(Cucurbitaceae) Y Evaluación De Su Capacidad Antioxidante

CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO FITOQUÍMICO DE PARTES AÉREAS DE LA ESPECIE Momordica charantia Linn (CUCURBITACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

GUINNET PAOLA FUQUENE BUSTOS

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR: LICENCIATURA EN QUÍMICA Bogotá. D.C 2018

CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO FITOQUÍMICO DE PARTES AÉREAS DE LA ESPECIE Momordica charantia Linn (CUCURBITACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

GUINNET PAOLA FUQUENE BUSTOS

Proyecto de grado como requisito para optar al título de pregrado en licenciatura en química.

DIRECTORES: WILLIAM FERNANDO CASTRILLON CARDONA Químico, Magíster en ciencias ambientales, Magíster investigación en educación, Especialista en informática para la docencia, Docente Universidad Distrital FJC

JAVIER ANDRES MATULEVICH PELAEZ Licenciado en Química, Especialista en Análisis Químico Instrumental, Magister en Ciencias Biológicas – Fitoquímica, Docente Universidad Distrital FJC

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA Bogotá. D.C 2018

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios en primer lugar por haberme acompañado y guiado a lo largo de mi carrera, a mis padres Mauricio y Nidia por su apoyo, fortaleza y amor en cada momento de mi vida, A mis abuelos Beatriz y Antonio, a mis tíos Pilar y Gregori por darme la fuerza y confianza para cumplir mis metas y sueños, siendo cada uno de ellos mi motor de vida.

Le agradezco a la universidad Distrital por la formación como profesional, además agradezco al profesor William Castrillón por permitirme estar en el Grupo de investigación de Productos Naturales Vegetales.

Le agradezco al profesor Javier Matulevich por él, apoyo, confianza y amistad quien a través de su experiencia y ejemplo a seguir. ha sido parte importante de mi aprendizaje en la carrera y formación en todo el trayecto de mi tesis.

Le agradezco a Carlos y a mis amigos por llenar mi vida de alegría y brindarme su apoyo incondicional.

A Diego Silva y a todo el grupo de Investigación de productos Naturales por el apoyo, la confianza y amistad formada.

A la Pontificia Universidad Javeriana le agradezco por el préstamo de instalaciones y equipos empleados, al igual que al profesor Gonzalo Sequeda por su colaboración en la determinación de la capacidad antioxidante.

TABLA DE CONTENIDO

1 RESUMEN ...... 1 2 INTRODUCCIÓN ...... 3 3 JUSTIFICACIÓN ...... 4 4 OBJETIVOS ...... 6 4.1 OBJETIVO GENERAL ...... 6 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 7 4.3 FÓRMULACIÓN DEL PROBLEMA ...... 7 5 ESTADO ACTUAL DEL TEMA ...... 8 5.1 FAMILIA CUCURBITACEAE ...... 8 Características generales de la familia Cucurbitaceae ...... 8 Características morfológicas de la familia Cucurbitaceae ...... 8 Distribución de la familia Cucurbitaceae ...... 9 Usos etnobotánicos de la familia Cucurbitaceae ...... 9 Actividades biológicas evaluadas en especies de la Familia Cucurbitaceae ...... 10 Momordica grosvenori...... 11 Estudios Químicos de la familia Cucurbitaceae ...... 12 5.2 Género Momordica ...... 15 Características morfológicas del género Momordica ...... 15 Distribución del género Momordica ...... 16 Usos etnobotánicos del género Momordica ...... 17 Actividades biológicas en especies del género Momordica ...... 17 Estudios químicos del género Momordica ...... 19 5.3 Especie Momordica Charantia L...... 23 Características morfológicas de la especie Momordica charantia L. …………………………………………………………………………..23 Distribución de la especie Momordica charantia L...... 24 Usos etnobotánicos de la especie Momordica charantia L...... 26 Actividad biológica de la especie Momordica Charantia L...... 26 Estudio químico de la especie Momordica Charantia L...... 28 5.4 Capacidad antioxidante ...... 30 Determinación de la capacidad antioxidante ...... 31 Método de 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH) ...... 31 Método del ácido 2,2'–azino–bis–[3–etillbenzotiazolin–6–sulfónico] (ABTS•+) ...... 32 6 METODOLOGIA ...... 34 6.1 GENERALIDADES ...... 34 Métodos de separación cromatográficos y elucidación estructural34 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear ...... 35

6.2 Estudio fitoquímico de las partes aéreas de Momordica charantia L ……………………………………………………………………………….35 Recolección e identificación del material vegetal...... 35 Marcha fitoquímica preliminar ...... 36 Obtención del extracto etanólico de las partes aéreas Momordica charantia (E. EtOH.Mc.PA) ...... 37 Evaluación de la Capacidad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS… ...... 41 7 RESULTADOS Y ANÁLISIS ...... 45 7.1 Marcha fitoquímica preliminar (MFP) ...... 45 7.2 Metabolitos secundarios aislados ...... 47 Composición de la mezcla McPA1 ...... 47 Composición de la mezcla McPA2 ...... 54 Composición de la mezcla McPA3 ...... 58 Composición de la mezcla McPA4 ...... 64 Elucidación estructural del compuesto McPA5 ...... 68 Elucidación estructural del compuesto McPA6 ...... 73 7.3 Evaluación de la capacidad antioxidante ...... 78 Curva de calibración para el ensayo DPPH ...... 78 Cuantificación de la capacidad captadora de radicales libres por DPPH …………………………………………………………………………..80 Estadística para el extracto, y las fracciones para determinar la capacidad antioxidante ...... 81 Curva de calibración para el ensayo ABTS ...... 83 Cuantificación de la capacidad captadora de radicales libres ABT …………………………………………………………………………………….85 Estadística para el extracto, y las fracciones ...... 86 Comparación entre el método de DPPH Y ABTS ...... 88 8 CONCLUSIONES ...... 92 9 RECOMENDACIONES ...... 94 10 BIBLIOGRAFÍA ...... 95

INDICE DE FIGURAS

Figura 5-1 Características morfológicas de la familia Cucurbitaceae ...... 8 Figura 5-2 Distribución de la familia Cucurbitaceae ...... 9 Figura 5-3 Estructuras identificadas en mono y sesquiterpenoides comunes en la familia Cucurbitaceae ...... 13 Figura 5-4 Ejemplos de triterpenoides de tipos oleanano y lupano comunes en la familia Cucurbitaceae ...... 14 Figura 5-5 Ejemplos de cucurbitacinas, triterpenóides típicos de la familia Cucurbitaceae ...... 15 Figura 5-6 Morfología del género Momordica ...... 16 Figura 5-7 Distribución de especie Momordica ...... 17 Figura 5-8 Ejemplos de fitoesteroles comunes encontrados en el género Momordica...... 20 Figura 5-9 Ejemplos de triterpenóides encontrados en el género Momordica)...... 21 Figura 5-10 Triterpenóides tipo cucurbitanos encontrados en el género Momordica...... 22 Figura 5-11 Características morfológicas de la especie Momordica charantia A. Hojas, B. Flor, C. Frutos...... 24 Figura 5-12 Distribución de la especie Momordica charantia en el mundo 25 Figura 5-13 Distribución de la especie Momordica charantia en Colombia ..... 26 Figura 5-14 Compuestos químicos más representativos de la especie Momordica charantia ...... 30 Figura 5-15 Reacción química del DPPH antes y después de reaccionar con un agente antioxidante...... 32 Figura 5-16 Reacción química del ABTS antes y después de reaccionar con un compuesto antirradical (AOH) ...... 33 Figura 6-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie Momordica charantia, Colombia (Tolima) municipio de honda...... 36 Figura 6-2 Diagrama de la marcha Fitoquímica preliminar ...... 37 Figura 6-3 Diagrama general del extracto y fracciones de partes aéreas de la especie Momordica charantia...... 38 Figura 6-4 Aislamiento y purificación de las mezclas y compuestos...... 40 Figura 6-5 Protocolo utilizado para el control de Trolox en los métodos de ABTS y DPPH ...... 43 Figura 7-1 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA1 ...... 48 Figura 7-2 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.30 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 49 Figura 7-3 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Epoxylinalool . 50

Figura 7-4 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 11.738 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 51 Figura 7-5 Posibles rutas de fragmentación propuesta para la Dihidroactinidiolida ...... 51 Figura 7-6 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 16.056 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 52 Figura 7-7 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido palmítico ...... 52 Figura 7-8 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 23.372 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 53 Figura 7-9 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Escualeno ...... 54 Figura 7-10 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA2 ...... 55 Figura 7-11 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 13.855 minutos de la mezcla McPA2. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 56 Figura 7-12 Posibles rutas de fragmentación propuesta para 3-Hidroxi-5,6- epoxy-beta-ionona ...... 56 Figura 7-13 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 14.014 minutos de la mezcla McPA2. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 57 Figura 7-14 Posibles rutas de fragmentación propuesta para 2-Ciclohexen-1- ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil) ...... 58 Figura 7-15 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA3 ...... 59 Figura 7-16 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.415 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 60 Figura 7-17 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido benzoico ...... 60 Figura 7-18 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 9.529 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 61 Figura 7-19 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el indol ...... 61 Figura 7-20 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 10.313 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 62 Figura 7-21 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el óxido de linalool ...... 63 Figura 7-22 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 10.680 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 63

Figura 7-23 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido cinámico ...... 64 Figura 7-24 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA4 ...... 65 Figura 7-25 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 7.184 minutos de la mezcla McPA4. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 66 Figura 7-26 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Eucaliptol ..... 66 Figura 7-27 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.415 minutos de la mezcla McPA4. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08 ...... 67 Figura 7-28 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester ...... 68 1 Figura 7-29 Espectro de RMN H (300 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA5 ...... 69 13 Figura 7-30 Espectro de RMN C J-MOD (75 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA5...... 70 Figura 7-31 Ampliación de espectro COSY en RMN para el compuesto McPA5...... 71 Figura 7-32 Asignación de los desplazamientos químicos para el compuesto McPA5 ...... 71 1 Figura 7-33 Espectro de RMN H (300 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA6 ...... 74 13 Figura 7-34 Espectro de RMN C J-MOD (75 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA6 ...... 75 Figura 7-35 Ampliación de espectro COSY en RMN para el compuesto McPA6 ...... 76 Figura 7-36 Asignación de los desplazamientos químicos para el compuesto McPA6 ...... 76

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 5-1 Actividades biológicas de algunas especies vegetales de la familia Cucurbitaceae ...... 10 Tabla 5-2 Actividades biológicas de algunas especies vegetales del género Momordica...... 18 Tabla 5-3 Clasificación taxonómica de Momordica charantia L...... 23 Tabla 5-4 Estudios de algunas actividades farmacológicas en la especie Momordica charantia + ...... 27 Tabla 7-1 Marcha fitoquímico preliminar del extracto etanólico de las partes aéreas de la especie Momordica charantia...... 45 Tabla 7-2 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA1 ...... 48 Tabla 7-3 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA2 ...... 55 Tabla 7-4 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA3 ...... 59 Tabla 7-5 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST08 para la mezcla McPA4 ...... 65 Tabla 7-6 Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto McPA5 con los de kaguasaponina D ...... 72 Tabla 7-7 Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto McPA5 con los de Momordicina ll ...... 77 Tabla 7-8 Promedio de absorbancias (n=3), %inhibición, IC50 de trolox...... 78 Tabla 7-9 Datos estadísticos para la sustancia patrón Trolox...... 79 Tabla 7-10 Lectura del extracto y las fracciones, a los 60 min transcurridos. .. 80 Tabla 7-11 Porcentaje de inhibición, datos estadísticos para el extracto y las fracciones por el método de DPPH ...... 81 Tabla 7-12 Promedio de absorbancias (n=3), %inhibición, IC50 de trolox...... 84 Tabla 7-13 Datos estadísticos para la sustancia patrón Trolox...... 85 Tabla 7-14 Lectura del extracto y las fracciones, a los 60 min transcurridos. .. 85 Tabla 7-15 % de inhibición por el método de ABTS para el extracto y las fracciones ...... 86 Tabla 7-16 Comparación del método DPPH Y ABTS a partir del IC50 para el extracto y fracciones ...... 88

Índice de Gráficas

Gráfica 7-1 Curva de calibración para trolox ...... 79 Gráfica 7-2 % de Inhibición para el control positivo, extracto y fracciones ...... 83 Gráfica 7-3 Curva de calibración para Trolox ...... 84 Gráfica 7-4 % de Inhibición para el control positivo, extracto y fracciones ...... 88

LISTA DE ABREVIATURAS ABTS Acido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6- AcOEt sulfonico AFP Acetato de etilo CC Análisis fitoquímico preliminar CCD Cromatografía en Columna CCDP Cromatografía Capa Delgada CF Cromatografía en capa delgada preparativa CG-EM Cromatografía en columna flash Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas DCM Diclorometano DDPH 1,1-difenil-2-pricril-hidrazilo EM Espectrometría de masas EtOH Etanol E. EtOH.Mc.PA Extracto etanólico de las partes aéreas de Momordica charantia Fx.AcOEt.Mc.PA Fracción de acetato de etilo de las partes aéreas de Momordica charantia Fx.DCM.Mc.PA Fracción de diclorometano de las partes aéreas de Momordica charantia Fx.HEP.Mc.PA Fracción de heptano de las partes aéreas de Momordica charantia Fx.Hidroalc.Mc.PA Fracción hidroalcohólica de las partes aéreas de Momordica charantia HEP Heptano IC50 Concentración inhibitoria del 50% MeOH Metanol MFP Marcha Fitoquímica Preliminar m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar m/z Relación masa carga TIC Corriente iónica total

1 RESUMEN

La especie Momordica charantia L. perteneciente al género Momordica de la familia Cucurbitaceae conocida comúnmente como balsamina, bejuco de coje, subicogen, pepinillo y pepino cimarrón es una planta enredadera con fruto amargo; actualmente es utilizada como planta medicinal, reconocida por su actividad hipoglicemiante nativa de la región tropical, teniendo en cuenta la importancia de esta especie en la medicina tradicional ,este trabajo presenta la contribución al estudio químico y biológico de las partes aéreas de la especie Momordica charantia, haciendo una importante contribución a la familia Cucurbitaceae y en especial al género Momordica, ya que presenta pocos estudios en nuestro país.

A partir del material vegetal colectado en el municipio de Honda (Tolima) e identificado en el herbario de la Universidad Nacional de Colombia bajo el número de colección COL 596915 se realizó la extracción mediante la técnica de maceración en frio con etanol al 96% obteniéndose 37.1 g (7.4 % p/p) de extracto total (E.EtOH.Mc.PA), donde mediante el estudio fitoquímico preliminar se determinó cualitativamente la presencia de diferentes metabolitos secundarios como: terpenos, taninos, glucósidos cardiotónicos y probablemente alcaloides siendo esto consecuente con estudios fitoquímicos realizados sobre diferentes especies del mismo género como Momordica balsamina (Mussa, 2006) o Momordica grosvenori (Takasaki et al., 2003).

Para la determinación y caracterización química de los metabolitos secundarios de la especie vegetal Momordica charantia se realizó un fraccionamiento liquido- liquido continuo al extracto E.EtOH.Mc.PA con solventes de polaridad creciente, obteniendo las fracciones de heptano (Fx.Hept.Mc.PA 1.22%), diclorometano (Fx.DCM.Mc.PA 8.51%), acetato de etilo (Fx.AcOEt.Mc.PA 1.02%) y un residuo hidroalcohólico (Fx.Hidroalc.Mc.PA 89.25%); estas fracciones fueron sometidas a separaciones sucesivas y purificación utilizando técnicas de cromatografía, tales como cromatografía en capa delgada (CCD), cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP) y cromatografía en columna (CC), permitiendo identificar dos compuestos denominados Kaguasaponina D y Momordicina ll ,

1 cuatro mezclas de compuestos, la primera conformado por: un terpeno oxigenado Epoxylinalool, un norisoprenoides Dihidroactinidiolida, un ácido graso saturado el Ácido palmítico y un triterpeno alifático identificado como Escualeno, en la segunda mezcla se encontró: un terpenoide biciclico (3-Hidroxi-5,6-epoxy- beta-ionona y un norisoprenoide 2-Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4- (3-oxo-1-butenil), en la tercer mezcla se encontró: un terpeno oxigenado el Oxido de linalool, dos compuestos fenólicos Ácido cinámico y Ácido benzoico, un compuesto heterocíclico Indol y por ultimo para la cuarta mezcla se encontró un terpeno oxigenado Eucaliptol y un ácido esterificado (ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester.La identificación de las mezclas obtenidas se realizó mediante la técnica de Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, realizando la comparación de los datos con los reportados en la librería NIST08.

La determinación de la capacidad antioxidante se realizó mediante dos métodos por DPPH y ABTS, donde presento efecto inhibitorio al 50% en concentraciones superiores a 1000 ppm, para el extracto total con un IC50 de 5734.1ppm, las fracciones de acetato de etilo con un IC50 de 6178ppm y el residuo hidroalcohólico con IC50 de 7251.8 ppm, por el método del radical DPPH. A diferencia por el método desarrollado ABTS el extracto etanolico presento un IC50 de 5513 ppm para las fracciones de heptano con un IC50 de 5578ppm , la fracción de acetato de etilo con un IC50 de 4282.9ppm y un residuo hidroalcohólico con un IC50 de 4375.2ppm, tomando como referencia la captación antioxidante del trolox como radical libre para ambos métodos, permitiendo establecer así la baja capacidad antioxidante que poseen las partes aéreas de la especie vegetal Momordica charantia debido a las altas concentraciones en que inhibe el radical.

2 INTRODUCCIÓN

Colombia ocupa el 0,22 % de la superficie terrestre y alberga cerca del 10% de la biodiversidad del planeta con aproximadamente 28.800 especies catalogado a nivel mundial, como territorio megadiverso dentro del grupo de los 14 con mayor índice de biodiversidad en la tierra (Andrade, 2011) utilizando estas especies con fines medicinales y etnobotánicos. A esta alta diversidad biológica subyacen factores, climáticos, ecológicos, geográficos y evolutivos, cuya interacción resulta en un mosaico de ecosistemas, procesos y especies (Ministerio de ambiente y desarrollo sostenible,2014).

Destacando la diversidad de especies presentes en el país algunos estudios han servido como modelos para la preparación de sustancias bioactivas, siendo materia prima para la síntesis de sustancias de interés farmacológico y/o interés industrial, realizando acciones útiles para la salud en procesos patológicos (Gutiérrez R. y Estévez B.,2009).

En la familia Cucurbitaceae se ha encontrado reportes acerca de la composición química y estudios farmacológicos de varias especies como, por ejemplo, especies del género Cucumis y Cucúrbita que presentan actividades biológicas como antiinflamatoria, antimicrobiana anticancerígena y antioxidante (Pozner, 2010; Mussa, 2006). Actualmente Momordica charantia ha tenido diferentes estudios preclínicos documentando los efectos antidiabéticos e hipoglucémicos a través de diversos mecanismos postulados y por lo que ha sido de gran ayuda en la medicina (Villareal et al., 2015).

De acuerdo con lo descrito anteriormente, el presente trabajo de investigación realiza un aporte al conocimiento químico y biológico de la familia Cucurbitaceae en Colombia, por medio del estudio químico de sus metabolitos fijos y la evaluación de la capacidad antioxidante de sus extractos y fracciones obtenidos de las partes aéreas de Momordica charantia L.

3 JUSTIFICACIÓN

En el planeta solo se ha estudiado una pequeña fracción de la flora en pro de la salud humana y animal. Se calcula que un 80% del cuidado primario de la salud en la población de los países en desarrollo depende de la medicina tradicional basada en medicamentos provenientes de plantas y animales (Rodríguez, 2003). Así mismo una sola planta puede presentar miles de metabolitos secundarios diferentes que pueden ser de gran importancia para el desarrollo de productos naturales que combatan diferentes enfermedades en el mundo (Hostettmann Gupta, & Mutis de Serna, 2008).

Colombia al ocupar el segundo lugar con mayor biodiversidad, se constituye como un gran potencial a estudiar, en especial por sus condiciones ambientales en las diversas regiones, lo cual puede representar mayor variedad de compuestos en cuanto a su composición química y actividad biológica (Hostettmann Gupta, & Mutis de Serna, 2008). Por lo anterior, el efecto que han tomado las plantas medicinales y los compuestos presentes en ellas en los últimos años ha sido un nuevo auge para varias investigaciones y estudios que se han expuesto con el fin de mantener viva la tradición herbolaria, encontrando nuevos compuestos activos con diferentes propiedades que actúan contra enfermedades, para el uso en la medicina moderna.

En las últimas décadas se ha generado gran interés en los antioxidantes naturales presentes en las plantas ya que el estrés oxidativo (un desequilibrio entre las sustancias oxidantes y prooxidantes) ha implicado grandes afecciones en la salud. Científicamente se ha demostrado que el daño oxidativo ocasionado por los radicales libres está relacionado con un amplio número de enfermedades y desordenes que incluye: fallo cardíaco, daños celébrales, cataratas, inflamaciones, entre otros (Youngson, 2005). Al contar con un recurso tan amplio como la biodiversidad en nuestro país, se ha permitido realizar el estudio fitoquímico de diferentes especies vegetales. Una de las familias vegetales que se encuentra ampliamente distribuida es la familia Cucurbitaceae, constituye una fuente importante de especies como Cucurbita mostacho, Sechium edule que según estudios reportados en la literatura posee un elevado potencial

4 antioxidante y otras especies como Cucumis anguria y Melothria guadalu presentan actividad antiinflamoria y antimicrobiana (Carlos, 2014) a esta familia también pertenece la especie vegetal Momordica charantia conocida comúnmente en las regiones tropicales de Colombia como ¨balsamina¨ se han reportado en los frutos y semillas efectos como febrífugo, dolencias hepáticas, cálculos renales, afecciones de piel, ulceras, quemaduras por contenido de carotenos, además se usa contra el raquitismo y la xeroftalmia (Arango,2006), de acuerdo con estudios realizados puede ser atribuida la capacidad antioxidante a compuestos fenólicos considerados marcadores quimiotaxonómicos de esta familia (Fonnegra & Jiménez, 2007). En la especie Momordica charantia no se tiene antecedentes científicos nacionales que comprueben su propiedad antioxidante y su composición; por esta razón se hace meritorio realizar este estudio contribuyendo de manera importante al conocimiento químico y biológico de esta especie.

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Contribuir al estudio químico de las partes aéreas de Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) y evaluar su capacidad antioxidante.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Obtener extractos y fracciones de distintas polaridades provenientes de la especie Momordica charantia L.

 Aislar, purificar y elucidar la estructura química de los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en los extractos o fracciones de las partes aéreas de Momordica charantia L.

