De La Lutte Biologique À L'invasion : La Coccinelle Harmonia Axyridis

Délivré par le Centre international d’études supérieures en sciences agronomiques Montpellier Préparée au sein de l’école doctorale :

Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences et Environnement (SIBAGHE)

Et de l’unité mixte de recherche : Centre de Biologie pour la Gestion des Populations (CBGP)

Spécialité : Evolution, Ecologie, Ressources Génétiques, Paléontologie

De la lutte biologique à l’invasion : la coccinelle Harmonia axyridis

comme espèce modèle.

Présentée par : Ashraf TAYEH

Soutenue le 17 décembre 2013 devant le jury composé de

Patrice David : Directeur de recherche, CNRS-Montpellier (France) Président Marc Kenis : Directeur de recherche, CABI- Delemont (Suisse) Examinateur Alain Roques : Directeur de recherche, INRA-Orléans (France) Rapporteur François Verheggen : Professeur, Université de Liège (Belgique) Rapporteur Arnaud Estoup : Directeur de recherche, INRA-Montpellier (France) Directeur Benoit Facon : Chargé de recherche, INRA Montpellier (France) Co-Directeur

Délivré par le Centre international d’études supérieures en sciences agronomiques Montpellier Préparée au sein de l’école doctorale :

Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences et Environnement (SIBAGHE)

Et de l’unité mixte de recherche : Centre de Biologie pour la Gestion des Populations (CBGP)

Spécialité : Evolution, Ecologie, Ressources Génétiques, Paléontologie

De la lutte biologique à l’invasion : la coccinelle Harmonia axyridis

comme espèce modèle.

Présentée par : Ashraf TAYEH

Soutenue le 17 décembre 2013 devant le jury composé de

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Un jour, je serai ce que je veux être.

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Sur cette terre, il y a ce qui mérite vie : sur cette terre, se tient la maîtresse de la terre, mère des préludes et des épilogues. On l’appelait Palestine. On l’appelle désormais Palestine.

Mahmoud Darwich

Remerciements

Mes remerciements vont en premier lieu à les stagiaires Léa, Elsa et Imad et les techniciens Arnaud Estoup et Benoit Facon pour les années Bruno et Anne. passées sous leur direction durant cette thèse. Je tiens également à adresser un grand merci à J’aurais appris énormément à vos côtés, que ce soit Guillaume avec qui j’ai partagé ces trois ans de thèse aux niveaux scientifique, technique, et humain. et en particulier les périodes de rédaction et le travail Merci de m’avoir fait profiter de votre expérience et de week end (merci pour tout). de votre pédagogie pour me transmettre une partie Je tiens à remercier très chaleureusement les de votre savoir. Je vous suis profondément gens qui m’ont aidé pendant les échantillonnages de reconnaissant de votre présence et votre disponibilité la petite coccinelle, en particulier Gérald et Shady. tout au long de mes travaux. Cette dernière année a Un grand merci également à toutes les personnes été très stimulante, notamment durant la phase avec qui j’ai pu interagir et discuter de mes résultats d’écriture de ce mémoire, et cela grâce à vous. en particulier Simon et Denis. Il serait illusoire de tenter d’établir une liste des Je tiens également à remercier Patrice David, chercheurs, techniciens ou étudiants du CBGP avec Marc Kenis, Alain Roques et François Verheggen qui j’ai passé de très bons moments au fil de ces d’avoir accepté d’évaluer mon travail en participant à dernières années. Donc merci à tout le CBGP, mon jury de thèse. notamment Alexandre, Philippe, Mathieu, Raphael Les membres de mon comité de thèse, Denis Jean-Pierre, Réjane, Nathalie, Sophie, Anne-Laure, Bourguet, Nicolas Ris, Julien Foucaud, Eric Marie, Caroline, Marie-Pierre … et aussi Adrien et Lombaert et Elodie Chapuis m’ont été d’une grande Bertrand, fondateurs de la Coupe du Monde aide et je leur en suis très reconnaissant. montpelliéraine de Ping-Pong et de l’équipe de Un merci tout particulier à Anne Loiseau, volley du CBGP. Merci à vous tous. Maxime Galan, Eric Bazin, Gaël Kergoat et (encore Je souhaite également remercier l’équipe BPI de lui) Julien Foucaud pour leurs efforts de correction l’INRA de Sophia-Antipolis, en particulier Eric et de mon français durant la rédaction de ce mémoire. Thomas avec qui j’ai interagi plus particulièrement, mais également Nicolas et Thibaut qui m’ont Je n’oublie pas Emmanuelle Jousselin, Armelle accueilli durant 3 semaines dans leur laboratoire. Cœur d’Acier et Gauthier Dobigny avec qui j’ai eu la J’ai également une pensée chaleureuse pour mes chance de travailler avant de débuter mes travaux sur camarades, Tareq, Anis, Mahmoud, Muiz, Ahed, Harmonia. Habash, Azzam, Raed, Mousleh, Hadeel, Nebal, J’ai également une pensée chaleureuse pour Soumaya, Salma, et Essya, ……. toutes les personnes qui ont partagé avec moi le Merci enfin aux collaborateurs qui ont permis de grand bureau B1.14. du CBGP et en particulier compléter mon échantillonnage pour ce travail, ainsi Olivier et Emmanuel avec qui j’ai cohabité durant que Julie Turgeon et Ruth Hufbauer. mes deux premières années de thèse et Nadine et Je suis sûr que nos interactions et notre amitié Marion qui leur ont succédé. perdureront bien au delà de cette thèse. Merci à toutes les personnes qui ont travaillé de manière plus temporaire avec moi et en particulier

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE

I. Lutte biologique et invasion biologique. 1. Lutte biologique………………………………………………………………………………………………………..15 2. Invasion biologique…………………………………………………………………………………………………..19 II. Impacts écologiques et socio-économiques de la lutte biologique et des invasions biologiques. 1. Lutte biologique …………………………………………………………………………………………..…………..22 2. Invasion biologique…………………………………………………………………………………………………..24 III. Principaux processus évolutifs en jeux dans les contextes de lutte et d’invasion biologique. 1. Processus évolutifs liés aux introductions accidentelles (bioinvasions) ou volontaires (lutte biologique)……………………………………………………………………………………..……………….27 2. Processus évolutifs liés à la domestication (phase d’élevage en lutte biologique)…………29 IV. Modèle biologique étudié au cours de cette thèse: la coccinelle asiatique Harmonia axyridis. 1. Biologie ……………………………………………………………………………………………………………….…..31 2. Utilisation en lutte biologique…………………………………………………………………………..……….33 3. Répartition géographique……………………………………………………………………………....…….…..35 4. Impacts écologiques et socio-économiques de la coccinelle asiatique………………...……….37 5. Etat des connaissances en écologie et biologie évolutive……………………………………..……..41 V. Objectifs et structure de la thèse……………………………………………………………………………..……42

CHAPITRE I : Populations de lutte biologique : évolution en conditions d’élevage et impacts potentiels sur les populations envahissantes.

I. Objectifs…………………………………………………………………………………………………………….…….47

II. Principaux résultats…………………………………………………………………………………………...... 47

III. Conclusion……………………………………………………………………………………………………………….50

IV. Articles associés………………………………………………………………………………………………………50 Article 1…………………………………………………………………………………..……………………………....51 Evolution in biocontrol strains: insight from the harlequin ladybird Harmonia axyridis.

Article 2…………..………………………………………………………………………………………………….…..61 Experimental evidence for the phenotypic impact of admixture between wild and biocontrol Asian ladybird (Harmonia axyridis) involved in the European invasion. Article 3……. ……………………………………………………………………………………………………………73 Cannibalism in invasive, native and biocontrol populations of the harlequin ladybird.

CHAPITRE II : Evolution des stratégies de vie dans les différents compartiments (natif, envahissant américain, envahissant européen et lutte biologique) de la coccinelle asiatique Harmonia axyridis.

I. Introduction…………………………………………………………………….……….……………………………103 II. Matériel et Méthodes ……………………………………………………………………………………………105 III. Analyses statistiques ……………………………………………………………………………………………109 IV. Résultats………………………………………………………………………………………….…………………….111

1. Analyse factorielle discriminante (AFD)………………………………………………………………111

2. Analyse de variance (ANOVA)………………………………………………………………..……………111

3. Corrélations entre traits …………………………………………………………………………..………...119 V. Discussion………………………………………………………………………………………………………....…..121

1. Comparaison entre les différents compartiments populationnels…………….…………121

2. Différentes variables étudiés chez H. axyridis …………………………………………………....122

3. Corrélations entre traits……………………………………………………………… .………….………123

Chapitre III: Etude d’un trait phénotypique clef : la résistance au froid

I. Introduction………………………………………………………………………………………………….………127

II. Déterminisme génétique de la résistance au froid……………………………………..………..129

1. Expérience 1: Croisements populationnels…………………………………………………..……..….129

1.1 Attendus théoriques…………………………………………………………………………………....129

1.2 Protocole expérimental………………………………………………………………………………..131

1.3 Analyses statistiques……………………………………………………………………………..……..133

1.4 Résultats et discussion ………………………………………………………………………………...135 2. Expérience 2 : Tests basés sur un protocole en familles…………………………………..………137 2.1 Attendus théoriques…………………………………………………………………………….………139

2.2 Protocole expérimental………………………………………………………………………………..129

2.3 Analyses statistiques…………………………………………………………………………..………..141

2.4 Résultats et discussion………………………………………………………………………………....141

3. Des différences inattendues entre les deux expériences réalisées……………………………141

III. Expérience 3 : études complémentaires de l’effet du statut d’accouplement sur la survie au froid et sur la capacité de reproduction post-stress.

1. Protocole expérimental…………………………………………………………………………………………147

2. Analyses statistiques …………………………………………………………………………….………………149

3. Résultats……………………………………………………………………………………………………..………..151

4. Discussion…………………………………………………………………………………………………………….153

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

I. Syndrome de la lutte biologique …………………………………………………………….………….…157

II. Lutte biologique et invasion………………………………………………………………………………....160

III. Etudier la diapause plutôt que la résistance au froid chez H. axyridis…………………163

BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………………………….169

ANNEXE.

Article 1…………………………………………………………………………………………….…………………179 Inbreeding depression is purged in the invasive insect Harmonia axyridis.

Article 2………………………………………………………………………………………….……………………187

Investigating the genetic load of an emblematic invasive species: the case of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis.

Article 3……………………………………………………………………………………………………………….197

Increase in male reproductive success and female reproductive investment in invasive populations of harlequin ladybird Harmonia axyridis.

INTRODUCTION GENERALE

Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux variations des traits d’histoire de vie présentes dans différentes populations de la coccinelle asiatique Harmonia axyridis représentants trois compartiments évolutifs caractérisés par des histoires démographiques et des pressions sélectives potentiellement différentes : le compartiment populationnel « natif » correspondant à l’aire native de l’espèce, le compartiment populationnel « envahissant » correspondant à l’aire récemment envahie par cette espèce et le compartiment « domestique » correspondant aux populations élevées en laboratoire dans un but de lutte biologique. Cette introduction générale est structurée autour de cinq parties : (i) une première partie décrivant quelques définitions clefs et principes généraux concernant à la fois la lutte biologique et les invasions biologiques ; une deuxième partie s’intéressant aux impacts écologiques et socio- économiques de la lutte biologique et des invasions biologiques ; une troisième partie précisant les principaux processus évolutifs en jeux dans des contextes de lutte et d’invasion biologique ; une quatrième partie consacrée au modèle biologique étudié au cours de cette thèse, la coccinelle asiatique H. axyridis ; et enfin une cinquième partie précisant les objectifs et structure de la thèse.

I. Lutte biologique et invasion biologique

1. Lutte biologique

1.1 Définition

La lutte biologique est une méthode de lutte contre des espèces nuisibles par l’utilisation d’une autre espèce qui agit par prédation ou parasitisme (Boivin, 2001). Elle correspond donc à l’utilisation d’organismes vivants dans le but de contrôler ou limiter des ravageurs et des pathogènes des cultures (Altieri et al., 2005; Eilenberg et al., 2001; Jourdheuil et al., 2002). La lutte biologique a pour objectif de diminuer l’utilisation des produits chimiques de type pesticides, fongicides et herbicides en agriculture en favorisant l’utilisation d’ennemis naturels, appelé alors auxiliaires, pour défendre les cultures. Les agents majeurs de la lutte biologique peuvent être des arthropodes (prédateurs et parasitoïdes), des nématodes et des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons (Altieri et al., 2005; Boller et al., 2004; Eilenberg et al., 2001). Certains auteurs considèrent également que certains vertébrés, comme les poissons ou les oiseaux, peuvent rentrer dans cette catégorie (Brown, 2004; Raymond, 1992).

1.2 Grands types de lutte biologique

On reconnaît classiquement différentes stratégies de lutte biologique : la lutte biologique par acclimatation, la lutte biologique sans acclimatation (par inondation ou inoculation), et enfin la lutte biologique par conservation (Boivin, 2001; Van Driesche & Bellows, 1996; Vincent & Coderre, 1992; Winkler, 2005).

1.2.1 Lutte biologique par acclimatation

La lutte biologique par acclimatation, appelée aussi lutte biologique classique, est la stratégie la plus ancienne. Le but de cette approche est de lutter contre les ravageurs exotiques en important leurs prédateurs, parasites ou pathogènes naturels depuis leur zone d’origine (Greathead, 1995). Le principe consiste à introduire intentionnellement un nouvel auxiliaire exotique dans l’environnement, dans le but d’un établissement permanent et du contrôle à long terme du ravageur. Par exemple, le prédateur australien Rodolia cardinalis Mulsant (Coleopera, Coccinellidae) a été introduit en Californie en 1888 pour lutter contre la cochenille australienne Icerya purchas (Roy & Wajnberg, 2008). L’établissement de ce prédateur en Amérique a permis de contrôler le ravageur sans utiliser de pesticides. En France, l’hyménoptère Coccobius fulvus (Hymenopera, Aphelinidae) originaire de Chine a été introduit pour lutter contre la cochenille japonaise des agrumes. Il existe de nombreux autres exemples d’entomophages acclimatés en France (Malausa et al., 2008).

1.2.2 Lutte biologique sans acclimatation

On peut distinguer deux stratégies de lutte biologique sans acclimatation : l’inondation ou l’inoculation. Ce type de lutte a pour avantage un effet non permanent qui évite l’introduction d’auxiliaire qui pourrait s’installer durablement dans l’environnement.

a) Lutte biologique par inondation

Le but principal de ce type de lutte est de libérer intentionnellement en nombre important d’auxiliaires. Elle vise un contrôle rapide du ravageur par les auxiliaires directement lâchés sur la culture afin de contrôler les ravageurs (Eilenberg et al., 2001). Par exemple en France, la lutte contre la pyrale Ostrinia nubialis peut être réalisée par la production et le lâcher en masse de l’auxiliaire Trichogramma maïdis dans les champs de maïs (Frandon & Kabiri, 1999). Ce type de lutte peut également être utilisé dans des systèmes agricoles fermés comme les serres (Winkler, 2005).

b) Lutte biologique par inoculation

Le principe de ce type de lutte est le même que la lutte par inondation à la différence que les auxiliaires vont se reproduire et se multiplier pendant une période définie et finie (Eilenberg et al., 2001). Les descendants des individus lâchés peuvent donc contrôler la population de ravageurs sur une période de temps plus importante sans pour autant s’installer durablement. Ce type de lutte est principalement utilisé en serre. Par exemple Encarsia formosa est utilisé à grande échelle dans les serres depuis plusieurs dizaines d’années pour lutter contre l’aleurode (Eilenberg et al., 2001; Van Lenteren, 2000).

1.2.3 Lutte biologique par conservation

Ce type de lutte repose sur notre capacité à manipuler l’habitat ou de modifier l’agrosystème (Hance, 2001). Ces manipulations ont pour but de protéger et d’augmenter les populations d’ennemis naturels locaux dans le but de faciliter leur capacité à contrôler les ravageurs des cultures. Ce type de lutte nécessite d’identifier les conditions essentielles pour la survie et la multiplication des ennemis naturels locaux. Par exemple, grâce à de nombreuses mesures réglementaires qui favorisent la gestion des habitats naturels telles que des zones refuges, des bandes enherbées ou des haies de bordure, le cycle de vie des Chrysopes (Chrysoperla spp) au sein des agroécosystèmes a été favorisé et leur effectif a ainsi été augmenté, ce qui devrait favoriser la lutte contre les pucerons (Villenave & Rat-Morris, 2008). Pour le moment, ce type de lutte biologique le moins développé (Wajnberg & Ris, 2009).

1.3 Harmonia axyridis en lutte biologique

En ce qui concerne l’utilisation de la coccinelle asiatique H. axyridis comme agent de lutte biologique essentiellement contre les pestes du type pucerons, il semblerait que les opérations de lutte biologique aient correspondu à deux objectifs différents : (i) soit un objectif d‘acclimatation, comme en Amérique du Nord (Caltagirone, 1989), et en France (Ferran et al., 1997). (ii) soit un objectif de non-acclamation et plus précisément d’inondation, comme en Asie (Seo & Youn, 2000), en Europe (Trouve et al., 1997), et en Amérique du Nord (LaRock & Ellington, 1996). Cependant, l’histoire et les objectifs de de ces introductions volontaires restent contreversés chez cette espèce et varie selon les auteurs consultés.

Tableau 1 : Quelques définitions d’espèces envahissantes dans la littérature.

Espèce explosant démographiquement dans un pays différent de son pays d’origine, principalement Elton, 1982 transportée par l’homme, avec de graves impacts écologiques. Espèce qui, habituellement transportée intentionnellement ou non par l’homme, colonise et s’étend dans Di Castri, 1990 de nouveaux territoires éloignés de son territoire d’origine.

Williamson, 1996 Espèce qui augmente son aire de répartition

Espèce qui réussit à s’installer dans un nouvel environnement et devient agressive, en entraînant des Mooney &t Hobbs 2000 pertes de biodiversité ou en modifiant le fonctionnement des écosystèmes. Espèce (i) présente dans un nouvel environnement grâce à l’action humaine, (ii) qui s’y reproduit et y maintient une population viable sans intervention humaine, (iii) qui s’y étend spatialement, souvent Richadson et al., 2000 grâce à une augmentation démographique, et (iv) qui n’a pas nécessairement d’impact important sur le fonctionnement des écosystèmes. Davis & Thompson, 2000 Espèce, native ou introduite, qui colonise un nouvel environnement et y a un large impact

Kolar & Lodge, 2001 Espèce non-indigène qui s’étend à partir de son point d’introduction et devient abondante.

Espèce transportée dans une nouvelle région par un vecteur et qui s’y établit, s’y étend et y devient Colautti & Maclsaac, 2004 démographiquement dominante. Espèce qui se disperse hors d’un environnement donneur et s’établit dans un nouvel environnement, ou Vermeji, 2005 ses performances accrues se traduisent souvent par une abondance plus grande et un rôle écologique plus important que dans son environnement d’origine. Espèce présente en-dehors de son aire de distribution passée et hors de portée de ses capacités de Falk-Petersen et al., 2002 dispersion, transportée par l’homme dans une nouvelle aire ou elle s’établit et s’étend dans l’espace.

2. Invasion biologique

2.1 Définition

La fréquence des invasions biologiques augmente significativement avec le développement des échanges commerciaux, qui tendent à supprimer les barrières naturelles et ainsi faciliter la migration des espèces. Ce phénomène d’introduction d’espèces exotiques hors de leur aire de répartition d’origine est d’autant plus une préoccupation majeure que l’on assiste à une véritable « crise mondiale de la biodiversité » (IUCN, 2000). En effet, les différentes études faites sur les espèces envahissantes (végétales ou animales) indiquent qu‘elles participent aux changements environnementaux globaux et qu’elles sont considérées comme l’une des causes les plus importantes de l’extinction d’espèces, juste après la destruction des habitats (Clavero & Garcia-Berthou, 2005; Simberloff, 2005; Vitousek et al., 1997; Williamson, 1999). Les organismes pouvant devenir envahissants sont des animaux vertébrés ou invertébrés ainsi que des plantes et des micro-organismes. N'importe quel organisme est probablement capable de devenir invasif s’il se trouve dans une nouvelle zone géographique ayant des caractéristiques favorables à son développement.

Depuis la publication de Charles Elton parue en 1958, « The Ecology of Invasions by Animals and Plants », il existe plusieurs définitions de l’invasion biologique (e.g. Williamson & Fitter, 1996, Valery et la., 2008 et tableau 1). Selon l’union internationale pour la conservation de la nature (IUCN) : « une espèce envahissante est une espèce exotique qui s’implante dans un écosystème ou un habitat naturel ou semi-naturel, qui induit des changements et menace la diversité biologique endémique » (Shine et al., 2000).

2.2 Différentes phases d’une invasion

Le processus invasif dépend de trois phases majeures: l’introduction, l’établissement et enfin, la prolifération (Duncan et al., 2003; Kolar & Lodge, 2001; Williamson & Fitter, 1996). Le passage d’une phase à une autre correspondant au franchissement de plusieurs types de barrières (Colautti et al., 2004; Richardson et al., 2000; Sakai et al., 2001) (Figure 1). On retrouve ces trois phases lors de l’introduction d’un agent de lutte biologique hors de son aire d’origine (lutte biologique classique).

Figure 1 : Représentation schématique des différentes phases d’une invasion biologique.

Note : l’introduction d’organismes exotiques dans un cadre de lutte biologique suit des étapes similaires.

2.2.1 Introduction

La première phase de processus d’invasion biologique est l’introduction. Les individus introduits issus de l’aire d’origine de la population doivent survivre durant le transport et être introduits dans leur nouveau territoire. Cette étape du processus d’invasion, très liée aux activités humaines (Lockwood, 1999), correspond au franchissement des barrières géographiques (Richardson et al., 2000). Cette phase d’introduction peut correspondre à plusieurs patrons, parmi lesquels, on compte la dispersion par corridor, la dispersion à très longue distance, la dispersion de masse et l’introduction volontaire (voir Wilson et al., 2009).

2.2.2 Établissement

La deuxième phase du processus d’invasion biologique est l’établissement, qui correspond au franchissement de deux barrières écologiques. Les individus introduits doivent tout d’abord survivre dans leur nouvel environnement. Ensuite ils doivent être capables de se reproduire naturellement (Richardson et al., 2000b). Lorsqu’une espèce introduite a réussi à s’établir avec succès, on parle alors de « naturalisation » de l’espèce (Richardson et al., 2000). Cette phase est très sensible, beaucoup d’espèces introduites dans des environnements peu adaptés ne survivent pas en raison des nouvelles pressions abiotiques et/ou biotiques auxquelles elles sont soumises (Maron & Vila, 2001). D’après Williamson & Fitter (1996) il est généralement admis qu’environ une seule espèce sur 1000 devienne réellement envahissante.

2.2.3 Prolifération

La dernière phase du processus d’invasion est la prolifération, qui est caractérisée par une explosion démographique et une expansion géographique des populations naturalisées dans leur nouvel environnement. Après une première phase de colonisation dans des milieux anthropiques (ex : milieu agricole) ou milieux naturels, on observe souvent une expansion spatiale très rapide (Duncan et al., 2003; Richardson et al., 2000; Williamson & Fitter, 1996). Cette dernière phase correspond à une capacité de franchissement des barrières démographiques (croissance et dispersion) (Kowarik, 1995; Sakai et al., 2001)

II. Impacts écologiques et socio-économiques de la lutte biologique et des invasions biologiques

1. Lutte biologique

La lutte biologique peut avoir plusieurs impacts négatifs et/ou positifs sur l’écosystème et au niveau socio-économique.

1.1 Effets positifs

L’utilisation de la lutte biologique pour protéger les cultures a augmenté depuis quelques dizaines d’années. D’après Van Lenteren (2000), on tire plusieurs avantages à utiliser le contrôle biologique plutôt que le traitement chimique. Les traitements chimiques sont devenus moins efficaces ou impossibles pour certains ravageurs qui présentent des formes de résistance. De plus, les pesticides doivent être utilisés chaque saison, à raison d’une application plusieurs fois par saison, avec tous les risques éventuels que cela comporte, notamment en termes d’impact sur l’environnement et/ou sur la santé humaine. Ces traitements ont également un impact important au niveau économique (Malausa, 2000b). A l’inverse des produits phytosanitaires, la lutte biologique ne nécessite pas de période de sécurité entre son application et la récolte. De plus, ce mode de protection des cultures bénéficie d’une opinion favorable auprès du grand public qui la relie à l’agriculture biologique. Ainsi, la lutte biologique contre les prédateurs des cultures représente une alternative séduisante à la lutte chimique sur les plans environnemental, économique et sociétal (Van Lenteren et al., 1997).

1.2 Effets négatifs

L’introduction d’un nouvel auxiliaire exogène comme agent de lutte biologique dans un nouveau milieu peut également avoir des conséquences indésirables sur l’environnement. Cet auxiliaire exotique peut, par exemple persister et proliférer dans l’environnement où il est introduit (Lynch & Thomas, 2000). Les conséquences sur leurs nouveaux territoires et écosystèmes de ces introductions peuvent être directes ou indirectes (voir ci-dessous Malausa , 2000, Van Lenterenet al., 2003). Bien que ces risques soient surtout présents dans le cas de la lutte biologique classique, ils existent aussi dans la lutte biologique par inondation si celle- ci utilise des organismes exotiques, notamment lors d’établissements imprévus (Van Lenteren et al., 2003).

1.2.1 Impacts directs

Parmi les effets négatifs, on peut noter :

(i) l’impact sur les polyphages non-cibles : la libération d’agents de lutte biologique peut en effet affecter l’abondance d’espèces non-cibles dans les écosystèmes (Howarth, 1991; Simberloff & Stiling, 1996). On peut citer l’exemple de l’introduction de populations de mangoustes d’origine indienne pour combattre les rats dans les plantations de canne à sucre à Trinidad et dans différentes îles des Antilles. Bien qu’une réduction importante des populations de rats ait été observée, les mangoustes ont eu un impact dramatique sur des espèces indigènes. Ce prédateur a ainsi contribué au déclin d’espèces d’oiseaux et à l’extinction de serpents et de lézards endémiques sur plusieurs îles des Caraïbes (Malausa, 2000b).

(ii) Un impact négatif peut également être observé par propagation/transmission de pathogènes. En effet, l’ennemi naturel peut dans certain cas être le vecteur de pathogènes et ainsi provoquer leur propagation dans l’environnement (Van Lenteren et al., 2003). La transmission de pathogènes relève cependant plus du cas particulier en comparaison avec le l’effet négatif précédemment évoqué.

1.2.2 Impacts indirects

Parmi les effets négatifs indirects, on peut citer :

(i) l’impact par la compétition ou la prédation intraguilde. L’agent de lutte biologique va attaquer et réduire la population de phytophages. Ainsi cet agent peut affecter alors négativement d’autres ennemis naturels qui se nourrissent de cette même ressource alimentaire. Lorsque l’agent de lutte biologique et les autres ennemis naturels exploitent une même ressource, il se peut que seule une de ces espèces survive. On peut citer comme exemple les études menées en Australie et en Nouvelle-Zélande à la suite de l’introduction de l’hyménoptère Braconide Microctonus aethopodes pour lutter contre le charançon Sitona discoidens (Aeschlimann, 1995). On peut également citer le crapaud géant Bufo marinus en Australie qui a été introduit pour combattre les insectes dans les plantations de canne à sucre. Il est vite devenu un prédateur vorace des espèces endémiques d’insectes, menaçant ainsi d’autres prédateurs utiles comme les lézards, les serpents et les petits mammifères (Shine et al., 2000). D’autres travaux (Duan et al., 1996) ont à l’inverse montré un impact relativement

limité sur les espèces indigènes vis à vis de l’introduction accidentelle de parasites exogènes contre les mouches des fruits (Diptères, Tephritidae) à Hawaii (Malausa, 2000b).

(ii) Un autre mécanisme entrainant un effet négatif est l’hybridation entre des agents de lutte biologique et des biotypes indigènes. La libération d’agents de lutte biologique peut conduire par hybridation à des changements génétiques des populations présentes dans l’écosystème, ainsi qu’induire des changements de dynamique populationnelle au cours de l’expansion spatiale des individus envahissants. Ainsi, de nombreuses introductions intentionnelles ou non intentionnelles de plantes et d’animaux phytophages ont eu, via l’hybridation, des conséquences néfastes pour les espèces indigènes apparentées et plus généralement l’environnement (Van Lenteren et al., 1997).

2. Invasion biologique

2.1 Effets positifs

L’introduction d’espèces animales ou végétales hors de leur aire d’origine est étroitement liée à l’histoire de la civilisation et s’avère un facteur de développement clef de ces civilisations (Kowarik, 1995). L’Homme a accéléré et amplifié cette dynamique en introduisant de nouvelles espèces dans son milieu de vie ou en emportant avec lui des espèces domestiques depuis le développement de l’agriculture et de l’élevage. On peut citer par exemple l’introduction de bovins et d’autre animaux domestiques en Australie, en Argentine et dans le Nord-Ouest du continent américain (Shine et al., 2000).

2.2 Effets négatifs

L’intérêt porté aux invasions biologiques est issu de l’observation d’un certain nombre d’impacts négatifs liés à certaines espèces envahissantes et à une augmentation sans précédent du nombre d’invasions dans le monde. En effet, les invasions biologiques ont des impacts divers et parfois très importants sur les écosystèmes, la biodiversité, les activités humaines et l’économie (Mack et al., 2000).

2.2.1 Impacts sur l’écosystème

Les espèces évoluant à l’extérieur de leur aire d’origine ne sont plus soumises aux contraintes qui limitent habituellement l’accroissement de leur population, notamment leurs ennemis naturels. Par exemple, le ragondin en provenance d’Amérique du Sud, Myocastor

coypus, a été introduit aux Etats-Unis en 1899 pour la production de vêtements en fourrure. Suite à la crise qu’a connue ce secteur, l’excédent d’animaux a été relâché dans la nature. En l’absence de prédateurs naturels, l’espèce s’est implantée dans 22 états et a sérieusement endommagé la végétation des zones humides, dégradant des habitats représentant des niches pour les oiseaux d’eau ainsi que des frayères de crevettes, de crabes, d’huîtres et de nombreuses espèces de poissons (Carter et al., 1999; Carter & Leonard, 2002). Les espèces envahissantes peuvent ainsi impacter la survie de certaines espèces indigènes à travers la prédation, la phytophagie, la concurrence pour les ressources, l’agression ou l’hybridation (Brown et Mitchell 2001). L’exemple le plus flagrant concerne l’introduction de la perche du Nil, Lates niloticus, dans le lac Victoria. Elle y serait responsable de la disparition, par prédation, de plus de 50% des 600 espèces endémiques de Cichlidés (Balirwa et al., 2003; Kaufman, 1992).

2.2.2 Impacts socio-économiques

Au niveau économique, certaines espèces envahissantes ont des incidences importantes à l’échelle mondiale. Par exemple aux Etats-Unis, le coût induit par les problèmes liés aux espèces envahissantes est estimé à 150 milliards d’euros par an. De même dans l’Union Européenne, l’impact des invasions biologiques atteindrait les 10 milliards d’euros par an, ce chiffre étant probablement très sous-estimé du fait de la difficulté à quantifier l’impact environnemental de ces invasions. (Hulme et al., 2009). Dans les pays du sud, les coûts sont respectivement estimés à 7 milliards pour l’Afrique du Sud, 50 milliards pour le Brésil et 117 milliards pour l’Inde (Pimentel et al., 2000). De plus, les espèces exotiques envahissantes peuvent être des réservoirs de maladies. Leurs introductions peuvent favoriser la transmission de certains micro-organismes nuisibles à la santé humaine et animale. Ils peuvent être véhiculés par des vecteurs tels que les moustiques et les animaux domestiques.

III. Principaux processus évolutifs en jeux dans les contextes de lutte et d’invasion biologique

1. Processus évolutifs liés aux introductions accidentelles (bioinvasions) ou volontaires (lutte biologique)

Le succès de la lutte biologique par un agent exotique dépend étroitement de sa capacité d’adaptation à son nouvel environnement (Parker & Gilbert, 2004; Roderick & Navajas, 2003). Ces propriétés sont directement liées aux caractéristiques évolutives des populations d’auxiliaires introduites. Les espèces envahissantes peuvent également présenter des changements évolutifs importants durant les différentes phases de l’invasion biologique. Notons que la lutte biologique classique peut être considérée comme une invasion biologique bénéfique et les opérations d’introductions volontaires comme des expériences in natura d’invasion dont on maîtrise certains paramètres. Ainsi, les espèces introduites (espèces envahissantes sensu stricto ou espèces utilisées en lutte biologique) représentent des modèles biologiques intéressants pour étudier les changements évolutifs contemporains rapides (Cox, 2004; Sakai et al., 2001). Les études s’intéressant aux processus évolutifs sur les espèces introduites sont cependant récentes (Hänfling & Kollmann, 2002; Lee, 2002).

Il est à présent largement accepté qu’une espèce exogène introduite dans un nouvel environnement peut évoluer rapidement. Des changements génétiques rapides peuvent intervenir et avoir des conséquences phénotypiques importantes (Bossdorf et al., 2005; Lee, 2002; Maron et al., 2004). En effet, la population introduite est généralement constituée d’un faible nombre d’individus (effet de fondation), entrainant une faible variabilité génétique. Ce goulot d’étranglement démographique accentue le phénomène de dérive génétique qui accélère les changements évolutifs comme la perte de fixation d’allèle par hasard (Barrett & Husband, 1990; Brown & Marshall, 1981). Cependant, cette perte de variabilité génétique peut constituer un frein à l’adaptation par sélection, notamment dans un contexte d’adaptation locale (Sax & Brown, 2000). La phase d’établissement correspondant à la survie des individus dans leur nouvel environnement et leur reproduction joue également un rôle important. Durant cette étape, les effets éventuels de la dépression de consanguinité liés à la reproduction entre apparentés accentue encore le phénomène de dérive génétique. Ce processus augmente la probabilité de fixation de mutations délétères (Lynch et al., 1995). La réponse évolutive rapide qui a lieu durant la phase d’établissement peut être la conséquence de pressions de sélections biotiques et abiotiques variées (Mooney & Cleland, 2001; Sakai et al., 2001). Enfin

Figure 2 : Différents types de pressions de sélection.

Dans la nature, la sélection naturelle est la seule pression de sélection agissant sur les individus.

Dans les conditions d’élevage cette pression de sélection est moins importante. Dans le milieu d’élevage, il existe deux autres pressions de sélection : la sélection artificielle (causée par l’homme) et la sélection induite par les conditions de captivité.

durant la phase de prolifération, l’espèce introduite doit être capable de s’adapter rapidement dans son nouvel environnement (Lee et al., 2007; Reznick & Ghalambor, 2001). Cette adaptation peut être liée à une plasticité phénotypique (Fordyce, 2006) ou à un caractère évolutif.

2. Processus évolutifs liés à la domestication (phase d’élevage en lutte biologique)

Le processus de domestication corresponds en soit à un processus de sélection diffèrent du processus sélection en conditions naturelles. On peut citer trois types de sélections associées à la domestication (Figure 2): (i) la sélection artificielle, (ii) la sélection induite par la captivité, et (iii) le relâchement de la sélection naturelle (Price, 1999; Price & King, 1968).

Dans tous les cas, les pressions de sélections en condition d’élevage diffèrent des pressions de sélection naturelles en qualité et intensité. Ainsi, les traits phénotypiques évoluent généralement différemment chez les populations d’élevages et chez les populations naturelles (c.f chapitre II). La sélection artificielle est l’aspect le mieux connu du processus de domestication. Elle est appliquée intentionnellement sur des caractères choisis par le sélectionneur, et concerne principalement des caractères phénotypiques. Par exemple, une meilleure production de la taille et le poids a été sélectionnée chez les volailles (Mignon- Grasteau & Faure, 2002), et une bonne productivité de lait chez les bovins (Coulon et al., 1997). Ce type de sélection peut aussi avoir des conséquences indirectes. Par exemple, chez les bovins sélectionnés sur la docilité et sur une réactivité moins importante à l’homme, ceux- ci développent plus rapidement un comportement maternel approprié (Murphy et al., 1998). On peut citer la sélection sur la largeur de la poitrine chez la dinde qui a abouti à l’élimination des aptitudes des mâles à pouvoir s’accoupler naturellement, obligeant la pratique systématique de l’insémination artificielle pour (association négative, (Price, 1999)). En absence de sélection artificielle, la pression induit par la captivité est le mécanisme à la base des changements génétiques dans les populations captives (voir figure 2). On peut citer l’exemple de l’adaptation fortuite à la nourriture fournie aux populations d’élevage, comme le foin chez le bétail ou les œufs de papillons pour l’élevage d’insectes. Les conditions d’élevage en grande densité, peut aussi entraîner des maladies infectieuses ou parasitaires, comme chez les volaille par exemple (Höglund et al., 1995) ainsi que, chez les ruminants (Bareille, 2007). Le passage du milieu naturel au milieu de captivité cause également un relâchement de la sélection naturelle (Price, 1999, Waples, 1991, figure 2). Par exemple certains comportements

Figure 3 : Les différents stades de développement d’H . axyridis.

A) reproduction d’adultes, B) ponte, C) éclosion des larves, D1 à D4) les quatre stades larvaires, E) nymphe, F) nouvel adulte.

30 importants dans le milieu naturel comme la recherche de la nourriture et l’évitement des prédateurs perdent tout leur sens en captivité, et s’atténuent au bout de quelques générations.

IV. Modèle biologique étudié au cours de cette thèse: la coccinelle asiatique Harmonia axyridis

Harmonia axyridis représente un modèle biologique particulièrement intéressant pour étudier les processus invasifs car elle constitue une espèce exotique invasive initialement utilisée en lutte biologique, qui a colonisée l’ensemble des territoires Européen, d’Amérique du Nord, d’Amérique du Sud et d’Afrique du Sud. Son expansion est actuellement sous haute surveillance du fait de son impact potentiellement négatif en particulier sur l’écosystème.

1. Biologie

1.1 Taxonomie

La coccinelle asiatique H. axyridis (Pallas 1773) fait partie de l’ordre Coleoptera, de la famille des Coccinellidae et de la sous famille des Coccinellinae. Elle est appelé Multicolored Asian lady beetle ou Halloween lady beetle dans les pays anglo-saxons (Mahr, 1996).

1.2 Cycle de vie

Le cycle de vie d’H. axyridis est métamorphe. On distingue l’œuf puis quatre stades larvaires mobiles (de L1 à L4), suivi d’un stade pupe fixe et enfin le stade adulte (Figure 3) (Hodek, 1973). La taille de l’adulte est d’environ 4.9 à 8.2 mm de long et 4 à 6.6 mm de large (Kuznetsov, 1997). Le cycle de développement complet est de 15 à 25 jours selon les conditions environnementales (Pervez & Omkar, 2006). D’après LaMana & Miller (1996), la larve éclot après 2.8 jours. Le premier stade larvaire dure 2.5 jours, le second 1.5 jours, le troisième 1.8 jours et le quatrième 4.4 jours. La pupe donne un adulte après 4.5 jours.

Harmonia. axyridis est une espèce généralement mono ou bivoltine présentant une diapause hivernale (Ongagna et al., 1993) mais dans certaines conditions trophiques et/ou abiotiques, elle peut développer jusqu’à 4 à 5 générations successives pendant l’année (Iablokoff-Khnzorian, 1982; Katsoyannos et al., 1997; Wang, 1986). La durée de vie d’un adulte peut atteindre 3 ans (Savoiskaya, 1970a; 1970b), mais est généralement limitée entre 30 et 90 jours (El-Sebaey & El-Gantiry, 1999; He et al., 1994; Soares et al., 2001). En condition de laboratoire, les femelles peuvent produire une moyenne de 3819 œufs, soit

Figure 4 : Les cinq morphes principaux de l’adulte d’H. axyridis :

1-Forme Succinea 1 : Rouges ou jaunes avec 19 taches noires dont une à la jonction antérieures des élytres. 2-Forme Succinea 2 : Rouges ou jaunes avec 0-18 taches noires, aucune à la jonction antérieure des élytres. 3- Forme Conspicua : Noire àavec2 taches rouges. 4- Forme Spectabilis : Noire avec 4 taches rouges. 5- Forme Axyridis : Rouge avec 12 taches rouges.

Figure 5 : Différences entre les deux sexes d’H.axyridis

32 environ 25 œufs par jour (Hukusima & Kamei, 1970; Koch, 2003). Les femelles pondent généralement des groupes d’approximativement 20 à 30 œufs par ponte (Takahashi, 1987). En été, les adultes peuvent entrer en quiescence estivale et à l’automne ils migrent en vols massifs pour hiverner (Kidd et al., 1995; LaMana & Miller, 1996). L’hivernation se fait en groupe, les individus se réfugiant dans des endroits cachés et abrités où ils s’agrègent. Ils créent ainsi un microclimat protecteur où la température est moins extrême qu’à l’extérieur (Obata, 1986; Sakurai et al., 1993).

1.3 Variabilité phénotypique

Les adultes d’ H. axyridis présentent une grande variabilité au niveau phénotypique qui a conduit à la description de plus de 120 formes différentes (Mader, 1955). En général, les élytres présentent une couleur très remarquable avec de 0 à 19 points (Sasaji, 1971), couramment regroupés en cinq grandes formes (Succinea 1, Succinea 2, Conspicua, Spectabilis et Axyridis (Seo et al., 2008) ; voir illustration en figure 4. D’après Iablokoff- Khnzorian (1982) cette variabilité serait d’origine génétique, géographique et/ou alimentaire.

Le dimorphisme sexuel est bien marqué chez H. axyridis. Généralement, (i) la femelle a une taille supérieure à celle du mâle, (ii) La coloration de la tête est noire chez la femelle avec parfois une tache triangulaire blanche entre les yeux. Chez le mâle, la tête est blanche avec la partie arrière des yeux noire (Figure 5).

2. Utilisation en lutte biologique

La coccinelle asiatique est un redoutable prédateur des insectes (Tedders & Schaefer, 1994). Elle se nourrit essentiellement de nombreuses espèces de pucerons (Hémiptères Aphidoidés) (Hodek, 1996) et d’œufs, de larves ou d’adultes d’autres petits insectes comme des psylles (Michaud, 2001), des lépidoptères (Koch, 2003) mais également des acariens, des cochenilles. Cette espèce étant particulièrement vorace, un individu peut consommer près de 400 pucerons pendant ses quatre stades larvaires (Hukusima & Kamei, 1970). Un seul adulte consomme entre 15 et 65 pucerons par jour (Hu et al., 1989; Lucas et al., 1997; Seko et al., 2008). Pour ses qualités prédatrices, elle a été utilisée comme auxiliaire de lutte biologique, principalement contre les pucerons, durant de nombreuses années (Lanzoni et al., 2004; Soares et al., 2001). Cette espèce représente ainsi un très bon candidat pour étudier les processus évolutifs liés à la lutte biologique (Lucas et al., 1998; Tedders & Schaefer, 1994).

