Fey Aus Wiesbaden

Aus der

Medizinischen Klinik und Poliklinik I der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. G. Ertl

Effekte von Paricalcitol auf Inflammation und Kalzifikationsregulation bei Hämodialysepatienten

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von Holger Fey aus Wiesbaden

Würzburg, Mai 2013 Referentenblatt

Referent: Professor Dr. med. Christoph Wanner

Koreferent: Professor Dr. med. Franz Jakob

Dekan: Professor Dr. med. Matthias Frosch

Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2014

Der Promovend ist Arzt

Gewidmet meiner Mutter

Inhaltsverzeichnis ______

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1 1.1 Mortalität bei chronischer Niereninsuffizienz 1 1.2 Inflammation bei chronischer Niereninsuffizienz 5 1.3 Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz 10 1.4 Vitamin D und Vitamin D-Rezeptor-Aktivatoren (VDRA) 19 1.4.1 Einfluss auf Inflammation 27 1.4.2 Einfluss auf Kalzifikation 29 1.5 Surrogatparameter für Inflammation und Kalzifikation 32 1.5.1 Hochsensitives CRP (hsCRP) 32 1.5.2 Fetuin A 34 1.5.3 Matrix Gla Protein (MGP) 36 1.5.4 Fibroblast-Growth-Factor-23 (FGF-23) 38 1.5.5 Hepcidin 40 1.6 Ziel der Untersuchung 41 2 Material und Methoden 42 2.1 Studiendesign 42 2.2 Studienteilnehmer 44 2.3 Studiendurchführung 47 2.3.1 Studienmedikation 48 2.3.2 Unerwünschte Ereignisse 49 2.3.3 Abbruchkriterien 49 2.3.4 Gewinnung, Aufbereitung und Versand der Blutproben 49 2.4 Laboranalytik 51 2.5 Statistische Auswertung 52 2.5.1 Analyse der Zielparameter 52 2.5.2 Analyse der Sicherheitsvariablen 55 3 Ergebnisse 56 3.1 Studienteilnehmerfluss 56 3.2 Ergebnisse der Analyse der Zielparameter 57 3.2.1 Ergebnisse der Analyse von hsCRP 58

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3.2.2 Ergebnisse der Analyse von Fetuin A 60 3.2.3 Ergebnisse der Analyse von FGF-23 62 3.2.4 Ergebnisse der Analyse von t-ucMGP 65 3.2.5 Ergebnisse der Analyse von Hepcidin 67 3.3 Ergebnisse der Analyse der Sicherheitsparameter 69 3.3.1 Ergebnisse der Analyse von PTH intakt 69 3.3.2 Ergebnisse der Analyse von Kalzium 71 3.3.3 Ergebnisse der Analyse von Phosphat 72 3.3.4 Ergebnisse der Analyse von Albumin 74 3.4 Unerwünschte Ereignisse (UE) 75 4 Diskussion 77 5 Zusammenfassung 87 6 Literaturverzeichnis 89 7 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 127 8 Anhang 130 8.1 Rohmessdaten von hsCRP 130 8.2 Rohmessdaten von Fetuin A 131 8.3 Rohmessdaten von t-ucMGP 132 8.4 Rohmessdaten von FGF-23 133 8.5 Rohmessdaten von Hepcidin 134 9 Danksagung 10 Curriculum Vitae

Einleitung ______

1 Einleitung

1.1 Mortalität bei chronischer Niereninsuffizienz

Die Mortalität bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und insbesondere bei Dialysepatienten ist hoch. Es zeigt sich zwar in den letzten Jahren möglicherweise aufgrund therapeutischer Verbesserungen ein Trend zur Verringerung der Mortalitätsrate bei Dialysepatienten1,2. Dennoch ist die Mortalitätsrate von Dialysepatienten in den USA, welche 65 Jahre oder älter sind, fast sieben mal höher als die in der Allgemeinbevölkerung1. Die Todesrate von Dialysepatienten liegt bei bis zu 20 % pro Jahr2. Hinsichtlich der Ursachen der hohen Mortalitätsrate zeigt sich sowohl in den USA als auch in Europa ein in den letzten Jahrzehnten weitgehend übereinstimmendes Bild. Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die eindeutig dominierende Todesursache dar1-4. Abbildung 1.1 zeigt eine Häufigkeitsverteilung der verschiedenen Mortalitätsursachen bei Dialysepatienten innerhalb der ersten drei Jahre nach Dialysebeginn in einer europäischen Kohorte4:

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Abbildung 1.1: Häufigkeitsverteilung der Mortalitätsursachen bei Dialysepatienten4.

Die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei chronischer Niereninsuffizienz lässt sich in vier verschiedene Gruppen einteilen5:

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1. Koronare Herzkrankheit und Myokardinfarkt 2. Kongestive Herzinsuffizienz 3. Zerebrovaskuläre Erkrankungen, Schlaganfall, Vorhofflimmern, AVK 4. Plötzlicher Herztod

Ein Hauptfaktor der enorm hohen kardiovaskulären Mortalität ist die ischämische Herzerkrankung, welche in den Untersuchungen der HEMO-Studie bei 39% aller Hämodialysepatienten prävalent war6. Die Begründung hierfür ist komplex und unterscheidet sich von der für die Allgemeinbevölkerung. Die Risikofaktoren der klassischen, koronaren Atherosklerose der Allgemeinbevölkerung sind gut untersucht und haben Eingang in die Anwendung verschiedener klinischer Scoring-Systeme gefunden (PROCAM7, Framingham8, SCORE9). Zu den klassischen koronaren Risikofaktoren gehören demnach Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Nikotinabusus und Hyperlipoproteinämie (Hypercholesterinämie, Hypertriglyzeridämie). Als prädisponierende Risikofaktoren gelten unter anderem Alter, Geschlecht und positive Familienanamnese bzgl. stattgehabter Myokardinfarkt. In der Dialysepopulation sind ein Teil dieser Faktoren ebenfalls von ätiologischer Bedeutung hinsichtlich der hohen kardiovaskulären Mortalität. So ist die Prävalenz von Diabetes mellitus (etwa 50%) und arterieller Hypertonie (etwa 75%) bei Dialysepatienten sehr hoch und erhöht damit die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Herzerkrankung deutlich10. Dies liefert zumindest eine Teilerklärung für die hohe Mortalitätsrate. In Bezug auf die Therapie einer Hyperlipoproteinämie bei Dialysepatienten mit Statinen gibt es keine eindeutige Evidenz für einen Nutzen derselben. So konnte in der 4D-Studie11 und der AURORA-Studie12 kein signifikanter Effekt einer Statintherapie bei Dialysepatienten auf kardiovaskuläre Endpunkte eruiert werden. In der SHARP-Studie13 konnte zwar eine signifikante Reduktion der kardiovaskulären Ereignisse unter Senkung des Low Density Lipoprotein (LDL)- Cholesterols bei Patienten mit fortgeschrittener, chronischer Niereninsuffizienz gesehen werden. Bei den teilnehmenden Dialysepatienten zeigte sich jedoch diesbezüglich ein deutlich geringerer und nicht signifikanter Effekt. Die Ursache

2 Einleitung ______hierfür könnte möglicherweise an der deutlich geringeren Senkung des LDL- Cholesterols bei gleicher Dosierung der Studienmedikation im Vergleich zu den Nicht-Dialysepatienten liegen. Auch der Risikofaktor Nikotinabusus wurde mittels einer Metaanalyse untersucht. Hierbei zeigte sich zwar, dass Rauchen die Gesamtmortalität erhöht, jedoch überraschenderweise nicht die kardiovaskuläre Mortalität14. Der prädisponierende Risikofaktor Alter konnte auch für Dialysepatienten nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich bei dieser Analyse, dass vor allem bei jungen Patienten zwischen 25-35 Jahren ein enorm erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Mortalität (altersentsprechend etwa 500-fach erhöht) im Vergleich zu älteren Patienten über 85 Jahren (altersentsprechend etwa 5-fach erhöht) verglichen mit der Allgemeinbevölkerung besteht (siehe Abbildung 15 1.2) . Einleitung

Abbildung 1.2: Altersabhängige kardiovaskuläre Mortalität bei Dialysepatienten15. 7 Abbildung 4: Jährlichen Mortalitätsrate bei Hämodialyse Patienten. Die geschlechtsspezifischen Unterschiede hinsichtlich kardiovaskulärer Mortalität mit Risikoerhöhung bei Männern sind auch bei Dialysepatienten nachweisbar.!"# $%&'()*+,%-./(%/0.$12.3/4(4&/%5.6/(.7(8+94/.18&(/%& Allerdings erscheinen diese deutlich weniger ausgeprägt/%. als in 16 derNeben Allgemeinbevölke vielen anderen Nebenwirkungenrung . einer Nierenersatztherapie steht häufig die rena- Diele Anämie chronische im Vordergrund, Niereninsuffizienz die durch selbstErythropoietin ist zusammen (EPO) Mangel,mit der toxisch-urämischeAlbuminurie ein 17 erheblicher,Abbauprodukte unabhängiger und eine verkürzte Risikofaktor Überlebenszeit für kardiovaskuläre der Erythrozyten Mortalität von 25-50%. Grund mit folglicher Hämolyse hervorgerufenen wird. Da eine gesunde Niere im Regelfall nicht nur für die Ausscheidung von Giftstoffen und die Regelung des Säure-Base-Haushaltes 3 verantwortlich ist, sondern über das Hormon Erythropietin auch die normale Blutbil- dung im Knochenmark reguliert, kommt es bei vielen Patienten regelhaft zur Anämie. Die oben genannten Urämietoxine und chronische Entzündungen führen zu einer verminderten Ansprechbarkeit der erythrozytären Vorläuferzellen auf EPO. Die meisten schwer nierenkranken Patienten erhalten daher seit mehr als 20 Jahren gentechnologisch hergestelltes Erythropoietin. Ein Behandlungsziel sollte laut aktueller Leitlinien zur Nierenersatztherapie dabei sein, den Hämoglobin Wert von 11 g/dl nicht dauerhaft zu unterschreiten, sowie mindestens ein Serum Ferritin > 100 µg/l, einen Hämatokrit von 33 % und eine Transferrinsättigung (TSAT) > 20 % zu erreichen.8 Einige der Patienten leiden unter einer, von der Dialysebehandlungsdauer abhängigen Resistenzentwicklung gegen Erythropoietin-stimulierende Substanzen (EPO = erythropoietin stimulating agents). Von einer Therapieresistenz gegen EPO kann ausgegangen werden, wenn die

4 Einleitung ______hierfür sind spezifische Mechanismen, die vornehmlich bei Vorhandensein einer chronischen Niereninsuffizienz zum Tragen kommen. Einen niereninsuffizienzassoziierten, spezifischen Mechanismus stellt die chronische, systemische Inflammation dar. Es ist nachgewiesen, dass erhöhte Akut-Phase-Proteine offensichtlich die Akzeleration einer Atherosklerose mitbedingen und damit die kardiovaskuläre Mortalität erhöhen18. Des Weiteren wird offensichtlich die linksventrikuläre Hypertrophie und Dysfunktion mit beeinflusst19,26. Die Ursache der Inflammation ist multifaktoriell und die Folgen vielfältig (s. Kapitel 1.2). Ein weiterer wichtiger Risikofaktor kardiovaskulärer Mortalität ist die Störung des Kalzium-Phosphathaushaltes infolge eines sekundären Hyperparathyreoidismus bei chronischer Niereninsuffizienz20. Diese Störung ist assoziiert mit extraossärer Kalzifikation, welche insbesondere auch das Gefäßsystem betrifft (siehe Kapitel 1.3). Die renale Anämie bedingt linksventrikuläre Hypertrophie und Dysfunktion21 und gilt als kardiovaskulärer Risikofaktor22. Allerdings ist eine überschießende Korrektur der Hämoglobinspiegel mittels Erythropoese-stimulierender Substanzen (ESA), orientiert an den Hämoglobin(Hb)-Normalbereichen der gesunden Allgemeinbevölkerung, möglicherweise ebenfalls mit einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität behaftet. In der CHOIR-Studie23 (Ziel-Hb 11,3 g/dl vs. 13,5 g/dl) kam es in der Gruppe mit hohem Ziel-Hb-Wert zu einer Übersterblichkeit, was zum Studienabbruch führte. In den Nachfolgestudien CREATE24 und TREAT25 zeigten sich zunächst keine Unterschiede, jedoch waren in letzterer wiederum in der Gruppe mit hohem Ziel-Hb-Wert mehr Schlaganfälle zu verzeichnen. Unklar ist dabei, ob die beobachteten Effekte direkte Folge der höheren Hb-Konzentration oder der höheren ESA-Dosierung waren. Der optimale Hb-Zielwert ist daher weiterhin unklar. Die linksventrikuläre Hypertrophie ist bei dialysepflichtigen Patienten mit einer Prävalenz von über 70% überrepräsentiert und somit in dieser Gruppe ein spezifisches Problem. Ursachen hierfür sind arterielle Hypertonie, Schwankungen des Volumenhaushaltes, renale Anämie, arterielle Gefäßsteifigkeit, Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems,

4 Einleitung ______oxidativer Stress, Inflammation und Stimulation von Wachstums- und Fibrosefaktoren26,27. Die linksventrikuläre Hypertrophie ist nach der koronaren Herzerkrankung der zweitbedeutendste Risikofaktor des plötzlichen Herztodes28 und geht mit einer diastolischen Dysfunktion und Herzinsuffizienz einher29. Die Dialysequalität hat auch einen wichtigen Einfluss auf die kardiovaskuläre Mortalität. So ist evident, dass eine Erhöhung der Dialysedauer30,31 und – frequenz!"#!! und somit der Dialysedosis eine Risikoreduktion bezüglich der Mortalität impliziert. Insgesamt bestehen also bezüglich der Relevanz kardiovaskulärer Risikofaktoren sowohl teilweise Übereinstimmungen, als auch deutliche Disparitäten zwischen Dialysepopulation und Allgemeinbevölkerung34. Diese bestehen wahrscheinlich aufgrund einer unterschiedlichen Ätiologie der kardiovaskulären Schädigung, welche in der chronischen Niereninsuffizienz selbst und ihren Begleiterkrankungen begründet ist. Jedoch sind die zugrundeliegenden Mechanismen nur zum Teil geklärt. Ein anderer Teil ist noch nicht ausreichend verstanden und bedarf der weiteren Forschung.

1.2 Inflammation bei chronischer Niereninsuffizienz

Inflammation ist ein systemischer Zustand des Organismus, welcher durch das Zusammenspiel vieler Faktoren, einschließlich Zytokinen, Komplement sowie Leukozyten, herbeigeführt wird35. Die Prävalenz einer (Mikro-)Inflammation bei Prädialyse- und Dialysepatienten ist mit 32 – 55% sehr hoch und weist genetische, sozioökonomisch und regionale Disparitäten auf36. Meist handelt es sich dabei um einen chronisch persistierenden Zustand. Die Akute-Phase-Reaktion ist das pathophysiologische Hauptphänomen, welches die Inflammation charakterisiert. Zahlreiche Inflammationsmarker sind bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz in Studien untersucht worden. Viele dieser Marker sind oft unspezifisch und werden durch eine Reihe anderer Faktoren mit beeinflusst. Als relativ spezifisch für Inflammation haben sich

5 Einleitung ______hochsensitives C-reaktives Protein (hsCRP, siehe Kapitel 1.5.1) und Interleukin- 6 erwiesen. Tabelle 1.1 zeigt eine Übersicht über die Inflammationsmarker mit Kategorisierung und Hinweis auf Evidenz bezüglich der Vorhersagbarkeit von Progression der Niereninsuffizienz oder Überleben37:

Kategorie Inflammationsmarker Evidenz* Kurze Pentraxine C-reaktives Protein (CRP) +++ Serum-Amyloid P (SAP) + Lange Pentraxine Pentraxin-3 (PTX3) + Neuronale Pentraxine ? Proinflammatorische Interleukin-6 (IL-6) +++ Zytokine Interleukin-1! (IL-1!) + Tumornekrosefaktor-" (TNF-") +/- Interleukin-8 (IL-8) + Interleukin-12 (IL-12) ? Interleukin-18 (IL-18) ? Interferon-# (INF-#) + Antiinflammatorische Interleukin-10 (IL-10) ? Zytokine IL-1 Rezeptorantagonist (IL-1ra) + Interleukin-4 (IL-4) ? Transforming growth factor-! (TGF-!) ? Adipokine Adiponektin ++ und Assoziierte Visfatin + Resistin + Leptin + CD 163 + Adhäsionsmoleküle und Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) ++ endotheliale Marker Vaskulär-celluläres Adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) ++ E-Selektin + Koagulationsmarker Fibrinogen + Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) + Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) + von-Willebrand-Faktor (vWF) + Faktor VII ? D-Dimer ? Inflammatorische Moleküle Albumin +++ mit negativer Transferrin oder totale Eisenbindungskapazität ++ Akute-Phase-Reaktion Eisen ++ Fetuin-A + Inflammatorische HDL inflammatory index (HII) + Lipoproteine Oxidiertes LDL (oxLDL) + Inflammatorische Enzyme Myeloperoxidase (MPO) + Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) + Proinflammatorische Aktivator Protein-1 (AP-1) + Transskriptionsfaktoren Nuclear factor $B (NF-$B) + Andere inflammatorische Serum-Ferritin +++ Marker Serum-Amyloid A (SAA) + Neopterin (Monozyten-/Makrophagen-Aktivator) + Thrombozytenzahl + Leukozytenzahl ++ Neutrophilenzahl + Blutkörperchensenkung (BKS) + * bezüglich Vorhersagbarkeit von Progression der Niereninsuffizienz oder Patientenüberleben

Tabelle 1.1: Bekannte Marker der Inflammation bei chronischer Niereninsuffizienz37.

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Die Ursache von Inflammation bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz ist multifaktorieller Natur. Folgende Mechanismen sind in diesem Zusammenhang identifiziert worden: • Verminderte Clearance von proinflammatorischen Zytokinen. Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass die Serumhalbwertszeit für TNF-!38 und IL-139 nach Nephrektomie erhöht war. Bei Prädialysepatienten konnte eine inverse Korrelation zwischen hsCRP- und IL-6-Konzentrationen und der glomerulären Filtrationsrate (GFR) nachgewiesen werden40,41. Hierbei ist aber unklar, ob es sich vornehmlich um eine verminderte renale Elimination, eine erhöhte Generation bei Urämie oder um einen negativen Effekt von Inflammation auf die Nierenfunktion handelt. • Volumenüberladung mit Endotoxinkumulation. In mehreren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es unter Kongestion bei Volumenüberladung zu einer erhöhten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine kommt42,43,44. Eine potentielle Ursache hierfür könnte in einer vermehrten bakteriellen Translokation aus dem Darm in das Blut bei mesenterialvenöser Kongestion liegen. Anschließend führt die nachfolgende Endotoxinfreisetzung zu einer Immunaktivierung mit Zytokinfreisetzung45. • Oxidativer Stress und Carbonylstress. Die Konzentration von Oxidantien bei Patienten an der Hämodialyse46 und mit Malnutrition47 ist signifikant erhöht. Dies korreliert mit einer vermehrten Produktion von inflammatorischen Zytokinen46. Oxidativer Stress könnte in Form von oxidiertem LDL ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von endothelialer Dysfunktion und Atherogenese sein48. Proteine können auch durch Carbonylgruppen modifiziert werden, welche durch Autoxidation von Kohlenwasserstoffen, Lipiden oder Aminosäuren entstehen49. Ein Produkt dieses sogenannten Carbonylstress sind Advanced Glycation Endproducts (AGE), welche bei chronischer Niereninsuffizienz vermehrt anfallen und ebenfalls mit Inflammation und Malnutrition assoziiert sind50. • Erniedrigte Serumkonzentrationen von Antioxidantien. Es gibt Hinweise, dass die Aufnahme von Vitamin C und Carotinoiden mit der Nahrung bei Hämodialysepatienten vermindert ist. Ein Grund hierfür könnte in der

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erforderlichen Kaliumrestriktion bei der Nahrungsaufnahme liegen51. Des Weiteren gibt es Hinweise, dass niedrige Serumkonzentrationen von Vitamin C mit einer erhöhten Rate an kardiovaskulären Ereignissen assoziiert sein könnten52,53. • Urämietoxine. Einige retinierte, urämische Solute scheinen ebenfalls eine modulierende Wirkung auf das Immunsystem zu haben. So konnten für Guanidinverbindungen sowohl pro- als auch antiinfammatorische Effekte auf Leukozyten nachgewiesen werden, was sowohl die erhöhte Inflammationsaktivität als auch die bekannte Infektanfälligkeit bei Urämikern erklären könnte54. • Akzelerierte Atherosklerose. Möglicherweise führt auch die vaskuläre Kalzifikation durch die Störung des Kalzium-Phosphat-Haushaltes im Rahmen einer chronischen Niereninsuffizienz zu lokaler Inflammation55. • Assoziierte Komorbiditäten. Im Zusammenhang mit der chronischen Niereninsuffizienz kann auch das gehäufte Auftreten von Parodontalerkrankungen56, Autoimmunerkrankungen57, HIV58 und subklinischen, persistierenden Infektionen bei allgemein erhöhter Infektanfälligkeit59 zu vermehrter Inflammation führen. • Hämodialyse-assoziierte Aspekte. Die Exposition von Blut gegenüber Hämodialysemembranen, insbesondere solchen mit niedriger Biokompatibilität, geht nachweislich mit erhöhten Inflammationsparametern einher60,61. Des Weiteren kann eine bakterielle Kontamination des Dialysates62,63 und des Dialysezuganges64,65 eine erhöhte entzündliche Aktivität bedingen. • Peritonealdialyse-assoziierte Aspekte. In diesem Zusammenhang stellen neben der Peritonitis und der Katheterinfektion offensichtlich auch die Bioinkompatibilität des Dialysates, die Volumenüberladung und der Verlust der Nierenrestfunktion wichtige Faktoren der Inflammation dar66. • Nierentransplantation. Es gibt Hinweise darauf, dass ein nicht entferntes Nierentransplantat nach Transplantatversagen bei Dialysepatienten mit einer chronischen Inflammation assoziiert ist. Als Folge einer Resektion könnte es zu einer Remission kommen67.

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• Genetische Risikofaktoren, welche mit Inflammation und oxidativem Stress assoziiert sind68. Hinsichtlich der Folgen, welche durch vermehrte Inflammation entstehen, scheinen die proinflammatorischen Zytokine IL-6, TNF-! und das antiinflammatorische Zytokin IL-10 eine zentrale pathogenetische Rolle zu spielen69. In Tabelle 1.2 sind die Effekte dieser Zytokine in Bezug auf die Atherosklerose und Katabolie dargestellt:

Zytokine Atherosklerose Katabolie IL-10 Herunterregulierung von Adhäsionsmolekülen - Herunterregulierung proinflammatorischer Zytokine - Inhibition der Sauerstoffradikalproduktion - Reduktion der Metalloproteinaseproduktion - Inhibition chemotaktischer Proteine - IL-6 Hochregulation von Adhäsionsmolekülen Verlust von Muskelproteinen Verminderte Adiponektinexpression Inhibition des insulin-like-growth-factor-1 (IGF-1) Herunterregulierung der Chemokinproduktion Appetitzügelung Verursacht endotheliale Dysfunktion - TNF-! Herunterregulierung von Apolipoprotein E Verlust von Muskelproteinen Förderung vaskulärer Kalzifikation Suppression von MyoD*-mRNA Verursacht endotheliale Dysfunktion Aktiviert das Ubiquitin-Proteasom-System Stimulation oxidativer Reaktionen mit NADPH Appetitzügelung Förderung der Insulinresistenz - * = Myogenic Differentiation 69 Tabelle 1.2: Effekte von IL-6, TNF-!, IL-10 in Bezug auf Atherosklerose und Katabolie .

Inflammation ist ein großer Risikofaktor für Mortalität. Im Vordergrund steht hierbei wiederum die kardiovaskuläre Mortalität18. In diesem Zusammenhang stellt Inflammation einen wichtigen und grundlegenden Mechanismus bei der Akzeleration einer Atherosklerose für Patienten mit und ohne chronische Niereninsuffizienz dar70. Zwischen Inflammation und Malnutrition scheint offenbar eine wechselseitige Beziehung zu bestehen. Inflammation führt einerseits zu Malnutrition71 mit Reduktion der Albuminsynthese, unabhängig von der Protein-Katabolie-Rate (PCR) respektive Proteinzufuhr72, und zu einer Reduktion der Cholesterolproduktion73,74. Beides geht bei Dialysepatienten mit einem erhöhten Mortalitätsrisiko einher75. Ursächlich für die Reduktion der Proteinsynthese (Albumin, Transferrin) mit Gewichtsverlust könnte eine Verschiebung hin zur Produktion von Akute-Phase-Proteinen (CRP, Fibrinogen, SAA) infolge der Wirkung von IL-6 sein76. Andererseits bedingt Malnutrition möglicherweise auch

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Inflammation. Ursächlich hierfür könnten eine verminderte Antioxidantienzufuhr51, eine verschlechterte Immunabwehr77 und eine verminderte Endotoxinbindung infolge von Hypocholesterinämie78 sein. Des Weiteren spielt Inflammation bei der Hyporesponsivität auf ESA-Therapie bei Dialysepatienten eine Rolle79 und geht auch mit einer verminderten Lebensqualität einher80. Zahlreiche pharmakologische Therapiestrategien mit unterschiedlichsten Wirkmechanismen sind bezüglich Beeinflussung der Inflammation bei chronischer Niereninsuffizienz vorstellbar. Bisher sind diese Therapieoptionen noch nicht ausreichend untersucht worden und Resultate, welche eine positive Auswirkung auf klinische Endpunkte zeigen, fehlen. Es existiert somit aktuell keine etablierte und zugelassene antiinflammatorische Therapie81.

1.3 Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz

Die extraossäre Kalzifikation ist ein Phänomen, welches im Vergleich zur Prävalenz der Allgemeinbevölkerung gehäuft bei chronischer Niereninsuffizienz auftritt82. Hiervon sind offensichtlich alle Altersklassen betroffen, insbesondere aber auch junge Dialysepatienten83. Als Hauptrisikofaktoren für Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz gelten fortgeschrittenes Alter, systemische Inflammation, Diabetes mellitus, Hyperphosphatämie, Hyperkalzämie respektive inadäquat hohe Kalziumzufuhr und Zeitdauer der Dialysetherapie84. Die Pathogenese der extraossären Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz ist nur in Teilen verstanden. Üblicherweise wurde hierfür früher die Störung des Kalzium-Phosphathaushaltes, welche infolge des sekundären Hyperparathyreoidismus (sHPT), der verminderten renalen Phosphatelimination und vermehrten Kalziumzufuhr im Rahmen der Phosphatbindertherapie auftritt, als entscheidender Mechanismus für Kalzifikation angenommen84,85,86. Dabei war auch postuliert worden, dass es sich bei der extraossären Kalzifikation alleinig um eine passive Präzipitation infolge einer Übersättigung mit Kalzium- und Phosphationen handeln müsse.