 Evaluar la capacidad antioxidante de los extractos y fracciones obtenidos de las partes aéreas de la especie Momordica charantia L.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la actualidad el uso de plantas para tratar ciertas enfermedades es bastante reconocida debido a los metabolitos secundarios que posee, por lo que han sido estudiados para aplicarlos en la industria farmacológica en beneficio de la población mundial (Aldana, 2010). Teniendo en cuenta la diversidad vegetal de Colombia es importante hacer el reconocimiento de algunas especies como lo son de la familia Cucurbitaceae que su estudio ha sido basado en la alimentación balanceada del ser humano y aunque otras de las especies de esta familia hacen parte del estudio en la medicina hace falta contribuir en el conocimiento de plantas como Momordica charantia que se ha utilizado como hipoglicemiante y que tiene cantidades de beneficios pero no se han hecho estudios recientes , es por esto que se hace necesario realizar estudios sobre capacidad antioxidante además de la extracción y purificación de metabolitos que pueden llegar a ser importantes para futuras investigaciones en la evaluación de otras actividades biológicas.

4.3 FÓRMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Cuál es la composición química de las partes aéreas de Momordica charantia L. y presentan sus extractos y fracciones capacidad antioxidante?

5 ESTADO ACTUAL DEL TEMA

5.1 FAMILIA CUCURBITACEAE

Características generales de la familia Cucurbitaceae

La familia Cucurbitaceae se encuentra constituida por 118 géneros y 845 especies distribuidas en el trópico con algunas especies semidesérticas (Stevens, 2009). Esta familia se divide en dos subfamilias: Zanonioideae y Cucurbitoideae generalmente son plantas herbáceas y trepadoras que crecen rápidamente, un gran número de especies en esta familia son utilizadas en la alimentación balanceada del ser humano y animal (Deyo & Malley, 2008).

Características morfológicas de la familia Cucurbitaceae

Son plantas típicamente trepadoras (zarcillos) con gruesos rizomas tuberosos, leñosas en la base, sus hojas palmeado-lobuladas, sin estípulas con nectarios extraflorales. Las flores usualmente son unisexuales y regulares monoicas o dioicas, epíginas. Las semillas se pueden encontrar grandes, aplanadas, sin endosperma, cotiledones muy desarrollados y con reservas oleaginosas. El fruto es alargado y rugoso, la mayoría de miembros tienen como característica en su estructura haces vasculares bicolaterales. (Trease & Evans, 2002; Facena, s.f). En la Figura 5-1 se observan algunas características morfológicas descritas anteriormente.

Figura 5-1 Características morfológicas de la familia Cucurbitaceae (Castroviejo et.al, 2005).

Distribución de la familia Cucurbitaceae

La familia Cucurbitaceae constituye una variedad de géneros y especies anteriormente mencionado presentándose en distintas zonas continentales. Las plantas se encuentran distribuidas en regiones tropicales y subtropicales de ambos hemisferios, en todo el mundo (Bolaños, 1998). Se desarrollan entre los 50-1500 m.s.n.m, ocupando áreas de bosques siempre verdes, caducifolios, márgenes de ríos, matorrales, sabanas, alrededor de asentamientos humanos y áreas de cultivo (Facena, s.f). Las especies de la familia Cucurbitaceae se encuentran principalmente en, África, sur de Asia, norte de Australia, y en el centro y sur de América como se puede observar en el mapa de la Figura 5-2.

Las Cucurbitáceas en los antecedentes botánicos favorecen el origen sur y centro americano y en los países que más han sido cultivados son (México, Colombia y Guatemala) debido a su gran importancia en la alimentación. En Colombia la distribución de esta familia se centra en las zonas de Sierra nevada, Santa Marta, Costa Atlántica, Antioquia y algunas zonas de la cordillera de los andes (Patiño, 2002).

Figura 5-2 Distribución de la familia Cucurbitaceae (tropicos.org, s.f).

*Las zonas de color amarillo corresponden a la distribución de la familia Cucurbitaceae

Usos etnobotánicos de la familia Cucurbitaceae

Diversas especies de la familia Cucurbitaceae son empleadas con fines curativos tradicionales Cayaponia racemosa, Citrullus lanatus, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Gurania spinulosa, Luffa cylindrica, L. sepium, Momordica charantia y Rytidostylis carthagenensis, por sus potenciales propiedades antiálgicas, antiflatulentas, antiinflamatorias, catárticas, febrífugas, otálgicas y vermífugas (Delascio & López, 2007). Como plantas alimenticias o comestibles, bajo la forma de frutas frescas, cocidas, ensaladas, jugos, dulces, arilos y semillas son consumidas Citrullus lanatus, Cucumis anguria, C. melo, Cucurbita sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo y Momordica charantia. Incluye además especies con valor alimenticio potencial que a partir de los años 60 se ha esforzado para producir variedades comerciales de las Cucurbitáceas con tolerancia y resistencia a las virosis más comunes y destructivas, ensayando con métodos tradicionales para el mejoramiento genético (Bolaños, 1998).

Actividades biológicas evaluadas en especies de la Familia Cucurbitaceae

Los estudios realizados sobre actividades biológicas en especies de la familia Cucurbitaceae son amplios debido a su distribución geográfica. Dentro de las diversas actividades biológicas evaluadas a extractos y compuestos aislados de especies pertenecientes a esta familia se encuentran reportes de actividad antiinflamatoria, antioxidante, antimicrobiana, antidiabética, y antiandrogénica (Pozner, 2010; Mussa, 2006). En la Tabla 5-1, se ilustran algunos estudios biológicos realizados en especies de la familia Cucurbitaceae.

Tabla 5-1 Actividades biológicas de algunas especies vegetales de la familia Cucurbitaceae

Órgano de la planta o Especie Actividad/caracterización Referencia extracto biológica evaluado

Cucurbita Semillas Actividad Antiandrogénica Bellma A et pepo L al., 2006

Cucurbita Extractos Actividad Antioxidante Gutiérrez et mostacho vegetales al., 2007

Cucumis Fruta Actividad Antimicrobiana Kumar & anguria kamaraj., 2011

Melothria Tallos y fruta Actividad Antiinflamatoria Mohamed, guadalu Polo & Martinez, s. f

Sechium Hojas y Actividad Antioxidante Ordoñez, edule semillas Gómez & Vattuone, 2006

Ecballium Extractos Actividad Attard, elaterium vegetales inmunomoduladora Brincat, & Cuschieri, 2005

Cucúrbita aff Semillas Actividad Vermífuga Avila & máxima Vásquez, 2011

Lagenaria Fruta Caracterización Yetisir, Sakar, siceraria Germoplasma & Serçe, 2008

Momordica Fruta Actividad Anti carcinogénica Takasaki et grosvenori. al., 2003

Momordica Semillas y Actividad Anti-diabética Raman & charantia l frutos Lau,1996

Estudios Químicos de la familia Cucurbitaceae

De los estudios fitoquímicos realizados sobre las especies de la familia Cucurbitaceae en general se han reportado triterpenoides tetracíclicos oxigenados denominados cucurbitacinas, con efecto purgante y sabor amargo, autores como Takabayashi et al., 1994, reportan en la familia Cucurbitaceae que algunas especies al estar infestadas por arácnidos, elevando los niveles de β- ocimeno de monoterpenos 4,8-dimetil-1,3E,7-nonatrieno a 25 y 54%, respectivamente, de los compuestos volátiles totales en libertad. Mientras el β- ocimeno (6) es particularmente un monoterpeno típico en la familia Cucurbitaceae, el monoterpeno 4,8-dimetil-1,3E,7-nonatrieno (2) y el sesquiterpeno 4,8,12-trimetil-1,3E,7E,11-tridecatetraeno (3) es común en muchas especies de diversas familias (Loughrin JH et. al,1994). En esta familia se han identificado los siguientes compuestos químicos: α-pineno (1), β- felandreno (5), (-)-mentol (4) ,1,8-cineol (7), piperitona (8), citronelal (9) ,neral (z-citral) (10), geranial (E-citral) (11), acetato de geranilo (12).

(1) (2) (3)

OH O

(4) (5) (6) (7) (8)

O H O H H O

(9) (10) (11) (12)

Figura 5-3 Estructuras identificadas en mono y sesquiterpenoides comunes en la familia Cucurbitaceae (Mussa, 2006).

Los compuestos de lupeol (17) y β-amirina (13) cuyos esqueletos de tipo Lupano y oleanano respectivamente se observan en la Figura 5-4, siendo otros alcoholes triterpenoides muy comunes en el reino vegetal. El lupeol actúa a través de un mecanismo diferente en acción de la aspirina y por lo tanto no inhibe la actividad de la ciclooxigenasa y la prostaglandina (Kweifio-Okai et.al ,1955). La actividad citotóxica de triterpenoides pentacíclicos también ha sido demostrada por el ácido Ursólico (16) y el ácido Oleanólico (15). Otros triterpenoides comunes en la familia Cucurbitaceae son: α-amirina (14), Betulinol (18), ácido betulinico (19), y acido 3-acetilbetunilico (20).

R2 R3

R1 R2

HO R1

(13) R1=CH3;R2=H;R3=CH3 β-amirina (17) R1=OH; R2=CH3 Lupeol (14) R1=CH3;R2= CH3;R3=H α- (18) R =OH; R = CH O H Betulinol amirina 1 2 2 (19) R1=OH; R2=CO2H Ac. (15) R1=CO2H; R2=H;R3=CH3 Ac. Betulínico Oleanólico (20) R1= OAc; R2= CO2H Ac. 3- (16) R1= CO2H; R2= CH3;R3=H Ac. acetilbetulínico Ursólico Figura 5-4 Ejemplos de triterpenoides de tipos oleanano y lupano comunes en la familia Cucurbitaceae (Gershenson & Croteau ,1991; Faldt, 2000).

Las cucurbitacinas son derivados bioactivos de triterpenoides tetracíclicos se producen principalmente en la familia Cucurbitaceae (Halaweish, Tallamy & Santana,1999) son conocidos por ser extremadamente amargos, por su alta toxicidad a la mayoría de los organismos (incluyendo seres humanos) y participan directa o indirectamente en los procedimientos de defensa contra las plantas (Miró,1995). Existen una variedad de cucurbitacinas que difieren en cuanto a la aparición de ciertos tipos de ligandos y la presencia de dobles enlaces en ciertas posiciones encontrando los siguientes: cucurbitacina D ó 2β,16α,20β,25-tetra-hidroxicucurbita-5,23-dien-3,11,22-triona (21) , cucurbitacina B ó 2β,16α,20β-trihidroxi-25-acetocucurbita-5,23-dien-3,11,22- triona (22), di-hidrocucurbitacina C ó 3β,16α,19,20β-tetra-hidroxi-25- acetocucurbita-5-en-11,22-diona (23) y di-hidrocucurbitacina Q1 ó 3β,3α,20β- tetra-hidroxi-25-acetocucurbita-5-en-11,22-diona (24) (Afifi et.al ,1999).

O O HO HO R OAc O O OH HO R1 OH

O HO

(21) R=OH (23)R1=H;R2=OH (22) R=OAc (24)R1=OH;R2=H Figura 5-5 Ejemplos de cucurbitacinas, triterpenóides típicos de la familia

Cucurbitaceae (Mussa, 2006).

5.2 Género Momordica

Características morfológicas del género Momordica

El género Momordica posee alrededor de 59 especies, en ambientes cálidos y en áreas húmedas. Este género cubre una amplia variedad de plantas silvestres de gran importancia por su funcionalidad en ecosistemas y aplicaciones terapéuticas de igual manera, incluye a la mayoría de vegetales de la familia Cucurbitaceae que se utilizan como alimento (Assubaie & Garawany, 2004).

Las semillas de este género son planas, gruesas sobre la superficie, contiene márgenes afiladas y gruesas en los lados, ampliamente rectangulares, sin distinción entre los extremos con micropilares, esculpidos. Los frutos son pequeños, distantemente blandos, sin protuberancias o crestas, aunque las especies monóicas anuales (M. balsamina y M. charantia) comparten más características morfológicas a diferencia de otras especies. Una característica especifica es el sujetador de la flor macho se encuentra en la base cerca del eje o por debajo del centro del tallo de la flor en M. charantia. Mientras que en M. balsamina se sitúa en el medio superior o hacia la punta del pedúnculo. Los filamentos de anteras se fusionan para dar una apariencia globosa como lo es la

15 especie M. charantia, mientras que en la otra especie se divide en lóbulos (Bharathi & Jhon, 2013). En la figura 5-6 se presenta la morfología del género Momordica.

ores nacen tallo robusto arracimadas en as a i as de os ta os

Frutos son bayas lisas y Hojas globulares palmadas y lobuladas

raíz cónica y ramificada

Figura 5-6 Morfología del género Momordica (Poisoner’s, 2018).

Distribución del género Momordica

Las especies del género Momordica se distribuyen en su mayoría en África tropical, Sudáfrica, Asia, India y algunas en sur América. Principalmente como vegetal están en Gabón, Sudán, y Malawi otras zonas principales donde se encuentran son en Ghana, Kenia, Uganda y Tanzania. La mayoría de los cultivos utilizados en África oriental son importados de países asiáticos. En la actualidad, los criadores de este género se están concentrando en los híbridos y las ventajas de obtener un mayor potencial de rendimiento teniendo una mejor resistencia a una proporción alta de plagas, enfermedades y al grado de amargura (Grubben & Denton, 2004), la distribución del género Momordica se observa en la Figura 5-7.

Figura 5-7 Distribución de especie Momordica (tropicos.org, s.f).

*Las zonas de color amarillo corresponden a la distribución del género Momordica

Usos etnobotánicos del género Momordica

Las especies del género Momordica se han utilizado como un purgante drástico incluso hasta tóxico, pero en algunas zonas de distintos continentes los frutos son tradicionalmente comestibles. Las hojas de algunas especies en este género se recogen de la naturaleza y se comen después de hervir por lo general en tiempos de escasez. Las plantas son pastoreadas por el ganado en Sudán, y las hojas se usan como forraje (Kenia, Tanzania). Según la literatura botánica, en la medicina se usa popularmente contra problemas de la piel y parásitos externos, como sarnas y granos también para expulsar parásitos estomacales e intestinales (Grubben & Denton, 2004).

Actividades biológicas en especies del género Momordica

En cuanto a los estudios de la actividad biológica en el género Momordica la literatura reporta principalmente actividades como Antihiperglucemica y Antidiabética como es el caso de la especie Momordica cymbalaria (Rao, Kesavulu & Apparao, 2001). Se reporta en otras especies estudios como Hipoglicemiante, Antioxidante, Anticancerígena y Antiinflamatoria (Maulide, 2012). En la Tabla 5-2, se observa algunos estudios biológicos realizados en especies del género Momordica.

Tabla 5-2 Actividades biológicas de algunas especies vegetales del género Momordica

Órgano de la planta o Especie Actividad/caracterización Referencia extracto biológica evaluado

Momordica Semillas Actividad Antiinflamatoria Maulide,2012 balsamina Actividad Antiemética Mussa,2006 Actividad Antioxidante

Actividad Antimicrobiana Bot et Propiedades anti-VIH al.,2006

Momordica Extractos Actividad antiovulatoria Rao, cymbalaria vegetales Actividad aantidiabética Kesavulu & Actividad hipolipidemica Apparao,

Actividad 2001 antihiperglucémica

Momordica Extractos Actividad anticarcinogénica Takasaki grosvenori vegetales et.al 2003 Actividad antinflamatoria Di, Huang y

Ho, 2011

Momordica Fruta y Actividad Antioxidante Kubola & cochinchinen Semillas Actividad Siriamornpu , sis inmunomoduladora 2011 Semillas Tsoi, NG & Actividad antinflamatoria Fong, 2006

Jung et.al 2013

Momordica Extracto Actividad Antipalúdica Waako et foetida acuoso de al.,2005 la planta

Momordica Semillas y Actividad Antidiabética Raman & charantia l frutos Lau, 1996

Estudios químicos del género Momordica

Se ha realizado algunos estudios preliminares fitoquímicos, sobre algunas especies de Momordica con el fin de caracterizar algunos metabolitos secundarios determinando su potencial biológico. En el que se atribuye la composición en flavonoides y taninos para propiedades antioxidantes antiinflamatorias antialérgicas y anticancerígenas. Por su contenido en triterpenos, como la momordicina propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y vasodilatadoras se encuentra el B-sitoesterol (30), estigmastanol (33) y campesterol (32). Los esteroides también hacen parte de este género el cual se le comprenden una estructura similar a la de triterpenoides, que consta de un sistema de anillo tetracíclico típico (Halaweish, Tallamy & Santana,1999). Los fitoesteroles al tener de 27 a 32 átomos de carbono tienen un grupo hidroxilo en la posición C-3, dos grupos metilos en las posiciones C-10 y C-13 y una cadena lateral de alquilo en la posición C-17 (Novotný, Vachalkova, & Biggs, 2001).También pueden producirse en forma de ésteres y ácidos grasos, por ejemplo, el linoleato de β-sitosterilo (36), E β-sitosterol es el fitosterol más abundante en las plantas como se ilustra en la Figura 5-8. Mientras que a los alcaloides y resinas se les atribuyen propiedades antimicrobianas antiinflamatorias, antisépticas y antiinfecciosas. Los glucósidos juegan un papel importante en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, (Mussa, 2006; Thakur et al., 2009). Encontrando así los siguientes compuestos: Colestano (25), ergostano (26), estigmastano (27), colesterol (28), campesterol (29), Momordeno ó 3β-hidroxi-estigmasta-5,14-dien-16-ona (31), Espinasterol ó Estigmasta-7,22-dien-3β-ol (34), Estigmasterol (35).

R R

(25) R=H colestano (28) R=H colesterol (26) R=Me ergostano HO (29) R=Me (27) R=Et campesterol estigmastano (30) R=Et sitosterol

(32)R=Me HO HO campesterol (31) (33)R=Et sitostanol o estigmastanol

HO HO

(34) (35)

H C 3 (CH2)4 (CH2)7 O

(36)

Figura 5-8 Ejemplos de fitoesteroles comunes encontrados en el género Momordica (Mussa, 2006).

Sin especificar las cantidades y composiciones, algunos estudios publicados muestran que diferentes partes del género Momordica contienen una resina, algunas saponinas y ciertos alcaloides, además de metabolitos tipo triterpenoide como la momordicina en mayor cantidad, el momordol un alcohol triterpenoide monocíclico, y un grupo de triterpenóides tipo pentacíclicos, que comprende momordicina, momordicinina y momordicilina (Figura 5-9) en algunas especies del género Momordica (Begum et.al 1997; Mussa, 2006). Por su amplia variedad se deduce que la diversidad estructural de triterpenoides está relacionada con funciones fisiológicas en lo que estos compuestos son sintetizados por especies, encontramos algunas como : Momordicina ó 13-hidroxi-28-metoxi-urs-11-en-3- ona (37), Momordicilina ó 24-(1´-hidroxi-1´-metil-2-penteniloxil)- ursan -3-ona (38) , Momordicina ó 13β,28-epoxi-urs-11-en-3-ona (39) y Momordol ó 1-hidroxi- 1,2-dimetil-2-(8´,10´-dihidroxi-4´7´-dimetil-11´-hidroximetil-trideca)-3etilciclohex- 5-en-4-ona (40) .

COCH3

O O OH

O C CH CH CH2 CH3 (37) (38)

O O

OH OH

O HO CH2OH (40) (39)

Figura 5-9 Ejemplos de triterpenóides encontrados en el género Momordica (Mussa, 2006).

Los cucurbitanos constituyen un grupo de triterpenoides tetracíclicos típico de las especies en la familia Cucurbitaceae, especialmente actúan en la actividad biológica antitumoral (Akihisa, Yasukawa, & Tokuda, 2003). En general, el cucurbitano tipo triterpenoide tiene un esqueleto compuesto de un núcleo tetracíclico similar al de esteroides (1,2-ciclopentano-perhidrofenantreno, designados gonano o esterano) y sustituido por dos grupos metilos en el C-4 de posición de otros grupos metilos en las posiciones C-9, C-13 y C-14 cadena lateral alquilo en C-17 como se observa en la Figura 5-10. A continuación las estructuras de los siguientes compuestos químicos encontrados en el género Momordica: 3β,7β,23α-trihidroxicucurbita-5,24-dien-19-al (41), 3β,7β,25- trihidroxicucurbita-5,23-dien-19-al (42), 3β,7β –trihidroxi-25-metoxicucurbita- 5,23-dien-19-al (43) , 3β-hidroxi-7β,25-dimetoxicucurbita-5,23-dien-19-al (44) ,3β-dihidroxi-7β-metoxicucurbita-5,23,25-trien-19-al (45) (Miró ,1995).

OR2 OH H H H H

CHO CHO (42)R =H ; R =H HO 1 2 HO OH (43)R1=H ; R2=Me OR 1 (44)R1=Me ; R2=Me (41)

H H

CHO

HO OMe

(45)

Figura 5-10 Triterpenóides tipo cucurbitanos encontrados en el género Momordica (Mussa, 2006).

5.3 Especie Momordica Charantia L.

Características morfológicas de la especie Momordica charantia L.

La especie Momordica charantia L. es una planta tipo enredadera, herbácea anual, es conocida como karela en India, melón amargo (por el sabor amargo de todas sus partes) o Cundeamor en sur América. En Colombia se reconoce por sus nombres comunes balsamina, bejuco de coje, subicogen, pepinillo, pepino cimarrón (Vademecum Colombiano de Plantas Medicinales, 2008) y en el Valle del Cauca, como comidita de culebra. En la tabla 5-3 se presenta la descripción taxonómica de la especie Momordica charantia tomado de (http://www.cabi.org, 2016).

Tabla 5-3 Clasificación taxonómica de Momordica charantia L.

Reino Vegetal

División Magnoliofita

Clase Dicotiledónea

Orden Violales

Familia Cucurbitaceae

Genero Momordica

Especie Momordica Charantia Linn

Esta especie se caracteriza por ser bastante ramificada con tallo provisto de zarcillos. Las hojas son lobadas (cinco a siete lóbulos de 3-6 cm ovado- oblongos), alternas, membranosas, lisas y aterciopeladas por debajo de la nerviación (Lima, 2008). Las flores son amarillas, axilares, solitarias, pedunculadas y unisexuales; tiene corola de cinco pétalos acompañadas de una gran bráctea. Su fruto es cilíndrico- alargado de aproximadamente 2-3 cm el cual es verde cuando está creciendo y al madurar adquiere una coloración naranja. En la Figura 5-11 Se ilustra un ejemplo de las características morfológicas de la especie Momordica charantia L.