Figure 6 : Représentation schématique des principales introductions d’H. axyridis liées à la lutte biologique dans le monde. En Amérique du Nord, de nombreuses populations natives différentes ont été utilisées. A l’inverse, en Europe, une seule population a été introduite à partir d’une souche de laboratoire en 1982. 3. Répartition géographique

3.1 Aire native

Harmonia axyridis est originaire du sud-est de l’Asie (Michaud, 2002; Snyder et al., 2004). Sa distribution originelle s’étend du sud de la Russie au sud de la Chine au Japon et à la Mongolie jusqu’à la Sibérie (Koch, 2003).

3.2 Aire d’introduction

Plusieurs milliers d’individus ont été introduits à partir de nombreux prélèvements indépendants dans l’Est de l’aire native (Japon, Est de la Chine, Est de la Sibérie) (Krafsur et al., 1997; Tedders & Schaefer, 1994). La première introduction a été réalisée en Californie en 1916 pour tenter d’améliorer le contrôle des populations de pucerons dans les agroécosystèmes. Plus tard, plusieurs autres introductions ont été conduites dans plusieurs Etats des USA et au Canada en 1964 et 1965, puis entre 1978 et 1982 (Chapin & Brou, 1991; Coderre et al., 1995), mais aussi en Louisiane (1988), en Géorgie et au Mississipi (1990).

En Europe, une population d’H. axyridis originaire de Chine a été transférée en 1982 par l’intermédiaire d’un laboratoire de l’INRA d’Antibes (Ongagna et al., 1993). Durant plusieurs années, des recherches en conditions contrôlées ont été menées sur cette espèce pour améliorer son utilisation en lutte biologique. En 1995, une souche a été commercialisée par des entreprises française, belge et hollandaise. A la fin des années 1990, une souche non volante a été sélectionnée en laboratoire (Tourniaire et al., 2000a; Tourniaire et al., 2000b) et en 2000, elle a été commercialisée par une entreprise française (BioTop). Enfin, notons que cette souche européenne de lutte biologique a également été utilisée en Amérique du Sud (Argentine) en 1986 et à la fin des années 90 (Poutsma et al., 2008), ainsi qu’en Afrique du Nord (Egypte) dans les années 2000 (Figure 6).

3.3 Une espèce envahissante

La première population établie a été observée en Amérique du Nord en 1988 en Louisiane (Chapin & Brou, 1991). Ensuite, un autre foyer a été identifié en 1991 dans l’Ouest américain, en Oregon (LaMana & Miller, 1996). Après la première observation, elle s’est rapidement étendue en 1994 dans toute l’Amérique de nord (Hesler et al., 2001; Smith et al., 1996). En Amérique de sud, H. axyridis a été observé pour la première fois en 2001 en Argentine (Saini, 2004) puis en 2006 au Mexique (Koch et al., 2006). En Europe, elle a été

Figure 7 : Représentation schématique de l’aire de répartition actuelle d’H. axyridis dans le monde. En vert l’aire native et en rouge les zones envahies (Nord-Est Américain ; Nord-Ouest Américain ; Europe ; Amérique du Sud ; Afrique du Sud). Les dates des premières observations de chaque foyer envahissant sont indiquées.

Figure 8 : Routes d’invasion de la coccinelle asiatique reconstruites à partir de données génétiques et de méthodes statistiques ABC (Eric Lombaert et al. Données et résultats non publiés). Aire native en vert, Aire envahie en rouge. Les introductions sont représentées par des flèches et les évènements d’admixture par des flèches convergentes. Les dates correspondent aux débuts d’invasion. NOA : Amérique du nord-ouest. NEA : Amérique du nord-est, AS : Amérique du sud, AF ; Afrique du Sud, EU : Europe, IbEu : Lutte biologique européenne.

36 observée pour la première fois en Belgique en 2001 (Adriaens et al., 2003) et s’est installée durablement dans le Nord de l’Europe. Cette espèce étant capable de voler sur des périodes de temps importantes (Nalepa et al., 2000), elle s’est rapidement répandue et a été observée à partir de 2010 dans tout le reste de l’Europe. En Afrique, H. axyridis est présente seulement en Afrique de Sud depuis 2004 (Stals & Prinsloo, 2007). Actuellement, H. axyridis est présente sur la majorité du territoire Européen, d’Amérique du Nord, d’Amérique du Sud et d’Afrique du Sud (Figure 7).

3.4 Routes d’invasion

Des études récentes ont permis de retracer le scénario de l’invasion mondiale de cette espèce (Lombaert et al., 2010; Lombaert et al., 2011). Des individus provenant de l’est de l’aire native seraient à l’origine de la population ouest-américaine et des populations de lutte biologique Européennes. La population est-américaine résulterait de l’admixture génétique entre des propagules venant de l’est et de l’ouest de l’aire native. Cette population est- américaine serait à son tour à l’origine des populations du sud de l’Amérique et de l’Afrique. En Europe, les populations envahissantes proviennent d’un mélange d’individus issus de populations américaines et de la souche de lutte biologique européenne (voir la figure 8).

4. Impacts écologiques et socio-économiques de la coccinelle asiatique

4.1 Impacts positifs

Harmonia. axyridis est une excellente espèce prédatrice très vorace de pucerons qui s’est révélée très efficace en Amérique du Nord. Elle est notamment, devenue un auxiliaire naturel important dans la gestion des populations du pucerons envahissants du soja Aphis glycines (Ragsdale et al., 2011). Sa polyphagie lui permet en effet d’être parmi les principales prédatrices de certaines espèces envahissantes nouvellement arrivées. Cependant, son introduction a engendré certains impacts négatifs.

4.2 Impacts négatifs

Après une longue utilisation d’H. axyridis comme agent de lutte biologique, cette espèce est considérée maintenant comme un échec de par les effets négatifs non-intentionnels qu’elle a engendré dans l’aire envahie (Koch & Galvan, 2008; Louda et al., 2003; Vilà et al., 2009).

Figure 9: Impacts négatifs d’H. axyridis.

Regroupements d’individus adultes en agrégat au moment de l’hivernage (a), nutrition sur pommes (b) et raisins (c).

38 4.2.1 Impacts négatifs sur les écosystèmes

Plusieurs études en laboratoire montrent la férocité d’H. axyridis de par sa prédation intraguilde. Par exemple, cette coccinelle « super-prédatrice » est capable de s’attaquer et de se nourrir des autres membre du même guilde (Pell et al., 2008). Son comportement agressif et sa voracité (Soares et al., 2005) lui permettent en effet d’attaquer d'autres espèces de coccinelles, par exemple Cycloneda munda Chilocorus stigma ou encore Adalia bipunctata sur laquelle elle a un fort impact négatif (Colunga-Garcia & Gage, 1998; Ware et al., 2009).

La diversité des espèces compétitrices naturels reste relativement stable en présence d’H. axyridis dans son aire d’origine (Kuznetsov, 1997). En revanche, un effet négatif remarquable sur la diversité des compétiteurs naturels est observé partout où la coccinelle asiatique s’est établie après avoir été introduite (Roy et al., 2006). En effet, on déplore une diminution de la proportion des autres espèces de coccinelles au profit d’H. axyridis, notamment en Amérique du Nord, Amérique du Sud et en Europe (Adriaens et al., 2008; Brown et al., 2011b; Colunga-Garcia & Gage, 1998; Martins et al., 2009; Michaud, 2002).

4.2.2 Impacts négatifs socio-économiques

L’agrégation de cette espèce en grand nombre (plusieurs milliers d’individus adultes ; Kidd et al., 1995), sur ou dans des bâtiments habités à l’automne constitue une gêne non- négligeable pour les habitants. En effet, à la fin de l’automne ces agrégats ont pour conséquence l’invasion de maisons par des milliers d’individus en quelques jours (Figure 9a). Outre les traces laissées par ces agrégats, des individus volant dans les maisons peuvent tomber dans la nourriture (McCutcheon & Scott, 2001; Nalepa et al., 2000). Ces invasions peuvent également poser des problèmes d’hygiène dans les hôpitaux, les laboratoires ou l’industrie agro-alimentaire (Nalepa et al., 2005). Des cas rares de réactions allergiques ont enfin été décrits (Goetz, 2007; Nakazawa et al., 2007).

De part sa forte polyphagie, on a observé des cas de consommation de fruits par la coccinelle asiatique sur plusieurs variétés d’arbres fruitiers (pommiers, pêchers, vignes, voir figure 9 b et c) ; (Koch & Galvan, 2008). Cependant, les dommages directs sur les arbres fruitiers sont peu nombreux. L’impact le plus important au niveau économique concerne les viticulteurs nord-américains (Koch et al., 2004). Il suffit en effet d’un individus par litre pour avoir un effet négatif sur la qualité gustative du vin (Pickering et al., 2004). H. axyridis est ainsi à l’origine d’un réel impact économique en Amérique du Nord qui se chiffre en millions

Tableau 2: Liste des principales publications du CBGP concernant la coccinelle H. axyridis (en plus de celles inclues dans ce travail de thèse)

Titre des publications Journal

Phenotypic variation in invasive and biocontrol populations of the harlequin 1 Lombaert et al., 2007 Biocontrol ladybird, Harmonia axyridis. Isolation and characterization of microsatellites in the harlequin ladybird, 2 Harmonia axyridis (Coleoptera, Coccinellidae), and cross-species Loiseau et al., 2009 Molecular Ecology Resources amplification within the family Coccinellidae. Bridgehead Effect in the Worldwide Invasion of the Biocontrol Harlequin 3 Lombaert et al., 2010 Plos One Ladybird. Consequences of hybridization between invasive and biocontrol individuals 4 Facon et a.l, 2010 IOBC / WPRS Bulletin of the harlequin ladybird Harmonia axyridis in France. Inferring the origin of populations introduced from a genetically structured 5 native range by approximate Bayesian computation: case study of the Lombaert et al., 2011 Molecular Ecology invasive ladybird Harmonia axyridis. Can things get worse when an invasive species hybridizes? The harlequin 6 Facon et al., 2011 Evolutionary Application ladybird Harmonia axyridis in France as a case study Rapid increase in dispersal during range expansion in the Journal of Evolutionary Biology 7 Lombaert et al., 2013 invasive ladybird Harmonia axyridis (soumis)

de dollars (Hutchison et al., 2010). Cependant, ce dernier problème n’a pour l’instant pas été observé en Europe et notamment sur les vignes françaises.

5. Etat des connaissances en écologie et biologie évolutive

Le CBGP, en collaboration avec l’INRA de Sophia Antipolis (équipe BPI), étudie depuis plusieurs années la biologie évolutive de H. axyridis. Les travaux issus de cette collaboration fructueuse ont mené à un certain nombre de résultats importants sur différentes questions. La liste des publications associées présentée dans le Tableau 2 permet une visualisation succincte de ces travaux. De surcroît, on dispose aussi de bonnes compétences au sein du CBGP en ce qui concerne les techniques d’élevages et les mesures de traits d’histoire de vie chez cette espèce.

La coccinelle asiatique est une espèce extrêmement étudiée par ailleurs, et on peut aisément trouver dans la littérature scientifique académique et appliquée des informations sur sa physiologie, son histoire de vie, ses interactions avec d’autres organismes et son usage en lutte biologique (Koch, 2003). Parmi ces études, on peut citer les travaux de recherche sur la compétition et la prédation intraguilde (Katsanis et al., 2013; Pell et al., 2008; Roy et al., 2012; Vilcinskas et al., 2013), l’effet néfaste sur l’environnement (Ware et al., 2009), le phénomène d’agrégation (Durieux et al., 2013), la variabilité morphologique (Dobzhansky (Dobzhansky, 1933; Michie et al., 2010; Seo et al., 2007), la résistance aux pathogènes (Roy (Cottrell & Shapiro-Ilan, 2003; Roy et al., 2007).

Cependant, seul un petit nombre de publications s’est à ce jour intéressé à l’évolution de cette espèce au cours de son invasion, ou aux mécanismes évolutifs qui en sont responsables. Travailler avec des populations de lutte biologique, ainsi que des populations provenant de l’aire native et de l’aire envahie offre pourtant la possibilité de comparer les trois types de compartiments populationnels, et d’apporter ainsi de nouveaux éléments concernant l’évolution contemporaine rapide ayant pu se produire au cours de des évènements d’introductions (invasions biologiques et lutte biologique).

V. Objectifs et structure de la thèse.

Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux changements évolutifs dans différents compartiments populationnels (natifs, invasifs et de lutte biologique) de la coccinelle asiatique H. axyridis. D’une part, la bonne connaissance historique de l’utilisation de cette espèce en lutte biologique et surtout des routes d’invasions qu’elle a empruntées, permet de bien identifier ces différents compartiments. D’autre part ses caractéristiques biologiques (alimentation aisée, forte capacité de reproduction et cycle de vie court) en font un modèle expérimental facile à élever au laboratoire.

L’objectif principal de cette thèse visait à améliorer notre connaissance des processus évolutifs liés aux invasions biologiques et à la domestication d’insectes à des fins de lutte biologique, ceci en se basant sur des approches expérimentales permettant de mieux caractériser les trois compartiments biologiques de la coccinelle asiatique H. axyridis.

Cette thèse s’articule autour de trois axes principaux :

Dans le premier axe, je présenterai les travaux consacrés à l’étude des changements évolutifs des individus de lutte biologique pouvant accompagner l’élevage en captivité pendant un grand nombre de générations. Ces travaux ont été complétés par l’étude de l’impact de ces populations de lutte biologique sur le processus invasif d’H. axyridis en Europe. Ce premier axe d’étude est abordé dans les trois articles suivants :

1. Evolution in biocontrol strains: insight from the harlequin ladybird Harmonia axyridis.(2012). Ashraf Tayeh, Arnaud Estoup, Guillaume Laugier, Anne Loiseau, Julie Turgeon, Stefan Toepfer and Benoit Facon. Evolutionary Applications.5 (5), 481-488.

2. Experimental evidence for the phenotypic impact of admixture between wild and biocontrol Asian ladybird (Harmonia axyridis) involved in the European invasion. (2011). J. Turgeon, A. Tayeh, B. Facon, E. Lombaert, P. De Clercq, N. Berkvens, J. G. Lundgren & A. Estoup. Journal of Evolutionary biology. 24(5):1044-1052

3. Cannibalism in invasive, native and biocontrol populations of the harlequin ladybird. (2013). Ashraf Tayeh, Arnaud Estoup, Eric Lombaert, Thomas Guillemaud, Natalia Kirichenko, Lori Lawson-Handley, Patrick De Clercq and Benoît Facon. Soumis à BMC Evolutionary Biology.

Le second axe est consacré à l’étude de l’évolution des stratégies de vie (sur l’ensemble du cycle de vie) au cours du processus invasif dans les différents compartiments biologiques (populations natives, populations envahissantes d’Amérique et d’Europe et populations de lutte biologique).

Le troisième axe de cette thèse se focalise sur l’étude d’un trait phénotypique pouvant jouer un rôle majeur dans le succès invasif d’H. axyridis : la résistance au froid. Ce travail a été réalisé en deux temps : une étude préliminaire sur le déterminisme génétique de la résistance au froid qui a conduit, dans un deuxième temps, à une étude de l’effet du statut d’accouplement sur la résistance au froid chez H. axyridis.

Une dernière partie de la thèse consistera en une discussion générale des résultats principaux, qui conduira à une synthèse et à une proposition de perspectives de recherche.

Notons que trois articles présentant des travaux sur H. axyridis auxquels j’ai également participé pendant ma thèse ont été ajoutés en annexe. Pour une question de cohérence dans l’écriture et les questions abordées ces articles ne sont pas présentés ni discutés dans cette thèse.

1. Inbreeding depression is purged in the invasive insect Harmonia axyridis. (2011). Benoît Facon, Ruth A. Hufbauer, Ashraf Tayeh, Anne Loiseau, Eric Lombaert, Renaud Vitalis, Thomas Guillemaud, Jonathan G. Lundgren, and Arnaud Estoup. Current Biology. 21 (5): 424-427. 2. Investigating the genetic load of an emblematic invasive species: the case of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis. (2013). A. Tayeh, A. Estoup, R. A. Hufbauer, V. Ravigne, I. Goryacheva, I. A. Zakharov, E. Lombaert & B. Facon. Ecology and Evolution. 3 (4): 864-871.

3. Increase in male reproductive success and female reproductive investment in invasive populations of harlequin ladybird Harmonia axyridis. (2013). Guillaume Laugier, Gilles Le Moguédec, Ashraf Tayeh, Anne Loiseau, Naoya Osawa, Arnaud Estoup and Benoit Facon. PlosOne, sous presse.

CHAPITRE I :

Populations de lutte biologique : Evolution en conditions d’élevage et impacts potentiels sur les populations envahissantes.

I. Objectifs

Dans ce chapitre de thèse nous aborderons deux problématiques associées aux populations de lutte biologique. Nous avons : (i) Tenté de mieux comprendre les changements évolutifs pouvant accompagner l’élevage au laboratoire des individus de lutte biologique pendant un grand nombre de générations. (ii) Etudié l’impact potentiel d’une hybridation entre les souches de lutte biologique et les populations envahissantes sur le processus invasif d’H. axyridis en Europe.

Ces deux problématiques ont été traitées dans trois articles scientifiques présentés brièvement ci-dessous.

II. Principaux résultats

Dans l’article 1 (Tayeh et al. 2012), nous avons étudié les effets du champignon entomopathogène Beauvaria bassiana sur la mortalité et la fécondité des femelles des trois compartiments populationnels (natives, envahissantes et lutte biologique) d’H. axyridis. Cinq populations ont été utilisées pour effectuer cette étude, deux populations de l’aire native (Chine et Japon), deux populations de l’aire envahie (Canada et Hongrie), et une population de lutte biologique (BioTop). Nos résultats montrent que la population de lutte biologique est particulièrement sensible à B.bassiana, et présente une mortalité deux fois plus élevée que les populations naturelles. Les conditions d’élevage au laboratoire semblent donc avoir favorisé une perte de résistance des individus de lutte biologique face au champignon B. bassiana. Nous avons montré également qu’il n’y a aucune différence entre les populations naturelles envahissantes et natives. La population européenne (Hongrie) résulte d’un mélange génétique entre la population d’Amérique de l’Est et la lutte biologique. Cependant, la plus forte sensibilité au champignon détectée dans la population de lutte biologique ne se retrouve pas dans la population envahissante en Europe ce qui suggère que ce trait a été contre-sélectionné in natura. Dans cet article, nous intégrons ces résultats dans le cadre général des changements évolutifs pouvant accompagner l’élevage des individus de lutte biologique pendant un grand nombre de générations, en considérant un ensemble de traits d’histoire de vie étudiés chez H. axyridis.

Dans l’article 2 (Turgeon et al. 2011), nous avons étudié le rôle de l’hybridation au cours de l’invasion en Europe . La population envahissante européenne résulte, en effet, d’une hybridation intra-spécifique entre la population envahissante du nord-est des Etats-Unis et la souche de lutte biologique commercialisée en Europe pendant des années (présence d’environ 40% de gènes d’origine lutte biologique dans la population envahissante Européenne ; (Lombaert et al., 2010; Lombaert et al., 2011). D’une manière générale, l’hybridation peut avoir des effets négatifs en cassant les complexes de gènes coadaptés à un environnement donné (Bailey & McCauley, 2006; Barton & Hewitt, 1985; Burke & Arnold, 2001; Keller et al., 2000). Cependant, l’hybridation peut aussi avoir des effets positifs. En effet, elle augmente d’une manière générale la diversité génétique ce qui est susceptible de favoriser l’émergence de nouvelles adaptations (Kolbe et al., 2004; Lynch & Walsh, 1997). Ce dernier type d’effets peut être particulièrement intéressant dans le cadre d’une invasion biologique dans la mesure ou les populations introduites subissent souvent une baisse de diversité génétique suite à des goulots d’étranglement démographiques et sont souvent confrontées à de nouveaux environnements auxquels elles doivent s’adapter (Facon et al., 2008; Kolbe et al., 2004; Lavergne & Molofsky, 2007).

Nous avons comparé différents traits d’histoires de vie entre différents types de populations d’H. axyridis: des populations envahissantes parentales « pures » (i.e. Américaines et de lutte biologique), une population envahissante hybride naturelle (i.e. Européenne) et des populations hybrides de première génération produites au laboratoire entre les populations parentales précédentes. Nous avons utilisé cinq populations pour réaliser cette étude : deux populations nord-américaines (Dakota et Québec), deux populations de lutte biologique (BioTop et BioBest) et une population européenne (Belgique). Au total, 13 croisements ont été réalisés, dont huit croisements hybrides. Nous avons mesuré six traits d’histoire de vie : taux d’éclosion, taux de survie larvaire, durée de développement, âge de reproduction, fécondité pendant six semaines et survie adulte sans nourriture. Nos résultats montrent qu’il n’y a pas de différences significatives entre les différents types de croisement pour le taux d’éclosion, le temps de développement et la survie sans nourriture. Pour les 3 autres traits, survie larvaire, âge de 1ère reproduction et fécondité, les individus d’origine américaine présentent des performances inférieures aux individus hybrides de 1ère génération et aux individus de lutte biologique. De plus les performances des individus issus de la population européenne ne sont pas différentes de ceux des hybrides de première génération. Cela suggère que les bénéfices de l’hybridation semblent être maintenus sur un

nombre important de générations (cf. environs 20 générations depuis l’observation d’une population envahissante en Europe).

Dans l’article 3 (Tayeh et al. 2013), nous avons étudié si un trait de vie particulier, le cannibalisme, a pu évoluer lors du passage en conditions d’élevage des populations de lutte biologique mais également au cours du processus d’invasion. Le cannibalisme est largement connu chez les insectes prédateurs et a fait l’objet de plusieurs études chez les coccinelles (Alabi et al., 2008). Il a notamment été montré chez H. axyridis (Osawa, 1989; 1992; Schellhorn & Andow, 1999). Différentes études mon mis en évidence que le cannibalisme dépendait principalement de trois facteurs : la densité de la population, la quantité de ressources et l’apparentement entre le cannibale et ses proies (Fox, 1975; Polis, 1981). Des études expérimentales ont mis en évidence que le cannibalisme pouvait évoluer rapidement et ainsi favoriser la colonisation de nouveaux milieux (Agashe et al., 2011; Via, 1999). Cependant, aucune étude ne s’était intéressée à l’évolution du taux de cannibalisme dans des populations naturelles d’une espèce envahissante. Nous avons comparé, en conditions contrôlées, le taux de cannibalisme des œufs par les femelles adultes et les larves de premier stade (larves L1) dans :

(i) des populations natives, envahissantes et de lutte biologique. (ii) au sein de plusieurs populations envahissantes en Europe localisées soit au niveau du foyer d’introduction, soit plus ou moins proches du front d’invasion.

Nous avons également testé l’effet de la densité sur le comportement de cannibalisme dans ces différentes populations.

Pour réaliser cette étude nous avons utilisé dix populations d’H. axyridis. Ces populations ont trois origines différentes: deux populations dans l’aire native (Japon et Sibérie), et deux populations de lutte biologique (BioBest et BioTop), et dans l’aire envahie européenne, six populations représentant deux transects géographiques allant du foyer au front d’invasion. Nos résultats montrent que le taux de cannibalisme présente des différences notoires entre les trois compartiments populationnels d'H. axyridis (natives, envahissantes et de lutte biologique) chez les larves L1, mais pas chez les femelles adultes. Les larves des populations envahissantes sont plus cannibales que les larves provenant de populations natives et celles de lutte biologique. Les larves de l’aire native sont également plus cannibales que les larves de lutte biologique. Il semblerait donc qu’un taux de cannibalisme plus élevé ait été sélectionné dans les populations envahissantes par rapport aux populations natives. En revanche, le

cannibalisme semble avoir été contre-sélectionné dans les populations de lutte biologique. Au sein des populations envahissantes, il n’y a pas de différence entre le foyer et le front, ceci quel que soit le stade étudié (femelles adultes ou larves L1). Nous avons également mis en évidence des différences significatives entre les deux densités. Quelque soit le stade étudié, le taux de cannibalisme est plus élevé à forte densité qu’à faible densité.

III. Conclusion

Nos études confirment la prédiction théorique que les agents de lutte biologique peuvent subir des changements génétiques et phénotypiques drastiques en réponse aux conditions de laboratoire associées à leur élevage. En revanche, les adaptations aux conditions d’élevage peuvent parfois être (très) désavantageuses dans l'environnement naturel (Waples (Araki et al., 2007; Kraaijeveld-Smit et al., 2006; McGinnity et al., 2003; Waples, 1999). Par exemple chez H. axyridis, la population de lutte biologique est nettement moins résistante au champignon entomopathogène B. bassiana par rapport aux populations sauvages. De même, la population de lutte biologique est nettement moins cannibale comparativement aux populations naturelles. Enfin, l’hybridation en Europe entre les souches de lutte biologique et les populations envahissantes américaines pourrait avoir entraîné des conséquences positives sur la valeur sélective. L’hybridation pourrait donc avoir joué un rôle favorable au cours de l’invasion Européenne

IV. Articles associés

Les trois articles introduits ici peuvent être consultés dans leur intégralité dans la continuité de ce chapitre de thèse.

Article 1 (publié dans Evolutionary Application): Evolution in biocontrol strains: insight from the harlequin ladybird Harmonia axyridis.

Article 2 (publié dans Journal of Evolutionary Biology) Experimental evidence for the phenotypic impact of admixture between wild and biocontrol Asian ladybird (Harmonia axyridis) involved in the European invasion.

Article 3 (en phase de révision dans BMC Evolutionary Biology): Cannibalism in invasive, native and biocontrol populations of the harlequin ladybird.

Article 1

Evolution in biocontrol strains : insight from the harlequin ladybird Harmonia axyridis.

Evolutionary Applications

Evolutionary Applications ISSN 1752-4571

ORIGINAL ARTICLE Evolution in biocontrol strains: insight from the harlequin ladybird Harmonia axyridis. Ashraf Tayeh,1 Arnaud Estoup,1 Guillaume Laugier,1 Anne Loiseau,1 Julie Turgeon,2 Stefan Toep- fer3 and Benoit Facon1*

1 Inra, Cbgp (Inra/Ird/Cirad/Montpellier SupAgro) Montpellier, France 2 De´ partement de biologie, Universite´ Laval Que´ bec, QC, Canada 3 CABI Europe Switzerland, Plant Protection & Soil Conservation Directorate Hodmezovasarhely, Hungary

Keywords Abstract biological control, biological invasion, fungal entomopathogen, genetic drift, Harmonia After being used as a biocontrol agent against aphids for decades without harmful axyridis, inadvertent selection, laboratory consequences, the Asian harlequin ladybird Harmonia axyridis has suddenly adaptation, life-history traits. become an invasive pest on a worldwide scale. We investigate the impact of captive breeding on several traits of this ladybird such as genetic diversity, fecundity, *Correspondence survival and pathogen resistance. We conducted an experiment in the laboratory Benoit Facon, Inra, Cbgp (Inra/Ird/Cirad/ to compare the fecundity and the susceptibility to the entomopathogenic fungus Montpellier SupAgro), Montpellier, France. Tel.: (33) 499 62 33 22; Beauveria bassiana of wild and biocontrol adults of H. axyridis. We compiled fax: (33) 499 62 33 45; these new findings with already published data. Altogether, our findings suggest e-mail: [email protected] that mass rearing of biological control agents may strongly impact genetic diversity and life-history traits. We discuss how such changes may subsequently affect Received: 7 November 2011 the fitness of biological control strains in natural environments. Accepted: 1 May 2012 doi:10.1111/j.1752-4571.2012.00274.x

at each generation (Wajnberg 1991; Fiumera et al. 2000). Introduction Inbreeding, the mating of close relatives, increases the fre- Biological control agents can be viewed as a type of domes- quency of homozygotes and can lead to changes in gene ticated species (Diamond 2002; Savolainen et al. 2002; frequencies by exposing deleterious recessive alleles to Ross-Ibarra et al. 2007), particularly when they are reared selection. Deleterious effects of inbreeding could deter the in captivity prior to release. As such, they may experience successful field colonization of exotic species in classical the same types of phenotypic and genetic changes experi- biological control programs. For instance, Kuriwada et al. enced by other domesticated species (Burke et al. 2007; (2011) reported higher inbreeding depression in a mass- O’Neill et al. 2010; Rubin et al. 2010). reared strain of Cylas formicarius than in a wild strain, sug- As such, it is important to document and understand the gesting that mass-reared weevils suffer serious inbreeding evolutionary changes that occur in captive populations of depression. biological control agents. Three major mechanisms may Because captive environments differ from wild ones, cause genetic changes under laboratory rearing conditions: selection can favour some peculiar genetic variants. In random drift, inbreeding and selection (Hopper et al. agreement with this, genetic adaptations to captivity have 1993). The first two mechanisms can be related to small been documented in various species (see for instance, Zou- population size. Indeed, drift arises from taking a finite ros et al. 1982; Allard 1988; Levin et al. 2001; Lewis and sample from a population: by chance, some individuals, Thomas 2001; Heath et al. 2003). It is worth stressing that and thus genotypes, contribute more and some less in each selection can be intentional or not. On the one hand, generation. This process can be substantial and induces a humans can alter deliberately the genetic composition of a high initial loss of genetic variability when only few foun- set of individuals to suit their needs, a process called ders are used to start laboratory populations and/or when genetic improvement (Hopper et al. 1993). Such inten- such populations include a low number of effective parents tional selection has allowed improving the efficiency of

© 2012 Blackwell Publishing Ltd. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution Non Commercial License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited and is not used for commercial purposes. 1 Evolutionary changes in Harmonia axyridis Tayeh et al. several biological control agents, especially in relation to population used locally to manage aphid populations (with host acceptance/suitability, temperature tolerance, diapause a contribution of biocontrol genes estimated around 43%). induction and insecticide resistance (Hoy 1985). For In the present study, we took advantage of this context instance, two greenhouse populations of Amblyseius fallacis to investigate the impact of captive breeding on several have shown a 64-fold increase in resistance against per- characteristics (such as fecundity, larval survival, resistance methrin insecticide after 12 rounds of selection. On the to a pathogen or genetic diversity) by comparing different other hand, continued laboratory breeding may result in sources of H. axyridis, i.e. the laboratory mass-reared pop- relaxed selection for some life-history characteristics (Sgro ulation used for biological control in Europe, as well as and Partridge 2000; Mack et al. 2001). Such characteristics wild populations (invasive alien and native ones). To this selected under captivity conditions can sometimes be dis- end, we first conducted an experiment in the laboratory to advantageous in the natural environment (Waples 1999; compare the fecundity and the susceptibility to the ento- McGinnity et al. 2003; Kraaijeveld-Smit et al. 2006; Araki mopathogenic fungus Beauveria bassiana of wild and bio- et al. 2007; Frankham 2008). For instance, a hatchery stock control adults of H. axyridis. We then compiled these new of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) in Canada findings with already published data by our research group evolved smaller eggs and supplementation of wild popula- and close collaborators to test for several predictions tions using this stock reduced egg size in introgressed wild regarding the impact of captive breeding practices on populations, resulting in reduced fitness in nature (Heath H. axyridis. et al. 2003). Such inadvertent selection may also occur for First, we expect a lower genetic diversity in European biological control agents during laboratory culture and biocontrol population compared to wild ones owing to maintenance of captive populations, favouring laboratory- genetic drift. It is likely that only a few founders would adapted genotypes that are maladapted to the field (Hop- have been used to start laboratory population and/or the per et al. 1993). number of effective parents at each generation was most Given its use for biological control and invasive history likely lower than in a wild population. (reviewed in Brown et al. 2011), the Asian harlequin lady- Second, the laboratory environment strongly differs from bird Harmonia axyridis is a good biological model to exam- the wild ones. Notably, lab-rearing conditions do not dis- ine the evolutionary impact of conditions in captivity and play seasonal variations of temperatures and cultures are its potential consequences in the field. Native to Asia, the maintained as free of pathogen as possible. Owing to the coccinellid H. axyridis has been introduced repeatedly in absence of these selective pressures in captivity, we could North America as a biocontrol agent against aphids since hypothesize that biocontrol individuals should exhibit a 1916 (Tedders and Schaefer 1994; Krafsur et al. 1997) and lower survival rate at low temperatures and a lower resis- in Europe and South America since 1980s (Ongagna et al. tance to a pathogen such as B. bassiana, the latter being 1993; Poutsma et al. 2008). Despite recurrent intentional present on both the native and introduced ranges of releases, the species did not establish for decades. However, H. axyridis. It has to be noted that a decrease of both traits it suddenly became invasive in eastern and western North upon relaxation of selection requires the additional America in 1988 and 1991 (Chapin and Brou 1991; LaMan- assumption of a cost, either a quantitative cost or a trade- a and Miller 1996), in Europe in 2001 (Belgium, Adriaens off with some other trait (Hufbauer 2002). et al. 2003), South America in 2001 (Argentina, Saini 2004) Third, similar selection in different environments might and in Africa in 2004 (South Africa, Stals and Prinsloo not be equally effective in leading to adaptation (Wilson 2007). The species has spread widely in these areas where it et al. 2006). Notably, lab-rearing conditions being less consumes nontarget arthropods, invades households and is multifaceted and more constant than field conditions, a pest of fruit production (Koch 2003; Koch and Galvan directional selection on particular traits maximizing fitness 2008). Based on the analysis of neutral genetic variation, in captivity may be more effective in biocontrol popula- Lombaert et al. (2010, 2011) recently retraced the routes of tion. For instance, we might predict that biocontrol indi- all five worldwide H. axyridis invasions. Eastern and wes- viduals would display higher larval survival, higher male tern North American invasive populations originate from reproductive success and an earlier and higher fecundity. two independent introductions from the native Asian Obviously, these four traits may also boost invasive suc- range. Surprisingly, eastern North America is the source of cess. By specifically comparing biocontrol population, colonists for all other successfully invaded areas. In South European invasive and American invasive ones, we could America and South Africa, invasive populations bear no assess whether the traits with higher values in the biocon- trace of genetic admixture with other sources. In Europe, trol population have been preserved or not in the field however, Lombaert et al. (2010) found evidence for genetic (i.e. in the European invasive population, the latter being admixture between eastern North American founders and the result of an admixture between American population individuals from the laboratory European biocontrol and biocontrol one).

Tayeh et al. Evolutionary changes in Harmonia axyridis

Materials and methods Experimental procedures Description of published data A total of 40 females and 40 males of the third labora- Our research group and close collaborators have previously tory-standardized generation of each of the five test pop- produced data comparing biocontrol-type H. axyridis with ulations were placed into a large box during 10 days to field collected ones for several characteristics. Lombaert allow copulations. After this period, females were trans- et al. (2011) estimated genetic diversity at 18 microsatel- ferred individually into 9-cm-diameter Petri dishes and lites in the European biocontrol populations and in several kept at 24°C; L: D 14:10; 60% relative humidity. Each native and invasive populations. Three other studies have female was presented to a single male for a period of compared, using experiments in controlled conditions, the 24 h. This was repeated three times with three different performances of European biocontrol individuals and field males per week. This procedure minimized density effects collected ones. First, Lombaert et al. (2008) measured the (e.g., delayed growth or reduced fecundity in paired indi- survival rate during quiescence at low temperatures for bio- viduals owing to competition) whilst allowing multiple control and invasive European adults. Second, Facon et al. copulations. (2011) estimated the male reproductive success of biocon- For each fertilized female, the number of eggs laid dur- trol and invasive European adults. Third, Turgeon et al. ing seven consecutive days following the first clutch were (2011) assessed larval survival, age at first reproduction and counted and averaged to estimate the mean daily fecun- fecundity for individuals coming from biocontrol, Ameri- dity prior treatment. Females of each population were can and European invasive populations. We compiled these then infected with B. bassiana or remained untreated. It is published data with those obtained in our new study (see known to be a natural mortality agent among overwinter- above), to test for predictions described in Introduction ing adult coccinellids (Steenberg and Harding 2009). This regarding the impact of captive breeding practices on result has led some authors to suggest that B. bassiana H. axyridis. could be a potential candidate for the biological control of invasive populations of H. axyridis (Shah and Pell 2003; Kenis et al. 2008; Roy et al. 2011). The strain of New experiments: susceptibility to B. bassiana and B. bassiana used in this study corresponded to a commer- fecundity cial preparation (BotaniGardES®, strain GHA 2.2 9 1013 Population sampling and rearing conditions conidia per kg; Laverlam International Corporation, Five H. axyridis populations of three different types were Butte, USA) that was already used in an experiment used in this study, i.e. a laboratory-reared type commonly with H. axyridis (Roy et al. 2008). The concentration of used for biological control purposes as well as invasive and viable conidia was 6.4 9 108 per g. Infected females were native types. Two populations were collected from the singly held in a B. bassiana solution in plastic cups native range of H. axyridis in 2009 (Beijing in China and (2 cm93 cm) for 5 s (2.2 9 108 conidia per ml). The Fuchuk in Japan). Two invasive populations were collected exposures have been made during four consecutive days in North America and Europe between 2008 and 2009 with an equal representation of each population each day. (Quebec City in Canada and Bataszek in Hungary). One It has to be noted that no significant differences were population was obtained from a laboratory population of found between exposure days. The control females were a biocontrol agent producer (winged strain of H. axyridis; held singly in sterile distilled water for the same duration. Biotop company, Valbonne, France) in 2007. This bio- A total of 89 females were infected with the fungus and control population has been reared in laboratory condi- 48 females were used in controls. After exposures to fun- tions since 1982; this is for a minimum of 70 generations gus or sterile distilled water, all females were transferred (assuming 2.5 generations per year; Koch 2003; Koch individually into 9-cm-diameter Petri dishes and kept at et al. 2006). This population was commercialized and 24°C; L: D 14:10; 80% relative humidity. Subsequently, used for the biocontrol of aphids between 1995 and 1999 eggs were counted per female and removed on a daily throughout Europe (Ferran et al. 1997; Tourniaire et al. basis during 15 days to estimate the mean daily fecundity 2000). We reared the five populations for two generations after treatment. Mortality was recorded daily until 15 days under controlled conditions (24°C; L: D 14:10; 60% rela- after treatment. Dead individuals were transferred to 1.5- tive humidity) to minimize potential biases owing to mL Eppendorf tubes with moistened cotton to observe maternal effects until the third generation was used for external fungal growth and hence to confirm B. bassiana experiments. All populations were fed ad libitum with as likely cause of death. External fungal growth has been irradiated eggs of Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyrali- recorded for around 60% (with no differences between dae) for these generations as well as for the following populations) of treated females, as it is classically observed experiment. with this kind of bioassay.

Evolutionary changes in Harmonia axyridis Tayeh et al.

parts: neutral genetic diversity, traits counter-selected in Statistical analyses the laboratory and traits under positive selection in the All data were analysed using the software JMP 8.01 (SAS laboratory. Institute Inc., Cary, NC, USA). First, we calculated the pro- portional reduction in daily mean egg production for each Neutral genetic diversity female as follows: ReductionFecundity = (Daily fecundity prior treatment – Daily fecundity after treatment)/Daily fecundity Genetic drift is the most important of the random pro- prior treatment. This trait was then analysed using ANOVA cesses that influence the gene frequencies in a laboratory with population type (biocontrol, native or invasive), treat- colony (Joslyn 1984). To avoid a substantial loss of ment (infected or control) and population nested in popula- genetic diversity, Wajnberg (1991) recommended that tion type, as well as the interaction between population type laboratory cultures should be started with the maximal and treatment as fixed factors. Second, we analysed the effective population size, and maintaining a maximum mortality using GLM (binomial distribution) with popula- number, within the limitations imposed, during the entire tion type (biocontrol, native or invasive) and population rearing process. nested in population type as fixed factors. We excluded the In the case of H. axyridis, the European biocontrol pop- control females from this analysis because none of them ulation exhibits evidence of substantial genetic drift, as it died during the experiment. Therefore, the factor treatment harbours significantly lower genetic diversity (2.4 alleles was removed from the full model. For the dead infected per locus) than native (5.3–6.6 alleles per locus) or invasive females, the date of death (i.e. survival time) was analysed (4.1–6.5 alleles per locus; Lombaert et al. 2011) popula- using ANOVA with population type (biocontrol, native or tions. Because the European invasive population originated invasive) and population nested in population type as fixed from a genetic admixture between eastern North American factors. Finally, we used control females to analyse the founders and individuals from the laboratory European fecundity apart from the effect of the fungus using ANOVA biocontrol population (Lombaert et al. 2010), the level of with population type (biocontrol, native or invasive) and genetic diversity is also significantly lower in the European population nested in population type as fixed factors. biocontrol population than in the European invasive popu- For the response variables analysed using ANOVA, we per- lation (6.0 alleles per locus). formed two analyses, one with the original data and one with the traditional transformations (square root for fecun- Traits counter-selected in the laboratory dity, log for survival time and Box-Cox for ReductionFecundity; Sokal and Rohlf 1995). As similar results were obtained, In agreement with our predictions, the European biocon- only results from untransformed data will be reported. trol population exhibits lower performance than natural populations (Table 1). It has a significantly lower survival rate (41%) during quiescence at low temperatures com- Results and discussion pared to invasive European population (86%). Similarly, This study supports the predictions that laboratory condi- European biocontrol individuals are significantly more sus- tions have significantly impacted several characteristics of ceptible to B. bassiana infection than individuals collected H. axyridis (Table 1). We detailed these results in three from native or invasive populations. In the biocontrol

Table 1. Predictions and compilations of results regarding the impact of captive breeding practices in H. axyridis on various traits (for details, see Introduction and Results). Symbols + and indicate relatively high and low values of these traits, respectively, and NA indicates that the data are not À available.

