 57-63, 2002. COQUEIRO A., REGASINI L. O., SKRZEK S. C., QUEIROZ M. M., SILVA D. H., DA SILVA BOLZANI V. Free radical scavenging activity of Kielmeyera variabilis (Clusiaceae). Molecules, v. 18, n. 2, p. 2376-2385, 2013.

CRAGG G. M., NEWMAN D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1830, n. 6, p. 3670-3695, 2013.

CURIN Y., ANDRIANTSITOHAIANA R. Polyphenols as potential therapeutical agents against cardiovascular diseases. Pharmacological Reports, v. 57, p. 97-107, 2005.

DANG B. T., GÉNY C., BLANCHARD P., ROUGER C., TONNERRE P., CHARREAU B., RAKOLOMALALA G., RANDRIAMBOAVONJY J. I., LOIRAND G., PACAUD P., LITAUDON M., RICHOMME P., SÉRAPHIN D., DERBRÉ S.. Advanced glycation inhibition and protection against endothelial dysfunction induced by coumarins and procyanidins from Mammea neurophylla. Fitoterapia Journal, v. 96, p. 65-75, 2014.

DATASUS. Disponível em: . Acesso em: 14 de abril 2016.

DE-JIAN J., ZHONG D., YUAN - JIAN L. Pharmacological effects of xanthones as cardiovascular protective agents. Cardiovascular Drug Reviews, v. 22, n. 2, p. 91- 102, 2004.

DHAR A., DHAR I., DESAI K. M., WU L. Methylglyoxal scavengers attenuate endothelial dysfunction induced by methylglyoxal and high concentrations of glucose. British Journal of Pharmacology, v. 161, n. 8, p. 1843-1856, 2010.

DIAS R. G., NEGRÃO C. E., KRIEGER M. H. Nitric oxide and the cardiovascular system: Cell activation, vascular reactivity and genetic variant. Sociedade Brasileira de Cardiologia, v. 96, n. 1, p. 68-75, 2009.

DUDZINSKI D. M., IGARASHI J., GREIF D., MICHEL T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. The Annual Review of Pharmacology and Toxicology, n. 46, p. 235-276, 2005.

DUDZINSKI D. M., THOMAS M. Life history of eNOS: Partners and pathways. Cardiovascular Research, v. 75, p. 247-260, 2007.

DUTRA A. R., MELLO R. J., MONTANI J., KONNO T. U. P., MUZITANO M. F., GUIMARÃES D. O., LEAL I. C. R. Avaliação da atividade antioxidante de espécies vegetais da Restinga de Jurubatiba. Livro de Resumos, II Jornada Fluminense de Produtos Naturais, Arraial do Cabo, p. 56, 2012.

FARZAEI M. H., ABBASABADI Z., ARDEKANI M. R., RAHIMI R., FARZAEI F. Parsley: a review of ethnopharmacology, phytochemistry and biological activities. Journal of Traditional Chinese Medicine, v. 33, n. 6, p. 815-826, 2013.

FÉLÉTOU M. Calcium-activated potassium channels and endothelial dysfunction: therapeutic options? British Journal of Pharmacology, v. 156, n. 4, p. 545-562, 2009.

FERCHICHI L., DREBRÉ S., MAHMOOD K., TOURÉ K., GUILET D., LITAUDON M., AWANG K., HADI A. H., LE RAY A. M., RICHOMME P.. Bioguided fractionation and isolation of natural inhibitors of advanced glycation end-products (AGEs) from Calophyllum flavoramulum. Phytochemistry, v. 78, p. 98-106, 2012.

FIGUEIREDO C. R., MATSUO A. L., MASSAOKA M. H., GIROLA N., AZEVEDO R. A., RABAÇA A. N., FARIAS C. F., PEREIRA F. V., MATIAS N. S., SILVA L. P., RODRIGUES E. G., LAGO J. H. G., TRAVASSOS L. R., SILVA R. M. G. Antitumor activity of Kielmeyera coriacea leaf constituents in experimental melanoma, tested in vitro and in vivo in syngeneic mice. Advanved Pharmaceutical Bulletin, v. 4, p., 429-436, 2014.