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Jedoch liegen selbst normale Serumkonzentrationen von Kalzium und Phosphat weit über ihrem Löslichkeitsprodukt in Wasser69. Die Löslichkeit von Kalzium und Phosphat ist im Serum jedoch deutlich besser. Einerseits wird dies durch pH-Wert, Körpertemperatur und die Natriumchlorid-Konzentration erreicht. Andererseits bedarf es aber auch einer aktiven Inhibition der Präzipitation. Zahlreiche dieser Inhibitoren und auch Induktoren der Kalzifikation konnten in den letzten Jahren identifiziert werden87. Als Induktoren von extraossärer Kalzifikation sind bekannt: • Kalzium-Phosphat-Produkt: Einerseits stellen hohe Kalzium- und Phosphatkonzentrationen möglicherweise das Substrat für passive Präzipitation dar. Andererseits konnte in vitro gezeigt werden, dass hohe Phosphatkonzentrationen eine osteogenen Transdifferenzierung der glatten Gefäßmuskelzellen und eine Deposition von Hydroxalapatit induzieren können88. Die phänotypische Veränderung hin zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen konnte über den Nachweis der Produktion knochenspezifischer Transkriptionsfaktoren, Proteinen und von Matrixvesikeln gezeigt werden. Ein ähnlicher Effekt konnte ebenfalls in vitro für hohe Kalzium- Konzentrationen nachgewiesen werden89. In einer experimentellen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass in Bezug auf Regulation der Knochenmineralisation und extraossärer Verkalkung der Phosphatkonzentration eine Schlüsselrolle zukommt90. • TNF-! und andere Zytokine: Proinflammatorische Bedingungen scheinen identische Veränderungen in Bezug auf osteogene Transdifferenzierung der glatten Gefäßmuskelzellen wie Phosphat zu induzieren. Dies konnte in vitro für TNF-!91 und auch für andere proinflammaorische Zytokine wie Oncostatin-M, welches zur IL-6-Unterfamilie zählt, und INF-"92 nachgewiesen werden. TNF-! führt offensichtlich zu einer Hochregulierung des knochenmorphogenen Protein-2 (BMP-2)93. Bei BMP-2 handelt es sich um einen Förderer der osteogenen Transdifferenzierung, der genaue funktionelle Zusammenhang ist aber noch nicht hinreichend erforscht94.

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• Hochdosiertes, aktives Vitamin D: Sowohl in vitro als auch in vivo konnte gezeigt werden, dass hochdosiertes, aktives Vitamin D Kalzifikation induzieren kann (siehe Kapitel 1.4.2). • Advanced Glycation Endproducts (AGE): In einer Zellkultur von Perizyten konnte gezeigt werden, dass AGE eine osteogene Transdifferenzierung dieser Zellen induzieren kann95. • Leptin: Es konnte in vitro nachgewiesen werden, dass Leptin eine osteogene Transdifferenzierung und damit eine Kalzifikation von Gefäßen induzieren kann96. • Genetische Faktoren: In zwei Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen Kalzifikation und genetischen Polymorphismen gibt97,98. Polymorphismen von TNF99, E-Selectin S128R100 und angiotensin I-converting enzyme (ACE)101 konnten mit Kalzifikation assoziiert werden. Die Identifizierung weiterer Faktoren bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Faktoren, welche mit der Förderung von Kalzifikation assoziiert sind, aber wahrscheinlich keine selbstständigen Induktoren darstellen. In mehreren Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass sehr hohe Plasmakonzentrationen an Parathormon (PTH) mit Kalzifikation bei hohem Knochenumsatz assoziiert sind. Es ist jedoch unklar, ob es sich dabei um einen direkten oder indirekten Effekt, etwa durch Erhöhung des Kalzium-Phosphat- Produktes oder durch Verminderung der Konzentrationen von Matrix Gla Protein (MGP) und Pyrophosphat, handelt102. Umgekehrt sind auch ein niedriger Knochenumsatz im Rahmen einer adynamen Knochenerkrankung und niedrige PTH-Plasmakonzentrationen mit Kalzifikation assoziiert, was möglicherweise mit der fehlenden Pufferwirkung des Knochens auf die Kalzium- und Phosphatkonzentration zu erklären ist103. Diese Beobachtungen könnten zumindest teilweise eine Erklärung für die U-förmig Beziehung zwischen PTH- Plasmakonzentration und Mortalität liefern104. Unter der Stimulation durch PTH sezernieren hauptsächlich Osteoblasten den „receptor for activation of NF-#B (RANK) ligand“ (RANKL), welcher über den

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Rezeptor RANK Osteoklasten stimuliert105. Die Freisetzung von RANKL kann des Weiteren durch die Entzündungsmediatoren IL-1$, Il-6 und Prostaglandin 106 E2 (PGE2) sowie Glukokortikoide als auch aktives Vitamin D stimuliert und durch Calcitonin gehemmt werden107. Gleichzeitig wird von verschiedenen Zellen das antagonistische Osteoprotegerin (OPG) sezerniert108. Unter normalen Bedingungen entsteht ein dynamisches Gleichgewicht, das über Knochenauf- und -abbau entscheidet. Im Rahmen der chronischen Niereninsuffizienz kommt es zu einem Ungleichgewicht (Hyperparathyreoidismus, Inflammation) mit Überwiegen RANKL-freisetzender Faktoren. Über die RANK-Aktivierung kommt es zu Knochenabbau und Freisetzung von Kalzium und Phosphat, was damit indirekt den Kalzifikationsprozess unterstützen kann. Möglicherweise spielt das OPG/RANKL-System eine zentrale Rolle in der Regulierung des Knochenstoffwechsels und Kalzifikationsprozesses109. Des Weiteren bildet die Fibroblast-Growth-Factor-23 (FGF-23) / Klotho-Achse ein wichtiges Regulationssystem in Bezug auf die Phosphatbilanz und die Synthese von aktivem Vitamin D. Dieses System ist somit indirekt in den Kalzifikationsprozess involviert, aber auch im Rahmen sehr seltener Erkrankungen selbst daran beteiligt (siehe Kapitel 1.5.4). Als Inhibitoren von extraossärer Kalzifikation sind bekannt: • Fetuin-A: Das Schlüsselprotein der systemischen Präzipitationsinhibition, welches mit Kalzium und Phosphat sogenannte Calciprotein-Partikel bildet (siehe Kapitel 1.5.2). • Matrix Gla Protein (MGP): Dieses Protein hemmt die Verkalkung in Gefäßen, Knorpel und Herzklappen. Seine Aktivierung ist Vitamin K- abhängig (siehe Kapitel 1.5.3). • Osteoprotegerin (OPG): Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass eine Defizienz von OPG mit vermehrter Kalzifikation bei gleichzeitiger Osteoporose einhergeht. Dabei ist jedoch unklar, ob die Kalzifikation nur eine Folge der hohen Freisetzung von Kalzium und Phosphat augrund fehlender RANKL-Inhibition ist oder ob OPG lokale Kalzifikations- inhibitorische Eigenschaften in der Gefäßwand, ähnlich wie MGP, besitzt110.

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• Pyrophosphat: Seit langem ist bekannt, dass anorganische Pyrophosphate die Präzipitation von Kalzium und Phosphat hemmen111. Dabei wird die lokale Pyrophosphatkonzentration von drei Faktoren reguliert112. Das Enzym „Ekto-Nukleotide-Pyrophosphatase / Phosphodiesterase-1“ (ENPP-1) und der Transmembranrezeptor kodiert vom „progressive ankylosis locus“ (ANK) fördern die lokale Freisetzung von Pyrophosphat. Eine Mutation mit Funktionsverlust von ENPP-1 führt zur idiopathischen infantilen arteriellen Kalzifikation, welche mit ubiquitärer vaskulärer Verkalkung bei Neugeborenen und Kleinkindern einhergeht113. Im Tierversuch konnte gezeigt werden das eine ANK-Defizienz mit generalisierter Kalzifikation, vor allem in periartikulären Geweben, assoziiert ist114. Die membrangebundene gewebeunspezifische alkalische Phosphatase (TNAP) führt zur Hydrolyse und damit zur Inaktivierung von Pyrophosphat. Dabei wird Phosphat freigesetzt, welches wiederum Kalzifikation induzieren kann112. Eine tierexperimentelle Untersuchung zeigte, dass möglicherweise ein urämisches Milieu die Aktivität von TNAP erhöhen und somit extraossäre Kalzifikation fördern kann115. • Osteopontin (OPN): Hierbei handelt es sich um ein multifunktionales Protein mit Vorkommen in Zähnen, Knochen und Nieren, welches unter anderem Kalzium und Integrin bindet und das Hydroxylapatitwachstum reguliert. Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass eine Defizienz zu vermehrter Kalzifikation führt116. • Magnesium: Mit Hilfe von Magnesium erfolgt eine Destabilisierung der kristallinen Struktur von Hydroxylapatitverbindungen, was zu verbesserter Löslichkeit beitragen kann117. Im Tierversuch konnte ein inhibitorischer Effekt auf Kalzifikation unter Verabreichung von Magnesium gezeigt werden118. Auch in klinischen Untersuchungen konnte eine signifikante Assoziation zwischen Hypomagnesiämie und Kalzifikation bei Hämodialysepatienten nachgewiesen werden119. • Moderat dosiertes, aktives Vitamin D: Offensichtlich kann moderat dosiertes, aktives Vitamin D Kalzifikation abmildern, respektive inhibieren (siehe Kapitel 1.4.2).

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• PTH related peptide (1-34), PTH (1-34): Experimentell konnte gezeigt werden, dass diese PTH-Fragmente osteogene Transdifferenzierung und vaskuläre Kalzifikation inhibieren120,121. • Knochenmorphogenes Protein-7 (BMP-7): Im Tierversuch konnte nachgewiesen werden, dass BMP-7 zu einer Reduktion von Kalzifikation und Phosphatkonzentration führt122. Damit hat BMP-7 gewissermaßen eine antagonistische Wirkung gegenüber BMP-294. Zusammenfassend sind wahrscheinlich folgende pathogenetische Mechanismen entscheidend für extraossäre Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz87: 1. Passive Präzipitation von Kalzium und Phosphat bei exzessiv hohen Serumkonzentrationen. 2. Hochregulation von Induktoren der zellulären osteogenen Transdifferenzierung und Deposition von Hydroxylapatitverbindungen. 3. Defizienz von Kalzifikationsinhibitoren. Die extraossäre Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz führt zu verschiedenen klinischen Entitäten, welche hauptsächlich das kardiovaskuläre System betreffen. Die vaskuläre Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz unterscheidet sich hinsichtlich Pathogenese und klinischer Manifestation erheblich von der bekannten Atherosklerose in der Allgemeinbevölkerung. Die klassische Atherosklerose der Intima geht mit Hyperplasie infolge Lipideinlagerung und Bildung sogenannter Plaques einher70. Die Gefahr besteht in einer Plaqueruptur, welche zur Organischämie führt. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der extraossären Kalzifikation im Rahmen der chronischen Niereninsuffizienz um eine Ablagerung von Kalziumsalzen. Dabei werden zwei verschiedenen Entitäten von vaskulärer Kalzifikation unterschieden. Zum einen die Kalzifikation der Intima in Nachbarschaft von lipidhaltigen Plaques und zum anderen die der Media, auch bekannt als Mediasklerose Typ Mönckeberg123. Die intimale Kalzifikation in Assoziation mit der klassischen Atherosklerose ist in Bezug auf die klinischen Konsequenzen bislang noch weitgehend unverstanden. Möglicherweise trägt sie aber sogar zu einer

15 Einleitung ______

Plaquestabilisierung bei124,125. Die mediale Kalzifikation ist vermutlich überwiegend das Ergebnis osteogener Transdifferenzierung. Die funktionellen Auswirkungen und prognostische Relevanz wurde in einigen klinischen Studien dargelegt. Die Mediasklerose führt zu einer erhöhten arteriellen Steifigkeit, welche am Herzen eine linksventrikuläre Hypertrophie mit diastolischer Herzinsuffizienz und eine verschlechterte koronare Perfusion bedingt27. Die Steifigkeit kann über die Messung der aortalen Pulswellengeschwindigkeit quantifizierbar abgeschätzt werden126,127. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass eine erhöhte arterielle Steifigkeit einen starken, unabhängigen Prädiktor kardiovaskulärer Mortalität darstellt126,127. Die Mediasklerose ist auch Risikofaktor für eine erhöhte Amputationsrate128. Des Weiteren kann vaskuläre Kalzifikation über den koronararteriellen Kalkscore mittels Computertomographie abgeschätzt werden. Es besteht eine Korrelation zwischen koronararteriellem Kalkscore und der Prävalenz einer angiographisch, nachweisbaren stenosierenden koronaren Herzerkrankung129. Ein erhöhter koronararterieller Kalkscore ist nachweislich ein signifikanter Prädiktor für Mortalität130. Die valvuläre Kalzifikation betrifft in erster Linie die Aorten- und Mitralklappe. Das Vorhandensein eines Vitiums infolge valvulärer Kalzifikation ist ein starker Prädiktor für Mortalität131. Die Folgen myokardialer Kalzifizierung sind bisher nur tierexperimentell untersucht worden. Dabei zeigte sich, dass Verkalkung des Myokards mit diastolischer Dysfunktion, kardialer Fibrose, verminderter Ischämietoleranz und Katecholaminresistenz assoziiert ist und somit möglicherweise einen bisher unterschätzten kardiovaskulären Risikofaktor darstellt132. Die Kalziphylaxie ist eine der schwerwiegendsten Gefäßverkalkungsmanifestationen und geht mit einer äußerst schmerzhaften Nekrotisierung und Ulzeration der Haut einher. Ursächlich hierfür ist eine mediale Kalzifizierung kutaner Arteriolen, weshalb diese Erkrankung auch als kalzifizierende urämische Arteriolopathie (CUA) bezeichnet wird. Es wird eine Assoziation mit dem Vorhandensein eines Hyperparathyreoidismus und der Defizienz von Inhibitoren wie Fetuin A oder MGP, insbesondere infolge einer

16 Einleitung ______

Therapie mit Vitamin K-Antagonisten, vermutet. Es handelt sich um eine lebensbedrohliche Komplikation, die insbesondere aufgrund von Superinfektionen mit septischen Verläufen und einer hohen Letalität einhergeht133. Bei der tumorösen Weichteilverkalkung handelt es sich um eine passive, dystrophe Form der Kalzifikation, welche zumeist das Ergebnis eines abnormen Kalzium-Phosphat-Produktes ist123. Es exisistieren verschiedene Ansätze zur Behandlung von Kalzifikation bei chronischer Niereninsuffizienz. Ein Hauptziel besteht in der Normalisierung erhöhter Serumkonzentrationen von Phosphat134, da erhöhte Werte mit einer gesteigerten kardiovaskulären Mortalität assoziiert sind135. Die Erreichung dieses Ziels erfolgt über diätetische Restriktion136, Phosphatbindertherapie137 und Phosphatentfernung mittels intensivierter Dialyse138. Im Falle einer Hyperkalzämie sollte die Dosis von kalziumhaltigen Phosphatbindern und Vitamin D-Rezeptor-Aktivatoren (VDRA) reduziert beziehungsweise gegebenenfalls abgesetzt werden134. Zur Normaliserung der Serumkonzentrationen von Kalzium und Phosphat ist auch eine adäquate Kontrolle des sHPT erforderlich. Nach aktuellen Empfehlungen sollte sich die Plasmakonzentration von PTH intakt bei Dialysepatienten zwischen dem 2- fachen bis 9-fachen des oberen Normwertes befinden. Zur Erreichung dieses Ziels kann aktives Vitamin D oder ein Kalzimimetikum oder eine Kombination von beidem eingesetzt werden. Bei Versagen dieser konservativen Therapie ist eine Parathyreoidektomie empfohlen134. Für die Gruppe der Kalzimimetika, welche über Modulation des kalziumsensitiven Rezeptors zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit für Kalzium und somit zu verminderter Freisetzung von PTH führen, konnte tierexperimentell gezeigt werden, dass diese Substanzgruppe im Gegensatz zu aktivem Vitamin D in der Lage ist, Kalzifikation bei sHPT zu verhindern139. Insbesondere im Rahmen der Kalziphylaxie scheint Natriumthiosulfat eine möglicherweise wirksame Therapieoption zu sein. Möglicherweise beruht der therapeutische Effekt auf der Chelatbildung mit Kalzium140. Ferner gibt es aber

17 Einleitung ______auch erste Hinweise, dass Natriumthiosulfat die koronararterielle Verkalkung verzögert141. Vitamin K bewirkt die Carboxylierung und damit Aktivierung des inhibitorisch wirkenden MGP (siehe Kapitel 1.5.3). Im Tierexperiment konnte gezeigt werden, dass die Einnahme von Vitamin K-Antagonisten zu vaskulärer Kalzifikation führt. Gleichzeitig erbrachte eine hochdosierte Vitamin K-Einnahme eine Regression der Verkalkung142. Anhand klinischer Daten ist bekannt, dass eine Assoziation zwischen Therapie mit Vitamin K-Antagonisten und valvulärer und koronararterieller Kalzifikation besteht143. Des Weiteren wird eine klinische Assoziation zur Kalziphylaxie postuliert133. Aufgrund dessen stellt Vitamin K eine therapeutische Option bei Kalzifikation dar144. Die Supplementation des inhibitorischen Faktors Magnesium bietet sich in Form von magnesiumhaltigen Phosphatbindern an. Nicht nur eine lokal erniedrigte Konzentration, sondern auch eine erniedrigte Plasmakonzentration von Pyrophosphat ist offensichtlich mit vermehrter Kalzifikation assoziiert145. Gleichzeitig werden im Rahmen der Hämodialyse messbare Mengen an Pyrophosphat entfernt, was eine Defizienz mit verursachen könnte146. Tierexperimentell konnte die intraperitoneale Gabe Kalzifikation inhibieren147. Ob dieser Therapieansatz auch beim Menschen wirksam ist, muss noch untersucht werden. Für die strukturell ähnlichen Bisphosphonate konnten positive Effekte bei Patienten mit koronararterieller Verkalkung148 und bei Kalziphylaxie149 nachgewiesen werden. Jedoch muss bei diesen Substanzen bedacht werden, dass eine Übersuppression des Knochenumsatzes im Sinne einer adynamischen Knochenerkrankung induziert werden kann134 und diese in Bezug auf Kalzifikation einen äußerst ungünstigen Effekt aufweist, da überschüssiges Kalzium und Phosphat nur noch insuffizient vom Knochen gepuffert werden kann103.

18 Einleitung ______

1.4 Vitamin D und Vitamin D-Rezeptor-Aktivatoren (VDRA)

Bei Vitamin D handelt es sich um ein Steroidhormon mit zentraler Bedeutung für den Mineral- und Knochenstoffwechsel. Zur Biosynthese von aktivem Vitamin D respektive Calcitriol sind drei wichtige, störanfällige Schritte erforderlich (siehe Abbildung 1.3).

7-Dehydrocholesterol

UV-B-Bestrahlung (Haut)

Cholecalciferol

25-Hydroxylase (Leber)

25-(OH)-Cholecalciferol (= Calcidiol)

1!-Hydroxylase (Niere)

1,25-(OH)2-Cholecalciferol (= Calcitriol)

Abbildung 1.3: Vereinfachtes Schema des Vitamin D-Metabolismus.

Die im Intermediärstoffwechsel des menschlichen Organismus gebildete natürliche Vorläufersubstanz ist 7-Dehydrocholesterol. Unter Einwirkung von UV-B-Licht der Wellenlänge 290 – 315 nm in der Haut entsteht aus 7-

Dehydrocholesterol das Prävitamin D3. Dieses Prävitamin D3 ist thermisch

19 Einleitung ______instabil, so dass es zu einer Isomerisierung zu Vitamin D3 respektive Cholecalciferol kommt150. Über das Blut wird Cholecalciferol, gebunden an das Vitamin D-bindende Protein (DBP), zur Leber transportiert und dort mittels einer 25-Hydroxylase zu 25-(OH)-Cholecalciferol, respektive Calcidiol, umgewandelt151. Als entscheidendes Enzym für die Katalyse der 25-Hydroxilierung konnte das mikrosomale Cytochrom P450 2R1 identifiziert werden152,153. Dieses scheint keiner relevanten Regulierung unterworfen zu sein, weshalb 25-(OH)- Cholecalciferol ein Indikator für die Vitamin D-Reserven ist. An DBP gebunden wird dieses zur Niere transportiert und dort in den proximalen Tubuluszellen, katalysiert durch eine 1!-Hydroxylase, zu 1,25-

(OH)2-Cholecalciferol respektive Calcitriol umgewandelt. Als entscheidendes Enzym für die 1!-Hydroxylierung konnte das mitochondriale Cytochrom P450 27B1 identifiziert werden. Der Defekt des kodierenden Genes konnte mit der Vitamin D-abhängigen Rachitis Typ 1 assoziiert werden154. Die Expression der 1!-Hydroxylase erfolgt hauptsächlich in den Nieren. Diese konnte jedoch auch in einigen extrarenalen Zellen und Geweben wie Makrophagen, Lunge, Haut, distalem Nephron, Prostata, Kolon, Nebenschilddrüse und anderen Geweben nachgewiesen werden. Dieses extrarenal produzierte Calcitriol ist vor allem ein lokal wirksamer autokriner oder parakriner Faktor für zellspezifische Funktionen und beeinflusst die Blutkonzentration unter normalen Umständen nur unwesentlich155. Die Expression der 1!-Hydroxylase unterliegt einer ausgeprägten Regulation. Die wichtigsten Faktoren, die eine vermehrte Expression direkt fördern, sind unabhängig voneinander eine erhöhte PTH-156, eine erniedrigte Kalzium-157 und eine erniedrigte Phosphatkonzentration158 im Blut. Des Weiteren hemmen hohe Konzentrationen des Phosphatinons FGF-23 die Aktivität der 1!-Hydroxylase159. Calcitriol selbst führt zu einer Verminderung der 1!-Hydroxylase-Aktivität im Sinne einer Rückkopplungshemmung156,160. Gleichzeitig wird die 24-Hydroxylase respektive Cytochrom P 450 24A1 durch die Anwesenheit von Calcitriol induziert, was die Degradation und Inaktivierung von Calcitriol und Calcidiol bewirkt154.

20 Einleitung ______

Calcitriol stellt die aktive Form des Vitamin D dar und ist Ligand des intrazellulären Vitamin D-Rezeptors (VDR). Calcitriol aktiviert dabei den VDR etwa 100-mal stärker als Calcidiol. Der VDR, welcher in den verschiedensten Geweben exprimiert wird, fungiert dabei wie ein Transkriptionsfaktor. Nach Heterodimerisierung mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) erfolgt über die Bindung an spezifische DNA-Sequenzen (Vitamin D response elements = VDRE) eine Translation spezifischer Proteine, die den Mineralhaushalt beeinflussen161. Die Hauptwirkung von aktivem Vitamin D bezieht sich vornehmlich auf den Kalzium-Phosphat-Stoffwechsel: • Darm: Steigerung der Kalzium-162 und Phosphatreabsorption163. • Niere: Steigerung der Kalziumreabsorption im distalen Tubulus, einerseits durch Aktivierung der Transkription der spezifischen

Kalziumtransportproteine ECaC und Calbindin-D28k infolge VDR- Aktivierung164 sowie andererseits durch Verstärkung des PTH-abhängigen Transportmechanismus165. Die Steigerung der Phosphatreabsorption erfolgt wahrscheinlich als indirekte Folge der VDR-induzierten PTH-Suppression161. • Nebenschilddrüse: Hemmung der Transkription des PTH-Gens und Hemmung der Hyperplasie der Nebenschilddrüsen166. Die Suppression der PTH-Bildung wird auch indirekt durch die Calcitriol-bedingte Erhöhung des Serumkalziums und vermehrte Expression des kalziumsensitiven Rezeptors (CaSR) der Nebenschilddrüsen bedingt167. Zudem wird die Expression des VDR in parathyreoidalen Zellen verstärkt168. • Knochen: Aufbau und Erhaltung eines gesunden, mineralisierten Skeletts. Hierfür ist eine optimal abgestimmte Regulierung von Osteogenese und Osteoklastogenese erforderlich. Im Nettoergebnis bewirkt Calcitriol einen knochenanabolen Effekt169. Dies wird gewährleistet durch vermehrte Bereitstellung von Kalzium und Phosphat sowie durch Supprimierung von PTH. Ferner wird einerseits in den Osteoblasten Osteocalcin, ein Vitamin K2-abhängiger Marker des Knochenaufbaus und Teil der Knochenmatrix, induziert170, und andererseits die Expression von RANKL erhöht sowie die des OPG vermindert, was die Osteoklastogenese stimuliert106.

21 Einleitung ______

Der Vitamin D-Mangel ist ein sehr häufiges Problem und betrifft Schätzungen zufolge mindestens eine Milliarde Menschen weltweit. Definitionsgemäß handelt es sich bei einer Insuffizienz um Calcidiol-Serumkonzentrationen zwischen 20 und 30 ng/ml, bei einer Defizienz hingegen um Calcidiol- Serumkonzentrationen kleiner als 20 ng/ml. Wichtige Einflussfaktoren bezüglich Insuffizienz und Defizienz sind Sonnenexposition, welche unter anderem von der geographische Breite und Hautpigmentierung, respektive Hautfarbe, abhängig ist, von Alter, Ernährung und Komorbiditäten171. Ebenfalls sehr häufig mit einer Calcidioldefizienz assoziiert sind chronische Lebererkrankungen172. In mehreren Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass auch bei Patienten mit einer chronischen Niereninsuffizienz eine sehr hohe Prävalenz bezüglich Calcidiol-Defizienz besteht173,174. Bei Menschen mit normaler Nierenfunktion besteht gewöhnlich keine Assoziation zwischen den Calcidiol- und Calcitriol-Serumkonzentrationen. Diese sind in erster Linie von der Aktivität der 1!-Hydroxlase abhängig175. Bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz ist hingegen eine eindeutige Korrelation zwischen Calcidiol- und Calcitriol-Serumkonzentration nachweisbar176,177. Insbesondere besteht bei Patienten mit einer GFR < 60 ml/min eine verminderte Bildungsfähigkeit von Calcitriol infolge einer verminderten Aktivität der 1!-Hydroxylase178. Diese verminderte Aktivität ist einerseits bedingt durch eine verminderte Masse an funktionsfähigem Nierengewebe und andererseits Folge der Suppression durch den phosphatretentionsbedingten Anstieg der FGF-23-Serumkonzentrationen178,179. Ferner scheint ein urämisches Milieu sowohl zu einer Verminderung der VDR- Expression180 als auch zu einer geringeren Affinität des VDR für Vitamin D181 zu führen. In der Folge eines Mangels sowohl von Calcidiol182 als auch von Calcitriol178 kommt es zu einem sHPT. Klinisch manifestiert sich ein solcher Mangel bei Patienten mit normaler Nierenfunktion als Rachitis, respektive Osteomalazie175. Bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz resultiert die sogenannte renale Osteodystrophie. Neben der Manifestation am Knochen kommt es aber auch zu Störungen des Kalzium-Phosphathaushaltes und zur extraossären

22 Einleitung ______

Kalzifikation (siehe Kapitel 1.3 und 1.4.2), was unter dem erweiterten Begriff der Chronic Kidney Disease - Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD) subsumiert wird183. Darüber hinaus fanden sich in den letzten Jahren immer mehr Hinweise darauf, dass Vitamin D über sogenannte pleiotrope Effekte verfügen muss, welche nicht in direktem Zusammenhang mit dem Knochenstoffwechsel oder Kalzium- Phosphat-Haushalt stehen. Folgende Effekte sind bekannt: • Modulation des Immunsystems: siehe Kapitel 1.4.1. • Modulation extraossärer Kalzifikation: siehe Kapitel 1.4.2. • Antihypertensiver Effekt: Tierexperimentell konnte nachgewiesen werden, dass ein Verlust der VDR-Signaltransduktion zu einer Hochregulation des Renin-Angiotensin-Systems führt184. • Antiproteinurischer und renoprotektiver Effekt: In mehreren Tierversuchen konnte gezeigt werden, dass die VDRA Maxacalcitol185, Calcitriol185 und Paricalcitol186,187 antiproteinurische und renoprotektive Effekte aufweisen. Dies erfolgt offensichtlich einerseits durch Hemmung des Renin- Angiotensin-Systems186,187 und andererseits durch Suppression fibrotischer (TGF-$)186,187 und proinflammatorischer (TNF-!) Zytokine188 in der Niere. • Verminderung von linksventrikulärer Hypertrophie: Tierexperimentell ergaben sich Hinweise, dass Vitamin D möglicherweise die Entstehung einer linksventrikulären Hypertrophie inhibiert189,190. Zudem konnte in einer Kohorte von Peritonealdialysepatienten eine Assoziation zwischen Calcidiol- Defizienz und linksventrikulärer Hypertrophie nachgewiesen werden191. • Suppression malignen Zellwachstums: Es konnte in zahlreichen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass Vitamin D-Defizienz mit dem häufigeren Auftreten von bisher 17 Krebsarten, unter anderem Mamma-, Kolon-, Prostata-, Blasen-, Ösophagus-, Rektum-, Endometrium-, Nieren- und Ovarialkarzinom sowie Non-Hodgkin-Lymphomen assoziiert ist192. Ursächlich hierfür ist möglicherweise unter anderem die durch Calcitriol vermittelte Hemmung von Wachstumsfaktoren wie Transforming-Growth- Factor-! (TGF-!)193, die Induktion von Inhibitoren des Zellzyklus, p21194 und p27195, und des Tumorsuppressors CCAAT/enhancer-binding-protein $

