UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
JÉSSICA PEREIRA JORDÃO
OCORRÊNCIA E ECOLOGIA QUÍMICA DE Montella sp. (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) EM Vanilla planifolia NO SUL DA BAHIA, BRASIL
ILHÉUS - BAHIA 2020
JÉSSICA PEREIRA JORDÃO
OCORRÊNCIA E ECOLOGIA QUÍMICA DE Montella sp. (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) EM Vanilla planifolia NO SUL DA BAHIA, BRASIL
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal. Linha de pesquisa: Proteção de plantas Orientador: Carla Fernanda Fávaro
ILHÉUS - BAHIA 2020
J82 Jordão, Jéssica Pereira. Ocorrência e ecologia química de Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae) em Vanilla planifolia no Sul da Bahia, Brasil / Jéssica Pereira Jordão. – Ilhéus, BA: UESC, 2020. 75 f. : il.
Orientadora: Carla Fernanda Fávaro. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal. Inclui referências.
1. Pragas – Controle biológico. 2. Feromonas. 3. Baunilha. 4. Bicudo-da-baunilha – Controle. 5. Vanilla planifolia. I. Título.
CDD 632.96
JÉSSICA PEREIRA JORDÃO
OCORRÊNCIA E ECOLOGIA QUÍMICA DE Montella sp. (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) EM Vanilla planifolia NO SUL DA BAHIA, BRASIL
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal.
Ilhéus, 20 de fevereiro de 2020.
______Carla Fernanda Fávaro UESC/DCAA (Orientadora)
______Rosane Rodrigues Pereira UFSB
______Eraldo Rodrigues Lima UFV
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, à Deus pela dádiva da vida e por me abençoar grandiosamente a cada dia. Aos meus pais Sebastião Jordão (in memorian) e Marileide Jordão, por acreditarem e apoiarem com muito amor e dedicação minhas escolhas, meu futuro e minha educação. Ao meu irmão Diego Jordão, minha cunhada Eduarda Jordão e minha avó Daia Pereira por todo amor e apoio. Ao curso de Pós-Graduação em Produção Vegetal da Universidade Estadual de Santa Cruz e à Capes, pela oportunidade de realização desta pesquisa, bem como o curso. À minha orientadora, Profа. Drа. Carla Fávaro pela orientação, amizade e apoio, contribuindo para o meu crescimento profissional e pessoal. Ao coordenador da Pós-Graduação em Produção Vegetal (UESC), Prof. Dr. Rafael Marani e ao Prof. Dr. Eduardo Gross pelo apoio e amizade prestados nos momentos em que mais precisei. Aos professores que avaliaram este trabalho, Prof. Dr. Eraldo Rodrigues de Lima (UFV) e a Profа. Drа. Rosane Rodrigues (UFSB). Aos cooperados do Instituto Cabruca do Sul da Bahia, pelos esforços e conhecimentos transmitidos em campo para a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Paulo Zarbin pela disponibilidade do Laboratório de Semioquímicos na Universidade Federal do Paraná, contribuindo para a realização de parte deste trabalho. Aos meus colegas de mestrado, pela convivência, apoio e carinho, em especial Thaiana Oliveira pela amizade que levarei para a vida toda. Aos colegas e amigos do Laboratório de Controle Biológico e Semioquímicos que me ajudaram nessa jornada, em especial à Palmira Neta, Leonardo Gonçalves, Danrley Santana, Ariane Morgana, Eliaber Barros e Danilo Batista. Aos meus amigos, em especial Djanira Lavrador, Laila Guerrieri, Maria Luiza Vaz, Palmira Neta, Flávia Levita, Juliana Coelho, Ismênia Moraes, Michelle Sena, Paulo Bruno, Murillo Hafner, Thiago Tomazelli, Lorena Bernardes, Ayalla Tomazelli, Sarah Macedo, Luan Gaudêncio, Leya Gomes e Victor Amorim, pela força, compreensão, carinho e incentivo em todos momentos da minha vida. À todos os meus familiares que sempre torceram pelo meu sucesso. E à todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO Os cultivos comerciais de Vanilla planifolia no sul da Bahia, Brasil são acometidos por ocorrências de injúrias causadas por besouros do gênero Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae). Este trabalho teve como objetivo relatar a primeira ocorrência do inseto como praga, descrever e caracterizar as injúrias causadas pelo inseto, analisar aspectos morfológicos e o comportamento de acasalamento, bem como identificar compostos químicos responsáveis pela comunicação da espécie. Registros fotográficos, avaliação, levantamento e contabilização de plantas foram realizadas em campo. Em estágio larval, Montella sp., constrói galerias que interrompem o fluxo de seiva. Já os adultos raspam e perfuram as pétalas das flores, reduzindo a produção de baunilha. O nível de dano econômico (NDE) foi 0,06 insetos/planta demonstrando que a tomada de decisão de controle da praga tem que ser logo após sua incidência. Observações em laboratório através de microscópio estereoscópico, em virtude das características externas, apontaram para formato arredondado no tergito e por diferenças abdominais com convexidade existente apenas em machos, sendo confirmada a diferenciação dos sexos na dissecação. Na avaliação do comportamento de acasalamento foi observada atividade sexual entre 07:00h e 10:00h da manhã. As etapas de acasalamento foram definidas por pré-cópula, com realização da corte, pela cópula por realização do ato sexual e pela pós- cópula por separação dos indivíduos. Os voláteis liberados por machos e fêmeas, coletados pela técnica de aeração e analisados por cromatografia gasosa, demonstraram que existem três compostos macho-específicos presentes nos extratos, identificados como: (E10,Z12)- hexadecadien-1-ol (A), acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila (B) e acetato de (E10,E12)- hexadecadienila (C). Compostos químicos com características estruturais semelhantes são normalmente identificados para Lepidoptera, mas este é o primeiro relato em Coleoptera. Já a extração dos compostos cuticulares revelou três compostos fêmea-específicos e a identificação das estruturas químicas destes está em andamento. Os bioensaios com os componentes sintéticos do feromônio apresentaram atratividade acima de 70% para ambos sexos ao acetato majoritário (B), comprovando o feromônio de agregação da espécie. O composto minoritário (A) foi atrativo apenas para fêmeas, podendo ser considerado um componente sexual. As respostas olfativas ao composto minoritário (C) não apresentaram atratividade para ambos sexos. Os resultados obtidos nesta pesquisa corroboram para elaboração de táticas de controle eficientes e sustentáveis para o inseto-praga Montella sp. na cultura da baunilha.
Palavras-chave: Controle de pragas, Feromônios, Baunilha.
ABSTRACT Commercial crops of Vanilla planifolia in southern Bahia, Brazil are affected by injuries caused by beetles of the genus Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae). This work aimed to report the first occurrence of the insect as a pest, describe and characterize injuries caused to commercial plantations, analyze morphological aspects and mating behavior, as well as identify chemical compounds responsible for species communication. Photographic records, evaluation, survey and accounting of plants were carried out in the field. It was observed that in the larval stage, Montella sp., Builds galleries that interrupt the flow of sap in the stems and leaves of the plants. As adults, they scrape and perforate flower petals, reducing vanilla production.. The level of economic damage (LED) was 0.06 insects/plant, demonstrating that the decision to control the pest has to take place immediately after its incidence. Observations in the laboratory through a stereoscopic microscope, due to the external characteristics, pointed to a rounded shape in the tergite and abdominal differences with existing convexity only in males, confirming the differentiation of sexes in dissection. In the evaluation of the mating behavior, sexual activity was observed between 07:00h and 10:00h AM. The mating stages were defined by pre-copulation, with courtship, by copulation by performing the sexual act and by post- copulation by separation of individuals. The volatiles released by males and females, collected by the aeration technique and analyzed by gas chromatography, demonstrated that there are three male-specific compounds present in the extracts, identified as: (E10, Z12)-hexadecadien- 1-ol (A), acetate (E10, Z12)-hexadecadienyl (B) and (E10, E12)-hexadecadienyl acetate (C). Chemical compounds with similar structural characteristics are usually identified for Lepidópitera, but this is the first report in Coleoptera. The extraction of cuticular compounds revealed three female-specific compounds and the identification of their chemical structures is underway. The bioassays with the synthetic components of the pheromone showed attractiveness above 70% for both sexes to the major acetate (B), proving the aggregation pheromone of the species. The minority compound (A) was attractive only to females, and can be considered a sexual component. The olfactory responses for the minority compound (C) were not attractive for both sexes. The results obtained in this research corroborate for the elaboration of efficient and sustainable control tactics for the insect pest Montella sp. in the culture of vanilla.
Keywords: Pest control, Pheromones, Vanilla.
SUMÁRIO
RESUMO ...... 5 ABSTRACT ...... 6 INTRODUÇÃO GERAL ...... 9 REFERENCIAL TEÓRICO ...... 10 Cultivo da baunilha: Importância econômica ...... 10 Caracterização botânica, propagação e produção de mudas de baunilha ...... 11 Tratos culturais da baunilha ...... 12 Pragas e doenças da baunilha ...... 13 Família Curculionidae ...... 15 Manejo integrado de pragas e uso dos feromônios ...... 15 REFERÊNCIAS ...... 18
CAPÍTULO I - Primeiro registro e determinação dos danos causados por Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em plantios de baunilha no sul da Bahia, Brasil ...... 24 RESUMO ...... 25 ABSTRACT ...... 26 1 INTRODUÇÃO ...... 27 1.1 MATERIAL E MÉTODOS ...... 28 1.2 RESULTADOS ...... 32 1.3 DISCUSSÃO ...... 36 1.4 CONCLUSÃO ...... 38 1.5 REFERÊNCIAS ...... 38
CAPÍTULO II - Dimorfismo sexual e comportamento de acasalamentode Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) ...... 41 RESUMO ...... 42 ABSTRACT ...... 43 2. INTRODUÇÃO ...... 44 2.1 MATERIAL E MÉTODOS ...... 46 2.2 RESULTADOS ...... 47 2.3 DISCUSSÃO ...... 51 2.4 CONCLUSÃO ...... 53
2.5 REFERÊNCIAS ...... 53
CAPÍTULO III - Identificação de feromônios do bicudo-da-baunilha Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) ...... 56 RESUMO ...... 57 ABSTRACT ...... 58 3. INTRODUÇÃO ...... 59 3.1 MATERIAL E MÉTODOS ...... 60 3.2 RESULTADOS ...... 63 3.3 DISCUSSÃO ...... 71 3.4 CONCLUSÃO ...... 73 3.5 REFERÊNCIAS ...... 73
INTRODUÇÃO GERAL
O gênero Vanilla pertence à família Orchidacea com cerca de 110 espécies distribuídas nos continentes americano, africano, asiático e na Oceania (SHIRAKI, DIAZ 2012; KOCH et al., 2013). Os principais países produtores são: Indonésia, Madagascar, China, México e Tonga, que em conjunto produzem aproximadamente 95% da baunilha mundial (FAO, 2018). As espécies são conhecidas como baunilha e, apesar de serem orquídeas, não possuem comercialização das suas flores, sendo consideradas esteticamente inferiores as demais plantas da família. Trata-se de uma especiaria de importância mundial e de alto valor econômico devido ao comércio das favas e da essência Vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído). Os derivados provenientes dessa planta são largamente utilizados na indústria para fabricação de inúmeros subprodutos alimentícios, cosméticos e medicinais (HOEHNE, 1949). Apesar da importância atribuída à cultura, publicações de relevância são escassas, assim como dados atuais da produtividade. Existem mais de 100 espécies desse gênero cultivadas mundialmente. Comercialmente, Vanilla planiflora é a principal por apresentar os maiores teores de vanilina nas favas beneficiadas da baunilha, variando de 4 à 8 mg/fava (RANADIVE, 2011). No Brasil existem poucas áreas plantadas com a cultura, apesar de demonstrar alta adaptabilidade (REIS, 2000). O empecilho maior na produção da baunilha é pela dificuldade de polinização, que deve ser realizada manualmente, ocasionando perda significativa de produção em detrimento do não pegamento na maior parte das tentativas. No Sul da Bahia é difundida a produção orgânica de diversas espécies do gênero Vanilla. A produção média nessa região pode atingir 300 à 400 kg/ha de fruto beneficiado, tendo como principal mercado comprador São Paulo (FRAIFE et al., 2015). Nos últimos anos essa produção está em declínio devido ocorrência do besouro Montella sp., que tem se demonstrado praga em potencial para a cultura. O gênero Montella sp. foi relatado apenas como polinizador secundarista em áreas de mata atlântica, em diferentes espécies de orquídeas (LIMA, 1940). Entretanto, a realidade para os agricultores orgânicos é outra, na variedade V. planifolia os resultados dos ataques deste inseto podem ser irreversíveis em detrimento do estádio fenológico das plantas. Essa questão é uma preocupação, visto que não existem métodos eficientes de controle e produtos fitossanitários registrados. Além disso, estimativa de danos, hábitos e ciclo biológico desse inseto ainda são desconhecidos para qualquer tomada de decisão.
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Uma alternativa para dar suporte aos cultivos orgânicos seria a utilização de semioquímicos como tática de controle do inseto em campo. Os semioquímicos são sinais químicos emitidos por indivíduos para se comunicarem de modo intraespecífico (mesma espécie) ou interespecífico (espécies diferentes). Esses podem ser classificados em feromônios e aleloquímicos. A utilização dos feromônios é promissora para o controle de pragas na agricultura (BURKHOLDER; MA, 1985), através de monitoramento de populações, coleta massal, supressão de acasalamento pelo confundimento e uso de armadilhas com inseticidas. O uso de feromônios sintéticos é uma técnica ambientalmente benigna que permite o controle da espécie alvo e redução na utilização de pesticidas (ZARBIN; CORREIA, 1999).