FIGUEROA E. O., SILVA L. C. N., MELO C. M., NEVES J. K., SILVA N. H., PEREIRA V. R, CORREIA M. T. Evaluation of antioxidant, immunomodulatory, and cytotoxic action of fractions from Eugenia uniflora L. and Eugenia malaccensis L.: correlation with polyphenol and flavanoid content. The Scientific World Journal, v. 2013, p. 1-7, 2013.

FILHO V. C., YUNES R. A. Estratégias para obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceito sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, n. 2, p. 99-105, 1997.

FÖRSTEMANN U., SESSA W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. European Heart Journal, v. 33, ed. 7, p. 829-837, 2012.

FU X. C., WANG M. W., LI S. P., ZHANG Y., WANG H. L.. Vasodilatation produced by orientin and its mechanism study. Biological Pharmacollogycal Bullard, n. 28, v. 1, p. 37-41, 2005.

FU X.C., WANG M.W., LI S.P., WANG H.L. Anti-apoptotic effect and the mechanism of orientin on ischaemic/reperfused myocardium. Journal of Asian natural products research, v. 8, p. 265 -72, 2007.

FURCHGOTT R. F., VANHOUTTE P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The Faseb Journal, v. 3, p. 2007-2018, 1989.

GILES T. D., SANDER G. E., NOSSAMAN B. D., KADOWITZ P. J.. Impaired vasodilatation in the pathogenesisof hypertension: Focus on nitric oxide, endothelial- derived hyperpolarizing factors, and prostaglandins. The Journal of Clinical Hypertension, v. 14, n. 4, p. 198-205, 2012.

GOVERS R., RABELINK T. J. Cellular regulation of endothelial nitric oxide synthase. The American Journal of Physiology- Renal Physiology, v. 280, n. 2, p. F193- 206, 2001.

GOMES F. S., PROCÓPIO T. F., NAPOLEÃO T. H., COELHO L. C., PAIVA P. M. Antimicrobial lectin from Schinus terebinthifolius leaf. Journal of Applied Microbiology, v. 114, n. 3, p. 672-679, 2013. GUIMARÃES R. M., ANDRADE S. S. C. de A., MACHADO E. L., BAHIA C. A., OLIVEIRA M. M., JACQUES F. V. L. Diferenças regionais na transição da mortalidade por doenças cardiovasculares no Brasil, 1980 a 2012. Pan American Journal of Public Health, v. 37, n. 2, p. 83-89, 2015.

GUN A., OZER M. K., BILGIC S., KOCAMAN N., OZAN G. Effect of caffeic acid phenethyl ester on vascular damage caused by consumption of high fructose corn syrup in rats. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2016, p. 1-8, 2016.

GUYTON A. C., HALL J. E. Tratado de Fisiologia Médica, 12° edição. Editora Elsevier Brasil, p. 551, 2011.

HEIN T. W., XU W., XU X., KUO L. Acute and chronic hyperglycemia elicit JIP1/JNK- mediated endothelial vasodilator dysfunction of retinal arterioles. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 57, n. 10, p. 4333-4340, 2016.

HIGASHI Y., NOMA K., YOSHIZUME M., KIHARA Y. Endothelial function and oxidative stress in cardiovascular diseases. Circulation Journal, v. 73, 411-418, 2009.

ISLAM M. Z., WATANABE Y., NGUYEN H. T., YAMAZAKI E. H., OBI T., SHIRAISHI M., MIYAMOTO A. Vasomotor effects of acetylcholine, bradykinin, noradrenaline, 5- hydroxytryptamine, histamine and angiotensin II on the mouse basilar artery. The Journal of veterinary Medical Science, v. 76, n. 10, p. 1339-1345, 2014.

JE H. G., HONG S. M., JE H. D., SHON U. D., CHOI Y. S., SEO S. Y., MIN Y. S., CHUNG S. J., SHIN Y. Y., LEE T. J., PARK E. S., JEONG J. H.. The inhibitory effect of vitexin on the agonist-induced regulation of vascular contractility. Pharmazie, v. 69, p. 224-228, 2014.