23 Einleitung ______

(C/EBP$)196,197 sowie durch Apoptoseinduktion198,199. Die meisten

proliferationshemmenden Effekte von Calcitriol sind wahrscheinlich eher autokriner als endokriner Natur und bedürfen daher einer ausreichenden Calcidiol-Serumkonzentration155. • Kontrolle der Differenzierung und Funktion der Haut: Lokal produziertes Calcitiriol induziert in normalen Keratinozyten zahlreiche Proteine, welche für die Zelldifferenzierung entscheidend sind200. Aufgrund des hemmenden Effektes auf TGF-! besitzt Calcitriol antiproliferative Eigenschaften, welche bei der Therapie der Psoriasis von Nutzen sind193. • Kontrolle der Insulinsekretion: Offensichtlich beeinträchtigt eine Vitamin D- Defizienz die Insulinsekretion201, was durch Substitution von Calcitriol möglicherweise behoben werden kann202. • Kontrolle der Muskelfunktion: Vitamin D-Defizienz ist mit muskulärer Schwäche und Atrophie assoziiert203,204. • Kontrolle des Nervensystems: Calcitriol erhöht die Nervenleitgeschwindigkeit205 und induziert die Synthese neurotrophischer Faktoren wie Nerve-Growth-Factor (NGF), der die weitere Zelldifferenzierung fördert und Mitosen inhibiert206. Im Embryo scheint Calcitriol eine wichtige Bedeutung für eine regelrechte Gehirnentwicklung zu besitzen207. Untersuchungen zufolge gibt es Hinweise, dass Vitamin D- Defizienz mit der Entwicklung einer Demenz208 und eines Morbus Parkinson209 assoziiert ist. • Auswirkungen in der Schwangerschaft: Vitamin D-Mangel in der Schwangerschaft ist assoziiert mit einer intrauterinen Wachstumsverzögerung, einem geringeren Geburtsgewicht und vorzeitigen Wehen192. Vitamin D-Defizienz in der Allgemeinbevölkerung ist ein unabhängiger Risikofaktor für Mortalität210,211 und kardiovaskuläre Ereignisrate212. Dies konnte sowohl für niedrige Calcidiol- als auch niedrige Calcitriol-Serumkonzentrationen nachgewiesen werden213. Ähnliche Resultate ergaben sich in Untersuchungen von Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz. Hier zeigte sich ebenfalls,

24 Einleitung ______dass Calcidiol-Defizienz eine erhöhte Mortalität177,214 und schnellere Progression hin zur terminalen Niereninsuffizienz177 bedingt. Vitamin D wird in unterschiedlichen Indikationen zu therapeutischen Zwecken verwendet. Dabei werden sowohl Cholecalciferol als auch Calcitriol und andere Vitamin D-Rezeptor-Aktivatoren (VDRA) eingesetzt. Bezüglich der Effektivität und Wirksamkeit der einzelnen Substanzen liegt eine heterogene Evidenzlage vor. Cholecalciferol wird oft zur Behandlung der Osteoporose eingesetzt. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass eine adäquate Supplementation von Cholecalciferol und Kalzium zu einer substantiellen Reduktion der Frakturrate, Steigerung der Knochendichte, Steigerung der Muskelkraft der unteren Extremität, Reduktion des Sturzrisikos, Verminderung von Parodontalerkrankungen und Verminderung des Risikos für kolorektale Karzinome führt215. In einer weiteren Untersuchung konnte gezeigt werden, dass durch Cholecalciferol- und Kalzium-Supplementation das allgemeine Krebsrisiko bei postmenopausalen Frauen sinkt216. Zudem konnte durch orale Cholecalciferoltherapie im Rahmen einer klinischen Studie bei Patienten mit diabetischer Nephropathie eine Senkung der Albumin- und TGF-$1- Konzentration im Urin erreicht werden217. Da es bei chronischer Niereninsuffizienz zur Defizienz von Calcitriol und konsekutiv zum sHPT kommt, wird aktives Vitamin D häufig in therapeutischer Indikation substituiert. Neben der direkten Supplementation von Calcitriol stehen weitere VDRA zur Verfügung. Hierzu zählen die Substanzen Alfacalcidol, Doxercalciferol, Maxacalcitol (= 22-Oxacalcitriol) und Paricalcitol (= 19-nor-1,25-Dihydroxyergocalciferol)218.

25 Einleitung ______

CH3 H C 3 CH3 CH3

CH3

Calcitriol Paricalcitol

Abbildung 1.4: Strukturvergleich von Calcitriol und Paricalcitol.

Bei Alfacalcidol und Doxercalciferol handelt es sich um sogenannte „Pro- Drugs“, welche einer enzymatischen Aktivierung in der Leber mit Umwandlung in Calcitriol bedürfen. Maxacalcitol und Paricalcitol hingegen binden an und aktivieren den VDR auf direktem Weg218. Der erwünschte PTH-senkende Effekt aller genannten VDRA konnte in klinischen Untersuchungen eindeutig belegt werden. Allerdings kommt es unter der Therapie mit VDRA häufig zu einer unerwünschten Erhöhung der Kalzium- und Phosphat-Serumkonzentrationen219. Des Weiteren konnte für die VDRA nachgewiesen werden, dass sowohl die orale als auch die intravenöse Supplementation mit einem verbesserten Überleben, respektive einer verminderten kardiovaskulären Mortalität, assoziiert ist104,220-222. In zwei Studien konnte eine interessante Beziehung zwischen Dosierung des VDRA und Überleben gefunden werden. Es scheint, dass der gewonnene Überlebensvorteil in den Subgruppen mit hoher Dosierung weniger ausgeprägt ist. Möglicherweise besteht zwischen Dosierung des aktiven Vitamin D- Derivates und Mortalität eine angedeutete U-förmige Beziehung104,222. Die Evidenz in Bezug auf die Unterschiede hinsichtlich Wirksamkeit und Effektivität zwischen den verschiedenen VDRA ist stark eingeschränkt. Für Paricalcitol im Speziellen konnte ebenfalls eine Senkung der Mortalität nachgewiesen werden104,221. Insbesondere werden dem Paricalcitol aufgrund

26 Einleitung ______einer tierexperimentellen Untersuchung Vorteile gegenüber Calcitriol zugeschrieben. Es konnte in einem Versuch mit urämischen Ratten nachgewiesen werden, dass sich im Zuge der PTH-Senkung durch Paricalcitolapplikation keine Hyperkalzämien und Hyperphosphatämien im Vergleich zu Calcitriol entwickelten223. Möglicherweise hängt dies mit einer verminderten intestinalen Expression des VDR beziehungsweise Kalziumtransportproteins Calbindin unter Paricalcitolwirkung zusammen224. In einer retrospektiven Analyse an Hämodialysepatienten ergaben sich ebenfalls Hinweise darauf, dass Paricalcitol im Vergleich zu Calcitriol mit weniger Hyperkalzämien und Hyperphosphatämien und sogar einem besseren Überleben assoziiert ist225. Eine prospektive Vergleichsstudie konnte bestätigen, dass Paricalcitol im Vergleich zu Calcitriol zu schnelleren PTH- Senkungen bei weniger Episoden mit Hyperkalzämie führt226. In einer rezenten mulitzentrischen randomisierten klinischen Studie konnte im Vergleich zwischen Paricalcitol und Alfacalcidol jedoch kein Unterschied in Bezug auf PTH- Senkung und Inzidenz einer Hyperkalzämie oder Hyperphosphatämie gefunden werden227. Ferner konnte im Rahmen der VITAL-Studie gezeigt werden, dass Paricalcitol bei Patienten mit diabetischer Nephropathie eine Senkung der Albuminurie bewirken kann228. Ein weiteres gesichertes Indikationsfeld für VDRA besteht in der topischen Anwendung bei Psoriasis229.

1.4.1 Einfluss auf Inflammation

Vitamin D ist ein potenter Modulator des Immunsystems. In diesem Zusammenhang sind einige physiologische Angriffspunkte des Vitamin D bekannt. Das Monozyten-Makrophagen-System wird durch Calcitirol offensichtlich aktiviert, indem dieses p21194 und C/EBP$196 induziert. Durch p21 wird die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen unterstützt194. Mit Hilfe des Transkriptionsfaktors C/EBP$ wird ebenfalls eine monozytäre Differenzierung196

27 Einleitung ______und insbesondere eine potente Typ1-T-Helferzellen (TH1) Immunantwort induziert, durch welche die Makrophagen antimikrobielle und antitumorale Eigenschaften erwerben230. In krankheitsaktivierten Makrophagen kommt es vermittelt durch INF-" zu einer vermehrten Expression der 1!-Hydroxylase, was zu einer vermehrten lokalen Produktion von Calcitriol führt231. INF-", das potenteste Makrophagen-aktivierende Zytokin, und Calcitriol wirken synergistisch, indem INF-" die Induktion der 24-Hydroxylase und somit den Abbau von Calcitriol inhibiert und Calcitriol die Deaktivierung des Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT)-1-Proteins, einem Transkriptionsfaktor, der in die meisten modulativen Aktivitäten des INF-" involviert ist, verhindert232. Ein weiterer Mechanismus, der zu einer verstärkten extrarenalen Calcitriolbildung in Makrophagen führt, besteht in der Aktivierung der Toll-like-Rezeptoren (TLR) durch Mycobacterium tuberculosis. Diese Aktivierung bedingt eine vermehrte Expression des VDR und der 1!- Hydroxylase in den Makrophagen. Die VDR-Aktivierung führt zur Induktion des antimikrobiellen Peptids Cathelicidin, welches Mycobacterium tuberculosis zerstört233. Voraussetzung für die extrarenale Calcitriolbildung ist wiederum das ausreichende Vorhandensein des Substrates Calcidiol155,233. Neben den antimikrobiellen und antitumoralen Wirkungen scheint Calcitriol aber auch antiinflammatorische Effekte zu besitzen und die Produktion proinflammatorischer Zytokine wie IL-6 und TNF-! in Monozyten zu hemmen234. In einer tierexperimentellen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass der TNF-!-senkende Effekt von Paricalcitol ausgeprägter als von Calcitriol zu sein scheint235. Auf Lymphozyten hat Calcitriol eine differenzierte Wirkung. So wird die Bildung von IL-2 durch Calcitriol supprimiert, was einen gewissen immunsuppressiven Effekt bewirkt236. Tierexperimentell konnte aber auch gezeigt werden, dass die mucosale Typ2-T-Helferzellen (TH2)-Immunantwort, die gekennzeichnet ist durch vermehrte Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10, respektive die Antikörper- basierte Immunantwort durch Calcitriol verstärkbar ist237,238. Die dendritischen Zellen, also hochspezialisierte antigenpräsentierende Zellen, werden durch Calcitriol in einem Stadium der Unreife gehalten. Dies erfolgt

28 Einleitung ______durch Inhibition der Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle und des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse II und spielt eine wichtige Rolle in Bezug auf Immuntoleranz und Immunsuppression239. Tierexperimentell konnte zudem gezeigt werden, dass Calcitriol und Paricalcitol die Abstoßung von transplantiertem Gewebe suffizient hemmen konnte, ohne jedoch dabei die Empfänglichkeit für Pilz- oder Virusinfektionen zu erhöhen240. In einer weiteren tierexperimentellen Studie konnte die Transplantattoleranz unter anderem mit der Calcitriol-vermittelten Herunterregulierung der kostimulatorischen Moleküle auf den dendritischen Zellen in Verbindung gebracht werden241. Diese physiologischen Mechanismen werden in einigen bekannten klinischen Erscheinungen reflektiert. Zahlreiche Untersuchungen konnten zeigen, dass Rachitis bei Kindern häufiger zum Auftreten pulmonaler Infektionen führt. Auch bei Erwachsenen konnte eine inverse Assoziation zwischen Calcidiol- Serumkonzentration und der Inzidenz von Infekten der oberen Atemwege nachgewiesen werden242. Bereits 1903 erhielt Dr. Niels Ryberg Finsen den medizinischen Nobelpreis für die Entdeckung, dass UV-Licht zur Heilung des Lupus vulgaris (Hauttuberkulose) beitragen kann. Heute ist bekannt, dass es sich bei dem dabei entscheidenden Agens um Vitamin D handelt233. Des Weiteren konnte eine Assoziation zwischen Vitamin D-Defizienz und dem Auftreten zahlreicher Autoimmunerkrankungen wie zum Beispiel des systemischen Lupus erythematodes243, des Diabetes mellitus Typ 1244, der rheumatoiden Arthritis245, vom Morbus Crohn246 und der multiplen Sklerose247 nachgewiesen werden. Bei HIV-infizierten Patienten konnte gezeigt werden, dass Vitamin D-Defizienz offensichtlich mit schnellerer Krankheitsprogression und schlechterem Überleben korreliert248. Offensichtlich wirken Calcitriol beziehungsweise VDRA bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz antiinflammatorisch und führen durch Hemmung der vermehrten systemischen Inflammation zu einer Verbesserung von Surrogatparametern (siehe Kapitel 1.5.1) und möglicherweise auch klinischen Endpunkten. Insbesondere in Bezug auf Letzteres fehlen jedoch randomisierte kontrollierte klinische Studien.

29 Einleitung ______

1.4.2 Einfluss auf Kalzifikation

Vitamin D ist ein Modulator extraossärer Kalzifikation. Es ist aus tierexperimentellen Studien bekannt, dass hohe oder toxische Dosen von Vitamin D oder VDRA reproduzierbar extraossäre Kalzifikation verursachen. In beiden Studien kam es aber auch zur Erhöhung des Kalzium-Phosphat- Produktes249,250. Offensichtlich bestehen bezüglich der Einflussnahme auf Kalzifikationsprozesse Unterschiede zwischen den einzelnen VDRA. In einer weiteren tierexperimentellen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass in urämischen Ratten sowohl durch Calcitriol als auch durch Doxercalciferol, nicht jedoch durch Paricalcitol, mediale Verkalkung induziert werden konnte, obwohl alle drei Substanzen gleichermaßen effektiv eine PTH-Senkung bewirkten. Des Weiteren konnte in der gleichen Untersuchung auf molekularer Ebene gezeigt werden, dass Calcitriol und Doxercalciferol in der Aorta die Expression von „Runt-related transcription factor 2“ (Runx2), einem für osteoblastische Differenzierung essentiellen Transkriptionsfaktor, induzieren. Auch dieser Effekt konnte für Paricalcitol nicht nachgewiesen werden251. Der günstigere Effekt von Paricalcitol gegenüber Calcitriol in Bezug auf extraossäre Kalzifikation könnte unter anderem in der unterschiedlichen Stimulierung des RANKL-OPG-Systems liegen. In einer weiteren tierexperimentellen Untersuchung konnte gezeigt werden, dass Calcitriol zu einer stärkeren RANKL-Expression führte, was im Gegensatz zu Paricalcitol vermehrte Knochenresorption und konsekutiv vermehrte extraossäre Kalzifikation bedingt252. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass Calcitriol die Expression von PTH related peptide, einem endogenen Inhibitor vaskulärer Kalzifikation, in bovinen vaskulären Gefäßmuskelzellen inhibiert und damit einen fördernden Effekt in Bezug auf vaskuläre Kalzifikation ausübt253. Die Assoziation zwischen Vitamin D-Therapie und extraossärer Kalzifikation ohne Korrelation mit den Kalzium- und Phosphat- Serumkonzentrationen konnte aber auch am Menschen im Rahmen einer Autopsiestudie an terminal niereninsuffizienten Kindern nachgewiesen werden254.

30 Einleitung ______

Vitamin D und VDRA scheinen jedoch nicht einen ausschließlich prokalzifizierenden Effekt zu haben. In einem weiteren Tiermodell wurden unterschiedliche Dosierungen von Calcitriol und Paricalcitol in Bezug auf den Kalzifikationsprozess evaluiert. Dabei zeigte sich, dass moderate, respektive physiologische Dosierungen der VDRA protektiv bezüglich vaskulärer Kalzifikation wirkten, hohe Dosierungen diese jedoch stimulierten. Dieser Effekt konnte auch auf der molekularen Ebene hinsichtlich der osteoblastischen Genexpression in der Aorta beobachtet werden. Diese wurde durch moderate Dosierungen reduziert255. In einer klinischen Untersuchung an Patienten mit und ohne Niereninsuffizienz konnte gezeigt werden, dass Calcidioldefizienz mit vermehrter koronararterieller Kalzifikation assoziiert ist256. Unklar ist der Pathomechanismus, der den gefäßprotektiven Effekt von niedrig dosiertem Vitamin D erklärt. Es ist denkbar, dass die Hemmung von urämieassoziierter Mikroinflammation neben dem knochenanabolen Effekt von VDRA mit zur Inhibition vaskulärer Kalzifikation beiträgt. Somit kann für VDRA ein bimodaler Effekt in Bezug auf extraossäre Kalzifikationsprozesse postuliert werden, der sich in einer U-förmigen Beziehung zwischen VDRA-Dosierung und Schweregrad der Kalzifikation widerspiegelt. In einer klinischen Untersuchung an dialysepflichtigen Kindern konnte dieser bimodale Effekt nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass sowohl hohe als auch niedrige Calcitriol-Serumkonzentrationen mit einer vermehrten Intima-Media-Dicke der Arteria carotis und einem erhöhten Kalkscore assoziiert waren. Ferner wurde Kalzifikation am häufigsten bei Patienten mit erhöhten hsCRP- und erniedrigten Calcitriol- Serumkonzentrationen gefunden257. Bemerkenswert ist des Weiteren, dass in einer klinischen Untersuchung an Dialysepatienten eine ebenfalls U-förmige Beziehung zwischen VDRA-Dosierung und Mortalität demonstriert werden konnte104. Es fehlen jedoch randomisierte kontrollierte klinische Studien, die zeigen, ob alle Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz, unabhängig von der sHPT-Behandlung, von einer niedrig dosierten VDRA-Therapie profitieren und ob es klinisch relevante Unterschiede zwischen den einzelnen VDRA gibt. Weiterhin ist unklar, ob die beobachteten Überlebensvorteile unter VDRA-

31 Einleitung ______

Therapie104,220-222,225 zumindest teilweise in Zusammenhang mit den protektiven Eigenschaften in Bezug auf extraossäre Kalzifikation stehen.

1.5 Surrogatparameter für Inflammation und Kalzifikation

Der am besten untersuchte Parameter hinsichtlich Inflammation und kardiovaskulärer Mortalität ist CRP37. Bei Hepcidin handelt es sich um einen relativ neuen Parameter, der sowohl von Inflammation als auch vom Eisenstoffwechsel beeinflusst wird. Fetuin-A, MGP und FGF-23 sind Surrogatparameter für Kalzifikation.

1.5.1 Hochsensitives CRP (hsCRP)

CRP wurde erstmals 1930 im Zusammenhang mit der serologischen Reaktion bei Pneumokokkenpneumonien beschrieben258. Es ist ein Akute-Phase-Protein, welches zur Familie der Pentraxine zählt und in der Leber synthetisiert wird. Die Expression wird am stärksten durch IL-6 induziert. CRP bindet an Phosphocholin und einer Reihe weiterer autologer und extrinsischer Liganden, die sich an der Oberfläche von geschädigten Zellen und Mikroorganismen befinden. Gebundenes CRP aktiviert das Komplementsystem über den klassischen Weg und setzt dadurch humorale und zelluläre Effektormechanismen des unspezifischen Immunsystems in Gang. Dieser unspezifische Abwehrmechanismus ist erheblich schneller als die Reaktion des spezifischen Immunsystems259. Die Frage, ob CRP nicht nur ein unspezifischer Marker, sondern auch ein kausales Agens bei der Pathogenese der Atherosklerose ist, ist nicht abschließend geklärt260. CRP ist der wichtigste und am häufigsten bestimmte Surrogatparameter für Inflammation. Inflammation stellt einen wichtigen pathogenetischen Faktor der Atherosklerose dar. Es ist durch zahlreiche Untersuchungen gut belegt, dass eine erhöhte CRP-Serumkonzentration ein starker Risikofaktor für

32 Einleitung ______kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität ist261. Diese Assoziation lässt sich auch auf Dialysepatienten übertragen18, 262. CRP wird traditionell vor allem zur Diagnostik bei infektiösen Erkrankungen angewendet. Die automatisierten Routinemethoden zur Messung von CRP mit konventionellen Assays haben eine Nachweisgrenze im Bereich von 3-8 mg/l. Da es sich bei den zur Erfassung der wichtigen prognostischen Informationen bezüglich kardiovaskulärer Mortalität und Morbidität betreffenden CRP-Werten um niedrige Konzentrationen handelt, war die Entwicklung hochsensitiver Assays zur Bestimmung des sogenannten hsCRP erforderlich, welche insbesondere auch die Bereiche < 3 mg/l erfassen263. In Tabelle 1.3 ist dargestellt, wie anhand der Erfahrungswerte aus klinischen Studien die CRP- Serumkonzentrationen in Bezug auf die Abschätzung des kardiovaskulären Risikos zu interpretieren sind37:

CRP-Serumkonzentration in mg/l Interpretation < 1 normal 1 - 3 eventuell erhöht 3 - 10 stark erhöht (häufig bei CKD) 10 - 50 häufig bei Dialysepatienten > 50 akute Infektion / Inflammation (gewöhnlich temporär)

Tabelle 1.3: Interpretation von CRP-Serumkonzentrationen in Bezug auf kardiovaskuläres Risiko37.

Folgende Medikamente senken nachweislich die CRP-Serumkonzentration: • Statine unabhängig vom LDL-Cholesterol-senkenden Effekt264,265 und auch bei Dialysepatienten266. • Acetylsalicylsäure bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung267,268. • Celecoxib bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung269 und Peritonealdialyse270. • Thiazolidindione271,272 unabhängig vom Glucose-senkenden Effekt272. • Betablocker bei Patienten mit koronarer Herzerkrankung273 und Herzinsuffizienz274. • Pentoxifyllin bei Dialysepatienten275. • !-Tocopherol276

33 Einleitung ______

• Sevelamer bei Hämodialysepatienten277 Eine Hormonersatztherapie mit Östrogen und Progesteron bei postmenopausalen Frauen steigert hingegen die CRP-Serumkonzentration278. In Bezug auf Vitamin D und Paricalcitol zeigten sich in einigen Studien ebenfalls Effekte auf die CRP-Serumkonzentration. Es konnte sowohl bei einer Calcidiol- 279,280 als auch einer Calcitriol-Defizienz257 eine Assoziation mit erhöhten CRP- Serumkonzentrationen nachgewiesen werden. Zudem führte eine orale Supplementation mit Cholecalciferol zu einem Abfall der CRP- Serumkonzentration281. Durch orale und intravenöse Substitution von Paricalcitol konnte in zwei kleineren Untersuchungen ein nicht-signifikanter Trend zu geringeren CRP-Serumkonzentrationen aufgezeigt werden282,283. Zur Bestätigung dieser Beobachtung ist eine randomisierte kontrollierte klinische Studie erforderlich.

1.5.2 Fetuin A

Fetuin A, auch unter dem Synonym !2-Heremans Schmid (HS) Glykoprotein (AHSG) bekannt, ist ein hauptsächlich in der Leber synthetisiertes Glykoprotein. Es kommt im Serum in einer hohen Konzentration vor und bildet einen Großteil 284 der !2-Bande der Serumelektrophorese . Auf zellulärer Ebene ist Fetuin A ein multifunktionales Molekül, das unter anderem als Antagonist von TGF-$ fungiert285 und die Autophosphorylierung und Tyrosinkinaseaktivität des Insulinrezeptors inhibiert286. Letzteres bedingt eine gewisse Insulinresistenz, was möglicherweise der Grund dafür ist, dass erhöhte Fetuin A-Serumkonzentrationen einen Risikofaktor für die Entwicklung eines metabolischen Syndroms darstellen287. Des Weiteren scheint Fetuin A einen antiinflammatorischen Effekt zu besitzen, indem proinflammatorische Zytokine wie TNF-!288 und die Aktivierung neutrophiler Granulozyten289 inhibiert werden. Die biologische Hauptfunktion besteht in der Inhibition von Kalzifikation. Fetuin A scheint dabei für über 50% der inhibitorischen Kapazität bezüglich Kalzium-

34 Einleitung ______

Phosphat-Präzipitation im Serum verantwortlich zu sein290. Dies wird erreicht durch Bildung stabiler kolloidaler Sphären mit Kalzium und Phosphat, welche als sogenannte Calciprotein-Partikel bezeichnet werden291. Im Tierversuch konnte die inhibitorische Wirkung auf Kalzifikation bestätigt werden. Mäuse mit Deletion des Fetuin A-Gens entwickelten in einer Studie schwere extraossäre Kalzifikationen292. Seit längerem ist bekannt, dass es sich bei Fetuin A um ein negatives Akute- Phase-Protein handelt, dessen Serumkonzentration bei inflammatorischen Prozessen absinkt293. Da Dialysepatienten häufig unter einer chronischen Inflammation leiden, besteht bei diesen Patienten regelmäßig eine Fetuin A- Defizienz. In einer klinischen Studie konnte gezeigt werden, dass niedrige Fetuin A-Serumkonzentrationen bei Hämodialysepatienten mit erhöhter Gesamt- und kardiovaskulärer Mortalität assoziiert waren. Die Fetuin A- Serumkonzentration war dabei invers mit der CRP-Serumkonzentration assoziiert. Gleichzeitig konnte in den Sera der Patienten, welche eine Fetuin A- Defizienz hatten, eine verminderte inhibitorische Kapazität in Bezug auf Kalzium-Phosphat-Präzipitation nachgewiesen werden. Daraus kann angenommen werden, dass Inflammation und Fetuin A-Defizienz bei Dialysepatienten wahrscheinlich die Entwicklung einer akzelerierten Atherosklerose fördern294. Diese Hypothese wird dadurch erhärtet, dass in zwei weiteren Studien eine Assoziation zwischen Fetuin A-Defizienz und sowohl valvulärer295 als auch koronararterieller Kalzifikation296 nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren ist Hypalbuminämie mit Fetuin A-Defizienz im Sinne eines Malnutrition-Inflammation-Atherosklerose-Syndroms assoziiert295. Für Paricalcitol konnte in einer kleinen Studie eine steigernde Wirkung auf die Fetuin A-Serumkonzentration nachgewiesen werden283. Dabei ist jedoch unklar, ob diese Wirkung indirekt durch Hemmung der Inflammation oder direkt durch die Beeinflussung der Genexpression von Fetuin A zustande kommt.

