Déformation Et Agrégation Sous Écoulement De Globules Rouges Et Vésicules En Microcanaux Luca Lanotte
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Déformation et agrégation sous écoulement de globules rouges et vésicules en microcanaux Luca Lanotte To cite this version: Luca Lanotte. Déformation et agrégation sous écoulement de globules rouges et vésicules en micro- canaux. Hématologie. Université de Grenoble; Università degli studi di Napoli Federico II, 2013. Français. NNT : 2013GRENY072. tel-01469764 HAL Id: tel-01469764 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01469764 Submitted on 16 Feb 2017 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. Università degli studi Federico II THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE préparée dans le cadre d’une cotutelle entre l’Université de Grenoble et l'Università degli Studi Federico II di Napoli Spécialité : Sciences physiques pour le vivant Arrêté ministériel : le 6 janvier 2005 -7 août 2006 Présentée par Luca LANOTTE Thèse dirigée par Lionel Bureau et Chaouqi Misbah codirigée par Stefano Guido préparée au sein des Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (Grenoble) et Dipartimento di Ingegneria Chimica (Napoli) dans l' École Doctorale de Physique Déformation et agrégation sous écoulement de globules rouges et vésicules en microcanaux Thèse soutenue publiquement le 17 mai 2013, devant le jury composé de : Mme Elisabeth CHARLAIX Professeur, Grenoble (Présidente du jury) Mme Giovanna TOMAIUOLO PhD, Département d'Ingégnerie Chimique, Naples (Examinatrice) M. Abdul BARAKAT Directeur de recherche CNRS, Palaiseau (Rapporteur) M. Andy SALMON MRC clinician scientist, Bristol (Rapporteur) M. Lionel BUREAU Chargé de recherche CNRS, Grenoble (Co-directeur de thèse) M. Chaouqi MISBAH Directeur de recherche CNRS, Grenoble (Co-directeur de thèse) Université Joseph Fourier / Université Pierre Mendès France / Université Stendhal / Université de Savoie / Grenoble INP Deformation and aggregation of red blood cells and vesicles flowing in microchannels Ing. Luca Lanotte PhD in Chemical Engineering { XXV Ciclo Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Industriale Universit`aFederico II di Napoli PhD in Physics Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy) Universit´eJoseph Fourier de Grenoble Vinci Program 2010{13 2 Deformation and aggregation of red blood cells and vesicles flowing in microchannels Ing. Luca Lanotte Dottorato in Ingegneria Chimica { XXV Ciclo Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Industriale Universit`aFederico II di Napoli Tutor Prof. Stefano Guido Doctorat en Physique Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy) Universit´eJoseph Fourier de Grenoble Tutors Dr. Lionel Bureau and Dr. Chaouqi Misbah Vinci Program 2010{13 2 3 Wisdom is brilliant, she never fades. By those who love her, she is readily seen, by those who seek her, she is readily found. She anticipates those who desire her by making herself known first. Whoever gets up early to seek her will have no trouble but will find her sitting at the door. Meditating on her is understanding in its perfect form, and anyone keeping awake for her will soon be free from care. (Wisdom 6, 12{15) La sapienza `eradiosa e indefettibile, facilmente `econtemplata da chi l'ama e trovata da chiunque la ricerca. Previene, per farsi conoscere, quanti la desiderano. Chi si leva per essa di buon mattino non faticher`a, la trover`aseduta alla sua porta. Riflettere su di essa `eperfezione di saggezza, chi veglia per lei sar`apresto senza affanni. (Sapienza 6, 12{15) La Sagesse est resplendissante, elle est inalt´erable. Elle se laisse ais´ementcontempler par ceux qui l'aiment, elle se laisse trouver par ceux qui la cherchent. Elle devance leurs d´esirsen se montrant `aeux la premi`ere. Celui qui la cherche d`esl'aurore ne se fatiguera pas: il la trouvera assise `asa porte. Ne plus penser qu'`eelle prouve un parfait jugement, et celui qui veille en son honneursera bient^otd´elivr´edu souci. (Sagesse 6, 12{15) 4 Abstract Italian version I globuli rossi (GR) rivestono un ruolo fondamentale nell'espletamento delle funzioni fisiologiche all'interno del corpo umano. Nel microcircolo, ad esem- pio, dove fluiscono in capillari dal diametro inferiore o, comunque, parago- nabile alle loro stesse dimensioni, gli eritrociti sono responsabili dello scam- bio di ossigeno e sostanze nutritive tra il sangue ed i tessuti. Il rilascio di gas, secondo il parere pressocch´eunanime della comunit`ascientifica, si ver- ifica grazie alla intima interazione tra i GR e l'endotelio che riveste i vasi sanguigni. E` stato, inoltre, provato