A B C

Fruto ovoide, Cinco a siete color lóbulos amarillo oblongos superficie lobado-palmadas cubierta por verrugas o tubérculos Semillas elípticas, Membranosas lisas y amarillas, con corola planas, color rojizo aterciopeladas de cinco pétalos y una gran bráctea Figura 5-11 Características morfológicas de la especie Momordica charantia A. Hojas, B. Flor, C. Frutos (www.shutterstock.com,s.f).

Distribución de la especie Momordica charantia L.

La especie Momordica charantia es originaria de China, India, Filipinas y Vietnam. Es un importante mercado de hortalizas en Asia meridional y oriental, y las poblaciones silvestres y cultivadas se puede encontrar en países como la India, Sri Lanka, Tailandia y Malasia, el sur de China y África tropical (Grubben, & Denton, 2004). Se cree que M. charantia se introdujo en América del oeste de África con el tráfico de esclavos. Momordica charantia se registró por primera vez en Puerto Rico en 1885 en el Herbario Nacional de los Estados Unidos (Grubben & Denton, 2004). Esta planta Ha sido usada tradicionalmente como planta medicinal en países como Brasil, Colombia, Haití, Nicaragua, México, Panamá, Perú, Ghana, India, China, Malasia, Nueva Zelanda y Cuba.

Figura 5-12 Distribución de la especie Momordica charantia en el mundo (http://www.cabi.org/,2016). *Los puntos negros corresponden a la distribución de la especie Momordica charantia en el mundo

En Colombia crece en los departamentos de Tolima, Magdalena, Antioquia, Bolívar, Santander, Valle del Cauca, entre otros como se puede observar en la Figura 5-13. En zonas de altitud entre 340 y 1000 m.s.n.m, se han registrado ejemplares en el Herbario Nacional Colombiano.

Figura 5-13 Distribución de la especie Momordica charantia en Colombia (http://www.gifex.com,s.f). *Los puntos morados corresponden a la distribución de la especie Momordica charantia en Colombia

Usos etnobotánicos de la especie Momordica charantia L.

Esta especie vegetal posee una larga tradición como planta antidiabética hasta el punto en que su extracto ha sido llamado "insulina vegeta ”. Recientemente, una proteína aislada de las semillas de Momordica, ha demostrado propiedades interesantes como antivírico y antineoplásico. En la medicina folklórica se atribuyen a esta planta multitud de aplicaciones: las hojas secas o la raíz pulverizada sirven para preparar una decocción que alivia las molestias de las hemorroides (aprendeenlinea.udea.edu.co, 2008). El jugo de los frutos se utiliza en la disentería y colitis crónica, mientras que la decocción de las semillas se emplea para las infecciones uretrales. También se dice que las semillas son vermífugas. Sin embargo, científicamente solo ha sido demostrados los efectos hipoglucémicos y antivíricos (Arango,2006)

En algunos libros de plantas medicinales en Colombia se nombra esta especie como uso de emenagogo, febrífugo, dolencias hepáticas; también usado en emplastos y cataplasmas contra las hemorroides, afecciones cutáneas, prurito, aftas, afecciones de la piel y quemadura, antimicótico, antimicrobiano. en asma, bronquitis, estreñimiento, fiebre, resfrió, tos, cefalea, hipertensión cálculos renales, desordenes menstruales, afecciones de piel, ulceras, quemaduras (Arango,2006).

Actividad biológica de la especie Momordica Charantia L.

A nivel de estudios de actividad biológica se ha demostrado que el extracto de la especie Momordica charantia presenta por electroforesis unas propiedades químicas similares a las de la insulina en algunos animales (Day et al.,1990). Otros hallazgos señalan que puede reducir la gluconeogénesis hepática, aumentar la síntesis hepática de glucógeno y aumentar la oxidación periférica de la glucosa en los eritrocitos y adipocitos, efectos todos ellos que contribuyen a

26 reducir los niveles de glucosa en sangre ( Basch, Gabardi & Ulbricht, 2003). Aunque esta especie presenta diferentes estudios a nivel internacional, como se describe en la Tabla 5-4 enfocados a la evaluación de diferentes actividades como: la antiinflamatoria, hipoglicemiante, antioxidante a nivel nacional los estudios de esta especie únicamente han sido orientados al establecimiento de parámetros de calidad y rango de variación en el material vegetal (Carlos, 2014).

Tabla 5-4 Estudios de algunas actividades farmacológicas en la especie Momordica charantia (Carlos, 2014).

Partes de la Actividad Tipo de Referencia planta Farmacológica estudio

Todas las Actividad In vivo Ali et al., 1993 Bailey, partes (fruto, hipoglicemiante Turner & Leatherdale, semillas, hojas) 1985 Çakici et al., 1994 Jayasooriya et al., 2000 Shibib, Khan & Rahman,1993

Sarkar, Pranava & Marita,1996

Suspensión de Actividad In vivo Ahmad et al.,1999 la pulpa del hipoglicemiante fruto

Extracto de Actividad Ensayo de Omoregbe, Ikuebe & hojas en agua, Antibacterial laboratorio Ihimire,1996 metanol y Ogata et al.,1991. etanol)

Extracto de la Actividad Ensayo de Yesilada, Gürbüz & planta entera Antimicrobiana laboratorio Shibata,1999

Extracto crudo y Actividad In vivo Battelli et al.,1996 fracciones Anticancerígena Ganguly, De & In vitro purificadas Das,2000 Licastro et al., 1980 Ng et al., 1994 Sun et al., 2001

Extracto de la Actividad ensayo de Khan & Omoloso,1998 planta entera Antiparasitaria laboratorio

Extractos de Actividad In vitro Yadav et al., 2010 frutos en agua, Hipoglicemiante etanol, metanol cloroformo y hexano

Estudio químico de la especie Momordica Charantia L.

La especie Momordica charantia L. cuenta con algunos estudios fitoquímicos reportando en general compuestos fenólicos (ácidos fenólicos), glicósidos triterpenicos, saponinas, glicósidos esteroidales adicionalmente se reportó la presencia de momordicosidos, momordicinas (i, ii y iii) y proteínas (Raman & lau, 1996). En partes de la planta más específicamente en raíces se han aislado algunos compuestos triterpenicos (Chen et al., 2008). En los frutos se han identificado triterpenos, alcaloides, fenoles, taninos, saponinas, además de terpenoides cucurbitanos, siendo coherentes con los reportes en la familia y genero dichos anteriormente (Yadav et al., 2010). Se encuentra los siguientes compuestos: Taiwacina A (46), Momordicosido K (47), Momordicosido L (48), Momordicina (49), Charantina (51), Kuguaglicosido G (54), Charantal (52), Charantin (50), Kuguacina A (53).

CH3 H3C O CH3 O O

H H O OH O O O O O HO O OH OH HO OH OH HO OH OH OH OH (46) (47)

H O OH

H H

OH HO O O HO OH HO OH OH (48) (49)

OH OH

H CHO H H Glu HO OH O

(51) (50)

O OH H

H H

Glu O HO O

(52) (53)

- O Glu

H H

HO O Glu

(54)

Figura 5-14 Compuestos químicos más representativos de la especie Momordica charantia (Lin, Yang & Lin C., 2011; Liu et al., 2010; Li et al., 2007; keller et al., 2011; Yuan, Gu & Tang, 2008; Chen et al., 2008).

5.4 Capacidad antioxidante

Los Antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhibiendo la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los radicales libres (Orjuela ,2015). La suplementación con antioxidantes está fundamentada en estudios epidemiológicos y clínicos que demuestran la estrecha relación entre factores como: dieta, estilo de vida, exposición a radiación, metales, pesticidas, tóxicos, y algunos medicamentos; con la aparición y desarrollo de enfermedades como cáncer, diabetes, aterosclerosis, desórdenes neurodegenerativos y envejecimiento. Todas estas condiciones patológicas están asociadas a un estado conocido como “estrés o idativo”, es decir, un aumento en as especies o idantes (principa mente Especies Reactivas del Oxígeno–EROs) y/o una disminución en los mecanismos de detoxificación de ellas. (Londoño, 2012).

Se encuentran dos categorías en los antioxidantes que son: sintéticos y naturales. En general los antioxidantes sintéticos son compuestos de estructuras fenólicas con varios grados de sustitución alquílica, mientras que los antioxidantes naturales pueden ser: compuestos fenólicos (tocoferoles, flavonoides y ácidos fenólicos), compuestos nitrogenados (alcaloides, derivados

30 de la clorofila, aminoácidos y aminas) o carotenoides, así como el ácido ascórbico. Los antioxidantes sintéticos como el BHA y BHT (Butil – hidroxianisol y Butil - hidroxitolueno) han sido utilizados como antioxidantes desde principios del siglo pasado. Sin embargo, se han impuesto medidas de precaución y se ha restringido su uso debido a su carcinogenicidad (Londoño, 2012). Debido a esto, el interés por los antioxidantes naturales se ha incrementado considerablemente ya que la capacidad de actuar como antioxidante se ha demostrado en especial con los flavonoides, muestra un amplio rango de efectos biológicos incluyendo funciones antibacteriales, antivirales, antiinflamatorias, antialergénicas, antitrombóticas y vasodilatadores. Una terapia antioxidante provee una alternativa barata para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo ya que se ha demostrado el efecto antioxidante de productos naturales provenientes de las plantas (Orjuela, 2015).

Determinación de la capacidad antioxidante

La manera más efectiva de evitar el daño producido por los radicales libres es su destrucción o estabilización por parte de antioxidantes, para medir esta capacidad existen diversos métodos entre ellos el ensayo de DPPH* y ABTS+•, el cual determinó la capacidad antioxidante de las fracciones y extractos donde se encuentran los respectivos metabolitos secundarios en las partes aéreas de la especie Momordica charantia basadas en: Método de 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH)

El ensayo DPPH se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) la cual se atribuye a la deslocalización del electrón desapareado, esta deslocalización también le otorga una coloración violeta caracterizada por una banda de absorción, en solución etanólica, centrada alrededor de 517 nm de forma que su concentración se puede determinar mediante métodos espectrofotométricos. Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que puede donar un átomo de hidrógeno o con otra especie radical (R.) se produce la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R con la consecuente pérdida del color y por lo tanto la pérdida de la absorbancia (Muñoz y Gutiérrez,

2009). En la Figura 5-15 se observa la reacción del DPPH con un agente antioxidante. O O + - + - N O N O - - O O + + N N N N NH N +A-H + A . O O + + N O N O - - O O

Figura 5-15 Reacción química del DPPH antes y después de reaccionar con un agente antioxidante (Muñoz y Gutiérrez, 2009).

Método del ácido 2,2'–azino–bis–[3–etillbenzotiazolin–6–sulfónico] (ABTS•+)

El ensayo ABTS●+ es uno de los métodos espectrométricos que han sido aplicados para medir la capacidad antioxidante total de soluciones o sustancias puras y mezclas acuosas (Re et al., 1999). La generación del radical catión ABTS●+, implica la producción directa del cromóforo ABTS●+ verde-azul a través de la reducción del ABTS con persulfato de potasio (K2S2O8).

El catión radical resulta en tres máximos de absorción a las longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm, considerándose mejor para ABTS●+, 734 nm como la longitud de onda de máxima absorbancia. La adición de los antioxidantes al radical pre-formado lo reduce a ABTS. De esta manera el grado de decoloración del radical catión ABTS●+ influye de acuerdo a la concentración de antioxidante como de la duración de la reacción sobre la inhibición de la absorción de catión radical se tienen en cuenta al determinar la capacidad antioxidante (Del Rio, 2013). En la Figura 5-16 se observa la reacción del ABTS con un agente antirradical.

2. Método del ácido 2,2'–azino–bis–[3–etillbenzotiazolin–6–sulfónico] (ABTS•+)

CH3 CH3 + N N N S N SO3H S K S O HO S S SO3H 2 2 8 3 N HO 3S S N N N H3C + AOH H3C

CH3

+ N N S SO H HO S 3 3 S N N

H3C

CH3

+ N HO 3S CNHH3 S SO H + 3 S N HO 3S N . N + AO SN SO H . 3 + AO S N H3C N

H3C Figura 5-16 Reacción química del ABTS antes y después de reaccionar con un compuesto antirradical (AOH) (Oliveira et al., 2014).

6 METODOLOGIA

Este trabajo de investigación se caracterizó por abordar dos aspectos, uno químico y otro biológico. El estudio químico se orientó en el aislamiento, purificación y elucidación estructural de metabolitos fijos presentes en las partes aéreas de la especie Momordica charantia y el estudio biológico se enfocó en evaluar la capacidad antioxidante del extracto y fracciones obtenidas de esta especie.

6.1 GENERALIDADES

Para el estudio fitoquímico de las partes aéreas de la especie Momordica charantia se emplearon métodos cromatográficos, espectroscópicos y espectrométricos convencionales utilizados en el aislamiento, purificación y elucidación estructural de metabolitos secundarios.

Métodos de separación cromatográficos y elucidación estructural

Los extractos y fracciones obtenidos fueron sometidos a separaciones sucesivas empleando para ello cromatografía en columna (CC) bajo gravedad, cromatografía en capa delgada (CCD) y cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP); cada una de las sub-fracciones obtenidas se monitorearon por cromatografía en capa delgada (CCD) utilizando cromatoplacas en sílica gel 60G F-254 Merck y para la CC se utilizó sílica gel 60 Merck (60- 200 Mesh).

El perfil cromatográfico de la CCD y la cantidad de fracción, permitió la selección de las fracciones que se llevaron a purificación, donde el control de pureza se realizó por CCD empleando como reveladores luz ultravioleta y vainillina en ácido sulfúrico.

Para determinar las mezclas obtenidas en las diferentes fracciones se utilizó un cromatógrafo con detector selectivo de masas SHIMADZU QP2010 plus, dotado con sonda de inserción directa y analizador de masas cuadrupolar. Utilizando un modo ionización electrónica (IE) a 70eV y una temperatura de la cámara de ionización de 230°C, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad

Distrital Francisco José de Caldas. La separación se realizó en una columna capilar SHRXi-5MS de 30 metros de ongitud 0,25 mm 0,25 μm con una inyección en modo Splitless, el gas de arrastre utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La programación de la temperatura del horno fue: de 50 °C (2 min) a 15°C/min hasta 200°C (2 min) a 10°C/min hasta 300°C (10min) para un tiempo total de análisis de 34 minutos, la temperatura de la línea de transferencia fue de 275°C y de la cámara de ionización de 230°C.

Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear

Los compuestos obtenidos fueron analizados por RMN (1H, 13C, J-MOD) tomados en un espectrómetro Bruker Avance del laboratorio de RMN de la Pontificia Universidad Javeriana. Los análisis se realizaron a 75 MHz para 13C y 1 300 MHz para H, empleando como solvente deuterado Metanol-d4, con tetrametilsilano (TMS) como referencia interna.

6.2 Estudio fitoquímico de las partes aéreas de Momordica charantia L

A continuación, se muestra la metodología que se empleó en la identificación de la especie vegetal, la obtención de extractos y fracciones, el aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios fijos.

Recolección e identificación del material vegetal

La especie vegetal fue recolectada en el municipio de Honda - Tolima (Coordenadas geográficas: 5°11′ 29′′ N, 74° 44′ 36′′ O) como se observa en la Figura 6-1.

Se recolectaron 500 g de partes aéreas, las cuales se secaron a temperatura ambiente y se redujeron de tamaño para su posterior extracción, una muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de Colombia para su determinación taxonómica la cual fue clasificada como Momordica charantia bajo el código COL 596915, identificada por el biólogo Carlos Alberto Parra.

Figura 6-1 Mapa de localización del área de recolección de la especie Momordica charantia, Colombia (Tolima) municipio de honda.

*Departamento Tolima, Municipio Honda. Adaptado de http://www.honda- tolima.gov.co/calendario/mapas_municipio.shtml?apc=bcxx-1-&x=1950707

Marcha fitoquímica preliminar

Para el estudio y caracterización de los metabolitos secundarios mayoritarios, se preparó un extracto etanólico, por medio de maceración en frio con 50 ml de etanol al 96%, empleando 10 g de partes aéreas secas de la especie vegetal Momordica charantia. A partir de este extracto se procedió a realizar las diferentes pruebas de identificación utilizando controles positivos para cada grupo de metabolitos presentes en la especie vegetal. El análisis se realizó basado en la guía de análisis fitoquímico preliminar (Sanabria, 1983) y en el método de estudio de productos naturales (Lock de Ugaz, 1994), tal como se muestra en la Figura 6-2.

Figura 6-2 Diagrama de la marcha Fitoquímica preliminar (Sanabria, 1983) y (Lock de Ugaz, 1994).

Obtención del extracto etanólico de las partes aéreas Momordica charantia (E. EtOH.Mc.PA)

La preparación del extracto se realizó con 500 g de material vegetal seco y molido de partes aéreas de la especie Momordica charantia empleando 2400 mL de EtOH al 96% a temperatura ambiente utilizando la técnica por maceración en frio. El extracto etanólico obtenido se filtró y concentro a una presión reducida a una temperatura de 40°C, posteriormente se floculó con H2O en relación 1:1 (E.

EtOH.Mc.PA:H2O) con el fin de eliminar interferencias e impurezas, posteriormente se realizó el fraccionamiento liquido-liquido continuo. El porcentaje de rendimiento neto que presento la extracción por maceración en frio con EtOH fue del 7.4 % p/p.

6.2.3.1 Obtención de Fracciones (Fx) totales

El extracto etanólico (E. EtOH.Mc.PA) fue empleado para el fraccionamiento liquido-liquido continuo, utilizando solventes de polaridad creciente; a partir de esto fueron obtenidas las fracciones de heptano (Fx.Hept.Mc.PA 450mg (1.22%)), diclorometano (Fx.DCM.Mc.PA 3152.2mg (8.51%)), acetato de etilo (Fx.AcOEt.Mc.PA 377.9mg (1.02%)) y un residuo hidroalcohólico (Fx.Hidroalc.Mc.PA (89.25%)). El proceso de fraccionamiento y los porcentajes de rendimiento para cada fracción se observan en la Figura 6-3.

500 g Material vegetal seco y Molido de Partes aéreas de Momordica charantia

Macerado en frio con EtOH al 96%

Obtención E.EtOH.Mc.PA 7.4%

Floculación de E.EtOH.Mc.PA sistema EtOH :H2O 1:1

Fraccionamiento Liquido- Liquido Continuo

Fx.Hep.Mc.PA Fx.DCM.Mc.PA Fx.AcOEt.Mc.PA Fx.Hidroalcolica.Mc.PA (450 mg) 1.22% (2000 mg) 8.51% (350 mg) 1.02% (1200 mg) 89.25%

Figura 6-3 Diagrama general del extracto y fracciones de partes aéreas de la especie Momordica charantia.

6.2.3.2 Fracción heptano de las partes aéreas de Momordica charantia (Fx.Hep.Mc.PA)

350 mg de Fx.Hep.Mc.PA fueron fraccionados por CC utilizando como fase móvil Hexano: Acetona 7:3, obteniendo 40 fracciones de las cuales fueron reunidas en 5 subfracciones. En la subfracción 9 (Fx9.Hept Mc .PA) se obtuvieron 30.9 mg de un sólido color amarillo denominado Mezcla McPA1, esta fracción fue analizada por CG-EM.

6.2.3.3 Fracción diclorometano de partes aéreas Momordica charantia (Fx.DCM.Mc.PA)

1000 mg de la fracción Fx.DCM.Mc.PA fue fraccionada por CC empleando como fase móvil CHCl3: Acetona 7:3 obteniendo 90 fracciones las cuales después de ser monitoreadas por CCD fueron reunidas en 22 fracciones. De la fracción 18 (Fx18.DCM Mc.PA) se obtuvo 156 mg de un sólido color amarillo-verdoso denominado Mezcla McPA2. De la fracción 21 (Fx21.DCM Mc.PA) se obtuvo 100 mg de un sólido color amarillo denominado Mezcla McPA3 , por último, en la fracción 30 (Fx30.DCM Mc.PA) se obtuvieron 100 mg de un sólido color amarillo al cual se le realizo CCDP empleando como fase móvil CHCl3: Acetona

1:1 empleando como revelador vainillina en H2SO4 y Luz ultravioleta obteniendo 3 subfracciones, de las cuales solo la subfracción 2 (Fx30.2 DCM Mc.PA) fue estudiada obteniendo 88.7mg de un sólido color blanco denominado Mezcla McPA4 siendo analizadas las fracciones y subfracciones por CG-EM.

6.2.3.4 Fracción de Acetato de Etilo de partes aéreas Momordica charantia (Fx.AcOEt.Mc.PA)

2,5 mg de la Fx.AcOEt.Mc.PA, fue fraccionada por el método de CC empleando como fase móvil Acetonitrilo: Metanol 8:2, obteniendo 25 fracciones las cuales después de ser monitoreadas por CCD utilizando cromatoplacas de aluminio en sílica gel RP18 Merck fueron reunidas a 5 fracciones. De la fracción 1 (Fx1.AcOEt Mc.PA) se obtuvo 18.3 mg de un cristal amarillo denominado Compuesto McPA5 el cual fue analizado por RMN.

6.2.3.5 Fracción Hidroalcohólica de partes aéreas Momordica charantia (Fx.Hidroalc.Mc.PA)

1000 mg de la Fx.Hidroalc.Mc.PA fueron separados por el método CF utilizando el equipo isoleraTM Biotage, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Empleando como fase móvil Metanol: Agua 8:2 y un cartucho SNAP Ultra C18 60g. Se obtuvo 70 fracciones las cuales fueron monitoreadas por CCD empleando cromatoplacas de aluminio en sílica gel RP18 Merck utilizando como fase móvil Metanol: agua 9:1 reunidas a 30 fracciones. De la fracción 6 (Fx6.Hidroalc Mc.PA) se obtuvo 38.5 mg de un cristal amarillo con punto de fusión de 222°C denominado Compuesto McPA6 el cual fue analizado por RMN.

La metodología empleada para el aislamiento de las mezclas y compuestos obtenidos de las fracciones de partes aéreas de Momordica charantia se ilustran en la Figura 6-4.

F.DCM.Mc.PA Fx.Hep.Mc.PA 1000 mg F.AcOEt. Mc.PA Fx.Hidroalc.Mc.PA 350 mg CC 250 mg 1000 mg CC CHCl3:Acetona CC CF Hex:Acetona 7:3 Acetonitrilo: Metanol Metanol:Agua 7: 3 8:2 90 fracciones 8:2 40 fracciones 25 fracciones 70 fracciones CCD CHCl3 : Acetona CCD DCM : Acetona 7:3 CCD Acetonitrilo: Metanol CCD Metanol:Agua 6:4 6:4 22 subfracciones 9:1 5 subfracciones 5 subfracciones 30 subfracciones

Fx.5.Hep.Mc.PA Fx1.AcOEt.Mc.PA Fx6.Hidroalc.Mc.PA Fx10.DCM Mc.PA Fx18.DCM Fx 21.DCM (156mg) Mc.PA (100mg) Mc.PA (200mg) Sólido Amarillo Sólido Amarillo (30.9 mg) Sólido Amarillo (38.3 mg) (50.2 mg) Sólido Amarillo Mezcla McPA2 Mezcla McPA3 CCDP CHCl3:Acetona Cristales Amarillos Cristales Amarillos Mezcla McPA1 1:1 2 subfracciones Compuesto McPA6 Compuesto McPA5 Fx s 21. 2.DCM Mc.PA (88,5mg) CG-EM Sólido Blanco RMN Mezcla McPA4 RMN

CG-EM

Figura 6-4 Aislamiento y purificación de las mezclas y compuestos.