35 Einleitung ______

1.5.3 Matrix Gla Protein (MGP)

Matrix Gla Protein wurde erstmals 1983 beschrieben. Da das Protein Vitamin K- abhängiges "-Carboxyglutamat (Gla) enthält, wurde der Name Matrix Gla Protein kreiert297. Exprimiert wird MGP in glatten Gefäßmuskelzelle (VSMC) und Chondrozyten und konnte in Knochen297, Knorpel, Lunge, Herz, Niere, Milz298 und atherosklerotischen Plaques299 nachgewiesen werden. Zur Aktivierung von MGP ist die Vitamin K-abhängige "-Carboxylierung erforderlich300. Zur Regulierung der Sekretion von MGP erscheint eine Phosphorylierung notwendig301. Somit kann MGP in carboxylierter (c), uncarboxylierter (uc), phosphorylierter (p) und dephosphorylierter (dp) Form vorliegen. MGP kann daher als dp-ucMGP, p-ucMGP, dp-cMGP und p-cMGP in Erscheinung treten. Vitamin K-Insuffizienz, infolge oraler Antikoagulation oder unzureichender Vitamin K-Versorgung, führt zu erhöhten Plasmakonzentrationen an dp-ucMGP. Dies liegt insbesondere bei gleichzeitiger Gefäßkalzifikation vor, da in diesem Fall eine erhöhte MGP- Synthese erforderlich, aber eine aktivierende "-Carboxylierung nicht in ausreichender Menge möglich ist. Bei suffizienter Vitamin K-Versorgung kommt es zu niedrigen dp-ucMGP- und vergleichsweise hohen dp-cMGP- Plasmakonzentrationen302. Die biologische Hauptwirkung von MGP liegt in der lokalen Inhibition von Kalzifikation. Der genaue Mechanismus hierfür ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass die Inhibition von BMP-2303 und eine Präzipitationshemmung durch Fetuin-Mineralkomplexe304, in welchen MGP einen bedeutsamen Anteil bildet, eine Rolle spielt. Mäuse mit Deletion des MGP-Gens entwickelten in einer Studie schwerste arterielle Mediaverkalkungen und verstarben im Alter von 6 bis 8 Wochen im hämorrhagischen Schock aufgrund spontaner Aortenrupturen („Aortenfrakturen“)305. Bei Ratten erzeugt in einer weiteren Studie die Applikation des Vitamin K-Antagonisten Warfarin eine Embryopathie, die sich in abnormer Knorpelverkalkung und anderen Störungen der Skelettentwicklung manifestiert306. Bei 10 Wochen alten Ratten erzeugte Warfarin arterielle Kalzifikation, welche unter anschließender hochdosierter

36 Einleitung ______

Vitamin K-Supplementation partiell reversibel war142. Beim Menschen verursachen verschiedene Mutationen des MGP-Gens das Keutelsyndrom307, welches durch Verkalkungen von Knorpel, Gefäßen und tracheobronchiale Stenosen gekennzeichnet ist308. Im klinischen Kontext konnte eine inverse Beziehung zwischen MGP- Serumkonzentration und koronararterieller Verkalkung nachgewiesen werden309. Bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz konnte gezeigt werden, dass die Plasmakonzentration von inaktivem Matrix Gla Protein (dp- ucMGP) mit valvulärer Kalzifikation assoziiert war310. Bei Dialysepatienten waren in einer rezenten Studie niedrige Plasmakonzentrationen des aktivierten Matrix Gla Protein (dp-cMGP), bedingt durch Vitamin K-Defizienz, mit einem erhöhten Mortalitätsrisiko verbunden311. Des Weiteren zeigte sich in früheren Untersuchungen, dass eine Therapie mit Vitamin K-Antagonisten mit koronararterieller und valvulärer Verkalkung143 sowie mit Kalziphylaxie assoziiert ist133. In Bezug auf Regulation der Expression von MGP konnten neben der aktivierenden Wirkung von Vitamin K für Retinsäure und Vitamin D modulierende Eigenschaften nachgewiesen werden. In einer experimentellen Untersuchung wurde gezeigt, dass Calcitriol die Transkription von uncarboxyliertem MGP (ucMGP) steigerte, was durch Retinsäure abgeschwächt wurde312. Therapeutisch lässt sich MGP durch Supplementation von Vitamin K beeinflussen. In der Rotterdam Studie konnte gezeigt werden, dass bei Menschen über 55 Jahren die diätetische Zufuhr von Vitamin K2 zu einer Risikoreduktion in Bezug auf Mortalität und Entwicklung einer schweren aortalen Verkalkung führte300. In einer weiteren Studie wurden postmenopausalen Frauen mit Vitamin K1, Kalzium und Vitamin D behandelt und in Bezug auf die Entwicklung der Gefäßelastizität untersucht. Die gemessene Gefäßelastizität änderte sich nach 3 Jahren in der Gruppe, die gleichzeitig mit Kalzium, Vitamin K1 und Vitamin D behandelt wurde, nicht, sank jedoch gleichermaßen in den Gruppen, die nur mit Kalzium und Vitamin D oder mit Placebo behandelt wurden313. Somit scheint eine Vitamin K- Supplementation den Gefäßalterungsprozess zu verzögern.

37 Einleitung ______

1.5.4 Fibroblast-Growth-Factor-23 (FGF-23)

FGF-23 wurde erstmals im Jahr 2000 in der Maus entdeckt und beschrieben314. Es handelt sich um ein Protein, welches hauptsächlich von Osteozyten synthetisiert wird315. Die biologische Hauptfunktion von FGF-23 besteht in einer hormonähnlichen Wirkung als Förderer der renalen Phosphatausscheidung durch Hemmung der Expression der Natrium-Phosphat-Kotransporter IIa und IIc (NaPi2a, NaPi2c) und der Aktivität der 1!-Hydroxylase in den proximalen Tubuluszellen der Niere. Entdeckt wurden diese Funktionen unter anderem durch die Entschlüsselung der Pathogenese der Tumor-induzierten Osteomalazie316 und der autosomal-dominanten hypophosphatämischen Rachitis317. Im ersten Fall kommt es zu einer ektopen Mehrproduktion, im zweiten Fall zu einer Abbaustörung von FGF-23. In beiden Fällen resultiert eine Hypophosphatämie durch Hyperphosphaturie und Suppression der 1!-Hydroxylase mit konsekutiv niedrigen Calcitriol-Serumkonzentrationen. Die Folge ist eine Osteomalazie respektive Rachitis. Umgekehrt können verschiedene Mutationen des FGF-23 auch eine Defizienz bewirken, was sich in der hereditären Störung der hyperphosphatämischen familiären tumoralen Kalzinose manifestiert. Dabei kommt es bei Hyperphosphatämie und erhöhter Calcitriol-Serumkonzentration zu massiver vaskulärer und Weichteil-Verkalkung318. Die renalen Wirkungen von FGF-23 erfolgen über den FGF-Rezeptor. Dieser Rezeptor bedarf der vorherigen Konversion und Aktivierung durch das $- Glukuronidase-ähnliche, transmembrane Klotho-Protein319. Im Tierexperiment zeigten sowohl Klotho-320 als auch FGF-23-Knockout-Mäuse321 ähnliche Phänotypen mit Hyperphosphatämie, erhöhter Calcitriol-Serumkonzentration, Hyperkalzämie, supprimiertem PTH, vaskulärer und Weichteil-Kalzifikation sowie Frühmortalität. Die gleichzeitige Deletion des 1!-Hydroxylase-Gens bei Klotho-Knockout-Mäusen korrigierte die genannten Störungen nahezu vollständig, was die hohe Bedeutung erhöhter Calcitriol-Serumkonzentrationen für die Kalzifikation unterstrich322. Neben der Niere wird Klotho auch in der Nebenschilddrüse und im Gehirn exprimiert323. In der Nebenschilddrüse

38 Einleitung ______stimuliert FGF-23 möglicherweise die PTH-Ausschüttung, wobei dieser Effekt aber wahrscheinlich auf der Calcitriolsuppression beruht, was einen zusätzlichen phosphaturischen Effekt generieren würde319. Die Funktion von FGF-23 im Gehirn ist noch weitgehend unerforscht. Die Serumkonzentration von FGF-23 wird in erster Linie von der Phosphat- und der Calcitriol-Serumkonzentration reguliert. Hohe Serumkonzentrationen an Phosphat und Calcitriol führen unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der FGF-23-Serumkonzentration324. FGF-23 ist somit in Bezug auf die Phosphathomöostase eine Art gegenregulatorisches Hormon zu Vitamin D325 und ein Surrogatparameter für eine positive Phosphatbilanz. Im Rahmen einer chronischen Niereninsuffizienz kommt es zu einer positiven Phosphatbilanz mit konsekutiver Hyperphosphatämie. Aufgrund dessen kommt es bei diesen Patienten zu erhöhten FGF-23-Serumkonzentrationen. Die Folge ist eine Abmilderung der Hyperphosphatämie, aber auch eine Verschärfung der Calcitriol-Defizienz326. Bei Dialysepatienten werden zum Teil sehr hohe FGF- 23-Serumkonzentrationen erreicht. Die Höhe der Serumkonzentrationen korrelierten in einer Studie mit vaskulärer Kalzifikation und Mortalität. Dabei zeigten Patienten unter VDRA-Therapie eine Tendenz zu höheren FGF-23- Serumkonzentrationen327. Für Paricalcitol im Speziellen konnte zunächst im Tierversuch eine steigernde Wirkung auf die FGF-23-Serumkonzentration nachgewiesen werden328. Diese Wirkung konnte in einer rezenten klinischen Studie für Paricalcitol und Alfacalcidol am Menschen bestätigt werden. Dabei konnte in Bezug auf die Steigerung der FGF-23-Serumkonzentration kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Substanzen nachgewiesen werden329. In Bezug auf andere klinische Auswirkungen erhöhter FGF-23- Serumkonzentrationen ist die Evidenzlage eingeschränkt. In einer rezenten präklinischen Studie konnte gezeigt, dass FGF-23 offensichtlich eine kausale Rolle bei der Entstehung der linksventrikulären Hypertrophie spielt330. Ob FGF- 23 einen ätiologischen Faktor für weitere klinische Erscheinungen darstellt, bedarf weiterer Untersuchungen.

39 Einleitung ______

1.5.5 Hepcidin

Hepcidin ist ein regulatorisches Schlüsselprotein in der Kontrolle der intestinalen Eisenresorption und Verteilung von Eisen im gesamten Körper. Es wurde erstmals im Jahr 2000 beschrieben, besteht aus 25 Aminosäuren und wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert331. Da es unter anderem auch bakterizide Eigenschaften besitzt, ergab sich der Name Hepcidin aus dieser Eigenschaft und dem Syntheseort332. Die biologische Hauptfunktion von Hepcidin besteht in einer hormonähnlichen Wirkung als Inhibitor der intestinalen Eisenresorption und der Freisetzung aus Speichern wie der Leber und aus Makrophagen, indem Ferroportin, ein transmembranöses Eisentransportprotein, internalisiert und degradiert wird. Hieraus resultiert ein Absinken der Eisen-Serumkonzentration und der Transferrinsättigung333. Folgende Regulatoren bedingen eine vermehrte Hepcidinfreisetzung: • Eisenüberladung durch übermäßige Zufuhr334. • Transferrin-gebundenes Eisen335. • IL-6 im Rahmen einer Inflammation336. Folgende Faktoren führen zu einer Verminderung der Hepcidinfreisetzung: • Eisendefizienz337. • Erythropoetische Aktivität bei Anämie und Hypoxie338. Da die Nieren den Hauptort der Elimination von Hepcidin darstellen, ist bei Dialysepatienten die Hepcidin-Serumkonzentration signifikant erhöht339. Die Hepcidin-Serumkonzentration ist assoziiert mit der CRP-Serumkonzentration340 und korreliert invers mit der Erythropoetindosis339. Die Gabe von Erythropoetin führt möglicherweise zu einer Reduktion der Hepcidin-Serumkonzentration341. Des Weiteren konnte in einer rezenten Studie gezeigt werden, dass bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz unabhängig von der GFR erhöhte PTH- und Phosphat- sowie erniedrigte Calcitriol-Konzentrationen mit einer erhöhten Hepcidin-Serumkonzentration assoziiert sind342.

40 Einleitung ______

Es ist nicht bekannt, inwiefern die Applikation von Vitamin D und VDRA die Hepcidin-Serumkonzentration beeinflusst. Dies bedarf weiterer zukünftiger Untersuchungen.

1.6 Ziel der Untersuchung

Ziel der Untersuchung ist es, die Effekte von Paricalcitol Kapseln auf Surrogatparameter für Inflammation und entzündungsabhängige Verkalkungsinhibition bei Hämodialysepatienten mit leichtgradigem bis moderatem sekundärem Hyperparathyreoidismus zu ermitteln. Die zentrale Hypothese ist, dass aktive Vitamin D-Analoga (VDRA) wie Paricalcitol einen antiinflammatorischen und verkalkungshemmenden Effekt haben, welcher durch entsprechende Veränderungen von spezifischen Surrogatparametern erfasst werden und potentiell einen positiven Einfluss auf das Überleben von Dialysepatienten besitzen kann. Hierfür durchliefen die Patienten zwei Behandlungsphasen im Rahmen einer prospektiven Crossover-Studie, in denen sie alternierend Paricalcitol oder Placebo einnahmen. Im Speziellen wurden während der jeweiligen Behandlungsphasen folgende Zielparameter untersucht: - Hochsensitives C-reaktives Protein (hsCRP) - Fetuin A - Hepcidin - Fibroblast-Growth-Factor-23 (FGF-23) - Totales uncarboxyliertes Matrix Gla Protein (t-ucMGP) Als primärer Endpunkt wurden die 30%-ige Senkung des hsCRP-Levels und 20%-ige Steigerung der Fetuin A-Serumwerte definiert. Sekundäre Endpunkte waren Veränderungen der Serumkonzentrationen von Hepcidin, FGF-23, t-ucMGP.

41 Material und Methoden ______

2 Material und Methoden

2.1 Studiendesign

Die Untersuchung erfolgte im Zeitraum Januar 2009 – November 2010 im Rahmen der sogenannten EPIC-CKD-Studie (The Effects of Paricalcitol capsules on Inflammation (CRP levels) and Calcification regulation (fetuin-A levels) in CKD stage 5D patients). Hierbei handelt es sich um eine multizentrische, randomisierte, doppelverblindete, prospektive, Placebo- kontrollierte Crossover-Studie. Sponsor der Studie ist die Julius-Maximilians- Universität in Würzburg, Deutschland (Leiter der klinischen Prüfung: Prof. Dr. Christoph Wanner). Der Zeitverlauf der Studie stellte sich wie in Abbildung 2.1 dar:

1. Behandlungsphase 2. Behandlungsphase

Paricalcitol (12 Wochen) Placebo (12 Wochen) Washout-Phase Washout-Phase Nachbeobachtungsphase (4 Wochen) (4 Wochen) (4 Wochen) Placebo (12 Wochen) Paricalcitol (12 Wochen)

Blutentnahme Blutentnahmen Blutentnahmen Blutentnahme Screening Woche 0,2,4,6,8,10,12 Woche 0,2,4,6,8,10,12 Studienende

Abbildung 2.1: Zeitlicher Verlauf der Studie.

Es erfolgte zunächst eine Washout-Phase von 4 Wochen, in welcher ggf. die bis dahin verabreichten aktiven Vitamin D-Präparate der Patienten pausiert wurden. Wenn die Ein- und Ausschlußkriterien (siehe Kapitel 2.2) positiv erfüllt waren, erfolgte doppelverblindet in der 1. Behandlungsphase eine Medikation entweder mit Paricalcitol-Kapseln (Startdosis 2 µg/Tag) oder mit Placebo. In der 2. Behandlungsphase wurde die Medikation gegen das jeweils andere Präparat getauscht. Die Adjustierung der Dosis der Studienmedikation erfolgte entsprechend der Werte für Kalzium, Phosphat und PTH intakt (siehe Kapitel 2.3.1). Die Gesamtstudiendauer betrug somit für den einzelnen Patienten maximal 8 Monate.

42 Material und Methoden ______

Eine detaillierte Übersicht über den zeitlichen Studienablauf während einer Behandlungsphase liefert Tabelle 2.1:

Woche Screening Studienende 0 2 4 6 8 10 12 (nur 1. Phase) (nur 2. Phase) Vorerkankungen x Vormedikation x Dokumentation Änderung Begleitmedikation x x x x x x x Dialysemodalität x x x x x x x x + + Routinelabor (Na , K , Hb, Leukozyten, x x x x x Kreatinin, Harnstoff, Eiweiß, Albumin, AP) Unerwünschte Ereignisse x x x x x x x x Ca2+, Phosphat x x x x x x x x x PTH intakt x x x x x hsCRP, Fetuin-A x x x x x x x x Hepcidin, FGF-23, t-ucMGP x x x x x x x x EKG x Körperliche Untersuchung x

Tabelle 2.1: Zeitlicher Ablauf während der Behandlungsphasen.

Zur Determinierung von zuverlässigen Stichprobenumfängen zu vorgegebenen Irrtumswahrscheinlichkeiten alpha und beta erfolgte durch die Zentrale für klinische Studien der Universität Würzburg (ZKSW) eine entsprechende Schätzungen für den primären Zielparameter Fetuin A auf Basis der bei Dialysepatienten bekannten Serumkonzentrationen294. Bei einem Anstieg der Fetuin A-Serumkonzentration von 20%, einer Irrtumswahrscheinlichkeit von ! = 0,05 und einer Power von 1 – $ = 0,8 wurde ein Stichprobenumfang von n = 22 pro Gruppe errechnet. Unter Berücksichtigung einer geschätzten Ausfallrate von fast 15% wären insgesamt 50 Patienten für beide Therapiearme erforderlich gewesen. Analoge Berechnungen für die hsCRP-Konzentrationen wurden nicht gemacht, um nicht zu unrealistischen Fallzahlen zu gelangen, da die bekannten inter- individuellen Varianzen zu hoch sind.

43 Material und Methoden ______

Coburg2.2 Studienteilnehmer17 Kronach 9 Meiningen 5 Fürth Insgesamt wurden 43 4 Patienten im Alter zwischen 41 und 81 Jahren aus 8 Lichtenfels 3 SonnebergDialysezentren eingeschlossen.3 Die Verteilung der teilnehmenden Patienten auf Kulmbachdie einzelnen Dialysezentren1 ist der Abbildung 2.2 zu entnehmen: Bamberg 1

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Abbildung 2.2: Verteilung der teilnehmenden Patienten auf die einzelnen Dialysezentren.

Die epidemiologischen und klinischen Baseline Charakteristika der Patienten sind aus der Tabelle 2.2 zu entnehmen.

44 Material und Methoden ______

Charakteristika Gesamt (n=43) Sequenz A (n=22) Sequenz B (n=21) Paricalcitol - Placebo Paricalcitol - Placebo Alter (Jahre) 63,6 (10,4) 62,1 (9,4) 65,1 (11,4) Weibliches Geschlecht 13 (30,2%) 6 (27,3%) 7 (33,3%) Biometrische Merkmale Gewicht (kg) 87,9 (15,9) 88,9 (15,6) 86,8 (16,5) Körpergröße (cm) 169,8 (7,9) 170,7 (8,2) 168,8 (7,5) Body-Mass-Index (kg/m2) 30,5 (5,4) 30,6 (5,5) 30,4 (5,4) Klinische Untersuchung Systolischer Blutdruck (mmHg) 135,1 (16,9) 135,6 (19,3) 134,5 (14,4) Diastolischer Blutdruck (mmHg) 74,4 (10,7) 74,7 (11,5) 74,0 (10,1) Herzfrequenz (Schläge/min) 70,5 (9,1) 71,4 (9,6) 69,7 (8,6) Dialysemodalität Dialysedauer (h) 4,89 (0,95) 4,84 (0,85) 4,95 (1,06) Dialysefrequenz pro Woche 3 (0) 3 (0) 3 (0) Dialysedauer pro Woche 14,68 (2,85) 14,52 (2,55) 14,84 (3,18) Dialyseeffektivität (Kt/V1) 1,40 (0,21) 1,32 (0,19) 1,48 (0,20) Dialysatkalzium (mmol/l) 1,37 (0,14) 1,38 (0,15) 1,37 (0,13) Laborparameter Hämoglobin (g/dl) 12,10 (1,07) 12,54 (0,85) 11,63 (1,09) Serum-Phosphat (mmol/l) 1,57 (0,36) 1,60 (0,40) 1,53 (0,33) PTH intakt (pmol/l2) 33,84 (13,23) 33,89 (15,24) 33,79 (11,25) 25-OH-Vitamin D (ng/ml) 37,14 (15,2) 35,98 (17,94) 38,35 (12,01) Serum-Albumin (g/dl) 4,01 (0,33) 4,08 (0,37) 3,94 (0,28) Kardiovaskuläre Vorerkrankungen Diabetes mellitus 21 (48,8%) 9 (40,9%) 12 (57,1%) Arterielle Hypertonie 41 (95,3%) 21 (95,5%) 20 (95,2%) Koronare Herzkrankheit 18 (41,9%) 11 (50%) 7 (33,3%) Periphere arterielle Verschlußkrankheit 11 (25,6%) 8 (36,4%) 3 (14,3%) TIA3 oder Schlaganfall 6 (14%) 4 (18,2%) 2 (9,5%) Chronisch-entzündliche Vorerkrankungen Insgesamt 14 (32,6%) 9 (40,9%) 5 (23,8%) Chronische Glomerulonephritis 8 (18,6%) 7 (31,8%) 1 (4,8%) Andere4 7 (16,3%) 3 (13,6%) 4 (19,0%) Dialysebezogene Vormedikation Gebrauch von ESA 38 (88,4%) 18 (81,8%) 20 (95,2%) Eisensubstitution 33 (76,7%) 18 (81,8%) 15 (71,4%) Antiinflammatorische Vormedikation Insgesamt 39 (90,7%) 19 (86,4%) 20 (95,2%) Statine 24 (55,8%) 13 (59,1%) 11 (52,4%) Acetylsalicylsäure 33 (76,7%) 16 (72,7%) 17 (81%) Betablocker 31 (72,1%) 15 (68,2%) 16 (76,2%) Sevelamer 3 (7%) 1 (4,5%) 2 (9,5%) Immunsuppressiva 3 (7%) 1 (4,5%) 2 (9,5%) Phosphatbinder Insgesamt 42 (97,7%) 21 (95,5%) 21 (100%) Kalzium-haltige Phosphatbinder 37 (86%) 18 (81,8%) 19 (90,5%) Lanthancarbonat 12 (27,9%) 6 (27,3%) 6 (28,6%) Sevelamer 3 (7%) 1 (4,5%) 2 (9,5%) Aluminium-haltige Phosphatbinder 1 (2,3%) 1 (4,5%) 0 (0%) Bei den Werten handelt es sich um den Mittelwert (Standardabweichung) oder die Anzahl (Prozentsatz) 1 K=Harnstoffclearance (ml/min), t=Dialysedauer (min), V=Harnstoff-Verteilungsvolumen (ml) 2 Um Werte des PTH intakt in pg/ml zu erhalten, muss mit 9,43 multipliziert werden 3 Transitorische ischämische Attacke 4 Polyarthritis, chronische Hepatitis, HIV, Psoriasis, M. Wegener, M. Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, Ulcus cruris Tabelle 2.2: Epidemiologische und klinische Baseline Charakteristika der teilnehmenden Patienten.

45 Material und Methoden ______

Die Auswahl der Hämodialysepatienten erfolgte nach folgenden Ein- und Ausschlusskriterien:

1.) Einschlusskriterien: - Alter ! 18 Jahre - Zeit an der Dialyse: > 6 Monate und < 5 Jahre - Keine vorbestehende Therapie mit aktiven Vitamin D-Analoga oder Pausieren der aktiven Vitamin D-Therapie für 1 Monat („Washout“) - PTH intakt Plasmaspiegel 200 – 600 pg/ml (zu Studienbeginn, bzw. nach 1 Monat Washout) - Serum-Kalzium < 10.2 mg/dl und Serum-Phosphat von < 6.5 mg/dl zu Studienbeginn - 25-OH-Vitamin D Serumspiegel > 20 ng/ml - Modifikationen der Phosphatbindertherapie, der Dialysat-Kalzium- Konzentration, der Diät und der Dialysezeit sind entsprechend klinischer Behandlungsstandards erlaubt - Bei Frauen im gebärfähigen Alter: Vorhandensein eines negativen Schwangerschaftstests und Verwendung von effektiven Kontrazeptiva (Implantate, orale Kontrazeptiva, Injektionen, sexuelle Abstinenz oder Sterilisation des Partners)

2.) Ausschlusskriterien: - Akute Infektionen - Schwangerschaft oder Stillzeit - Instabile kardiovaskuläre Erkrankung (symptomatische koronare Herzkrankheit, dekompensierte Herzinsuffizienz, akuter Myokardinfarkt in den 6 Monaten vor Screening) - Malignom, mit Ausnahme nicht metastasierender Hauttumoren - Klinisch relevante gastrointestinale Störungen (Durchfall, Resorptionsstörungen, aktive Hepatitis, Ikterus) - Therapie mit Calcimimetika - Teilnahme an einer weiteren klinischen Prüfung oder

46 Material und Methoden ______

Studienteilnahme innerhalb von einem Monat vor Studieneinschluss

Die Beschränkung der Zeit an der Dialyse auf ein Intervall von 6 Monaten bis 5 Jahren erfolgte zur Sicherstellung, dass einerseits ein Steady-State- Behandlungszustand (nach 4-6 Monaten) erreicht wurde und andererseits um zu erwirken, dass Patienten mit therapierefraktärem (autonomem) sekundärem Hyperparathyreoidismus (Wahrscheinlichkeit steigt mit der Zeit an der Dialyse) soweit wie möglich von der Studie ausgeschlossen waren. Im Rahmen des Screenings wurden in den teilnehmenden Dialysezentren die Patientenakten hinsichtlich der Ein- und Ausschlusskriterien untersucht. Im Falle der vermuteten Erfüllbarkeit dieser Kriterien wurde eine Screening- Blutentnahme durchgeführt, in welcher PTH intakt, Kalzium, Phosphat und 25- OH-Vitamin D bestimmt wurden. Stand der Patient unter einer Therapie mit aktivem Vitamin D, so musste diese zuvor 4 Wochen pausiert werden. Wurden die Einschlusskriterien gemäß der Ergebnisse der Screening-Blutentnahme erfüllt, erfolgte der Einschluss in die Studie. Es wurden ausschließlich Patienten eingeschlossen, die zuvor ihr schriftliches Einverständnis nach erfolgter Aufklärung gegeben haben.

2.3 Studiendurchführung

Die Zuteilung in die jeweiligen Behandlungsarme erfolgte direkt nach dem Vorliegen der Ergebnisse der Screening-Blutentnahme durch das Studienbüro der Zentrale für klinische Studien der Universität Würzburg (ZKSW). Die Übermittlung der Randomisierung vom Studienbüro an die jeweiligen teilnehmenden Zentren erfolgte per Faxantwort. Sowohl die Patienten als auch die teilnehmenden Zentren unterlagen einer Verblindung in Bezug auf die Behandlungssequenz.

47 Material und Methoden ______

2.3.1 Studienmedikation

Die Studienmedikation (identisch aussehende Paricalcitol- und Placebo- Kapseln) wurde zur Verfügung gestellt von der Firma Abbott, Ludwigshafen, Deutschland. Gelagert wurde sie in der Zentrale für klinische Studien in Würzburg (ZKSW). Die Verschickung nach Randomisierung in die jeweiligen Zentren erfolgte postalisch und der Empfang wurde dort per Faxantwort an die ZKSW rückbestätigt. In den teilnehmenden Zentren wurde sie in einem temperaturüberwachten, abschließbaren Schrank gelagert. Es waren Lagertemperaturen zwischen 15°C und 30°C erlaubt. Zudem wurde durch einen Verantwortlichen die Bestellung, der jeweils aktuelle Bestand, die Ausgabe der Medikation und die Rückgabe unverbrauchter Medikation durch den Patienten an den Prüfarzt sichergestellt und in entsprechenden Formularen dokumentiert. Die Ausgabe und Rückgabe der Medikation erfolgte während der Behandlungsphasen alle 2 Wochen im Rahmen einer Studienvisite. Die Steuerung der Dosierung von 2 µg/Tag zu Beginn der Behandlungsphasen erfolgte anhand der Werte von Kalzium, Phosphat und PTH intakt. PTH intakt- Werte von < 100 pg/ml führten in einem ersten Schritt zu einer 50%-igen Dosisreduktion von Paricalcitol. Bei wiederholter Unterschreitung nach 3 Wochen (verkürztes Sicherheitsintervall) war der Ausschluss des Patienten aus der Studie vorgesehen. PTH intakt-Werte von > 300 pg/ml führten zur Erhöhung der täglichen Paricalcitol-Dosis in 1 µg-Schritten, sofern die Kalzium- und Phosphat-Spiegel im Normbereich blieben. Für PTH intakt-Werte von > 600 pg/ml trotz adäquater Dosisanpassungen war ebenfalls der Studienausschluss vorgesehen. Phosphat-Spiegel über dem Zielbereich 6.5 mg/dl im Serum wurden durch Anpassungen der Phospatbindertherapie korrigiert. Kalzium- Spiegel über dem Zielbereich von 10.2 mg/dl im Serum wurden zunächst mit Anpassungen der Dialysat-Kalzium-Konzentration und der kalziumhaltigen Phosphatbindertherapie, falls zutreffend, korrigiert. Falls die Kalzium- und Phosphat-Werte dann weiterhin erhöht blieben, wurde die Paricalcitol-Dosis um 50% abgesenkt.