REFERENCIAL TEÓRICO
Cultura da baunilha: importância econômica
A baunilha é o nome comum para diversas espécies pertencentes ao gênero Vanilla. Essas são originárias do sudeste do México, da Guatemala e outras regiões das Américas Central e do Sul, incluindo o Brasil (CAMERON, 2011). O aroma e sabor característico das favas foi historicamente apreciado pelos astecas e maias como capsulas da Vanilla em bebidas da época. Com o domínio espanhol sob essas civilizações antigas, a descoberta foi levada à Europa e difundida mundialmente (BRACHT et al., 2011). O cultivo da baunilha foi impulsionado após a descoberta da polinização artificial e a propagação vegetativa. Sem esse conhecimento, a disseminação e desenvolvimento das espécies em outras localidades era impedida, isso devido à ausência do polinizador endêmico da América Central e escassez de informações sobre a cultura (FERRÃO, 1993). No âmbito mundial existe uma variedade em torno de 100 espécies para o gênero Vanilla, entretanto, comercialmente apenas a mexicana Vanilla planifolia detém da melhor qualidade dos frutos e, consequentemente, a maior qualidade de essência denominada Vanilina (RANADIVE, 2011). A vanilina possui alto valor comercial, devido ao seu processo de extração ser trabalhoso, em virtude dessa dificuldade cerca de 90% da baunilha consumida mundialmente é sintética por ter baixo preço comercial (DAUGSCH; PASTORE 2005). Os valores dos extratos naturais de vanilina podem ultrapassar US$ 4.000,00/mL devida à baixa demanda frente à concorrência com extratos sintéticos da essência (CBI, 2018).
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Dentre os maiores produtores de baunilha estão os países Madagascar, Indonésia, China e México. Os países cultivam espécies diferentes, por exemplo, em Madagascar cultivam-se a Vanilla planifolia Andrews, conhecida como “Bourbon”, por ser de excelente qualidade, Vanilla java, já na Indonésia a Vanilla tahitensis (Sul do Pacífico) e Vanilla pompona (Antilhas) são mais incidentes (DRESSLER, 1993; HOMMA et al., 2006). A comercialização no Brasil é feita no mercado interno, devido à pouca disponibilidade do produto, além de áreas cultivadas pouco extensivas, tornando a cultura inviável, no país, para exportação, apesar da potencialidade para o plantio (FRAIFE et. al, 2015). A baunilha beneficiada é comercializada em torno de US$ 600,00 o quilo, ficando atrás somente da especiaria mais cara, conhecida como Açafrão Espanhol (CBI, 2018).
Caracterização botânica, propagação e produção de mudas de baunilha
As espécies cultivadas do gênero Vanilla sp. possuem flores verde-amareladas e frutos com fava medindo aproximadamente 20 a 25 cm de comprimento (Figura 1), estas apresentam raízes aéreas, hastes suculentas, folhas alternadas, podendo atingir mais de 10 metros de altura (HOMMA et al., 2006; CASTRO-BOBADILLA et al., 2011). A floração da baunilha ocorre entre os meses de setembro à outubro. Nas plantas vigorosas, são polinizadas de 8 à 10 flores/inflorescência e 10 à 20 inflorescências/planta (FRAIFE, 2015).
Figura 1: Flor com duas horas de abertura e frutos com cinco meses de gerados em cultivos de Vanilla planifolia no sul do estado da Bahia, Brasil.
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As flores de baunilha são formadas de inflorescências axilares, as quais são geralmente simples e sem ramificações. Pétalas e sépalas juntas são denominadas de perianto (KAHANE et al., 2008). A pétala inferior é pequena, larga e modificada em um labelum que envolve a estrutura central denominada coluna em sua porção final. O ápice da coluna tem um único estame com duas polínias cobertas por uma estrutura semelhante a um gancho denominado rostelum, abaixo do qual está o estigma, ele atua como uma barreira física entre o estigma e a antera (polínia) (CHILDERS et al., 1959; BICALHO, 1969). As flores são adaptadas a permitir a polinização manual (SASIKUMAR, 2010). Os frutos de baunilha podem ser diferenciados a partir de vários aspectos morfológicos como formato da semente e do fruto, tamanho e largura das cápsulas que também podem variar de uma espécie para outra e tais características morfológicas servem para diferenciação das espécies e clones (SOTO-ARENAS; CAMERON, 2003). Em algumas espécies os frutos aparecem sulcados e em outras, apresentam-se lisas, as sementes podem variar de tamanho de uma espécie para outra. Estas informações servem para serem armazenadas em bancos de genes e auxiliam no estudo de descoberta de novas populações segregantes, além de diferenciá-las de acordo com a ocorrência de espécies em cada região de origem e caracterizá-las (REYES- LOPEZ et al., 2014). Sementes de baunilha não germinam facilmente sob condições naturais, em caso de germinação a porcentagem de morte de plântulas é alta (SASIKUMAR, 2010). Essa baixa viabilidade da semente é em virtude da dureza do tegumento e ocorrência de sais nitrogenados,
12 sendo necessário recorrer a escarificação química (MORAES et al., 2012). O sucesso da propagação por meio da germinação “in vitro” e pela micropropagação são uma realidade, entretanto, a segunda opção destaca-se por meio da utilização dos ápices caulinares ou estacas nodais (SASIKUMAR, 2010). O tipo de plantio mais empregado é por estaquia , As estacas de baunilha devem ser oriundas de uma planta matriz e apresentar 40 cm de comprimento, retirando - se as folhas das extremidades das estacas antes do plantio, duas gemas devem ser colocadas sob o solo, no berço do plantio (HOMMA et al., 2006).
Tratos culturais da baunilha
Os tratos culturais na baunilha consistem na poda de limpeza da área com a retirada de galhos e folhas secas. A roçagem deve ser realizada antes de implantar a cultura, para evitar danos as plantas. A eliminação de ervas daninhas, podem ser feitas por meio da roçagem manual e química por meio da aplicação de herbicidas, entretanto, deve-se ter cuidado com as raízes e partes rastejantes da planta. A poda de formação é realizada no período do inverno, visando o período de floração (HOMMA et al., 2006). A irrigação é aconselhada se houver períodos muito longos de seca, sendo usada para garantir o florescimento, e deve ser feita de modo que o solo fique molhado por um longo período de tempo. A planta de baunilha, na fase jovem, necessita de água em abundância, devido à ausência de estruturas de reserva pouco desenvolvida (DRESSLER, 1993). A irrigação deve ser feita de modo que o solo não ultrapasse a capacidade de campo, ou seja, encharcado (CASTRO-BOBADILLA et al., 2011; MARTINS et al., 2011). O estresse hídrico na planta pode resultar em efeitos negativos para a cultura, pois pode interferir negativamente no desenvolvimento da planta provocando aborto de flores, queda de frutos, reduzindo consideravelmente a taxa de crescimento da planta. A irrigação é utilizada como suprimento aos longos períodos secos do ano (CASTRO-BOBADILLA et al., 2011). A falta de água na cultura da baunilha interfere na absorção de nutrientes, agindo diretamente na produtividade e na polinização (CASTRO-BOBADILLA et al., 2011).
Pragas e doenças da baunilha
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A cultura da baunilha é acometida por doenças fúngicas e viróticas, como: murcha vascular, necrose, manchas de frutos, antracnose e entre outras. Além disso, estes patógenos podem causar a morte meristemática da planta, podridão e necrose das folhas, depreciando o produto no mercado (CARDONA et al., 2012). As doenças fúngicas ocorrem com mais frequência em período chuvoso, enquanto na estação seca diminuem a incidência das mesmas. As partes da planta de baunilha mais atacadas são as folhas, hastes e frutos onde o fungo Scytalidium lignicola, causa lesões necróticas deprimidas de coloração marron e negra (VERZIGNASSI et al., 2007). Estudos descrevem Fusarium oxysporum, como sendo uma das principais doenças da baunilha, causando uma doença chamada podridão basal, sendo necessários mais estudos para a descoberta de várias doenças relacionadas aos demais fungos, devido à existência de oomycetes provocando sintomas parecidos (TOMBE; LIEW, 2010). A antracnose causada pelo fungo Colletotrichum tem por ambiente favorável de disseminação a umidade e temperaturas em torno de 10ºC e 20ºC, atacam qualquer parte da planta cujos sintomas são o aparecimento de manchas arredondadas pardas irregulares e deprimidas. O método de controle é retirar partes doentes da planta e caso o ataque tenha sido intenso e aplicação de fungicidas à base de cobre (SHIRAKI, 2012). A presença de vírus costuma ser comum nas orquídeas. Cerca de 27 espécies de vírus foram encontradas, contudo somente 5 espécies são de importância econômica: Vírus da mancha Anelar do Odontoglossum (ORSV), Vírus do Mosaico do Cymbidium (CyMV), Orchid Fleck Vírus (OFV), Cucumber mosaic Vírus (CMV) e Cymbidium ringspot Vírus (Cym RSV) (FRANGIONI, 2001; KLEIN, 2008; RÊGO, 2017). Estes provocam vários sintomas como mosaico nas folhas, mancha anelares ou irregulares, aborto de botões florais e manchas necróticas. Não existe controle contra vírus. O tratamento preventivo consiste em esterilizar ferramentas após o uso, erradicar plantas doentes e combater os insetos que são vetores da doença. As orquídeas são plantas altamente susceptíveis a ataques de pragas. Os pulgões são mais frequentes nas plantações, sugam a seiva das plantas e danificam as flores, também podem transmitir doenças viróticas. Existem outras pragas que atacam a cultura da baunilha entre elas estão as lesmas, caracóis, cochonilhas variadas, vespas, nematoides além de outras (SHIRAKI et al., 2012; ODOUX; GRISONI, 2010). Segundo SHIRAKI (2012), as lesmas dos gêneros Vaginula sp. e Veronicella sp. e os caracóis Bradybaena sp. causam grandes estragos em brotações novas, flores, raízes e botões.
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Os percevejos da espécie Tenthecoris orchidearum, T. Neoneella zikani e T. Neofurius carvalhoi, são insetos que possuem hábitos alimentares sugando a seiva, o controle é feito com inseticidas químicos (SHIRAKI et al., 2012). Existem duas espécies distintas de vespas que ocorrem em orquídeas, sendo uma delas a espécie Calorileya nigra, que colocam seus ovos nas extremidades das raízes, principal fonte de alimento das larvas (SHIRAKI et al., 2012). A espécie Eurytoma orchidearum deposita seus ovos nas brotações e pseudobulbos e os tecidos são fonte de alimentos das larvas, que causam destruição dos tecidos internos levando a planta a morte, seu controle é por meio do uso de iscas e pulverização com inseticidas (SHIRAKI et al., 2012). Em áreas comerciais na Índia, foi realizado um levantamento insetos-praga em 60 fazendas na região Tamil Nadu. Entre as pragas, foram encontradas larvas dos coleópteras Holotrichia serrata Fabricius e H. rufoflava Brenske causando danos consideráveis às raízes e caules das plantas de baunilha (VANITHA et al., 2011).
Família Curculionidae
O Brasil possui diversidade biológica exorbitante, principalmente em artrópodes. Este filo contém o maior número de espécies conhecidas, com 85% da fauna total do mundo (ANDERSON, 2002). Dentro do reino animal, a ordem Coleoptera é a maior e mais diversificada do planeta, e onde Curculionidae representa um dos grupos com o maior número de espécies. Esta família possui 60.000 espécies identificadas com ampla preferência por hospedeiros e habitat. Aproximadamente 10.000 espécies ocorrem na América do Sul, atribuídas a cerca de 1.000 gêneros (WIBMER; O'BRIEN, 1986; ALONSO-ZARAZAGA; LYAL, 1999). A principal característica morfológica nesta família é a presença de rostro desenvolvido. Muitas espécies são pragas de importância agrícola e possuem pesquisas que visam seu controle com feromônio (BARTELT, 1999). Até o momento não existem relatos desses insetos causando danos a cultura da baunilha. Apresentam antenas clavadas e geniculadas. Esses coleópteros são fitófagos da fase pupal até os adultos, alimentando-se de qualquer parte do vegetal. Os curculionídeos adultos apresentam vida longa, maior que um mês, e dependem essencialmente dos alimentos para reprodução (AMBROGI et. al, 2009; MOREIRA et. al, 2005). Esta família detém besouros capazes de abrir galerias em diversas partes na planta, independente dos tecidos constituintes, causando danos severos em fase larval (WIBMER; 15
O'BRIEN, 1986). Esses curculionídeos podem parasitar ovários de flores, depositando os ovos neste local, onde as larvas desenvolvem e alimentam-se do conteúdo do ovário (MONTE, 1942).
