Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociência Bruno Meirelles Paes INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR Macaé 2017 INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Profª. Drª. Juliana Montani Raimundo Bruno Meirelles Paes Macaé, 2017 Bruno Meirelles Paes INVESTIGAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DA Kielmeyera membranacea SOBRE A DISFUNÇÃO VASCULAR Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio de Janeiro para obtenção do grau de mestre em produtos e bioativos e biociências. Orientadora: Profª Drª Juliana Montani Raimundo Aprovada em 07/06/2017 BANCA EXAMINADORA __________________________________________________ Profa. Dra. Juliana Montani Raimundo (Orientadora) Campus UFRJ-Macaé __________________________________________________ Profa. Dra.Cintia Monteiro de Barros Campus UFRJ-Macaé ____________________________________________________ Prof. Dr. Leandro Louback da Silva Campus UFRJ-Macaé _____________________________________________________ Prof. Dr. Thiago da Silveira Álvares Campus UFRJ-Macaé Dedico esta conquista a todos os meus familiares, amigos e a todas as pessoas que me fazem felizes. AGRADECIMENTO Aos meus pais primeiramente, Moacyr e Alba. Sem o apoio, o incentivo ao estudo e o amor de vocês essa conquista não seria possível. Às minhas irmãs, Marina e Liana. Irmãos não servem apenas para brigar e sim, para apoiar, aprender e puxar as orelhas de vez em quando. Aos meus avós maternos, Wanilton e Alba. Com a calma, mimos, sabedoria, experiência e o amor de vocês. Aos meus avós paternos, Herval e Maria Francisca, também tenho mais além de agradecimentos. Apesar de não ter sido muito próximo do meu avô e minha avó ter falecido antes do meu nascimento, construíram de maneira perfeita os pilares de suas famílias e, um desses pilares, é o meu pai. A todos meus familiares que contribuíram de forma significativa para essa conquista. Destaco em especial aos meus tios, Mário, Luís Antônio, Paulinho e à minha única e preferida tia, Cida. Faço um agradecimento em especial à memória do meu tio Teté. Esse nos deixou no meio dessa jornada. Sempre foi um tio muito presente e incentivador aos estudos. À minha namorada Fernanda. Apesar de nos reencontramos no meio dessa jornada, foi essencial para o término da mesma através do seu amor, paciência e carinho. Aos meus amigos, em especial William, Reynaldo, Diego, Bruno Moraes, Jéssica Ladeira e Cinthya Maciel. Nessa trajetória de mestrado não houve tantas festas, bebedeiras e ressacas quanto no tempo de graduação, mas o apoio e a amizade de vocês foram essenciais para esta conquista. A todos os colegas que passaram e ficaram na minha vida nesse período do mestrado. A todos os amigos e colegas que fiz no LIP. Em especial à Cinthya Maciel, Millena Vidal e Letícia Ferreira. Todas vocês foram essenciais para essa conquista. Em especial à minha professora orientadora Juliana Montani. Pela calma, conhecimento, atitudes e paciência, mas muita paciência. E mais um pouco de paciência. Talvez mais um pouco de paciência. Pode ter certeza que o profissional que virei hoje, tirei um pouco de você. Aos professores que contribuíram de forma significativa para meu crescimento profissional e formação. À CAPES, pelo apoio financeiro. RESUMO Alterações vasculares morfológicas e funcionais, como estresse oxidativo e disfunção endotelial, são característicos das doenças cardiovasculares e seus fatores de risco. Sendo assim, há a necessidade de busca por novas substâncias capazes de atenuar e/ou prevenir a disfunção vascular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial farmacológico de produtos bioativos obtidos da espécie vegetal Kielmeyera membranacea (extrato hidroalcólico das folhas – EKM, frações e subfrações) na disfunção vascular. A atividade vasodilatadora e os efeitos na reatividade vascular na ausência e presença de disfunção vascular foram investigados em aortas isoladas de ratos Wistar preparadas para registro de tensão isométrica. O EKM provocou vasodilatação dependente do endotélio através da ativação da produção de óxido nítrico, com participação dos receptores de bradicinina B2 e de estrogênio ERα. A incubação de anéis de aorta com 25 mM de glicose por 2 h ou com 10 µM de pirogalol por 15 min resultou em aumento da contração induzida por fenilefrina e redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina. Quando a disfunção vascular foi induzida por glicose, o pré-tratamento com 3,5 µg/mL de EKM normalizou a reatividade à fenilefrina e restaurou parcialmente a vasodilatação em resposta à acetilcolina. No entanto, quando