Predictions for European European American the European biocontrol invasive invasive Native Trait considered biocontrol population population population population populations Sources

Genetic diversity + Lombaert et al. 2011; ÀÀÀÀ Survival in quiescence + NA NA Lombaert et al. 2008; ÀÀ Resistance to pathogen +++ This study ÀÀ Larval survival +++ NA Turgeon et al. 2011; À Delay before reproduction + NA Turgeon et al. 2011; ÀÀÀ Fecundity ++ This study & Turgeon et al. 2011; ÀÀÀ Male reproductive success ++ NA NA Facon et al. 2011 À

Tayeh et al. Evolutionary changes in Harmonia axyridis

On the contrary, the decrease of fecundity and the survival Table 2. Results of statistical analyses for reduction of fecundity, mor- time of the infected females owing to fungus infection are tality and survival time owing to fungus infection and for fecundity not influenced by the population type (i.e. biocontrol, without fungus infection. native or invasive; Table 2 and Fig. 2). Traits Test statistic P-value We suggest that both mortality during quiescence and mortality because of fungal infection can be viewed as (A) Fecundity reduction F (df) Population type 2.09 (2) 0.12 examples of adverse genetic changes as a result of captive Treatment 41.11 (1) 0.0001 rearing. An important issue raised by such adverse genetic Population (population type) 1.01 (2) 0.36 changes is how selection for laboratory-adapted genotypes Population type 9 treatment 1.38 (2) 0.25 may induce maladaptation to the field when laboratory- (B) Mortality L-R chi-square (df) reared individuals are introduced into the wild and repro- Population type 14.68 (2) 0.0007 duce among wild individuals. According to the literature, Population (population type) 0.17 (2) 0.92 characteristics selected under captive conditions are often (C) Survival time F (df) Population type 0.14 (2) 0.87 disadvantageous in natural environments (see for instance Population (population type) 0.19 (2) 0.82 Frankham et al. 1986; Fleming and Gross 1993; Reisenbich- (D) Fecundity F (df) ler and Rubin 1999; Chilcote 2003; Heath et al. 2003; Kra- Population type 6.12 (2) 0.005 aijeveld-Smit et al. 2006). The most emblematic examples Population (population type) 2.49 (2) 0.10 come from fishes where selection in hatcheries causes highly deleterious effects. For instance, lifetime reproductive success of hatchery fish stocks, once returned to the population, there are twice as many deaths as in the natural field, was found to be only 5–15% of that for the wild fish native and invasive populations (93% vs 38% and 46%, populations (Leider et al. 1990). In the case of H. axyridis, respectively; P = 0.0007) owing to B. bassiana infection, the decrease of survival during quiescence and pathogen whereas no significant differences in mortality are found resistance upon relaxation of selection suggests that there between invasive and native females (Table 2 and Fig. 1). exists a cost for both traits, either a quantitative cost or a

(A) (B) 100 a 8 a a a 80 6 60 b b 4 40 Mortality (%) 2 20 Survival time (days)

0 0 Biocontrol Invasive Native Biocontrol Invasive Native

Figure 1 Mean values for (A) mortality and (B) survival time owing to fungus infection, depending on the population type, i.e. biocontrol, invasive and native.

(A) (B) 50 Biocontrol 80 a Invasive 40 Native b b 40 30

20 0

10 –40 Fecundity reduction (%) Fecundity (# eggs per days) 0 Infected Control Biocontrol Invasive Native

Figure 2 Mean values for (A) fecundity without fungus infection and (B) fecundity reduction owing to fungus infection, depending on the population type, i.e. biocontrol, invasive and native.

Evolutionary changes in Harmonia axyridis Tayeh et al. trade-off with some other trait that has been selected in adaptation to laboratory conditions may also inadvertently laboratory conditions. The very poor survival rate at low select for values favouring establishment and range expan- temperatures of the biocontrol strain seems to be counter- sion in the field. With respect to H. axyridis, it seems to be selected in the field as the invasive European populations the case for larval survival and age at first clutch as Euro- show a much higher survival rate. Regarding the suscepti- pean invasive population has retained the biocontrol bility to B. bassiana, the invasive European population dis- genetic background associated to higher fitness. On the plays the same mortality owing to this fungus as the other hand, European invasive population displays lower invasive American population, which is twofold lower than fecundity than biocontrol individuals. It is more difficult to the biocontrol population. This result indicates that this envision how lower fecundity may be advantageous for the higher susceptibility of biocontrol population seems also to invasive European beetles. This result suggests that it may be counter-selected in the field. Both results are, at least exist a trade-off between fecundity and unknown trait(s) intuitively, not surprising as survival during quiescence and not considered in the study that could be selected in the resistance to pathogens are certainly important parts of the field. fitness of H. axyridis individuals during the invasion process of natural habitats. Conclusions A weakness of our study lies in the absence of replicate bio- Traits under positive selection in the laboratory control populations. Unfortunately, to our knowledge, The European biocontrol population displays higher values there remain only two biocontrol strains of H. axyridis for several traits suggesting a higher efficiency of directional (Biotop and Biobest; Turgeon et al. 2011). Furthermore, selection in the less multifaceted laboratory environment the Biobest strain was derived from the Biotop strain used (Table 1). Indeed, it has a significant higher male repro- in this study and thus even was it available to us, it would ductive success than the European invasive population be somewhat problematic as a replicate. Given this limita- (Facon et al. 2011). When competing with European inva- tion, we cannot rule out with certainty that the differences sive males, biocontrol males sire around 75% of offspring of life-history trait values observed in the biocontrol-type produced by females. Biocontrol females display also higher H. axyridis only stem from genetic drift, more especially as fecundity (average = 40.0 eggs per day) than native (aver- we demonstrated that the European biocontrol population age = 28.6 eggs per day) and invasive ones (28.2 eggs per exhibits evidence of substantial genetic drift. However, this day; Fig. 2 and Table 2). This trend is confirmed by Tur- would imply that only individuals with these trait values geon et al. (2011), who showed that biocontrol females lay were sampled in the creation of this laboratory mass-reared significantly more eggs (38.9 eggs per day) than females biocontrol population. It seems unlikely that genetic drift from the American (25.4 eggs per day) and European (29.5 alone can explain all the changes of trait values along our eggs per day) invasive populations. For two other traits, predictions on the impact of captive breeding and the biocontrol individuals performed better than American action of selection seems more parsimonious. Ruling out invasive individuals but not compared to European inva- this alternative hypothesis more definitively would require sive ones. Biocontrol individuals survive at significantly experimental selection, which would provide a better higher rates in the larval period (91%) and reproduce sig- understanding of the genetic architecture of the traits, and nificantly earlier (11.1 days after emergence on average) would give us information about the relative likelihood of than the American invasive population (73% and drift versus selection. 13.3 days, respectively) but not compared to European This study hence supports the predictions that biological invasive population (92% and 12.1 days). control agents can undergo drastic genetic and phenotypic A number of genetic adaptations to captivity have been changes as a consequence of laboratory conditions. How- previously suggested in a variety of taxa (Frankham 2008). ever, we are still at an early stage in understanding how Most of these cases also correspond to an increase of fecun- mass rearing of biological control agents can induce genetic dity and a reduction of development time (Hopper et al. changes of life-history traits important for the success of 1993; Frankham 2008). For instance, a threefold increase in field releases or for evolutionary trajectories of wild popu- reproductive fitness has been reported over 84 generations lations. We hope that our study will stimulate new research in the dipteran fly Drosophila (Gilligan and Frankham on this topic. 2003). The butterfly Pieris brassicae laid many more eggs in cage experiments and had a higher ovary mass when labo- Acknowledgements ratory reared for 100-150 generations than females from a stock recently obtained from the wild (Lewis and Thomas We thank D. Bourguet and N. Ris for comments and dis- 2001). For this kind of traits, we could envisage that cussions. This work was supported by grants from the

Tayeh et al. Evolutionary changes in Harmonia axyridis

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Evolutionary changes in Harmonia axyridis Tayeh et al.

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Article 2

Experimental evidence for the phenotypic impact of admixture between wild and biocontrol asian ladybird (Harmonia axyridis) involved in the European invasion.

doi: 10.1111/j.1420-9101.2011.02234.x

Experimental evidence for the phenotypic impact of admixture between wild and biocontrol Asian ladybird (Harmonia axyridis) involved in the European invasion

J. TURGEON* ,A.TAYEH ,B.FACON ,E.LOMBAERTà,P.DECLERCQ§,N.BERKVENS§, J. G. LUNDGREN– &A.ESTOUP *De´partement de Biologie, Universite´ Laval, Que´bec, QC, Canada INRA UMR Centre de Biologie et de Gestion des Populations (INRA ⁄ IRD ⁄ Cirad ⁄ Montpellier SupAgro), Montferrier-Sur-Lez, France àEquipe ‘‘Biologie des Populations en Interaction’’, INRA UMR 1301 IBSV (INRA ⁄ CNRS ⁄ Universite´ de Nice-Sophia Antipolis), Sophia-Antipolis, France §Laboratory of Agrozoology, Department of Crop Protection, Ghent University, Ghent, Belgium –USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD, USA

Keywords: Abstract adaptive evolution; Hybridization can fuel evolutionary processes during biological invasions. The admixture; harlequin ladybird Harmonia axyridis has long been used as a biocontrol agent biocontrol; before the species became invasive worldwide. Previous analysis based on biological invasion; microsatellite data has shown that European invasive populations bear traces Europe; of admixture between an eastern North American source, which is at the harlequin ladybird; origin of the worldwide invasion, and biocontrol strains used in Europe. In this Harmonia axyridis; study, we tested the hypothesis that this early admixture event may have Hybridization; fostered the European invasion by impacting on the phenotypes of wild life history; European populations. Mean life history traits of experimental F1 hybrids are phenotype. compared with pure parental sources and wild European crosses. Our results reveal a biased impact whereby North American beetles beneﬁtted from being admixed with European biocontrol strains. Resemblance between experimental hybrids and wild European invasive crosses further suggests a long-lasting effect of admixture that may still be at work and fostering invasiveness.

Hybridization is one way to foster such adaptive Introduction evolution during invasion (Ellstrand & Schierenbeck, Biological invasions offer prime examples of rapid, 2000; Rieseberg et al., 2007; Schierenbeck & Ellstrand, contemporary adaptive evolution (e.g. Reznick & 2009). Interspecific hybridization leads to new allelic Ghalambor, 2001; Lee, 2002; Facon et al., 2006; Carroll composition, and evolutionary novelties may become et al., 2007; Dlugosch & Parker, 2008; Prentis et al., 2008; fixed in allopolyploids or clonally reproducing lineages Suarez & Tsutsui, 2008). In the introduced range, new (e.g. Thompson, 1991; Abbott et al., 2003). At the selective regimes can cause genetically based shifts in intraspecific level, multiple introductions and admixture phenotypes that provide a greater fitness in the new of genetically differentiated source populations increase environment. Examples are quickly accumulating and genetic diversity and often result in novel genotypes include changes in tolerance to the abiotic environment in invasive populations (e.g. Kolbe et al., 2004; Darling and ⁄ or in major life history traits (e.g. Lee et al., 2003; et al., 2008). Hybrid vigour may favour heterozygotes in Bohn et al., 2004; Bossdorf et al., 2005; Xu et al., 2009). early generations (Lynch & Walsh, 1998) and change mean population phenotypes. Importantly, admixture Correspondence: Julie Turgeon, De´partement de biologie, Universite´ may also increase evolutionary potential when higher Laval, Vachon 3048, 1045 Avenue de la Me´decine, Que´bec City, QC, Canada G1V 0A6. genetic variance, involving novel, recombinant and Tel.: +1 418 656 3135; fax: +1 418 656 2043; potentially fitter phenotypes, translate in heritable phe- e-mail: [email protected] notypic variation, hence facilitating prolonged response

ª 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 1044–1052 1044 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY ª 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY

Admixture impacts on invasive H. axyridis 1045

to selection. Through these processes, invasive hybrid narios not involving admixture. Moreover, the microsat- populations may outperform parental sources, strongly ellite allele distribution in the European invasive indicating that admixture can promote invasiveness population taken as reference sample (Gent, Belgium) (Facon et al., 2005; Lavergne & Molofsky, 2007; Kolbe is better explained by invoking contributions from both et al., 2007; Facon et al., 2008; Keller & Taylor, 2010; eastern North American populations and biocontrol but see Wolfe et al., 2007). Certainly, hybridization and strain; at several loci, the few European biocontrol strain admixture may also have negative effects by disrupting alleles, of which some are not observed in America, are coadapted gene complexes and weakening local adapta- overrepresented and co-occur with alleles common in tions (e.g. Barton & Hewitt, 1985; Keller et al., 2000, America. Burke & Arnold, 2001; Bailey & McCauley, 2006). Given the success of the colonists from eastern North Demonstrating that admixture resulted in adaptive America at invading several remote areas, parsimony evolution and so enabled a species to become invasive is suggests that the most important evolutionary shift not an easy task. It first requires that the identity of the enabling HA invasion has occurred in eastern North ancestral populations at the origin of admixed invasive America following the introduction from the native population be known (Keller & Taylor, 2008; Estoup & range. The nature of this shift remains unknown. Guillemaud, 2010). Second, differences between derived Moreover, it appears that admixture may not be neces- and parental populations must confer higher fitness to sary for invasiveness to develop in other areas colonized admixed individuals and should not be because of chance by eastern North American propagules. Indeed, there are events (Wolfe et al., 2007; Xu et al., 2009). Ideally, the no traces of admixture in South America, and HA was fitness advantages should be matched with the new never used for biocontrol in South Africa prior to the selective challenge imposed by the new environment in recent invasion. Nevertheless, the admixture between the introduced range and ⁄ or their impact on population eastern North American HA and the European biocontrol growth, survival and expansion should be quantified. strain evidenced in Lombaert et al. (2010) may have Native to Asia, the coccinellid Harmonia axyridis (Pallas) played a role in impeding or facilitating the first outburst (HA) has been introduced repeatedly in North America in Europe. The positive influence of admixture is classi- as a biocontrol agent against aphids since 1916 (Tedders cally associated with heterosis, i.e. admixed individuals & Schaefer, 1994; Krafsur et al., 1997) and in Europe display higher fitness than the mean of parental sources. and South America since 1980s (Ongagna et al., 1993; In the context of the European invasion by HA, however, Poutsma et al., 2008). These biocontrol strains were we are especially interested by the positive or negative developed from small samples originating from various consequences of admixture on the fitness of American regions of the vast native area. Despite recurrent inten- propagules. tional releases, the species did not establish for decades. This study hence follows from our previous knowledge However, for unknown reasons, it recently and suddenly of the global H. axyridis invasion routes indicating that became invasive in eastern and western North America invasive European HA derive from the admixture in 1988 and 1991 (USA, Chapin & Brou, 1991; LaMana & between wild invasive populations from eastern North Miller, 1996), Europe in 2001 (Belgium, Adriaens et al., America and the European biocontrol strain (Lombaert 2003), South America in 2001 (Argentina, Saini, 2004) et al., 2010). We specifically tested the hypothesis that and Africa in 2004 (South Africa, Stals & Prinsloo, 2007). this admixture event affected HA life history traits early The species has spread widely in these areas where it during the European invasion. Experimental crosses consumes nontarget arthropods, invades households and between biocontrol and American harlequin ladybird is a pest of fruit production (Koch, 2003; Koch & Galvan, were performed to obtain admixed individuals. The 2008). impact on mean life history trait values was examined On the basis of analysis of neutral genetic variation, in the first hybrid generation and reveal that American Lombaert et al. (2010) recently retraced the routes of all HA benefited from admixture. Also, phenotypic resem- five worldwide HA invasions. Eastern and western North blance between experimentally admixed and wild inva- American invasive populations originate from two inde- sive European HA offers support for a long-term impact pendent introductions from the native Asian range. of admixture in the invasion process in Europe. Surprisingly, eastern North America is the source of colonists for all other successfully invaded areas. In South Materials and methods America and South Africa, invasive populations bear no trace of genetic admixture with other sources. In Europe, Experimental procedures however, there is clear evidence of admixture between eastern North American and the local biocontrol strain We used invasive populations from eastern North Amer- (with a contribution of biocontrol genes estimated at ica and European biocontrol strains as the two parental 43%, 95% CI: 18–83%; Lombaert et al., 2010). The types (American, Biocontrol). One American population admixture scenario in Europe is strongly supported by was sampled in the late summer of 2009 in Quebec City, quantitative comparisons with alternative invasion sce- Quebec, Canada (hereafter ‘Q’). The other was sampled

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in October 2007 in Brookings, South Dakota, USA Table 1 Description of Harmonia axyridis experimental crosses. (hereafter ‘D’) and was kept in the laboratory for two Admixed crosses (QB, QT, DB, DT, underlined) involve reciprocal generations before this experiment started in the fall of crosses between sexes (e.g. QB = QF · BM and QM · BF). 2009. South Dakota is located in central North America, Crosses but close monitoring of the spatial expansion of the invasion as well as microsatellite data (E. Lombaert & Status Provenance Pop ⁄ Strain QDBTG A. Estoup, unpublished data) indicate that H. axyridis Invasive North Quebec (Q) QQ – QB QT – from this state derived from the eastern North American America S. Dakota (D) DD DB DT – invasion originating from Louisiana (Koch et al., 2006). Biocontrol European Biobest (B) BB – – In Europe, three commercial H. axyridis strains have been biocontrol Biotop (T) TT – used for biocontrol, all being derived from the INRA Invasive Europe Ghent (G) GG strain (Institut National de Recherche Agronomique, France) first released in France in 1982. Microsatellite genotyping of HA samples collected in these biocontrol G adults strains confirmed that they are derived from the original 1 20F × 20M INRA strain (unpublished results). Here, we used two (7–10 days) strains that were in use in Europe when the first invasive population was reported in 2001 (Adriaens et al., 2003); the third strain no longer exists. The first strain originates F ………….....F from the company Biobest NV (hereafter ‘B’) and 1 20 was maintained in a laboratory at Ghent University Eggs (Belgium) at low population size for over 60 generations. The second strain was commercialized by the firm Biotop SA (hereafter ‘T’) until 2000 and was also maintained in Hatching rate* (%) E1……....……..E 20 the laboratory for many generations at INRA and then at N = 204 Larvae Biotop rearing facilities. It is worth noting that this is not Development the Biotop flightless strain (Tourniaire et al., 2000a,b) time (days) L1………..….. L 50 first released in France in 2000 and which is the only Larval survival* (0/1) N = 585 biocontrol strain used in Europe since 2002. Finally, N = 666 we used a wild invasive European population sampled G2 adults in 2009 in Belgium (Ghent, hereafter ‘G’), the area where the European invasion began in the early 2000s NO food Food (M, F) (F) (Adriaens et al., 2003, 2008; Brown et al., 2008). Based Age at first on data at 18 microsatellite loci, genetic diversity and Survival in clutch (days) Male levels of differentiation vary sharply among these pop- starvation N = 191 ulations and strains (unpubl. data). The two biocontrol (days) (random) strains have relatively low genetic diversity (expected N = 202 heterozygosity: 0.31 and 0.38 in B and T, respectively), Fecundity* Death Eggs and they are strongly differentiated from one another (N eggs per day) (Fst = 0.38) as well as from every other wild invasive N = 191 population (Fst = 0.16–0.33, mean: 0.26). In contrast, wild populations are genetically more diverse (expected Fig. 1 Harmonia axyridis life history traits estimated for each exper- heterozygosity: 0.57, 0.58 and 0.61 in D, Q and G, imental cross (see Table 1), along with total sample sizes. G2-larvae and G -adults were kept individually in separate Petri dishes. respectively), with the American populations not differ- 2 Variables followed by a star were used to calculate the composite entiated from one another (Fst = 0) and only moderately fitness index for 147 G1-females (Fitness Index = Hatching differentiated from Ghent (Fst = 0.034–0.046). Rate · Larval Survival · Fecundity). To reduce maternal effect, 50–60 individuals from each available population or strain (experimental G0) were Each American population (Q and D) was crossed with kept separately in the laboratory for one generation prior each biocontrol strain (B and T), including reciprocal to the experimental crosses. For each population or crosses between the sexes, totalling eight crosses; intra- strain, 20 couples were bred separately to produce the population ⁄ strain crosses were also performed including next generation (G1). Upon emergence, adult males and that of the wild invasive European population (G), females (G1) were kept separated until all individuals totalling five additional crosses (Table 1). These 13 were at least 1 week old. Rearing conditions remained crosses are grouped into four Types, namely American, constant for the entire experiment (23 °C; 65% RH; L : D Biocontrol, Admixed and Europe. For each cross, 20 G1- 14 : 10). Individuals were fed ad libitum with irradiated females were placed with 20 G1-males in a large box and eggs of Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae). allowed to mate (Fig. 1). Seven to ten days elapsed before

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Admixture impacts on invasive H. axyridis 1047

females were isolated in Petri dish and data collection yses were performed with pooled reciprocal crosses (DB, started. DT, QB, QT). For each cross, several life history traits were recorded First, we tested the hypothesis that admixed individ- for the G2-individuals (Fig. 1). Hatching rate (HatchRate) uals are different from parental source(s). To do so, we was estimated as the proportion of eggs that developed tested for differences among the three corresponding into larvae. This was estimated as the mean hatching rate Types of crosses, i.e. Admixed, Biocontrol and American.We of two clutches from each of 11–20 females that laid eggs used hierarchical general linear models with Cross nested per cross. Larvae were then kept individually, and larval within Type while specifying the appropriate distribution survival (LarvSurv) to successful pupation was recorded (normal, Poisson or binomial). When a Type effect was (0 or 1) for a mean of 50 individuals per cross (mean of detected, we performed pairwise contrasts between Types 2.90 larvae per female for 12–20 females per cross). to determine which Type differed and whether differ- Development time (DevoTime, days) from egg to pupation ences indicated lower or higher fitness. Higher values was recorded for a mean of 45 individuals per cross for HatchRate, LarvSurv, Fecund and StarvSurv, as well as (mean of 3.26 individuals per female for 12–20 females lower values for AgeClutch and DevoTime, were considered per cross). indicative of higher fitness. For these variables, we also G2-adults were then separated in two groups (see tested whether there was evidence of heterosis, i.e. if Fig. 1). A subset of females were kept individually and hybrids had mean trait values suggesting higher fitness fed upon emergence. These were used to record the age than the mean traits of parents. This was performed by at laying of the first egg clutch (AgeClutch), fecundity testing whether the mean of each admixed cross was (Fecund) and a composite fitness estimate (FitIndex). At higher (LarvSurv, Fecund, FitIndex) or lower (AgeClutch) age 7–10 days, each female was presented with a male than the mean of pure parental crosses [e.g. DB vs. mean for 24 h. Males were of similar age and randomly selected (DD, BB)] using one-sided Tukey–Kramer HSD tests for from a pool of males containing a balanced mix of males Fecund and FitIndex, Wilcoxon rank-sum test for AgeClutch from each cross. The next day, they were offered another and logistical regression (modelling error variance with such male, again for 24 h. In cases where the females did binomial distribution) for LarvSurv. not lay eggs within the next week, this procedure was Second, we compared wild invasive European H. axy- repeated. AgeClutch was estimated as the number of days ridis (Europe, represented by cross GG) with the other elapsed from pupation to the first clutch. The number of three Types to determine whether European invasive eggs laid over eight consecutive days following the first were different from Admixed and ⁄ or most similar to either clutch were counted and averaged to estimate Fecund. alleged parental source (Biocontrol and American). To do The composite fitness estimate (FitIndex) was calculated so, we performed GLM analysis as above, using only for 147 G2-females by multiplying HatchRate, LarvSurv the Type effect, followed by contrasts between Europe and (expressed in %) and Fecund. Individuals (both males and the other three Types. Tukey–Kramer HSD tests provided females) not used for AgeClutch and Fecund were kept highly similar results (not shown). All analyses were individually without any food upon emergence. The performed with JMP 8.01 (SAS Institute 2009, JMP, number of days they survived was recorded as the release 8.01: SAS Institute, Cary, NC, USA). starvation survival period (StarvSurv). Results Statistical analyses For each variable, Table 2 summarizes results for Types and For each variable, conformance to Normal and Poisson Crosses within Types. Variables were not correlated globally, distributions was appraised with Shapiro Wilk W and within Type or within Cross. While a few odd correlations Kolmogorov’s D tests, respectively. Larval survival were detected, they were generally only slightly signifi- coded as 0 (death) and 1 (survival) was treated as cant (0.01 < P < 0.09), and the same variables were not binomial. All time variables (estimated in days) were correlated in more than two Cross comparisons. Poisson-distributed, whereas Fecund and FitIndex were GLM statistical results are reported in Table 3. For normally distributed. HatchRate was arcsin-transformed HatchRate, StarvSurv and DevoTime, there were no signif- to approach normality. For each variable, differences icant Type effect detected among Admixed, American and between reciprocal crosses (e.g. cross DB: DF · BM vs. Biocontrol (P > 0.39). For LarvSurv, AgeClutch, Fecund and DM · BF) were assessed by means of Tukey–Kramer FitIndex, highly significant statistical Type effects were HSD tests as well as hierarchical ANOVAs with female detected (P < 0.01). In these cases, pairwise contrasts origin nested within female Type (B or T within indicated that American was significantly different from Biocontrol; D or Q within American). The vast majority Admixed and Biocontrol, but the two latter types were not of reciprocal crosses displayed no significant differences different (Fig. 2a–d). American crosses had lower larval (results not shown). The only significant difference was survival and laid their first clutch when they were older between DevoTime for DM · BF vs. DF · BM (P = 0.013) than Admixed and Biocontrol crosses. Fecundity was also when using HSD tests. Therefore, all subsequent anal- lower in American than in Admixed and Biocontrol crosses.

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Table 2 Mean values (and SEM) for life history traits estimated in Harmonia axyridis experimental crosses. Values for reciprocal admixed crosses (QB = QF · BM and QM · BF) are pooled. See Table 1 for codes and cross description.

American Biocontrol Admixed Europe

Type cross DD QQ Total BB TT Total DB DT QB QT Total GG Grand total

Hatching rate Mean 73.83 73.88 73.85 66.41 78.87 73.14 75.43 75.44 76.21 76.97 76.02 77.28 75.29 SEM 4.35 4.24 2.99 3.56 2.45 2.32 3.03 2.54 2.17 2.79 1.33 3.09 1.02 N 15 14 29 17 20 37 34 34 30 33 131 16 213 Larval survival % 67.9 78.8 73.1 88.0 94.0 91.0 91.0 91.1 88.5 91.2 90.4 92.2 87.84 N 56 52 108 50 50 100 100 101 104 102 407 51 666 Development time (days) Mean 20.47 19.20 19.81 20.14 20.09 20.11 20.15 19.52 19.49 19.22 19.59 19.43 19.69 SEM 0.14 0.17 0.13 0.13 0.07 0.07 0.12 0.08 0.12 0.10 0.06 0.14 0.04 N 38 41 79 44 47 91 91 92 92 93 368 47 585 Age ﬁrst clutch (days) Mean 12.79 13.92 13.31 11.47 10.80 11.13 10.69 11.68 10.68 11.57 11.16 12.14 11.52 SEM 0.99 1.48 0.86 0.69 0.78 0.52 0.26 0.48 0.28 0.43 0.19 0.91 0.20 N 14 12 26 15 15 30 29 31 31 30 121 14 191 Fecundity (egg ⁄ day) Mean 22.91 28.33 25.41 31.26 46.48 38.87 35.96 34.80 39.00 33.48 35.82 29.54 34.43 SEM 2.09 1.48 1.40 3.25 1.51 2.26 1.57 1.88 2.09 1.82 0.94 2.30 0.79 N 14 12 26 15 15 30 29 31 31 30 121 14 191 Composite ﬁtness index (egg ⁄ day) Mean 14.26 16.47 15.30 20.13 33.86 27.23 26.36 22.83 27.49 25.91 25.59 21.28 24.15 SEM 2.54 2.01 1.62 2.62 2.16 2.10 2.46 1.63 2.37 2.04 1.06 2.35 0.85 N 10 9 19 14 15 29 20 23 21 22 86 13 147 Survival in starvation (days) Mean 8.21 8.07 8.14 8.41 7.53 7.97 7.37 7.39 7.94 8.03 7.69 8.00 7.82 SEM 0.61 0.38 0.36 0.26 0.24 0.19 0.26 0.34 0.30 0.28 0.15 0.33 0.11 N 14 14 28 17 17 34 30 31 32 31 124 16 202

Table 3 Results of nested GLM analyses (and pairwise contrasts) testing for differences in H. axyridis life history variables among parental (American: AME and Biocontrol: BIO) and Admixed (ADM) cross types. Signiﬁcant P-values are shown in bold.

Type (d.f. = 2) Cross (Type) (d.f. = 5) Type Contrasts

Larval survival v2 P-value v2 P-value AME-BIO AME-ADM BIO-ADM Pattern

Hatching rate 1.84 0.39 6.28 0.27 – – – – Larval survival 19.21 < 0.001 3.39 0.64 < 0.001 < 0.001 0.77 AMEfl Development time 0.30 0.59 1.46 0.57 – – – – Age at first clutch 8.94 0.011 3.33 0.65 0.018 0.003 0.98 AME› Fecundity 28.49 < 0.001 2.09 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.11 AMEfl Composite fitness 21.07 < 0.001 18.61 0.002 < 0.001 < 0.001 0.49 AMEfl Survival (no food) 0.77 0.68 2.35 0.79 – – – –

The two Biocontrol crosses were variable, but nevertheless when Quebec served as one parent (for DB vs. (DD, BB); averaged higher than American crosses (Table 2). FitIndex DT vs. (DD, TT); QB vs. (QQ, BB) and QT vs. (QQ, TT): 2 varied as fecundity, one of its component variables. v1 = 7.36, 1.12, 5.09, 1.23 and one-sided P = 0.003, Heterosis was apparent, but affected crosses differently 0.010, 0.133, 0.144, respectively). Evidence for heterosis for different life history traits. There was no evidence for was also found for Fecund; mean parental values were heterosis for AgeClutch (for DB vs. (DD, BB), DT vs. (DD, lower than those of the admixed cross only when the TT), QB vs. (QQ, BB) and QT vs. (QQ, TT); Z = 1.37, 1.33, Biobest strain served as one parent (DB < mean (DD, BB) )0.76, )0.49 and one-sided P = 0.084, 0.091, 0.222, and QB < mean (QQ, BB); HSD one-sided P = 0.002). 0.310, respectively). There was heterosis for LarvSurv This same pattern was detected for FitIndex, which only when the Dakota population was involved, but not involves fecundity (HSD one-sided P = 0.002).

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Admixture impacts on invasive H. axyridis 1049

(a) (b) 100 15 a b b a b b 95 A B B B 14 A B B AB 90 13 85 12 80 11 75 10 70 9

Larval survival (%) 65 8 America Biocontrol Admixed Europe Age at first clutch (days) America Biocontrol Admixed Europe

Fecundity (eggs per day) America Biocontrol Admixed Europe America Biocontrol Admixed Europe Fitness index (eggs per day)

Fig. 2 Mean Harmonia axyridis trait values by Type (American, Biocontrol, Admixed and Europe) for variables showing Type effect (see Table 3). Error bars indicate SEM. Types with same letter are not signiﬁcantly different. Small letters refer to tests for differences between Admixed and parental types (American and Biocontrol). Capital letters refer to tests comparing all four cross Types (American, Biocontrol, Admixed and Europe).

Comparisons among all four cross types indicated a strongest trend was that admixed individuals possessed 2 strong Type effect (LarvSurv: v3 = 21.75, P < 0.001; Age- mean trait values different from American HA. Admixed 2 2 Clutch: v3 = 9.12, P = 0.0277; Fecund: v3 = 29.71, individuals survived better in the larval period, females 2 P < 0.001; FitIndex: v3 = 20.63, P=0.001). Comparisons laid more eggs and at an earlier age. Changes in larval between European invasive and the three other Types survival and fecundity coincided with egg hatching rate revealed that Europe was never different from Admixed and so resulted in a higher composite fitness estimate of (P > 0.13, Fig. 2a–d). For LarvSurv, Europe was similar to admixed relative to American individuals. Moreover, Admixed and Biocontrol and clearly significantly higher differences between admixed and American HA were all than American (P = 0.003, Fig. 2a). For AgeClutch, Fecund biased towards values contributing to faster population and FitIndex, Europe was intermediate between American increase rate in the admixed crosses. In contrast, admixed and the other two Types. American was not different from individuals were similar to the biocontrol type for these Europe for these traits (Fig. 2b–d; P > 0.32), but never- traits and never possessed values suggesting lower theless remained significantly different from Biocontrol fitness. This biased impact suggests that American HA and Admixed (P < 0.02, Fig. 2b; P < 0.001, Fig. 2c; can benefit from admixture. Despite recurrent use in P < 0.003, Fig. 2d). agriculture, historical and genetic data indicate that, at . least in Europe, the biocontrol strains never established and spread in natura. The biocontrol strains used in Europe seemingly possess unfavourable characteristics at Discussion some other important fitness-related traits not investi- Our precise knowledge of invasion routes of H. axyridis gated in this study. For example, the Biotop strain has (Lombaert et al., 2010) allowed generating the hypoth- been shown to have lower hatching rate and very poor esis that hybridization between eastern North American survival rate at low temperature (5–15 °C) compared populations and the European biocontrol strain might with invasive European populations (Lombaert et al., have had an impact early during the European outburst. 2008); these debilitating traits may have prevented its On one hand, the eastern North American propagules, establishment in Europe. Nevertheless, both biocontrol having spread worldwide, were probably already invasive strains can, via admixture, enhance fitness-related trait when they reached Europe. On the other hand, the value of American populations. European biocontrol strains seem to have been unable to It could be argued that the observed bias in the effect of establish sustained populations (Ferran et al., 1997) and admixture, which mostly changed traits of the wild are thus likely to have low overall fitness in the wild. It American type, simply reflects the acquisition of alleles was hence hypothesized that such an admixture could conferring trait values favourable in the laboratory either enhance or restrict the invasive process in Europe. environment, for which biocontrol strains have long Our experimental results show that admixed HA were been indirectly selected for. However, the wild invasive often different from at least one parental type. The European beetles were generally similar to the admixed

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and biocontrol individuals, indicating that the laboratory Ghent sample is from 2009. Given that HA can produce environment is not, per se, the sole factor at work to 2–3 generations per year (Koch et al., 2006), ca. 20 explain the observed phenotypic effects. Likewise, het- generations of evolution in natural settings might have erosis does not appear to be a common cause for the elapsed. This time lag between experimentally admixed change in life history traits of the admixed individuals. individuals (F1) and wild invasive European HA (Fn) For fecundity (and the composite fitness index including may, in fact, reveal the action of natural selection in fecundity), heterosis was observed only when crosses nature on F1 hybrids. In this case, our results showing involved the biocontrol strain Biobest. This strain is that F1 admixed HA are not significantly different from characterized by a low fecundity relative to the biocon- wild invasive European HA, while differing from the trol strain Biotop, as well as a suite of trait values American parental source, would strongly suggest that suggesting lower general fitness (lower egg hatching and phenotypic changes operating in the early admixture larval survival rate, greater age at first clutch, Table 2) stage are, to a large extent, maintained in further We suspect that the Biobest laboratory strain we used generations. Alternatively, the intermediate values of was subjected to long-term low effective population size, European invasive relative to representative of American and our experimental admixture per se may indeed have and biocontrol parental types may only result from been beneficial for this strain. In any cases, crosses additive effects. Nonetheless, these values would confer between both American sources and either biocontrol higher population increase rate (fitness) to the admixed strains resulted in similar fecundity levels in Admixed individuals. individuals (GLM: v2 = 4.94, d.f. = 3, P = 0.17), suggest- Our experimental design was inspired from the ing that crossing these two specific HA types does cause inferred invasion route indicating that European invasive increased fitness in admixed individuals relative to the genotypes are admixed HA between biocontrol and American parents. American sources at neutral genetic loci. Here, we show General resemblance between experimentally admixed that life history traits of experimentally admixed indi- and wild invasive European HA bring support to the viduals were also affected. Having used only two popu- hypothesis that the admixture process affected important lations for the American parental type, and a single phenotypic characteristics of the resulting invasive pop- population to represent invasive European HA, it obvi- ulations. For larval survival and the age at first clutch, ously cannot be strictly affirmed that our results are fully admixed and European crosses were comparable with representative of what happened in the wild early during the biocontrol strains, possessing higher mean trait the European invasion. Nevertheless, despite the varia- values compatible with higher fitness. For these traits, tion present between American populations (e.g. Larv- it thus appears that admixed European invasive popula- Surv, Fecund, Table 2), the latter were clearly affected tions have retained the biocontrol genetic background by admixture. Also, the extant Ghent population was the associated to higher fitness. In contrast, the European best choice for comparison with F1 hybrids probably cross displayed lower fecundity than the biocontrol formed in this area where the European invasion began strains. Higher fecundity in these two biocontrol strains in the early 2000s. Overall, our experiment may not be relative to other invasive European populations has an exact reproduction of the admixture event, but our already been documented (Lombaert et al., 2008), sug- results show quite clearly that biocontrol strains can gesting that our results are representative of a real favourably affect wild population via admixture. It is difference. It is difficult to envision how lower fecundity worth noting that genetic differentiation at neutral loci may be advantageous for the invasive European beetles. was not always related to phenotypic resemblance. For The intermediate fecundity of European beetles may example, American populations were phenotypically simply reflect their intermediate (i.e. hybrid) ancestry very different from wild European HA, yet they were and segregation of additive genetic effects. However, only slightly genetically differentiated (Fst = 0.034– when fecundity is combined with larval survival and 0.046, unpublished data). In contrast, the strong genetic hatching rate into the composite fitness index, invasive differentiation of each biocontrol strain with wild pop- European HA resemble both admixed and biocontrol ulations (Fst = 0.26–0.42, unpublished data) was paral- types. Given that fecundity is often related to fitness, leled by either strong (with American) or generally weak there may also exist a trade-off between fecundity and (with Europe) phenotypic differences. As per other unknown trait(s) not considered in that study. studies (Dlugosch & Parker, 2008; Keller & Taylor, Differences in values between experimentally admixed 2008), these comparisons stress the fact that neutral and wild invasive European HA relative to the parental genetic characteristics, while crucial for reconstructing sources may partly results from the fact that this invasion routes, are not sufficient to inform on the comparison involves two types of hybrids. In our exper- adaptive processes at work during invasions. iment, we measured phenotypic traits in F1 hybrids Experimental evidence is accumulating that admixture raised in the laboratory. The invasive European popula- can effectively fuel both early and late HA invasion stages tion used for comparison is likely not composed of F1 in Europe. In this study, we reproduced the initial hybrids. The invasion was detected in 2001, and our European admixture event previously evidenced by

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Admixture impacts on invasive H. axyridis 1051

neutral genetic markers. We show that American prop- Bossdorf, O., Auge, H., Lafuma, L., Rogers, W.E., Siemann, E. & agules benefit from contacts with biocontrol strain, Prati, D. 2005. Phenotypic and genetic differentiation between leading to phenotypes resembling established invasive native and introduced plant populations. Oecologia 144: 1–11. European populations. Recently, Facon et al. (2011) Brown, P.M.J., Adriaens, T., Bathon, H., Cuppen, J., Goldaraz- showed that admixture with another biocontrol strain ena, A., Ha¨gg, T. et al. 2008. Harmonia axyridis in Europe: spread and distribution of a non-native coccinellid. Biocontrol still used in Europe (i.e. the flightless strain, also derived 53: 5–21. from the initial INRA biocontrol strain; Tourniaire et al., Burke, J.M. & Arnold, M.L. 2001. Genetics and the fitness of 2000a,b) can further affect the phenotypic characteristics hybrids. Annu. Rev. Ecol. Syst. 35: 31–52. of contemporary invasive European populations. These Carroll, S.P., Hendry, A.P., Reznick, D.N. & Fox, C.W. 2007. two genetically differentiated HA types breed readily in Evolution on ecological time-scales. Funct. Ecol. 21: 387–393. the laboratory, and admixed offspring differ from paren- Chapin, J.B. & Brou, V.A. 1991. Harmonia axyridis (Pallas), the tal types in terms of development time and their ability 3rd species of the genus to be found in the United States to withstand starvation periods. Moreover, mate choice (Coleoptera, Coccinellidae). Proc. Entomol. Soc. Wash. 93: 630– experiments revealed that males of the biocontrol flight- 635. less strain sired more offspring, suggesting that admixture Darling, J.A., Bagley, M.J., Roman, J., Tepolt, C.K. & Geller, J.B. 2008. Genetic patterns across multiple introductions of the may be fostered by invasive female preferences and or ⁄ globally invasive crab genus Carcinus. Mol. Ecol. 17: 4992– biocontrol male superiority. Altogether, it thus appears 5007. that both the initial propagule and the ensuing admixed Dlugosch, K.M. & Parker, I.M. 2008. Founding events in species wild invasive HA can benefit from genetic introgression invasions: genetic variation, adaptive evolution, and the role with biocontrol individuals. Given the invasive success of of multiple introductions. Mol. Ecol. 17: 431–449. propagules from eastern North America in South Amer- Ellstrand, N.C. & Schierenbeck, K.A. 2000. Hybridization as a ica and South Africa (Lombaert et al., 2010), admixture stimulus for the evolution of invasiveness in plants? Proc. Natl. may not have been necessary for the spread of HA in Acad. Sci. USA 97: 7043–7050. Europe. Nevertheless, biocontrol strains can effectively Estoup, A. & Guillemaud, T. 2010. Reconstructing routes of contribute to phenotypic changes compatible with higher invasion using genetic data: why, how and so what? Mol. Ecol. 19: 4113–4130. invasion potential. A simple precautionary principle calls Facon, B., Jarne, P., Pointier, J.P. & David, P. 2005. Hybridiza- for ceasing to release HA strains for biocontrol control in tion and invasiveness in the freshwater snail Melanoides Europe, irrespective of their flying ability. tuberculata: hybrid vigour is more important than increase in genetic variance. J. Evol. Biol. 18: 524–535. Acknowledgments Facon, B., Genton, B.J., Shykoff, J., Jarne, P., Estoup, A. et al. 2006. A general eco-evolutionary framework for understand- This work was supported by grants from the Agence ing bioinvasions. Trends Ecol. Evol. 21: 130–135. Nationale de la Recherche (ANR-06-BDIV-008-01) and Facon, B., Pointier, J.P., Jarne, P., Sarda, V. & David, P. 2008. from the Agropolis Fondation (RTRA – Montpellier, High genetic variance in life-history strategies within invasive BIOFIS Project). We are grateful to A. Loiseau for help in populations by way of multiple introductions. Curr. Biol. 18: 363–367. the laboratory during rush periods. Facon, B., Crespin, L., Loiseau, A., Lombaert, E., Magro, A. & Estoup, A. 2011. Can things get worse when an invasive References species hybridizes? The harlequin ladybird Harmonia axyridis in France as a case study. Evol. Appl. 4: 71–78. Abbott, R.J., James, J.K., Milne, R.I. & Gillies, A.C.M. 2003. Ferran, A., Giuge, L., Brun, J., Gambier, J. & Kabiri, F. 1997. Plant introductions, hybridization and gene flow. Philos. Trans. Coccinelle Harmonia axyridis pallas: mise au point sur son R Soc. Lond. B Biol. Sci. 358: 1123–1132. introduction et son utilisation en lute biologique. Adalia 36: Adriaens, T., Branquart, E. & Maes, D. 2003. The multicoloured 21–24. Asian Ladybird Harmonia axyridis Pallas (Coleoptera: Cocci- Keller, S.R. & Taylor, D.R. 2008. History, chance and adaptation nellidae), a threat for native aphid predators in Belgium? Belg. during biological invasion: separating stochastic phenotypic J. 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ª 2011 THE AUTHORS. J. EVOL. BIOL. 24 (2011) 1044–1052 JOURNAL OF EVOLUTIONARY BIOLOGY ª 2011 EUROPEAN SOCIETY FOR EVOLUTIONARY BIOLOGY

Article 3

Cannibalism in invasive, native and biocontrol populations of the harlequin ladybird.