Manejo integrado de pragas e uso dos feromônios
A determinação do comportamento de um inseto é definida pela forma com a qual ele se ajusta e interage no ambiente, abrangendo as relações com organismos da própria espécie, como os de outras espécies e com o ambiente físico (MATTHEWS; MATTHEWS, 2010). Os aspectos etológicos nos insetos são dirigidos por uma série de interações que envolvem os sinais físicos e químicos do ambiente (DICKENS, 2002). Dentre os animais, os insetos utilizam as substâncias químicos no ambiente em todos os estágios do desenvolvimento, para localização de recursos alimentares, acasalamento, oviposição, defesa, hibernação, para se unirem aos coespecíficos, acasalamento, defesa, reconhecimento de habitats ou hospedeiros, entre outros comportamentos (AGELOPOULOS et al., 1999; LIMA; DELLA LÚCIA, 2001). O comportamento animal é baseado na comunicação, em que há transmissão e recepção de sinais entre os indivíduos. Nessa comunicação podem existir benefícios e prejuízos em vezes para emissores e em vezes para receptores, ou ainda para ambos (NASCIMENTO; SANT’ANA, 2001). Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e são reconhecidas pelas antenas dos insetos, que desencadeiam respostas nos receptores e provocam um estímulo comportamental (ZARBIN et al., 2009; PAIVA; PEDROSA-MACEDO, 1985; PENG; LEAL, 2001). Os semioquímicos são os compostos produzidos naturalmente pelos insetos que regem aspectos do comportamento (BERGSTRÕM, 2007; EL-SAYED et al., 2006). O conhecimento dos semioquímicos e suas interações fazem parte das pesquisas em ecologia química, que contribuem para a compreensão do comportamento, desenvolvimento e evolução dos organismos. De forma prática, fornece a base para o uso bem-sucedido de produtos semioquímicos para o controle de pragas como alternativa ao amplo uso de inseticidas (AGERLOPOULOS et al., 1999; EVENDEN; SILK, 2016). Os compostos envolvidos na comunicação intraespecífica, ou seja, emissão e recepção de sinais químicos entre indivíduos da mesma espécie são denominados feromônios. A comunicação realizada entre espécies diferentes, designada como relação interespecífica, estes detém compostos denominados de aleloquímicos (LEAL, 2005).
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Os feromônios são específicos e únicos para cada espécie de inseto, possuindo um “código” de comunicação próprio. Isso permite que a reprodução ou outro tipo de interação aconteça apenas entre indivíduos de mesma espécie, e não com as distintas (BARALDI; CORRÊA, 2004). Em 1959 o primeiro feromônio foi isolado e identificado pelo pesquisador alemão Adolph Butenandt, extraindo glândulas da mariposa do bicho-da-seda (Bombyx mori). O composto isolado é um álcool conhecido popularmente como bombicol (o trans-10, cis-12- hexadecadien-1-ol) (BUTENANDT, 1959). O uso de feromônios é uma alternativa considerada ecológica. Dentre as ordens de insetos, Coleoptera e Lepidoptera possuem a maior gama de feromônios identificados. Os coleopteros da família Curculionidae, geralmente, possuem compostos produzidos por machos que atraem ambos os sexos. Para essa família, também existem outros feromônios, tais como: sexuais, produzidos por fêmeas e atraem principalmente machos; feromônios de contato, que permitem conhecer coespecíficos; e os feromônios de oviposição, que são utilizados para marcar deposição de ovos (AMBROGI et al., 2009). Inúmeras espécies de curculionídeos atuam como pragas em plantações e locais de armazenamento. Para alguns, existem formas de controle químico ou biológico, entretanto, nem sempre funcionam com eficácia servindo apenas como paliativo. O controle utilizando semioquímicos ou, mais especificamente, os feromônios são satisfatórios para curculionídeos (BLASSIOLI-MORAES et al., 2013). Dentre os principais insetos-praga desta família destaca-se o bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis, que foi o primeiro curculionídeo a ter o feromônio estudado, o qual é liberado por machos e conhecido como Grandisol, a mistura feromonal é constituída por quatro componentes sendo álcoois e aldeídos (TUMLINSON et al., 1969). Outro caso de uso eficaz do feromônio sintético refere-se à praga Rhynchophorus palmarum L. chamada popularmente de broca-das-palmeiras ou broca-do-olho do coqueiro, o feromônio de agregação identificado é conhecido como Rhinchophorol ((S, E)-6-metil-2-hepten-4-ol) (ROCHAT, 1991). Entretanto, a espécie R. ferrugineus libera o feromônio conhecido como Ferruginol (HALLETT et al., 1993). O inseto moleque-da-bananeira, Cosmopolites sordidus G. produz o feromônio conhecido como Sordidina (MORI et al., 1996), que aumenta sua eficácia na captura quando utilizado com atrativos alimentares. Espécies do gênero Sitophilus, como S. oryzae e S. zeamais liberam compostos que caracterizam o feromônio Sithophilure (PHILIPS et al., 1981;
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WALGENBACH et al., 1987). Já para a espécie S. grnarius foi identificado o Sithophilate (PHILIPS et al., 1985). A entomologia tem criado e desenvolvido técnicas de controle ano após ano. Juntamente com as demais áreas das ciências agrárias, essa ciência tem muito o que contribuir para o desenvolvimento sustentável da agricultura e a potencialização da produção de alimentos no mundo (GALLO et al., 2002). Atualmente, o uso do feromônio é uma tática crescente utilizada como método de controle de pragas, como monitoramento e amostragem na agricultura. Esse avanço é uma alternativa à alusão de que apenas pesticidas são eficientes no controle de insetos- praga (MAYER; MCLAUGHLIN, 1990). No manejo integrado de pragas (MIP), o controle comportamental é feito pelo uso dos feromônios para monitoramento, coleta massal, confusão sexual e atrai-e-mata (ZARBIN et al., 2009; ARIOLI et al., 2013). O monitoramento populacional consiste na utilização de armadilhas contendo o sinal químico para avaliar a dinâmica e sazonalidade de determinado inseto, podendo indicar o momento de tomada de decisão por algum método de controle (WITZGALL et al., 2010). Na coleta massal são utilizados atrativos alimentares juntamente ao atrativo feromonal como iscas nas armadilhas, visando capturar o maior número de insetos- alvo, mantendo a população abaixo do nível de dano econômico (EL-SAYED et al., 2006; BENTO, 2001). A técnica de atrai-e-mata utiliza feromônio sintético em conjunto com inseticidas dentro da armadilha, pode apresentar maior eficiente na mortalidade de pragas, ou seja, essa alternativa pode agregar um conjunto de técnicas para controlar pragas em campo, diminuindo os impactos de métodos isolados como o químico (WITZGALL et al., 2010). Na confusão sexual, também conhecida como técnica de interrupção do acasalamento, ocorre a liberação do feromônio sintético na área para diminuir ou impedir a localização correta do parceiro, reduzindo o acasalamento e consequentemente obtendo queda da população da praga (BENTO, 2001; WITZGALL et al., 2010). Para subfamília Baridinae não existem feromônios identificados. Também não existe identificação de curculionídeos-praga de orquídeas, nem produtos fitossanitários registrados (AGROFIT, 2020), além da escassez dos métodos de controle que auxiliem o MIP. As principais etapas para a elaboração de um programa de manejo de pragas incluem o reconhecimento das pragas de maior importância levando-se em consideração a taxonomia, biologia, hábitos, hospedeiros e inimigos naturais (ROSA, 2011).
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CAPÍTULO I
Primeiro registro, descrição das injúrias e determinação dos danos causados por Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae) em plantios de baunilha no sul da Bahia, Brasil
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Primeiro registro, descrição das injúrias e determinação dos danos causados por Montella sp. Bondar (Coleoptera: Curculionidae) em plantios de baunilha no sul da Bahia, Brasil
RESUMO
A orquídea Vanilla planifolia (Asparagales: Orchidaceae) é o gênero de Orchidaceae mais conhecido e economicamente importante no mundo, amplamente utilizado na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. Os plantios comerciais de baunilha no sul da Bahia, Brasil têm constantes ocorrências de injúrias causadas por besouros em culturas comerciais. Neste trabalho relata a primeira ocorrência do inseto Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) como praga e descreve as injúrias causadas nas plantas e os danos provocados em plantações comerciais. Observou-se que o gorgulho, em estágio larval, constrói galerias que interrompem o fluxo de seiva nos caules e folhas das plantas. Na fase adulta, raspam e perfuram as pétalas das flores, reduzindo a produção de baunilha. O grau de severidade foi considerado alto pela generalização dos ataques na planta, demonstrando a porcentagem média do estande total avaliado em 56% das plantas atacadas. O NDE calculado (nível de dano econômico) foi de 0,06 insetos/planta para interferência na produtividade. A dinâmica populacional do inseto variou de acordo com a temperatura, com alta ocorrência abaixo de 29 ° C. Esses dados são importantes para tomada de decisão no manejo desta praga na cultura da baunilha.
Palavras-chave: Vanilla planifolia, bicudo-da-baunilha, danos econômicos.
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First record, description of injuries and determination of damage ratio of Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) in vanilla plantations in Southern Bahia, Brazil
ABSTRACT
The orchilla Vanilla planifolia (Asparagales: Orchidaceae), is the most well-known and economically important genus of Orchidaceae in the world, widely used in the food, cosmetic and pharmaceutical industry. Known as vanilla, suffers from constant attacks of beetles on commercial crops. This work reports the first occurrence of the insect Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) as a pest and describes damage to plants and damage to commercial plantations. It was observed that the weevil, in larval stage, build galleries that interrupt the sap flow in plant stems and leaves. In adult stage they scrape and pierce the petals of the flowers, reducing the production of the vanilla beans. The degree of severity was considered high by the generalization of the attacks in the plant, demonstrating the average percentage of the total stand evaluated in 56% of plants attacked. The calculated LED (Level of Economic Damage) was 0.06 insects / plant for productivity interference. The population dynamics of the insect varied according to the temperature, with a high occurrence below 29°C. These data are important for decision making in the management of this pest in the culture of vanilla.
Keywords: Vanilla planifolia, vanilla pest, economic damage
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1. INTRODUÇÃO
O gênero Vanilla pertence à família Orchidaceae, com cerca de 110 espécies distribuídas nos continentes americano, africano, asiático e oceânico (SHIRAKI; DIAS, 2012; KOCH et al., 2013). Os principais países produtores são: Indonésia, Madagascar, China, México e Tonga, que juntos produzem aproximadamente 95% da baunilha comercial do mundo (FAO, 2018). Dentre as espécies pertencentes ao gênero, a principal é Vanilla planifolia Andrews, cultivada comercialmente devido à alta qualidade e concentração de vanilina nos frutos (KALIMUTHU; SENTHILKUMAR; MURUGALATHA, 2006). As vagens contêm 2,0 a 2,5% dessa substância e exala aroma doce (RANADIVE, 2011). O valor econômico varia de acordo com as etapas do processamento, aumentando em até quatro vezes o preço de mercado (FRAIFE et al., 2015). A produção para consumo natural exige alta qualidade nos processos de produção de baunilha com alto custo em todo o processo de produção e maturação, esse processo trabalhoso faz com que a baunilha seja considerada a segunda especiaria mais cara do mercado mundial (ASTER, 2002; PARTHASARATHY; CHEMPAKAM; ZACHARIAH, 2008). Os preços da baunilha estão em alta devido à baixa produção mundial e à alta demanda nos últimos anos. Em maio de 2018, o preço médio de mercado da baunilha atingiu US$ 600 e US$ 700 por kg (CBI, 2018). O processamento de vagem de baunilha é o estágio mais crítico; o processo de cicatrização faz com que as vagens desenvolvam placas de cristal, onde a alanina é alocada. Em seguida, as vagens são desidratadas lentamente, sendo imersas em água fervente para ativar o processo de fermentação e liberação do aroma, ficando ao sol por 4 a 6 dias e terminando à sombra nas bandejas (HOMMA; MENEZES; MATOS, 2006). No Brasil, a produção é incipiente, não incluída nas estatísticas oficiais de produtividade da CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento). No estado da Bahia, existem plantações comerciais da variedade V. planifolia e o principal mercado comprador dessa produção é o estado de São Paulo (FRAIFE et al., 2015). As dificuldades no cultivo são devidas aos fatores bióticos e abióticos que limitam a produção. No sul da Bahia, entre os fatores bióticos, a ausência de insetos polinizadores específicos dificulta a polinização realizada manualmente pelo agricultor, mas esse processo pode danificar as estruturas reprodutivas e comprometer a produção (MAY et al., 2006). As pesquisas sobre pragas de insetos associadas à cultura de baunilha são escassas. Muitas espécies foram descritas na Índia e classificadas de acordo com sua gravidade de incidência, pertencem às ordens Lepidoptera, Hemiptera e Orthoptera. Insetos da ordem 27
Coleoptera, Holotrichia serrata Fabricius e H. rufoflava Brenske, ambos da família Melolonthidae, apresentam alta severidade e podem causar injúrias à planta em todos os estágios de desenvolvimento do inseto (VANITHA et al., 2011). A cochonilha Conchaspis angraeci Cockerell, 1893 é relatada como uma praga chave de V. planifolia na Ilha da Reunião, causando danos por sucção de seiva das plantas (RICHARD et al., 2003). Outra praga destacada é o gorgulho Cratopus retusa, pertencente à família Curculionidae, que causa o abortamento floral, impedindo a formação das vagens (FAROOQI et al., 2005). Besouros do gênero Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae: Baridinae) são encontrados em orquídeas, especialmente durante a floração. Estudos com a orquídea Dichaea pendula demonstraram que esse inseto foi considerado florívoro e polinizador secundário, devido à autopolinização por acasalamento em flor (NUNES et al., 2016). Em orquídeas da espécie Phragmipedium sargentianum, este besouro foi relatado apenas como visitante floral (HANSEN et al., 2013). Nas espécies Grobya amherstiae Lindl., Montella sp. foi considerado influenciador da reprodução por autopolinização (MICKELIUNAS et al., 2006). No Brasil, não há relatos de ocorrência de pragas nas culturas de baunilha. Assim, este estudo relata a primeira ocorrência e descreve as injúrias e caracteriza os danos econômicos causados por insetos do gênero Montella sp. em plantações comerciais de Vanilla planifolia no sul da Bahia, Brasil.