48 Material und Methoden ______

2.3.2 Unerwünschte Ereignisse

Jedes unerwünschte Ereignis wurde dokumentiert. Alle schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse zwischen der Einschlussphase der Studie bis einschließlich 30 Tage nach letzter Gabe der Studienmedikation wurden dem Sponsor oder dessen Vertreter gemeldet. Dies erfolgte innerhalb von 24 Stunden per Telefon oder Fax unter Verwendung eines Berichts-Formulars.

2.3.3 Abbruchkriterien

Folgende Kriterien waren für den Ausschluss eines Patienten aus der Studie vorgesehen: - Verpassen von zwei aufeinanderfolgende Studienvisiten - Nierentransplantation - Widerruf der Einverständnis an der Studienteilnahme - Schwangerschaft während der Studienteilnahme - Interkurrente, klinisch signifikante Infektion (Fieber, Leukozytose, CRP-Erhöhung) ohne Resolution über 2 Visiten - Indikation für und Verordnung von Calcimimetika oder Immunsuppressiva während der Studienteilnahme

2.3.4 Gewinnung, Aufbereitung und Versand der Blutproben

Alle Blutproben wurden vor Beginn der jeweiligen Hämodialyse Sitzungen zu den in Tabelle 2.1 genannten Zeitpunkten entnommen. Die Blutprobenentnahme erfolgte standardisiert durch das verantwortliche Studienpersonal der jeweiligen Prüfzentren, so dass bei allen Patienten eine gleichartige Vorgehensweise garantiert war. Zur Blutentnahme wurden folgende Röhrchen der Firma Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland verwendet:

49 Material und Methoden ______

- EDTA-Monovette® 7,5 ml: PTH intakt - EDTA-Monovette® 2,7 ml: Blutbild - Serum-Monovette® 7,5 ml: Na+, K+, Ca2+, Phosphat, AP, Kreatinin, Harnstoff, Albumin, Eiweiß, 25-OH- Vitamin D - Serum-Monovette® 7,5 ml: hsCRP, Fetuin A, FGF-23 - Serum-Monovette® 7,5 ml: Hepcidin, t-ucMGP

Die entnommenen Blutproben wurden innerhalb von 30 Minuten der Verarbeitung zugeführt. Die Zentrifugation von Serum und EDTA-Plasma erfolgte standardisiert bei 2000 rpm für 8 Minuten. Der Überstand wurde in leere Standard-Plastikröhrchen überführt. Die Röhrchen wurden ebenso wie die Laboranforderungsscheine mit der Randomisierungsnummer bzw. Screeningnummer, den Patienteninitialen, der Visitennummer und dem Entnahmedatum beschriftet. Das EDTA-Plasma zur Messung von PTH intakt wurde umgehend bei -20°C eingefroren. Die Serum-Proben zur Messung der Routineparameter (Na+, K+, AP, Kreatinin, Harnstoff, Albumin, Eiweiß), Ca2+ und Phosphat, sowie das EDTA-Blutbild wurden im Kühlschrank bei 4°C gelagert. Innerhalb von 24 Stunden wurden diese Proben in die zertifizierten Versorgungslabore der einzelnen Zentren verbracht, ohne dabei die Kühlkette zu unterbrechen. Die ermittelten Laborwerte wurden von dem verantwortlichen Studienpersonal vor Ort dokumentiert. Die Serum-Proben zur Messung von hsCRP, Fetuin A, FGF-23, Hepcidin und t- ucMGP wurden zunächst aliquotiert und bei -20°C in den Prüfzentren eingefroren und aufbewahrt. Nach Studienende wurden diese dann per Trockeneisabholung über den Kurierdienst GO!, Bonn, Deutschland in die entsprechenden, analysierenden Labore.

50 Material und Methoden ______

2.4 Laboranalytik

Die Messung der Routineparameter (Na+, K+, Ca2+, Phosphat, AP, Kreatinin, Harnstoff, Albumin, Eiweiß, 25-OH-Vitamin D, Blutbild) und PTH intakt erfolgte in den zertifizierten Versorgungslaboren der einzelnen Zentren. Die Messung von hsCRP, Fetuin A und FGF-23 erfolgte im Labor Limbach, Heidelberg, Deutschland. Hierfür wurden folgende kommerziell erhältliche Assays gemäß Protokoll des jeweiligen Herstellers verwendet:

1) hsCRP: CardioPhase® hsCRP Assay (Nephelometrie) gemessen mit dem Dimension Vista® System der Firma Siemens, München, Deutschland.

2) Fetuin A: EDI™ Human Fetuin-A ELISA Kit der Firma Epitope Diagnostics, San Diego, Kalifornien, USA.

3) FGF-23: Human FGF-23 (C-Term) ELISA Kit (2nd Generation) der Firma Immutopics, San Clemente, Kalifornien, USA.

Die Bestimmung von t-ucMGP erfolgte durch die Firma VitaK BV (CEO Dr. Cees Vermeer) in Assoziation mit dem CARIM (CArdioVascular Research Institute Maastricht) der Universität Maastricht, Maastricht, Niederlande. Dabei wurde ein ELISA Assay verwendet, wobei ein spezieller Antikörper gegen die uncarboxylierte MGP-Sequenz 35-49 (mAb-ucMGP) zum Einsatz kam343. Die Bestimmung von Hepcidin erfolgte im Department of Clinical Biochemistry (Ansprechpartner: Mark Busbridge) des Charing Cross Hospital in London, Vereinigtes Königreich. Zur Messung wurde ein Radioimmunassay benutzt, bei welchem ein polyklonaler Antikörper gegen Hepcidin vom Kaninchen verwendet wurde344.

51 Material und Methoden ______

2.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte durch die Zentrale für klinische Studien der Universität Würzburg (ZKSW) nach Beendigung der Studie. Zwischenanalysen wurden nicht durchgeführt. Die Aufbereitung aller Daten und die graphischen Darstellungen wurde unter Verwendung des Softwareprogrammes Microsoft Excel® der Firma Microsoft, Redmond, Washington, USA erstellt. Zur Durchführung der statistischen Analysen wurde das Softwareprogramm SAS (Statistical Analysis System) der Firma SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA angewendet. Alle Signifikanztests innerhalb der Auswertung erfolgten zweiseitig, das Signifikanzniveau war 0,05.

2.5.1 Analyse der Zielparameter

Zur Auswertung der primären Zielparameter hsCRP und Fetuin A sowie des sekundären Zielparameters FGF-23 wurde die 3-Schritt-Prozedur von Tudor & Koch345 angewendet, welcher das Modell von Grizzle für 2x2 Crossover- Studien zugrunde liegt346. Hierbei handelt es sich um 3 hintereinander geschaltete Analysen, bei welchen neben dem Test auf einen unterschiedlichen Behandlungseffekt (%) durch das Verum Paricalcitol (T) gegenüber der Kontrolle Placebo (C) auch eine Untersuchung auf mögliche Periodeneffekte (&) und Carryover Effekte ('), die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 wirken, erfolgt. Zur Erhöhung der statistischen Power werden die Baselinewerte der beiden Behandlungsphasen in die Auswertung mit einbezogen, wenn eine zumindest moderate Korrelation (Spearman’scher Korrelationskoeffizient ! 0,5) zwischen den Beobachtungen am selben Patient (Zeitpunkte Baseline, Ende Phase 1, Beginn Phase 2, Ende Phase 2) vorliegt. Folgende Analysen sind Bestandteil der oben genannten 3-Schritt-Prozedur:

52 Material und Methoden ______

Analyse 1: Test zum Vergleich der Behandlungseffekte von Paricalcitol und Placebo über die beiden Phasen hinweg.

H0: { 2 (%(T) - %(C)) - ('(T) - '(C)) = 0 }

Wenn diese Nullhypothese H0 verworfen werden kann, kann davon ausgegangen werden, dass für eine der beiden Behandlungen ein größerer Response über die beiden Phasen hinweg vorherrscht. In diesem Fall erfolgt im nächsten Schritt Analyse 2.

Analyse 2: Schätzung der Differenz der Carryover Effekte.

H0('): '(T) = '(C)

Kann die Nullhypothese H0(') nicht abgelehnt werden, deutet dies zusammen mit der Ablehnung von H0 auf einen tatsächlichen Unterschied in den direkten

Behandlungseffekten hin. Kann die Nullhypothese H0(') hingegen abgelehnt werden, so kann davon ausgegangen werden, dass die direkten Behandlungseffekte und/oder Carryover-Effekte der beiden Behandlungen unterschiedlich sind. In diesem Fall erfolgt im dritten Schritt Analyse 3.

Analyse 3: Schätzung der Differenz der direkten Behandlungseffekte.

H0(%): %(T) = %(C)

Hierdurch erfolgt die Klärung welcher mögliche Unterschied, der zwischen den direkten Behandlungseffekten oder der zwischen den Carryover Effekten, hauptsächlich für die Ablehnung von H0 verantwortlich ist.

Zudem kann unter der Annahme gleicher Carryover Effekte ('(T) = '(C) = ') ein Test der Nullhypothese gleicher Periodeneffekte durchgeführt werden:

53 Material und Methoden ______

H0(&): &(2) + ' - &(1) = 0

Ferner kann mittels der Baselinewerte zu Beginn der Phase 1 und zu Beginn der Phase 2 nach der Washout-Phase auch die Hypothese getestet werden, ob mögliche Carryover Effekte (() von der Phase 1 hinein in die Washout-Phase unterschiedlich sind:

H0((): ((T) = ((C)

Da die Werte der Zielparameter nur ungenügend mit der Normalverteilungsannahme verträglich sind, erfolgten die Analysen zunächst nichtparametrisch. Zum Testen der oben genannten Hypothesen wurden daher für die primären Zielparameter hsCRP und Fetuin A sowie des sekundären Zielparameters FGF-23 der Mann-Whitney-Test347 und für die Punktschätzung der Lokationsparameter der Hodges-Lehmann-Schätzer348 mit zughörigem 95%-Konfidenzintervall nach der exakten Methode verwendet. Zum Vergleich wurden jeweils der T-Test für unabhängige Stichproben und die parametrische Mittelwertschätzung mit 95%-Konfidenzintervall berechnet. Zur Auswertung der sekundären Zielparameter Hepcidin und t-ucMGP erfolgte lediglich die deskriptive Untersuchung aller oben genannter Hypothesen mittels Punktschätzung der Lokationsparameter unter Verwendung des Hodges- Lehmann-Schätzer mit zughörigem 95%-Konfidenzintervall nach der exakten Methode. Nur zum Vergleich wurde jeweils auch die parametrische Mittelwertschätzung mit 95%-Konfidenzintervall berechnet. Des Weiteren wurden rein deskriptiv die Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen aller Zielparameter zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen und ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte dargestellt.

54 Material und Methoden ______

2.5.2 Analyse der Sicherheitsvariablen

Zur Auswertung der Sicherheitsparameter erfolgte die deskriptive Darstellung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen und 95%- Konfidenzintervallen von PTH intakt, Kalzium und Phosphat anhand derer die Adjustierung der Dosierung der Studienmedikation vorgenommen wurde. Hierfür wurden jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo beide Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte zusammengefasst. Zudem erfolgte in gleicher Weise die Darstellung von Albumin im Serum.

55 Ergebnisse ______

3 Ergebnisse

3.1 Studienteilnehmerfluss

Der Studienteilnehmerfluss in Bezug auf Vorauswahl, Ausschluss, Randomisierung, Studienabbruch und Einschluss in die Analyse ist in Abbildung 3.1 dargestellt:

Vorausgewählte Patienten (n = 44)

Einschlusskriterium nicht erfüllt (n = 1)

Randomisierte Patienten (n = 43)

Sequenz A (Paricalcitol – Placebo) Sequenz B (Placebo – Paricalcitol) (n = 22) (n = 21)

Vorzeitiger Studienabbruch (n = 7) Vorzeitiger Studienabbruch (n = 7) wegen: wegen: - PTH < 100 pg/ml (n = 5) - PTH < 100 pg/ml (n = 3) - Nierentransplantation (n = 1) - Nierentransplantation (n = 2) - Tod (n = 1) - Schweres unerwünschtes Ereignis (n = 1) - Noncompliance (n = 1)

Ausschluss von der Analyse wegen Ausschluss von der Analyse wegen unvollständiger Messwerte (n = 1) unvollständiger Messwerte (n = 3)

Einschluss in die Analyse (n = 14) Einschluss in die Analyse (n = 11)

Abbildung 3.1: Studienteilnehmerfluss in Bezug auf Vorauswahl, Ausschluss, Randomisierung, Studienabbruch mit Begründung und Einschluss in die Analyse.

Von 44 vorausgewählten Patienten konnten 43 eingeschlossen werden. Bei 14 (32,6%) Patienten kam es zu einem vorzeitigen Studienabbruch, so dass von insgesamt 29 (67,4%) Patienten die Studie protokollgemäß beendet wurde. Bei 4 dieser 29 Patienten lagen keine vollständigen Messwerte vor. Somit konnten

56 Ergebnisse ______

25 Patienten, 14 der Sequenz A und 11 der Sequenz B, der statistischen Analyse zugeführt werden.

3.2 Ergebnisse der Analyse der Zielparameter

Zur Überprüfung, ob die Baselinewerte der beiden Behandlungsphasen in die Auswertung mit einbezogen werden konnten, wurden die Spearman’schen Korrelationskoeffizienten zwischen den Beobachtungswerten zum selben Patienten errechnet. Die Ergebnisse in Bezug auf die jeweiligen Zielparameter sind in Tabelle 3.1 wiedergegeben:

Parameter Spearman'sche Korrelationskoeffizienten* hsCRP 0,54 - 0,74 Fetuin A 0,43 - 0,75 FGF-23 0,72 - 0,83 t-ucMGP 0,52 - 0,83 Hepcidin 0,53 - 0,80 * Beobachtungswerten zu den Zeitpunkten Baseline, Ende Phase 1, Beginn und Ende Phase 2

Tabelle 3.1: Spearman’schen Korrelationskoeffizienten zwischen den Beobachtungswerten aller Zielparameter zum selben Patienten.

Es zeigte sich für nahezu alle Zielparameter eine zumindest moderate Korrelation (Spearman’scher Korrelationskoeffizient ! 0,5) zwischen den Beobachtungen am selben Patient, weshalb alle Baselinewerte mit in die Auswertung einbezogen wurden. Lediglich die Beobachtungen für Fetuin A zum Ende der Phase 2 zeigten eine geringe Korrelation mit den Beobachtungen zu Baseline (Spearman’scher Korrelationskoeffizient 0.43) sowie mit den Beobachtungen zu Beginn der Phase 2 (Korrelationskoeffizient 0.48). Die Spearman’schen Korrelationskoeffizienten zwischen den Beobachtungswerten für die Zeitpunkte Baseline, Ende Phase 1 und Beginn Phase 2 lagen jedoch zwischen 0.61 und 0.75, und waren somit hoch genug, um ebenfalls die Baselinewerte von Fetuin A für die Auswertung mit zu berücksichtigen.

57 Ergebnisse ______

3.2.1 Ergebnisse der Analyse von hsCRP

Die Ergebnisse der Analysen zu den in Kapitel 2.5.1 genannten Nullhypothesen für hsCRP sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst:

Nullhypothese Mann-Whitney-Test Hodges-Lehmann- t-Test Mittelwertschätzung (p-Wert) Schätzung (p-Wert) (95%-Konfidenzintervall) (95%-Konfidenzintervall) Behandlungseffekte über beide - 0,215 - 0,809 Perioden hinweg sind gleich: 0,85 0,72 (- 4,82 , + 4,26) (- 5,416 , + 3,798) H0: { 2 (!(T) - !(C)) - ("(T) - "(C)) = 0 } Carryover Effekte, die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 - 3,325 - 3,743 wirken sind gleich: (- 11,47 , + 2,93) (- 10,592 , + 3,106)

H0("): "(T) = "(C) Direkte Behandlungseffekte sind gleich: - 1,345 - 2,276 (- 8,39 , + 1,09) (- 6,923 , + 2,371) H0(!): !(T) = !(C) Periodeneffekte sind gleich: - 1,51 - 3,382 0,273 0,143 H0(#): #(2) + " - #(1) = 0 (- 7,79 , + 2,66) (- 7,989 , + 1,226) Carryover Effekte von Phase 1 hinein in Washout-Phase sind - 3,15 - 2,717 0,051 0,179 gleich: (- 7,68 , - 0,02) (- 6,777 , + 1.342)

H0($): $(T) = $(C)

Tabelle 3.2: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für hsCRP.

Es zeigte sich bezüglich den Behandlungseffekten, Carryover Effekten und Periodeneffekten keine signifikanten Unterschiede. Die Nullhypothesen der jeweiligen Tests konnten nicht abgelehnt werden. Lediglich bezüglich der Carryover Effekte von der Phase 1 hinein in die Washout-Phase bestand eine Borderline-Signifikanz, weshalb unterschiedliche Carryover Effekte aus Phase 1 hinein in die Washout-Phase nicht ausgeschlossen werden konnten. Durchgehend präsentierte sich jedoch in Bezug auf alle Effekte eine Verschiebung zu höheren Werten für hsCRP unter der Placebobehandlung. Somit bestand ein Trend zu niedrigeren Werten unter Paricalcitolbehandlung, der aber nicht signifikant war. Dieser Effekt konnte auch rein deskriptiv bei Berechnung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher

58 Ergebnisse ______

Periodeneffekte oder Carryover Effekte nachgewiesen werden. Insbesondere kam es in der Paricalcitolgruppe zu einem Abfall des hsCRP von 32,6%. Einschränkend muss dabei jedoch erwähnt werden, dass zu dem deutlichen Abfall der Mittelwerte in der Paricalcitolgruppe ein Ausreißerwert beigetragen hat. Bei Patient 04-9933 betrug der Baselinewert in der Paricalcitolphase 67 mg/l. Bei der Betrachtung der Mediane, in welche dieser Einzelwert nur als größter Wert eingeht und somit die absolute Größe für die Berechnung unerheblich ist, zeigte sich in der Paricalcitolgruppe ebenfalls ein kontinuierlicher Abfall von hsCRP in jedoch abgeschwächtem Ausmaß (s. Tabelle 3.3, Abbildung 3.2 und 3.3):

Baseline 6 Wochen 12 Wochen Differenz (Baseline - Woche 12) absolut (prozentual) Mittelwerte Paricalcitol 8,78 6,07 5,92 - 2,86 (Standardabweichung) (13,1) (5,08) (5,14) (- 32,6%) Mittelwerte Placebo 5,51 5,72 6,13 0,62 (Standardabweichung) (4,25) (5,6) (4,88) (+ 11,3%)

Mediane Paricalcitol 5,06 4,32 4,3 - 0,76

ZeitpunktMediane PlaceboMittelwerte Mittelwerte4,72 Standardabweichung3,83 Standardabweichung4,41 Mediane -Mediane 0,31 Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 8,78 5,51 13,1 4,25 5,06 4,72 6 Wochen 6,07 5,72 5,08 5,6 4,32 3,83 12Tabelle Wochen 3.3: Mediane,5,92 Mittelwerte6,13 mit Standardabweichungen5,14 4,88 und Differenzen4,3 für4,41 hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: mg/l). Mean hsCRP-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

9 8,5 Using BOTH Periods 8 7,5 7 6,5 Mittelwerte Paricalcitol 6 Mittelwerte 5,5 Placebo Mittelwerte (mg/l) Mittelwerte(mg/l) 5 4,5 4 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.2: Verlauf der Mittelwerte für hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Median hsCRP-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

5,5

5 59

4,5 Mediane Paricalcitol 4 Mediane Placebo Mediane (mg/l) (mg/l) Mediane

3,5

3 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Zeitpunkt Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 8,78 5,51 13,1 4,25 5,06 4,72 6 Wochen 6,07 5,72 5,08 5,6 4,32 3,83 12 Wochen 5,92 6,13 5,14 4,88 4,3 4,41

Mean hsCRP-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

9 8,5 Using BOTH Periods 8 7,5 7 6,5 Mittelwerte Paricalcitol 6 Mittelwerte 5,5 Placebo Mittelwert (mg/l) (mg/l) Mittelwert 5 4,5 4 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Ergebnisse ______Median hsCRP-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

5,5

4,5 Mediane Paricalcitol 4 Mediane Placebo Mediane (mg/l) (mg/l) Mediane

3,5

3 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.3: Verlauf der Mediane für hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

3.2.2 Ergebnisse der Analyse von Fetuin A

Die Ergebnisse der Analysen zu den Nullhypothesen für Fetuin A sind in Tabelle 3.4 abgebildet:

Nullhypothese Mann-Whitney-Test Hodges-Lehmann- t-Test Mittelwertschätzung (p-Wert) Schätzung (p-Wert) (95%-Konfidenzintervall) (95%-Konfidenzintervall) Behandlungseffekte über beide < 0,00005 0,003 Phasen hinweg sind gleich: 0,827 0,899 (- 0,04 , + 0,05) (- 0,043 , +0,049) H0: { 2 (!(T) - !(C)) - ("(T) - "(C)) = 0 } Carryover Effekte, die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 0,075 0,079 wirken sind gleich: (- 0,03 , + 0,17) (- 0,019, + 0,176)

H0("): "(T) = "(C) Direkte Behandlungseffekte sind gleich: 0,04 0,041 (- 0,02, + 0,10) (- 0,012, + 0,093) H0(!): !(T) = !(C) Periodeneffekte sind gleich: - 0,01 - 0,003 0,605 0,899 H0(#): #(2) + " - #(1) = 0 (- 0,04 , + 0,04) (- 0,049 , + 0,043) Carryover Effekte von Phase 1 hinein in Washout-Phase sind 0,04 0,039 gleich: (- 0,01 , + 0,09) (- 0,013 , + 0,090)

H0($): $(T) = $(C)

Tabelle 3.4: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für Fetuin A.

60 Ergebnisse ______

Es zeigte sich zwischen Paricalcitol und Placebo in der Gesamtbetrachtung von Behandlungseffekten und Carryover Effekten eine nahezu nicht von Null zu unterscheidende Differenz im Response über die beiden Phasen hinweg. Auch ein Trend war nicht erkennbar. Lediglich in Bezug auf die getrennten Schätzungen der Carryover Effekte und direkten Behandlungseffekte präsentierten sich leichte Verschiebungen hin zu höheren Werten für Fetuin A unter Paricalcitol. Diese waren allerdings auf Grund der schwachen Ausprägung bei geringer Fallzahl statistisch nicht als signifikant nachzuweisen. Auch rein deskriptiv zeigte sich bei Berechnung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte nahezu keine Differenz (s. Tabelle 3.5, Abbildung 3.4 und 3.5):

Baseline 6 Wochen 12 Wochen Differenz (Baseline - Woche 12) absolut (prozentual) Mittelwerte Paricalcitol 0,333 0,341 0,333 0 (Standardabweichung) (0,062) (0,075) (0,062) (0%) Mittelwerte Placebo 0,339 0,332 0,331 - 0,008 (Standardabweichung) (0,0575) (0,067) (0,071) (- 2,4%)

Mediane Paricalcitol 0,33 0,32 0,34 0,01

Mediane Placebo 0,33 0,32 0,33 0

Tabelle 3.5: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und Differenzen für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: g/l).

61 Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Basline 0,333 0,339 0,062 0,0575 0,33 0,33 Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo 6 Wochen 0,341 0,332 0,075 0,067 0,32 0,32 Basline 0,333 0,339 0,062 0,0575 0,33 0,33 12 Wochen 0,333 0,331 0,062 0,071 0,34 0,33 6 Wochen 0,341 0,332 0,075 0,067 0,32 0,32 12 Wochen 0,333 0,331 0,062Ergebnisse 0,071 0,34 0,33 ______Mean Fetuin-A Serum values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks Mean Fetuin-A Serumtreatment; values for at Paricalcitol baseline, after and 6 Placebo weeks and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 0,4 0,4

0,38 0,38

0,36 0,36 Mittelwerte Paricalcitol Mittelwerte 0,34 MittelwerteParicalcitol Placebo

Mittelwerte (g/l) Mittelwerte(g/l) 0,34 Mittelwerte Placebo 0,32 Mittelwerte(g/l)

0,32

0,3

0,3 Basline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Basline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.4: Verlauf der Mittelwerte für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Median Fetuin-A Serum values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks Median Fetuin-A Serumtreatment; values for at Paricalcitol baseline, after and Placebo6 weeks and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 0,4

0,4 0,38

0,38 0,36 Mediane 0,36 Paricalcitol Mediane 0,34 Mediane Meanvalue Paricalcitol Placebo 0,34 Mediane

Mediane (g/l) (g/l) Mediane Placebo 0,32

0,32 0,3 Basline 6 Wochen 12 Wochen 0,3 Time of measurement Basline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.5: Verlauf der Mediane für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

3.2.3 Ergebnisse der Analyse von FGF-23

Da die originalen FGF-23-Werte größenordnungsmäßigen Schwankungen unterliegen, wurden im Einklang mit der in der Literatur üblichen Vorgehensweise vor der Auswertung alle Daten logarithmisch transformiert (natürlicher Logarithmus zur Basis e). Die Ergebnisse der Analysen zu den

62 Ergebnisse ______

Nullhypothesen für die logarithmierten Werte von FGF-23 sind in Tabelle 3.6 aufgeführt:

Nullhypothese Mann-Whitney-Test Hodges-Lehmann- t-Test Mittelwertschätzung (p-Wert) Schätzung (p-Wert) (95%-Konfidenzintervall) (95%-Konfidenzintervall) Behandlungseffekte über beide 0,599 0,595 Phasen hinweg sind gleich: 0,051 0,039 (+ 0,064 , + 1,173) (+ 0,033 , + 0,158) H0: { 2 (!(T) - !(C)) - ("(T) - "(C)) = 0 } Carryover Effekte, die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 0,407 0,306 0,467 0,441 wirken sind gleich: (- 0,510 , + 1,212) (- 0,500 , + 1,112)

H0("): "(T) = "(C) Direkte Behandlungseffekte sind gleich: 0,61 0,467 (- 0,06 , + 1,20) (- 0,175 , + 1,108) H0(!): !(T) = !(C) Periodeneffekte sind gleich: 0,57 0,530 0,064 0,064 H0(#): #(2) + " - #(1) = 0 (- 0,03 , + 1,22) (- 0,033 , + 1,092) Carryover Effekte von Phase 1 hinein in Washout-Phase sind 0,11 0,033 0,69 0,912 gleich: (- 0,49 , + 0,70) (- 0,570 , + 0,636)

H0($): $(T) = $(C)

Tabelle 3.6: Zusammenfassung der Analyseergebnisse der logarithmierten FGF-23-Werte.