JUNIOR C. V., BOLZANI V. S., BARREIRO E. J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006.

KANG D.G., YIN M.H., OH H., LEE D.H., LEE H.S. Vasorelaxation by amentoflavone isolated from Selaginella tamariscina. Planta Medica, v. 70, n. 8, p. 718-722, 2004.

KANG G., LEE Y. R., JOO H. K., PARK M. S., KIM C. S., CHOI S., JEON B. H. Trichostatin A Modulates Angiotensin II-induced Vasoconstriction and Blood 66

Pressure Via Inhibition of p66shc Activation. The Korean Journal of Physiology and Pharmacology, v. 19, n. 5, p. 467-472, 2015.

KEDZIERSKI R. M., YANAGISAWA M. Endothelin system: the double-edged sword in health and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v. 41, p. 851-876, 2001.

KENNEDY D. O., WIGHTMAN E. L. Herbal extracts and phytochemicals: Plant secondary metabolites and the enhancement of human brain function. American Society for Nutrition, v. 2, p. 32-50, 2011.

KERTH V. B. S., SELLOUM N. E., CHATAIGNEAU T., AUGER C. Vascular protection by natural product-derived polyohenols: In vitro and in vivo evidence. Planta Medica, v. 77, p. 1161-1167, 2011.

KHALIL M. I., SULAIMAN S. A. The potential role of honey and its polyphenols in preventing heart diseases: A review. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicine, v. 7, p. 315-321, 2010.

KIM S. H., KANG K. H., KIM K. W., KIM N. D. Procyanidins in crataegus extract evoke endothelium-dependent vasorelaxation in rat aorta. Life Science, v. 67, p. 121-131, 2000.

KOTCHEN T. A., JR A. W. C., LIANG M. Ushering hypertension into a new era of precision medicine. American Medical Association, v. 315, n. 4, p. 343-344, 2016.

KUNES J., HOJNÁ S., KADLECOVÁ M., DEBESOVÁ Z., RAUCHOVÁ H., VOKURKOVÁ M., LOUKOTOVÁ J., PECHÁNOVÁ O., ZICHA J.. Altered balance of vasoactive systems in experimental hypertension: The role of relative NO deficiency. Physiological Research, v. 53, p. S23-S24, 2004.

LACHINE N. A., ELNEKIEDY A.A., MEGALLAA M. H., KHALIL G. I., SADAKA M. A., ROHOMA K. H., KASSAB H. S.. Serum chemerin and high-sensitivy C reactive protein as markers of subclinical atherosclerosis in Egyptian patients with type 2 diabetes. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism, v. 7, n. 2, p. 47-56, 2016.

LAM K. Y., LING A. P., KOH R. Y., WONG Y. P., SAY Y. H. A review on medicinal properties of orientin. Advances in Pharmacological Sciences, v. 10, p. 1-8, 2016.

LAU Y. S., LING W. C., MURUGAN D., KWAN C. Y., MUSTAFA M. R.. Endothelium- dependent relaxation effect of Apocynum venetum leaf extract via Src/PI3K/Akt signalling pathway. Nutrients, v. 30, n. 7, p. 5239-5253, 2015.

LEMOS L.M., MARTINS T. B., TANAJURA G. H., GAZONI V. F., BONALDO J., STRADA C. L., SILVA M. G., DALL´OGLIO E. L., DE SOUZA JÚNIOR P. T., MARTINS D. T. Evaluation of antiulcer activity of chromanone fraction from Calophyllum brasiliesnse Camb. Journal Ethnopharmacology, v. 141, n. 1, p. 432- 439, 2012.

LI, H., XIA, N., FÖRSTERMANN, U. Cardiovascular effects and molecular targets of resveratrol. Nitric Oxide, v. 26, p.102-110, 2012.

LIU J., WANG Y., QIU L., YU Y., WANG C. Saponins of Panax notoginseng: chemistry, cellular targets and therapeutic opportunities in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Investigational Drugs, v. 23, n. 4, p. 523-539, 2014.