1.2 MATERIAL E METÓDOS
1.2.1 Locais de estudo
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Controle Biológico e Semioquímicos (LaCoBSe)na UESC e em 11 propriedades com plantios comerciais de baunilha orgânica, pertencentes à cooperados do Instituto Cabruca. A localização em campo compreende uma faixa territorial de Itacaré à Colônia de Una, na região sul da Bahia.
1.2.1.1 Caracterização e descrição das áreas em campo
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Em todos os sistemas de plantio foram realizadas avaliações das características, acompanhamento da situação fitossanitária e desenvolvimento do cultivo. Os itens levantados foram: ● Número de plantas ● Data de plantio ● Tipo de condução do Sistema de plantio (tutor, cortinas..) ● Situação sanitária (presença de pragas ou doenças) ● Crescimento e desenvolvimento das plantas
1.2.2 Ocorrência do inseto Montella sp. Espécimes de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) foram coletadas entre agosto de 2018 e março de 2019. Foram realizadas inspeções em Vanilla planifolia para avaliar as lesões causadas por insetos. As plantações estavam localizadas no sul da Bahia - Brasil, em 11 propriedades (Figura 1). Os dados de temperatura foram registrados (Tabela 1). Tabela 1: Temperatura média para região Sul do estado da Bahia, Brasil, no período de Agosto (2018) à Março (2019).
Meses Temperatura (°C) Agosto 26± 1ºC Setembro 28± 1ºC Outubro 28± 1ºC Novembro 29± 1ºC Dezembro 30± 1ºC Janeiro 31± 1ºC Fevereiro 31± 1ºC Março 30± 1ºC
Os dados de temperatura dessas propriedades foram obtidos no Instituto Nacional de Meteorologia do Brasil (INMET, 2019). Observou-se que agosto apresentou temperatura média de 26ºC, setembro e outubro apresentaram média de 28ºC e novembro, dezembro, janeiro, fevereiro e março apresentaram média de 30 ± 1ºC.
Figura 1. Distribuição das cidades de coleta de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em áreas de plantio de baunilha, Vanilla planifolia (Asparagales: Orchidaceae) na região sul do estado da Bahia, Brasil.
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1.2.2 Descrição das injúrias As injúrias causadas pelos insetos em estágio larval foram visualmente estimadas em porcentagem, descritas e fotografadas in loco, para caracterização. As fazendas onde os insetos foram coletados foram agrupadas por estágios de desenvolvimento das plantas, sendo: estágio reprodutivo - floração (8 fazendas) e estágio vegetativo inicial (3 fazendas). As plantas foram contabilizadas, e aquelas que apresentaram sinais de ataques de insetos foram marcadas para determinar a porcentagem de danos. Os seguintes critérios foram avaliados: presença de galerias em caules, folhas e favas, para estágio larval. Dois avaliadores estimaram independentemente a gravidade dos ataques para cada área, usando uma escala de notas (Tabela 2). As avaliações das lesões observadas contribuíram para descrever as características alimentares dos insetos nos hospedeiros.
Tabela 2. Escala utilizada para estimar a severidade das injúrias das larvas de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em Vanilla planifolia em fazendas no Sul da Bahia. 30
Escala Descrição 1 nenhuma evidência de injuria pela larva 2 até 15% das folhas com galerias 3 até 15% de folhas + caule com galerias 4 até 15% de folhas + caule + favas com galerias 5 16 a 50% das folhas com galerias 6 16 a 50% das folhas + caule com galerias 7 16 a 50% das folhas + caule + favas com galerias 8 mais de 50% das folhas com galerias 9 mais de 50% das folhas + caule com galerias 10 mais de 50% das folhas + caule + favas com galerias
1.2.3 Avaliação do dano econômico
O custo de controle (CC), a taxa de produtividade (PR) e o valor de produção (VP) da plantação de V. planifolia que sofre injúrias das larvas foram estimados em moeda brasileira a partir das equações definidas por Stone & Pedigo (1972). O CC foi baseado no controle cultural, com coleta manual de insetos e remoção das partes infestadas das plantas. Os dados do serviço de campo foram coletados, bem como os dias necessários para a captura de insetos, em uma fazenda durante o ano de 2018 por uma colheita. A taxa de produtividade foi definida pela média de dados coletados nesta produção. O VP foi calculado usando dados de produtividade em reais (R$) por hectare, conforme a equação (1): (1) VP = Pd x Pu, Onde: Pd = produtividade (kg/ha) e Pu = preço unitário (R$/kg). A produtividade média esperada foi determinada para 1 hectare, o valor da produtividade (Pd) = 300 kg/ha e o preço unitário (Pu) = 3.300,00 R$/kg. O valor de (Pu) foi a média dos preços cotados nos primeiros meses de 2019. As perdas de produtividade foram estimadas em porcentagem pelos Níveis de Dano Econômico (NDE), segundo Stone & Pedigo (1972), pela equação (2): (2) NDE = CC x 100/VP x K, Onde: CC= Custo de Controle (R$/ha); VP = Valor da Produção (R$/ha); e K= coeficiente de eficiência do controle (%).
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Para K, foi utilizado um valor de 0,5 correspondente a 50% de eficiência, devido ao ressurgimento da praga em pouco tempo com controle cultural.
1.3 RESULTADOS
As características morfológicas dos insetos coletados foram contrastadas com a descrição da espécie e os exemplares identificados pelo Dr. Germano H. Rosado Neto (Universidade Federal do Paraná) e pelo Dr. Sérgio A. Vanin (Instituto de Biociências da USP) comprovando tratar-se do inseto Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae). O adulto possui coloração preta uniforme e aproximadamente 3 a 5 mm de comprimento. A cabeça é projetada para a frente do corpo devido ao rosto alongado. As larvas têm cabeça quitinizada, o corpo curvado e a cor branca leitosa (Figura 2).
Figura 2. Adulto de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) coletados em Vanilla planifolia no sul da Bahia, (a) dorsal, (b) ventral e (e) morfologia lateral.
(d) Foto: Ariane M. L. Soares. A ocorrência do inseto foi verificada em todas as onze fazendas avaliadas nos estágios larval e adulto. Embora endofitico, foi possível observar as injúrias causadas pelas larvas nas plantas inspecionadas. A presença das larvas no campo apontou danos característicos como: galerias no caule, seguidas de secagem da lesão, amarelecimento próximo ao local de predação e ausência de broto apical. Essas características influenciaram para estabelecer a severidade do herbivório nas plantas. Considerando o estágio de desenvolvimento das plantas após o ataque, o grau de severidade apresentou resultados divergentes para os estágios reprodutivo e vegetativo (Tabela 3). Todas as plantas em fase reprodutiva apresentaram escore 9, demonstrando lesões em mais de 50% das folhas e caules das galerias. Dentre as oito propriedades pertencentes a esse grupo, seis apresentaram a nota 3 com até 15% das plantas com folhas e caules com galerias.
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Tabela 3. Estimativa visual em função da contabilização do estádio reprodutivo com notas de 1 a 10 para determinação da severidade de ataque por Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) ESCALA Fazendas Estádio Total de 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 plantas (1) RS 500 492 ------8 - (2) RS 300 200 - 58 - - - - - 30 12 (3) VS 380 298 ------82 - (4) VS 200 120 ------80 - (5) RS 400 132 - 197 - - - - - 67 4 (6) VS 155 ------155 - (7) RS 676 662 ------14 - (8) RS 1076 715 - 120 - 11 - - - 217 13 (9) RS 744 596 - 24 - - - - - 148 2 (10) RS 500 297 - 47 - - 52 - 46 57 1 (11) RS 360 287 - 23 - - - - - 50 - Nota na escala: 1 = nenhuma evidência de ataque de besouro; 2 = até 15% de folhas com galerias; 3 = até 15% de folhas + caule com galerias; 4 = até 15% de folhas + caule + favas com galerias; 5 = 16 a 50% das folhas com galerias; 6 = 16 a 50% das folhas + caule com galerias; 7 = 16 a 50% das folhas + caule + favas com galerias; 8 = mais de 50% das folhas com galerias; 9 = mais de 50% das folhas + caules com galerias; e 10 = mais de 50% das folhas + caules + favas com galerias.
A porcentagem média de plantas atacadas no estágio reprodutivo foi de 13% e no estágio vegetativo foram de 43% do total de plantas. Nas plantas juvenis, as injúrias foram maiores, pois apresentam estrutura e tecidos tenros no desenvolvimento primário (fase vegetativa). Plantas bem desenvolvidas também mostraram quantidades significativas de injúrias. Entretanto, as plantas com estrutura e desenvolvimento estabelecidos têm maior capacidade de recuperação frente às injúrias, podendo emitir novos brotos apicais e cicatrizar as galerias, retomando o crescimento. Os danos na fase larval foram caracterizados pela abertura de galerias nas plantas. Quando as larvas consumiram o caule, o fluxo de seiva foi interrompido causando necrose nos tecidos constituintes. Nas folhas, essas galerias causaram a redução da área foliar fotossintética. Em alguns casos de intenso ataque, a morte de plantas na fase juvenil foi causada pela obstrução dos vasos condutores e deterioração dos tecidos. Insetos adultos rasparam e 33 perfuraram flores e botões florais (Figura 3 (h,i)). Observaram-se injúrias nas flores causadas por perfurações nos tecidos superficiais das pétalas, causando irregularidades no desenvolvimento das vagens. Em casos graves de ataque, ocorreu o aborto floral, influenciando consequentemente a produtividade e desenvolvimento da planta.
Figura 3. Injúrias causadas por Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em baunilhas: A; B; C; D) Evolução do ataque em caules e folhas; E) Gema apical sadia; F) Gema apical danificada; G) Abortamento da gema apical; H) Flor sadia; I) Flor danificada.
Durante as inspeções, 156 besouros foram coletados. Nos períodos com temperaturas em torno de 31°C, janeiro, fevereiro e março de 2019, foi observada uma diminuição na população de besouros, sendo coletados apenas 3 insetos (Gráfico 1). No entanto, entre agosto
34 e início de dezembro de 2018, quando as temperaturas eram mais amenas (26°C à 29°C), os ataques foram mais altos e ocorreu aumento da população em campo, com total de 153 besouros. O mesmo mecanismo defensivo foi observado em laboratório, os insetos construíram "galerias" em vermiculita nas gaiolas e permaneceram inertes quando expostos a alta luminosidade e temperaturas em torno de 30°C.
Gráfico 1. Relação entre temperatura e incidência de insetos em campo nos meses de coleta.
32 50
31 45
30 40 35
29
C) ° 30 28 25
27 insetos de
20 ° N
Temperatura Temperatura ( 26 15
25 10
24 5
23 0 Agosto Setembro Outubro Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro Março
N° de insetos Temperatura
O Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) tem comportamento diurno. Ocorre aglomeração dos besouros principalmente entre 6:00 e 8:00 horas da manhã, período identificado para abertura dos botões florais. A alta atividade biológica dos insetos observada no campo foi entre 7:00 e 10:00 horas da manhã, quando as temperaturas ainda são amenas, em torno de 23°C à 27°C. Após esse período, os besouros não foram mais vistos, provavelmente pelo período de alta temperatura, acima de 28°C, das 10:00 às 16:00 horas, quando esses insetos se escondiam no solo. No período de floração, os adultos foram encontrados agrupados dentro das flores, provavelmente como forma de proteção e para realização dos acasalamentos. Para os cálculos de nível de dano econômico os valores obtidos com custo de controle (CC) foi de 308,00 (Tabela 4). Os dados foram levantados em função do controle cultural empregado nas áreas.
Tabela 4: Custo (por hectare) de equipamentos e mão-de-obra usados no controle do Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) na cultura de baunilha.
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CUSTO TOTAL DE CONTROLE Serviços/Insumos Custo unitário Qt. Custo/aplicação (R$) (R$) EPI 180,00 0,10 18,00 Mão-de-Obra (Trabalhador) 50,00 5 250,00 Ferramentas 150,00 0,10 15,00 Sacos para coleta 25,00 1,00 25,00 TOTAL 305,00 308,00
O valor da produtividade (VP) atingiu R$ 990.000,00/ha. O nível de dano econômico calculado para Montella sp. em baunilheiras pela porcentagem de perdas na produtividade (NDE) correspondeu à 0,06 bicudos por planta. Para amenizar a constância e permanência das larvas em campo, com intuito de cessar os danos nas baunilhas, as partes vegetais infestadas foram cortadas e queimadas. Injúrias semelhantes são comumente encontrados para diversas coleobrocas pertencentes à família Curculionidae.