in numerosi lavori scientifici come dis- funzioni nelle propriet`adei globuli rossi e il danneggiamento del tessuto en- doteliale, in particolare dello strato glicoproteico che lo ricopre (glycocalyx), siano la causa principale di malattie vascolari molto diffuse oggigiorno, come la trombosi, il diabete, l'aterosclerosi. Lo studio del comportamento dei globuli rossi nel sistema microvascolare ha assunto, dunque, un'importanza sempre maggiore nel mondo della ricerca. La conoscenza delle propriet`a meccaniche e reologiche che consentono agli eritrociti di deformarsi e or- ganizzarsi in aggregati all'interno dei vasi, per esempio, consentirebbe di comprendere a pieno i meccanismi che governano il flusso sanguigno e, di conseguenza, facilitare la diagnosi di stati patologici. In questo lavoro di tesi l'attenzione `efocalizzata essenzialmente su due argomenti: l’aggregabilit`adei globuli rossi durante il flusso in capillari e la funzione del glycocalyx endoteliale nel microcircolo. La formazione di treni di eritrociti all'interno di vasi di piccole dimensioni (diametro ≤ 20 µm) `e del tutto normale all'interno del corpo umano e favorisce la coagulazione del sangue in caso di danneggiamento dei tessuti. L'alterazione del normale fenomeno di aggregazione dei GR, per`o,pu`oportare all'insorgere di patologie diffuse quanto dannose, come la trombosi. Per quanto l'argomento sia at- tuale e di rilevante interesse scientifico, un'analisi quantitativa del fenomeno di formazione di aggregati di globuli rossi (cluster) non `eancora stata ef- fettuata. Nella prima fase di tale progetto di dottorato, dunque, presso il laboratorio Chemems del Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Mate- riali e della Produzione Industriale di Napoli, sono stati condotti esperi- menti in vitro su sospensioni di eritrociti, con ematocrito attorno al 10%, 5 6 per osservare la tendenza dei GR ad aggregarsi durante il moto in tubi in silica di diametro micrometrico (≈ 10 µm). E` stata verificata questa attitu- dine in funzione del battente di pressione imposto e del tempo di residenza all'interno di segmenti di microcapillari, misurando la lunghezza degli ag- gregati e la loro composizione in numero. La campagna sperimentale `estata mirata a comprendere quale sia il tipo di interazione che si verifica tra le cellule componenti un cluster: si tratta di un'interazione di tipo puramente idrodinamico o intervengono anche forze di altra natura? Dai risultati sper- imentali appare chiaro come la vera forza spingente del fenomeno sia la pressione imposta nei microtubi La visione pi`uprecisa del fenomeno, grazie ad un approccio microfluidico, consente di gettare le basi per la proget- tazione e la successiva messa a punto di dispositivi clinici atti a monitorare l’aggregabilit`aeritrocitaria a fini diagnostici, su sangue sano, ma anche in corrispondenza di stati infiammatori, ad esempio. La seconda parte del progetto `estata effettuata in collaborazione tra il Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e della Produzione Indus- triale di Napoli ed il Laboratoire Interdisciplinaire de Physique di Grenoble. E` stata effettuata una campagna sperimentale su microcapillari in vetro rivestiti da polymer brush, al fine di simulare le condizioni in vivo nel mi- crocircolo. Si `everificato come la presenza di strati (layer) polimerici alteri non solo le propriet`aidrodinamiche del flusso nei microtubi trattati, ma anche quelle dinamiche dei globuli rossi circolanti al loro interno. E` sta- bilito con certezza che il lumen dei vasi sanguigni `erivestito da uno strato di glicopolimeri (glycocalyx) legati alla membrana delle cellule endoteliali che ricoprono le loro pareti. La conoscenza del ruolo idrodinamico del layer in questione sarebbe molto utile per (i) comprendere come le disfunzioni o i danneggiamenti del glycocalyx siano coinvolti in patologie vascolari (ad esempio l'aterosclerosi) e (ii) al fine di sviluppare test basati sulla microflu- idica, in grado di rappresentare correttamente le interazioni tra pareti e componenti del sangue. I polymer brush, per la loro spiccata attitudine a modificare le propriet`achimico-fisiche delle superfici ed alterare il flusso in ambito micro e nanofluidico, rappresentano una opzione logica, allo scopo di riprodurre l’effetto del glycocalyx all'interno dei vasi nel microcircolo e le interazioni tra catene polimeriche e globuli rossi. Layer nanometrici di polyhydroxyethylmethacrylate (pHEMA) sono stati prodotti attraverso cosiddetta tecnica grafting-from e, dopo accurata caratterizzazione, utiliz- zati per rivestire le superfici interne di capillari