LUNA-VÁZQUEZ, F.J., IBARRA-ALVARADO, C., ROJAS-MOLINA, A., ROJAS- MOLINA, I., ZAVALA-SÁNCHEZ, M.A. Vasodilator compounds derived from plants and their mechanisms of action. Molecules, v. 18, p. 5814-5857, 2013.

LV H., YU Z., ZHENG Y., WANG L., QIN X., CHENG G., CI X.. Isovitexin exerts anti- inflammatory and anti-oxidant activities on lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting MAPK and NF-κB and activating HO-1/Nrf2 pathways. International Journal of Biological Sciences, v. 12, n. 1, p. 72-86, 2016.

MASSRY K. F. E., GHORAB A. H. E., SHAABAN H. A., SHIBAMOTO T. Chemical compositions and antioxidant/antimicrobial activities of various samples prepared from Schinus terebinthifolius leaves cultivated in Egypt. Journal of Agricultural and Food Chemstry, v. 57, n. 12, p. 5265-5270, 2009.

MATLUNG H. L., BAKKER E. N., VANBAVEL E. Shear stress, reactive oxygen species and arterial structure and function.Antioxid Redox Signal, v. 11, n. 7, p. 1699-1709, 2009.

McNEILL, J.R., JURGENS, T.M. A systematic review of mechanisms by which natural products of plant origin evoke vasodilatation. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, v. 84, p. 803-821, 2006.

MELO M. S., BRITO R. G., SANTOS P. L., NOGUEIRA P. C., MORAES V. R., MATOS M. C., FERRO J. N., BARRETO E. O., JUNIOR L. W., BOTELHO M. A., JUNIOR L. J. Q. Involvement of cerebral nervous system areas and cytokines on antihyperalgesic and anti-inflammatory activities of Kielmeyera rugosa Choisy (Calophyllaceae) in rodents. Phytotherapy Research, v. 28, n. 12, p. 1806-1815, 2014.

MIDDLETON E. JR., KANDASWAMI C., THEOHARIDES T. C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacological Reviews, v. 52, n. 4, p. 673-751, 2000.

MICHEL T., VANHOUTTE P. M. Cellular signaling and NO production. European Journal of Physiology, v. 459, n. 6, p. 807-816, 2010.

MILLER V. M., VANHOUTTE P. M. Endothelium-dependent contractions to arachidonic acid are mediated by products of cyclooxygenase. American Journal of Physiology, v. 248, n. 4, p.H432-437, 1985.

MOBOT. Missouri Botanical Garden. 2014. Disponível em: < http://www.mobot.org>. Acesso em: 19/08/2016.

MOHAMMED R. S., ABOU A. H. Z., EL HAWARY S. S., SLEEM A. A., ASHOUR W. E.. Flavonoid constituents, cytotoxic and antioxidant activities of Gleditsia triacanthos L. leaves. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 21, n. 6, p. 547-553, 2014.

MORAIS T. R., COSTA – SILVA T. A., TEMPONE A. G., BORBOREMA S. E., SCOTTI M. T., SOUZA R. M., ARAUJO A. C., OLIVEIRA A., MORAIS S. A., SARTORELLI P., LAGO J. H. Antiparasitic activity of natural and semi-synthetic tirucallane triterpenoids Schinus terebinthifolius (Anacardiaceae): structure/activity relationships. Molecules, v. 19, n. 5, p. 5761-5776, 2014.

MÜLLER S. D., FLORENTINO D., ORTMANN C. F., MARTINS F. A., DANIELSKI L. G., MICHELS M., CONSTANTINO L. S., PETRONILHO F., REGINATTO F. H.. Anti- inflammatory and antioxidant activities of aqueous extract of Cecropia glaziovii leaves. Journal of Ethno pharmacology, v. 185, n. 7, p. 255-262, 2016.

NEWMAN D. J., CRAGG G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, p. 311-335, 2012.