Evaluación de la Capacidad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS

6.2.4.1 Preparación de la solución de DPPH

Para el ensayo se preparó la solución del radical libre 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo disolviendo 10mg de (DPPH•) en 10ml de metanol grado analítico. La solución fue protegida totalmente de la luz para evitar su degradación.

6.2.4.2 Cuantificación de la capacidad antioxidante en DPPH

Se evaluó de forma cuantitativa la capacidad que tienen los diferentes extractos y compuestos antioxidantes para neutralizar un radical libre, para este estudio se empleó el compuesto DPPH el cual se caracteriza por ser un radical estable gracias a la deslocalización de su electrón libre y su color violeta oscuro que posee una banda de absorción a 520nm, permitiendo determinar las concentraciones optimas de inhibición mediante métodos espectrofotométricos. Cuando una solución de DPPH se mezcla con una solución donadora de protones como un antioxidante, el radical se reduce perdiendo la intensidad de color y su absorbancia (Jara, 2013).

Se realizaron lecturas del ensayo para la capacidad antioxidante por triplicado utilizando placas excavadas con un tota de 96 pozos de 300 μL c/u. Se prepararon concentraciones stock para cada una de las fracciones a 10000 ppm, para cada ensayo se realizaron diluciones en serie de 9000, 6000, 3000, 1000, 500 y 100 ppm a 25 μL de cada uno se agregó 275 μL de solución DPPH y se leyó su absorbancia a 520 nm, en un equipo FLUOstar OPTIMA BMG LABTECH ubicado en el laboratorio de química de la Pontificia Universidad Javeriana, Las absorbancias se registraron teniendo en cuenta intervalos de tres minutos ente 0 y 60 min respectivamente. Se utilizó un control de trolox en solución metanólica, siguiendo el protocolo descrito en la Figura 6-5, el porcentaje de inhibición del radical DPPH, se calculó utilizando la ecuación 1:

(퐴퐵−퐴퐴) % de inhibición del DPPH= ∗ 100 퐴퐵

Ecuación 1. Cálculo % de inhibición DPPH

Donde:

AB corresponde a la absorbancia del blanco

AA corresponde a absorbancia del antioxidante

6.2.4.3 Preparación de la solución de ABTS

El radical catiónico ABTS●+ se produjo mediante la reacción entre ABTS 20 mg en agua desionizada y persulfato de potasio 2.4mg, almacenado en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16h debido a la alta sensibilidad a la luz.

6.2.4.4 Cuantificación de la capacidad antioxidante en ABTS

El ensayo ABTS●+ se basa en la transferencia de electrones; por lo cual los diferentes compuestos antioxidantes presentes en los extractos, donan uno o dos electrones para reducir el radical catión generando una medida precisa de la capacidad antioxidante total en el punto final de reacción (Wootton-Beard et al., 2011). Este catión radical ABTS azul posee una banda de absorción en 734nm volviéndose una solución incolora en presencia de antioxidantes, permitiendo así determinar las concentraciones óptimas de inhibición mediante métodos espectrofotométricos.

Se realizaron lecturas del ensayo para la capacidad antioxidante por triplicado uti izando p acas e cavadas con un tota de 96 pozos de 300 μL c/u. Se prepararon concentraciones stock para cada una de las fracciones a 10000 ppm, para cada ensayo se realizaron diluciones de 9000 6000, 3000, 1000, 500, 100 ppm, continuando con el mismo protocolo empleado en la medición por DPPH. El porcentaje de inhibición del radical ABTS, se calculó a partir de la ecuación 2:

(퐴퐵−퐴퐴) % de inhibición del ABTS= ∗ 100 퐴퐵

Ecuación 2. Cálculo % de inhibición ABTS

Donde:

AB corresponde a la absorbancia del blanco

AA corresponde a absorbancia del antioxidante

En la figura 6-5 se describe el procedimiento empleado para la evaluación de la capacidad antioxidante por los métodos de DPPH y ABTS.

Método DPPH Método ABTS

A partir de un stock de 200 A partir de un stock de 200 ppm de Trolox ppm de Trolox

En solución gua metanólica desionizada

Se preparo Se preparo

Di uciones a 20, 60 y Diluciones a 60, 75 y 100 ppm 125 ppm

se agregó 275 μL de se agregó 275 μL de so ución DPPH y 25 μL de so ución B S y 25 μL de cada dilución cada dilución

Se eyó a absorbancia en un equipo L Ostar OP M BM L B ECH ubicado en e aboratorio de a 520nm química de a Pontificia a 734nm niversidad averiana

En intervalos de En intervalos de

Tres minutos entre 0 y 60 min Dos minutos entre 0 y 60 min

Figura 6-5 Protocolo utilizado para el control de Trolox en los métodos de ABTS y DPPH

6.2.4.5 Análisis estadístico para los métodos de DPPH Y ABTS

El análisis estadístico para la cuantificación de la capacidad antioxidante (% inhibición y IC50), se realizó para el extracto etanólico y las fracciones de las partes aéreas de Momordica charantia, de acuerdo a los reportes establecidos

43 por triplicado (n=3), donde se estableció coeficientes de correlación y análisis de varianza, para cada ensayo utilizando el programa de statgraphics centurion XVI.

7 RESULTADOS Y ANÁLISIS

A continuación, se presenta los resultados obtenidos del trabajo de investigación denominado “CONTRIBUCIÓN AL ESTUDIO FITOQUÍMICO DE PARTES AÉREAS DE LA ESPECIE VEGETAL Momordica charantia Linn (CUCURBITACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU CAPACIDAD ANTIOXIDANTE” de acuerdo al estudio químico y biológico realizado.

7.1 Marcha fitoquímica preliminar (MFP) La MFP se desarrolló teniendo en cuenta patrones de comparación de diferentes tipos de metabolitos secundarios para este estudio; Los resultados fueron realizados a partir del extracto etanólico (E.EtOH.Mc.PA) y se encuentran consignados en la Tabla 7-1.

Tabla 7-1 Marcha fitoquímico preliminar del extracto etanólico de las partes aéreas de la especie Momordica charantia.

Grupo de Prueba Química Patrón de comparación Resultado Metabolitos

Shinoda -

Flavonoides Rosenheim Catequina -

Leucoantocianidinas -

Borntrager-Krauss -

Comportamiento H+ - Quinonas Plumbagina Comportamiento OH- -

Rodamina -

Gelatina-Sal +

Taninos FeCl3 Ácido Gálico +

Acetato de Plomo +

Hidroxamato férrico - Cumarinas 7-Hidroxicumarina Erlich -

Drangerdorf - Alcaloides Cinconina Mayer -

Valser +

Wagner +

Schleiber +

Formación de espuma + Saponinas Diosgenina Rosenthaler +

Terpenos Liebermann-Buchard Colesterol +

Carotenoides Ácido sulfúrico 98% Ex. Calendula oficinalis +

Baljet +

Glucósidos Tollens + Ex. Digitales purpurea cardiotónicos Antrona +

Molish +

*(-) resultado negativo, (+) resultado positivo.

Los resultados de la MFP de la Tabla 7-1, indica que la especie vegetal Momordica charantia, a través de pruebas cualitativas contiene diferentes metabolitos secundarios como: terpenos, taninos, glucósidos cardiotónicos, carotenoides y probablemente alcaloides debido a que solo tres pruebas dieron resultado positivo, por el contrario no presenta quinonas, flavonoides y cumarinas, siendo esto consecuente con estudios fitoquímicos realizados en diferentes especies del mismo género como Momordica balsamina (Mussa,2006) o Momordica grosvenori (Takasaki, et al; 2003). A pesar de que en nuestro país solo se encuentran algunos estudios de cuatro especies de la familia Cucurbitaceae que son Luffa cylindrica, Citrullus lanatus, Cucurbita máxima y Momordica charantia, en estudios internacionales únicamente en las especies Cucurbita máxima ,Citrullus lanatus y Momordica charantia se han caracterizado y reportado flavonoides, polifenoles, carotenoides, saponinas, proteínas y triterpenos, en frutos y semillas (Rajasree et al.,2016) siendo metabolitos importantes como agentes activos que poseen actividad farmacológica.

Aunque la especie Momordica charantia es la única del género Momordica presente en Colombia , se han realizado pocos estudios entre ellos un estudio acerca del tamizaje fitoquímico preliminar de hojas y semillas en la costa atlántica

46 ya que es una especie promisoria por su uso en la medicina tradicional estableciendo así metabolitos como: alcaloides glucósidos cardiotónicos y triterpenos (Beltrán, Díaz & Gómez, 2013) a nivel internacional se determinó principalmente en los frutos los siguiente compuestos: Taninos, glicósidos triterpenicos , glicósidos esteroidales y alcaloides (Rajasree et al., 2016) permitiendo determinar y corroborar a partir de MFP que la especie conserva una composición química similar en las diferentes regiones de Colombia .

7.2 Metabolitos secundarios aislados

La separación y purificación de las fracciones de heptano, diclorometano, acetato de etilo e hidroalcohólica, obtenidas a partir del extracto etanólico total de las parte aéreas de la especie Momordica charantia permitió la identificación de cuatro mezclas y dos compuestos la primer mezcla conformada por: un terpeno oxigenado Epoxylinalool, un norisoprenoide, Dihidroactinidiolida, un ácido graso saturado y un triterpeno alifático (Ácido palmítico y Escualeno) denominada Mezcla McPA1, en la mezcla designada como Mezcla McPA2 se encontró: un terpenoide biciclico (3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona y un norisoprenoide 2-Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil), en la Mezcla McPA3 se encontró: un terpeno oxigenado Oxido de linalool, dos compuestos fenólicos Ácido cinámico y Ácido benzoico, un compuesto heterocíclico Indol, por ultimo para la Mezcla McPA4 se encontró un terpeno oxigenado Eucaliptol y un ácido esterificado (ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1- dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester siendo las mezclas analizadas por CG- EM, los compuestos aislados e identificados como saponinas denominado el compuesto McPA5 como Kaguasaponina D y el compuesto McPA6 como Momordicina ll , analizados por RMN (1H, 13C, J-MOD).

Composición de la mezcla McPA1

La mezcla McPA1 (44.4 mg) se obtuvo como un sólido amarillo a partir de la fracción de heptano, el cual presentó manchas de color azul-violeta en CCD al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La corriente iónica total (TIC) del análisis por CG-EM arrojo cuatro señales significativas de alta intensidad. La comparación

47 de los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería NIST08 fueron identificados como: Epoxylinalool, Dihidroactinidiolida, Ácido palmítico y escualeno. Para determinar la posible composición de la mezcla se compararon los espectros obtenidos con los de la librería NIST08, la TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos que se encuentran consignados en la Figura 7-1 y la Tabla 7-2 respectivamente.

Figura 7-1 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA1

O O CH3 O

H3C CH3 H3C CH3 OH O H C H3C 3 CH3 CH2

Tabla 7-2 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA1

tR (min) % Área %Coincidencia* Asignación posible

8.3000 1.08 92 Epoxylinalool

11.738 7.10 92 Dihidroactinidiolida

16.056 42.81 92 Ácido palmítico

23.372 1.25 96 Escualeno

*Comparado con la librería NIST 08

En la figura 7-2 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 8.3000 minutos obtenido en la mezcla McPA1 y en la figura 7-2 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como Epoxylinalool con la fórmula molecular

C10H18O2 y un % de coincidencia del 92%.

Figura 7-2 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.30 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

Según la Figura 7-2 el compuesto Epoxylinalool no presenta ion molecular (M+) m/z a 170 por inestabilidad de la molécula, presentando una señal de baja intensidad en m/z 155 por pérdida de un radical alquílico (CH3). A partir de la señal de baja intensidad m/z 137 se fragmenta generando las señales de m/z 94 y m/z 43. Posteriormente el pico base m/z 68 corresponde a la pérdida de un radical acetileno C2H2 (M-26) en la señal m/z 94. En la Figura 7-3 se describen las posibles rutas de fragmentación propuestas para el compuesto identificado como epoxylinalool.

+ H3C CH3 H C + H3C OH 3 + -CH C OH + O 3 O -H2O O C H C H C 3 H3C 3 CH CH 2 CH2 2 m/z 170 m/z 155 m/z 137

+ H C + H C H C 3 . -C2H2 3 + + CH2 O H3C CH2 m/z 43 CH2 m/z 68 m/z 94

Figura 7-3 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Epoxylinalool

El Epoxylinalool ha sido reportado en la familia Caricaceae (Winterhalter, Katzenberger & Schreier,1986) particularmente en la especie vegetal Carica papaya que posee ciertas características en el aroma debido a varios compuestos volátiles entre los más destacados son derivados del linalool, la especie ha demostrado importantes actividades biológicas en distintos órganos de la planta como lo son: antihelmíntica, antibacteriana, vermífuga y antidisintérica (Torres et.al,2005). En la familia Cucurbitaceae se reporta en las flores de la especie Luffa acutangula y en los frutos de la especie Momordica charantia (Fernando y Grün, 2001) siendo el primer reporte en partes aéreas y consecuente con el reporte en los frutos.

En la figura 7-4 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 11.738 minutos obtenido en la mezcla McPA1 y en la figura 7-4 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como Dihidroactinidiolida con la fórmula molecular C11H16NO2 y un % de coincidencia del 92%.

Figura 7-4 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 11.738 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-4 se observa el ion molecular (M+) m/z 180 el cual genera la señal en m/z 137 a partir de una ruptura en el ciclohexano, formando el radical isopropil correspondiente a la señal de mediana intensidad m/z 43. Él espectro A y B muestran una señal intensa en m/z 111 correspondiente al pico base el cual se fragmenta a partir del ion molecular, generado por un reordenamiento tipo Mclafferty, en la Figura 7-5 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto.

O -C5H9 O + + H H3C O . O C H3C CH3 O O + H3C CH3 C H m/z 180 m/z 111 m/z 137 m/z 43

Figura 7-5 Posibles rutas de fragmentación propuesta para la Dihidroactinidiolida

La Dihidroactinidiolida ha sido reportado en la familia Zygophyllaceae (Dastagir, Hussain & Rehman, 2014) particularmente en la especie vegetal Tribulus terrestris demostrando importantes actividades biológicas como la antioxidante, antibacterial, antiinflamatoria y analgésica (Borran et al., 2017). En la familia Euphorbiaceae (Dastagir, Hussain & Rehman 2014) especialmente en la especie Ricinus communis la cual se ha reportado una actividad antioxidante promisoria, además de actividades citotóxicas y mutagénicas leves (Abbas et.al, 2018) siendo el primer reporte en el género Momordica.

En la figura 7-6 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 16.056 minutos obtenido en la mezcla McPA1 y en la figura 7-6 B el espectro

51 reportado por la librería NIST 08 como Ácido palmítico con la fórmula molecular

C16H32O2 y un % de coincidencia del 92%.

Figura 7-6 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 16.056 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-6 se presenta el ion molecular (M+) a m/z 256, para el compuesto Ácido palmítico, el cual presenta una señal de mediana intensidad en m/z 213 que se produce por perdida de un propilo C3H7 (M-43), la señal de m/z 73 de alta intensidad se da por la ruptura de cadena lateral C13H27 en esta ruptura se toma como referencia el compuesto base; se presentan una señal m/z 43 características de la perdida de metilo de una cadena carbonada, una señal en m/z 60 que es el pico base y es una fragmentación de tipo McLafferty. De acuerdo con la literatura (Walker ,2017) las posibles fragmentaciones propuestas para el ácido palmítico se presentan en la Figura 7-7.

HO + HO -C3H7 + O CH CH3 O 2 m/z 256 -C13H27 m/z 213 -C H O 13 25 2 -C14H28

+ HO H C CH + 2 3 HO + CH O 2 m/z 43 HO CH 2 m/z 73 m/z 60

Figura 7-7 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido palmítico

El ácido palmítico ha sido ampliamente reportado en la familia Asteraceae en particular la especie Carthamus tinctorius (Kang, Chang & Park,1990) demostrando un alto potencial antioxidante al igual que la especie Myrciaria cauliflora de la familia Myrtaceae (Neuza,2011). En la familia Cucurbitaceae se encuentra en las especies Cucurbita moschata, Cucumeropsis mannii, Cucurbita pepo (Fokou et al., 2009) además en los frutos de Momordica cochinchinensis (Ishida et al.,2004) y flores de Momordica charantia (Sarkar, N., & Barik,2015) siendo consecuente con el reporte en partes aéreas.

En la figura 7-2 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 23.372 minutos obtenido en la mezcla McPA1 y en la figura 7-2 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como Escualeno con la fórmula molecular

C30H50 y un % de coincidencia del 96%.

Figura 7-8 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 23.372 minutos de la mezcla McPA1. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-8 no se presenta el ion molecular (M+) a m/z 410 el cual por fragmentación alfa de una cadena C15H27 (M-207) genera la señal en m/z 203, siendo esta señal participe de dos fragmentaciones la primera en m/z 69 con pérdida de una cadena lateral C10H14 (M-68) estableciendo esta señal como pico base tanto en el espectro A como B, la segunda fragmentación en m/z 81 se genera por perdida de la cadena lateral C9H14 siendo esta señal de mediana intensidad. Finalmente, a partir de la señal m/z 81 por perdida del radical propino

(M-40) se origina m/z 41, en la Figura 7-9 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto escualeno.

H3C CH3 m/z 410

-C15H27

H3C CH2 m/z 203 -C10H14 -C9H14

+ -C H + H3C + 3 4 H2C CH H2C CH2 CH2

m/z 69 m/z 81 m/z 41

Figura 7-9 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Escualeno

El escualeno es una molécula que tiene la capacidad de suministrar oxígeno a las células, además de generar capacidad antioxidante (principalmente en la parte interna de la membrana celular) protegiendo a las células de los radicales libres (Warleta et al.,2007). Este compuesto ha sido reportado en especies como Calea ternifolia de la familia Asteraceae y Cocos nucifera L. de la familia Arecaceae (López, 2016). En la familia Cucurbitaceae se reporta en las especies Cucurbita máxima y cucurbita moschata estableciendo su posible uso como hipocolesterolémicos en humanos (Martínez, Valdivié & Estarrón, 2011). Es reportado por primera vez en la especie Momordica charantia.

Composición de la mezcla McPA2

La mezcla McPA2 (156 mg) se obtuvo como un sólido amarillo, a partir de la fracción de diclorometano, el cual presentó manchas de color azul-violeta en

CCD al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La corriente iónica total (TIC) del análisis por CG-EM arrojo cuatro señales significativas de alta intensidad. La comparación de los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería NIST08, fueron identificados como: 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona y 2-

Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil). Para determinar la posible composición de la mezcla se compararon los espectros obtenidos con los de la librería NIST 08, la TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos que se encuentran consignados en la Figura 7-10 y la Tabla 7-3 respectivamente.

H C 3 O CH H3C 3

O HO CH3

H3C

H C CH3 3 OH

H C 3 O

Figura 7-10 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA2

Tabla 7-3 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA2

tR (min) % Área %Coincidencia* Asignación posible

13.855 49.99 90 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta- ionona

14.014 10.28 94 2-Ciclohexen-1-ona-4- hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3- oxo-1-butenil)

*Comparado con la librería NIST 08

En la figura 7-11 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 13.855 minutos obtenido en la mezcla McPA2 y en la figura 7-11 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona con la fórmula molecular C13H20O3 y un % de coincidencia del 90%.

Figura 7-11 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 13.855 minutos de la mezcla McPA2. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-12B se presenta el ion molecular (M+) m/z a 224, a diferencia del espectro B que no presenta el ion molecular por inestabilidad del compuesto, el cual por fragmentación alfa de una cadena C5H9O2 (M-207) genera la señal en m/z 123, estableciendo esta señal como pico base tanto en el espectro A como B, posteriormente a partir de la anterior ruptura por perdida de la cadena lateral

C6H8 (M-80) se origina la señal a m/z 43, en la Figura 7-12 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta- ionona.

H3C + O + CH H3C 3 . H3C -C H O O 5 9 2 CH -C6H8 H3C 3 + H3C . O O HO CH3 m/z 43 CH3 m/z 224 m/z 123

Figura 7-12 Posibles rutas de fragmentación propuesta para 3-Hidroxi-5,6- epoxy-beta-ionona

El compuesto 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona se ha reportado en el aceite esencial de diferentes especies vegetales como: Vallisneria spiralis de la familia Hydrocharitaceae (Xian et al., 2006), Prunus pérsica de la familia Rosaceae

(Aubert et al., 2003) y la especie Rumex hastatus con promisoria actividad antioxidante (Ahmad et al., 2016) de la familia Polygonaceae. En la especie Momordica charantia es reportado por primera vez.

En la figura 7-13 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 14.014 minutos obtenido en la mezcla McPA2 y en la figura 7-13 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como 2-Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6- trimetil-4-(3-oxo-1-butenil) con la fórmula molecular C13H18O3 y un % de coincidencia del 94%. A

Figura 7-13 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 14.014 minutos de la mezcla McPA2. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-13 tanto en el espectro A como B no presenta ion molecular debido a la inestabilidad de la molécula , por lo que se genera la señal en m/z 124 por perdida del radical C5H6O2, estableciendo esta señal como pico base tanto en el espectro A como B, posteriormente se presenta una señal de mediana intensidad indicativa del radical propilo m/z a 43, en la Figura 7-14 se describen las posibles fragmentaciones para el compuesto 2-Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil- 4-(3-oxo-1-butenil).

+ O O +. H C 3 H3C -C5H6O2

H C CH3 CH 3 OH H3C 3

H C 3 O m/z 124 m/z 222 -C11H15O2

+ H3C . O

m/z 43

Figura 7-14 Posibles rutas de fragmentación propuesta para 2-Ciclohexen-1- ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil)

El compuesto 2-Ciclohexen-1-ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil). ha sido reportado en diferentes especies como Sphaeranthus indicus de la familia Asteraceae (Rao & Vijaya, 2018), Beloperone plumbaginifolia (Rajasekaran, Archana & Raviprasadh,2012) de la familia Acanthaceae con promisoria actividad antiinflamatoria y también la especie Gymnotheca involucrata de la familia Saururaceae (Yang et al., 2010), En la especie vegetal Momordica charantia es reportada por primera vez.