Im Vergleich der Behandlungseffekte über die beiden Phasen hinweg zeigte sich eine Borderline-Signifikanz hinsichtlich höherer FGF-23-Werte unter Paricalcitol. In den 95%-Konfidenzintervallen sowohl der nichtparametrischen als auch der parametrischen Schätzung war die Null jeweils nicht enthalten. Da sich unterschiedliche Carryover-Effekte im Sinne einer Verschiebung hin zu höheren FGF-23-Werten unter Paricalcitol allenfalls andeuteten, jedoch statistisch nicht signifikant nachzuweisen waren, konnten die deutlich höheren FGF-23-Werte unter Paricalcitol über beide Phasen hinweg so interpretiert werden, dass eine tatsächlich vorhandene Differenz zwischen den direkten Behandlungseffekten primär verantwortlich für das borderline-signifikante Resultat war. Des Weiteren zeigte sich bezüglich der Periodeneffekte eine borderline- signifikante Verschiebung hin zu höheren Werten in Phase 2. Rein deskriptiv konnte mit der Darstellung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher

63 Ergebnisse ______

Periodeneffekte oder Carryover Effekte ebenfalls die Tendenz zu deutlich höheren FGF-23-Werten unter Paricalcitol gezeigt werden (s. Tabelle 3.7, Abbildung 3.6 und 3.7):

Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 5,606 5,662 1,258 1,395 5,268 5,308 Zeitpunkt6 Wochen Mittelwerte6,588 Mittelwerte5,878 Standardabweichung1,316 Standardabweichung1,352 Mediane Mediane6,617 5,522 Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo 12Zeitpunkt Wochen Mittelwerte6,089 Mittelwerte5,823 Standardabweichung1,358 Standardabweichung1,484 Mediane Mediane5,79 5,313 Basline 5,606 5,662 1,258 1,395 5,268 5,308 Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo 6 Wochen 6,588 5,878 1,316 1,352 6,617 5,522 Basline 5,606 5,662 1,258 1,395 5,268 5,308 Tabelle12 Wochen 3.7: Mediane,6,089 Mittelwerte5,823 und1,358 Standardabweichungen1,484 für die5,79 logarithmierten5,313 Werten 6 Wochen Mean6,588 LN(FGF23)5,878 values at1,316 baseline, after 6 1,352weeks and after6,617 12 weeks5,522 treatment; for 12 Wochen 6,089 5,823 1,358 1,484 5,79 5,313 von FGF-23 unter der Behandlung mit ParicalcitolParicalcitol und Placebo.and Placebo Mean LN(FGF23) values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for

Mean LN(FGF23) values at baseline,Paricalcitol after and 6 weeks Placebo and after 12 weeks treatment; for 6,8 Paricalcitol and Placebo 6,8 6,6 6,66,8 6,4 6,46,6

6,26,46,2

6,26 6 Mittelwerte Mittelwerte 5,86 Paricalcitol Paricalcitol

Mittelwerte 5,8 Mittelwerte

Mittelwerte Mittelwerte 5,65,8 Paricalcitol Placebo Mittelwerte Mittelwerte 5,6 Placebo 5,45,6 Mittelwerte Placebo 5,4 5,25,4

5,255,2 Basline 6 Wochen 12 Wochen 5 5 Zeitverlauf BaslineBaseline 6 Wochen6 Wochen 12 Wochen12 Wochen Abbildung 3.6: Verlauf der MittelwerteZeitverlauf fürZeitverlauf die logarithmierten Werte von FGF-23 unter der Behandlung mitMedian Paricalcitol LN(FGF23) und Placebo. values at baseline, after 6 weeks, and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo Median LN(FGF23) values at baseline, after 6 weeks, and after 12 weeks treatment; 6,8 Median LN(FGF23) valuesfor Paricalcitolat baseline, and after Placebo 6 weeks, and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 6,6 6,8 6,4 6,66,8 6,2 6,46,6 6 6,2 Mediane Mediane 5,86,4 Paricalcitol 6 MedianeMediane

Mediane 5,66,2 5,8 PlaceboParicalcitol 5,4 5,6 6 Mediane Placebo Mediane

5,2Mediane 5,45,8 Paricalcitol 5 5,2 Mediane 5,6 Basline 6 Wochen 12 Wochen Placebo 5 Zeitverlauf 5,4 Basline 6 Wochen 12 Wochen 5,2 Zeitverlauf

5 Abbildung 3.7: Verlauf der Mediane für die logarithmierten Werte von FGF-23 unter der Baseline 6 Wochen 12 Wochen Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Zeitverlauf

64 Ergebnisse ______

3.2.4 Ergebnisse der Analyse von t-ucMGP

Die Ergebnisse der parametrischen und nichtparametrischen Schätzungen der Effekte für t-ucMGP sind in Tabelle 3.8 zusammengefasst:

Nullhypothese Mann-Whitney-Test Hodges-Lehmann- t-Test Mittelwertschätzung (p-Wert) Schätzung (p-Wert) (95%-Konfidenzintervall) (95%-Konfidenzintervall) Behandlungseffekte über beide Phasen hinweg sind gleich: 167,5 186,9 (- 273,0 , + 617,0) (- 269,7 , + 643,4) H0: { 2 (!(T) - !(C)) - ("(T) - "(C)) = 0 } Carryover Effekte, die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 244,0 122,8 wirken sind gleich: (- 525,0 , + 693,0) (- 467,4 , + 713,0)

H0("): "(T) = "(C) Direkte Behandlungseffekte sind gleich: 150,5 126,8 (- 175,0 , + 485,0) (- 234,5 , + 488,1) H0(!): !(T) = !(C) Periodeneffekte sind gleich: - 1102,5 - 1166,7

H0(#): #(2) + " - #(1) = 0 (- 1594,0 , - 691,0) (- 1623,3 , - 710,2) Carryover Effekte von Phase 1 hinein in Washout-Phase sind - 8,0 - 56,11 gleich: (- 415,0 , + 378,0) (- 443,4 , + 331,2)

H0($): $(T) = $(C)

Tabelle 3.8: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für t-ucMGP.

Es zeigten sich über beide Phasen hinweg eine Verschiebung zu höheren Werte unter der Behandlung mit Paricalcitol. Diese Tendenz ist aber zu schwach, um zu signifikanten Ergebnissen zu führen. Hinweise auf relevante Carryover Effekte ergaben sich nicht. Jedoch zeigten sich in Bezug auf die Periodeneffekte deutlich höhere Werte in Phase 2 im Vergleich zu Phase 1. Dieser schwer zu interpretierende Effekt war sowohl unter der Behandlung mit Paricalcitol als auch unter der mit Placebo zu deutlich zu erkennen. Auch bei Berechnung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte konnte kein relevanter Unterschied zwischen den Behandlungsarmen aufgezeigt werden (s. Tabelle 3.9, Abbildung 3.8 und 3.9):

65 Ergebnisse ______

Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 2209 2193,6 562,2 593,1 2199 2018 Zeitpunkt6 Wochen Mittelwerte2260,3 Mittelwerte2222,8 Standardabweichung653,4 Standardabweichung560,6 Mediane Mediane2253 2057 Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo 12 Wochen 2384,5 2384,6 681,4 651,3 2175 2302 BaslineZeitpunkt Mittelwerte2209 Mittelwerte2193,6 Standardabweichung562,2 Standardabweichung593,1 Mediane2199 Mediane2018 6 Wochen Paricalcitol2260,3 Placebo2222,8 Paricalcitol653,4 Placebo560,6 Paricalcitol2253 Placebo2057 Basline12Tabelle Wochen 3.9:2384,5 2209Mediane,2384,62193,6 Mittelwerte 681,4562,2 und Standardabweichungen651,3593,1 für21752199 t-ucMGP23022018 unter der 6 Wochen 2260,3Mean ucMGP2222,8 values at653,4 baseline, after 6 560,6weeks and after2253 12 weeks2057 treatment; for 12 Wochen 2384,5 2384,6 681,4 651,3 2175 2302 Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit:Paricalcitol nM). and Placebo Mean ucMGP values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 2500 Mean ucMGP values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 2500

25002400 2400

2400 2300 2300 Mittelwerte Mittelwerte Paricalcitol 2300 Paricalcitol 2200 Mittelwerte 2200 Mittelwerte Mittelwerte Placebo PlaceboParicalcitol

2200 Mittelwerte(nM) Mittelwerte Mittelwerte (nM) Mittelwerte(nM) Placebo 21002100 Mittelwerte (nM) Mittelwerte(nM) 2100 20002000 Basline 6 Wochen 12 Wochen 2000 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Basline 6Zeitverlauf Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.8: Verlauf der Mittelwerte für t-ucMGP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Median ucMGP values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Treatment summarizing/descriptiveMedian ucMGP values graphs atParicalcitol baseline, and after Placebo 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Median ucMGP values at baseline, Paricalcitolafter 6 weeks and and Placebo after 12 weeks treatment; for Treatment summarizing/descriptiveParicalcitol graphs and Placebo Treatment2500 summarizing/descriptive graphs 2500 2500 2400

24002400 2300 Mediane 23002300 Paricalcitol 2200 MedianeMediane Mediane Paricalcitol Mediane (nM) (nM) Mediane Placebo Paricalcitol 2200 Mediane 2200 Mediane Mediane (nM) (nM) Mediane 2100 Placebo

Mediane (nM) (nM) Mediane Placebo 2100 20002100 Basline 6 Wochen 12 Wochen 2000 Zeitverlauf 2000 Basline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.9: Verlauf der Mediane für t-ucMGP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

66 Ergebnisse ______

3.2.5 Ergebnisse der Analyse von Hepcidin

Die Ergebnisse der parametrischen und nichtparametrischen Schätzungen für Hepcidin sind in Tabelle 3.10 aufgeführt:

Nullhypothese Mann-Whitney-Test Hodges-Lehmann- t-Test Mittelwertschätzung (p-Wert) Schätzung (p-Wert) (95%-Konfidenzintervall) (95%-Konfidenzintervall) Behandlungseffekte über beide Phasen hinweg sind gleich: 29,49 130,6 (- 44,7 , + 198,89) (- 49,36 , + 310,6) H0: { 2 (!(T) - !(C)) - ("(T) - "(C)) = 0 } Carryover Effekte, die aus Phase 1 hinüber in Phase 2 33,19 3,36 wirken sind gleich: (- 173,26 , + 207,67) (- 183,0 , + 189,7)

H0("): "(T) = "(C) Direkte Behandlungseffekte sind gleich: 64,94 71,94 (- 30,96 , +142,59) (- 37,61 , + 181,5) H0(!): !(T) = !(C) Periodeneffekte sind gleich: 10,66 2,63

H0(#): #(2) + " - #(1) = 0 (- 81,26 , + 99,37) (- 177,3 , + 182,6) Carryover Effekte von Phase 1 hinein in Washout-Phase sind - 2,40 9,93 gleich: (- 107,77 , + 89,88) (- 128,8 , + 148,7)

H0($): $(T) = $(C)

Tabelle 3.10: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für Hepcidin.

Insgesamt zeigte sich über beide Phasen ein leichter Trend hin zu höheren Werten für Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol, der jedoch nicht als signifikant nachgewiesen werden konnte. Dieser Trend resultierte insbesondere aus einem Abfall der Hepcidin-Werte unter Placebo, während die Werte unter Paricalcitol nahezu unverändert blieben. Es ergaben sich ferner keine Hinweise auf Carryover Effekte oder Periodeneffekte. Auch rein deskriptiv bei Berechnung der Mediane und Mittelwerte mit Standardabweichungen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12 jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte ließ sich der Trend zu niedrigeren Werten unter Placebo bei nahezu unveränderten Werten unter Paricalcitol illustrieren (s. Tabelle 3.11, Abbildung 3.10 und 3.11):

67 Ergebnisse ______

Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 312,6 321,75 171,4 179,9 290,6 326,6 Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane 6 WochenParicalcitol295,8 Placebo248,9 Paricalcitol142,7 Placebo 133,9 Paricalcitol 245,4Placebo 246,3 Zeitpunkt12 WochenMittelwerte303,7 Mittelwerte247,5 Standardabweichung214,8 Standardabweichung128,1 Mediane 253,7Mediane 226,6 Baseline Paricalcitol312,6 Placebo321,75 Paricalcitol171,4 Placebo179,9 Paricalcitol290,6 Placebo326,6 Baseline6 Wochen 295,8312,6 321,75248,9 142,7171,4 133,9179,9 245,4290,6 246,3326,6 612Tabelle Wochen Wochen 3.11:303,7295,8 Mediane,247,5248,9 Mittelwerte214,8142,7 und Standarda128,1bweichungen133,9 253,7 für245,4 Hepcidin226,6246,3 unter der Mean Hepcidin values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for 12Behandlung Wochen 303,7mit Paricalcitol247,5 und Placebo214,8 (Einheit: ng/ml).128,1 253,7 226,6 Paricalcitol and Placebo Mean Hepcidin values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Mean Hepcidin values at baseline,Paricalcitol after 6and weeks Placebo and after 12 weeks treatment; for 350 Paricalcitol and Placebo 350 350

300 300 300 Mittelwerte Mittelwerte Paricalcitol Paricalcitol Mittelwerte MittelwerteParicalcitol Mittelwerte 250 250 Placebo Placebo Mittelwerte 250 Mittelwerte (ng/ml) Mittelwerte(ng/ml) Placebo Mittelwerte (ng/ml) Mittelwerte(ng/ml) Mittelwerte (ng/ml) Mittelwerte(ng/ml)

200 200 Baseline 6 Wochen 12 Wochen 200 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Baseline Zeitverlauf6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Zeitverlauf Abbildung 3.10: Verlauf der Mittelwerte für Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol und Median Hepcidin values at baseline, after 6 weeks and after 12 weeks treatment; for Placebo. Paricalcitol and Placebo Treatment summarizing/descriptiveMedianMedian Hepcidin Hepcidin values values at graphs baseline, at baseline, after 6 after weeks 6 weeksand after and 12 after weeks 12 treatment; weeks treatment; for for Treatment Treatment summarizing/descriptive summarizing/descriptive graphsParicalcitol graphsParicalcitol and Placebo and Placebo 350

350350

300

300 300 Mediane Paricalcitol Mediane Mediane 250 Paricalcitol Placebo Mediane Mediane Paricalcitol

Mittelwerte (ng/ml) Mittelwerte(ng/ml) 250 Placebo

Mediane (ng/ml) (ng/ml) Mediane Mediane 250 Placebo 200 Mittelwerte (ng/ml) Mittelwerte(ng/ml) Baseline 6 Wochen 12 Wochen 200 Zeitverlauf Baseline 6 Wochen 12 Wochen 200 Zeitverlauf Baseline 6 Wochen 12 Wochen Abbildung 3.11: Verlauf der Mediane fürZeitverlauf Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

68 Ergebnisse ______

3.3 Ergebnisse der Analyse der Sicherheitsparameter

Bei der rein deskriptiven Analyse der Sicherheitsparameter waren PTH intakt, Kalzium und Phosphat Gegenstand der Untersuchung. Wie in Kapitel 2.3.1 beschrieben, erfolgte anhand dieser Parameter die Dosissteuerung der Studienmedikation. Ferner erfolgte die Analyse von Albumin im Serum, einem sogenannten negativen Akute-Phase-Protein (analog Fetuin A).

3.3.1 Ergebnisse der Analyse von PTH intakt

Die Berechnungen der Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und 95%-Konfidenzintervallen von PTH intakt erfolgte jeweils für die Behandlung mit Paricalcitol und Placebo unter Zusammenfassung beider Sequenzen ohne Berücksichtigung möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 6 und Woche 12. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.12 zusammengefasst und die Verläufe der Mittelwerte und Mediane in den Abbildungen 3.12 und 3.13 illustriert:

Zeitpunkt Mittelwerte (SD) Mittelwerte (SD) 95%-Konfidenzintervall 95%-Konfidenzintervall Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 394,77 (141,17) 341,39 (130,84) 339,43 - 450,10 290,10 - 392,67 370 300 6 Wochen 189,09 (149,88) 363,02 (155,14) 130,34 - 247,85 302,21 - 423,84 148,11 356 12 Wochen 164,26 (94,57) 369,38 (151,34) 127,19 - 201,34 310,05 - 428,70 132,08 339 Tabelle 3.12: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: pg/ml).

69 Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Baseline Paricalcitol394,77 341,39Placebo Paricalcitol141,17 130,84Placebo Paricalcitol370 300Placebo Baseline6 Wochen 394,77189,09 363,02341,39 149,88141,17 155,14130,84 148,11370 356300 12 Wochen 164,26 369,38 94,57 151,34 132,08 339 6 Wochen 189,09 363,02 Ergebnisse149,88 155,14 148,11 356 12 Wochen 164,26 369,38 94,57 151,34 132,08 339 ______Mean iPTH-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo Mean iPTH-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 400

400350

350300 Using BOTH Periods 300250 Using BOTH Periods Mittelwerte 250200 Paricalcitol MittelwerteMittelwerte 150 200 PlaceboParicalcitol Mittelwerte

Mittelwerte (ng/l) Mittelwerte(ng/l) 100 150 Placebo 50 Mittelwerte (ng/l) Mittelwerte(ng/l) 100

500 Baseline 6 Wochen 12 Wochen 0 Zeitverlauf Baseline 6 Wochen 12 Wochen Abbildung 3.12: Verlauf der MittelwerteZeitverlauf für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol Median iPTH-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks und Placebo. treatment; for Paricalcitol and Placebo Median iPTH-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks 400 treatment; for Paricalcitol and Placebo

350 400 300 350 250 300 Mediane 200 Paricalcitol 250 150 Mediane PlaceboMediane 200 (ng/l) Mediane Paricalcitol 100 150 Mediane Placebo Mediane (ng/l) (ng/l) Mediane 50 100 0 50 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf 0 Baseline 6 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.13: Verlauf der Mediane für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

Es zeigte sich bei der Betrachtung der Verläufe von Mittelwerten und Medianen ein deutlicher Trend mit Nicht-Überschneidung der 95%-Konfidenzintervalle ab Woche 6 zu niedrigeren Werten von PTH intakt unter Paricalcitoltherapie. Dies könnte auf einen direkten Behandlungseffekt von Paricalcitol unter der Voraussetzung eines Nichtvorhandenseins möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte zurückzuführen sein.

70 Ergebnisse ______

3.3.2 Ergebnisse der Analyse von Kalzium

Analog erfolgten die Berechnungen der Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und 95%-Konfidenzintervallen von Kalzium zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 2, 4, 6, 8, 10 und 12. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.13 und die Verläufe der Mittelwerte und Mediane in den Abbildungen 3.14 und 3.15 dargestellt:

Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Zeitpunkt MittelwerteParicalcitol (SD) MittelwertePlacebo (SD) 95%-KonfidenzintervallParicalcitol 95%-KonfidenzintervallPlacebo Paricalcitol Mediane PlaceboMediane Baseline Paricalcitol2,18 Placebo2,25 Paricalcitol0,19 0,15Placebo Paricalcitol2,2 2,24Placebo 2 BaselineWochen 2,18 (0,19)2,35 2,25 2,28(0,15) 2,100,21 - 2,25 0,152,18 - 2,31 2,372,2 2,282,24 4 2Wochen Wochen 2,35 (0,21)2,41 2,28 2,25(0,15) 2,270,22 - 2,43 0,142,22 - 2,34 2,382,37 2,282,28 6 4Wochen Wochen 2,41 (0,22)2,41 2,25 2,25(0,14) 2,320,29 - 2,49 0,162,20 - 2,31 2,382,38 2,312,28 8 6Wochen Wochen 2,41 (0,29)2,4 2,25 2,24(0,16) 2,300,18 - 2,53 0,162,19 - 2,32 2,392,38 2,232,31 108 Wochen 2,40 (0,18)2,38 2,24 2,25(0,16) 2,330,19 - 2,47 0,142,18 - 2,30 2,372,39 2,252,23 1210 Wochen Wochen 2,38 (0,19)2,41 2,25 2,23(0,14) 2,310,16 - 2,45 0,172,19 - 2,30 2,392,37 2,242,25 12 Wochen 2,41 (0,16) 2,23 (0,17) 2,35 - 2,48 2,16 - 2,30 2,39 2,24 Tabelle 3.13: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: Using BOTH Periods mmol/l). Mean Kalzium-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

2,5 2,45 2,4 2,35 2,3 Mittelwerte 2,25 Paricalcitol 2,2 Mittelwerte Placebo 2,15 2,1 Mittelwerte (mmol/l) Mittelwerte(mmol/l) 2,05 2 Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.14: Verlauf der Mittelwerte für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Median Kalzium-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

2,5 2,45 2,4 2,35 2,3 Mediane 2,25 Paricalcitol 2,2 Mediane Placebo 2,15 Mediane (mmol/l) (mmol/l) Mediane 2,1 71 2,05 2 Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 2,18 2,25 0,19 0,15 2,2 2,24 2 Wochen 2,35 2,28 0,21 0,15 2,37 2,28 4 Wochen 2,41 2,25 0,22 0,14 2,38 2,28 6 Wochen 2,41 2,25 0,29 0,16 2,38 2,31 8 Wochen 2,4 2,24 0,18 0,16 2,39 2,23 10 Wochen 2,38 2,25 0,19 0,14 2,37 2,25 12 Wochen 2,41 2,23 0,16 0,17 2,39 2,24

Using BOTH Periods

Mean Kalzium-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

Ergebnisse ______Median Kalzium-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

2,5 2,45 2,4 2,35 2,3 Mediane 2,25 Paricalcitol 2,2 Mediane Placebo 2,15 Mediane (mmol/l) (mmol/l) Mediane 2,1 2,05 2 Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.15: Verlauf der Mediane für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

Bei Betrachtung der Verläufe von Mittelwerten und Medianen zeigte sich ein deutlicher Trend zu höheren Werten von Kalzium unter Paricalcitoltherapie. In den Wochen 4, 8, 10 und 12 erschien dieser Effekt bei Nicht-Überschneidung der 95%-Konfidenzintervalle besonders ausgeprägt. Auch hier könnte es sich um einen direkten Behandlungseffekt von Paricalcitol unter der Voraussetzung eines Nichtvorhandenseins möglicher Periodeneffekte oder Carryover Effekte handeln.

3.3.3 Ergebnisse der Analyse von Phosphat

Die Ergebnisse der Berechnungen der Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und 95%-Konfidenzintervallen von Phosphat zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 2, 4, 6, 8, 10 und 12 sind in Tabelle 3.14 aufgelistet und die Verläufe der Mittelwerte und Mediane in den Abbildungen 3.16 und 3.17 graphisch dargestellt:

72 Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 1,7 1,55 0,37 0,31 1,73 1,53 2 Wochen 1,88 1,68 0,41 0,38 1,77 1,61 4 Wochen 1,81 1,55 0,48 0,29 1,76 1,56 6 Wochen 1,92 1,59 0,46 0,36 1,82 1,65 8 Wochen 1,82 1,66 0,4 0,33 1,72 1,66 10 Wochen 1,73 1,71 0,35 0,35 1,64 1,74 12 Wochen 1,69 1,65 0,33 0,52 1,66 1,65

Using BOTH Periods Mean Phosphat-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

Ergebnisse 1,95 ______1,85

Zeitpunkt1,75 Mittelwerte (SD) Mittelwerte (SD) 95%-Konfidenzintervall 95%-Konfidenzintervall Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo BaselineZeitpunkt1,65 1,70Mittelwerte (0,37) 1,55Mittelwerte (0,31) Standardabweichung1,55 - 1,85 Standardabweichung1,43 - 1,67 Mediane1,73 MittelwerteMediane1,53 2 Wochen 1,88Paricalcitol (0,41) 1,68Placebo (0,38) Paricalcitol1,72 - 2,04 Placebo1,53 - 1,83 Paricalcitol1,77 ParicalcitolPlacebo1,61 1,55 Baseline4 Wochen 1,81 (0,48)1,7 1,551,55 (0,29) 1,620,37 - 2,00 0,311,44 - 1,67 1,731,76 1,531,56 Mittelwerte 2 6Wochen Wochen 1,92 (0,46)1,88 1,591,68 (0,36) 1,740,41 - 2,10 0,381,45 - 1,74 1,771,82 1,611,65 1,45 Placebo 4 8Wochen Wochen 1,82 (0,40)1,81 1,661,55 (0,33) 1,660,48 - 1,97 0,291,53 - 1,79 1,761,72 1,561,66 Mittelwerte (mmol/l) Mittelwerte(mmol/l) 6 10Wochen 1,35Wochen 1,73 (0,35)1,92 1,711,59 (0,35) 1,590,46 - 1,86 0,361,57 - 1,85 1,821,64 1,651,74 8 12Wochen Wochen 1,69 (0,33)1,82 1,651,66 (0,52) 1,560,4 - 1,82 0,331,44 - 1,85 1,721,66 1,661,65 10 Wochen1,25 1,73 1,71 0,35 0,35 1,64 1,74 Tabelle12 Wochen Baseline 3.14: Mediane,1,692 Wochen 4 Mittelwerte Wochen1,65 6 Wochen mit0,33 8 Standardabweichungen Wochen 10 Wochen0,52 12 Wochen (SD) 1,66 und 1,65 95%- Zeitverlauf Konfidenzintervallen für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: mmol/l). Median Phosphat-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks Using BOTH Periods treatment; for Paricalcitol and Placebo Mean Phosphat-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo 1,95

1,951,85

1,851,75

1,751,65 Mediane Paricalcitol

1,651,55 MedianeMittelwerte PlaceboParicalcitol

1,55 (mmol/l) Mediane 1,45 Mittelwerte Placebo 1,451,35 Mittelwerte (mmol/l) Mittelwerte(mmol/l) 1,351,25 Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen 1,25 Zeitverlauf Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Abbildung 3.16: Verlauf der Mittelwerte für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Median Phosphat-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

1,95

1,85

1,75

1,65 Mediane Paricalcitol 1,55 Mediane Placebo

Mediane (mmol/l) (mmol/l) Mediane 1,45

1,35

1,25 Baseline 2 Wochen 4 Wochen 6 Wochen 8 Wochen 10 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.17: Verlauf der Mediane für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

73 Ergebnisse ______

Es zeigte sich in den ersten 6 Wochen bei unterschiedlichen Baseline-Werten von Phosphat ein allenfalls leichter Trend zu höheren Werten unter Paricalcitoltherapie. In Woche 6 lag ein knappes Nicht-Überschneiden der 95%- Konfidenzintervalle vor. Jedoch kam es in der zweiten Hälfte der jeweiligen Behandlungsphasen wieder zu einer Annäherung der Verlaufskurven.

3.3.4 Ergebnisse der Analyse von Albumin

Für Albumin im Serum erfolgten die Berechnungen der Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und 95%-Konfidenzintervallen zu den Zeitpunkten Baseline, Woche 4, 8 und 12. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.15 aufgeführt und die Verläufe der Mittelwerte und Mediane in den Abbildungen 3.18 und 3.19 graphisch abgebildet:

Zeitpunkt Mittelwerte (SD) Mittelwerte (SD) 95%-Konfidenzintervall 95%-Konfidenzintervall Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 4,11 (0,41) 4,04 (0,26) 3,95 - 4,27 3,94 - 4,15 3,95 4,10 4 Wochen 4,04 (0,29) 4,08 (0,33) 3,93 - 4,16 3,95 - 4,22 4,00 4,10 8 ZeitpunktWochen 4,06Mittelwerte (0,23) 4,13Mittelwerte (0,27) Standardabweichung3,97 - 4,15 Standardabweichung4,02 - 4,24 Mediane4,05 Mediane4,20 12 Wochen 4,08Paricalcitol (0,34) 4,09Placebo (0,37) Paricalcitol3,94 - 4,21 Placebo3,95 - 4,24 Paricalcitol4,00 Placebo4,01 Baseline 4,11 4,04 0,41 0,26 3,95 4,1 4Tabelle Wochen 3.15: Mediane,4,04 Mittelwerte4,08 mit0,29 Standardabweichungen0,33 (SD)4 und 4,1 95%- 8 Wochen 4,06 4,13 0,23 0,27 4,05 4,2 12Konfidenzintervallen Wochen 4,08 für Albumin4,09 im Serum unter0,34 der Behandlung0,37 mit Paricalcitol4 und Placebo4,01 (Einheit: g/dl). Mean Albumin-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

4,5 4,4 Using BOTH Periods 4,3 4,2 4,1 Mittelwerte 4 Paricalcitol 3,9 Mittelwerte Placebo 3,8 Mittelwerte (g/dl) Mittelwerte(g/dl) 3,7 3,6 3,5 Baseline 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.18: Verlauf der Mittelwerte für Albumin im Serum unter der Behandlung mit Paricalcitol undMedian Placebo. Albumin-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

4,5 4,4 74 4,3 4,2 4,1 Mediane 4 Paricalcitol 3,9 Mediane

Mediane (g/dl) (g/dl) Mediane Placebo 3,8 3,7 3,6 3,5 Baseline 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf Zeitpunkt Mittelwerte Mittelwerte Standardabweichung Standardabweichung Mediane Mediane Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Paricalcitol Placebo Baseline 4,11 4,04 0,41 0,26 3,95 4,1 4 Wochen 4,04 4,08 0,29 0,33 4 4,1 8 Wochen 4,06 4,13 0,23 0,27 4,05 4,2 12 Wochen 4,08 4,09 0,34 0,37 4 4,01

Mean Albumin-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

4,5 4,4 Using BOTH Periods 4,3 4,2 4,1 Mittelwerte 4 Paricalcitol 3,9 Mittelwerte Placebo 3,8 Mittelwerte (g/dl) Mittelwerte(g/dl) 3,7 3,6 3,5 Baseline 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Ergebnisse ______Median Albumin-Levels at baseline, after 6 weeks treatment and after 12 weeks treatment; for Paricalcitol and Placebo

4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 Mediane 4 Paricalcitol 3,9 Mediane

Mediane (g/dl) (g/dl) Mediane Placebo 3,8 3,7 3,6 3,5 Baseline 4 Wochen 8 Wochen 12 Wochen Zeitverlauf

Abbildung 3.19: Verlauf der Mediane für Albumin im Serum unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo.