NOGUEIRA P. C. L., ANDRADE M. S., ANDRADE L. M., MORAES V. R. S., RIBEIRO A. S., BITTRICH V., AMARAL M. C. E., FERREIRA A. G., ALCÂNTARA G. B., LEÃO K.V., ALVES P. B. Chemical constituents from Kielmeyera rugosa Choisy (Clusiaceae). Biochemical Systematics and Ecology, v. 36, p. 921-924, 2009.

OBICI S., OTOBONE F. J., SELA V. R. S., ISHIDA K., SILVA J. C., NAKAMURA C. V., CORTEZ D. A. G., AUDI E. A. Preliminary toxicity study of dichloromethane extract of Kielmeyera coriacea stems in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 115, p. 131-139, 2008.

OGINO M., FUKUI S., NAKADA Y., TOKUNOH R., ITOKAWA S., KAKOI Y., NISHIMURA S., SANADA T., FUSE H., KUBO K., WADA T., MARUI S.. Discovery of a potent and orally available acyl-CoA: cholesterol acyltransferase inhibitor as an anti-atherosclerotic agent: (4-phenylcoumarin) acetanilide derivatives. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 59, n. 10, p. 1268-1273, 2011.

OGUT O., BROZOVICH F. V. Regulation of force in vascular smooth muscle. Journal of Molecular and Celular Cardiology, v. 35, p. 347-355, 2003.

OKOP K. J., MUKUMBANG F. C., MATHOLE T., LEVITT N., PUOANE T. Perceptions of body size, obesity threat and the willingnen to lose weight among black South African aduslts: A qualitative study. Public Health, v. 16, p. 1-13, 2016.

OLIVEIRA A. C., BRITTO A. C., HENRIQUES R. M., CARDOSO G. M., ANJOS C. S., JESUS A. M., COSTA E. V., MORAES V. R., NOGUEIRA P. C., BEZERRA D. P. In vivo growth inhibition of sarcoma 180 by Kielmeyera rugosa Choisy (Calophyllaceae). Natural Product Reaearch, v. 27, n. 23, p. 2248-2250, 2013.

OLIVEIRA-PAULA G. H., LACCINI R., TANUS-SANTOS J. E.. Inducible nitric oxide synthase as a possible target in hypertension. Currente Drug Target, v. 15, n. 2, p. 164-174, 2015.

ORALLO F. Regulation of cytosolic calcium levels in vascular smooth muscle. Pharmacology, v. 69, n. 3, p. 153-171, 1996.

PAES, B. M. Potencial farmacológico de Kielmeyera membranacea no sistema cardiovascular: investigação da atividade vasodilatadora do extrato hidroalcoólico de folhas e frações. Trabalho de Conclusão de Curso, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2014.

PAULA G. H. O., LACCHINI R., SANTOS J. E. T. Endothelial nitric oxide synthase: From biochemistry and gene structure to clinical implications of NOS3 polymorphims. Gene, v. 575, p. 584-599, 2016.

PARK S. H., SHIM B. S., YOON J. S., LEE H. H., LEE H. W., YOO S. B., WI A. J., PARK W. S., KIM H. J., KIM D. W., OAK M. H.. Vascular protective effect of an ethanol extract of Camellia japonica fruit: endothelium-dependent relaxation of coronary artery and reduction of smooth muscle cell migration. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 10, p. 1-9, 2015.

PARKINGTON H. C., COLEMAN H. A., TARE M. Prostacyclin and endothelium- dependent hyperpolarization. Pharmacological Research, v. 49, p. 509-514, 2004.

PENSO J., CORDEIRO K. C., DA CUNHA C. R., DA SILVA CASTRO P. F., MARTINS D. R., LIÃO L. M., ROCHA M. L., DE OLIVEIRA V. Vasorelaxant activity of 7-β-O-glycosides biosynthesized from flavonoids. European Journal of Pharmacology, v. 773, p. 75-80, 2014.