1 Cannibalism in invasive, native and biocontrol populations of the harlequin ladybird

3 Ashraf Tayeh1*, Arnaud Estoup1, Eric Lombaert2, 3,4, Thomas Guillemaud2, 3,4, Natalia

4 Kirichenko5, Lori Lawson-Handley6, Patrick De Clercq7 and Benoît Facon1

6 1Inra, UMR 1062 CBGP Montpellier, France

7 ²INRA, UMR 1355 Institut Sophia Agrobiotech, F-06903 Sophia Antipolis, France

8 3Université de Nice-Sophia Antipolis, UMR Institut Sophia Agrobiotech, F-06903 Sophia

9 Antipolis, France

10 4CNRS, UMR 7254 Institut Sophia Agrobiotech, F-06903 Sophia Antipolis, France

11 5V.N. Sukachev Institute of Forest, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences,

12 Akademgorodok 50/28, Krasnoyarsk 660036, Russia

13 6Evolutionary Biology Group, School of Biological, Biomedical and Environmental

14 Sciences, University of Hull, Cottingham Road, Kingston-Upon-Hull, HU6 7RX, United

15 Kingdom

16 7Department of Crop Protection, Ghent University, Coupure Links 653, B-9000 Ghent,

17 Belgium

19 * To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]

21 Running head: Cannibalism in an invasive ladybird

1 Abstract

2 Background: Cannibalism is widespread in both vertebrates and invertebrates but its extent

3 is variable between and within species. Cannibalism depends on population density and

4 nutritional conditions, and could be beneficial during colonisation of new environments.

5 Empirical studies are needed to determine whether this trait might facilitate invasion of a

6 new area in natural and/or artificial (i.e. laboratory) systems. We investigated the evolution

7 of cannibalism during invasion in the harlequin ladybird Harmonia axyridis after

8 introduction and during spatial expansion in Western Europe, as well as in laboratory-reared

9 biocontrol populations. We measured the cannibalism rates of eggs by first instar larvae and

10 adult females at two different individual densities of ladybirds from three types of

11 population (invasive, native and biocontrol), in laboratory-controlled conditions.

12 Results: Larvae from invasive populations in Western Europe have a significantly higher

13 propensity for cannibalism than larvae from the native range, perhaps because H. axyridis

14 larvae may have faced a nutritionally stressful situation in the new environment of the

15 invaded area. However, no significant difference in cannibalism rate from the core to the

16 front of the invaded area in Western Europe was observed by larvae or adults. Larvae from

17 laboratory-reared biocontrol populations showed a significantly lower propensity for

18 cannibalism than larvae from wild (native or invasive) populations. This may result from the

19 peculiar eco-evolutionary constraints of captive rearing. The norm of reaction of

20 cannibalism to individual density did not change significantly during the invasion and/or

21 laboratory rearing processes. Finally, in contrast to larvae, invasive adults do not show any

22 significant difference in the propensity for cannibalism compared to native and biocontrol

23 ones.

1 Conclusion: This study is the first to provide evidence for a rapid increase of cannibalism in

2 natural invasive populations. Our experiments shed also light on the difference in

3 cannibalism evolution with respect to life stages. However, we are still at an early stage in

4 understanding the underlying mechanisms and several research perspectives are needed to

5 determine whether the evolution of increased cannibalism can be a general feature of the

6 invasion process.

7 Keywords

8 Harmonia axyridis; cannibalism; evolution, invasive, native and biocontrol populations

1 Background

3 Cannibalism is ubiquitous in the animal kingdom [1, 2] and probably occurs in almost all

4 major vertebrate and invertebrate groups [3]. It is particularly common in arthropods [4, 5],

5 notably in generalist predators, where it is seen as an extension of their normal predatory

6 behaviour [6]. One common feature of cannibalism in arthropods is that victims are

7 preferentially defenceless life stages such as eggs, young larvae or quiescent pupae [2, 7].

8 The extent of cannibalism is highly variable between, but also within species [8]. Significant

9 genetic variation in cannibalism rate has been shown within several species (see for instance

10 [1, 9-11]. Moreover experimental selection studies on the red flour beetle Tribolium

11 castaneum have revealed that it is possible to select rapidly for strains displaying different

12 levels of cannibalism [12, 13].

13 Various factors can be responsible for the evolution of cannibalism rate. On the one

14 hand, cannibalism may provide two clear benefits. First, conspecifics can be a high-quality

15 resource, thus cannibalism may be adaptive due to its nutritional benefit, particularly when

16 resources are limited [2, 14, 15]. Second, it may decrease the intensity of competition [3,

17 16]. On the other hand, several costs may select against cannibalism, since cannibals risk

18 acquiring pathogens or being injured or killed [3, 17]. Also, the evolution of cannibalism in

19 structured populations may be limited by kin selection, since individuals risk an inclusive

20 fitness cost by eating related individuals [18, 19]. In relation to this, a theoretical study has

21 recently examined how different levels of dispersal affect the evolution of cannibalism and

22 how cannibalism in turn drives the evolution of dispersal [8]. This study showed that the

23 coevolution of cannibalism and dispersal results in the evolution of various alternative life-

24 history strategies, with different dispersal and cannibalism regimes depending on the

25 environmental conditions that determine initial cannibalism rates. For instance, higher

1 dispersal rates increase the propensity for cannibalism by decreasing the relatedness between

2 the cannibals and their prey, but high initial cannibalism rate can also drive the evolution of

3 dispersal [8].

4 Cannibalism has also been suggested to be helpful in colonizing new environments [20,

5 21]. It has been shown experimentally in the red flour beetle that cannibalism might

6 facilitate colonization of a marginal environment by rescuing individuals from nutritionally

7 poor situations through increased survival and fecundity and decreased development time

8 [11]. Moreover, higher cannibalism rates have been shown to evolve in populations

9 colonizing nutritionally stressful environments [11, 22]. Via et al [11] also stressed the need

10 for more empirical work to test whether cannibalism might facilitate invasion of a new area

11 in natural systems. To our knowledge, this question has not yet been investigated. The aim

12 of the present study is to fill this gap by testing differences in cannibalism among various

13 native, invasive and biocontrol populations of the harlequin ladybird Harmonia axyridis

14 (Pallas, 1773) (Coleoptera: Coccinellidae).

15 Native to Asia, H. axyridis was introduced to North America and Europe as a biological

16 control agent against aphids, and later turned invasive. Its rapid worldwide spread followed

17 a complex invasion history involving admixture events and a prominent role of the Eastern

18 North American outbreak [23, 24]. In Europe, there is evidence for admixture between

19 Eastern North American founders and individuals from the European biocontrol laboratory

20 population, used locally to control aphid populations (with a contribution of biocontrol stock

21 genes estimated around 40%) [23]. H. axyridis represents an appropriate biological model

22 for studying cannibalism in the particular context of biological invasion, as well as in that of

23 laboratory-reared biocontrol populations. Firstly, cannibalism appears to play an important

24 role in the population dynamics of H. axyridis [25]. In its native area, field studies indicate

1 that egg cannibalism may be a major mortality factor regulating population densities [26],

2 and account for up to 60% of egg mortality [25, 27]. Although egg cannibalism is most often

3 performed by larvae, adults can also eat conspecific eggs [7, 28, 29]. Cannibalism in H.

4 axyridis has been shown to provide nutritional benefits when other prey are scarce [20],

5 nutrients are deficient, or toxic [30], and to increase survival and reduce development time

6 [20, 30]. Significant genetic variation in cannibalism rate has been demonstrated between

7 individuals within population [20]. Notably, there is a strong genetic basis for the expression

8 of cannibalism in a low food environment, whereas heritability is not significant in a higher

9 food environment [20]. H. axyridis displays cannibalism behaviour on both sibling and non-

10 sibling eggs. In aphidophagous coccinellids, including H. axyridis, sibling egg cannibalism

11 is frequently associated with the presence of bacteria such as Wolbachia and Spiroplasma,

12 which kill males early in their development [31, 32]. Male-killer infected females obtain a

13 substantial indirect fitness benefit from consuming the undeveloped male eggs from within

14 their clutch [33]. Here, we chose to focus on non-sibling egg cannibalism to avoid any

15 confounding effects of male-killer infection. Moreover, a recent experimental study has

16 shown that larvae are less likely to cannibalize related than non-related eggs [34]. Finally,

17 we found, using the same two populations transects used in this study, a marked heritable

18 increase in flight speed of H. axyridis adults from the core to the front of the invasion range

19 in Western Europe [35]. As a theoretical study [35] has recently showed, we could expect

20 that this increase of dispersal may have affected the evolution of cannibalism during the

21 spatial expansion.

22 The main goal of this study was to investigate whether the propensity for cannibalism in

23 H. axyridis has evolved in invasive populations both after introduction and during spatial

24 expansion in Western Europe. We were also interested in assessing possible change in this

1 trait in laboratory-reared biocontrol populations of the same species. Finally, we examined

2 whether the norm of reaction of cannibalism to individual density has shifted during the

3 invasion and/or laboratory rearing processes. To address these issues, we collected ladybirds

4 from three types of population: 1) two populations from the native area, 2) six invasive

5 populations sampled along two transects going from the core to the front of the invaded area

6 in Western Europe and 3) two European biocontrol strains. We assessed cannibalism of eggs

7 by unrelated first instar larvae and adult females of H. axyridis at two different individual

8 densities, in laboratory-controlled conditions.

10 Results

12 (a) Spatial expansion in Western Europe

13 We did not find any significant difference in cannibalism rates by first instar larvae and

14 adult females between populations located on the core, intermediate and front of the

15 expanding range (P = 0.52 and P = 0.81 for larvae and adults respectively, table 2 and

16 figures 2A and 3A). Population identity within Western Europe did not have a significant

17 effect on cannibalism by first instar larvae or adult females (P = 0.79 and P = 0.93 for larvae

18 and adults respectively, table 2).

19 Cannibalism by first instar larvae was globally 43% higher in the high-density

20 treatment compared to the low-density treatment (mean number of eggs consumed per larva

21 in 42 h = 9.39 and 6.55 for high and low density, respectively; P = 0.0002, table 2 and figure

22 2B). Cannibalism by adult females was globally 31% higher in the high-density treatment

23 compared to the low-density treatment (8.24 and 6.28 eggs consumed per female per 42h for

1 high and low density, respectively; P = 0.04, table 2 and figure 3B). We did not find any

2 significant interaction between the individual density and the core, intermediate and front

3 populations (P = 0.09 and P = 0.46 for larvae and adults respectively, table 2). This means

4 that reaction norms according to individual density did not evolve during the spatial

5 expansion, at least in the studied area.

7 (b) Native versus invasive versus biocontrol populations

8 We compared the cannibalism rates among the three types of population (native, invasive

9 and biocontrol). Cannibalism by first instar larvae differed significantly between population

10 types (P = 0.0001, table 2 and figure 2C). Larvae from invasive populations displayed a

11 37% higher cannibalism rate compared to those from native populations (7.78 and 5.69 eggs

12 per larva per 42 h for invasive and native larvae, respectively; P = 0.002, figure 2C) and

13 displayed twice the cannibalism rate of larvae from the biocontrol populations (3.79 eggs

14 per larva, P = 0.0001, figure 2C). The native larvae cannibalized 55% more than those from

15 the biocontrol populations (P = 0.05, figure 2C). There was no significant interaction

16 between population types and density level (P = 0.71, table 2). In contrast to the results

17 obtained on first instar larvae, cannibalism by adult females did not differ significantly

18 between population types neither alone (P = 0.83, table 2 and figure 3C) nor in interaction

19 with density level (P = 0.67, Table 2).

20 Considering the three types of populations together, we found that higher density

21 significantly increased cannibalism by 41 % in first instar larvae (mean number of eggs

22 consumed per larva per 42h = 8.25 and 5.87 for high and low density, respectively; P =

23 0.0001, figure 2D) and by 27% in adult females (7.96 and 6.25 eggs consumed per female

1 per 42h for high and low density, respectively; P = 0.04, table 2 and figure 3D). The factor

2 population identity was again not significant considering the three types of populations (P =

3 0.51 and P = 0.65 for larvae and adults, respectively; table 2).

5 Discussion

7 We provide the first evidence that cannibalism behaviour may show an evolutionary shift

8 during an invasion. More specifically, we found that larvae from invasive populations in

9 Western Europe have a higher propensity for cannibalism than larvae from the native range

10 and from commercial laboratory-reared biocontrol populations. Cannibalism behaviour has

11 been suggested to facilitate the colonization of marginal new environments by rescuing

12 individuals from nutritionally poor situations [11, 21]. An evolutionary increase in

13 cannibalism linked to natural selection in such a nutritionally poor environment has been

14 experimentally demonstrated in laboratory experiments [11, 22]. A possible hypothesis is

15 thus that upon entry into the new environment of the invasive area, H. axyridis larvae may

16 have faced a nutritionally stressful situation (e.g. physiological maladaptation to the new

17 prey, difficulty to find or capture them, or even a lack of temporal synchrony). First instar

18 larvae of H. axyridis tend to stay on the leaves on which they hatched [36] and their

19 efficiency in capturing prey is very low even on prey encounter [37, 38]. Our result

20 conforms with the fact that the larval propensity for cannibalism in H. axyridis had been

21 suggested to respond to selection in nutritionally poor situations by Wagner with co-authors

22 [20], who found a higher heritability for larval cannibalism in low food environments as

23 compared to high food environments.

1 We also found that larvae from laboratory-reared biocontrol populations showed a

2 lower propensity for cannibalism than larvae from wild native or invasive populations. This

3 difference may result from the peculiar eco-evolutionary constraints of captive rearing.

4 During mass rearing, biocontrol larvae have been fed ad libitum on highly nutritious

5 unnatural prey (E. kuehniella eggs) over numerous generations. Such feeding regimes may

6 have suppressed the selective pressure for cannibalism, which therefore substantially

7 declined. It is also possible that cannibalism has been purposefully counter selected during

8 the mass rearing process, with ladybirds displaying the cannibalism phenotype being

9 discarded from the rearing. Although these adaptive explanations are attractive, one cannot

10 at present exclude the possibility that the observed shift results from genetic drift, which is

11 also common under laboratory rearing conditions [39], as the latter are often characterized

12 by low effective population sizes. In agreement with this, substantially lower genetic

13 variation was found at microsatellite markers in biocontrol populations when compared to

14 both native and invasive populations [24]. It has to be noted, however, that captive rearing

15 has already been shown to significantly impact several other traits in biocontrol populations

16 of H. axyridis, including a higher male reproductive success, a lower survival rate at lower

17 temperatures [40] and a lower resistance to pathogens [41-43]. Altogether, it may indicate

18 that adaptation to laboratory rearing conditions involves important reallocation of resources

19 and energy, which is likely to affect other life history components of H. axyridis like

20 fecundity and survival. Interestingly, although Western European invasive populations

21 display a contribution of biocontrol genes estimated around 40 % [23,24], these invasive

22 populations showed a significantly higher propensity for cannibalism than biocontrol

23 populations. This result indicates that the low propensity for cannibalism of biocontrol

24 individuals has not been retained in the field but was rather counter-selected during the

25 genetic introgression process.

1 Our experiments also shed light on the difference in cannibalism evolution with

2 respect to life stages. In contrast to larvae, invasive adults do not show any significant

3 difference in the propensity for cannibalism compared to native and biocontrol ones. In

4 agreement with our laboratory-based results, most of the descriptions of egg cannibalism in

5 the field involve larvae [25, 28]. Contrary to young larvae, which often stay on leaves on

6 which they hatched [36], adults are able to fly long distances searching for food and may

7 thus suffer much less from local resource scarcity. Moreover, the energetic advantage of

8 cannibalism could be much greater for larvae than for adults.

9 A further aim of our study was to test whether cannibalism has evolved during the

10 spatial expansion of H. axyridis in Western Europe. A theoretical study has shown that

11 higher dispersal rates can increase the probability of cannibalism but also that cannibalism

12 itself can have important evolutionary consequences and select for increased dispersal rates

13 [8]. Our study did not reveal any significant difference in cannibalism rates from the core to

14 the front of the invasion range in either larvae or adults. For adults, the absence of evolution

15 along the expanding range might be explained by the same reasons as those detailed

16 previously. For larvae, however, we suggest that the evolutionary increase of cannibalism

17 between native and Western European invasive populations might have eroded the genetic

18 variance at this trait, preventing a further increase in cannibalism rate along the expanding

19 range. This is even more plausible given that Western European invasive populations

20 correspond to a secondary introduction from a previously invaded area in Western USA

21 [44]. This result indicates that cannibalism has not evolved conjointly with dispersal during

22 the expansion of Western Europe. Rather, as it has been theoretically shown [8], the

23 increased cannibalism rate in the invasive area compared to the native one may have helped

24 the rapid increase in dispersal along the expanding range in Western Europe [8].

1 Finally, individuals often have to face recurrent bottlenecks (i.e. periods of low

2 population density) during the invasion process, both at the time of the introduction and

3 during the spatial expansion [44]. Because a reduced population density found at an

4 expanding front may potentially reduce the selective advantage of cannibalism, one could

5 have predicted a change of the norm of reaction of cannibalism to individual density during

6 the spatial expansion of an invasive area. For both larvae and adults, we detected a higher

7 individual rate of cannibalism at higher densities. This result is congruent with the incidence

8 of cannibalism being higher at higher densities in the majority of taxa [1, 2] and confirms

9 that population density is a key factor in the expression of cannibalism [45]. We did not find

10 however any significant interaction between the density and the tested populations (invasive

11 populations located on the core, intermediate and the front of the expansion). This means

12 that reaction norms according to density did not evolve during the course of invasion (at the

13 introduction or during the spatial expansion). Interestingly, a similar result was observed for

14 biocontrol populations of H. axyridis which also endured recurrent and severe bottleneck

15 events during their rearing in the lab.

17 Conclusions

18 This study is the first to provide evidence for a rapid increase of cannibalism in natural

19 invasive populations. However, we are still at an early stage in understanding the underlying

20 mechanisms and several research perspectives seem appealing. For instance, since H.

21 axyridis now has a worldwide distribution (Asia, Africa, South America, North America,

22 Europe) [46], the study of cannibalism behaviour in invaded continents other than Europe

23 would allow to determine whether the evolution of increased cannibalism is a general

24 feature of the invasion process. In addition, it has been suggested that enhanced cannibalism

1 might be a transient phenomenon in the new environment, with cannibalism rates increasing

2 initially and then declining as physiological adaptation to new prey increases and the

3 nutritional benefits of cannibalism thereby diminish [11, 22]. It would hence be interesting

4 to test whether higher cannibalism rates are maintained in the European invasive populations

5 in the long term.

6 Methods

8 (a) Sampling of populations and rearing conditions

9 A total of ten H. axyridis populations of three different types (native, invasive and

10 biocontrol) were used in this study. The first observations of established feral H. axyridis

11 populations in Europe were made in 2001 near Ghent and Brussels in Belgium. A rapid

12 demographic and spatial expansion to a large part of Europe has subsequently been observed

13 [46, 47]. We thus considered the centre of Belgium as the invasion core. Based on the

14 information about the spatial expansion given by the French national H. axyridis survey

15 (http://vinc.ternois.pagesperso-orange.fr/cote_nature/Harmonia_axyridis/), we collected six

16 populations, sampled between October and November 2010, along two transects (three

17 samples per transect) ranging from the invasion core of the European outbreak (Brussels

18 area) towards the invasion front in southern and western France (figure 1, table1). The six

19 population samples used in this study are part of the same spatial expansion of a unique

20 outbreak originating from a single introduction event as demonstrated by [35] using analyses

21 based on microsatellite markers. Two samples were also collected from the native range of

22 H. axyridis in 2009 (Krasnoyarsk in Russia and Fuchu in Japan). Sampling was conducted in

23 public location that did not required specific authorization, and did not involved endangered

24 or protected species. Finally, we used two H. axyridis samples from commercial biocontrol

25 stocks (from Biotop and Biobest biocontrol companies), both of which were derived around

1 1995 from a strain reared under laboratory conditions since 1982. Founding insects of those

2 laboratory populations were probably collected in China by INRA (Institut National de

3 Recherche Agronomique, France) [24, 48]. Before the experiments started, we reared all the

4 populations in the laboratory for at least three generations (G0 to G3), under strictly

5 controlled conditions, in order to avoid bias due to maternal effects. In all experiments,

6 individuals were fed ad libitum with irradiated Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae)

7 eggs and reared at constant environmental conditions (24 ± 1 °C; 60 ± 10 % relative

8 humidity; L:D 14:10 h photoperiod).

10 (b) Experimental procedures

11 For each population, the G3 generation consisted of 200 individuals (100 females and 100

12 males), which were placed randomly into five boxes (9 cm high, 29 cm length and width)

13 with 20 females and 20 males per box, for ten days to allow for mating. The 200 individuals

14 from these 5 boxes were then distributed between two groups. The first group (60 females

15 and 60 males) was used to produce eggs for the cannibalism experiments. The H. axyridis

16 eggs used in these experiments were collected daily and kept at -20°C for a maximum period

17 of two weeks before use in the cannibalism experiments. We collected 2400 eggs for each

18 population sample (totalling 24000 stored eggs). Individuals of the second group (40

19 females and 40 males for each population sample) were divided over two boxes and were

20 used to obtain larvae and new adults for the cannibalism tests. To do so, we collected 25-35

21 egg clutches per population sample. A subsample of the larvae obtained from those eggs was

22 used to test the propensity for larval cannibalism on eggs. The remaining larvae were reared

23 to adulthood in order to test the propensity for cannibalism of adult females.

1 To measure cannibalism rates, we placed individuals in a small cylindrical box

2 measuring 5 cm diameter and 2.5 cm high. First instar larvae and adult females of each

3 population sample were separated into two groups: low density (one individual per box), and

4 high density (five larvae or three adult females per box). In the centre of each box we placed

5 15 H. axyridis eggs per individual on a piece of black paper (i.e. same ratio of eggs to

6 predator in every box). Note that the eggs and the cannibalistic larvae or adults belong to the

7 same population. We recorded the number of eggs eaten after 42 h. (see figure F1 for

8 illustration).

9 A total of 950 first instar larvae (24h hours old) were tested with, for each population,

10 n = 75 replicated tests for the high-density treatment and n = 20 tests for the low-density

11 treatment. A total of 650 adult females were tested with, for each population, n = 45

12 replicated tests for the high-density treatment and n = 20 test for the low-density treatment.

13 All adult females were 10-15 days old and initially fed with Ephestia eggs to standardize

14 their feeding response.

16 (c) Statistical analysis

17 All statistical analyses were conducted using the JMP Pro 9 package (SAS Institute 2009).

18 To study the propensity for cannibalism, the number of eggs eaten by individuals for each of

19 the different treatments was compared using ANOVA, as follows. First, we focused on the

20 six (invasive) European populations to test for potential differences in cannibalism rates that

21 might take place during the spatial expansion in Western Europe. The model included the

22 following factors: spatial level (core, intermediate and front, figure 1), population sample

23 nested in spatial level, density (low or high) as well as the interaction between density and

1 spatial level. Second, we tested for differences in cannibalism rates among the three

2 different types of H. axyridis populations. The model included the following factors:

3 population type (native, invasive and biocontrol), population sample nested in population

4 type, density (low or high) and the interaction between density and population type. Note

5 that the analyses presented here include the six invasive Western European populations, but

6 we obtained the same results when taking two of those populations randomly (results not

7 shown). We performed all analyses separately for first instar larvae and adult females.

1 Additional file

2 Additional file 1: Photos F1 illustrating the cannibalistic behaviour on eggs by (A) a larva

3 (stage L1) and (B) an adult individual of Harmonia axyridis. (Photo courtesy of A. Tayeh).

4 Additional file 2: The data set of cannibalism by adult females.

5 Additional file 3: The data set of cannibalism by first instar larvae.

8 Competing interests

9 The authors declare that they have no competing interests.

11 Authors’ contributions

12 All authors read and approved the final manuscript, BF, AT and AE designed the

13 experimental, AT and EL collected samples, AT and BE analysed the data, BF, AT and AE

14 drafted the manuscript.

16 Acknowledgements

17 We thank Bastien Poutout for technical assistance during laboratory experiments, Virginie

18 Ravigné and Guillaume Laugier for comments and discussion on an earlier draft of the ms,

19 and Cathleen Thomas for help in sample collection. This work was supported by a grant

20 from the Agropolis Fondation (RTRA – Montpellier) to the BIOFIS project 1001-001.

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1 Table 1. Sampling details of the ten studied H. axyridis populations

Biogeographic Sampling site Sample Distance from Date of first status locality code outbreak core (Km) observation Invasive Brussels (Belgium) X1 0 2001 Fondettes (France) X2 469 2006 Chizé (France) X3 629 2009 Walhain (Belgium) Y1 0 2001 Quincieux (France) Y2 522 2007 Prade-le-lez (France) Y3 770 2008 Native Krasnoyarsk (Russia) Z1 N/A N/A Fuchu (Japan) Z2 N/A N/A Biocontrol Valbonne (France) W1 N/A N/A Westerlo (Belgium) W2 N/A N/A 3

4 Note: Two populations were sampled in the native area (Z1 and Z2), six in the European

5 invaded area (X1 to X3 and Y1 to Y3) and two populations originated from commercial

6 biocontrol stocks (W1 and W2). For the European invasive populations, samples were

7 collected along two transects starting from the outbreak core and ending near the invasion

8 front (see figure 1).

1 Table 2. Statistical analyses of cannibalism rates by first instar larvae and adult

2 females of H. axyridis

First instar larvae Adult females Analysis Test statistic P-value Test statistic P-value 1- Spatial expansion in Europe F (df) F (df) Spatial level 0.64 (2) 0.5252 0.20 (2) 0.8173 Population (Spatial level) 0.34 (3) 0.7914 0.15 (3) 0.9279 Density 14.07 (1) <0.0002 1.19 (1) <0.042 Spatial level × Density 2.38 (2) 0.0949 0.78 (2) 0.4556 2- Different types of population Population type 17.44 (2) <0.0001 0.19 (2) 0.8262 Population (Population type) 0.59 (7) 0.5106 0.72 (7) 0.6482 Density 22.63 (1) <0.0001 4.34 (1) <0.037 Population type × Density 0.34 (2) 0.7066 0.40 (2) 0.6706 3

4 Note: Analysis 1- focuses on spatial expansion in Western Europe (invaded area), and

5 analysis 2-compare different types of populations, i.e. native, invasive and biocontrol.

6 Significant P-values at the 5% threshold are shown in bold.

1 Figure 1. Geographic locations of the sampled populations of H. axyridis

3 Note: (a) Geographical regions of the different native (Z1 and Z2) and invasive (X1 to X3

4 and Y1 to Y3) sampled populations of H. axyridis. Closed circles correspond to locations

5 where the two native populations have been sampled. (b) The Western European invasive

6 populations of H. axyridis were sampled along two transects. Letters (X or Y) correspond to

7 the transect names, and years are the dates of the first observation of H. axyridis at the

8 sampled geographic localities. Two biocontrol populations reared in European laboratories

9 since 1981, probably originating from China, were also used for the present study. See main

10 text for details.

1 Figure 2. Mean numbers of eggs eaten per individual (± standard error) by first instar

2 larvae of H. axyridis.

4 Note: Results are given for (A) the three spatial levels within Europe expanding range (core,

5 intermediate and front), (B) the low and high individual density treatments in data (A)

6 pooling geographic locations, (C) three types of studied populations (i.e. Native, Invasive

7 and Biocontrol populations), and (D) the low and high density treatments in data (C) pooling

8 the different population types. Bars marked by different letters are significantly different at

9 the 5% threshold (P-levels are mentioned in the main text and Table 2).

1 Figure 3. Mean number of eggs eaten per individual (± standard error) by adult

2 females of H. axyridis

4 Note: Results are given for (A) the three spatial levels within Europe expanding range (core,

5 intermediate and front), (B) the low and high individual density treatments in data (A)

6 pooling geographic locations, (C) three types of studied populations (i.e. Native, Invasive

7 and Biocontrol populations), and (D) the low and high density treatments in data (C) pooling

8 the different population types. Bars marked by different letters are significantly different at

9 the 5% threshold (P-levels are mentioned in the main text and Table 2).

1 Additional files 1: F1 Photos illustrating the cannibalistic behaviour on eggs by (A) a larva 2 (stage L1) and (B) an adult individual of Harmonia axyridis. (Photo courtesy of A. Tayeh).

4 5

CHAPITRE II :

Evolution des stratégies de vie dans les différents compartiments (natif, envahissant américain, envahissant européen et lutte biologique) de la coccinelle asiatique Harmonia axyridis.

I. Introduction

L’étude des traits d’histoire de vie cherche à expliquer les variations inter-individuelles observées au niveau des caractéristiques fondamentales de la vie des organismes (Roff, 2002; Stearns, 1992). Ces traits touchent au cycle de vie des individus (d’une population), e.g. l’âge à maturité, la fécondité, la longévité, etc… (Stearns, 1992). Les traits d’histoire de vie sont donc les composantes de la valeur sélective d’un individu. De nombreuses études par le passé ont tenté de définir les traits d’histoire de vie sur lesquels pouvaient reposer le succès invasif (Baker, 1965; Newsome & Noble, 1986; Williamson & Fitter, 1996). Ces études consistaient notamment soit en des comparaisons interspécifiques (entre espèces envahissantes et espèces non envahissantes par exemple) soit en des comparaisons intra-spécifiques (entre des populations natives et envahissantes de la même espèce). On a longtemps pensé que les envahisseurs étaient plutôt des espèces à stratégie r, c’est à dire présentant une durée de vie courte basée sur la production d'un grand nombre de jeunes, le plus tôt possible (Baker, 1965; Lodge, 1993). Cependant, on considère désormais que les traits déterminant le succès d’invasion sont très dépendants de l’environnement envahi (Facon et al., 2006) et peuvent même être différents au cours du processus d’invasion lui-même (Sakai et al., 2001). Notamment des traits liés aux stratégies r (ex : petite taille, forte fécondité, reproduction précoce…) seront avantageux dans les phases initiales de l’invasion. Au contraire, des traits liés aux stratégies K (ex : faible fécondité, taille élevée…) seraient favorisés dans les stades finaux de l’invasion, c’est-à-dire lorsque l’envahisseur commence à entrer en interaction (surtout compétitive) avec la communauté envahie (Duyck et al., 2007; Facon et al., 2008). D’autre part, une méta-analyse réalisée par Sol et al (2012) met en avant l’importance des stratégies de production des descendants dans le succès invasif. En se basant sur une analyse comparative reprenant plus de 2700 événements d’introduction d’oiseaux, cette étude montre que la stratégie r (au sens d’une reproduction forte et précoce) n’est pas la plus avantageuse. Au contraire, les envahisseurs ayant le plus de succès présentent une stratégie de vie favorisant la reproduction future par rapport à la reproduction présente. Etaler sa reproduction sur une plus grande période permettrait de mieux répondre à des pressions écologiques nouvelles dans l’environnement d’introduction.

Notre modèle d’étude H. axyridis présente la particularité d’avoir subi plusieurs évènements de sélection naturelle et artificielle. Comme nous l’avons présenté dans l’introduction générale, il s’agit une espèce avec une longue histoire d’élevage au laboratoire, que l’on peut comparer à un processus de domestication. On peut donc s’attendre à ce que

certains traits phénotypiques aient subi des pressions de sélection en laboratoire (voir chapitre I) liés à l’élevage en captivité. De plus, cette espèce est particulièrement appropriée pour mettre en évidence des traits d’histoire de vie qui pourraient être sélectionnés dans les populations envahissantes, et ainsi présenter des différences par rapport aux populations natives.

La notion de compromis (ou trade-off) est un point central de la théorie des traits d’histoire de vie. Plusieurs compromis communs à un grand nombre d’organismes ont ainsi pu être mis en évidence comme le compromis entre fécondité et survie ou encore entre nombre et taille des descendants (Stearns, 1992). Il est donc crucial d’étudier non pas un trait d’histoire de vie particulier mais des stratégies de vie (résultant des compromis potentiels entre différents traits d’histoire de vie) pour tenter d’identifier sur quoi repose le succès invasif. Cela nécessite d’étudier un grand nombre de traits voire même l’ensemble du cycle de vie. En conséquence, l'étude des traits d’histoire de vie que nous avons menée se base sur la caractérisation d'un ensemble de traits d'histoire de vie adultes utilisant les différents compartiments populationnels (natif, invasif américaine, invasif européen et lutte biologique) d’H. axyridis. Notre objectif principal était d’évaluer si ces différentes populations présentent des stratégies de vie différentes en lien avec les différentes pressions de sélection qu’elles ont pu subir. En effet, d’éventuelles différences entre les compartiments populationnels nous permettront de mieux comprendre (i) les changements évolutifs des populations de lutte biologique et des populations naturelles, (ii) les processus évolutifs des populations envahissantes par rapport aux populations natives, et enfin (iii) les changements évolutifs au sein des populations envahissantes en Amérique et issues de l’admixture en Europe.

II. Matériel et Méthodes

1. Matériel biologique

Nous avons utilisé huit populations d’H. axyridis pour réaliser cette étude, ces populations ayant quatre origines différentes : (i) deux populations de l’aire native (Fuchu au Japon et Beijing en Chine, NAT) échantillonnées en 2009 et 2011 ; (ii) deux populations envahissantes américaines (Brookings aux Etats-Unis et Santiago au Chili, INV Am) échantillonnées en 2010; (iii) deux populations envahissantes européennes (Bruxelles en Belgique et Budapest en Hongrie, INV Eu) échantillonnées en 2011 ; (iv) deux populations de

Figure 1 : Cycle expérimental réalisé pour chaque femelle jusqu’à sa mort

lutte biologique (Biotop en France et Biobest en Belgique, BIO). Toutes les populations naturelles ont passé au moins deux générations en conditions contrôlées afin de diminuer d’éventuels effets maternels. Les populations de lutte biologique ont quant à elle passé plus de 70 générations au laboratoire (Ferran et al., 1997 ; Ongagna et al., 1993).

2. Protocole expérimental

Nous avons d’abord réalisé une nouvelle génération (G3) pour chaque population. Soixante individus par population (30 femelles et 30 mâles) ont été produits, pour lesquels nous avons noté la date d’émergence (passage à l’état adulte). Nous avons ensuite placé une femelle et un mâle de la même population dans une boîte (2.5 cm longueur, 5 cm diamètre). Nous avons ensuite répété pour chaque femelle jusqu’à sa mort le cycle suivant : femelle isolée dans une boîte pendant trois jours puis mise en présence avec un mâle (tiré au hasard dans le pool des mâles de la même population) pendant quatre jours (Figure 1). L’expérience a été réalisée en conditions contrôlées (enceintes bioclimatique) à 24°C, 16HJ :8HN, humidité 60%. Tous les individus sont nourris ad libitum avec des œufs d’Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae).

Au cours de cette expérience, nous avons mesuré les variables suivantes : (1) le poids de chaque adulte (femelle et mâle) 72H après l’émergence ; (2) la date de première reproduction pour chacune des femelles ; (3) le nombre d’œufs pondus par femelle une fois par semaine après 48H d’isolement jusqu’à sa mort ; (4) la date de dernière reproduction pour chaque femelle ; (5) l’âge de mort pour chaque individu (femelle et mâle).

Nous avons réalisé cette étude en deux blocs expérimentaux : 1) le premier bloc incluant les deux populations de lutte biologique (Biotop et Biobest), les deux populations de l’aire native (Fuchu et Beijing), une population envahissante Américaine (Brookings), et une population envahissante européenne (Bruxelles) ; 2) le deuxième bloc expérimental incluant une population envahissante européenne (Budapest), une population envahissante américaine (Chili). Dans le second bloc, nous avons aussi ajouté deux populations précédemment utilisées dans le premier bloc : une population envahissante américaine (Brookings) et une population de lutte biologique (Biotop).

III. Analyses statistiques

A partir des mesures réalisées au cours de l’expérience, les variables que nous avons analysées sont les suivantes : poids des individus, âge de 1ère reproduction, durée de reproduction, fécondité journalière, fécondité totale et longévité. Dans un premier temps, nous avons effectué l’analyse factorielle discriminante (AFD), dans le but de positionner chacune des populations étudiées dans l'espace de l’ensemble de traits mesurés.

Dans un deuxième temps, nous avons étudié les traits séparément pour mieux comprendre les différences entre les quatre compartiments par l’intermédiaire d'analyses de la variance (ANOVA), pour mettre en évidence une éventuelle différence au sein des moyennes entre les différents types de populations étudiés. Ensuite, le test t de Student (P < 0,05) est réalisé dans le but de comparer les moyennes deux à deux. Les conditions d’application pour les tests ANOVA ont été vérifiées avant d’effectuer l’analyse de la variance. Une transformation en Log (x) a été effectuée pour les variables âge de 1ère reproduction, durée de vie reproductive et fécondité totale. Les variables poids, fécondité journalière et longévité n’ont pas été transformées car elles remplissaient les conditions d’application. Le modèle utilisé pour les analyses inclut l’origine des populations (càd native, invasive américaine, invasive européenne et lutte biologique) comme effet fixe, le bloc expérimental, ainsi que la population nichée dans l’origine comme effets aléatoires. Pour les variables poids et longévité, le modèle inclut également le sexe comme effet fixe ainsi que son interaction avec l’origine des populations.

Enfin, pour estimer les corrélations phénotypiques entre les différents traits, qui ne sont pas indépendants, nous avons réalisé une analyse en composantes principales (ACP) à partir de la matrice des corrélations phénotypiques des 6 traits. Les composantes qui expliquent la plus grande partie des résultats ont ensuite été utilisées comme variables à expliquer dans une ANOVA. La variable explicative étant l’origine populationnelle (e.g. Aire native, aire envahie américaine et européenne, lutte biologique).

Pour construire les variables utilisées dans l’analyse des données, nous avons procédé comme suit: (i) Age 1ère reproduction = [date première ponte – date d’émergence]. (ii) Durée de vie reproductive = [date dernière ponte – date première ponte]. (iii) Fécondité totale = [nombre total d’œufs par femelle pendant sa vie]. (iv) Fécondité journalière = [Fécondité totale / durée de vie reproductive]. (v) Longévité = [date de mort – date d’émergence].

Figure 2 : Analyse discriminante pour les différentes populations étudiées. a : Position des populations en fonction des deux premières composantes de l’analyse. b : Représentation des différentes variables en fonctions des mêmes composantes.

IV. Résultats

1. Analyse factorielle discriminante (AFD)

La figure 2 montre que les 8 populations étudiées sont bien discriminées : la dispersion du nuage de points de tous les individus représente bien les quatre compartiments (NAT, INV Am, INV Eu et BIO). L’AFD montre que les traits phénotypiques les plus caractéristiques des différentes origines sont l’âge de première reproduction, la durée de vie reproductive et la longévité. Ces trois traits permettent de discriminer les quatre types de populations.

2. Analyse des variances (ANOVA)

2.1 Poids des individus

Le poids des individus n’est pas significativement différent entre les quatre origines d’H. axyridis (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) (P = 0.68, figure 3, tableau 1). Les femelles sont toujours plus lourdes que les mâles quelle que soit leur origine (P = 0.0001). Nous avons noté un effet significatif de la population imbriquée dans l’origine (P = 0.0018). Le test t de Student montrent que l’effet ‘population’ concerne les deux populations INV Eu (Bruxelles et Hongrie, P = 0.0001) et les deux populations d’origine NAT (Fuchu et Beijing, P = 0.007). Nous avons aussi observé un effet significatif de l'interaction sexe*origine (P = 0.0025). Les populations envahissantes ont des femelles plus lourdes que les populations natives ou de lutte biologique tandis que les mâles des différents types de population ont des poids similaires (figure 3). Il faut enfin noter que les individus du bloc 2 sont significativement plus légers que ceux du bloc 1 (P = 0.0001, tableau 1).

2.2 Age de 1ère reproduction

L’origine des femelles a un effet significatif sur l’âge de 1ère reproduction (P = 0.0017, figure 4, tableau 2). Les tests t de Student montrent que les femelles de lutte biologique se reproduisent plus tôt (8.22 jours) que les femelles des trois autres origines : P = 0.0004, 0.012 et 0.026 respectivement pour les femelles natives (17.12 jours), les femelles envahissantes américaines (11.04 jours) et les femelles envahissantes européennes (10.14 jours). L’âge de 1ère reproduction des femelles natives est significativement plus tardif que celui des deux types de femelles envahissantes (P = 0.0037 et 0.0008 respectivement pour les femelles américaines et européennes). Il n’y a pas de différence significative entre les femelles des

Figure 3: Poids des deux sexes en g (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différentes origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis.

Figure 4: Âge de 1ere reproduction en jours (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différentes origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis.

Tableau 1 : Résultats de l'ANOVA d’un modèle à effets mixtes pour le poids des individus.

Source Stat. de test (d.d.l.)* P-value Origine 0.54 (3) 0.68 Population† [Origine] 15.10 (1) 0.0018 Bloc† 14.94 (1) <0.0001 Sexe 287.51 (1) <0.0001 Sexe*Origine 4.83 (3) 0.0025 *Les statistiques de test utilisées sont un F de Fisher pour les effets fixes et un X² pour les effets aléatoires. † Effet aléatoire.

Tableau 2: Résultats de l’ANOVA d’un modèle à effets mixtes pour l’âge de 1ere reproduction et la durée de vie reproduction.

Source Age de 1ere reproduction Durée de vie reproductive

Stat. de test (d.d.l.)* P-value Stat. de test (d.d.l.)* P-value Origine 46.36 (3) 0.0017 8.7 (3) 0.035 Population† [Origine] 0.04 (1) 0.84 0.15(1) 0.69 Bloc† 0.001(1) 0.97 18.02 (1) <0.0001 *Les statistiques de test utilisées sont un F de Fisher pour les effets fixes et un X² pour les effets aléatoires. † Effet aléatoire

Tableau 3: Résultats de l’ANOVA d’un modèle à effets mixtes pour la fécondité journalière et la fécondité totale.

Source Fécondité journalière Fécondité totale Stat. de test (d.d.l.)* P-value Stat. de test (d.d.l.)* P-value Origine 7.4 (3) 0.0001 4.52 (3) 0.0042 Population† [Origine] 0.53 (1) 0.46 0.006 (1) 0.93 Bloc† 0.53 (1) 0.46 17.16 (1) <0.0001 *Les statistiques de test utilisées sont un F de Fisher pour les effets fixes et un X² pour les effets aléatoires. † Effet aléatoire

Figure 5: Durée de vie reproductive en jours (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différentes origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis.

Figure 6: Fécondité journalière (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différentes origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis.

deux types de population envahissantes (P = 0.24, figure 4, tableau 5). Enfin les effets bloc expérimental et population ne sont pas significatifs (Tableau 2).