1.4 DISCUSSÃO
Esta é a primeira evidência de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) como potencial praga em orquídeas do gênero Vanilla ou outras culturas comerciais. Este besouro foi descrito como visitante floral e colonizador de orquídeas nativas da Mata Atlântica (HANSEN et al., 2013; LIMA, 1940). O levantamento de insetos no Brasil, realizado por Thomas L. Casey em 1922, registrou Baridineos brasileiros em 13 tribos. Anos depois, Bondar, com estudo na Bahia, referiu-se à subfamília Baridinae como promessa futura de ataques a palmeiras e gramíneas (LIMA, 1940). No entanto, atualmente não existem registros de ocorrência, descrição ou identificação de danos econômicos causados a cultivares comerciais no Brasil. Os danos causados à espécie Vanilla planifolia por Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) são considerados graves devido aos ataques serem generalizados, atingindo caules, folhas e flores. A grande maioria dos insetos da família Curculionidae é considerada praga de importantes culturas agronômicas e apresenta a mesma ação de construção de galerias nas plantas hospedeiras. Outros insetos-praga que interferem comercialmente e causam danos significativos, quanto à abertura das galerias, são Metamasius hemipterus,
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Heillipus catagraphus, Cosmopolites sordidus, Rhinostomus barbirostris e Rhynchophorus palmarum (FERREIRA, 2008). Consequentemente, as plantas atacadas são enfraquecidas e se tornam alvo da colonização de outras pragas e doenças. No México, o Baridineo Peltophorus adustus foi relatado causando ataques nas sementes de Agave vivipara L. e A. cupreata em plantações comerciais, porém sem causar danos econômicos ao produto comercial (FIGUEROA-CASTRO et al., 2016). Os estágios fenológicos foram indicativos do enfraquecimento da planta pelo ataque do besouro. Plantas em estágios vegetativos apresentaram maior suscetibilidade ao ataque quando comparadas àquelas em reprodução. No entanto, a perda de produtividade é maior no florescimento em virtude da generalização das partes atacadas das plantas, sendo o dano econômico mais significativo devido ao abortamento floral, que daria origem às vagens, tornando esse estágio de maior perda. A perda de energia para recuperação de tecidos atacados atrasa o desenvolvimento e a produção (GAYLER et al., 2004). Em inúmeras plantas, em ambos os períodos fenológicos, foi comprometido mais de 50% da planta em função da construção de galerias realizadas por larvas ao longo dos caules e folhas, torna-se evidente o grande potencial de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) como praga, devendo ser identificado e controlado em áreas de Vanilla planifolia. Não existem métodos de controle em baunilha e nem inseticidas registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, Brasil) para Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae). O controle cultural é a alternativa mais viável até o momento. A determinação dos níveis de dano econômico é fundamental para descrever com precisão a influência da intensidade do ataque na produtividade, mas esse objetivo é difícil de alcançar em condições de campo (HAO et al., 2002; HIGLEY; PEDIGO, 1996). O NDE (Nível de Dano Econômico) de 0,06 insetos/planta encontrado demonstra a necessidade de controles eficientes. Conforme a severidade determinada por grau 9 registrada na maioria das propriedades, ataques constantes tem grande influência na redução da produtividade. A simulação do NDE= 1 inseto planta pode causar uma queda de até 30% no valor da produção. Os cultivos de baunilha na região sul da Bahia, Brasil, recebem sombreamento entre 60 a 70% para atender às necessidades da cultura. Esse bloqueio parcial da luminosidade causa uma redução na temperatura, proporcionando um ambiente favorável para atividade do besouro. Os processos para o desenvolvimento biológico de insetos, como crescimento, alimentação, oviposição, número de gerações anuais e comportamento, dependem de fatores abióticos (SPEIGHT et al., 1999). Entre os meses de agosto e novembro (2018) as temperaturas variaram
37 de 26°C à 29°C e, consequentemente, foram encontrados bicudos nas áreas. Foi possível observar a diminuição da ocorrência de insetos em função da temperatura durante os 8 meses de avaliação de campo. A dinâmica da população obteve queda e foi influenciada pelo aumento das temperaturas entre dezembro de 2018 e março de 2019, variando de 30°C à 31°C. O conhecimento da dependência da temperatura sob insetos é importante para prever possíveis mudanças na dinâmica populacional (KROSCHEL et al., 2013). A explicação para a ausência do inseto no campo com altas temperaturas também pode ser esclarecida em laboratório. Quando submetido à temperaturas acima de 30°C na sala de criação, Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) mostrou inatividade e recuou para a vermiculita. Esse mecanismo de defesa é reconhecido pelo ritmo biológico do inseto que sofre alterações advindas do meio externo, como é o caso de altas temperaturas e luminosidade.
1.5 CONCLUSÃO
Este é o primeiro registro de insetos do gênero Montella causando danos econômicos aos cultivos de baunilha, Vanilla planifolia, na região sul do estado da Bahia, Brasil. Por se tratar de uma cultura de alto valor econômico, apenas um inseto de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) é capaz de causar perdas na produção. Sugerindo que, a partir deste relato, seja realizado o manejo integrado de pragas para a cultura.
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CAPÍTULO II
Dimorfismo sexual e comportamento de acasalamento de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
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Dimorfismo sexual e comportamento de acasalamento de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
RESUMO
O gorgulho Montella sp. (Bondar, 1948) acomete cultivos comerciais de baunilha, causando intensos ataques às folhas, caules e flores da planta. Informações referentes à biologia deste inseto são limitadas, não sendo relatado em literatura aspectos relacionados à reprodução, comportamentos, hábitos e entre outros. Em função da escassez de informações biológicas e de reprodução, neste trabalho o objetivo foi determinar diferenças que permitam identificar o sexo de adultos de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) e analisar o comportamento sexual. Gorgulhos coletados em áreas comerciais de baunilha foram individualizados em caixas e mantidos em laboratório. Dez gorgulhos de cada sexo foram sacrificados e observados sob microscópio estereoscópico. Foram examinadas superfície do corpo, principalmente a região torácica e abdominal, para diferenciação dos sexos. Os sexos foram confirmados por dissecação em virtude das diferenças externas. Duas diferenças morfológicas são visíveis a olho nu: 1) A região abdominal dos machos possui convexidade aprofundada enquanto não existe esse atributo em fêmeas; 2) o último tergito nos machos possui formato arredondado e em fêmeas este formato é acuminado. As diferenças entre machos e fêmeas encontradas neste trabalho permitem, sem danificar os insetos nem alterar seu comportamento, uma sexagem eficiente do bicudo-da-baunilha. Por 10 dias, insetos foram agrupados em casais, sendo 1 casal/recipiente, e o comportamento sexual para Montella sp. foi observado das 07:00h às 10:00h da manhã. As etapas de acasalamento foram definidas por pré- cópula, com realização da corte, pela cópula por realização do ato sexual e pela pós-cópula por separação dos indivíduos. As informações e as técnicas propostas trazem grandes contribuições para estudos biológicos e comportamentais, bem como auxílio para determinação de métodos de controle e tomada de decisão dessa praga em cultivos de baunilha.
Palavras-chave: Etograma, Gorgulho, Comportamento.
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Sexual dimorphism and mating behavior of Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
ABSTRACT
The weevil Montella sp. (Bondar, 1948) affects commercial crops of vanilla, causing intense attacks on the leaves, stems and flowers of the plant. Information regarding the biology of this insect is limited, and aspects related to reproduction, behaviors, habits and others are not reported in the literature. Due to the scarcity of biological, food and reproductive information, this study aimed to determine differences that allow the identification of the sex of adults from Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) and analyze sexual behavior. Weevils collected in commercial vanilla areas were individualized in boxes and kept in the laboratory. Ten weevils of each sex were sacrificed and observed under a stereomicroscope. Body surfaces were examined, mainly the thoracic and abdominal regions, to differentiate the sexes. The sexes were confirmed by dissection due to external differences. Two morphological differences are visible to the naked eye: 1) The abdominal region of males has deep convexity while this attribute does not exist in females; 2) the last tergite in males has a rounded shape and in females this shape is acuminated. The differences between males and females found in this work allow, without damaging the insects or altering their behavior, an efficient sexing of the vanilla weevil. For 10 days, insects were grouped into couples, being 1 couple/recipient, and sexual behavior for Montella sp. was observed from 07:00 to 10:00h A.M. The mating stages were defined by pre-copulation, with courtship, by copulation by performing the sexual act and by post- copulation by separation of individuals. The information and techniques proposed bring great contributions to biological and behavioral studies, as well as help to determine methods of control and decision making of this pest in vanilla crops.
Keywords: Ethogram, Weevil, Behavior.
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1 INTRODUÇÃO
Estudos sobre a biologia de Montella sp. Bondar (1948) são escassos. A geração de informações direcionadas a diferenciar machos e fêmeas dessa espécie é um fator importante para apoiar estudos relacionados à reprodução, comportamento sexual, entre outros, além de contribuir significativamente ao desenvolvimento de métodos de controle para esta praga (FERNANDES et al., 2005; CORDEIRO et al., 2011; FONSECA et al., 2014). Para compreensão dos estudos comportamentais em insetos é indispensável identificar o sexo dos indivíduos sem danificá-los, exigindo métodos de sexagem rápidos e com o mínimo de manipulação. Diferentes técnicas para sexagem de gorgulhos foram descobertas, mas dificilmente se adequam à todas as espécies (SAPPINGTON et al., 2000). A morfologia interna pode ser usada para determinar o sexo, mas a dissecção é um processo oneroso, pois envolve matar os gorgulhos (JONES et al., 1992). A diferenciação dos sexos dos gorgulhos também pode ser determinada ao observar o acasalamento dos espécimes (MITCHELL, 1963). As genitálias podem ser parcialmente expostas apertando o abdômen de alguns gorgulhos (AGEE, 1964). Nas espécies de importância econômica da família Curculionidae, foram descritas numerosas características para distinguir o sexo entre indivíduos da mesma espécie. A forma do penúltimo tergito é utilizada na distinção dos sexos de adultos de Homalinotus coriaceus Gyllenhal (SARRO etal., 2004), Amerrhinus ynca Salberg (SOUZA, 2006), Conotrachelus nenuphar Herbst (THOMSON, 1932) e Anthonomus pomorum L. (DUAN et al., 1999). O espinho mesocoxal permite distinguir os machos de Anthonomus rubi Herbst (INNOCENZI et al., 2002). A forma das tíbias nos machos distingue Sternechus subsignatus Boheman (ROSADO-NETO, 1987). Existem 6 espécies identificadas para Montella sp. que entre as características descritas, tais como: aspecto dos mesepímeros, funículo antenal, lobos oculares e entre outras, torna-se trabalhosa a diferenciação entre essas (ALONSO-ZARAZAGA; LYAL, 1999; BOUCHARD et al., 2011). Além disso, este gênero de inseto, até o momento, não foi constatado como praga de culturas de importância agrícola, o que dificulta expansão de informações sobre o mesmo. O conhecimento preciso do modo de vida do inseto auxilia no desenvolvimento de métodos alternativos que reduzem o uso de inseticidas podendo ser uma oportunidade de controle. De modo geral, assim como todos seres vivos, os insetos estabelecem padrões comportamentais ao longo do processo evolutivo.
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O reconhecimento do ritmo circadiano é uma importante ferramenta no entendimento biológico dos insetos. A característica de maior interesse nesse estudo está relacionada às repetições persistentes das atividades na ausência de mudanças ambientais normais no período de 24 horas (HARKER, 1958). Dessa maneira podem ser observados dois tipos de ritmos: A) aqueles que ocorrem como resposta imediata para mudanças no ambiente (ritmos exógenos); B) os que persistem quando as condições no ambiente são mantidas constantes (ritmos endógenos). A importância dos conceitos relativos aos ritmos circadianos endógenos e exógenos influenciados por fatores ambientais como as variações diárias de luminosidade (ciclo claro/escuro) e de temperatura, demonstram que atos comportamentais dos insetos indicam suas necessidades. Geralmente, a maioria deles evita exposição à altas temperaturas ou luminosidade, portanto, as condições de elevada umidade e sombreamento propiciam ao inseto maior mobilidade no ambiente (PIZZAMIGLIO, 1991). Os fatores abióticos podem exercer influências comportamentais em insetos. A temperatura, por exemplo, pode influenciar diretamente ou indiretamente sobre os insetos. Diretamente, pode afetar o desenvolvimento e o comportamento. Já indiretamente, afeta sua alimentação, regulando as atividades sexuais dos insetos (SILVEIRA NETO et al., 1976). O estudo do comportamento sexual em insetos abrange todos os eventos ocorridos desde a formação dos casais a partir do cortejo até a separação dos mesmos após a cópula (GWYNNE, 2003). Além disso, o comportamento reprodutivo dos insetos pode ser dividido em localização do parceiro, corte, cópula e oviposição (ATKINS, 1980). Entretanto, Mathews & Mathews (1978), consideram a localização e o reconhecimento do parceiro como sendo um dos passos no comportamento de corte. A corte consiste principalmente de imobilização, movimentos de antenas e asas, incluindo vibração, sendo que esta atua inclusive como estímulo visual (LIMA; DELLA LÚCIA, 2001). A identificação correta das pragas tem importância fundamental no diagnóstico dos problemas com vistas à adoção de estratégias e táticas de controle. Além disso, as características de diferenciação sexual são de grande importância para estudos comportamentais e ecológicos, visto que o estudo comportamental é relativamente complexo em relação ao hábito de vida (ZUCCHI, 2002). Desta forma, o fornecendo de informações é imprescindível para o desenvolvimento de técnicas de controle que auxiliem no manejo integrado de pragas. Os trabalhos que envolvem a elucidação de feromônios em Curculionidae, visando a utilização no MIP, estiveram respaldados em estudos comportamentais das espécies-alvo (CALYECAC- CORTERO et al., 2006; PRASUNA et al., 2008). O conjunto dessas análises possibilita o
45 reconhecimento dos horários ideais para a coleta de voláteis, bem como determinar a biologia na comunicação entre os indivíduos. Sendo assim, o objetivo neste trabalho foi avaliar o comportamento de acasalamento e caracterizar diferenças morfológicas, para estabelecer uma técnica de identificação de sexo de adultos de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae), que seja simples, rápida e confiável.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Insetos Insetos adultos foram coletados em áreas comerciais de V. planifolia, nas cidades de: Itabuna, Ilhéus, Una, Uruçuca e Itacaré, e levados ao Laboratório de Controle Biológico e Semioquímicos na Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). Os indivíduos foram acondicionados em recipientes (20 cm x 10 cm) com caule de baunilheira, vermiculita e ágar (BDA) para garantia da longevidade da planta, tornando o ambiente similar ao campo. As gaiolas de criação foram mantidas em sala aclimatada à 27°C e umidade relativa em torno de 70%. Para alimentação foram fornecidos pedaços de cana-de-açúcar (fonte de sacarose) e partes vegetativas da baunilha (caule, folhas ou flores), com manutenção à cada três ou quatro dias para limpeza e troca do alimento.