PICCINELLI A. C., SANTOS J. A., KONKIEWITZ E. C., OESTERREICH S. A., FORMAGIO A. S., CRODA J., ZIFF E. B., KASSUYA C. A. Antihyperalgesic and antidepressive actions of (R)-(+)-limonene, α-phellandrene, and essential oil from Schinus terebinthifolius fruits in a neuropathic pain model. Nutritional Neuroscience, v. 16, n. 5, p. 217-224, 2014.

PONTES L. B., ANTUNES F., SUDO R. T., RAIMUNDO J. M., LIMA L. M., BARREIRO E. J., SUDO G. Z. Vasodilatory activity and antihypertensive profile mediated by inhibition of phosphodiesterase type 1 induced by a novel sulfonamide compound. Fund.Clin.Pharmacol. v. 26, p. 690-700, 2012.

QIAN L. B., FU J. Y., CAI X., XIA M. L. Betulinic acid inhibits superoxide anion- mediated impairment of endothelium-dependent relaxation in rat aortas. Indian Journal of Pharmacology, v. 44, n. 5, p. 588-592, 2012.

QIN B., ZHOU J. Src family kinases (SFK) mediate angiotensin II-induced myosin light chain phosphorylation and hypertension. Plos One, v. 10, n. 5, 2015.

RAIMUNDO J. M., TRINDADE A. P., VELOZO L. S., KAPLAN M. A., SUDO R. T., ZAPATA-SUDO G. The lignan eudesmin extracted from Piper truncatum induced vascular relaxation via activation of endothelial histamine H1 receptors. European Journal of Pharmacology, v. 15, p. 150-154, 2009.

RÄTHEL T. R., LEIKERT J. F., VOLLMAR A. M., DIRSCH V. M.. The soy isoflavone genistein induces a late but sustained activation of the endothelial nitric oxide- synthase system in vitro. British Journal of Pharmacology, v. 144, n. 3, p. 394-399, 2005. RATTMANN Y. D., ANSELM E., KIM J. H., DAL-ROS S., AUGER C., MIGUEL O. G., SANTOS A. R. S., CHATAIGNEAU T., SCHINI-KERTH V. B.. Natural products extract of Dicksonia sellowiana induces endothelium-dependent relaxations by a redox-sensitive Src - and Akt – dependent activation of eNOS in porcine coronary arteries. Journal of Vascular Research, v. 49, p. 284-298, 2012.

REFLORA. Listas de Espécies da Flora do Brasil. 2013. Disponível em: < http://floradobrasil.jbrj.gov.br>. Acesso em: 19/07/2016.

RODRIGO R., LIBUY M., FELIÚ F., HASSON D. Oxidative stress-related biomarkers in essential hypertension and ischemia-reperfusion myocardial damage. Disease Markers, v. 35, ed. 6, p. 773-790, 2013.

RODRIGUES P. A., MORAIS S. M., SOUZA C. M., MAGALHÃES D. V., VIERIRA I. G., ANDRADE G. M., RAO V. S., SANTOS F. A. Gastroprotective effect of Byrsonima sericea DC leaf extract against ethanol-induced gastric injury and its possible mechanisms of action. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 84, n. 1, p. 113-122, 2012.

ROE N. D., REN J. Nitric oxide synthase uncoupling: A therapeutic target in cardiovascular diseases. Vascular Pharmacology, v. 57, p. 168-172, 2012.

RUHFEL B. R., BITTRICH V., BOVE C. P., GUSTAFSSON M. H. G., PHILBRICK C. T., RUTISHAUSER R., XI Z., DAVIS C. C.. Phylogeny of the clusioid clade (MALPIGHIALES): Evidence from the plastid and mitochondrial genomes. American Journal of Botany, v. 98, n. 2, p. 306-325, 2011.

SADDI N. A taxonomic revision of the genus Kielmeyera Mart. (Guttiferae). Tese de PhD. University of Reading, UK, p. 1-213, 1982.

SAKURAI T. H. M., KASUYA Y., TAKUWA Y., NAKAUCHI H., MASAKI T., GOTO K. Level of ETB receptor mRNA is down-regulated by endothelins through decreasing the intracellular stability of mRNA molecules. Biochemestry Biophysical Research Commun, v.186, n.1, p. 342-7, 1992.