Composición de la mezcla McPA3

La mezcla McPA3 (100 mg) se obtuvo como un sólido amarillo-verdoso, a partir de la fracción de diclorometano, el cual presentó manchas de color azul-violeta en CCD al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La corriente iónica total (TIC) del análisis por CG-EM arrojo cuatro señales significativas de alta intensidad. La comparación de los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería NIST08, fueron identificados como: Ácido benzoico, Indol, oxido de linaool, Ácido y cinámico. Para determinar la posible composición de la mezcla se compararon los espectros obtenidos con los de la librería NIST 08, la TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos que se encuentran consignados en la Figura 7-15 y la Tabla 7-4 respectivamente.

HO O

H3C CH3

H O N

H3C

CH2

Figura 7-15 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA3

Tabla 7-4 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla McPA3

tR (min) % Área %Coincidencia* Asignación posible

8.415 24.16 95 Ácido benzoico

9.529 1.83 96 Indol

10.313 2.30 92 Oxido de linalool

10.680 1.71 94 Ácido cinámico

*Comparado con la librería NIST 08

En la figura 7-16 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 8.415 minutos obtenido en la mezcla McPA3 y en la figura 7-16 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como 3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona con la fórmula molecular C7H6O2. y un % de coincidencia del 95%.

Figura 7-16 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.415 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-16 se presenta el ion molecular (M+) m/z 122, el cual por perdida del hidroxilo (M-17) genera la señal en m/z 105 de alta intensidad establecida como en pico base tanto en el espectro A como B, la ruptura del carbonilo (M- 28) genera la señal de mediana intensidad en m/z 77. Finalmente, a partir de la anterior señal por perdida del radical acetileno C2H2 (M-26) se origina la señal en m/z 51 de acuerdo con la literatura (Galen & Feiters, 2016) en la Figura 7-17 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto Ácido benzoico.

+ O + + + HO O C -OH -CO C -C2H2

m/z 122 m/z 105 m/z 77 m/z 51

Figura 7-17 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido benzoico El ácido benzoico ha sido reportado ampliamente en la familia Orchidaceae en la especie Encyclia longifolia (Bhattacharya et al.,2006) y en particular en especies del género Phalaenopsis (Minh et al., 2016) reportando actividades farmacológicas como: antirreumáticos, antiinflamatorios, antivirales, anticancerígenos, neutroprotectores, anticancerígenos, antimicrobianos, antibacterianos y antioxidantes (Minh et al., 2016).En la especie Momordica

60 charantia este compuesto se ha reportado en corea en órganos como frutos

(Chae, Lee & Park, 2014) flores ,tallos y hojas (Cuong et al. 2018) corroborando así con el estudio de este trabajo en Colombia.

En la figura 7-18 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 9.529 minutos obtenido en la mezcla McPA3 y en la figura 7-18 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como indol con la fórmula molecular C8H7N y un % de coincidencia del 96%. A

Figura 7-18 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 9.529 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-18 presenta el ion molecular (M+) m/z 117 para el compuesto Indol, el cual por reordenamiento tipo Mclafferty genera la señal en m/z 90 establecida como el pico base tanto en el espectro A como B. De acuerdo con la literatura (Powers, 1968) en la Figura 7-19 se describen la posible ruta de fragmentación para el compuesto Indol.

H + N + -CH2N

m/z 117 m/z 90

Figura 7-19 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el indol

El Indol ha sido ampliamente reportado en la familia Araceae en particular especies como Alocasia indica (Lim,2015) y Sauromatum guttatum (Chen y

Meeuse ,1971) especies estudiadas que poseen alta actividad fitotóxica e insecticida (Khan et al., 2007).En la familia Cucurbitaceae se encuentra en las especies Cucurbita máxima, Cucurbita pepo (Andersen y Metcalf, 1987) luffa acutangula y en las flores de Momordica charantia (Fernando y Grün, 2001) siendo consecuente con el reporte en partes aéreas.

En la figura 7-20 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 10.313 minutos obtenido en la mezcla McPA3 y en la figura 7-20 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como oxido de linalool con la fórmula molecular

C10H18O2 y un % de coincidencia del 92%.

Figura 7-20 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 10.313 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-20 el compuesto óxido de linalool , no presenta ion molecular (M+) m/z a 170, por inestabilidad del compuesto, a partir de la fragmentación entre el carbono 2 del furano y el radical etilo 1-hidroxi-1-metil genera una señal de baja intensidad en m/z 111 y una señal de alta intensidad m/z 59 siendo el pico base tanto en el espectro A como B, posteriormente la señal m/z 43 se originan por la pérdida de oxigeno (M-16) de la señal m/z 59 .En la Figura 7-21 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto oxido de linalool.

HO + + + H C CH 3 3 CH OH . O C -O + O + CH H C 3 H3C CH3 H3C CH3 H3C CH2

CH2 m/z 170 m/z 111 m/z 59 m/z 43

Figura 7-21 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el óxido de linalool

El óxido de linalool ha sido ampliamente reportado en la familia Magnolaceae en particular especies como Magnolia bark (Sha et al.,2004 )y Michelia champaca (Kaiser,1991) demostrando potencial en actividades antioxidantes, analgésicas y citotóxicas (Hossain et al.,2009).En la familia Fabaceae se encuentra en la especie Albizia julibrissin (Zhang & Setzer,2013) presentando actividades antipiréticas, analgésicas, estrogénicas y antiinflamatorias (Farag et al., 2013) No se encuentran reportes para la familia Cucurbitaceae y para el género Momordica. Es reportada por primera vez para la especie Momordica charantia.

En la figura 7-22 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 10.680 minutos obtenido en la mezcla McPA3 y en la figura 7-22 B el espectro reportado por la librería NIST 08 como oxido de linalool con la fórmula molecular

C9H8O2. y un % de coincidencia del 94%. A

Figura 7-22 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 10.680 minutos de la mezcla McPA3. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-22 presenta el ion molecular (M+) m/z 148 para el compuesto Ácido cinámico, presentando el pico base en m/z 147 tanto en el espectro A como B, a partir del ion molecular por fragmentación del radical hidroxilo (M-17) genera la señal en m/z 131 y este a su vez por la fragmentación del carbonil origina la señal m/z 103. Posteriormente una fragmentación de acetileno (M-26) genera señales em m/z 77 y m/ z 51 en la Figura 7-23 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto Ácido cinámico.

+ + + HO O O CH + + -CO -OH -C2H2 -C2H2

m/z 77 m/z 51

m/z 148 m/z 131 m/z 103

Figura 7-23 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido cinámico

El ácido cinámico ha sido ampliamente reportado en la familia Fabaceae en particular las especies Myroxylon toluiferum y Myroxylon balsamum demostrando un alto potencial como antiséptico en ambas especies (Sartoriet al., 2015), otra especie reportada ha sido Schisandra chinensis (Sladkovský y Opletal, 2011) caracterizada por una óptima actividad Antioxidante y antibacterial (Chen et al., 2011). En la familia Cucurbitaceae se ha reportado en la especie Cucumis sativus (Ye et al., 2004) además en las flores de la especie Momordica charantia (Cuong et al., 2018) siendo consecuente con el reporte en partes aéreas.

Composición de la mezcla McPA4

La mezcla McPA4 (88.7 mg) se obtuvo como un sólido blanco, a partir de la fracción de diclorometano al realizar una CCDP a la fracción 30, la cual presentó manchas de color violeta en CCD al ser revelado con Vainillina /H2SO4. La corriente iónica total (TIC) del análisis por CG-EM arrojo dos señales significativas de alta intensidad. La comparación de los espectros de masas de las respectivas señales con los de la librería NIST08, arrojo resultados de dos

64 compuestos identificados como: Eucaliptol y Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1- dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester. Para determinar la posible composición de la mezcla se compararon los espectros obtenidos con los de la librería NIST 08, la TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos que se encuentran consignados en la Figura 7-24 y la Tabla 7-5 respectivamente.

Figura 7-24 Corriente iónica total (TIC) de la mezcla McPA4

H C CH 3 CH3 3 CH3 O H3C CH O 3 O O

CH3 CH H3C 3 O

H3C CH3

Tabla 7-5 Tiempos de retención y resultados de la comparación con la librería NIST08 para la mezcla McPA4

tR (min) % Área %Coincidencia* Asignación posible

7.184 2.81 95 Eucaliptol

8.415 25.76 92 Ácido propanoico, 2-metil- , 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil- 1,3-propanediol ester

En la figura 7-25 A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 7.184 minutos obtenido en la mezcla McPA4 y en la figura 7-25 B el espectro

65 reportado por la librería NIST08 como eucaliptol con la fórmula molecular

C10H18O y un % de coincidencia del 95%. A

Figura 7-25 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 7.184 minutos de la mezcla McPA4. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-25 presenta el ion molecular (M+) m/z 154 para el compuesto

Eucaliptol, presentando una pérdida de radical alquílico CH3, para la señal de m/z 139, por reordenamiento del ion molecular y posterior ruptura forma los iones

C8H15 en m/z 111, C7H12 en m/z 96 y C2H3O para la señal de m/z 43 establecido como el pico base tanto en el espectro A como B. En la Figura 7-26 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto Eucaliptol (Stashenko et al.,2007).

CH3 +

H3C CH3 m/z 154 + CH CH CH3 + H3C 3 m/z 43

O + CH3 + +

H C 3 H C 3 CH3 m/z 81 m/z 139 m/z 96 m/z 111

Figura 7-26 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Eucaliptol

El Eucaliptol ha sido ampliamente reportado en la familia Lamiaceae particularmente en las especies del género Ocimum, siendo utilizado en la medicina tradicional por sus propiedades antisépticas, particularmente de las vías respiratorias (Beltrán et al., 2010). Otra especie reportada ha sido Myrcianthes rophaloides de la familia Myrtaceae demostrando un alto potencial en la (actividad antimicrobiana Maldonado, 2006). Siendo reportado por primera vez para la especie Momordica charantia.

En la figura 7-27A se observa el espectro de masas para el compuesto con Tr 8.415 minutos obtenido en la mezcla McPA4 y en la figura 7-27 B el espectro reportado por la librería NIST08 como Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1- dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester con la fórmula molecular C16H30O4 y un % de coincidencia del 95%.

Figura 7-27 (A) Espectro de masas para el compuesto con tiempo de retención 8.415 minutos de la mezcla McPA4. (B) Espectro de masas reportado de la librería NIST08

En la Figura 7-27 no presenta el ion molecular (M+) m/z 286 por inestabilidad del compuesto , presentando el pico base para el espectro A y B en la señal m/z 71 por perdida de la cadena lateral C12H23O3 , a partir del ion molecular se presenta la señal de m/z 43 generando el ion propilo en la Figura 7-28 se describen las posibles rutas de fragmentación para el compuesto Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester.

H C CH 3 + CH3 3 CH3 + O O H3C CH -C H O O 3 12 23 3 O O CH H3C 3 CH H3C 3 m/z 71 m/z 286 -C13H23O

+ CH H3C CH3

m/z 43

Figura 7-28 Posibles rutas de fragmentación propuesta para el Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester

El Ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3-propanediol ester se ha reportado en diferentes especies vegetales como Mandragora autumnalis de la familia Solanáceae (Hanuš, Dembitsky & Moussaief, 2006) presentando promisoria actividad antimicrobiana y antioxidante en las raíces (Jodallah, 2013). También se encuentra en la especie Glossostemon briguieri de la familia Malvaceae con pontencial antimicrobiano y antifúngico (Darweesh & Ahmed,2016) y la especie Cyclopia subternata de la familia Fabaceae (Roux et al.,2012). Siendo reportado por primera vez para la especie Momordica charantia. Elucidación estructural del compuesto McPA5

El compuesto McPA5 (50.2 mg) se obtuvo como un cristal amarillo soluble en metanol, el cual presento un punto de fusión de 234 °C. El compuesto fue aislado a partir de la fracción de Acetato de etilo y analizado por 1H, 13C J-MOD y COSY permitió identificar el compuesto 25-etoxi-7b-hidroxicucurbita-5,23(E)-dien-19-al 3-O-b-dalopiranosido también conocido como kaguasaponina D con m/z 685 y formula molecular C38H62O9.

El Espectro de RMN 1H para el compuesto McPA5 , tomado a 300MHz en

Metanol-d4, se puede observar en la Figura 7-29 siete singletes en δH 0.89 , 0.93, 1.30, 1.32, 1.10, 1.47, 0.83 ppm correspondiente a grupos metilos , dos protones

68 de oximetina a δH 3.71 ppm (br, s) y 4.05 ppm (d, J=4.6 Hz), y dos protones olefínicos δH 6.14 ppm (d, J = 7.8 Hz), y 6.06 ppm (d, J = 4.4 Hz).

El singlete en δH 9.89 ppm indica la presencia de un protón carboxaldehido. La presencia de un etil se presenta en las señales de δH 3.53 y 1.19 ppm, por otra parte las señales del glucosido presentan un doblete para el protón anomérico en δH 5.28 , un doble doblete a δH 4.40 (dd, J = 9.1, 5.2Hz ) y δH 4.61 (dd, J =

9.1, 1.9 Hz), y multipletes en δH 4.56 , 3.95 , 4.03 y 4.27 ppm (Zhang et al., 2014).

1 Figura 7-29 Espectro de RMN H (300 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA5 En el espectro de 13C, J-MOD para el compuesto McPA5, tomado a 75MHz en

Metanol-d4, se puede observar en la Figura 7-30, diversas señales las cuales son atribuidas a 38 carbonos compuestas por: ocho metilos (δC 13.96, 19.47,

24.63, 26.09, 28.65,26.42, 17.81 , 17.28) , ocho metilenos (δC 20.81, 29.42, 21.90,

45.35, 34.22, 28.83 ,40.88, 61.32), un metileno oxigenado (δC , 62.9), cuatro metinos (δC 49.40, 36.14, 50.54, 32.35), cuatro olefínicos (δC 145.98, 122.67,

124.42, 139.51), seis metinos oxigenados (δC 86.9, 65.49, 76.46, 75.48, 70.29,

79.35), cuatro carbonos cuaternarios (δC 39.65, 49.28, 27.17, 49.28), junto con un carbonilo aldehído particular en la región campo bajo (δC 208.65) y un carbono anomérico (δC 102.30) (Zhang et al., 2014).

13 Figura 7-30 Espectro de RMN C J-MOD (75 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA5.

La correlación a tres enlaces entre hidrógenos se estableció mediante el análisis del espectro COSY (Figura 7.31) en este espectro se muestran correlaciones como la de los protones en δH 4.05 ppm (s, 1H) y 6.14 ppm (s, 1H) corroborando la presencia de una olefina en el posición 6 , al igual que la correlación entre el protón δH 5.61 y 6.06 ppm en la posición 24 y 25; el protón δH 3.53 y 1.19 ppm indica la presencia de un etil, la correlación entre δH 5.28 y 4.56 ppm indican los desp azamientos químicos de os carbonos 1’ y 2’ de glucosido.

(3.51,1.21) (5.60,2.19)

(1.58,2.55)

(5.28,4.56)

(5.60,6.06) (4.05,6.14)

Figura 7-31 Ampliación de espectro COSY en RMN para el compuesto McPA5. Luego del análisis de los espectros en RMN y la comparación con otros autores se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los carbonos e hidrógenos de la molécula (Figura 7-32) la cual se identificó como kaguasaponina D.

Figura 7-32 Asignación de los desplazamientos químicos para el compuesto McPA5

En la Tabla 7-6 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto McPA5 y los descritos para la kaguasaponina D, según Zhang et al., 2014. Tomados con diferente solvente y a diferente frecuencia 1H (400 MHz, 13 piridina-d5) y C (100 MHz, piridina-d5).

Tabla 7-6 Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto McPA5 con los de kaguasaponina D (Zhang et al., 2014).

McPA5* Kaguasaponina D** RMN Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H 13C 1 1.73;1.96 20.81 1.57;1.93 22.4 2 1.90 ;2.44 29.42 1.92; 2.46 28.6 3 3.71 (br,s) 86.22 3.66 (br,s) 86.9 4 - 39.65 - 41.9 5 - 145.98 - 145.5

6 6.14 (d,J = 7.7 Hz) 122.67 6.20 (d,J = 7.8 Hz) 123.5

7 4.05 (d, J=4.3 Hz) 65.49 4.31 (d, J=4.6 Hz) 65.5 8 2.39 49.62 2.33 50.7 9 - 49.28 - 50.4 10 1.53 36.20 1.48 36.8 11 2.55 ;1.91 21.90 2.56;2.65 22.6 12 1.58 27.17 1.52 29.3 13 - 45.35 - 45.6 14 - 49.28 - 48.2 15 1.35 34.22 1.35 34.8 16 1.27;1.90 28.83 1.20;1.90 27.6 17 1.48 50.54 1.48 50.0 18 0.89 13.96 0.85 14.9 19 9.89 208.65 10.57 207.8 20 1.52 32.35 1.49 36.2 21 0.93 19.47 0.94 18.9 22 2.17 40.88 1.83;2.18 39.6 23 5.61 124.42 5.59 127.7

24 6.06 (d,J = 4.5 Hz) 139.51 5.55 (d,J = 4.4 Hz) 138.2

25 - 75.64 - 74.6 26 1.30 (s,3H) 24.63 1.32 27.1 27 1.32 (s,3H) 26.09 1.32 26.5 28 1.10 (s,3H) 28.65 1.09 27.8 29 1.41 (s,3H) 26.42 1.56 25.8 30 0.83 (s,3H) 17.81 0.80 18.1 31 3.53 61.32 3.39 57.7 32 1.19 (s,3H) 17.28 1.17 16.4 1’ 5.28 101.6 5.30 104.7 2’ 4.56 74.9 4.64 73.4 3’ 3.95 78.7 3.83 72.1 4’ 4.03 71.8 4.15 69 5’ 4.27 78.8 4.43 75.5 6’ 4.40;4.61 62.9 4.34;4.48 62.9 1 13 * Datos obtenidos a 300 MHz para RMN H y 75 MHz en RMN C (Solvente: Metanol-d4) 1 13 ** Datos obtenidos a 400 MHz para RMN H y 100 MHz en RMN C (Solvente: piridina-d5) (Zhang et al.,2014)

La Kaguasaponina D es una saponina común en la familia Cucurbitaceae, encontrado en Frutos de la especie Momordica charantia y Momordica balsamina (Zhang et al.,2014) y (Mussa, 2006).

. Elucidación estructural del compuesto McPA6

El compuesto McPA6 (18.3 mg) se obtuvo como un cristal de color amarillo, insoluble en heptano, poco soluble en diclorometano y soluble en metanol, el cual presento un punto de fusión de 222°C.El compuesto fue aislado a partir de la fracción hidroalcoholica y analizado por 1H, 13C, J-MOD y COSY permitió identificar el compuesto 23-O-ß-d-glucopiranosil-3,7-dihidroxycucurbita-5,24- dien-19-al, también conocido como Momordicina ll con m/z 657 y formula molecular C36H58O9.

El Espectro de RMN 1H para el compuesto McPA6 , tomado a 300MHz en

Metanol-d4, se puede observa en la Figura 7-33 siete singletes en δH 0.83 , 1.19, 1.72, 1.74, 0.94, 1.41, 1.18 ppm correspondiente a grupos metilos , tres protones de oximetina a δH 3.71 (br, s) , 4.05 (d, J=4.6 Hz) y 4.60 ppm (d, J=7.8 Hz), y dos protones olefínicos δH 5.93 ppm (d, J = 7.8 Hz), y 5.28 ppm (d, J = 4.4 Hz).

El singlete en δH 9.90 ppm indica la presencia de un protón carboxaldehido. Por otra parte las señales del glucosido presentan un doblete para el protón anomérico en δH 4.94 ppm, un doble doblete a δH 4.37 (dd, J = 9.1, 5.2Hz ) y δH

4.40 ppm (dd, J = 9.1, 1.9 Hz), y multipletes en δH 4.02 , 4.25 , 4.27 y 3.88 ppm (Mekuria et al., 2006).

1 Figura 7-33 Espectro de RMN H (300 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA6 En el espectro de 13C, J-MOD para el compuesto McPA6, tomado a 75MHz en

Metanol-d4, se puede observar en la Figura 7-34, diversas señales las cuales son atribuidas a 36 carbonos compuestas por: siete metilos (δC 14.8, 18.30,

16.95, 26.37, 24.62, 27.17, 17.36 ) , siete metilenos (δC 21.89, 28.85, 20.77,

28.43, 34.24, 27.17, 42.89), un metileno oxigenado (δC 61.37), cuatro metinos (δC

39.65, 36., 50.67, 32.21), dos metinos olefínicos (δC 122.44, 127.22), siete metinos oxigenados (δC 75.24, 65.41, 74.07, 75.69, 76.40, 70.18, 77.02), cuatro carbonos cuaternarios (δC 40.87, 47.33, 45.32, 46.73), dos carbonos olefínicos

(δC 145.95, 132.27), junto con un carbonilo aldehído particular en la región campo bajo (δC 208.91) y un carbono anomérico (δC 102.15) (Mekuria et al., 2006).

13 Figura 7-34 Espectro de RMN C J-MOD (75 MHz, Metanol-d4) del compuesto McPA6 La correlación a tres enlaces entre hidrógenos se estableció mediante el análisis del espectro COSY (Figura 7.35) en este espectro se muestran correlaciones como la de los protones en δH 4.02 ppm (s, 1H) y 5.93ppm (s, 1H) corroborando la presencia de una olefina en el posición 6 , al igual que la correlación entre el protón a δH 4.60 y 5.28 ppm en la posición 24 y 25 ; el protón δH 1.43 ppm del ciclopentil con el protón δH 2.41 en la posición 20 y el protón δH 2.60ppm con el protón δH 1.50 ppm indicando la unión entre los ciclos A y B indicativo de la base estructural del ciclopentilperhidrofenantreno.

(2.60,1.50)

(4.60,181)

(1.43,2.41)

(4.60,5.28) (1.74,5.28)

(4.02,5.93)

Figura 7-35 Ampliación de espectro COSY en RMN para el compuesto McPA6 Luego del análisis de los espectros en RMN y la comparación con otros autores se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los carbonos e hidrógenos de la molécula (Figura 7-36) la cual se identificó como Momordicina ll.

Figura 7-36 Asignación de los desplazamientos químicos para el compuesto McPA6

En la Tabla 7-7 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto McPA5 y los descritos para la Momordicina ll, según Mekuria et al., 2006. Tomados con diferente solvente y a diferente frecuencia 1H (400 MHz, 13 piridina-d5) y C (100 MHz, piridina-d5).