2.3 Durée de vie reproductive

L’origine des femelles a un effet significatif sur leur durée de vie reproductive (P = 0.035, figure 5, tableau 2). Les tests t de Student (Tableau 5) montrent que les femelles envahissantes américaines (61.50 jours) ont une durée de vie reproductive plus longue que les femelles de lutte biologique (30.62 jours, P = 0.0123) et de l’aire native (38.71 jours, P = 0.034) mais pas significativement différente des femelles envahissantes européennes (47.88 jours, P = 0.133). Les femelles de lutte biologique présentent des durées de vie reproductive significativement plus courtes que les femelles envahissantes européennes (P = 0.032) mais pas différentes des femelles natives (P = 0.141). Enfin, l’effet population n’est pas significatif (P = 0.69), et l’effet bloc expérimental est significatif (P = 0.0001, tableau 2).

2.4 Fécondité (a) Fécondité journalière

Nos analyses ANOVA montrent une différence significative entre les différentes origines sur la fécondité journalière (P = 0.0001, figure 6, tableau 3). Il n’y a pas d’effet 'population' ni d’effet ‘blocs’ dans l’analyse (P > 0.1, tableau 3). Les tests t de Student montrent que les femelles de lutte biologique ont une fécondité journalière plus élevée (43.95 œufs/j) que les femelles des autres origines : P = 0.0003, 0.0002 et 0.0002 respectivement pour les femelles natives (34,48 œufs/j), américaines (34.75 œufs/j) et européennes (34.42 œufs/j). Nous n'avons observé aucune différence entre les populations natives et les populations envahissantes (INV Am et INV Eu) (P = 0.91 pour les populations américaines et P = 0.98 pour les populations européennes) ainsi qu'entre les deux types de populations envahissantes (P = 0.90, figure 6, tableau 5).

(b) Fécondité totale

Nos analyses statistiques ANOVA indiquent des différences significatives de fécondité totale entre les quatre origines (P = 0.0042, figure 7, tableau 3). Les tests t de Student montrent une différence significative entre les femelles américaines (1975 œufs) et les femelles des autres origines : P = 0.0014, 0.0011 et 0.050 respectivement pour les femelles natives (1184 œufs), de lutte biologique (1245 œufs) et européennes (1506 œufs) (figure 7 et

Figure 7: Fécondité totale (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différentes origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis.

Figure 8: Longévité en jour (Moyenne ± Erreur Standard) pour les différents origines (NAT, INV Am, INV Eu et BIO) d’Harmonia axyridis selon les sexes.

Tableau 4 : Résultats des ANOVA d’un modèle à effets mixtes pour la longévité pour les deux sexes

Source Stat. de test (d.d.l.)* P-value Origine 22.3 (3) 0.0047 Population† [Origine] 3.01 (1) 0.0039 Bloc† 37.49 (1) <0.0001 Sexe 3.70 (1) 0.054 Sexe*Origine 3.26 (3) 0.021 *Les statistiques de test utilisées sont un F de Fisher pour les effets fixes et un X² pour les effets aléatoires. † Effet aléatoire.

Tableau 5 : Résultats des tests t de Student pour les différents traits d'histoire de vie mesurés.

Age de 1ere Durée de vie fécondité Fécondité Origine Longévité reproduction reproductive journalière totale P-value P-value P-value P-value P-value NAT BIO 0.0004 0.142 0.0002 0.0728 0.0108 NAT INV Am 0.0037 0.034 0.917 0.0014 0.0635 NAT INV Eu 0.0008 0.215 0.983 0.135 0.0179 BIO INV Am 0.012 0.0123 0.0002 0.0011 0.0013 BIO INV Eu 0.026 0.032 0.0003 0.187 0.0172 INV Am INV Eu 0.24 0.133 0.901 0.050 0.0119

Tableau 6: Matrice des corrélations phénotypiques réalisée à partir de tous les individus. Toutes les corrélations sont significatives à P < 0.05.

Age de 1ere Durée de vie Fécondité Fécondité Poids Longévité Ligne reproduction reproductive totale journalière

Poids 1 Age 1er reproduction -0.1666 1 Longévité 0.0860 0.3341 1 Durée de reproduction 0.0407 0.0403 0.8759 1 Fécondité totale 0.1101 -0.0117 0.7045 0.8547 1 Fécondité journalière 0.1582 -0.0632 -0.0869 -0.0497 0.3664 1

Tableau 7: Résultats du test du Chi-deux pour les corrélations aux deux premières composantes.

Valeur Pourcentage de Pourcentage Degrés de Composante X² P-value propre corrélation cumulé liberté 1 2.67 44.50 44.50 1063.84 20.00 <0.0001 2 1.37 22.81 67.30 810.75 14.00 <0.0001

Tableau 8: Analyse de variance de deux composantes principales de l’ACP.

Degrés de Carré Principale Source Somme des carrés Rapport F P-value liberté moyen Origine 3 69.606 23.20 9.91 <0.0001 1 Résidus 233 545.357 2.34 Total corrigé 236 614.964 Origine 3 62.441 20.81 18.52 <0.0001 2 Résidus 233 261.740 1.12 Total corrigé 236 324.182

Tableau 9: Comparaisons des deux composantes principales de l’ACP, pour chaque paire d’origine en utilisant le t de Student.

Origine Principale 1 Principale 2 Niveau Niveau P-value P -value BIO INV Am 0.0001 0.0281 BIO INV Eu 0.0473 <0.0001 BIO NAT 0.0001 <0.0001 NAT INV Eu 0.0473 <0.0001 NAT INV Am 0.8345 <0.0001 INV Am INV Eu 0.0226 0.4410

Figure 10 : Représentation graphique de l’ANOVA des deux composantes principales de l’ACP. A) 1ère composante, B) 2ème composante.

tableau 5). Aucune différence significative n’est notée entre les 3 autres types de populations. Enfin, il n’y a pas d’effet 'population' dans l’analyse (P = 0.93), mais il y a un effet significatif entre les deux blocs expérimentaux (P = 0.0001, tableau 3).

2.5 Longévité

Nos analyses statistiques ANOVA montrent une différence significative entre les quatre origines (P = 0.0047, figure 8, tableau 4). Les individus de lutte biologique vivent moins longtemps (53.58 jours) que les individus des trois autres origines : P = 0.010, 0.017 et 0.001 respectivement pour les individus natifs (80.80 jours), européens (77.75 jours) et américains (104.87 jours). Les individus européens vivent également significativement moins longtemps que les individus natifs (P = 0.017) et américains (P = 0.011). En revanche, nous n'avons pas détecté de différence significative entre les individus natifs et américains (P = 0.063, figure 8 et tableau 5). Nous avons aussi noté une différence marginalement significative entre les deux sexes (P = 0.054). De plus, nos résultats montrent un effet significatif de l'interaction 'origine'*'sexe' (P = 0.021). Les tests t de Student montrent des différences significatives entre les deux sexes pour les populations américaines (P = 0.017, les femelles possèdent une durée de survie plus longue que les mâles), ainsi que pour les populations natives (où les femelles possèdent une durée de vie plus longue que les mâles ; P = 0.026) (Figure 8). Nos analyses montrent enfin une différence significative entre les deux blocs expérimentaux (P = 0.0001).

3. Corrélation entre traits

Le Tableau 6 présente les corrélations des traits phénotypiques obtenue à partir des données sur l’ensemble des individus. Toutes les corrélations sont significatives (P = 0.0001, tableau 7). Nous avons observé des corrélations positives fortes entre, d’une part, la longévité et la durée de vie reproductive (0.87), et d’autre part avec la fécondité totale (0.70). Nous avons également noté une forte corrélation positive entre la durée de vie reproductive et la fécondité totale (0.85). Ainsi, que qu’une corrélation négative entre poids et l’âge de première reproduction (-0.16).

L’ACP réalisée à partir de la matrice des corrélations phénotypiques révèle que les deux premières composantes expliquent respectivement 44.5 % et 22.8 % de la variance totale qui existe entre les 6 traits phénotypiques étudiées. La première composante est reliée positivement aux traits fécondité totale, durée de vie reproductive et longévité. Cet axe permet donc de distinguer les individus qui ont une longue durée de vie et corrélativement une longue

Figure 9 : Représentation des deux premières composantes principales de l’ACP réalisée sur 6 traits. Les individus des différents compartiments (Nat, INV Am, INV Eu et BIO) d’H. axyridis, dans le plan principal sont représentés de façon schématique sur cette figure par des points

durée de vie reproductive et une forte fécondité totale. La deuxième composante est essentiellement expliquée positivement par la fécondité journalière et le poids et négativement par l’âge de première reproduction (Figure 9). Cette deuxième composante représente donc le compromis (trade-off) entre l’âge premier reproduction et les traits fécondité journalière et poids.

Nous avons ensuite réalisé une ANOVA pour les deux composantes principales de l’ACP. Nos analyses montrent qu’il y a des différentes significatives entre les différents compartiments (P = 0.0001, tableau 8, figure 10), quelle que soit la composante analysée. Ainsi, le tableau 9 présente les différences significatives entre chaque paire d’origine selon chaque composante de l’ACP.

V. Discussion

1. Comparaison entre les différents compartiments populationnels

Notre étude a permis de mettre en évidence des différences importantes de stratégie de vie entre les quatre compartiments populationnels (natif, invasif américain, invasif européen et lutte biologique) d’H. axyridis. Sur la base des différents traits d’histoire de vie mesurés au cours de cette étude, les différents compartiments étudiés chez H. axyridis se divisent en trois points.

(i) Les différences majeures entre les populations de lutte biologique et les populations naturelles.

Les premières possèdent une longévité et une durée de vie reproductive plus courtes. En effet, les femelles se reproduisent plus tôt, et ont une fécondité journalière plus élevées comparée aux populations naturelles. Ce résultat confirme que ces traits phénotypiques ont subi des pressions de sélection fortes en condition d’élevage. En effet l’adaptation aux conditions d’élevage peut induire des changements de caractéristiques biologiques importantes chez les espèces en captivité. On peut citer l’étude de Kuriwada et al (2010) qui ont montré que la souche de laboratoire présente un temps de développement plus court et un nombre de descendants plus élevé par rapport aux populations sauvages chez le charançon de la patate douce Cylas formicarius (Coléoptera : Brentidae).

(ii) Différences entre les populations envahissantes américaines et populations natives

Nos résultats montrent clairement l’existence de différences importantes pour certains traits phénotypiques entre les populations envahissantes américaines et les populations natives. Les populations envahissantes possèdent une longévité et une durée de vie reproductive plus longue. Ainsi, malgré une fécondité journalière équivalente, la fécondité totale est plus élevée que dans les populations natives. De surcroît, la première reproduction a lieu plus tôt dans les populations envahissantes. Nos résultats suggèrent aussi que les populations envahissantes subissent des pressions de sélection fortes dans l’aire d’introduction. La majorité des études sur les invasions biologiques compare des populations envahissantes aux populations natives, notamment afin d’identifier d’éventuels changements évolutifs importants (Hierro et al., 2005; Keller & Taylor, 2008). Il est alors primordial de pouvoir comparer une population envahissante avec sa vraie source (Dlugosch & Parker, 2008; Estoup & Guillemaud, 2010; Keller & Taylor, 2008; Richards et al., 2006; Wares et al., 2005). Par exemple, dans leur méta-analyse, van Kleunen et al (2010), comparent de nombreux traits (dont la fitness) chez près de 125 espèces de plantes envahissantes et 196 natives. Ils montrent de grandes différences entre les deux compartiments populationnels. D’autre part, il a été observé que les individus sont généralement plus grands au sein de l’aire d’invasion que dans la zone native, en particulier chez les plantes (par exemple Prati et al., 2004, Eckert el al 1996 ). Enfin pour les traits d’histoire de vie pour lesquels des différenciations évolutives ont été montrées, les populations introduites montrent souvent une plus grande fécondité que les populations natives en conditions contrôlées (Bastlova & Kvet, 2002; Buschmann et al., 2005; Leger & Rice, 2007; Wolfe et al., 2004).

(iii) Différences entre les populations envahissantes

En ce qui concerne les deux types de populations envahissantes étudiées ici (américaines et européennes), nous avons mis en évidence que les trais liés à la reproduction sont comparables d’une population à l’autre au sein du compartiment envahi, mis à part une augmentation remarquable de la durée de vie, et une fécondité totale plus élevée dans les populations américaines. Ces résultats sont en accord avec ceux d’études précédentes (cf. chapitre I) qui montrent que les populations envahissantes en Europe sont issues de l’admixture entre la population de lutte biologique européenne et les populations envahissantes en Amérique.

2. Différentes variables étudiés chez H. axyridis

A notre connaissance, cette étude est malheureusement la seule à comparer les différents compartiments populationnels (native, envahissantes américaines, envahissantes européennes et lutte biologique) chez H. axyridis. Il est donc difficile de comparer convenablement nos résultats avec la littérature sur H. axyridis. Toutefois, il existe quelques études qui étudient les cycles de vie complets et les stratégies de reproduction dans l’un de ces compartiments (voir par exemple Abdel -Salam & Abdel-Baky 2001).

Nos résultats concernant le poids d’individus d’H. axyridis sont similaires à ceux de Berkvens et la (2008) sur la population de lutte biologique. De plus, en ce qui concerne l’âge de première reproduction, nos résultats sont proches de ceux de plusieurs études réalisées sur la population de laboratoire (Abdel-Salam & Abdel-Baky, 2001; Berkvens et al., 2008; Brun, 1993; Hodek. & Honek, 1996; Lanzoni et al., 2004), ainsi que de ceux d’autres populations envahissantes et natives chez cette espèce (cf chapitre II, article 2 et annexe, article 1, Turgeon et al., 2011, Facon et al., 2011). Berkvens et al. (2008) montrent que la durée de vie reproductive dans une population de lutte biologique (BioBest) est similaire à ceux trouvés dans notre étude. En outre, les durées de vie en laboratoire mesurée ici sont proches de celles trouvées par Abdel-Salam & Abdel-Baky 2001. En ce qui concerne la fécondité totale nos résultats sont comparables aux travaux réalisés sur H. axyridis (Hodek. & Honek, 1996; Hukusima & Kamei, 1970). D’après nos résultats et ceux d’autres études réalisées sur H. axyridis, on constate que les traits d’histoire de vie peuvent varier selon les conditions environnementales telles que la nourriture, la photopériode et la température.

3. Corrélations entre traits

L’étude des corrélations entre les six traits analysées indique que les différents traits d’histoire de vie sont corrélés positivement entre eux. Cette étude met également en évidence un compromis entre l’âge de 1ère reproduction et la fécondité journalière ainsi qu’entre l’âge de 1ère reproduction et le poids des femelles. Le contraste majeur se trouve entre les populations d’élevages et les populations naturelles, la première ayant une survie plus courte et un avantage en termes de fécondité et de reproduction plus précoce, alors que les autres ont une durée de vie plus élevée et une durée de reproduction plus longue (cf. stratégies r et K). Nos résultats corroborent la méta-analyse réalisée par Sol et al (2012) qui montre que la stratégie consistant à « ne pas mettre tous ces œufs dans le même panier » peut être avantageuse dans les populations envahissantes. Etaler sa reproduction sur une plus grande

période, comme c’est le cas des populations envahissantes notamment américaines d’H. axyridis, permettrait de mieux répondre à des pressions écologiques nouvelles dans l’environnement d’introduction (Sol et al., 2012).

Ainsi, nos résultats soulignent l’importance de travailler sur le cycle de vie complet lorsque l’on cherche à comparer différentes populations, et ce même lorsque l’on travaille au sein d’une même espèce. Il est également utile de mesurer plusieurs traits, comme la durée de vie reproductive, la fécondité et l’âge de première reproduction, même si ceux-ci sont fortement corrélés entre eux.

CHAPITRE III

Etude d’un trait phénotypique clef : la résistance au froid.

I. Introduction

Chez les arthropodes, la température est un paramètre environnemental clé qui influence de nombreux traits d’histoire de vie (Huey & Stevenson, 1979). Elle a notamment une influence majeure sur la survie hivernale des insectes. Deux paramètres semblent plus particulièrement importants pour la survie hivernale des arthropodes : la durée d’exposition au froid (Jean et al., 1990; Salt, 1961) et la réponse à des conditions de température extrêmes (Sinclair et al., 2003). De nombreux insectes présentent des mécanismes d’adaptation qui leur permettent de survivre au froid (Strang, 1992), soit par tolérance aux basses températures, soit en évitant la congélation (Bale, 1996). Ces mécanismes d'adaptation ont l’avantage de permettre la survie hivernale chez les espèces des régions tempérées ou froides (Denlinger, 1991).

Chez les insectes, plusieurs études sur les conditions microclimatiques montrent que la sélection de l’habitat (cad le choix du site d’hivernage) ainsi que certains comportements jouent également un rôle important pour la survie aux basses températures (Sinclair et al., 2003). La formation d’agrégats est une des stratégies comportementales utilisée par H. axyridis pour survivre à des hivers froids (Obata, 1986; Sakurai et al., 1992). Les individus adultes se déplacent dans des endroits cachés et abrités où ils se regroupent. Ils créent ainsi un microclimat protecteur où la température est moins extrême qu’à l’extérieur (Obata, 1986; Sakurai et al., 1992). Labrie et al (2008) démontrent que l’agrégation peut grandement influencer le succès de l’invasion chez H. axyridis. Il est possible que ce soit cette stratégie comportementale qui leur ait permis de s’établir en Amérique du Nord et en Europe (Brown et al., 2011).

En plus d’un comportement d’agrégation adaptatif, les individus peuvent également présenter des adaptations physiologiques aux températures froides. Ainsi, Lombaert et al (2008) ont montré que les populations envahissantes en Europe présentaient une plus grande survie et une plus grande plasticité phénotypique que les populations de lutte biologique à des températures froides allant de 5 à 15°C. Une plus faible capacité de résistance au froid des populations de lutte biologique pourrait expliquer les échecs répétés d’établissement à long terme de ces populations (Ferran et al., 1997).

Dans cette partie de ma thèse, je me suis intéressé au déterminisme génétique pouvant être à l’origine des différences de résistance au froid entre les individus de lutte biologique et les individus envahissants de la coccinelle Asiatique. Au vu de certains résultats (voir ci-

dessous), j’ai été également conduit à étudier l’effet du statut d’accouplement sur la résistance au froid chez cette espèce.

II. Déterminisme génétique de la résistance au froid

Je me suis focalisé sur l’étude de la résistance au froid de deux populations d’H. axyridis contrastées du point de vue de leur histoire et par conséquence de leur capacité de résistance au froid : (i) une population en élevage depuis 1982 dans un but de lutte biologique (BioTop) (environ 70-80 générations, Ferran et al., 1997; Ongagna et al., 1993), maintenue en laboratoire en conditions constantes notamment pour ce qui est de la température (24°C) ; (ii) une population située dans l’aire envahie aux États-Unis (Dakota du Sud, Brookings) qui a résisté à une vingtaine d'hivers nord-américains depuis son établissement en 1988 (Chapin & Brou, 1991). Cette population a été échantillonnée en 2011 et a passé trois générations en conditions contrôlées au laboratoire (CBGP) avec une phase de diapause forcée à 13°C entre chaque génération. Les approches expérimentales réalisées ont eu pour but d’étudier le déterminisme génétique de la résistance au froid chez H. axyridis.

Dans un premier temps, j’ai effectué plusieurs expériences préliminaires afin d’identifier les conditions de stress thermique les plus discriminantes pour ces deux populations (température, durée du stress, individus groupés ou isolés etc…). J’ai ensuite utilisé une approche classique de génétique mendélienne basée sur des croisements de première génération. Nous avons mesuré pour des croisements entre les individus de ces deux populations et de leurs hybrides les taux de survie après un événement de stress thermique au froid.

1. Expérience 1: Croisements populationnels

Dans une première expérience, nous avons effectué un croisement populationnel de première génération afin de tester l’hypothèse simple d'une résistance au froid sous le contrôle d’un gène majeur autosomal avec deux allèles : résistant (R) et sensible (S).

1.1 Attendus théoriques

Sous cette hypothèse, les attendus théoriques, en terme de résistance au froid après le stress thermique, sont présentés dans la figure 1. Considérons le cas de deux populations monomorphes 100 % sensibles (SS) pour les individus de lutte biologique (Top) et 100 % résistants (RR) pour les individus envahissants (USA ; figure 1a). Les hybrides (H1 et H2,

Tableau 1 : (Expérience 1) Croisements réalisés pour cette expérience

Type de croisement Nombre des femelles Nombre des mâles Code utilisé à la suite Top x Top 50 Top 50 Top Top Top x USA 50 Top 50 USA H1 USA x Top 50 USA 50 Top H2 USA x USA 50 USA 50 USA USA

Figure 1: (Expérience 1) Taux de survie théorique attendu pour les populations pures (Top et USA) et leurs hybrides de première génération. a) Cas où les 2 populations sont fixées pour deux allèles différents, b) Cas où les 2 populations sont polymorphes avec une fréquence de l’allèle R de 50% dans les 2 populations. c) Cas où les 2 populations sont polymorphes avec une fréquence l’allèle R de 75% dans la population USA et 25% dans la population Top. Dans les 3 cas, on fait l’hypothèse que les phénotypes sensibles et résistants ne se retranscrivent pas intégralement en terme de survie. Ainsi même les individus SS ne présentent pas une survie de 0% et les individus RR ne présentent pas une survie de 100%.

pour les deux sens de croisement) seront alors 100 % hétérozygotes (RS). Si l’allèle R est dominant, on attend alors 100 % d’hybrides résistants. Inversement, si l’allèle R est récessif, on s’attend à ce que tous les hybrides F1, H1 ou H2, soient sensibles. Si les deux populations parentales sont polymorphes, l’attendu théorique dépend alors de la fréquence des allèles R et S dans chaque population. La figure 1b présente le cas où les 2 allèles sont équifréquents dans les deux populations. Dans cette situation, on devrait avoir, en panmixie, 25% d’individus SS, 25 % d’individus RR et 50% d’individus RS pour les différents types de croisement. Si l’allèle R est dominant, 75 % des individus F1 (issus de H1 aussi bien que de H2) devraient résister dans chaque croisement. Si au contraire R est récessif, on attend alors 75 % de mortalité parmi les individus hybrides. La figure 1c montre une situation plus vraisemblable, pour laquelle l’allèle R est majoritaire dans la population USA (75%) et minoritaire dans la population Top (25%). Dans ce cas, les proportions attendues dans les descendants H1 et H2 sont les suivantes : 6 % d’individus SS, 56 % d’individus RR et 38% d’individus RS pour USA. Ainsi, si l’allèle R est dominant on s’attend alors à ce que 94 % des individus soient résistants. Si cet allèle est récessif, la proportion des individus sensibles au froid devraient être de 44 % des individus. Pour la souche Top, on attend, en panmixie, 56 % d’individus SS, 6 % d’individus RR et 38% d’individus SR. Si R est dominant on attend alors que 44 % des individus soient résistants. Si R est récessif, on attend alors que 94 % des individus soient sensibles.

1.2 Protocole expérimental

Nous avons d’abord réalisé une nouvelle génération pour chaque population en croisant au hasard 200 individus par population (100 femelles et 100 mâles) pour produire un grand nombre d’individus pour réaliser cette étude. Ces adultes constituent la génération G0. Ensuite, nous avons effectué à partir des descendants les quatre croisements décrits dans le tableau 1. La nouvelle génération a été produite pour les deux populations en conditions contrôlées (enceintes bioclimatiques) à 24°C, 14H J : 10H N, humidité 60%. Tous les individus ont été nourris avec des œufs d’Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae).

A noter que chaque boîte contient une femelle et un mâle du même croisement (50 boîtes par croisement), et les mâles ont été changés de boîte au hasard trois fois par semaine pour favoriser les fécondations multiples. A partir de ces individus G0, nous avons obtenu 1560 individus G1 (780 femelles et 780 mâles) pour l’ensemble des quatre croisements : 240,

Tableau 2 : (Expérience 1) Effectifs des différents croisements pour les deux blocs expérimentaux testés pour un stress thermique à -3°C et les témoins à 24°C.

Nombre Nombre Nombre Nombre de boites Nombre de boites Type de Descendants Sexe d’individus testés d’individus d’individus par testées par bloc à témoins par bloc croisements F1 par bloc témoins par bloc boite -3°C à 24°C

Femelle 120 50 10 Top 20 5 1 Mâle 120 50 10 Femelle 220 100 10 H1 20 10 1 Mâle 220 100 10 Femelle 220 100 10 H2 20 10 1 Mâle 220 100 10 Femelle 220 100 10 USA 20 10 1 Mâle 220 100 10 Totale Individus 1560 700 80 Ƃƃ 35 4

Figure 2 : (Expérience 1) Plan d’expérience suivi pour l’étude de la résistance au froid chez H. axyridis.

440, 440 et 440 individus respectivement pour les croisements Top, H1, H2 et USA (Tableau 2).

Les tests de survie au froid ont été réalisés sur des groupes d’individus vierges (10 femelles et 10 mâles G1 par boîte; longueur = 26 cm, largeur = 13 cm, hauteur = 8 cm). Du fait de contraintes (au niveau du matériel biologique et des enceintes climatiques), les 1400 individus ont été testés en deux blocs expérimentaux. Pour chaque bloc (1 et 2), nous avons testé un total de 700 individus (350 femelles et 350 mâles): 5, 10, 10 et 10 boîtes de 20 individus respectivement pour Top, H1, H2 et USA (Figure 2). Au total, 160 individus ont servi de témoins et placés à 24°C, i.e., une boîte (10 femelles et 10 mâles) par croisement pour chaque bloc (Tableau 2).

Pour chaque bloc expérimental, nous avons séparé les descendants directement après l’émergence par sexe pour éviter les contacts entre les femelles et les mâles. Nous les avons gardés à 24°C jusqu’à l’âge de 7 à 10 jours. Nous avons ensuite placé 10 femelles et 10 mâles dans chaque boite. Nous avons transféré toutes ces boîtes à 13°C dans une enceinte bioclimatique pendant 48 heures, puis dans une autre enceinte bioclimatique à -3°C pendant 10 jours. Ensuite nous les avons replacées dans les enceintes bioclimatiques à 13°C pendant 48 heures. Enfin les boîtes ont été placées à 24°C pendant 10 jours. Nous avons noté le nombre de morts au quatrième jour à 24°C (Figure 2).

1.3 Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques pour cette partie ont été effectuées à l’aide du logiciel JMP Pro 9. La proportion d’individus ayant survécu au stress thermique a été analysée par un modèle linéaire généralisé (GLM) avec une distribution binomiale (estimation par maximum de vraisemblance). Nous avons modélisé la survie des individus en fonction de (i) l’effet de la température (-3°C et 24°C), (ii) l’effet du type de croisement (Top, H1, H2 et USA) et de l’interaction température * type de croisement, (iii) l’effet de la boîte imbriquée dans le type de croisement, (iv) l’effet sexe et de l’interaction sexe * type de croisement ainsi que l’interaction sexe * température, (v) l’effet bloc et de l’interaction bloc * type de croisement, l’interaction bloc * température, et l’interaction bloc * sexe. Nous avons ensuite utilisé le test du Chi-deux pour les comparaisons deux à deux pour chaque modalité analysée.

Tableau 3 : (Expérience 1) Résultats des analyses statistique GLM pour les différents effets testées.

Chi deux du rapport de Source Degrés de liberté Prob.>Chi deux vraisemblance Type de croisement 3 27.889 <0.0001 Température 1 0.517 0.472 Température*Type de croisement 3 10.029 0.0183 Boite [Type de croisement] 31 41.725 0.094 Sexe 1 3.626 0.056 Sexe*Type de croisement 3 38.525 <0.0001 Sexe*Température 1 0.836 0.360 Sexe*Bloc 1 3.237 0.072 Bloc 1 3.627 0.056 Bloc*Type de croisement 3 4.414 0.22 Bloc*Température 1 0.679 0.409

Figure 3: (Expérience 1) Taux de survie moyen (± Erreur Standard) calculé sur l’ensemble des deux blocs et pour les deux températures -3°C et 24°C pour les différents croisements Top, H1, H2 et USA.

1.4 Résultats et discussion

Nos analyses statistiques montrent qu’il y a des différences significatives entre les types de croisement (P = 0.0001, tableau 3). Quelle que soit la température (-3°C ou 24°C), les individus (Top) ont des taux de survie plus faible (49.5% à -3°C) par rapport aux individus des autres croisements H1, H2 et USA, dont les taux de survie s’élèvent à 90.7%, 91.2% et 94.5%, respectivement après le stress thermique à -3°C. Les individus témoin à 24°C ont des taux de survie de 77.5%, 82°C, 85% et 82% pour Top, H1, H2 et USA, respectivement (Figure 3).

Les résultats de la figure 3 pourrait s’expliquer par la présence d’un gène de résistance au froid autosomal à deux allèles de type R/S, avec l’allèle R dominant (quasiment) fixé dans la population USA. En effet, le taux de survie observé est proche de celui attendu chez USA sous l’hypothèse que la population soit (quasi) monomorphe (95% de type R). Pour la population Top, le résultat obtenu correspondrait à un polymorphisme de type R/S avec 50% d’allèle R.

Ces résultats sur les croisements populationnels montrent des différences importantes entre les taux de survie observés et attendus, en particulier chez les hybrides. En effet, en considérant les informations chez Top et USA, le taux de survie observé chez les deux types d’hybride (environ 90%) s’avère trop élevé, même dans le cas d’une dominance complète de la résistance au froid (la survie attendue serait au mieux de 70%). Les résultats chez les hybrides semblent donc invalider l’hypothèse d’un contrôle de la résistance au froid par un unique gène majeur autosomal à deux allèles R et S.

Il est intéressant de noter que l’effet d’interaction sexe * type de croisement est hautement significatif (P = 0.0001). Nos tests du Chi-deux indiquent que, pour la population Top, les mâles sont plus résistants que les femelles (P = 0.0001). En revanche, il n’y a pas de différence entre sexe pour les croisements H1, H2 et USA (Figure 4, Tableau 4). Le fait d’observer un fort effet du sexe dans la population Top (avec un de taux de survie moyen de 77% chez les mâles et 22% chez les femelles) nous a amené à envisager une hypothèse alternative basée sur un déterminisme impliquant un ou plusieurs gènes majeurs localisés sur les chromosomes sexuels. Le déterminisme génétique du sexe chez H. axyridis est du type XY (femelle homogamétique XX et mâle hétérogamétique XY), (Beauchamp.R.L. & R.B., 2006; Zakharov et al., 1999). L’excès de résistance chez les mâles Top par rapport aux femelles Top pourrait résulter d’un déterminisme monogénétique lié au chromosome X. Ce

Tableau 4 : (Expérience 1) Résultats des analyses statistique (Chi-deux) entre les différentes interactions.

Type de croisement Sexe*Type de croisement Top H1 H2 USA 7RSƃ +ƃ +ƃ 86$ƃ Top 0.0015 0.05 <0.0001 7RSƂ <0.0001 H1 0.46 0.033 +Ƃ 0.44 H2 0.006 +Ƃ 0.34 USA 86$Ƃ 0.25

Figure 4: (Expérience 1) Taux de survie moyen (±Erreur Standard) calculé sur l’ensemble des deux blocs, aux températures -3°C et 24°C, pour les croisements Top, H1, H2 et USA.

gène serait caractérisé par deux allèles : un allèle de sensibilité au froid (S) et un allèle de résistance au froid (r). De part la baisse importante de survie observée chez les femelles Top par rapport aux mâles, la résistance au froid conférée par l’allèle (r) serait plutôt récessive. La population USA serait potentiellement fixée pour l’allèle (r) avec un seul type de mâles (XrY) et de femelles (XrXr). La population Top serait quant à elle polymorphe avec deux types des mâles (XrY et XSY) et trois types des femelles (XrXr, XSXr et XSXS), avec une fréquence de l’allèle (r) autour de 64 à 90% (cf. proportion moyenne de survie chez les mâles dans les deux blocs expérimentaux). La population Top caractérisée par une taille efficace faible pendant l’élevage aurait pu subir des effets de dérive importants ayant pu aboutir, par hasard, à une forte diminution en fréquence de l’allèle r et, de manière corrélative, à une forte augmentation de l’allèle S.

Même si cette seconde hypothèse de déterminisme génétique (un gène majeur porté par le chromosome X) expliquerait mieux nos résultats, nous remarquons que deux points dans nos résultats semblent en contradiction avec cette hypothèse. Tout d'abord, nos résultats indiquent un déficit relativement important de femelles résistantes (rr) dans la population parentale Top si la fréquence de l’allèle r dans la population est estimée directement à partir de la proportion de mâles survivants (on attend un taux de survie plus élevée chez les femelles Top autour de 59% au lieu des 22% observés). Ce déficit est encore plus important si on relâche l’hypothèse d’une récessivité totale de r. Deuxièmement, le taux de survie dans la population H1 est trop élevé (90.7%) par rapport à ce qui est attendu (77%). La survie accrue chez H1 par rapport à l’attendu pourrait mieux s’expliquer si on relâche l’hypothèse d’une récessivité totale de r. Pour tester plus directement l’hypothèse d’un gène majeure porté par le chromosome X, nous avons réalisé dans un second temps des tests de résistance au froid basés sur un protocole expérimental à partir de familles (et non plus sur des populations).

2. Expérience 2 : Tests basés sur un protocole en familles

Pour tester proprement l’hypothèse d’un allèle (r) conférant une résistance au froid porté par le chromosome X et partiellement récessif, il convient de réaliser des tests sur des familles correspondant à un ensemble de descendants issus d’une seule femelle croisée avec un seul mâle. Pour obtenir une descendance variable pour le trait considéré, il semble pertinent de réaliser ces familles à partir de croisements entre des individus de la population USA (potentiellement fixée pour l’allèle r) et deux de la population Top (polymorphe avec présence d’allèles S et r).

Tableau 5 : Expérience 2 : Effectifs des deux hybrides pour FH1 et FH2.

Nombre de Nombre de Nombre d’individus Nombre d’individus Hybride Sexe descendants par famille par boite testés famille Femelle 20 200 FH1 10 20 Mâle 20 200 Femelle 20 200 FH2 10 20 Mâle 20 200 Totale Individus 20 800 Ƃƃ 800

Figure 5: Expérience 2 : Taux de survie moyen attendu pour les différentes familles des deux hybrides FH1 et FH2 selon un déterminisme d’un gène majeur de porté par le chromosome X avec un allèle de résistance récessif (r).

Dans tous les cas, on fait l’hypothèse que les phénotypes sensibles et résistants ne se retranscrivent pas intégralement en termes de survie.

2.1 Attendus théoriques

Si l’hypothèse d’un allèle (r) conférant une résistance au froid porté par le chromosome X et partiellement récessif est valide, notre attendu théorique est d’obtenir trois types de familles pour l’hybride de première génération FH1 (femelle Top x mâle USA), et deux types de familles pour l’hybride de première génération FH2 (mâle Top x femelle USA). Les attendus théoriques après le stress thermique au froid sont présentés dans la figure 5.

Pour le premier hybride, FH1, on attend trois types de descendance : (a) si la femelle Top est XSXS, on s’attend à obtenir une descendant composée de 100% de femelles sensibles (XrXS et 100% de mâles sensibles (XSY) ; (b) si la femelle Top est XrXS, on s’attend à 50% de femelles sensibles (XrXS), 50% de femelles résistantes (XrXr), 50% de mâles sensibles (XSY) et 50% de mâles résistants (XrY) ; (c) si la femelle Top est XrXr, on s’attend à 100% de femelles résistantes (XrXݎr) et 100% de mâles résistants (XrY).

Pour le deuxième hybride, FH2, on attend deux types de descendances : (a) si le mâle Top est XSY, on s’attend à 100% de femelles sensibles (XrXS) et 100% de mâles résistants (XrY) ; (b) si le mâle Top est XrY, on s’attend à 100% de femelles résistantes (XrXr) et 100% de mâles résistants (XݎY).

2.2 Protocole expérimental

Nous avons réalisé une nouvelle génération pour chaque population parentale (Top et USA) en croisant au hasard 100 individus par population (50 femelles et 50 mâles). A partir des descendants de cette génération, nous avons ensuite effectué deux types de croisement familiaux hybrides : (i) des croisements d’une femelle Top avec un mâle USA (hybrides FH1), et (ii) des croisements d’une femelle USA avec un mâles Top (hybrides FH2). Dix familles ont été ainsi produites pour chaque type d’hybride. Les tests au froid ont été réalisés avec les mêmes conditions de température que lors de la première expérience (croisements populationnels). Nous avons testé au froid 800 descendants hybrides au total (400 pour chacun des deux types d'hybrides FH1 et FH2). Pour chaque famille, 2 boîtes contenant 20 individus chacun ont été testées (Tableau 5).

Figure 6 : (Expérience 2) Taux de survie moyen (± Erreur Standard) observés pour les deux sexes dans les différentes familles d’hybrides (FH1 et FH2), la lettre P indique les différentes familles ayant pondu avant le passage à -3°C.

2.3 Analyses statistiques

Nous avons utilisé la même méthode statistique (GLM) que lors de la première expérience, et tenté d'expliquer la proportion d’individus ayant survécu au stress thermique en fonction de (i) l’effet du type d’hybride (FH1 et FH2), (ii) l’effet de la boîte imbriqué dans le type d’hybride, (iii) l’effet famille, (iv) l’effet sexe et l’interaction sexe * type d’hybride.

2.4 Résultats et discussion

Nos analyses montrent que l'effet famille est significatif (P = 0.0001, tableau 6). Les figures 6a et 6b montrent qu’il y a des différences significatives entre les 10 familles testées quel que soit le type d’hybride FH1 ou FH2. On observe également un effet du sexe (Tableau 6), avec un taux de survie plus élevé chez les mâles que chez les femelles.

Ces différences entre familles correspondent à l’attendu théorique. Cependant, nous ne retrouvons pas les prédictions de l’attendu théorique quant aux 3 types de descendances chez les hybrides FH1 et aux 2 types de descendances chez l’hybride FH2 (Figure 5). De plus, nous observons des différences importantes entre les deux sexes dans la plupart des familles, ce qui est contraire à l’attendu (Figure 6). Au final, pour les deux types d’hybride (FH1 et FH2), nos résultats de la deuxième expérience sur les différentes familles montrent des différences importantes entre nos attendus théoriques (Figure 5) et nos résultats observés (Figure 6). On peut donc rejeter l'hypothèse d’un gène majeur porté par le chromosome X avec un allèle de résistance récessif.

3. Des différences inattendues entre les deux expériences réalisées

Les résultats des deux expériences réalisées sur populations (expérience 1) et sur familles (expérience 2) présentent des différences importantes inattendues. Ces différences concernent notamment les proportions d’individus ayant survécu après le stress thermique : 90.7 % et 91.2 % pour les deux hybrides (H1 et H2, figure 3) de l'expérience 1 et 76 % et 71 % pour les deux hybrides (FH1 et FH2, figure 7) de l'expérience 2. De plus, nous n'avons pas obtenu de différences entre les deux sexes dans les hybrides de l’expérience 1, alors que nous avons observé un effet sexe dans l'expérience 2.

Il faut noter que le protocole de l’expérience 2 n’inclut pas de témoins pour les populations parentales Top et USA. Ces témoins auraient été utiles pour nous aider à expliquer les différences de taux de survie moyens observées chez les hybrides entre les

Tableau 6 : (Expérience 2) Résultats des analyses statistiques GLM.

Chi deux du rapport de Source Degrés de liberté Prob.>Chi deux vraisemblance Type d'hybride 1 0.0000 0.99 Famille [Type d'hybride] 18 166.6182 <0.0001 Boite [Type d'hybride, Famille] 20 25.1378 0.1962 Sexe 1 119.3217 <0.0001 Sexe*Type d'hybride 1 5.8354 0.0157

Figure 7 : (Expérience 2) Taux de survie moyen (±Erreur Standard) calculé sur l’ensemble des données familiales pour les deux sexes pour les deux types d’hybrides FH1 et FH2.

expériences 1 et 2. Soulignons que nous avons également observé des pontes dans certaines boîtes à 13°C, c’est-à-dire juste avant le passage en stress thermique (température négative) dans l’expérience 2 (par exemple pour les familles F13, F4 et F6 des hybrides FH1 et pour les familles F10, F15, F4 et F9 des hybrides FH2), alors que nous n’avons pas observé de telles pontes dans l’expérience 1. Ceci implique que les individus de la deuxième expérience ont été capables de s’accoupler et se reproduire à 13°C dans l’expérience 2 et pas dans l’expérience 1.

Cette étude sur la résistance au froid chez H. axyridis, met en évidence la difficulté d'obtenir des résultats à la fois simples et cohérents sur le déterminisme génétique de ce trait. En dépit de ces difficultés, nos résultats suggèrent qu’il est peu probable que le déterminisme génétique de la résistance au froid soit simple. En particulier les hypothèses d'un contrôle par un gène majeur autosomal ou porté par le chromosome X n'ont pas été validées expérimentalement. Il est en fait possible, voir même probable, que le déterminisme de la résistance au froid soit contrôlé par plusieurs gènes chez H. axyridis.

Nos expériences visant à étudier les stratégies de vie des différentes populations d’H. axyridis (cf chapitre II) peuvent également nous aider à interpréter nos résultats expérimentaux sur la résistance au froid. Tout d'abord, les femelles de la population Top se reproduisent significativement plus tôt que les femelles d’USA (respectivement 8.8 et 11.1 jours en moyenne). De plus, les individus de la population Top ont une durée de vie plus courte que les individus de la population USA. On observe également des différences significatives entre les deux sexes chez la population Top (respectivement 48.5 et 61.9 jours pour les femelles et les mâles). En revanche, les femelles et les mâles de la population USA ne montrent pas de différences significatives (respectivement 114.9 et 104.3 jours en moyenne).

In fine, nous proposons d’interpréter les différences observées entre le taux de survie après le stress thermique au froid des populations Top et USA de la manière suivante.

Premièrement, les individus de la population Top sont capables de s’accoupler et se reproduire au cours des deux jours à 13°C précédant le passage en température négative pendant notre cycle de froid expérimental : ils sont alors âgés de 12 à 15 jours. En revanche, au moins certains individus de la population USA, s'ils sont de même âge, n'ont peut-être pas encore atteint la même maturité sexuelle dans la mesure où celle-ci est plus tardive dans cette population. Or, nous avons montré sur plusieurs populations que le statut d’accouplement

(vierges, accouplés et reproducteurs) modifie significativement la survie au stress au froid ; ce point sera détaillé dans la section suivante III. En effet, les individus vierges résistent plus au froid que les individus présentant un autre statut reproducteur. Ainsi une différence de statut reproducteur entre les individus de même âge des populations Top et USA au cours de notre protocole expérimental pourrait en partie expliquer nos résultats.

Deuxièmement, la durée du cycle de stress thermique depuis l’émergence des adultes jusqu’à la date d’observation de la survie dure entre 28 à 30 jours. D'après nos résultats sur l'espérance de vie des différentes populations, les individus de Top sont déjà relativement proches de leur durée de vie moyenne contrairement aux individus USA qui vivent en moyenne plus longtemps. Or d'une manière générale, les jeunes adultes résistent mieux aux basses températures que les adultes âgés (Monaghan et al., 2008). Dans le même esprit, la différence de survie post-stress observée entre les deux sexes dans la population Top dans la première expérience (croisements populationnels) pourrait s'expliquer par le fait que les mâles de cette population montre une durée de vie significativement plus grande que les femelles et seraient donc physiologiquement moins « âgés » au moment du stress thermique.