Es zeigte sich zwischen Paricalcitol und Placebo in der Gesamtbetrachtung eine nahezu nicht von Null zu unterscheidende Differenz im Response über die beiden Phasen hinweg. Auch ein Trend war nicht erkennbar.

3.4 Unerwünschte Ereignisse (UE)

Insgesamt traten 52 unerwünschte Ereignisse (UE) auf, wovon es sich bei 20 um schwere unerwünschte Ereignisse handelte. Die SUE sind gesondert in Tabelle 3.16 dargestellt. Insgesamt waren von den UE 22 (51,2%) und von den SUE 10 (23,3%) der 43 randomisierten Patienten betroffen. 28 der UE betrafen Patienten der Sequenz A und 24 Patienten der Sequenz B. 10 (19,2%) der 52 UE traten bei Frauen auf. Aufgeschlüsselt nach Behandlungsphasen zeigte sich, dass sich 24 (46,2%) UE im Paricalcitolarm, 19 (36,5%) UE im Placeboarm und 9 (17,3%) UE in der Washout-Phase ereigneten. Von den 25 in die Analyse eingeschlossenen Patienten waren insgesamt 13 (52%) von UE betroffen. Davon traten bei 4 (16%) Patienten SUE auf. Von den insgesamt 30 in dieser Gruppe auftretenden UE betrafen 13 (43,3%) UE

75 Ergebnisse ______

Patienten im Paricalcitolarm, 11 (36,7%) UE Patienten im Placeboarm und 6 (20%) UE Patienten in der Washout-Phase. Bei 2 Patienten wurde ein Bezug zur Studienmedikation respektive ein Kausalzusammenhang angenommen. Bei Patient 03-9943 wurde die Ursache einer Hyperkalzämie mit der Studienmedikation in Verbindung gebracht. Nach Dosisreduktion kam es auch zu einem Verschwinden dieser Hyperkalzämie. Nach Entblindung zeigte sich, dass sich dieses UE im Paricalcitolarm ereignet hatte. Bei Patient 08-9945 wurden gastroösophageale Refluxbeschwerden in einen möglichen Zusammenhang mit der Studienmedikation gebracht. Unter Therapie mit einem Protonenpumpeninhibitor kam es zur Beschwerdefreiheit. Der Patient befand sich zum Zeitpunkt des UE im Paricalcitolarm. Bei 2 Patienten kam es zu einem vorzeitigen Studienabbruch auf Grund eines SUE. Bei Patient 03-9914 ereignete sich eine schwere obere gastrointestinale Blutung bei gleichzeitiger Pyelonephritis. Patient 08-9930 verstarb in Folge einer terminalen Herzinsuffizienz.

Patienten-ID Alter Geschlecht Sequenz Behandlungsarm Schweres unerwünschtes Ereignis Dauer Studienabbruch Einschluss in (Jahre) (Tage) die Analyse 03-9905 62 m A Paricalcitol Thoraxschmerzen 5 nein ja Paricalcitol Obere gastrointestinale Blutung infolge 2 nein Ibuprofeneinnahme 03-9911 68 m A Paricalcitol Instabile Angina pectoris 11 nein ja Paricalcitol pAVK IIb rechts 36 nein 03-9913 44 m A Washout-Phase Hypertensive Entgleisung mit Dyspnoe 6 nein ja und Angina pectoris 03-9914 45 m B Placebo Perikarderguß in Folge einer Allergie 39 nein nein gegen Minoxidil Paricalcitol Obere gastrointestinale Blutung und 17 ja Pyelonephritis 04-9934 70 m B Paricalcitol Akuter Myokardinfarkt (NSTEMI*) 9 nein nein 06-9927 81 f B Paricalcitol Peranaler Blutabgang bei Hämorrhoiden 2 nein ja und Sigmadivertikulose 08-9930 74 m A Paricalcitol NSTEMI* 1 nein nein Paricalcitol NSTEMI* bei Vorhofflattern 36 nein Placebo Dekompensierte Herzinsuffizienz 9 nein Placebo Terminale Herzinsuffizienz 19 nein Placebo Tod in Folge terminaler Herzinsuffizienz - ja 09-9923 66 m B Placebo Gangrän Coecum und Colon ascendens 14 nein nein Washout-Phase Hypoglykämie 3 nein Paricalcitol Peritonitis bei ischämischer Gangrän 16 nein des Colon transversum 10-9949 58 f A Paricalcitol Gangrän bei pAVK unbekannt nein nein 11-9938 68 f A Paricalcitol Shuntverschluss 6 nein nein Washout-Phase Hyperhydratation unbekannt nein * Nicht-ST-Hebungsmyokardinfarkt Tabelle 3.16: Auflistung aller SUE über den gesamten Studienzeitraum.

76 Diskussion ______

4 Diskussion

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der Effekte von Paricalcitol auf Surrogatparameter für Inflammation und Kalzifikation bei Hämodialysepatienten mit leichtgradigem bis moderatem sekundärem Hyperparathyreoidismus. Als Studiendesign wurde eine multizentrische, randomisierte, doppelverblindete, prospektive, Placebo-kontrollierte Crossover-Studie gewählt. Als Vorteil von Crossover-Studien gilt im Allgemeinen, dass der Einfluss konfundierender Variablen nicht vorhanden ist, da jeder Patient als eigene Kontrolle dient. Dieser Umstand bewirkt ferner, dass gegenüber einem Parallelgruppen-Versuch eine geringere Anzahl an Studienteilnehmern erforderlich ist, um zu statistisch signifikanten Aussagen bezüglich eines Behandlungseffektes zu kommen. Der Nachteil von Crossover-Studien besteht im möglichen Auftreten von Carryover-Effekten, weshalb eine ausreichend lange Washout-Phase zwischen beide Behandlungsperioden geschaltet sein muss, damit die Wirkung des ersten Medikamentes vollständig abgebaut ist. Ferner existiert die Möglichkeit des Auftretens von Periodeneffekten349. Die Hauptlimitation der vorliegenden Studie besteht in der niedrigen Anzahl an Patienten, welche der Analyse zugeführt werden konnten. Zwar konnten 43 Patienten eingeschlossen und randomisiert werden, jedoch lag die Ausfallrate mit 18 (41,9%) Patienten unerwartet hoch. Diese war zuvor mit bis zu 15% kalkuliert und somit unterschätzt worden. Hauptgrund für einen vorzeitigen Studienabbruch war die wiederholte Unterschreitung eines PTH intakt-Wertes von 100 pg/ml bei insgesamt 8 (18,6%) Patienten (s. Abbildung 3.1). Da die Auswertung von Crossover-Studien primär nach Sequenzgruppen und nicht nach Behandlungsgruppen wie bei einem Parallelgruppen-Versuch erfolgt, resultiert in dieser Studie mit 14 versus 11 Patienten eine verminderte statistische Power. Eine Zusammenfassung der Sequenzgruppen zu reinen Behandlungsgruppen zum Zwecke der statistischen Analyse ist zweischneidig und problematisch.

77 Diskussion ______

Einerseits würde eine Nichtberücksichtigung der Sequenzen die Power bei statistischen Tests deutlich erhöhen. Auch sind vom biologischen Standpunkt her aufgrund der relativ kurzen Halbwertszeiten der Zielparameter zum einen und von Paricalcitol mit durchschnittlich 13,9 Stunden bei Hämodialysepatienten zum anderen in Anbetracht einer 4-wöchigen Washout- Phase keine Carryover Effekte zu erwarten. Andererseits werden im Allgemeinen in der statistischen Literatur die Ergebnisse der Auswertung von Crossover-Studien, bei denen keine Auftrennung nach Sequenzgruppen erfolgt, als verfälscht und von geringer wissenschaftlicher Aussagekraft betrachtet349. Die Auswertung separat nach Sequenzgruppen ist neben der Überprüfung des Vorhandenseins von Carryover Effekten, insbesondere auch zur Testung auf das Vorliegen von Periodeneffekten zwingend erforderlich. In einer rezenten Studie mit ähnlichem Studiendesign, bei welcher der Effekt von Paricalcitol mit dem von Alfacalcidol auf die Behandlung des sekundären Hyperparathyreoidismus verglichen wurde, kam es zu einem signifikanten Periodeneffekt, so dass nur die Daten der ersten Periode der statistischen Analyse zugeführt und analog eines Parallelgruppen-Versuches ausgewertet werden konnten227. Daher beschränkte sich bei der vorliegenden Studie die Analyse von zu Behandlungsgruppen zusammengefassten Daten ohne Berücksichtigung der Sequenz auf rein deskriptive Darstellungen. Statistische Tests wurden auf Grundlage dieser zusammengefassten Daten nicht durchgeführt, sondern nur unter Berücksichtigung der Sequenz. Die Analyse der Sicherheitsparameter, welche rein deskriptiv erfolgte, zeigte in Bezug auf PTH intakt einen deutlichen Abfall in der Paricalcitolphase. Bezogen auf die Mittelwerte ist es in der Paricalcitolphase zu einem Abfall von PTH intakt von 230,51 pg/ml (58,4%) gekommen, während es in der Placebophase zu einem leichten Anstieg von 27,99 pg/ml (8,2%) kam (s. Tabelle 3.12 und Abbildungen 3.12 und 3.13). Dieser Effekt, welcher gut verstanden und bekannt ist (entsprechend der Zulassung des Medikaments Paricalcitol)166,167, illustriert durch seine Deutlichkeit, dass offensichtlich eine gute Therapieadhärenz in Bezug auf die Einnahme der Studienmedikation vorgelegen haben muss.

78 Diskussion ______

Die Serumkonzentrationen von Kalzium lagen unter der Therapie mit Paricalcitol deutlich höher als unter der mit Placebo (s. Tabelle 3.13 und Abbildungen 3.14 und 3.15). Auch dieser Effekt ist bereits bekannt und wurde in mehreren rezenten Studien beschrieben227,350. Erwähnenswert ist dabei, dass dieser Effekt früheren Annahmen widerspricht, in welchen postuliert wurde, dass Paricalcitol keine Hyperkalzämien bewirken würde223. Selbst im direkten Vergleich mit Alfacalcidol zeigt sich auch in der Studie von Hansen et al. offensichtlich keine Überlegenheit des Paricalcitol hinsichtlich der Verhinderung von Hyperkalzämien227. In Bezug auf Phosphat zeigte sich in den ersten 6 Wochen ein allenfalls leichter Trend zu höheren Werten unter Paricalcitol. In der zweiten Hälfte der jeweiligen Behandlungsphasen kam es zu einem Angleichen der Phosphatwerte unter Paricalcitol- respektive Placebobehandlung (s. Tabelle 3.14 und Abbildungen 3.16 und 3.17). Hyperphosphatämien unter Paricalcitol sind ein ebenfalls bereits bekanntes Phänomen227. Die geringe Ausprägung dieses Effektes in der vorliegenden Studie ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Phosphatbindertherapie keiner reglementierten Einschränkung unterlag und Anpassungen somit den Effekt von Paricalcitol überlagert haben könnten. Die Analyse des primären Zielparameter hsCRP erbrachte in den statistischen Tests keine signifikanten Unterschiede zwischen Paricalcitol- und Placebophase (s. Tabelle 3.2). Jedoch zeigte sich durchgehend ein Trend zu niedrigeren hsCRP-Werten unter Paricalcitolbehandlung. In der rein deskriptiven Betrachtung der Mittelwerte präsentierte sich unter Paricalcitol sogar ein relativ deutlicher Abfall von hsCRP um 2,86 mg/l (32,6%) und unter Placebo ein leichter Anstieg um 0,62 mg/l (11,3%). Bei der Betrachtung der Mediane war dieser Trend wesentlich schwächer ausgeprägt (s. Tabelle 3.3, Abbildungen 3.2 und 3.3). Grund hierfür war ein Ausreißerwert bei Patient 04- 9933 zum Zeitpunkt Baseline in der Paricalcitolphase. Gemäß den Erfahrungswerten aus klinischen Studien sind hsCRP-Konzentrationen größer 50 mg/l eher akuten, temporär begrenzten Infektionen zuzuordnen und weniger dem Bereich der chronischen Inflammation bei Hämodialysepatienten (s. Tabelle 1.3)37. Unter nachträglichem Ausschluss von Patienten mit hsCRP-

79 Diskussion ______

Werten über 50 mg/l, was nur auf den oben genannten Patient 04-9933 zutraf, ergab sich bei der Neuberechnung der Mittelwerte der verbliebenen 24 Patienten ein deutlich abgeschwächter Trend. Der Abfall unter Paricalcitol betrug nur noch moderate 0,85 mg/l (13,4%), der Anstieg unter Placebo 0,92 mg/l (18,1%). Somit ergab sich zusammenfassend ein allenfalls leichter, nicht signifikanter Trend zu niedrigeren Werten für hsCRP unter Paricalcitolbehandlung. Dieses Ergebnis ist konkordant zu denen zweier Vorstudien, in welchen ebenfalls nicht signifikante Trends zu niedrigeren Werten für hsCRP unter Paricalcitolbehandlung nachgewiesen werden konnten282,283. Im Vergleich zur vorliegenden Studie handelte es sich aber um kleinere Studien mit geringeren Patientenzahlen. Unter der Hypothese, dass Paricalcitol antiinflammatorische Eigenschaften besitzt, erfolgte eine deskriptive Analyse des negativen Akute-Phase-Proteins Albumin im Serum. Gemäß dieser Hypothese hätte es unter Paricalcitolbehandlung zu einem Anstieg von Albumin kommen müssen. In der Analyse der Mittelwerte und Mediane zeigte sich jedoch eine nahezu nicht von Null zu unterscheidende Differenz im Response über die beiden Phasen hinweg. Auch ein Trend war nicht erkennbar (s. Kapitel 3.3.4). Zu dieser Betrachtung muss jedoch einschränkend erwähnt werden, dass es sich bei Albumin im Serum, aufgrund der langen Halbwertszeit von etwa 19 Tagen, um einen sehr träge reagierenden Parameter handelt. Daher sind auch Carryover Effekte und Periodeneffekte, welche statistisch nicht überprüft wurden, nicht auszuschließen. Ferner existieren zahlreiche andere Einflussfaktoren, insbesondere die Ernährung, welche in keinem direkten Zusammenhang mit chronischer Inflammation stehen. Es sind mehrere Gründe denkbar, warum Paricalcitol einen, wenn überhaupt vorhanden, allenfalls leichten antiinflammatorischen und somit hsCRP- senkenden Effekt besitzt. Ein wichtiger Punkt besteht sicherlich in der Tatsache, dass in Bezug auf die Serumkonzentration von hsCRP zahlreiche andere Einflussfaktoren respektive Störfaktoren existieren. Neben den häufig auftretenden interkurrenten, subklinischen Infekten kommt speziell bei Dialysepatienten eine hohe Anzahl an zum Teil schwer beeinflussbaren

80 Diskussion ______

Faktoren hinzu, welche in Kapitel 1.2 ausführlich präsentiert wurden. Darüber hinaus gibt es einige, durchaus auch häufig verordnete Medikamente, welche die Serumkonzentration von hsCRP beeinflussen können (s. Kapitel 1.5.1). Diese Konfundierungseffekte bedingen eine schwer beeinflussbare respektive überschaubare Überlagerung und Verzerrung der Messergebnisse. Ein weiterer wichtiger Punkt betrifft die Pathophysiologie. Wie in Kapitel 1.4.1 ausführlich beschrieben, wirkt Calcitriol sowohl in vitro als auch tierexperimentell über die Aktivierung des VDR modulierend auf das Immunsystem im Sinne einer selektiven Aktivierung wie auch Inhibierung. Dabei spielt die ektope extrarenale Produktion von Calcitriol in Zellen des Immunsystems, unter anderem durch vermehrte Expression der 1!- Hydroxylase, eine wichtige Rolle231,233. Hierbei entstehen zum Zwecke der autokrinen oder parakrinen Regulation hohe Konzentrationen an Calcitriol auf lokaler Ebene. Für die ektope Calcitriolbildung ist allerdings auch das ausreichende Vorhandensein von Calcidiol Voraussetzung. Ferner bestehen zahlreiche bekannte immunologische Erscheinungen in der klinischen Medizin, welche mit einer Calcidioldefizienz assoziiert sind (s. Kapitel 1.4.1). Aus diesen Überlegungen heraus stellt sich die Frage, welches Agens, systemisch vorhandenes Calcidiol oder Calcitriol, das in Bezug auf Immunmodulation für den menschlichen Organismus entscheidende ist. Insbesondere ist aufgrund der ektopen Calcitriolbildung unklar, welche Rolle systemisch substituiertes Calcitriol respektive VDRA spielen. In der vorliegenden Studie waren zudem Patienten mit einer Calcidioldefizienz mit einem Serumspiegel < 20 ng/ml von der Teilnahme ausgeschlossen, so dass bei den eingeschlossenen Patienten ausreichendes Substrat für die ektope Calcitriolbildung zur Verfügung gestanden haben muss. Möglicherweise ist dies ein weiterer Faktor, der den geringen antiinflammatorischen Effekt von Paricalcitol in der zugrunde liegenden Studie begründet. Die Analyse des primären Zielparameters Fetuin A ergab zwischen Paricalcitol und Placebo in der Gesamtbetrachtung eine nahezu nicht von Null zu unterscheidende Differenz im Response über die beiden Phasen hinweg (s. Tabelle 3.5). Zwar wurde der für eine zuverlässige statistische Aussage vorher

81 Diskussion ______errechnete notwendige Stichprobenumfang von n = 22 pro Sequenzgruppe nicht erreicht, jedoch war in der Analyse auch keinerlei Trend erkennbar. Dieses Ergebnis widerspricht einer Vorläuferstudie, welche jedoch durch eine deutlich niedrigere Anzahl an teilnehmenden Patienten gekennzeichnet war283. Die vorliegende Studie ist somit bezüglich der Fragestellung über die Auswirkung von Paricalcitol auf die Serumkonzentration von Fetuin A, die mit der zurzeit größeren statistischen Aussagekraft und Power. Hinsichtlich der Interpretation dieses Ergebnisses ergeben sich zwei wesentliche Erklärungsansätze. Zum einen sind die Ergebnisse der zugrunde liegenden Studie durchaus konkordant zu rezenten Beobachtungen aus der experimentellen Forschung. So konnte in einer experimentellen Studie an kultivierten Hepatozyten gezeigt werden, dass eine in vitro Stimulation der Zellen mit Calcitriol keine vermehrte Genexpression von Fetuin A induzierte351. Somit scheint die Stimulation des VDR durch Calcitriol oder auch andere VDRA keinen direkten Einfluss auf die Fetuin A-Synthese zu haben. Der protektive Effekt von VDRA in moderaten Dosierungen bezüglich vaskulärer Kalzifikation steht also wahrscheinlich nicht in einem Zusammenhang mit Fetuin A. Vielmehr konnte in einer rezenten tierexperimentellen Arbeit nachgewiesen werden, dass sowohl Calcitriol als auch Paricalcitol zu einer Induktion von Klotho und Osteopontin führen und hierüber verkalkungsprotektive Effekte entfalten könnten352. Zum anderen handelt es sich bei Fetuin A (analog zum Albumin) um ein negatives Akute-Phase-Protein, dessen Serumkonzentration bei inflammatorischen Prozessen absinkt37,293. Somit wäre zu erwarten, dass antiinflammatorische Prozesse einen Anstieg der Fetuin A-Konzentration bewirken könnten. Paricalcitol wies in der vorliegenden Studie allerdings einen allenfalls milden antiinflammatorischen Effekt auf. Diese Ausprägung war offensichtlich aber zu gering, um einen relevant messbaren Einfluss auf die Fetuin A-Konzentration nehmen zu können. Die Analyse des sekundären Zielparameters FGF-23 erbrachte eine Borderline- Signifikanz hinsichtlich höherer Werte unter Paricalcitol (s. Tabelle 3.6). Hierbei

82 Diskussion ______handelt es sich um einen mittlerweile bekannten Effekt, der kürzlich in einer anderen Studie nachgewiesen werden konnte329. Dieser Effekt ist möglicherweise von großer Bedeutung für zumindest ein Teilverständnis der Auswirkungen einer Therapie mit Paricalcitol respektive VDRA. Zwar konnte in einigen Observationsstudien nachgewiesen werden, dass eine Therapie mit VDRA mit einem Überlebensvorteil assoziiert ist221,225,353, jedoch könnte der induzierte Anstieg von FGF-23 diesen Vorteil auch relativieren. So ist bekannt, dass hohe Werte für FGF-23 bei Dialysepatienten einen Mortalitätsprädiktor darstellen327 und offensichtlich auch unmittelbar über eine unspezifische Stimulation myokardialer FGF-Rezeptoren linksventrikuläre Hypertrophie induzieren330. Vor diesem Hintergrund lassen sich insbesondere im Zusammenhang mit dem Effekt von Paricalcitol auf FGF- 23 möglicherweise auch die Ergebnisse der PRIMO-Studie leichter interpretieren350. Hierbei handelte es sich um eine doppelblinde, randomisierte, Placebo-kontrollierte Studie, in welcher über eine 48-wöchige Behandlungsphase untersucht wurde, ob bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz eine Therapie mit oralem Paricalcitol die Zunahme linksventrikulärer Hypertrophie verhindern konnte. Diese Annahme beruhte insbesondere auf experimentellen Studien an genetisch manipulierten Mäusen, bei denen Defizienzen des Vitamin D-Rezeptors beziehungsweise der 1!- Hydroxylase zu ausgeprägter Myokardhypertrophie führte189,354. Der linksventrikuläre Massenindex als primärer Endpunkt war in der PRIMO-Studie nach 48 Wochen zwischen den beiden Gruppen allerdings nicht unterschiedlich, es gab sogar einen leichten Trend hin zu höheren Werten unter Paricalcitoltherapie. Untersuchungen zur diastolischen Dysfunktion am Ende der Behandlungsperiode ergaben ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden Behandlungsgruppen. Möglicherweise haben sich in dieser Studie in Bezug auf die Progression linksventrikulärer Hypertrophie vorteilhafte Auswirkungen einer VDRA-Therapie, wie die nachlastsenkende Inhibition des Renin-Angiotensin-Systems und die Inhibition von Gefäßverkalkung respektive Entwicklung arterieller Gefäßsteifigkeit, gegen den nachteiligen Umstand der FGF-23-Erhöhung unter Paricalcitol aufgehoben.

83 Diskussion ______

Wahrscheinlich induziert eine Therapie mit VDRA eine vermehrte Genexpression von FGF-23. Dies konnte zumindest für Calcitriol in vitro an Zellkulturen von Ratten nachgewiesen. Dabei zeigte sich, dass die Induktion bei urämischen Ratten ausgeprägter war als bei normalen Ratten355. Jedoch führen erhöhte Phosphatwerte, wie sie zum Beispiel regelmäßig im Rahmen einer Behandlung mit VDRA auftreten, ebenfalls zu einem Anstieg von FGF-23324. Bislang ist unklar, welcher der beiden Mechanismen für den menschlichen Organismus entscheidend ist. Die Analyse des sekundären Zielparameters t-ucMGP erbrachte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungen mit Paricalcitol und Placebo. In der zweiten Behandlungsphase kam es zu einem Periodeneffekt, der nicht ausreichend erklärbar ist (s. Tabelle 3.8). Somit hat die Therapie mit Paricalcitol oder anderen VDRA bei Menschen möglicherweise keinerlei direkte Auswirkung auf die Konzentration von t-ucMGP. Die Ergebnisse einiger tierexperimenteller Untersuchungen, in denen es zu einer vermehrten Transkription von MGP durch Vitamin D oder Calcitriol kam312,356, konnten somit nicht bestätigt werden. Zudem konnte in einer weiteren tierexperimentellen Studie gezeigt werden, dass die Expression von MGP in Gefäßwänden durch Calcitriol sogar herunter reguliert und durch Kalzimimetika herauf reguliert wurde. Möglicherweise besteht der entscheidende präventive Mechanismus in Zusammenhang mit MGP gegen vaskuläre Kalzifikation mehr in der Aktivierung des CaSR in der Gefäßmuskulatur357. Die Analyse des sekundären Zielparameters Hepcidin erbrachte ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungen mit Paricalcitol und Placebo. Bislang konnten durch experimentelle oder klinische Studien auch keine direkten pathophysiologischen Zusammenhänge oder Interaktionen zwischen Hepcidin und VDRA nachgewiesen werden. Hinzukommend ergibt sich aufgrund des Ergebnisses der vorliegenden Studie ebenso kein Anhalt für einen direkten Effekt von Paricalcitol oder anderen VDRA auf die Serumkonzentration von Hepcidin. Bemerkenswert war jedoch, dass sich über beide Behandlungsphasen ein leichter Trend hin zu höheren Werten für Hepcidin unter Paricalcitol zeigte.

84 Diskussion ______

Dieser Trend resultierte insbesondere aus einem Abfall der Hepcidin-Werte unter Placebo, während die Werte unter Paricalcitol nahezu unverändert blieben (s. Tabelle 3.11, Abbildungen 3.10 und 3.11). Da Inflammation eine vermehrte Hepcidinfreisetzung bedingt, wäre bei einem antiinflammatorischen Effekt von Paricalcitol eher mit niedrigeren Hepcidin-Werten unter Paricalcitol und somit einem genau umgekehrten Trend zu rechnen gewesen. Dieses Ergebnis legt einmal mehr nahe, dass der antiinflammatorische Effekt von Paricalcitol offensichtlich als sehr gering einzuschätzen ist. Zusammenfassend muss bezugnehmend auf die vorliegende Studie konstatiert werden, dass die primären Endpunkte einer 30%-igen Senkung des hsCRP- Levels und einer 20%-igen Steigerung der Fetuin A-Serumwerte nicht erreicht wurden. Es zeigte sich lediglich ein leichter nicht signifikanter Trend zu niedrigeren hsCRP-Werten unter Paricalcitoltherapie. Hinsichtlich der sekundären Endpunkte konnte nur für FGF-23 eine Borderline-Signifikanz zu höheren Werten unter Paricalcitoltherapie nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse werfen neue Fragestellungen hinsichtlich weiterer medizinischer Grundlagenforschung und klinischer Forschung auf: Zur definitiven Abklärung, ob Paricalcitol oder auch andere VDRA im menschlichen Organismus einen antiinflammatorischen Effekt haben, müsste aufgrund der zahlreichen Konfundierungseffekte eine klinische Studie mit einer deutlich höheren Patientenzahl als bei der vorliegenden Studie durchgeführt werden. In einer solchen Studie könnte auch gleichzeitig die Frage geklärt werden, welche Bedeutung in Bezug auf Modulation des Immunsystems einerseits Calcidiol und andererseits Calcitriol respektive VDRA besitzen und welchem der beiden dabei die entscheidende Rolle zukommt. Dies könnte zum Beispiel durch Einschleusung in unterschiedliche Therapiearme erfolgen. Ferner könnte in einer experimentellen Arbeit untersucht werden, welche lokalen Konzentrationen in Entzündungsherden bei ektoper Calcitriolbildung erreicht werden, und welche Rolle dabei dem hauptsächlich in den Nieren gebildeten, systemischen Calcitriol zukommt. In Bezug auf FGF-23 ist die Frage ungeklärt, ob im menschlichen Organismus der direkte Effekt, über Steigerung der Genexpression, oder der indirekte

85 Diskussion ______

Effekt, über Erhöhung der Phosphatwerte, entscheidend für den Anstieg unter Paricalcitoltherapie ist. Insbesondere stellt sich vor diesem Hintergrund die Frage, ob eine effektive phosphatbindende Therapie den Anstieg von FGF-23 wirksam verhindern kann. Da FGF-23 isoliert betrachtet ein Mortalitätsprädiktor ist, wäre im Rahmen von zukünftigen klinischen Studien eine Evaluation der Bedeutung der FGF-23-Erhöhung unter VDRA-Therapie erforderlich. Möglicherweise führt die weitere Forschung in diesem Gebiet auch zu neuen medikamentösen Innovationen. Von besonderem Interesse könnte dabei die Antagonisierung von FGF-23 sein. Diese Therapie müsste sehr wahrscheinlich hochselektiv erfolgen, da die einfache Inhibition von FGF-23 durch Antikörper im Tierexperiment zwar einerseits zu einer Verbesserung des sekundären Hyperparathyreoidismus führte, aber andererseits auch eine vermehrte vaskuläre Kalzifizierung durch Hyperphosphatämie und eine erhöhte Mortalität zur Folge hatte358. Daher müsste eine antagonisierende Therapie spezifisch gegen den biologischen Mechanismus gerichtet sein, welcher für die unerwünschten myokardialen Wirkungen von FGF-23 verantwortlich sind. Hierzu ist aber zunächst eine bessere Erforschung organspezifischer FGF- Rezeptor-Subtypen und der zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen erforderlich.