Tabla 7-7 Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto McPA5 con los de Momordicina ll (Mekuria et al., 2006).

McPA6 Momordicina ll Posición RMN 1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C 1 1.27; 1.50 21.89 1.18 ;1.57 21.74 2 1.95 ;2.18 28.85 1.94;2.02 29.88 3 3.90 (br s) 75.24 3.80 (br s) 75.61 4 - 40.87 - 41.72 5 - 145.95 - 145.69 5.93(d, J = 7.6 6.27 (d, J = 6 122.49 124.27 Hz) 7.8 Hz) 4.02 (d, J=7.5 4.02 (d, J=7.8 7 65.41 65.70 Hz) Hz) 8 2.36 49.40 2.58 50.57 9 - 47.33 - 50.64 10 2.60 36.14 2.71 36.83 11 1.89 20.77 1.93 22.68 12 1.35 28.43 1.50 29.60 13 - 45.32 - 45.89 14 - 47.33 - 48.26 15 1.55 34.24 1.50 34.92 16 1.33;1.72 27.17 1.29;1.87 27.81 17 1.43 50.67 1.53 51.24 18 0.83 14.8 0.86 14.93 19 9.90 208.91 10.73 207.50 20 2.41 32.21 2.06 32.66 21 1.19 18.30 1.10 19.41 22 1.81;2.38 42.89 1.96;2.71 43.75 23 4.60 74.07 4.94 75.29 5.28 (d, J = 4.3 5.61 (d, J = 4.4 24 127.22 129.11 Hz) Hz) 25 - 132.27 - 132.23 26 1.72 (s,3H) 16.95 1.69 18.25 27 1.74 (s,3H) 26.37 1.75 26.21

28 0.94 (s,3H) 24.62 0.88 25.82 29 1.47 (s,3H) 27.17 1.47 27.31 30 1.18 (s,3H) 17.36 1.16 18.21 1’ 4.94 102.15 4.99 104.16 2’ 4.02 75.69 4.01 75.66 3’ 4.25 76.40 4.21 78.90 4’ 4.27 70.18 4.22 71.81 5’ 3.88 77.02 3.82 78.25 6’ 4.37;4.40 61.37 4.34;4.46 61.37 1 13 * Datos obtenidos a 300 MHz para RMN H y 75 MHz en RMN C (Solvente: Metanol-d4) 1 13 ** Datos obtenidos a 400 MHz para RMN H y 100 MHz en RMN C (Solvente: piridina-d5) (Mekuria et al.,2006)

La Momordicina ll es una saponina común en la familia Cucurbitaceae, encontrado en Hojas de la especie Momordica charantia y Frutos de Momordica balsamina (Mekuria et al.,2014) y (Mussa , 2006)

7.3 Evaluación de la capacidad antioxidante

La capacidad antioxidante se determinó mediante el método de DPPH y ABTS al extracto etanólico (E. EtOH.Mc.PA), y a las fracciones de heptano (Fx.Hept.Mc.PA), diclorometano (Fx.DCM.Mc.PA), acetato de etilo (Fx.AcOEt.Mc.PA) e hidroalcohólica (F. Hidroalcoholica.Mc.PA) a una longitud de onda de 520 nm y 740 nm respectivamente.

Curva de calibración para el ensayo DPPH

A partir de un Stock de 200 ppm de Trolox (sustancia análoga hidrosoluble de la vitamina E) se realizaron tres (3) diluciones a 20, 60 y 100 ppm. Se midieron las absorbancias de cada una de estas diluciones a 520 nm, los promedios de las absorbancias obtenidas se presentan en la Tabla 7-8, así como su % de inhibición calculado con la ecuación 1 y su IC50.

Tabla 7-8. Promedio de absorbancias (n=3), %inhibición, IC50 de trolox

Pozos Promedio de % Inhibición IC50 Absorbancias

20ppm 0.666 ± 0.001 32.6

60ppm 0.386 ± 0.0005 63.1 47.5

100ppm 0.151 ± 0.001 88.8

Los valores obtenidos en el ensayo de DPPH se interpretaron con valores estadísticos, correspondiente al control positivo en cada ensayo así mismo se determinó, el tiempo en que el patrón inhibió cerca del 50% del radical, que para Trolox fue a los 15 minutos con un coeficiente de correlación de 0,997655. Como se observa en la gráfica 7-1 la curva de calibración para Trolox, establecen que la función matemática entre las variables del porcentaje de inhibición y concentración (ppm) indica una buena relación lineal, en el grado de asociación entre las dos variables cuantitativas, generando una relación directamente proporcional. Los valores estadísticos se resumen en la tabla 7-9.

100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 R² = 0,9976 50,0 40,0 %inhibición 30,0 20,0 10,0 0,0 0 20 40 60 80 100 120 concentración(ppm)

Ecuación Lineal: Y = a + b*x % inhibición = (19,4) + (0,7019) *(concentración) Gráfica 7-1 Curva de calibración para trolox

Tabla 7-9 Datos estadísticos para la sustancia patrón Trolox

TROLOX en el método de DPPH Coeficiente de correlación Análisis de varianza

0.7019 Media Pendiente 47.5

19.4 Intercepto DesvStd 0.1

0.9976 Coef. R2 CV % 0.24

Coef.R2 (Coeficiente de relación); Desv Std (Desviación estándar); CV (Coeficiente de variación.

De acuerdo al análisis estadístico realizado, el coeficiente de varianza se comporta de manera homogénea debido a que solo se presenta un 0.2% entre la desviación estándar (47.5 ± 0.1) y la media del IC50, indicando una relación significativa entre cada una de las variables. Los valores estadísticos indican que el modelo es adecuado para la interpolación de los valores obtenidos para el extracto y las fracciones.

Cuantificación de la capacidad captadora de radicales libres por DPPH

Los porcentajes de inhibición (%I) y la IC50 se evaluaron midiendo las absorbancias del minuto 0 al minuto 60 en ciclos de tres minutos, donde se determinó el punto de partida y equilibrio en el momento en que las absorbancias se hacen constantes en las muestras de estudio. En la tabla 7-10 se observa los promedios de las absorbancias del extracto y las cuatro fracciones evaluadas.

Tabla 7-10 Lectura del extracto y las fracciones, a los 60 min transcurridos.

Promedio de Absorbancias

Pozos 100 500 1000 3000 6000 9000 ppm ppm ppm ppm ppm Ppm

E. EtOH.Mc.PA 0.887 0.908 0.787 0.650 0.404 0.318 ± ± ± ± ± ± 0.02 0.05 0.01 0.04 0.01 0.10

Fx.Hept.Mc.PA 0.836 8.858 0.946 0.762 0.555 0.795 ± ± ± ± ± ± 0.001 0.06 0.1 0.07 0.03 0.2 Fx.DCM.Mc.PA 0.831 0.858 0.971 0.845 0.808 0.735 ± ± ± ± ± ± 0.06 0.10 0.03 0.10 0.05 0.04 Fx.AcOEt.Mc.PA 0.813 0.792 0.948 0.638 0.446 0.380 ± ± ± ± ± ± 0.01 0.04 0.1 0.04 0.05 0.07 Fx.Hidroalc.Mc.PA 0.832 0.962 0.944 0.778 0.624 0.402 ± ± ± ± ± ± 0.001 0.3 0.01 0.02 0.1 0.03

Estadística para el extracto, y las fracciones para determinar la capacidad antioxidante

La determinación de la capacidad antioxidante del extracto y las fracciones se consideró como activo y valido, aquellos que presentaron un porcentaje de inhibición en un rango del 40%-58%, valor utilizado como referencia de acuerdo al equivalente a la mitad de la actividad presentada por Trolox como patrón control, dichos porcentajes corresponden al IC50, que se calculó teniendo en cuenta los valores estadísticos de la pendiente, la intersección con el eje y el coeficiente R2 , estableciéndose una relación lineal positiva entre la inhibición al 50% y la concentración. De acuerdo a las 5 muestras analizadas por el método DPPH, solo el extracto etanolico y las fracciones de acetato de etilo e hidroalcohólica, inhiben mayor al 40% en concentraciones superiores a 1000ppm, en la Tabla 7-9 y la gráfica 7-2 se ilustran los resultados obtenidos para el método de DPPH.

Tabla 7-11 Porcentaje de inhibición, datos estadísticos para el extracto y las fracciones por el método de DPPH

*T %INHIBICION I DPPH Extracto/ Coef.R2 IC50 (ppm) CV E % Fracción M P 3000 6000 9000 O ppm ppm ppm

E. 12 30.7 55.9 70.5 0.976 5734.1 ± 82.7 1.4 EtOH.Mc. PA Fx. 30 33.8 56.1 60 0.934 6178 ± 759.8 12 AcOEt.Mc .PA Fx.Hidroa 57 26.4 35.5 67.1 0.908 7251.8±187.1 2.6 lc.Mc.PA

*Tiempo especificado en minutos; Coef.R2 (Coeficiente de relación); CV (Coeficiente de varianza)

Según los resultados en la Tabla 7-9 el porcentaje de inhibición al 50% para el extracto y las fracciones establece una relación de la capacidad antioxidante en concentraciones superiores a los 1000ppm ,por lo que transcurrido a los 12 minutos para extracto etanólico con un coeficiente de relación de 0.976 y un coeficiente de variación del 1.4% entre la media y la desviación estándar (5734.1 ± 82.7) , para la fracción de acetato de etilo fue transcurrido a los 30 minutos con un coeficiente de relación de 0,934 mostrando un coeficiente de variación del 12% entre la media y la desviación estándar (6178 ± 759.8) y para la fracción hidroalcohólica transcurrido 57 minutos con un coeficiente de relación 0.908 se muestra un coeficiente de variación del 2.6% entre la media y la desviación estándar (7251.8 ± 187.1), estableciendo así valores muy altos en comparación con el patrón trolox.

De acuerdo a los resultados en la Gráfica 7-2, el extracto (E. EtOH.Mc.PA) y las fracciones (Fx.AcOEt.Mc.PA; Fx.Hidroalc.Mc.PA) presentaron un % de inhibición superior al 40%. A medida que la concentración disminuye por cada ensayo el % de inhibición se comporta de la misma manera; las concentraciones que superaron el 40% de inhibición se encuentran en el rango de (6000 a 9000 ppm) por lo que comparado con el patrón Trolox y la especie vegetal Rosmarinus officinalis L. que según estudios (Mahmoud, Al-Shihry, & Son, 2005 y Wang et al.,2008) ha sido aceptada como una de las especies con mayor actividad

82 antioxidante presente en sus hojas , no se ajusta a una buena capacidad antioxidante ya que se busca a bajas concentraciones inhibir el radical, por lo tanto las partes aéreas de la especie vegetal Momordica charantia no presenta promisoria capacidad antioxidante tanto en el extracto como en todas las fracciones evaluadas por el método de DPPH.

100,0

90,0

80,0

70,0

60,0

50,0

40,0 % Inhibición %

30,0

20,0

10,0

0,0

Trolox 20 ppm 20 Trolox ppm 60 Trolox

Trolox 100ppm Trolox

Fx.Hept.Mc.PA 100ppm Fx.Hept.Mc.PA

E. EtOH.Mc.PA 100ppm EtOH.Mc.PA E. E. EtOH.Mc.PA 500ppm EtOH.Mc.PA E.

Fx.Hept.Mc.PA 500 ppm 500 Fx.Hept.Mc.PA

Fx.DCM.Mc.PA 100 ppm 100 Fx.DCM.Mc.PA Fx.DCM.Mc.PA 500 ppm 500 Fx.DCM.Mc.PA

E. EtOH.Mc.PA 1000ppm EtOH.Mc.PA E. 3000ppm EtOH.Mc.PA E. 9000ppm EtOH.Mc.PA E.

Fx.Hept.Mc.PA 1000 ppm 1000 Fx.Hept.Mc.PA ppm 3000 Fx.Hept.Mc.PA ppm 6000 Fx.Hept.Mc.PA ppm 9000 Fx.Hept.Mc.PA

Fx.DCM.Mc.PA 1000ppm Fx.DCM.Mc.PA ppm 3000 Fx.DCM.Mc.PA ppm 6000 Fx.DCM.Mc.PA ppm 9000 Fx.DCM.Mc.PA

E. EtOH.Mc.PA 6000 ppm 6000 EtOH.Mc.PA E.

Fx. AcOEt.Mc.PA 100ppm AcOEt.Mc.PA Fx. 500ppm AcOEt.Mc.PA Fx.

Fx.Hidroalc.Mc.PA 100ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA

Fx. AcOEt.Mc.PA 1000ppm AcOEt.Mc.PA Fx. 3000ppm AcOEt.Mc.PA Fx. 6000ppm AcOEt.Mc.PA Fx. 9000ppm AcOEt.Mc.PA Fx.

Fx.Hidroalc.Mc.PA 500 ppm 500 Fx.Hidroalc.Mc.PA

Fx.Hidroalc.Mc.PA 3000ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA 6000ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA 9000ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA Fx.Hidroalc.Mc.PA 1000 ppm 1000 Fx.Hidroalc.Mc.PA Gráfica 7-2 % de Inhibición para el control positivo, extracto y fracciones

Curva de calibración para el ensayo ABTS

A partir de un Stock de 200 ppm de Trolox al igual que en el ensayo de DPPH, se realizaron tres (3) diluciones a 60,75 y 125 ppm previamente seleccionadas en comparación de métodos espectrofotométricos y se midieron las absorbancias a 740 nm, los promedios de las absorbancias obtenidas se presentan en la Tabla 7-12, así como su % de inhibición calculado con la ecuación 2 y su IC50.

Tabla 7-12 Promedio de absorbancias (n=3), %inhibición, IC50 de trolox

Pozos Promedio de % Inhibición IC50 Absorbancias

60ppm 0.774 ± 0.0007 27.8

75ppm 0.635 ± 0.011 42.9 128.5

125ppm 0.307 ± 0.004 55.7

Los valores obtenidos en el ensayo de ABTS se interpretaron con valores estadísticos, correspondiente al control positivo en cada ensayo así mismo se determinó, el tiempo en que el patrón inhibió cerca del 50% del radical, que para Trolox fue a los 8 minutos con un coeficiente de correlación de 0,983496. Como se observa en la gráfica 7-3 la curva de calibración para Trolox, establecen que la función matemática entre las variables del porcentaje de inhibición y concentración (ppm) indica una buena relación lineal, en el grado de asociación entre las dos variables cuantitativas, generando una relación directamente proporcional. Los valores estadísticos se resumen en la tabla 7-13.

60,0

50,0 R² = 0,9977 40,0

30,0 %inhibición

20,0

10,0

0,0 0 2000 4000 6000 8000 10000 concentración(ppm)

Ecuación Lineal: Y = a + b*x % inhibición = (14,19) + (0,0047) *(concentración) Gráfica 7-3 Curva de calibración para Trolox

Tabla 7-13 Datos estadísticos para la sustancia patrón Trolox.

TROLOX en el método de ABTS Coeficiente de correlación Análisis de varianza

0.425 Pendiente Media 128.5

7.878 Intercepto DesvStd 4.94

0.998 Coef. R2 CV % 3.85

Coef.R2 (Coeficiente de relación); Desv Std (Desviación estándar); CV (Coeficiente de variación.

Los resultados expuestos en la tabla 7-12 sobre los datos estadísticos indican un coeficiente de varianza del 4.94% siendo homogéneo entre la desviación estándar 4.94 y la media del IC50, indicando una relación significativa entre cada una de las variables. Los valores estadísticos indican que el modelo es adecuado para la interpolación de los valores obtenidos para el extracto y las fracciones.

Cuantificación de la capacidad captadora de radicales libres ABTS

Para el método de ABTS los porcentajes de inhibición (%I) y el IC50 se evaluaron midiendo las absorbancias del minuto 0 al minuto 60 en ciclos de dos minutos, donde se determinó el punto de partida y equilibrio en el momento en que las absorbancias se hacen constantes en las muestras de estudio. En la tabla 7-14 se observa los promedios de las absorbancias del extracto y las cuatro fracciones evaluadas.

Tabla 7-14 Lectura del extracto y las fracciones, a los 60 min transcurridos.

Promedio de Absorbancias Pozos 100 500 1000 3000 6000 9000 ppm ppm ppm ppm Ppm Ppm E.EtOH.Mc .PA 0.801 0.911 0.869 0.544 0.536 0.459 ± ± ± ± ± ±

0.1 0.02 0.04 0.2 0.03 0.1 Fx.Hept.Mc.PA 0.836 0.969 0.946 0.757 0.65 0.518 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.004 0.05 0.02 0.04 0.07 Fx.DCM.Mc.PA 0.824 0.877 0.923 0.49 0.452 0.472 ± ± ± ± ± ± 0.03 0.2 0.1 0.03 0.4 0.02 Fx.AcOEt.Mc.PA 0.816 0.832 0.912 0.435 0.298 0.0949 ± ± ± ± ± ± 0.01 0.03 0.001 0.2 0.04 0.03 Fx.Hidroalc.Mc.PA 0.812 0.922 0.903 0.545 0.339 0.147 ± ± ± ± ± ± 0.05 0.1 0.07 0.1 0.03 0.2

Estadística para el extracto, y las fracciones

La determinación de la capacidad antioxidante del extracto y las fracciones se consideró como activo y valido, aquellos que presentaron un porcentaje de inhibición mayor al 40% valor utilizado como referencia de acuerdo al equivalente a la mitad de la actividad presentada por Trolox como patrón control, dichos porcentajes corresponden al IC50, estableciéndose una relación lineal positiva entre la inhibición al 50% y la concentración. De acuerdo a las 5 muestras analizadas por el método ABTS, presentaron inhibición mayor al 40% el extracto etanólico y las fracciones de Heptano, acetato de etilo e hidroalcohólica en concentraciones superiores a 1000 ppm . en la Tabla 7-15 y la gráfica 7-4 se ilustran los resultados obtenidos para el método de ABTS.

Tabla 7-15 % de inhibición por el método de ABTS para el extracto y las fracciones

*T %INHIBICION DPPH I E Extracto/ M Coef.R2 IC50 (ppm) CV% 3000 6000 9000 Fracción P ppm ppm ppm O

0.993 5513 ±287.96 5.2 E. 47.6 51.2 52.2 EtOH.Mc.PA 34

0.997 5578 ± 332.9 Fx. 45,08 50,44 57,02 6.0 Hept. Mc. PA 48

4282.9±266.7 Fx. 43,3 57,4 84,4 0.986 6.2 AcOEt.Mc.PA 12

Fx. Hidroalc.Mc. 10 46,1 56,7 84,01 0.955 4375.2±369.3 9.1 PA

*Tiempo especificado en minutos; Coef.R2 (Coeficiente de relación); CV (Coeficiente de varianza)

Según los resultados en la Tabla 7-15 el porcentaje de inhibición al 50% para el extracto y las fracciones es transcurrido a los 34 minutos para el extracto etanolico con un coeficiente de relación de 0.938 indicando una buena relación lineal entre las dos variables cuantitativas, además en los datos estadísticos se muestra un coeficiente de variación del 5.2% entre la media y la desviación estándar (5513 ± 287.96) , para la fracción de heptano fue transcurrido 48 minutos con un coeficiente de relación 0,997 mostrando un coeficiente de variación del 6% entre la media y la desviación estándar (5578± 332.9) para la fracción de acetato de etilo fue transcurrido a los 12 minutos con un coeficiente de relación de 0,986 mostrando un coeficiente de variación del 6.2% entre la media y la desviación estándar (4282.9± 266.07) y para la fracción hidroalcohólica transcurrido 10 minutos con un coeficiente de relación 0.955 se muestra un coeficiente de variación del 9.1% entre la media y la desviación estándar (4375.2 ± 369.3) siendo el de mayor dispersión en el coeficiente de variación , logrando resaltar la fracción de acetato de etilo con menor IC50, sin embargo las concentraciones son superiores a 1000ppm , al igual que por el método de DPPH.

De acuerdo a los resultados en la Gráfica 7-4, el extracto (E. EtOH.Mc.PA), y las fracciones (Fx.Hept.Mc.PA, Fx.AcOEt.Mc.PA, Fx.Hidroalc.Mc.PA). A medida que la concentración disminuía por cada ensayo el % de inhibición disminuía; las concentraciones que superaron el 40% de inhibición comparado con el patrón no presentan capacidad antioxidante promisoria ya que a concentraciones de 3000,6000 y 9000ppm la especie vegetal es diez veces mayor en concentración

87 que la muestra patrón por lo que se busca que a bajas concentraciones los antioxidantes inhiban el 50% del radical y como se mencionó anteriormente la especie Rosmarinus officinalis posee mayor capacidad antioxidante comparada entre otras especies, por lo que inhibe a una concentración de 110 μg / m (Mahmoud, Al-Shihry, & Son, 2005 y Wang et al.,2008).

100,0

90,0

80,0

70,0

60,0

50,0

40,0 _%_Inhibición 30,0

20,0

10,0

0,0

Trolox ppm60

Trolox ppm75

Trolox 125 ppm

Fx.Hept.Mc.PA100ppm

Fx.Hept.Mc.PA500ppm

E.EtOH.Mc.PA 100ppm

E.EtOH.Mc.PA 500ppm

Fx.DCM.Mc.PA 100 ppm

Fx.DCM.Mc.PA 500 ppm

Fx.Hept.Mc.PA1000ppm

E.EtOH.Mc.PA 1000ppm

E.EtOH.Mc.PA 3000ppm

E.EtOH.Mc.PA 9000ppm

Fx.Hept.Mc.PA 3000ppm

Fx.Hept.Mc.PA 9000ppm

Fx.DCM.Mc.PA1000ppm

Fx.DCM.Mc.PA 3000 ppm

Fx.DCM.Mc.PA 6000 ppm

Fx.DCM.Mc.PA 9000 ppm

E.EtOH.Mc.PA 6000 ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 100ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 500ppm

Fx.Hept.Mc.PA 6000ppm

Fx.Hidroalc.Mc.PA 100ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 1000ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 3000ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 6000ppm

Fx.AcOEt.Mc.PA 9000ppm

Fx.Hidroalc.Mc.PA 500 ppm

Fx.Hidroalc.Mc.PA 3000ppm

Fx.Hidroalc.Mc.PA 6000ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA 9000ppm Fx.Hidroalc.Mc.PA 1000ppm Gráfica 7-4 % de Inhibición para el control positivo, extracto y fracciones

Comparación entre el método de DPPH Y ABTS

En la tabla 7-16 se presenta el IC50 por el método de DPPH Y ABTS para el extracto y fracciones de la especie Momordica charantia.