Au regard de l’ensemble de nos résultats et de ces points de discussions, il nous paraît sensé d’émettre l’hypothèse que la population de lutte biologique Européenne Top a perdu la capacité à diapauser pendant les périodes froides (hiver in natura). Cette caractéristique est susceptible d’expliquer les difficultés observées pour les individus lâchés dans la nature lors des opérations de lutte biologique à s’établir sur le long terme. Les protocoles expérimentaux choisis jusqu’à présent ne semblent pas pertinents pour comprendre le déterminisme génétique de ce trait chez H. axyridis.

Tableau 7 : (Expérience 3) Effectifs expérimentaux pour l’étude de l’effet du statut d’accouplement sur la survie au froid et sur la capacité de reproduction post-stress

Statuts Total des Nombre d’individus Nombre d’individus Nombre d’individus Nombre des Nombre de boites testées Nombre de boites Sexe d’accouplement descendants G2 testés à -1.5°C testés à -5°C Témoin à 13°C individus par boite par température par témoin

Femelle 130 60 60 10 Vierge 20 6 1 Mâle 130 60 60 10 Femelle 110 50 50 10 Accouplé 20 5 1 Mâle 110 50 50 10 Femelle 110 50 50 10 Reproducteur 20 5 1 Mâle 110 50 50 10 Totale Individus 700 320 320 60 Ƃƃ 16 3

III. Expérience 3 : études complémentaires de l’effet du statut d’accouplement sur la survie au froid et sur la capacité de reproduction post-stress

Comme nous l’avons vu dans la section précédente, les différences inattendues observées entre nos résultats d'études populationnelles et familiales (respectivement expériences 1 et 2) pourraient être dues à la présence de femelles reproductrices que nous avons observées seulement dans la deuxième expérience. Il est donc possible que le statut d’accouplement ait eu un effet sur nos expérimentations et puisse expliquer, au moins en partie, les différences de résultats entre nos deux expériences. Nous avons donc réalisé une troisième expérience dans le but de tester l'hypothèse d'une tolérance au froid supérieure des individus vierges par rapport aux individus fécondés.

1. Protocole expérimental

1.1 Matériel biologique

Pour cette expérience, nous avons échantillonné une population envahissante européenne d’H. axyridis à Sophia Antipolis (France) en 2013. Cette population naturelle a passé deux générations en conditions contrôlées pour éviter d’éventuels effets maternels. Pour chaque nouvelle génération, nous avons croisé au hasard des individus (80 et 52 femelles et 80 et 52 mâles pour les générations 1 et 2 respectivement). Les mâles ont été changés de boîte au hasard deux fois par semaine pour favoriser les fécondations multiples. Nous avons ainsi produit 700 individus (350 femelles et 350 mâles) pour la génération 2 sur laquelle nos tests ont été effectués (Tableau 7). Tous les individus ont été élevés en conditions contrôlées (enceintes bioclimatiques) à 24°C, 14H J : 10H N, humidité 60%, et nourris ad libitum avec des œufs d’Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae).

1.2 Survie au froid en fonction du statut d'accouplement

Huit à dix jours après l'émergence des adultes, nous avons constitué trois groupes caractérisés par un statut d’accouplement différent : vierges, accouplés et reproducteurs. Il n'y a eu aucun contact entre les femelles et les mâles dans le groupe « individus vierges ». Pour le groupe « individus accouplés », nous avons placé aléatoirement mâles et femelles dans huit grosses boîtes (15 femelles et 15 mâles) par boîte pendant 48 heures avant le test au froid. Nous avons pris en compte que les contacts entre les deux sexes pendant 48 heures nous permettent d’avoir une forte probabilité que chaque individu se soit accouplé au moins une

fois. Notons que ce délai ne laisse pas le temps aux femelles de pondre. Enfin, pour le groupe « individus reproducteurs », nous avons placé une femelle et un mâle dans une petite boîte pendant 10 jours, et nous nous sommes assurés que toutes les femelles avaient pondu au moins une fois.

Les tests au froid ont été réalisés sur des groupes d’individus (10 femelles et 10 mâles par boîte; longueur = 26 cm, largeur = 13 cm, hauteur = 8 cm) pour les différents statuts d’accouplement, et pour deux températures négatives (-1.5 °C et -5 °C). Pour chaque statut d’accouplement, nous avons également mis en place une boîte témoin à 13°C (Tableau 7).

Avant le stress thermique, nous avons placé tous les individus à 24°C pendant 8 à 10 jours pour nous permettre de réaliser les trois statuts d’accouplement (vierge, accouplé, reproducteur). Pour initier le stress thermique, nous avons transféré toutes les boîtes à 13°C dans une enceinte bioclimatique pendant 48 heures, puis ces boîtes ont été transférées dans une autre enceinte bioclimatique à -1.5 °C ou -5 °C pendant 10 jours. Ensuite les boîtes ont été replacées dans les enceintes bioclimatiques à 13°C pendant 48 heures. Enfin elles ont été transférées à 24°C pendant 10 jours. Nous avons noté le nombre de morts le quatrième jour à 24°C. Nous avons gardé les 3 boîtes « témoins » pour les trois statuts à la température de 13C° pendant le période au froid, puis on les a replacés à la 24°C avec les individus testés pour noter la mortalité.

1.3 Capacité de reproduction après un stress au froid

Suite à l’expérience précédente, nous nous sommes intéressés à la capacité des femelles à se reproduire après le stress thermique a -1.5°C. Pour cela, nous avons effectué l’expérience suivante. Après l'expérience précédente, nous avons placé les individus survivants après 10 jours en couple (un mâle et une femelle par boîte ; longueur = 2.5 cm, diamètre = 5 cm). Nous avons ainsi obtenu respectivement 58, 44 et 36 couples pour les différents statuts d’accouplement (vierge, accouplé et reproducteur). Nous avons ensuite calculé la proportion de femelles s’étant reproduit au moins une fois pendant les 14 jours suivant la mise en couple.

2. Analyses statistiques

La proportion d’individus ayant survécu au stress thermique a été analysée par un modèle linéaire généralisé (GLM) avec une distribution binomiale (estimation par maximum de vraisemblance). On modélise la survie des individus en fonction de (i) la température (-

Tableau 8 : (Expérience 3) Survie au froid : Résultats des analyses statistique GLM pour les deux températures testées.

Degrés de Chi deux du rapport de Source Prob.>Chi deux liberté vraisemblance Température 1 313.408 <0.0001 Statut d'accouplement 2 74.111 <0.0001 Statut d'accouplement*Température 2 4.342 0.114 Boite [statut d'accouplement] 13 15.849 0.2573 Sexe 1 0.0586 0.8086 Sexe*Statut d'accouplement 2 2.732 0.2551 Sexe*Température 1 0 0.99

Tableau 9 : (Expérience 3) Survie au froid : résultats des analyses statistiques (Chi-deux) entre les différents statuts.

Statut d'accouplement Vierges Accouplés Reproducteur Vierge <0.00001 <0.00001 Accouples 0.0004 Reproducteur

Figure 8: (Expérience 3) Taux de survie moyen (±Erreur Standard) pour les différents statuts d’accouplement, pour les deux températures testées.

1.5°C et -5°C), (ii) l’effet du statut d’accouplement (vierge, accouplé et reproducteur), (iii) l’interaction température * statut d’accouplement, (iv) l’effet de la boîte imbriqué dans le statut d’accouplement, (v) l’effet sexe, et (vi) l’interaction sexe * statut d’accouplement et l’interaction sexe * température. Lorsque l’effet statut était significatif, nous avons testé les différences entre les statuts deux à deux par un test du Chi-deux.

La proportion des femelles ayant pondu après le stress thermique à -1.5°C a été analysée par la même méthode statistique que pour la proportion d’individus ayant survécu au passage au froid. On modélise ainsi la proportion de femelles ayant pondu après le stress thermique en fonction du statut d’accouplement (vierge, accouplé, reproducteur). Nous avons testé les différences entre les statuts deux à deux par un test du Chi-deux.

3. Résultats

3.1 Survie au froid en fonction du statut d'accouplement

Nos analyses statistiques montrent des différences significatives entre les deux températures (-1.5C° et -5°C, P = 0.0001,) sur la proportion des individus survivants après le stress thermique, quel que soit le statut d’accouplement (Tableau 8). Des différences significatives entre les trois statuts d’accouplements (vierge, accouplé et reproducteur, P = 0.0001) sont observées, ceci quelques soit la température testée. En revanche, nos résultats montrent qu’il n’y a pas de différence significative entre les sexes (P = 0.80), ni d’effets d'interaction significatifs (température * statut d’accouplement, P = 0.14 ; sexe * statut d’accouplement, P = 0.25 ; sexe * température, P = 0.99). De même, il n’y a pas d’effet boîte (P = 0.25, tableau 8).

Les tests du Chi-deux montrent qu’il existe des différences significatives entre les individus vierges et les deux autre statuts d’accouplement après le stress thermique (P = 0.0001 lorsque l’on compare les individus accouplés et reproducteurs ; tableau 9), ceci quelle que soit la température testée. Les individus accouplés diffèrent aussi significativement des individus reproducteurs (P = 0.0004, tableau 9). La figure 8 montre que le sens des différences observées est le suivant : survie au froid des individus vierges > individus accouplés > individus reproducteurs. A noter que nous n’avons observé aucun individu mort dans les boîtes témoins à 13°C pour les 3 statuts d’accouplement.

Tableau 10 : (Expérience 3) Capacité de reproduction post-stress : résultats des analyses statistiques (Chi-deux) entre les différents statuts d’accouplement.

Statut d'accouplement Vierges Accouplés Reproducteur Vierge 0.97 0.021 Accouples 0.038 Reproducteur

Figure 9: (Expérience 3) Proportion de femelles reproductrices (±Erreur Standard) après un stress thermique à -1.5°C pour les différents statuts d’accouplement.

3.2 Capacité de reproduction après un stress au froid

Nos analyses statistiques GLM montrent des différences significatives entre les trois statuts d’accouplement (P = 0.045 ; figure 9). Les tests du Chi-deux montrent que la proportion de femelles reproductrices ayant pondu après le stress thermique au froid est plus faible que celle des femelles accouplées (53% versus 75% ; P = 0.038) et celle des femelles vierges (76 % ; P = 0.021). Il n’y a pas de différence significative entre les femelles vierges et accouplées (P = 0.97, tableau 10).

4. Discussion

Nos résultats montent qu’il existe des différences importantes entre les trois statuts (vierge, accouplé et reproducteur) aussi bien pour la survie au froid que pour la capacité de reproduction post-stress. Ces résultats sont en accord avec des études démontrant que le processus d’accouplement peut avoir un impact important sur la survie des insectes (Chapman et al., 2003). La résistance au froid plus importante des femelles vierges par rapport aux femelles non vierges a déjà été montrée chez des insectes sociaux comme les hyménoptères; par exemple, chez les guêpes Vespila maculifron (Jennifer & Goodisman, 2012) et chez Bombus terrestris L. (Greeff & Schmid-Hempel, 2008). En revanche, chez les fourmis Cardiocondyla obscurior, les reines accouplées avec un mâle stérilisé possèdent une plus grande longévité que les reines non accouplées (Schrempf et al., 2005). Soulignons ici que nous avons démontré par des expériences annexes des effets similaires du statut d’accouplement sur d’autres populations d’H. axyridis (population sauvage USA et une population hybride entre Beijing et Top) (résultats non présentés). Nos conclusions semblent donc généralisables à l’ensemble des populations d’H. axyridis. Dans la mesure où les femelles vierges présentant une survie supérieure au froid et un taux de reproduction plus élevée a pu être sélectionnés in natura.

Dans la nature, la proportion des femelles fécondées présentes dans les sites d’hivernage varie entre les populations d’H. axyridis. Nalepa et al (1996) ont montré que 12 à 41 % des femelles sont fécondées dans le site d’hivernage aux USA. En République tchèque, 20 à 60% des femelles prélevées lors de l’hivernage sont fécondées (Awad et al., 2013). Récemment, ces auteurs ont montré que dans la nature environ 20% des femelles sont fécondées deux mois après l’hivernage, et cette proportion diminue avec le temps passé en diapause jusqu’à 9 %. Cette dynamique observée in natura est en accord avec nos résultats obtenus en laboratoire

montrant que les femelles vierges sont plus résistantes au froid relativement aux femelles reproductrices. Ainsi, en fin d’hivernage, la majorité des individus dans les sites d’agrégation sont probablement des individus vierges de la dernière génération de l’année précédente, ces individus vierges ayant une capacité plus élevée de résister au froid hivernal et de se reproduire au printemps.

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Dans ce travail de thèse, je me suis intéressé aux variations des traits d’histoire de vie dans différentes populations de la coccinelle asiatique H. axyridis représentants trois compartiments évolutifs caractérisés par des histoires démographiques et des pressions sélectives potentiellement différentes : le compartiment populationnel correspondant à l’aire native de l’espèce, celui correspondant à l’aire récemment envahie par cette espèce et celui correspondant aux populations élevées en laboratoire dans un but de lutte biologique. Cette section de discussion générale se focalisera sur trois points majeurs de nos résultats. Le premier point concerne la mise en évidence d’un syndrome de domestication fort observé dans les populations de lutte biologique. Dans le deuxième point, j’aborderai la question des relations évolutives entre lutte biologique et invasion biologique. Enfin, dans le troisième point, je discuterai de l’intérêt d’ouvrir notre questionnement sur la résistance au froid à une perspective plus générale d’étude de la diapause chez H. axyridis.

I. Syndrome de la lutte biologique

1. Des changements majeurs observés

Les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse soulignent l’existence de changements évolutifs importants dans les populations de lutte biologique (populations « domestiques ») relativement aux populations sauvages (envahissantes et natives). Les changements évolutifs les plus spectaculaires concernent les traits d’histoire de vie suivants. Les femelles de la lutte biologique se reproduisent plus tôt, et possèdent une fécondité journalière plus élevée, ainsi, qu’une longévité et une durée de vie reproductive plus courte, ce qui conduit à une reproduction plus précoce dans les conditions d’élevages relativement aux populations naturelles (cf chapitre II). De plus, nous avons montré que les individus de lutte biologique ont un taux de cannibalisme plus faible par rapport les populations sauvages chez H. axyridis (cf chapitre I, article 3 Tayeh et al., 2013). Les individus de lutte biologique ont montré également une plus forte sensibilité au champignon entomopathogène B. bassiana (article 1 ; Tayeh et al., 2012) ainsi que aux basses températures (cf chapitre III).

Les changements observés, notamment ceux concernant des caractères avantageux pour des traits liés à la reproduction, sont similaires à ceux mis en évidence dans les populations en conditions d’élevage de nombreuses espèces de vertébrés et d’invertébrés. Ainsi, chez certains insectes, suite à plusieurs dizaines de générations au laboratoire, la valeur reproductive a triplé chez la mouche Drosophila melanogaster (Gilligan & Frankham, 2003). De plus, Lewis &

Thomas (2001) ont montré une augmentation remarquable de reproduction chez les femelles de la piéride du chou Pieris brassicae (L.) en captivité par rapport aux populations sauvages. De telles augmentations de traits liés à la reproduction correspondent à une réponse adaptative aux conditions de captivité. Il existe aussi un certain nombre d’exemples illustrant les changements dus aux autres types de sélection (voir figure 2 de l’introduction générale).Par l’exemple chez les populations d’élevage de poissons, des changement importants portant sur l’âge de la reproduction (Burger & Chevassus, 1987; Su et al., 1999), la taille des individus (Vandeputte & Launey, 2004), ainsi que l’âge de la maturité sexuelle (Burger & Chevassus, 1987; Su et al., 1999). Les conditions d’élevage s’accompagnent aussi fréquemment d’un relâchement des pressions de sélection contre des parasites ou prédateurs naturels (Gilligan & Frankham, 2003) mais voir Stangeland et al. 1996 pour une sélection accrue contre des pathogènes) .

2. Origine des changements phénotypiques observés

Chez les animaux, la domestication est définie comme «le processus par lequel une population animale devient adaptée à un environnement de captivité par des changements génétiques intervenant au cours des générations» (Price, 1984). Ces changements génétiques, qui se répercutent sur le phénotype des individus, sont causés par la sélection et la dérive génétique qui sont deux facteurs agissant souvent de manière forte dans les populations d’élevage. La vitesse et l’amplitude du processus de domestication dépend de l’intensité des pressions de sélection en conditions de captivité (Spurway, 1955), et du nombre de générations pendant lesquelles la population est maintenue en élevage (Gilligan & Frankham, 2003). En effet, même si la sélection induite par les conditions de captivité est plus importante que les autres types de sélection (voir figure2, dans l’introduction générale), celle-ci nécessite tout de même plusieurs générations avant de porter ses fruits. Les changements phénotypiques observés entre les populations de lutte biologique (domestiques) et les populations naturelles d’H. axyridis sont compatibles avec un tel processus de domestication.

Les pressions de sélection sur un caractère en condition d’élevage peuvent avoir des répercussions positives ou négatives pour l’espèce lorsque celle-ci se retrouve à nouveau en milieu naturel. Nous avons ainsi montré l’existence probable d’une sélection positive dans la population Européenne de lutte biologique d’H. axyridis aboutissant à une reproduction précoce. Nous avons par ailleurs montré l’existence d’une sélection négative en conditions d’élevage pour deux traits phénotypiques. D’une part, les populations de lutte biologique

présentent une baisse de la résistance au champignon entomopathogène par rapport aux populations naturelles. Berkvens et al (2010) ont également montré que la même population de laboratoire est plus sensible au parasitoïde Dinocampus coccinellae par rapport aux populations envahissantes de Belgique. D’autre part, nous avons observé que les individus de la population Européenne de lutte biologique d’H. axyridis présente une forte sensibilité aux basses températures relativement aux populations envahissantes américaines. Ce résultat est en accord avec ceux de Lombaert et al (2008), qui ont montré que les populations de lutte biologique présentaient un taux de survie à basse température plus faible que les populations sauvages envahissantes Européennes.

La population domestique (ici de lutte biologique) a probablement également subi des effets de dérive génétique importants pendant plusieurs années d’élevage. Ceci est corroboré par une baisse importante de la diversité génétique au sein des souches de lutte biologique d’H. axyridis telle que mesurée à l’aide de marqueurs microsatellites neutres (hétérozygotie de 0.3-0.4 au lieu de 0.6-0.7 pour les populations sauvages et nombre d’allèles divisé par trois; Lombaert et al., 2011). La dérive génétique est fréquemment en cause dans les populations d’élevage, à cause de leurs faibles effectifs génétiques. L’utilisation massive d’un reproducteur porteur d’un allèle rare conduit à la diffusion de cet allèle et à l’augmentation de sa fréquence, même quand cet allèle n’est pas responsable de la valeur sélective du reproducteur. Boichard et al (1996) montre ainsi que la faible taille efficace des populations d’espèces d’élevage, par exemple des bovins laitiers de races Holstein et Normande, est due à la forte sélection à laquelle sont soumises ces races, notamment sur la voie mâle. En effet, l’utilisation massive de l’insémination artificielle a permis une plus grande diffusion du patrimoine génétique de certains individus, réduisant par là même le nombre de reproducteurs mâles utilisés dans l’ensemble de la population. Il est également important de noter que cette diminution du nombre de reproducteurs mâles a entraîné une hausse de la consanguinité, qui influence aussi le déséquilibre de liaison. La population de lutte biologique d’H. axyridis a subi une forte dérive génétique au cours des générations passées en captivité. Or, une dérive génétique importante diminue l’efficacité de la sélection. Le fait que ces populations présentent une forte réponse aux pressions de sélection subies en captivité montre que ces pressions ont été très importantes.

3. Perspectives expérimentales

Harmonia axyridis, constitue un bon modèle biologique pour étudier et comprendre les changements évolutifs associés à un élevage en conditions contrôlées (au laboratoire ou dans les bio-fabriques) de part la présence de population(s) de lutte biologique crées il y a 70-80 générations et de nombreuses populations naturelles (natives et envahissantes). Malheureusement, en dépit de recherches poussées notamment auprès de laboratoires et bio- fabriques en Amérique du Nord, il semble subsister de nos jours une seule souche de lutte biologique d’H axyridis (souche Européenne originaire de l’INRA France-Biotop). L’absence d’autres souches de lutte biologique est un handicap évident (cf. pas de réplicats d’étude possibles). Dans le but d’augmenter les nombres de réplicats de populations en conditions d’élevage, il serait indispensable de produire de nouvelles souches de laboratoire à partir d’une ou plusieurs populations de l’aire native. Le temps de génération court de cette espèce (environ 1 mois) rend cette perspective réaliste. L’obtention de nombreux réplicats nous permettrait notamment de mieux distinguer l’effet de la dérive génétique et l’effet de la sélection sur les changements évolutifs observés.

Dans le but de généraliser nos résultats concernant le syndrome de domestication obtenus sur H. axyridis, il serait pertinent d’étendre les études comparative de traits d’histoire de vie entre populations d’élevage et sauvages chez d’autres espèces d’insectes utilisées en lutte biologique et pour lesquelles il existe un grand nombre de souches différentes maintenues au laboratoire. Ce type d’étude serait par exemple envisageable sur l’agent de lutte biologique, Psyttalia lounsburyi (Hymenoptera, Braconidae), actuellement introduit en France pour lutter contre un ravageur de l’olivier, Bactrocera oleae (Diptera, Tephritidae), ou encore l’agent de lutte biologique Trichogramma brassicae utilisé en France pour lutter contre la pyrale du maïs Ostrina nubilalis (Lepidoptera, Pyralidae).

II. Lutte biologique et invasion

Les concepts spécifiques des invasions biologiques peuvent être étendus à la lutte biologique par acclimatation (Fauvergue et al., 2007; Fowler et al., 2006; Grevstad, 1999; Memmott et al., 2005). En effet, les agents de lutte biologique introduits font l’objet, en général, d’études préalables visant notamment à vérifier leur capacité à s’adapter à leur nouvel environnement (Williamson, 2006).

1. Faible capacité d’établissement des populations de lutte biologique d’H axyridis dans le milieu naturel

Grâce à son caractère prédateur très vorace, H. axyridis à une longue histoire d’utilisation en tant qu’agent de lutte biologique. Cette espèce représentait en effet un bon candidat pour contrôler les populations de pucerons dans les agroécosystèmes. Il est intéressant de noter que, au début de son introduction en Amérique et en Europe il y a plusieurs décennies, H. axyridis s’est montrée incapable de s'acclimater dans la nature malgré les nombreux lâchers. Ce n’est que récemment qu’elle est devenue une espèce envahissante en colonisant presque la totalité de la planète en moins de 25 ans.

Nous avons montré au cours de cette étude que la souche de lutte biologique européenne était globalement plus performante pour certains traits reproductifs (i.e. notamment reproduction plus précoce) relativement aux populations envahissantes américaines. Malgré ces avantages phénotypiques, cette population ne semble pas avoir été capable de s’acclimater en Europe. Nous avons également montré que cette population de lutte biologique était particulièrement sensible aux conditions environnementales, en particulier les basses températures. Une grande sensibilité au froid hivernal pourrait représenter une « mal- adaptation » majeure aux conditions naturelles, expliquant en grande partie les difficultés d’acclimatation observées.

2. Contrer la mal-adaptation au milieu naturel dans les populations de lutte biologique

En fonction de l’objectif visé par l’introduction d’agent de lutte biologique, la mal- adaptation peut être considérée comme un facteur positif ou négatif. Si le but de cette introduction est de contrôler les ravageurs sans acclimatation de l’agent de lutte biologique, alors la mal-adaptation sera d’une certaine manière avantageuse pour ce type de lutte. Au contraire, si le but de l’introduction est un établissement dans la nature, alors la mal- adaptation des agents est un problème pour cette méthode de lutte biologique.

Les agents de luttes biologiques introduits sont généralement constitués d’un faible nombre d’individus issus d’une population d’origine. L’échantillonnage à partir d’une population source entraine une perte de diversité génétique avant même leur introduction en raison de l'échantillonnage initial et des conditions d'élevage en laboratoire (Reznick & Ghalambor, 2001; Schierenbeck & Ainouche, 2006). Si la perte de la diversité est trop

importante, les agents de lutte biologique seront incapables de se réadapter à leur environnement naturel notamment lorsque celui-ci est différent de leur environnement d’origine (Hopper et al., 1993; Hufbauer & Roderick, 2005; Roderick & Navajas, 2003).

On peut envisager plusieurs pistes pour améliorer les possibilités d’adaptation et ainsi favoriser l’établissement des populations de lutte biologique. En premier lieu, il est possible d’élever l’agent de lutte biologique dans des conditions semi-contrôlées moins différentes des conditions naturelles que les élevages en laboratoire. On peut ainsi par ce biais éviter de soustraire les populations à des sélections négatives clefs notamment celles liées au stress environnemental comme par exemple la résistance au froid et aux pathogènes. D’autre part, il est envisageable de maintenir la diversité génétique dans la population de lutte biologique tout en freinant les phénomènes de mal-adaptation en créant des flux de gènes réguliers depuis un grand nombre de populations sauvages.

3. Hybridation avec les populations envahissantes sauvages

De nombreux travaux suggèrent que l’hybridation intraspécifique entre populations différenciées génétiquement pourrait favoriser les invasions biologiques (Ellstrand & Schierenbeck, 2000; Facon et al., 2005; Kolbe et al., 2004). Un tel fait est documenté chez plusieurs espèces de plantes (Arnold, 1992; Campbell et al., 2006), ainsi que chez quelques espèces animales (Kolbe et al., 2007).

Dans le cas d’H. axyridis en Europe, l’introgression de gènes avantageux provenant de la population européenne de lutte biologique dans les populations envahissantes américaines a potentiellement pu se produire (Lombaert et al., 2010). Par exemple, la population hongroise européenne, dont les traits d’histoire de vie ont été étudiés au cours de cette thèse, est un hybride naturel entre la population envahissante d’Amérique de l’Est et celle de la lutte biologique. Dans cette population hongroise, la plus forte sensibilité au champignon détectée dans la population de lutte biologique ne se retrouve pas, ce qui suggère que ce trait a été contre-sélectionné in natura. Ce type de résultats suggère que les traits limitant l’établissement de la population de lutte biologique ont été rapidement contre-sélectionnés dans la nature chez la population hybride européenne. En effet, les changements génétiques défavorables par la sélection d’un génotype adapté au laboratoire peuvent induire une mal- adaptation dans la nature.

Il est possible que l’évènement d’hybridation entre les populations de lutte biologique européenne et les populations envahissantes américaines ait pu changer la dynamique d’invasion d’H. axyridis en Europe. Les traits d’histoire de vie des hybrides de première génération ont été étudiés en laboratoire (article 2, Turgeon et al., 2011). Les traits d’histoire de vie également mesurés dans la population européenne envahissante (i.e. l’hybride in natura) s’avèrent globalement proches de ceux obtenus avec les hybrides F1 de laboratoire, ce qui suggère que les bénéfices de l’hybridation puissent être maintenus sur un nombre important de générations. Il est intéressant de noter que l’admixture a un impact fort sur l’évolution des traits d’histoire de vie uniquement lorsque celle-ci implique une population de lutte biologique, cette dernière ayant subi en élevage des pressions de sélection fortes et différentes de celles in natura. En effet, lorsque cette admixture concerne des populations naturelles (natives ou envahissantes), les changements observés chez les hybrides sont alors de faible amplitude (article 1, Tayeh et al., 2012).

En dépit de ce dernier point, l’impact éventuel d’évènements d’admixture entre populations envahissantes sur le processus d’invasion reste cependant largement méconnu. Il serait potentiellement intéressant d’étudier via des approches de génétique quantitative similaires à celles réalisées dans cette thèse ce qui se produit au niveau de zones de contact « naturelles » entre les populations au sein des zones envahies chez H. axyridis. En effet, il existe deux zones de contacts dans l’aire envahie chez cette espèce : (i) une zone de contact entre les populations envahissantes situées à l’Est et l’Ouest de l’Amérique du Nord, et (ii) plusieurs zones de contact entre les quatre foyers envahissants identifiés par E. Lombaert (cf. figure 7). Notons que le cas des populations européennes est potentiellement particulier dans la mesure où trois d’entre elles comportent des gènes issus des populations de lutte biologique européenne.

III. Etudier la diapause plutôt que la résistance au froid chez H. axyridis

1. Résistance au froid : une étude symptomatique des difficultés à étudier un trait complexe

L’étude réalisée au cours de cette thèse sur la résistance au froid chez H. axyridis (cf chapitre III) a été motivée par des observations en laboratoire portant sur des sensibilités variables d’une population à l’autre aux conditions climatiques (notamment lors du stockage des populations en enceinte froide), avec des différences majeures observées chez les

populations de lutte biologique. Ces observations ont conduit à la réalisation de plusieurs expériences préliminaires pour identifier les paramètres les plus discriminants à utiliser pour tenter de comprendre le déterminisme génétique de la résistance au froid en laboratoire chez H. axyridis. Nous avons volontairement rédigé cette section de thèse d’une manière relativement linéaire, ceci afin d’illustrer la difficulté d’une démarche expérimentale lorsque celle-ci porte sur un trait complexe (au moins pour ce qui est de ses déterminants in natura) comme la résistance au froid. Malheureusement, à l’issu de ces travaux, les résultats obtenus ne permettent pas d’identifier le déterminisme génétique responsable de la résistance au froid chez H. axyridis. Les seules conclusions nettes concernent l’effet du statut d’accouplement chez cette espèce sur cette résistance.

2. Etudier la résistance au froid ou plus généralement la diapause ?

Les difficultés rencontrées pour tenter de comprendre le déterminisme de la résistance au froid ainsi que les résultats obtenus sur ce sujet nous ont progressivement amené à nous intéresser à un mécanisme physiologique plus général, qui entre en jeu dans la capacité de l’espèce à résister à des hivers rigoureux, à savoir la diapause hivernale. Les résultats du chapitre III suggèrent en effet que, plutôt que de parler de sensibilité au froid accrue de la population de lutte biologique européenne, il serait plus judicieux de considérer l’hypothèse que cette population a perdu en grande partie sa capacité à entrer en diapause hivernale.

Nous tentons de conserver au CBGP sur plusieurs années des populations d’H. axyridis provenant de divers endroits du globe sous la forme d’une banque de populations vivantes. Cette banque n’est réalisable à grande échelle que s’il est possible de conserver les individus en condition de vie ralentie en suspendant leur comportement reproducteur pendant plusieurs mois via un séjour au froid. Ainsi, la banque d’H. axyridis consiste en plusieurs boîtes d’une soixantaine d’individus de chaque sexe placés pendant plusieurs mois dans une chambre climatique dans les conditions suivantes : température de 13°C; éclairage de 12HJ :12HN. Les coccinelles placées dans ces conditions se regroupent en agrégats, un comportement caractéristique de la diapause chez cette espèce. Au cours des manipulations nécessaires au maintien de la banque populationnelle, nous avons remarqué que les populations provenant de l’aire envahie sont capables de se reproduire rapidement une fois replacées en conditions optimales (i.e.24°C 16HJ:8HN), ce qui correspond à une sortie de diapause, contrairement à la plupart des populations de l’aire native qui s’avèrent beaucoup plus lente sur ce point. Les

individus de la souche de lutte biologique sont quant à eux incapables de survivre aux conditions de la banque pendant des temps prolongés.

Il reste toutefois à caractériser les différences observées entre les compartiments populationnels (natifs, envahissants et lutte biologique) au travers d’expériences rigoureuses et à mieux cerner les facteurs clefs de la diapause chez H. axyridis, notamment température et photopériode (Raak-Van Berg et al., 2013; Tauber & Tauber, 1986).

3. Etude de la diapause chez H. axyridis

H. axyridis est une espèce présentant une diapause hivernale chez l’adulte (Ongagna et al., 1993). La diapause est induite par des conditions défavorables de l’environnement, comme, un stress induit par l’absence de nourriture ou une photopériode courte, (Berkvens et al., 2008; Hodek. & Honek, 1996; Ongagna & Iperti, 1994; Sakurai et al., 1988). Au cours de la diapause, certains aspects de la physiologie, de la morphologie et du comportement sont modifiés temporairement (Denlinger, 2002; Tauber & Tauber, 1986). Il existe un certain nombre d’études qui décrivent la diapause chez cette espèce (Raak-Van Berg et al., 2013; Reznik & Vaghina, 2011). La plupart de ces études se focalisent sur les populations in natura; (Awad et al., 2013; Berkvens et al., 2008; Raak-Van Berg et al., 2013). Les rares études expérimentales en laboratoire sur ce sujet utilisent un agrégat préalablement formé en conditions naturelles qui est ensuite étudié en conditions de laboratoire. Ces études ne permettent donc pas de comprendre les conditions d’entrée en diapause.

Les conditions d’entrée et de sortie de diapause sont globalement mal-connues en laboratoire. Pour les étudier, plusieurs expériences préliminaires seraient nécessaires. Ces expériences nécessiteraient de manipuler les conditions de température, de photopériode, de durée de diapause.

Nous proposons de réaliser une expérience pour étudier la diapause chez H. axyridis (en laboratoire). Si le protocole expérimental de cette expérience demande encore à être affiné, les grands principes peuvent être décrits comme suit.

L’objectif général de cette étude consisterait à réaliser une expérience de sélection expérimentale orientée sur la perte de la diapause à partir d’une population naturelle. Le but de cette expérience serait de sélectionner deux groupes d’individus : l’un constitué d’individus diapausants et l’autre d’individus non-diapausants (i.e. ayant perdu la capacité à entrer en diapause). Dans cette expérience on produira, à partir d’individus d’une population

Figure 1 : Représentation schématique d’une expérience de sélection expérimentale permettant d’étudier la diapause chez H. axyridis en laboratoire.

X : les conditions d’induction et de sortie de diapause sont encore mal-connues et nécessiteront des expériences préliminaires.

1- Mesures de la capacité à diapauser et de traits d’histoire de vie. 2- Conserver les individus dans l’alcool permettrait une étude génomique afin d’étudier la base génétique de la diapause.

native (G0), une nouvelle génération (G1) dont les descendants se divisent en deux groupes (groupe non-diapausant et groupe diapausant). Pour chaque groupe on réalisera 10 réplicats (R1 à R10). La durée de cette expérience serait d’une dizaine de générations pour chacun des groupes (voir la Figure 1). Pour le premier groupe (diapausant), nous tenterons d’induire à chaque génération une diapause par des températures basse et une photopériode réduite (13°C, 12H J : 12H N) pendant trois semaines. Il semblerait préférable que les changements de température soient progressifs afin d’éviter un choc thermique. Le second groupe (non- diapausant) ne passerait pas par une phase de diapause entre chaque génération et serait donc soumis à des conditions constantes et optimales d’élevage (24°C, 16H J : 8H N). Au bout d’une dizaine de générations, nous réaliserons des mesures sur la capacité à diapauser pour les deux groupes ainsi que des mesures portant sur un ensemble de traits d’histoire de vie afin de mettre en évidence des compromis évolutifs éventuels. A noter que cette expérience pourra être complétée par une analyse de génomique (marqueurs NGS) sur les populations des deux groupes afin de caractériser l’architecture génétique du ou des gène(s) responsable(s) de la diapause chez H. axyridis.

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ANNEXE

Article

Article 1: Inbreeding depression is purged in the invasive insect Harmonia axyridis. (2011). Benoît Facon, Ruth A. Hufbauer, Ashraf Tayeh, Anne Loiseau, Eric Lombaert, Renaud Vitalis, Thomas Guillemaud, Jonathan G. Lundgren, and Arnaud Estoup. Current Biology. 21 (5): 424-427.

Article 2: Investigating the genetic load of an emblematic invasive species: the case of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis. (2013). A. Tayeh, A. Estoup, R. A. Hufbauer, V. Ravigne, I. Goryacheva, I. A. Zakharov, E. Lombaert & B. Facon. Ecology and Evolution. 3 (4): 864-871.

Article 3: Increase in male reproductive success and female reproductive investment in invasive populations of harlequin ladybird Harmonia axyridis. (2013). Guillaume Laugier, Gilles Le Moguédec, Ashraf Tayeh, Anne Loiseau, Naoya Osawa, Arnaud Estoup and Benoit Facon. PlosOne, sous presse.

Article 1

Inbreeding Depression Is Purged in the Invasive Insect Harmonia axyridis

Benoıˆt Facon,1,* Ruth A. Hufbauer,2 Ashraf Tayeh,1 [5, 6]. We lack the ability to say whether positive effects of Anne Loiseau,1 Eric Lombaert,3 Renaud Vitalis,4 bottlenecks are theoretical curiosities or whether they truly Thomas Guillemaud,3 Jonathan G. Lundgren,5 influence the dynamics of natural populations [7]. One mecha- and Arnaud Estoup1 nism by which bottlenecks can have positive effects is through 1Institut National pour la Recherche Agronomique, the purging of deleterious mutations that lead to inbreeding UMR - Centre de Biologie pour la Gestion des Populations, depression [8]. Theory states that for purging to occur, the Campus International de Baillarguet, CS 30 016, 34988 reduction in population size should be of intermediate intensity Montferrier/Lez cedex, France (i.e., ranging from 40–300 individuals, depending upon intensity 2Department of Bioagricultural Sciences and Pest of selection) and the mutations leading to inbreeding depres- Management, Graduate Degree Program in Ecology, Colorado sion should be strongly deleterious and highly recessive [3, 7]. State University, Fort Collins, CO 80523, USA Such purging of deleterious mutations has been demonstrated 3Institut National pour la Recherche Agronomique, empirically in artificially bottlenecked populations [4, 9, 10], but UMR - Laboratoire Interactions Biotiques et Sante´ Ve´ ge´ tale given the conditions imposed, high rates of extinction have Universite´ de Nice Sophia-Antipolis, Centre National de la been observed. This makes it difficult to directly extrapolate Recherche Scientifique, 06903 Sophia-Antipolis, France to natural populations [7]. To date, studies documenting a purge 4Institut National pour la Recherche Agronomique, Centre of deleterious mutations during bottlenecks are scarce and rely National de la Recherche Scientifique, UMR Centre de Biologie on indirect evidence [5]. pour la Gestion des Populations, Campus International de The ability of invasive species to dominate novel ecosys- Baillarguet, CS 30 016, 34988 Montferrier/Lez cedex, France tems has been considered puzzling given that they typically 5United States Department of Agriculture, Agricultural pass through bottleneck in population size during introduc- Research Service, North Central Agricultural Research tions ([2], although see [11]. Such bottlenecks have been Laboratory, Brookings, SD 57006, USA seen as detrimental to invasion success; the implicit assumption is that they reduce genetic variation, and thereby inhibit the ability of introduced species to adapt to their new environ- Summary ments, and that they increase inbreeding and associated inbreeding depression [2]. However, it may be that rather Bottlenecks in population size reduce genetic diversity and than increasing inbreeding depression, bottlenecks that occur increase inbreeding, which can lead to inbreeding depres- during invasions tend to be of the intensity that could enhance sion [1]. It is thus puzzling how introduced species, which invasion ability via the purging of the deleterious alleles under- typically pass through bottlenecks, become such success- lying inbreeding depression. ful invaders [2]. However, under certain theoretical condi- Here, we use a world-wide invader, the harlequin ladybird tions, bottlenecks of intermediate size can actually purge Harmonia axyridis (HA), as a model system to examine whether the alleles that cause inbreeding depression [3]. Although bottlenecks might have led to reduced inbreeding depression this process has been confirmed in model laboratory in invasive populations relative to native ones. Native to Asia, systems [4], it has yet to be observed in natural invasive HA was repeatedly introduced as a biological control agent populations. We evaluate whether such purging could facil- into North America and Europe, but for decades it failed to itate biological invasions by using the world-wide invasion establish itself. However, by 1988, it had not only established of the ladybird (or ladybug) Harmonia axyridis. We first itself in North America but had also rapidly become an invasive show that invasive populations endured a bottleneck of pest on a world-wide scale. A recent study showed that inva- intermediate intensity. We then demonstrate that replicate sions of HA followed a bridgehead scenario [12], in which the introduced populations experience almost none of the initial invasive population in eastern North America acted as inbreeding depression suffered by native populations. the source of the invasions into the European, South American, Thus, rather than posing a barrier to invasion as often and African continents (Figure 1). This result suggests that an assumed, bottlenecks, by purging deleterious alleles, can evolutionary shift that triggered invasion probably occurred in enable the evolution of invaders that maintain high fitness the bridgehead population in eastern North America. With this even when inbred. background knowledge, we first use data from neutral genetic markers to test the hypothesis that the introduction of HA in Results and Discussion eastern North America was associated with a population bottleneck, and we evaluate whether the size of this bottleneck Reductions in population size, or bottlenecks, decrease genetic was of the appropriate level for purging to occur. Then, we variation and lead to inbreeding, which can cause inbreeding experimentally test the hypothesis that invasive populations depression within introduced populations [1]. However, there have evolved reduced inbreeding depression with respect to is growing recognition that the consequences of bottlenecks life-history traits important for invasion success. are varied and that, under some circumstances, they can actu- We investigated evidence for a bottleneck of an appropriate ally lead to increased individual and population performance intensity for purging to occur by using data from 18 microsatellite loci that we analyzed with approximate Bayesian computation [13, 14]. Specifically, we evaluated whether a bottleneck *Correspondence: [email protected] occurred during the introduction of HA from the native area Increased Fitness Due to Purging in an Invasive Ladybird 425

Figure 1. Worldwide Routes of Invasion of Harmonia axyridis For each outbreak, the arrow indicates the most likely invasion pathway [12]. Yellow and blue indicate native and invasive areas, respectively. Years of ﬁrst observation of invasive populations are indicated. Abbreviations 1991 ARF ABA correspond to the samples used in the experimental NOV 1988 2001 study (see Experimental Procedures for further explana- DAK tions). KYO

We found that the generation time of inva- 2001 sive populations is on average 6.3 days shorter SAF than that of native populations (p = 0.0005). 2004 Invasion status and level of consanguinity interact (p = 0.047; Figure 3 and Table S1) such that the difference is most apparent in inbred individuals. Native populations suffer strong inbreeding depression with respect to generation time (coefficient of inbreeding into the bridgehead population from eastern North America depression, d = 0.21, p = 0.03), whereas invasive populations [12], and we estimated its intensity (see Supplemental Experi- suffer none (d = 20.05, p = 0.57) and are thus able to maintain mental Procedures). Two sets of population samples were the outbred phenotype. A significant population effect nested considered as representative of the native and introduced within the origin effect (Table S1) reveals that one native areas. In one, we used the same populations as those used population (Abakan, Russia) exhibits a longer generation for the present quantitative genetics studies, and in the other, time in outbred treatment than the other native populations, we used the same populations as those analyzed in [12]to implying no significant inbreeding depression for this trait in make inferences about introduction routes in H. axyridis (see this population. As for generation time, invasive populations Supplemental Information). We found that a scenario including have higher average lifetime performance than native ones a bottleneck during the introduction was supported by very (p = 0.02), and there is a strong interaction between invasion high probabilities in comparison to a scenario without a bottle- status and level of consanguinity (p = 0.001; Figure 3 and neck (see Supplemental Experimental Procedures). The high- Table S1). In general, native populations suffer intense est joint posterior densities of the size and duration of the inbreeding depression (d = 0.59, p < 0.001), whereas invasive bottleneck corresponded to values around 150 individuals populations do not (d = 0.12, p = 0.16). and 20 generations compared to an estimated stable effective For both traits, invasive individuals exhibit a decline in population size of several thousand individuals in the native inbreeding depression and are thus able to maintain the high area (Figure 2). Similar results were obtained when we consid- performance of the outbred phenotype. Inbred invasive indi- ered other sets of priors and data sets (Figure S1). These viduals developed more quickly and attained a higher lifetime results are well within the theoretical range that can lead to performance than native ones (p = 0.0005 and 0.0057, respec- the purging of deleterious alleles [3]. However, it has to be tively), indicating that inbreeding depression decreased within noted that theoretical work is still needed to assess the range invasive populations, which is consistent with the predicted of magnitudes and durations of bottlenecks that make purging purging of recessive deleterious mutations. Moreover, inbred likely after introduction from a large equilibrium population. lines from invasive populations developed just as quickly Indeed, up to now, theoretical studies investigating the and attained just as high lifetime performance as outbred lines purging of recessive mutations have mainly focused on muta- from both invasive and native populations (Figure 3). Purging tion-selection-drift equilibrium populations. leads to an overall increase in performance of the invasive To test the premise that purging might have occurred during populations for these two traits closely linked to fitness, and the invasion of HA, we brought six natural field populations it might thus have boosted the invasiveness of HA. Indeed, into the laboratory and compared their fitness (Figure 1 and by shortening average generation time and increasing average Supplemental Experimental Procedures) under two contrast- lifetime performance, the drop in inbreeding depression might ing levels of consanguinity (inbred versus outbred). By using increase the population growth rate of invasive populations. three replicate populations from both the native and the inva- Our two main results, evidence of a type of bottleneck consis- sive ranges, we could evaluate differences between the ranges tent with the purging of alleles that lead to inbreeding depres- robustly, providing a potent test of how the response to sions (i.e., a bottleneck of intermediate intensity) and evidence inbreeding is affected by population status (native versus inva- of such purging in two fitness-related traits, together match sive; see Supplemental Experimental Procedures). We the theoretical expectations well. Moreover, theory [3, 5] illus- measured two traits clearly linked to fitness: generation time trates that the greatest purging occurs when inbreeding and lifetime performance. Generation time is an important trait depression is mainly due to mutations that are both strongly to examine with respect to invasions because a shorter gener- deleterious and highly recessive, suggesting that inbreeding ation time leads to faster population growth [15]. Our measure depression in native populations of HA probably stems from of lifetime performance accounts for both survival through the highly recessive and strongly deleterious mutations. life stages and subsequent reproduction. It thus represents Several theoretical [3, 16] and empirical [8, 17, 18] studies individual fitness well, and it is independent of generation establish that consanguineous mating increases the efficiency time (Supplemental Experimental Procedures). of purging. Geographical spread during the invasion process Current Biology Vol 21 No 5 426

15 40 40% 35 30% 20 % 0 9 30 20% 25 25

30 20 15 35 10 10% Lifetime Performance Generation(days) time 40 5 Inbred Outbred Inbred Outbred

Figure 3. Generation Time and Lifetime Performance of Native versus Inva- % 90 sive Populations and Consanguinity of Inbred versus Outbred Populations Circles represent native populations, and squares represent invasive ones.