SHEN K., LEUNG S. W., JI L., HUANG Y., HOU M., XU A., WANG Z., VANHOUTTE P. M.. Notoginsenoside Ft1 activates both glucocorticoid and estrogen receptors to induce endothelium-dependent, nitric oxide-mediated relaxations in rat mesenteric arteries. Biochemical Pharmacology, v. 88, n. 1, p. 66-74, 2014.

SHI Y., VANHOUTTE P. M.. Reactive oxygen-derived free radicals are key to the endothelial dysfunction of diabetes. Journal of Diabetes, v. 1, n. 3, p. 151-162, 2017.

SIANG L. Y., SUBRAMANIAM G., HADI A. H. A., MURUGAN D., MUSTAFA M. R.. Reactive oxygen species-induced impairment of endothelium-dependent relaxations 71 in rat aortic rings: protection by methanolic extracts of Phoebe grandis. Molecules, v. 16, p. 2990-3000, 2011.

SIMÕES C.M.O., SCHENKEL E.P., GOSMANN G., MELLO J.C.P., MENTZ L.A., PETROVICK P.R. (ORGS). Farmacognosia da planta ao medicamento, 6ª Edição. Rio Grande do Sul. Editora UFRGS, v. 8, p. 35, 2010.

SOBRAL I. S., SOUZA – NETA L. C., COSTA G. A. N., GUEDES M. L. S., MARTINS D., CRUZ F. G. Xantonas, triterpenos e atividade antibacteriana do extrato em diclorometano de Kielmeyera cuspidata Saddi, Clusiaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 19, n. 3, p. 686-689, 2009.

SONG B., WANG Z., LIU Y., XU S., HUANG G., XIONG Y., ZHANG S., XU L., DENG X., GUAN S.. Immunosuppressive activity of daphnetin, one of coumarin derivatives, is mediated through suppression of NF-κB and NFAT signaling pathways in mouse T cells. PLoS One, v. 9, n. 5, p. 1-11, 2014.

SOUZA Z. L., DE OLIVEIRA F. F., DA CONCEIÇÃO A. O., SILVA L. A., ROSSI M. H., SANTOS J. S., ANDRIOLI J. L. Biological activities of extracts from Chenopodium ambrosioides Lineu and Kielmeyera neglecta Saddi. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, v. 11, n. 20, p. 11-20, 2012.

STAPLETON P. A., JAMES M. E., GOODWILL A. G., FRISBEE J. C. Obesity and vascular dysfunction. Pathophysiology, v. 15, p. 79-89, 2008.

STOCLET J. C., CHATAIGNEAU T., NDIAYE M., OAK M. H., BEDOUI J. E., CHATAIGNEAUT M., KERTH V. B. S.. Vascular protection by dietary polyphenols. Science Direct, v. 500, p. 299-313, 2004.

SU J. B. Vascular endothelial dysfunction and pharmacological treatment. World Journal of Cardiology, v. 7, n. 11, p. 719-741, 2015.

SUFFREDINI I. B., PACIENCIA M. L., VARELLA A. D., YOUNES R. N. Antibacterial activity of Brazilian Amazon plant extracts. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 10, n. 6, p. 400-402, 2006.

TAIZ L., ZEIGER E. Plant physiology. Sinauer Associates, Inc Sunderland, ed. 3ª, v. 3, p. 283-308, 2002.

TANG Y., LI S., ZHANG P., ZHU J., MENG G., XIE L., YU Y., JI Y., HAN Y.. Soy isoflavone protects myocardial ischemia/reperfusion injury through increasing endothelial nitric oxide synthase and decreasing oxidative stress in ovariectomized rats. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 10, p. 1-14, 2016.

TOPAL G., KOÇ E., KARAKA Ç., ALTUG T., ERGIN B., DEMIRCE C., MELICOGLU G., MERIÇLI A. H., KUCUR M., ÖSDEMIR O., DOGAN B. S. U.. Effects of Crataegus microphylla on vascular dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Phytotherapy Research, v. 27, p. 330-337, 2013.