2.2. Identificação dos sexos. Características morfológicas foram contrastadas com a descrição da espécie e com exemplares identificados pelos especialistas Dr. Germano H. Rosado Neto (UFPR) e Dr. Sergio Vanin (USP). Para a observação de caracteres macroscópicos Montella sp., visando a separação das formas sexuais, 20 exemplares da espécie foram selecionados para estudo, sendo 10 machos e 10 fêmeas. Os espécimes foram examinados sob microscópio estereoscópico, observando-se os seguintes caracteres morfológicos: tipo de antena, padrão de estrias no protórax, número de esternitos visíveis ventralmente, formato, comprimento e largura do último segmento abdominal. Para autenticar a distinção e validá-la, as estruturas reprodutivas de ambos os sexos, edeago e ovipositor, foram analisadas por dissecação com auxílio do microscópio estereoscópico, sendo utilizados os 20 insetos observados para confirmação.
2.3 Avaliação comportamental de acasalamento.
46
Foi avaliada a sequência comportamental do acasalamento de adultos de Montella sp. (Bondar, 1948). Para tanto, oito casais virgens foram colocados, individualizados, em recipientes plásticos contendo baunilha, forrada de papel filtro e vedada com tampa com tela para ventilação. As avaliações e observações ocorreram por 10 dias em dois períodos: 12 horas de fotofase e 12h de escotofase. A relação do período de atividade sexual foi contrastada com o período de repouso do inseto, para identificar os horários de interesse e analisar o modo de vida. No repouso foram atribuídos os hábitos exercidos, como: alimentação, exploração, agregação e entre outros comportamentos. Anotações, fotografias e vídeos, com câmera SONY cyber shot W800, de todas as posturas comportamentais (reprodução, sexual, alimentar e exploração) exercidas pelos insetos foram registradas de forma descritiva para determinação da sequência do comportamento, horário de cópula e identificação dos sinais usados na localização entre parceiros.
2.3 RESULTADOS
Aspectos morfológicos de identificação de sexos
Os registros das características morfológicas externas demostraram diferenças visuais. Existe uma convexidade no primeiro esternito abdominal dos machos (Figura 1.A) e ausência dessa característica nas fêmeas (Figura 1.B). Outra diferença morfológica encontrada está no formato levemente acuminado do último tergito abdominal nas fêmeas (Figura 1.D), enquanto no macho este formato é arredondado (Figura 1.C). Esses caracteres permitem a distinção entre os sexos do gênero Montella sp. Na realização da dissecação, as genitálias esperadas para os sexos distintos foram localizadas nos espécimes. Nas 10 fêmeas dissecadas foram encontradas massas de ovos (Figura 1.E) e nos machos o aparelho reprodutor edeago (Figura 1.F), confirmando a veracidade das características morfológicas externas para validar a separação dos sexos visualmente.
Figura 1. Diferença morfológica visual de Montella sp.. A) convexidade encontrada no abdome do inseto macho; B) ausência do aprofundamento no abdome da fêmea; C) formato arredondado do último tergito (macho); D) formato levemente acuminado (fêmea); E) edeago; F) massa de ovos.
47
Comportamento de acasalamento
Antes do acasalamento, a fêmea e o macho de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) permaneciam imóveis à curta distância dentro da gaiola (Figura 2.A). Ao iniciar o movimento de acasalamento, fase de pré-cópula, o macho se aproximava da fêmea pela lateral do corpo da mesma tocando-a com as antenas, realizando a corte (Figura 2.B). Na percepção do toque, a fêmea agitava as asas em excitação, como reconhecimento do parceiro (Figura 2.C). O macho realizou a monta segurando a fêmea com as pernas posteriores e medianas (Figura 2.D). A etapa de cópula iniciou quando o macho se ajustou ao corpo da fêmea, após a monta, e inseriu o edeago na câmara genital da sua parceira (Figura 2.E). Os tempos de cópula variaram entre 20 e 30 minutos. Durante o ato, as fêmeas permaneceram imóveis. O final da copulação 48 foi marcado pelo retorno dos movimentos de caminhamento da fêmea e o desacoplamento do edeago da genitália da fêmea. Na pós-cópula foi registrado descida do macho do corpo da fêmea e o comportamento de separação de ambos insetos para lados distintos (Figura 2.F).
Figura 2. Sequência do comportamento de acasalamento de Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) (A) Imobilidade a curta distância; (B) Aproximação e toque da antena pelo macho; (C) Agitação de asas pela fêmea; (D) Realização da monta pelo macho; (E) Inserção do edeago na genitália da fêmea; (F) Separação de ambos insetos para lados distintos
O comportamento de acasalamento do bicudo-da-baunilha ocorreu preferencialmente entre a segunda e quinta hora (07:00 às 10:00 h) da fotofase, com 80% de acasalamentos dos 8 casais avaliados. Apenas 3 casais apresentaram novas tentativas de cópula entre a décima e décima primeira hora (15:00 à 16:00h), com 40% de resposta, durante o período de avaliação (Gráfico 1). Entre os horários de 11:00 às 14:00 horas foi observado comportamento de
49 alocação abaixo das porções de alimentos, utilizando-os como abrigo, e se mantiveram em repouso e agregados.
Gráfico 1. Relação entre atividade sexual e repouso durante a fotofase para Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em função dos hábitos e comportamento (27°C, UR 70%)
Atividade sexual Repouso
10
8
6
4
2 Númerode casais 0 06:00 07:00 08:00 09:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 17:00 Horários da fotofase
No período noturno nenhuma atividade sexual foi observada entre os horários de 18:00 à 03:00 horas (Gráfico 2). Entretanto, 3 casais começaram a manifestar movimentos de pré- cópula a partir de 04:00 h, porém sem sucesso de monta ou copulação. Nestes horários houve apenas maior locomoção dos indivíduos pelo comportamento de exploração e hábito alimentar.
Gráfico 2. Relação entre atividade sexual e repouso na escotofase para Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae) em função dos hábitos e comportamento (27°C, UR 70%)
Atividade Sexual Repouso
10 8 6 4 2
Númerode insetos 0 18:00 19:00 20:00 21:00 22:00 23:00 00:00 01:00 02:00 03:00 04:00 05:00 Horários da escotofase
50
2.4 DISCUSSÃO
Machos de Montella sp. apresentaram a convexidade abdominal no primeiro esternito e formato arredondado no último tergito o que não foi constatado em fêmeas. A diferença encontrada nos tergitos de machos adultos e fêmeas é uma característica que também foi observada em outras espécies de gorgulhos (SARRO et al., 2004; SILVA-FILHO et al., 2007; BARRETO; ROSADO-NETO, 2012). O dimorfismo sexual utilizado para sexagem de Montella sp. foi válido e usual. Entretanto, necessita manipulação do inseto para observação do aprofundamento abdominal do macho, podendo ocasionar estresse momentâneo e interferir em avalições posteriores. Em estudos com gorgulho Ozopherus muricatus (Coleoptera: Curculionidae), diferenças morfológicas baseadas nos segmentos finais do abdome foram utilizadas para distinguir os sexos (SANTOS et al., 2018). Para o gorgulho-da-goiaba, Conotrachelus psidii Marshall, três diferenças morfológicas visíveis foram identificadas, uma delas foi: o primeiro esternito abdominal nas fêmeas é mais avantajado e convexo e nos machos esse segmento é côncavo (SILVA-FILHO et al., 2007). Estudos de comportamento animal, descrevem principais atividades diárias como: locomoção, alimentação, cópula, oviposição e entre outras. Existe uma importância fundamental na caracterização da biologia das espécies de inseto, que permite distinguir comportamentos raros ou fases e etapas específicos, podendo ser observados em etogramas (SOUZA 2012; COLOMBO et al., 2014). No etograma desenvolvido para o comportamento de acasalamento descrito em Montella sp., atos como limpeza de pernas, limpeza de antenas e agitação das asas foram observados nas fêmeas. Esses comportamentos demonstram o reconhecimento do parceiro para cópula. A oscilação do dia para noite atua sobre o ritmo do reino animal, dentro do período compreendido em 24 horas, sendo reconhecido o ritmo circadiano. Em curculionídeos são poucos os estudos que evidenciam ritmos circadianos. Comportamentos das atividades locomotoras em Rhynchophorus palmarum foram descritas iniciando pela manhã entre 9:00 às 11:00 horas, com suspensão de movimentos após este horário e retorno das atividades entre 15:00 às 17:00 horas (ROCHAT, 1987; HERNÁNDEZ et al., 1992). Essa variação da atividade corresponde à variação da temperatura na região Neotropical, sugerindo sensibilidade à altas temperaturas. No gênero Conotrachelus foi evidenciada a existência de ritmo circadiano no comportamento de C. nenuphar (OWENS et al., 1982; RACETTE et al., 1991). O bicudo-da-
51 baunilha apresentou traços característicos de ritmo circadiano com atividades biológicas influenciadas por atributos externos. No período fotofásico foram caracterizadas as repetições de acasalamentos, evidenciando que existe influência do fotoperíodo no comportamento sexual de Montella sp., demonstrando o ritmo biológico exógeno para reprodução. No final do período escotofásico, ocorreram algumas tentativas de acasalamento com etapas da pré-cópula, entretanto sem sucesso das etapas seguintes. Dessa forma, comprovou-se que a mudança luminosa, passagem da fase escura para clara, influenciou o ato sexual à ocorrer. Essas alternâncias modificam atos comportamentais podendo caracterizar diferentes padrões relativos às atividades biológicas (ARRUDA, 2013). Na escotofase o comportamento exploratório foi atribuído à procura por alimento. Ritmos biológicos diários podem ser observados em ampla variedade de insetos, mas que geralmente podem restringir algumas atividades a determinados momentos do dia (SAUNDERS, 2002). O reconhecimento do comportamento ajuda a determinar as preferências e influências ambientais em quaisquer que sejam os hábitos. Montella sp. apresenta comportamento exploratório durante período noturno, ao mesmo tempo existe uma procura por alimento. Estudos revelam que curculionídeos tendem a ter hábitos noturnos em função da temperatura, buscando esconderijo nos componentes de sua hospedeira. Em Cosmopolites sordidus (GERM.) (Coleoptera: Curculionidae), essa preferência e mecanismo de proteção foi observada quando adultos, no período da manhã, permaneciam em ambientes úmidos e sombreados junto às touceiras, entre as bainhas foliares e nos restos culturais de bananeiras (VIANA, 1992; BARBOSA, 2009). As etapas do comportamento de acasalamento, bem como os horários de atividade sexual e repouso, permitem identificar o momento de maior comunicação química desses insetos, facilitando o entendimento da atuação dos feromônios em uma população. Durante a pré-cópula, caracterizada pelo comportamento de antenação e movimentação dos machos em direção à fêmea, provavelmente, foi guiada por substância produzida e liberada por elas, visto que em nenhum momento estas se deslocaram em direção aos machos. Sugerindo que as fêmeas sejam responsáveis pela liberação do feromônio de contato da espécie. Comportamento semelhante foi observado para Sphenophorus levis Vaurie, 1978 (Coleoptera: Curculionidae), quando fêmeas iniciavam a corte com a movimentação das asas selecionando os parceiros que aproximavam delas exercendo toque antenal, sem que a mesma tivesse locomovido (ALENCAR, 2016).
52
2.5 CONCLUSÃO
As características morfológicas externas encontradas em espécimes de Montella sp. corroboram para identificação de machos e fêmeas. O comportamento de acasalamento da espécie perante atividade sexual determina este inseto como diurno, com hábitos alimentares noturnos pelo comportamento de exploração. Esses resultados poderão ser empregados no manejo integrado desta praga na cultura da baunilha.