Tabla 7-16 Comparación del método DPPH Y ABTS a partir del IC50 para el extracto y fracciones

Método DPPH Método ABTS

Extracto/Fracción IC50

(5734.1± 82.7) (5513 ± 287.96)

E. EtOH.Mc.PA Fx.Hept.Mc.PA >10000 (5578± 332.9)

Fx.DCM.Mc.PA >10000 >10000

Fx.AcOEt.Mc.PA (6178± 759.8) (4282.9± 266.07)

Fx.Hidroalc.Mc.PA (7251.8 ± 187.1) (4375.2 ± 369.3)

De acuerdo a los resultados sobre la capacidad antioxidante por el método DPPH Y ABTS para el extracto y las diferentes fracciones, de la especie vegetal Momordica charantia aunque se demostró inhibición mayor al 40% en el E. EtOH.Mc.PA, Fx.AcOEt.Mc.PA y Fx.Hidroalc.Mc.PA teniendo en cuenta que cada método tiene diferentes condiciones de reacción y solubilidad en ambos métodos fue a concentraciones superiores de 1000 ppm por lo tanto las partes aéreas de la especie vegetal no tienen un efecto de inhibición promisorio, por lo que se debe tener en cuenta ciertas condiciones en la especie vegetal como el tiempo de recolección , la temperatura, calidad del aire y el suelo para garantizar la germinación y desarrollo total de la planta (Carlos, 2014).

Es importante inferir que de acuerdo a los resultados arrojados en ambos métodos las diferencias se deben a varios factores, como la baja selectividad del ABTS•+, ya que reacciona con cualquier compuesto aromático hidroxilado, independientemente de su potencial antioxidante real (Roginsky & Lissi ,2005). Por el contrario, si la capacidad antioxidante de los extractos se debe a la presencia de ácidos fenólicos, flavonoides y otro tipo de polifenoles, como se reporta en la literatura (Ahn et al.,2007) se debe a que el DPPH es más selectivo que el ABTS•+ y, a diferencia de este último, no reacciona con los flavonoides carentes de grupos hidroxilo en el anillo B, ni con ácidos aromáticos que contengan un solo grupo hidroxilo (Roginsky & Lissi ,2005).

Según Chekroun et al., (2015) para la famila Cucurbitaceae se determino la capacidad antioxidante al extracto butanolico de raices en la especie Bryonia dioica mostrando una interesante actividad de eliminación de radicales libres con C50 = 2.25 μg / ml, al igual que el extracto butanólico (IC50 = 61 μg / m ) y acuoso ( C50 = 241,25 μg / m ) de os frutos en a especie Citrullus colocynthis. Los autores Sulaiman, y Ooi, (2013) demostraron la actividad antioxidante de diferentes especies como Luffa acutangula (28.04 ± 0.37 mg GAE / g de extracto), Benincasa hispida (IC50 = 0.44 ± 0.03 mg / ml) y Sechium edule demostró la mayor actividad de DPPH (951,73 ± 29,14 mM de extracto TE / g) Se descubrió que la isoquercetina era el principal contribuyente a las actividades de las diferentes especies vegetales.

Para el género Momordica la especie Momordica balsamina se determina en los resultados obtenidos un bajo índice de IC50 por lo que se utiliza con otros fines terapéuticos (Maulide,2012). En cuanto a la especie Momordica charantia los autores Sulaiman, y Ooi (2013) demostraron las mayores actividades reductoras y anti-α-glucosidasa mediante los extractos de metanol y acetato de etilo de Momordica charantia (692,56 ± 43,38 mM / g, 66,64 ± 2,94%, respectivamente). También autores como (Aljohi, Matou-Nasri & Ahmed, 2016) estudiaron las actividades antioxidantes usando 0-15mg/ml de los extractos de pulpa de Momordica charantia a un pH 7.4 e incubación a 37°C, para evaluar actividades de barrido de radicales hidroxilos, DPPH, actividad quelante de metales y potencia de reducción de los extractos. Se determinó los distintos extractos son capaces de prevenir la formación en acumulación de productos finales de glicación avanzada AGEs in vitro, por lo que no solo puede reducir la hiperglucemia sino también proteger contra la acumulación de AGEs tisulares y reducir el estrés oxidativo en pacientes con diabetes.

En la fracción de heptano no se encontró algún compuesto significativo comparable para la capacidad antioxidante por lo que coincide con los resultados en DPPH y ABTS , para la fracción de diclorometano al aislar el ácido cinámico y ácido benzoico se puede determinar que Momordica charantia contiene derivados de estos compuestos en baja proporción que a su vez pueden estar presentes en los extractos de acetato de etilo e hidroalcohólico debido a la mayor

90 polaridad que presentan de acuerdo a los hidroxilos sustituidos en estos compuestos, sin embargo los resultados obtenidos en cuanto a las concentraciones de estas fracciones son iguales que para los de menor polaridad que en este estudio es heptano.

8 CONCLUSIONES

Los resultados de la MFP de las partes aéreas de la especie vegetal Momordica charantia, a través de pruebas cualitativas indica que contiene diferentes metabolitos secundarios como: terpenos, taninos, glucósidos cardiotónicos, carotenoides y probablemente alcaloides debido a que solo tres pruebas dieron resultado positivo coincidiendo con especies del mismo género como Momordica balsamina y Momordica grosvenori.

El trabajo fitoquímico desarrollado para las partes aéreas de la especie vegetal Momordica charantia permitió el aislamiento e identificación de dos compuestos denominados kaguasaponina D y momordicina ll y cuatro mezclas la primera conformado por: un terpeno oxigenado Epoxylinalool, un norisoprenoides Dihidroactinidiolida, un ácido graso saturado y un triterpeno alifático (Ácido palmítico y Escualeno), en la segunda mezcla se encontró: un terpenoide biciclico (3-Hidroxi-5,6-epoxy-beta-ionona y un norisoprenoide 2-Ciclohexen-1- ona-4-hidroxi-3,5,6-trimetil-4-(3-oxo-1-butenil), en la tercer mezcla se encontró: un terpeno oxigenado Oxido de linalool, dos compuestos fenólicos Ácido cinámico y Ácido benzoico, un compuesto heterocíclico Indol y por ultimo para la cuarta mezcla se encontró un terpeno oxigenado Eucaliptol y un ácido esterificado (ácido propanoico, 2-metil-, 1-(1,1-dimetiletil)-2-metil-1,3- propanediol ester aislados por primera vez para la especie en nuestro país.

La evaluación de la capacidad antioxidante de las partes aéreas de la especie vegetal Momordica charantia mediante los métodos DPPH y ABTS permitió establecer el efecto inhibitorio al 50% en concentraciones superiores a 1000 ppm, obteniendo como resultado para el extracto total un IC50 de 5734.1ppm, para las fracciones de acetato de etilo un IC50 de 6178ppm y el residuo hidroalcohólico con IC50 de 7251.8 ppm por el método del radical DPPH. A diferencia del método por ABTS el extracto etanolico presento un IC50 de 5513 ppm, para las fracciones de heptano un IC50 de 5578ppm , la fracción de acetato de etilo un IC50 de 4282.9ppm y un residuo hidroalcohólico con un IC50 de 4375.2ppm, tomando como referencia la captación antioxidante de trolox como

92 radical libre para ambos métodos, permitiendo establecer así la baja capacidad antioxidante en las partes aéreas de Momordica charantia debido a las altas concentraciones en que inhibe el radical.

El presente trabajo de investigación realiza un aporte al conocimiento químico y biológico de la familia Cucurbitaceae en Colombia, por medio del estudio fitoquímico de sus metabolitos fijos y la determinación de la capacidad antioxidante de sus extractos y fracciones presentes en las partes aéreas de Momordica charantia.

9 RECOMENDACIONES

Respecto a los avances del estudio que se realizó y de acuerdo a los resultados obtenidos, para continuar con el estudio de la especie se recomienda:

Realizar el estudio de otras actividades biológicas en la especie, con el fin de contribuir al conocimiento biológico en nuestro país.

Obtener los perfiles cromatográficos de la fracción del residuo hidroalcohólico de las partes aéreas de Momordica charantia por HPLC acoplada a espectrometría de masas, debido a que esta fracción presenta el mayor porcentaje de rendimiento.

Continuar el estudio de la capacidad antioxidante con otros métodos como: Poder de reducción antioxidante del hierro (FRAP), N,N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) , Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CUPRAC) , Capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC) ,Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP) entre otros , además de realizarlo a partir de la recolección en otras partes de Colombia.

10 BIBLIOGRAFÍA

Abbas, M., Ali, A., Arshad, M., Atta, A., Mehmood, Z., Tahir, I. M., & Iqbal, M. (2018). Mutagenicity, cytotoxic and antioxidant activities of Ricinus communis different parts. Chemistry Central Journal, 12(1), 3.

Afifi, M. S., Ross, S. A., Elsohly, M. A., Naeem, Z. E., & & Halaweish, F. T. (1999). Cucurbitacins of Cucumis prophetarum and Cucumis prophetarum. Journal of chemical ecology, 25(4), 847-859.

Ahmad, N., Hassan, M. R., Halder, H., & Bennoor, K. S. (1999). Effect of Momordica charantia (Karolla) extracts on fasting and postprandial serum glucose levels in NIDDM patients. Bangladesh Medical Research Council Bulletin, 25(1), 11-13.

Ahmad, S., Ullah, F., Sadiq, A., Ayaz, M., Imran, M., Ali, I., & ... Shah, M. R. (2016). Chemical composition, antioxidant and anticholinesterase potentials of essential oil of Rumex hastatus D. Don collected from the North West of Pakistan. BMC complementary and alternative medicine, 16(1), 29.

Ahn, M. R., Kumazawa, S., Usui, Y., Nakamura, J., Matsuka, M., Zhu, F., & Nakayama, T. (2007). Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China. Food Chemistry, 101(4), 1383-1392.

Akihisa, T., Yasukawa, W., & Tokuda, H. (2003). Studies in Natural Products Chemistry.Bioactive Natural Products (Part J). Great Britain: Atta-ur- Rahman: 28th.

Aldana, J. (2010). Evaluación de la actividad antimicrobiana de fracciones y subfracciones obtenidas a partir de hojas de Elaeagia útiles sobre Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus acidophilus (Tesis de pregrado). Bogotá,Colombia: Pontificia unviersidad javeriana.

Ali, L., Khan, A. K., Mamun, M. I., Mosihuzzaman, M., Nahar, N., Nur-e-Alam, M., & Rokeya, B. (1993). Ali, L., Khan, A. K. A., Mamun, M. I. R.,

Mosihuzzaman, M., Nahar, N., Nur-e-Alam, M., & Rokeya, B. (1993). Studies on hypoglycemic effects of fruit pulp, seed, and whole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta medica, 59(05), 408-412.

Aljohi, A., Matou-Nasri, S., & Ahmed, N. (2016). Antiglycation and antioxidant properties of Momordica charantia. PloS one, 11(8), e0159985.

Andersen, J., & Metcalf, R. (1987). Factors influencing distribution of Diabrotica spp. in blossoms of cultivated Cucurbita spp. J. Chem. Ecol, 13:681-699.

Andrade, C. M. (2011). Estado del conocimiento de la biodiversidad en Colombia y sus amenazas. Consideraciones para fortalecer la interacción ambiente- política. Rev. Acad. Colomb. Cienc. , 35 (137): 491-507, ISNN 0370-3908.

Aprendeenlinea.udea.edu.co. (2008). Obtenido de Plantas medicinales.Banco de objetos de Aprendizaje y de información: http://aprendeenlinea.udea.edu.co/ova/?q=node/407&page=4 [Accessed 18 Mar. 2017].

Arango Mejía, M. (2006). Plantas medicinales. botánica de interés médico. 1st ed. Manizales: Universidad de Caldas. 1st ed. Manizales: Universidad de Caldas.pp 77-79.

Assubaie, N. F., & El-Garawany, M. M. (2004). Evaluation of some important chemical constituents of Momordica charantia cultivated in Hofuf, Saudi Arabia.Journal of Biological Sciences (Pakistan). Journal of Biological Sciences (Pakistan).

Attard, E., Brincat, M., & Cuschieri, A. (2005). Immunomodulatory activity of cucurbitacin E isolated from Ecballium elaterium. Institute of Agriculture, University of Malta, Malta.

Aubert, C., Ambid, C., Baumes, R., & Günata, Z. (2003). Investigation of bound aroma constituents of yellow-fleshed nectarines (Prunus persica L. Cv. Springbright). Changes in bound aroma profile during maturation. Journal of agricultural and food chemistry, 51(21), 6280-6286.

Avila, A., & Vásquez, A. (2011). Determinación del efecto vermífugo de semillas tratadas de Cucúrbita Aff. Maxima. (Tesis de pregrado), universidad de cuenca, cuenca, Ecuador.

Bailey, C. J., Turner, S. L., & Leatherdale, B. A. (1985). Cerasee, a traditional treatment for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice. Diabetes research (Edinburgh, Scotland), 2(2), 81-84.

Basch, E., Gabardi, S., & Ulbricht, C. (2003). Bitter melon (Momordica charantia): a review of efficacy and safety. American Journal of Health-System Pharmacy, 60(4), 356-359.

Battelli, M. G., Polito, L., Bolognesi, A., Lafleur, L., Fradet, Y., & Stirpe, F. (1996). Toxicity of ribosome-inactivating proteins-containing immunotoxins to a human bladder carcinoma cell line. International journal of cancer, 65(4), 485-490.

Begum, S., Ahmed, M., Siddiqui, B. S., Khan, A., Saify, Z. S., & Arif, M. (1997). Triterpenes, a sterol and a monocyclic alcohol from Momordica charantia. Phytochemistry, 44(7), 1313-1320.

Bellma Menéndez, A., Tillán Capó, J., Menéndez Castillo, R. A., López González, O., Carrillo Domínguez, C., & González Sanabria, M. L. (2006). Evaluación del extracto lipofílico de Cucurbita pepo L. sobre la hiperplasia prostática inducida por andrógenos. Revista cubana de plantas medicinales, 11(2),0- 0.

Beltrán Cifuentes, M. C., Peláez Gutiérrez, E. C., Estrada Álvarez, J. M., Escobar Ríos, J. A., Serna Ángel, L., & Ríos Morales, D. (2010). I study farmacognosico for the care of the health from essential oils obtained by distillation of steam dragging.

Beltrán Villanueva, C. E., Díaz Castillo, F., & Gómez Estrada, H. (2013). Tamizaje fitoquímico preliminar de especies de plantas promisorias de la costa atlántica colombiana. Cubana de Plantas Medicinales, 18(4), 619-631.

Bharathi, L., & John, K. (2013). Momordica genus in Asia—an overview. Springer, New Delhi, 147.

Bhattacharyya, J., Nishonov, A. A., Felix, L. P., Pires, M. F., & Majetich, G. M. (2006). Constituents of Encyclia longifolia Schltr.(Orchidaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, 16(1), 22-23.

Bolaños, A. (1998). Introducción a la Olericultura. 1 edición Editorial universidad estatal a distancia (EUNED), San josé costa rica.

Borran, M., Minaiyan, M., Zolfaghari, B., & Mahzouni, P. (2017). Protective effect of Tribulus terrestris fruit extract on cerulein-induced acute pancreatitis in mice. Avicenna journal of phytomedicine, 7(3), 250.

Bot, Y. S., Mgbojikwe, L. O., Nwosu, C., Abimiku, A., Dadik, J., & Damshak, D. (2007). Screening of the fruit pulp extract of Momordica balsamina for anti HIV property. African journal of Biotechnology, 6(1).

Cabi.org. (2016). Momordica charantia (bitter gourd). Obtenido de [image] Available at: http://www.cabi.org/isc/datasheet/34678 [Accessed 9 Mar. 2017].

Çakici, Í., Hurmoǧlu, C., Tunçtan, B., Abacioǧlu, N., Kanzik, Í., & & Sener, B. (1994). Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts in normoglycaemic or cyproheptadine-induced hyperglycaemic mice. Journal of Ethnopharmacology, 44(2), 117-121.

Carlos, L. (2014). Contribución al establecimiento de parámetros de calidad y rangos de variación para material vegetal de Momordica charantia L. provenientes de individuos silvestres y de cultivo (Tesis de Maestría). Universidad Nacional, Bogotá, Colombia.

Castroviejo, S., Aedo, C., Cirujano, S., LaÍnz, M., Montserrat, P., Morales, M., . . . Soriano, C. (2005). Castroviejo, S., Aedo, C., Cirujano, S., LaÍnFlora Ibérica Plantas vasculares de la Península Ibérica e Islas Baleares. 3rd ed.Madrid:Jardin botánico CSIC. Obtenido de 3rd ed. [ebook] Madrid: Real Jardin Botan.

Chae, S. C., Lee, J. H., & Park, S. U. (2014). Phenolic Compounds in Bitter Melons Collected from Different Regions of Korea. Asian Journal of Chemistry, 26(16), 5313.

Chekroun, E., Benariba, N., Adida, H., Bechiri, A., Azzi, R., & Djaziri, R. (2015). Antioxidant activity and phytochemical screening of two Cucurbitaceae: Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 5(8), 632-637.

Chen, J., & Meeuse, B. J. (1971). Production of free indole by some aroids. Acta botanica neerlandica, 20(6), 627-635.

Chen, J., Liu, W., Lu, L., Qiu, M., Zheng, Y., Yang, L., . . . Li, Z. (2009). Kuguacins F–S, cucurbitane triterpenoids from Momordica charantia. Phytochemistry, 70(1), pp.133-140.

Chen, J., Tian, R., Qiu, M., Lu, L., Zheng, Y., & & Zhang, Z. (2008). Trinorcucurbitane and cucurbitane triterpenoids from the roots of Momordica charantia. Phytochemistry, 69(4), 1043-1048.

Chen, X., Zhang, Y., Zu, Y., Fu, Y., & Wang, W. (2011). Composition and biological activities of the essential oil from Schisandra chinensis obtained by solvent-free microwave extraction. LWT-Food Science and Technology, 44(10), 2047-2052.

Cuong, D. M., Kwon, S. J., Jeon, J., Park, Y. J., Park, J. S., & Park, S. U. (2018). Identification and Characterization of Phenylpropanoid Biosynthetic Genes and Their Accumulation in Bitter Melon (Momordica charantia). Molecules. 23(2), 469.

Darweesh, K. F., & Ahmed, K. M. (2016). Anatomical and Phytochemical Study of Glossostemon bruguieri (Desf.) Sterculiaceae in Kurdistan Region of Iraq. Diyala journal for pure sciences, p.p 30-33.

Dastagir, G., Hussain, F., & Rehman, I. U. (2014). Essential oil composition of some plants of family Zygophyllaceae and Euphorbiaceae. Pak. J. Bot, 46(6), 2043-2049.

Day, C., Cartwright, T., Provost, J., & Bailey, C. J. (1990). Hypoglycaemic effect of Momordica charantia extracts. Planta Medica, 56(05), 426-429.

Del Rio, J. T. ( 2013). Determinación de la actividad antioxidante por DPPH y ABTS de 30 plantas recolectadas en la ecoregión cafetera (Doctoral dissertation, Universidad Tecnológica de Pereira. Facultad de Tecnologías. Química Industrial).

Delascio-Chitty, F., & López, R. (2007). las cucurbitáceas del estado cojedes, venezuela/Cucurbits of Cojedes State, Venezuela. Acta Botanica Venezuelica, 19-41.

Deyo, A., & Malley, B. (2008). In College Seminar 235 Food for Thought: The Science, Culture, & Politics of Food. In spring 2008.

Di, R., Huang, M. T., & Ho, C. T. (2001). Anti-inflammatory activities of mogrosides from Momordica grosvenori in murine macrophages and a murine ear edema model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(13), 7474-7481.

Facena, u. (n.d). EUDICOTILEDONEAS ESENCIALES-Clado Rosides- Eurosides I-Cucurbitales: Cucurbitaceae. Obtenido de [online] Diversidad Vegetal Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura (UNNE): http://exa.unne.edu.ar/biologia/diversidadv/documentos/ANGIOSPERMA S/Rosideas/Eurosides%20I/3Clado%20de%20los%20fijadores%20de%2 0Nitr%F3geno/1-Cucurbitales/2-Cucurbitaceae.pdf [Accessed 6 Feb. 2017].

Faldt, J. (2000). Volatile constituents in conifers and conifer-related wood- decaying fungi. PhD dissertation, Royal Institute of Technology,Stockholm, Sweden.

Farag, M., Gamal, A., Kalil, A., Al-Rehaily, A., El Mirghany, O., & El Tahir, K. (2013). Evaluation of some biological activities of Albizia lebbeck flowers. Pharmacology & Pharmacy, 4(06), 473.

Fernando, L. N., & Grün, I. U. (2001). Headspace–SPME analysis of volatiles of the ridge gourd (Luffa acutangula) and bitter gourd (Momordica charantia) flowers. Flavour and fragrance journal, 16(4), 289-293.

100

Fokou, E., Achu, M. B., Kansci, G., Ponka, R., Fotso, M., Tchiegang, C., & Tchouanguep, F. M. (2009). Chemical properties of some Cucurbitaceae oils from Cameroon.

Fonnegra Gómez, R., & Jiménez Ramírez, S. (2007). Plantas medicinales aprobadas en Colombia. 1st ed. Medellín, Colombia: Editorial Universidad de Antioquia.

Galen, P., & Feiters, M. C. (2016). Mass Spectrometry. En Instrumental Analysis in (Bio)Molecular Chemistry (págs. 8-9). Radboud University, Nijmegen: Institute for Molecules and Materials.

Ganguly, C., De, S., & Das, S. (2000). Prevention of carcinogen-induced mouse skin papilloma by whole fruit aqueous extract of Momordica charantia. European journal of cancer prevention, 9(4), 283-288.

Gershenzon, J., & Croteau, R. (1991). Terpenoids, in Herbivores, Their Interactions with Secondary Plant Metabolites. 2nd edn., v 1,,(eds. G. A. Rosenthal and M. R. Berenbaum), Acad, Press, San Diego, CA, 165-219.

Gifex. (n.d). Obtenido de [image] Availableat:http://www.mapa- colombia.com/#country [Accessed 9 Mar.2017]

Grubben, G., & Denton, O. (2004). Plant resources of tropical africa 2 vegetables. 2nd ed. [ebook] wageningen,netherlads: Prota foundation.

Gutiérrez Zavala, Á., Ledesma Rivero, L., García García, I., & Grajales Castillejos, O. (2007). Capacidad antioxidante total en alimentos convencionales y regionales de Chiapas, México. Revista Cubana de Salud Pública, 33(1), pp.0-0.

Gutierrez-Ravelo, A., & Estévez-Braun, A. (2009). Relevancia de los productos naturales en el descubrimiento de nuevos fármacos en el S. XXI. Revista de la Real Academia de Ciencias Exactas, Fisicas y Naturales, 103 (2): 409-19.