86 Zusammenfassung ______

5 Zusammenfassung

Die Mortalität bei Dialysepatienten ist bedeutend höher als in der Allgemeinbevölkerung. Hauptgrund ist eine deutlich erhöhte kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Als wichtige Ursachen hierfür gelten bei Dialysepatienten unter anderem das vermehrte Auftreten systemischer Inflammation und die Störung des Kalzium-Phosphathaushaltes, welche mit vermehrter vaskulärer Kalzifikation einhergeht. Da große Beobachtungsstudien darauf hinweisen, dass aktive Vitamin D-Therapie mit einem Überlebensvorteil für Dialysepatienten assoziiert ist, besteht die Hypothese, dass Paricalcitol antiinflammatorische und verkalkungsinhibitorische Effekte haben könnte. In dieser vorliegenden multizentrischen, doppelverblindeten, prospektiven und Placebo-kontrollierten Crossover-Studie wurden 43 Hämodialysepatienten eingeschlossen, randomisiert und zwei Behandlungssequenzen zugeordnet. In der einen Behandlungssequenz erfolgte zunächst eine 12-wöchige Behandlung mit Paricalcitol (Startdosis 2 µg/Tag) und nach einer 4-wöchigen Washout- Phase eine 12-wöchige Behandlung mit Placebo. In der anderen Behandlungssequenz erfolgte nach gleichem Modus zunächst eine Behandlung mit Placebo und dann eine Behandlung mit Paricalcitol. Die Adjustierung der Dosis der Studienmedikation erfolgte entsprechend der Werte für Kalzium, Phosphat und PTH intakt. Zur Untersuchung der Hypothese wurden Zielparameter für Inflammation (hsCRP, Hepcidin) und Kalzifikation (Fetuin A , t-ucMGP, FGF-23) in regelmäßigen Intervallen gemessen. Als primärer Endpunkt wurden die 30%-ige Senkung des hsCRP-Levels und 20%-ige Steigerung der Fetuin A-Serumwerte definiert. Sekundäre Endpunkte waren Veränderungen der Serumkonzentrationen von Hepcidin, FGF-23 und t- ucMGP. Insgesamt wurde die Studie von 25 Patienten protokollgemäß beendet. Bezüglich der primären Zielparameter zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo. Es konnte lediglich bei hsCRP ein leichter Trend zu niedrigeren Werten unter

87 Zusammenfassung ______

Paricalcitolbehandlung registriert werden. Bei den sekundären Zielparametern zeigte sich eine Borderline-Signifikanz (p = 0,051) hinsichtlich höherer FGF-23- Werte unter Paricalcitol. Bei Hepcidin und t-ucMGP konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo verzeichnet werden. In der vorliegenden Studie konnten die primären Endpunkte unter Paricalcitoltherapie somit nicht erreicht werden. Die Expression von Fetuin A wird von Paricalcitol wahrscheinlich nicht beeinflusst. Möglicherweise existiert aber ein leichter antiinflammatorischer Effekt, der eine Senkung der hsCRP- Serumwerte bedingen könnte. Des Weiteren steigert Paricalcitol die Expression von FGF-23, während die von Hepcidin und t-ucMGP unbeeinflusst zu sein scheint.

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7 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1.1: Bekannte Marker der Inflammation bei chronischer Niereninsuffizienz37...... 6 69 Tabelle 1.2: Effekte von IL-6, TNF-!, IL-10 in Bezug auf Atherosklerose und Katabolie ...... 9 Tabelle 1.3: Interpretation von CRP-Serumkonzentrationen in Bezug auf kardiovaskuläres Risiko37...... 33 Tabelle 2.1: Zeitlicher Ablauf während der Behandlungsphasen...... 43 Tabelle 2.2: Epidemiologische und klinische Baseline Charakteristika der teilnehmenden Patienten...... 45 Tabelle 3.1: Spearman’schen Korrelationskoeffizienten zwischen den Beobachtungswerten aller Zielparameter zum selben Patienten...... 57 Tabelle 3.2: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für hsCRP...... 58 Tabelle 3.3: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und Differenzen für hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: mg/l)...... 59 Tabelle 3.4: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für Fetuin A...... 60 Tabelle 3.5: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen und Differenzen für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: g/l)...... 61 Tabelle 3.6: Zusammenfassung der Analyseergebnisse der logarithmierten FGF-23-Werte....63 Tabelle 3.7: Mediane, Mittelwerte und Standardabweichungen für die logarithmierten Werten von FGF-23 unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 64 Tabelle 3.8: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für t-ucMGP...... 65 Tabelle 3.9: Mediane, Mittelwerte und Standardabweichungen für t-ucMGP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: nM)...... 66 Tabelle 3.10: Zusammenfassung der Analyseergebnisse für Hepcidin...... 67 Tabelle 3.11: Mediane, Mittelwerte und Standardabweichungen für Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: ng/ml)...... 68 Tabelle 3.12: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: pg/ml)...... 69 Tabelle 3.13: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: mmol/l)...... 71 Tabelle 3.14: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: mmol/l)...... 73

127 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis ______

Tabelle 3.15: Mediane, Mittelwerte mit Standardabweichungen (SD) und 95%- Konfidenzintervallen für Albumin im Serum unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo (Einheit: g/dl)...... 74 Tabelle 3.16: Auflistung aller SUE über den gesamten Studienzeitraum...... 76 Tabelle 8.1: Rohmessdaten von hsCRP (Einheit: mg/l)...... 130 Tabelle 8.2: Rohmessdaten von Fetuin A (Einheit: g/l)...... 131 Tabelle 8.3: Rohmessdaten von t-ucMGP (Einheit: nM)...... 132 Tabelle 8.4: Rohmessdaten von FGF-23 (Einheit: kRU/l)...... 133 Tabelle 8.5: Rohmessdaten von Hepcidin (Einheit: ng/ml)...... 134

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Häufigkeitsverteilung der Mortalitätsursachen bei Dialysepatienten4...... 1 Abbildung 1.2: Altersabhängige kardiovaskuläre Mortalität bei Dialysepatienten15...... 3 Abbildung 1.3: Vereinfachtes Schema des Vitamin D-Metabolismus...... 19 Abbildung 1.4: Strukturvergleich von Calcitriol und Paricalcitol...... 26 Abbildung 2.1: Zeitlicher Verlauf der Studie...... 42 Abbildung 2.2: Verteilung der teilnehmenden Patienten auf die einzelnen Dialysezentren...... 44 Abbildung 3.1: Studienteilnehmerfluss in Bezug auf Vorauswahl, Ausschluss, Randomisierung, Studienabbruch mit Begründung und Einschluss in die Analyse...... 56 Abbildung 3.2: Verlauf der Mittelwerte für hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 59 Abbildung 3.3: Verlauf der Mediane für hsCRP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 60 Abbildung 3.4: Verlauf der Mittelwerte für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 62 Abbildung 3.5: Verlauf der Mediane für Fetuin A unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 62 Abbildung 3.6: Verlauf der Mittelwerte für die logarithmierten Werte von FGF-23 unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 64 Abbildung 3.7: Verlauf der Mediane für die logarithmierten Werte von FGF-23 unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 64 Abbildung 3.8: Verlauf der Mittelwerte für t-ucMGP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 66 Abbildung 3.9: Verlauf der Mediane für t-ucMGP unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 66 Abbildung 3.10: Verlauf der Mittelwerte für Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 68

128 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis ______

Abbildung 3.11: Verlauf der Mediane für Hepcidin unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 68 Abbildung 3.12: Verlauf der Mittelwerte für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 70 Abbildung 3.13: Verlauf der Mediane für PTH intakt unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 70 Abbildung 3.14: Verlauf der Mittelwerte für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 71 Abbildung 3.15: Verlauf der Mediane für Kalzium unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 72 Abbildung 3.16: Verlauf der Mittelwerte für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 73 Abbildung 3.17: Verlauf der Mediane für Phosphat unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 73 Abbildung 3.18: Verlauf der Mittelwerte für Albumin im Serum unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 74 Abbildung 3.19: Verlauf der Mediane für Albumin im Serum unter der Behandlung mit Paricalcitol und Placebo...... 75

129 Anhang ______

8 Anhang

8.1 Rohmessdaten von hsCRP HSCRP_NEU

Patienten_ID1 Patienten_ID2 hsCRP_0_1 hsCRP_6_1 hsCRP_12_1 hsCRP_0_2 hsCRP_6_2 hsCRP_12_2 hsCRP_Ende AB 06-9927 1,25 0,53 1,41 0,72 0,73 0,67 0,45 AS 03-9913 16,7 9,17 8,42 8,84 4,47 12,5 4,5 BB 07-9937 2,52 7,42 8,5 9,09 7,69 8,33 9,13 BK 10-9947 19,1 21,7 BS 08-9908 7,37 17,9 4,97 6,03 7,36 4,87 4,85 CW 03-9901 6,36 6,92 4,3 4,72 7,67 4,81 17,2 EB 03-9924 9,47 7,8 8,12 11,3 9,12 5,65 7,38 EH 03-9912 5,06 1,83 4,01 1,85 1,83 3,59 3,75 EL 09-9939 8,45 6,39 ER 03-9907 2,61 2,5 1,57 3,4 8,47 2,82 1,18 FJ 03-9914 4,53 3,07 2,28 3,11 2,19 1,68 GA 03-9916 14,4 12,8 11,6 9,11 8,13 16,7 7,05 GH 03-9942 0,55 0,52 0,38 0,69 0,46 4,01 0,38 GK 08-9945 2,75 2,15 14 9,88 3,85 3,46 4,79 GL 08-9925 1,12 2,76 2,57 1,55 2,6 1,06 1,18 H_HG 03-9905 3,42 4,06 3,01 6,49 10,1 1,2 1,71 HB 03-9902 9,26 8,76 15,8 13,2 8,29 8,45 18,7 HB 04-9932 7,24 26,8 8,75 15,4 7,27 13,9 9,3 HB 09-9909 2,26 7,5 1,84 3,07 HJ 11-9938 8,76 7,04 9,38 5,4 4,44 17,8 HL 10-9949 3,36 HT 09-9941 4,76 H-UG 03-9911 3,29 1,94 2,97 9,44 3,44 3,81 4,84 IF 03-9904 4,68 6,13 18,1 6,58 6,31 4,41 3,95 JM 08-9930 2,44 12,1 39,8 31,9 JN 08-9931 3,36 2,59 2,32 6,68 3,31 6,16 8,5 K-HB 03-9903 1,01 1,29 2,82 2,8 1,12 1,85 2,65 KR 10-9948 3,9 1,71 0,72 1,34 2,66 0,97 LF 09-9940 5,05 3,92 7,87 LU 03-9943 1,02 1,97 17,4 1,46 1,11 1,36 1,13 MH 03-9906 8,48 6,27 5,54 16,3 16,1 5,26 27 NFF 04-9934 2,41 1,42 4,7 4,05 NM 08-9929 2,4 6,23 RM 08-9935 2,56 1,86 1,79 3,23 RM 09-9923 12,7 6,37 9,37 7,08 7,17 RS 06-9915 6,64 4,32 5,74 2,03 2,23 3,55 7,48 RT 08-9928 3,45 2,57 1,6 2,31 3,83 1,51 3,41 SF 10-9946 3,19 6,56 2 SH 04-9933 67 17,5 15,9 15,6 10,6 9,08 8 SM 06-9936 0,42 0,66 UK 03-9922 1,18 1,22 1,36 1,6 0,94 1,09 0,85 WB 08-9926 0,65 0,97 6,02 0,99 1,91

Tabelle 8.1: Rohmessdaten von hsCRP (Einheit: mg/l).

130

Page 1 Anhang ______

8.2 Rohmessdaten von FetuinFETUIN_NEU A

Patienten_ID1 Patienten_ID2 Fetuin A_0_1 Fetuin A_6_1 Fetuin A_12_1 Fetuin A_0_2 Fetuin A_6_2 Fetuin A_12_2 Fetuin A_Ende AB 06-9927 0,34 0,43 0,39 0,38 0,39 0,39 0,37 AS 03-9913 0,41 0,41 0,42 0,45 0,44 0,33 0,43 BB 07-9937 0,32 0,32 0,31 0,32 0,31 0,35 0,32 BK 10-9947 0,32 0,33 BS 08-9908 0,43 0,38 0,43 0,45 0,46 0,42 0,46 CW 03-9901 0,39 0,36 0,37 0,38 0,32 0,28 0,27 EB 03-9924 0,32 0,37 0,38 0,36 0,38 0,36 0,33 EH 03-9912 0,25 0,43 0,23 0,38 0,27 0,28 0,23 EL 09-9939 0,41 0,44 ER 03-9907 0,34 0,3 0,28 0,27 0,32 0,3 0,25 FJ 03-9914 0,31 0,32 0,33 0,33 0,3 0,33 GA 03-9916 0,27 0,27 0,25 0,26 0,26 0,25 0,21 GH 03-9942 0,42 0,25 0,35 0,37 0,26 0,28 0,3 GK 08-9945 0,32 0,32 0,32 0,33 0,3 0,32 0,38 GL 08-9925 0,37 0,29 0,34 0,3 0,28 0,33 0,32 H_HG 03-9905 0,27 0,3 0,29 0,3 0,28 0,34 0,31 HB 03-9902 0,39 0,34 0,38 0,36 0,39 0,36 0,36 HB 04-9932 0,29 0,4 0,23 0,32 0,24 0,32 0,25 HB 09-9909 0,44 0,33 0,5 0,41 HJ 11-9938 0,35 0,4 0,4 0,32 0,39 0,37 HL 10-9949 0,27 HT 09-9941 0,34 H-UG 03-9911 0,32 0,32 0,31 0,21 0,27 0,31 0,35 IF 03-9904 0,27 0,32 0,29 0,27 0,25 0,29 0,26 JM 08-9930 0,36 0,3 0,29 0,19 JN 08-9931 0,3 0,27 0,25 0,21 0,23 0,21 0,18 K-HB 03-9903 0,42 0,37 0,35 0,36 0,58 0,34 0,34 KR 10-9948 0,47 0,42 0,41 0,41 0,42 0,46 LF 09-9940 0,39 0,37 0,35 LU 03-9943 0,31 0,32 0,24 0,25 0,28 0,3 0,32 MH 03-9906 0,3 0,27 0,34 0,31 0,4 0,26 0,38 NFF 04-9934 0,37 0,43 0,38 0,45 NM 08-9929 0,4 0,4 RM 08-9935 0,27 0,3 0,29 0,3 RM 09-9923 0,43 0,36 0,34 0,44 0,31 RS 06-9915 0,34 0,32 0,36 0,33 0,3 0,34 0,32 RT 08-9928 0,38 0,33 0,35 0,36 0,33 0,32 0,4 SF 10-9946 0,49 0,49 0,47 SH 04-9933 0,31 0,34 0,39 0,36 0,4 0,53 0,37 SM 06-9936 0,29 0,31 UK 03-9922 0,43 0,39 0,47 0,4 0,47 0,47 0,47 WB 08-9926 0,31 0,32 0,26 0,28 0,26

Tabelle 8.2: Rohmessdaten von Fetuin A (Einheit: g/l).

131Page 1 Anhang ______

8.3 Rohmessdaten von t-ucMGPUCMPGK_NEU

Patienten_ID1 Patienten_ID2 t-ucMGP_0_1 t-ucMGP_6_1 t-ucMGP_12_1 t-ucMGP_0_2 t-ucMGP_6_2 t-ucMGP_12_2 t-ucMGP_Ende AB 06-9927 2270 1989 1879 2351 2361 2662 AS 03-9913 1939 1960 1975 1956 2005 2240 2529 BB 07-9937 2093 1491 1731 1916 1716 2694 2527 BK 10-9947 2579 2844 BS 08-9908 2681 2768 2896 2979 2803 2751 3207 CW 03-9901 2474 2503 1613 2072 2090 2959 2937 EB 03-9924 1996 2109 2127 2306 2253 2553 2654 EH 03-9912 1184 1295 1886 1723 1651 2387 2184 EL 09-9939 2506 3114 ER 03-9907 2803 2300 2179 3073 3234 3034 3172 FJ 03-9914 1806 1309 2101 2137 2182 1860 GA 03-9916 1365 2016 2287 2698 2460 2449 2105 GH 03-9942 2136 2367 1950 2161 2330 2345 2337 GK 08-9945 2439 1734 2326 2090 2323 1939 2432 GL 08-9925 2199 1227 1889 1728 1862 1891 1938 H_HG 03-9905 1613 1469 1460 1508 2032 2545 2483 HB 03-9902 2020 1991 1723 1594 1756 3736 3486 HB 04-9932 2090 2090 1996 2678 2245 2505 2829 HB 09-9909 2284 2839 2490 3442 HJ 11-9938 1671 2944 2441 2533 2976 2500 HL 10-9949 2814 HT 09-9941 2403 H-UG 03-9911 1667 1475 1763 1574 2556 1956 2923 IF 03-9904 1464 1816 2077 1750 2057 2302 3149 JM 08-9930 2687 1920 2001 1046 JN 08-9931 1965 1929 1556 1986 2035 2175 2678 K-HB 03-9903 2570 2218 2486 2478 3379 3694 3467 KR 10-9948 2154 2429 2549 2266 3643 2641 LF 09-9940 1170 2902 3031 LU 03-9943 2018 1561 1347 1432 2400 1714 2162 MH 03-9906 1982 1825 1913 2222 2954 2909 3666 NFF 04-9934 1712 1959 1943 2685 NM 08-9929 2567 2654 RM 08-9935 1259 1206 1422 1430 RM 09-9923 1903 2058 1800 2359 2387 RS 06-9915 1790 1848 1882 1372 1937 1724 RT 08-9928 2436 2185 2392 2869 3029 2927 3234 SF 10-9946 2902 2832 3137 SH 04-9933 3047 3457 2890 3821 3778 3530 3772 SM 06-9936 2406 2534 UK 03-9922 3317 2935 3614 3148 3443 4379 4303 WB 08-9926 1654 2086 2307 1765 1980

Tabelle 8.3: Rohmessdaten von t-ucMGP (Einheit: nM).

132 Page 1 Anhang ______

8.4 Rohmessdaten von FGF-23FGF_NEU

Patienten_ID1 Patienten_ID2 FGF-23_0_1 FGF-23_6_1 FGF-23_12_1 FGF-23_0_2 FGF-23_6_2 FGF-23_12_2 FGF-23_Ende AB 06-9927 18 111 203 189 359 134 95 AS 03-9913 242 748 1199 1408 1606 1760 1441 BB 07-9937 19 45 63 51 68 71 42 BK 10-9947 49 203 BS 08-9908 1225 2739 3344 2695 1375 1012 2376 CW 03-9901 240 3960 365 326 142 198 179 EB 03-9924 267 440 171 488 6677 517 407 EH 03-9912 4180 3091 5731 4048 5291 5390 3366 EL 09-9939 2960 833 ER 03-9907 148 311 146 241 256 290 287 FJ 03-9914 143 158 236 291 234 446 GA 03-9916 225 61 280 194 831 438 344 GH 03-9942 156 230 285 102 403 111 120 GK 08-9945 5302 2035 9141 4928 6094 6358 4928 GL 08-9925 80 173 53 91 105 31 67 H_HG 03-9905 80 398 333 158 230 374 1091 HB 03-9902 166 1408 148 332 140 186 161 HB 09-9909 190 335 107 183 HB 04-9932 671 1441 506 583 2783 2387 968 HJ 11-9938 264 698 145 4110 1076 637 HL 10-9949 441 HT 09-9941 3950 H-UG 03-9911 1188 3366 1683 935 2046 3168 2684 IF 03-9904 124 329 202 263 250 357 916 JM 08-9930 729 661 349 2570 JN 08-9931 190 72 89 179 291 327 442 K-HB 03-9903 36 85 107 104 181 79 53 KR 10-9948 639 115 109 210 151 95 LF 09-9940 347 142 205 LU 03-9943 416 223 259 207 1276 528 674 MH 03-9906 202 86 80 114 639 275 307 NFF 04-9934 510 329 350 257 NM 08-9929 166 103 RM 09-9923 1208 829 3990 8890 4640 RM 08-9935 168 246 216 242 RS 06-9915 121 1398 189 177 335 452 96 RT 08-9928 1294 1168 2706 1102 2970 4455 3630 SF 10-9946 66 1119 98 SH 04-9933 178 263 241 199 163 122 152 SM 06-9936 1480 1440 UK 03-9922 174 759 124 154 161 181 204 WB 08-9926 153 327 209 197 451

Tabelle 8.4: Rohmessdaten von FGF-23 (Einheit: kRU/l).

Page 1

133 Anhang ______

8.5 Rohmessdaten von HepcidinHEPCIDINK_NEU

Patienten_ID1 Patienten_ID2 Hepcidin_0_1 Hepcidin_6_1 Hepcidin_12_1 Hepcidin_0_2 Hepcidin_6_2 Hepcidin_12_2 Hepcidin_Ende AB 06-9927 316,91 401,18 433,82 277,46 251,88 320,8 AS 03-9913 293,87 285,7 246 223,9 138,87 340,62 238,28 BB 07-9937 229,21 205,88 18,52 57,52 19,63 20,12 105,56 BK 10-9947 970,47 517,7 BS 08-9908 362,66 547,7 345,44 326,58 513,07 317,2 286,23 CW 03-9901 493,64 220,26 423,92 592,46 469,16 355,65 883,96 EB 03-9924 436,91 294,35 285,09 514,02 239,73 278,85 307,64 EH 03-9912 173,34 210,98 222,6 264,74 246,3 374,99 303 EL 09-9939 101,78 246,28 ER 03-9907 150,13 119,87 144,53 213,33 256,93 157,47 202,93 FJ 03-9914 122 317,61 307,6 239,33 167,41 136,18 GA 03-9916 373,42 261,56 195,78 422,38 245,4 872,95 298,03 GH 03-9942 190,13 177,6 154,2 37,73 10,93 7,6 39,47 GK 08-9945 271,8 222,88 221,3 191,68 268,44 277,61 229,47 GL 08-9925 679,26 486,43 925,79 694,25 456,65 294,28 410,6 H_HG 03-9905 83,79 392,1 464,11 691,06 222,1 595,49 158,89 HB 03-9902 465,98 172,4 385,76 503,78 240,85 369,73 282,1 HB 04-9932 349,25 263,5 201,82 165,1 152,84 163,79 205,53 HB 09-9909 102,13 142,7 90,92 110,71 HJ 11-9938 491,64 585,97 420,7 419,15 282,88 697,6 HL 10-9949 194,65 HT 09-9941 91,66 H-UG 03-9911 273,71 505,58 214,93 342,15 206,53 221,6 245,43 IF 03-9904 157,16 116,77 195,21 167,87 327,6 258,09 334,8 JM 08-9930 193,65 267,62 209,27 415,45 JN 08-9931 378,51 393,82 223,16 359,79 228,85 152,03 81,28 K-HB 03-9903 51,9 51,95 65,64 53,42 138,45 115 117,46 KR 10-9948 492,98 246,65 254,53 269,9 236,32 LF 09-9940 108,99 88,6 137,16 LU 03-9943 212,94 255,04 199,54 294,4 263,69 174,53 118 MH 03-9906 434,07 374,07 319,31 315,94 364,14 319,8 542,97 N.F.F 04-9934 403,06 335,54 248,52 139,56 NM 08-9929 215,26 267,16 RM 08-9935 241,67 147,44 189,03 188,26 RM 09-9923 23,63 61,51 71,55 5 4,78 RS 06-9915 673,91 498,18 566 470,95 218,23 626,52 RT 08-9928 235,04 216,75 253,68 266,72 228,02 226,63 215,84 SF 10-9946 305,32 355,2 276,1 SH 04-9933 693,54 352,53 360,48 269,48 211,94 162,07 126,01 SM 06-9936 409,76 452,76 UK 03-9922 290,64 685,54 277,88 340,92 265,16 275,75 266,87 WB 08-9926 299,6 259,69 365,46 290,33 255,19

Tabelle 8.5: Rohmessdaten von Hepcidin (Einheit: ng/ml).

Page 1

134 Danksagung ______

9 Danksagung

Ich danke

Herrn Prof. Ketteler für sein Vertrauen in mich, für die durchgehend hervorragende und vorbildliche Betreuung bei dieser Arbeit und für die enorm gute berufliche Förderung während meiner fachärztlichen Ausbildung.

Herrn Prof. Wanner für die ausgezeichnete Planung dieser Studie, für seine Bereitschaft mich als Doktorand zu übernehmen und für seine konstruktive und pragmatische Unterstützung in den letzten Monaten bei der Auswertung dieser Arbeit.

Frau Monika Lautner, die mit ihrem Engagement als Dialyse- und Studienschwester die praktische Durchführung dieser Studie ganz maßgeblich ermöglichte.

Herrn Dr. Biggar für seine sehr nützlichen Vorschläge in Bezug auf diese Studie und seine stets konstruktiv kritische Geisteshaltung bei wissenschaftlichen Fragestellungen, durch die ich sehr viel gelernt habe.

Herrn Dr. Buchholz für die praktische Unterstützung bei dieser Studie, für seinen unerschütterlichen Idealismus und für seine Freundschaft.

Den an der Studie teilnehmenden Dialysezentren – insbesondere aber Herrn Dr. Oliver Dorsch aus Kronach für sein weit überdurchschnittliches Engagement.

Frau Lena Gutjahr-Lengsfeld und Herrn Dr. Uwe Mahlzahn für die statistische Auswertung der Studienmessdaten.

Danksagung ______

Dem Bildungssystem der Bundesrepublik Deutschland, welches im Gegensatz zu manch anderen westlichen Industrieländern weitgehende Chancengleichheit unabhängig vom sozialen Status bietet. Erst dieser Umstand ermöglichte mir das zu erreichen, was ich erreicht habe.

Meiner Mutter, Sonja Fey, die mir durch jahrelange Unterstützung und Förderung ermöglichte, dass ich Medizin studieren und damit das machen konnte, was sie selbst so gerne gemacht hätte.

Curriculum Vitae ______

10 Curriculum Vitae

Name: Holger Fey

Geburtsdatum und -ort: 27.07.1976 in Wiesbaden

Nationalität: deutsch

Schulbildung: 1982 – 1986 Adalbert-Stifter-Grundschule / Wiesbaden 1986 – 1995 Rabanus-Maurus-Gymnasium / Mainz 21.06.1995 Allgemeine Hochschulreife (Abitur)

Studium: 1996 – 1998 Vorklinisches Studium der Medizin an der Johannes-Gutenberg-Universität / Mainz 22.09.1998 Physikum 1998 – 2003 Klinisches Studium der Medizin an der Johannes-Gutenberg-Universität / Mainz 22.03.2001 1. Staatsexamen 02.04.2003 2. Staatsexamen 04/2003 - 04/2004 Praktisches Jahr am Klinikum Ludwigshafen 29.04.2004 3. Staatsexamen

Würzburg, den 26.06.2014

Holger Fey