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Capítulo III
Identificação de feromônios do bicudo-da-baunilha Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
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Identificação de feromônios do bicudo-da-baunilha Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
RESUMO
A orquídea Vanilla planifolia, conhecida como baunilha, é hospedeira do curculionídeo Montella sp., em cultivos comerciais na região sul do Estado da Bahia, Brasil. No estágio larval abre galerias no caule e nas folhas interrompendo o fluxo de seiva das plantas. Os adultos causam injúrias nas flores, reduzindo a produção das favas. Este trabalho teve como objetivo identificar semioquímicos que medeiam as interações entre indivíduos da mesma espécie no cultivo de baunilha comercial. Para isso, insetos adultos foram coletados em baunilhas e mantidos em laboratório. Machos e fêmeas foram separados por diferenças na região abdominal. Os extratos voláteis (EV’s) dos insetos foram coletados pela técnica de aeração e os cuticulares (EC’s) pela técnica de extração por solvente. Os EV’s foram analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) e a comparação dos cromatogramas demostraram três compostos macho-específicos, sendo identificados como (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol (A), conhecido também como bombicol, acetato de (E10,Z12)- hexadecadienila (B) e acetato de (E10,E12)-hexadecadienila (C). As análises por CG-EM dos EC’s mostraram que as fêmeas produzem três compostos sexo-específicos e a identificação das estruturas químicas destes está em andamento. Os bioensaios com o acetato majoritário (B) sintético apresentaram atratividade acima de 70% para ambos sexos, comprovando ser o feromônio de agregação da espécie. No entanto, o composto minoritário bombicol (A) foi atrativo apenas para fêmeas, podendo ser considerado um componente sexual. Já as respostas olfativas nos bioensaios com composto minoritário (C) demonstraram não atratividade para ambos sexos. As estruturas químicas dos componentes feromonais de Montella sp. são incomuns dentre as identificadas para curculionídeos até o momento, sendo estruturas típicas de feromônios de Lepidoptera. Além disso, este é o primeiro estudo sobre feromônios da subfamília Baridinae.
Palavras-chave: Olfatometria, Agregação, Vanilla. Baridinae, Semioquímicos.
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Identification of pheromones of the vanilla weevil Montella sp. Bondar, 1948 (Coleoptera: Curculionidae)
ABSTRACT
The orchid Vanilla planifolia, known as vanilla, hosts the curculionid Montella sp., In commercial crops in the southern region of the State of Bahia, Brazil. In the larval stage, it opens galleries on the stem and leaves, interrupting the flow of sap from the plants. Adults cause injuries to flowers, reducing the production of broad beans. This work aimed to identify semiochemicals that mediate interactions between individuals of the same species in the cultivation of commercial vanilla. For that, adult insects were collected in vanilla and kept in the laboratory. Males and females were separated by differences in the abdominal region. The volatile extracts (EV’s) of the insects were collected by the aeration technique and the cuticular (EC’s) by the solvent extraction technique. The EV's were analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (CG-EM) and the comparison of the chromatograms showed three male-specific compounds, being identified as (E10, Z12)-hexadecadien-1-ol (A), also known as bombicol, (E10,Z12)-hexadecadienyl acetate (B) and (E10,E12)-hexadecadienyl acetate (C). CG-EM analyzes of EC's showed that females produce three sex-specific compounds and the identification of their chemical structures is underway. The bioassays with the synthetic majority (B) acetate showed attractiveness above 70% for both sexes, proving to be the aggregation pheromone of the species. However, the minority compound bombicol (A) was attractive only to females and can be considered a sexual component. The olfactory responses in the bioassays with a minority compound (C) showed no attractiveness for both sexes. The chemical structures of the pheromone components of Montella sp. they are uncommon among those identified for curculionids to date, being typical structures of Lepidoptera pheromones. In addition, this is the first study on pheromones in the subfamily Baridinae.
Keywords: Olfactometry, Aggregation, Vanilla. Baridinae, Semochemicals.
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3.1 INTRODUÇÃO
O contexto atual emprega formas alternativas ao uso de produtos químicos considerados tóxicos na produção agrícola, que têm sido acompanhadas pelo processo de transformação sustentável conjunto a agricultura moderna (ASSAD & ALMEIDA, 2004). As adaptações de técnicas de manejo diferenciadas nos sistemas de produção estão em constante crescimento. Desta forma, o mercado orgânico tem ganhado destaque. Essa forma de produção é difundida pelos cooperados do Instituto Cabruca, que possuem os plantios comerciais de baunilha orgânica na região sul de Ilhéus, na Bahia. Nestes cultivos comerciais de Vanilla planifolia, o inseto Montella sp. (Coleoptera: Curculionidae), um gorgulho pertencente a subfamília Baridinae, vem causando perdas significativas nas áreas. Até o momento, o manejo desta praga não possui métodos de controle e nem produtos fitossanitários registrados (AGROFIT, 2020). Estudos visando a utilização de semioquímicos para o controle de pragas tem aumentado. O intuito é a substituição do uso de inseticidas que são prejudiciais ao meio ambiente e à saúde humana e animal. Essa alternativa pode ser atribuída aos cultivos orgânicos e convencionais (MAPA, 2020). A utilização de semioquímicos na agricultura, principalmente por feromônios sintéticos, demostra eficiência para o controle de importantes pragas da família Curculionidae, como Anthonomus grandis, R. palmarum e R. barbirostris (PAPA, 1992; NAVARRO et al., 2002; REIS, 2018). A manipulação de populações por meio dessa alternativa é um método em evidência no manejo de pragas. Atualmente, não existem estudos sobre os semioquímicos envolvidos na comunicação desta espécie e nenhum ferômonio identificado para a subfamília Baridinae (PHEROBASE, 2020). A interrupção da comunicação com feromônios sintéticos é uma técnica ambientalmente benigna de controle de pragas que permite o controle da espécie alvo e reduz a utilização de pesticidas (GOULART et al., 2015). O uso de feromônios para monitoramento pode determinar a dinâmica populacional e auxiliar a tomada de decisão no manejo dos insetos (VILELA, 1992; CIRINO, 2012). Diante da escassez de recomendações técnicas para o controle, ineficiência na utilização do método de controle cultural, e de altas infestações dos insetos ocorridas nos cultivos de baunilha no sul da Bahia, o objetivo deste estudo foi identificar os compostos bioativos produzidos por Montella sp. responsáveis pela comunicação química dos seus co-específicos.
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3.2 MATERIAL E METÓDOS
3.2.1 Coleta e criação dos insetos
Insetos adultos foram coletados em plantas de V. planifolia, nas cidades de: Itabuna, Ilhéus, Una, Uruçuca e Itacaré, e levados ao Laboratório de Controle Biológico e Semioquímicos na Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). A população foi sexada e os indivíduos foram acondicionados em recipientes (12,5 cm x 9 cm) com caule de baunilheira, vermiculita e ágar (BDA) para garantia da longevidade da planta, tornando o ambiente similar ao campo (Figura 1). As gaiolas de criação foram mantidas em sala aclimatada à 27°C e umidade relativa em torno de 70%. Para alimentação foram fornecidos pedaços de cana-de- açúcar (fonte de sacarose) e partes vegetativas da baunilha (caule, folhas ou flores), com manutenção à cada três ou quatro dias para limpeza e troca do alimento.
Figura 1. Gaiolas de criação de Montella sp. adaptadas com ágar, vermiculita e muda de baunilha.
3.2.2 Extração de compostos voláteis
Para obtenção dos voláteis foi utilizada a técnica de aeração. Em duas câmaras de vidro adaptadas (11 cm x 3 cm) foram inseridos 6 insetos de cada sexo, sob as mesmas condições de
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temperatura e umidade que a criação. Foram ofertados pedaços de cana-de-açúcar e baunilha para alimentação. Uma corrente de ar contínua, fornecida através de bomba à vácuo com fluxo de 1,5 L/min, percorreu carvão ativado para purificação do ar e foi umidificada com água destilada antes da entrada nas câmaras (Figura 2). Para captura dos voláteis liberados pelos insetos, colunas de vidro contendo polímero adsorvente HayeSep-Q foram conectadas na parte superior das câmaras. A cada 96 horas de aeração, os compostos retidos no polímero foram eluídos em 200 µL de Hexano e os extratos foram armazenados em freezer, para posteriores análises químicas e bioensaios.
Figura 2. Componentes do sistema de aeração para captura de voláteis de Montella sp.: (A) bomba à vácuo; (B) filtro de carvão ativado; (C) filtro de água destilada; (D) câmaras de aeração.
3.2.3 Extração de compostos cuticulares
Compostos químicos presentes na cutícula dos insetos foram extraídos pelo método de extração direta, quando o solvente em contato com a cutícula extrai os compostos presentes. Adultos de ambos sexos foram colocados em congelador por 15 minutos, para que o metabolismo fosse cessado. Em seguida, os indivíduos foram separados por sexo e imersos em 130 µL de hexano por indivíduo, permanecendo por dez minutos. Após este período, o inseto 61 foi retirado e o extrato foi armazenado em freezer para posteriores análises químicas e bioensaios.
3.2.4 Análises químicas dos extratos
Os extratos de voláteis e cuticulares foram analisados por um cromatógrafo à gás com coluna capilar Rtx-5 (30 m x 0,25 mm D.I. x 0,25 μm de filme) acoplado ao espectrômetro de massas (CG/EM) modelo Shimadzu QP- 2010 Plus com ionização por impacto de elétrons (70 eV). Foram injetados 1 µL por extrato, nas análises dos extratos de voláteis, o CG foi operado em modo splitless (250 ºC), com programação para voláteis em temperatura de 40 ºC por 1 min, aumentando 7 ºC/min até 250 ºC e permanecendo a esta temperatura por 10 min, utilizando gás hélio como gás de arraste com fluxo de 1 mL/min. A programação para análise dos extratos de cutícula iniciou a temperatura de 40 ºC por 1 min, aumentando 7 ºC/min até 250 ºC e permanecendo a esta temperatura por 20 min. Os cromatogramas obtidos, dos extratos de machos e fêmeas, foram comparados para detectar compostos químicos específicos de cada sexo. Os índices de Kovats (IK) calculados dos compostos de interesse foram baseados na fórmula a seguir:
IK = 100 y + 100 (z – y) * (trx – try) (trz – try) Onde: y = número de carbonos do hidrocarboneto que elui antes do composto x; z = número de carbonos do hidrocarboneto que elui depois do composto x; tr = tempo de retenção dos compostos.
Os índices de Kovats (IK) foram calculados utilizando uma solução padrão de hidrocarbonetos de C10 a C26.
3.2.5 Bioensaios em olfatômetro
O teste de olfatometria consistiu em um tubo de vidro no formato Y, determinado de olfatômetro, que possui 4,5 cm de diâmetro, constituído do tubo principal com 40 cm de comprimento e 20 cm cada um dos dois braços menores (figura 3). A resposta comportamental aos extratos foi testada com 30 machos e 30 fêmeas em cada tratamento. Na extremidade de
62 cada saída do olfatômetro foi disposta como fontes de odores papel filtro impregnado com soluções. Os tratamentos foram: (I) extrato de macho vs. extrato de fêmea; (II) extrato de macho vs. hexano (controle); (III) extrato de fêmea vs. hexano (controle). Já os tratamentos para os sintéticos, também em 100 ppm, foram: (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol (bombicol) (composto A) vs. hexano; acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila (composto B) vs. hexano (controle); e acetato de (E10,E12)-hexadecadienila (composto C) vs. hexano. O adulto, podendo ser macho ou fêmea, foi introduzido no braço maior do olfatômetro e seu comportamento foi observado durante 10 minutos. Foi registrado o comportamento e considerada resposta ao extrato em que o inseto se aproximava e permanecia por mais tempo.
Figura 3. Sistema de olfatometria utilizado para realização dos bioensaios comportamentais com machos e fêmeas de Montella sp.
3.2.6 Análises estatísticas
Os dados das respostas de machos e fêmeas para os diferentes tratamentos em 2 olfatômetro foram analisados utilizando-se o teste Qui-quadrado (P<0,05), com Xcalc. = 3.64, testando a homogeneidade das proporções de respostas positivas e negativas. Os insetos que não escolheram nenhum dos braços foram excluídos da análise estatística.
63
3.2 RESULTADOS
Identificação e análises químicas dos compostos voláteis
A comparação dos cromatogramas obtidos das análises dos voláteis de adultos machos e fêmeas do gênero Montella sp. pela técnica de CG/EM mostraram a presença de três compostos macho-específicos (figura 4). A proporção dos compostos A, B e C na amostra feromonal natural foi 8:25:1, respectivamente.
Figura 4. Comparação de cromatogramas dos extratos de voláteis liberados por machos e fêmeas de Montella sp.
As respostas comportamentais dos insetos adultos frente aos extratos de voláteis de machos versus extratos de fêmeas mostraram que dos 30 insetos machos submetidos ao teste 21 (70%) (X2= 20,4; g.l.= 1; P<0,05) escolheram a fonte de odor com voláteis de machos (Gráfico 1). Já 23 (77%) (X2= 19,26; g.l.=1; P<0,05) fêmeas responderam aos compostos macho-específicos. Nos ensaios utilizando extrato de voláteis de machos versus hexano (controle), 24 machos (80%) e 23 fêmeas (77%) foram atraídos para o tratamento. As respostas aos voláteis de machos foram acima de 70% para ambos sexos, tornando-se evidente a presença do feromônio de agregação da espécie.
64
Gráfico 1. Respostas de machos e fêmeas de Montella sp. aos extratos de voláteis produzidos pelos machos e fêmeas coespecíficos.
COMPOSTO NATURAL
Extrato M Extrato F Hexano
* Machos
*
* Fêmeas
*
25 15 5 5 15 25 Resposta (número de insetos)
(*) Diferença significativa pelo teste Qui-Quadrado (X2) p<0,05.