Halaweish, F. T., Tallamy, D. W., & Santana, E. (1999). Cucurbitacins: A role in cucumber beetle sterol nutrition? J. Chem. Ecol., 25:2373-2383.

101

Hanuš, L. O., Dembitsky, V. M., & Moussaieff, A. (2006). Comparative study of volatile compounds in the fresh fruits of Mandragora autumnalis. Acta Chromatographica, 17, 151-160.

Hossain, M. M., Jahangir, R., Hasan, S. R., Akter, R., Ahmed, T., Islam, M. I., & Faruque, A. (2009). Antioxidant, analgesic and cytotoxic activity of Michelia champaca Linn. Leaf. . Stamford Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(2), 1-7.

Hostettmann, K., Gupta, M., & Mutis de Serna, O. (2008). Manual de estrategias para el aislamiento de productos naturales bioactivos. 1st ed. Bogotá: Programa Iberoamericano de Ciencias y Tecnología.

Ishida, B. K., Turner, C., Chapman, M. H., & McKeon, T. A. (2004). Fatty acid and carotenoid composition of gac (Momordica cochinchinensis Spreng) fruit. Journal of agricultural and food chemistry, 52(2), 274-279.

Jara Beltrán, Á. I. (2013). Ánalisis fitoquímico y determinación de la actividad antioxidante del extracto etanólico de las hojas de la especie Piper imperiale (Piperaceae) (Tesis de Pregrado). Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.

Jayasooriya, A. P., Sakono, M., Yukizaki, C., Kawano, M., Yamamoto, K., & Fukuda, N. (2000). Effects of Momordica charantia powder on serum glucose levels and various lipid parameters in rats fed with cholesterol- free and cholesterol-enriched diets. journal of ethnopharmacology, 72(1),331-336.

Jodallah, N. B. (2013). Antioxidant and antimicrobial activity of Mandragora autumnalis Bertol extracts. Doctoral dissertation, p.p 22-34.

Jung, K., Chin, Y. W., Yoon, K. D., Chae, H. S., Kim, C. Y., Yoo, H., & Kim, J. (2013). Anti-inflammatory properties of a triterpenoidal glycoside from Momordica cochinchinensis in LPS-stimulated macrophages. Immunopharmacology and immunotoxicology, 35(1).

102

Kaiser, R. (1991). New volatile constituents of the flower concrete of Michelia champaca L. Journal of Essential Oil Research, 3(3), 129-146.

Kang, G. H., Chang, E. J., & Park, S. W. (1999). Antioxidative activity of phenolic compounds in roasted safflower (Carthamus tinctorius L.) seeds. Preventive Nutrition and Food Science, 4(4), 221-225.

Keller, A. C., Ma, J., Kavalier, A., He, K., Brillantes, A. M., & Kennelly, E. J. (2011). Saponins from the traditional medicinal plant Momordica charantia stimulate insulin secretion in vitro. Phytomedicine, 19(1), 32-37.

Khan, M. R., & Omoloso, A. D. (1998). Momordica charantia and Allium sativum; Broad Spectrum Antibacterial Activity. Diario de las plantas medicinales. Diario de las plantas medicinales, .29(3), 155-158.

Khan, T., Ahmad, M., Khan, R., Khan, H., & Choudhary, M. I. (2007). Phytotoxic and insecticidal activities of medicinal plants of Pakistan: Studies on Trichodesma indicum, Aconitum laeve and Sauromatum guitatum. Journal of the Chemical Society of Pakistan, 29(3), 260-264.

Kubola, J., & Siriamornpun, S. (2011). Phytochemicals and antioxidant activity of different fruit fractions (peel, pulp, aril and seed) of Thai gac (Momordica cochinchinensis Spreng) . Food chemistry, 127(3), 1138-1145.

Kumar, S., & kamaraj, M. (2011). Antimicrobial activity of Cucumis anguria L. By agar well diffusion method ,Tamil,nail, india, Botany research international. jamal Mohamed college, department of research botany, 4(2), PP.41-42.

Kweifio-Okai, G., De Munk, F., Macrides, T. A., Smith, P., & Rumble, B. A. (1995). Antiarthritic mechanisms of lupeol triterpenes. Drug Dev. Res, 36: 20–24. doi:10.1002/ddr.430360104

Li, Q. Y., Liang, H., Chen, H. B., Wang, B., & Zhao, Y. Y. (2007). A new cucurbitane triterpenoid from Momordica charantia. Chinese Chemical Letters, 18(7), 843-845.

Licastro, F., Franceschi, C., Barbieri, L., & Stirpe, F. (1980). Toxicity of Momordica charantia lectin and inhibitor for human normal and leukaemic

103

lymphocytes. Virchows Archiv B Cell Pathology Zell-pathologie, 33(1), 257-265.

Lim, T. (2015). Edible Medicinal and Non-Medicinal plants .Modified stems,roots,bulbs (Vol. 9). New York, NY, USA: Springer.pp 433-435.

Lima, P. (2008). Avaliação da atividade de extratos de folhas de Momordica charantia, Auxemma oncocalyx e Ziziphus joazeiro sobre bactérias e larvas de Culex quinquefasciatus. Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal Rural do Sem.

Lin, K. W., Yang, S. C., & Lin, C. N. (2011). Antioxidant constituents from the stems and fruits of Momordica charantia. Food chemistry, 127(2), 609- 614.

Liu, C. H., Yen, M. H., Tsang, S. F., Gan, K. H., Hsu, H. Y., & Lin, C. N. (2010). Antioxidant triterpenoids from the stems of Momordica charantia. Food chemistry, 118(3), 751-756.

Lock de Ugaz, O. (1994). Investigación fitoquímica, Métodos en el estudio de productos naturales. (segunda ed.). Editorial de la Pontificia Universidad Católica del Perú.

Londoño, J. (2012). Antioxidantes: importancia biológica y métodos para medir su actividad. In Desarrollo y Transversalidad serie Lasallista Investigación y Ciencia.Corporación Universitaria Lasallista.

López., J. (2016). Herbolaria apuntes. Unidad de aprendizaje. Universidad Autónoma del Estado de México, pp 218-309.

Loughrin, J. H., Manukian, A. R., Heath, R. R., Turlings, T. C., & Tumlinson, J. H. (1994). Diurnal cycle of emission of induced volatile terpenoids by herbivore-injured cotton plant. Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(25), 11836-11840.

Mahmoud, A. A., Al-Shihry, S. S., & Son, B. W. (2005). Diterpenoid quinones from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.). Phytochemistry, 66(14), 1685- 1690.

104

Maldonado Rodríguez, M. E. (2006). Estudio químico y evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Myrcianthes rophaloides Mc Vaugh. (Master's thesis).

Martínez Aguilar, Y. M., Valdivié Navarro, M., & Estarrón Espinosa, M. (2011). Fitoesteroles y escualeno como hipocolesterolémicos en cinco variedades de semillas de Cucurbita maxima y Cucurbita moschata (calabaza). Revista Cubana de Plantas Medicinales, 16(1), 72-81.

Maulide Cane, R. (2012). Obtención y caracterización de extractos de Momordica balsamina L. Tesis de Maestría, Universidad Autónoma de Madrid. Departamento de Química Física Aplicada.

Mekuria, D. B., Kashiwagi, T., Tebayashi, S. I., & Kim, C. S. (2006). Cucurbitane glucosides from Momordica charantia leaves as oviposition deterrents to the leafminer, Liriomyza trifolii. Zeitschrift für Naturforschung C, 61(1-2), 81-86.

Minh, T. N., Khang, D. T., Tuyen, P. T., Anh, L. H., Quan, N. V., Ha, P. T., & ... Xuan, T. D. (2016). Phenolic compounds and antioxidant activity of Phalaenopsis orchid hybrids. Antioxidants. 5(3), 31.

Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, P. d. (2014). Quinto informe nacional de biodiversidad de colombia.Ante el convenio de diversidad biólogica. Bogotá, D.C, Colombia p.101.

Miró, M. (1995). Cucurbitacins and their pharmacological effects. Phytother. Res., 9: 159–168. doi:10.1002/ptr.2650090302

Mohamed, A., Polo, E. M., & Martinez, A. (s.f). Análisis fitoquímico preliminar y determinación de la actividad antiinflamatoria de Melothria guadalu. (Tesis de pregrado), Universidad Nacional, Bogotá,Colombia.

Muñoz Juárez, M. A., & Gutiérrez, D. M. (2009). Determinación de actividad antioxidante de diversas partes del árbol Nicotiana glauca. . Facultad Química, Universidad Autónoma de Queretaro.

105

Mussa, E. (2006). Composição química de extractos da Momordica balsamina cultivada em Moçambique. (Tesis de Maestría), Universidad de Aveiro,Aveiro,Portugal.

Neuza., j. (2011). Actividad antioxidante y perfil de ácidos grasos de las semillas de jabuticaba (Myrciaria cauliflora Berg) . Acta Biológica Colombiana, 16(2), 75-82.

Ng, T. B., Liu, W. K., Sze, S. F., & Yeung, H. W. (1994). Action of α-momorcharin, a ribosome inactivating protein, on cultured tumor cell lines. General Pharmacology: The Vascular System,, 25(1), 75-77.

Novotný, L., Vachalkova, A., & Biggs, D. (2011). Ursolic acid: an anti-tumorigenic and chemopreventive activity. Minireview. Neoplasma, 48(4), 241-246.

Ogata, F., Miyata, T., Fujii, N., Yoshida, N., Noda, K., Makisumi, S., & Ito, A. (1991). Purification and amino acid sequence of a bitter gourd inhibitor against an acidic amino acid-specific endopeptidase of Streptomyces griseus. Journal of Biological Chemistry, 266(25), 16715-16721.

Oliveira, S. D., Souza, G. A., Eckert, C. R., Silva, T. A., Sobral, E. S., Fávero, O. A., & ... Baader, W. J. (2014). Evaluation of antiradical assays used in determining the antioxidant capacity of pure compounds and plant extracts. Química Nova. 37(3), 497-503.

Omoregbe, R. E., Ikuebe, O. M., & Ihimire, I. G. (1996). Antimicrobial activity of some medicinal plants extracts on Escherichia coli, Salmonella paratyphi and Shigella dysenteriae. African journal of medicine and medical sciences, 25(4), 373-375.

Ordoñez, A., Gomez, J., & Vattuone, M. (2006). Antioxidant activities of Sechium edule (Jacq.). Swartz extracts. Food Chemistry, 97(3), pp.452-458.

Orjuela Rodriguez, A. A. (2015). Determinación de actividad antioxidante de extractos y fracciones de hojas de Chromolaena perglabra (BL Robinson) RM King y H. Robinson . (Tesis de Pregrado), Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A.

106

Osuna, L., Tapia, M., & Aguilar, A. (2005). Plantas medicinales de la medicina tradicional mexicana para tratar afecciones gastrointestinales.Estudio etnobotánico, fitoquímico y farmacológico. España: Publicacions i Edicions de la universidad de barcelona.pp 50-51.

Patiño, V. (2002). Historia y dispersión de los frutales nativos del neotrópico. Obtenido de 1st ed. [ebook] Cali: CIAT, pp.143-147.: https://books.google.com.co/books?isbn=9586940373 [Accessed 4 Mar. 2017].

Powers, J. C. (1968). Mass spectrometry of simple indoles. The Journal of Organic Chemistry, 33(5), 2044-2050.

Pozner, R. (2010). Flora del Valle de Lerma. 1st ed. Salta: Herbario MCNS, Fac. de Ciencias Naturales, Univ. Nacional de Salta.

Rajasekaran, M., Archana, R., & Raviprasadh, R. (2012). GC/MS analysis and identification of phytochemicals present in the leaves of Beloperone plumbaginifolia (Jacq.) . Nees. Int J Bioeng Sci Technol, 3, 134-138.

Rajasree, R. S., Sibi, P. I., Francis, F., & William, H. (2016). Phytochemicals of Cucurbitaceae family. A review. IJPPR, 8, 113-123.

Raman, A., & Lau, C. (1996). Anti-diabetic properties and phytochemistry of Momordica charantia L.(Cucurbitaceae). Phytomedicine, 2(4), 349-362.

Rao, B. K., Kesavulu, M. M., & Apparao, C. (2001). Antihyperglycemic activity of Momordica cymbalaria in alloxan diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, 78(1), 67-71.

Rao, M. R., & Vijaya Lakshmi, N. (2018). Preliminary phytochemical and GC MS analysis of different extracts of Sphaeranthus indicus leaves. Indo American J of Pharmaceutical Sciences, 5(3), 1511-1520.

Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine;. 26: 1231–1237.

107

Rodríguez Becerra, M. (Noviembre de 2003). Los múltiples servicios de los bosques y el desarrollo sostenible en Colombia. Conferencia Internacional de Bosques, ACAD Conf. Bosques y Servicios llevada a cabo en Santa Marta, Colombia.

Roginsky, V., & Lissi, E. (2005). Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food. Food Chemistry, 92 (2): 235-254.

Roux, M. L., Cronje, J. C., Burger, B. V., & Joubert, E. (2012). Characterization of volatiles and aroma-active compounds in honeybush (Cyclopia subternata) by GC-MS and GC-O analysis. Journal of agricultural and food chemistry, 60(10), 2657-2664.

Sanabria Galindo, A. (1983). Análisis fitoquímico preliminar: Metodología y su aplicación en la evaluación de 40 plantas de la familia Compositae.

Sarkar, N., & Barik, A. (2015). Free fatty acids from Momordica charantia L. flower surface waxes influencing attraction of Epilachna dodecastigma (Wied.)(Coleoptera: Coccinellidae). International journal of pest management, 61(1), 47-53.

Sarkar, S., Pranava, M., & Marita, A. R. (1996). Demonstration of the hypoglycemic action of Momordica charantia in a validated animal model of diabetes. Pharmacological Research, 33(1), 1-4.

Sartori, Â. L., Lewis, G. P., de Freitas Mansano, V., & Azevedo Tozzi, A. M. (2015). A revision of the genus Myroxylon (Leguminosae: Papilionoideae). . 70(4), 48.

Sha, Y. F., Huang, T. M., Shen, S., & Duan, G. L. (2004). Determination of volatile compounds in Magnolia bark by microwave-assisted extraction coupled to headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical sciences, 20(5), 857-859.

Shibib, B. A., Khan, L. A., & Rahman, R. (1993). Hypoglycaemic activity of Coccinia indica and Momordica charantia in diabetic rats:. depression of the hepatic gluconeogenic enzymes glucose-6-phosphatase and fructose-

108

1,6-bisphosphatase and elevation of both liver and red-cell shunt enzyme glucose-6-phospahate deshydrogenase, págs. 292(1),267-270.

Shutterstock.com. (n.d). Momordica Charantia Imágenes sin cargo, y vectores en stock | Shutterstock. Obtenido de https://www.shutterstock.com/es/search/momordica+charantia [Accessed 9 Mar 2017].

Sladkovský, R., Solich, P., & Opletal, L. (2001). Simultaneous determination of quercetin, kaempferol and (E)-cinnamic acid in vegetative organs of Schisandra chinensis Baill. by HPLC. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 24(5-6), 1049-1054.

Stashenko, E. E., Martínez, J. R., Patiño, J. G., & Reyes, J. A. (2007). Caracterización de los metabolitos secundarios de dos especies de ocimum (fam. labiatae), en función del método de extracción. Scientia et Technica, 1(33), 121-123.

Stevens, P. (2009). Angiosperm Phylogeny Website. Obtenido de Mobot.org: http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/ [Accessed 4 Feb. 2017].

Sulaiman, S. F., & Ooi, K. L. (2013). Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities of cucurbit fruit vegetables and identification of active and major constituents from phenolic-rich extracts of Lagenaria siceraria and Sechium edule. Journal of agricultural and food chemistry, 61(42), 10080- 10090.

Sun, Y., Huang, P. L., Li, J. J., Huang, Y. Q., Zhang, L., Huang, P. L., & & Lee- Huang, S. (2001). Anti-HIV agent MAP30 modulates the expression profile of viral and cellular genes for proliferation and apoptosis in AIDS-related lymphoma cells infected with Kaposi's sarcoma-associated virus. Biochemical and biophysical research communications, 287(4), 983-994.

Takabayashi, J., & Dicke, M. (1996). Plant-carnivore mutualism through herbivore-induced carnivore attractants. Trends Plant Sci , 1:109–113.

Takabayashi, J., Dicke, M., Takahashi, S., Posthumus, M., & Van Beek, T. (1994). Leaf age affects composition of herbivore-induced synomones and

109

attraction of predatory mites. Journal of Chemical Ecology, 20(2), pp.373- 386.

Takasaki, M., Konoshima, T., Murata, Y., Sugiura, M., Nishino, H., Tokuda, H., . . . Yamasaki, K. (2003). Anticarcinogenic activity of natural sweeteners, cucurbitane glycosides, from Momordica grosvenori. Kyoto Pharmaceutical University, Misasagi, Yamashina-ku, Kyoto, Japan.

Thakur, G. S., Bag, M., Sanodiya, B. S., Bhadauriya, P., Debnath, M., Prasad, G. B., & Bisen, P. S. (2009). Momordica balsamina: a medicinal and neutraceutical plant for health care management. Current pharmaceutical biotechnology, 10(7), 667-682.

Trease, G., & Evans, W. (2002). Pharmacognosy. 15th ed. London: Baillière Tindall.

Tropicos.org, s. (s.f.). www.tropicos.org. Obtenido de Recuperado el 08 de febrero de 2017: http://tropicos.org/Name/42000146?tab=maps.

Tsoi, A. Y., NG, T. B., & Fong, W. P. (2006). Immunomodulatory activity of a chymotrypsin inhibitor from Momordica cochinchinensis seeds. Journal of Peptide Science , 12(9), 605-611.

Ucihonda.com. (s.f). Obtenido de www.ucihonda.com: http://ucihonda.com.co/index.php?page=./HTML/mapatolima&tituloenc= Departamento%20del%20Tolima[Accessed el 15 de mar de 2017]

Vademecum. (2008). Vademecum Colombiano de Plantas Medicinales. Obtenido de 1st ed. [ebook] Ministerio de la Protección Social.: https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/1/Vademecum%20Colombiano%2 0de%20Plantas%2Medicinales.PDF [Accessed 9 Feb. 2017].

Villareal, E. C., Lagunes, L. D., López, P. A., García, E., Palma, D. J., Ortiz, C. F., & Oranday, M. A. (2015). Evaluación etnofarmacológica de plantas con propiedades hipoglucémicas usadas en la medicina tradicional del sureste de México. Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 14(2).

110

Waako, P. J., Gumede, B., Smith, P., & Folb, P. I. (2005). The in vitro and in vivo antimalarial activity of Cardiospermum halicacabum L. and Momordica foetida Schumch. Et Thonn. Journal of Ethnopharmacology, 99(1), 137- 143.

Walker, W. (2017). Lipidhome.co.uk. Obtenido de Mass Spectrometry of free (unesterified) fatty acids and their trimethylsilyl (TMS) esters: http://www.lipidhome.co.uk/ms/others/ffa-tms/index.htm

Wang, W., Wu, N., Zu, Y. G., & Fu, Y. J. (2008). Antioxidative activity of Rosmarinus officinalis L. essential oil compared to its main components. Food chemistry, 108(3), 1019-1022.

Warleta, F., Ruiz-Mora, J., Segura, M. C., Serrano, M. J., & Gaforio, J. J. (2007). El Escualeno, componente minoritario del aceite de oliva, y su relación con el cáncer. In I Congreso de la Cultura del Olivo. Instituto de Estudios Giennenses, pp. 765-782.

Winterhalter, P., Katzenberger, D., & Schreier, P. (1986). 6, 7-Epoxy-linalool and related oxygenated terpenoids from Carica papaya fruit. Phytochemistry. 25(6), 1347-1350.

Wootton-Beard, P., & Moran A, R. L. (2011). Stability of the total antioxidant capacity and total polyphenol content of 23 commercially available vegetable juices before and after in vitro digestion measured by FRAP, DPPH, ABTS and Folin- Ciocalteu methods. Food Res Int, 44: 217-224.

Xian, Q., Chen, H., Liu, H., Zou, H., & Yin, D. (2006). Isolation and Identification of Antialgal Compounds from the Leaves of Vallisneria spiralis L. by Activity-Guided Fractionation . Environmental Science and Pollution Research, 13(4), 233-237.

Yadav, M., Lavania, A., Tomar, R., Prasad, G. B., Jain, S., & Yadav, H. (2010). Complementary and comparative study on hypoglycemic and antihyperglycemic activity of various extracts of Eugenia jambolana seed, Momordica charantia fruits, Gymnema sylvestre and Trigonella foenum

111

graecum seeds in rats. Applied biochemistry and biotechnology, 160(8),2388-2400.

Yang, Z. B., Mao, H. L., Kang, W. Y., Zou, H. T., Sun, C. B., & Guo, Z. Y. (2010). Rapid Determination of Volatile Compounds in Gymnotheca involucrata Pei. by MAE–HS-SPME Followed by GC–MS. Journal of the American Oil Chemists' Society, 87(7), 737-745.

Ye, S. F., Yu, J. Q., Peng, Y. H., Zheng, J. H., & & Zou, L. Y. (2004). Incidence of Fusarium wilt in Cucumis sativus L. is promoted by cinnamic acid, an autotoxin in root exudates. Plant and Soil. 263(1), 143-150.

Yeşilada, E., Gürbüz, I., & Shibata, H. (1999). Screening of Turkish anti- ulcerogenic folk remedies for anti-Helicobacter pylori activity. Journal of Ethnopharmacology, 66(3), 289-293.

Yetisir, H., Sakar, M., & Serçe, S. (2008). Collection and morphological characterization of Lagenaria siceraria germplasm from the Mediterranean region of Turkey, Genetic Resources and Crop Evolution. 1257-1266.

Youngson, R. (2005). Antioxidantes y radicales libres. 1st ed. Madrid: Editorial EDAF.

Yuan, X., Gu, X., & Tang, J. (2008). Purification and characterisation of a hypoglycemic from Momordica charantia L. . Var abbreviata ser.food.chemistry, 111(2), 415-420.

Zapata Bustos, R. (2009). Mecanismos Moleculares del efecto hipoglucemiante de plantas usadas tradicionalmente como antidiabéticos.

Zhang, H., & Setzer, W. N. (2013). The floral essential oil composition of Albizia julibrissin growing in Northern Alabama. American Journal of Essential Oils and Natural Products, 1(2), 41-42.

Zhang, L. J., Liaw, C. C., Hsiao, P. C., Huang, H. C., Lin, M. J., Lin, Z. H., ... & Kuo, Y. H. (2014). Cucurbitane-type glycosides from the fruits of Momordica charantia and their hypoglycaemic and cytotoxic activities. Journal of Functional Foods, 6, 564-574.

112

113