a disfunção vascular foi induzida por pirogalol, o EKM normalizou apenas a reatividade à fenilefrina. A fração butanólica do EKM provocou intenso relaxamento vascular e foi mais potente que as demais frações e o EKM. Entre os flavonoides identificados na fração butanólica, a orientina parece ser o principal envolvido no efeito vasodilatador. Palavras chave: Disfunção vascular, óxido nítrico, vasodilatação. ABSTRACT Functional and morphological vascular changes, such as oxidative stress and endothelial dysfunction, are characteristics of cardiovascular diseases and its risk factors. Therefore, there discovery of new substances capable of attenuating and/or preventing vascular dysfunction is needed. The aim of the present work was to investigate the pharmacological potential of bioactive products from Kielmeyera membanacea species (hydroalcoholic extract of leaves – EKM, fracions and subfractions) for vascular dysfunction. The vasodilatory activity and the effects on vascular reactivity in the absence and presence of vascular dysfunction were assessed in Wistar rat aortas prepared for isometric tension recording. EKM-induced vasodilation was endothelium-dependent and mediated through the activation of NO production, with the involvement of bradykinin B2 and estrogen ERα receptors. Incubation of aortas with either 25 mM glucose for 2 h or 10 µM pyrogallol for 15 mim, resulted in augmented vasoconstriction to phenylephrine and reduced vasodilation to acetylcholine. When vascular dysfunction was induced by glucose, pretreatment with 3.5 µg/mL of EKM normalized vascular reactivity to phenylephrine and partially restored vascular reactivity to acetylcholine. On the other hand, when vascular dysfunction was induced by pyrogallol, pretreatment with EKM only restored vascular response to phenylephrine. Butanol fraction of EKM induced intense vasodilation and exhibited higher potency when compared with the other fractions and EKM. Among the flavonoids isolated from butanol fraction, orientin seems to be the main metabolite involved in the vascular effects of EKM. Key words: Vascular dysfunction, nitric oxide, vasodilatation. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Mecanismo de vasodilatação causado pelo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) 21 Figura 2. Mecanismo potencial pelo qual fatores de risco cardiovascular levam ao estresse oxidativo e desacoplamento da eNOS 24 Figura 3. Registro representativo do teste para avaliação da integridade do endotélio 34 Figura 4. Registro típico da resposta contrátil a 10µL de fenilefrina seguido a exposição a concentrações crescentes e cumulativas do EKM em anéis de aorta com endotélio 37 Figura 5. Efeito vasodilatador do EKM em anéis de aorta com e sem endotélio 38 Figura 6. Envolvimento da via NO/GMPc no efeito vasodilatador do EKM 39 Figura 7. Envolvimento dos receptores muscarínicos e de bradicinina no efeito vasodilatador do EKM 40 Figura 8. Envolvimento da via PI3k/Akt e da ativação dos receptores de estrogênio no efeito vasodilatador do EKM 41 Figura 9. Efeitos do EKM na reatividade vascular à fenilefrina 42 Figura 10. Efeitos do EKM na reatividade vascular à acetilcolina 43 Figura 11. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por glicose 44 Figura 12. Efeitos do EKM na reatividade vascular na presença de disfunção vascular induzida por estresse oxidativo 46 Figura 13. Efeito vasodilatador das frações hexânica, em diclorometano, em acetato de etila e butanólica do extrato hidroalcoólicos das folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio 48 Figura 14. Efeito vasodilatador das subfrações 1, 2 e 4 da fração butanólica do extrato hidroalcoólico das folhas de K. membranacea em anéis de aorta com endotélio 50 Figura 15. Estrutura química das substâncias isoladas da subfração 2 da fração butanólica: orientina, isoorientina, vitexina e podocarpos flavona A 57 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Fracionamento cromatográfico da fração butanólica. 33 Tabela 2. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de 49 folhas de K. membranacea (EKM) e frações. Tabela 3. Concentração inibitória média (CI50) do extrato hidroalcoólico de 51 folhas de K. membranacea (EKM), da fração butanólica (Fr. BuOH) e suas subfrações. Tabela 4. Constituintes majoritários presentes nas subfrações da fração 51 butanólica de K. membranacea. LISTA DE ABRAVIATURAS E SIGLAS 2+ 2+ [Ca ]i – Concentração intracelular de Ca AcOEt – Acetato de etila AMPc – Adenosina monofosfato cíclico ou monofosfato de adenosina cíclico AMPK – Proteína quinase ativada pelo AMPc