Bottleneck duration Bottleneck Note that the y axis shows low values of generation time, which correspond

50% to high ﬁtness, at the top, and high values of generation time (low ﬁtness) at 60% the bottom. Mean values are 61.96 standard error. See also Table S1.

70%

80% without being slowed by inbreeding depression if recessive

051015202530 deleterious alleles have been purged. Second, our findings 050100150200250300might explain the ‘‘lag time’’ of invasions: the period of time that is often observed between initial introductions and subse- Number of individuals during bottleneck quent invasions [20]. This lag time could be due to negative population growth and initially high rates of local extinction Figure 2. Intensity of the Bottleneck Event Following the Introduction of associated with the purging of the deleterious alleles. Once Harmonia axyridis in Eastern North America from Its Native Area the recessive deleterious alleles are purged, explosive popula- The joint densities of posterior distributions for the correlated pair of demo- tion growth would follow. In HA, it could be that a high rate of graphic parameters number of individuals during bottleneck and bottleneck extinction of inbred populations contributed to the repeated duration (in number of generations) were obtained via ABC analysis of microsatellite data under the introduction scenario 1 (Figure S1); prior set 1 failures of efforts to establish populations for biological was assumed (Table S1), and population samples were from Kyoto (Japan) control. Third, our results might explain the finding that and Brookings (South Dakota, USA), taken as representative of the native invasive populations often have higher performance than and introduced areas, respectively (i.e., the samples were from the same native ones even when reared in a common environment. populations as those used for the experiment). See Experimental Proce- This has been attributed mainly to adaptation to the new range dures for justification of population sampling and Figure S2 for complemen- [21–23]. However, a purging of inbreeding depression could tary results obtained with different priors and sampling combinations. The black lines represent the 10%–90% highest density contours of the plot of explain, at least partly, the increase in performance without joint densities. Median value of the stable effective population size before invoking local adaptation. This mechanism could be particu- and after the bottleneck period was estimated at 2940 individuals (95% larly appropriate when there is no obvious adaptive challenge confidence interval: 1220 – 8930). See also Figure S1. associated with the new introduced environment, as sus- pected for HA. Finally, a shift toward selfing has been observed in some invasive plants [24, 25]. Inbreeding depres- can promote consanguineous mating in the invasion front. sion is considered to be one of the main forces opposing the Density in the front can be very low [19], setting up a situation evolution of self-fertilization [26]. A reduction in genetic load in which individuals from the same clutch have only each other during invasions could thus promote a shift from outcrossing to mate with. In this scenario, purging could be further facili- toward selfing in invasive plant populations. tated in invasive populations and could occur for a broader Our results link, for the first time in natural populations, range of population sizes and in populations with less strongly bottlenecks of intermediate size during invasion with purging recessive deleterious mutations. of deleterious mutations. This purging results in the evolution The invasive populations used in our study are connected by of populations that experience no inbreeding depression in their recent history [12]: the eastern North American invasive important fitness traits and leads to higher mean fitness rela- population is the main source of the South African and Euro- tive to native populations. Thus, not only might bottlenecks pean invasive populations. It is hence probable that the reduc- not pose the problems previously assumed for invasive tion in inbreeding depression evolved only once, in eastern species [27], but they might actually facilitate invasion. This North America, and was subsequently transmitted to the other kind of purging should be particularly important during the first invasive populations. This mechanism could be responsible stages of the invasion (when there is a small effective popula- for the North American’s status as an invasive bridgehead. tion size) and during the spatial expansion (at the front of inva- Because we obviously could not sample all locations within sion), i.e., when mating between relatives is likely to occur the native range of HA, we cannot completely reject the most frequently. After this stage, when invasive populations hypothesis that purging of deleterious alleles occurred within reach a large, stable effective population size, it might be the native range in an unknown way. The hypothesis that that new deleterious mutations start to accumulate, and thus purging occurred in the introduced range during the bottle- inbreeding depression might return to invasive populations. neck period is nevertheless far more parsimonious. Our results shed new light on four patterns commonly observed in biological invasions. First, they help explain how Experimental Procedures non-native species spread so rapidly when they become inva- Biological Material sive. Even small populations on the invasion front, in which Three native populations (Kyoto in Japan [KYO], Novosibirsk [NOV], and consanguineous matings are probable, can grow quickly Abakan [ABA] in Russia) and three invasive populations (Croix [FRA] in Increased Fitness Due to Purging in an Invasive Ladybird 427

France, Brookings [DAK] in South Dakota-USA, and Bethlehem [SAF] in 6. Goodnight, C.J. (1988). Epistatic genetic variance and the effect of South Africa) were sampled in the wild between 2007 and 2008. The loca- founder events on the additive genetic variance. Evolution 42, 441–454. tions were chosen because they cover major parts of the current native 7. Boakes, E.H., Wang, J., and Amos, W. (2007). An investigation of and introduced distribution of H. axyridis (Figure 1), and the native range inbreeding depression and purging in captive pedigreed populations. populations are within the region likely to have been the source of the inva- Heredity 98, 172–182. sion [12]. In each population, 80–100 adults were collected. See Supple- 8. Pujol, B., Zhou, S.R., Sanchez Vilas, J., and Pannell, J.R. (2009). mental Information for further details on sampled populations. Reduced inbreeding depression after species range expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 15379–15383. Inferences about the Bottleneck Event 9. Crnokrak, P., and Barrett, S.C.H. (2002). Perspective: Purging the Two ﬁeld-collected samples, Kyoto and Brookings, representing the native genetic load: A review of the experimental evidence. Evolution 56, and bridgehead invasive populations, respectively, were genotyped at 2347–2358. 18 microsatellite markers. Using approximate Bayesian computation 10. Avila, V., Amador, C., and Garcı´a-Dorado, A. (2010). The purge of (ABC), we analyzed two competing introduction scenarios that differed by genetic load through restricted panmixia in a Drosophila experiment. the presence or absence of a bottleneck event after introduction. We J. Evol. Biol. 23, 1937–1946. assessed the robustness of our ABC inferences by considering two different 11. Kolbe, J.J., Glor, R.E., Rodrı´guez Schettino, L., Lara, A.C., Larson, A., sets of prior distributions and by processing our analyses on a second and Losos, J.B. (2004). Genetic variation increases during biological microsatellite data set that included other representative population invasion by a Cuban lizard. Nature 431, 177–181. samples (see Supplemental Experimental Procedures). 12. Lombaert, E., Guillemaud, T., Cornuet, J.M., Malausa, T., Facon, B., and Estoup, A. (2010). Bridgehead effect in the worldwide invasion of the Quantitative Genetic Experiment biocontrol harlequin ladybird. PLoS ONE 5, e9743.

For each of the six populations sampled, 100 ﬁeld-collected (G0) individuals 13. Beaumont, M.A., Zhang, W.Y., and Balding, D.J. (2002). Approximate initiated populations in the laboratory. We maintained these populations for Bayesian computation in population genetics. Genetics 162, 2025– two generations under strictly controlled conditions to minimize potential 2035. biases due to maternal effects (see Supplemental Information). We then 14. Cornuet, J.M., Santos, F., Beaumont, M.A., Robert, C.P., Marin, J.M., created two types of crosses: inbred (between pairs of siblings) and outbred Balding, D.J., Guillemaud, T., and Estoup, A. (2008). Inferring population (between unrelated individuals of the same population). For the two types of history with DIY ABC: A user-friendly approach to approximate

G3 individuals produced, we measured hatching rate, larval survival, Bayesian computation. Bioinformatics 24, 2713–2719. development time, time to sexual maturity, and fecundity. Finally, we 15. Cole, L.C. (1954). The population consequences of life history analyzed two combined traits linked to fitness: generation time and lifetime phenomena. Q. Rev. Biol. 29, 103–137. performance (see Supplemental Experimental Procedure). To calculate 16. Wang, J. (2000). Effects of population structures and selection strate- generation time, we added egg-to-adult development time and time to gies on the purging of inbreeding depression due to deleterious muta- reach sexual maturity into a single cumulative measure. We obtained tions. Genet. Res. 76, 75–86. a measure of lifetime performance by multiplying hatching rate by larval 17. Barrett, S.C.H., and Charlesworth, D. (1991). Effects of a change in the survival by subsequent fecundity for each family and cross. We analyzed level of inbreeding on the genetic load. Nature 352, 522–524. these data by using mixed-model ANOVAs. Origin (invasive versus native), 18. Fox, C.W., Scheibly, K.L., and Reed, D.H. (2008). Experimental evolution treatment (inbred versus outbred), population nested in origin, and their of the genetic load and its implications for the genetic basis of interactions were entered as fixed effects. Family nested within population inbreeding depression. Evolution 62, 2236–2249. was treated as a random effect. 19. Tobin, P.C., Whitmire, S.L., Johnson, D.M., Bjørnstad, O.N., and Liebhold, A.M. (2007). Invasion speed is affected by geographical vari- Supplemental Information ation in the strength of Allee effects. Ecol. Lett. 10, 36–43. 20. Crooks, J.A. (2005). Lag time and exotic species: The ecology and Supplemental Information includes Supplemental Experimental Proce- management of biological invasions in slow motion. Ecoscience 12, dures, one figure, and one table and can be found with this article online 316–329. at doi:10.1016/j.cub.2011.01.068. 21. Lee, C.E. (2002). Evolutionary genetics of invasive species. Trends Ecol. Evol. 17, 386–391. 22. Facon, B., Genton, B.J., Shykoff, J., Jarne, P., Estoup, A., and David, P. Acknowledgments (2006). A general eco-evolutionary framework for understanding bioinvasions. Trends Ecol. Evol. (Amst.) 21, 130–135. We thank L. Wolfe and D. Bourguet for comments and discussion on an 23. Blair, A.C., and Wolfe, L.M. (2004). The evolution of an invasive plant: An earlier draft. We thank I. Goryacheva, I. Zakharov, N. Osawa, R. Stals, and experimental study with Silene latifolia. Ecology 85, 3035–3042. G. Prinsloo, who provided us with some of the HA samples used in this 24. Barrett, S.C.H., Colautti, R.I., and Eckert, C.G. (2008). Plant reproductive study. This work was supported by grants from the Agence Nationale de systems and evolution during biological invasion. Mol. Ecol. 17, la Recherche (ANR-06-BDIV-008-01) and from the Agropolis Fondation 373–383. (RTRA, Montpellier, BIOFIS project). R.A.H. received support from 25. Sloop, C.M., Ayres, D.R., and Strong, D.R. (2009). The rapid evolution of Fulbright-France, INRA, NSF DEB-0541673 and the Colorado Agricultural self-fertility in Spartina hybrids (Spartina alterniflora x foliosa) invading Experiment Station during this work. San Francisco Bay, CA. Biological Invasions 11, 1131–1144. 26. Charlesworth, D., and Willis, J.H. (2009). The genetics of inbreeding Received: November 22, 2010 depression. Nat. Rev. Genet. 10, 783–796. Revised: January 25, 2011 27. Dlugosch, K.M., and Parker, I.M. (2008). Invading populations of an Accepted: January 26, 2011 ornamental shrub show rapid life history evolution despite genetic Published online: February 17, 2011 bottlenecks. Ecol. Lett. 11, 701–709.

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Article 2

Investigating the genetic load of an emblematic invasive species: the case of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis

Investigating the genetic load of an emblematic invasive species: the case of the invasive harlequin ladybird Harmonia axyridis A. Tayeh1, A. Estoup1, R. A. Hufbauer2, V. Ravigne3, I. Goryacheva4, I. A. Zakharov4, E. Lombaert5 & B. Facon1 1Cbgp, (Inra/Ird/Cirad/Montpellier SupAgro), Inra, Montpellier, France 2Department Bioagricultural Science and Pest Management, Graduate Degree Prom in Ecology, Colorado State Univ, Ft Collins, CO, 80523 3CIRAD, UMR BGPI, F-34398 Montpellier, France 4Vavilov Institute of General Genetics, Moscow MV Lomonosov State University, Moscow, Russia 5INRA, UMR 1301 IBSV (Inra Universite de Nice Sophia Antipolis/CNRS), 400 route des Chappes, BP 167-06903, Sophia Antipolis Cedex, France

Keywords Abstract admixture, bottleneck, genetic load, heterosis, inbreeding depression, outbreeding Introduction events can lead to admixture between genetically differentiated depression populations and bottlenecks in population size. These processes can alter the adaptive potential of invasive species by shaping genetic variation, but more Correspondence importantly, they can also directly affect mean population fitness either increas- B. Facon, Cbgp (Inra/Ird/Cirad/Montpellier ing it or decreasing it. Which outcome is observed depends on the structure SupAgro), Inra, Montpellier, France. Tel: +33 of the genetic load of the species. The ladybird Harmonia axyridis is a good (0)4 99 62 33 22; Fax: +33 (0)4 99 62 33 example of invasive species where introduced populations have gone through 45; E-mail: [email protected] admixture and bottleneck events. We used laboratory experiments to manipulate Funding Information the relatedness among H. axyridis parental individuals to assess the possibility This work was supported by a grant from the for heterosis or outbreeding depression in F1 generation offspring for two traits Agropolis Fondation (RTRA, Montpellier, related to fitness (lifetime performance and generation time). We found that BIOFIS project). R.A.H. received support from inter-populations crosses had no major impact on the lifetime performance of Fulbright-France, INRA, NSF DEB-0541673 the offspring produced by individuals from either native or invasive popula- and the Colorado Agricultural Experiment tions. Significant outbreeding depression was observed only for crosses between Station during this work. native populations for generation time. The absence of observed heterosis is Received: 14 December 2012; Revised: 19 indicative of a low occurrence of fixed deleterious mutations within both the December 2012; Accepted: 24 December native and invasive populations of H. axyridis. The observed deterioration of 2012 fitness in native inter-population crosses most likely results from genetic incompatibilities between native genomic backgrounds. We discuss the implica- doi: 10.1002/ece3.490 tions of these results for the structure of genetic load in H. axyridis in the light of the available information regarding the introduction history of this species.

Introduction an almost obligate component of the invasion process, giving rise to the expectation that invasive populations Biological invasions constitute a global contemporary will be genetically depauperate (Tsutsui et al. 2000; rearrangement of species among ecosystems worldwide Golani et al. 2007). From the seminal demonstration by (Sax et al. 2005). The characteristics of introduction Kolbe et al. (2004) that not all invasive populations have events (number of individuals, genetic composition, and low genetic variability, the role of multiple introductions timing) are key aspects of the invasion process (Dlugosch and genetic admixture (i.e., the mixture of individuals and Parker 2008a; Keller and Taylor 2008). For over a from genetically differentiated populations) in counterbal- decade, admixture events (Facon et al. 2008; Keller and ancing bottlenecks and promoting high genetic diversity Taylor 2010) and bottlenecks (Tsutsui et al. 2000; Dlu- has been emphasized in several case studies using neutral gosch and Parker 2008b) have been recognized as crucial molecular markers (e.g., Bossdorf et al. 2005; Roman and processes shaping the levels of genetic variation in intro- Darling 2007; Marrs et al. 2008). An assumption implicit in duced populations. Bottlenecks were long considered as much of what has been written about the role of multiple

ª 2013 The Authors. Published by Blackwell Publishing Ltd. This is an open access article under the terms of the Creative 1 Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis A. Tayeh et al. introductions is that they increase not only variation at heterosis results when deleterious, recessive mutations molecular loci but also variation in ecologically impor- fixed within parental populations, that are brought back tant, quantitative traits, thus resulting in higher evolu- into heterozygotic states by inter-population crosses tionary potential of invasive populations and allowing (Escobar et al. 2008). On the contrary, inbreeding depres- rapid responses to selection. However, with the exception sion is defined as a lower observed fitness of inbred rela- of a few key systems (Kolbe et al. 2007; Lavergne and tive to outbred offspring within the same population Molofsky 2007; Facon et al. 2008), the effects of multiple (Charlesworth and Charlesworth 1999). It is usually introductions on variation in ecologically important traits attributed to the expression of recessive deleterious muta- of introduced species remains largely unknown. tions when they become homozygous in inbred individu- In addition to shaping genetic variation, bottlenecks als (Charlesworth and Willis 2009). and admixture events may also directly affect mean fitness Admixture can also directly decrease mean fitness of of individuals in a population, either increasing it or individuals in a population via outbreeding depression decreasing it. These effects, because they are on fitness (Lynch 1991; Edmands 1999). Outbreeding depression rather than simply on genetic variation, could have a arises as a result of the disruption of local adaptation more immediate influence on the success of introduced mediated by gene 9 environment interactions, under- populations. Notably, the effects of both admixture and dominance, or epistatic interactions such as the breakup bottlenecks on mean fitness of individuals in a population of favorable additive 9 additive epistatic effects (Lynch can be mediated via how introduction events influence 1991; Edmands 1999). the genetic load of populations. Genetic load is the reduc- Despite the direct effects, bottlenecks and admixture tion in the mean fitness of individuals in a population can have on the mean fitness of individuals in introduced relative to a population composed entirely of individuals populations; these processes have been seldom studied in having optimal genotypes (Whitlock and Bourguet 2000). the context of biological invasions. The ladybird Harmo- Bottlenecks associated with the introduction process may nia axyridis is a good example of invasive species where erode genetic variation at loci segregating for alleles introduced populations have gone through both bottle- (including deleterious mutations) in two possible man- neck and admixture events. The species is native to Asia. ners (Pujol et al. 2009; Facon et al. 2011). First, deleteri- It was originally introduced into North America and Eur- ous mutations could be lost (termed “purging of genetic ope as a biological control agent against aphids (Koch load”), during bottlenecks, leading to an increase in mean 2003). It is now invasive in four different continents. population fitness in introduced areas relative to native Lombaert et al. (2010) have shown, using Approximate areas (Facon et al. 2011). Second, deleterious mutations Bayesian Computation on microsatellite data, that this could be fixed during introductions, leading to a decrease worldwide invasion followed what has been called a in mean fitness of individuals in the introduced popula- bridgehead scenario, with the oldest invasive population tions (Pujol et al. 2009). Theoretical studies have shown in eastern North America acting as the source, or bridge- that purging is more probable if inbreeding depression is head, for the colonists that invaded Europe, South Amer- mainly due to mutations that are both strongly deleteri- ica, and Africa (see also Lombaert et al. 2011 for evidence ous and highly recessive (Kirkpatrick and Jarne 2000; of potential admixture of the eastern North American Glemin 2003). population). In Europe, it was shown that some admix- Admixture events can mask the genetic load that has ture occurred with a biological control strain (Lombaert built up in isolated native populations, increasing mean et al. 2010, 2011). Facon et al. (2011) have shown that, fitness of individuals in the introduced populations. This contrary to native populations, invasive populations of can happen when introduced individuals stem from pop- H. axyridis do not suffer from inbreeding depression, that ulations that are fixed for different deleterious mutations. is, inbred crosses are as fit as outbred crosses within inva- In this situation, crosses between those populations can sive populations. As inbreeding depression is the result of result in fitter progeny compared with within-population mutations segregating within populations, and because crosses. This phenomenon is known as heterosis (Lynch invasive inbred individuals were fitter than native ones, and Walsh 1998). In general, heterosis is produced by the Facon et al. (2011) attributed this absence of inbreeding presence of complementary sets of deleterious recessive depression to a purge of deleterious mutations in the first alleles within both parental populations and the masking stages of the invasion process. Moreover, the same study of their effects in F1 heterozygotes (Charlesworth and demonstrated that invasive populations endured a bottle- Willis 2009). To a lesser extent, overdominance and epis- neck of intermediate intensity compatible with a purging tasis may also contribute to heterosis (Lynch 1991). It is process. important to note that heterosis and inbreeding depres- The aim of this study was to go a step further toward sion are not mirror images of each other. Indeed, understanding how admixture and bottlenecks associated

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A. Tayeh et al. Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis with introductions shape the genetic load of invasive pop- biases due to maternal effects. For these first generations ulations. Specifically, we investigated whether admixture and the rest of the experiment, individuals were fed with leads to either heterosis or outbreeding depression in ionized Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) eggs H. axyridis populations from the native and introduced and maintained at 23°C, 65% relative humidity, with a ranges. To this end, we measured two fitness-related traits photoperiod of L:D 14:10, that are considered optimal for (i.e., lifetime performance and generation time; see Facon the laboratory rearing of this species. Moreover, native et al. 2011) under controlled laboratory conditions on and invasive areas both extend over a similar range of lat- offspring from crosses differing in the level of relatedness itudes (although not at the same longitude), so that there of the parents: crossing within a population, crossing is not much reason to think that they differ strongly in between populations of the same biogeographical status terms of temperature and sensitivity to photoperiod. (invasive or native), and crossing between populations of Crosses used to maintain laboratory populations were different status. We show that heterosis has negligible designed to minimize the risk of purging or fixation of impact on H. axyridis populations whatever their biogeo- deleterious alleles. For each population, from the P indi- graphical status. Outbreeding depression affects only viduals, we created around 50 pairs to produce the fol- native populations, and only with respect to generation lowing generation by keeping one new male and female time. Finally, we discuss the implications of this result for from each pair (F1). We then randomly created 50 pairs the structure of genetic load in this species in the light of of F1 individuals to produce the F2 individuals in the the available information regarding its introduction history. same way. During this step, males and females were separated immediately after emergence to prevent mating. Material and methods They were then maintained in the same environmental conditions for 2 weeks to ensure that all individuals had reached reproductive maturity. Sampled populations Three live native populations and three live invasive pop- Experimental design ulations of H. axyridis were sampled in the wild in 2007 and 2008 (hereafter P generation; see Table 1). The The experiment per se started with the third generation. native range samples were from Kyoto (Japan, KYO), For 10 families per population, three sexually mature F2 Novosibirsk and Abakan (Russia, NOV and ABA, respec- sisters per family were randomly assigned to one of the tively). The invaded range samples included Croix three following treatments: (1) mating with an unrelated (France, FRA), Brookings (South Dakota, USA, DAK), male of the same population; (2) mating with a male and Bethlehem (South Africa, SAF). In each population, from a different randomly chosen population of the same around 100 adults were collected (with ~1:1 sex ratio). biogeographical status (i.e., from an invasive or native We checked our laboratory populations for some endos- population); and (3) mating with a male from a ran- ymbionts and we never found significant infection rates. domly chosen population from the opposite status The level of selectively neutral genetic variation was mea- (Fig. 1). sured at 18 microsatellite loci genotyped in P individuals collected in each sampled population (n = 26–31 individ- Traits measured uals per population) as described by Loiseau et al.

(2009). Genetic variation within samples was quantiﬁed We collected and isolated two clutches of F3 eggs with at by calculating the mean expected heterozygosity He (Nei least 20 eggs per clutch from each couple. At the day of 1987) and mean number of alleles with Genepop (Ray- hatching (the fourth day), eight larvae were randomly mond and Rousset 1995). Genetic variation between chosen and each isolated for individual monitoring in a populations was summarized by calculating with Gene- small cylindrical box (height = 2 cm; diameter = 5 cm). pop pairwise FST estimates as described by Weir and The following traits were measured on the eggs and Cockerham (1984). Such basic neutral genetic data are larvae. (1) Hatching rate was determined by counting summarized in Table 1. eggs from all clutches and recording the number of living larvae after 4 days divided by the number of eggs in the clutch; (2) Larval survival was scored daily; (3) Develop- Controlled rearing conditions ment time was recorded as the period it took for individ- For each of the six populations sampled, ﬁeld sampled uals to develop from an egg into an adult. A subset of individuals (P) were used to initiate populations in the individuals reaching adulthood was used for additional laboratory that were maintained for two generations measurements. Ten days after emergence, one female per under strictly controlled conditions to minimize potential family and per cross was presented with potential mates.

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Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis A. Tayeh et al.

Table 1. Sampling details of the six studied H. axyridis populations and genetic variation within (A) and between (B) those populations measured at 18 neutral microsatellite loci.

(A) Sampling details and genetic variation within populations Nb of Geographic Biogeo-graphic genotyped Mean number Expected Population code Country City coordinates status individuals of alleles heterozygosity (He)

FRA France Croix 50.68°N Invasive 30 6.16 0.581 3.14°E DAK USA Brookings 44.35°N Invasive 30 5.44 0.567 96.81°W SAF South Africa Bethlehem 28.25°N Invasive 31 5.11 0.555 28.32°E ABA Russia Abakan 53.73°N Native 31 6.39 0.570 91.46°E NOV Russia Novosibirsk 55.04°N Native 30 6.19 0.555 82.93°E KYO Japan Kyoto 35.01°N Native 26 6.94 0.587 135.77°E

(B) Genetic variation between populations: matrix of pairwise FST values Pop FRA DAK SAF ABA NOV

DAK 0.0444 SAF 0.0455 0.0193 ABA 0.0565 0.0378 0.0421 NOV 0.0690 0.0468 0.0580 0.0062 À KYO 0.0413 0.0333 0.0386 0.0194 0.0227

mated females. Measurement (iv): time to sexual maturity was estimated for each of these females by recording the day they first laid a clutch of eggs. Measurement (v): fecundity was estimated as the number of eggs laid during the first 8 days after the start of oviposition. Finally, we used the above measurements to create two combined traits linked to fitness: generation time and lifetime performance (see Facon et al. 2011). To calculate generation time, we added egg-to-adult development time and time to reach sexual maturity into a single cumulative measure for each family and cross. Lifetime performance was obtained by multiplying hatching rate by larval survival by subsequent fecundity for each family Figure 1. A male climbing on top of the female during the mating and cross. During this ecological genetics experiment process in the harlequin ladybird (photo courtesy of B. Serrate). focused on six separate populations, we followed more

than 7000 eggs, 1440 larvae, and 180 females at the F3 Each female was presented with a single male for a period generation. of 24 h, and this was repeated three times with three different males during the course of a week. This procedure Statistical analyses minimized density effects (e.g., delayed growth or reduced fecundity in paired individuals due to competition) while The following analyses were conducted using the software leaving time for multiple copulations to occur. Males SAS (SAS Institute 2003). The two combined traits, gen- were randomly chosen from the stock colony obtained eration time and lifetime performance, were analyzed with different mixing of individuals from the six popula- using mixed-model ANOVA (PROC MIXED with Satt- tions to minimize bias due to male identity. We then erthwaite’s approximation in SAS). The model included carried out the following two measurements on these the following factors: two biogeographical status (invasive

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A. Tayeh et al. Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis and native populations) and three crossing treatments Table 2. Results of statistical analyses using mixed-model ANOVA for (intra-population, inter-population from the same status, the combined traits lifetime performance and generation time. and inter-population from the opposite status). Popula- Sources Test statistic P-value tion was nested in status and the interaction between status and treatment were entered as fixed effects. Family (A) Lifetime Performance nested within population was treated as random effect. Fixed effects F (df) Treatment 1.67 (2; 94.8) 0.1935 Status 0.17 (1; 48.9) 0.6777 Results population (status) 0.64 (4; 47.9) 0.6363 Status 9 treatment 0.77 (2; 94.8) 0.4646 Figure 2 shows the mean reaction norms for lifetime per- Random effect Wald test formance and generation time of the three treatments for Fam (pop) 1.07 0.1419 invasive and native status. Table 2 summarizes results of (B) Generation time the statistical analyses using mixed-model ANOVA. Fixed effects F (df) Treatment 0.89 (2; 81.5) 0.4166 We found that lifetime performance was not signifi- Status 8.29 (1; 43.8) 0.0061 cantly affected by the crossing treatment (P = 0.19), nor Population (status) 5.11 (4; 42.9) 0.0019 the biogeographical status (native or invasive, P = 0.68), Status 9 treatment 4.29 (2; 81.5) 0.0169 nor the population identity (P = 0.64). The overall mean Random effect Wald test for lifetime performance is 31.5 (Fig. 2A). Generation Fam (pop) 0.03 0.4883 time did not significantly differ according to crossing treatment (P = 0.42). Generation time of invasive popula- of native populations (Fig. 2B, mean generation time of tions was on average 3.4 days shorter, however, than that 23.5 days vs. 26.9 days, P = 0.0061). A significant variation for generation time between populations also 40 (A) remained within status (P = 0.0019). Finally, we found

36 for this composite trait a signiﬁcant interaction between status and crossing treatment (P = 0.0169). This interac- 32 tion mainly reﬂected the fact that individuals from crosses between different invasive populations had a mean gener- 28 ation time almost 10 days shorter than individuals from crosses between different native populations (mean gener-

Lifetime performance 24 ation time of 20.8 days vs. 30.5 days, P = 0.0029; see 20 black squares and white diamonds associated to the label Intra-pop Same status Different status “same status” in Fig. 2B). Inter-pop

15 (B) Discussion 19 In this study, we have investigated the possibility of 23 heterosis and outbreeding depression in both native and invasive populations of the harlequin ladybird. By manip- 27 ulating the relatedness among parental individuals and

31 evaluating fitness effects in the F1 generation, we have Generation time (days) shown that inter-populations crosses had no major impact 35 on the fitness of the offspring produced in H. axyridis. Intra-pop Same status Different status Significant outbreeding depression was observed only Inter-pop among native populations for generation time. Figure 2. Mean values of lifetime performance (A) and generation These results bring new insights into the structure of time (B) of native (black squares) and invasive (white diamonds) the genetic load in H. axyridis populations from both the populations for the three studied types of crosses. Note: Intra- native and introduced ranges. Heterosis is thought to pop = mating with an unrelated male of the same population. Inter- result from deleterious, recessive mutations that are fixed pop = mating with a male from a different randomly chosen (and thus homozygous) within parental populations and population of the same biogeographical status (i.e., from an invasive brought back into heterozygotic states by inter-population or native population) and from a different status. Mean values are 1.96 standard error. The y axis shows low values of generation crosses (Lynch 1991; Lynch and Walsh 1998; Edmands Æ time, which correspond to high fitness, at the top, and high values of 1999; Charlesworth and Willis 2009). The absence of generation time (low fitness) at the bottom. observed heterosis is thus indicative of a low occurrence

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Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis A. Tayeh et al. of fixed deleterious mutations within both the native and that many deleterious mutations have been purged in invasive populations of H. axyridis. Facon et al. (2011) introduced populations. This result is reminiscent of have recently demonstrated strong inbreeding depression those obtained in studies dealing with mating systems, within the native range of H. axyridis. It is thus likely that where it has been repeatedly been shown that the purge most deleterious mutations are segregating within popula- of deleterious mutations (e.g., due to high and sustained tions of the native range. The evidence for a low selfing) diminishes both inbreeding depression and heter- frequency of fixed deleterious mutations, the high level of osis (Schemske and Lande 1985; Escobar et al. 2008). heterozygosity found at neutral microsatellite markers Altogether, our results suggest that genetic admixture (i.e., He = ca. 0.57; Table 1), and the low observed level of per se is unlikely to have significantly contributed to the genetic differentiation among native range populations invasion success of H. axyridis. At first glance, this con- observed at those markers (FST < 0.023 between pairs of clusion seems surprising as the literature on outcrossing native populations; Table 1), indicate that native H. axyridis between allopatric populations in invasive species reports populations are characterized by large effective population numerous cases where admixture has been implicated in sizes (see Lombaert et al. 2011 for similar measures of the invasion process (Ellstrand and Schierenbeck 2000; genetic variation obtained at additional H. axyridis popu- Kolbe et al. 2007; Lavergne and Molofsky 2007; Facon lations). Such demogenetic features are in agreement with et al. 2008; Keller and Taylor 2010; but see Chapple et al. a low occurrence of fixed deleterious mutations within 2013). In particular, based on a study of the invasive population(s) (Bataillon and Kirkpatrick 2000; Escobar plant species Silene latifolia, Verhoeven et al. (2011) argue et al. 2008). that the benefits of admixture should be larger for popu- Outbreeding depression was detected for generation lations that experienced a recent bottleneck or that face time only among native populations. Outbreeding depres- novel selection pressures such as invasive populations. sion may result from disruption of local adaptation or This study brings new insights into the potential role of genetic incompatibilities (Lynch 1991; Edmands 1999). genetic admixture in biological invasion for at least two Because the present experiment was carried out under aspects of this important issue. First, we would like to strictly controlled laboratory conditions, we were likely emphasize that much insight into the structure of the not able to detect any fitness effects resulting from genes genetic load of populations can be gained by keeping a involved in in natura local adaptation. The observed dete- precise distinction among inbreeding depression, heterosis rioration of fitness in native inter-population crosses and outbreeding depression, as traditionally done in evo- therefore most likely results from genetic incompatibili- lutionary biology. If the expected effect of admixture is ties, that is, alleles complementing each other in one pop- heterosis, then the later can be measured by comparing ulation, but that do not have the same beneficial effects the fitness of outbred offspring within a given population when associated with alleles from other populations relative to outbred offspring between different popula- (namely, co-adapted gene complexes). tions (Lynch and Walsh 1998). Inbreeding depression In contrast to native populations, introduced H. axyridis should be considered as a distinct phenomenon. It is populations do not suffer from outbreeding depression. defined as a lower observed fitness of inbred relative to Inter-population crosses even tend to be fitter than outbred offspring within the same population (Charles- within-population crosses for generation time (although worth and Charlesworth 1999). Both phenomena have this trend was not significant). It is worth stressing that been shown to stem from different structures of the all studied invasive populations share a common origin genetic load. As a matter of fact, while heterosis is due to in that they all originate from the US bridgehead invasive mutations that are fixed within parental populations, population (Lombaert et al. 2010). It is therefore likely inbreeding depression is caused by mutations segregating that co-adapted gene complexes are similar across invasive within parental populations (Escobar et al. 2008). populations. Moreover, invasive H. axyridis populations Second, and consequently, admixture is expected to have gone through one to several bottleneck events of boost the mean fitness of individuals in invasive popula- moderate intensities, such demographic events explaining tions when the propagule pools that come into contact the structure of genetic variation observed at microsatel- and breed have distinct sets of fixed deleterious muta- lite loci within and among invasive population as well as tions. This may happen either because native populations among invasive and native populations (Table 1; and see suffer from high genetic load with many fixed deleterious Lombaert et al. 2010, 2011). Facon et al. (2011) showed mutations, or when, whatever the composition of native that invasive populations do not suffer from inbreeding populations, intense drift event during introduction has depression and have a higher overall fitness compared fixed (rather than purged) deleterious mutations in the with native populations. The absence of heterosis nascent invasive populations (see Pujol et al. 2009). In all observed in this study therefore reinforces the conclusion other cases, as in this study, admixture is not particularly

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A. Tayeh et al. Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis expected to be associated to heterosis. However, we rec- Burke, J. M., and M. L. Arnold. 2001. Genetics and the fitness ognize that the present results stem only from the study of hybrids. Ann. Rev. Genet. 35:31–52. of the F1 hybrid generation and different conclusions Chapple, D. G., K. A. Miller, F. Kraus, and M. B. Thompson. might have been reached if we had conducted additional 2013. Divergent introduction histories among invasive generations of crosses. For instance, hybrids are known to populations of the delicate skink (Lampropholis delicata): express phenotypic breakdown in the F2 generation has the importance of genetic admixture in the success of (Lynch 1991; Burke and Arnold 2001). Additionally, our biological invasions been overemphasized? Div. Distrib. experimental design did not allow us to investigate the 19:134–146. potential for admixture to alleviate the loss of genetic var- Charlesworth, B., and D. Charlesworth. 1999. The genetic basis iance after founder events and hence to restore or even of inbreeding depression. Genet. Res. 74:329–340. increase the efficiency of selection. Charlesworth, D., and H. Willis. 2009. The genetics of inbreeding depression. Nat. Rev. Genet. 10:783–796. Dlugosch, K. M., and I. M. Parker. 2008a. Founding events in Conclusion species invasions: genetic variation, adaptive evolution, and Because mutation, fixation, and purging are stochastic the role of multiple introductions. Mol. Ecol. 17:431–449. processes (Lynch 2000), the impact of introduction events Dlugosch, K. M., and I. M. Parker. 2008b. Invading such as admixture and bottleneck on the genetic load of populations of an ornamental shrub show rapid life history invasive population cannot be expected to be uniform evolution despite genetic bottlenecks. Ecol. Lett. 11:701–709. among invasive species, as it depends on both the popula- Edmands, S. 1999. Heterosis and outbreeding depression in tion biology within the native range and the demographic interpopulation crosses spanning a wide range of divergence. history of invasive populations. The main result of our Evolution 53:1757–1768. laboratory crossing experiments was a lack of evidence for Ellstrand, N. C., and K. A. Schierenbeck. 2000. Hybridization any fixation load in invaded area, because no heterosis as a stimulus for the evolution of invasiveness in plants? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7043–7050. was observed in between-population crosses from intro- Escobar, J. S., A. Nicot, and P. David. 2008. The different duced populations. We argue that it is crucial to better sources of variation in inbreeding depression, heterosis and understand the role of introduction events in biological outbreeding depression in a metapopulation of Physa acuta. invasions not only through their potential impact on ben- Genetics 180:1593–1608. eficial genetic variation but also through their impact on Facon, B., J. P. Pointier, P. Jarne, V. Sarda, and P. David. the structure of the genetic load. We hope that additional 2008. High genetic variance in life-history strategies within experimental tests that manipulation of relatedness of invasive populations by way of multiple introductions. Curr. other invasive species will help to fill this gap. Biol. 18:363–367. Facon, B., R. A. Hufbauer, A. Tayeh, A. Loiseau, E. Lombaert, Acknowledgments R. Vitalis, et al. 2011. Inbreeding depression is purged in the invasive insect Harmonia axyridis. Curr. Biol. 21:424–427. We thank J.G. Lundgren, N. Osawa, and G.J. Prinsloo Glemin, S. 2003. How are deleterious mutations purged? Drift who provided us with H. axyridis samples used in this versus non-random mating. Evolution 57:2678–2687. study. This study was supported by a grant from the Ag- Golani, D., E. Azzurro, M. Corsini-Foka, M. Falautano, F. ropolis Fondation (RTRA, Montpellier, BIOFIS project). Andaloro, and G. Bernardi. 2007. Genetic bottlenecks and R.A.H. received support from Fulbright-France, INRA, successful biological invasions: the case of a recent NSF DEB-0541673 and the Colorado Agricultural Experi- Lessepsian migrant. Biol. Lett. 3:541–545. ment Station during this study. Keller, S. R., and D. R. Taylor. 2008. History, chance and adaptation during biological invasion: separating stochastic Conflict of Interest phenotypic evolution from response to selection. Ecol. Lett. 11:852–866. None declared. Keller, S. R., and D. R. Taylor. 2010. Genomic admixture increases fitness during a biological invasion. J. Evol. Biol. References 23:1720–1731. Bataillon, T., and M. Kirkpatrick. 2000. Inbreeding depression Kirkpatrick, M., and P. Jarne. 2000. The effects of bottlenecks due to mildly deleterious mutations in finite populations: on inbreeding depression and the genetic load. Am. Nat. size does matter. Genet. Res. 75:75–81. 155:154–167. Bossdorf, O., H. Auge, L. Lafuma, W. E. Rogers, E. Siemann, and Koch, R. L. 2003. The multicolored Asian lady beetle, D. Prati. 2005. Phenotypic and genetic differentiation between Harmonia axyridis: a review of its biology, uses in biological native and introduced plant populations. Oecologia 144:1–11. control, and non-target impacts. J. Insect. Sci. 3:32.