VANHOUTTE P. M. Endothelium-derived free radicals: for worse and for better. Journal of Clinical Investigation, v. 107, n. 1, p. 23-25, 2001.

VANHOUTTE P. M., TANG E. H. C. Endothelium-dependent contractions: When a good guy turns bad. Journal of Physiology, v. 586, n. 22, p. 5295-5304, 2008.

VANHOUTTE P. M. Endothelium-dependent hyperpolarizations: The history. Pharmacological Research, v. 49, p. 503-508, 2004.

VÁZQUEZ F. J. L., ALVARADO C. I., MOLINA A. R., MOLINA I. R., SÁNCHEZ A. R. Vasodilator compounds derived from plants and their mechanisms of action. Molecules, v. 18, p. 5814-5857, 2013.

VELAYUTHAM R., SANKARADOSS N., AHAMED K. F. Protective effect of tannins from Ficus racemosa in hypercholesterolemia and diabetes induced vascular tissue damage in rats. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 5, n. 5, p. 367-373, 2012.

WEISS, A., BELOOSESKY Y., GROSSMAN A., SHLESINGER A., KOREN-MORAG N., GROSSMAN E.. The association between orthostatia hypertension and all-cause mortality in hospitalized elderly persons. Journal of Geriatric Cardiology, v. 13, p. 239-243, 2016.

WHO. Cardiovascular Diseases. Disponível em: . Acesso em: 12 de abril de 2016.

WURDACK K. J., DAVIS C. C. Malphighiales phylogenetics: Gaining ground on one of the most recalcitrant clades in the angiosperm tree of life. American Journal of Botany, v. 96, n. 8, p. 1551-1570, 2009.

ZAGO A. S., ZANESCO A. Óxido nítrico, doenças cardiovasculares e exercício físico. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 87, n. 6, p. E264-E270, 2006.

ZAGOTO J. N., BRACHT A., PAGADIGORRIA C. L., ISHII – IWAMOTO E. L., CORTEZ D. A., YAMAMOTO N. S. Effects of the Kielmeyera coriacea extract on energy metabolism in the rat liver. Journal of Ethnopharmacology, v. 105, n. 1-2, p. 47-54, 2006.

ZHAO Y., VANHOUTTE P. M., LEUNG S. W. S. Vascular nitric oxide: Beyond eNOS. Journal of Pharmacological Sciences, v. 129, p. 83-94, 2015

ZHOU S., CHEN H. Z., WAN Y. Z., ZHANG Q. J., WEI Y. S., HUANG S., LIU J. J., LU Y. B., ZHANG Z. Q., YANG R. F., ZHANG R., CAI H., LIU D. P., LIANG C. C.. Repression of P66Shc expression by SIRT1 contributes to the prevention of hyperglycemia-induced endothelial dysfunction. Circulation Research, v. 109, n. 6, p. 639-648, 2011.

ANEXO

RT: 0,00 - 35,00 NL: 18000 1,30E4 UV_VIS_3 16000 UV 3 FR2_FRBU 14000 OH 5,67

12000

10000 uAU 8000 7,01

6,07 6000 31,37 12,76 4000 0,73 8,70 8,81 11,31 0,88 13,02 30,19 5,36 13,91 15,19 18,76 19,22 20,39 21,53 22,53 23,74 25,06 26,64 2000 2,68 3,84 4,60

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Time (min) Figura 1. Cromatograma da subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea

Tabela 1. Perfil de fragmentação dos flavonoides presentes na subfração 2 da fração butanólica de K. membranacea. Análise por Cromatografia líquida de alta eficiência- espectroscopia de massa (CLAE-EM).

Tempo de Peso m/z Flavonoides retenção (min) Molecular [M+H] Luteolina 6-C-glicosídeo 5,67 448 449 (isoorientina) Luteolina 8-C-glicosídeo 6,07 448 449 (orientina) Apigenina 6-C- 7,01 432 433 glicosídeo (isovitexina) Podocarpusflavona A 12,76 552 553