Com a confirmação da existência de 3 compostos macho-específicos por cromatografia gasosa prosseguiu-se a identificação de tais compostos. O espectro de massas do composto A apresentou pico base m/z 67 e um pico do íon molecular m/z 238 (M+). A presença do fragmento + m/z 220 (M -18), referente à perda de uma molécula de água (H2O), sugere a função álcool na cadeia com fórmula molecular C16H30O (figura 5). O tempo de retenção foi 24.1 minutos e o IK calculado foi 1932. O grau de insaturação da molécula sugeriu a presença de duas ligações duplas C-C e a fragmentação característica de cadeias carbônicas lineares. Espectro de massas semelhante foi encontrado para o feromônio sexual da mariposa Bombyx mori Lineu (1758), apresentando mesmo padrão de fragmentação e fórmula molecular (BUTENANDT et al. 1959; ANDO et al. 1988). Desta forma, após sintetizado e comparado com composto natural em CG- EM confirmou-se a estrutura do composto A como sendo (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol (figura 6).
Figura 5. Espectro de massas do composto (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol (A) do feromônio de agregação liberado poro machos de Montella sp.
65
% 100 67
75 81
50 55 41 96 25 109 57 121 135 238 149 163 0 177 220 243 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0
Figura 6. Comparação dos cromatogramas do extrato natural de macho de Montella sp. com composto A sintético identificado como (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol em CG-EM.
O espectro de massas do composto B (figura 7) apresentou também o pico base em m/z 67 (100%), íon molecular m/z 280 (M+) e um fragmento característico de acetatos em m/z 220 + (M -60), referente à perda de um ácido acético (CH3COOH), sugerindo que a fórmula molecular para este composto é C18H32O2. A leitura dos fragmentos do espectro da esquerda para a direita observa-se um aumento sequencial de 14 unidades de massa (CH2), acompanhada da diminuição da intensidade dos fragmentos, o que sugeriu uma linearidade na cadeia carbônica. O tempo de retenção foi 25,8 minutos e o IK calculado de 2057. A proporção da área foi de 75% em média na comparação dos 3 compostos, tornando-se esse o composto majoritário da amostra. O grau de insaturação da molécula sugeriu a presença de duas ligações duplas C- C. O composto B foi sintetizado e comparado com composto natural em CG-EM sendo confirmado como o acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila (figura 8).
Figura 7. Espectro de massas (E10,Z12)-hexadecadienila (B) do feromônio de agregação liberado por machos de Montella sp.
66
% 100 67
75 81
50 96 43 55 25 121 109 135 280 138 220 163 177 192 281 0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0
Figura 8. Comparação dos cromatogramas do extrato natural de macho de Montella sp. com composto B sintético identificado como acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila em CG-EM.
O composto C apresentou espectro de massas similar ao composto B, com pico base m/z 67 (100%) e íon molecular m/z 280 (M+) (figura 9). A proporção da área foi em média 3% na comparação com os demais compostos de interesse, sendo este, também, um composto minoritário. Além disso, apresentou tempo de retenção em 26,1 e IK de 2074, que são valores muito próximos aos encontrados para o composto B. Os espectros de massas com fragmentações iniciais também são semelhantes, sugerindo que estes sejam isômeros. O composto C sintetizado e comparado ao extrato natural de macho foi confirmado como acetato de (E10,E12)-hexadecadienila (figura 10).
Figura 9. Espectro de massas (E10,E12)-hexadecadienila (C) liberado por machos de Montella sp.
67
% 100 67
75
81
50 43 96 55 121 25 109 135 280 138 163 220 281 0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0
Figura 10. Comparação dos cromatogramas do extrato natural de macho de Montella sp. com composto C sintético identificado como acetato de (E10,E12)-hexadecadienila em CG-EM.
As respostas dos insetos frente à exposição aos voláteis dos três compostos sintéticos individuais: (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol (A), acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila (B) e acetato de (E10,E12)-hexadecadienila (C), foram avaliadas e os resultados apresentaram comportamentos discrepantes. Na atração de fêmeas frente ao sintético E10,Z12-16:OH (bombicol), 26 escolheram o composto A, correspondendo à 73% de respostas (X2= 18,26; g.l.=1; P<0,005) demonstrando alta atratividade na presença deste componente. Ao todo 40 fêmeas foram testadas, onde 10 permaneceram no braço principal, sendo essas excluídas da estatística por não atividade. Já os machos, dos 40 insetos testados, 22 escolheram o controle e apenas 8 optaram para o braço contendo o composto A e 10 permaneceram no braço principal e, também, não foram utilizados em estatística. Não apresentando resultados quanto à atratividade ao componente e apontando preferência significativa ao hexano (Gráfico 2). Desta forma, o composto A pode ser considerado componente atrativo sexual para reprodução da espécie.
Gráfico 2. Respostas olfativas de machos e fêmeas de Montella sp. ao sintético (E10,Z12)- hexadecadien-1-ol (bombicol)
68
COMPOSTO A - (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol Bombicol Hexano
Fêmeas
*
Machos *
25 15 5 5 15 25 Resposta (número de insetos)
(*) Diferença significativa pelo teste Qui-Quadrado (X2) p<0,05.
A avaliação da atratividade ao componente majoritário sintético (composto B), E10,Z12-18:Ac, em comparação ao hexano (controle), obteve 73% de respostas dos machos (X2= 18,26; g.l.= 1; P<0,005). Dos 35 machos testados, 22 insetos apresentaram atratividade ao componente, 8 escolheram o controle e 5 permaneceram no braço principal. Entretanto, das 34 fêmeas, 4 não demonstraram atividade permanecendo no braço principal e não contabilizadas em estatística, 18 optaram pelo composto B demonstrando 60% de preferência ao acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila (X2= 15,6; g.l.=1; P<0,005). (Gráfico 3). As respostas olfativas de ambos os sexos representam atratividade elevada ao composto majoritário, podendo esse ser reconhecido como componente de agregação da espécie.
Gráfico 3. Respostas olfativas de machos e fêmeas de Montella sp. ao sintético acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila composto majoritário nos extratos de machos.
69
COMPOSTO B - acetato de (E10,Z12)-hexadecadienila
Majoritário Hexano
* Fêmeas
* Machos
25 15 5 5 15 25 Resposta (número de insetos)
(*) Diferença significativa pelo teste Qui-Quadrado (X2) p<0,05.
O minoritário C sintético, E10,E12-18:Ac, também foi testado para ambos sexos, mas não apresentou resultados de atratividade ao composto C, 90% dos machos (X2= 24,6; g.l.= 1; P<0,005) e 92% das fêmeas (X2= 26,2; g.l.= 1; P<0,005) optaram pelo braço com hexano (Gráfico 4). Ao todo foram testados 33 machos e 32 fêmeas, com inatividade e permanência no braço principal 3 e 2 insetos, respectivamente.
Gráfico 4. Respostas de olfativas de machos e fêmeas de Montella sp. ao sintético acetato de (E10,E12)-hexadecadienila.
COMPOSTO C - acetato de (E10,E12)-hexadecadienila
Minoritário Hexano
* Fêmea
* Macho
20 10 0 10 20 30
(*) Diferença significativa pelo teste Qui-Quadrado (X2) p<0,05.
As fêmeas de Montella sp. responderam ao feromônio de agregação natural e ao composto B exibindo quatro tipos de comportamento: limpeza de antenas, limpeza de pernas e batimento de asas quando próximas à fonte de odor. Os mesmos comportamentos foram observados no acasalamento, quando havia aproximação dos machos perante as fêmeas na fase de pré-cópula.
70
Identificação dos compostos cuticulares
A comparação dos cromatogramas de extratos cuticulares apontou três compostos presentes nos extratos de fêmeas que não são encontrados em machos (figura 11). A repetibilidade das análises desses extratos permitiu afirmar que a fêmea produz compostos que podem fazer parte da comunicação dos insetos. Os compostos D, E e F ainda estão em processo de identificação, entretanto, os padrões de fragmentação nos espectros de massas desses compostos mostram a possibilidade destes serem isômeros, apresentando-se como possíveis diois insaturados com cadeira carbônica longa.
Figura 11. Comparação de cromatogramas dos extratos cuticulares machos e fêmeas de Montella sp.
3.3 DISCUSSÃO
O comportamento de agregação é característico da família Curculionidae, vários autores relatam a presença de feromônio de agregação liberado por machos (CROSS et al. 1966; ELLER et al. 1994). No entanto, há relatos em fêmeas, incluindo feromônios a longa distância, atraindo principalmente machos, feromônios de contato, que permitem conhecer co- específicos, e feromônios de oviposição, que são usados para marcar onde são depositados ovos (AMBROGI et al, 2009). O feromônio de agregação pode ser indicador de nova planta hospedeira, para ambos sexos, e ou atração das fêmeas para acasalamento. A espécie Sphenophorus levis é uma importante praga da cana-de-açúcar encontrada principalmente no norte da Argentina, Paraguai e Brasil. Testes laboratoriais preliminares, usando o álcool sintético (S) -2-metiloctan-4-ol produzido pelos machos dessa espécie, sugeriram que este composto causa um comportamento de agregação entre machos e fêmeas da espécie (VANIN, 1988; ZARBIN et al., 2003).
71
Uma mesma família pode expressar um padrão de estruturas moleculares. Em lepidópteras, a maioria dos feromônios sexuais são compostos de cadeia linear constituídos um grupo funcional como álcool, aldeído e acetatos. Já os feromônios de coleópteros são constituídos por componentes derivados de ácidos graxos e aminoácidos (JURENKA, 2004). Inúmeros insetos-praga da família Curculionidae já tiveram seus feromônios identificados e os compostos correspondem, basicamente, a duas classes: monoterpenoides e possíveis derivados de ácidos graxos (álcoois, cetonas e ésteres) (AMBROGI et al, 2009). No entanto, o curculionídeo Montella sp. Bondar, 1948 libera compostos nunca encontrados para essa família, sendo identificados três compostos macho-específicos característicos da ordem Lepidóptera, que incluem mariposas e borboletas. Esses componentes identificados nos voláteis do bicudo-da-baunilha apontam presença de feromônio. O composto B majoritário, identificado como acetato de (E10,Z12)- hexadecadienila, apresentou respostas com alta atratividade para ambos sexos em bioensaios em laboratório. Ficou evidente o comportamento gregário, podendo ser usado como indicador de sítio alimentar ou de atração sexual, definido por feromônio de agregação da espécie. O composto A, identificado como Bombicol, já foi descrito como componente principal do feromônio sexual do bicho-da-seda, Bombyx mori, (Lepidoptera: Bombycidae) extraído de glândulas femininas (BUTENANDT et al. 1959). A produção da mesma molécula por um curculionídeo é uma descoberta inédita na comunidade científica. Nos bioensaios realizados em laboratório houve alta atratividade ao composto A (E10,Z12)-hexadecadien-1-ol para fêmeas de Montella sp. e não houve para machos, em virtude desses preferirem o braço que continha o hexano. Houve repetibilidade de comportamentos, como: agitação das asas quando as fêmeas encontravam a fonte de odor com composto majoritário e bombicol. As respostas olfativas de Montella sp. ao composto C não foram satisfatórias quanto à atratividade ao componente para ambos sexos. Os insetos possuem um sistema sensorial capaz de detectar compostos que mediam as interações entre os insetos e outros organismos (THÖMING et al., 2014). As estruturas responsáveis pela detecção destes compostos químicos são as sensilas, que são encontradas em diversas regiões superficiais do corpo do inseto, como a antena, considerada o principal órgão do sistema olfativo do inseto (ALTNER; PRILLINGER, 1980; CALLAHAN, 1975). Este componente é o isômero do composto majoritário B e, apesar de serem estruturas muito semelhantes, as propriedades de cada composto são diferentes e apenas um dos isômeros apresenta a característica do feromônio.
72
Entretanto, pode ocorrer efeito aditivo ou sinérgico entre os componentes em função das concentrações. Os feromônio de contato nas espécies de curculionídeos exercem papel à curtas distâncias, quando existe aproximação dos parceiros (BIRCH, 1974; AMBROGI et al, 2009). Os compostos cuticulares encontrados em fêmeas de Montella sp. podem indicar o feromônio de contato da espécie. Segundo Waku (et al., 1984), espécies podem conter em suas cutículas lipídeos, ésteres, triglicerídeos, hidrocarbonetos e entre outros compostos que podem expressas reações em indivíduos de diferente ou mesma espécie. O toque antenal do macho sob o corpo da fêmea, também, pode indicar o reconhecimento sexual pelos hidrocarbonetos presentes na cutícula da parceira. Os compostos cuticulares produzidos por insetos podem agir na comunicação inter ou intra-específica, no reconhecimento sexual e até mesmo na defesa contra inimigos naturais (SINGER,1998; HOWARD et al., 2005).
3.4 CONCLUSÃO
Foram encontrados três compostos cuticulares em fêmeas de Montella sp. que podem atuar como feromônio de contato da espécie. Comprovou-se a existência de compostos voláteis que medeiam comportamentos, sugerindo por bioatividade olfatométrica o composto A como feromônio sexual e o composto B como feromônio de agregação para Montella sp. em cultivos de baunilha. Este trabalho abre precedentes para geração de produtos bem como a implantação de uma tática de controle comportamental intraespecífica que poderá ser usada na produção orgânica de baunilha.
3.5 REFERÊNCIAS
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