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Genetic Load in the Invasive Harmonia axyridis A. Tayeh et al.

Kolbe, J. J., R. E. Glor, L. R. G. Schettino, A. C. Lara, (spotted knapweed, Asteraceae) to North America. Mol. A. Larson, and J. B. Losos. 2004. Genetic variation increases Ecol. 17:4197–4208. during biological invasion by a Cuban lizard. Nature Nei, M. 1987. Molecular evolutionary genetics. Columbia 431:177–181. University Press, New York. Kolbe, J. J., A. Larson, and J. B. Losos. 2007. Differential Pujol, B., S. R. Zhou, J. S. Vilas, and J. R. Pannell. 2009. admixture shapes morphological variation among invasive Reduced inbreeding depression after species range populations of the lizard Anolis sagrei. Mol. Ecol. expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15379–15383. 16:1579–1591. Raymond, M., and F. Rousset. 1995. Genepop (version 1.2), a Lavergne, S., and J. Molofsky. 2007. Increased genetic variation population genetics software for exact tests and and evolutionary potential drive the success of an invasive ecumenicism. J. Hered. 86:248–249. grass. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3883–3888. Roman, J., and J. A. Darling. 2007. Paradox lost: diversity and Loiseau, A., T. Malausa, E. Lombaert, J. F. Martin, and the success of aquatic invasions. Trends Ecol. Evol. A. Estoup. 2009. Isolation and characterization of 22:454–464. microsatellites in the harlequin ladybird, Harmonia axyridis SAS Institute. 2003. The SAS System for Windows, release 9.1. (Coleoptera, Coccinellidae), and cross-species ampliﬁcation SAS Institute, Cary, NC, USA. within the family Coccinellidae. Mol. Ecol. Res. 9:934–937. Sax, D. F., B. P. Kinlan, and K. F. Smith. 2005. A conceptual Lombaert, E., T. Guillemaud, J. M. Cornuet, T. Malausa, B. framework for comparing species assemblages in native and Facon, and A. Estoup. 2010. Bridgehead effect in the exotic habitats. Oikos 108:457–464. worldwide invasion of the biocontrol harlequin ladybird. Schemske, D. W., and R. Lande. 1985. The evolution of PLoS ONE 5:e9743. self-fertilization and inbreeding depression in plants.2. Lombaert, E., T. Guillemaud, C. E. Thomas, L. J. L. Handley, Empirical observations. Evolution 39:41–52. J. Li, S. Wang, et al. 2011. Inferring the origin of populations Tsutsui, N. D., A. V. Suarez, and D. A. Holway. 2000. introduced from a genetically structured native range by Reduced genetic variation and the success of an invasive approximate Bayesian computation: case study of the invasive species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5948–5953. ladybird Harmonia axyridis. Mol. Ecol. 20:4654–4670. Verhoeven, K. J. F., M. Macel, L. M. Wolfe, and A. Biere. Lynch, M. 1991. The genetic interpretation of inbreeding 2011. Population admixture, biological invasions and the depression and outbreeding depression. Evolution balance between local adaptation and inbreeding depression. 45:622–629. P. Roy. Soc. Lond. B. Bio. 278:2–8. Lynch, M. 2000. The limits to knowledge in quantitative Weir, B. S., and C. Cockerham. 1984. Estimating F-statistics genetics. Evol. Biol. 32:225–237. for the analysis of population structure. Evolution Lynch, M., and B. Walsh. 1998. Genetics and analysis of 38:1358–1370. quantitative traits. Sinauer Associates, Inc., Sunderland Whitlock, M. C., and D. Bourguet. 2000. Factors affecting the (MA). genetic load in Drosophila: synergistic epistasis and Marrs, R. A., R. Sforza, and R. A. Hufbauer. 2008. Evidence correlations among ﬁtness components. Evolution for multiple introductions of Centaurea stoebe micranthos 54:1654–1660.

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Article 3

Increase in Male Reproductive Success and Female Reproductive Investment in Invasive Populations of the Harlequin Ladybird Harmonia axyridis

Guillaume J. M. Laugier1*, Gilles Le Mogue´dec2, Ashraf Tayeh1, Anne Loiseau1, Naoya Osawa3, Arnaud Estoup1, Benoıˆt Facon1 1 Inra, Centre de Biologie pour la Gestion des Populations, Montpellier, France, 2 Inra, botAnique et bioinforMatique de l’Architecture des Plantes, Montpellier, France, 3 Laboratory of Forest Ecology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kyoto, Japan

Abstract Reproductive strategy affects population dynamics and genetic parameters that can, in turn, affect evolutionary processes during the course of biological invasion. Life-history traits associated with reproductive strategy are therefore potentially good candidates for rapid evolutionary shifts during invasions. In a series of mating trials, we examined mixed groups of four males from invasive and native populations of the harlequin ladybird Harmonia axyridis mating freely during 48 hours with one female of either type. We recorded the identity of the first male to copulate and after the 48 h-period, we examined female fecundity and share of paternity, using molecular markers. We found that invasive populations have a different profile of male and female reproductive output. Males from invasive populations are more likely to mate first and gain a higher proportion of offspring with both invasive and native females. Females from invasive populations reproduce sooner, lay more eggs, and have offspring sired by a larger number of fathers than females from native populations. We found no evidence of direct inbreeding avoidance behaviour in both invasive and native females. This study highlights the importance of investigating evolutionary changes in reproductive strategy and associated traits during biological invasions.

Citation: Laugier GJM, Le Mogue´dec G, Tayeh A, Loiseau A, Osawa N, et al. (2013) Increase in Male Reproductive Success and Female Reproductive Investment in Invasive Populations of the Harlequin Ladybird Harmonia axyridis. PLoS ONE 8(10): e77083. doi:10.1371/journal.pone.0077083 Editor: Gabriele Sorci, CNRS, Universite´ de Bourgogne, France Received June 10, 2013; Accepted September 6, 2013; Published October 18, 2013 Copyright: ß 2013 Laugier et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was supported by Agropolis Fondation under the reference ID « BIOFIS » 1001-001. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: [email protected]

Introduction fate of some invasions [18,19]. In particular, low effective population sizes following the introduction should increase the Evolutionary processes and genetic attributes of invasive proportion of mating between relatives and thus decrease the populations may underpin their success in becoming established mean fitness of the population through inbreeding depression [20]. in a new range [1–3]. Life-history traits associated with The response of a species to purging and admixture depends on its reproductive strategy are potentially good candidates for rapid mating regime. For example, high selfing rates may slow evolutionary shifts during invasions [4], because reproductive admixture and accelerate purging, whereas multiple mating and strategy affects population dynamics and genetic parameters that allogamy would be expected to have the opposite effect. can, in turn, have feedback effects on evolutionary processes [5–7]. Our current understanding of evolutionary shifts in the Indeed, when species shift their range, they encounter a suite of reproductive strategies associated with invasions is based largely new selective pressures that may affect their reproductive strategy. on plant species (e.g. [6,21,22]). Moreover, most studies have dealt For instance, the lower population density at an expanding front exclusively with female function (with no measurement of male would be expected to select for higher fecundity, lower age at first function), focusing particularly on female reproductive effort reproduction, or even a switch from outcrossing to selfing, all of [12,23,24]. Consequently, very little is known about the effects which increase the individual’s rate of reproduction [6,8,9]. Rapid of invasion processes on other aspects of reproductive systems, evolution towards higher levels of reproduction following invasions including behavioural components, such as male-male competition may also result from a relaxation of selection for defence against for access to females and sperm competition. In particular, enemies in the invaded range [10,11]. In accordance with these multiple mating (also referred to as promiscuous mating), although expectations, a number of studies have shown that invasive taxonomically widespread, has never been investigated in this populations can display increased reproductive efforts, have higher context. Multiple mating is known to trigger the rapid evolution of levels of reproductive investment, shorter generation times or sexual traits [25]. It can provide females with many advantages, higher selfing rates than native populations [6,10,12–17]. Repro- such as ensuring fertilisation [26], the laying of larger numbers of ductive strategy can also influence the adaptive potential of eggs [27], greater genetic diversity of the progeny [28,29] and invasive populations. The purging of deleterious alleles and sperm quality selection [30]. Multiple mating also has major admixture between populations are crucial determinants of the evolutionary consequences for males [31], because the net

PLOS ONE | www.plosone.org 1 October 2013 | Volume 8 | Issue 10 | e77083 Reproductive Success in Invasive Populations reproductive success of an individual male is determined by his a total of 129 virgin females and four times as many males (See success in acquiring mates and copulating (i.e., mating success), Table S1 in the supporting information). Females were set and by the number of eggs fertilised at each mating (i.e., individually in arenas (Petri dishes, 7 cm in diameter) into which fertilisation success). Multiple mating may also incur considerable we had placed four virgin males the day before (see Figure S1 in fitness costs, due to greater exposure to sexually transmitted the supplementary materials for details). Setting the females into disease, predation, a decrease in lifespan or the risk of physical the arena after the males ensured that the arenas were not harm to the female during copulation [32,33]. In species saturated with females pheromones at the start of the experiment. displaying multiple mating, the reproductive success of both sexes The choice of the four males was inspired by a previous study depends on processes occurring both before (pre-mating) and after [41,42]. One of the males was a full-sib of the female, another was (post-mating) copulation [34]. an unrelated male from the same population, and the remaining In this study, we investigated the effects of invasion on two males were from other populations, one native and the other reproductive traits in a species with multiple mating as a major invasive. The males were identified by means of coloured dots reproductive strategy: the invasive harlequin ladybird Harmonia painted onto the elytra. The colour code was randomised to axyridis Pallas. H. axyridis is native to Asia and was introduced into prevent confounding effects of marking. All individuals had North America and Europe as a biological control agent. It emerged about 18 days before the experiment and had been kept subsequently became invasive and has spread rapidly worldwide, alone, ensuring that they were all of the same age, sexually mature, with a complex invasion history involving admixture events in but virgin [43,44]. particular [35,36]. H. axyridis displays multiple mating [37], the Once all five individuals were present in the arena, we observed storage by females of sperm from multiple males [38,39] and the them for one hour and recorded the identity of the first male to production of up to three generations per year [40]. Studies engage in copulation (successful mounting, phase iv as described comparing H. axyridis populations have indicated that this species by Obata [45]) with the female. The boxes were then left for has undergone rapid evolution during the invasion process. Firstly, 48 hours, during which time the individuals were allowed to invasive females have been shown to reproduce earlier than native copulate freely, and the males were then removed and preserved in females [41]. Secondly, while native populations display inbreed- ethanol for subsequent molecular analysis. Our experimental ing depression, invasive populations do not, probably due to a design differs from mating trials involving the sequential mating of purging process during invasion [41]. As inbreeding depression a female with two different males, the second male being proposed exerts a major selective pressure on the mating system, different to the female after the end of copulation with the first male [46]. reproductive traits may evolve in invasive populations in this The design of our experiment did not allow such a high level of species. However, it remains unclear whether any other aspects of control, and we only recorded the first mating. However, it better mating behaviour differ between invasive and native populations. reflects natural conditions for a promiscuous species with multiple The aim of this study was to clarify this point by investigating male partners available at the same time. It did allow free mating differences in reproductive success, for both males and females, between a female and four males over a 48-hour period, including between native and invasive populations of H. axyridis.We the possibilities of all males remating, not mating at all and specifically aimed to determine whether (1) invasive males were possible mate guarding behaviour [47]. The first male to mate at an advantage, in terms of both mating success (probability of may, therefore, also have been the last. It has to be noted that our being the first male to copulate) and fertilisation success (number paternity analyses confirm that H. axyridis displays multiple mating of offspring sired), (2) invasive females copulated with more males, [37] and the storage by females of sperm from multiple males. were more fecund and began to reproduce at younger age than Indeed, the 48-hour period is enough for multiple mating to occur native females, (3) there was a potential interaction between male and most females (75%) in all populations studied mothered and female origin (invasive vs. native) for these traits, and (4) offspring from several males (see Results). whether there was a difference in inbreeding avoidance between native and invasive females. Female reproductive investment Female fecundity was assessed by checking the females for eggs Materials and Methods every two to three days after the start of the experiment, and for 23–24 days following their first clutch. Similarly to a previous work Samples of H. axyridis [41], we followed the females for up to 63 days (corresponding to We used H. axyridis individuals sampled from five populations, the time required for 80% of the females to lay eggs). The subsequently reared in laboratory conditions for three generations remaining females were assumed to be sterile or to have not mated to minimise maternal effects in mating experiments. Two of these successfully. We recorded the date of the first clutch and the total populations came from the native area and were sampled from number of eggs laid during this period. Once counted, the egg Beijing (China) and Fuchu (Japan). The other three populations clutches were transferred to individual Petri dishes and fresh came from the invaded area, and were sampled in Quebec City oviposition medium was provided to the females. The hatching (Canada), Bataszek (Hungary) and Bethlehem (South Africa). The rate was estimated for a mean of three clutches per female. Two of sampling was conducted in public locations that did neither these three clutches per female, laid at least 10 days apart, were require specific authorisation nor involve endangered or protected allowed to develop to the second larval stage, which was stored in species. The samples included at least 50 individuals of each sex ethanol for subsequent molecular analysis. per population. All individuals were reared at 23uC, with 14:10 L:D and fed with an excess of ionised Ephestia khueniella eggs. We Male reproductive success used pieces of black cardboard, folded above the food, as Male mating success was estimated by the identity of the male oviposition medium. engaged in the first mating. Male fertilisation success was evaluated by the number of offspring sired by each of the four Mating trials males for all studied females. We genotyped microsatellite loci in We investigated mixed groups of four males from invasive and up to eight larvae per clutch for the two clutches per female native populations mating with one female of either type, involving allowed to develop to the second larval stage. We also genotyped

PLOS ONE | www.plosone.org 2 October 2013 | Volume 8 | Issue 10 | e77083 Reproductive Success in Invasive Populations

female origin (native vs. invasive) and the characteristics of the first male copulating with the female or siring the majority of the female’s offspring. The male characteristics considered were origin and being a full sibling of the female concerned. We studied male reproductive success by calculating the probability of a male being the first to copulate, and its percentage paternity among the offspring of the female as a function of his characteristics and those of the female. The male characteristics considered were origin (native vs. invasive), population, the relatedness to the female (whether or not the male and the female were full siblings) and, when applicable, involvement in the first copulation. The female characteristics studied were origin (native vs. invasive) and population. We also investigated the potential effects of the body size (measured as the length of elytron) and colour morph of both sexes in preliminary statistical treatments. These two factors were found to have no significant effect (results not shown) and were, therefore, not included in the factors considered in the statistical models presented below. As the explanatory variables were potentially subject to complex interactions or nesting, we studied the response variable (i.e. probability of first copulation and percentage paternity) by a Figure 1. Effect of the origin of the male on his probability of being the first to copulate. Observed proportion of invasive males modelling approach. Males were in competition with each other being the first to copulate with native and invasive females. The red within each Petri dish, and the reproductive success of a given dashed lines represent the proportion expected under the null male depended not only on his own characteristics, but also on hypothesis. those of his competitors. The non-independence of the reproduc- doi:10.1371/journal.pone.0077083.g001 tive success of the individual males in each Petri dish precluded the use of classical generalised linear models. The competition all males and females. We used the eight most variable between males in terms of copulation and percentage paternity microsatelite loci of those described by Loiseau et al. [48]. is essentially like a race between competitors. We therefore use Paternity was assessed with PROBMAX software [49]. We found multinomial models classically used in competition analysis (e.g. no difference in paternity pattern between the early and late [50,51]). Our modelling approach is described in detail in the clutches, which were therefore pooled for data analysis. Coupling supplementary materials. In brief, the probability of a given male percentage paternity with the results of the mating trials allowed copulating with the female or being the father of the offspring in a distinction between mating success and fertilisation. It also allowed particular egg is a function of the characteristics of this focal male the comparison of the realized paternity between different males with respect to those of the other males present in the arena. In while controlling for first sperm precedence. The effective number each round, four males ‘run to the finish line’ (mounting the 2 of fathers per female was calculated as Ef =1/gi fi , where fi is the female), so the probability Pi,k of a male k winning a race in frequency of paternity for male i. ‘arena’ i (a given Petri dish) depends on its ‘fitness score’ yi,k relative to the other three males. Modelling and statistical analyses This probability can be written We used classic parametric (t-test, Binomial GLM) and non- parametric (Kruskal-Wallis rank-sum test) statistical tests to assess yi,k statistical differences in female traits. We recorded the percentage Pi,k~ K , K~4; yi,k§0 for all i, k; y of egg-laying females, the daily fecundity of egg-laying females and k0~1 i,k0 the hatching rate. These traits were analysed with respect to the and Pkpi,k~1 for all i X Table 1. Statistical models of probability of being the first male to copulate.

Models df Log(L) Test statistic* P*

C0 null model 0 2166.4 2 23 C1 = origin 1 2161.5 X 1 =9.62 1.9610 2 C1.2 = population 4 2160.5 X 3 = 2.05 0.56 2 C2 = origin: R origin 2 2161.5 X 1 = 0.03 0.86 2 C2.2 = origin+= origin : R population 5 2159.3 X 3 = 4.44 0.22 ` 2 23 C3 = origin+sibling 2 2158.2 X 1 =6.7 9.6610 ` 2 C4 = origin+sibling : origin 3 2157.7 X 1 = 0.94 0.33 ` 2 C4.2 = origin+= sibling+sibling :population 6 2156.2 X 3 =6.32 0.097

*Test statistics and P-values from Chi-squared tests of the differences of log likelihood. `Whether or not the male was a full sibling of the female. Colons represent interaction factors, according to the conventions of the R language. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t001

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Figure 2. Proportion of females that engaging in a first copulation with an invasive male (A) or with their brother (B). The red dashed lines are the proportions expected under the null hypothesis (random mating). In panel B, the proportion is calculated for the females first copulated with a male of the same origin (native vs. invasive) only. Chi: China, Jap: Japan, Hun: Hungary, Can: Canada, SAf: South Africa. doi:10. 1371/journal.pone.0077083.g002 where the score yi,k can be generally written as Results

T Male reproductive success y ~exp m i,k t~1 t,k During the first hour of the experiment, 93% of females X engaged in copulation (see Table S1, and Dataset S1 in the with mt,k the effect of factor ti,k (including interaction factors) for supporting information for details). We analysed the traits of the male k in arena i. males only for these females. Starting with a null model in which each male has the same Invasive males tend to be the first to copulate. In our probability of success, we then added the effects (or interactions of experimental design, native females were presented with three effects) to be tested. Comparing nested models with likelihood native males and one invasive male each, so 25% of first ratio-tests allowed testing if each effect or interaction of effects copulations would be expected to be with the invasive male if improves the model [52]. For the relevant models, confidence mate choice were random. Conversely, invasive females were intervals were calculated with bootstraps of 2,000 samplings and presented with one native male and three invasive males, so 75% used to test separately the effects that would otherwise been of first copulations would be expected to be with invasive males in confounded. a context of random choice. We found that 40% of native females The R software [53] was used for both the classical statistical and 85% of invasive females first copulated with an invasive male analysis and the modelling approach. (Figure 1), regardless of the population of the male (see Table S1 in

Table 2. Estimated effects in models of probability of being the first male to copulate.

Models Estimate P(x?0){

C1 xinvasive= =0.67 **

C3 xbrother = 0.51 *

xinvasive= =0.70 **

C4.2 xbrother:japan = 1.11 -

xbrother:hungary = 20.01 NS

xbrother:canada =0.37 NS

xbrother:S.africa = 0.33 NS

xbrother = 0.16 NS

xinvasive= =0.80 *

{Significance code for probability of the effect estimate being different from zero (the effect taken as a reference), using a bootstrap of 2,000 replicates. **P#0.01; *P#0.05; - P#0.1; NS P.0.1. Figure 3. Effect of the origin of the male on his percentage Colons represent interaction factors in accordance with the conventions of R paternity. Average observed percentage paternity of each invasive language. Only relevant models are presented. male copulating with a native or an invasive female. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t002 doi:10.1371/journal.pone.0077083.g003

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Table 3. Statistical models of percentage paternity.

Models df Log(L) Test statistic* P*

P0 null model 0 21255 { 2 2117 P1 first 1 2990.1 X 1 =530 3.5610 { 2 25 P2 first +R origin 2 2980.6 X 1 =18.98 1.3610 { { 2 230 P2.2 first +first :R population 5 2886.1 X 3 =140.94 2.4610 { 2 216 P3 first += origin 2 2957.6 X 1 =64.9 7.7610 { 2 26 P3.2 first += population 5 2942.6 X 3 =30.122 1.3610 { 2 P4 first += origin: R origin 3 2956.6 X 1 =2.03 0.15 { 2 230 P4.2 first += origin+= origin : R population 6 2886.1 X 4 =143.0 6.5610 { ` 2 P5 first += origin+sibling 3 2955.3 X 1 =4.59 0.032 { ` 2 P6 first += origin+sibling : origin 4 2955.3 X 1 =0.08 0.78 { ` 2 227 P6.2 first += origin+= origin+sibling :population 7 2892.5 X 3 =125.5 3.1610

*Test statistics and P-values from Chi-squared tests of the differences of log likelihood. {Whether or not the male was the first to copulate with the female. `Whether or not the male was a full sibling of the female. Colons represent interaction factors, according to the conventions of the R language. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t003 supporting information). Our modelling-based analysis indicated C3). The model was not improved by allowing differences between that being invasive had a significant effect on the model likelihood native and invasive females (Table 1, model C4). of being the first male to copulate (P = 1.961023, Table 1, model The Japanese females tended to be more likely to mate with C1). The estimated effect was positive and significantly different their brothers than were the females of other populations from zero (Table 2, model C1), and no significant difference in (Figure 2B; Tables 1 and 2, model C4.2). This trend was only estimated effect was found between native and invasive females marginally significant, but this study lacked statistical power for (P.0.1, Table 1, model C2) or between populations (Figure 2A; analyses at the population scale. However, if we fitted the model to Table 1, models C1.2 and C2.2). the data without the Japanese population (equivalent to model C3 Invasive males have a higher percentage paternity. According in Table 1), the effect of being a full sibling was not significant to the null model, each male should sire 25% of the female’s offspring. (data not shown). However, we found that invasive males sired, on average, 41% of the Percentage paternity of brothers. According to the null offspring when mating with a native female, and 29% of the offspring model, each male would be expected to sire 25% of the female’s when mating with an invasive female (Figure 3A). As invasive males are offspring. We found that the brothers of the females sired, on more likely to mate first, we used our statistical modelling approach to average, 2663% of the female’s offspring, with each of the other take the advantage of being the first male to mate into account (Table 3, three males siring, on average, 2560.1% of the offspring. This model P1), then estimated the effect of being invasive on his percentage direct result does not take into account the effects of being the first paternity among the offspring. The inclusion of an effect of being invasive male to copulate and being invasive into account. significantly improved the model (P=7.7610216,Table3,modelP3), Including the effect of being the female’s brother in model P3, in and this effect was positive and significant (Table 4, model P3), although which these effects were already present, significantly improved smaller than that of being the first male to copulate. Allowing different the model (P = 0.032, Table 3, model P5). The estimated effect was estimations between male populations significantly improved the model negative, but was not significantly different from zero (P.0.1, (Table 3, model P3.2). However, the pattern with two categories of males Table 4, model P5), indicating a slight disadvantage of being the (Native vs. Invasive) was mainly found again, except that South African female’s brother in terms of paternity success. The model was not males were not significantly different from native ones (Table 4, model improved by allowing the effect of being the female’s brother to P3.3). differ between native and invasive populations (Table 3, model There was no significant difference in the effect of being an P6), but the model was improved by allowing this effect to differ invasive male between native and invasive females (Table 3, model between populations. However, the differences between popula- P4). Allowing the effect of being invasive to differ between female tions were not significant (Table 4, model P6.2). populations significantly improved the model, (Table 3, model P4.2) but the differences between populations were not significant Female reproductive investment (Table 4, model P4.2). Invasive females are more fecund and lay eggs earlier than native females. During the first hour of the experiment, Does inbreeding avoidance occur? 92% of native females and 95% of invasive females engaged in Females do not avoid copulation with their brothers. Acco- copulation. This difference is not significant (Fisher’s exact test rding to the null model 25% of the females should first copulate with P = 0.71). Females that did not mate during the first hour laid their brother. We found that 34% of native females and 37% of the significantly fewer eggs than those that did (P = 0.02, Table 5). invasive females first copulated with their brother. Once the advantage of Native females laid their first clutch 1362.7 days after the start of being invasive was taken into accountbythemodel,beingafullsibling the experiment, whereas invasive females started laying after only was found to have a significant effect on the probability of being the first 2.260.5 days (Wilcoxon rank-sum test P = 6.4361027, Table 5; male to copulate (P=9.661023;Table1,modelC3).Theestimated and Figure 4A). Native females laid fewer eggs than invasive effect of being a full sibling was positive and significant (Table 2, model females during the period studied (mean 6 SEM = 17.762.1 and

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Table 4. Estimated effects in models of percentage paternity. mothered offspring from two to four different males. Invasive females were fertilised by a significantly larger number of fathers (2.1860.13 an mean 6 SEM = 1.6260.14 fathers for invasive and Models Factor Estimate P(x?0){ native females, respectively; Kruskal-Wallis rank sum test: 2 23 X 1 = 9.48, P = 2.07610 ). We found no significant difference P1 first copulation 1.29 ** between native populations. The Hungarian females mated with P2 first:invasiveR 0.51 NS slightly more individuals than other invasive ones, but the first copulation 1.17 ** difference was only marginally significant (Kruskal-Wallis rank 2 P2.2 first:japaneseR 20.28 NS sum test: X 2 = 5.95, P = 0.05). Invasive females also were fertilised first:hugarianR 20.69 NS by a higher effective number of fathers than native females (1.6860.10 and mean 6 SEM = 1.3260.09 effective fathers for 2 first:canadianR 0.76 NS invasive and native females, respectively; Kruskal-Wallis rank sum first:S.africanR 20.60 NS 2 23 test: X 1 = 8.58, P = 3.4610 ). We found no significant difference first copulation 1.78 ** between invasive populations. The Japanese females had offspring P3 first:invasive= 0.59 ** from slightly more effective fathers than Chinese ones, but the first copulation 1.24 ** difference was only marginally significant (Kruskal-Wallis rank sum test: X2 = 3.93, P = 0.05). P3.2 first copulation 1.23 ** 1 Influence of males on female fecundity. Among females japaneseR 0.28 NS laying viable eggs, fecundity was higher if the principal father was hungarianR 0.98 ** a full sibling, for invasive females (mean 6 SEM = 30.062.2 eggs canadianR 0.86 ** per day for females whose brother sired most offspring, and 23 S.africanR 0.46 NS 18.061.5 for other females, P = 3.6610 , Table 6), but not for P4.2 invasive=:japaneseR 21.04 NS native females (mean 6 SEM = 22.362.9 eggs per day for brothers, and 15.962.3 for other males, P.0.1; Table 6). invasive=:hungarianR 20.68 NS Although significant in South African and Hungarian females, invasive=:canadianR 20.43 NS this differences was not significant for the Canadian female invasive=:S.africanR 0.56 NS (P.0.1). The origin (invasive/native) of the first male to copulate invasive= 0.99 - or the principal father of the offspring had no effect on any other first copulation 1.23 * female trait (male factors in Table 6). P5 brother 20.15 NS Discussion invasive= 0.58 ** first copulation 1.26 ** Our results show that invasive populations display changes in P6.2 brother=:japaneseR 1.21 NS both male and female traits associated with reproductive strategy, brother=: hungarian R 1.09 NS whose are expected to be selected for during a biological invasion [4,54]. brother =: canadian R 0.88 NS One of the key results of this study is that invasive males have a brother =: S.african R 0.51 NS higher probability of being the first to copulate with both native brother 20.92 NS and invasive females. This result indicates the absence of invasive= 0.57 ** assortative mating [55] with respect to native/invasive origin first copulation 1.25 ** and population. The advantage of invasive males over native ones may reflect a more active reproductive behaviour, a better ability {Significance code for probability of the effect estimate being different from to detect and locate females or a greater locomotive ability [56– zero (the effect taken as a reference), using a bootstrap of 2,000 replicates. 58]. Indeed, despite of the small size of the arenas, many females **P#0.01; *P#0.05; ran away from males for a few minutes before accepting - P#0.1; copulation. Hence, males with greater locomotory behaviour NS P.0.1. had more chance to be the first to detect the female than males Colons represent interaction factors in accordance with the conventions of R that stayed still. language. Only relevant models are presented. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t004 Early in the invasion process (and continually at the invasion front) population density is low, reducing the probability of mate encounters (an aspect of the Allee effect, see Elam et al. [59], for 22.761.6 eggs per day for native and invasive females, respec- example). Higher levels of male sexual activity increase the tively). This difference is significant (Kruskal-Wallis rank-sum test chances of finding and mating with a female, and are therefore P = 0.041, Table 5) and can be broken down into a trend towards expected to be selected for during invasions [60]. higher proportions of egg-laying females within invasive popula- We also found that invasive males have the advantage of siring a tions and a trend for these females to lay more eggs per day greater percentage of the offspring. Moreover, although we found (Figure 4B). These trends were not significant when considered a strong sperm precedence for the first male to copulate (Tables 3 separately (p.0.05; Table 5). We found no significant difference in and 4 of this article and figure S2 in supporting information), hatching rate between native and invasive females (0.760.03 for invasive males sired a greater proportion of the offspring than both native and invasive females, Table 5). No significant native ones, even if they were not the first to copulate. This difference was found between populations within status for any suggests that invasive males outperform native males in terms of of these traits (data not shown). both sperm defence and offence [61,62] This feature might come Multiple paternity of offspring. Most of the females from invasive males producing higher quality, more competitive producing larvae that survived to the second larval stage (75%) sperm [63], or larger ejaculates that might dilute or displace the

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Table 5. Statistical tests of the effects of female factors on female traits.

Effects Response variable Values (% or mean ± SE) Type of test Test statistic Probability

Female factors 2 R copulation* R eggs laid daily copulation: 9.264.5; no Kruskal-Wallis rank X 1 = 5.3 0.0213 (eggs/day) copulation: 21.561.4 sum test R origin daily fecundity (eggs/day) 2 - all R native: 17.762.1; invasive: Kruskal-Wallis rank X 1 = 4.170 0.0415 22.761.6 sum test -onlyegg-layingR native: 24.462; invasive: F test F = 0.70 0.4042 26.461.5 2 R origin % of egg-laying R native: 72.5%; invasive: 85.7% Likelihood Ratio Test X 1 = 3.32 0.070 2 R mean hatching rate native: 0.67360.034; invasive: Kruskal-Wallis rank X 1 = 6.04 0.6628 0.65760.027 sum test 2 27 Time to first clutch (days) native: 13.362.7; invasive: Kruskal-Wallis rank X 1 = 24.8 6.32610 2.260.5 sum test

*Whether or not copulation occurred during the first hour of the experiment. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t005 sperm of previous males [46,64]. Alternatively, females might was not designed to test any effects at population level, and such exert directional post-copulation sexual selection in favour of result should be interpreted with caution. invasive males [25]. Wang Su et al. [65] previously suggested that Native and invasive populations also differed in terms of female H. axyridis might display cryptic female choice. Unfortunately, our reproductive traits. This result provides an additional evidence, experiments do not allow testing any of these (non-exclusive) monitored over a longer period of time, for greater fecundity, hypotheses and further experiments are needed to do so. beginning earlier in invasive females of H. axyridis (see Facon et al. Regardless of the mechanisms involved, our results are consistent [41] for initial evidence of this). At least in the early stages, invasive with selection for more sexually competitive males as expected populations are typically in a state of demographic disequilibrium, during the invasion process, because the populations densities, with little or no regulation by density [67]. This demographic although low in the early stages of an invasion can be very high at setting may result in the selection for higher levels of fecundity and the outbreak in later stages [66]. on earlier onset of reproduction, both of which would accelerate This pattern of higher percentage paternity was found for all population growth [8]. invasive males, even though it was less pronounced in South Invasive females were also fertilised by both a higher total African males. Although all these populations are genetically very number of fathers and a higher effective number of fathers. This close (data not shown), a certain amount of variation between may be the result of a post-copulation selective mechanism. Note invasive populations was indeed expected, because all the that this result may also be at least partly due to our experimental populations used in this study have a different invasion scenario design in which invasive females were presented with one native [36], and thus possibly different density histories. Unfortunately, male and three invasive (therefore more competitive) males, information on densities in these populations is scarce if any. whereas native females were presented with three native males and Moreover, with only 2–3 populations of each type, the experiment one invasive male. A higher number of effective fathers would

Figure 4. Fecundity traits of native and invasive females. A: Distribution of the time to first clutch after the presentation of native and invasive females to the males. The difference between the mean times to first clutch of native and invasive female is significant (Table 5). B: Distribution of the mean number of eggs per day laid by a native and by an invasive female. The means for native and invasive females are significantly different (see Table 5). doi:10.1371/journal.pone.0077083.g004

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Table 6. Statistical tests of the effects of male factors on female traits.

Effects Response variable Values (% or mean ± SE) Type of test Test statistic Probability

{ 2 first = origin % of egg-laying R native: 93%; invasive: 97% Pearson’s Chi-squared test X 1 =0.084 0.777 ` 2 major = origin R daily fecundity (eggs/day) native: 25.061.9; invasive: Kruskal-Wallis rank sum testX 1 =0.043 0.835 25.361.6 R mean hatching rate native: 0.6960.03; invasive: Kruskal-Wallis rank sum testW = 885 0.929 0.6960.02 ` 2 first = sibling % of egg-laying R brother: 86%; other: 81% Pearson’s Chi-squared test X 1 =2.297 0.586 major{ = sibling R daily fecundity (eggs/day) 2 24 - all R brother: 30.062.2; other: Kruskal-Wallis rank sum testX 1 = 11.6 6.7610 18.061.5 2 - native R brother: 22.362.9; other: Kruskal-Wallis rank sum testX 1 =1.6 0.21 15.962.3 2 23 - invasive R brother: 32.862.5; other: Kruskal-Wallis rank sum testX 1 =9.83 1.7610 19.661.9 2 R mean hatching rate brother: 0.6460.04; other: Kruskal-Wallis rank sum testX 1 =1.2 0.27 0.6760.02

{First male to copulate with the female. `Male siring most of the female’s offspring. doi:10.1371/journal.pone.0077083.t006 ensure greater genetic diversity in the offspring of every single of Harmonia axyridis display higher levels of reproductive investment female [68]. This kind of bet-hedging strategy might make in both males and females. Interestingly, we found no major admixture more efficient and could be a key element of adaptation interaction between male and female origin on the probability of to new environments [68,69], especially in the context of a copulation or its outcome. Invasive males and females have thus biological invasion, where genetic diversity that may have higher reproductive success regardless of the origin of their decreased during the introduction process could be restored partner. This result matches well the theoretical expectations in [18,70]. this particular evolutionary context [4,54]. Contrary to expecta- Finally, we were interested in determining whether native and tions [41] we found no evidence of inbreeding behaviour during invasive individuals displayed different levels of inbreeding pre- nor post-copulation competition processes in native or avoidance. Facon et al. [41] found that native populations of H. invasive populations, suggesting that another mechanism would axyridis displayed inbreeding depression, whereas invasive popula- exist at least in native populations [74]. More work is needed to tions did not, probably due to the occurrence of a purging process test this assumption. We hope that this study will stimulate further during invasion. Although we expected direct inbreeding avoid- research into the evolution of reproductive strategy and associated ance behaviour to occur, at least in the native populations, this traits during invasion processes. study provided no evidence of such mechanism in H. axyridis.On the contrary, we found that the brothers of the females tested had Supporting Information a slight, but significant advantage over the other males, increasing the likelihood of copulating first with their sisters, in both native Table S1 Summary table of the copulation results. * Population and invasive populations. This advantage might only genuinely of origin: Chi: China, Jap: Japan, Hun: Hungary, Can: Canada, exist in the Japanese population studied, but we cannot tell if it SAf: South Africa. { Number of females that laid eggs. { Number reflects a particular feature of the Japanese population as we used of which copulated with their brother first. " Number of females only two native populations. Regardless, we found no trend for with viable eggs. 1 Number of females with genotyped larvae. The individuals to avoid copulation with siblings in any population, last three columns only include females that copulated during the and the weak negative impact of kinship on paternity did not seem first hour, i.e. for which first copulation data were available. to be strong enough to be considered as an actual direct (DOCX) mechanism of inbreeding avoidance. The probability of encounter Figure S1 Design of the mate choice experiment. Each of a sibling may be low in the field, for instance, if dispersal occurs female was placed in a Petri dish containing four males: a full before sexual maturity [71,72] as it occurs in H. axyridis [73]. This sibling, another unrelated male from the same population and two might explain why H. axyridis individuals have no mechanisms for males from other populations, one native and one invasive. The preventing copulation between full siblings in the conditions of our identity of the first male to mount the female was recorded during experiment. Besides invasive females are, on average, more fecund the first hour and the insects were then left to copulate freely for when fertilised with their brothers contrary to native ones. This the next 47 hours. The males were then removed and the females result could be linked with the absence of the cost imposed by were left alone for 23 days after the laying of the first clutch of inbreeding depression in invasive populations [73], and might be eggs. During this period, female fecundity was recorded and the explained by kin selection in a context of mate limitation such as hatching rate of the eggs was estimated from at least one early and expected in the first steps of invasion or at the invasion front. one late clutch. The paternity of eight second-instar larvae was In conclusion, reproductive traits are expected to evolve during assessed by molecular analysis, in two clutches laid at least 10 days the invasion process as a result of changes in population densities apart. and selective pressures. Our study shows that invasive populations (TIFF)

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Figure S2 Effect of being the first male to copulate with Appendix S1 Details of the statistical model of compe- a given female on percentage of paternity within the tition. female’s offspring. A: Observed percentage paternity of the (DOCX) first male to copulate with native and invasive females. Red dashed lines are the values expected under the null hypothesis. B: Model Acknowledgments estimates of the effect of being the first male to copulate with a female on percentage paternity, with corresponding 95% confi- We thank Denis Bourguet, Cathleen Thomas, Stefan Toepfer, Julie dence intervals. The expected effect with the null model is zero for Turgeon, and G. Prinsloo for sampling efforts, and Wang Su, Tamsin Majerus, Wolf Blackenhorn and two anonymous reviewers for helpful both native and invasive females. The effect is significant in both comments. All molecular data were generated at the molecular genetic cases, but the difference between native and invasive females is not analysis technical facilities of the Environment and Biodiversity IFR 119 at significant (see models P1 and P2 in Tables 2 and 4). Montpellier (France). (TIFF) Dataset S1 Experimental data used in this study. This Author Contributions spreadsheet contains the results of the copulation experiments as Conceived and designed the experiments: BF AE. Performed the well as the paternity assignment obtained from microsatellite experiments: GJML BF AE AL AT. Analyzed the data: GJML GLM BF genotypes. AE. Contributed reagents/materials/analysis tools: GJML AT AL. Wrote (ODS) the paper: GJML BF AE GLM NO.

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Résumé :

La lutte biologique est souvent présentée comme une méthode de lutte contre les ravageurs respectueuse de l’environnement, même si la lutte par acclimatation (introduction d’une espèce exotique) peut être à l’origine d’invasion biologique. La coccinelle asiatique Harmonia axyridis Pallas (Coleoptera : Coccinellidae) a été utilisée comme agent de lutte biologique introduit en Amérique et en Europe pour lutter contre les pucerons. Actuellement, cette espèce est considérée comme envahissante, et a des impacts négatifs sur l’environnement. L’objectif principal de cette thèse est d’améliorer notre connaissance des processus évolutifs pouvant accompagner l’élevage en captivité, ainsi que ceux qui sont liés aux invasions biologiques. J’ai pour cela utilisé une approche expérimentale au travers d’études permettant de caractériser les différences de traits d’histoire de vie entre les trois compartiments populationnels d’H. axyridis (populations natives, envahissantes et de lutte biologique). Les résultats obtenus montrent que les changements évolutifs les plus importants concernent le compartiment de lutte biologique par rapport aux compartiments sauvages (natifs et envahissants). Ce compartiment a subi des changements phénotypiques remarquables en réponse aux conditions d’élevage en laboratoire. Les changements évolutifs les plus spectaculaires concernent différents traits liés à la reproduction. Par exemple, les femelles de lutte biologique se reproduisent plus tôt, ont une fécondité journalière plus élevée, ainsi qu’une longévité et une durée de vie reproductive plus courte. Nous avons également mis en évidence des changements évolutifs entre des populations sauvages natives et envahissantes. Les adaptations aux conditions d’élevage peuvent parfois être désavantageuses dans l’environnement naturel. Par exemple, la résistance au froid et aux pathogènes est moins importante que celle des populations sauvages. Nos résultats montrent aussi que, même si la souche de lutte biologique européenne est incapable de s’implanter dans la nature, l’hybridation avec les populations envahissantes américaines pourrait avoir jouer un rôle positif au cours de l’invasion en Europe.

Mots clés : lutte biologique, invasion biologique, Harmonia axyridis, populations sauvages, natives, envahissantes, traits d’histoire de vie, changements évolutifs, et hybridation.

Summary:

Biological control is generally considered as an environmentally low-impact solution for pest control. However, the use of foreign control agents may ultimately lead to undesired biological invasions. The Asian harlequin ladybird Harmonia axyridis Pallas (Coleoptera: Coccinellidae) was originally used as a biological control agent of aphids in North America and Europe. This species is now considered as invasive, and can have harmful effects on the environment. The main objective of this thesis is to better understand the impact of mass rearing on life-history traits, with a focus on traits that may be associated with invasion success. To do so, experimental approaches were carried out to monitor changes in life-history traits for three types of populations (biocontrol, native or invasive). The corresponding results indicate that the most important evolutionary changes occur in the biocontrol populations (by contrast with the invasive and native populations). Mass rearing appears to induce significant phenotypic changes in the biocontrol populations, with the most spectacular changes being related to reproductive life-history traits. For instance, biocontrol females reproduce significantly earlier, have a higher daily fecundity, but also exhibit lower life expectancy and lower reproductive lifespan. We also evidence other differences between the native and invasive populations. Cold tolerance and pathogen resistance are also lower in biocontrol populations than in wild populations. Altogether, our findings indicate that adaptations to mass rearing conditions may affect the fitness of H. axyridis populations in natural environments. This suggests that, even if the European biocontrol strain is unable to successfully colonize a natural environment, it may nonetheless impact the invasion dynamics of the species in Europe thanks to the admixture with the invasive American population.

Keywords: biocontrol populations, biological control, biological invasion, evolutionary changes, Harmonia axyridis, hybridization, invasive populations, life-history traits, native populations.

Ashraf Tayeh Centre de Biologie pour la Gestion des Populations (CBGP) Campus International de Baillarguet. CS30016, 34988 Montferrier sur Lez. France.